マラリア原虫増殖の抑制に関与する細菌、マラリア治療剤、およびマラリア治療剤の生産方法
【課題】アクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理をすることなく、低コストかつ簡便にマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を回収することができる、細菌の提供。
【解決手段】マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生するオクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する、細菌。オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を有効成分とする、マラリア治療剤。
【解決手段】マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生するオクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する、細菌。オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を有効成分とする、マラリア治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫類による感染症の治療に有用な物質を産生する微生物、その物質を利用したマラリア治療剤ならびにその生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは年間４億人以上が感染し、そのうち数百万人が死亡している重要度が非常に高い感染症であり、人類最大の寄生原虫感染症であるといっても過言ではない。この脅威はこれまで亜熱帯・熱帯が主な感染域であったが、地球規模での経済活動の拡大に伴う渡航者の感染や輸入感染症としての報告が我が国でも急増している。また、近年では従来薬に対する耐性種が蔓延しており、さらには地球温暖化による感染域の拡大が懸念されているため、新規のマラリア治療剤の開発は急務となっている。
【０００３】
ヒトに寄生するマラリア原虫類には熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）の４種類に分類される。これらの中で、最も厄介なものはマラリア感染者の８０％を占める熱帯熱マラリア原虫であり、重症の場合には脳性マラリアになって死に至る。これらのマラリア原虫類に対する既存のマラリア治療剤としては、化学合成医薬品であるクロロキンやファンシダール（ピリメサミンとスルファドキシンとの合剤）等、及び生薬青蒿の有効成分であるアルテミシニン等が用いられていた。
【０００４】
哺乳動物体内において、マラリア原虫は赤血球内に侵入して分裂・増殖を繰り返している。マラリア原虫は赤血球内のヘモグロビンをアミノ酸源として利用しているが、その際に原虫体内に残る遊離ヘムは、強い酸化力をもっているために原虫にとって有害である。そのためマラリア原虫は遊離ヘムを重合化するシステム、すなわちヘムを無毒化して排泄するシステムを備えている。キニーネから発展したキノリン系薬剤やアルテミシニンなどの現在使用されているマラリア治療剤はヘム重合化を阻害し、マラリア原虫がヘムを無毒化できなくすることで薬効を示していると考えられている。上記クロロキンやファンシダールの作用機序は、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属の赤血球寄生段階におけるヘモグロビンの代謝中に、ヘムの無毒化の機構を、キノリンが二価の鉄に対する錯形成によって阻害するものと考えられている（例えば、非特許文献１参照）。この様な背景から、ヘム重合化の阻害はマラリアの治療ならびに予防に有効であることが考えられる。
【０００５】
特許文献１には、ヘム重合化の阻害作用によるマラリア治療剤の開発に関して、キノリン環を有する化合物の開発が報告されている。この場合の化合物は化学合成によって得られるものである。しかしながら、化学合成法では、一般にベンゼン、強酸、強アルカリなどの毒性試薬の使用、高温高圧条件、多段階反応を必要とする場合が多い。例えば、クロロキンの基本骨格であるキノリン化合物の場合、キノリン化合物によっては、合成自体が難しく、所望の構造の化合物を得ることが困難である。また、アルテミシニンに代表される植物の抽出物は、多糖等の水溶性化合物から目的物質を精製する際に労力を必要としてしまう。そこで、化学合成法ではなく、糖等の安価な原料から微生物培養によって一段階で目的物質が生産できれば生産面から極めて有利である。
【０００６】
特許文献２や非特許文献２には、抗マラリア活性を有する微生物培養抽出物に関して、ストレプトマイセス属放線菌によるポリエーテル系抗生物質が記載されている。
【０００７】
また、特許文献３には、抗マラリア活性を有する微生物培養抽出物に関して、放線菌によるボレリジンが記載されている。
【０００８】
しかしながら、放線菌はグラム陽性菌に属し、細胞壁は厚く、その８０％がペプチドグリカンであるため、細胞壁が強固である。したがって、放線菌の細胞壁を破砕するためにはアクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理が必要となり、生産物を回収することがグラム陰性菌に比べて高コストとなってしまう。さらには、使用したアクロモペプチダーゼを除去する処理も必要となるため、生産物を回収することがグラム陰性菌に比べて煩雑である。
また、グラム陽性菌の中でも特に分岐した糸状の細胞や菌糸を形成する放線菌は、多様な生理活性を有する二次代謝物を生産する機能を備えることが知られている。ところが、大量生産のための酸素供給を目的とした撹拌が必要であるにもかかわらず、放線菌は糸状の形態を示すことが多いために撹拌に伴う物理的な剪断による細胞の断裂を原因とする死滅が起きてしまい、再現性の高い生産の実施には撹拌の適切な管理が必要となってしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１６３０号公報
【特許文献２】特開２００３−３３５６６７号公報
【特許文献３】特開２００４−２６９４４０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】グエン・ティエン・ヒュイ（Ｎｇｕｙｅｎ Ｔｉｅｎ Ｈｕｙ）、外７名、「クロトリマゾールはヘムに結合してヘム依存性溶血を促進する：クロトリマゾールの提案される抗マラリア機構（Ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｈｅｍｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｈｅｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ）」、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（米国）、米国生化学・分子生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００２年２月、第２７７巻、第６号、ｐ．４１５２−４１５８
【非特許文献２】ジャキュエス・アドベランデ（Ｊａｃｑｕｅｓ Ａｄｏｖｅｌａｎｄｅ）、外１名、「マラリア化学療法におけるカルボン酸型イオノホア：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるプラスモジウム・ファルシパラムとｉｎ ｖｉｖｏにおけるプラスモジウム・ビンケイ・ペッテリに及ぼすモメンシンとニゲリシンの影響（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓ ｉｎ ｍａｌａｒｉａ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｅｎｓｉｎ ａｎｄ ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ ｏｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｎｃｋｅｉ ｐｅｔｔｅｒｉ ｉｎ ｖｉｖｏ）」、（オランダ）、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、１９９６年、第５９巻、第２０号、ｐ．３０９−３１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記のような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的はアクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理をすることなく、低コストかつ簡便にマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を回収することができる細菌を提供することである。また、撹拌の適切な管理をすることなく、高い再現性で該抑制物質を生産できる細菌を提供することも目的とする。さらに、マラリア感染地区がアジア、アフリカ、中南米等の熱帯・亜熱帯に属する発展途上国で医療制度も経済的な基盤の充実もない地域であり、低コストかつ簡便に生産できるマラリア治療剤が望まれていることに鑑みて、該抑制物質を利用したマラリア治療剤や低コストかつ簡便なマラリア治療剤の生産方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明による細菌は、上記の目的の少なくとも一部を達成するために、以下の手段をとった。
