メラミン類分解剤及びこれを用いたメラミン類の分解方法
【課題】複雑な培養制御を要することなくメラミン類を効率的に分解できる微生物を提供する。
【解決手段】好気的条件下でメラミン類を分解する、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）及びマイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）並びにこれらの変異株を提供する。
【解決手段】好気的条件下でメラミン類を分解する、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）及びマイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）並びにこれらの変異株を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、メラミン類の分解方法及びこの方法に用いる分解微生物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
塗料工場や塗装工程を有する工場から排出される廃水には、親水性有機化合物が多く含まれている。廃水は一般に活性汚泥によって処理されるが、廃水中には難分解性物質も含まれており、こうした難分解性物質は分解されずに排出されてしまう可能性がある。例えば、塗料中に架橋剤として含まれるメラミン樹脂も難分解性物質の一つである。メラミン樹脂は、トリアジン環を有するメラミン類の一種であるメラミンをメチロール化して重縮合して得られる重合体である。メラミン類が完全分解されれば、ＣＯ2とＮＨ4となる。
【０００３】
廃水中のメラミン樹脂を分解するために、種々のメラミン類の分解微生物あるいは微生物群が探索されてきている。例えば、活性汚泥によると、１０００〜７５００ｐｐｍのメラミン溶液を嫌気性条件下、ｐＨ９付近、３０〜３７℃という条件で、１日で８７％以上の分解率で分解できることが開示されている（特許文献１）。
【０００４】
また、塗料製造工場の廃水処理施設から採取したスラッジから単離したメラミン分解性微生物（４種の菌株を含む菌ペースト）をメラミン含有培地（メラミン１００ｍｇ／ｌ）で培養したところ、４９日で培地中のメラミンを１００％分解できたことが記載されている（特許文献２）。
【０００５】
水田土壌より単離したメラミン分解性微生物を公知のベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１やブラディルゾビジウムジャポニカムＣＳＢ１と組み合わせて用いて、メラミン含有培地（メラミン濃度５ｍｇ／Ｌ）を３０℃で２１０ｒｐｍ、暗所で培養を行うことにより、メラミンの分解実験を行ったことが記載されている（特許文献３）。この文献によれば、メラミン分解性微生物と公知の微生物とを組み合わせることにより、初めて、完全にメラミンを分解できたことが開示されている。
【０００６】
また、種々の環境から採取したトリアジン環化合物を分解する微生物群を単離し、メラミン分解性評価を行ったところ、１００ｐｐｍメラミン溶液を、1日で２０％、２日で７０％の分解性を示したことも記載されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５４−１６３８９２号公報
【特許文献２】特開２００７−２８２６３１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１３０９６５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】塗料の研究、No.149，p2-p7， 2008年3月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これまで単離されたメラミン分解性微生物は、必ずしも十分なメラミン分解性を発揮する物ではなかった。文献に開示されるのは、いずれも、複合的な微生物群による複合的なメラミン系化合物の分解処理である。こうした微生物群による分解処理は、安定した菌組成を得ることのほか、個々に分解性能の異なる微生物を良好に機能させるための制御が困難であり、安定してメラミン系化合物を分解するのは困難であった。また、分解速度も十分でなかった。また、できるだけ低エネルギーコストで廃水処理を行うことも望まれている。
【００１０】
そこで、本明細書は、複雑な培養制御を要することなくメラミン類を効率的に分解できる微生物及び当該微生物によるメラミン類の分解方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、種々の環境から、メラミン類の分解処理条件を考慮してメラミン類分解微生物のスクリーニングを行ったところ、いくつかの微生物を見出した。さらに、これらの微生物のうち、特にメラミン類の分解活性が良好でありかつ同様の分解傾向を有する複数の微生物を見出した。本発明は、これらの知見に基づいて提供される。
【００１２】
本発明によれば、好気的酸性条件下でメラミン類を分解するメラミン下の（１）〜（４）から選択される１種又は２種以上のメラミン類分解剤を用いる、メラミン類の分解剤が提供される。
以下の（１）〜（４）から選択される１種又は２種以上を含む、メラミン類分解剤。
（１）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列と９９．６％超の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１３】
（２）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するアクロモバクター属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．６％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１４】
（３）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．５％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１５】
（４）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
（分類学的性質）
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９０．９％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１６】
前記ステノトロホモナス属菌、前記アクロモバクター属菌、前記スフィンゴバクテリウム属菌及び前記マイクロバクテリウム属菌における前記科学的性質は、好気的条件、２０℃でメラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する性質であってもよい。
【００１７】
前記ステノトロホモナス属菌は、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株であるステノトロホモナス属菌であってもよいし、前記アクロモバクター属菌は、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）又はその変異株であるアクロモバクター属菌であってもよいし、前記スフィンゴバクテリウム属菌は、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株であるスフィンゴバクテリウム属菌であってもよいし、前記マイクロバクテリウム属菌は、マイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株であるマイクロバクテリウム属菌であってもよい。
【００１８】
本発明によれば、本発明のメラミン類分解剤を用いて、メラミン類を分解する工程
を備える、メラミン類の分解方法が提供される。
【００１９】
前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を、好気的条件下で１５℃以上４０℃以下の温度で前記メラミン類に接触させる工程であってもよい。また、前記分解工程は、塗装廃水中の前記メラミン類を分解する工程であってもよい。さらに、前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる工程であってもよい。
【００２０】
本発明によれば、上記ステノトロホモナス属菌、上記アクロモバクター属菌、上記スフィンゴバクテリウム属菌及び上記マイクロバクテリウム属菌から選択される１種又は２種以上でメラミン類を含む廃水を分解する分解槽を有する、廃水処理装置も提供される。
【００２１】
本発明によれば、メラミン類分解能を有し、上記ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株である細菌、上記アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）又はその変異株である細菌、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株であるスフィンゴバクテリウム属菌、又はマイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株である細菌も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、各種環境から準備した３０株についてのメラミン分解性能の評価結果を示す図である。
【図２】図２は、ＧＣ−ＭＳ分析及びＮＭＲ分析により、この活性汚泥処理前後の各チャートを示す図である。
【図３】図３は、各種環境から準備した３０株の菌についての実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価結果を示す図である。
【図４】図４は、１ＫＢ３２−１株についての実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価に関して、分解処理前のＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図５】図５は、１ＫＢ３２−１株についての実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価に関して、分解処理後のＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図６】図６は、１ＫＢ３２−１株についての高濃度メラミン類含有実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価に関して、活性汚泥処理液についての（ａ）メラミン類分解処理前及び（ｂ）メラミン類分解処理後、（ｃ）酸性処理後及び（ｄ）酸性処理後にメラミン類分解処理後の各ＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図７】図７は、１ＫＢ３２−１株によるメラミン類分解後におけるメラミン、アンメリン、アンメリド、シアヌル酸の濃度変化を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書の開示は、メラミン類分解性を有するステノトロホモナス属菌、アクロモバクター属菌、スフィンゴバクテリウム属菌及びマイクロバクテリウム属菌及びその利用に関する。本明細書に開示されるこれらのメラミン類分解微生物は、メラミンなどのメラミン類を、共通する条件でかつ効率的に分解できる。しかもこれらの微生物は、低エネルギーコストでメラミン類を分解できる。したがって、例えば、これらの微生物を１種又は２種以上用いることで、複雑な制御を要さず、低エネルギーコストで効率的にメラミン類を分解できる。また、これらの微生物は、モノメトキシメチルメラミンなどの単置換メラミンを含む「置換基を有するメラミン」を分解できる。したがって、メラミン樹脂を使用する工程の廃水の廃水処理に有用である。以下、本明細書の開示の実施形態について詳細に説明する。
【００２４】
（メラミン類分解微生物）
本明細書に開示されるメラミン類分解微生物は、ステノトロホモナス属、アクロモバクター属、スフィンゴバクテリウム属及びマイクロバクテリウム属に属している。これらの微生物は、土壌、堆肥及び塗装廃水から微生物を採取して選択されたものである。また、これらの微生物は、共通して、置換基を有するメラミンを含む培地で、好気的条件、２０℃で、培養継続することにより、選択されたものである。
【００２５】
これらの微生物は、いずれも、単独で高いメラミンの分解能を有するほか、置換基を有するメラミンの分解能を有する。したがって、これらの微生物を単独であるいは複数組み合わせて用いることで、メラミン類を効率的に分解することができる。また、これらの微生物は、メラミンを、アンメリン、アンメリド及びシアヌル酸を経て、さらに低分子にまで分解し、トリアジン環を有しない化合物へと無害化することができる。
【００２６】
（ステノトロホモナス属菌）
本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００２７】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
【００２８】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号４に示す配列を有している。配列番号４に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０ (テクノスルガ・ラボ 静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号４に示す塩基配列は“Stenotrophomonas humi Ｒ−３２７２９（Accession No.AM403587）”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９９．６%）を示した。
【００２９】
以上の菌学的性質及び16S rＤＮＡの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌はStenotrophomonas fumiに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、Stenotrophomonas humi ２ＫＡ１４−３と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１２年３月５日に寄託申請し、２０１２年３月６日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９として受領された。
【００３０】
なお、本明細書に開示される新規なステノトロホモナス属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１９４７９で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されステノトロホモナス属菌は、上記した菌学的性質を有するステノトロホモナス属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について配列番号４に示す塩基配列に対して９９．６％超の同一性を有し、好ましくは９９．７％以上、より好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するステノトロホモナス属菌を含んでいる。
【００３１】
（アクロモバクター属菌）
本明細書に開示されるアクロモバクター属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００３２】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。好ましくは、２０℃、好気的条件下で、メラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
【００３３】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号１に示す配列を有している。配列番号１に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０（テクノスルガ・ラボ、静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号１に示す塩基配列は“Acromobacter sp.ＭＴ−Ｅ３ (Accession No.ＥＵ７２７１９６．１）”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９９．６%）を示した。
【００３４】
以上の菌学的性質及び16S rRNAの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるアクロモバクター属菌はAchromobacterに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、Achromobacter sp.１ＫＣ６４−１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１１年３月２１日に寄託申請し、２０１１年３月２２日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２として受領された。
【００３５】
なお、本明細書に開示される新規なアクロモバクター属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されるアクロモバクター属菌は、上記した菌学的性質を有するアクロモバクター属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるアクロモバクター属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について配列番号１に示す塩基配列に対して９９．６％超の同一性を有し、好ましくは９９．７％以上、より好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するアクロモバクター属菌を含んでいる。
