メチルケトン類の製造方法
【課題】
微生物によるメチルケトン類の製造方法において、培地に高濃度の油脂が含まれていても、微生物の成育が妨げられず、油脂を効率よくメチルケトン類に変換する方法を提供すること。
【解決手段】
液体培地に、メチルケトンを生産できる真菌類の固体培養物を接種して培養を行い、ペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し油脂を重量比で２倍量以上加え培養することを特徴とするメチルケトンの製造方法。
微生物によるメチルケトン類の製造方法において、培地に高濃度の油脂が含まれていても、微生物の成育が妨げられず、油脂を効率よくメチルケトン類に変換する方法を提供すること。
【解決手段】
液体培地に、メチルケトンを生産できる真菌類の固体培養物を接種して培養を行い、ペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し油脂を重量比で２倍量以上加え培養することを特徴とするメチルケトンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物変換による天然油脂からのメチルケトン類の製造方法に関する。さらに詳しくは、液体培地に対し重量比で２倍量以上の油脂を使用しても、油脂を効率よくメチルケトン類に変換する、好収率のメチルケトン類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチルケトン類はブルーチーズのキーフレーバーであり、また、乳製品、石鹸等のフレーバー用の香料素材として有用な物質であるため、従来より油脂から微生物を用いて天然のメチルケトン類を生産する方法が検討されてきた。例えば、ラウリン酸０．４％を含む基質をペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）に属する微生物を用いて変換する方法（非特許文献１）、ブルーチーズを最大３２％含むスラリーを基質としてペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）に属する微生物を用いて生産する方法（非特許文献２）、ラウリン酸を最大で４６％含む基質に対しペニシリウム・シトリナム（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）またはユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属に属する微生物を使用して生産する方法（非特許文献３）、ココナッツオイルを約３．２％含む基質にアスペルギルス・ルーバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｕｂｅｒ）もしくはアスペルギルス・レペンス（Ａ．ｒｅｐｅｎｓ）に属する微生物を作用させる方法（非特許文献４）等が知られている。また、微生物変換においてメチルケトン類の生産効率を高める方法として、特定の属または種に属する微生物を使用する方法（特許文献１）、微生物としてオウレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）を使用し、微生物の成育に有害でない基質濃度を維持しながら培養して、培地中の油脂濃度が最大３３％にて変換を可能とした、大量のメチルケトンを生産する方法（特許文献２）、多孔性床を使用し、微生物の生育を阻害せず基質濃度を上げる方法（実施例における最大の油脂含量４３％）（特許文献３）、２価のアルカリ土類金属イオンの存在下で培養を行い、培地中油脂が最大１０％の高濃度でも基質をメチルケトン類に変換する方法等が提案されている。
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１，ｐ．２８９−３０２（１９６８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．，３０，ｐ．１９７−２０２（１９７９）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３（１２）ｐ．２８４７−２８４９，（１９８４）
【非特許文献４】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６（５），ｐ．１４１７−１４２０（１９８７）
【特許文献１】特開平２−２６５４９５号公報
【特許文献２】特開平３−７６５８８号公報
【特許文献３】特開平３−１５１８８６号公報
【特許文献４】特開平４−１４８６８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
メチルケトン類の微生物変換による生産においては、油脂含量を上げることにより、油脂の抗菌性、栄養物質の移動の妨害によって微生物の成育が妨げられ、メチルケトン類の生産が抑制される。そのため、前述した従来の方法では、いずれも生産の効率が十分とはいえず、さらに効率の良いメチルケトン類の製造方法が求められていた。したがって、本発明の目的は、培地に高濃度の油脂が含まれていても、微生物の成育が妨げられず、油脂を効率よくメチルケトン類に変換する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、前記課題に鑑み種々検討を行った。その結果、前培養における液体培地での培養において、真菌類をペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し油脂を添加してさらに培養すると、油脂が効率よく分解してメチルケトンに変換されることを見出した。さらに、驚くべきことに、この方法においは油脂を液体培地に対し重量比で２倍量以上加えても変換が進行することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
かくして、本発明は、液体培地に、メチルケトンを生産できる真菌類の固体培養物を接種して培養を行い、ペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し重量比で２〜４倍量の油脂を添加して、さらに培養することを特徴とするメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、メチルケトンを生産できる真菌類がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属および／またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属であることを特徴とする、前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【０００８】
本発明はまた、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐ．ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・フェオニシス（Ａｓｐ．ｐｈｅｏｎｉｃｉｓ）であり、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物がペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カゼイ（Ｐｅｎ．ｃａｓｅｉ）またはペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎ． ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）である前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明はまた、液体培地に油脂を加える時点で、さらに、リパーゼを添加することを特徴とする、前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【００１０】
