ユーロピアンコーンボーラー防除のためのＣＲＹ１ＡｂおよびＣＲＹ２Ａａを含む殺虫性タンパク質の組み合わせならびに昆虫抵抗性管理のための方法
本発明は、一部には、ＣｒｙＩＡｂタンパク質およびＣｒｙ２Ａａタンパク質をスタッキングして、より耐久的で、これら２種の毒素いずれかの活性に対し抵抗性の昆虫を発生させる傾向がより少ない植物（特にトウモロコシまたはメイズ）を作製することに関する。これらのスタックは、ユーロピアンコーンボーラーの特異的な標的化に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
人間は、トウモロコシを食料およびエネルギー用途のために栽培する。昆虫は、トウモロコシ植物を食害することによりこのような人間の努力を台無しにする。
【０００２】
現在、これら有害生物の植物内（in-plant）トランスジェニック防除は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来のＣｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする結晶（Ｃｒｙ）デルタエンドトキシン遺伝子の植物における発現により達成される。Ｃｒｙ１Ｆａは、現在、ＦＡＷおよびＥＣＢ害虫に対し抵抗性の、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製トランスジェニックトウモロコシ種子のＨｅｒｃｕｌｅｘ（商標）ブランド（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ−ＥｘｔｒａおよびＨｅｒｃｕｌｅｘ−ＲＷ）に含まれているタンパク質毒素である。このタンパク質は、昆虫の中腸に位置する特異的受容体（複数可）と結合することによって機能し、腸細胞内にポアを形成する。このようなポア形成は、昆虫の浸透圧バランス調節を妨げ、その結果昆虫に死をもたらす。
【０００３】
しかし、その腸内のＣｒｙ１Ｆａと結合する受容体の遺伝子変異により、昆虫が、Ｃｒｙ１Ｆａの作用に対する抵抗性を発達できるようになる可能性があることが懸念される。Ｃｒｙ１Ｆａ結合能の低い受容体を産生する昆虫は、Ｃｒｙ１Ｆａの活性に対し抵抗性となり、従ってこのタンパク質を発現する植物において生存することができる。
【０００４】
成長条件の植物において持続的に存在する単一のＣｒｙ毒素を用いると、昆虫の腸におけるＣｒｙ１Ｆａ毒素と結合する受容体の遺伝子変異により、昆虫が、このタンパク質の活性に対する抵抗性を発達し得るとの懸念がある。受容体のこのような変化による毒素結合の減少は、Ｃｒｙ１Ｆａの毒性の低下をもたらしかねず、これは最終的には作物において発現した際のタンパク質の有効性の低下をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質およびＣｒｙ２Ａａタンパク質をスタッキング（stacking）して、より耐久的で、これら２種の毒素いずれかの活性に対し抵抗性の昆虫を発生させる傾向がより少ない植物（特にトウモロコシまたはメイズ）を作製することに関する。これらのスタック（stack）は、ユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ）の特異的な標的化に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＥＣＢ由来のＢＢＭＶにおける１２５Ｉ Ｃｒｙ１Ａｂ（０．５ｎＭ）のパーセント特異的結合対、非標識の相同Ｃｒｙ１Ａｂ（◆）および異種Ｃｒｙ２Ａａ（□）による競合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質をスタッキングして、より耐久的で、これら２種の毒素いずれかの活性に対し抵抗性の昆虫を発生させる傾向がより少ない植物（特にトウモロコシまたはメイズ）を作製することに関する。これらのスタックは、ユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））の特異的な標的化に用いることができる。
【０００８】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質およびＣｒｙ２Ａａタンパク質を基本のペアとする３種（以上の）タンパク質毒素の三重スタックまたは「ピラミッド（pyramid）」に関する。（「別個の作用部位」とは、所定のタンパク質のいずれも互いに交差抵抗性を生じないことを意味する。）ＥＣＢを標的とする第三のタンパク質の追加は、ＥＣＢに対する第三の作用部位を有するタンパク質を提供することができる。一部の好ましい実施形態において、第三のタンパク質はＤＩＧ−３（米国特許出願公開第２０１０−００２６９２２３号明細書を参照）、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ２ＡａおよびＣｒｙ１Ｆａからなる群から選択することができる。例えば、２００９年１２月１６日に出願されたＵＳＳＮ６１／２８４，２７８を参照されたし。米国特許出願公開第２００８−０３１１０９６号明細書も参照されたし。
【０００９】
従って、一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素は、ＥＣＢに対し３種の別個の作用部位を有する。さらに、好ましいピラミッドの組み合わせは、対象タンパク質ペアと、第三のＩＲＭタンパク質である。
【００１０】
対象ペアおよび／または三重（tripe）スタック（ＥＣＢに対し活性）は、例えばフォールアーミーワーム（fall armyworm）（ＦＡＷ）を標的化するための追加的なタンパク質と組み合わせてもよい。このようなタンパク質は、例えば、Ｖｉｐ３、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄおよび／またはＣｒｙ１Ｅを含むことができる。Ｃｒｙ１Ｂｅおよび／またはＣｒｙ１Ｆａは、ＦＡＷおよびＥＣＢの標的化に用いることもできる。
【００１１】
ＧＥＮＢＡＮＫを利用して、本明細書に開示または言及されている遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得ることができる。付録Ａを参照されたし。
【００１２】
本発明はまた、単一の標的有害生物に対し活性を有するが互いに交差抵抗性を生じない３種の殺虫性タンパク質（一部の好ましい実施形態において、Ｃｒｙタンパク質）に関する。
【００１３】
これら３種の（少なくとも）毒素を産生する植物（およびこのような植物を植え付けた地所）は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子を付け加えてもよいが、これら特定の三重スタックは、本発明において、有利にかつ驚くほどにＥＣＢに対し３種の作用部位を提供するであろう。
【００１４】
本発明のペアまたは三重スタック（および／または追加的なタンパク質の組み合わせ）は、緩衝帯（refuge）地所の要件の縮小または除外（例えば、４０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満またはさらには０％の緩衝帯）に役立つ可能性がある。よって、このように植え付けられた１０エーカーを超える圃場（field）は、本発明の範囲内に含まれる。対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは、非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター（複数可）制御下の遺伝的構築物に置かれている。対象ポリヌクレオチドは、植物における発現増強のためのコドン使用を含むことができる。
【００１５】
Ｃｒｙタンパク質に対する抵抗性を発達させる昆虫の能力に対抗するため、本出願人らは、ＥＣＢ腸におけるタンパク質受容体と非競合的に結合するＣｒｙ毒素を同定した。Ｃｒｙ１Ａｂが、ＥＣＢ幼虫の昆虫腸に位置する受容体とＣｒｙ２Ａａの結合を置き換え（displace）ないことが発見された。
【００１６】
本出願人らは、Ｃｒｙ２ＡａおよびＣｒｙ１Ａｂが、ＥＣＢ幼虫にとって有毒であるが同一受容体部位（複数可）と完全には相互作用しないことを見出した。このことは、これらの毒性が、ＥＣＢにおいて交差抵抗性になりにくいであろうことを示す。
【００１７】
よって、Ｃｒｙ１Ａｂに対する抵抗性を発達させた昆虫は、依然として例えば別の受容体部位と結合するＣｒｙ２Ａａタンパク質の毒性に対して感受性である。本出願人らは、この説を支持する生化学的データを得た。これらタンパク質の組み合わせをトランスジェニック植物において発現することにより、圃場において昆虫の抵抗性が発達する確率の低下に有用で価値のあるメカニズムを提供し、退避地（refugia）要件の減少をもたらす。本明細書に後述するデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ａｂとは別の標的部位（複数可）で相互作用するＣｒｙ２Ａａタンパク質を示し、よって、優れたスタッキングパートナーが得られるであろう。
【００１８】
Ｃｒｙ毒素と結合する昆虫腸受容体の親和性の変化によって抵抗性が発生する場合、複数のタンパク質を発現する植物において昆虫が生存できるようになるには、変化は少なくとも２種の異なる受容体で同時に生じる必要がある。この事象が発生する確率は非常に低く、従って、タンパク質に対する耐性を発達できる昆虫の区画（ward）に対するトランスジェニック産物の耐久性を増加させる。
【００１９】
本出願人らは、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質を放射性ヨウ素化し、放射性受容体結合アッセイ技法を用いて、その昆虫腸膜内に位置する推定受容体タンパク質との結合相互作用を測定した。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒの方法により、腸膜を刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）として調製した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のヨードビーズ（iodo beads）かヨードゲン（iodogen）処理したチューブのいずれかを用いて毒素のヨウ素化を行った。放射標識した毒素の特異活性は、およそ１〜４μＣｉ／μｇタンパク質であった。結合試験は、基本的にＬｉａｎｇ（１９９５）の手順により行った。
【００２０】
本明細書に提示しているデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ａｂとは別の標的部位において相互作用する毒素を示し、従って優れたスタッキングパートナーが得られるであろう。
【００２１】
本発明は、様々な植物に用いることができる。具体例として、トウモロコシ（メイズ）、ダイズおよびワタが挙げられる。
【００２２】
