マツタケ菌糸体の製造方法
小スケール培養において、液体培地中に通気を行なわない条件下又は０．０５ｖｖｍ未満の低通気条件下で、マツタケ菌糸体を撹拌培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法を開示する。前記製造方法によれば、生理活性を損なうことなく、マツタケ菌糸体を大量に製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、マツタケ菌糸体の製造方法に関する。特には、マツタケ菌糸体の大量製造の母菌として利用可能なマツタケ菌糸体を製造し、これを利用して、マツタケ菌糸体を大量に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
国際公開第ＷＯ０２／３０４４０号パンフレット（特許文献１）の２７ページには、マツタケ菌糸体の乾燥粉末をストレス負荷回復促進に利用する提案がなされている。
マツタケ菌糸体の製造方法に関して、特公昭第６１−５３０３２号公報（特許文献２）の実施例１には、マツタケ菌の斜面寒天培養物を、デンプン類を含む液体培地中で、３０日間振盪培養し、更に、デンプン類を含む液体培地２０Ｌに接種して、３０日間通気撹拌培養して、マツタケ菌糸体を製造する方法が記載されている。
更に、特開平第１１−３１８４３３号公報（特許文献３）の実施例１には、市販のマツタケ子実体から分離した菌糸体を４日間平板培養し、野菜抽出物を含有する液体培地で４日間馴化培養し、更に、野菜抽出物を含有する液体培地２Ｌを加えた５Ｌの深層通気撹拌培養槽を用いて、６日間培養することにより、マツタケ菌糸体を製造できることが記載されている。
しかしながら、マツタケ菌糸体の大量製造に関して、生理活性を損なうことなく、大量製造を可能にする新たな提案が待望されている。
（特許文献１）国際公開第２００２−３０４４０号公報
（特許文献２）特公昭第６１−５３０３２号公報
（特許文献３）特開平第１１−３１８４３３号公報
【発明の開示】
本発明は、マツタケ菌糸体の大量製造の母菌として利用可能なマツタケ菌糸体を製造し、これを利用して、生理活性を損なうことなく、マツタケ菌糸体を大量に製造する方法を提供することを目的とするものである。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、マツタケ菌糸体を、小スケール培養において、液体培地中に通気を行なわない条件下又は低通気条件下で撹拌培養する（好ましくは、前記撹拌培養に用いるマツタケ菌糸体を、予め、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を種株として、所定の期間、静置液体培養し、次いで振盪培養する）ことにより、マツタケ菌糸体の量産に適したマツタケ菌の母菌が得られること、及び前記母菌を深部培養（例えば、深部撹拌培養）することにより、効率的にマツタケ菌糸体を量産できるという知見を得るに到った。
従って、本発明は、
［１］小スケール培養において、液体培地中に通気を行なわない条件下又は０．０５ｖｖｍ未満の低通気条件下で、マツタケ菌糸体を撹拌培養する工程（以下、非通気撹拌培養と称する）を含む、マツタケ菌糸体の製造方法；
［２］前記撹拌培養の前培養工程として、
（１）マツタケ菌糸体を静置液体培養する工程、
（２）マツタケ菌糸体を振盪培養する工程、あるいは、
（３）マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程
のいずれか１つの工程を更に含む、［１］の製造方法；
［３］前記撹拌培養工程における培養液単位体積あたりの撹拌所要動力が０．０１〜２ｋＷ／ｍ３である、［１］又は［２］の製造方法；
［４］マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程を含む、マツタケ菌糸体（特にはマツタケ菌糸体の製造用母菌）の製造方法；
［５］［１］〜［４］の製造方法で得られたマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、深部培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法；
［６］静置液体培養の期間が３０〜４００日間である、［２］〜［５］の製造方法；
［７］振盪培養の期間が５〜５０日間である、［２］〜［６］の製造方法；
［８］接種時拡大倍率２〜５０倍の拡大培養である、［１］〜［７］の製造方法；
［９］培養液の浸透圧を０．０１〜０．８ＭＰａに調製した培地を用いる、［１］〜［８］の製造方法；
［１０］初発菌糸体に含有されるファイバー状菌糸体の初発菌糸体濃度が０．０５ｇ／Ｌ以上である、［１］〜［９］の製造方法
に関する。
前記［５］の製造方法における前記深部培養工程の好ましい態様によれば、［１］〜［３］の製造方法で得られたマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、大スケール培養にて深部培養する。
更に、本発明は、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養し、次いで、振盪培養することを特徴とする、マツタケ菌糸体の製造方法に関する。
更に、本発明は、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養、次いで、振盪培養、更に、１００Ｌ未満の小型培養装置を用い、液体培地中に通気を行なわない撹拌培養を行なうことを特徴とする、マツタケ菌糸体の製造方法に関する。
更に、本発明は、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養、次いで、振盪培養、更に、１００Ｌ未満の小型培養装置を用い、液体培地中に通気を行なわない撹拌培養を行い製造したマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、１００Ｌ以上の中型又は大型培養装置で、深部培養によりマツタケ菌糸体を製造する方法に関する。
本明細書において、用語「小スケール培養」及び「大スケール培養」とは、微生物の大量培養で一般的に行われている段階的培養方法、すなわち、培養液量の少ない小スケールの培養から、順次、培養液量の多いスケールの培養へ移行する周知培養方法における用語「小スケール培養」及び「大スケール培養」を意味する。従って、「小スケール」及び「大スケール」の各範囲は、必ずしも具体的な培養液量で絶対的に規定されるものではなく、例えば、スケールアップの手順（特には培養装置の容積）に応じて適宜決定することのできる、相対的な概念である。
また、本明細書で用いる用語「小型培養装置」及び「大型培養装置」も、同様に、具体的な容積で絶対的に規定されるものではなく、例えば、スケールアップの手順（特には培養スケール）に応じて適宜決定することのできる、相対的な概念である。
なお、これらの好適範囲については、後述する各培養工程において詳述する。
また、本明細書中では、発明の理解を容易にするため、必要に応じて次のように記載する。
マツタケ菌の種株又はマツタケ菌の菌株をマツタケ菌Ｉと記載する。
マツタケ菌Ｉを固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、マツタケ菌ＩＩと記載する。
マツタケ菌ＩＩを静置液体培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＩＩＩと記載する。
マツタケ菌ＩＩＩを振盪培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＩＶと記載する。
マツタケ菌ＩＶを、小スケール培養において、あるいは、小型培養装置（例えば、容積１００Ｌ未満の小型培養装置）を用いて、培養液中に通気を行なわない条件下又は低通気条件下で撹拌培養を行い得られるマツタケ菌を、マツタケ菌Ｖと記載する。
マツタケ菌Ｖを、大スケール培養において、あるいは、大型培養装置（例えば、容積１００Ｌ以上の大型培養装置）を用いて、深部培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＶＩと記載する。
マツタケ菌ＶＩ、大スケール培養において、あるいは、大型培養装置（例えば、容積１００Ｌ以上の大型培養装置）を用いて、深部培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＶＩＩと記載する。
更に、マツタケ菌ＶＩＩ、大スケール培養において、あるいは、大型培養装置（例えば、容積１００Ｌ以上の大型培養装置）を用いて、深部培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＶＩＩＩと記載する。
【図面の簡単な説明】
図１は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが２００Ｌ培養槽であり、培養温度が２３±１℃である条件下で培養を実施した、撹拌所要動力と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」、「黒四角」、及び「黒三角」は、それぞれ、撹拌所要動力が０．１２ｋｗ／ｍ３、１．１ｋｗ／ｍ３、及び２．６ｋｗ／ｍ３の場合の結果である。
図２は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが２００Ｌ培養槽であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．１２ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、浸透圧と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」、「黒四角」、及び「黒三角」は、それぞれ、浸透圧が０．９８ＭＰａ、０．５ＭＰａ、及び０．０５ＭＰａの場合の結果である。
図３は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが５００ｍＬフラスコ振盪培養であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．１４ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、初発菌糸体濃度と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」、「黒四角」、「黒三角」、及び「×」は、それぞれ、初発菌糸体濃度が０．０６ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、及び１ｇ／Ｌの場合の結果である。
図４は、ファイバー状菌糸体の菌糸体形状を示す図面である。
図５は、ペレット状菌糸体の菌糸体形状を示す図面である。
図６は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが２００Ｌ培養槽（培養液量＝１４０Ｌ）であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．１２ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、母菌形状と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」及び「黒四角」は、それぞれ、母菌形状がファイバー状及びペレット状の場合の結果である。
図７は、母菌培養系の概要を示す説明図である。
図８は、本発明方法を実施するのに用いることができる培養システムを示す説明図である。
図９は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが６５ｍ３培養槽（培養液量＝４０ｍ３）であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．０１〜０．１２ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、培養日数と菌糸体濃度の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の製造方法では、非通気撹拌培養工程を少なくとも実施することにより、マツタケ菌糸体を製造することができる。本明細書において、非通気撹拌培養とは、液相（すなわち、培養液）への通気を行わないか、あるいは、液相への通気量が０．０５ｖｖｍ以下であって培養液中に実質的に通気を行わない撹拌培養を意味する。なお、培養装置の内圧を保持する目的で、気相に通気を行うことは、非通気撹拌培養の範疇に入るものとする。非通気撹拌培養工程で得られるマツタケ菌糸体それ自体を、最終製品とすることもできるし、あるいは、大量製造の母菌として用いることもできるが、大量製造の母菌として用いることが特に好ましい。
本発明の製造方法における非通気撹拌培養工程に用いるマツタケ菌糸体としては、例えば、増殖及び馴化等を目的とする適当な前培養を実施することにより得られるマツタケ菌糸体を用いることができ、前記前培養としては、例えば、静置液体培養若しくは振盪培養、又はそれらの組み合わせ（特には、静置液体培養及び振盪培養の連続実施）を挙げることができる。
以下、静置液体培養、振盪培養、非通気撹拌培養、及び深部培養の順に、本発明の製造方法を説明する。
本明細書におけるマツタケ菌とは、トリコローマ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）属、及びその近縁種に属する種の菌類を言う。例を挙げると、トリコローマ属としては、例えば、マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ）があり、その近縁種には、例えば、ニセマツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｆｕｌｖｏｃａｓｔａｎｅｕｍ Ｈｏｎｇｏ ｓｐ．ｎｏｖ．）、バカマツタケ（Ｔ．ｂａｋａｍａｔｓｕｔａｋｅ Ｈｏｎｇｏ ｓｐ．ｎｏｖ．）、又はマツタケモドキなどがある。
本発明の製造方法で使用するマツタケ菌、例えば、マツタケ菌の種株又はマツタケ菌の菌株であるマツタケ菌Ｉは、天然又は市販のマツタケ子実体から純粋分離した菌糸体を用いることができる。
更に、市販、あるいは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターなどに寄託されているマツタケ菌株も本発明において使用することができる。本発明で用いることのできる菌株の例を挙げると、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のＡＴＣＣ３４９７９株、ＡＴＣＣ３４９８１株、若しくはＡＴＣＣ３４９８８株、発酵研のＩＦＯ６９１５株、ＩＦＯ６９２５株、ＩＦＯ６９３０株、ＩＦＯ６９３５株、ＩＦＯ３０６０４株、ＩＦＯ３０６０５株、若しくはＩＦＯ３０６０６株、農生資源研のＭＡＦＦ４６００３８株、又は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているトリコローマ属のＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株などがある。
マツタケ菌ＩＩの培養又は保存に用いる培地は、一般的にマツタケ菌を培養する栄養源基質を有する培地であれば、特に制限無く使用することができる。例えば、太田培地［Ｏｈｔａ，Ａ（１９９０）Ｔｒａｎｓ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ ３１：３２３−３３４］、ＭＭＮ培地［Ｍａｒｘ，Ｄ．Ｈ．（１９６９）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５９：１５３−１６３］、又は浜田培地［浜田（１９６４）マツタケ、９７−１００］などを挙げることができる。
固形培地用の固形化剤の例を挙げると、カラギーナン、マンナン、ペクチン、寒天、カードラン、デンプン、又はアルギン酸などがあり、これらのうち寒天が好ましい。
使用可能な培地の栄養源基質には、例えば、炭素源、窒素源、及び無機元素源などがある。
炭素源の例を挙げると、デンプン類（例えば、米デンプン、小麦粉デンプン、バレイショデンプン、又はサツマイモデンプンなど）、多糖類（例えば、デキストリン、又はアミロペクチンなど）、少糖類（例えば、マルトース、又はシュクロースなど）、又は単糖類（例えば、フラクトース、又はグルコースなど）がある。更に、麦芽エキスを挙げることができる。マツタケ菌の生長速度から、グルコースなどの単糖類が好ましい時期と、デンプン類の好ましい時期とがあるので、時期に応じた炭素源を選択し、必要に応じて組み合わせて使用する。
窒素源の例を挙げると、天然由来物質である酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、大豆粉、又は大豆ペプトンなどがあり、その他の窒素源としては、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、又は尿素などもある。これらを単独で、又は組み合わせて使用することができる。一般に、生長速度を考慮すると天然由来物質、特に酵母エキスが好ましい。
無機元素源は、リン酸及び微量元素を供給するために使用する。例を挙げると、リン酸塩、金属イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、銅、又は鉄等）の硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、又はリン酸塩などの無機塩があり、必要量を培地中に溶解する。
更に、培地にビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）又はアミノ酸類を添加することもできる。
更に、使用するマツタケ菌の性質に応じて、植物抽出物、有機酸、又は核酸関連物質などを加えることができる。例を挙げると、果菜類、根菜類、又は葉菜類などの抽出物、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、又は乳酸などの有機酸、及び市販の核酸、核酸抽出物、酵母、又は酵母エキスなどの核酸関連物質がある。
固体培地を調製する場合、炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌである。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で、好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるように使用する。更に、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、及び／又は核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。また、調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．０、特に好ましくは５．０〜５．５とする。
（静置液体培養）
次に、マツタケ菌ＩＩ（固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌）を静置液体培養してマツタケ菌ＩＩＩを製造する方法について記載する。
通常、静置液体培養可能な培養容器（例えば、３０ｍＬ〜１０Ｌ容、好ましくは１００ｍＬ〜２Ｌ容の三角フラスコ）を用いて行う。
この静置液体培養は、液体培地にマツタケ菌ＩＩを接種することにより開始する。
接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた体積の、接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液の体積に対する比（以下において、「接種時拡大倍率」と記載）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍となる量の液体培地を使用する。