本発明はまた、油脂がラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸を主要な構成脂肪酸とするグリセライドであることを特徴とする前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明では、固体培養物の接種が液体培地に対し分生子数で１０３〜１０５個／ｍｌである前記のメチルケトンの製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法によれば、油脂含量が６６％を越える培地でも油脂をメチルケトン類に変換する反応が効率よく進行するため、メチルケトン類の効率の良い製造方法を提供することができる。また、その結果、１バッチ製造当たりの収量があがり、製造に係わるコストを低減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明において使用することのできる真菌類としてはメチルケトン類を生産することのできる真菌類であればいずれの微生物でも良いが、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する真菌類を例示することができる。また、これらのうちアルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐ．ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・フェオニシス（Ａｓｐ．ｐｈｅｏｎｉｃｉｓ）を挙げることができる。また、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物としてペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カゼイ（Ｐｅｎ．ｃａｓｅｉ）またはペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）を挙げることができる。さらに、これらのタイプカルチャーとしてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＡＭ２１５２、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ ＩＦＯ４６２２を例示することができる。
【００１４】
本発明でメチルケトンの出発物質として使用することのできる油脂としては脂肪酸単独、あるいは脂肪あるいはその他のエステルを含んだものが使用できるが、実際には入手上の容易さから、グリセリンの脂肪酸エステルが好ましい。具体的に使用することのできる油脂としては、大豆油、ごま油、コーン油、菜種油、米糠油、綿実油、ひまし油、落花生油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油、サフラワー油、小麦胚芽油、椰子油、ヒマワリ油、つばき油、ココア脂、イワシ油、サケ油、サバ油、サメ油、マグロ油、鯨油、イルカ油、イカ油、サンマ油、にしん油、たら油、牛脂、鶏油、豚脂、バター等の動植物油脂類を挙げることができる。また、生成するメチルケトン類を香料として使用する場合には、油脂はラウリン酸、デカン酸、オクタン酸を主要な構成脂肪酸とするグリセライドであることが好ましく、その中でも特に好ましくはヤシ油およびパーム核油を挙げることができる。
【００１５】
真菌類を液体培地にて培養する前段階として、固体培養物を作成することが好ましい。固体培養物を液体培地に接種することにより、液体培地に接種する分生子数の量をコントロールし、かつ、分散を均一にすることが容易となる。固体培養物は穀物類、芋類、豆類、パン粉等の比表面積が広く、ほぐれやすい素材をそのまま、あるいは必要に応じて水に浸漬して吸水させた後、澱粉のα化を兼ねて加熱滅菌して得られたものを培地として、真菌類を接種し、約２０℃〜約４０℃で約３日〜約５日間培養して作成する。このようにして得られた固体培養物には菌糸が組織の内部全体に行き渡り、多数の分生子を生じ、また、全体がほぐれやすいため、液体培地に接種する分生子数のコントロールおよび分散の均一化をきわめて容易に行うことができる。
【００１６】
引き続き、真菌類を液体培地にて培養する。液体培地の組成は炭素源、窒素源、無機物、微量栄養素等を程よく含有する培地中において、好気的条件下に温度、ｐＨ等を調節しつつ培養する。
【００１７】
液体培地に使用する炭素源としてはグルコース、スクロース、グリセリン、デキストリン等糸状菌の培養に通常用いられる炭素源を使用する。窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、アスパラギン、グルタミン酸ナトリウム、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が、無機物・微量栄養素としては硫酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化第二鉄、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カリウム、ホウ酸、種々のビタミン（パントテン酸カルシウム、イノシトール、ピリドキシン等）等が用いられる。また、炭素源、窒素源、無機栄養源を兼ねたものとして、コーンスティープリカー、ホエー、脱脂粉乳、乾燥酵母、酒粕等を加えることもできる。また、培養中バクテリアによるコンタミネーションをさけるため、クロラムフェニコール等の殺バクテリア性物質を培地に含有させてもよい。
【００１８】
また、液体培地には、メチルケトン類の出発物質として使用するのと同じ油脂をあらかじめ液体培地全体の約０．１％〜約１０％程度添加しておくことが好ましい。このことにより、真菌類が油脂をメチルケトンに変換するための酵素活性を効率よく誘導することができる。
【００１９】
液体培養は次のようにして行う。まず、前記の液体培地原料を混合、滅菌した後、先に得られた固体培養物の水懸濁物を接種し培養を行う。本発明では、このとき、ペレット状の菌糸体を形成させるように培養することが重要である。このことにより後に大量の油脂を加えた時にも、大量の油脂全てを効率よくメチルケトン類に変換することが可能となる。菌糸体がパルプ状に生育した場合、培地の粘度により、酸素や栄養素の移送が阻害されて培地の部位での酸素や栄養素の偏りが生じ、また粘度により基質である油脂と菌糸との接触が悪くなり、油脂のメチルケトン類への変換効率が低下する。培養方法及び条件は菌糸体がペレット状に生育するような方法であればいかなる方法でも良い。菌糸体をペレット状に生育させるためのひとつの方法として、固体培養物の接種が液体培地に対し分生子数で１０３〜１０５個／ｍｌであるようにコントロールする方法を例示できる。液体培地での培養では初菌数により菌糸体の生育形態が変化することが知られているが、初期の分生子数を１０３〜１０５個／ｍｌとした場合、菌糸体がペレット状に生育することが認められる。一方、初期の分生子数が１０５個／ｍｌより多い場合、菌糸体がパルプ状に生育してしまい、また、初期の分生子数が１０３個／ｍｌより少ない場合、菌糸体はパルプ状に生育するか、もしくは、菌糸体は培養槽の壁部に付着して生育し、いずれもペレットを形成しないことが認められる。
【００２０】
培養条件としては温度として約１５℃〜約５０℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃で、必要に応じて通気、攪拌、振盪等の条件を採用し、約４時間〜約４８時間培養する。また、必要に応じてｐＨを微生物の成育に最も適した範囲内に調整しながら反応させることも可能である。