本発明において有用な遺伝子および毒素は、開示されている全長配列のみならず、本明細書に特に例示されている毒素の特徴的な殺有害生物活性を保持するこれらの配列の断片、変種、変異体および融合タンパク質も含む。本明細書において、遺伝子の「変種」または「変異種」という用語は、同一毒素をコードする、あるいは殺有害生物活性を有する均等な毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において、用語「均等な毒素」は、標的有害生物に対し請求されている毒素と同一または本質的に同一の生物活性を有する毒素を意味する。
【００２３】
本明細書において、境界は、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」、N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews（1998）62巻:807〜813により、およそ９５％（例えば、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ２Ａａ）、７８％（例えば、Ｃｒｙ１ＡおよびＣｒｙ２Ａ）ならびに４５％（Ｃｒｙ１およびＣｒｙ２）の配列同一性を表す。これらのカットオフは、コアタンパク質のみに適用してもよい。
【００２４】
例示されている毒素の殺有害生物活性を保持する断片および均等物は、本発明の範囲内となるであろう。また、遺伝暗号の重複性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されているアミノ酸配列をコードし得る。同一または本質的に同一の毒素をコードするこのような代替的なＤＮＡ配列を作製することは、十分に当業者の技能範囲内のものである。これら変種のＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。本明細書において、「本質的に同一」の配列の言及は、殺有害生物活性に実質的な影響を与えないアミノ酸置換、欠失、付加または挿入を有する配列を意味する。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子断片もこの定義に含まれる。
【００２５】
毒素をコードする遺伝子および本発明において有用な遺伝子部分を同定するためのさらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適切な標識に基づいて検出可能となり得る、あるいは、国際公開第９３／１６０９４号パンフレットに記載されている通り蛍光が内在するよう作製することができる。本技術分野でよく知られている通り、プローブ分子と核酸試料が、２分子間で強固な結合を形成することによりハイブリダイズするのであれば、プローブと試料が実質的に相同であると合理的に推測することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, G. H., M. M. Manak（1987）DNA Probes、Stockton Press、ニューヨーク州ニューヨーク、169〜170頁に記載されている、本技術分野でよく知られている技法によるストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度および温度の組み合わせを数例次に示す（ストリンジェンシー増加順）。２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、室温；１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、６５℃。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが行われたか公知の様式において決定するための手段を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に係るプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準手順を用いて合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることもできる。
【００２６】
本明細書において、本発明の特定のタンパク質を特に例示してきた。これらタンパク質は本発明のタンパク質の単なる具体例であるため、本発明が、例示されているタンパク質と同一または同様の殺有害生物活性を有する変種または均等なタンパク質（および均等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むことが容易に明らかとなるべきである。均等なタンパク質は、例示されているタンパク質とアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸同一性は、通常７５％を超え、９０％を超え、また、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超えることができる。アミノ酸同一性は、生物活性の原因となる、あるいは最終的に生物活性の原因となる三次元配置の決定に関与する、タンパク質の重要領域において最も高くなる。この点において、これらの置換が、活性に重要ではない領域において起こる場合、あるいは分子の三次元配置に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、特定のアミノ酸置換が許容でき、これを予想することができる。例えば、アミノ酸は、次のクラス、無極性、無電荷極性、塩基性および酸性に分類することができる。あるクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸に置き換える保存的置換は、置換が化合物の生物活性を実質的に変化させない限り本発明の範囲内に収まる。次に、各クラスに属すアミノ酸の具体例のリストを示す。場合によっては、非保存的置換が行われてもよい。重要な要素は、これらの置換が、タンパク質の生物活性を有意に損なってはならないことである。
【００２７】
【表１】
【００２８】
植物の形質転換。本発明の殺虫性タンパク質の産生のための好ましい組換え宿主は、形質転換植物である。本明細書に開示されている通り、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする遺伝子は、本技術分野でよく知られた様々な技法を用いて植物細胞へと挿入することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）における複製システムおよび形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、外来遺伝子の高等植物への挿入の準備に利用できる。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４をとりわけ含む。従って、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、ベクターの適切な制限部位に挿入することができる。その結果生じたプラスミドを大腸菌（E. coli）の形質転換に用いた。大腸菌（E. coli）細胞を適切な栄養培地中で培養し、続いて収集し溶解する。プラスミドを回収する。解析方法として一般に、配列解析、制限酵素解析（restriction analysis）、電気泳動その他の生化学的・分子生物学的方法が行われる。各操作の後、用いたＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列と連結することができる。各プラスミド配列は、同一または他のプラスミドにクローニングすることができる。所望の遺伝子の植物への挿入方法に応じて、他のＤＮＡ配列が必要となり得る。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドが植物細胞の形質転換に用いられる場合、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側境界、多くの場合右および左側境界は、挿入される遺伝子のフランキング領域として連結している必要がある。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は、集中的に研究されてきており、欧州特許第１２０５１６号明細書、Lee and Gelvin（2008）、Hoekema（1985）、Fraleyら（1986）およびAnら（1985）に十分に記載されており、本技術分野において十分に確立されている。
【００２９】
挿入ＤＮＡは、植物ゲノムに組込まれると比較的安定的になる。形質転換ベクターは通常、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン等、殺生物剤または抗生物質に対する抵抗性を形質転換植物細胞に付与する選択マーカーを含有する。従って、個々に用いたマーカーは、挿入ＤＮＡを含有しない細胞よりも形質転換細胞の選択を可能にする。
【００３０】
ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために多数の技法を利用できる。これらの技法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換の媒体として用いたＴ−ＤＮＡによる形質転換、融合、インジェクション、遺伝子銃（微粒子銃）またはエレクトロポレーションと、他の可能な方法を含む。アグロバクテリウム細菌が形質転換に用いられる場合、挿入されるＤＮＡは、特殊なプラスミド、すなわち中間型ベクター（intermediate vector）またはバイナリーベクターのいずれかにクローニングする必要がある。中間型ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ内の配列と相同的な配列による相同組換えによりＴｉまたはＲｉプラスミドに組込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの伝達に必要とされるｖｉｒ領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム細菌において自己複製できない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミド（接合）によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に伝達することができる。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）とアグロバクテリウム細菌の両方において自己複製できる。これは、右および左側のＴ−ＤＮＡ境界領域によって画定される選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これは、アグロバクテリウム細菌へと直接的に形質転換することができる（Holstersら、1978）。宿主細胞として用いたアグロバクテリウム（Agrobacterium）属は、ｖｉｒ領域を有するプラスミドを含む必要がある。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への伝達に必要である。追加的なＴ−ＤＮＡを含有してよい。このように形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換に用いられる。植物外植片は、ＤＮＡの植物細胞への伝達のためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と共に有利に培養することができる。次に、選択用の抗生物質または殺生物剤を含有し得る適切な培地において、感染した植物材料（例えば、葉片、茎のセグメント、根、さらにはプロトプラストまたは懸濁培養細胞）から植物体全体を再生させることができる。次に、このようにして得られた植物体を挿入ＤＮＡの存在に関して試験することができる。インジェクションおよびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに関して特段の定めはない。例えばｐＵＣ派生体等、通常のプラスミドを用いることが可能である。