接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液中のマツタケ菌ＩＩの乾燥菌糸体重量と、接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた混合物の体積の比（以下において、「初発菌糸体濃度」と記載）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌ＩＩを含有する培養液を接種する。
本発明の静置液体培養では、培養温度を、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２５℃とし、好ましくは３０〜４００日間、より好ましくは１２０〜２４０日間培養する。培養期間が、３０日未満であっても、４００日間より長期間であっても、大量培養に適した生育能を有するマツタケ菌ＩＩＩを得ることが困難になる。
静置液体培養に使用する液体培地は、その浸透圧を好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
静置液体培養に用いる栄養源基質として、マツタケ菌Ｉを培養する固形培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）、又はアミノ酸類を使用することができる。
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩を使用する場合は、リン元素相当量で好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるようにする。
更に、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、及び核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。
調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
マツタケ菌ＩＩＩを含有している静置液体培養による培養液の一部又は全部を、マツタケ菌ＩＩを含有している培養液（若しくは、培養物）と同様に静置液体培養の接種源として、再度、静置液体培養工程で使用することもできる。
（振盪培養）
次に、マツタケ菌ＩＩＩを振盪培養して、マツタケ菌ＩＶを製造する方法について記載する。
通常、振盪培養可能な培養容器（例えば、３０ｍＬ〜１０Ｌ容、好ましくは３００ｍＬ〜５Ｌ容の三角フラスコ又は坂口フラスコ）を用いて行う。
この振盪培養は、液体培地にマツタケ菌ＩＩＩ（すなわち、静置液体培養により得られるマツタケ菌）を接種することにより開始することもできるし、あるいは、マツタケ菌ＩＩ（すなわち、固形培地又は液体培地で培養又は保存したマツタケ菌）を接種することにより開始することもできる。前記接種は、前段階で得られたマツタケ菌糸体をホモジェネート処理してから用いることが好ましい。
接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた体積の、接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液の体積に対する比（以下において、「接種時拡大倍率」と記載）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。
なお、接種時拡大倍率に見合う培養液の量を確保するために、静置液体培養を複数の培養容器を用いて製造することもできる。
接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液中のマツタケ菌ＩＩＩの乾燥菌糸体重量と、接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた混合物の体積の比（以下において、「初発菌糸体濃度」と記載）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液を接種する。
振盪培養では、培養温度を、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２５℃とし、好ましくは５〜５０日間、より好ましくは７〜５０日間、より好ましくは１４〜２８日間実施し、撹拌培養に用いるマツタケ菌ＩＶを製造する。
振盪培養に要する動力として、通常、三角フラスコ内の培養液単位体積あたりの撹拌所要動力０．０１〜２ｋＷ／ｍ３、好ましくは０．０５〜０．４ｋＷ／ｍ３を用いる。
振盪培養に使用する液体培地は、その浸透圧を好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは、０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
振盪培養に用いられる栄養源基質として、マツタケ菌ＩＩを培養する液体培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）、又はアミノ酸類を使用することができる。
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるようにする。
更に、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、及び／又は核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。
調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
（非通気撹拌培養）
次に、非通気撹拌培養により、マツタケ菌Ｖを製造する方法について記載する。
この撹拌培養は、液体培地にマツタケ菌ＩＶ（すなわち、振盪培養工程により得られるマツタケ菌）又はマツタケ菌ＩＩＩ（すなわち、静置液体培養により得られるマツタケ菌）を接種することにより開始する。前記接種は、前段階で得られたマツタケ菌糸体をホモジェネート処理してから用いることができる。
以下、マツタケ菌ＩＶを接種する場合を例に取り、非通気撹拌培養工程を説明するが、マツタケ菌ＩＩＩを用いても同様にして実施することができる。また、撹拌培養で得られるマツタケ菌を、再度、撹拌培養に用いることもできる。
非通気撹拌培養で用いる液体培地は、次のようにして調製することができる。
栄養源基質は、振盪培養で使用する、炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）、又はアミノ酸類と同じものを使用することができる。
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌであり、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。デンプン類を好ましく使用できる。
非通気撹拌を行なう培養液中の浸透圧に影響するグルコースなどの単糖類を併用する場合、その使用量は、好ましくは０．１〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜４０ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．７〜２０ｇ／Ｌである。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるようにする。
更に、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、及び／又は核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて、適宜、添加することができる。
調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
非通気撹拌培養に使用する液体培地は、その浸透圧を好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
非通気撹拌培養の培養温度は、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２５℃である。
接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液と液体培地とを合わせた体積の、接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液の体積に対する比（以下において、「接種時拡大倍率」と記載）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。
接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液中のマツタケ菌（ＩＶ）の乾燥菌糸体重量と、接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液と液体培地とを合わせた混合物の体積の比（以下において、「初発菌糸体濃度」と記載）を、好ましくは０．０１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液を接種する。なお、初発菌糸体の内、０．００５〜５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０２５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０５〜２ｇ／Ｌがファイバー状菌糸体であることが望ましい。
非通気撹拌培養で得られるマツタケ菌（Ｖ）を、次の深部培養の母菌として用いる場合の培養日数は、好ましくは３〜２０日間、より好ましくは５〜１４日間実施する。
これらの培養日数後に、マツタケ菌（Ｖ）の乾燥菌糸体含有量が、好ましくは０．５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜８ｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｇ／Ｌになっている培養液は、深部培養に適した生育能を有するマツタケ菌（Ｖ）を含有している。
非通気撹拌培養で得られるマツタケ菌（Ｖ）を、マツタケ菌糸体として分離する場合の培養日数は、好ましくは５〜３０日間、より好ましくは７〜２０日間、特に好ましくは１０〜１５日間実施する。
これらの培養日数から、炭素源の資化速度が著しく低下した時を培養終了とするのが好ましいが、適宜、製造サイクル又は製造コスト等の製造形態に合わせて決定することができる。
振盪培養及びそれ以降の工程では、マツタケ菌糸体は、大別して、ペレット状とファイバー状の形状をとる。本発明の製造方法では、各工程で得られた菌糸体を次の工程の母菌として使用する場合には、その菌糸体の５０％以上（より好ましくは８０％以上）がファイバー状であることが好ましい。ファイバー状の菌糸体は、次の液体培地に接種した場合、ペレット状菌糸体と比べ、速やかな増殖を得ることができる。なお、菌糸体全体の量が充分確保することができる場合には、ファイバー状菌糸体が前記割合よりも低くても、ファイバー状菌糸体の絶対量を充分に確保することができるため、前記割合に限定されるものではない。なお、ファイバー状菌糸体とペレット状菌糸体の比率は、例えば、目開き１ｍｍ程度のメッシュ等で水篩することにより測定することができる。
一方、その工程が最後の工程となり、最終製品としてのマツタケ菌糸体を分離する場合には、マツタケ菌糸体の量を充分に確保することが重要であるので、ペレット状又はファイバー状のいずれの形状であるかは重要でなく、ペレット状とファイバー状との割合も特に限定されるものではない。
非通気撹拌培養は、小スケール培養、すなわち、小スケールの培養液を用いて実施する。非通気撹拌培養で用いることのできる培養液量は、通常の微生物の大量培養における一般的な段階的培養において実施される小スケール培養の範囲を超えない限り、特に限定されるものではない。非通気撹拌培養で用いることのできる培養液量は、通常、１０００Ｌ未満であり、好ましくは５００Ｌ未満、より好ましくは１００Ｌ未満である。また、培養液量の下限は、通常、０．８Ｌ以上であり、好ましくは４Ｌ以上である。
非通気撹拌培養に使用する培養装置としては、例えば、無菌性を確保することができ、小スケール培養が可能な培養装置を用いることができる。このような培養装置としては、小型培養装置、例えば、容積が１０００Ｌ以下（好ましくは５００Ｌ以下、より好ましくは１００Ｌ以下、特に好ましくは１００Ｌ未満）の小型培養装置（例えば、ジャーファーメンター又は小型培養槽）を使用することができる。なお、前記培養装置の容量の下限は、通常、１Ｌ以上であり、好ましくは５Ｌ以上である。
マツタケ菌ＩＶの培養を行いマツタケ菌Ｖを製造する場合、液体培地中に通気せずに、撹拌培養を行なう。小スケール培養（例えば、１００Ｌ未満のジャーファーメンター又は小型培養槽）で通気を行なって培養すると、菌糸が凝集し、成長点が欠失して母菌としての生育能が損なわれる場合があるからである。
非通気撹拌培養における撹拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの撹拌所要動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ３、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ３の範囲で撹拌を行なうことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育をはじめ、酸素供給量が不足し、更に、生育した菌糸体の分散が不充分になるので、適宜、撹拌の強度を大きくすることが必要になる。
非通気撹拌培養から得られたマツタケ菌糸体の分離及び回収は、常法によって行なうことができる。例えば、フィルタープレスなどによるろ過、又は遠心分離などである。得られたマツタケ菌糸体は、その使用目的に応じて、乾燥し、又は乾燥しないで、破砕、抽出又は成形して製品化する。
（深部培養）
深部培養では、マツタケ菌Ｖ、すなわち、非通気撹拌培養で得られるマツタケ菌を、液体培地に接種することにより開始することができる。また、深部培養で得られるマツタケ菌（例えば、マツタケ菌Ｖ〜ＶＩＩ）を、再度、深部培養に用いることもできる。更には、マツタケ菌ＩＶ、すなわち、振盪培養工程により得られるマツタケ菌（特には、静置液体培養し、続いて、振盪培養することにより得られるマツタケ菌）を、深部培養に用いることもできる。前記接種は、前段階で得られたマツタケ菌糸体をホモジェネート処理してから用いることができる。
また、深部培養とは、空気を培養槽外から培養液中に強制的に供給し、撹拌装置による機械的撹拌、あるいは、ドラフトチューブ又は分散板等によって通気される気泡を微粒化し、気液界面を大きくさせ、しかも、培養液中の気泡の滞留時間を大きくさせることにより、微生物への酸素供給を効率よく行う方法である。例えば、通気撹拌培養槽による培養、気泡塔型培養槽（エアリフト型培養槽）による培養、又は流動層型培養槽による培養などを挙げることができる。
深部培養で用いる液体培地は、非通気撹拌培養で用いる液体培地と同じものを使用することができる。また、非通気撹拌培養と同じ基質を用いることができ、目標収量に合わせて基質濃度を調整することができる。但し、基質由来の浸透圧を０．０１〜０．８ＭＰａに調整することが望ましい。
また、培養温度、接種時拡大倍率、初発菌糸体濃度、培養日数、及び撹拌所要動力についても、非通気撹拌培養と同様にして実施することができる。
深部培養は、大スケール培養、すなわち、大スケールの培養液を用いて実施することが好ましい。深部培養で用いることのできる培養液量は、通常の微生物の大量培養における一般的な段階的培養において実施される大スケール培養の範囲を超えない限り、特に限定されるものではない。深部培養で用いることのできる培養液量は、通常、１００Ｌ以上であり、好ましくは１０００Ｌ以上、より好ましくは３０００Ｌ以上である。
深部培養に使用する培養装置としては、必要に応じて通気することができ、深部撹拌ができ、無菌性を確保することができ、大スケール培養が可能な培養装置を用いることができる。このような培養装置としては、大型培養装置、例えば、容積が１００Ｌ以上、好ましくは１０００Ｌ以上、より好ましくは３０００Ｌ以上の大型培養装置を用いることができる。なお、前記大型培養装置には、中型培養装置と称されることのある培養装置も含まれる。
大スケール培養（例えば、１００Ｌ以上の大型培養槽などの培養装置）により工業スケールで深部培養を行なう場合、必要に応じて通気を行なう。この場合の通気量は、０．０５〜１．０ｖｖｍ、特に、０．２〜０．５ｖｖｍとするのが好ましい。
深部培養における撹拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの撹拌所要動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ３、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ３の範囲で撹拌を行なうことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育をはじめ、酸素供給量が不足し、更に、生育した菌糸体の分散が不充分になるので、適宜、撹拌の強度を大きくすることが必要になる。深部培養では、培養初期には低通気及び低撹拌速度で培養し、培養後期には高通気及び高撹拌速度で培養するのが好ましい。
深部培養から得られたマツタケ菌糸体の分離及び回収は、常法によって行なうことができる。例えば、フィルタープレスなどによるろ過、又は遠心分離などである。得られたマツタケ菌糸体は、その使用目的に応じて、乾燥し、又は乾燥しないで、破砕、抽出又は成形して製品化する。
以下、マツタケ菌糸体としてマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を用いた場合を例に取り、本発明方法について、更に説明する。なお、以下の説明は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株以外のマツタケ株についても、通常、当てはまる。
１．生育特性
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は環境要因に敏感である。物理的な環境要因は、撹拌由来の機械的衝撃及び浸透圧などが考えられる。また、生育に時間を要するため、短期間で培養を終了するためには、各継代時に多量の母菌を必要とし、大量接種が可能な培養システムの構築が必要である。
２．基本培養条件
（１）機械的衝撃への耐性
通気撹拌培養での撹拌の主な目的は、酸素及び栄養源の拡散である。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の増殖速度は遅く、酸素要求量は小さく、過剰な酸素供給は不要と考える。図１は撹拌所要動力と生育の関係を示したグラフである。撹拌所要動力が大きい場合、菌糸体の生育が阻害される。また、溶存酸素の低下が見られないことから、撹拌の影響は機械的衝撃が支配的と考えられる。
更に、撹拌所要動力の大きな系では、菌糸体形状がペレット化する傾向があり、生育が停滞する。この原因は、撹拌による凝集効果に起因すると考えられる。本菌株の生育において、菌糸体への機械的ダメージ及びペレット化が重要な要因となっている。
（２）生育と浸透圧
通常、担子菌の炭素源資化経路は、糖類をグルコースに分解し、グルコース−６−リン酸に変換した後に細胞内に取り込むと考えられる。つまり、一般には多糖類に比してグルコースなどの単糖類の資化効率が高いといえる。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株においても同様にグルコースを経て多糖類を資化することが推測されるが、グルコース濃度の高い高浸透圧の培養液中では、生育が阻害される傾向がある。図２は培地中の炭素源にデンプン及びグルコースを混合し、浸透圧を調整し、培養を行った実験結果である。グルコース濃度の高い系では、生育が得られにくい傾向があり、浸透圧に対する耐性が小さいことが示唆される。そこで、デンプンを主炭素源とした培地にグルコースを微量添加することで、２つの炭素源の特性を活用する培地処方を採用することができる。