【００３６】
（のスフィンゴバクテリウム属菌）
本明細書に開示されるスフィンゴバクテリウム属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００３７】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。好ましくは、２０℃、好気的条件下で、メラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
【００３８】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号２に示す配列を有している。配列番号２に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０（テクノスルガ・ラボ、静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号２に示す塩基配列は“Sphingobacterium sp. ＭＧ２(Accession No.ＡＹ５５６４１７．１)”及び“Sphingobacterium sp. Ｇ−２−２７−２(Accession No.ＥＦ１０２８６５．１)”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９９．５%）を示した。
【００３９】
以上の菌学的性質及び16S rRNAの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるスフィンゴバクテリウム属菌はSphingobacteriumに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、Sphingobacterium sp.１ＫＢ３２−１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１１年３月２１日に寄託申請し、２０１１年３月２２日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１として受領された。
【００４０】
なお、本明細書に開示される新規なスフィンゴバクテリウム属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、上記した菌学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるスフィンゴバクテリウム属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について、配列番号２に示す塩基配列に対して９９．５％超の同一性を有し、好ましくは９９．６％以上、より好ましくは９９．７％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、一層好ましくは９９．９％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するスフィンゴバクテリウム属菌を含んでいる。
【００４１】
（マイクロバクテリウム属菌）
本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００４２】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下で、メラミン類を分解する。好ましくは、２０℃、好気的条件下で、メラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
【００４３】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号３に示す配列を有している。配列番号３に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０（テクノスルガ・ラボ、静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号３に示す塩基配列は“Microbacterium sp. ＡＳ−４４(Accession No.ＡＪ３９１２０５．１)”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９０．９%）を示した。
【００４４】
以上の菌学的性質及び16S rRNAの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌はMicrobacteriumに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、２ＫＡ１４−１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１１年３月２１日に寄託申請し、２０１１年３月２２日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３として受領された。
【００４５】
なお、本明細書に開示される新規なマイクロバクテリウム属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、上記した菌学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について、配列番号３に示す塩基配列に対して９０．９％超の同一性を有し、好ましくは９１．０％以上、より好ましくは９５．０％以上、さらに好ましくは９７．０％以上、一層好ましくは９８．０％以上、より一層好ましくは９９．０％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するマイクロバクテリウム属菌を含んでいる。
【００４６】
これらの微生物を、公知の方法により変異処理し、一定条件下でスクリーニングすることにより、メラミン類の分解能に関し同等あるいはそれ以上の変異株を取得できる。なお、こうした微生物の変異処理方法としては、例えば物理的方法又は化学的方法が挙げられる。物理的方法としては、紫外線照射、Ｘ線照射等が用いられ、化学的方法としては、変異原性化学物、例えば亜硝酸、Ｎ−メチルＮ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、アクリジン系色素等が使用される。こうした方法は、いずれも当業者における周知技術である。
【００４７】
本明細書に開示される微生物は、いずれも、特別な炭素源及び窒素源がなくても、メラミン類を分解・資化して生存、増殖することが可能である。このため、炭素源及び窒素源を必須とすることなく、低コストでメラミン類を分解処理することができる。
【００４８】
本明細書においてメラミン類とは、例えば、以下の式（１）：
【化１】
（式（１）において、Ｘ１は、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシアルキルアミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基であり、好ましくは、アミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基であり、特に好ましくはアミノ基であり、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、水素原子、アルキル基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アミノアルキル基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基である。）
で表されるトリアジン環を１分子中に少なくとも１個有する化合物である。メラミン類には、トリアジン環を一つ有する単核性メラミン類と複数個有する多核性メラミン類が含まれる。
【００４９】
トリアジン環におけるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロパン−１−イル基、プロパン−２−イル基（イソプロピル基）、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはメチル基、エチル基、特に好ましくはメチル基を挙げることができる。アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基を例示することができ、好ましくはメチルチオ基を挙げることができる。アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロパン−１−イルアミノ基、プロパン−２−イルアミノ基（イソプロピルアミノ基）、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基を例示することができ、好ましくはエチルアミノ基を挙げることができる。ジアルキルアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはジメチルアミノ基を挙げることができる。アミノアルキル基としては、例えば、アミノメチル基、アミノエチル基、アミノプロパン−１−イル基、アミノプロパン−２−イル（アミノイソプロピル基）、アミノイソブチル基、アミノｓｅｃ−ブチル基、アミノｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはアミノメチル基を挙げることができる。ヒドロキシアルキルアミノ基としては、例えば、ヒドロキシメチルアミノ基、ヒドロキシエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはヒドロキシメチルアミノ基を挙げることができる。ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基としては、例えば、ビス（ヒドロキシメチル）アミノ基、ビス（ヒドロキシエチル）アミノ基を例示することができ、好ましくはビス（ヒドロキシメチル）アミノ基を挙げることができる。アルコキシアルキルアミノ基としては、メトキシメチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、エトキシエチルアミノ基、エトキシメチルアミノ基等が挙げられる。また、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基としては、ビス（メトキシメチル）アミノ基、ビス（メトキシエチル）アミノ基、ビス（エトキシメチル）アミノ基、ビス（エトキシエチル）アミノ基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子、好ましくは塩素原子を挙げることができる。
【００５０】
トリアジン環において、Ｘ１はアミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基とすることが好ましい。また、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基、又は水素原子とすることができる。
【００５１】
単核性のメラミン類は、上記式Ｉにおいて、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がアミノ基（ＮＨ2）である化合物（メラミン）が含まれる。また、単核性のメラミン類には、メラミンにおいてアミノ基の一つのＨが置換されているメラミン類である単置換メラミン、メラミンにおいて、二つ以上のＨが置換されている多数置換メラミンである「置換基を有するメラミン」が含まれる。また、単核性のメラミン類には、Ｘ１及びＸ２がアミノ基であり且つＸ３が水酸基である化合物（アンメリン）、Ｘ１がアミノ基であり且つＸ２及びＸ３が水酸基である化合物（アンメリド）などのメラミン類の分解中間体が含まれる。
【００５２】
単置換メラミンには、Ｘ１がアルコキシアルキルアミノ基であり、Ｘ２及びＸ３がアミノ基である、モノアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。また、多置換メラミンには、Ｘ１及びＸ２がアルコキシアルキルアミノ基であり、Ｘ３がアミノ基である、ジアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。さらに、Ｘ１〜Ｘ３がアルコキシアルキルアミノ基であるトリアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。さらに、Ｘ１がビス（アルコキシアルキル）アミノ基であり、Ｘ２及びＸ３がアミノ基であるジアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。さらに、このほか、メラミンの水素原子１個〜６個のうち、１〜６個がアルコキシアルキル基で置換されたアルコキシアルキル置換メラミンが含まれる。
【００５３】
単核性のメラミン類は、好ましくはメラミンの有するアミノ基のうち水素原子の少なくとも一つがメトキシメチル基で置換された単置換メラミン及び多置換メラミンが挙げられる。こうしたメラミン類としては、モノメトキシメチルメラミン、ジメトキシメチルメラミン、トリメトキシメチルメラミンを始めとして、最大６個がモノメトキシメチル基で置換されたメラミンが挙げられる。
【００５４】
この他、メラミン類としては、シアヌル酸、イソシアヌル酸、硫酸メラミン、ポリリン酸メラミン、メラム、硫酸メラム、ベンズグアナミン、アセトグアナミン、フタロジグアナミン、サクシノグアナミン、メラミンシアヌレート、メラミンフォスフェート、ピロリン酸メラミン、ブチレンジグアナミン、ノルボルネンジグアナミン、トリグアナミン、ベンゾグアナミン、アセトグアナミン、メチレンジメラミン、エチレンジメラミン、トリメチレンジメラミン、テトラメチレンジメラミン、ヘキサメチレンジメラミン、１，３−ヘキシレンジメラミン、トリス（β−シアノエチル）イソシアヌレート等が挙げられる。
【００５５】
また、多核性のメラミン類としては、上記式（１）で表されるトリアジン環を複数含む化合物が挙げられる。例えば、同一又は異なるトリアジン環を単量体ユニットとして有する重合体が挙げられる。こうした多核性メラミン類としては、いわゆるメラミン樹脂が挙げられる。ここで、メラミン樹脂とは、メラミンなどの単核性メラミン類にアルデヒド、殊にホルムアルデヒド及び/又はアルコールを反応させることにより得られる重合体を包含し、例えば、メチルエーテル化メラミン、エチルエーテル化メラミン、ブチルエーテル化メラミン等のアルキルエーテル化メラミンやメチロール化メラミンなどを挙げることができる。
【００５６】
モノメトキシメチルメラミン、サイメル３０３及び３０５（いずれも日本サイテックインダストリーズ製）が挙げられる。モノメトキシメチルメラミン並びにサイメル３０３及び３０５に含まれるトリアジン環構造を以下に示す。なお、サイメル３０３及び３０５は、平均重合度がそれぞれ１．７及び２．３である。
【００５７】
【化２】
【００５８】
塗装工程における廃水には、塗料に由来する各種のメラミン樹脂あるいは当該メラミン樹脂の部分分解物である多核性及び単核性メラミン類（単置換メラミンや多置換メラミン）が含まれていることが多い。
【００５９】
（メラミン類分解剤）
本明細書に開示されるメラミン類分解剤は、上記したステノトロホモナス属菌、アクロモバクター属菌、スフィンゴバクテリウム属菌及びマイクロバクテリウム属菌から選択される１種又は２種以上を含んでいる。本明細書に開示される微生物製剤は、これらの各微生物が、共通する条件下で単独で高いメラミン類の分解能を発揮でき、同様の分解傾向を有することから、任意の組み合わせで用いても、高いメラミン類の分解活性を有する製剤を得ることができる。また、この微生物製剤によれば、低エネルギーコストでメラミン類を分解することができる。なお、本メラミン類分解剤を用いてメラミン類を分解する条件は、メラミン類が分解される限り、特に限定されないで、後述する条件を適用できる。本メラミン類分解剤は、好気的条件下、夏場における冷却手段や冬場における加熱手段を要することなく、例えば、１５℃以上４０℃以下でメラミン類を効果的に分解できる。
【００６０】
本メラミン類分解剤は、メラミン類の分解の用途に用いられ、メラミン類を含んでいればとくにその適用対象は限定されない。典型的には、例えば、メラミン類を含有する工場廃水、農業廃水、家庭廃水などを適用対象とすることができる。また、適用対象は、土壌、堆肥等のメラミン類の残留可能性のある適用対象中のメラミン類としてもよい。なお、こうした固形物中のメラミン類は、固形物を適宜水等の液体に懸濁して液体にメラミン類を溶解させた懸濁物やその固液分離物であってもよい。工場廃水としては、特に塗装工程を有する工場や現場の廃水（塗装廃水ともいう。）が挙げられる。
【００６１】
（メラミン類の分解方法）
本明細書に開示されるメラミン類の分解方法は、本発明のメラミン類分解剤を用いて、メラミン類を分解する工程を備えることができる。本分解方法によれば、加熱手段又は冷却手段を特に必要とすることなく、また、好気的条件でメラミン類を微生物によって分解処理できるため、低コストで実施できる。また、メラミン類分解剤を構成する微生物は、いずれも、単独で、メラミン類を分解する能力が良好であるため、複雑な制御を必要とせずに、効率的にメラミン類を分解できる。
【００６２】
分解工程において、本分解剤を構成する微生物が、メラミン類を分解し資化する条件は、特に限定されないが、好気的条件下でメラミン類と接触させることが好ましい。好気的条件は、通常、大気圧雰囲気での培養により容易に得ることができる。大気圧雰囲気下で、必要に応じて、静置培養のほか、振とう培養、撹拌培養、通気培養等の各種の好気的培養手法を適宜採用することができる。
【００６３】