【００３１】
形質転換細胞は、通常の様式で植物内において増殖する。これは、生殖細胞を形成し、形質転換された形質（複数可）を後代植物に伝達することができる。このような植物は、通常の様式で育成し、同一の形質転換された遺伝要素または他の遺伝要素を有する植物と交雑することができる。その結果生じた雑種個体は、対応する表現型上の性質を有する。
【００３２】
本発明の好ましい一実施形態において、植物は、コドン使用が植物に最適化された遺伝子で形質転換される。例えば、これにより本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第５，３８０，８３１号明細書を参照されたし。本明細書において数例の切断型毒素が例示されているが、Ｂｔ技術分野においてよく知られていることに、１３０ｋＤａ型（全長）毒素は、コア毒素であるＮ末端側半分およびプロトキシン「テール部（tail）」であるＣ末端側半分を有する。よって、適切な「テール部」は、本発明の切断型／コア毒素と共に用いることができる。例えば、米国特許第６，２１８，１８８号明細書および米国特許第６，６７３，９９０号明細書を参照されたし。さらに、植物において用いるための合成Ｂｔ遺伝子を作製するための方法は、本技術分野において公知のものである（Stewart and Burgin、2007）。好ましい形質転換植物の非限定的な一例として、Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含み、Ｃｒｙ１Ｂｅタンパク質をコードする第二の植物発現可能遺伝子をさらに含む稔性を有するトウモロコシ植物が挙げられる。
【００３３】
Ｃｒｙ１ＤａおよびＣｒｙ１Ｂｅにより決定される形質（複数可）の自殖（inbred）トウモロコシ系統への伝達（または遺伝子移入）は、反復（recurrent）選択育種、例えば戻し交雑により達成することができる。この場合、先ず、所望の反復親を、Ｃｒｙ１ＤおよびＣｒｙ１Ｃにより決定される形質の適切な遺伝子（複数可）を有するドナー自殖系（非反復親）と交雑する。次に、この交雑の後代を反復親と戻し交配し、続いてその結果生じた後代において、非反復親から伝達される所望の形質（複数可）を選択する。所望の形質（複数可）を選択しつつ反復親と戻し交雑してから３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の後、後代は、伝達された形質（複数可）を制御する遺伝子座に関してヘテロ接合型となるが、他の遺伝子に関しては大部分またはほぼ全てが反復親と同様のものとなる（例えば、Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops、第４版、172〜175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development、１巻: Theory and Technique、360〜376を参照）。
【００３４】
昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略。例えば、Roushらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための、「ピラミッド化（pyramiding）」または「スタッキング」とも称される２毒素戦略について概要を述べる（The Royal Society、Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353、1777〜1786）。
【００３５】
米国環境保護局（the United States Environmental Protection Agency）は、そのウェブサイト（epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm）において、標的有害生物に対し活性を有する単一のＢｔタンパク質を産生するトランスジェニック作物と共に用いるための、非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区画）を設置するための次の要件を公開する。
「コーンボーラーから保護されたＢｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品のための特定の構造化された要件は次の通りである。
構造化された緩衝帯：コーンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔトウモロコシ緩衝帯、２０％
コットンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔ緩衝帯、５０％
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大限に高めるための、Ｂｔ圃場の１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内にある別の圃場）
圃場内帯状地（strip）
帯状地は、幼生移動の効果を低減するために少なくとも４列幅（好ましくは６列）である必要がある」
【００３６】
さらに、全米トウモロコシ生産者協会（National Corn Growers Association）も、そのウェブサイト：
（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）
において、緩衝帯要件に関する同様の指針、例えば次の事項を提示する。
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
− 緩衝帯雑種をトウモロコシ畑の少なくとも２０％に植えること
− ワタ生産区域において、緩衝帯は５０％でなければならない
− 緩衝帯雑種の１／２マイル以内に植えなければならない
− 緩衝帯はＢｔ圃場内に帯状地として設置することができる；緩衝帯は、少なくとも４列幅でなければならない
− 標的昆虫に対して経済的許容限界に達した場合のみ、緩衝帯を従来の殺有害生物剤で処理してよい
− Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤は、緩衝帯トウモロコシに用いることができない
− Ｂｔトウモロコシの農場毎に適切な緩衝帯を設置しなければならない」
【００３７】
Ｒｏｕｓｈらによって記述された通り（例えば、１７８０および１７８４頁右段）、それぞれ標的有害生物に対して有効であり、交差抵抗性がほとんどないまたは全くない２種の異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小規模の緩衝帯の使用を可能にする。Ｒｏｕｓｈは、成功したスタックにおける１０％未満の緩衝帯の緩衝帯サイズは、単一（非ピラミッド化）形質における約５０％の緩衝帯に匹敵する抵抗性管理をもたらし得ることを示唆する。現在利用できるピラミッド化したＢｔトウモロコシ製品に対し、米国環境保護局は、単一形質の製品（概して２０％）よりも有意に少ない（概して５％）非Ｂｔトウモロコシの構造化された緩衝帯の植え付けを要求する。
【００３８】
Ｒｏｕｓｈら（上記参照）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書にさらに記載されている通り、圃場における様々な幾何級数的栽植パターン（上述）や種子同梱袋（in-bag seed mixture）等、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な仕方が存在する。
【００３９】
上述のパーセンテージまたは類似の緩衝帯比率は、対象の二重もしくは三重スタックまたはピラミッドに用いることができる。単一の標的有害生物に対し３種の作用機序を備える三重スタックに関して、目標はゼロ緩衝帯（または例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、商業的地所、例えば１０エーカーを超えるものに特に当てはまる。
【００４０】
本明細書に参照または引用されているあらゆる特許、特許出願、仮出願および刊行物は、本明細書に明示されている教示と不一致とならない範囲まで、ここに本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全体を援用する。
【００４１】
特に示唆または暗示されていなければ、単数形の用語は、本明細書において「少なくとも１個」を示す。
【００４２】
次に、本発明の実施のための手順を説明する実施例を示す。これらの実施例は、限定的なものとして解釈するべきではない。他に断りがなければ、あらゆるパーセンテージは重量で表し、あらゆる溶媒混合物の割合は容量で表す。あらゆる温度はセ氏で表す。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
Ｃｒｙタンパク質の１２５Ｉ標識
Ｃｒｙ毒素のヨウ素化。精製した切断型Ｃｒｙ毒素を、ヨードビーズまたはヨードゲン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてヨウ素化した。すなわち、２種のヨードビーズを５００μｌのリン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、鉛の遮蔽物の背後の１．５ｍｌ遠心分離チューブ内に置いた。そこに１００μｌのＰＢＳを加えた。ドラフト（hood）内で適切な放射性取り扱い技法を用いて、０．５ｍＣｉ Ｎａ１２５Ｉ（１７．４Ｃｉ／ｍｇ、ロット０１１４、Ａｍｅｒｓｈａｍ）をヨードビーズの入ったＰＢＳ溶液に添加した。成分を５分間室温にて反応させ、次に２〜２５μｇの高純度切断型Ｃｒｙタンパク質を溶液に添加し、さらに３〜５分間反応させた。ヨードビーズから溶液を除去し、それをＰＢＳで平衡化した０．５ｍｌ脱塩Ｚｅｂａスピンカラム（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）へとアプライすることによって反応を終結させた。ヨードビーズを各１０μｌのＰＢＳで２回洗浄し、この洗浄液も脱塩カラムにアプライした。１，０００×ｇで２分間の遠心分離によって、脱塩カラムから放射性溶液を溶出した。この手順を用いて、先ず、小容量の０．５ｍｌポリミキシンカラムに複数回通すことによって１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）中のｃｒｙ毒素からリポ多糖（ＬＰＳ）を取り除いた。ヨードゲンチューブ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）に、ＬＰＳ不含Ｃｒｙ１Ｄａ毒素を２０μｇ添加し、次に０．５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉを添加した。反応混合物を１５分間２５℃で振盪した。チューブから溶液を除去し、５０μｌの０．２Ｍ非放射標識ＮａＩを添加して反応を停止した。タンパク質をＰＢＳに対しバッファーを３回交換しつつ透析し、非結合１２５Ｉを完全に除去した。
