マウス微量アミンレセプター
【課題】マウスの新規な微量アミン関連受容体およびその利用を提供する。
【解決手段】Ｇタンパク質共役型受容体のサブファミリーを形成する微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で選択的なフィンガープリント配列を提供する。また、このファミリーのメンバーとして同定された新しいマウスのポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、および新しいファミリーメンバーを含むベクターと宿主細胞も提供する。加えて、ＴＡＡＲを同定する方法を提供する。
【解決手段】Ｇタンパク質共役型受容体のサブファミリーを形成する微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で選択的なフィンガープリント配列を提供する。また、このファミリーのメンバーとして同定された新しいマウスのポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、および新しいファミリーメンバーを含むベクターと宿主細胞も提供する。加えて、ＴＡＡＲを同定する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体のサブファミリーを形成するマウスの微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で選択的なフィンガープリント配列を提供する。本発明はまた、このファミリーのメンバーとして同定されたマウスのポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、および新しいファミリーメンバーを含むベクター、宿主細胞、およびヒト以外の動物を提供する。さらに本発明は、マウスＴＡＡＲを同定する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
微量アミン（ＴＡ）は、構造的に生体アミンに関連する内因性化合物であり、哺乳動物神経系で微量見出される。ＴＡは、神経末端に貯えられ、古くから知られている生体アミンと共に放出される。現在までに、ＴＡを唯一の伝達物質として用いるシナプスが存在するという証拠は無い。最近、特異的に微量アミンを結合する受容体が、Borowski et al.（Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98(16): 8966-8971.）および、Bunzow et al.(Amphetamine, 3,4-methylenedioxymethamphetamine, lysergic acid diethylamide, and metabolites of the catecholamine neurotransmitters are agonists of a rat trace amine receptor. Mol. Pharmacol.2001, 60(6): 1181-1188.)によって報告された。これらの受容体は、明らかに新しいＧＰＣＲファミリーである。
【０００３】
微量アミンの調節不全は、種々の精神障害、即ち、うつ病（Sandler M.et al.,Decreased cerebrospinal fluid concentration of free phenylacetic acid in depressive illness. Clin. Chim. Acta, 1979, 93(l): 169-171; Davis BA and Boulton AA. The trace amines and their acidic metabolites in depression--an overview. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1994, 18(1): 17-45.）、統合失調症（Potkin SG. et al. Phenylethylamine in paranoid chronic schizophrenia. Science. 1979, 206(4417): 470-471; Sandler M and Reynolds GP. Does phenylethylamine cause schizophrenia? Lancet, 1976, 1(7950): 70-71.）および、双極性障害（Boulton AA.: Some aspects of basic psychopharmacology: the trace amines. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1982; 6(4-6): 563-570; Sabelli HC et al., Clinical studies on the KM/29.04. 2005; phenylethylamine hypothesis of affective disorder: urine and blood phenylacetic acid and phenylalanine dietary supplements. J. Clin. Psychiatry, 1986 Feb; 47(2): 66-70.）に関連付けられた。さらに、微量アミンの調節不全は、注意欠陥多動性障害（Baker et al. Phenylethylaminergic mechanisms in attention-deficit disorder. Biol. Phychiatry, 1991, 29(1): 15-22)、パーキンソン病(Heller B and Fischer E., Diminution of phenethylamine in the urine of Parkinson patients. Arzneimittelforschung, 1973, 23(6): 884-886.）、片頭痛（D'Andrea G. et al. Elusive amines and primary headaches: historical background and prospectives. Neurol. Sci. 2003, 24 Suppl. 2.: S65-7; D'Andrea, G. et al., Elevated levels of circulating trace amines in primary headaches. Neurology, 2004, 62(10): 1701-1705.）、および、摂食障害（Wolf ME and Mosnaim AD. Phenylethylamine in neuropsychiatric disorders. Gen. Pharmacol,1983, 14(4): 385-390; Branchek TA and Blackburn TP. Trace amine receptors as targets for novel therapeutics: legend myth and tact. Curr. Opin. Pharmacol. 2003, 3(l): 90-97.）、即ち、ＰＥＡがこれまでに知られているもっとも強力な食欲低下化合物であるアンフェタミンと非常に高い構造上の類似性を有することから示唆されて、肥満症と食欲低下のような障害（Samanin R, and Garattini S.: Neurochemical mechanism of action of anorectic drugs. Pharmacol. Toxicol. 1993 Aug; 73(2): 63-68; Popplewell DA et al., A behavioural and pharmacological examination of phenylethylamine-induced anorexia and hyperactivity--comparisons with amphetamine. Pharmacol. Biochem. Behav. 1986 Oct; 25(4): 711-716.）、と関連付けられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、微量アミン受容体に関する知見の増加、特に、さらなる微量アミン受容体の同定に、広い関心が存在する。しかし、文献と公開データベースのエントリの調査から、微量アミン受容体の命名についての不整合が明らかになった。例えば、ヒト受容体ＧＰＲ１０２（Lee et al. Discovery and mapping of ten novel G protein-coupled receptor genes. Gene, 2001, 275(1): 83-91.）は、またＴＡ５（Borowski et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98(16): 8966-8971）とも呼ばれ、ヒト５−ＨＴ４Ψ（Liu et al., A serotonin-4 receptor-like pseudogene in humans. Brain Res. Mol. Brain Res. 1998, 53(1-2): 98-103.）は、またＴＡ２Ψとも名付けられている（Borowski et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98(16): 8966-8971）。さらに、ＧＰＲ５７（Lee et al. Cloning and characterization of additional members of the G protein-coupled receptor family. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1490(3): 311-323.）、ＧＰＲ５８（Lee et al. Cloning and characterization of additional members of the G protein-coupled receptor family. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1490(3): 311-323.）およびＰＮＲ（Zeng et al. Cloning of a putative human neurotransmitter receptor expressed in skeletal muscle and brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 242(3): 575-578.）は、これまで、一般にＴＡ受容体とは認められなかった。この不整合は、混乱と不確実性を引き起こす。したがって、この受容体ファミリーの明確な定義が強く求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
現行の命名法の曖昧さを解決するため、これらの受容体を微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）と呼ぶ新しい統一的な命名法を、本発明と共に提案する。この新しい命名法は、少なくともあるＴＡＡＲはＴＡに全く応答しないという発見を反映したものであり、それゆえ「関連」という用語を用いる。この命名法は、このＧＰＣＲファミリーの全ての受容体をカバーし、種々の種のいろいろな数の受容体遺伝子に適合している。新しい命名法は、厳密に各ヒト染色体上の受容体遺伝子の配列順序に基づいており、また同時に、さまざまな種に亘る受容体遺伝子の詳細な系統学的解析（図３）にも基づいている。この命名法は、次の規則を堅守する：
【０００６】
ａ）２つ（または３つ）のオーソログ遺伝子、即ち種形成事象により生じた遺伝子には、どれも同じ番号を付する。逆に、２つの遺伝子がもしオーソログでなければ、同じ番号を付してはならない。
【０００７】
ｂ）パラログ、即ち、１つの種の系統内で遺伝子重複事象により生じた遺伝子は、１字の添字によって区別する。
【０００８】
Ｃ）例：遺伝子ｈＴＡＡＲ５、ｒＴＡＡＲ５、ｍＴＡＡＲ５は、全てオーソログである。
マウスの遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、ｃは、パラログである。
遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、ｃは、全てｈＴＡＡＲ８のオ−ソログである。
【０００９】
本発明は、ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定された新しいポリペプチド、該ポリペプチドの薬物標的としての利用、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および、該ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、およびヒト以外の動物を提供する。さらに本発明は、ＴＡＡＲファミリーに特異的で選択的なフィンガープリントモチーフと、これの利用に関する。
【００１０】
本発明は、配列ＮＳＸＸＮＰＸＸＺＸＸＸＢＸＷＦ（配列番号１）を含むフィンガープリント配列を提供する；配列中、Ｘは自然に存在するいずれのアミノ酸でもよく、Ｚはチロシンまたはヒスチジン、Ｂはチロシンかフェニルアラニンでよい。ここで用いる「フィンガープリント」、「フィンガープリントモチーフ」、「フィンガープリント配列」という用語は、マウスＧＰＣＲサブファミリーＴＡＡＲに特異的で選択的なアミノ酸配列に関するものである。フィンガープリントモチーフは、機能的ＴＡＡＲに特異的であることが好ましい。トリプトファン残基は、フィンガープリントモチーフではもっぱらＴＡＡＲ中だけで見出され、どの他の既知のＧＰＣＲ中でも見出されない；むしろ他のＧＰＣＲ 中では、対応する配列位置は、ほとんど必ず極性を有する、または電荷さえ有するアミノ酸で占められている。フィンガープリントモチーフは、ＴＡＡＲ、好ましくは機能的ＴＡＡＲを同定するために用いることができる。
【００１１】
本発明はまた、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いてマウスＴＡＡＲを同定する方法を提供する。マウスＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるためには、ポリペプチドは１００％の同一性を持てば良い。
【００１２】
さらに、本発明は、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いて、他の種、好ましくは哺乳類ＴＡＡＲを同定する方法に関する。ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるためには、ポリペプチドは少なくとも、フィンガープリント配列と７５％の同一性、好ましくは８７％以上の、より好ましくは１００％の同一性を持てば良い。
【００１３】
フィンガープリント配列は、例えばＴＡＡＲファミリーメンバーを同定するための検索を、配列データベースに対して行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。そのような検索は、例えばＥＭＢＯＳＳのｆｕｚｚｐｒｏ（Rice et al., EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics, 2000, 16(6): 276-277）のようなパターン認識プログラムを用いて行うことができる。マウスＴＡＡＲに対する検索は、ｆｕｚｚｐｒｏを用い、ＮＳＸＸＮＰＸＸ［ＨＹ］ＸＸＸ［ＹＦ］ＸＷＦを必要配列とし、ミスマッチ数＝０、データベース＝ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ（リリース４３)、として実行できる。
【００１４】
マウスＴＡＡＲファミリーは、１６メンバー（ｍＴＡＡＲ１〜９）を含み、その中の１つは偽遺伝子：ｍＴＡＡＲ７ｃΨである。マウスＴＡＡＲファミリーメンバーをコードする全ての遺伝子が、第１０染色体の同一領域（１０Ａ４）に位置する。２個のエクソンでコードされるｍＴＡＡＲ２を例外として、全てのＴＡＡＲ遺伝子をコードする配列が、単一のエクソン中に存在する。
【００１５】
ここで用いる「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連したＤＮＡの任意のセグメントを表す。遺伝子は、特定の染色体上の特定の位置に存在し、特定の機能的生産物をコードするヌクレオチドの順序づけられた配列である。
【００１６】
ここで用いる「偽遺伝子」という用語は、活性を有する祖先遺伝子から突然変異事象によって進化した可能性のある不活性な遺伝子のことである。不活性であるとは、遺伝子が機能を有するポリペプチドに翻訳されないことを意味する。
【００１７】
本発明は、配列番号５の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）として同定され、ｍＴＡＡＲ２と命名された。
【００１８】
ここで用いる「ポリペプチド配列」（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、など）という用語は、自然に存在するアミノ酸から成るアミノ酸のポリマーをいう。
【００１９】
「単離された」との用語は、「人間の手によって」自然状態から変えられたことを意味する。もし、「単離された」組成物または物質が、自然界に見いだされる場合、それは変化させられたか、元の環境から移されたか、またはその両方である。例えば、生きている動物内に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、しかし自然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ここで採用した用語に従って、「単離され」ている。
【００２０】
「組換え型」という用語は、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連して用いられた場合、概して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、異種（または外来）の核酸の導入または天然の核酸の改変によって修飾されたこと、またはタンパク質またはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入によって修飾されたこと、を示す。
【００２１】
本発明はさらに、ポリペプチドｍＴＡＡＲ２をコードする配列番号４を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２２】
ここで用いる「ポリヌクレオチド配列」（例えば、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、など）という用語は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇを含むヌクレオチドのポリマーについて用いられる。
【００２３】
本発明はさらに、配列番号７の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ３と命名された。
【００２４】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ３をコードする配列番号６を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２５】
本発明はさらに、配列番号９の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ４と命名された。
【００２６】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ４をコードする配列番号８を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２７】
本発明はさらに、配列番号１１の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ５と命名された。
【００２８】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ５をコードする配列番号１０を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２９】
本発明はさらに、配列番号１３の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ６と命名された。
【００３０】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ６をコードする配列番号１２を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００３１】
本発明はさらに、配列番号１５の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ａと命名された。
【００３２】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ａをコードする配列番号１４を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００３３】
本発明はさらに、配列番号１７の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｂと命名された。
【００３４】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｂをコードする配列番号１６を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００３５】
本発明はさらに、配列番号２２の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｄと命名された。
【００３６】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｄをコードする配列番号２１を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号２４の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｅと命名された。
【００３８】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｅをコードする配列番号２３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号２６の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｆと命名された。
【００４０】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｆをコードする配列番号２５を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４１】
