本発明は、ポリヌクレオチドシードライブラリーの生成方法、並びに、組換えタンパク質の新規変異体の生成におけるこれらのライブラリーの使用、より具体的には、組換えヒト抗体の集中的なライブラリーの生成及び標的抗原との親和性結合に関するスクリーニングのための、これらのライブラリーの使用に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の特性を有する目的のタンパク質の製造方法であって、
ａ．目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードし、ＳＨＭのために最適化された、該少なくとも１つの目的の領域をコードする少なくとも１つの合成核酸配列を含む、ポリヌクレオチドのシードライブラリーを合成する工程、
ｂ．目的のタンパク質の複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで、発現ベクター中に連結する工程、
ｃ．目的のタンパク質の複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーの発現によって目的のタンパク質が産生されるように、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる宿主細胞を、該発現ベクターで形質転換する工程、
ｄ．任意で、ＡＩＤ活性を誘導するか、或いはポリヌクレオチドのシードライブラリーにＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程、
ｅ．所望の特性を有する変異タンパク質を発現する、細胞集団内の単一又は複数の細胞を同定する工程、並びに
ｆ．工程（ｅ）で同定した単一又は複数の細胞から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程
を含む方法。
【請求項２】
所望の特性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法であって、
ａ．少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを有する複数の１以上の抗体重鎖タンパク質又はフラグメントをコードし、ＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲをコードする少なくとも１つの第一の合成核酸配列を含む、第一のポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程、
ｂ．少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを有する複数の１以上の抗体軽鎖タンパク質又はフラグメントをコードし、ＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲをコードする少なくとも１つの第二の合成核酸配列を含む、第二のポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程、
ｃ．複数の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリー、並びに複数の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで発現ベクター中に連結する工程、
ｄ．同じ又は異なる発現ベクター上の、複数の抗体重鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーからの重鎖配列、及び複数の抗体軽鎖タンパク質又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーからの軽鎖配列の共発現によって、抗体又はその抗原結合フラグメントが産生されるように、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる宿主細胞を、該発現ベクターで形質転換する工程、
ｅ．任意で、ＡＩＤ活性を誘導するか、或いはポリヌクレオチドのシードライブラリーにＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程、
ｆ．所望の特性を有する変異した抗体又はその抗原結合フラグメントを発現する、細胞集団内の単一又は複数の細胞を同定する工程、並びに
ｇ．工程（ｆ）で同定した単一又は複数の細胞から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程
を含む方法。
【請求項３】
複数のタンパク質を同時に進化させる方法であって、
ａ．第一の目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードし、ＳＨＭのために最適化された、少なくとも１つの第一の目的の領域をコードする少なくとも１つの第一の合成核酸配列を含む、ポリヌクレオチドの第一のシードライブラリーを合成する工程、
ｂ．第二の目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードし、少なくとも１つの第二の目的の領域をコードしかつＡＩＤ介在性の体細胞超変異のための基質として作用するように改変された少なくとも１つの第二の合成核酸配列を含む、ポリヌクレオチドの第二のシードライブラリーを合成する工程、
ｃ．第一の目的のタンパク質の複数の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリー、並びに第二の目的のタンパク質の複数の目的のポリペプチド種をコードするポリヌクレオチドのシードライブラリーを、作動可能な組合せで発現ベクター中に連結する工程、
ｄ．第一及び第二の目的のタンパク質が、同じ又は異なる発現ベクター上の、ポリヌクレオチドの第一及び第二のシードライブラリーの共発現によって産生されるように、ＡＩＤを発現するか、或いは誘導因子の添加によってＡＩＤを発現するように誘導できる宿主細胞を、該発現ベクターで形質転換する工程、
ｅ．任意で、ＡＩＤ活性を誘導するか、或いはポリヌクレオチドのシードライブラリーにＡＩＤ介在性の変異誘発を起こさせる工程、
ｆ．所望の特性を有する変異した第一及び第二の目的のタンパク質を発現する、細胞集団内の単一又は複数の細胞を同定する工程、並びに
ｇ．工程（ｆ）で同定した単一又は複数の細胞から、１以上のクローン性細胞集団を樹立する工程
を含む方法。
【請求項４】
合成核酸配列が、好ましくないコドンの密度を低下させることによってＳＨＭのために最適化されている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの第一又は第二の合成核酸配列が、好ましくないコドンの密度を低下させることによってＳＨＭのために最適化されている、請求項２又は３記載の方法。
【請求項６】
合成核酸配列が、１以上のＷＡＣモチーフ、１以上のＷＲＣモチーフ又はそれらの組み合わせの挿入によってＳＨＭのために最適化されている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの第一又は第二の合成核酸配列が、１以上のＷＡＣモチーフ、１以上のＷＲＣモチーフ又はそれらの組み合わせの挿入によってＳＨＭのために最適化されている、請求項２又は３記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの合成核酸配列が、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によってＳＨＭのために最適化されている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの第一又は第二の合成核酸配列が、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によってＳＨＭのために最適化されている、請求項２又は３記載の方法。