【００４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ホスホロイメージング（phosphorimaging）およびガンマカウントにより、ヨウ素化Ｃｒｙタンパク質の放射性純度を決定した。すなわち、２μｌの放射性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離後、メーカーの説明書に従ってＢｉｏＲａｄゲル乾燥装置を用いてゲルを乾燥した。乾燥したゲルをＭｙｌａｒフィルム（１２μｍ厚）に包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓストレージホスホロスクリーン（storage phosphor screen）（３５ｃｍ×４３ｃｍ）下に１時間曝露することによって撮像した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ８２０ホスホロイメージャー（phosphorimager）を用いてプレートを現像し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを用いて撮像解析した。放射性バンドをバンドの直ぐ上および下の部分と共にかみそりの刃を用いてゲルから切り出し、ガンマカウンターにおいてカウントした。放射活性は、Ｃｒｙタンパク質バンドと、バンドの下部分のみから検出された。バンドの上方からは放射活性は検出されず、この結果は、全放射性混入物が、切断型Ｃｒｙタンパク質よりも小分子のタンパク質成分からなることを示唆した。これらの成分は、ほぼ確実に分解産物を表す。
【００４５】
〔実施例２〕
ＢＢＭＶ調製プロトコール
可溶化ＢＢＭＶの調製および分画。終齢スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）またはアメリカタバコガ（Heleothis. zea）幼虫を一晩絶食させ、次に、朝に氷上で１５分間冷却した後に解剖した。外皮に付着した後腸を残して、中腸組織を体腔から取り出した。サプライヤーの推奨通り希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇｍａ Ｐ−２７１４）を補充した９×容量の氷冷ホモジナイゼーションバッファー（３００ｍＭマンニトール、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１７ｍＭ ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ７．５）に中腸を置いた。ガラス組織ホモジナイザーを１５往復（stroke）させることにより組織をホモジナイズした。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒ（１９９３）のＭｇＣｌ２沈殿法によりＢＢＭＶを調製した。すなわち、等容量の３００ｍＭマンニトール中２４ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間攪拌し、氷上で１５分間静置した。溶液を２，５００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離した。上清を取り分け、元の容量の０．５×希釈したホモジナイゼーションバッファーにペレットを懸濁し、再度遠心分離した。２つの上清を組み合わせ、２７，０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離してＢＢＭＶ画分を生成した。ペレットを１０ｍｌのホモジナイゼーションバッファーに懸濁し、プロテアーゼ阻害剤を補充し、２７，０００×ｇで３０分間、４℃にて再度遠心分離してＢＢＭＶを洗浄した。その結果得られたペレットを約３ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度となるようＢＢＭＶ保存バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質としたＢｒａｄｆｏｒｄ法（１９７６）を用いてタンパク質濃度を決定した。試料を凍結する前に、Ｓｉｇｍａアッセイを用いてメーカーの説明書に従ってアルカリホスファターゼ決定を行った。ＢＢＭＶ画分におけるこのマーカー酵素の特異活性は、通常、中腸ホモジネート画分に観察されるものと比べて７倍増加した。ＢＢＭＶを２５０μｌ試料のアリコートに分注し、液体Ｎ２中で手早く凍結し、−８０℃で保存した。
（１カクテル成分の終濃度（μＭ表記）は、ＡＥＢＳＦ（５００）、ＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）、ベスタチン（３２）、Ｅ−６４（０．３５）、ロイペプチン（０．２５）およびアプロチニン（０．０７５）である。）
【００４６】
〔実施例３〕
１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質のＢＢＭＶタンパク質との結合を測定する方法
１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質のＢＢＭＶとの結合。結合アッセイにおいて用いるＢＢＭＶタンパク質の最適量を決定するため、飽和曲線を作成した。１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙタンパク質（０．５ｎＭ）を、結合バッファー（８ｍＭ ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中で０〜５００μｇ／ｍｌ範囲の様々な量のＢＢＭＶタンパク質と１時間、２８℃でインキュベートした。総容量は０．５ｍｌであった。１．５ｍｌ遠心分離チューブから５００μｌ遠心分離チューブへと、１５０μｌの反応混合液を３回複製して試料採取し、試料を１４，０００×ｇで６分間、室温にて遠心分離することによって、結合型１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質を非結合型から分離した。上清を穏やかに除去し、ペレットを氷冷した結合バッファーで穏やかに３回洗浄した。ペレットの入った遠心分離チューブの底を切り出し、１３×７５ｍｍガラス培養管内に置いた。試料をガンマカウンターにおいて各５分間カウントした。試料に含まれるカウントは、バックグラウンドカウント（タンパク質なしの反応）から差し引かれ、ＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。用いるタンパク質の最適量を０．１５ｍｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質と決定した。
【００４７】
結合反応速度を決定するため、飽和曲線を作成した。すなわち、ＢＢＭＶ（１５０μｇ／ｍｌ）を、０．０１から１０ｎＭ範囲の増加濃度の１２５Ｉ Ｃｒｙ毒素と１時間、２８℃でインキュベートした。１５０μｌの各濃度を３回複製して試料採取し、上述通りに試料を遠心分離してカウントすることにより、合計結合を決定した。１，０００ｎＭの相同のトリプシン処理非放射活性Ｃｒｙ毒素を反応混合物に添加してあらゆる非特異的受容体結合部位を飽和させつつ、同じ仕方で非特異的結合を決定した。合計結合と非特異的結合との間の差異として、特異的結合を算出した。
【００４８】
１５０μｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質および０．５ｎＭの１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙタンパク質を用いて相同および異種競合結合アッセイを行った。反応混合物に添加した競合的非放射標識Ｃｒｙ毒素の濃度は、０．０４５から１，０００ｎＭの範囲であり、真の結合競合を確実にするため、放射活性リガンドと同時に添加した。インキュベーションは１時間、２８℃で行い、その受容体毒素と結合した１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質の量は、非特異的結合を差し引いて上述通りに測定した。１００パーセント合計結合は、競合相手のリガンドなしで決定した。結果は、片対数プロットにおいてパーセント合計特異的結合対、添加した競合的リガンド濃度としてプロットした。
【００４９】
〔実施例４〕
結果の概要
図１は、ＥＣＢ由来のＢＢＭＶにおける１２５Ｉ Ｃｒｙ１Ａｂ（０．５ｎＭ）のパーセント特異的結合対、非標識の相同Ｃｒｙ１Ａｂ（◆）および異種Ｃｒｙ２Ａａ（□）による競合を示す。Ｃｒｙ１Ａｂによる相同的競合の置き換え曲線は、約３ｎＭのＣｒｙ１Ａｂにおいて放射性リガンドの５０％置き換えを示すＳ字形曲線を形作った。１，０００ｎＭ（置き換えられる１２５Ｉ Ｃｒｙ１Ａｂより２，０００倍高濃度）の濃度のＣｒｙ２Ａａは、５０％未満の置き換えをもたらした。エラーバーは、３回複製による決定から得られた数値範囲を表す。
【００５０】
（参考文献）
Wolfersberger, M.G., (1993), Preparation and Partial Characterization of Amino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut ofthe Gypsy Moth (Lyniantria Dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol. 24: 139-147.
Liang, Y., Patel, S.S., and Dean, D.H., (1995), Irreversible Binding Kinetics of Bacillus thuringiensis Cry lA Delta-Endotoxins to Gypsy Moth Brush Border Membrane Vesicles is Directly Correlated to Toxicity. J. Bioi. Chern., 270, 24719-24724.