本発明はさらに、配列番号２８の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ８ａと命名された。
【００４２】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ８ａをコードする配列番号２７を含む単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４３】
本発明はさらに、配列番号３０の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ８ｂと命名された。
【００４４】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ８ｂをコードする配列番号２９を含む、単離された、または組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号３２の配列を含む、単離された、または組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ８ｃと命名された。
【００４６】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ８ｃをコードする配列番号３１を含む、単離された、または組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４７】
本発明はさらに、配列番号３４の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ９と命名された。
【００４８】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ９をコードする配列番号３３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４９】
ＴＡＡＲファミリーの他のメンバーｍＴＡＡＲ１は、配列番号２のポリヌクレオチド配列および配列番号３のポリペプチド配列を持ち、以前に記載された（Borowsky, B. et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.(2001)98(16),8966-8971）。
【００５０】
本発明はまた、ｍＴＡＡＲ７ｃΨ（配列番号１８）のヌクレオチド配列を提供する。さらにまた本発明は、ｍＴＡＡＲ７ｃΨの修復されたポリヌクレオチド配列（配列番号１９）を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｍＴＡＡＲ７ｃ（配列番号２０）によってコードされるポリヌクレオチド配列を提供する。ここで用いる「修復された遺伝子」または「修理された遺伝子」という用語は、遺伝子が活性型になるように配列が変えられた偽遺伝子を指す。すなわち、ｈＴＡＡＲ３のポリヌクレオチド配列は、早期終止コドンを生じた突然変異によって不活性である。この配列は、１３３〜１３４の位置（図４参照）の２個のヌクレオチドの挿入によって修復された。
【００５１】
本発明はまた、フィンガープリント配列（配列番号１）を含みかつ配列番号３の配列とは異なるアミノ酸配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。
【００５２】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドの薬物標的としての使用に関する。本発明のポリペプチドは、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的として用いられるのが好ましい。この薬物標的は、薬学的に活性のある化合物の設計、スクリーニング、および開発にとって適切なものであり得る。
【００５３】
本発明の１つの実施形態は、薬物標的としての、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のポリペプチド配列を有するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的として用いられるのが好ましい。
【００５４】
本発明のもう１つの実施形態は、フィンガープリント配列を含み配列番号３の配列とは異なるアミノ酸配列有する、薬物標的としてのマウス受容体に関する。これらの受容体は、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的とするのが好ましい。
【００５５】
「本発明のポリペプチド」という用語は、本発明によって提供される新しいポリペプチド、即ちｍＴＡＡＲ２〜９を指す。
【００５６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターによって形質導入された宿主細胞、および組換技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。ベクターは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、または 配列番号３３、を含むポリヌクレオチドを含むことが好ましく、そして、宿主細胞は該ベクターによって形質導入されていることが好ましい。
【００５７】
宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドの発現系または発現系の一部を組み込むために、遺伝子工学による操作（例えば、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション）がされていてもよい。ベクターの宿主細胞への導入は、Davis et al. Basic methods in molecular biology. Elsevier, New York（1986); Davis JM（ed.): Basic cell culture: a practical approach, sec. edition. Oxford University Press（2002); R. Ian Freshney: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, fourth edition. John Wiley & Sons（Sd）1999; and Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（1989),のような、多くの標準実験室マニュアルに記載されている方法、即ち、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などのような方法によって、実現できる。
【００５８】
宿主細胞は、ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ，ＣＯＳ，ＨｅＬａのような哺乳動物細胞；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，ＰＣ１２，ＨＮ−１０（Lee HJ, Hammond DN, Large TH, Roback JD, Sim JA, Brown DA, Otten UH, Wainer BH.: Neuronal properties and trophic activities of immortalized hippocampal cells from embryonic and young adult mice. J. Neurosci. 1990 Jun; 10(,6): 1779-1787.）、IMR-32, NB41A3, Neuro-2a, TE 671のような、神経、神経内分泌、神経芽腫、またはグリアの細胞系統；ラット、マウスのような哺乳動物の一次神経またはグリア細胞；アフリカツメガエル卵母細胞；連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、放線菌および枯草菌の細胞のようなバクテリア細胞；酵母やコウジカビ細胞のような真菌類細胞；ショウジョウバエＳ２、ヨトウガＳｆ９細胞のような昆虫細胞；および植物細胞でよい。
【００５９】
非常に多様な発現系を用いることができる。そのような発現系には、他のものの中に、染色体、エピゾーム、および、ウイルスから導かれる系、即ち、バクテリアのプラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、酵母のエピゾームから、酵母の染色体要素から、ウイルス(例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、牛痘ウイルス、アデノウイルス、鳥類ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）から、導かれるベクターが含まれる。また、これらの結合から導かれるベクター、即ちコスミドおよびファージミドのような、プラスミドとバクテリオファージの遺伝要素から導かれるベクターも含まれる。発現系は、発現を生じさせると共に制御する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中でポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチドを維持し、伝播し、または発現するのに適した系またはベクターは、どれでも使用できる。適切なヌクレオチド配列は、種々の周知・慣用技術のいずれによっても、例えば、Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y.（1989）or Borowski et al Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc Natl Acad Sci USA（2001）98(16): 8966-71）に記載されているような技術によっても、発現系に挿入することが可能である。
【００６０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。ヒト以外のトランスジェニック動物は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、または配列番号３３を含むポリヌクレオチドを含むのが好ましい。
【００６１】
ヒト以外のトランスジェニック動物は、周知のヒト以外の動物であればよい。好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック動物は齧歯類である。最も好ましくは、本発明のトランスジェニック動物はマウスである。
【００６２】
ヒト以外のトランスジェニック動物を作り出す方法は周知技術であり、例えば、Hogan, B.C., F; Lacy, E, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 1986, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Hogan, B., et al., Manipulating the mouse embryo. 1994, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, および Joyner, A.（ed.): Gene Targeting - A Practical Approach, Second Edition. Practical Approach Series, Oxford University Press 1999, に記載されているような方法である。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、受容体に結合する化合物および本発明の受容体ポリペプチドを活性化し（アゴニスト）または活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）、または例えば受容体の輸送に作用することによって受容体の機能を調節する化合物、をスクリーニングする過程において採用することができる。
【００６４】
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって：
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物と接触させること、および
ｂ）化合物が本発明のポリペプチドと結合するか否かを決定すること、
を含む方法を提供する。
【００６５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生物学的活性またはその発現に対して、刺激または阻害作用を有する化合物を同定するための方法であって、
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物と接触させること、および
ｂ）該化合物が本発明のポリペプチドの機能または活性をモジュレーションしたか否かを決定すること、
を含む方法を提供する。
【００６６】
一般に、上述のようなスクリーニングの手順は、本発明の受容体ポリペプチドを表面に発現する適当な細胞の産生を必要とするが、しかし、適当な細胞に発現した受容体は、細胞内に局在してもよい。そのような細胞は、哺乳動物、アフリカツメガエル、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞を含む。次に、受容体を発現している細胞（または、発現した受容体を含む細胞膜）をテスト化合物と接触させ、結合、または機能的応答の刺激または阻害を測定する。
【００６７】
一つのスクリーニング技術は、本発明の受容体の発現細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３）を、受容体活性化に起因する細胞外ｐＨ変化または細胞内カルシウム変化を測定するシステムにおいて使用することを特徴とする。この技術では、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現している細胞と接触させる。次に、セカンドメッセンジャー応答、例えば、信号変換、ｐＨ変化、ＰＩ加水分解、ＧＴＰ−γ−［３５Ｓ］放出、またはカルシウムレベル変化を測定し、候補化合物が受容体を活性化するか阻害するかを決定する。
【００６８】
もう１つの方法は、受容体阻害剤のスクリーニングを、受容体が媒介するｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の阻害または刺激の測定によって行うことを特徴とする。この方法では、真核細胞に本発明の受容体をトランスフェクションして、受容体を細胞表面に発現させることが必要である。その細胞は次に、本発明の受容体存在下で、候補アンタゴニストに晒される。次にｃＡＭＰの蓄積量を測定する。もし候補アンタゴニストが受容体に結合し、その結果受容体結合を阻害すれば、受容体に媒介されたｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性のレベルは減少するか増加することになる。
【００６９】
本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出するもう１つの方法は、U.S. Patent 5,482,835記載の酵母を基礎にした技法である。
【００７０】
測定は、単に候補化合物の結合をテストすればよく、受容体を有する細胞への付着を、候補化合物と直接または間接的に関連するラベルを用いて、またはラベルされた競合物との競争を含む測定によって検出する。さらに、これらの測定法では、候補化合物が、受容体の活性化によって信号を発生させる結果になるか否かを、受容体を表面に有する細胞に適切な検出システムを用いてテストしてもよい。活性化阻害剤は、一般に、既知のアゴニスト存在下で検定し、候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響を観測する。そのようなスクリーニング検定実施の標準的方法は、従来技術においてよく理解されている。
【００７１】
本発明のポリペプチドの候補アンタゴニストの例としては、抗体、または、ある場合には、本発明のポリペプチドのリガンドと密接に関連したオリゴヌクレオチドまたはタンパク質で、例えば、リガンドの断片、または例えば神経伝達物質の、またはアミノ酸の代謝物のような小分子量の分子であって、受容体に結合するが応答を出さないために受容体の活性が阻止されるもの、を含む。
【００７２】
ここまで一般的に本発明を記述してきたが、同じことが特定の実施例を参照することでより良く理解できるようになる。実施例は説明のみの目的でここに含まれており、特にそうではないと断らない限り、図に関連づけて限定することを意図したものではない。
【００７３】
【表１】
【００７４】
表１：微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）の新しい命名法
公表された配列データと本発明により提供された配列との不整合が検出された全ての遺伝子および、新しく同定されたＴＡＡＲには下線を付してある。Genbank登録番号は、公表された遺伝子および、公表された配列と本発明により提供された配列との不整合を紹介している。ＴＡＡＲ遺伝子のクローニングと配列分析は、ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（ヒト脳の全ＲＮＡに由来する、Stratagene社）を採用して、標準プロトコルに従って行なわれた。（ｎｔ＝ヌクレオチド配列；ａａ＝アミノ酸配列）。
【実施例】
【００７５】
実施例において言及する市販の試薬は、特に明記しない限りメーカーの指示に従って用いた。
【００７６】
実施例1：ＴＡＡＲファミリーメンバーの同定
ＴＡＡＲ遺伝子を、以前に公表されたＴＡＡＲ受容体遺伝子と、Genbankから入手可能なヒト、ラット、およびマウスのゲノム配列情報（表１も参照のこと）とを、ＢＬＡＳＴのような標準アルゴリズムを使用して比較することにより、同定した。
【００７７】
この配列情報に基づき、ＴＡＡＲ遺伝子を、それぞれの種のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかから、ＰＣＲにより増幅した。さらに指定しない場合は、すべての手順を基本的には、Sambrook, J., Fritsch, E.F.,und Maniatis, T.（1989). Molecular Cloning: A laboratory manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press）の記載に従って実施した。全ての試薬は入手できた最高純度のものであり、全ての溶液および試薬は特に明記しない限り使用前に滅菌した。
【００７８】
この目的のため、オリゴヌクレオチドプライマ−（表２）を、Ｇｅｎｂａｎｋで利用できるゲノム配列情報から導かれるＴＡＡＲコーディング配列に基づいて設計した。プライマーは、アンプリコンが読み枠全体を含むように設計した。プライマーを、主にVectorNT1 ソフトウエア（VectorNT1、version 9.0.0, Informax）を用い、ＰＣＲプライマーの標準規則に従って設計した：ａ）プライマーは、１８〜２５ヌクレオチドの長さを有するべきであり、ｂ）約５０％のＧ／Ｃ含量を持ち、ｃ）３ヌクレオチド以上長い逆方向の反復を含むべきでなく、ｄ）少なくとも５’端にＧかＣを有するべきであり、ｅ）３個より多くの同じヌクレオチドの単純な繰り返しを有するべきでなく、そして、ｆ）同じＰＣＲ反応で用いられるプライマーのアニーリング温度（ＴＭ）の違いはできる小さくすべきである（詳しくは、例えば、McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R.（eds.): ＰＣＲ 2 - A Practical Approach. The practical approach series, Oxford University Press, 1995, ISBN: 0-19-963424-6 を参照のこと）。プライマーオリゴヌクレオチドのアニーリング温度を、Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA.: Predicting ＤＮＡ duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986 Jun;83(11): 3746-3750、に記載された規則に基づいて計算した（この規則は、配列が対称的でなく、少なくとも１個のＧまたはＣを含み、最小８ヌクレオチドの長さを有することを仮定している）。オリゴヌクレオチドは、Microsynth 社（Microsynth AG, Schutzenstrasse 15, 9436 Balgach, Switzerland）にＨＰＬＣ精製品質のものを注文した。
【００７９】
【表２】
【００８０】
表２：ｍＴＡＡＲクローニング用プライマー
ｍＴＡＡＲ２：ｍＴＡＡＲ２をｃＤＮＡからクローニングした主な理由は、対応する遺伝子転写物が実際に２つのエクソンを含んでいるか否か確かめるためであった。この実験とは独立に、２個のコーディングエクソンを、ゲノムＤＮＡから別々にクローニングした。（Tm：℃で表した融解温度で、 Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA.: Predicting ＤＮＡ duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, Jun;83（11):3746-3750、に従い計算した； プライマー名中の５は、５’プライマー（即ち、ｍｕｓＴＡＲ３＿５＿０１）を示し、プライマー名中の３は、３’プライマーを示す）。
【００８１】
実際のＰＣＲ反応物は、総体積５０μｌで次の組成であった：５〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに等しく、１００〜２００ｎｇの全ＲＮＡ（入手先は以下で特定）相当量である鋳型、２００ｎＭオリゴヌクレオチドプライマー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Invitrogen）、２００ｍＭ各ｄＮＴＰ（Invitrogen）、１×濃縮ＰＣＲ反応緩衝液（Invitrogen）、および ５Ｕ／反応物の組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）。ＰＣＲ反応物を、ＵＶ照射装置を有する殺菌作業ベンチ下で集め、ａ）鋳型材料の調製、ｂ）ＰＣＲ反応物の集成、ｃ）ＰＣＲ反応とアガロースゲル電気泳動の実施、およびｄ）プラスミドの調製、は、それぞれ別々の部屋で行った。試薬と、ＰＣＲで増幅した材料またはプラスミドＤＮＡとの間で起こりうる交差汚染を避けるためである。ＰＣＲ反応物を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む２００μｌのＰＣＲカップ（Eppendorf）に室温（ＲＴ）で集め、９５℃に予熱したサーモサイクラー（Geneamp 9700 金ブロック付き、Applied Biosystems）に移した。温度条件を次のように調整した。
【００８２】
【表３】
【００８３】