（３）必要母菌量
マツタケ菌は生育が遅いことが知られているが、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株も同様、生育速度は遅い傾向をもつが、工業的な生産培養を実施する上では、一定期間内に有効な生育を得ることが望ましい。図３はＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の母菌接種量と生育速度の関係を検討した結果を示す。初発菌糸体濃度０．１〜２．０ｇ／Ｌ程度（その内、ファイバー状菌糸体が０．０５〜２．０ｇ／Ｌ）の条件の生育が早く、工業的な培養においては多量の接種量が必要であることが示唆される。特に低接種量の場合、誘導期間が著しく長く工業的な培養が困難となる傾向がある。
（４）菌糸体形状の制御
糸状菌の培養において、菌糸体の形状は生育に大きな影響を与えることが知られている。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は大別して、ファイバー状（図４）とペレット状（図５）の形状をとるが、ファイバー状の菌糸体が生育が有利である。図６はペレット状の母菌とファイバー状の母菌を接種し、生育を確認した生育曲線であるが、ペレット状の母菌を接種した系では有効な生育が得られない傾向がある。そのため、菌糸体形状の制御は工業生産において重要な要件となる。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体形状に寄与する要因として、例えば、培養液の流動、母菌接種量、培地処方等が挙げられる。特に、小型のジャーファーメンターにおいては通気による培養液の流動により菌糸体が相互に絡み合い、融着してペレットを形成する傾向があり、良好な前培養母菌を得るためには、通気方法を最適化することが好ましい。ペレット状菌糸体は母菌として効率的生育を示さないため、工業的な培養を行う上では、母菌中に含まれるファイバー状菌糸体の母菌全体の比率で５０％以上、特に８０％とすることが好ましい。但し、次世代での初発菌糸体（乾燥重量換算）の内、ファイバー状菌糸体濃度が０．０５〜２ｇ／Ｌ程度確保することができれば、これに代えることができる場合がある。
３．培養システム
（１）母菌培養系
前述のように、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は大量の母菌を必要とする傾向があるため、大量の母菌を培養するシステムを用いることが好ましい。そこで、図７に示すように、固形培地で継代保存した母菌を多段階に静置培養した後、振盪培養を行う母菌培養法を確立した。この培養方法は液体培地への馴化を目的としている。
（２）タンク培養系
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の生育を速やかに得るためには、大量の母菌を必要とする傾向があることは前述のとおりである。従って、タンク培養においても同様であり、初発菌糸体濃度０．１〜２．０ｇ／Ｌ程度であることが好ましい。また、培養開始時の培養液中の菌糸体は、初発菌糸体濃度として０．０５〜２．０ｇ／Ｌ程度のファイバー状菌糸体が含まれていることが好ましい。図８は、本発明方法を実施するのに用いることができる培養システムである。タンク培養系は本培養を含め、４段階としており、いずれも０．１〜２．０ｇ／Ｌ程度の初発菌糸体濃度を確保するため、拡大倍率を５〜１５倍程度に設定している。図８に示す培養システムと培養法により、本培養１２〜１４日間で、１２〜１４ｇ／Ｌ程度の菌糸体収量確保が可能となった。図９に生産培養の生育曲線の一例を示す。
【実施例】
以下に本発明に係わる、マツタケ菌糸体の大量製造の母菌として利用可能なマツタケ菌糸体を製造し、これを利用して、マツタケ菌糸体を大量に製造する方法を実施例で説明する。
実施例において、使用したマツタケ菌は、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株である。マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）］に平成１２年９月１４日より寄託しているものである。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４の菌学的性質については、国際公開第ＷＯ０２／３０４４０号パンフレット（特許文献１）に記載されている。例えば、１０ｍＬのエビオス寒天斜面培地を入れた試験管中で維持されている。
先述のマツタケ菌ＩＩ〜マツタケ菌ＶＩＩＩに対応する、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４を使用して得られたマツタケ菌を、マツタケ菌（ＩＩ−１）〜マツタケ菌（ＶＩＩＩ−１）と記載した。
撹拌培養に以下の装置を使用した。
実施例３、比較例２−１、又は比較例３−１（非通気の場合）において、６枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した３０Ｌ容のジャーファーメンターから通気用スパージャーを取り外して使用した。実施例又は比較例、各々において、３０Ｌ容ジャーファーメンターと記載した。
比較例３−１において、６枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した３０Ｌ容のジャーファーメンターを使用した。比較例３−１において、スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンターと記載した。
実施例４、実施例７−１〜７−４、実施例８−２、８−３、実施例９−１〜９−３、又は実施例１１−１において、４枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した２００Ｌ容培養槽を使用した。実施例、各々において、２００Ｌ容培養槽と記載した。
実施例５において、６枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した７ｍ３容培養槽を使用した。実施例５において、７ｍ３容培養槽と記載した。
実施例６において、６枚ディスクタービン翼３段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した６５ｍ３容培養槽を使用した。実施例６において、６５ｍ３容培養槽と記載した。
実施例２〜６、実施例７−１、実施例９−１、実施例１０−１〜１０−３、又は実施例１１−１に「培養液単位体積当たりの撹拌所要動力」と記載されている中の培養液は、各々で使用されている、２Ｌ容三角フラスコ、３０Ｌ容ジャーファーメンター、スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンター、２００Ｌ容培養槽、７ｍ３容培養槽、又は６５ｍ３容培養槽の中の全内容物（接種母菌の培養液も含む）を意味しており、調合した液体培地のみを意味しているのではない。
栄養源基質として、実施例４、実施例７−１、実施例９−１、又は実施例１１−１において、２００Ｌ容培養槽を用いて、培地を調製する際に、次の３通りの組み合わせのいずれかを記載する必要のある場合には、Ａ型基質、Ｂ型基質、又はＣ型基質と記載した。
Ａ型基質：（１）バレイショデンプン４．９ｋｇ、（２）グルコース１４０ｇ、（３）乾燥酵母エキス２８０ｇ、（４）リン酸二水素カリウム２８０ｇ、（５）硫酸マグネシウム・７水和物４２ｇ、（６）塩化カルシウム・２水和物０．８４ｇ、（７）硫酸亜鉛・７水和物０．５６ｇ、（８）塩化マンガン・４水和物０．７０ｇ、（９）硫酸銅・５水和物０．１４ｇ、（１０）塩化鉄・６水和物１．１２ｇ、及び（１１）チアミン塩酸塩０．１４ｇ。
Ｂ型基質：Ａ型基質と、（３）乾燥酵母エキス３２０ｇのみ異なっている。他［（１）、（２）、及び（４）〜（１１）］は内容及び使用量ともにＡ型基質と同じ。
Ｃ型基質：Ａ型基質及びＢ型基質と、（４）〜（１１）の内容と使用量が同じで、乾燥酵母エキス６４０ｇと、バレイショデンプンとグルコースの使用量が異なっている。バレイショデンプンとグルコースの使用量は実施例１１−１〜１１−３に記載の量を使用した。
以下の実施例１〜実施例６で、５００ｍＬ容三角フラスコから６５ｍ３容培養槽まで製造規模を拡大して行く過程を示した。
実施例１：５００ｍＬ容三角フラスコを用いた、静置液体培養によるマツタケ菌（ＩＩＩ−１）の製造方法
グルコース３０ｇ／Ｌ及び乾燥酵母エキス３ｇ／Ｌとなるように水道水に溶解し培地を調製した。接種後の培地の浸透圧は、０．４ＭＰａであった。この培地を５００ｍＬ容の三角フラスコに１２０ｍＬ分注し、滅菌した。上記培地組成に静置液体培養で継代保存していたマツタケ菌（ＩＩ−１）を含有する培養液１０ｍＬを接種し、２３±２℃の条件下で１８０日間静置液体培養し、マツタケ菌（ＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液を製造した。
接種時拡大倍率１３倍、初発菌糸体濃度０．３８ｇ／Ｌ。
実施例２：振盪培養によるマツタケ菌（ＩＶ−１）の製造方法
グルコース３０ｇ／Ｌ、乾燥酵母エキス１ｇ／Ｌ、大豆ペプトン２ｇ／Ｌ、麦芽エキス１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム・７水和物０．３ｇ／Ｌとなるように水道水に溶解し、培地を調製した。この培地を２Ｌ容の三角フラスコに８７０ｍＬ分注し、滅菌した。この８７０ｍＬの培地に、実施例１のようにして製造した、マツタケ菌（ＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液１３０ｍＬをホモジェネート処理後に接種し、ロータリーシェイカーで培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１４ｋｗ／ｍ３、２３±２℃の条件下で２０日間振盪培養し、マツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体４．８ｇ／Ｌ）を含有する培養液を製造した。接種後の浸透圧は、０．４ＭＰａであった。
接種時拡大倍率７．７倍、初発菌糸体濃度０．６５ｇ／Ｌ。
実施例３：３０Ｌ容ジャーファーメンターによるマツタケ菌（Ｖ−１）の製造方法
バレイショデンプン６００ｇ、グルコース６０ｇ、乾燥酵母エキス４０ｇ、リン酸二水素カリウム４０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物６ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．１２ｇ、硫酸亜鉛・７水和物０．０８ｇ、塩化マンガン・４水和物０．１ｇ、硫酸銅・５水和物０．０２ｇ、塩化鉄・６水和物０．１８ｇ、及びチアミン塩酸塩０．０２ｇを３０Ｌ容ジャーファーメンター内で水道水に溶解し、滅菌し、１８Ｌの培地を調製した。接種後の培地の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。
この培地に、実施例２のようにして製造した、マツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌを含有する培養液２Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．０８ｋｗ／ｍ３、２３±２℃の条件下で、培養液中に通気用スパージャーから通気することなしに、７日間培養し、マツタケ菌（Ｖ−１）乾燥菌糸体含有量１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．９５ｇ／Ｌ）の培養液を製造した。接種時拡大倍率１０倍、初発菌糸体濃度０．５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．４５ｇ／Ｌ）。
実施例４：２００Ｌ容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩ−１）の製造方法
Ａ型基質を２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌して１２０Ｌの培地を調製した。培地の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。この培地に、実施例３のようにして製造した、マツタケ菌（Ｖ−１）乾燥菌糸体１ｇ／Ｌを含有する培養液２０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋｗ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で７日間深部培養し、マツタケ菌（ＶＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体２．７ｇ／Ｌ）の培養液を製造した。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
実施例５：７ｍ３容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩＩ−１）の製造方法
溶性デンプン１４０ｋｇ、グルコース４ｋｇ、乾燥酵母エキス８ｋｇ、リン酸二水素カリウム８ｋｇ、硫酸マグネシウム・７水和物１．２ｋｇ、塩化カルシウム・２水和物２４ｇ、硫酸亜鉛・７水和物１６ｇ、塩化マンガン・４水和物２０ｇ、硫酸銅・５水和物４ｇ、塩化鉄・６水和物３２ｇ、及びチアミン塩酸塩４ｇを７ｍ３容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌し、培地３．７２ｍ３を調製した。培地の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。この培地に、実施例４のようにして製造した、マツタケ菌（ＶＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌの培養液、２槽相当分である２８０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．０５ｋｗ／ｍ３、通気量１．２ｍ３／ｍｉｎ、温度２３±２℃で、７日間深部培養し、マツタケ菌（ＶＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体２．６ｇ／Ｌ）の培養液を製造した。
接種時拡大倍率１４．３倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例６：６５ｍ３容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩＩＩ−１）の製造方法
溶性デンプン１５７５ｋｇ、グルコース４５ｋｇ、乾燥酵母エキス１３５ｋｇ、リン酸二水素カリウム９０ｋｇ、硫酸マグネシウム・７水和物１３．５ｋｇ、塩化カルシウム・２水和物２７０ｇ、硫酸亜鉛・７水和物１８０ｇ、塩化マンガン・４水和物２２５ｇ、硫酸銅・５水和物４５ｇ、塩化鉄・６水和物３６０ｇ、及びチアミン塩酸塩４５ｇを６５ｍ３容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌し、３６ｍ３の培地を調製した。接種後の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。
この培地に、実施例５のようにして製造した、マツタケ菌（ＶＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌの培養液、１槽相当分である４ｍ３を接種し、通気量１２ｍ３／ｍｉｎ、温度２３±２℃で、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．０１３ｋｗ／ｍ３で培養を開始し、その後、菌糸の伸張をみて、適宜、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力を大きくしていき、１２日目に０．１２ｋｗ／ｍ３とし、１３日間深部培養して、マツタケ菌（ＶＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量１３．５ｇ／Ｌの培養液を製造した。
接種時拡大倍率１０倍、初発菌糸体濃度０．３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．２６ｇ／Ｌ）。
比較例１
静置液体培養によるマツタケ菌（ＩＩＩ−１）を含有している培養液が振盪培養に及ぼした効果：静置液体培養の工程を経ない培養物と比較。
マツタケ菌（ＩＩ−１）を含有しているエビオス寒天斜面培地培養物１０ｍＬを用いる他は、実施例２と同様に、２０日間振盪培養した。
２０日後の培養液から乾燥菌糸体含有量を求めることができなかった。
【実施例７】
静置液体培養によるマツタケ菌（ＩＩＩ−１）を含有している培養液の製造期間が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：実施例１の１８０日間静置液体培養と、３０日間静置液体培養、５０日間静置液体培養及び、４００日間静置液体培養で製造した培養液を用いて比較。
実施例７−１：１８０日間静置液体培養
実施例１、実施例２、次いで、実施例３と同様にして、マツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液を製造した。
他方、Ｂ型基質を２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌して１２０Ｌの培地を調製した。この培地に、マツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液２０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
実施例７−２：３０日間静置液体培養
静置液体培養の期間のみ３０日間とする他は、実施例１と同様に培養した培養液を用いて、実施例２、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液２０Ｌ用いる他は、２００Ｌ容培養槽で実施例７−１に準じた培養操作を行った。
乾燥菌糸体含有量２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
実施例７−３：５０日間静置液体培養
静置液体培養の期間のみ５０日間とする他は、実施例１と同様に培養した培養液を用いて、実施例２、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液を２０Ｌ用いる他は、２００Ｌ容培養槽で実施例７−１に準じた培養操作を行った。
乾燥菌糸体含有量８ｇ／Ｌの培養液が得られた。
実施例７−４：４００日間静置液体培養
静置液体培養の期間のみ４００日間とする他は、実施例１と同様に培養した培養液を用いて、実施例２、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液２０Ｌを用いる他は、２００Ｌ容培養槽で実施例７−１に準じた培養操作を行った。
乾燥菌糸体含有量６ｇ／Ｌの培養液が得られた。
比較例２
振盪培養によるマツタケ菌（ＩＶ−１）を含有している培養液が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：振盪培養の工程を経ない培養液と比較
比較例２−１：振盪培養抜き
実施例１で製造した、マツタケ菌（ＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液２Ｌを用いて、菌糸体をホモジェネート処理後、実施例３と同様の培養操作で、３０Ｌ容ジャーファーメンターで培養を行ったが、７日間培養後の培養液から乾燥菌糸体含有量を求めることができなかった。
なお、２０日間振盪培養を実施した結果は、実施例７−１に示すとおりである。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
【実施例８】