本分解方法における分解工程の条件は、上記したとおり既に説明した条件を適用できる。好ましくは、好気的条件下で１５℃以上４０℃以下の温度で前記メラミン類に接触させるようにする。本明細書に開示される微生物は、こうした温度域、すなわち、加温を必要としない温度域においても、良好なトリアジン分解能及び置換メラミン分解能を有している。この温度域は、メラミン樹脂の使用工程の工程廃水としては通常の温度であるほか、年間を通じて外気又は室内において一定期間放置することにより容易に得ることができる温度である。このため、本明細書に開示される微生物は、特に廃水を加温や冷却等の温度制御を必須とすることなく、低エネルギーコストで廃水処理をすることが可能である。本方法では、３５℃以下、より好ましくは３０℃以下、さらに好ましくは２５℃以下、さらに２０℃以下であっても十分にメラミン類や置換メラミン類を分解できる。一方、メラミン類分解活性が維持される限り、２０℃以上であってもよい。より高温域であれば、メラミン類の分解活性はより向上する。こうした観点からは、分解温度は、２５℃以上であってもよく、３０℃以上であってもよい。なお、４０℃を超える高温での分解工程を排除するものではない。
【００６４】
また、ｐＨについては、中性付近とすることが好ましい。すなわち、ｐＨ６〜８程度であり、より好ましくはｐＨ６．５以上７．５以下程度である。こうしたｐＨを維持するには、こうしたｐＨに緩衝域を有する緩衝液を適宜選択して用いることができる。
【００６５】
分解工程は、本メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる工程であってもよい。こうした分解工程を実施することで、活性汚泥による分解作用とメラミン類分解剤による分解作用とを同時に実現することができる。また、こうした分解工程を備えることで、後段で詳述するように分解工程に先立って行う活性汚泥による処理工程を補ったりあるいは省略することも可能である。本メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる場合であっても、上記した本分解工程における条件の範囲内で分解工程を実施することができる。
【００６６】
分解工程に先立ってメラミン類含有廃水に対して活性汚泥処理工程が実施されていることが好ましい。本メラミン類分解剤による分解工程に供される廃水は、好ましくは、活性汚泥処理後の廃水である。メラミン類は、上記のように各種の廃水、典型的には車両を始め、各種の塗装工程の廃水に含まれる。本発明者らによれば、メラミン樹脂を含む塗料の塗装工程等の廃水には、メラミン樹脂に由来する多様なメラミン類が含まれているが、活性汚泥処理により、メラミン類を含む廃水のうち、メラミン類以外の溶剤などの各種成分が分解除去され、ひいては、メラミン類が主成分ともなりうることがわかっている。すなわち、メラミン類分解剤による分解処理前に活性汚泥処理工程を実施することで、微生物の増殖阻害を生じさせるような成分を除去でき、その後のメラミン類分解剤を用いた分解工程に適した組成とすることができる。
【００６７】
活性汚泥処理の手法や種類は特に限定されないで、従来メラミン類を含みうる塗装工程廃水に適用した方法をそのまま適用することができる。例えば、活性汚泥を添加し、例えば１５℃〜４０℃、ｐＨ６〜８で曝気処理３０〜７０日間程度とすることができる。
【００６８】
また、メラミン類分解剤による分解工程に先立って、メラミン類含有廃水に対して、酸性下で廃水中の多置換メラミン類を分解する工程を実施することが好ましい。本発明者らによれば、酸性下にこうした廃水を曝すことで、多置換メラミン類が分解されてメラミン、あるいはこれに加えて単置換メラミンが主成分となることがわかっている。メラミン、あるいはこれに加えて単置換メラミンを主成分とすることで、本メラミン類分解剤を用いた分解を効率的に行うことができる。
【００６９】
この処理工程の酸性条件は特に限定しないが、分解促進の観点からは、好ましくは、ｐＨ６以下であり、より好ましくはｐＨ５以下であり、さらに好ましくはｐＨ４以下であり、一層このましくはｐＨ３以下である。また、ｐＨ調整操作の観点からは、好ましくはｐＨ３以上であり、より好ましくはｐＨ４以上であり、さらに好ましくはｐＨ５以上である。メラミン類含有廃水は、例えば、適当な有機酸及び／又は無機酸で酸性化することができる。典型的には塩酸などの無機酸が挙げられる。酸性処理工程は、その温度は特に限定しないが、好ましくは１５℃以上４０℃以下程度とし、適宜撹拌しながら行うことが好ましい。時間も、置換基の解離を促進し、分解物であるメラミン、あるいはこれに加えて単置換メラミンが主成分となるように実施する。温度にもよるが、例えば、数時間から６０時間程度、好ましくは１０時間から５０時間手程度行うことが好ましい。
【００７０】
酸性処理工程と活性汚泥処理工程とは、いずれか一方を行ってもよいが、その双方を行ってもよい。双方を行う場合には、好ましくは活性汚泥処理工程を先に行い、その後、酸性処理工程を行う。活性汚泥処理工程後に酸性処理工程を実施することで、酸性処理工程をより効果的に行うことができる。
【００７１】
酸性処理工程後に本メラミン類分解剤を用いた分解工程を実施する場合には、酸性の液性を中和して既に説明した本分解工程に適したｐＨに調整することが好ましい。ｐＨ調整は、特に限定しないが、適当なアルカリを用いて実施する。
【００７２】
（メラミン類含有廃水の処理方法）
本発明によれば、メラミン類を含有する廃水の処理方法が提供される。本処理方法は、酸性下でメラミン類含有廃水中の多置換メラミン類を分解する処理工程、を備えることができる。こうした処理方法によれば、多置換メラミン類が減少し、メラミン、あるいはメラミンと単置換メラミンが主体となっているため、その後の微生物等を用いた分解処理に適した組成となっている。特に、本処理方法は、本メラミン類分解剤を用いた分解処理のために当該分解処理に先立ってすることが好ましい。本メラミン類分解剤によれば、残存する各種のメラミンあるいはメラミンと単置換メラミンを効率的に分解できるからである。また、本処理方法は、活性汚泥処理後の塗装工程廃水に適用することが好ましい。活性汚泥によりメラミンあるいはメラミンと単置換メラミンが主成分となっているため酸処理も効率的に進行する。
【００７３】
（メラミン類を含む廃水の処理装置）
本明細書の開示によれば、本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌、アクロモバクター属菌、スフィンゴバクテリウム属菌及びマイクロバクテリウム属菌からなる群から選択される１種又は２種以上で、メラミン類を含む廃水を分解する分解槽を有する、廃水処理装置が提供される。本装置によれば、常温でかつ好気的条件で廃水を処理できるので、装置構成も簡略化できるし、しかも、低コストで連続運転させることができる。本処理装置においては、本分解方法について説明した各種の実施態様を適用することができる。
【００７４】
分解槽におけるこれらの微生物の存在形態は特に限定しない。浮遊状態であってもよいし、凝集形態であってもよいし、なんらかの固相担体に固定化された状態であってもよい。また、分解槽の形態も特に限定されない、必要に応じてバッチ式あるいは連続式の処理に適したものとすることができる。
【００７５】
本処理装置は、メラミン樹脂塗料を用いた塗装工程廃水処理設備の一部であってもよい。また、前記分解槽の前段には、活性汚泥処理槽及び／又は酸性処理槽を備えることもできる。活性汚泥処理槽及び酸性処理槽における各処理は、活性汚泥処理工程及び酸処理工程について既に説明した各種の実施態様を適用できる。好ましくはこれらの双方を有し、上流から順に活性汚泥処理槽、酸性処理槽及び本分解槽を備える。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
（メラミン類分解微生物の集積培養及び分離）
（スクリーニングＡ）
土壌、堆肥、塗装廃水などから微生物を採取し、培地Ａ（０．１％サイメル３０３（完全アルキル化型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１％サイメル３２５（イミノ基型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１Ｍリン酸カリウムナトリウムバッファ（ｐＨ６．７）、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０４３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ4、・５Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ Ｈ3ＢＯ3、０．２２３ｍｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１５ｍｇ／Ｌ ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０３ｍｇ／Ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．６６ｍｇ／Ｌ ＣａＣＯ3）１０ｍｌに加え、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうし、１週間ごとに培養液１ｍｌを採取し、新しい培地Ａ９ｍｌに加え、再び、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうを続ける操作を５週間継続した。振とう液０．１ｍｌを選択培地Ｂ（培地Ａ、１５ｇ／Ｌ 寒天）に塗布し、２０℃、７日間培養した。培養後、出現したコロニーの中から２９株を分離した。
【００７８】
（スクリーニングＢ）
さらに、土壌、堆肥、塗装廃水などから微生物を採取し、培地Ａ（０．１％サイメル３０３（完全アルキル化型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１％サイメル３２５（イミノ基型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１Ｍリン酸カリウムナトリウムバッファ（ｐＨ６．７）、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０４３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ4、・５Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ Ｈ3ＢＯ3、０．２２３ｍｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１５ｍｇ／Ｌ ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０３ｍｇ／Ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．６６ｍｇ／Ｌ ＣａＣＯ3）１０ｍｌに加え、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうし、１週間ごとに培養液１ｍｌを採取し、新しい培地Ａ９ｍｌに加え、再び、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうを続ける操作を５週間継続した。振とう液０．１ｍｌを選択培地Ｂ（培地Ａ、１５ｇ／Ｌ 寒天）に塗布し、２０℃、７日間培養した。培養後、出現したコロニーの中から１株を分離した。
【実施例２】
【００７９】
（メラミンの分解能評価）
培地Ｃ（培地Ａのうち、サイメル３０３及びサイメル３２５を０．０１％メラミン（和光純薬株式会社製）としたもの）１０ｍｌに濁度２（波長６６０ｎｍ）に調整したスクリーニングＡによって得られた分解菌２９株の懸濁液５００μｌを添加し、２０℃で２４時間、１５０ｒｐｍで振とう培養してメラミン分解性を評価した。メラミンの分解性は、溶液中に存在するメラミンをＨＰＬＣ（島津製作所Prominence、カラム：インタクト製Unison UK-C8）を用いて分析し、その濃度変化により評価した。その結果を図１に示す。また、スクリーニングＢにより追加で分離した１株についても、同様にメラミンの分解能を評価した。結果を、図１に併せて示す。
【００８０】
図１に示すように、スクリーニングによって得られた菌株はほとんどがほぼ１００％メラミンを分解した。こうした分解率は、従来の好気的条件におけるメラミン分解法を遙かに凌ぐものであった。
【実施例３】
【００８１】
（実廃水でのメラミン類分解能評価）
本実施例は、実廃水Ａ（ＣＯＤ１０００ｍｇ／ｍｌ）１ｌに活性汚泥を添加し（ＭＬＳＳ２７００ｍｇ／ｌ）、２０〜２５℃、ｐＨ７〜８で曝気処理５０日間行った。ろ過により固液分離を行い、活性汚泥処理液（液層）を得た（ＣＯＤ１３０ｍｇ／ｍｌ）。図２に示すように、ＧＣ−ＭＳ分析及びＮＭＲ分析により、この活性汚泥処理液の含有成分は溶剤成分が消失し、トリアジン環を有するメラミン類が主成分として残留していることがわかった。
【００８２】
活性汚泥処理液１０ｍｌに濁度２（波長６６０ｎｍ）に調製した分解菌２９株の懸濁液５００μｌを添加し、２０℃で２４時間、１５０ｒｐｍで振とう培養してメラミン類分解性を評価した。メラミン類の分解性は実施例２と同様にして評価した。同様にして、スクリーニングＢにより分離した分解菌１株についても、分解能を評価した。これらの結果を併せて図３に示す。
【００８３】
図３に示すように、スクリーニングによって得られた菌株は、ほとんど実廃水中のメラミン類分解能を有していた。なかでも、２ＫＡ１４−３株、１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株の４株は一日の処理で初期値２００ｐｐｍのメラミンをほぼ半分にまで分解した。また、１ＫＢ３２−１株についての処理前後のＨＰＬＣチャートを図４及び図５に示す。図４及び図５に示すように、メラミン分解処理によりメラミン（ピークＢ）とモノメトキシメチルメラミンの一つのピーク（ピークＣ）が完全に消失し、その他の置換基を有するメラミンのピーク（モノメトキシメチルメラミン（ピークＤ）、ジメトキシメチルメラミン（ピークＥ、Ｆ）も減少が見られ、本菌株を用いるとメラミンだけでなく「置換基を有するメラミン」に関しても分解可能であることが示された。また、図４及び図５に示すように、その他のメラミン（ピークＨ）も減少しており、上記した「置換基を有するメラミン」だけでなくその他のメラミンにも有効であることがわかった。さらに、こうした傾向を、同様にメラミン類分解能の高い２ＫＡ１４−３株、１ＫＣ６４−１株、２ＫＡ１４−１株についても確認できた。
【実施例４】
【００８４】
（高濃度メラミン類含有実廃水での分解能評価）
本実施例では高濃度メラミンを含有する実廃水での分解性を評価した。
塗装工程廃水Ｂ（ＣＯＤ６０００ｍｇ／ｍｌ）１ｌに活性汚泥を添加し（ＭＬＳＳ２７００ ｍｇ／ｌ）、２０〜２５℃、ｐＨ７〜８で曝気処理を５０日間行った。活性汚泥処理液１０ｍｌに対して、濁度２（波長６６０ｎｍ）に調製した１ＫＢ３２−１株の懸濁液５００μｌを添加し、２０℃で４週間振とう培養を行い、実施例２と同様にしてメラミン類分解性を評価した。活性汚泥処理前後のＨＰＬＣのクロマトグラムを図６中の（ａ）及び（ｂ）に示す。図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、クロマトグラム上のピークに変化は見られずメラミン類分解能は検出されなかった。なお、これらのクロマトグラム上のピークＨは、多置換メラミンを含むメラミン類に対応している。
【００８５】
さらに、活性汚泥処理液１０ｍｌを、１Ｎ塩酸を用いてｐＨ５に調整後、２０℃で４週間振とうを行った。この酸処理の結果、図６（ｃ）に示すように、多置換メラミンを含むメラミン類に由来するピークＨは消滅し、その替わりメラミン（ピークＢ）、単置換メラミンであるモノメトキシメチルメラミン（ピークＣ）のピークが出現した。さらに、この酸処理後の溶液を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７に調整後、濁度２（波長６６０ｎｍ）に調整した１ＫＢ３２−１株の懸濁液５００μｌと混合し、２０℃で３日間振とう培養を行い、これらのメラミン類分解性を評価した。その結果を図６（ｄ）に示す。
【００８６】
図６（ｄ）に示すように、ＨＰＬＣのクロマトグラム上のメラミン（ピークＢ）及びモノメトキシメチルメラミン（ピークＣ）はほぼ消滅した。以上のことから、活性汚泥処理液の特定微生物による分解処理によっては、メラミン類は分解されないで残存するが、その後の酸処理により多置換メラミンを含むメラミン類は消失ないし減少してメラミン及び単置換メラミンが主体となり、その後の特定の微生物による処理によってこれらのメラミン類が容易に消失することがわかった。
【実施例５】
【００８７】
本実施例では、菌株を同定した。メラミン類分解性評価の結果から、メラミン分解性の高い１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株及び２ＫＡ１４−３株について形態学的性質及び遺伝学的性質を解析した。形態学的性質はＬＢ寒天培地で３７℃、４８時間培養後に形成されたコロニーを実体顕微鏡（オリンパス製 ＳＺＨ１０）で、グラム染色後に光学顕微鏡（オリンパス製 ＢＸ５０Ｆ４）で観察した。
【００８８】
また、分類学的性質は、これらの各菌株菌体からゲノム抽出し、定法に従い、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく遺伝学的解析を行った。すなわち、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域をＰＣＲにより増幅し、その後、配列決定を行った。なお、使用したプライマーは、以下のとおりとした。
【００８９】
（１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株用）
増幅プライマー
９Ｆ：5'-gagtt tgatc ctggc tcag-3'（配列番号５）
１４９２Ｒ：5'-tacgg ytacc ttgtt acgac tt-3'（配列番号６）
Y=t 又はc
（１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株用の増幅プライマー）
シークエンスプライマー
９Ｆ：5'-gagtt tgatc ctggc tcag-3'（配列番号５）