アニーリング温度：低い方のＰＣＲ反応Ｔｍ（融解温度）値（上に特定した方法で計算したもの）を有するオリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ−１℃を、アニーリング温度として用いた。例：プライマー１のＴｍ＝５５℃、プライマー２のＴｍ＝５７℃である２つのプライマー⇒アニーリング温度：５４℃。
【００８４】
伸長時間を、アンプリコンの長さ（ｋｂ単位）×１分、で計算した。
【００８５】
サイクル数：各遺伝子に対して、いくつかのＰＣＲ反応をサイクル数２５〜４０で平行して行った。その後全てのＰＣＲ反応物を、アガロースゲル電気泳動で分析し、明らかに視認できる正しいサイズのＰＣＲ産物が生産されている中で、最低のサイクル数のＰＣＲ反応物を、次のクローニングに用いた。
【００８６】
ＰＣＲ産物を、１％超純粋アガロース（GibcoBRL）を用いてTAE 緩衝液（Invitrogen）中で作成したアガロースゲルの電気泳動によって分析した。アガロースゲル泳動を、PerfectBlue Horizontal Mini Electrophoresis System（Pequlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany）を用い、標準プロトコル(Sambrook et al., 1989）に従って行った。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＰＣＲ産物をＵＶトランスイルミネーター（Syngene, Cambridge, UK）で可視化し、ＰＣＲ産物のサイズを、分子量標準１ｋｂ ＤＮＡラダー（Invitrogen）と比較して解析した。予想サイズのＰＣＲ産物を、ゲルから滅菌したメス（Bayha, Tuttlingen, Germany）で切り取り、アガロースゲル切片からQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN AG, Basel, Switzerland）を用い、メーカーの指示に従って抽出した。
【００８７】
抽出したＰＣＲ産物を、冷エタノール／酢酸ナトリウム沈殿（Sambrook et al., 1989)によって沈殿させ、ＤＮＡペレットを１０μｌの１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．５に溶解した。次に、この溶液中のＰＣＲ産物を、配列決定用ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen；ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターを含むキットを使用）を用い、メーカーの指示に従ってクローニングした。ライゲーション産物を、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなバクテリア（配列決定用ＴＯＰＯクローニングキットに含まれる）中にメーカーの指示に従って入れて形質転換し、次いで１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma, Division of FLUKA Chemie GmbH, Buchs, Switzerland）を含むＬＢ寒天プレートにプレートし、３７℃１晩インキュベートした。バクテリアのコロニーを「miniprep PCR」と呼ばれる方法によって分析した。すなわち：コロニーを滅菌した接種ループ（Copan Diagnostic S.P.A., Brescia, Italy）を用いて採取し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む新しいＬＢ寒天プレートに移した。次に同じ接種ループを、それぞれ１．５ｍｌ Eppendorfカップ（Eppendorf）中の５０μｌの１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．５に入れ、ループ上に残っているバクテリアを溶液中に移した。次にこのバクテリア懸濁液を９５℃５分間熱し、得られる溶菌液の、ＰＣＲ反応物５０μｌ当たり１μｌを、ＰＣＲ反応の鋳型に用いた。プライマーには、プラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯの複数クローニング部位の両側に接着するプライマー（Ｔ７と逆Ｍ１３、配列：プライマー“Ｔ７”：５’−ｃｇｇｇａｔａｔｃａｃｔｃａｇｃａｔａａｔ−３’、プライマー“逆Ｍ１３”：５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応物を、上述のように集成し、次の温度概要で実施した：
【００８８】
【表４】
【００８９】
ＰＣＲ産物を、上述通り、アガロースゲル電気泳動によって分析した。上に概説した方法によって、予想サイズのクローニングされたＤＮＡ断片が検出されたバクテリアのコロニーを、次のプラスミドの調製のために用いた。
【００９０】
プラスミドの調製のため、「miniprep PCR」によって予想サイズの挿入を有すると同定されたバクテリアのコロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地のバクテリア液体培養液への植付けに用い、培養液は水平シェイカーで、３７℃、一晩インキュベートした（Sambrook et al. 1989）。プラスミドを、バクテリア液体培養液からHiSpeed Plasmid Maxi Kit（QIAGEN AG, Basel, Switzerland）を用い、メーカーの指示に従って単離した。プラスミド濃度をＵＶ／可視分光光度計ultrospec 3300 pro（Amersham Biosciences Europe GmbH, Otelfingen, Switzerland）を用い、２６０ｎｍのＯＤを測定して決定した。単離したプラスミド中の挿入のサイズを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌ（New England Biolabs, products distributed in Switzerland by Bioconcept, Allschwil, Switzerland）を用いた制限酵素消化によって解析した；ＥｃｏＲＩの制限部位がｐＣＲ４−ＴＯＰＯとｐＣＲ２．ｌ−ＴＯＰＯの両ベクターの複数クローニング部位の両側にあり、それ故、クローニングされた挿入を、ＥｃｏＲＩ制限酵素消化によりプラスミドから切り離すことができる。各プラスミドの０．５μｇを、ＥｃｏＲＩを用い、全容積２０μｌ中でメーカーの推奨に従って消化した。制限酵素消化産物を、上記通りアガロースゲル電気泳動により分析した。予想サイズの挿入を有することが制限酵素解析によって明らかになったプラスミドは、外部会社（Microsynth社、Schutzenstrasse 15,9436 Balgach、Switzerland）によるＤＮＡ配列分析に付した。
【００９１】
ＤＮＡ配列分析で明らかになった、クローニングされたＴＡＡＲ遺伝子読み枠のＤＮＡ配列を、これまでに公表された配列、および／または、ゲノム配列情報から検索したＴＡＡＲ遺伝子の配列と比較した。ＰＣＲ反応によって導入された可能性があるＤＮＡ配列情報のエラーを、各ＴＡＡＲ遺伝子ごとに、独立したＰＣＲ反応によってクローンニングされた２〜３のＤＮＡプラスミドの配列を比較して、除去した。：独立なＰＣＲ反応において同じＰＣＲエラーが全く同じ位置で起こる確率は基本的にゼロであるので、各々の遺伝子に対する独立の配列が一致することによって、きわめて正しいＤＮＡ配列が明らかになった。
【００９２】
鋳型材料：我々は、可能な場合には、同じ近交系の、ゲノム配列情報をＧｅｎｂａｎｋで利用できた系統から得られる標準化された鋳型材料を用いるように特別の注意を払った。Ｃ５７ＢＬ／６のマウス、またはこのマウス系統に由来するゲノムＤＮＡを、Jackson Laboratory（600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 USA)から購入し、近交系 Crl:Wi のラットを、Charles River Laboratories France（Les Oncins,France; belongs to Charles River Laboratories,Inc 251 Ballardvale Street, Wilmington, MA 01887-1000,USA)から購入した。成体Crl:Wiラットから生体組織採取した尾部のゲノムＤＮＡを、基本的に：Laird PW, Zijderveld A, Linders K, Rudnicki MA, Jaenisch R, Berns A.: Simplified mammalian ＤＮＡ isolation procedure. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19（15): 4293に従って調製した。ＤＮＡ濃度を、上述のように２６０ｎｍのＯＤを測定して決定し、ＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／μｌに調整した。ＤＮＡを小分けして４℃で保存した。ヒトゲノム遺伝子をStratagene から購入した。
【００９３】
ｃＤＮＡを商業的に購入するか（ヒト:ヒト脳,小脳のMarathon-Ready cDNA, BD Biosciences Clontech）、または、全ＲＮＡから作成した。ＲＮＡを商業的に購入するか（ヒト:ヒト成人全脳, 男性,全ＲＮＡ, Stratagene, Stratagene Europe, P.O. Box 12085 1100 AB Amsterdam, The Netherlands）、または生後３日目のＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＣｒｌ：Ｗｉラットの幼獣から下記のようにして抽出した。
【００９４】
ＲＮＡの単離：
ＲＮＡを、組織サンプルから基本的にChomczynski,P. and Sacchi, N.: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.（Analytical Biochemistry（1987）162, 156-159）に従って分離した。ＲＮＡを取り扱う基本的な規則および原理は、Sambrook et al.(1989)に詳述されている。
【００９５】
ラットまたはマウスの幼獣を、断頭によって殺した。脳全体を取り出し、重さを量り、５ｍｌのガラスホモジナイザーに移し、１０×体積のTrizol試薬（Invitrogen）中でホモジネートした。全ＲＮＡをこのホモジネートからメーカーの指示に従って抽出した。各半脳に由来するＲＮＡ沈殿物を、１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．０ ２００μｌに溶かした。微量のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ分解酵素Ｉ消化（１０μｌの１００μＭ ＭｇＣｌ２と５μｌ ＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅ Ｉ，１０３Ｕ／μｌ，Ｒｏｃｈｅを加え３７℃１時間インキュベート）して除いた。ＤＮＡ分解酵素Ｉを、溶液からSambrook et al.(1989)に従いフェノール／クロロフォルム抽出（Ｈ２Ｏ飽和フェノールｐＨ７．０，Ｓｉｇｍａ）によって除いた。ＲＮＡを、冷エタノール／酢酸ナトリウム沈殿で沈殿させ（Sambrook et al.1989）、１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．０に溶解し、ＲＮＡ濃度を、上記通り２６０ｎｍ ＯＤを測定して決定した。このＲＮＡ標品を、ｃＤＮＡの合成に用いた。
【００９６】
ｃＤＮＡ合成：１．５ｍｌ Eppendorfカップ中で：総量１１μｌ中に２μｇ全ＲＮＡと１μｌの０．５μｇ／μｌオリゴｄＴ１２〜１８（Invitrogen）を混合した。混合物を７０℃１０分間加熱し、氷上に置き、次の試薬を加えた：
【００９７】
５×反応緩衝液４μｌ（酵素と共に加える）、ＤＴＴ ２μｌ（酵素と共に加える）、ｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）１μｌ、ＲＮＡｓｅ阻害剤ＲＮＡｓｅ−ＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μｌ、Superscript II逆転写酵素（Invitrogen）０．８μｌ。反応物を短時間ボルテックスし、１時間４２℃でインキュベートし、酵素を７０℃１０分間保温して不活性化し、反応物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．０で最終体積１００μｌにした。ｃＤＮＡを使用に先だって小別けにし、−８０℃で保存した。
【００９８】
一般に、ＰＣＲ反応による配列エラーと、鋳型材料から導入される多型性による配列エラーを取り除くため、特別な処置を講じた： a)サイクル数：それぞれのＴＡＡＲ遺伝子に対して、サイクル数の異なる数回のＰＣＲ反応を行い、特定の生産物をクローニングに十分な量だけ供給した、最低サイクル数のＰＣＲ反応物を用いた。ｂ）遺伝子当たり数個の独立なクローン：各ＴＡＡＲ遺伝子は、独立のＰＣＲ反応によって２〜３回クローニングし、正しい配列を、これらの独立に生成されたプラスミドの配列の一致から推測した：あるＰＣＲエラーが、全く同じ位置で複数の独立なＰＣＲ反応において起こる可能性は基本的にゼロであるので、これらのプラスミドの配列のアライメントは、遺伝子のきわめて正しい配列をもたらす。Ｃ）標準化された鋳型材料：近交系の系統間の差異は、配列情報に重大な不整合をもたらすため、我々は、ＴＡＡＲ遺伝子クローニングのために用いる鋳型材料の選択にも特別の注意を払った：マウス・ゲノムＤＮＡをJackson Laboratory（600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 USA；近交系Ｃ５７ＢＬ／６のゲノムＤＮＡを使用した。この系統が、Genbankでマウス・ゲノム配列データベースに採用されていたからである）から購入し、ヒトゲノムＤＮＡをStratageneから購入し、また、ラット・ゲノムＤＮＡをCharles River Laboratories France（Les Oncins, France； belongs to Charles River Laboratories, Inc., 251 Ballardvale Street, Wilmington, MA 01887-1000,USA；ラット系統Crl:Wiを選択した。この系統がGenbank でラット・ゲノム配列データベースに採用されていたからである）から購入した近交系Ｃｒｌ：Ｗｉのラットから単離した。ｃＤＮＡ合成のために、ラットとマウスの全脳の全ＲＮＡを、Ｃｒｌ：ＷｉラットまたはＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれかの生後３日の幼獣から、Trizol試薬を採用し、メーカーの推奨に従って単離した。ヒト全脳ＲＮＡを、Stratageneから購入した。ｃＤＮＡを、Invitrogenから購入したSuperScriptII逆転写酵素とAmersham から購入したｄＮＴＰを使用し、メーカーの推奨に従って合成した。
【００９９】
実施例２： 細胞培養および安定した細胞系統の生成
ａ）サブクローニング：哺乳類の細胞系統でＴＡＡＲ受容体を発現させるために、ＴＡＡＲの全読み枠を所持しているＤＮＡ断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯまたはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）から、ｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２（Rees S et al., Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibiotic-resistant cells to express recombinant protein. Biotechniques,1996 Jan;20(1）: 102-4, 106, 108-110）へサブクローニングした。
【０１００】
この目的のため、ＴＡＡＲの全読み枠を有するＤＮＡ断片を、それぞれのＴＯＰＯベクターから、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化および、それに続く上述のような〜１ｋｂの断片のアガロースゲル電気泳動による精製およびゲルからの抽出により切り離した。平行して、ｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターを、ＥｃｏＲＩによって線状化し、エビのアルカリフォスファターゼ（Roche）によりメーカーの指示書に従って脱リン酸化した。ＴＡＡＲの全読み枠を有するＤＮＡ断片を、線状化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を用いてライゲーションした。線状化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクター３０ｎｇ、各ＴＡＡＲコーディング配列を有するＤＮＡ断片１００〜３００ｎｇ、１×ライゲーション緩衝液（最終濃度；酵素を１０×濃縮物として加えた）および、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌを、全容量２０μｌに混合した。反応は、室温で２〜３時間進行させ、ライゲーション産物を、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細胞中に、ＴＯＰＯライゲーションの項に記載したようにしてトランスフォームした。形質転換されたバクテリアのプレートおよびバクテリアのクローン採取を、先にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからのＴＡＡＲ遺伝子のＰＣＲクローニングの項で述べた通りに行った。採取したバクテリアクローンを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ ５ｍｌ中の液体培養に接種するために使用した。この液体培養物を、QlAprep Miniprep Kit（QIAGEN）を用いた小規模なプラスミド調製のために、メーカーの指示書に従って用いた。精製したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２由来のプラスミドの構成物を、予想サイズの挿入の存在を確認するため、ＥｃｏＲＩとアガロースゲル電気泳動を用いた制限酵素分析によって分析した。予想サイズの挿入を有することを確認したプラスミドについては、挿入の正しい方向性と配列を確かめるために、ＤＮＡ配列解析がMicrosynth社により行われた。正しい方向の正しい挿入を有するプラスミドを、哺乳類細胞系統でそれぞれのＴＡＡＲを発現させるために用いた。
【０１０１】
ｂ）細胞培養: 使用した基本的な細胞培養操作と技術は、Davis JM（ed.): Basic cell culture, sec. edition. Oxford University Press 2002, ISBN: 0199638535、に記載されている。ＴＡＡＲを、HEK細胞(ATCC number: CRL-1573; described in Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., und Nairn, R.（1977）Characteristics of a human cell line transformed by ＤＮＡ from human adenovirus type 5. Journal of General Virology 36, 59-74)中で発現させた。培地を、Invitrogen Cat.#31966-021の、Glutamax I、ピルビン酸ナトリウム、ピリドキシン、およびグルコース４，５００ｍｇ／Ｌを加えたＤＭＥＭ；ペニシリン／ストレプトマイシン；および熱不活性化されたウシ胎児血清１０％、で構成した。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen Cat. # 25300-062）を用い、１：１０〜１：３０の比率で、継代した。
【０１０２】
ｃ）安定した細胞系統：安定にトランスフェクションされた細胞系統生成のため、ＨＥＫ細胞を、各ＴＡＡＲのｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２発現ベクターにより、Lipofectamin 2000トランスフェクション試薬およびGlutamax添加Optimem 1還元血清培地（Invitrogen Cat. # 51985-026）を用い、Lipofectamine 2000データシート記載の推奨に従って、トランスフェクションした。２４時間後、トランスフェクション後の細胞をトリプシン処理し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した培養液で１：１０〜１：３００に希釈し、９０ｍｍ組織培養皿（Nunc）に移した。培養液を毎日入れ換えた。トランスフェクションの７〜１０日後、十分に単離されたクローンを観察し、直径が約３ｍｍに達した時に採取した。クローンの採取は、クローン全体を培養皿から１ｍｌ Ｇｉｌｓｏｎピペットを用いて分離し、クローンを、１．５ｍｌ Eppendorfカップ中でトリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen Cat. # 25300-062）を用いてトリプシン処理し、そしてそれらを４８ウエルの皿にプレートすることによって行ない、続いて、そこからより広い培養表面積（４８ウエル−１２ウエル−６０ｍｍ等）へと細胞を移動させることにより、細胞を拡大した。新しいプレートに細胞を移動させるときには、何時も注意深く細胞をトリプシン処理した。単一クローンを選択するとすぐに、培地のＧ４１８濃度を５００μｇ／ｍｌに減じた。
【０１０３】
個々のクローンを十分に拡大させた後、Amersham cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay（EIA）Systemによって、微量アミン（ｐ−チラミン、β−フニルエチルアミン（β−ＰＥＡ）、トリプタミン、オクトパミン）または、化合物のセレクション（５−ＨＴセロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン、ヒスタミン）を用いて、機能測定のテストをした。安定にトランスフェクションされた細胞系統生成の成功率は、テストしたクローンの約１／３であった。この高い成功率は、ｐＩＲＥＳベクターの使用により可能になった。このベクターから、ＴＡＡＲは、ＴＡＡＲコーディング配列とＮＥＯＲコーディング配列を有する２シストロンの転写物として、同じｍＲＮＡ分子中に発現される。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