振盪培養によるマツタケ菌（ＩＶ−１）を含有している培養液が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：実施例２の２０日間振盪培養と、５日間振盪培養、３日間振盪培養とで得られた培養液を用いて比較。
実施例８−１：２０日間振盪培養
実施例７−１に示すとおりである。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
実施例８−２：５日間振盪培養
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養期間を５日間とする他は、実施例２と同様にして培養液を製造し、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で、実施例７−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量７ｇ／Ｌの培養液が得られた。
実施例８−３：３日間振盪培養
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養期間を３日間とする他は、実施例２と同様にして培養液を製造し、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で、実施例７−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量０．５ｇ／Ｌの培養液が得られた。
比較例３
３０Ｌ容ジャーファーメンターを用いた、通気しない撹拌培養によるマツタケ菌（Ｖ−１）を含有する培養液が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて培養中に通気して得られた培養液との比較。
比較例３−１：マツタケ菌（ＩＶ−１）培養時に培養液に通気した場合
実施例１、次いで、実施例２で製造した培養液を用いて、スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンターを使用して、２Ｌ／ｍｉｎの通気をする他は、実施例３と同様の操作を行い、培養液を製造した。この培養液中の菌糸は凝集していた。培養終了時の乾燥菌糸体含有量は０．６ｇ／Ｌで、その内、ファイバー状菌糸体０．０３ｇ／Ｌであった。この培養液を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で、実施例７−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液が得られた。
なお、マツタケ菌（ＩＶ−１）培養時に培養液に通気しない場合は、実施例７−１に示すとおりである。実施例３と同様に、３０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、培養液に通気しないで培養した培養液中の菌糸の多くはファイバー状であり、培養終了時の乾燥菌糸体含有量は１ｇ／Ｌで、その内、ファイバー状菌糸体０．９５ｇ／Ｌであった。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
【実施例９】
通気した深部培養によるマツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液の使用量が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：実施例４で得られた培養液の使用量を変えて比較：
実施例９−１：マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を１０Ｌ接種
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を製造した。
他方、Ｂ型基質を２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解・滅菌して１３０Ｌの培地を調製した。この１３０Ｌの培地に、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液１０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例９−２：マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を５Ｌ接種
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で製造した、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を５Ｌ使用し、更に、無菌水を５Ｌ使用する他は、２００Ｌ容培養槽で実施例９−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量１０ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率２８倍、初発菌糸体濃度０．１０７ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０９７ｇ／Ｌ）。
実施例９−３：マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を２Ｌ接種
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で製造した、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を２Ｌ使用し、更に、無菌水を８Ｌ使用する他は、２００Ｌ容培養槽で、実施例９−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７０倍、初発菌糸体濃度０．０４３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０４ｇ／Ｌ）。
【実施例１０】
通気した深部培養によるマツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を母菌に使用して２００Ｌ容培養槽による深部培養する際の撹拌条件が菌糸体生成に及ぼした効果：
実施例１０−１：培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３
実施例９−１に示すとおりである。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１０−２：培養液単位体積当たりの撹拌所要動力１．０９ｋＷ／ｍ３
培養液単位体積当たりの撹拌所要動力を１．０９ｋＷ／ｍ３にする他は、実施例１０−１と同様に、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量７ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１０−３：培養液単位体積当たりの撹拌所要動力２．６３ｋＷ／ｍ３〔
培養液単位体積当たりの撹拌所要動力を２．６３ｋＷ／ｍ３にする他は、実施例１０−１と同様に、１２日間深部培養したが、１２日後の培養液から乾燥菌糸体含有量を求めることができなかった。
【実施例１１】
通気した深部培養によるマツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培地を母菌に使用して２００Ｌ容培養槽による深部培養する際の炭素源の違いが菌糸体生成に及ぼした効果：バレイショデンプンとグルコースとの使用量（指標としての浸透圧）による比較。
実施例１１−１：浸透圧０．０５ＭＰａ
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を製造した。
他方、Ｃ型基質、バレイショデンプン９．８ｋｇ及び、グルコース１４０ｇを２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌して、浸透圧０．０５ＭＰａの培地１３０Ｌを調製した。この１３０Ｌの培地に、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液１０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で本培養として１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量１４ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１１−２：浸透圧０．５０ＭＰａ
バレイショデンプン４．９７ｋｇ、グルコース４．９７ｋｇを使用して、浸透圧０．５０ＭＰａの培地１３０Ｌを作製する他は、実施例１１−１と同様に操作し、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量９．５ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１１−３：浸透圧０．９８ＭＰａ
バレイショデンプン１４０ｇ、グルコース９．８ｋｇを使用して、浸透圧０．９８ＭＰａの培地１３０Ｌを作製する他は、実施例１１−１と同様に操作し、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
【実施例１２】
振盪培養の撹拌所要動力がマツタケ菌（Ｖ）の形状と生育活性に及ぼした効果。
実施例１２−１：撹拌所要動力１．６ｋｗ／ｍ３
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養の培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を１．６ｋｗ／ｍ３とすること以外は、実施例２と同様にしてマツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体３．２ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体２．２ｇ／Ｌ）を含有する培養液を製造した。次いでマツタケ菌（ＩＶ−１）の接種量を３Ｌ（実施例３と初発菌糸体濃度を同等とするため）とする以外は実施例３と同様の培養操作を行ったところ、３０Ｌ容ジャーファーメンターによるマツタケ菌（Ｖ−１）から得られた乾燥菌糸体濃度は０．７５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．６ｇ／Ｌ）であった。
接種時拡大倍率６．７倍、初発菌糸体濃度０．４８ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．３８ｇ／Ｌ）。
次いで、このマツタケ菌（Ｖ）を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で上記マツタケ菌（Ｖ）を２０Ｌ接種すること以外は実施例７−１に準じた培養を行った。培養終了時の乾燥菌糸体濃度は９．７ｇ／Ｌであった。
実施例１２−２：撹拌所要動力２．２ｋｗ／ｍ３
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養の培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を２．２ｋｗ／ｍ３の高速回転とすること以外は、実施例２と同様にしてマツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体２．４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０１３ｇ／Ｌ）を含有する培養液を製造した。次いでマツタケ菌（ＩＶ−１）の接種量を４Ｌ（実施例３と初発菌糸体濃度を同等とするため）とする以外は実施例３と同様の培養操作を行ったところ、３０Ｌ容ジャーファーメンターによるマツタケ菌（Ｖ−１）から得られた乾燥菌糸体濃度は０．５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０１ｇ／Ｌ）であった。
接種時拡大倍率５倍、初発菌糸体濃度０．４８ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．００２６ｇ／Ｌ）。
次いで、このマツタケ菌（Ｖ）を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽でマツタケ菌（Ｖ）の接種量を２０Ｌとする以外は実施例７−１に準じた培養を行った。培養終了時の乾燥菌糸体濃度は４．７ｇ／Ｌであった。
【実施例１３】
２００Ｌ容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩ）の撹拌所要動力がマツタケ菌（ＶＩ）の形状と生育活性に及ぼした効果。
実施例１３−１：撹拌所要動力１．７ｋｗ／ｍ３
実施例１、実施例２、及び実施例３でマツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液を製造した。次いで、培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を１．７ｋｗ／ｍ３にすること以外は実施例４に準じた培養を行ったところ、２００Ｌ容培養槽から乾燥菌糸体含有量１．６ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体１．１ｇ／Ｌ）のマツタケ菌（ＶＩ−１）が得られた。次いで、ここで得られたマツタケ菌（ＶＩ−１）を用いて実施例９−１に準じた培養を行ったところ、乾燥菌糸体含有量は９．７ｇ／Ｌのマツタケ菌糸体培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．１１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体濃度０．７８ｇ／Ｌ）。
実施例１３−２：撹拌所要動力２．２ｋｗ／ｍ３
実施例１、実施例２、実施例３でマツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液を製造した。次いで、培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を２．２ｋｗ／ｍ３にすること以外は実施例４に準じた培養を行ったところ、２００Ｌ容培養槽から乾燥菌糸体含有量０．６８ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０２ｇ／Ｌ）のマツタケ菌（ＶＩ−１）が得られた。次いで、ここで得られたマツタケ菌（ＶＩ−１）を用いてマツタケ菌（ＶＩ−１）を２５Ｌ接種する点と、培地調製量を１１５Ｌとする点以外を実施例９−１に準じた培養を行ったところ、培養終了時の乾燥菌糸体含有量は２．５ｇ／Ｌであった。
接種時拡大倍率５．６倍、初発菌糸体濃度０．１２ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体濃度０．００３６ｇ／Ｌ）。
実施例１４：大量培養に得られたマツタケ菌糸体におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の評価
（１）大量培養に得られたマツタケ菌糸体の凍結乾燥品の調製
実施例６で得られたマツタケ菌糸体を遠心濾過機にて遠心分離し、そのケーキ部分を回収した後に、５ｍｍ角程度に解砕した。解砕したマツタケ菌糸体のブロック（含水率７９．４％Ｗ．Ｂ．）６ｋｇを専用トレー（５１０ｍｍ×７９０ｍｍ）に充填し、−３５℃で２４時間予備凍結した。なお、「Ｗ．Ｂ．」は湿潤重量（ｗｅｔ ｂａｓｅ）を意味する。予備凍結したマツタケ菌糸体を真空度１３Ｐａの減圧条件下で凍結乾燥し、凍結乾燥品１．２ｋｇを得た。凍結乾燥時の最高温度は５０℃であり、凍結乾燥を完了するまで２４時間を要した。凍結乾燥品の含水率は２．７％Ｗ．Ｂ．であった。
得られた凍結乾燥品１．２ｋｇを、粉砕機（ピンミル方式，５０００ｒ／ｍｉｎ）で粉砕し、粉砕品を得た。凍結乾燥品の供給速度は１２ｋｇ／ｈとし、粉砕時の温度は５０℃以下に制御した。前記粉砕品の粒度は、１２５μｍの篩で９０％が通過する粒度であった。
（２）ＮＫ細胞活性の評価
本実施例では、マツタケ菌糸体の有する生理活性として、ストレス負荷に対する促進活性の指標の１つであるＮＫ細胞活性の評価を行った。具体的には、ＮＫ細胞活性は、国際公開第ＷＯ０２／３０４４０号パンフレットの評価例１に記載の方法（マウスを用いた評価系）により、「３０％傷害単位（Ｌｙｔｉｃ Ｕｎｉｔｓ ３０％；ＬＵ３０）」、すなわち、エフェクター細胞１０７個当たり３０％の腫瘍細胞を傷害する細胞数を算出した後、ｔ−検定により比較した。なお、マツタケ菌糸体粉砕品の投与量は、マウスに対して１５０ｍｇ／ｋｇ／日（ヒト相当量に換算した場合、０．６ｇ／日）であった。
前記実施例１４（１）で調製したマツタケ菌糸体の凍結乾燥品には、ＮＫ細胞活性が認められ、蒸留水投与系のコントロール群に対する有意差（有意差検定Ｐ＜０．０５）も認められた。
【産業上の利用可能性】
本発明の製造方法によれば、生理活性を損なうことなく、マツタケ菌糸体を大量に製造することができる。例えば、本発明により、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養し、次いで、振盪培養、更に、小スケール培養において（例えば、１００Ｌ未満の小型培養装置を用い）、液体培地中に通気を行なわない条件下又は０．０５ｖｖｍ未満の低通気条件下で撹拌培養を行い製造したマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、大スケール培養（例えば、１００Ｌ以上の中型又は大型培養装置）で、深部培養によりマツタケ菌糸体を製造することが可能になった。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、マツタケ菌糸体の製造方法に関する。特には、マツタケ菌糸体の大量製造の母菌として利用可能なマツタケ菌糸体を製造し、これを利用して、マツタケ菌糸体を大量に製造する方法に関するものである。
【背景技術】
国際公開第ＷＯ０２／３０４４０号パンフレット（特許文献１）の２７ページには、マツタケ菌糸体の乾燥粉末をストレス負荷回復促進に利用する提案がなされている。
マツタケ菌糸体の製造方法に関して、特公昭第６１−５３０３２号公報（特許文献２）の実施例１には、マツタケ菌の斜面寒天培養物を、デンプン類を含む液体培地中で、３０日間振盪培養し、更に、デンプン類を含む液体培地２０Ｌに接種して、３０日間通気撹拌培養して、マツタケ菌糸体を製造する方法が記載されている。
更に、特開平第１１−３１８４３３号公報（特許文献３）の実施例１には、市販のマツタケ子実体から分離した菌糸体を４日間平板培養し、野菜抽出物を含有する液体培地で４日間馴化培養し、更に、野菜抽出物を含有する液体培地２Ｌを加えた５Ｌの深層通気撹拌培養槽を用いて、６日間培養することにより、マツタケ菌糸体を製造できることが記載されている。
しかしながら、マツタケ菌糸体の大量製造に関して、生理活性を損なうことなく、大量製造を可能にする新たな提案が待望されている。
（特許文献１）国際公開第２００２−３０４４０号公報
（特許文献２）特公昭第６１−５３０３２号公報
（特許文献３）特開平第１１−３１８４３３号公報
【発明の開示】
本発明は、マツタケ菌糸体の大量製造の母菌として利用可能なマツタケ菌糸体を製造し、これを利用して、生理活性を損なうことなく、マツタケ菌糸体を大量に製造する方法を提供することを目的とするものである。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、マツタケ菌糸体を、小スケール培養において、液体培地中に通気を行なわない条件下又は低通気条件下で撹拌培養する（好ましくは、前記撹拌培養に用いるマツタケ菌糸体を、予め、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を種株として、所定の期間、静置液体培養し、次いで振盪培養する）ことにより、マツタケ菌糸体の量産に適したマツタケ菌の母菌が得られること、及び前記母菌を深部培養（例えば、深部撹拌培養）することにより、効率的にマツタケ菌糸体を量産できるという知見を得るに到った。