【００２１】
次いで液体培養物に対して重量比で２倍量以上の油脂を添加し、油脂のメチルケトンへの変換を行う。油脂を加える時点は、平均粒径が０．５〜３ｍｍのペレット状の菌糸体が形成された時点が好ましい。菌糸のペレットがこの平均粒径の範囲内となった時点であれば、培地に対して重量比で２倍量以上の油脂を添加しても安定して油脂をメチルケトン類に変換できることが認められる。またペレットが３ｍｍを越えてしまうと、ペレット内部の菌糸と油脂の接触が悪くなるため、効率が低下する。
【００２２】
また、油脂を加える時点で、さらに、リパーゼを添加することにより、油脂のメチルケトンへの変換をさらに効率よく行うことができる。油脂からのメチルケトン類への変換はまず油脂がリパーゼ活性により脂肪酸とグリセリンに分解され、さらに脂肪酸がβ酸化され、続いて脱炭酸されてメチルケトン類に変換される。したがって、このときリパーゼを添加することにより、油脂の脂肪酸への分解を促進し、油脂からのメチルケトン類への変換の効率を高めることができる。使用することのできるリパーゼとしては、特に制限されるものではなく、例えば、アスペルギルス属、リゾムコール属、リゾープス属、ペニシリウム属、キャンディダ属、ピキア属、クロモバクテリウム属、アルカリゲネス属、ストレストマイセス属、アクチノマデュラ属、バチラス属等の各種微生物から採取されるリパーゼ、豚の膵臓から得られるリパーゼ、子ヤギ、子ヒツジ、子ウシの口頭分泌腺から採取したオーラルリパーゼ等を適宜利用することができる。また、市販品としてはリパーゼＡ、リパーゼＬ、リパーゼＭ、リパーゼＡＰ、リパーゼＡＹ、リパーゼＰ、リパーゼＡＫ、リパーゼＣＥＳ、リパーゼＭ−ＡＰ、リパーゼＤ、リパーゼＮ、リパーゼＣＴ、リパーゼＲ(以上、アマノエンザイム（株）製)、リパーゼＭＹ（名糖産業（株）製）、リパーゼＰ（ナガセケムテックス（株）製）、豚膵臓リパーゼ(シグマアルドリッチジャパン（株）製)、レシターゼ、パラターゼ、パラダーゼＭ(以上、ノボザイムズ（株）製)、リパーゼ「サイケン」（（株）ヤクルト本社製）、タリパーゼ(田辺製薬（株）製)等を例示することができる。これらのリパーゼは単独又は数種組み合わせて利用することもできる。リパーゼの使用量は、力価等により異なり一概には言えないが、通常、油脂原料の重量を基準として０．１〜１００００ｕ／ｇ、好ましくは０．５〜２０００ｕ／ｇ、より好ましくは２〜５００ｕ／ｇの範囲内を例示することができる。
【００２３】
油脂のメチルケトン類への変換における培養条件としては、温度として約１５℃〜約５０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃で、必要に応じて通気、攪拌、振盪等の条件を採用し、また、必要に応じてｐＨを微生物の成育に最も適した範囲内に調整しながら反応させることも可能である。また、反応時間としては約２０時間〜約１００時間、好ましくは約４０時間〜約８０時間培養する方法を例示することができるが、メチルケトン類の生成量を測定しながら、適宜選択することが好ましい。
【００２４】
変換反応終了液からのメチルケトン類の回収は常法により行うことができる。例えば、本発明の方法では、得られるメチルケトン類の量が多いため、培養液の上層に油相としてメチルケトン類の豊富な油の層が得られる。したがって、変換反応終了液から菌体を除去し、さらに遠心分離等の分離手段により油相を採取し、油相を常圧または減圧蒸留法にてメチルケトン類を含む留分を採取することにより、メチルケトン類を精製することができる。また、遠心分離により採取した油相から、液体クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等のカラム分離操作によりメチルケトン類を得ることも可能である。前記の分離した菌体や遠心分離時の水層にもメチルケトン類は含まれているが、これらはヘキサン、酢酸エチル、石油エーテル、クロロホルム等の有機溶剤にて抽出し、溶剤を回収した後、減圧または減圧蒸留法にてメチルケトン類を含む留分を採取することにより回収することができる。また前記の分離した菌体や遠心分離時の水層からは、水蒸気蒸留によってもメチルケトン類を回収することが可能である。また、菌体の分離や培養液の遠心分離等の分離操作を行わず、精製の当初から溶剤抽出または水蒸気蒸留を行うことも可能である。いかなる方法を選択するかは、メチルケトン類の回収率と、作業性、生産コスト等を考慮しながら決定すればよい。
【００２５】
かくして得られたメチルケトン類はブルーチーズ、マヨネーズ、ワイン、ウィスキー、酒、味噌、醤油、パン等の食品類のフレーバーの他、シャンプー、化粧品等の香粧品類、あるいは医薬品類用の香料類等の各種調合香料の原料として使用するとことが可能である。
以下、実施例および比較例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例】
【００２６】
実施例１
精白米１３０ｇを水に一夜浸漬し、水切りの後、１２０℃、１５分間滅菌後、同一培地にて培養したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＡＭ２１５２の培養物１ｇを接種し３０℃にて４日間培養し、固体培養物を得た。
別に、リン酸1カリウム １２９ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２Ｈ２０ １８ｇ、結晶ぶどう糖 １６６ｇ、酵母エキス１１２ｇ、ヤシ油５００ｇ、水９０７５ｇを５０Ｌジャーファーメンターに投入し、１２１℃、２０分間加熱殺菌を行った後、３０℃まで冷却し、液体培地とした。この液体培地に、先に培養した固体培養物２５ｇを滅菌水１２５ｇに懸濁したもの（分生子数６×１０５個／ｍｌ）を添加した（このときの液体培地中の分生子数は計算上９×１０３個／ｍｌとなる）。培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら、２８時間培養を行ったところ、菌糸体はペレット状に生育し、その平均粒径は約０．９ｍｍであった。さらにここに溶解したヤシ油（一旦６０℃加熱溶解後、３５℃まで冷却）２０ｋｇ（油脂を含めた培地全体の６６％）およびリーパーゼＡ（アマノエンザイム（株）社製）１５ｇを投入し、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら培養を行った。培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を図１に示す。なお、図１におけるメチルケトンの生成量（％）は添加したヤシ油の重量に対する重量（％）を表す。メチルケトン類の分析は、ガスクロマトグラフィー法により行った。分析条件は下記の通りである。
機器：ヒュ−レットパッカ−ド ５８９０
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（３０ｍ×０．２５ｎｍ）
Ｉ．Ｄ＝０．２５μｍ
キャリア−ガス：１ｍｌ／ｍｉｎ．（Ｈｅ）抽入口圧＝１４ｐｓｉ
カラム温度：１００°Ｃ（１ｍｉｎ．）〜２５０°Ｃ（１０°Ｃ／ｍｉｎ．）
インジェクタ−：２５０°Ｃ、スプリットレス、１μｌ
ディテクタ−：ＦＩＤ
また、ヤシ油の一般的な脂肪酸組成（％）は下記の通りである。
カプロン酸 ０〜０．８％
カプリル酸 ５〜９％
カプリン酸 ６〜１０％
ラウリン酸 ４４〜５２％
ミリスチン酸 １３〜１９％
パルミチン酸 ８〜１１％
ステアリン酸 １〜３％
オレイン酸 ５〜８％
リノール酸 ｔｒａｃｅ〜２．５％
微生物変換によりカプロン酸より２−ヘプタノン、カプリル酸より２−ノナノン、カプリン酸より２−ウンデカノンが生成する。
７７時間まで培養を行ったところ、香料として重要である２−ヘプタノンおよび２−ノナノンについては原料ヤシ油中のカプロン酸およびカプリル酸がほぼ全量変換されたと考えられる量で生成した。