【００１３】
本発明の細菌は、マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生するオクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属すること、を要旨とする。
【００１４】
また、本発明の細菌において、前記抑制物質がマラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とすることもできる。
【００１５】
また、本発明の細菌において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００１６】
また、本発明の細菌において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【００１７】
本発明のマラリア治療剤は、オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を有効成分とすること、を要旨とする。
【００１８】
また、本発明のマラリア治療剤において、マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とすることもできる。
【００１９】
また、本発明のマラリア治療剤において、前記培養物のうち上清画分を有効成分とすることを特徴とすることもできる。
【００２０】
また、本発明のマラリア治療剤において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２１】
また、本発明のマラリア治療剤において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２２】
本発明のマラリア治療剤の生産方法は、オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を採取する工程を少なくとも行うこと、を要旨とする。
【００２３】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２４】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２５】
本発明のマラリア治療剤の生産方法は、オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物から上清画分を抽出し、該上清画分を採取する工程を少なくとも行うこと、を要旨とする。
【００２６】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２７】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の細菌はグラム陰性菌であるので、アクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理をすることなく、低コストかつ簡便にマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を回収することができる。また本発明の細菌はグラム陰性菌なので、放線菌で必要となるような撹拌の適切な管理をすることなく、高い再現性で該抑制物質を生産することもできる。
一方、本発明のマラリア治療剤はグラム陰性菌を用いて生産するので、アクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理をすることなく、低コストかつ簡便に生産することができる。また、本発明のマラリア治療剤はグラム陰性菌を用いて生産するので、放線菌で必要となるような撹拌の適切な管理をすることなく高い再現性で生産することができる。
【発明の実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明において使用する細菌はオクロバクトラム属もしくはセラチア属に属するものであるが、ヘムの重合阻害ならびにマラリアの分裂・増殖を抑制する抑制物質を産生する微生物であれば特に限定されない。例えばオクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が好適に用いられるが、それと実質的に同一の菌学的性質を有する菌株であればいずれの菌株も使用することができる。このオクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株は、本発明者らが沖縄県石垣市および宮古島市より採取した多種類の土壌からのスクリーニングによって見出したものである。
【００３０】
１６ＳｒＲＮＡ配列の比較から、３４−２９株はオクロバクトラム アンスロピの標準菌株（米微生物寄託機関アメリカンタイプカルチャーコレクションにＡＴＣＣ４９１８８として寄託されている）の１６ＳｒＲＮＡ配列と９９．７％一致し、４４−１株はセラチアマルセセンスの標準菌株（独微生物寄託機関ドイツ微生物寄託センターにＤＳＭ３０１２１として寄託されている）の１６ＳｒＲＮＡ配列と９９．７％一致したことから、それぞれ、オクロバクトラム属、セラチア属と同定された。これらの菌株は表１に示す菌学的性質を示す。また、これらの菌株は独立行政法人産業技術総合研究所に平成２２年２月１５日付けで寄託し、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５、ＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４を得ている。
【００３１】
これまでにオクロバクトラム属あるいはセラチア属の登録菌株がマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生する能力を有することに関しては全く報告がないのに対し、３４−２９株、４４−１株は後述するようにそのような能力を有する。よって、３４−２９株はオクロバクトラム属に属する新菌株であり、４４−１株はセラチア属に属する新菌株であることが分かった。
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明において用いる細菌の培養は、細菌の通常の培養法に従って行われる。培養の形態は固体培養または液体培養のどちらでもよいが、液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などが利用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物などの有機栄養物質が使用される。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類などが必要に応じて用いられる。培養は細菌が生育可能である温度とｐＨ下で行われ、使用する細菌の最適培養条件で行うのが好ましい。一般的には、培地のｐＨを適当なｐＨ、例えばｐＨ６〜８とし、また、適当な温度、例えば２５−３５℃好ましくは３０℃の通常の細菌の培養条件で、振盪または通気条件下で好気的に行われる。本発明によるマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質の産生は、上記のような培地にて、上記の細菌を上記のような条件で培養することにより行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実地例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実地例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：培養抽出物の調整