従って、本発明は、
［１］小スケール培養において、液体培地中に通気を行なわない条件下又は０．０５ｖｖｍ未満の低通気条件下で、マツタケ菌糸体を撹拌培養する工程（以下、非通気撹拌培養と称する）を含む、マツタケ菌糸体の製造方法；
［２］前記撹拌培養の前培養工程として、
（１）マツタケ菌糸体を静置液体培養する工程、
（２）マツタケ菌糸体を振盪培養する工程、あるいは、
（３）マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程
のいずれか１つの工程を更に含む、［１］の製造方法；
［３］前記撹拌培養工程における培養液単位体積あたりの撹拌所要動力が０．０１〜２ｋＷ／ｍ３である、［１］又は［２］の製造方法；
［４］マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程を含む、マツタケ菌糸体（特にはマツタケ菌糸体の製造用母菌）の製造方法；
［５］［１］〜［４］の製造方法で得られたマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、深部培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法；
［６］静置液体培養の期間が３０〜４００日間である、［２］〜［５］の製造方法；
［７］振盪培養の期間が５〜５０日間である、［２］〜［６］の製造方法；
［８］接種時拡大倍率２〜５０倍の拡大培養である、［１］〜［７］の製造方法；
［９］培養液の浸透圧を０．０１〜０．８ＭＰａに調製した培地を用いる、［１］〜［８］の製造方法；
［１０］初発菌糸体に含有されるファイバー状菌糸体の初発菌糸体濃度が０．０５ｇ／Ｌ以上である、［１］〜［９］の製造方法
に関する。
前記［５］の製造方法における前記深部培養工程の好ましい態様によれば、［１］〜［３］の製造方法で得られたマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、大スケール培養にて深部培養する。
更に、本発明は、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養し、次いで、振盪培養することを特徴とする、マツタケ菌糸体の製造方法に関する。
更に、本発明は、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養、次いで、振盪培養、更に、１００Ｌ未満の小型培養装置を用い、液体培地中に通気を行なわない撹拌培養を行なうことを特徴とする、マツタケ菌糸体の製造方法に関する。
更に、本発明は、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養、次いで、振盪培養、更に、１００Ｌ未満の小型培養装置を用い、液体培地中に通気を行なわない撹拌培養を行い製造したマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、１００Ｌ以上の中型又は大型培養装置で、深部培養によりマツタケ菌糸体を製造する方法に関する。
本明細書において、用語「小スケール培養」及び「大スケール培養」とは、微生物の大量培養で一般的に行われている段階的培養方法、すなわち、培養液量の少ない小スケールの培養から、順次、培養液量の多いスケールの培養へ移行する周知培養方法における用語「小スケール培養」及び「大スケール培養」を意味する。従って、「小スケール」及び「大スケール」の各範囲は、必ずしも具体的な培養液量で絶対的に規定されるものではなく、例えば、スケールアップの手順（特には培養装置の容積）に応じて適宜決定することのできる、相対的な概念である。
また、本明細書で用いる用語「小型培養装置」及び「大型培養装置」も、同様に、具体的な容積で絶対的に規定されるものではなく、例えば、スケールアップの手順（特には培養スケール）に応じて適宜決定することのできる、相対的な概念である。
なお、これらの好適範囲については、後述する各培養工程において詳述する。
また、本明細書中では、発明の理解を容易にするため、必要に応じて次のように記載する。
マツタケ菌の種株又はマツタケ菌の菌株をマツタケ菌Ｉと記載する。
マツタケ菌Ｉを固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、マツタケ菌ＩＩと記載する。
マツタケ菌ＩＩを静置液体培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＩＩＩと記載する。
マツタケ菌ＩＩＩを振盪培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＩＶと記載する。
マツタケ菌ＩＶを、小スケール培養において、あるいは、小型培養装置（例えば、容積１００Ｌ未満の小型培養装置）を用いて、培養液中に通気を行なわない条件下又は低通気条件下で撹拌培養を行い得られるマツタケ菌を、マツタケ菌Ｖと記載する。
マツタケ菌Ｖを、大スケール培養において、あるいは、大型培養装置（例えば、容積１００Ｌ以上の大型培養装置）を用いて、深部培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＶＩと記載する。
マツタケ菌ＶＩ、大スケール培養において、あるいは、大型培養装置（例えば、容積１００Ｌ以上の大型培養装置）を用いて、深部培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＶＩＩと記載する。
更に、マツタケ菌ＶＩＩ、大スケール培養において、あるいは、大型培養装置（例えば、容積１００Ｌ以上の大型培養装置）を用いて、深部培養して得られるマツタケ菌を、マツタケ菌ＶＩＩＩと記載する。
【図面の簡単な説明】
図１は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが２００Ｌ培養槽であり、培養温度が２３±１℃である条件下で培養を実施した、撹拌所要動力と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」、「黒四角」、及び「黒三角」は、それぞれ、撹拌所要動力が０．１２ｋｗ／ｍ３、１．１ｋｗ／ｍ３、及び２．６ｋｗ／ｍ３の場合の結果である。
図２は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが２００Ｌ培養槽であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．１２ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、浸透圧と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」、「黒四角」、及び「黒三角」は、それぞれ、浸透圧が０．９８ＭＰａ、０．５ＭＰａ、及び０．０５ＭＰａの場合の結果である。
図３は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが５００ｍＬフラスコ振盪培養であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．１４ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、初発菌糸体濃度と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」、「黒四角」、「黒三角」、及び「×」は、それぞれ、初発菌糸体濃度が０．０６ｇ／Ｌ、０．２ｇ／Ｌ、０．６ｇ／Ｌ、及び１ｇ／Ｌの場合の結果である。
図４は、ファイバー状菌糸体の菌糸体形状を示す図面である。
図５は、ペレット状菌糸体の菌糸体形状を示す図面である。
図６は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが２００Ｌ培養槽（培養液量＝１４０Ｌ）であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．１２ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、母菌形状と生育の関係を示すグラフである。グラフ中の各記号「黒丸」及び「黒四角」は、それぞれ、母菌形状がファイバー状及びペレット状の場合の結果である。
図７は、母菌培養系の概要を示す説明図である。
図８は、本発明方法を実施するのに用いることができる培養システムを示す説明図である。
図９は、デンプン、グルコース、及びリン酸二水素カリウム等を含む培地を使用し、培養スケールが６５ｍ３培養槽（培養液量＝４０ｍ３）であり、培養温度が２３±１℃であり、撹拌所要動力が０．０１〜０．１２ｋｗ／ｍ３である条件下で培養を実施した、培養日数と菌糸体濃度の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の製造方法では、非通気撹拌培養工程を少なくとも実施することにより、マツタケ菌糸体を製造することができる。本明細書において、非通気撹拌培養とは、液相（すなわち、培養液）への通気を行わないか、あるいは、液相への通気量が０．０５ｖｖｍ以下であって培養液中に実質的に通気を行わない撹拌培養を意味する。なお、培養装置の内圧を保持する目的で、気相に通気を行うことは、非通気撹拌培養の範疇に入るものとする。非通気撹拌培養工程で得られるマツタケ菌糸体それ自体を、最終製品とすることもできるし、あるいは、大量製造の母菌として用いることもできるが、大量製造の母菌として用いることが特に好ましい。
本発明の製造方法における非通気撹拌培養工程に用いるマツタケ菌糸体としては、例えば、増殖及び馴化等を目的とする適当な前培養を実施することにより得られるマツタケ菌糸体を用いることができ、前記前培養としては、例えば、静置液体培養若しくは振盪培養、又はそれらの組み合わせ（特には、静置液体培養及び振盪培養の連続実施）を挙げることができる。
以下、静置液体培養、振盪培養、非通気撹拌培養、及び深部培養の順に、本発明の製造方法を説明する。
本明細書におけるマツタケ菌とは、トリコローマ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ）属、及びその近縁種に属する種の菌類を言う。例を挙げると、トリコローマ属としては、例えば、マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ）があり、その近縁種には、例えば、ニセマツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｆｕｌｖｏｃａｓｔａｎｅｕｍ Ｈｏｎｇｏ ｓｐ．ｎｏｖ．）、バカマツタケ（Ｔ．ｂａｋａｍａｔｓｕｔａｋｅ Ｈｏｎｇｏ ｓｐ．ｎｏｖ．）、又はマツタケモドキなどがある。
本発明の製造方法で使用するマツタケ菌、例えば、マツタケ菌の種株又はマツタケ菌の菌株であるマツタケ菌Ｉは、天然又は市販のマツタケ子実体から純粋分離した菌糸体を用いることができる。
更に、市販、あるいは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターなどに寄託されているマツタケ菌株も本発明において使用することができる。本発明で用いることのできる菌株の例を挙げると、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のＡＴＣＣ３４９７９株、ＡＴＣＣ３４９８１株、若しくはＡＴＣＣ３４９８８株、発酵研のＩＦＯ６９１５株、ＩＦＯ６９２５株、ＩＦＯ６９３０株、ＩＦＯ６９３５株、ＩＦＯ３０６０４株、ＩＦＯ３０６０５株、若しくはＩＦＯ３０６０６株、農生資源研のＭＡＦＦ４６００３８株、又は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されているトリコローマ属のＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株などがある。
マツタケ菌ＩＩの培養又は保存に用いる培地は、一般的にマツタケ菌を培養する栄養源基質を有する培地であれば、特に制限無く使用することができる。例えば、太田培地［Ｏｈｔａ，Ａ（１９９０）Ｔｒａｎｓ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ ３１：３２３−３３４］、ＭＭＮ培地［Ｍａｒｘ，Ｄ．Ｈ．（１９６９）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ５９：１５３−１６３］、又は浜田培地［浜田（１９６４）マツタケ、９７−１００］などを挙げることができる。
固形培地用の固形化剤の例を挙げると、カラギーナン、マンナン、ペクチン、寒天、カードラン、デンプン、又はアルギン酸などがあり、これらのうち寒天が好ましい。
使用可能な培地の栄養源基質には、例えば、炭素源、窒素源、及び無機元素源などがある。
炭素源の例を挙げると、デンプン類（例えば、米デンプン、小麦粉デンプン、バレイショデンプン、又はサツマイモデンプンなど）、多糖類（例えば、デキストリン、又はアミロペクチンなど）、少糖類（例えば、マルトース、又はシュクロースなど）、又は単糖類（例えば、フラクトース、又はグルコースなど）がある。更に、麦芽エキスを挙げることができる。マツタケ菌の生長速度から、グルコースなどの単糖類が好ましい時期と、デンプン類の好ましい時期とがあるので、時期に応じた炭素源を選択し、必要に応じて組み合わせて使用する。
窒素源の例を挙げると、天然由来物質である酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、大豆粉、又は大豆ペプトンなどがあり、その他の窒素源としては、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、又は尿素などもある。これらを単独で、又は組み合わせて使用することができる。一般に、生長速度を考慮すると天然由来物質、特に酵母エキスが好ましい。
無機元素源は、リン酸及び微量元素を供給するために使用する。例を挙げると、リン酸塩、金属イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、銅、又は鉄等）の硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、又はリン酸塩などの無機塩があり、必要量を培地中に溶解する。
更に、培地にビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）又はアミノ酸類を添加することもできる。
更に、使用するマツタケ菌の性質に応じて、植物抽出物、有機酸、又は核酸関連物質などを加えることができる。例を挙げると、果菜類、根菜類、又は葉菜類などの抽出物、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、又は乳酸などの有機酸、及び市販の核酸、核酸抽出物、酵母、又は酵母エキスなどの核酸関連物質がある。
固体培地を調製する場合、炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌである。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で、好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるように使用する。更に、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、及び／又は核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。また、調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．０、特に好ましくは５．０〜５．５とする。
（静置液体培養）
次に、マツタケ菌ＩＩ（固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌）を静置液体培養してマツタケ菌ＩＩＩを製造する方法について記載する。
通常、静置液体培養可能な培養容器（例えば、３０ｍＬ〜１０Ｌ容、好ましくは１００ｍＬ〜２Ｌ容の三角フラスコ）を用いて行う。
この静置液体培養は、液体培地にマツタケ菌ＩＩを接種することにより開始する。
接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた体積の、接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液の体積に対する比（以下において、「接種時拡大倍率」と記載）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍となる量の液体培地を使用する。
接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液中のマツタケ菌ＩＩの乾燥菌糸体重量と、接種したマツタケ菌ＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた混合物の体積の比（以下において、「初発菌糸体濃度」と記載）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌ＩＩを含有する培養液を接種する。
本発明の静置液体培養では、培養温度を、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２５℃とし、好ましくは３０〜４００日間、より好ましくは１２０〜２４０日間培養する。培養期間が、３０日未満であっても、４００日間より長期間であっても、大量培養に適した生育能を有するマツタケ菌ＩＩＩを得ることが困難になる。
静置液体培養に使用する液体培地は、その浸透圧を好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
静置液体培養に用いる栄養源基質として、マツタケ菌Ｉを培養する固形培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）、又はアミノ酸類を使用することができる。
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩を使用する場合は、リン元素相当量で好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるようにする。
更に、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、及び核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。
調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
マツタケ菌ＩＩＩを含有している静置液体培養による培養液の一部又は全部を、マツタケ菌ＩＩを含有している培養液（若しくは、培養物）と同様に静置液体培養の接種源として、再度、静置液体培養工程で使用することもできる。
（振盪培養）
次に、マツタケ菌ＩＩＩを振盪培養して、マツタケ菌ＩＶを製造する方法について記載する。
通常、振盪培養可能な培養容器（例えば、３０ｍＬ〜１０Ｌ容、好ましくは３００ｍＬ〜５Ｌ容の三角フラスコ又は坂口フラスコ）を用いて行う。
この振盪培養は、液体培地にマツタケ菌ＩＩＩ（すなわち、静置液体培養により得られるマツタケ菌）を接種することにより開始することもできるし、あるいは、マツタケ菌ＩＩ（すなわち、固形培地又は液体培地で培養又は保存したマツタケ菌）を接種することにより開始することもできる。前記接種は、前段階で得られたマツタケ菌糸体をホモジェネート処理してから用いることが好ましい。
接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた体積の、接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液の体積に対する比（以下において、「接種時拡大倍率」と記載）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。