【００５１】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【表２−８】
【表２−９】
【表２−１０】
【表２−１１】
【表３−１】
【表３−２】
【背景技術】
【０００１】
人間は、トウモロコシを食料およびエネルギー用途のために栽培する。昆虫は、トウモロコシ植物を食害することによりこのような人間の努力を台無しにする。
【０００２】
現在、これら有害生物の植物内（in-plant）トランスジェニック防除は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来のＣｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする結晶（Ｃｒｙ）デルタエンドトキシン遺伝子の植物における発現により達成される。Ｃｒｙ１Ｆａは、現在、ＦＡＷおよびＥＣＢ害虫に対し抵抗性の、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製トランスジェニックトウモロコシ種子のＨｅｒｃｕｌｅｘ（商標）ブランド（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ−ＥｘｔｒａおよびＨｅｒｃｕｌｅｘ−ＲＷ）に含まれているタンパク質毒素である。このタンパク質は、昆虫の中腸に位置する特異的受容体（複数可）と結合することによって機能し、腸細胞内にポアを形成する。このようなポア形成は、昆虫の浸透圧バランス調節を妨げ、その結果昆虫に死をもたらす。
【０００３】
しかし、その腸内のＣｒｙ１Ｆａと結合する受容体の遺伝子変異により、昆虫が、Ｃｒｙ１Ｆａの作用に対する抵抗性を発達できるようになる可能性があることが懸念される。Ｃｒｙ１Ｆａ結合能の低い受容体を産生する昆虫は、Ｃｒｙ１Ｆａの活性に対し抵抗性となり、従ってこのタンパク質を発現する植物において生存することができる。
【０００４】
成長条件の植物において持続的に存在する単一のＣｒｙ毒素を用いると、昆虫の腸におけるＣｒｙ１Ｆａ毒素と結合する受容体の遺伝子変異により、昆虫が、このタンパク質の活性に対する抵抗性を発達し得るとの懸念がある。受容体のこのような変化による毒素結合の減少は、Ｃｒｙ１Ｆａの毒性の低下をもたらしかねず、これは最終的には作物において発現した際のタンパク質の有効性の低下をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質およびＣｒｙ２Ａａタンパク質をスタッキング（stacking）して、より耐久的で、これら２種の毒素いずれかの活性に対し抵抗性の昆虫を発生させる傾向がより少ない植物（特にトウモロコシまたはメイズ）を作製することに関する。これらのスタック（stack）は、ユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ）の特異的な標的化に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＥＣＢ由来のＢＢＭＶにおける１２５Ｉ Ｃｒｙ１Ａｂ（０．５ｎＭ）のパーセント特異的結合対、非標識の相同Ｃｒｙ１Ａｂ（◆）および異種Ｃｒｙ２Ａａ（□）による競合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質をスタッキングして、より耐久的で、これら２種の毒素いずれかの活性に対し抵抗性の昆虫を発生させる傾向がより少ない植物（特にトウモロコシまたはメイズ）を作製することに関する。これらのスタックは、ユーロピアンコーンボーラー（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））の特異的な標的化に用いることができる。
【０００８】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質およびＣｒｙ２Ａａタンパク質を基本のペアとする３種（以上の）タンパク質毒素の三重スタックまたは「ピラミッド（pyramid）」に関する。（「別個の作用部位」とは、所定のタンパク質のいずれも互いに交差抵抗性を生じないことを意味する。）ＥＣＢを標的とする第三のタンパク質の追加は、ＥＣＢに対する第三の作用部位を有するタンパク質を提供することができる。一部の好ましい実施形態において、第三のタンパク質はＤＩＧ−３（米国特許出願公開第２０１０−００２６９２２３号明細書を参照）、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ２ＡａおよびＣｒｙ１Ｆａからなる群から選択することができる。例えば、２００９年１２月１６日に出願されたＵＳＳＮ６１／２８４，２７８を参照されたし。米国特許出願公開第２００８−０３１１０９６号明細書も参照されたし。
【０００９】
従って、一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素は、ＥＣＢに対し３種の別個の作用部位を有する。さらに、好ましいピラミッドの組み合わせは、対象タンパク質ペアと、第三のＩＲＭタンパク質である。
【００１０】
対象ペアおよび／または三重（tripe）スタック（ＥＣＢに対し活性）は、例えばフォールアーミーワーム（fall armyworm）（ＦＡＷ）を標的化するための追加的なタンパク質と組み合わせてもよい。このようなタンパク質は、例えば、Ｖｉｐ３、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄおよび／またはＣｒｙ１Ｅを含むことができる。Ｃｒｙ１Ｂｅおよび／またはＣｒｙ１Ｆａは、ＦＡＷおよびＥＣＢの標的化に用いることもできる。
【００１１】
ＧＥＮＢＡＮＫを利用して、本明細書に開示または言及されている遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得ることができる。付録Ａを参照されたし。
【００１２】
本発明はまた、単一の標的有害生物に対し活性を有するが互いに交差抵抗性を生じない３種の殺虫性タンパク質（一部の好ましい実施形態において、Ｃｒｙタンパク質）に関する。
【００１３】
これら３種の（少なくとも）毒素を産生する植物（およびこのような植物を植え付けた地所）は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子を付け加えてもよいが、これら特定の三重スタックは、本発明において、有利にかつ驚くほどにＥＣＢに対し３種の作用部位を提供するであろう。
【００１４】
本発明のペアまたは三重スタック（および／または追加的なタンパク質の組み合わせ）は、緩衝帯（refuge）地所の要件の縮小または除外（例えば、４０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満またはさらには０％の緩衝帯）に役立つ可能性がある。よって、このように植え付けられた１０エーカーを超える圃場（field）は、本発明の範囲内に含まれる。対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは、非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター（複数可）制御下の遺伝的構築物に置かれている。対象ポリヌクレオチドは、植物における発現増強のためのコドン使用を含むことができる。
【００１５】
Ｃｒｙタンパク質に対する抵抗性を発達させる昆虫の能力に対抗するため、本出願人らは、ＥＣＢ腸におけるタンパク質受容体と非競合的に結合するＣｒｙ毒素を同定した。Ｃｒｙ１Ａｂが、ＥＣＢ幼虫の昆虫腸に位置する受容体とＣｒｙ２Ａａの結合を置き換え（displace）ないことが発見された。
【００１６】
本出願人らは、Ｃｒｙ２ＡａおよびＣｒｙ１Ａｂが、ＥＣＢ幼虫にとって有毒であるが同一受容体部位（複数可）と完全には相互作用しないことを見出した。このことは、これらの毒性が、ＥＣＢにおいて交差抵抗性になりにくいであろうことを示す。
【００１７】
よって、Ｃｒｙ１Ａｂに対する抵抗性を発達させた昆虫は、依然として例えば別の受容体部位と結合するＣｒｙ２Ａａタンパク質の毒性に対して感受性である。本出願人らは、この説を支持する生化学的データを得た。これらタンパク質の組み合わせをトランスジェニック植物において発現することにより、圃場において昆虫の抵抗性が発達する確率の低下に有用で価値のあるメカニズムを提供し、退避地（refugia）要件の減少をもたらす。本明細書に後述するデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ａｂとは別の標的部位（複数可）で相互作用するＣｒｙ２Ａａタンパク質を示し、よって、優れたスタッキングパートナーが得られるであろう。
【００１８】
Ｃｒｙ毒素と結合する昆虫腸受容体の親和性の変化によって抵抗性が発生する場合、複数のタンパク質を発現する植物において昆虫が生存できるようになるには、変化は少なくとも２種の異なる受容体で同時に生じる必要がある。この事象が発生する確率は非常に低く、従って、タンパク質に対する耐性を発達できる昆虫の区画（ward）に対するトランスジェニック産物の耐久性を増加させる。
【００１９】
本出願人らは、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質を放射性ヨウ素化し、放射性受容体結合アッセイ技法を用いて、その昆虫腸膜内に位置する推定受容体タンパク質との結合相互作用を測定した。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒの方法により、腸膜を刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）として調製した。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製のヨードビーズ（iodo beads）かヨードゲン（iodogen）処理したチューブのいずれかを用いて毒素のヨウ素化を行った。放射標識した毒素の特異活性は、およそ１〜４μＣｉ／μｇタンパク質であった。結合試験は、基本的にＬｉａｎｇ（１９９５）の手順により行った。
【００２０】
本明細書に提示しているデータは、昆虫腸内のＣｒｙ１Ａｂとは別の標的部位において相互作用する毒素を示し、従って優れたスタッキングパートナーが得られるであろう。
【００２１】
本発明は、様々な植物に用いることができる。具体例として、トウモロコシ（メイズ）、ダイズおよびワタが挙げられる。
【００２２】
本発明において有用な遺伝子および毒素は、開示されている全長配列のみならず、本明細書に特に例示されている毒素の特徴的な殺有害生物活性を保持するこれらの配列の断片、変種、変異体および融合タンパク質も含む。本明細書において、遺伝子の「変種」または「変異種」という用語は、同一毒素をコードする、あるいは殺有害生物活性を有する均等な毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において、用語「均等な毒素」は、標的有害生物に対し請求されている毒素と同一または本質的に同一の生物活性を有する毒素を意味する。
【００２３】
本明細書において、境界は、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」、N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews（1998）62巻:807〜813により、およそ９５％（例えば、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ２Ａａ）、７８％（例えば、Ｃｒｙ１ＡおよびＣｒｙ２Ａ）ならびに４５％（Ｃｒｙ１およびＣｒｙ２）の配列同一性を表す。これらのカットオフは、コアタンパク質のみに適用してもよい。
【００２４】
例示されている毒素の殺有害生物活性を保持する断片および均等物は、本発明の範囲内となるであろう。また、遺伝暗号の重複性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されているアミノ酸配列をコードし得る。同一または本質的に同一の毒素をコードするこのような代替的なＤＮＡ配列を作製することは、十分に当業者の技能範囲内のものである。これら変種のＤＮＡ配列は、本発明の範囲内である。本明細書において、「本質的に同一」の配列の言及は、殺有害生物活性に実質的な影響を与えないアミノ酸置換、欠失、付加または挿入を有する配列を意味する。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子断片もこの定義に含まれる。
【００２５】
毒素をコードする遺伝子および本発明において有用な遺伝子部分を同定するためのさらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。これらのプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。これらの配列は、適切な標識に基づいて検出可能となり得る、あるいは、国際公開第９３／１６０９４号パンフレットに記載されている通り蛍光が内在するよう作製することができる。本技術分野でよく知られている通り、プローブ分子と核酸試料が、２分子間で強固な結合を形成することによりハイブリダイズするのであれば、プローブと試料が実質的に相同であると合理的に推測することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, G. H., M. M. Manak（1987）DNA Probes、Stockton Press、ニューヨーク州ニューヨーク、169〜170頁に記載されている、本技術分野でよく知られている技法によるストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度および温度の組み合わせを数例次に示す（ストリンジェンシー増加順）。２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、室温；１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、６５℃。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが行われたか公知の様式において決定するための手段を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に係るプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準手順を用いて合成することができる。これらのヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることもできる。