１２４０Ｒ：5'-ccatt gtagc acgtg t-3'（配列番号７）
【００９０】
（２ＫＡ１４−３株用）
増幅プライマー
9F : 5’-gag ttt gat cct ggc tca g- 3’（配列番号５）
1510R : 5’-gtg aag ctt acg gyt acc ttg tta cga ctt- 3’（配列番号８）
シークエンスプライマー
9F : 5’-gag ttt gat cct ggc tca g- 3’（配列番号５）
785F : 5’-gga tta gat acc ctg gta- 3’（配列番号９）
805R : 5’-tac cag ggt tac taa tcc- 3’（配列番号１０）
1510R : 5’-gtg aag ctt acg gyt acc ttg tta cga ctt- 3’（配列番号１１）
【００９１】
得られた増幅産物につき、定法に従い、塩基配列を決定した。得られた１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列に基づいて相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。データベースとしては国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を使用した。結果を表１に示す。また、それぞれの菌についての遺伝学的解析結果を表２〜５に示す。
【００９２】
【表１】
【００９３】
[表２]
（１ＫＣ６４−１株）
近縁種 相同性（％）
Achromobacter sp. MT-E3（EU727196.1） 99.6
Alcaligenes sp. ON5（AJ306836.1） 99.6
Alcaligenes sp. SK0603（DQ459259.1） 99.5
Achromobacter sp. Esp3（EF433459.1） 99.5
Achromobacter sp. AMC1（AY635878.1） 99.5
Alcaligenes sp. Yen（AY744384.1） 99.4
Achromobacter sp. CEMM 05-01-040（GU244494.1） 99.4
Achromobacter sp. CEMM 05-01-038（GU244493.1） 99.4
Achromobacter sp. F3feb.50（GQ417634.1） 99.4
Achromobacter sp. F2oct.45（GQ417528.1） 99.4
Achromobacter xylosoxidans ybb5（EU214611.1） 99.4
Achromobacter insolitus Y2P1（EU221379.1） 99.4
【００９４】
[表３]
（１ＫＢ３２−１株）
近縁種 相同性（％）
Sphingobacterium sp. MG2（AY556417.1） 99.5
Sphingobacterium sp. G-2-27-2（EF102865.1） 99.5
Sphingobacterium sp. No.6（FJ868219.1） 99.4
Sphingobacterium sp. M7（FM958445.1） 99.4
Sphingobacterium sp. F19（GU120661.1） 99.4
Sphingobacterium multivorum BAC3045（HM355636.1） 99.4
Sphingobacterium sp. 1ZP4（HQ540555.1） 99.3
Sphingobacterium multivorum OM-A8（AB020205.1） 99.2
Sphingobacterium sp. IN42（HQ423411.1） 99.1
Sphingobacterium sp. Cxh-8（EF059711.1） 99.0
【００９５】
[表４]
（２ＫＡ１４−１株）
近縁種 相同性（％）
Microbacterium liquefaciens DSM20638（NR_026162） 90.5
Microbacterium sp. AS-44（AJ391205.1） 90.9
Microbacterium sp. S15-M4（AM234160.1） 90.8
Microbacterium sp. 3019BRRJ（FJ200406.2） 90.8
Microbacterium oxidans XH0903（GQ279110.1） 90.8
Microbacterium oxidans WT141（GQ152132.1） 90.8
Microbacterium oxidans 407（EU714369.1） 90.8
Microbacterium oxidans 3227（EU714357.1） 90.8
Microbacterium oxidans 2704（EU714344.1） 90.8
Microbacterium oxidans 2083（EU714335.1） 90.8
Microbacterium oxidans（AB365061.1） 90.8
Microbacterium maritypicum（AM181506.1） 90.8
【００９６】
[表５]
（２ＫＡ１４−３株）
近縁種 相同性（％）
Stenotrophomonas humi R-32729 (AM403587) 99.6
Stenotrophomonas nitritireducensJCM13311 (Tecsrg0094) 99.5
Stenotrophomonas terrae R-32768 (AM403589) 98.9
Pseudomonas pictorium ATCC23328 (AB021392) 98.4
Stenotrophomonas acidaminiphilaDSM13117 (Tecsrg0095) 98.1
Stenotrophomonas maltophilaNBRC14161 (Tecsrg0093) 97.6
Stenotrophomonas koreensisJCM13256 (Tecsrg0092) 97.1
Stenotrophomonas ginsengisoli DCY01 (DQ109037) 97.4
Stenotrophomonas rhizophila e-p10 (AJ293463) 97.3
Xanthomonas sacchari LMG471 (Y10766) 96.7
【００９７】
表２に示す遺伝学的解析によれば、１ＫＣ６４−１株は、Achromobacterに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたAchromobacter属菌の一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、１ＫＣ６４−１は属のレベルにおいてAchromobacter に含まれると判断された。一方、Achromobacter に属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、１ＫＣ６４−１株はAchromobacter に属する新規菌株であると判断された。
【００９８】
表３に示す遺伝学的解析によれば、１ＫＢ３２−１株は、Sphingobacteriumに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたSphingobacterium属菌の一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、１ＫＢ３２−１株は属のレベルにおいてSphingobacterium に含まれると判断された。一方、Sphingobacterium に属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、１ＫＢ３２−１株はSphingobacterium に属する新規菌株であると判断された。
【００９９】
表４に示す遺伝学的解析によれば、２ＫＡ１４−１株は、Microbacteriumに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたMicrobacterium属菌の一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、２ＫＡ１４−１は属のレベルにおいてMicrobacterium に含まれると判断された。一方、しかしなから、Microbacterium に属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、２ＫＡ１４−１株はMicrobacterium に属する新規菌株であると判断された。
【０１００】
表５に示す遺伝学的解析によれば、２ＫＡ１４−３株は、Stenotrophomonasに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたStenotrophomonas humiの一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、２ＫＡ１４−３株は種のレベルにおいてStenotrophomonas humiに含まれると判断された。一方、しかしなから、Stenotrophomonas humiに属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、２ＫＡ１４−３株はStenotrophomonas humiに属する新規菌株であると判断された。
【実施例６】
【０１０１】
実施例４における１ＫＢ３２−１株によるメラミン類分解の０日後、１日後、３日後、６日後、１０日後、１３日後の各サンプルをＨＰＬＣ解析し、メラミン、アンメリン、アンメリド、シアヌル酸の濃度変化を比較した。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりとした。結果を図７に示す。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Unison UK-amino 2.0mm×250mm（インタクト社製）
溶媒：アセトニトリル：水＝80：20、10mM酢酸アンモニウム
流速：0.2mL/min
温度：40℃
検出：UV220nm（メラミン、アンメリド、シアヌル酸）
230nm（アンメリン）
【０１０２】
図７に示すように、メラミンは処理３日でほぼ消失した。これに対し、アンメリン、アンメリド、シアヌル酸の各中間体の濃度はメラミンの減少分に比べてわずかに上昇したのみでその後消失し、メラミン分解に対して中間体の分解反応は十分に速く、中間体の生成は問題とはならず、こうした中間体が速やかに無害な物質へと変換されていると判断された。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号５〜１１：プライマー
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、メラミン類の分解方法及びこの方法に用いる分解微生物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
塗料工場や塗装工程を有する工場から排出される廃水には、親水性有機化合物が多く含まれている。廃水は一般に活性汚泥によって処理されるが、廃水中には難分解性物質も含まれており、こうした難分解性物質は分解されずに排出されてしまう可能性がある。例えば、塗料中に架橋剤として含まれるメラミン樹脂も難分解性物質の一つである。メラミン樹脂は、トリアジン環を有するメラミン類の一種であるメラミンをメチロール化して重縮合して得られる重合体である。メラミン類が完全分解されれば、ＣＯ2とＮＨ4となる。
【０００３】
廃水中のメラミン樹脂を分解するために、種々のメラミン類の分解微生物あるいは微生物群が探索されてきている。例えば、活性汚泥によると、１０００〜７５００ｐｐｍのメラミン溶液を嫌気性条件下、ｐＨ９付近、３０〜３７℃という条件で、１日で８７％以上の分解率で分解できることが開示されている（特許文献１）。
【０００４】
また、塗料製造工場の廃水処理施設から採取したスラッジから単離したメラミン分解性微生物（４種の菌株を含む菌ペースト）をメラミン含有培地（メラミン１００ｍｇ／ｌ）で培養したところ、４９日で培地中のメラミンを１００％分解できたことが記載されている（特許文献２）。
【０００５】
水田土壌より単離したメラミン分解性微生物を公知のベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１やブラディルゾビジウムジャポニカムＣＳＢ１と組み合わせて用いて、メラミン含有培地（メラミン濃度５ｍｇ／Ｌ）を３０℃で２１０ｒｐｍ、暗所で培養を行うことにより、メラミンの分解実験を行ったことが記載されている（特許文献３）。この文献によれば、メラミン分解性微生物と公知の微生物とを組み合わせることにより、初めて、完全にメラミンを分解できたことが開示されている。
【０００６】
また、種々の環境から採取したトリアジン環化合物を分解する微生物群を単離し、メラミン分解性評価を行ったところ、１００ｐｐｍメラミン溶液を、1日で２０％、２日で７０％の分解性を示したことも記載されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５４−１６３８９２号公報
【特許文献２】特開２００７−２８２６３１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１３０９６５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】塗料の研究、No.149，p2-p7， 2008年3月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、これまで単離されたメラミン分解性微生物は、必ずしも十分なメラミン分解性を発揮する物ではなかった。文献に開示されるのは、いずれも、複合的な微生物群による複合的なメラミン系化合物の分解処理である。こうした微生物群による分解処理は、安定した菌組成を得ることのほか、個々に分解性能の異なる微生物を良好に機能させるための制御が困難であり、安定してメラミン系化合物を分解するのは困難であった。また、分解速度も十分でなかった。また、できるだけ低エネルギーコストで廃水処理を行うことも望まれている。
【００１０】
そこで、本明細書は、複雑な培養制御を要することなくメラミン類を効率的に分解できる微生物及び当該微生物によるメラミン類の分解方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、種々の環境から、メラミン類の分解処理条件を考慮してメラミン類分解微生物のスクリーニングを行ったところ、いくつかの微生物を見出した。さらに、これらの微生物のうち、特にメラミン類の分解活性が良好でありかつ同様の分解傾向を有する複数の微生物を見出した。本発明は、これらの知見に基づいて提供される。
【００１２】
本発明によれば、好気的酸性条件下でメラミン類を分解するメラミン下の（１）〜（４）から選択される１種又は２種以上のメラミン類分解剤を用いる、メラミン類の分解剤が提供される。
以下の（１）〜（４）から選択される１種又は２種以上を含む、メラミン類分解剤。
（１）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列と９９．６％超の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１３】
（２）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するアクロモバクター属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．６％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１４】
（３）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．５％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１５】
（４）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
（分類学的性質）
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９０．９％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【００１６】
前記ステノトロホモナス属菌、前記アクロモバクター属菌、前記スフィンゴバクテリウム属菌及び前記マイクロバクテリウム属菌における前記科学的性質は、好気的条件、２０℃でメラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する性質であってもよい。
【００１７】
前記ステノトロホモナス属菌は、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株であるステノトロホモナス属菌であってもよいし、前記アクロモバクター属菌は、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）又はその変異株であるアクロモバクター属菌であってもよいし、前記スフィンゴバクテリウム属菌は、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株であるスフィンゴバクテリウム属菌であってもよいし、前記マイクロバクテリウム属菌は、マイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株であるマイクロバクテリウム属菌であってもよい。
【００１８】
本発明によれば、本発明のメラミン類分解剤を用いて、メラミン類を分解する工程
を備える、メラミン類の分解方法が提供される。
【００１９】