ヤシ油を添加してから７７時間経過した時点で培養を終了し、７５℃、１５分間加熱殺菌、４０℃まで冷却後、４０℃にて保温静置し、デカントにより上層のオイル部を分離した後、遠心分離にて油相９．８ｋｇを回収した。この油相を常圧蒸留して１５０℃〜２００℃の留分（本発明品１）２．３６ｋｇを得た。
本発明品１におけるメチルケトン類の組成比は以下の通りであった。
２−ヘプタノン ２８．１％
２−ノナノン ２４．５％
２−ウンデカノン ３６．０％
【００２７】
実施例２
実施例１において、香料として重要である２−ヘプタノンおよび２−ノナノンが原料ヤシ油中のカプロン酸およびカプリル酸がほぼ全量変換されたと考えられる量まで生成したため、培養を７７時間までとした。しかしながら、培養をさらに続けた場合、２−ウンデカノンの生成は時間と共にさらに増加すると考えられる。そこで、実施例１と全く同一条件で、さらに２４５時間まで培養を継続した。培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を図２に示す。
２４５時間まで培養を継続したところ、２−ウンデカノンが原料ヤシ油中のカプリン酸が全て変換されたと考えられる量まで生成した。しかしながら、香料として重要な２−ヘプタノンおよび２−ノナノンは約８０時間をピークとしてその後は減少へと転じた。この原因としては微生物が資化したか、または、通気培養であるため揮散してしまった等が考えられるが原因は明らかではない。
【００２８】
比較例１（接種菌数が多くパルプ状の菌糸体を形成した例）
実施例１において、固体培養物２５ｇを滅菌水１２５ｇに懸濁したものを液体培地に添加するのに代えて固体培養物１０００ｇを滅菌水５０００ｇに懸濁したものを液体培地に添加した。このときの分生子数は２．４×１０５／ｍｌであった。引き続き実施例１と同様に培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら、２８時間培養を行ったが菌糸体はパルプ状に生育した。
ここに溶解したヤシ油（一旦６０℃加熱溶解後、３５℃まで冷却）２０ｋｇおよびリーパーゼＡ（アマノエンザイム（株）社製）１５ｇを投入し、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら培養を行った。反応時間とメチルケトン類の生成量の関係を図３に示す。なお、図３におけるメチルケトンの生成量（％）は添加したヤシ油の重量に対する重量（％）を表す。
図３に示した通り、菌糸体がパルプ状に生育した比較例３は菌糸体がペレット状に生育した実施例１と比較して、油脂のメチルケトンへの変換効率は１／２以下であり、変換効率が悪かった。
【００２９】
実施例３（メチルケトン類を生産する微生物としてペニシリウムを使用）
パン粉５０ｇに水１０ｇを添加し、１２０℃、１５分間滅菌後、滅菌水４０ｍｌを添加し、同一培地にて培養したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ ＩＦＯ４６２２の培養物１ｇを接種し３０℃にて４日間培養し、固体培養物を得た。
別に、リン酸1カリウム １２９ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２Ｈ２０ １８ｇ、結晶ぶどう糖 １６６ｇ、酵母エキス１１２ｇ、ヤシ油５００ｇ、水９０７５ｇを５０Ｌジャーファーメンターに投入し、１２１℃、２０分間加熱殺菌を行った後、３０℃まで冷却し、液体培地とした。この液体培地に、先に培養した固体培養物５０ｇを滅菌水２５０ｇに懸濁したもの（分生子数２．４×１０６個／ｍｌ）を添加した。このときの分生子数は７．０×１０４個／ｍｌであった。培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら、２６時間培養を行ったところ、菌糸体はペレット状に生育し、その平均粒径は約０．７ｍｍであった。
ここに溶解したヤシ油（一旦６０℃加熱溶解後、３５℃まで冷却）２０ｋｇおよびリーパーゼＡ（アマノエンザイム（株）社製）１５ｇを投入し、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら培養を行った。反応時間とメチルケトン類の生成量の関係を図４に示す。なお、図４におけるメチルケトンの生成量（％）は添加したヤシ油の重量に対する重量（％）を表す。
図４に示した通り、微生物としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ ＩＦＯ４６２２を使用した場合においても、実施例１とほぼ同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】菌糸体がペレット形成後にヤシ油を添加した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（実施例１）
【図２】図１において反応時間をさらに延長した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（実施例２）
【図３】菌糸体がパルプ状に生育したところにヤシ油を添加した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（比較例１）
【図４】微生物としてＰｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉを使用し、菌糸体がペレット形成後にヤシ油を添加した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（実施例３）
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物変換による天然油脂からのメチルケトン類の製造方法に関する。さらに詳しくは、液体培地に対し重量比で２倍量以上の油脂を使用しても、油脂を効率よくメチルケトン類に変換する、好収率のメチルケトン類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチルケトン類はブルーチーズのキーフレーバーであり、また、乳製品、石鹸等のフレーバー用の香料素材として有用な物質であるため、従来より油脂から微生物を用いて天然のメチルケトン類を生産する方法が検討されてきた。例えば、ラウリン酸０．４％を含む基質をペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）に属する微生物を用いて変換する方法（非特許文献１）、ブルーチーズを最大３２％含むスラリーを基質としてペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）に属する微生物を用いて生産する方法（非特許文献２）、ラウリン酸を最大で４６％含む基質に対しペニシリウム・シトリナム（Ｐ．ｃｉｔｒｉｎｕｍ）またはユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属に属する微生物を使用して生産する方法（非特許文献３）、ココナッツオイルを約３．２％含む基質にアスペルギルス・ルーバー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｒｕｂｅｒ）もしくはアスペルギルス・レペンス（Ａ．ｒｅｐｅｎｓ）に属する微生物を作用させる方法（非特許文献４）等が知られている。また、微生物変換においてメチルケトン類の生産効率を高める方法として、特定の属または種に属する微生物を使用する方法（特許文献１）、微生物としてオウレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）を使用し、微生物の成育に有害でない基質濃度を維持しながら培養して、培地中の油脂濃度が最大３３％にて変換を可能とした、大量のメチルケトンを生産する方法（特許文献２）、多孔性床を使用し、微生物の生育を阻害せず基質濃度を上げる方法（実施例における最大の油脂含量４３％）（特許文献３）、２価のアルカリ土類金属イオンの存在下で培養を行い、培地中油脂が最大１０％の高濃度でも基質をメチルケトン類に変換する方法等が提案されている。