内径１８ｍｍ試験管内に調整した培地（可溶性でんぷん、ポリペプトン、肉エキス各１０ｇ、脱イオン水１Ｌ、ｐＨ７．２に調整）５ｍＬをシリコ栓で密栓後、１２１℃、２０分でオートクレーブ処理をし、ＰＣ−１液体培地とした。その後、ＰＣ−１寒天培地（ＰＣ−１培地に寒天末１５ｇを添加したもの）に４℃で保存したオクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株を上記ＰＣ−１液体培地に接種し、３０℃、３日間、１５０ｒｐｍの条件でタイテック社ＢＲ−４０ＬＦ型を用いて好気的に培養し、ＰＣ−１培養液を得た。さらに、シリコ栓で密栓した１００ｍＬ容邪魔板付き三角フラスコに培地（可溶性でんぷん２．５ｇ、ソイビーンミール１．５ｇ、乾燥酵母０．２ｇ、炭酸カルシウム０．４ｇ、脱イオン水１Ｌ、ｐＨ７）２０ｍＬ調整後、同様にオートクレーブ処理を行い、Ｋ培地とした。さらに、そのようにして得られたオクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株のＰＣ−１培養液１ｍＬをＫ培地に接種し、３０℃、７日間好気的に培養した。得られた培養物にアセトンを等量添加し、培養抽出物とした。ここでは微生物の代謝生産物である培養物を溶解しやすくするために培養物にアセトンを添加しているが、培養物を溶解することができるものであればよくメタノールやジメチルスルホキシドなどを添加してもよい。
【００３６】
実施例２：Ｔｗｅｅｎ２０を用いたヘム重合化の阻害活性試験
実施例１で得られた培養抽出物によるヘム重合化の阻害活性試験はＨｕｙらが報告した方法に凖じて行った（グエン・ティエン・ヒュイ（Ｎｇｕｙｅｎ Ｔｉｅｎ Ｈｕｙ）、外６名、「抗マラリア物質のハイスループットスクリーニングのための比色法を用いた簡易ヘム結晶化阻害試験（Ｓｉｍｐｌｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｅｍｅ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」、（米国）、アンチマイクロバイアル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ）、２００７年１月、第５１巻、第１号、ｐ．３５０−３５３）。この方法は、ヘムに一個の塩化物イオンが配意したヘミンに、重合開始剤として非イオン性界面活性剤であるＴＷＥＥＮ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を混合することによってヘムを重合させる。ヘミン（フルカ社製）２０ｍｇをジメチルスルホキシド（ナカライ社製）１．４ｍＬに溶解したものおよび、Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社製）４８ｍｇを脱イオン水１Ｌに溶解したものをそれぞれ、フィルター濾過（ミリポア社製、３μｍ穴径）で不溶物を除去してヘミン溶液、およびＴｗｅｅｎ２０溶液とした。次に、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）５ｍＬに上記ヘミン溶液と０．１規定硫酸水溶液をそれぞれ、終濃度５０μＭ、２０ｍＭになるように混合して作製した。これに、Ｔｗｅｅｎ２０溶液を終濃度１２ｍｇ／Ｌになるように加えたＴｗｅｅｎ２０（＋）サンプルと、対照としてＴｗｅｅｎ２０溶液の代わりに脱イオン水を加えたＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルを作製した。これらのＴｗｅｅｎ２０（＋）サンプルとＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルのそれぞれにオクロバクトラム属３４−２９株培養抽出物を添加したサンプル、セラチア属４４−１株の培養抽出物を添加したサンプル、クロロキンを添加したサンプル、何も添加しないサンプルの計８サンプルを作製した。ここでは、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を、Ｔｗｅｅｎ２０（＋）サンプル又はＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルに最終反応液量の４分の１量を添加した。一方、代表的な抗マラリア剤であるクロロキン試料としてクロロキンニリン酸塩（和光純薬社製）５１．５８６ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解したものを使用し、クロロキンの終濃度が１ｍＭとなるようにＴｗｅｅｎ２０（＋）サンプル又はＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルに添加した。これらの計８サンプルを３７℃で２５０分間インキュベーションした。これにより、Ｔｗｅｅｎ２０含有サンプルではヘム重合化反応が起きる。ヘムの重合化は、波長４１５ｎｍの吸光度（ヘムの吸光波長）の値から波長６１５ｎｍの吸光度（ヘム重合化物であるヘモゾイン形成による濁度）の値を引いた値（４１５−６１５ｎｍ値）で判定した。すなわち、Ｔｗｅｅｎ２０を加えるとヘムが重合化して、波長４１５ｎｍの吸光度が減少して波長６１５ｎｍの吸光度が上昇するために４１５−６１５ｎｍ値は小さくなる。添加物のヘム重合化阻害活性（Ａ比）は、Ｔｗｅｅｎ２０含有サンプルの４１５−６１５ｎｍ値を、Ｔｗｅｅｎ２０非含有サンプルの４１５−６１５ｎｍ値で除することで求めることができる。Ａ比が高いほど、阻害活性が高いことを示す。この実験結果を表２に示す。クロロキンを添加したサンプルのＡ比は添加物なしのサンプルのＡ比よりも高いことから、本評価法の妥当性が検証できた。また、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を添加した場合においても、著しく高いＡ比を示し、両培養抽出物共に高いヘム重合化阻害活性を示した。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物が、ヘム重合を阻害することが分かった。これにより、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が、ヘム重合を阻害する物質を産生することが分かった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
さらに実施例１と同様に培養して得られた培養物を３，０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清と菌体画分を採取した後、各画分にアセトンを培養液と等量添加し、それぞれ上清画分抽出液、菌体画分抽出液とした。ここでは微生物の代謝生産物である培養物を溶解しやすくするために培養物にアセトンを添加しているが、培養物を溶解することができるものであればよくメタノールやジメチルスルホキシドなどを添加してもよい。これら画分抽出液を用いて上記と同様の評価法によりＡ比の比較を行った。この結果を表３に示す。オクロバクトラム属３４−２９株については、菌体画分抽出液を添加すると添加物が無いときと同等のＡ比を示したのに対して上清画分抽出液を添加すると高いＡ比を示したことから、上清画分抽出液にヘム重合活性阻害作用があることが分かる。一方、セラチア属４４−１株については上清、菌体画分抽出液共にヘム重合反応の阻害活性が認められたが、上清画分抽出液を添加したときのＡ比が菌体画分抽出液を添加したときのＡ比よりもやや高いため、上清画分抽出液が菌体画分抽出液よりヘム重合反応の阻害活性がやや強いことが分かった。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物のうち上清画分が、ヘム重合を阻害することが分かった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
実地例３：マラリア原虫粗抽出物によるヘム重合化の阻害活性試験
本試験はＡｒａｗａｌらが報告している方法に準じて行った（ラシュミ・アグラワル（Ｒａｓｈｍｉ Ａｇｒａｗａｌ）、外５名、「シプロヘプタジンが持つ抗マラリア活性の新しいターゲットとしてのヘム重合化酵素（Ｈａｅｍ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）」、（英国）、バイオケミカル・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、エルセビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年１１月、第６４巻、第９号、ｐ．１３９９−１４０６）。この方法は、マラリア感染マウスより採取した感染赤血球を破壊してマラリア原虫を回収し、その原虫の粗抽出物を混合してヘムを重合させる。言い換えるならば、本方法はマラリア原虫が備えているヘム重合化システムをｉｎ ｖｉｔｒｏで再現した方法である。３匹のマウスマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉ）感染マウスの心臓からシリンジを用いて３ｍＬ血液を採取した。採取した血液を１３６ｍＭグルコース、８５ｍＭクエン酸三ナトリウム、３８ｍＭクエン酸を含む水溶液９ｍＬに溶解したものを、室温、１，５００ｒｐｍ条件下で１０分間遠心分離し、沈殿物を赤血球画分とした。赤血球画分は２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、９ｇ／Ｌグルコースを溶解した２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）約２．