前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を、好気的条件下で１５℃以上４０℃以下の温度で前記メラミン類に接触させる工程であってもよい。また、前記分解工程は、塗装廃水中の前記メラミン類を分解する工程であってもよい。さらに、前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる工程であってもよい。
【００２０】
本発明によれば、上記ステノトロホモナス属菌、上記アクロモバクター属菌、上記スフィンゴバクテリウム属菌及び上記マイクロバクテリウム属菌から選択される１種又は２種以上でメラミン類を含む廃水を分解する分解槽を有する、廃水処理装置も提供される。
【００２１】
本発明によれば、メラミン類分解能を有し、上記ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株である細菌、上記アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）又はその変異株である細菌、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株であるスフィンゴバクテリウム属菌、又はマイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株である細菌も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、各種環境から準備した３０株についてのメラミン分解性能の評価結果を示す図である。
【図２】図２は、ＧＣ−ＭＳ分析及びＮＭＲ分析により、この活性汚泥処理前後の各チャートを示す図である。
【図３】図３は、各種環境から準備した３０株の菌についての実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価結果を示す図である。
【図４】図４は、１ＫＢ３２−１株についての実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価に関して、分解処理前のＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図５】図５は、１ＫＢ３２−１株についての実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価に関して、分解処理後のＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図６】図６は、１ＫＢ３２−１株についての高濃度メラミン類含有実廃水を用いたメラミン類分解性能の評価に関して、活性汚泥処理液についての（ａ）メラミン類分解処理前及び（ｂ）メラミン類分解処理後、（ｃ）酸性処理後及び（ｄ）酸性処理後にメラミン類分解処理後の各ＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図７】図７は、１ＫＢ３２−１株によるメラミン類分解後におけるメラミン、アンメリン、アンメリド、シアヌル酸の濃度変化を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書の開示は、メラミン類分解性を有するステノトロホモナス属菌、アクロモバクター属菌、スフィンゴバクテリウム属菌及びマイクロバクテリウム属菌及びその利用に関する。本明細書に開示されるこれらのメラミン類分解微生物は、メラミンなどのメラミン類を、共通する条件でかつ効率的に分解できる。しかもこれらの微生物は、低エネルギーコストでメラミン類を分解できる。したがって、例えば、これらの微生物を１種又は２種以上用いることで、複雑な制御を要さず、低エネルギーコストで効率的にメラミン類を分解できる。また、これらの微生物は、モノメトキシメチルメラミンなどの単置換メラミンを含む「置換基を有するメラミン」を分解できる。したがって、メラミン樹脂を使用する工程の廃水の廃水処理に有用である。以下、本明細書の開示の実施形態について詳細に説明する。
【００２４】
（メラミン類分解微生物）
本明細書に開示されるメラミン類分解微生物は、ステノトロホモナス属、アクロモバクター属、スフィンゴバクテリウム属及びマイクロバクテリウム属に属している。これらの微生物は、土壌、堆肥及び塗装廃水から微生物を採取して選択されたものである。また、これらの微生物は、共通して、置換基を有するメラミンを含む培地で、好気的条件、２０℃で、培養継続することにより、選択されたものである。
【００２５】
これらの微生物は、いずれも、単独で高いメラミンの分解能を有するほか、置換基を有するメラミンの分解能を有する。したがって、これらの微生物を単独であるいは複数組み合わせて用いることで、メラミン類を効率的に分解することができる。また、これらの微生物は、メラミンを、アンメリン、アンメリド及びシアヌル酸を経て、さらに低分子にまで分解し、トリアジン環を有しない化合物へと無害化することができる。
【００２６】
（ステノトロホモナス属菌）
本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００２７】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
【００２８】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号４に示す配列を有している。配列番号４に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０ (テクノスルガ・ラボ 静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号４に示す塩基配列は“Stenotrophomonas humi Ｒ−３２７２９（Accession No.AM403587）”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９９．６%）を示した。
【００２９】
以上の菌学的性質及び16S rＤＮＡの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌はStenotrophomonas fumiに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、Stenotrophomonas humi ２ＫＡ１４−３と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１２年３月５日に寄託申請し、２０１２年３月６日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９として受領された。
【００３０】
なお、本明細書に開示される新規なステノトロホモナス属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１９４７９で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されステノトロホモナス属菌は、上記した菌学的性質を有するステノトロホモナス属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について配列番号４に示す塩基配列に対して９９．６％超の同一性を有し、好ましくは９９．７％以上、より好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するステノトロホモナス属菌を含んでいる。
【００３１】
（アクロモバクター属菌）
本明細書に開示されるアクロモバクター属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００３２】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。好ましくは、２０℃、好気的条件下で、メラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
【００３３】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号１に示す配列を有している。配列番号１に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０（テクノスルガ・ラボ、静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号１に示す塩基配列は“Acromobacter sp.ＭＴ−Ｅ３ (Accession No.ＥＵ７２７１９６．１）”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９９．６%）を示した。
【００３４】
以上の菌学的性質及び16S rRNAの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるアクロモバクター属菌はAchromobacterに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、Achromobacter sp.１ＫＣ６４−１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１１年３月２１日に寄託申請し、２０１１年３月２２日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２として受領された。
【００３５】
なお、本明細書に開示される新規なアクロモバクター属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されるアクロモバクター属菌は、上記した菌学的性質を有するアクロモバクター属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるアクロモバクター属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について配列番号１に示す塩基配列に対して９９．６％超の同一性を有し、好ましくは９９．７％以上、より好ましくは９９．８％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するアクロモバクター属菌を含んでいる。
【００３６】
（のスフィンゴバクテリウム属菌）
本明細書に開示されるスフィンゴバクテリウム属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００３７】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。好ましくは、２０℃、好気的条件下で、メラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
【００３８】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号２に示す配列を有している。配列番号２に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０（テクノスルガ・ラボ、静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号２に示す塩基配列は“Sphingobacterium sp. ＭＧ２(Accession No.ＡＹ５５６４１７．１)”及び“Sphingobacterium sp. Ｇ−２−２７−２(Accession No.ＥＦ１０２８６５．１)”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９９．５%）を示した。
【００３９】
以上の菌学的性質及び16S rRNAの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるスフィンゴバクテリウム属菌はSphingobacteriumに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、Sphingobacterium sp.１ＫＢ３２−１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１１年３月２１日に寄託申請し、２０１１年３月２２日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１として受領された。
【００４０】
なお、本明細書に開示される新規なスフィンゴバクテリウム属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、上記した菌学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるスフィンゴバクテリウム属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について、配列番号２に示す塩基配列に対して９９．５％超の同一性を有し、好ましくは９９．６％以上、より好ましくは９９．７％以上、さらに好ましくは９９．８％以上、一層好ましくは９９．９％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するスフィンゴバクテリウム属菌を含んでいる。
【００４１】
（マイクロバクテリウム属菌）
本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、以下の菌学的性質及び分類学的性質を有する。
【００４２】
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下で、メラミン類を分解する。好ましくは、２０℃、好気的条件下で、メラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
【００４３】
（分類学的性質）
１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする塩基配列（１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子）について、配列番号３に示す配列を有している。配列番号３に示す塩基配列をもとにデータベース（Genbank/DDBJ/EMBL又はアポロンＤＢ−ＢＡ７．０（テクノスルガ・ラボ、静岡））及びホモロジー検索ソフト（アポロン２．０（テクノスルガ・ラボ、静岡）又はBLAST）を用いてホモロジー検索したところ、配列番号３に示す塩基配列は“Microbacterium sp. ＡＳ−４４(Accession No.ＡＪ３９１２０５．１)”として登録された塩基配列と最も高い同一性（９０．９%）を示した。
【００４４】
以上の菌学的性質及び16S rRNAの塩基配列に基づく知見から、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌はMicrobacteriumに属する新規な菌株であると推定された。このため本微生物を新菌株と認定し、２ＫＡ１４−１と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に２０１１年３月２１日に寄託申請し、２０１１年３月２２日（受領日）付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３として受領された。
【００４５】
なお、本明細書に開示される新規なマイクロバクテリウム属菌は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３で特定される寄託菌株に限定されず、当該寄託菌株と同じ菌株に分類される他の微生物も含むものである。例えば、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、上記した菌学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌を含んでいる。また、本明細書に開示されるマイクロバクテリウム属菌は、その１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子について、配列番号３に示す塩基配列に対して９０．９％超の同一性を有し、好ましくは９１．０％以上、より好ましくは９５．０％以上、さらに好ましくは９７．０％以上、一層好ましくは９８．０％以上、より一層好ましくは９９．０％以上の同一性を有する。また、例えば、好気的条件下、低温（例えば２０℃）でメラミン及び／又はモノメトキシメチルメラミンを分解する能力を有するマイクロバクテリウム属菌を含んでいる。
【００４６】
これらの微生物を、公知の方法により変異処理し、一定条件下でスクリーニングすることにより、メラミン類の分解能に関し同等あるいはそれ以上の変異株を取得できる。なお、こうした微生物の変異処理方法としては、例えば物理的方法又は化学的方法が挙げられる。物理的方法としては、紫外線照射、Ｘ線照射等が用いられ、化学的方法としては、変異原性化学物、例えば亜硝酸、Ｎ−メチルＮ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、アクリジン系色素等が使用される。こうした方法は、いずれも当業者における周知技術である。
【００４７】
本明細書に開示される微生物は、いずれも、特別な炭素源及び窒素源がなくても、メラミン類を分解・資化して生存、増殖することが可能である。このため、炭素源及び窒素源を必須とすることなく、低コストでメラミン類を分解処理することができる。
【００４８】
本明細書においてメラミン類とは、例えば、以下の式（１）：
【化１】
（式（１）において、Ｘ１は、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシアルキルアミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基であり、好ましくは、アミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基であり、特に好ましくはアミノ基であり、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、水素原子、アルキル基、アルキルチオ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アミノアルキル基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基からなる群から選択される基である。）