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１，ｐ．２８９−３０２（１９６８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．，３０，ｐ．１９７−２０２（１９７９）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３（１２）ｐ．２８４７−２８４９，（１９８４）
【非特許文献４】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６（５），ｐ．１４１７−１４２０（１９８７）
【特許文献１】特開平２−２６５４９５号公報
【特許文献２】特開平３−７６５８８号公報
【特許文献３】特開平３−１５１８８６号公報
【特許文献４】特開平４−１４８６８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
メチルケトン類の微生物変換による生産においては、油脂含量を上げることにより、油脂の抗菌性、栄養物質の移動の妨害によって微生物の成育が妨げられ、メチルケトン類の生産が抑制される。そのため、前述した従来の方法では、いずれも生産の効率が十分とはいえず、さらに効率の良いメチルケトン類の製造方法が求められていた。したがって、本発明の目的は、培地に高濃度の油脂が含まれていても、微生物の成育が妨げられず、油脂を効率よくメチルケトン類に変換する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、前記課題に鑑み種々検討を行った。その結果、前培養における液体培地での培養において、真菌類をペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し油脂を添加してさらに培養すると、油脂が効率よく分解してメチルケトンに変換されることを見出した。さらに、驚くべきことに、この方法においは油脂を液体培地に対し重量比で２倍量以上加えても変換が進行することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
かくして、本発明は、液体培地に、メチルケトンを生産できる真菌類の固体培養物を接種して培養を行い、ペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し重量比で２〜４倍量の油脂を添加して、さらに培養することを特徴とするメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【０００７】
また、本発明は、メチルケトンを生産できる真菌類がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属および／またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属であることを特徴とする、前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【０００８】
本発明はまた、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐ．ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・フェオニシス（Ａｓｐ．ｐｈｅｏｎｉｃｉｓ）であり、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物がペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カゼイ（Ｐｅｎ．ｃａｓｅｉ）またはペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎ． ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）である前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明はまた、液体培地に油脂を加える時点で、さらに、リパーゼを添加することを特徴とする、前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【００１０】
本発明はまた、油脂がラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸を主要な構成脂肪酸とするグリセライドであることを特徴とする前記のメチルケトンの製造方法を提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明では、固体培養物の接種が液体培地に対し分生子数で１０３〜１０５個／ｍｌである前記のメチルケトンの製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法によれば、油脂含量が６６％を越える培地でも油脂をメチルケトン類に変換する反応が効率よく進行するため、メチルケトン類の効率の良い製造方法を提供することができる。また、その結果、１バッチ製造当たりの収量があがり、製造に係わるコストを低減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明において使用することのできる真菌類としてはメチルケトン類を生産することのできる真菌類であればいずれの微生物でも良いが、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する真菌類を例示することができる。また、これらのうちアルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐ．ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・フェオニシス（Ａｓｐ．ｐｈｅｏｎｉｃｉｓ）を挙げることができる。また、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物としてペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カゼイ（Ｐｅｎ．ｃａｓｅｉ）またはペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）を挙げることができる。さらに、これらのタイプカルチャーとしてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＡＭ２１５２、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ ＩＦＯ４６２２を例示することができる。
【００１４】
本発明でメチルケトンの出発物質として使用することのできる油脂としては脂肪酸単独、あるいは脂肪あるいはその他のエステルを含んだものが使用できるが、実際には入手上の容易さから、グリセリンの脂肪酸エステルが好ましい。具体的に使用することのできる油脂としては、大豆油、ごま油、コーン油、菜種油、米糠油、綿実油、ひまし油、落花生油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油、サフラワー油、小麦胚芽油、椰子油、ヒマワリ油、つばき油、ココア脂、イワシ油、サケ油、サバ油、サメ油、マグロ油、鯨油、イルカ油、イカ油、サンマ油、にしん油、たら油、牛脂、鶏油、豚脂、バター等の動植物油脂類を挙げることができる。また、生成するメチルケトン類を香料として使用する場合には、油脂はラウリン酸、デカン酸、オクタン酸を主要な構成脂肪酸とするグリセライドであることが好ましく、その中でも特に好ましくはヤシ油およびパーム核油を挙げることができる。