表３：ｍＴＡＡＲ１の薬理学。表題の受容体を安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞が、リストした各化合物による刺激に応答して産生したｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ ＥＩＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Amersham）を用いて測定した。ＥＣ５０値を、μＭで示している（少なくとも３回の独立の実験の平均：ＥＣ５０値は、３０μＭ〜０．１ｎＭの範囲で均等に分布した１２の濃度で、各濃度点を二重にとって行った実験から計算してある）。最大応答は、ｐ−ＴＹＲによって誘導された最大ｃＡＭＰレベルのパ−セントで表示してある。ドーパミンについての実験では、ＥＣ５０値を、ｐ−Ｔｙｒａｍｉｎｅが到達するレベルと比較して５０％である最大ｃＡＭＰレベルに基づいて計算した。
【０１０６】
ｍＴＡＡＲ１以外の全てのｍＴＡＡＲについて、最小１０の独立なクローンをテストした。もし微量アミンまたは選択した重要な化合物のいずれにも応答するものが検出できなかった場合は、そのＴＡＡＲは、この一定のテスト条件では全く化合物に応答しないと結論した。
【０１０７】
ｃＡＭＰ測定：ｃＡＭＰを、Amersham社のcAMP Biotrak Enzymeimmunoassay（EIA）System を用い、製品マニュアルに記載されているように、いわゆる非アセチル化ＥＩＡ手順に従って測定した。一般の手順もまた、Notley-McRobb L. et al.,（The relationship between external glucose concentration and cAMP levels inside Escherichia coli: implications for models of phosphotransferase-mediated regulation of adenylate cyclase. Microbiology. 1997 Jun;143（Pt 6): 1909-18）および Alfonso A, de la Rosa L et al.（Yessotoxin, a novel phycotoxin, activates phosphodiesterase activity. Effect of yessotoxin on cAMP levels in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2003 Jan 15;65(2):193-208.）に記載されている。
【０１０８】
プロトコルに次の小修正を加えた：９６ウエルプレート中のHEK細胞を刺激後、予冷した（−２０℃）等量のエタノールを加えて反応を止めた。細胞の融解は、キットで供給された融解緩衝液を加えることによっては達成されなかったが、９６ウエルプレートを−８０℃に最短６時間（数日まで）移すことにより達成された。その後９６ウエルプレートの内容を５０℃で一晩乾燥させ、９６ウエルプレートに残った物質を測定緩衝液（キットの全ての試薬を再懸濁するための緩衝液）２００μｌに再懸濁した。再懸濁液を測定緩衝液で逐次希釈して測定した。
【０１０９】
系統学的分析
ヒト、マウス、ラットのゲノム配列（human：NCBI reference draft 34, July 2003; mouse：NCBI draft 32, October 2003; rat：Rat Genome Sequencing Consortium draft 3, June 2003）を、全ＴＡＡＲ遺伝子同定のための、特にこれまで未知で存在可能性のあるＴＡＡＲファミリーメンバーのための企業内ゲノム配列解析手段を利用して、スクリーニングした。このスクリーニングにより、ヒト、マウス、ラット全体で４４のＴＡＡＲ遺伝子が同定され、その中２２が新しい遺伝子（２つの偽遺伝子と１つのヒトＴＡＡＲ７遺伝子断片を含む）であり、１１遺伝子がこれまでに公表された配列と不整合であった。単純なＤＮＡおよびタンパク質の配列およびより複雑なパラメーター、例えばリガンドポケットベクターのＧＣＲＰ薬理作用団類縁関係およびＴＡＡＲ遺伝子の系統学的関係、とゲノム配列とを比較することにより、図３にリストしたＴＡＡＲ受容体は、ヒト、マウス、およびラットの完全なＴＡＡＲ受容体ファミリーを表しているという結論が強く支持される。ゲノム配列情報に基づくＴＡＡＲ遺伝子の同定は、ＴＡＡＲ２を除く全てのＴＡＡＲが単一のエクソンによってコードされているという事実によってきわめて容易になった。
【０１１０】
これに関連して、ヒト、マウス、およびラットのゲノムのＴＡＡＲ遺伝子配列を解析した（ヒトについては図１を参照のこと）。遺伝子は、全体としてヒトで約１０９ｋｂ（染色体６ｑ２３．１）、マウスで１９２ｋｂ（染色体１０Ａ４）、ラットで２１６ｋｂ（染色体１ｐ１２、全ての染色体領域はＬｏｃｕｓＬｉｎｋによって所属をきめた）の非常にコンパクトな領域にマップされ、同じ染色体領域に、他には注釈を付けたり予測したりする遺伝子は無かった。２つのエクソンによってコードされるＴＡＡＲ２を例外として、全てのＴＡＡＲ遺伝子のコード配列は単一のエクソンに位置し、３つの動物種すべてについて約１ｋｂの長さである点が非常に似通っている（範囲：９９９〜１０８９ｂｐ）。ヒト６番染色体の領域６ｑ２３．１は、統合失調症感受性座位として知られており（Levinson et al.,: Multicenter linkage study of schizophrenia candidate regions on chromosomes 5q, 6q, 10p, and 13q: schizophrenia linkage collaborative group III. Am.J.Hum.Genet. 2000 Sep;67(3): 652-63. Epub 2000 Aug 02.; Martinez et al., Follow-up study on a susceptibility locus for schizophrenia on chromosome 6q. Am.J.Med.Genet.1999 Aug 20;88(4): 337-43）、これが、精神障害に対する薬物標的としてのＴＡＡＲの可能性を明白に示すことを指摘するのは興味深いことである。
【０１１１】
ヒトＴＡＡＲ１〜５、ＴＡＡＲ６、８、および９は、逆方法の読み枠を有する遺伝子の２ブロックに配置されていることが見出された。最も著しいヒトと齧歯類の違いは、ヒトゲノムから機能的ＴＡＡＲ７パラログが完全に欠如していることである。ＴＡＡＲ７はラットにおいては全ＴＡＡＲファミリーのほとんど半分にあたるものであるが、これに対して、我々は、ｒＴＡＡＲ７ｈにきわめて高い類似性をもつ退化遺伝子断片のみをヒトにおいて検出した。さらに、ＴＡＡＲ３および４は、齧歯類では機能している受容体であるが、ヒトでは偽遺伝子である。ｈＴＡＡＲ３Ψと４Ψの偽遺伝子化はおそらく最近の出来事である。その理由は、これらの遺伝子が全体として非常によく保存されており、コーディング配列中の塩基対変化はそれぞれ２カ所と３カ所のみであり、これが遺伝子を機能的でなくしているからである。互いに異なる総数９個のラットのＴＡＡＲ７パラログ（２個の偽遺伝子ｒＴＡＡＲ７ｆΨとｒＴＡＡＲ７ｉΨを含む）と６個のマウスのＴＡＡＲ７パラログ（１個の偽遺伝子ｍＴＡＡＲ７ｃΨを含む）は、このように密接に関連している遺伝子のファミリー内での、著しい齧歯類間差異を表しており、これは、リガンドポケットベクターのＧＣＲＰ薬理作用団類縁関係の解析から求められた、個々のマウスおよびラットＴＡＡＲ間の、リガンド結合の顕著な差異予測に反映されている（以下を参照のこと）。全体としては非常に類似したタンパク質配列を有する受容体の予想リガンド結合ポケットに検出された顕著な差異は、全体のアミノ酸配列の同一性が、マウスおよびラットＴＡＡＲの薬理学的側面についての類似度を予測する適当な尺度ではないことを示しており、行動学的な動物モデルを開発するためには綿密な注意が必要であるという事実を示している。
【０１１２】
ヒトおよび齧歯類ＴＡＡＲ遺伝子のコンパクトな染色体配置と、各種内に存在する多数の非常に似通った遺伝子とが端緒となり、ＴＡＡＲ遺伝子の系統学的関係を３種全てに亘って解析した。系統学的解析は、ＴＡＡＲ遺伝子が推定上の共通祖先に由来し、そこから全８回の遺伝子重複事象を経て進化し、結果として霊長類と齧歯類の系統分離前に９個の遺伝子セットとなったことを示している（図２；共通の祖先からの遺伝子重複事象、ヒトと霊長類系統へと導く種形成、および齧歯類系統内の遺伝子重複はそれぞれ個々にひとまとめにしてそれぞれ数字１、２、３で表している）。７つのケースでは、ヒト、マウス、およびラットへと導く２つの種形成事象により、これらの遺伝子はさらに重複し、３つのオーソログセットとなった。齧歯類ＴＡＡＲ７と８のオーソログは、さらなるラットとマウスの系統内での独立の重複によって進化した。これらの出来事が上に概説した順序でのみ起こり得た点を指摘しておくことは重要である。
【０１１３】
系統樹の全体の構造は、直ちに、ＴＡＡＲファミリーが３つのサブグループ（図３の灰色の囲みによって示す）に区別されることを、われわれに示唆した。以下に詳述するように、サブグループの概念は、ＤＮＡ配列全体だけから推定される恣意的な区別ではなく、重要な機能的差異を反映していることが明らかになった。
【０１１４】
合計５つの偽遺伝子が、ヒト、ラット、およびマウスに存在する。全ての偽遺伝子は、小さな変化の導入によって、機能蛋白質に変換することができた。以下は偽遺伝子化を引起した可能性がある、最も明らかで確からしい突然変異事象である：ｈＴＡＡＲ３Ψは、早期終止を引き起こしている位置１３５の２塩基対（ＣＡ）の欠失のために偽遺伝子となった可能性が最も高い。Ｃｙｓを終止コドンに変える点突然変異（Ａ４１１Ｔ）と２つの挿入（Ｇ６０５、Ａ７５０）が、ｈＴＡＡＲ４Ψの偽遺伝子化を引き起こした可能性がある。ｒＴＡＡＲ７ｆΨは、他の全てのＴＡＡＲ７メンバーに比べて２つの明らかな相違、即ち、おそらく挿入事象によって引き起こされた位置７２６の付加塩基対１２個と、Ｔｒｐを終止コドンに変える点突然変異（Ａ５１５Ｇ）とを有する。２番目のラット偽遺伝子ｒＴＡＡＲ７ｉΨは、位置９０で１０塩基対を失っており、これが早期終止を引き起こしている。またｍＴＡＡＲ７ｃΨは、位置８９５（細胞内ループ３）で１５塩基対と、位置５１３で７塩基対を失い、これが早期終止を引き起こしている。まとめると、ＴＡＡＲファミリー内では、偽遺伝子化は、点突然変異、欠失、および挿入のような全ての可能な突然変異事象によって引き起こされたと思われる。その事象は、非常によく保存された全体の配列からみて、かなり最近起こったと思われる。そのような修復された偽遺伝子の薬理学は、進化のあいだに起こった適応過程に関連したＴＡＡＲの重要性について洞察を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１はマウスのＴＡＡＲ遺伝子の染色体上の局在を示す。染色体上のＴＡＡＲ遺伝子の相対的位置を、各遺伝子の単一のコーディングエクソンを表すボックスで示す。２個のエクソンによってコードされるｍＴＡＡＲ２については、ボックスは、読み枠の９５％以上を収める第２のコーディングエクソンの位置を示す。ボックスの幅は、それぞれのコーディング配列の長さに比例したものではなく、色は、本文で議論する受容体サブグループ内の区別を示す。ボックス上の矢印は、ｍＴＡＡＲ遺伝子の方向（→：順鎖方向の読み枠、←：逆鎖方向の読み枠）を示す。（Ψ＝偽遺伝子）
【図２Ａ−１】図２は、全ての機能的なＴＡＡＲのアライメントを示す。ヒト、ラット、およびマウスのＴＡＡＲ全てにおいて保存されているアミノ酸残基は、黒い影を付けて強調している。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントモチーフが、ＴＭ ＶＩＩに局在している。 機能的なヒトＴＡＡＲのアライメント。予想されたＴＭの位置：
【表６】
【図２Ａ−２】図２は、全ての機能的なＴＡＡＲのアライメントを示す。ヒト、ラット、およびマウスのＴＡＡＲ全てにおいて保存されているアミノ酸残基は、黒い影を付けて強調している。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントモチーフが、ＴＭ ＶＩＩに局在している。 機能的なヒトＴＡＡＲのアライメント。予想されたＴＭの位置：
【表７】
【図２Ａ−３】図２は、全ての機能的なＴＡＡＲのアライメントを示す。ヒト、ラット、およびマウスのＴＡＡＲ全てにおいて保存されているアミノ酸残基は、黒い影を付けて強調している。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントモチーフが、ＴＭ ＶＩＩに局在している。 機能的なヒトＴＡＡＲのアライメント。予想されたＴＭの位置：
【表８】
【図２Ｂ−１】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−２】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−３】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−４】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−５】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−１】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−２】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−３】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−４】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−５】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図３】図３は、ＤＮＡ配列に基づいたヒト、ラット、およびマウスにおけるＴＡＡＲ遺伝子の系統学的関係を示す。 その後に起こる遺伝子重複事象を、分岐点の数字で示す（（１）：推定共通祖先からの遺伝子重複；（２）：霊長類系統と齧歯類系統の分離へと導く種形成；（３）：マウスとラットの種へ導く遺伝子重複）。外集団は、ヒト５−ＨＴ４受容体との配列比較に基づいて配置された。ＴＡＡＲ遺伝子を、異なるサブファミリーごとにまとめて灰色の影を付けた囲みで示す。Ψ：偽遺伝子、＊：齧歯類ＴＡＡＲ７パラログ残遺物に類似した、ヒトゲノム中でラットＴＡＡＲ７ｈに最も高い類似性を有する遺伝子断片。スケール：ＪＴＴタンパク質距離。
【図４】図４は、偽遺伝子ｈＴＡＡＲ３（古い名称ＧＰＲ５７Ψ）の「修復」を示す：修理された読み枠の１３３〜１３４位置に２塩基対ＣＣが付加され、それによって、修復前は早期終止コドンＴＣＡであったものが修復された。
【図５Ａ】図５は、リガンドポケットベクター（計算モデルから決定された、その残基がおそらくリガンド結合に参加しているアミノ酸）の性質に基づく、ＴＡＡＲの類縁関係を示す。Ａ：Kratochwil et al.(2004)により推定した、ヒト、ラット、およびマウスＴＡＡＲタンパク質のリガンドポケットベクター（ＬＰＶｓ）。各ＴＡＡＲが、最も緊密に類似しているリガンド結合ポケットを有するタンパク質が互いに隣り合うように並べられている。アミノ酸残基の物理化学的性質が、着色した影によって示されている（青：疎水性／芳香族残基；緑：脂肪族極性残基；赤／深紫：陽電荷／陰電荷を有する残基；オレンジ／黄：グリシン／プロリン残基、これはＴＭドメイン中で屈曲を誘発している可能性がある；ピンク：ヒスチジン；淡青：チロシン）。それぞれのアミノ酸の膜貫通ドメイン（ＴＭ１〜７）中の位置が、細胞外ループＩＩ（ＥＣＩＩ）の位置と共に、図の下部のボックスで示されている。推定ＴＭ領域の正確な位置については、図２の説明を参照のこと。
【図５Ｂ】図５は、リガンドポケットベクター（計算モデルから決定された、その残基がおそらくリガンド結合に参加しているアミノ酸）の性質に基づく、ＴＡＡＲの類縁関係を示す。Ｂ：ＴＡＡＲタンパク質のリガンド結合ポケットの薬理作用団類似性の階層的ツリー表示。次のタンパク質は、「修復された偽遺伝子」として分析に含めた。かっこ中は修飾を示す：ｈＴＡＡＲ３Ψ（挿入：Ｃ１３５−、Ａ１３６−）、ｈＴＡＡＲ４Ψ（点突然変異：Ｔ４１１Ａ、欠失：−６０５Ｇ、−７５０Ａ）、ｍＴＡＡＲ７ｃΨ（挿入：Ｃ５１３−）、ｒＴＡＡＲ７ｆΨ（点突然変異：Ｇ５１５Ａ）、ｒＴＡＡＲ７ｉΨ（挿入：Ａ９０−）．スケールバー：薬理作用団多様性単位
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体のサブファミリーを形成するマウスの微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）に特異的で選択的なフィンガープリント配列を提供する。本発明はまた、このファミリーのメンバーとして同定されたマウスのポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、および新しいファミリーメンバーを含むベクター、宿主細胞、およびヒト以外の動物を提供する。さらに本発明は、マウスＴＡＡＲを同定する方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
微量アミン（ＴＡ）は、構造的に生体アミンに関連する内因性化合物であり、哺乳動物神経系で微量見出される。ＴＡは、神経末端に貯えられ、古くから知られている生体アミンと共に放出される。現在までに、ＴＡを唯一の伝達物質として用いるシナプスが存在するという証拠は無い。最近、特異的に微量アミンを結合する受容体が、Borowski et al.（Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98(16): 8966-8971.）および、Bunzow et al.(Amphetamine, 3,4-methylenedioxymethamphetamine, lysergic acid diethylamide, and metabolites of the catecholamine neurotransmitters are agonists of a rat trace amine receptor. Mol. Pharmacol.2001, 60(6): 1181-1188.)によって報告された。これらの受容体は、明らかに新しいＧＰＣＲファミリーである。
【０００３】
微量アミンの調節不全は、種々の精神障害、即ち、うつ病（Sandler M.et al.,Decreased cerebrospinal fluid concentration of free phenylacetic acid in depressive illness. Clin. Chim. Acta, 1979, 93(l): 169-171; Davis BA and Boulton AA. The trace amines and their acidic metabolites in depression--an overview. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1994, 18(1): 17-45.）、統合失調症（Potkin SG. et al. Phenylethylamine in paranoid chronic schizophrenia. Science. 1979, 206(4417): 470-471; Sandler M and Reynolds GP. Does phenylethylamine cause schizophrenia? Lancet, 1976, 1(7950): 70-71.）および、双極性障害（Boulton AA.: Some aspects of basic psychopharmacology: the trace amines. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 1982; 6(4-6): 563-570; Sabelli HC et al., Clinical studies on the KM/29.04. 2005; phenylethylamine hypothesis of affective disorder: urine and blood phenylacetic acid and phenylalanine dietary supplements. J. Clin. Psychiatry, 1986 Feb; 47(2): 66-70.）に関連付けられた。さらに、微量アミンの調節不全は、注意欠陥多動性障害（Baker et al. Phenylethylaminergic mechanisms in attention-deficit disorder. Biol. Phychiatry, 1991, 29(1): 15-22)、パーキンソン病(Heller B and Fischer E., Diminution of phenethylamine in the urine of Parkinson patients. Arzneimittelforschung, 1973, 23(6): 884-886.）、片頭痛（D'Andrea G. et al. Elusive amines and primary headaches: historical background and prospectives. Neurol. Sci. 2003, 24 Suppl. 2.: S65-7; D'Andrea, G. et al., Elevated levels of circulating trace amines in primary headaches. Neurology, 2004, 62(10): 1701-1705.）、および、摂食障害（Wolf ME and Mosnaim AD. Phenylethylamine in neuropsychiatric disorders. Gen. Pharmacol,1983, 14(4): 385-390; Branchek TA and Blackburn TP. Trace amine receptors as targets for novel therapeutics: legend myth and tact. Curr. Opin. Pharmacol. 2003, 3(l): 90-97.）、即ち、ＰＥＡがこれまでに知られているもっとも強力な食欲低下化合物であるアンフェタミンと非常に高い構造上の類似性を有することから示唆されて、肥満症と食欲低下のような障害（Samanin R, and Garattini S.: Neurochemical mechanism of action of anorectic drugs. Pharmacol. Toxicol. 1993 Aug; 73(2): 63-68; Popplewell DA et al., A behavioural and pharmacological examination of phenylethylamine-induced anorexia and hyperactivity--comparisons with amphetamine. Pharmacol. Biochem. Behav. 1986 Oct; 25(4): 711-716.）、と関連付けられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、微量アミン受容体に関する知見の増加、特に、さらなる微量アミン受容体の同定に、広い関心が存在する。しかし、文献と公開データベースのエントリの調査から、微量アミン受容体の命名についての不整合が明らかになった。例えば、ヒト受容体ＧＰＲ１０２（Lee et al. Discovery and mapping of ten novel G protein-coupled receptor genes. Gene, 2001, 275(1): 83-91.）は、またＴＡ５（Borowski et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98(16): 8966-8971）とも呼ばれ、ヒト５−ＨＴ４Ψ（Liu et al., A serotonin-4 receptor-like pseudogene in humans. Brain Res. Mol. Brain Res. 1998, 53(1-2): 98-103.）は、またＴＡ２Ψとも名付けられている（Borowski et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2001）98(16): 8966-8971）。さらに、ＧＰＲ５７（Lee et al. Cloning and characterization of additional members of the G protein-coupled receptor family. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1490(3): 311-323.）、ＧＰＲ５８（Lee et al. Cloning and characterization of additional members of the G protein-coupled receptor family. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1490(3): 311-323.）およびＰＮＲ（Zeng et al. Cloning of a putative human neurotransmitter receptor expressed in skeletal muscle and brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 242(3): 575-578.）は、これまで、一般にＴＡ受容体とは認められなかった。この不整合は、混乱と不確実性を引き起こす。したがって、この受容体ファミリーの明確な定義が強く求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