で表されるトリアジン環を１分子中に少なくとも１個有する化合物である。メラミン類には、トリアジン環を一つ有する単核性メラミン類と複数個有する多核性メラミン類が含まれる。
【００４９】
トリアジン環におけるアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロパン−１−イル基、プロパン−２−イル基（イソプロピル基）、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはメチル基、エチル基、特に好ましくはメチル基を挙げることができる。アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基を例示することができ、好ましくはメチルチオ基を挙げることができる。アルキルアミノ基としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロパン−１−イルアミノ基、プロパン−２−イルアミノ基（イソプロピルアミノ基）、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基を例示することができ、好ましくはエチルアミノ基を挙げることができる。ジアルキルアミノ基としては、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはジメチルアミノ基を挙げることができる。アミノアルキル基としては、例えば、アミノメチル基、アミノエチル基、アミノプロパン−１−イル基、アミノプロパン−２−イル（アミノイソプロピル基）、アミノイソブチル基、アミノｓｅｃ−ブチル基、アミノｔｅｒｔ−ブチル基を例示することができ、好ましくはアミノメチル基を挙げることができる。ヒドロキシアルキルアミノ基としては、例えば、ヒドロキシメチルアミノ基、ヒドロキシエチルアミノ基を例示することができ、好ましくはヒドロキシメチルアミノ基を挙げることができる。ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基としては、例えば、ビス（ヒドロキシメチル）アミノ基、ビス（ヒドロキシエチル）アミノ基を例示することができ、好ましくはビス（ヒドロキシメチル）アミノ基を挙げることができる。アルコキシアルキルアミノ基としては、メトキシメチルアミノ基、メトキシエチルアミノ基、エトキシエチルアミノ基、エトキシメチルアミノ基等が挙げられる。また、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基としては、ビス（メトキシメチル）アミノ基、ビス（メトキシエチル）アミノ基、ビス（エトキシメチル）アミノ基、ビス（エトキシエチル）アミノ基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子又は塩素原子、好ましくは塩素原子を挙げることができる。
【００５０】
トリアジン環において、Ｘ１はアミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基とすることが好ましい。また、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ独立に、アミノ基、アルコキシアルキルアミノ基、ビス（アルコキシアルキル）アミノ基、水酸基、ハロゲン原子、アミノアルキル基、ヒドロキシアルキルアミノ基、ビス（ヒドロキシアルキル）アミノ基、又は水素原子とすることができる。
【００５１】
単核性のメラミン類は、上記式Ｉにおいて、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３がアミノ基（ＮＨ2）である化合物（メラミン）が含まれる。また、単核性のメラミン類には、メラミンにおいてアミノ基の一つのＨが置換されているメラミン類である単置換メラミン、メラミンにおいて、二つ以上のＨが置換されている多数置換メラミンである「置換基を有するメラミン」が含まれる。また、単核性のメラミン類には、Ｘ１及びＸ２がアミノ基であり且つＸ３が水酸基である化合物（アンメリン）、Ｘ１がアミノ基であり且つＸ２及びＸ３が水酸基である化合物（アンメリド）などのメラミン類の分解中間体が含まれる。
【００５２】
単置換メラミンには、Ｘ１がアルコキシアルキルアミノ基であり、Ｘ２及びＸ３がアミノ基である、モノアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。また、多置換メラミンには、Ｘ１及びＸ２がアルコキシアルキルアミノ基であり、Ｘ３がアミノ基である、ジアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。さらに、Ｘ１〜Ｘ３がアルコキシアルキルアミノ基であるトリアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。さらに、Ｘ１がビス（アルコキシアルキル）アミノ基であり、Ｘ２及びＸ３がアミノ基であるジアルコキシアルキルメラミンが挙げられる。さらに、このほか、メラミンの水素原子１個〜６個のうち、１〜６個がアルコキシアルキル基で置換されたアルコキシアルキル置換メラミンが含まれる。
【００５３】
単核性のメラミン類は、好ましくはメラミンの有するアミノ基のうち水素原子の少なくとも一つがメトキシメチル基で置換された単置換メラミン及び多置換メラミンが挙げられる。こうしたメラミン類としては、モノメトキシメチルメラミン、ジメトキシメチルメラミン、トリメトキシメチルメラミンを始めとして、最大６個がモノメトキシメチル基で置換されたメラミンが挙げられる。
【００５４】
この他、メラミン類としては、シアヌル酸、イソシアヌル酸、硫酸メラミン、ポリリン酸メラミン、メラム、硫酸メラム、ベンズグアナミン、アセトグアナミン、フタロジグアナミン、サクシノグアナミン、メラミンシアヌレート、メラミンフォスフェート、ピロリン酸メラミン、ブチレンジグアナミン、ノルボルネンジグアナミン、トリグアナミン、ベンゾグアナミン、アセトグアナミン、メチレンジメラミン、エチレンジメラミン、トリメチレンジメラミン、テトラメチレンジメラミン、ヘキサメチレンジメラミン、１，３−ヘキシレンジメラミン、トリス（β−シアノエチル）イソシアヌレート等が挙げられる。
【００５５】
また、多核性のメラミン類としては、上記式（１）で表されるトリアジン環を複数含む化合物が挙げられる。例えば、同一又は異なるトリアジン環を単量体ユニットとして有する重合体が挙げられる。こうした多核性メラミン類としては、いわゆるメラミン樹脂が挙げられる。ここで、メラミン樹脂とは、メラミンなどの単核性メラミン類にアルデヒド、殊にホルムアルデヒド及び/又はアルコールを反応させることにより得られる重合体を包含し、例えば、メチルエーテル化メラミン、エチルエーテル化メラミン、ブチルエーテル化メラミン等のアルキルエーテル化メラミンやメチロール化メラミンなどを挙げることができる。
【００５６】
モノメトキシメチルメラミン、サイメル３０３及び３０５（いずれも日本サイテックインダストリーズ製）が挙げられる。モノメトキシメチルメラミン並びにサイメル３０３及び３０５に含まれるトリアジン環構造を以下に示す。なお、サイメル３０３及び３０５は、平均重合度がそれぞれ１．７及び２．３である。
【００５７】
【化２】
【００５８】
塗装工程における廃水には、塗料に由来する各種のメラミン樹脂あるいは当該メラミン樹脂の部分分解物である多核性及び単核性メラミン類（単置換メラミンや多置換メラミン）が含まれていることが多い。
【００５９】
（メラミン類分解剤）
本明細書に開示されるメラミン類分解剤は、上記したステノトロホモナス属菌、アクロモバクター属菌、スフィンゴバクテリウム属菌及びマイクロバクテリウム属菌から選択される１種又は２種以上を含んでいる。本明細書に開示される微生物製剤は、これらの各微生物が、共通する条件下で単独で高いメラミン類の分解能を発揮でき、同様の分解傾向を有することから、任意の組み合わせで用いても、高いメラミン類の分解活性を有する製剤を得ることができる。また、この微生物製剤によれば、低エネルギーコストでメラミン類を分解することができる。なお、本メラミン類分解剤を用いてメラミン類を分解する条件は、メラミン類が分解される限り、特に限定されないで、後述する条件を適用できる。本メラミン類分解剤は、好気的条件下、夏場における冷却手段や冬場における加熱手段を要することなく、例えば、１５℃以上４０℃以下でメラミン類を効果的に分解できる。
【００６０】
本メラミン類分解剤は、メラミン類の分解の用途に用いられ、メラミン類を含んでいればとくにその適用対象は限定されない。典型的には、例えば、メラミン類を含有する工場廃水、農業廃水、家庭廃水などを適用対象とすることができる。また、適用対象は、土壌、堆肥等のメラミン類の残留可能性のある適用対象中のメラミン類としてもよい。なお、こうした固形物中のメラミン類は、固形物を適宜水等の液体に懸濁して液体にメラミン類を溶解させた懸濁物やその固液分離物であってもよい。工場廃水としては、特に塗装工程を有する工場や現場の廃水（塗装廃水ともいう。）が挙げられる。
【００６１】
（メラミン類の分解方法）
本明細書に開示されるメラミン類の分解方法は、本発明のメラミン類分解剤を用いて、メラミン類を分解する工程を備えることができる。本分解方法によれば、加熱手段又は冷却手段を特に必要とすることなく、また、好気的条件でメラミン類を微生物によって分解処理できるため、低コストで実施できる。また、メラミン類分解剤を構成する微生物は、いずれも、単独で、メラミン類を分解する能力が良好であるため、複雑な制御を必要とせずに、効率的にメラミン類を分解できる。
【００６２】
分解工程において、本分解剤を構成する微生物が、メラミン類を分解し資化する条件は、特に限定されないが、好気的条件下でメラミン類と接触させることが好ましい。好気的条件は、通常、大気圧雰囲気での培養により容易に得ることができる。大気圧雰囲気下で、必要に応じて、静置培養のほか、振とう培養、撹拌培養、通気培養等の各種の好気的培養手法を適宜採用することができる。
【００６３】
本分解方法における分解工程の条件は、上記したとおり既に説明した条件を適用できる。好ましくは、好気的条件下で１５℃以上４０℃以下の温度で前記メラミン類に接触させるようにする。本明細書に開示される微生物は、こうした温度域、すなわち、加温を必要としない温度域においても、良好なトリアジン分解能及び置換メラミン分解能を有している。この温度域は、メラミン樹脂の使用工程の工程廃水としては通常の温度であるほか、年間を通じて外気又は室内において一定期間放置することにより容易に得ることができる温度である。このため、本明細書に開示される微生物は、特に廃水を加温や冷却等の温度制御を必須とすることなく、低エネルギーコストで廃水処理をすることが可能である。本方法では、３５℃以下、より好ましくは３０℃以下、さらに好ましくは２５℃以下、さらに２０℃以下であっても十分にメラミン類や置換メラミン類を分解できる。一方、メラミン類分解活性が維持される限り、２０℃以上であってもよい。より高温域であれば、メラミン類の分解活性はより向上する。こうした観点からは、分解温度は、２５℃以上であってもよく、３０℃以上であってもよい。なお、４０℃を超える高温での分解工程を排除するものではない。
【００６４】
また、ｐＨについては、中性付近とすることが好ましい。すなわち、ｐＨ６〜８程度であり、より好ましくはｐＨ６．５以上７．５以下程度である。こうしたｐＨを維持するには、こうしたｐＨに緩衝域を有する緩衝液を適宜選択して用いることができる。
【００６５】
分解工程は、本メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる工程であってもよい。こうした分解工程を実施することで、活性汚泥による分解作用とメラミン類分解剤による分解作用とを同時に実現することができる。また、こうした分解工程を備えることで、後段で詳述するように分解工程に先立って行う活性汚泥による処理工程を補ったりあるいは省略することも可能である。本メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる場合であっても、上記した本分解工程における条件の範囲内で分解工程を実施することができる。
【００６６】
分解工程に先立ってメラミン類含有廃水に対して活性汚泥処理工程が実施されていることが好ましい。本メラミン類分解剤による分解工程に供される廃水は、好ましくは、活性汚泥処理後の廃水である。メラミン類は、上記のように各種の廃水、典型的には車両を始め、各種の塗装工程の廃水に含まれる。本発明者らによれば、メラミン樹脂を含む塗料の塗装工程等の廃水には、メラミン樹脂に由来する多様なメラミン類が含まれているが、活性汚泥処理により、メラミン類を含む廃水のうち、メラミン類以外の溶剤などの各種成分が分解除去され、ひいては、メラミン類が主成分ともなりうることがわかっている。すなわち、メラミン類分解剤による分解処理前に活性汚泥処理工程を実施することで、微生物の増殖阻害を生じさせるような成分を除去でき、その後のメラミン類分解剤を用いた分解工程に適した組成とすることができる。
【００６７】
活性汚泥処理の手法や種類は特に限定されないで、従来メラミン類を含みうる塗装工程廃水に適用した方法をそのまま適用することができる。例えば、活性汚泥を添加し、例えば１５℃〜４０℃、ｐＨ６〜８で曝気処理３０〜７０日間程度とすることができる。
【００６８】
また、メラミン類分解剤による分解工程に先立って、メラミン類含有廃水に対して、酸性下で廃水中の多置換メラミン類を分解する工程を実施することが好ましい。本発明者らによれば、酸性下にこうした廃水を曝すことで、多置換メラミン類が分解されてメラミン、あるいはこれに加えて単置換メラミンが主成分となることがわかっている。メラミン、あるいはこれに加えて単置換メラミンを主成分とすることで、本メラミン類分解剤を用いた分解を効率的に行うことができる。
【００６９】
この処理工程の酸性条件は特に限定しないが、分解促進の観点からは、好ましくは、ｐＨ６以下であり、より好ましくはｐＨ５以下であり、さらに好ましくはｐＨ４以下であり、一層このましくはｐＨ３以下である。また、ｐＨ調整操作の観点からは、好ましくはｐＨ３以上であり、より好ましくはｐＨ４以上であり、さらに好ましくはｐＨ５以上である。メラミン類含有廃水は、例えば、適当な有機酸及び／又は無機酸で酸性化することができる。典型的には塩酸などの無機酸が挙げられる。酸性処理工程は、その温度は特に限定しないが、好ましくは１５℃以上４０℃以下程度とし、適宜撹拌しながら行うことが好ましい。時間も、置換基の解離を促進し、分解物であるメラミン、あるいはこれに加えて単置換メラミンが主成分となるように実施する。温度にもよるが、例えば、数時間から６０時間程度、好ましくは１０時間から５０時間手程度行うことが好ましい。
【００７０】
酸性処理工程と活性汚泥処理工程とは、いずれか一方を行ってもよいが、その双方を行ってもよい。双方を行う場合には、好ましくは活性汚泥処理工程を先に行い、その後、酸性処理工程を行う。活性汚泥処理工程後に酸性処理工程を実施することで、酸性処理工程をより効果的に行うことができる。
【００７１】
酸性処理工程後に本メラミン類分解剤を用いた分解工程を実施する場合には、酸性の液性を中和して既に説明した本分解工程に適したｐＨに調整することが好ましい。ｐＨ調整は、特に限定しないが、適当なアルカリを用いて実施する。
【００７２】
（メラミン類含有廃水の処理方法）
本発明によれば、メラミン類を含有する廃水の処理方法が提供される。本処理方法は、酸性下でメラミン類含有廃水中の多置換メラミン類を分解する処理工程、を備えることができる。こうした処理方法によれば、多置換メラミン類が減少し、メラミン、あるいはメラミンと単置換メラミンが主体となっているため、その後の微生物等を用いた分解処理に適した組成となっている。特に、本処理方法は、本メラミン類分解剤を用いた分解処理のために当該分解処理に先立ってすることが好ましい。本メラミン類分解剤によれば、残存する各種のメラミンあるいはメラミンと単置換メラミンを効率的に分解できるからである。また、本処理方法は、活性汚泥処理後の塗装工程廃水に適用することが好ましい。活性汚泥によりメラミンあるいはメラミンと単置換メラミンが主成分となっているため酸処理も効率的に進行する。
【００７３】
（メラミン類を含む廃水の処理装置）
本明細書の開示によれば、本明細書に開示されるステノトロホモナス属菌、アクロモバクター属菌、スフィンゴバクテリウム属菌及びマイクロバクテリウム属菌からなる群から選択される１種又は２種以上で、メラミン類を含む廃水を分解する分解槽を有する、廃水処理装置が提供される。本装置によれば、常温でかつ好気的条件で廃水を処理できるので、装置構成も簡略化できるし、しかも、低コストで連続運転させることができる。本処理装置においては、本分解方法について説明した各種の実施態様を適用することができる。
【００７４】
分解槽におけるこれらの微生物の存在形態は特に限定しない。浮遊状態であってもよいし、凝集形態であってもよいし、なんらかの固相担体に固定化された状態であってもよい。また、分解槽の形態も特に限定されない、必要に応じてバッチ式あるいは連続式の処理に適したものとすることができる。
【００７５】
本処理装置は、メラミン樹脂塗料を用いた塗装工程廃水処理設備の一部であってもよい。また、前記分解槽の前段には、活性汚泥処理槽及び／又は酸性処理槽を備えることもできる。活性汚泥処理槽及び酸性処理槽における各処理は、活性汚泥処理工程及び酸処理工程について既に説明した各種の実施態様を適用できる。好ましくはこれらの双方を有し、上流から順に活性汚泥処理槽、酸性処理槽及び本分解槽を備える。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７７】
（メラミン類分解微生物の集積培養及び分離）
（スクリーニングＡ）