【００１５】
真菌類を液体培地にて培養する前段階として、固体培養物を作成することが好ましい。固体培養物を液体培地に接種することにより、液体培地に接種する分生子数の量をコントロールし、かつ、分散を均一にすることが容易となる。固体培養物は穀物類、芋類、豆類、パン粉等の比表面積が広く、ほぐれやすい素材をそのまま、あるいは必要に応じて水に浸漬して吸水させた後、澱粉のα化を兼ねて加熱滅菌して得られたものを培地として、真菌類を接種し、約２０℃〜約４０℃で約３日〜約５日間培養して作成する。このようにして得られた固体培養物には菌糸が組織の内部全体に行き渡り、多数の分生子を生じ、また、全体がほぐれやすいため、液体培地に接種する分生子数のコントロールおよび分散の均一化をきわめて容易に行うことができる。
【００１６】
引き続き、真菌類を液体培地にて培養する。液体培地の組成は炭素源、窒素源、無機物、微量栄養素等を程よく含有する培地中において、好気的条件下に温度、ｐＨ等を調節しつつ培養する。
【００１７】
液体培地に使用する炭素源としてはグルコース、スクロース、グリセリン、デキストリン等糸状菌の培養に通常用いられる炭素源を使用する。窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、アスパラギン、グルタミン酸ナトリウム、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が、無機物・微量栄養素としては硫酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化第二鉄、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カリウム、ホウ酸、種々のビタミン（パントテン酸カルシウム、イノシトール、ピリドキシン等）等が用いられる。また、炭素源、窒素源、無機栄養源を兼ねたものとして、コーンスティープリカー、ホエー、脱脂粉乳、乾燥酵母、酒粕等を加えることもできる。また、培養中バクテリアによるコンタミネーションをさけるため、クロラムフェニコール等の殺バクテリア性物質を培地に含有させてもよい。
【００１８】
また、液体培地には、メチルケトン類の出発物質として使用するのと同じ油脂をあらかじめ液体培地全体の約０．１％〜約１０％程度添加しておくことが好ましい。このことにより、真菌類が油脂をメチルケトンに変換するための酵素活性を効率よく誘導することができる。
【００１９】
液体培養は次のようにして行う。まず、前記の液体培地原料を混合、滅菌した後、先に得られた固体培養物の水懸濁物を接種し培養を行う。本発明では、このとき、ペレット状の菌糸体を形成させるように培養することが重要である。このことにより後に大量の油脂を加えた時にも、大量の油脂全てを効率よくメチルケトン類に変換することが可能となる。菌糸体がパルプ状に生育した場合、培地の粘度により、酸素や栄養素の移送が阻害されて培地の部位での酸素や栄養素の偏りが生じ、また粘度により基質である油脂と菌糸との接触が悪くなり、油脂のメチルケトン類への変換効率が低下する。培養方法及び条件は菌糸体がペレット状に生育するような方法であればいかなる方法でも良い。菌糸体をペレット状に生育させるためのひとつの方法として、固体培養物の接種が液体培地に対し分生子数で１０３〜１０５個／ｍｌであるようにコントロールする方法を例示できる。液体培地での培養では初菌数により菌糸体の生育形態が変化することが知られているが、初期の分生子数を１０３〜１０５個／ｍｌとした場合、菌糸体がペレット状に生育することが認められる。一方、初期の分生子数が１０５個／ｍｌより多い場合、菌糸体がパルプ状に生育してしまい、また、初期の分生子数が１０３個／ｍｌより少ない場合、菌糸体はパルプ状に生育するか、もしくは、菌糸体は培養槽の壁部に付着して生育し、いずれもペレットを形成しないことが認められる。
【００２０】
培養条件としては温度として約１５℃〜約５０℃、好ましくは約２０℃〜約４０℃で、必要に応じて通気、攪拌、振盪等の条件を採用し、約４時間〜約４８時間培養する。また、必要に応じてｐＨを微生物の成育に最も適した範囲内に調整しながら反応させることも可能である。
【００２１】
次いで液体培養物に対して重量比で２倍量以上の油脂を添加し、油脂のメチルケトンへの変換を行う。油脂を加える時点は、平均粒径が０．５〜３ｍｍのペレット状の菌糸体が形成された時点が好ましい。菌糸のペレットがこの平均粒径の範囲内となった時点であれば、培地に対して重量比で２倍量以上の油脂を添加しても安定して油脂をメチルケトン類に変換できることが認められる。またペレットが３ｍｍを越えてしまうと、ペレット内部の菌糸と油脂の接触が悪くなるため、効率が低下する。
【００２２】
また、油脂を加える時点で、さらに、リパーゼを添加することにより、油脂のメチルケトンへの変換をさらに効率よく行うことができる。油脂からのメチルケトン類への変換はまず油脂がリパーゼ活性により脂肪酸とグリセリンに分解され、さらに脂肪酸がβ酸化され、続いて脱炭酸されてメチルケトン類に変換される。したがって、このときリパーゼを添加することにより、油脂の脂肪酸への分解を促進し、油脂からのメチルケトン類への変換の効率を高めることができる。使用することのできるリパーゼとしては、特に制限されるものではなく、例えば、アスペルギルス属、リゾムコール属、リゾープス属、ペニシリウム属、キャンディダ属、ピキア属、クロモバクテリウム属、アルカリゲネス属、ストレストマイセス属、アクチノマデュラ属、バチラス属等の各種微生物から採取されるリパーゼ、豚の膵臓から得られるリパーゼ、子ヤギ、子ヒツジ、子ウシの口頭分泌腺から採取したオーラルリパーゼ等を適宜利用することができる。また、市販品としてはリパーゼＡ、リパーゼＬ、リパーゼＭ、リパーゼＡＰ、リパーゼＡＹ、リパーゼＰ、リパーゼＡＫ、リパーゼＣＥＳ、リパーゼＭ−ＡＰ、リパーゼＤ、リパーゼＮ、リパーゼＣＴ、リパーゼＲ(以上、アマノエンザイム（株）製)、リパーゼＭＹ（名糖産業（株）製）、リパーゼＰ（ナガセケムテックス（株）製）、豚膵臓リパーゼ(シグマアルドリッチジャパン（株）製)、レシターゼ、パラターゼ、パラダーゼＭ(以上、ノボザイムズ（株）製)、リパーゼ「サイケン」（（株）ヤクルト本社製）、タリパーゼ(田辺製薬（株）製)等を例示することができる。これらのリパーゼは単独又は数種組み合わせて利用することもできる。リパーゼの使用量は、力価等により異なり一概には言えないが、通常、油脂原料の重量を基準として０．１〜１００００ｕ／ｇ、好ましくは０．５〜２０００ｕ／ｇ、より好ましくは２〜５００ｕ／ｇの範囲内を例示することができる。
【００２３】
油脂のメチルケトン類への変換における培養条件としては、温度として約１５℃〜約５０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃で、必要に応じて通気、攪拌、振盪等の条件を採用し、また、必要に応じてｐＨを微生物の成育に最も適した範囲内に調整しながら反応させることも可能である。また、反応時間としては約２０時間〜約１００時間、好ましくは約４０時間〜約８０時間培養する方法を例示することができるが、メチルケトン類の生成量を測定しながら、適宜選択することが好ましい。
【００２４】