現行の命名法の曖昧さを解決するため、これらの受容体を微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）と呼ぶ新しい統一的な命名法を、本発明と共に提案する。この新しい命名法は、少なくともあるＴＡＡＲはＴＡに全く応答しないという発見を反映したものであり、それゆえ「関連」という用語を用いる。この命名法は、このＧＰＣＲファミリーの全ての受容体をカバーし、種々の種のいろいろな数の受容体遺伝子に適合している。新しい命名法は、厳密に各ヒト染色体上の受容体遺伝子の配列順序に基づいており、また同時に、さまざまな種に亘る受容体遺伝子の詳細な系統学的解析（図３）にも基づいている。この命名法は、次の規則を堅守する：
【０００６】
ａ）２つ（または３つ）のオーソログ遺伝子、即ち種形成事象により生じた遺伝子には、どれも同じ番号を付する。逆に、２つの遺伝子がもしオーソログでなければ、同じ番号を付してはならない。
【０００７】
ｂ）パラログ、即ち、１つの種の系統内で遺伝子重複事象により生じた遺伝子は、１字の添字によって区別する。
【０００８】
Ｃ）例：遺伝子ｈＴＡＡＲ５、ｒＴＡＡＲ５、ｍＴＡＡＲ５は、全てオーソログである。
マウスの遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、ｃは、パラログである。
遺伝子ｍＴＡＡＲ８ａ、ｂ、ｃは、全てｈＴＡＡＲ８のオ−ソログである。
【０００９】
本発明は、ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定された新しいポリペプチド、該ポリペプチドの薬物標的としての利用、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および、該ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、およびヒト以外の動物を提供する。さらに本発明は、ＴＡＡＲファミリーに特異的で選択的なフィンガープリントモチーフと、これの利用に関する。
【００１０】
本発明は、配列ＮＳＸＸＮＰＸＸＺＸＸＸＢＸＷＦ（配列番号１）を含むフィンガープリント配列を提供する；配列中、Ｘは自然に存在するいずれのアミノ酸でもよく、Ｚはチロシンまたはヒスチジン、Ｂはチロシンかフェニルアラニンでよい。ここで用いる「フィンガープリント」、「フィンガープリントモチーフ」、「フィンガープリント配列」という用語は、マウスＧＰＣＲサブファミリーＴＡＡＲに特異的で選択的なアミノ酸配列に関するものである。フィンガープリントモチーフは、機能的ＴＡＡＲに特異的であることが好ましい。トリプトファン残基は、フィンガープリントモチーフではもっぱらＴＡＡＲ中だけで見出され、どの他の既知のＧＰＣＲ中でも見出されない；むしろ他のＧＰＣＲ 中では、対応する配列位置は、ほとんど必ず極性を有する、または電荷さえ有するアミノ酸で占められている。フィンガープリントモチーフは、ＴＡＡＲ、好ましくは機能的ＴＡＡＲを同定するために用いることができる。
【００１１】
本発明はまた、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いてマウスＴＡＡＲを同定する方法を提供する。マウスＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるためには、ポリペプチドは１００％の同一性を持てば良い。
【００１２】
さらに、本発明は、フィンガープリント配列（配列番号１）を用いて、他の種、好ましくは哺乳類ＴＡＡＲを同定する方法に関する。ＴＡＡＲファミリーのメンバーとして同定されるためには、ポリペプチドは少なくとも、フィンガープリント配列と７５％の同一性、好ましくは８７％以上の、より好ましくは１００％の同一性を持てば良い。
【００１３】
フィンガープリント配列は、例えばＴＡＡＲファミリーメンバーを同定するための検索を、配列データベースに対して行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。そのような検索は、例えばＥＭＢＯＳＳのｆｕｚｚｐｒｏ（Rice et al., EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics, 2000, 16(6): 276-277）のようなパターン認識プログラムを用いて行うことができる。マウスＴＡＡＲに対する検索は、ｆｕｚｚｐｒｏを用い、ＮＳＸＸＮＰＸＸ［ＨＹ］ＸＸＸ［ＹＦ］ＸＷＦを必要配列とし、ミスマッチ数＝０、データベース＝ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ（リリース４３)、として実行できる。
【００１４】
マウスＴＡＡＲファミリーは、１６メンバー（ｍＴＡＡＲ１〜９）を含み、その中の１つは偽遺伝子：ｍＴＡＡＲ７ｃΨである。マウスＴＡＡＲファミリーメンバーをコードする全ての遺伝子が、第１０染色体の同一領域（１０Ａ４）に位置する。２個のエクソンでコードされるｍＴＡＡＲ２を例外として、全てのＴＡＡＲ遺伝子をコードする配列が、単一のエクソン中に存在する。
【００１５】
ここで用いる「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連したＤＮＡの任意のセグメントを表す。遺伝子は、特定の染色体上の特定の位置に存在し、特定の機能的生産物をコードするヌクレオチドの順序づけられた配列である。
【００１６】
ここで用いる「偽遺伝子」という用語は、活性を有する祖先遺伝子から突然変異事象によって進化した可能性のある不活性な遺伝子のことである。不活性であるとは、遺伝子が機能を有するポリペプチドに翻訳されないことを意味する。
【００１７】
本発明は、配列番号５の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）として同定され、ｍＴＡＡＲ２と命名された。
【００１８】
ここで用いる「ポリペプチド配列」（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、など）という用語は、自然に存在するアミノ酸から成るアミノ酸のポリマーをいう。
【００１９】
「単離された」との用語は、「人間の手によって」自然状態から変えられたことを意味する。もし、「単離された」組成物または物質が、自然界に見いだされる場合、それは変化させられたか、元の環境から移されたか、またはその両方である。例えば、生きている動物内に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、しかし自然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ここで採用した用語に従って、「単離され」ている。
【００２０】
「組換え型」という用語は、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関連して用いられた場合、概して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、異種（または外来）の核酸の導入または天然の核酸の改変によって修飾されたこと、またはタンパク質またはポリペプチドが、異種アミノ酸の導入によって修飾されたこと、を示す。
【００２１】
本発明はさらに、ポリペプチドｍＴＡＡＲ２をコードする配列番号４を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２２】
ここで用いる「ポリヌクレオチド配列」（例えば、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、など）という用語は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、Ｇを含むヌクレオチドのポリマーについて用いられる。
【００２３】
本発明はさらに、配列番号７の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ３と命名された。
【００２４】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ３をコードする配列番号６を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２５】
本発明はさらに、配列番号９の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ４と命名された。
【００２６】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ４をコードする配列番号８を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２７】
本発明はさらに、配列番号１１の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ５と命名された。
【００２８】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ５をコードする配列番号１０を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００２９】
本発明はさらに、配列番号１３の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ６と命名された。
【００３０】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ６をコードする配列番号１２を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００３１】
本発明はさらに、配列番号１５の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ａと命名された。
【００３２】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ａをコードする配列番号１４を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００３３】
本発明はさらに、配列番号１７の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｂと命名された。
【００３４】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｂをコードする配列番号１６を含むポリヌクレオチド配列に関する。
【００３５】
本発明はさらに、配列番号２２の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｄと命名された。
【００３６】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｄをコードする配列番号２１を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号２４の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｅと命名された。
【００３８】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｅをコードする配列番号２３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号２６の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ７ｆと命名された。
【００４０】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ７ｆをコードする配列番号２５を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４１】
本発明はさらに、配列番号２８の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ８ａと命名された。
【００４２】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ８ａをコードする配列番号２７を含む単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４３】
本発明はさらに、配列番号３０の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ８ｂと命名された。
【００４４】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ８ｂをコードする配列番号２９を含む、単離された、または組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号３２の配列を含む、単離された、または組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ８ｃと命名された。
【００４６】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ８ｃをコードする配列番号３１を含む、単離された、または組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４７】
本発明はさらに、配列番号３４の配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは微量アミン関連受容体として同定され、ｍＴＡＡＲ９と命名された。
【００４８】
本発明はまた、ポリペプチドｍＴＡＡＲ９をコードする配列番号３３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド配列に関する。
【００４９】
ＴＡＡＲファミリーの他のメンバーｍＴＡＡＲ１は、配列番号２のポリヌクレオチド配列および配列番号３のポリペプチド配列を持ち、以前に記載された（Borowsky, B. et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.(2001)98(16),8966-8971）。
【００５０】
本発明はまた、ｍＴＡＡＲ７ｃΨ（配列番号１８）のヌクレオチド配列を提供する。さらにまた本発明は、ｍＴＡＡＲ７ｃΨの修復されたポリヌクレオチド配列（配列番号１９）を提供する。本発明はさらに、修理されたヌクレオチド配列ｍＴＡＡＲ７ｃ（配列番号２０）によってコードされるポリヌクレオチド配列を提供する。ここで用いる「修復された遺伝子」または「修理された遺伝子」という用語は、遺伝子が活性型になるように配列が変えられた偽遺伝子を指す。すなわち、ｈＴＡＡＲ３のポリヌクレオチド配列は、早期終止コドンを生じた突然変異によって不活性である。この配列は、１３３〜１３４の位置（図４参照）の２個のヌクレオチドの挿入によって修復された。
【００５１】
本発明はまた、フィンガープリント配列（配列番号１）を含みかつ配列番号３の配列とは異なるアミノ酸配列を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチドを提供する。
【００５２】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドの薬物標的としての使用に関する。本発明のポリペプチドは、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的として用いられるのが好ましい。この薬物標的は、薬学的に活性のある化合物の設計、スクリーニング、および開発にとって適切なものであり得る。
【００５３】
本発明の１つの実施形態は、薬物標的としての、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４のポリペプチド配列を有するポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的として用いられるのが好ましい。
【００５４】
本発明のもう１つの実施形態は、フィンガープリント配列を含み配列番号３の配列とは異なるアミノ酸配列有する、薬物標的としてのマウス受容体に関する。これらの受容体は、うつ病治療、統合失調症治療、片頭痛治療、または注意欠陥多動性障害や、食欲低下や肥満症のような摂食障害の治療、に有用な化合物を同定するための薬物標的とするのが好ましい。
【００５５】
「本発明のポリペプチド」という用語は、本発明によって提供される新しいポリペプチド、即ちｍＴＡＡＲ２〜９を指す。
【００５６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターによって形質導入された宿主細胞、および組換技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。ベクターは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、または 配列番号３３、を含むポリヌクレオチドを含むことが好ましく、そして、宿主細胞は該ベクターによって形質導入されていることが好ましい。
【００５７】
宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチドの発現系または発現系の一部を組み込むために、遺伝子工学による操作（例えば、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション）がされていてもよい。ベクターの宿主細胞への導入は、Davis et al. Basic methods in molecular biology. Elsevier, New York（1986); Davis JM（ed.): Basic cell culture: a practical approach, sec. edition. Oxford University Press（2002); R. Ian Freshney: Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, fourth edition. John Wiley & Sons（Sd）1999; and Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.（1989),のような、多くの標準実験室マニュアルに記載されている方法、即ち、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などのような方法によって、実現できる。
【００５８】
宿主細胞は、ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ，ＣＯＳ，ＨｅＬａのような哺乳動物細胞；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ，ＰＣ１２，ＨＮ−１０（Lee HJ, Hammond DN, Large TH, Roback JD, Sim JA, Brown DA, Otten UH, Wainer BH.: Neuronal properties and trophic activities of immortalized hippocampal cells from embryonic and young adult mice. J. Neurosci. 1990 Jun; 10(,6): 1779-1787.）、IMR-32, NB41A3, Neuro-2a, TE 671のような、神経、神経内分泌、神経芽腫、またはグリアの細胞系統；ラット、マウスのような哺乳動物の一次神経またはグリア細胞；アフリカツメガエル卵母細胞；連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、放線菌および枯草菌の細胞のようなバクテリア細胞；酵母やコウジカビ細胞のような真菌類細胞；ショウジョウバエＳ２、ヨトウガＳｆ９細胞のような昆虫細胞；および植物細胞でよい。