【００２６】
本明細書において、本発明の特定のタンパク質を特に例示してきた。これらタンパク質は本発明のタンパク質の単なる具体例であるため、本発明が、例示されているタンパク質と同一または同様の殺有害生物活性を有する変種または均等なタンパク質（および均等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含むことが容易に明らかとなるべきである。均等なタンパク質は、例示されているタンパク質とアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸同一性は、通常７５％を超え、９０％を超え、また、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を超えることができる。アミノ酸同一性は、生物活性の原因となる、あるいは最終的に生物活性の原因となる三次元配置の決定に関与する、タンパク質の重要領域において最も高くなる。この点において、これらの置換が、活性に重要ではない領域において起こる場合、あるいは分子の三次元配置に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、特定のアミノ酸置換が許容でき、これを予想することができる。例えば、アミノ酸は、次のクラス、無極性、無電荷極性、塩基性および酸性に分類することができる。あるクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸に置き換える保存的置換は、置換が化合物の生物活性を実質的に変化させない限り本発明の範囲内に収まる。次に、各クラスに属すアミノ酸の具体例のリストを示す。場合によっては、非保存的置換が行われてもよい。重要な要素は、これらの置換が、タンパク質の生物活性を有意に損なってはならないことである。
【００２７】
【表１】
【００２８】
植物の形質転換。本発明の殺虫性タンパク質の産生のための好ましい組換え宿主は、形質転換植物である。本明細書に開示されている通り、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする遺伝子は、本技術分野でよく知られた様々な技法を用いて植物細胞へと挿入することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）における複製システムおよび形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、外来遺伝子の高等植物への挿入の準備に利用できる。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４をとりわけ含む。従って、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、ベクターの適切な制限部位に挿入することができる。その結果生じたプラスミドを大腸菌（E. coli）の形質転換に用いた。大腸菌（E. coli）細胞を適切な栄養培地中で培養し、続いて収集し溶解する。プラスミドを回収する。解析方法として一般に、配列解析、制限酵素解析（restriction analysis）、電気泳動その他の生化学的・分子生物学的方法が行われる。各操作の後、用いたＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列と連結することができる。各プラスミド配列は、同一または他のプラスミドにクローニングすることができる。所望の遺伝子の植物への挿入方法に応じて、他のＤＮＡ配列が必要となり得る。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドが植物細胞の形質転換に用いられる場合、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側境界、多くの場合右および左側境界は、挿入される遺伝子のフランキング領域として連結している必要がある。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は、集中的に研究されてきており、欧州特許第１２０５１６号明細書、Lee and Gelvin（2008）、Hoekema（1985）、Fraleyら（1986）およびAnら（1985）に十分に記載されており、本技術分野において十分に確立されている。
【００２９】
挿入ＤＮＡは、植物ゲノムに組込まれると比較的安定的になる。形質転換ベクターは通常、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン等、殺生物剤または抗生物質に対する抵抗性を形質転換植物細胞に付与する選択マーカーを含有する。従って、個々に用いたマーカーは、挿入ＤＮＡを含有しない細胞よりも形質転換細胞の選択を可能にする。
【００３０】
ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために多数の技法を利用できる。これらの技法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換の媒体として用いたＴ−ＤＮＡによる形質転換、融合、インジェクション、遺伝子銃（微粒子銃）またはエレクトロポレーションと、他の可能な方法を含む。アグロバクテリウム細菌が形質転換に用いられる場合、挿入されるＤＮＡは、特殊なプラスミド、すなわち中間型ベクター（intermediate vector）またはバイナリーベクターのいずれかにクローニングする必要がある。中間型ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ内の配列と相同的な配列による相同組換えによりＴｉまたはＲｉプラスミドに組込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの伝達に必要とされるｖｉｒ領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム細菌において自己複製できない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミド（接合）によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に伝達することができる。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）とアグロバクテリウム細菌の両方において自己複製できる。これは、右および左側のＴ−ＤＮＡ境界領域によって画定される選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これは、アグロバクテリウム細菌へと直接的に形質転換することができる（Holstersら、1978）。宿主細胞として用いたアグロバクテリウム（Agrobacterium）属は、ｖｉｒ領域を有するプラスミドを含む必要がある。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への伝達に必要である。追加的なＴ−ＤＮＡを含有してよい。このように形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換に用いられる。植物外植片は、ＤＮＡの植物細胞への伝達のためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と共に有利に培養することができる。次に、選択用の抗生物質または殺生物剤を含有し得る適切な培地において、感染した植物材料（例えば、葉片、茎のセグメント、根、さらにはプロトプラストまたは懸濁培養細胞）から植物体全体を再生させることができる。次に、このようにして得られた植物体を挿入ＤＮＡの存在に関して試験することができる。インジェクションおよびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに関して特段の定めはない。例えばｐＵＣ派生体等、通常のプラスミドを用いることが可能である。
【００３１】
形質転換細胞は、通常の様式で植物内において増殖する。これは、生殖細胞を形成し、形質転換された形質（複数可）を後代植物に伝達することができる。このような植物は、通常の様式で育成し、同一の形質転換された遺伝要素または他の遺伝要素を有する植物と交雑することができる。その結果生じた雑種個体は、対応する表現型上の性質を有する。
【００３２】
本発明の好ましい一実施形態において、植物は、コドン使用が植物に最適化された遺伝子で形質転換される。例えば、これにより本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許第５，３８０，８３１号明細書を参照されたし。本明細書において数例の切断型毒素が例示されているが、Ｂｔ技術分野においてよく知られていることに、１３０ｋＤａ型（全長）毒素は、コア毒素であるＮ末端側半分およびプロトキシン「テール部（tail）」であるＣ末端側半分を有する。よって、適切な「テール部」は、本発明の切断型／コア毒素と共に用いることができる。例えば、米国特許第６，２１８，１８８号明細書および米国特許第６，６７３，９９０号明細書を参照されたし。さらに、植物において用いるための合成Ｂｔ遺伝子を作製するための方法は、本技術分野において公知のものである（Stewart and Burgin、2007）。好ましい形質転換植物の非限定的な一例として、Ｃｒｙ１Ｄａタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含み、Ｃｒｙ１Ｂｅタンパク質をコードする第二の植物発現可能遺伝子をさらに含む稔性を有するトウモロコシ植物が挙げられる。
【００３３】
Ｃｒｙ１ＤａおよびＣｒｙ１Ｂｅにより決定される形質（複数可）の自殖（inbred）トウモロコシ系統への伝達（または遺伝子移入）は、反復（recurrent）選択育種、例えば戻し交雑により達成することができる。この場合、先ず、所望の反復親を、Ｃｒｙ１ＤおよびＣｒｙ１Ｃにより決定される形質の適切な遺伝子（複数可）を有するドナー自殖系（非反復親）と交雑する。次に、この交雑の後代を反復親と戻し交配し、続いてその結果生じた後代において、非反復親から伝達される所望の形質（複数可）を選択する。所望の形質（複数可）を選択しつつ反復親と戻し交雑してから３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の後、後代は、伝達された形質（複数可）を制御する遺伝子座に関してヘテロ接合型となるが、他の遺伝子に関しては大部分またはほぼ全てが反復親と同様のものとなる（例えば、Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops、第４版、172〜175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development、１巻: Theory and Technique、360〜376を参照）。
【００３４】
昆虫抵抗性管理（ＩＲＭ）戦略。例えば、Roushらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための、「ピラミッド化（pyramiding）」または「スタッキング」とも称される２毒素戦略について概要を述べる（The Royal Society、Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353、1777〜1786）。
【００３５】
米国環境保護局（the United States Environmental Protection Agency）は、そのウェブサイト（epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm）において、標的有害生物に対し活性を有する単一のＢｔタンパク質を産生するトランスジェニック作物と共に用いるための、非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区画）を設置するための次の要件を公開する。
「コーンボーラーから保護されたＢｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品のための特定の構造化された要件は次の通りである。
構造化された緩衝帯：コーンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔトウモロコシ緩衝帯、２０％
コットンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔ緩衝帯、５０％