土壌、堆肥、塗装廃水などから微生物を採取し、培地Ａ（０．１％サイメル３０３（完全アルキル化型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１％サイメル３２５（イミノ基型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１Ｍリン酸カリウムナトリウムバッファ（ｐＨ６．７）、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０４３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ4、・５Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ Ｈ3ＢＯ3、０．２２３ｍｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１５ｍｇ／Ｌ ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０３ｍｇ／Ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．６６ｍｇ／Ｌ ＣａＣＯ3）１０ｍｌに加え、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうし、１週間ごとに培養液１ｍｌを採取し、新しい培地Ａ９ｍｌに加え、再び、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうを続ける操作を５週間継続した。振とう液０．１ｍｌを選択培地Ｂ（培地Ａ、１５ｇ／Ｌ 寒天）に塗布し、２０℃、７日間培養した。培養後、出現したコロニーの中から２９株を分離した。
【００７８】
（スクリーニングＢ）
さらに、土壌、堆肥、塗装廃水などから微生物を採取し、培地Ａ（０．１％サイメル３０３（完全アルキル化型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１％サイメル３２５（イミノ基型メトキシメチルメラミン、日本サイテックインダストリーズ製）、０．１Ｍリン酸カリウムナトリウムバッファ（ｐＨ６．７）、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０４３ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ4、・５Ｈ2Ｏ、０．３ｍｇ／Ｌ Ｈ3ＢＯ3、０．２２３ｍｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．０１５ｍｇ／Ｌ ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０３ｍｇ／Ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、０．６６ｍｇ／Ｌ ＣａＣＯ3）１０ｍｌに加え、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうし、１週間ごとに培養液１ｍｌを採取し、新しい培地Ａ９ｍｌに加え、再び、２０℃、１５０ｒｐｍで振とうを続ける操作を５週間継続した。振とう液０．１ｍｌを選択培地Ｂ（培地Ａ、１５ｇ／Ｌ 寒天）に塗布し、２０℃、７日間培養した。培養後、出現したコロニーの中から１株を分離した。
【実施例２】
【００７９】
（メラミンの分解能評価）
培地Ｃ（培地Ａのうち、サイメル３０３及びサイメル３２５を０．０１％メラミン（和光純薬株式会社製）としたもの）１０ｍｌに濁度２（波長６６０ｎｍ）に調整したスクリーニングＡによって得られた分解菌２９株の懸濁液５００μｌを添加し、２０℃で２４時間、１５０ｒｐｍで振とう培養してメラミン分解性を評価した。メラミンの分解性は、溶液中に存在するメラミンをＨＰＬＣ（島津製作所Prominence、カラム：インタクト製Unison UK-C8）を用いて分析し、その濃度変化により評価した。その結果を図１に示す。また、スクリーニングＢにより追加で分離した１株についても、同様にメラミンの分解能を評価した。結果を、図１に併せて示す。
【００８０】
図１に示すように、スクリーニングによって得られた菌株はほとんどがほぼ１００％メラミンを分解した。こうした分解率は、従来の好気的条件におけるメラミン分解法を遙かに凌ぐものであった。
【実施例３】
【００８１】
（実廃水でのメラミン類分解能評価）
本実施例は、実廃水Ａ（ＣＯＤ１０００ｍｇ／ｍｌ）１ｌに活性汚泥を添加し（ＭＬＳＳ２７００ｍｇ／ｌ）、２０〜２５℃、ｐＨ７〜８で曝気処理５０日間行った。ろ過により固液分離を行い、活性汚泥処理液（液層）を得た（ＣＯＤ１３０ｍｇ／ｍｌ）。図２に示すように、ＧＣ−ＭＳ分析及びＮＭＲ分析により、この活性汚泥処理液の含有成分は溶剤成分が消失し、トリアジン環を有するメラミン類が主成分として残留していることがわかった。
【００８２】
活性汚泥処理液１０ｍｌに濁度２（波長６６０ｎｍ）に調製した分解菌２９株の懸濁液５００μｌを添加し、２０℃で２４時間、１５０ｒｐｍで振とう培養してメラミン類分解性を評価した。メラミン類の分解性は実施例２と同様にして評価した。同様にして、スクリーニングＢにより分離した分解菌１株についても、分解能を評価した。これらの結果を併せて図３に示す。
【００８３】
図３に示すように、スクリーニングによって得られた菌株は、ほとんど実廃水中のメラミン類分解能を有していた。なかでも、２ＫＡ１４−３株、１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株の４株は一日の処理で初期値２００ｐｐｍのメラミンをほぼ半分にまで分解した。また、１ＫＢ３２−１株についての処理前後のＨＰＬＣチャートを図４及び図５に示す。図４及び図５に示すように、メラミン分解処理によりメラミン（ピークＢ）とモノメトキシメチルメラミンの一つのピーク（ピークＣ）が完全に消失し、その他の置換基を有するメラミンのピーク（モノメトキシメチルメラミン（ピークＤ）、ジメトキシメチルメラミン（ピークＥ、Ｆ）も減少が見られ、本菌株を用いるとメラミンだけでなく「置換基を有するメラミン」に関しても分解可能であることが示された。また、図４及び図５に示すように、その他のメラミン（ピークＨ）も減少しており、上記した「置換基を有するメラミン」だけでなくその他のメラミンにも有効であることがわかった。さらに、こうした傾向を、同様にメラミン類分解能の高い２ＫＡ１４−３株、１ＫＣ６４−１株、２ＫＡ１４−１株についても確認できた。
【実施例４】
【００８４】
（高濃度メラミン類含有実廃水での分解能評価）
本実施例では高濃度メラミンを含有する実廃水での分解性を評価した。
塗装工程廃水Ｂ（ＣＯＤ６０００ｍｇ／ｍｌ）１ｌに活性汚泥を添加し（ＭＬＳＳ２７００ ｍｇ／ｌ）、２０〜２５℃、ｐＨ７〜８で曝気処理を５０日間行った。活性汚泥処理液１０ｍｌに対して、濁度２（波長６６０ｎｍ）に調製した１ＫＢ３２−１株の懸濁液５００μｌを添加し、２０℃で４週間振とう培養を行い、実施例２と同様にしてメラミン類分解性を評価した。活性汚泥処理前後のＨＰＬＣのクロマトグラムを図６中の（ａ）及び（ｂ）に示す。図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、クロマトグラム上のピークに変化は見られずメラミン類分解能は検出されなかった。なお、これらのクロマトグラム上のピークＨは、多置換メラミンを含むメラミン類に対応している。
【００８５】
さらに、活性汚泥処理液１０ｍｌを、１Ｎ塩酸を用いてｐＨ５に調整後、２０℃で４週間振とうを行った。この酸処理の結果、図６（ｃ）に示すように、多置換メラミンを含むメラミン類に由来するピークＨは消滅し、その替わりメラミン（ピークＢ）、単置換メラミンであるモノメトキシメチルメラミン（ピークＣ）のピークが出現した。さらに、この酸処理後の溶液を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７に調整後、濁度２（波長６６０ｎｍ）に調整した１ＫＢ３２−１株の懸濁液５００μｌと混合し、２０℃で３日間振とう培養を行い、これらのメラミン類分解性を評価した。その結果を図６（ｄ）に示す。
【００８６】
図６（ｄ）に示すように、ＨＰＬＣのクロマトグラム上のメラミン（ピークＢ）及びモノメトキシメチルメラミン（ピークＣ）はほぼ消滅した。以上のことから、活性汚泥処理液の特定微生物による分解処理によっては、メラミン類は分解されないで残存するが、その後の酸処理により多置換メラミンを含むメラミン類は消失ないし減少してメラミン及び単置換メラミンが主体となり、その後の特定の微生物による処理によってこれらのメラミン類が容易に消失することがわかった。
【実施例５】
【００８７】
本実施例では、菌株を同定した。メラミン類分解性評価の結果から、メラミン分解性の高い１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株及び２ＫＡ１４−３株について形態学的性質及び遺伝学的性質を解析した。形態学的性質はＬＢ寒天培地で３７℃、４８時間培養後に形成されたコロニーを実体顕微鏡（オリンパス製 ＳＺＨ１０）で、グラム染色後に光学顕微鏡（オリンパス製 ＢＸ５０Ｆ４）で観察した。
【００８８】
また、分類学的性質は、これらの各菌株菌体からゲノム抽出し、定法に従い、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく遺伝学的解析を行った。すなわち、１６Ｓ ｒＲＮＡ領域をＰＣＲにより増幅し、その後、配列決定を行った。なお、使用したプライマーは、以下のとおりとした。
【００８９】
（１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株用）
増幅プライマー
９Ｆ：5'-gagtt tgatc ctggc tcag-3'（配列番号５）
１４９２Ｒ：5'-tacgg ytacc ttgtt acgac tt-3'（配列番号６）
Y=t 又はc
（１ＫＣ６４−１株、１ＫＢ３２−１株、２ＫＡ１４−１株用の増幅プライマー）
シークエンスプライマー
９Ｆ：5'-gagtt tgatc ctggc tcag-3'（配列番号５）
１２４０Ｒ：5'-ccatt gtagc acgtg t-3'（配列番号７）
【００９０】
（２ＫＡ１４−３株用）
増幅プライマー
9F : 5’-gag ttt gat cct ggc tca g- 3’（配列番号５）
1510R : 5’-gtg aag ctt acg gyt acc ttg tta cga ctt- 3’（配列番号８）
シークエンスプライマー
9F : 5’-gag ttt gat cct ggc tca g- 3’（配列番号５）
785F : 5’-gga tta gat acc ctg gta- 3’（配列番号９）
805R : 5’-tac cag ggt tac taa tcc- 3’（配列番号１０）
1510R : 5’-gtg aag ctt acg gyt acc ttg tta cga ctt- 3’（配列番号１１）
【００９１】
得られた増幅産物につき、定法に従い、塩基配列を決定した。得られた１６Ｓ ｒＤＮＡ領域の塩基配列に基づいて相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。データベースとしては国際塩基配列データベース（GenBank/DDBJ/EMBL）を使用した。結果を表１に示す。また、それぞれの菌についての遺伝学的解析結果を表２〜５に示す。
【００９２】
【表１】
【００９３】
[表２]
（１ＫＣ６４−１株）
近縁種 相同性（％）
Achromobacter sp. MT-E3（EU727196.1） 99.6
Alcaligenes sp. ON5（AJ306836.1） 99.6
Alcaligenes sp. SK0603（DQ459259.1） 99.5
Achromobacter sp. Esp3（EF433459.1） 99.5
Achromobacter sp. AMC1（AY635878.1） 99.5
Alcaligenes sp. Yen（AY744384.1） 99.4
Achromobacter sp. CEMM 05-01-040（GU244494.1） 99.4
Achromobacter sp. CEMM 05-01-038（GU244493.1） 99.4
Achromobacter sp. F3feb.50（GQ417634.1） 99.4
Achromobacter sp. F2oct.45（GQ417528.1） 99.4
Achromobacter xylosoxidans ybb5（EU214611.1） 99.4
Achromobacter insolitus Y2P1（EU221379.1） 99.4
【００９４】
[表３]
（１ＫＢ３２−１株）
近縁種 相同性（％）
Sphingobacterium sp. MG2（AY556417.1） 99.5
Sphingobacterium sp. G-2-27-2（EF102865.1） 99.5
Sphingobacterium sp. No.6（FJ868219.1） 99.4
Sphingobacterium sp. M7（FM958445.1） 99.4
Sphingobacterium sp. F19（GU120661.1） 99.4
Sphingobacterium multivorum BAC3045（HM355636.1） 99.4
Sphingobacterium sp. 1ZP4（HQ540555.1） 99.3
Sphingobacterium multivorum OM-A8（AB020205.1） 99.2
Sphingobacterium sp. IN42（HQ423411.1） 99.1
Sphingobacterium sp. Cxh-8（EF059711.1） 99.0
【００９５】
[表４]
（２ＫＡ１４−１株）
近縁種 相同性（％）
Microbacterium liquefaciens DSM20638（NR_026162） 90.5
Microbacterium sp. AS-44（AJ391205.1） 90.9
Microbacterium sp. S15-M4（AM234160.1） 90.8
Microbacterium sp. 3019BRRJ（FJ200406.2） 90.8
Microbacterium oxidans XH0903（GQ279110.1） 90.8
Microbacterium oxidans WT141（GQ152132.1） 90.8
Microbacterium oxidans 407（EU714369.1） 90.8
Microbacterium oxidans 3227（EU714357.1） 90.8
Microbacterium oxidans 2704（EU714344.1） 90.8
Microbacterium oxidans 2083（EU714335.1） 90.8
Microbacterium oxidans（AB365061.1） 90.8
Microbacterium maritypicum（AM181506.1） 90.8
【００９６】
[表５]
（２ＫＡ１４−３株）
近縁種 相同性（％）
Stenotrophomonas humi R-32729 (AM403587) 99.6
Stenotrophomonas nitritireducensJCM13311 (Tecsrg0094) 99.5
Stenotrophomonas terrae R-32768 (AM403589) 98.9
Pseudomonas pictorium ATCC23328 (AB021392) 98.4
Stenotrophomonas acidaminiphilaDSM13117 (Tecsrg0095) 98.1
Stenotrophomonas maltophilaNBRC14161 (Tecsrg0093) 97.6
Stenotrophomonas koreensisJCM13256 (Tecsrg0092) 97.1
Stenotrophomonas ginsengisoli DCY01 (DQ109037) 97.4
Stenotrophomonas rhizophila e-p10 (AJ293463) 97.3
Xanthomonas sacchari LMG471 (Y10766) 96.7
【００９７】
表２に示す遺伝学的解析によれば、１ＫＣ６４−１株は、Achromobacterに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたAchromobacter属菌の一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、１ＫＣ６４−１は属のレベルにおいてAchromobacter に含まれると判断された。一方、Achromobacter に属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、１ＫＣ６４−１株はAchromobacter に属する新規菌株であると判断された。
【００９８】
表３に示す遺伝学的解析によれば、１ＫＢ３２−１株は、Sphingobacteriumに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたSphingobacterium属菌の一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、１ＫＢ３２−１株は属のレベルにおいてSphingobacterium に含まれると判断された。一方、Sphingobacterium に属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、１ＫＢ３２−１株はSphingobacterium に属する新規菌株であると判断された。
【００９９】