８ｍＬに懸濁した。該懸濁液１ｍＬを液体窒素に５分間浸せきして、凍結後、室温にて融解し、該懸濁液中の赤血球とマラリア原虫を破壊した。破砕されたマラリア原虫を４℃、１３，０００ｒｐｍ条件下で２０分間遠心分離し、得られた沈殿物を１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０）０．５ｍＬに懸濁したものをマラリア原虫粗抽出物とした。ヘムの重合反応は、１ｍＭヘミン１００μＬ、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μＬ、マラリア原虫粗抽出物５０μＬとオクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株の培養抽出物５０μＬ、滅菌脱イオン水７００μＬを加えて、３７℃で４時間振盪することで行った。また、各菌株の培養抽出物の代わりに２０ｍＭクロロキンを５０μＬ加えた（終濃度１ｍＭ）ものをヘム重合化阻害の陽性対照とし、脱イオン水を５０μＬ加えたものを陰性対照とした。反応終了後、室温、１３，０００ｒｐｍ条件下で５分間遠心分離により得た沈殿物を２．５質量％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）にて１回、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）にて２回、１００ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ ９．０）にて１回洗浄後、室温、１３，０００ｒｐｍ条件下で５分間遠心分離後得られた沈殿物を重合化ヘム画分とした。重合化ヘム画分は５０μＬの２規定ＮａＯＨと２．５質量％ＳＤＳ水溶液９５０μＬに溶解することで遊離ヘム化させ、その遊離ヘムの波長４００ｎｍの吸光度を測定することで重合化ヘムを定量した。重合化ヘム量は同一条件の実験を３回実施し、測定値の平均値と標準偏差を算出した。その結果を表４に示す。表４の結果から、添加物のない場合と比較して、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を添加した場合には測定された重合化ヘム量が極めて低く、該培養抽出物によりヘム重合化活性が阻害されたことが明らかである。また、その効果は代表的な合成抗マラリア薬クロロキンと同程度であった。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物が、マラリア原虫のヘム重合を阻害することが分かった。これにより、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が、マラリア原虫のヘム重合を阻害する物質を産生することが分かった。
【００４１】
【表４】
【００４２】
実地例４：マウスにおける致死性マラリア原虫の成長・増殖阻害試験
マウス致死性のマウスマラリア（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）を含む血液を１５ｕＬヘパリン（ニプロファーマ社製）を含む２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に添加し、１０６−感染赤血球／１００ｕＬになるように調整し、感染血液試料とした。１２週齢の雄の野生型マウスに該感染血液試料０．１ｍＬを腹腔内に試験開始初日に一回投与した。このマラリアは通常、感染９日前後でマウスを死に至らしめる。次に、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物に２２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０分の１量加えたもの（終濃度２２ｍＭ）２００μＬを第１回目投与翌日から毎日該マウスの腹腔内に一日一回投与した。上記感染マウスの尾０．５ｍｍを医療用ハサミで切断し、該切断尾部から得られる血液一滴をスライドガラス上に塗沫し、マラリア学ラボマニュアル（田辺和裄、「マラリア学ラボマニュアル」、第１版、（株）菜根出版、２０００年１１月１５日、ｐ２３−２４）に記載の方法に従ってギムザ染色処理後、油浸レンズによる顕微鏡観察により、マラリア感染赤血球数および全赤血球数を計測し、全赤血球数に対するマラリア感染赤血球数の割合からマラリア感染率を算出した。陽性対照としてクロロキンを用い、感染血液試料を投与した翌日より、２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｇ／Ｌとなるように調整したクロロキン溶液を毎日、一回ずつ、２００μＬ投与した。また、陰性対照として、菌を培養していない培地を実施例１と同様の方法で調整した抽出物を用いた。この実験結果を図１に示す。陰性対照のマウスは、感染５日目から血中にマラリア原虫が確認でき、その後感染率は日毎に上昇して感染９日目にはマラリア感染率が５０％に達し、死亡した（図１では、陰性対照マウスの死亡を十字架で示す）。一方、陽性対照であるクロロキン、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を投与したマウスは、感染後９日までマラリア感染率が１０％以下であった。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物が、マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制していると考えられる。これにより、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が、マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生していると推測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】致死性マラリア感染マウスにおける感染後日数と感染率の関係を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫類による感染症の治療に有用な物質を産生する微生物、その物質を利用したマラリア治療剤ならびにその生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは年間４億人以上が感染し、そのうち数百万人が死亡している重要度が非常に高い感染症であり、人類最大の寄生原虫感染症であるといっても過言ではない。この脅威はこれまで亜熱帯・熱帯が主な感染域であったが、地球規模での経済活動の拡大に伴う渡航者の感染や輸入感染症としての報告が我が国でも急増している。また、近年では従来薬に対する耐性種が蔓延しており、さらには地球温暖化による感染域の拡大が懸念されているため、新規のマラリア治療剤の開発は急務となっている。
【０００３】
ヒトに寄生するマラリア原虫類には熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）の４種類に分類される。これらの中で、最も厄介なものはマラリア感染者の８０％を占める熱帯熱マラリア原虫であり、重症の場合には脳性マラリアになって死に至る。これらのマラリア原虫類に対する既存のマラリア治療剤としては、化学合成医薬品であるクロロキンやファンシダール（ピリメサミンとスルファドキシンとの合剤）等、及び生薬青蒿の有効成分であるアルテミシニン等が用いられていた。
【０００４】
哺乳動物体内において、マラリア原虫は赤血球内に侵入して分裂・増殖を繰り返している。マラリア原虫は赤血球内のヘモグロビンをアミノ酸源として利用しているが、その際に原虫体内に残る遊離ヘムは、強い酸化力をもっているために原虫にとって有害である。そのためマラリア原虫は遊離ヘムを重合化するシステム、すなわちヘムを無毒化して排泄するシステムを備えている。キニーネから発展したキノリン系薬剤やアルテミシニンなどの現在使用されているマラリア治療剤はヘム重合化を阻害し、マラリア原虫がヘムを無毒化できなくすることで薬効を示していると考えられている。上記クロロキンやファンシダールの作用機序は、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属の赤血球寄生段階におけるヘモグロビンの代謝中に、ヘムの無毒化の機構を、キノリンが二価の鉄に対する錯形成によって阻害するものと考えられている（例えば、非特許文献１参照）。この様な背景から、ヘム重合化の阻害はマラリアの治療ならびに予防に有効であることが考えられる。
【０００５】