なお、接種時拡大倍率に見合う培養液の量を確保するために、静置液体培養を複数の培養容器を用いて製造することもできる。
接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液中のマツタケ菌ＩＩＩの乾燥菌糸体重量と、接種したマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液と液体培地とを合わせた混合物の体積の比（以下において、「初発菌糸体濃度」と記載）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌ＩＩＩを含有する培養液を接種する。
振盪培養では、培養温度を、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２５℃とし、好ましくは５〜５０日間、より好ましくは７〜５０日間、より好ましくは１４〜２８日間実施し、撹拌培養に用いるマツタケ菌ＩＶを製造する。
振盪培養に要する動力として、通常、三角フラスコ内の培養液単位体積あたりの撹拌所要動力０．０１〜２ｋＷ／ｍ３、好ましくは０．０５〜０．４ｋＷ／ｍ３を用いる。
振盪培養に使用する液体培地は、その浸透圧を好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは、０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
振盪培養に用いられる栄養源基質として、マツタケ菌ＩＩを培養する液体培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）、又はアミノ酸類を使用することができる。
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるようにする。
更に、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、及び／又は核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。
調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
（非通気撹拌培養）
次に、非通気撹拌培養により、マツタケ菌Ｖを製造する方法について記載する。
この撹拌培養は、液体培地にマツタケ菌ＩＶ（すなわち、振盪培養工程により得られるマツタケ菌）又はマツタケ菌ＩＩＩ（すなわち、静置液体培養により得られるマツタケ菌）を接種することにより開始する。前記接種は、前段階で得られたマツタケ菌糸体をホモジェネート処理してから用いることができる。
以下、マツタケ菌ＩＶを接種する場合を例に取り、非通気撹拌培養工程を説明するが、マツタケ菌ＩＩＩを用いても同様にして実施することができる。また、撹拌培養で得られるマツタケ菌を、再度、撹拌培養に用いることもできる。
非通気撹拌培養で用いる液体培地は、次のようにして調製することができる。
栄養源基質は、振盪培養で使用する、炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１など）、又はアミノ酸類と同じものを使用することができる。
炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌであり、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。デンプン類を好ましく使用できる。
非通気撹拌を行なう培養液中の浸透圧に影響するグルコースなどの単糖類を併用する場合、その使用量は、好ましくは０．１〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜４０ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．７〜２０ｇ／Ｌである。
窒素源の使用量は、窒素元素相当量で、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００７〜０．０７ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で好ましくは０．００１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００５〜０．０３ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２ｍｏｌ／Ｌになるようにする。
更に、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、及び／又は核酸関連物質などマツタケ菌の性質に応じて、適宜、添加することができる。
調製した栄養源基質溶液のｐＨを好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。
非通気撹拌培養に使用する液体培地は、その浸透圧を好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。
非通気撹拌培養の培養温度は、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２５℃である。
接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液と液体培地とを合わせた体積の、接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液の体積に対する比（以下において、「接種時拡大倍率」と記載）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。
接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液中のマツタケ菌（ＩＶ）の乾燥菌糸体重量と、接種したマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液と液体培地とを合わせた混合物の体積の比（以下において、「初発菌糸体濃度」と記載）を、好ましくは０．０１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌（ＩＶ）を含有する培養液を接種する。なお、初発菌糸体の内、０．００５〜５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０２５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０５〜２ｇ／Ｌがファイバー状菌糸体であることが望ましい。
非通気撹拌培養で得られるマツタケ菌（Ｖ）を、次の深部培養の母菌として用いる場合の培養日数は、好ましくは３〜２０日間、より好ましくは５〜１４日間実施する。
これらの培養日数後に、マツタケ菌（Ｖ）の乾燥菌糸体含有量が、好ましくは０．５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜８ｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｇ／Ｌになっている培養液は、深部培養に適した生育能を有するマツタケ菌（Ｖ）を含有している。
非通気撹拌培養で得られるマツタケ菌（Ｖ）を、マツタケ菌糸体として分離する場合の培養日数は、好ましくは５〜３０日間、より好ましくは７〜２０日間、特に好ましくは１０〜１５日間実施する。
これらの培養日数から、炭素源の資化速度が著しく低下した時を培養終了とするのが好ましいが、適宜、製造サイクル又は製造コスト等の製造形態に合わせて決定することができる。
振盪培養及びそれ以降の工程では、マツタケ菌糸体は、大別して、ペレット状とファイバー状の形状をとる。本発明の製造方法では、各工程で得られた菌糸体を次の工程の母菌として使用する場合には、その菌糸体の５０％以上（より好ましくは８０％以上）がファイバー状であることが好ましい。ファイバー状の菌糸体は、次の液体培地に接種した場合、ペレット状菌糸体と比べ、速やかな増殖を得ることができる。なお、菌糸体全体の量が充分確保することができる場合には、ファイバー状菌糸体が前記割合よりも低くても、ファイバー状菌糸体の絶対量を充分に確保することができるため、前記割合に限定されるものではない。なお、ファイバー状菌糸体とペレット状菌糸体の比率は、例えば、目開き１ｍｍ程度のメッシュ等で水篩することにより測定することができる。
一方、その工程が最後の工程となり、最終製品としてのマツタケ菌糸体を分離する場合には、マツタケ菌糸体の量を充分に確保することが重要であるので、ペレット状又はファイバー状のいずれの形状であるかは重要でなく、ペレット状とファイバー状との割合も特に限定されるものではない。
非通気撹拌培養は、小スケール培養、すなわち、小スケールの培養液を用いて実施する。非通気撹拌培養で用いることのできる培養液量は、通常の微生物の大量培養における一般的な段階的培養において実施される小スケール培養の範囲を超えない限り、特に限定されるものではない。非通気撹拌培養で用いることのできる培養液量は、通常、１０００Ｌ未満であり、好ましくは５００Ｌ未満、より好ましくは１００Ｌ未満である。また、培養液量の下限は、通常、０．８Ｌ以上であり、好ましくは４Ｌ以上である。
非通気撹拌培養に使用する培養装置としては、例えば、無菌性を確保することができ、小スケール培養が可能な培養装置を用いることができる。このような培養装置としては、小型培養装置、例えば、容積が１０００Ｌ以下（好ましくは５００Ｌ以下、より好ましくは１００Ｌ以下、特に好ましくは１００Ｌ未満）の小型培養装置（例えば、ジャーファーメンター又は小型培養槽）を使用することができる。なお、前記培養装置の容量の下限は、通常、１Ｌ以上であり、好ましくは５Ｌ以上である。
マツタケ菌ＩＶの培養を行いマツタケ菌Ｖを製造する場合、液体培地中に通気せずに、撹拌培養を行なう。小スケール培養（例えば、１００Ｌ未満のジャーファーメンター又は小型培養槽）で通気を行なって培養すると、菌糸が凝集し、成長点が欠失して母菌としての生育能が損なわれる場合があるからである。
非通気撹拌培養における撹拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの撹拌所要動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ３、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ３の範囲で撹拌を行なうことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育をはじめ、酸素供給量が不足し、更に、生育した菌糸体の分散が不充分になるので、適宜、撹拌の強度を大きくすることが必要になる。
非通気撹拌培養から得られたマツタケ菌糸体の分離及び回収は、常法によって行なうことができる。例えば、フィルタープレスなどによるろ過、又は遠心分離などである。得られたマツタケ菌糸体は、その使用目的に応じて、乾燥し、又は乾燥しないで、破砕、抽出又は成形して製品化する。
（深部培養）
深部培養では、マツタケ菌Ｖ、すなわち、非通気撹拌培養で得られるマツタケ菌を、液体培地に接種することにより開始することができる。また、深部培養で得られるマツタケ菌（例えば、マツタケ菌Ｖ〜ＶＩＩ）を、再度、深部培養に用いることもできる。更には、マツタケ菌ＩＶ、すなわち、振盪培養工程により得られるマツタケ菌（特には、静置液体培養し、続いて、振盪培養することにより得られるマツタケ菌）を、深部培養に用いることもできる。前記接種は、前段階で得られたマツタケ菌糸体をホモジェネート処理してから用いることができる。
また、深部培養とは、空気を培養槽外から培養液中に強制的に供給し、撹拌装置による機械的撹拌、あるいは、ドラフトチューブ又は分散板等によって通気される気泡を微粒化し、気液界面を大きくさせ、しかも、培養液中の気泡の滞留時間を大きくさせることにより、微生物への酸素供給を効率よく行う方法である。例えば、通気撹拌培養槽による培養、気泡塔型培養槽（エアリフト型培養槽）による培養、又は流動層型培養槽による培養などを挙げることができる。
深部培養で用いる液体培地は、非通気撹拌培養で用いる液体培地と同じものを使用することができる。また、非通気撹拌培養と同じ基質を用いることができ、目標収量に合わせて基質濃度を調整することができる。但し、基質由来の浸透圧を０．０１〜０．８ＭＰａに調整することが望ましい。
また、培養温度、接種時拡大倍率、初発菌糸体濃度、培養日数、及び撹拌所要動力についても、非通気撹拌培養と同様にして実施することができる。
深部培養は、大スケール培養、すなわち、大スケールの培養液を用いて実施することが好ましい。深部培養で用いることのできる培養液量は、通常の微生物の大量培養における一般的な段階的培養において実施される大スケール培養の範囲を超えない限り、特に限定されるものではない。深部培養で用いることのできる培養液量は、通常、１００Ｌ以上であり、好ましくは１０００Ｌ以上、より好ましくは３０００Ｌ以上である。
深部培養に使用する培養装置としては、必要に応じて通気することができ、深部撹拌ができ、無菌性を確保することができ、大スケール培養が可能な培養装置を用いることができる。このような培養装置としては、大型培養装置、例えば、容積が１００Ｌ以上、好ましくは１０００Ｌ以上、より好ましくは３０００Ｌ以上の大型培養装置を用いることができる。なお、前記大型培養装置には、中型培養装置と称されることのある培養装置も含まれる。
大スケール培養（例えば、１００Ｌ以上の大型培養槽などの培養装置）により工業スケールで深部培養を行なう場合、必要に応じて通気を行なう。この場合の通気量は、０．０５〜１．０ｖｖｍ、特に、０．２〜０．５ｖｖｍとするのが好ましい。
深部培養における撹拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの撹拌所要動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ３、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ３の範囲で撹拌を行なうことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育をはじめ、酸素供給量が不足し、更に、生育した菌糸体の分散が不充分になるので、適宜、撹拌の強度を大きくすることが必要になる。深部培養では、培養初期には低通気及び低撹拌速度で培養し、培養後期には高通気及び高撹拌速度で培養するのが好ましい。
深部培養から得られたマツタケ菌糸体の分離及び回収は、常法によって行なうことができる。例えば、フィルタープレスなどによるろ過、又は遠心分離などである。得られたマツタケ菌糸体は、その使用目的に応じて、乾燥し、又は乾燥しないで、破砕、抽出又は成形して製品化する。
以下、マツタケ菌糸体としてマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を用いた場合を例に取り、本発明方法について、更に説明する。なお、以下の説明は、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株以外のマツタケ株についても、通常、当てはまる。
１．生育特性
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は環境要因に敏感である。物理的な環境要因は、撹拌由来の機械的衝撃及び浸透圧などが考えられる。また、生育に時間を要するため、短期間で培養を終了するためには、各継代時に多量の母菌を必要とし、大量接種が可能な培養システムの構築が必要である。
２．基本培養条件
（１）機械的衝撃への耐性
通気撹拌培養での撹拌の主な目的は、酸素及び栄養源の拡散である。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の増殖速度は遅く、酸素要求量は小さく、過剰な酸素供給は不要と考える。図１は撹拌所要動力と生育の関係を示したグラフである。撹拌所要動力が大きい場合、菌糸体の生育が阻害される。また、溶存酸素の低下が見られないことから、撹拌の影響は機械的衝撃が支配的と考えられる。
更に、撹拌所要動力の大きな系では、菌糸体形状がペレット化する傾向があり、生育が停滞する。この原因は、撹拌による凝集効果に起因すると考えられる。本菌株の生育において、菌糸体への機械的ダメージ及びペレット化が重要な要因となっている。
（２）生育と浸透圧
通常、担子菌の炭素源資化経路は、糖類をグルコースに分解し、グルコース−６−リン酸に変換した後に細胞内に取り込むと考えられる。つまり、一般には多糖類に比してグルコースなどの単糖類の資化効率が高いといえる。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株においても同様にグルコースを経て多糖類を資化することが推測されるが、グルコース濃度の高い高浸透圧の培養液中では、生育が阻害される傾向がある。図２は培地中の炭素源にデンプン及びグルコースを混合し、浸透圧を調整し、培養を行った実験結果である。グルコース濃度の高い系では、生育が得られにくい傾向があり、浸透圧に対する耐性が小さいことが示唆される。そこで、デンプンを主炭素源とした培地にグルコースを微量添加することで、２つの炭素源の特性を活用する培地処方を採用することができる。
（３）必要母菌量
マツタケ菌は生育が遅いことが知られているが、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株も同様、生育速度は遅い傾向をもつが、工業的な生産培養を実施する上では、一定期間内に有効な生育を得ることが望ましい。図３はＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の母菌接種量と生育速度の関係を検討した結果を示す。初発菌糸体濃度０．１〜２．０ｇ／Ｌ程度（その内、ファイバー状菌糸体が０．０５〜２．０ｇ／Ｌ）の条件の生育が早く、工業的な培養においては多量の接種量が必要であることが示唆される。特に低接種量の場合、誘導期間が著しく長く工業的な培養が困難となる傾向がある。
（４）菌糸体形状の制御
糸状菌の培養において、菌糸体の形状は生育に大きな影響を与えることが知られている。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は大別して、ファイバー状（図４）とペレット状（図５）の形状をとるが、ファイバー状の菌糸体が生育が有利である。図６はペレット状の母菌とファイバー状の母菌を接種し、生育を確認した生育曲線であるが、ペレット状の母菌を接種した系では有効な生育が得られない傾向がある。そのため、菌糸体形状の制御は工業生産において重要な要件となる。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体形状に寄与する要因として、例えば、培養液の流動、母菌接種量、培地処方等が挙げられる。特に、小型のジャーファーメンターにおいては通気による培養液の流動により菌糸体が相互に絡み合い、融着してペレットを形成する傾向があり、良好な前培養母菌を得るためには、通気方法を最適化することが好ましい。ペレット状菌糸体は母菌として効率的生育を示さないため、工業的な培養を行う上では、母菌中に含まれるファイバー状菌糸体の母菌全体の比率で５０％以上、特に８０％とすることが好ましい。但し、次世代での初発菌糸体（乾燥重量換算）の内、ファイバー状菌糸体濃度が０．０５〜２ｇ／Ｌ程度確保することができれば、これに代えることができる場合がある。
３．培養システム
（１）母菌培養系
前述のように、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は大量の母菌を必要とする傾向があるため、大量の母菌を培養するシステムを用いることが好ましい。そこで、図７に示すように、固形培地で継代保存した母菌を多段階に静置培養した後、振盪培養を行う母菌培養法を確立した。この培養方法は液体培地への馴化を目的としている。