【００５９】
非常に多様な発現系を用いることができる。そのような発現系には、他のものの中に、染色体、エピゾーム、および、ウイルスから導かれる系、即ち、バクテリアのプラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、酵母のエピゾームから、酵母の染色体要素から、ウイルス(例えば、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、牛痘ウイルス、アデノウイルス、鳥類ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）から、導かれるベクターが含まれる。また、これらの結合から導かれるベクター、即ちコスミドおよびファージミドのような、プラスミドとバクテリオファージの遺伝要素から導かれるベクターも含まれる。発現系は、発現を生じさせると共に制御する制御領域を含んでもよい。一般に、宿主中でポリペプチドを産生するためのポリヌクレオチドを維持し、伝播し、または発現するのに適した系またはベクターは、どれでも使用できる。適切なヌクレオチド配列は、種々の周知・慣用技術のいずれによっても、例えば、Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N.Y.（1989）or Borowski et al Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc Natl Acad Sci USA（2001）98(16): 8966-71）に記載されているような技術によっても、発現系に挿入することが可能である。
【００６０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。ヒト以外のトランスジェニック動物は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、または配列番号３３を含むポリヌクレオチドを含むのが好ましい。
【００６１】
ヒト以外のトランスジェニック動物は、周知のヒト以外の動物であればよい。好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト以外のトランスジェニック動物は齧歯類である。最も好ましくは、本発明のトランスジェニック動物はマウスである。
【００６２】
ヒト以外のトランスジェニック動物を作り出す方法は周知技術であり、例えば、Hogan, B.C., F; Lacy, E, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 1986, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Hogan, B., et al., Manipulating the mouse embryo. 1994, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, および Joyner, A.（ed.): Gene Targeting - A Practical Approach, Second Edition. Practical Approach Series, Oxford University Press 1999, に記載されているような方法である。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、受容体に結合する化合物および本発明の受容体ポリペプチドを活性化し（アゴニスト）または活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）、または例えば受容体の輸送に作用することによって受容体の機能を調節する化合物、をスクリーニングする過程において採用することができる。
【００６４】
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法であって：
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物と接触させること、および
ｂ）化合物が本発明のポリペプチドと結合するか否かを決定すること、
を含む方法を提供する。
【００６５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生物学的活性またはその発現に対して、刺激または阻害作用を有する化合物を同定するための方法であって、
ａ）本発明のポリペプチドを候補化合物と接触させること、および
ｂ）該化合物が本発明のポリペプチドの機能または活性をモジュレーションしたか否かを決定すること、
を含む方法を提供する。
【００６６】
一般に、上述のようなスクリーニングの手順は、本発明の受容体ポリペプチドを表面に発現する適当な細胞の産生を必要とするが、しかし、適当な細胞に発現した受容体は、細胞内に局在してもよい。そのような細胞は、哺乳動物、アフリカツメガエル、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞を含む。次に、受容体を発現している細胞（または、発現した受容体を含む細胞膜）をテスト化合物と接触させ、結合、または機能的応答の刺激または阻害を測定する。
【００６７】
一つのスクリーニング技術は、本発明の受容体の発現細胞（例えば、トランスフェクションされたＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３）を、受容体活性化に起因する細胞外ｐＨ変化または細胞内カルシウム変化を測定するシステムにおいて使用することを特徴とする。この技術では、化合物を本発明の受容体ポリペプチドを発現している細胞と接触させる。次に、セカンドメッセンジャー応答、例えば、信号変換、ｐＨ変化、ＰＩ加水分解、ＧＴＰ−γ−［３５Ｓ］放出、またはカルシウムレベル変化を測定し、候補化合物が受容体を活性化するか阻害するかを決定する。
【００６８】
もう１つの方法は、受容体阻害剤のスクリーニングを、受容体が媒介するｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の阻害または刺激の測定によって行うことを特徴とする。この方法では、真核細胞に本発明の受容体をトランスフェクションして、受容体を細胞表面に発現させることが必要である。その細胞は次に、本発明の受容体存在下で、候補アンタゴニストに晒される。次にｃＡＭＰの蓄積量を測定する。もし候補アンタゴニストが受容体に結合し、その結果受容体結合を阻害すれば、受容体に媒介されたｃＡＭＰまたはアデニル酸シクラーゼ活性のレベルは減少するか増加することになる。
【００６９】
本発明の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを検出するもう１つの方法は、U.S. Patent 5,482,835記載の酵母を基礎にした技法である。
【００７０】
測定は、単に候補化合物の結合をテストすればよく、受容体を有する細胞への付着を、候補化合物と直接または間接的に関連するラベルを用いて、またはラベルされた競合物との競争を含む測定によって検出する。さらに、これらの測定法では、候補化合物が、受容体の活性化によって信号を発生させる結果になるか否かを、受容体を表面に有する細胞に適切な検出システムを用いてテストしてもよい。活性化阻害剤は、一般に、既知のアゴニスト存在下で検定し、候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響を観測する。そのようなスクリーニング検定実施の標準的方法は、従来技術においてよく理解されている。
【００７１】
本発明のポリペプチドの候補アンタゴニストの例としては、抗体、または、ある場合には、本発明のポリペプチドのリガンドと密接に関連したオリゴヌクレオチドまたはタンパク質で、例えば、リガンドの断片、または例えば神経伝達物質の、またはアミノ酸の代謝物のような小分子量の分子であって、受容体に結合するが応答を出さないために受容体の活性が阻止されるもの、を含む。
【００７２】
ここまで一般的に本発明を記述してきたが、同じことが特定の実施例を参照することでより良く理解できるようになる。実施例は説明のみの目的でここに含まれており、特にそうではないと断らない限り、図に関連づけて限定することを意図したものではない。
【００７３】
【表１】
【００７４】
表１：微量アミン関連受容体（ＴＡＡＲ）の新しい命名法
公表された配列データと本発明により提供された配列との不整合が検出された全ての遺伝子および、新しく同定されたＴＡＡＲには下線を付してある。Genbank登録番号は、公表された遺伝子および、公表された配列と本発明により提供された配列との不整合を紹介している。ＴＡＡＲ遺伝子のクローニングと配列分析は、ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（ヒト脳の全ＲＮＡに由来する、Stratagene社）を採用して、標準プロトコルに従って行なわれた。（ｎｔ＝ヌクレオチド配列；ａａ＝アミノ酸配列）。
【実施例】
【００７５】
実施例において言及する市販の試薬は、特に明記しない限りメーカーの指示に従って用いた。
【００７６】
実施例1：ＴＡＡＲファミリーメンバーの同定
ＴＡＡＲ遺伝子を、以前に公表されたＴＡＡＲ受容体遺伝子と、Genbankから入手可能なヒト、ラット、およびマウスのゲノム配列情報（表１も参照のこと）とを、ＢＬＡＳＴのような標準アルゴリズムを使用して比較することにより、同定した。
【００７７】
この配列情報に基づき、ＴＡＡＲ遺伝子を、それぞれの種のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかから、ＰＣＲにより増幅した。さらに指定しない場合は、すべての手順を基本的には、Sambrook, J., Fritsch, E.F.,und Maniatis, T.（1989). Molecular Cloning: A laboratory manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press）の記載に従って実施した。全ての試薬は入手できた最高純度のものであり、全ての溶液および試薬は特に明記しない限り使用前に滅菌した。
【００７８】
この目的のため、オリゴヌクレオチドプライマ−（表２）を、Ｇｅｎｂａｎｋで利用できるゲノム配列情報から導かれるＴＡＡＲコーディング配列に基づいて設計した。プライマーは、アンプリコンが読み枠全体を含むように設計した。プライマーを、主にVectorNT1 ソフトウエア（VectorNT1、version 9.0.0, Informax）を用い、ＰＣＲプライマーの標準規則に従って設計した：ａ）プライマーは、１８〜２５ヌクレオチドの長さを有するべきであり、ｂ）約５０％のＧ／Ｃ含量を持ち、ｃ）３ヌクレオチド以上長い逆方向の反復を含むべきでなく、ｄ）少なくとも５’端にＧかＣを有するべきであり、ｅ）３個より多くの同じヌクレオチドの単純な繰り返しを有するべきでなく、そして、ｆ）同じＰＣＲ反応で用いられるプライマーのアニーリング温度（ＴＭ）の違いはできる小さくすべきである（詳しくは、例えば、McPherson M.J., Hames B.D., Taylor G.R.（eds.): ＰＣＲ 2 - A Practical Approach. The practical approach series, Oxford University Press, 1995, ISBN: 0-19-963424-6 を参照のこと）。プライマーオリゴヌクレオチドのアニーリング温度を、Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA.: Predicting ＤＮＡ duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986 Jun;83(11): 3746-3750、に記載された規則に基づいて計算した（この規則は、配列が対称的でなく、少なくとも１個のＧまたはＣを含み、最小８ヌクレオチドの長さを有することを仮定している）。オリゴヌクレオチドは、Microsynth 社（Microsynth AG, Schutzenstrasse 15, 9436 Balgach, Switzerland）にＨＰＬＣ精製品質のものを注文した。
【００７９】
【表２】
【００８０】
表２：ｍＴＡＡＲクローニング用プライマー
ｍＴＡＡＲ２：ｍＴＡＡＲ２をｃＤＮＡからクローニングした主な理由は、対応する遺伝子転写物が実際に２つのエクソンを含んでいるか否か確かめるためであった。この実験とは独立に、２個のコーディングエクソンを、ゲノムＤＮＡから別々にクローニングした。（Tm：℃で表した融解温度で、 Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA.: Predicting ＤＮＡ duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, Jun;83（11):3746-3750、に従い計算した； プライマー名中の５は、５’プライマー（即ち、ｍｕｓＴＡＲ３＿５＿０１）を示し、プライマー名中の３は、３’プライマーを示す）。
【００８１】
実際のＰＣＲ反応物は、総体積５０μｌで次の組成であった：５〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに等しく、１００〜２００ｎｇの全ＲＮＡ（入手先は以下で特定）相当量である鋳型、２００ｎＭオリゴヌクレオチドプライマー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Invitrogen）、２００ｍＭ各ｄＮＴＰ（Invitrogen）、１×濃縮ＰＣＲ反応緩衝液（Invitrogen）、および ５Ｕ／反応物の組換えＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen）。ＰＣＲ反応物を、ＵＶ照射装置を有する殺菌作業ベンチ下で集め、ａ）鋳型材料の調製、ｂ）ＰＣＲ反応物の集成、ｃ）ＰＣＲ反応とアガロースゲル電気泳動の実施、およびｄ）プラスミドの調製、は、それぞれ別々の部屋で行った。試薬と、ＰＣＲで増幅した材料またはプラスミドＤＮＡとの間で起こりうる交差汚染を避けるためである。ＰＣＲ反応物を、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む２００μｌのＰＣＲカップ（Eppendorf）に室温（ＲＴ）で集め、９５℃に予熱したサーモサイクラー（Geneamp 9700 金ブロック付き、Applied Biosystems）に移した。温度条件を次のように調整した。
【００８２】
【表３】
【００８３】
アニーリング温度：低い方のＰＣＲ反応Ｔｍ（融解温度）値（上に特定した方法で計算したもの）を有するオリゴヌクレオチドプライマーのＴｍ−１℃を、アニーリング温度として用いた。例：プライマー１のＴｍ＝５５℃、プライマー２のＴｍ＝５７℃である２つのプライマー⇒アニーリング温度：５４℃。
【００８４】
伸長時間を、アンプリコンの長さ（ｋｂ単位）×１分、で計算した。
【００８５】
サイクル数：各遺伝子に対して、いくつかのＰＣＲ反応をサイクル数２５〜４０で平行して行った。その後全てのＰＣＲ反応物を、アガロースゲル電気泳動で分析し、明らかに視認できる正しいサイズのＰＣＲ産物が生産されている中で、最低のサイクル数のＰＣＲ反応物を、次のクローニングに用いた。
【００８６】
ＰＣＲ産物を、１％超純粋アガロース（GibcoBRL）を用いてTAE 緩衝液（Invitrogen）中で作成したアガロースゲルの電気泳動によって分析した。アガロースゲル泳動を、PerfectBlue Horizontal Mini Electrophoresis System（Pequlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany）を用い、標準プロトコル(Sambrook et al., 1989）に従って行った。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、ＰＣＲ産物をＵＶトランスイルミネーター（Syngene, Cambridge, UK）で可視化し、ＰＣＲ産物のサイズを、分子量標準１ｋｂ ＤＮＡラダー（Invitrogen）と比較して解析した。予想サイズのＰＣＲ産物を、ゲルから滅菌したメス（Bayha, Tuttlingen, Germany）で切り取り、アガロースゲル切片からQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN AG, Basel, Switzerland）を用い、メーカーの指示に従って抽出した。
【００８７】
抽出したＰＣＲ産物を、冷エタノール／酢酸ナトリウム沈殿（Sambrook et al., 1989)によって沈殿させ、ＤＮＡペレットを１０μｌの１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．５に溶解した。次に、この溶液中のＰＣＲ産物を、配列決定用ＴＯＰＯクローニングキット（Invitrogen；ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターを含むキットを使用）を用い、メーカーの指示に従ってクローニングした。ライゲーション産物を、ＴＯＰ１０の化学的にコンピテントなバクテリア（配列決定用ＴＯＰＯクローニングキットに含まれる）中にメーカーの指示に従って入れて形質転換し、次いで１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Sigma, Division of FLUKA Chemie GmbH, Buchs, Switzerland）を含むＬＢ寒天プレートにプレートし、３７℃１晩インキュベートした。バクテリアのコロニーを「miniprep PCR」と呼ばれる方法によって分析した。すなわち：コロニーを滅菌した接種ループ（Copan Diagnostic S.P.A., Brescia, Italy）を用いて採取し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む新しいＬＢ寒天プレートに移した。次に同じ接種ループを、それぞれ１．５ｍｌ Eppendorfカップ（Eppendorf）中の５０μｌの１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．５に入れ、ループ上に残っているバクテリアを溶液中に移した。次にこのバクテリア懸濁液を９５℃５分間熱し、得られる溶菌液の、ＰＣＲ反応物５０μｌ当たり１μｌを、ＰＣＲ反応の鋳型に用いた。プライマーには、プラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯとｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯの複数クローニング部位の両側に接着するプライマー（Ｔ７と逆Ｍ１３、配列：プライマー“Ｔ７”：５’−ｃｇｇｇａｔａｔｃａｃｔｃａｇｃａｔａａｔ−３’、プライマー“逆Ｍ１３”：５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃ−３’）を用いた。ＰＣＲ反応物を、上述のように集成し、次の温度概要で実施した：
【００８８】
【表４】
【００８９】
ＰＣＲ産物を、上述通り、アガロースゲル電気泳動によって分析した。上に概説した方法によって、予想サイズのクローニングされたＤＮＡ断片が検出されたバクテリアのコロニーを、次のプラスミドの調製のために用いた。
【００９０】
プラスミドの調製のため、「miniprep PCR」によって予想サイズの挿入を有すると同定されたバクテリアのコロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地のバクテリア液体培養液への植付けに用い、培養液は水平シェイカーで、３７℃、一晩インキュベートした（Sambrook et al. 1989）。プラスミドを、バクテリア液体培養液からHiSpeed Plasmid Maxi Kit（QIAGEN AG, Basel, Switzerland）を用い、メーカーの指示に従って単離した。プラスミド濃度をＵＶ／可視分光光度計ultrospec 3300 pro（Amersham Biosciences Europe GmbH, Otelfingen, Switzerland）を用い、２６０ｎｍのＯＤを測定して決定した。単離したプラスミド中の挿入のサイズを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌ（New England Biolabs, products distributed in Switzerland by Bioconcept, Allschwil, Switzerland）を用いた制限酵素消化によって解析した；ＥｃｏＲＩの制限部位がｐＣＲ４−ＴＯＰＯとｐＣＲ２．ｌ−ＴＯＰＯの両ベクターの複数クローニング部位の両側にあり、それ故、クローニングされた挿入を、ＥｃｏＲＩ制限酵素消化によりプラスミドから切り離すことができる。各プラスミドの０．５μｇを、ＥｃｏＲＩを用い、全容積２０μｌ中でメーカーの推奨に従って消化した。制限酵素消化産物を、上記通りアガロースゲル電気泳動により分析した。予想サイズの挿入を有することが制限酵素解析によって明らかになったプラスミドは、外部会社（Microsynth社、Schutzenstrasse 15,9436 Balgach、Switzerland）によるＤＮＡ配列分析に付した。
【００９１】
ＤＮＡ配列分析で明らかになった、クローニングされたＴＡＡＲ遺伝子読み枠のＤＮＡ配列を、これまでに公表された配列、および／または、ゲノム配列情報から検索したＴＡＡＲ遺伝子の配列と比較した。ＰＣＲ反応によって導入された可能性があるＤＮＡ配列情報のエラーを、各ＴＡＡＲ遺伝子ごとに、独立したＰＣＲ反応によってクローンニングされた２〜３のＤＮＡプラスミドの配列を比較して、除去した。：独立なＰＣＲ反応において同じＰＣＲエラーが全く同じ位置で起こる確率は基本的にゼロであるので、各々の遺伝子に対する独立の配列が一致することによって、きわめて正しいＤＮＡ配列が明らかになった。
【００９２】