特許文献１には、ヘム重合化の阻害作用によるマラリア治療剤の開発に関して、キノリン環を有する化合物の開発が報告されている。この場合の化合物は化学合成によって得られるものである。しかしながら、化学合成法では、一般にベンゼン、強酸、強アルカリなどの毒性試薬の使用、高温高圧条件、多段階反応を必要とする場合が多い。例えば、クロロキンの基本骨格であるキノリン化合物の場合、キノリン化合物によっては、合成自体が難しく、所望の構造の化合物を得ることが困難である。また、アルテミシニンに代表される植物の抽出物は、多糖等の水溶性化合物から目的物質を精製する際に労力を必要としてしまう。そこで、化学合成法ではなく、糖等の安価な原料から微生物培養によって一段階で目的物質が生産できれば生産面から極めて有利である。
【０００６】
特許文献２や非特許文献２には、抗マラリア活性を有する微生物培養抽出物に関して、ストレプトマイセス属放線菌によるポリエーテル系抗生物質が記載されている。
【０００７】
また、特許文献３には、抗マラリア活性を有する微生物培養抽出物に関して、放線菌によるボレリジンが記載されている。
【０００８】
しかしながら、放線菌はグラム陽性菌に属し、細胞壁は厚く、その８０％がペプチドグリカンであるため、細胞壁が強固である。したがって、放線菌の細胞壁を破砕するためにはアクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理が必要となり、生産物を回収することがグラム陰性菌に比べて高コストとなってしまう。さらには、使用したアクロモペプチダーゼを除去する処理も必要となるため、生産物を回収することがグラム陰性菌に比べて煩雑である。
また、グラム陽性菌の中でも特に分岐した糸状の細胞や菌糸を形成する放線菌は、多様な生理活性を有する二次代謝物を生産する機能を備えることが知られている。ところが、大量生産のための酸素供給を目的とした撹拌が必要であるにもかかわらず、放線菌は糸状の形態を示すことが多いために撹拌に伴う物理的な剪断による細胞の断裂を原因とする死滅が起きてしまい、再現性の高い生産の実施には撹拌の適切な管理が必要となってしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−１６３０号公報
【特許文献２】特開２００３−３３５６６７号公報
【特許文献３】特開２００４−２６９４４０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】グエン・ティエン・ヒュイ（Ｎｇｕｙｅｎ Ｔｉｅｎ Ｈｕｙ）、外７名、「クロトリマゾールはヘムに結合してヘム依存性溶血を促進する：クロトリマゾールの提案される抗マラリア機構（Ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｈｅｍｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｈｅｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ）」、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（米国）、米国生化学・分子生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００２年２月、第２７７巻、第６号、ｐ．４１５２−４１５８
【非特許文献２】ジャキュエス・アドベランデ（Ｊａｃｑｕｅｓ Ａｄｏｖｅｌａｎｄｅ）、外１名、「マラリア化学療法におけるカルボン酸型イオノホア：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるプラスモジウム・ファルシパラムとｉｎ ｖｉｖｏにおけるプラスモジウム・ビンケイ・ペッテリに及ぼすモメンシンとニゲリシンの影響（Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓ ｉｎ ｍａｌａｒｉａ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｏｎｅｎｓｉｎ ａｎｄ ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ ｏｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｎｃｋｅｉ ｐｅｔｔｅｒｉ ｉｎ ｖｉｖｏ）」、（オランダ）、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、１９９６年、第５９巻、第２０号、ｐ．３０９−３１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記のような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的はアクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理をすることなく、低コストかつ簡便にマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を回収することができる細菌を提供することである。また、撹拌の適切な管理をすることなく、高い再現性で該抑制物質を生産できる細菌を提供することも目的とする。さらに、マラリア感染地区がアジア、アフリカ、中南米等の熱帯・亜熱帯に属する発展途上国で医療制度も経済的な基盤の充実もない地域であり、低コストかつ簡便に生産できるマラリア治療剤が望まれていることに鑑みて、該抑制物質を利用したマラリア治療剤や低コストかつ簡便なマラリア治療剤の生産方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明による細菌は、上記の目的の少なくとも一部を達成するために、以下の手段をとった。
【００１３】
本発明の細菌は、マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生するオクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属すること、を要旨とする。
【００１４】
また、本発明の細菌において、前記抑制物質がマラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とすることもできる。
【００１５】
また、本発明の細菌において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００１６】
また、本発明の細菌において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【００１７】
本発明のマラリア治療剤は、オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を有効成分とすること、を要旨とする。
【００１８】
また、本発明のマラリア治療剤において、マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とすることもできる。
【００１９】
また、本発明のマラリア治療剤において、前記培養物のうち上清画分を有効成分とすることを特徴とすることもできる。
【００２０】
また、本発明のマラリア治療剤において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２１】
また、本発明のマラリア治療剤において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２２】
本発明のマラリア治療剤の生産方法は、オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を採取する工程を少なくとも行うこと、を要旨とする。
【００２３】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２４】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２５】
本発明のマラリア治療剤の生産方法は、オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物から上清画分を抽出し、該上清画分を採取する工程を少なくとも行うこと、を要旨とする。
【００２６】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とすることもできる。
【００２７】
また、本発明のマラリア治療剤の生産方法において、前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とすることもできる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の細菌はグラム陰性菌であるので、アクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理をすることなく、低コストかつ簡便にマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を回収することができる。また本発明の細菌はグラム陰性菌なので、放線菌で必要となるような撹拌の適切な管理をすることなく、高い再現性で該抑制物質を生産することもできる。