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大限に高めるための、Ｂｔ圃場の１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内にある別の圃場）
圃場内帯状地（strip）
帯状地は、幼生移動の効果を低減するために少なくとも４列幅（好ましくは６列）である必要がある」
【００３６】
さらに、全米トウモロコシ生産者協会（National Corn Growers Association）も、そのウェブサイト：
（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）
において、緩衝帯要件に関する同様の指針、例えば次の事項を提示する。
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
− 緩衝帯雑種をトウモロコシ畑の少なくとも２０％に植えること
− ワタ生産区域において、緩衝帯は５０％でなければならない
− 緩衝帯雑種の１／２マイル以内に植えなければならない
− 緩衝帯はＢｔ圃場内に帯状地として設置することができる；緩衝帯は、少なくとも４列幅でなければならない
− 標的昆虫に対して経済的許容限界に達した場合のみ、緩衝帯を従来の殺有害生物剤で処理してよい
− Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤は、緩衝帯トウモロコシに用いることができない
− Ｂｔトウモロコシの農場毎に適切な緩衝帯を設置しなければならない」
【００３７】
Ｒｏｕｓｈらによって記述された通り（例えば、１７８０および１７８４頁右段）、それぞれ標的有害生物に対して有効であり、交差抵抗性がほとんどないまたは全くない２種の異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小規模の緩衝帯の使用を可能にする。Ｒｏｕｓｈは、成功したスタックにおける１０％未満の緩衝帯の緩衝帯サイズは、単一（非ピラミッド化）形質における約５０％の緩衝帯に匹敵する抵抗性管理をもたらし得ることを示唆する。現在利用できるピラミッド化したＢｔトウモロコシ製品に対し、米国環境保護局は、単一形質の製品（概して２０％）よりも有意に少ない（概して５％）非Ｂｔトウモロコシの構造化された緩衝帯の植え付けを要求する。
【００３８】
Ｒｏｕｓｈら（上記参照）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書にさらに記載されている通り、圃場における様々な幾何級数的栽植パターン（上述）や種子同梱袋（in-bag seed mixture）等、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な仕方が存在する。
【００３９】
上述のパーセンテージまたは類似の緩衝帯比率は、対象の二重もしくは三重スタックまたはピラミッドに用いることができる。単一の標的有害生物に対し３種の作用機序を備える三重スタックに関して、目標はゼロ緩衝帯（または例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、商業的地所、例えば１０エーカーを超えるものに特に当てはまる。
【００４０】
本明細書に参照または引用されているあらゆる特許、特許出願、仮出願および刊行物は、本明細書に明示されている教示と不一致とならない範囲まで、ここに本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全体を援用する。
【００４１】
特に示唆または暗示されていなければ、単数形の用語は、本明細書において「少なくとも１個」を示す。
【００４２】
次に、本発明の実施のための手順を説明する実施例を示す。これらの実施例は、限定的なものとして解釈するべきではない。他に断りがなければ、あらゆるパーセンテージは重量で表し、あらゆる溶媒混合物の割合は容量で表す。あらゆる温度はセ氏で表す。
【実施例】
【００４３】
〔実施例１〕
Ｃｒｙタンパク質の１２５Ｉ標識
Ｃｒｙ毒素のヨウ素化。精製した切断型Ｃｒｙ毒素を、ヨードビーズまたはヨードゲン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてヨウ素化した。すなわち、２種のヨードビーズを５００μｌのリン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、鉛の遮蔽物の背後の１．５ｍｌ遠心分離チューブ内に置いた。そこに１００μｌのＰＢＳを加えた。ドラフト（hood）内で適切な放射性取り扱い技法を用いて、０．５ｍＣｉ Ｎａ１２５Ｉ（１７．４Ｃｉ／ｍｇ、ロット０１１４、Ａｍｅｒｓｈａｍ）をヨードビーズの入ったＰＢＳ溶液に添加した。成分を５分間室温にて反応させ、次に２〜２５μｇの高純度切断型Ｃｒｙタンパク質を溶液に添加し、さらに３〜５分間反応させた。ヨードビーズから溶液を除去し、それをＰＢＳで平衡化した０．５ｍｌ脱塩Ｚｅｂａスピンカラム（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）へとアプライすることによって反応を終結させた。ヨードビーズを各１０μｌのＰＢＳで２回洗浄し、この洗浄液も脱塩カラムにアプライした。１，０００×ｇで２分間の遠心分離によって、脱塩カラムから放射性溶液を溶出した。この手順を用いて、先ず、小容量の０．５ｍｌポリミキシンカラムに複数回通すことによって１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）中のｃｒｙ毒素からリポ多糖（ＬＰＳ）を取り除いた。ヨードゲンチューブ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）に、ＬＰＳ不含Ｃｒｙ１Ｄａ毒素を２０μｇ添加し、次に０．５ｍＣｉのＮａ１２５Ｉを添加した。反応混合物を１５分間２５℃で振盪した。チューブから溶液を除去し、５０μｌの０．２Ｍ非放射標識ＮａＩを添加して反応を停止した。タンパク質をＰＢＳに対しバッファーを３回交換しつつ透析し、非結合１２５Ｉを完全に除去した。
【００４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ホスホロイメージング（phosphorimaging）およびガンマカウントにより、ヨウ素化Ｃｒｙタンパク質の放射性純度を決定した。すなわち、２μｌの放射性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離後、メーカーの説明書に従ってＢｉｏＲａｄゲル乾燥装置を用いてゲルを乾燥した。乾燥したゲルをＭｙｌａｒフィルム（１２μｍ厚）に包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓストレージホスホロスクリーン（storage phosphor screen）（３５ｃｍ×４３ｃｍ）下に１時間曝露することによって撮像した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ８２０ホスホロイメージャー（phosphorimager）を用いてプレートを現像し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを用いて撮像解析した。放射性バンドをバンドの直ぐ上および下の部分と共にかみそりの刃を用いてゲルから切り出し、ガンマカウンターにおいてカウントした。放射活性は、Ｃｒｙタンパク質バンドと、バンドの下部分のみから検出された。バンドの上方からは放射活性は検出されず、この結果は、全放射性混入物が、切断型Ｃｒｙタンパク質よりも小分子のタンパク質成分からなることを示唆した。これらの成分は、ほぼ確実に分解産物を表す。
【００４５】
〔実施例２〕
ＢＢＭＶ調製プロトコール
可溶化ＢＢＭＶの調製および分画。終齢スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）またはアメリカタバコガ（Heleothis. zea）幼虫を一晩絶食させ、次に、朝に氷上で１５分間冷却した後に解剖した。外皮に付着した後腸を残して、中腸組織を体腔から取り出した。サプライヤーの推奨通り希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇｍａ Ｐ−２７１４）を補充した９×容量の氷冷ホモジナイゼーションバッファー（３００ｍＭマンニトール、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１７ｍＭ ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ７．５）に中腸を置いた。ガラス組織ホモジナイザーを１５往復（stroke）させることにより組織をホモジナイズした。Ｗｏｌｆｅｒｓｂｅｒｇｅｒ（１９９３）のＭｇＣｌ２沈殿法によりＢＢＭＶを調製した。すなわち、等容量の３００ｍＭマンニトール中２４ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間攪拌し、氷上で１５分間静置した。溶液を２，５００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離した。上清を取り分け、元の容量の０．５×希釈したホモジナイゼーションバッファーにペレットを懸濁し、再度遠心分離した。２つの上清を組み合わせ、２７，０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離してＢＢＭＶ画分を生成した。ペレットを１０ｍｌのホモジナイゼーションバッファーに懸濁し、プロテアーゼ阻害剤を補充し、２７，０００×ｇで３０分間、４℃にて再度遠心分離してＢＢＭＶを洗浄した。その結果得られたペレットを約３ｍｇ／ｍｌタンパク質の濃度となるようＢＢＭＶ保存バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質としたＢｒａｄｆｏｒｄ法（１９７６）を用いてタンパク質濃度を決定した。試料を凍結する前に、Ｓｉｇｍａアッセイを用いてメーカーの説明書に従ってアルカリホスファターゼ決定を行った。ＢＢＭＶ画分におけるこのマーカー酵素の特異活性は、通常、中腸ホモジネート画分に観察されるものと比べて７倍増加した。ＢＢＭＶを２５０μｌ試料のアリコートに分注し、液体Ｎ２中で手早く凍結し、−８０℃で保存した。
（１カクテル成分の終濃度（μＭ表記）は、ＡＥＢＳＦ（５００）、ＥＤＴＡ（２５０ｍＭ）、ベスタチン（３２）、Ｅ−６４（０．３５）、ロイペプチン（０．２５）およびアプロチニン（０．０７５）である。）
【００４６】
〔実施例３〕
１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質のＢＢＭＶタンパク質との結合を測定する方法
１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質のＢＢＭＶとの結合。結合アッセイにおいて用いるＢＢＭＶタンパク質の最適量を決定するため、飽和曲線を作成した。１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙタンパク質（０．５ｎＭ）を、結合バッファー（８ｍＭ ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中で０〜５００μｇ／ｍｌ範囲の様々な量のＢＢＭＶタンパク質と１時間、２８℃でインキュベートした。総容量は０．５ｍｌであった。１．５ｍｌ遠心分離チューブから５００μｌ遠心分離チューブへと、１５０μｌの反応混合液を３回複製して試料採取し、試料を１４，０００×ｇで６分間、室温にて遠心分離することによって、結合型１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質を非結合型から分離した。上清を穏やかに除去し、ペレットを氷冷した結合バッファーで穏やかに３回洗浄した。ペレットの入った遠心分離チューブの底を切り出し、１３×７５ｍｍガラス培養管内に置いた。試料をガンマカウンターにおいて各５分間カウントした。試料に含まれるカウントは、バックグラウンドカウント（タンパク質なしの反応）から差し引かれ、ＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。用いるタンパク質の最適量を０．１５ｍｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質と決定した。
【００４７】
結合反応速度を決定するため、飽和曲線を作成した。すなわち、ＢＢＭＶ（１５０μｇ／ｍｌ）を、０．０１から１０ｎＭ範囲の増加濃度の１２５Ｉ Ｃｒｙ毒素と１時間、２８℃でインキュベートした。１５０μｌの各濃度を３回複製して試料採取し、上述通りに試料を遠心分離してカウントすることにより、合計結合を決定した。１，０００ｎＭの相同のトリプシン処理非放射活性Ｃｒｙ毒素を反応混合物に添加してあらゆる非特異的受容体結合部位を飽和させつつ、同じ仕方で非特異的結合を決定した。合計結合と非特異的結合との間の差異として、特異的結合を算出した。
【００４８】
１５０μｇ／ｍｌのＢＢＭＶタンパク質および０．５ｎＭの１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙタンパク質を用いて相同および異種競合結合アッセイを行った。反応混合物に添加した競合的非放射標識Ｃｒｙ毒素の濃度は、０．０４５から１，０００ｎＭの範囲であり、真の結合競合を確実にするため、放射活性リガンドと同時に添加した。インキュベーションは１時間、２８℃で行い、その受容体毒素と結合した１２５Ｉ Ｃｒｙタンパク質の量は、非特異的結合を差し引いて上述通りに測定した。１００パーセント合計結合は、競合相手のリガンドなしで決定した。結果は、片対数プロットにおいてパーセント合計特異的結合対、添加した競合的リガンド濃度としてプロットした。