変換反応終了液からのメチルケトン類の回収は常法により行うことができる。例えば、本発明の方法では、得られるメチルケトン類の量が多いため、培養液の上層に油相としてメチルケトン類の豊富な油の層が得られる。したがって、変換反応終了液から菌体を除去し、さらに遠心分離等の分離手段により油相を採取し、油相を常圧または減圧蒸留法にてメチルケトン類を含む留分を採取することにより、メチルケトン類を精製することができる。また、遠心分離により採取した油相から、液体クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等のカラム分離操作によりメチルケトン類を得ることも可能である。前記の分離した菌体や遠心分離時の水層にもメチルケトン類は含まれているが、これらはヘキサン、酢酸エチル、石油エーテル、クロロホルム等の有機溶剤にて抽出し、溶剤を回収した後、減圧または減圧蒸留法にてメチルケトン類を含む留分を採取することにより回収することができる。また前記の分離した菌体や遠心分離時の水層からは、水蒸気蒸留によってもメチルケトン類を回収することが可能である。また、菌体の分離や培養液の遠心分離等の分離操作を行わず、精製の当初から溶剤抽出または水蒸気蒸留を行うことも可能である。いかなる方法を選択するかは、メチルケトン類の回収率と、作業性、生産コスト等を考慮しながら決定すればよい。
【００２５】
かくして得られたメチルケトン類はブルーチーズ、マヨネーズ、ワイン、ウィスキー、酒、味噌、醤油、パン等の食品類のフレーバーの他、シャンプー、化粧品等の香粧品類、あるいは医薬品類用の香料類等の各種調合香料の原料として使用するとことが可能である。
以下、実施例および比較例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例】
【００２６】
実施例１
精白米１３０ｇを水に一夜浸漬し、水切りの後、１２０℃、１５分間滅菌後、同一培地にて培養したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＩＡＭ２１５２の培養物１ｇを接種し３０℃にて４日間培養し、固体培養物を得た。
別に、リン酸1カリウム １２９ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２Ｈ２０ １８ｇ、結晶ぶどう糖 １６６ｇ、酵母エキス１１２ｇ、ヤシ油５００ｇ、水９０７５ｇを５０Ｌジャーファーメンターに投入し、１２１℃、２０分間加熱殺菌を行った後、３０℃まで冷却し、液体培地とした。この液体培地に、先に培養した固体培養物２５ｇを滅菌水１２５ｇに懸濁したもの（分生子数６×１０５個／ｍｌ）を添加した（このときの液体培地中の分生子数は計算上９×１０３個／ｍｌとなる）。培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら、２８時間培養を行ったところ、菌糸体はペレット状に生育し、その平均粒径は約０．９ｍｍであった。さらにここに溶解したヤシ油（一旦６０℃加熱溶解後、３５℃まで冷却）２０ｋｇ（油脂を含めた培地全体の６６％）およびリーパーゼＡ（アマノエンザイム（株）社製）１５ｇを投入し、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら培養を行った。培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を図１に示す。なお、図１におけるメチルケトンの生成量（％）は添加したヤシ油の重量に対する重量（％）を表す。メチルケトン類の分析は、ガスクロマトグラフィー法により行った。分析条件は下記の通りである。
機器：ヒュ−レットパッカ−ド ５８９０
カラム：ＤＢ−ＷＡＸ（３０ｍ×０．２５ｎｍ）
Ｉ．Ｄ＝０．２５μｍ
キャリア−ガス：１ｍｌ／ｍｉｎ．（Ｈｅ）抽入口圧＝１４ｐｓｉ
カラム温度：１００°Ｃ（１ｍｉｎ．）〜２５０°Ｃ（１０°Ｃ／ｍｉｎ．）
インジェクタ−：２５０°Ｃ、スプリットレス、１μｌ
ディテクタ−：ＦＩＤ
また、ヤシ油の一般的な脂肪酸組成（％）は下記の通りである。
カプロン酸 ０〜０．８％
カプリル酸 ５〜９％
カプリン酸 ６〜１０％
ラウリン酸 ４４〜５２％
ミリスチン酸 １３〜１９％
パルミチン酸 ８〜１１％
ステアリン酸 １〜３％
オレイン酸 ５〜８％
リノール酸 ｔｒａｃｅ〜２．５％
微生物変換によりカプロン酸より２−ヘプタノン、カプリル酸より２−ノナノン、カプリン酸より２−ウンデカノンが生成する。
７７時間まで培養を行ったところ、香料として重要である２−ヘプタノンおよび２−ノナノンについては原料ヤシ油中のカプロン酸およびカプリル酸がほぼ全量変換されたと考えられる量で生成した。
ヤシ油を添加してから７７時間経過した時点で培養を終了し、７５℃、１５分間加熱殺菌、４０℃まで冷却後、４０℃にて保温静置し、デカントにより上層のオイル部を分離した後、遠心分離にて油相９．８ｋｇを回収した。この油相を常圧蒸留して１５０℃〜２００℃の留分（本発明品１）２．３６ｋｇを得た。
本発明品１におけるメチルケトン類の組成比は以下の通りであった。
２−ヘプタノン ２８．１％
２−ノナノン ２４．５％
２−ウンデカノン ３６．０％
【００２７】
実施例２
実施例１において、香料として重要である２−ヘプタノンおよび２−ノナノンが原料ヤシ油中のカプロン酸およびカプリル酸がほぼ全量変換されたと考えられる量まで生成したため、培養を７７時間までとした。しかしながら、培養をさらに続けた場合、２−ウンデカノンの生成は時間と共にさらに増加すると考えられる。そこで、実施例１と全く同一条件で、さらに２４５時間まで培養を継続した。培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を図２に示す。
２４５時間まで培養を継続したところ、２−ウンデカノンが原料ヤシ油中のカプリン酸が全て変換されたと考えられる量まで生成した。しかしながら、香料として重要な２−ヘプタノンおよび２−ノナノンは約８０時間をピークとしてその後は減少へと転じた。この原因としては微生物が資化したか、または、通気培養であるため揮散してしまった等が考えられるが原因は明らかではない。
【００２８】
比較例１（接種菌数が多くパルプ状の菌糸体を形成した例）
実施例１において、固体培養物２５ｇを滅菌水１２５ｇに懸濁したものを液体培地に添加するのに代えて固体培養物１０００ｇを滅菌水５０００ｇに懸濁したものを液体培地に添加した。このときの分生子数は２．４×１０５／ｍｌであった。引き続き実施例１と同様に培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら、２８時間培養を行ったが菌糸体はパルプ状に生育した。
ここに溶解したヤシ油（一旦６０℃加熱溶解後、３５℃まで冷却）２０ｋｇおよびリーパーゼＡ（アマノエンザイム（株）社製）１５ｇを投入し、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら培養を行った。反応時間とメチルケトン類の生成量の関係を図３に示す。なお、図３におけるメチルケトンの生成量（％）は添加したヤシ油の重量に対する重量（％）を表す。
図３に示した通り、菌糸体がパルプ状に生育した比較例３は菌糸体がペレット状に生育した実施例１と比較して、油脂のメチルケトンへの変換効率は１／２以下であり、変換効率が悪かった。
【００２９】
実施例３（メチルケトン類を生産する微生物としてペニシリウムを使用）
パン粉５０ｇに水１０ｇを添加し、１２０℃、１５分間滅菌後、滅菌水４０ｍｌを添加し、同一培地にて培養したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ ＩＦＯ４６２２の培養物１ｇを接種し３０℃にて４日間培養し、固体培養物を得た。