（２）タンク培養系
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の生育を速やかに得るためには、大量の母菌を必要とする傾向があることは前述のとおりである。従って、タンク培養においても同様であり、初発菌糸体濃度０．１〜２．０ｇ／Ｌ程度であることが好ましい。また、培養開始時の培養液中の菌糸体は、初発菌糸体濃度として０．０５〜２．０ｇ／Ｌ程度のファイバー状菌糸体が含まれていることが好ましい。図８は、本発明方法を実施するのに用いることができる培養システムである。タンク培養系は本培養を含め、４段階としており、いずれも０．１〜２．０ｇ／Ｌ程度の初発菌糸体濃度を確保するため、拡大倍率を５〜１５倍程度に設定している。図８に示す培養システムと培養法により、本培養１２〜１４日間で、１２〜１４ｇ／Ｌ程度の菌糸体収量確保が可能となった。図９に生産培養の生育曲線の一例を示す。
【実施例】
以下に本発明に係わる、マツタケ菌糸体の大量製造の母菌として利用可能なマツタケ菌糸体を製造し、これを利用して、マツタケ菌糸体を大量に製造する方法を実施例で説明する。
実施例において、使用したマツタケ菌は、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株である。マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）］に平成１２年９月１４日より寄託しているものである。ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４の菌学的性質については、国際公開第ＷＯ０２／３０４４０号パンフレット（特許文献１）に記載されている。例えば、１０ｍＬのエビオス寒天斜面培地を入れた試験管中で維持されている。
先述のマツタケ菌ＩＩ〜マツタケ菌ＶＩＩＩに対応する、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４を使用して得られたマツタケ菌を、マツタケ菌（ＩＩ−１）〜マツタケ菌（ＶＩＩＩ−１）と記載した。
撹拌培養に以下の装置を使用した。
実施例３、比較例２−１、又は比較例３−１（非通気の場合）において、６枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した３０Ｌ容のジャーファーメンターから通気用スパージャーを取り外して使用した。実施例又は比較例、各々において、３０Ｌ容ジャーファーメンターと記載した。
比較例３−１において、６枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した３０Ｌ容のジャーファーメンターを使用した。比較例３−１において、スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンターと記載した。
実施例４、実施例７−１〜７−４、実施例８−２、８−３、実施例９−１〜９−３、又は実施例１１−１において、４枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した２００Ｌ容培養槽を使用した。実施例、各々において、２００Ｌ容培養槽と記載した。
実施例５において、６枚ディスクタービン翼２段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した７ｍ３容培養槽を使用した。実施例５において、７ｍ３容培養槽と記載した。
実施例６において、６枚ディスクタービン翼３段を備えた撹拌機と通気用スパージャーを装備した６５ｍ３容培養槽を使用した。実施例６において、６５ｍ３容培養槽と記載した。
実施例２〜６、実施例７−１、実施例９−１、実施例１０−１〜１０−３、又は実施例１１−１に「培養液単位体積当たりの撹拌所要動力」と記載されている中の培養液は、各々で使用されている、２Ｌ容三角フラスコ、３０Ｌ容ジャーファーメンター、スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンター、２００Ｌ容培養槽、７ｍ３容培養槽、又は６５ｍ３容培養槽の中の全内容物（接種母菌の培養液も含む）を意味しており、調合した液体培地のみを意味しているのではない。
栄養源基質として、実施例４、実施例７−１、実施例９−１、又は実施例１１−１において、２００Ｌ容培養槽を用いて、培地を調製する際に、次の３通りの組み合わせのいずれかを記載する必要のある場合には、Ａ型基質、Ｂ型基質、又はＣ型基質と記載した。
Ａ型基質：（１）バレイショデンプン４．９ｋｇ、（２）グルコース１４０ｇ、（３）乾燥酵母エキス２８０ｇ、（４）リン酸二水素カリウム２８０ｇ、（５）硫酸マグネシウム・７水和物４２ｇ、（６）塩化カルシウム・２水和物０．８４ｇ、（７）硫酸亜鉛・７水和物０．５６ｇ、（８）塩化マンガン・４水和物０．７０ｇ、（９）硫酸銅・５水和物０．１４ｇ、（１０）塩化鉄・６水和物１．１２ｇ、及び（１１）チアミン塩酸塩０．１４ｇ。
Ｂ型基質：Ａ型基質と、（３）乾燥酵母エキス３２０ｇのみ異なっている。他［（１）、（２）、及び（４）〜（１１）］は内容及び使用量ともにＡ型基質と同じ。
Ｃ型基質：Ａ型基質及びＢ型基質と、（４）〜（１１）の内容と使用量が同じで、乾燥酵母エキス６４０ｇと、バレイショデンプンとグルコースの使用量が異なっている。バレイショデンプンとグルコースの使用量は実施例１１−１〜１１−３に記載の量を使用した。
以下の実施例１〜実施例６で、５００ｍＬ容三角フラスコから６５ｍ３容培養槽まで製造規模を拡大して行く過程を示した。
実施例１：５００ｍＬ容三角フラスコを用いた、静置液体培養によるマツタケ菌（ＩＩＩ−１）の製造方法
グルコース３０ｇ／Ｌ及び乾燥酵母エキス３ｇ／Ｌとなるように水道水に溶解し培地を調製した。接種後の培地の浸透圧は、０．４ＭＰａであった。この培地を５００ｍＬ容の三角フラスコに１２０ｍＬ分注し、滅菌した。上記培地組成に静置液体培養で継代保存していたマツタケ菌（ＩＩ−１）を含有する培養液１０ｍＬを接種し、２３±２℃の条件下で１８０日間静置液体培養し、マツタケ菌（ＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液を製造した。
接種時拡大倍率１３倍、初発菌糸体濃度０．３８ｇ／Ｌ。
実施例２：振盪培養によるマツタケ菌（ＩＶ−１）の製造方法
グルコース３０ｇ／Ｌ、乾燥酵母エキス１ｇ／Ｌ、大豆ペプトン２ｇ／Ｌ、麦芽エキス１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム・７水和物０．３ｇ／Ｌとなるように水道水に溶解し、培地を調製した。この培地を２Ｌ容の三角フラスコに８７０ｍＬ分注し、滅菌した。この８７０ｍＬの培地に、実施例１のようにして製造した、マツタケ菌（ＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液１３０ｍＬをホモジェネート処理後に接種し、ロータリーシェイカーで培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１４ｋｗ／ｍ３、２３±２℃の条件下で２０日間振盪培養し、マツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体４．８ｇ／Ｌ）を含有する培養液を製造した。接種後の浸透圧は、０．４ＭＰａであった。
接種時拡大倍率７．７倍、初発菌糸体濃度０．６５ｇ／Ｌ。
実施例３：３０Ｌ容ジャーファーメンターによるマツタケ菌（Ｖ−１）の製造方法
バレイショデンプン６００ｇ、グルコース６０ｇ、乾燥酵母エキス４０ｇ、リン酸二水素カリウム４０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物６ｇ、塩化カルシウム・２水和物０．１２ｇ、硫酸亜鉛・７水和物０．０８ｇ、塩化マンガン・４水和物０．１ｇ、硫酸銅・５水和物０．０２ｇ、塩化鉄・６水和物０．１８ｇ、及びチアミン塩酸塩０．０２ｇを３０Ｌ容ジャーファーメンター内で水道水に溶解し、滅菌し、１８Ｌの培地を調製した。接種後の培地の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。
この培地に、実施例２のようにして製造した、マツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌを含有する培養液２Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．０８ｋｗ／ｍ３、２３±２℃の条件下で、培養液中に通気用スパージャーから通気することなしに、７日間培養し、マツタケ菌（Ｖ−１）乾燥菌糸体含有量１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．９５ｇ／Ｌ）の培養液を製造した。接種時拡大倍率１０倍、初発菌糸体濃度０．５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．４５ｇ／Ｌ）。
実施例４：２００Ｌ容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩ−１）の製造方法
Ａ型基質を２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌して１２０Ｌの培地を調製した。培地の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。この培地に、実施例３のようにして製造した、マツタケ菌（Ｖ−１）乾燥菌糸体１ｇ／Ｌを含有する培養液２０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋｗ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で７日間深部培養し、マツタケ菌（ＶＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体２．７ｇ／Ｌ）の培養液を製造した。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
実施例５：７ｍ３容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩＩ−１）の製造方法
溶性デンプン１４０ｋｇ、グルコース４ｋｇ、乾燥酵母エキス８ｋｇ、リン酸二水素カリウム８ｋｇ、硫酸マグネシウム・７水和物１．２ｋｇ、塩化カルシウム・２水和物２４ｇ、硫酸亜鉛・７水和物１６ｇ、塩化マンガン・４水和物２０ｇ、硫酸銅・５水和物４ｇ、塩化鉄・６水和物３２ｇ、及びチアミン塩酸塩４ｇを７ｍ３容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌し、培地３．７２ｍ３を調製した。培地の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。この培地に、実施例４のようにして製造した、マツタケ菌（ＶＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌの培養液、２槽相当分である２８０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．０５ｋｗ／ｍ３、通気量１．２ｍ３／ｍｉｎ、温度２３±２℃で、７日間深部培養し、マツタケ菌（ＶＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体２．６ｇ／Ｌ）の培養液を製造した。
接種時拡大倍率１４．３倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例６：６５ｍ３容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩＩＩ−１）の製造方法
溶性デンプン１５７５ｋｇ、グルコース４５ｋｇ、乾燥酵母エキス１３５ｋｇ、リン酸二水素カリウム９０ｋｇ、硫酸マグネシウム・７水和物１３．５ｋｇ、塩化カルシウム・２水和物２７０ｇ、硫酸亜鉛・７水和物１８０ｇ、塩化マンガン・４水和物２２５ｇ、硫酸銅・５水和物４５ｇ、塩化鉄・６水和物３６０ｇ、及びチアミン塩酸塩４５ｇを６５ｍ３容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌し、３６ｍ３の培地を調製した。接種後の浸透圧は、０．０５ＭＰａであった。
この培地に、実施例５のようにして製造した、マツタケ菌（ＶＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量３ｇ／Ｌの培養液、１槽相当分である４ｍ３を接種し、通気量１２ｍ３／ｍｉｎ、温度２３±２℃で、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．０１３ｋｗ／ｍ３で培養を開始し、その後、菌糸の伸張をみて、適宜、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力を大きくしていき、１２日目に０．１２ｋｗ／ｍ３とし、１３日間深部培養して、マツタケ菌（ＶＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量１３．５ｇ／Ｌの培養液を製造した。
接種時拡大倍率１０倍、初発菌糸体濃度０．３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．２６ｇ／Ｌ）。
比較例１
静置液体培養によるマツタケ菌（ＩＩＩ−１）を含有している培養液が振盪培養に及ぼした効果：静置液体培養の工程を経ない培養物と比較。
マツタケ菌（ＩＩ−１）を含有しているエビオス寒天斜面培地培養物１０ｍＬを用いる他は、実施例２と同様に、２０日間振盪培養した。
２０日後の培養液から乾燥菌糸体含有量を求めることができなかった。
【実施例７】
静置液体培養によるマツタケ菌（ＩＩＩ−１）を含有している培養液の製造期間が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：実施例１の１８０日間静置液体培養と、３０日間静置液体培養、５０日間静置液体培養及び、４００日間静置液体培養で製造した培養液を用いて比較。
実施例７−１：１８０日間静置液体培養
実施例１、実施例２、次いで、実施例３と同様にして、マツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液を製造した。
他方、Ｂ型基質を２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌して１２０Ｌの培地を調製した。この培地に、マツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液２０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
実施例７−２：３０日間静置液体培養
静置液体培養の期間のみ３０日間とする他は、実施例１と同様に培養した培養液を用いて、実施例２、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液２０Ｌ用いる他は、２００Ｌ容培養槽で実施例７−１に準じた培養操作を行った。
乾燥菌糸体含有量２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
実施例７−３：５０日間静置液体培養
静置液体培養の期間のみ５０日間とする他は、実施例１と同様に培養した培養液を用いて、実施例２、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液を２０Ｌ用いる他は、２００Ｌ容培養槽で実施例７−１に準じた培養操作を行った。
乾燥菌糸体含有量８ｇ／Ｌの培養液が得られた。
実施例７−４：４００日間静置液体培養
静置液体培養の期間のみ４００日間とする他は、実施例１と同様に培養した培養液を用いて、実施例２、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液２０Ｌを用いる他は、２００Ｌ容培養槽で実施例７−１に準じた培養操作を行った。
乾燥菌糸体含有量６ｇ／Ｌの培養液が得られた。
比較例２
振盪培養によるマツタケ菌（ＩＶ−１）を含有している培養液が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：振盪培養の工程を経ない培養液と比較
比較例２−１：振盪培養抜き
実施例１で製造した、マツタケ菌（ＩＩＩ−１）乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液２Ｌを用いて、菌糸体をホモジェネート処理後、実施例３と同様の培養操作で、３０Ｌ容ジャーファーメンターで培養を行ったが、７日間培養後の培養液から乾燥菌糸体含有量を求めることができなかった。
なお、２０日間振盪培養を実施した結果は、実施例７−１に示すとおりである。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
【実施例８】
振盪培養によるマツタケ菌（ＩＶ−１）を含有している培養液が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：実施例２の２０日間振盪培養と、５日間振盪培養、３日間振盪培養とで得られた培養液を用いて比較。
実施例８−１：２０日間振盪培養
実施例７−１に示すとおりである。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
実施例８−２：５日間振盪培養
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養期間を５日間とする他は、実施例２と同様にして培養液を製造し、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で、実施例７−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量７ｇ／Ｌの培養液が得られた。
実施例８−３：３日間振盪培養
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養期間を３日間とする他は、実施例２と同様にして培養液を製造し、次いで、実施例３と同様の培養操作を行い、培養液を製造した。この培養液を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で、実施例７−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量０．５ｇ／Ｌの培養液が得られた。
比較例３
３０Ｌ容ジャーファーメンターを用いた、通気しない撹拌培養によるマツタケ菌（Ｖ−１）を含有する培養液が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて培養中に通気して得られた培養液との比較。
比較例３−１：マツタケ菌（ＩＶ−１）培養時に培養液に通気した場合
実施例１、次いで、実施例２で製造した培養液を用いて、スパージャー装備３０Ｌ容ジャーファーメンターを使用して、２Ｌ／ｍｉｎの通気をする他は、実施例３と同様の操作を行い、培養液を製造した。この培養液中の菌糸は凝集していた。培養終了時の乾燥菌糸体含有量は０．６ｇ／Ｌで、その内、ファイバー状菌糸体０．０３ｇ／Ｌであった。この培養液を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で、実施例７−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量５ｇ／Ｌの培養液が得られた。