鋳型材料：我々は、可能な場合には、同じ近交系の、ゲノム配列情報をＧｅｎｂａｎｋで利用できた系統から得られる標準化された鋳型材料を用いるように特別の注意を払った。Ｃ５７ＢＬ／６のマウス、またはこのマウス系統に由来するゲノムＤＮＡを、Jackson Laboratory（600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 USA)から購入し、近交系 Crl:Wi のラットを、Charles River Laboratories France（Les Oncins,France; belongs to Charles River Laboratories,Inc 251 Ballardvale Street, Wilmington, MA 01887-1000,USA)から購入した。成体Crl:Wiラットから生体組織採取した尾部のゲノムＤＮＡを、基本的に：Laird PW, Zijderveld A, Linders K, Rudnicki MA, Jaenisch R, Berns A.: Simplified mammalian ＤＮＡ isolation procedure. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19（15): 4293に従って調製した。ＤＮＡ濃度を、上述のように２６０ｎｍのＯＤを測定して決定し、ＤＮＡ濃度を１００ｎｇ／μｌに調整した。ＤＮＡを小分けして４℃で保存した。ヒトゲノム遺伝子をStratagene から購入した。
【００９３】
ｃＤＮＡを商業的に購入するか（ヒト:ヒト脳,小脳のMarathon-Ready cDNA, BD Biosciences Clontech）、または、全ＲＮＡから作成した。ＲＮＡを商業的に購入するか（ヒト:ヒト成人全脳, 男性,全ＲＮＡ, Stratagene, Stratagene Europe, P.O. Box 12085 1100 AB Amsterdam, The Netherlands）、または生後３日目のＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＣｒｌ：Ｗｉラットの幼獣から下記のようにして抽出した。
【００９４】
ＲＮＡの単離：
ＲＮＡを、組織サンプルから基本的にChomczynski,P. and Sacchi, N.: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.（Analytical Biochemistry（1987）162, 156-159）に従って分離した。ＲＮＡを取り扱う基本的な規則および原理は、Sambrook et al.(1989)に詳述されている。
【００９５】
ラットまたはマウスの幼獣を、断頭によって殺した。脳全体を取り出し、重さを量り、５ｍｌのガラスホモジナイザーに移し、１０×体積のTrizol試薬（Invitrogen）中でホモジネートした。全ＲＮＡをこのホモジネートからメーカーの指示に従って抽出した。各半脳に由来するＲＮＡ沈殿物を、１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．０ ２００μｌに溶かした。微量のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ分解酵素Ｉ消化（１０μｌの１００μＭ ＭｇＣｌ２と５μｌ ＲＮＡｓｅフリーＤＮＡｓｅ Ｉ，１０３Ｕ／μｌ，Ｒｏｃｈｅを加え３７℃１時間インキュベート）して除いた。ＤＮＡ分解酵素Ｉを、溶液からSambrook et al.(1989)に従いフェノール／クロロフォルム抽出（Ｈ２Ｏ飽和フェノールｐＨ７．０，Ｓｉｇｍａ）によって除いた。ＲＮＡを、冷エタノール／酢酸ナトリウム沈殿で沈殿させ（Sambrook et al.1989）、１０ｍＭトリス／塩酸ｐＨ７．０に溶解し、ＲＮＡ濃度を、上記通り２６０ｎｍ ＯＤを測定して決定した。このＲＮＡ標品を、ｃＤＮＡの合成に用いた。
【００９６】
ｃＤＮＡ合成：１．５ｍｌ Eppendorfカップ中で：総量１１μｌ中に２μｇ全ＲＮＡと１μｌの０．５μｇ／μｌオリゴｄＴ１２〜１８（Invitrogen）を混合した。混合物を７０℃１０分間加熱し、氷上に置き、次の試薬を加えた：
【００９７】
５×反応緩衝液４μｌ（酵素と共に加える）、ＤＴＴ ２μｌ（酵素と共に加える）、ｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）１μｌ、ＲＮＡｓｅ阻害剤ＲＮＡｓｅ−ＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５μｌ、Superscript II逆転写酵素（Invitrogen）０．８μｌ。反応物を短時間ボルテックスし、１時間４２℃でインキュベートし、酵素を７０℃１０分間保温して不活性化し、反応物を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．０で最終体積１００μｌにした。ｃＤＮＡを使用に先だって小別けにし、−８０℃で保存した。
【００９８】
一般に、ＰＣＲ反応による配列エラーと、鋳型材料から導入される多型性による配列エラーを取り除くため、特別な処置を講じた： a)サイクル数：それぞれのＴＡＡＲ遺伝子に対して、サイクル数の異なる数回のＰＣＲ反応を行い、特定の生産物をクローニングに十分な量だけ供給した、最低サイクル数のＰＣＲ反応物を用いた。ｂ）遺伝子当たり数個の独立なクローン：各ＴＡＡＲ遺伝子は、独立のＰＣＲ反応によって２〜３回クローニングし、正しい配列を、これらの独立に生成されたプラスミドの配列の一致から推測した：あるＰＣＲエラーが、全く同じ位置で複数の独立なＰＣＲ反応において起こる可能性は基本的にゼロであるので、これらのプラスミドの配列のアライメントは、遺伝子のきわめて正しい配列をもたらす。Ｃ）標準化された鋳型材料：近交系の系統間の差異は、配列情報に重大な不整合をもたらすため、我々は、ＴＡＡＲ遺伝子クローニングのために用いる鋳型材料の選択にも特別の注意を払った：マウス・ゲノムＤＮＡをJackson Laboratory（600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 USA；近交系Ｃ５７ＢＬ／６のゲノムＤＮＡを使用した。この系統が、Genbankでマウス・ゲノム配列データベースに採用されていたからである）から購入し、ヒトゲノムＤＮＡをStratageneから購入し、また、ラット・ゲノムＤＮＡをCharles River Laboratories France（Les Oncins, France； belongs to Charles River Laboratories, Inc., 251 Ballardvale Street, Wilmington, MA 01887-1000,USA；ラット系統Crl:Wiを選択した。この系統がGenbank でラット・ゲノム配列データベースに採用されていたからである）から購入した近交系Ｃｒｌ：Ｗｉのラットから単離した。ｃＤＮＡ合成のために、ラットとマウスの全脳の全ＲＮＡを、Ｃｒｌ：ＷｉラットまたはＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれかの生後３日の幼獣から、Trizol試薬を採用し、メーカーの推奨に従って単離した。ヒト全脳ＲＮＡを、Stratageneから購入した。ｃＤＮＡを、Invitrogenから購入したSuperScriptII逆転写酵素とAmersham から購入したｄＮＴＰを使用し、メーカーの推奨に従って合成した。
【００９９】
実施例２： 細胞培養および安定した細胞系統の生成
ａ）サブクローニング：哺乳類の細胞系統でＴＡＡＲ受容体を発現させるために、ＴＡＡＲの全読み枠を所持しているＤＮＡ断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯまたはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）から、ｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２（Rees S et al., Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibiotic-resistant cells to express recombinant protein. Biotechniques,1996 Jan;20(1）: 102-4, 106, 108-110）へサブクローニングした。
【０１００】
この目的のため、ＴＡＡＲの全読み枠を有するＤＮＡ断片を、それぞれのＴＯＰＯベクターから、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化および、それに続く上述のような〜１ｋｂの断片のアガロースゲル電気泳動による精製およびゲルからの抽出により切り離した。平行して、ｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターを、ＥｃｏＲＩによって線状化し、エビのアルカリフォスファターゼ（Roche）によりメーカーの指示書に従って脱リン酸化した。ＴＡＡＲの全読み枠を有するＤＮＡ断片を、線状化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクターにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）を用いてライゲーションした。線状化したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２ベクター３０ｎｇ、各ＴＡＡＲコーディング配列を有するＤＮＡ断片１００〜３００ｎｇ、１×ライゲーション緩衝液（最終濃度；酵素を１０×濃縮物として加えた）および、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌを、全容量２０μｌに混合した。反応は、室温で２〜３時間進行させ、ライゲーション産物を、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細胞中に、ＴＯＰＯライゲーションの項に記載したようにしてトランスフォームした。形質転換されたバクテリアのプレートおよびバクテリアのクローン採取を、先にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからのＴＡＡＲ遺伝子のＰＣＲクローニングの項で述べた通りに行った。採取したバクテリアクローンを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ ５ｍｌ中の液体培養に接種するために使用した。この液体培養物を、QlAprep Miniprep Kit（QIAGEN）を用いた小規模なプラスミド調製のために、メーカーの指示書に従って用いた。精製したｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２由来のプラスミドの構成物を、予想サイズの挿入の存在を確認するため、ＥｃｏＲＩとアガロースゲル電気泳動を用いた制限酵素分析によって分析した。予想サイズの挿入を有することを確認したプラスミドについては、挿入の正しい方向性と配列を確かめるために、ＤＮＡ配列解析がMicrosynth社により行われた。正しい方向の正しい挿入を有するプラスミドを、哺乳類細胞系統でそれぞれのＴＡＡＲを発現させるために用いた。
【０１０１】
ｂ）細胞培養: 使用した基本的な細胞培養操作と技術は、Davis JM（ed.): Basic cell culture, sec. edition. Oxford University Press 2002, ISBN: 0199638535、に記載されている。ＴＡＡＲを、HEK細胞(ATCC number: CRL-1573; described in Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., und Nairn, R.（1977）Characteristics of a human cell line transformed by ＤＮＡ from human adenovirus type 5. Journal of General Virology 36, 59-74)中で発現させた。培地を、Invitrogen Cat.#31966-021の、Glutamax I、ピルビン酸ナトリウム、ピリドキシン、およびグルコース４，５００ｍｇ／Ｌを加えたＤＭＥＭ；ペニシリン／ストレプトマイシン；および熱不活性化されたウシ胎児血清１０％、で構成した。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen Cat. # 25300-062）を用い、１：１０〜１：３０の比率で、継代した。
【０１０２】
ｃ）安定した細胞系統：安定にトランスフェクションされた細胞系統生成のため、ＨＥＫ細胞を、各ＴＡＡＲのｐＩＲＥＳ−ＮＥＯ２発現ベクターにより、Lipofectamin 2000トランスフェクション試薬およびGlutamax添加Optimem 1還元血清培地（Invitrogen Cat. # 51985-026）を用い、Lipofectamine 2000データシート記載の推奨に従って、トランスフェクションした。２４時間後、トランスフェクション後の細胞をトリプシン処理し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充した培養液で１：１０〜１：３００に希釈し、９０ｍｍ組織培養皿（Nunc）に移した。培養液を毎日入れ換えた。トランスフェクションの７〜１０日後、十分に単離されたクローンを観察し、直径が約３ｍｍに達した時に採取した。クローンの採取は、クローン全体を培養皿から１ｍｌ Ｇｉｌｓｏｎピペットを用いて分離し、クローンを、１．５ｍｌ Eppendorfカップ中でトリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen Cat. # 25300-062）を用いてトリプシン処理し、そしてそれらを４８ウエルの皿にプレートすることによって行ない、続いて、そこからより広い培養表面積（４８ウエル−１２ウエル−６０ｍｍ等）へと細胞を移動させることにより、細胞を拡大した。新しいプレートに細胞を移動させるときには、何時も注意深く細胞をトリプシン処理した。単一クローンを選択するとすぐに、培地のＧ４１８濃度を５００μｇ／ｍｌに減じた。
【０１０３】
個々のクローンを十分に拡大させた後、Amersham cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay（EIA）Systemによって、微量アミン（ｐ−チラミン、β−フニルエチルアミン（β−ＰＥＡ）、トリプタミン、オクトパミン）または、化合物のセレクション（５−ＨＴセロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリン、ヒスタミン）を用いて、機能測定のテストをした。安定にトランスフェクションされた細胞系統生成の成功率は、テストしたクローンの約１／３であった。この高い成功率は、ｐＩＲＥＳベクターの使用により可能になった。このベクターから、ＴＡＡＲは、ＴＡＡＲコーディング配列とＮＥＯＲコーディング配列を有する２シストロンの転写物として、同じｍＲＮＡ分子中に発現される。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
表３：ｍＴＡＡＲ１の薬理学。表題の受容体を安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞が、リストした各化合物による刺激に応答して産生したｃＡＭＰ量を、ｃＡＭＰ Ｂｉｏｔｒａｋ ＥＩＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Amersham）を用いて測定した。ＥＣ５０値を、μＭで示している（少なくとも３回の独立の実験の平均：ＥＣ５０値は、３０μＭ〜０．１ｎＭの範囲で均等に分布した１２の濃度で、各濃度点を二重にとって行った実験から計算してある）。最大応答は、ｐ−ＴＹＲによって誘導された最大ｃＡＭＰレベルのパ−セントで表示してある。ドーパミンについての実験では、ＥＣ５０値を、ｐ−Ｔｙｒａｍｉｎｅが到達するレベルと比較して５０％である最大ｃＡＭＰレベルに基づいて計算した。
【０１０６】
ｍＴＡＡＲ１以外の全てのｍＴＡＡＲについて、最小１０の独立なクローンをテストした。もし微量アミンまたは選択した重要な化合物のいずれにも応答するものが検出できなかった場合は、そのＴＡＡＲは、この一定のテスト条件では全く化合物に応答しないと結論した。
【０１０７】
ｃＡＭＰ測定：ｃＡＭＰを、Amersham社のcAMP Biotrak Enzymeimmunoassay（EIA）System を用い、製品マニュアルに記載されているように、いわゆる非アセチル化ＥＩＡ手順に従って測定した。一般の手順もまた、Notley-McRobb L. et al.,（The relationship between external glucose concentration and cAMP levels inside Escherichia coli: implications for models of phosphotransferase-mediated regulation of adenylate cyclase. Microbiology. 1997 Jun;143（Pt 6): 1909-18）および Alfonso A, de la Rosa L et al.（Yessotoxin, a novel phycotoxin, activates phosphodiesterase activity. Effect of yessotoxin on cAMP levels in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2003 Jan 15;65(2):193-208.）に記載されている。
【０１０８】
プロトコルに次の小修正を加えた：９６ウエルプレート中のHEK細胞を刺激後、予冷した（−２０℃）等量のエタノールを加えて反応を止めた。細胞の融解は、キットで供給された融解緩衝液を加えることによっては達成されなかったが、９６ウエルプレートを−８０℃に最短６時間（数日まで）移すことにより達成された。その後９６ウエルプレートの内容を５０℃で一晩乾燥させ、９６ウエルプレートに残った物質を測定緩衝液（キットの全ての試薬を再懸濁するための緩衝液）２００μｌに再懸濁した。再懸濁液を測定緩衝液で逐次希釈して測定した。
【０１０９】
系統学的分析
ヒト、マウス、ラットのゲノム配列（human：NCBI reference draft 34, July 2003; mouse：NCBI draft 32, October 2003; rat：Rat Genome Sequencing Consortium draft 3, June 2003）を、全ＴＡＡＲ遺伝子同定のための、特にこれまで未知で存在可能性のあるＴＡＡＲファミリーメンバーのための企業内ゲノム配列解析手段を利用して、スクリーニングした。このスクリーニングにより、ヒト、マウス、ラット全体で４４のＴＡＡＲ遺伝子が同定され、その中２２が新しい遺伝子（２つの偽遺伝子と１つのヒトＴＡＡＲ７遺伝子断片を含む）であり、１１遺伝子がこれまでに公表された配列と不整合であった。単純なＤＮＡおよびタンパク質の配列およびより複雑なパラメーター、例えばリガンドポケットベクターのＧＣＲＰ薬理作用団類縁関係およびＴＡＡＲ遺伝子の系統学的関係、とゲノム配列とを比較することにより、図３にリストしたＴＡＡＲ受容体は、ヒト、マウス、およびラットの完全なＴＡＡＲ受容体ファミリーを表しているという結論が強く支持される。ゲノム配列情報に基づくＴＡＡＲ遺伝子の同定は、ＴＡＡＲ２を除く全てのＴＡＡＲが単一のエクソンによってコードされているという事実によってきわめて容易になった。
【０１１０】
これに関連して、ヒト、マウス、およびラットのゲノムのＴＡＡＲ遺伝子配列を解析した（ヒトについては図１を参照のこと）。遺伝子は、全体としてヒトで約１０９ｋｂ（染色体６ｑ２３．１）、マウスで１９２ｋｂ（染色体１０Ａ４）、ラットで２１６ｋｂ（染色体１ｐ１２、全ての染色体領域はＬｏｃｕｓＬｉｎｋによって所属をきめた）の非常にコンパクトな領域にマップされ、同じ染色体領域に、他には注釈を付けたり予測したりする遺伝子は無かった。２つのエクソンによってコードされるＴＡＡＲ２を例外として、全てのＴＡＡＲ遺伝子のコード配列は単一のエクソンに位置し、３つの動物種すべてについて約１ｋｂの長さである点が非常に似通っている（範囲：９９９〜１０８９ｂｐ）。ヒト６番染色体の領域６ｑ２３．１は、統合失調症感受性座位として知られており（Levinson et al.,: Multicenter linkage study of schizophrenia candidate regions on chromosomes 5q, 6q, 10p, and 13q: schizophrenia linkage collaborative group III. Am.J.Hum.Genet. 2000 Sep;67(3): 652-63. Epub 2000 Aug 02.; Martinez et al., Follow-up study on a susceptibility locus for schizophrenia on chromosome 6q. Am.J.Med.Genet.1999 Aug 20;88(4): 337-43）、これが、精神障害に対する薬物標的としてのＴＡＡＲの可能性を明白に示すことを指摘するのは興味深いことである。
【０１１１】
ヒトＴＡＡＲ１〜５、ＴＡＡＲ６、８、および９は、逆方法の読み枠を有する遺伝子の２ブロックに配置されていることが見出された。最も著しいヒトと齧歯類の違いは、ヒトゲノムから機能的ＴＡＡＲ７パラログが完全に欠如していることである。ＴＡＡＲ７はラットにおいては全ＴＡＡＲファミリーのほとんど半分にあたるものであるが、これに対して、我々は、ｒＴＡＡＲ７ｈにきわめて高い類似性をもつ退化遺伝子断片のみをヒトにおいて検出した。さらに、ＴＡＡＲ３および４は、齧歯類では機能している受容体であるが、ヒトでは偽遺伝子である。ｈＴＡＡＲ３Ψと４Ψの偽遺伝子化はおそらく最近の出来事である。その理由は、これらの遺伝子が全体として非常によく保存されており、コーディング配列中の塩基対変化はそれぞれ２カ所と３カ所のみであり、これが遺伝子を機能的でなくしているからである。互いに異なる総数９個のラットのＴＡＡＲ７パラログ（２個の偽遺伝子ｒＴＡＡＲ７ｆΨとｒＴＡＡＲ７ｉΨを含む）と６個のマウスのＴＡＡＲ７パラログ（１個の偽遺伝子ｍＴＡＡＲ７ｃΨを含む）は、このように密接に関連している遺伝子のファミリー内での、著しい齧歯類間差異を表しており、これは、リガンドポケットベクターのＧＣＲＰ薬理作用団類縁関係の解析から求められた、個々のマウスおよびラットＴＡＡＲ間の、リガンド結合の顕著な差異予測に反映されている（以下を参照のこと）。全体としては非常に類似したタンパク質配列を有する受容体の予想リガンド結合ポケットに検出された顕著な差異は、全体のアミノ酸配列の同一性が、マウスおよびラットＴＡＡＲの薬理学的側面についての類似度を予測する適当な尺度ではないことを示しており、行動学的な動物モデルを開発するためには綿密な注意が必要であるという事実を示している。
【０１１２】