表４に示す遺伝学的解析によれば、２ＫＡ１４−１株は、Microbacteriumに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたMicrobacterium属菌の一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、２ＫＡ１４−１は属のレベルにおいてMicrobacterium に含まれると判断された。一方、しかしなから、Microbacterium に属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、２ＫＡ１４−１株はMicrobacterium に属する新規菌株であると判断された。
【０１００】
表５に示す遺伝学的解析によれば、２ＫＡ１４−３株は、Stenotrophomonasに属する可能性が高いと考えられた。また、菌学的性質の観察結果から得られた性質は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたStenotrophomonas humiの一般性状と一致するものの、若干異なっていると考えられた。以上のことから、２ＫＡ１４−３株は種のレベルにおいてStenotrophomonas humiに含まれると判断された。一方、しかしなから、Stenotrophomonas humiに属する公知株には、こうしたメラミン分解性を有しているものが報告されていないことから、２ＫＡ１４−３株はStenotrophomonas humiに属する新規菌株であると判断された。
【実施例６】
【０１０１】
実施例４における１ＫＢ３２−１株によるメラミン類分解の０日後、１日後、３日後、６日後、１０日後、１３日後の各サンプルをＨＰＬＣ解析し、メラミン、アンメリン、アンメリド、シアヌル酸の濃度変化を比較した。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりとした。結果を図７に示す。
ＨＰＬＣ条件：
カラム：Unison UK-amino 2.0mm×250mm（インタクト社製）
溶媒：アセトニトリル：水＝80：20、10mM酢酸アンモニウム
流速：0.2mL/min
温度：40℃
検出：UV220nm（メラミン、アンメリド、シアヌル酸）
230nm（アンメリン）
【０１０２】
図７に示すように、メラミンは処理３日でほぼ消失した。これに対し、アンメリン、アンメリド、シアヌル酸の各中間体の濃度はメラミンの減少分に比べてわずかに上昇したのみでその後消失し、メラミン分解に対して中間体の分解反応は十分に速く、中間体の生成は問題とはならず、こうした中間体が速やかに無害な物質へと変換されていると判断された。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号５〜１１：プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（４）から選択される１種又は２種以上を含む、メラミン類分解剤。
（１）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するステノトロホモナス属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列と９９．６％超の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（２）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するアクロモバクター属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．６％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（３）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．５％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（４）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
（分類学的性質）
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９０．９％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【請求項２】
前記ステノトロホモナス属菌、前記アクロモバクター属菌、前記スフィンゴバクテリウム属菌及び前記マイクロバクテリウム属菌における前記科学的性質は、好気的条件、２０℃でメラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する性質である、請求項１に記載のメラミン類分解剤。
【請求項３】
前記ステノトロホモナス属菌は、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株であるステノトロホモナス属菌である、請求項１又は２に記載のメラミン類分解剤。
【請求項４】
前記アクロモバクター属菌は、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）又はその変異株であるアクロモバクター属菌である、請求項１〜３のいずれかに記載のメラミン類分解剤。
【請求項５】
前記スフィンゴバクテリウム属菌は、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株であるスフィンゴバクテリウム属菌である、請求項１〜４のいずれかに記載のメラミン類分解剤。
【請求項６】
前記マイクロバクテリウム属菌は、マイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株であるマイクロバクテリウム属菌である、請求項１〜５のいずれかに記載のメラミン類分解剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のメラミン類分解剤を用いて、メラミン類を分解する工程、
を備える、メラミン類の分解方法。
【請求項８】
前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を、好気的条件下で１５℃以上４０℃以下の温度でメラミン類に接触させる工程である、請求項７に記載のメラミン類の分解方法。
【請求項９】
前記分解工程は、廃水中のメラミン類を分解する工程である、請求項７又は８に記載のメラミン類の分解方法。
【請求項１０】
前記廃水は、活性汚泥処理後の廃水である、請求項９に記載の分解方法。
【請求項１１】
前記分解工程に先だって、酸性下で前記廃水中の多置換の前記メラミン類を分解する処理工程を備える、請求項７〜１０のいずれかに記載の分解方法。
【請求項１２】
前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる工程である、請求項７〜１１のいずれかに記載の分解方法。
【請求項１３】
以下の（１）〜（４）：
（１）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するステノトロホモナス属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列と９９．６％超の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（２）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するアクロモバクター属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．６％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（３）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．５％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（４）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
（分類学的性質）
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９０．９％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
から選択される１種又は２種以上で、メラミン類を含む廃水を分解する分解槽を有する、廃水処理装置。
【請求項１４】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株である、細菌。
【請求項１５】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２又はその変異株である、細菌。
【請求項１６】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株である、細菌。
【請求項１７】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、マイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株である、細菌。
【請求項１８】
メラミン類を含有する廃水の処理方法であって、
酸性下で前記廃水中の多置換の前記メラミン類を分解する処理工程、
を備える方法。
【請求項１９】
前記廃水は、活性汚泥処理後の塗装工程廃水である、請求項１８に記載の処理方法。
【請求項１】
以下の（１）〜（４）から選択される１種又は２種以上を含む、メラミン類分解剤。
（１）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するステノトロホモナス属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列と９９．６％超の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（２）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するアクロモバクター属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．６％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（３）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．５％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（４）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
（分類学的性質）
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９０．９％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
【請求項２】
前記ステノトロホモナス属菌、前記アクロモバクター属菌、前記スフィンゴバクテリウム属菌及び前記マイクロバクテリウム属菌における前記科学的性質は、好気的条件、２０℃でメラミン及びモノメトキシメチルメラミンを分解する性質である、請求項１に記載のメラミン類分解剤。
【請求項３】
前記ステノトロホモナス属菌は、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株であるステノトロホモナス属菌である、請求項１又は２に記載のメラミン類分解剤。
【請求項４】
前記アクロモバクター属菌は、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２）又はその変異株であるアクロモバクター属菌である、請求項１〜３のいずれかに記載のメラミン類分解剤。
【請求項５】
前記スフィンゴバクテリウム属菌は、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株であるスフィンゴバクテリウム属菌である、請求項１〜４のいずれかに記載のメラミン類分解剤。
【請求項６】
前記マイクロバクテリウム属菌は、マイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株であるマイクロバクテリウム属菌である、請求項１〜５のいずれかに記載のメラミン類分解剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のメラミン類分解剤を用いて、メラミン類を分解する工程、
を備える、メラミン類の分解方法。
【請求項８】
前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を、好気的条件下で１５℃以上４０℃以下の温度でメラミン類に接触させる工程である、請求項７に記載のメラミン類の分解方法。
【請求項９】
前記分解工程は、廃水中のメラミン類を分解する工程である、請求項７又は８に記載のメラミン類の分解方法。
【請求項１０】
前記廃水は、活性汚泥処理後の廃水である、請求項９に記載の分解方法。
【請求項１１】
前記分解工程に先だって、酸性下で前記廃水中の多置換の前記メラミン類を分解する処理工程を備える、請求項７〜１０のいずれかに記載の分解方法。
【請求項１２】
前記分解工程は、前記メラミン類分解剤を含有する活性汚泥を用いる工程である、請求項７〜１１のいずれかに記載の分解方法。
【請求項１３】
以下の（１）〜（４）：
（１）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するステノトロホモナス属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号４に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列と９９．６％超の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（２）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するアクロモバクター属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：淡黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．６％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（３）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するスフィンゴバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：−
（分類学的性質）
配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９９．５％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
（４）以下の菌学的性質及び分類学的性質を有するマイクロバクテリウム属菌
（菌学的性質）
（科学的性質）
好気的条件下でメラミン類を分解する。
（形態学的性質）（使用培地：ＬＢ培地、３７℃、４８時間）
細胞形態：桿菌
コロニー色調：黄色
（生理学的性質）
グラム染色：＋
（分類学的性質）
配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ又は前記塩基配列と９０．９％超の同一性を有するＤＮＡを含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有する。
から選択される１種又は２種以上で、メラミン類を含む廃水を分解する分解槽を有する、廃水処理装置。
【請求項１４】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、ステノトロホモナス フミ ２ＫＡ１４−３株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１４７９）又はその変異株である、細菌。
【請求項１５】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、アクロモバクター １ＫＣ６４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５２又はその変異株である、細菌。
【請求項１６】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、スフィンゴバクテリウム １ＫＢ３２−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５１）又はその変異株である、細菌。
【請求項１７】
好気的条件下でのメラミン類分解能を有し、マイクロバクテリウム ２ＫＡ１４−１（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１３５３）又はその変異株である、細菌。
【請求項１８】
メラミン類を含有する廃水の処理方法であって、
酸性下で前記廃水中の多置換の前記メラミン類を分解する処理工程、
を備える方法。
【請求項１９】
前記廃水は、活性汚泥処理後の塗装工程廃水である、請求項１８に記載の処理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−２３１７８９（Ｐ２０１２−２３１７８９Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−９６９８７（Ｐ２０１２−９６９８７）
【出願日】平成２４年４月２０日（２０１２．４．２０）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年４月２０日（２０１２．４．２０）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【Ｆターム（参考）】
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