【００４９】
〔実施例４〕
結果の概要
図１は、ＥＣＢ由来のＢＢＭＶにおける１２５Ｉ Ｃｒｙ１Ａｂ（０．５ｎＭ）のパーセント特異的結合対、非標識の相同Ｃｒｙ１Ａｂ（◆）および異種Ｃｒｙ２Ａａ（□）による競合を示す。Ｃｒｙ１Ａｂによる相同的競合の置き換え曲線は、約３ｎＭのＣｒｙ１Ａｂにおいて放射性リガンドの５０％置き換えを示すＳ字形曲線を形作った。１，０００ｎＭ（置き換えられる１２５Ｉ Ｃｒｙ１Ａｂより２，０００倍高濃度）の濃度のＣｒｙ２Ａａは、５０％未満の置き換えをもたらした。エラーバーは、３回複製による決定から得られた数値範囲を表す。
【００５０】
（参考文献）
Wolfersberger, M.G., (1993), Preparation and Partial Characterization of Amino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut ofthe Gypsy Moth (Lyniantria Dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol. 24: 139-147.
Liang, Y., Patel, S.S., and Dean, D.H., (1995), Irreversible Binding Kinetics of Bacillus thuringiensis Cry lA Delta-Endotoxins to Gypsy Moth Brush Border Membrane Vesicles is Directly Correlated to Toxicity. J. Bioi. Chern., 270, 24719-24724.
【００５１】
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【表２−４】
【表２−５】
【表２−６】
【表２−７】
【表２−８】
【表２−９】
【表２−１０】
【表２−１１】
【表３−１】
【表３−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスジェニック植物。
【請求項２】
Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１ＩおよびＤＩＧ−３からなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
前記第三のタンパク質が、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｂｅからなる群から選択され、前記植物が、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１ＥおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される第四および第五の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
前記ＤＮＡを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の植物の種子。
【請求項５】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１〜３のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
【請求項６】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項７】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項８】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項９】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項１０】
前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項１１】
非Ｂｔ緩衝帯植物由来の緩衝帯種子および請求項４に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の４０％未満を構成する、種子混合物。
【請求項１２】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の３０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１３】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の２０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１４】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１５】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の５％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１６】
種子を播いて請求項５に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、昆虫によるＣｒｙタンパク質に対する抵抗性の発達を管理する方法。
【請求項１７】
前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、請求項５〜１０のいずれかに記載の圃場。
【請求項１８】
トウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項１９】
トウモロコシ植物である、請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれかに記載の植物の植物細胞であって、前記植物細胞が、前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡおよび前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡを含み、前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質が、配列番号１と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質が、配列番号２と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【請求項２１】
前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質が、配列番号１を含み、前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質が、配列番号２を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の植物細胞を作製する方法。
【請求項２３】
ユーロピアンコーンボーラー昆虫をＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質と接触させることによって、ユーロピアンコーンボーラー昆虫を防除する方法。
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスジェニック植物。
【請求項２】
Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１ＩおよびＤＩＧ−３からなる群から選択される第三の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
前記第三のタンパク質が、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｂｅからなる群から選択され、前記植物が、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１ＥおよびＶｉｐ３Ａｂからなる群から選択される第四および第五の殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
前記ＤＮＡを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の植物の種子。
【請求項５】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１〜３のいずれかに記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
【請求項６】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項７】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項８】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項９】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項１０】
前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項５に記載の植物圃場。
【請求項１１】
非Ｂｔ緩衝帯植物由来の緩衝帯種子および請求項４に記載の複数の種子を含む種子混合物であって、前記緩衝帯種子は混合物の全ての種子の４０％未満を構成する、種子混合物。
【請求項１２】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の３０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１３】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の２０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１４】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１５】
前記緩衝帯種子が混合物の全ての種子の５％未満を構成する、請求項１１に記載の種子混合物。
【請求項１６】
種子を播いて請求項５に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、昆虫によるＣｒｙタンパク質に対する抵抗性の発達を管理する方法。
【請求項１７】
前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、請求項５〜１０のいずれかに記載の圃場。
【請求項１８】
トウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項１９】
トウモロコシ植物である、請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれかに記載の植物の植物細胞であって、前記植物細胞が、前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡおよび前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡを含み、前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質が、配列番号１と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質が、配列番号２と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【請求項２１】
前記Ｃｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質が、配列番号１を含み、前記Ｃｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質が、配列番号２を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の植物細胞を作製する方法。
【請求項２３】
ユーロピアンコーンボーラー昆虫をＣｒｙ１Ａｂ殺虫性タンパク質およびＣｒｙ２Ａａ殺虫性タンパク質と接触させることによって、ユーロピアンコーンボーラー昆虫を防除する方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５１４７７６（Ｐ２０１３−５１４７７６Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４８４７（Ｐ２０１２−５４４８４７）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０８３１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５９０
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０８３１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５９０
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
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