なお、マツタケ菌（ＩＶ−１）培養時に培養液に通気しない場合は、実施例７−１に示すとおりである。実施例３と同様に、３０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、培養液に通気しないで培養した培養液中の菌糸の多くはファイバー状であり、培養終了時の乾燥菌糸体含有量は１ｇ／Ｌで、その内、ファイバー状菌糸体０．９５ｇ／Ｌであった。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７倍、初発菌糸体濃度０．１４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１３ｇ／Ｌ）。
【実施例９】
通気した深部培養によるマツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液の使用量が２００Ｌ容培養槽による深部培養に及ぼした効果：実施例４で得られた培養液の使用量を変えて比較：
実施例９−１：マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を１０Ｌ接種
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を製造した。
他方、Ｂ型基質を２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解・滅菌して１３０Ｌの培地を調製した。この１３０Ｌの培地に、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液１０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例９−２：マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を５Ｌ接種
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で製造した、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を５Ｌ使用し、更に、無菌水を５Ｌ使用する他は、２００Ｌ容培養槽で実施例９−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量１０ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率２８倍、初発菌糸体濃度０．１０７ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０９７ｇ／Ｌ）。
実施例９−３：マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を２Ｌ接種
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で製造した、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を２Ｌ使用し、更に、無菌水を８Ｌ使用する他は、２００Ｌ容培養槽で、実施例９−１に準じた培養操作を行った。乾燥菌糸体含有量２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率７０倍、初発菌糸体濃度０．０４３ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０４ｇ／Ｌ）。
【実施例１０】
通気した深部培養によるマツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を母菌に使用して２００Ｌ容培養槽による深部培養する際の撹拌条件が菌糸体生成に及ぼした効果：
実施例１０−１：培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３
実施例９−１に示すとおりである。
接種時及び、培養後のデータは次の通り。
乾燥菌糸体含有量１２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１０−２：培養液単位体積当たりの撹拌所要動力１．０９ｋＷ／ｍ３
培養液単位体積当たりの撹拌所要動力を１．０９ｋＷ／ｍ３にする他は、実施例１０−１と同様に、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量７ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１０−３：培養液単位体積当たりの撹拌所要動力２．６３ｋＷ／ｍ３〔
培養液単位体積当たりの撹拌所要動力を２．６３ｋＷ／ｍ３にする他は、実施例１０−１と同様に、１２日間深部培養したが、１２日後の培養液から乾燥菌糸体含有量を求めることができなかった。
【実施例１１】
通気した深部培養によるマツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培地を母菌に使用して２００Ｌ容培養槽による深部培養する際の炭素源の違いが菌糸体生成に及ぼした効果：バレイショデンプンとグルコースとの使用量（指標としての浸透圧）による比較。
実施例１１−１：浸透圧０．０５ＭＰａ
実施例１、実施例２、実施例３、次いで、実施例４で、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液を製造した。
他方、Ｃ型基質、バレイショデンプン９．８ｋｇ及び、グルコース１４０ｇを２００Ｌ容培養槽内で水道水に溶解し、滅菌して、浸透圧０．０５ＭＰａの培地１３０Ｌを調製した。この１３０Ｌの培地に、マツタケ菌（ＶＩ−１）を含有している培養液１０Ｌを接種し、培養液単位体積当たりの撹拌所要動力０．１２ｋＷ／ｍ３、通気量４２Ｌ／ｍｉｎ、２３±２℃の条件下で本培養として１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量１４ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１１−２：浸透圧０．５０ＭＰａ
バレイショデンプン４．９７ｋｇ、グルコース４．９７ｋｇを使用して、浸透圧０．５０ＭＰａの培地１３０Ｌを作製する他は、実施例１１−１と同様に操作し、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量９．５ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
実施例１１−３：浸透圧０．９８ＭＰａ
バレイショデンプン１４０ｇ、グルコース９．８ｋｇを使用して、浸透圧０．９８ＭＰａの培地１３０Ｌを作製する他は、実施例１１−１と同様に操作し、１２日間深部培養した。
乾燥菌糸体含有量２ｇ／Ｌの培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．２１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．１９ｇ／Ｌ）。
【実施例１２】
振盪培養の撹拌所要動力がマツタケ菌（Ｖ）の形状と生育活性に及ぼした効果。
実施例１２−１：撹拌所要動力１．６ｋｗ／ｍ３
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養の培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を１．６ｋｗ／ｍ３とすること以外は、実施例２と同様にしてマツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体３．２ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体２．２ｇ／Ｌ）を含有する培養液を製造した。次いでマツタケ菌（ＩＶ−１）の接種量を３Ｌ（実施例３と初発菌糸体濃度を同等とするため）とする以外は実施例３と同様の培養操作を行ったところ、３０Ｌ容ジャーファーメンターによるマツタケ菌（Ｖ−１）から得られた乾燥菌糸体濃度は０．７５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．６ｇ／Ｌ）であった。
接種時拡大倍率６．７倍、初発菌糸体濃度０．４８ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．３８ｇ／Ｌ）。
次いで、このマツタケ菌（Ｖ）を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽で上記マツタケ菌（Ｖ）を２０Ｌ接種すること以外は実施例７−１に準じた培養を行った。培養終了時の乾燥菌糸体濃度は９．７ｇ／Ｌであった。
実施例１２−２：撹拌所要動力２．２ｋｗ／ｍ３
実施例１で製造した培養液を用いて、振盪培養の培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を２．２ｋｗ／ｍ３の高速回転とすること以外は、実施例２と同様にしてマツタケ菌（ＩＶ−１）乾燥菌糸体２．４ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０１３ｇ／Ｌ）を含有する培養液を製造した。次いでマツタケ菌（ＩＶ−１）の接種量を４Ｌ（実施例３と初発菌糸体濃度を同等とするため）とする以外は実施例３と同様の培養操作を行ったところ、３０Ｌ容ジャーファーメンターによるマツタケ菌（Ｖ−１）から得られた乾燥菌糸体濃度は０．５ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０１ｇ／Ｌ）であった。
接種時拡大倍率５倍、初発菌糸体濃度０．４８ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．００２６ｇ／Ｌ）。
次いで、このマツタケ菌（Ｖ）を用いて、更に、２００Ｌ容培養槽でマツタケ菌（Ｖ）の接種量を２０Ｌとする以外は実施例７−１に準じた培養を行った。培養終了時の乾燥菌糸体濃度は４．７ｇ／Ｌであった。
【実施例１３】
２００Ｌ容培養槽によるマツタケ菌（ＶＩ）の撹拌所要動力がマツタケ菌（ＶＩ）の形状と生育活性に及ぼした効果。
実施例１３−１：撹拌所要動力１．７ｋｗ／ｍ３
実施例１、実施例２、及び実施例３でマツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液を製造した。次いで、培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を１．７ｋｗ／ｍ３にすること以外は実施例４に準じた培養を行ったところ、２００Ｌ容培養槽から乾燥菌糸体含有量１．６ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体１．１ｇ／Ｌ）のマツタケ菌（ＶＩ−１）が得られた。次いで、ここで得られたマツタケ菌（ＶＩ−１）を用いて実施例９−１に準じた培養を行ったところ、乾燥菌糸体含有量は９．７ｇ／Ｌのマツタケ菌糸体培養液が得られた。
接種時拡大倍率１４倍、初発菌糸体濃度０．１１ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体濃度０．７８ｇ／Ｌ）。
実施例１３−２：撹拌所要動力２．２ｋｗ／ｍ３
実施例１、実施例２、実施例３でマツタケ菌（Ｖ−１）を含有している培養液を製造した。次いで、培養液単位体積あたりの撹拌所要動力を２．２ｋｗ／ｍ３にすること以外は実施例４に準じた培養を行ったところ、２００Ｌ容培養槽から乾燥菌糸体含有量０．６８ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体０．０２ｇ／Ｌ）のマツタケ菌（ＶＩ−１）が得られた。次いで、ここで得られたマツタケ菌（ＶＩ−１）を用いてマツタケ菌（ＶＩ−１）を２５Ｌ接種する点と、培地調製量を１１５Ｌとする点以外を実施例９−１に準じた培養を行ったところ、培養終了時の乾燥菌糸体含有量は２．５ｇ／Ｌであった。
接種時拡大倍率５．６倍、初発菌糸体濃度０．１２ｇ／Ｌ（その内、ファイバー状菌糸体濃度０．００３６ｇ／Ｌ）。
実施例１４：大量培養に得られたマツタケ菌糸体におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の評価
（１）大量培養に得られたマツタケ菌糸体の凍結乾燥品の調製
実施例６で得られたマツタケ菌糸体を遠心濾過機にて遠心分離し、そのケーキ部分を回収した後に、５ｍｍ角程度に解砕した。解砕したマツタケ菌糸体のブロック（含水率７９．４％Ｗ．Ｂ．）６ｋｇを専用トレー（５１０ｍｍ×７９０ｍｍ）に充填し、−３５℃で２４時間予備凍結した。なお、「Ｗ．Ｂ．」は湿潤重量（ｗｅｔ ｂａｓｅ）を意味する。予備凍結したマツタケ菌糸体を真空度１３Ｐａの減圧条件下で凍結乾燥し、凍結乾燥品１．２ｋｇを得た。凍結乾燥時の最高温度は５０℃であり、凍結乾燥を完了するまで２４時間を要した。凍結乾燥品の含水率は２．７％Ｗ．Ｂ．であった。
得られた凍結乾燥品１．２ｋｇを、粉砕機（ピンミル方式，５０００ｒ／ｍｉｎ）で粉砕し、粉砕品を得た。凍結乾燥品の供給速度は１２ｋｇ／ｈとし、粉砕時の温度は５０℃以下に制御した。前記粉砕品の粒度は、１２５μｍの篩で９０％が通過する粒度であった。
（２）ＮＫ細胞活性の評価
本実施例では、マツタケ菌糸体の有する生理活性として、ストレス負荷に対する促進活性の指標の１つであるＮＫ細胞活性の評価を行った。具体的には、ＮＫ細胞活性は、国際公開第ＷＯ０２／３０４４０号パンフレットの評価例１に記載の方法（マウスを用いた評価系）により、「３０％傷害単位（Ｌｙｔｉｃ Ｕｎｉｔｓ ３０％；ＬＵ３０）」、すなわち、エフェクター細胞１０７個当たり３０％の腫瘍細胞を傷害する細胞数を算出した後、ｔ−検定により比較した。なお、マツタケ菌糸体粉砕品の投与量は、マウスに対して１５０ｍｇ／ｋｇ／日（ヒト相当量に換算した場合、０．６ｇ／日）であった。
前記実施例１４（１）で調製したマツタケ菌糸体の凍結乾燥品には、ＮＫ細胞活性が認められ、蒸留水投与系のコントロール群に対する有意差（有意差検定Ｐ＜０．０５）も認められた。
【産業上の利用可能性】
本発明の製造方法によれば、生理活性を損なうことなく、マツタケ菌糸体を大量に製造することができる。例えば、本発明により、固形培地又は液体培地で、培養又は保存したマツタケ菌を、静置液体培養し、次いで、振盪培養、更に、小スケール培養において（例えば、１００Ｌ未満の小型培養装置を用い）、液体培地中に通気を行なわない条件下又は０．０５ｖｖｍ未満の低通気条件下で撹拌培養を行い製造したマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、大スケール培養（例えば、１００Ｌ以上の中型又は大型培養装置）で、深部培養によりマツタケ菌糸体を製造することが可能になった。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小スケール培養において、液体培地中に通気を行なわない条件下又は０．０５ｖｖｍ未満の低通気条件下で、マツタケ菌糸体を撹拌培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法。
【請求項２】
前記撹拌培養の前培養工程として、
（１）マツタケ菌糸体を静置液体培養する工程、
（２）マツタケ菌糸体を振盪培養する工程、あるいは、
（３）マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程
のいずれか１つの工程を更に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記撹拌培養工程における培養液単位体積あたりの撹拌所要動力が０．０１〜２ｋＷ／ｍ３である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法で得られたマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、深部培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法。
【請求項６】
静置液体培養の期間が、３０〜４００日間である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
振盪培養の期間が５〜５０日間である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
接種時拡大倍率２〜５０倍の拡大培養である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
培養液の浸透圧を０．０１〜０．８ＭＰａに調製した培地を用いる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
初発菌糸体に含有されるファイバー状菌糸体の初発菌糸体濃度が０．０５ｇ／Ｌ以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１】
小スケール培養において、液体培地中に通気を行なわない条件下又は０．０５ｖｖｍ未満の低通気条件下で、マツタケ菌糸体を撹拌培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法。
【請求項２】
前記撹拌培養の前培養工程として、
（１）マツタケ菌糸体を静置液体培養する工程、
（２）マツタケ菌糸体を振盪培養する工程、あるいは、
（３）マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程
のいずれか１つの工程を更に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記撹拌培養工程における培養液単位体積あたりの撹拌所要動力が０．０１〜２ｋＷ／ｍ３である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
マツタケ菌糸体を静置液体培養し、続いて、前記静置液体培養で得られたマツタケ菌糸体を用いて振盪培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法で得られたマツタケ菌糸体を製造用母菌に用いて、深部培養する工程を含む、マツタケ菌糸体の製造方法。
【請求項６】
静置液体培養の期間が、３０〜４００日間である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
振盪培養の期間が５〜５０日間である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
接種時拡大倍率２〜５０倍の拡大培養である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
培養液の浸透圧を０．０１〜０．８ＭＰａに調製した培地を用いる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
初発菌糸体に含有されるファイバー状菌糸体の初発菌糸体濃度が０．０５ｇ／Ｌ以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３８００９
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【発行日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４６４７８（Ｐ２００４−５４６４７８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３６５７
【国際出願日】平成１５年１０月２４日（２００３．１０．２４）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年５月６日（２００４．５．６）
【発行日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１３６５７
【国際出願日】平成１５年１０月２４日（２００３．１０．２４）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
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