一方、本発明のマラリア治療剤はグラム陰性菌を用いて生産するので、アクロモペプチダーゼのような厚い細胞壁を特異的に分解するような高価な酵素による処理をすることなく、低コストかつ簡便に生産することができる。また、本発明のマラリア治療剤はグラム陰性菌を用いて生産するので、放線菌で必要となるような撹拌の適切な管理をすることなく高い再現性で生産することができる。
【発明の実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明において使用する細菌はオクロバクトラム属もしくはセラチア属に属するものであるが、ヘムの重合阻害ならびにマラリアの分裂・増殖を抑制する抑制物質を産生する微生物であれば特に限定されない。例えばオクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が好適に用いられるが、それと実質的に同一の菌学的性質を有する菌株であればいずれの菌株も使用することができる。このオクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株は、本発明者らが沖縄県石垣市および宮古島市より採取した多種類の土壌からのスクリーニングによって見出したものである。
【００３０】
１６ＳｒＲＮＡ配列の比較から、３４−２９株はオクロバクトラム アンスロピの標準菌株（米微生物寄託機関アメリカンタイプカルチャーコレクションにＡＴＣＣ４９１８８として寄託されている）の１６ＳｒＲＮＡ配列と９９．７％一致し、４４−１株はセラチアマルセセンスの標準菌株（独微生物寄託機関ドイツ微生物寄託センターにＤＳＭ３０１２１として寄託されている）の１６ＳｒＲＮＡ配列と９９．７％一致したことから、それぞれ、オクロバクトラム属、セラチア属と同定された。これらの菌株は表１に示す菌学的性質を示す。また、これらの菌株は独立行政法人産業技術総合研究所に平成２２年２月１５日付けで寄託し、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５、ＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４を得ている。
【００３１】
これまでにオクロバクトラム属あるいはセラチア属の登録菌株がマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生する能力を有することに関しては全く報告がないのに対し、３４−２９株、４４−１株は後述するようにそのような能力を有する。よって、３４−２９株はオクロバクトラム属に属する新菌株であり、４４−１株はセラチア属に属する新菌株であることが分かった。
【００３２】
【表１】
【００３３】
本発明において用いる細菌の培養は、細菌の通常の培養法に従って行われる。培養の形態は固体培養または液体培養のどちらでもよいが、液体培養が好ましい。培地の栄養源としては通常用いられているものが広く用いられる。炭素源としては利用可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、コハク酸、クエン酸、酢酸などが利用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、ポリペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン加水分解物などの有機栄養物質が使用される。そのほか、リン酸塩、炭酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、タングステン、銅、ビタミン類などが必要に応じて用いられる。培養は細菌が生育可能である温度とｐＨ下で行われ、使用する細菌の最適培養条件で行うのが好ましい。一般的には、培地のｐＨを適当なｐＨ、例えばｐＨ６〜８とし、また、適当な温度、例えば２５−３５℃好ましくは３０℃の通常の細菌の培養条件で、振盪または通気条件下で好気的に行われる。本発明によるマラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質の産生は、上記のような培地にて、上記の細菌を上記のような条件で培養することにより行うことができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実地例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実地例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：培養抽出物の調整
内径１８ｍｍ試験管内に調整した培地（可溶性でんぷん、ポリペプトン、肉エキス各１０ｇ、脱イオン水１Ｌ、ｐＨ７．２に調整）５ｍＬをシリコ栓で密栓後、１２１℃、２０分でオートクレーブ処理をし、ＰＣ−１液体培地とした。その後、ＰＣ−１寒天培地（ＰＣ−１培地に寒天末１５ｇを添加したもの）に４℃で保存したオクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株を上記ＰＣ−１液体培地に接種し、３０℃、３日間、１５０ｒｐｍの条件でタイテック社ＢＲ−４０ＬＦ型を用いて好気的に培養し、ＰＣ−１培養液を得た。さらに、シリコ栓で密栓した１００ｍＬ容邪魔板付き三角フラスコに培地（可溶性でんぷん２．５ｇ、ソイビーンミール１．５ｇ、乾燥酵母０．２ｇ、炭酸カルシウム０．４ｇ、脱イオン水１Ｌ、ｐＨ７）２０ｍＬ調整後、同様にオートクレーブ処理を行い、Ｋ培地とした。さらに、そのようにして得られたオクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株のＰＣ−１培養液１ｍＬをＫ培地に接種し、３０℃、７日間好気的に培養した。得られた培養物にアセトンを等量添加し、培養抽出物とした。ここでは微生物の代謝生産物である培養物を溶解しやすくするために培養物にアセトンを添加しているが、培養物を溶解することができるものであればよくメタノールやジメチルスルホキシドなどを添加してもよい。
【００３６】
実施例２：Ｔｗｅｅｎ２０を用いたヘム重合化の阻害活性試験
実施例１で得られた培養抽出物によるヘム重合化の阻害活性試験はＨｕｙらが報告した方法に凖じて行った（グエン・ティエン・ヒュイ（Ｎｇｕｙｅｎ Ｔｉｅｎ Ｈｕｙ）、外６名、「抗マラリア物質のハイスループットスクリーニングのための比色法を用いた簡易ヘム結晶化阻害試験（Ｓｉｍｐｌｅｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｅｍｅ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」、（米国）、アンチマイクロバイアル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏｇｙ）、２００７年１月、第５１巻、第１号、ｐ．３５０−３５３）。この方法は、ヘムに一個の塩化物イオンが配意したヘミンに、重合開始剤として非イオン性界面活性剤であるＴＷＥＥＮ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）を混合することによってヘムを重合させる。ヘミン（フルカ社製）２０ｍｇをジメチルスルホキシド（ナカライ社製）１．４ｍＬに溶解したものおよび、Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社製）４８ｍｇを脱イオン水１Ｌに溶解したものをそれぞれ、フィルター濾過（ミリポア社製、３μｍ穴径）で不溶物を除去してヘミン溶液、およびＴｗｅｅｎ２０溶液とした。次に、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）５ｍＬに上記ヘミン溶液と０．１規定硫酸水溶液をそれぞれ、終濃度５０μＭ、２０ｍＭになるように混合して作製した。これに、Ｔｗｅｅｎ２０溶液を終濃度１２ｍｇ／Ｌになるように加えたＴｗｅｅｎ２０（＋）サンプルと、対照としてＴｗｅｅｎ２０溶液の代わりに脱イオン水を加えたＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルを作製した。これらのＴｗｅｅｎ２０（＋）サンプルとＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルのそれぞれにオクロバクトラム属３４−２９株培養抽出物を添加したサンプル、セラチア属４４−１株の培養抽出物を添加したサンプル、クロロキンを添加したサンプル、何も添加しないサンプルの計８サンプルを作製した。ここでは、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を、Ｔｗｅｅｎ２０（＋）サンプル又はＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルに最終反応液量の４分の１量を添加した。一方、代表的な抗マラリア剤であるクロロキン試料としてクロロキンニリン酸塩（和光純薬社製）５１．