ヒトおよび齧歯類ＴＡＡＲ遺伝子のコンパクトな染色体配置と、各種内に存在する多数の非常に似通った遺伝子とが端緒となり、ＴＡＡＲ遺伝子の系統学的関係を３種全てに亘って解析した。系統学的解析は、ＴＡＡＲ遺伝子が推定上の共通祖先に由来し、そこから全８回の遺伝子重複事象を経て進化し、結果として霊長類と齧歯類の系統分離前に９個の遺伝子セットとなったことを示している（図２；共通の祖先からの遺伝子重複事象、ヒトと霊長類系統へと導く種形成、および齧歯類系統内の遺伝子重複はそれぞれ個々にひとまとめにしてそれぞれ数字１、２、３で表している）。７つのケースでは、ヒト、マウス、およびラットへと導く２つの種形成事象により、これらの遺伝子はさらに重複し、３つのオーソログセットとなった。齧歯類ＴＡＡＲ７と８のオーソログは、さらなるラットとマウスの系統内での独立の重複によって進化した。これらの出来事が上に概説した順序でのみ起こり得た点を指摘しておくことは重要である。
【０１１３】
系統樹の全体の構造は、直ちに、ＴＡＡＲファミリーが３つのサブグループ（図３の灰色の囲みによって示す）に区別されることを、われわれに示唆した。以下に詳述するように、サブグループの概念は、ＤＮＡ配列全体だけから推定される恣意的な区別ではなく、重要な機能的差異を反映していることが明らかになった。
【０１１４】
合計５つの偽遺伝子が、ヒト、ラット、およびマウスに存在する。全ての偽遺伝子は、小さな変化の導入によって、機能蛋白質に変換することができた。以下は偽遺伝子化を引起した可能性がある、最も明らかで確からしい突然変異事象である：ｈＴＡＡＲ３Ψは、早期終止を引き起こしている位置１３５の２塩基対（ＣＡ）の欠失のために偽遺伝子となった可能性が最も高い。Ｃｙｓを終止コドンに変える点突然変異（Ａ４１１Ｔ）と２つの挿入（Ｇ６０５、Ａ７５０）が、ｈＴＡＡＲ４Ψの偽遺伝子化を引き起こした可能性がある。ｒＴＡＡＲ７ｆΨは、他の全てのＴＡＡＲ７メンバーに比べて２つの明らかな相違、即ち、おそらく挿入事象によって引き起こされた位置７２６の付加塩基対１２個と、Ｔｒｐを終止コドンに変える点突然変異（Ａ５１５Ｇ）とを有する。２番目のラット偽遺伝子ｒＴＡＡＲ７ｉΨは、位置９０で１０塩基対を失っており、これが早期終止を引き起こしている。またｍＴＡＡＲ７ｃΨは、位置８９５（細胞内ループ３）で１５塩基対と、位置５１３で７塩基対を失い、これが早期終止を引き起こしている。まとめると、ＴＡＡＲファミリー内では、偽遺伝子化は、点突然変異、欠失、および挿入のような全ての可能な突然変異事象によって引き起こされたと思われる。その事象は、非常によく保存された全体の配列からみて、かなり最近起こったと思われる。そのような修復された偽遺伝子の薬理学は、進化のあいだに起こった適応過程に関連したＴＡＡＲの重要性について洞察を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１はマウスのＴＡＡＲ遺伝子の染色体上の局在を示す。染色体上のＴＡＡＲ遺伝子の相対的位置を、各遺伝子の単一のコーディングエクソンを表すボックスで示す。２個のエクソンによってコードされるｍＴＡＡＲ２については、ボックスは、読み枠の９５％以上を収める第２のコーディングエクソンの位置を示す。ボックスの幅は、それぞれのコーディング配列の長さに比例したものではなく、色は、本文で議論する受容体サブグループ内の区別を示す。ボックス上の矢印は、ｍＴＡＡＲ遺伝子の方向（→：順鎖方向の読み枠、←：逆鎖方向の読み枠）を示す。（Ψ＝偽遺伝子）
【図２Ａ−１】図２は、全ての機能的なＴＡＡＲのアライメントを示す。ヒト、ラット、およびマウスのＴＡＡＲ全てにおいて保存されているアミノ酸残基は、黒い影を付けて強調している。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントモチーフが、ＴＭ ＶＩＩに局在している。 機能的なヒトＴＡＡＲのアライメント。予想されたＴＭの位置：
【表６】
【図２Ａ−２】図２は、全ての機能的なＴＡＡＲのアライメントを示す。ヒト、ラット、およびマウスのＴＡＡＲ全てにおいて保存されているアミノ酸残基は、黒い影を付けて強調している。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントモチーフが、ＴＭ ＶＩＩに局在している。 機能的なヒトＴＡＡＲのアライメント。予想されたＴＭの位置：
【表７】
【図２Ａ−３】図２は、全ての機能的なＴＡＡＲのアライメントを示す。ヒト、ラット、およびマウスのＴＡＡＲ全てにおいて保存されているアミノ酸残基は、黒い影を付けて強調している。特徴的なＴＡＡＲフィンガープリントモチーフが、ＴＭ ＶＩＩに局在している。 機能的なヒトＴＡＡＲのアライメント。予想されたＴＭの位置：
【表８】
【図２Ｂ−１】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−２】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−３】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−４】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｂ−５】図２Ｂは、機能的なマウスＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−１】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−２】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−３】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−４】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図２Ｃ−５】図２Ｃは、機能的なラットＴＡＡＲのアライメントである。
【図３】図３は、ＤＮＡ配列に基づいたヒト、ラット、およびマウスにおけるＴＡＡＲ遺伝子の系統学的関係を示す。 その後に起こる遺伝子重複事象を、分岐点の数字で示す（（１）：推定共通祖先からの遺伝子重複；（２）：霊長類系統と齧歯類系統の分離へと導く種形成；（３）：マウスとラットの種へ導く遺伝子重複）。外集団は、ヒト５−ＨＴ４受容体との配列比較に基づいて配置された。ＴＡＡＲ遺伝子を、異なるサブファミリーごとにまとめて灰色の影を付けた囲みで示す。Ψ：偽遺伝子、＊：齧歯類ＴＡＡＲ７パラログ残遺物に類似した、ヒトゲノム中でラットＴＡＡＲ７ｈに最も高い類似性を有する遺伝子断片。スケール：ＪＴＴタンパク質距離。
【図４】図４は、偽遺伝子ｈＴＡＡＲ３（古い名称ＧＰＲ５７Ψ）の「修復」を示す：修理された読み枠の１３３〜１３４位置に２塩基対ＣＣが付加され、それによって、修復前は早期終止コドンＴＣＡであったものが修復された。
【図５Ａ】図５は、リガンドポケットベクター（計算モデルから決定された、その残基がおそらくリガンド結合に参加しているアミノ酸）の性質に基づく、ＴＡＡＲの類縁関係を示す。Ａ：Kratochwil et al.(2004)により推定した、ヒト、ラット、およびマウスＴＡＡＲタンパク質のリガンドポケットベクター（ＬＰＶｓ）。各ＴＡＡＲが、最も緊密に類似しているリガンド結合ポケットを有するタンパク質が互いに隣り合うように並べられている。アミノ酸残基の物理化学的性質が、着色した影によって示されている（青：疎水性／芳香族残基；緑：脂肪族極性残基；赤／深紫：陽電荷／陰電荷を有する残基；オレンジ／黄：グリシン／プロリン残基、これはＴＭドメイン中で屈曲を誘発している可能性がある；ピンク：ヒスチジン；淡青：チロシン）。それぞれのアミノ酸の膜貫通ドメイン（ＴＭ１〜７）中の位置が、細胞外ループＩＩ（ＥＣＩＩ）の位置と共に、図の下部のボックスで示されている。推定ＴＭ領域の正確な位置については、図２の説明を参照のこと。
【図５Ｂ】図５は、リガンドポケットベクター（計算モデルから決定された、その残基がおそらくリガンド結合に参加しているアミノ酸）の性質に基づく、ＴＡＡＲの類縁関係を示す。Ｂ：ＴＡＡＲタンパク質のリガンド結合ポケットの薬理作用団類似性の階層的ツリー表示。次のタンパク質は、「修復された偽遺伝子」として分析に含めた。かっこ中は修飾を示す：ｈＴＡＡＲ３Ψ（挿入：Ｃ１３５−、Ａ１３６−）、ｈＴＡＡＲ４Ψ（点突然変異：Ｔ４１１Ａ、欠失：−６０５Ｇ、−７５０Ａ）、ｍＴＡＡＲ７ｃΨ（挿入：Ｃ５１３−）、ｒＴＡＡＲ７ｆΨ（点突然変異：Ｇ５１５Ａ）、ｒＴＡＡＲ７ｉΨ（挿入：Ａ９０−）．スケールバー：薬理作用団多様性単位
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項２】
配列番号７を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号９を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１１を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１３を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１５を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１７を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２２を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２４を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２６を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２８を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号３０を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号３２を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号３４を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、薬物標的としての使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、統合失調症治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、片頭痛治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、うつ病治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、摂食障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、注意欠陥多動性障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項２１】
配列番号４を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号６を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号８を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号１０を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号１２を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１４を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号１６を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号２１を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号２３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号２５を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号２７を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号２９を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号３１を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列番号３３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項２１〜３４のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３６】
請求項３５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
請求項３６記載のポリヌクレオチドを含むヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３８】
配列ＮＳＸＸＮＰＸＸＺＸＸＸＢＸＷＦを含み、配列中、Ｘは自然に存在するいずれのアミノ酸であり、Ｚはチロシンまたはヒスチジンであることができ、Ｂはチロシンまたはフェニルアラニンであることができる、フィンガープリントモチーフ。
【請求項３９】
請求項３８記載のフィンガープリントモチーフを含む配列の、ＴＡＡＲを同定するための使用。
【請求項４０】
請求項３８のフィンガープリントモチーフを含み、配列番号３の配列とは異なる配列を有する、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項４１】
薬物標的としての、請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４２】
統合失調症治療、片頭痛治療、うつ病治療、摂食障害の治療、または注意欠陥多動性障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての、請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドを、候補化合物に接触させること、および
ｂ）化合物が前記ポリペプチドに結合するか否かを決定すること、
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法。
【請求項４４】
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドを、候補化合物に接触させること、および
ｂ）前記該化合物が前記ポリペプチドの機能または活性をモジュレーションしたか否かを決定すること、
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドの生物学的活性に対して、刺激または阻害効果を有する化合物を同定するための方法。
【請求項１】
配列番号５を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項２】
配列番号７を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号９を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１１を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１３を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１５を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１７を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２２を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２４を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２６を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２８を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号３０を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号３２を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号３４を含む、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、薬物標的としての使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、統合失調症治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、片頭痛治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、うつ病治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、摂食障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリペプチドの、注意欠陥多動性障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての使用。
【請求項２１】
配列番号４を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号６を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号８を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号１０を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号１２を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１４を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号１６を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号２１を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号２３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号２５を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号２７を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号２９を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号３１を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列番号３３を含む、単離されたまたは組換え型のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項２１〜３４のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３６】
請求項３５記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
請求項３６記載のポリヌクレオチドを含むヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３８】
配列ＮＳＸＸＮＰＸＸＺＸＸＸＢＸＷＦを含み、配列中、Ｘは自然に存在するいずれのアミノ酸であり、Ｚはチロシンまたはヒスチジンであることができ、Ｂはチロシンまたはフェニルアラニンであることができる、フィンガープリントモチーフ。
【請求項３９】
請求項３８記載のフィンガープリントモチーフを含む配列の、ＴＡＡＲを同定するための使用。
【請求項４０】
請求項３８のフィンガープリントモチーフを含み、配列番号３の配列とは異なる配列を有する、単離されたまたは組換え型のポリペプチド。
【請求項４１】
薬物標的としての、請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４２】
統合失調症治療、片頭痛治療、うつ病治療、摂食障害の治療、または注意欠陥多動性障害の治療に有用な化合物を同定するための薬物標的としての、請求項４０記載のポリペプチド。
【請求項４３】
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドを、候補化合物に接触させること、および
ｂ）化合物が前記ポリペプチドに結合するか否かを決定すること、
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法。
【請求項４４】
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドを、候補化合物に接触させること、および
ｂ）前記該化合物が前記ポリペプチドの機能または活性をモジュレーションしたか否かを決定すること、
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項または請求項４０記載のポリペプチドの生物学的活性に対して、刺激または阻害効果を有する化合物を同定するための方法。
【図１】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ａ−３】
【図２Ｂ−１】
【図２Ｂ−２】
【図２Ｂ−３】
【図２Ｂ−４】
【図２Ｂ−５】
【図２Ｃ−１】
【図２Ｃ−２】
【図２Ｃ−３】
【図２Ｃ−４】
【図２Ｃ−５】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ａ−３】
【図２Ｂ−１】
【図２Ｂ−２】
【図２Ｂ−３】
【図２Ｂ−４】
【図２Ｂ−５】
【図２Ｃ−１】
【図２Ｃ−２】
【図２Ｃ−３】
【図２Ｃ−４】
【図２Ｃ−５】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【公開番号】特開２００６−２０６３４（Ｐ２００６−２０６３４Ａ）
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００５−１９９９８４（Ｐ２００５−１９９９８４）
【出願日】平成１７年７月８日（２００５．７．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月２６日（２００６．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１９９９８４（Ｐ２００５−１９９９８４）
【出願日】平成１７年７月８日（２００５．７．８）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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