別に、リン酸1カリウム １２９ｇ、リン酸水素２ナトリウム・１２Ｈ２０ １８ｇ、結晶ぶどう糖 １６６ｇ、酵母エキス１１２ｇ、ヤシ油５００ｇ、水９０７５ｇを５０Ｌジャーファーメンターに投入し、１２１℃、２０分間加熱殺菌を行った後、３０℃まで冷却し、液体培地とした。この液体培地に、先に培養した固体培養物５０ｇを滅菌水２５０ｇに懸濁したもの（分生子数２．４×１０６個／ｍｌ）を添加した。このときの分生子数は７．０×１０４個／ｍｌであった。培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら、２６時間培養を行ったところ、菌糸体はペレット状に生育し、その平均粒径は約０．７ｍｍであった。
ここに溶解したヤシ油（一旦６０℃加熱溶解後、３５℃まで冷却）２０ｋｇおよびリーパーゼＡ（アマノエンザイム（株）社製）１５ｇを投入し、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍにて通気を行いながら培養を行った。反応時間とメチルケトン類の生成量の関係を図４に示す。なお、図４におけるメチルケトンの生成量（％）は添加したヤシ油の重量に対する重量（％）を表す。
図４に示した通り、微生物としてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ ＩＦＯ４６２２を使用した場合においても、実施例１とほぼ同様の結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】菌糸体がペレット形成後にヤシ油を添加した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（実施例１）
【図２】図１において反応時間をさらに延長した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（実施例２）
【図３】菌糸体がパルプ状に生育したところにヤシ油を添加した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（比較例１）
【図４】微生物としてＰｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉを使用し、菌糸体がペレット形成後にヤシ油を添加した場合の培養時間とメチルケトン類の生成量の関係を示した図である。（実施例３）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地に、メチルケトンを生産できる真菌類の固体培養物を接種して培養を行い、ペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し重量比で２〜４倍量の油脂を添加して、さらに培養することを特徴とするメチルケトンの製造方法。
【請求項２】
メチルケトンを生産できる真菌類がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物であることを特徴とする、請求項１に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項３】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐ．ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・フェオニシス（Ａｓｐ．ｐｈｅｏｎｉｃｉｓ）であり、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物がペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カゼイ（Ｐｅｎ．ｃａｓｅｉ）またはペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）である請求項２に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項４】
液体培地に油脂を添加する時点で、さらに、リパーゼを添加することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項５】
油脂がラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸を主要な構成脂肪酸とするトリグリセライドであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項６】
固体培養物の接種が液体培地に対し分生子数で１０３〜１０５個／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項１】
液体培地に、メチルケトンを生産できる真菌類の固体培養物を接種して培養を行い、ペレット状の菌糸体を平均粒径が０．５〜３ｍｍとなるように形成させた後、液体培地に対し重量比で２〜４倍量の油脂を添加して、さらに培養することを特徴とするメチルケトンの製造方法。
【請求項２】
メチルケトンを生産できる真菌類がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物であることを特徴とする、請求項１に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項３】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐ．ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ．ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・フェオニシス（Ａｓｐ．ｐｈｅｏｎｉｃｉｓ）であり、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物がペニシリウム・ロックフォルチ（Ｐｅｎ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カゼイ（Ｐｅｎ．ｃａｓｅｉ）またはペニシリウム・ジャンシネラム（Ｐｅｎ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ）である請求項２に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項４】
液体培地に油脂を添加する時点で、さらに、リパーゼを添加することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項５】
油脂がラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸を主要な構成脂肪酸とするトリグリセライドであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のメチルケトンの製造方法。
【請求項６】
固体培養物の接種が液体培地に対し分生子数で１０３〜１０５個／ｍｌであることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のメチルケトンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１０４３７３（Ｐ２００８−１０４３７３Ａ）
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８８４５１（Ｐ２００６−２８８４５１）
【出願日】平成１８年１０月２４日（２００６．１０．２４）
【出願人】（０００２１４５３７）長谷川香料株式会社 (176)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２４日（２００６．１０．２４）
【出願人】（０００２１４５３７）長谷川香料株式会社 (176)
【Ｆターム（参考）】
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