５８６ｍｇを脱イオン水１ｍＬに溶解したものを使用し、クロロキンの終濃度が１ｍＭとなるようにＴｗｅｅｎ２０（＋）サンプル又はＴｗｅｅｎ２０（−）サンプルに添加した。これらの計８サンプルを３７℃で２５０分間インキュベーションした。これにより、Ｔｗｅｅｎ２０含有サンプルではヘム重合化反応が起きる。ヘムの重合化は、波長４１５ｎｍの吸光度（ヘムの吸光波長）の値から波長６１５ｎｍの吸光度（ヘム重合化物であるヘモゾイン形成による濁度）の値を引いた値（４１５−６１５ｎｍ値）で判定した。すなわち、Ｔｗｅｅｎ２０を加えるとヘムが重合化して、波長４１５ｎｍの吸光度が減少して波長６１５ｎｍの吸光度が上昇するために４１５−６１５ｎｍ値は小さくなる。添加物のヘム重合化阻害活性（Ａ比）は、Ｔｗｅｅｎ２０含有サンプルの４１５−６１５ｎｍ値を、Ｔｗｅｅｎ２０非含有サンプルの４１５−６１５ｎｍ値で除することで求めることができる。Ａ比が高いほど、阻害活性が高いことを示す。この実験結果を表２に示す。クロロキンを添加したサンプルのＡ比は添加物なしのサンプルのＡ比よりも高いことから、本評価法の妥当性が検証できた。また、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を添加した場合においても、著しく高いＡ比を示し、両培養抽出物共に高いヘム重合化阻害活性を示した。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物が、ヘム重合を阻害することが分かった。これにより、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が、ヘム重合を阻害する物質を産生することが分かった。
【００３７】
【表２】
【００３８】
さらに実施例１と同様に培養して得られた培養物を３，０００ｒｐｍ、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清と菌体画分を採取した後、各画分にアセトンを培養液と等量添加し、それぞれ上清画分抽出液、菌体画分抽出液とした。ここでは微生物の代謝生産物である培養物を溶解しやすくするために培養物にアセトンを添加しているが、培養物を溶解することができるものであればよくメタノールやジメチルスルホキシドなどを添加してもよい。これら画分抽出液を用いて上記と同様の評価法によりＡ比の比較を行った。この結果を表３に示す。オクロバクトラム属３４−２９株については、菌体画分抽出液を添加すると添加物が無いときと同等のＡ比を示したのに対して上清画分抽出液を添加すると高いＡ比を示したことから、上清画分抽出液にヘム重合活性阻害作用があることが分かる。一方、セラチア属４４−１株については上清、菌体画分抽出液共にヘム重合反応の阻害活性が認められたが、上清画分抽出液を添加したときのＡ比が菌体画分抽出液を添加したときのＡ比よりもやや高いため、上清画分抽出液が菌体画分抽出液よりヘム重合反応の阻害活性がやや強いことが分かった。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物のうち上清画分が、ヘム重合を阻害することが分かった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
実地例３：マラリア原虫粗抽出物によるヘム重合化の阻害活性試験
本試験はＡｒａｗａｌらが報告している方法に準じて行った（ラシュミ・アグラワル（Ｒａｓｈｍｉ Ａｇｒａｗａｌ）、外５名、「シプロヘプタジンが持つ抗マラリア活性の新しいターゲットとしてのヘム重合化酵素（Ｈａｅｍ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ）」、（英国）、バイオケミカル・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、エルセビア・サイエンス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００２年１１月、第６４巻、第９号、ｐ．１３９９−１４０６）。この方法は、マラリア感染マウスより採取した感染赤血球を破壊してマラリア原虫を回収し、その原虫の粗抽出物を混合してヘムを重合させる。言い換えるならば、本方法はマラリア原虫が備えているヘム重合化システムをｉｎ ｖｉｔｒｏで再現した方法である。３匹のマウスマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉ）感染マウスの心臓からシリンジを用いて３ｍＬ血液を採取した。採取した血液を１３６ｍＭグルコース、８５ｍＭクエン酸三ナトリウム、３８ｍＭクエン酸を含む水溶液９ｍＬに溶解したものを、室温、１，５００ｒｐｍ条件下で１０分間遠心分離し、沈殿物を赤血球画分とした。赤血球画分は２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、９ｇ／Ｌグルコースを溶解した２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）約２．８ｍＬに懸濁した。該懸濁液１ｍＬを液体窒素に５分間浸せきして、凍結後、室温にて融解し、該懸濁液中の赤血球とマラリア原虫を破壊した。破砕されたマラリア原虫を４℃、１３，０００ｒｐｍ条件下で２０分間遠心分離し、得られた沈殿物を１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０）０．５ｍＬに懸濁したものをマラリア原虫粗抽出物とした。ヘムの重合反応は、１ｍＭヘミン１００μＬ、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１００μＬ、マラリア原虫粗抽出物５０μＬとオクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株の培養抽出物５０μＬ、滅菌脱イオン水７００μＬを加えて、３７℃で４時間振盪することで行った。また、各菌株の培養抽出物の代わりに２０ｍＭクロロキンを５０μＬ加えた（終濃度１ｍＭ）ものをヘム重合化阻害の陽性対照とし、脱イオン水を５０μＬ加えたものを陰性対照とした。反応終了後、室温、１３，０００ｒｐｍ条件下で５分間遠心分離により得た沈殿物を２．５質量％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）にて１回、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ７．４）にて２回、１００ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ ９．０）にて１回洗浄後、室温、１３，０００ｒｐｍ条件下で５分間遠心分離後得られた沈殿物を重合化ヘム画分とした。重合化ヘム画分は５０μＬの２規定ＮａＯＨと２．５質量％ＳＤＳ水溶液９５０μＬに溶解することで遊離ヘム化させ、その遊離ヘムの波長４００ｎｍの吸光度を測定することで重合化ヘムを定量した。重合化ヘム量は同一条件の実験を３回実施し、測定値の平均値と標準偏差を算出した。その結果を表４に示す。表４の結果から、添加物のない場合と比較して、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を添加した場合には測定された重合化ヘム量が極めて低く、該培養抽出物によりヘム重合化活性が阻害されたことが明らかである。また、その効果は代表的な合成抗マラリア薬クロロキンと同程度であった。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物が、マラリア原虫のヘム重合を阻害することが分かった。これにより、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が、マラリア原虫のヘム重合を阻害する物質を産生することが分かった。
【００４１】
【表４】
【００４２】
実地例４：マウスにおける致死性マラリア原虫の成長・増殖阻害試験
マウス致死性のマウスマラリア（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）を含む血液を１５ｕＬヘパリン（ニプロファーマ社製）を含む２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に添加し、１０６−感染赤血球／１００ｕＬになるように調整し、感染血液試料とした。１２週齢の雄の野生型マウスに該感染血液試料０．１ｍＬを腹腔内に試験開始初日に一回投与した。このマラリアは通常、感染９日前後でマウスを死に至らしめる。次に、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物に２２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０分の１量加えたもの（終濃度２２ｍＭ）２００μＬを第１回目投与翌日から毎日該マウスの腹腔内に一日一回投与した。上記感染マウスの尾０．５ｍｍを医療用ハサミで切断し、該切断尾部から得られる血液一滴をスライドガラス上に塗沫し、マラリア学ラボマニュアル（田辺和裄、「マラリア学ラボマニュアル」、第１版、（株）菜根出版、２０００年１１月１５日、ｐ２３−２４）に記載の方法に従ってギムザ染色処理後、油浸レンズによる顕微鏡観察により、マラリア感染赤血球数および全赤血球数を計測し、全赤血球数に対するマラリア感染赤血球数の割合からマラリア感染率を算出した。陽性対照としてクロロキンを用い、感染血液試料を投与した翌日より、２２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に５ｇ／Ｌとなるように調整したクロロキン溶液を毎日、一回ずつ、２００μＬ投与した。また、陰性対照として、菌を培養していない培地を実施例１と同様の方法で調整した抽出物を用いた。この実験結果を図１に示す。陰性対照のマウスは、感染５日目から血中にマラリア原虫が確認でき、その後感染率は日毎に上昇して感染９日目にはマラリア感染率が５０％に達し、死亡した（図１では、陰性対照マウスの死亡を十字架で示す）。一方、陽性対照であるクロロキン、オクロバクトラム属３４−２９株又はセラチア属４４−１株培養抽出物を投与したマウスは、感染後９日までマラリア感染率が１０％以下であった。よって、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株を培養して得られる培養物が、マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制していると考えられる。これにより、オクロバクトラム属３４−２９株およびセラチア属４４−１株が、マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生していると推測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】致死性マラリア感染マウスにおける感染後日数と感染率の関係を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生するオクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌。
【請求項２】
前記抑制物質がマラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の細菌
に記載の細菌。
【請求項４】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の細菌。
【請求項５】
オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を有効成分とするマラリア治療剤。
【請求項６】
マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とする請求項５に記載のマラリア治療剤。
【請求項７】
前記培養物のうち上清画分を有効成分とすることを特徴とする請求項５又は６のいずれかに記載のマラリア治療剤
【請求項８】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載のマラリア治療剤。
【請求項９】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載のマラリア治療剤。
【請求項１０】
オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を採取する工程を少なくとも行うマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１１】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項１０に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１２】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項１０に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１３】
オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物から上清画分を抽出し、該上清画分を採取する工程を少なくとも行うマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１４】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項１３に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１５】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項１３に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１】
マラリア原虫の増殖を抑制する抑制物質を産生するオクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌。
【請求項２】
前記抑制物質がマラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とする請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の細菌
に記載の細菌。
【請求項４】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の細菌。
【請求項５】
オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を有効成分とするマラリア治療剤。
【請求項６】
マラリア原虫のヘム重合を阻害することにより該マラリア原虫の増殖を抑制することを特徴とする請求項５に記載のマラリア治療剤。
【請求項７】
前記培養物のうち上清画分を有効成分とすることを特徴とする請求項５又は６のいずれかに記載のマラリア治療剤
【請求項８】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載のマラリア治療剤。
【請求項９】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載のマラリア治療剤。
【請求項１０】
オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物を採取する工程を少なくとも行うマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１１】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項１０に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１２】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項１０に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１３】
オクロバクトラム属またはセラチア属のいずれかに属する細菌を培養して得られる培養物から上清画分を抽出し、該上清画分を採取する工程を少なくとも行うマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１４】
前記オクロバクトラム属に属する細菌がオクロバクトラムＦＥＲＭ Ｐ−２１９１５菌株であることを特徴とする請求項１３に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【請求項１５】
前記セラチア属に属する細菌がセラチアＦＥＲＭ Ｐ−２１９１４菌株であることを特徴とする請求項１３に記載のマラリア治療剤の生産方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−２４４７９７（Ｐ２０１１−２４４７９７Ａ）
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３１４６４（Ｐ２０１０−１３１４６４）
【出願日】平成２２年５月２１日（２０１０．５．２１）
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月８日（２０１１．１２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２１日（２０１０．５．２１）
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
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