【請求項１０】
１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入が、目的の領域における１以上のアミノ酸置換の挿入によるものであり、該アミノ酸置換がサイレント、保存的、半保存的、非保存的又はそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入が、第一又は第二の目的の領域における１以上のアミノ酸置換の挿入によるものであり、該アミノ酸置換がサイレント、保存的、半保存的、非保存的又はそれらの組み合わせである、請求項２又は３記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
原核細胞が大腸菌細胞である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
真核細胞が哺乳動物細胞又は酵母細胞である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドのシードライブラリーが、ＳＨＭ耐性になった少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドの第一又は第二のシードライブラリーが、ＳＨＭ耐性になった少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２又は３記載の方法。
【請求項１７】
目的のタンパク質の目的の領域を少なくとも１つ有する複数の１以上の目的のポリペプチド種をコードし、１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入によってＳＨＭのために最適化された、該少なくとも１つの目的の領域をコードする少なくとも１つの合成核酸配列を含む、ポリヌクレオチドのシードライブラリーを含む組成物。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドのシードライブラリーが、ＳＨＭ耐性になった少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
合成核酸配列が、好ましくないコドンの密度を低下させることによってＳＨＭのために最適化されている、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
１以上の好ましいＳＨＭコドンの挿入が、目的の領域への１以上のアミノ酸置換の挿入によるものであり、該アミノ酸置換がサイレント、保存的、半保存的、非保存的又はそれらの組み合わせである、請求項１７記載の組成物。
【請求項２１】
合成核酸配列が、１以上のＷＡＣモチーフ、１以上のＷＲＣモチーフ又はそれらの組み合わせの挿入によってＳＨＭのために最適化されている、請求項１７記載の組成物。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドのシードライブラリーが、抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする、請求項１７記載の組成物。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドのシードライブラリーが、抗体重鎖又はそのフラグメントをコードする、請求項１７記載の組成物。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドのシードライブラリーが、抗体軽鎖又はそのフラグメントをコードする、請求項１７記載の組成物。
【請求項２５】
抗体重鎖が、図２０Ａの抗体重鎖から選択される可変領域を含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
抗体重鎖が、ＩＧＨＶ６−１、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ３−３０−３、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ１−２及びＩＧＨＶ１−６９からなる群より選択される可変領域を含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
抗体軽鎖が、図２０Ｂの抗体軽鎖から選択される可変領域を含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２８】
抗体軽鎖が、ＩＧＫＶ２Ｄ−３０、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ１−３３、ＩＧＫＶ１Ｄ−３９及びＩＧＫＶ３−２０からなる群より選択されるκ軽鎖可変領域を含む、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
抗体軽鎖が、図２０Ｃの抗体軽鎖から選択されるλ可変領域を含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項３０】
抗体軽鎖が、ＩＧＫＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ２−１１及びＩＧＬＶ３−２１からなる群より選択されるλ軽鎖可変領域を含む、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
少なくとも１つの目的の領域が、抗体重鎖又は軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項３２】
少なくとも１つの目的の領域が、抗体重鎖又は軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項３３】
目的のタンパク質が受容体、酵素、補因子又は転写因子である、請求項１７記載の組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５−１】

【図１５−２】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２０Ｃ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６Ａ】

【図３６Ｂ】

【図３６Ｃ】

【図３６Ｄ】

【図３６Ｅ】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３−１】

【図５３−２】

【公表番号】特表２０１０−５１８８５９（Ｐ２０１０−５１８８５９Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５０９３５（Ｐ２００９−５５０９３５）
【出願日】平成２０年２月２０日（２００８．２．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２３９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０３４７４
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．フロッピー
【出願人】（５０９２３４８５８）アナプティスバイオ　インコーポレイティッド (3)
【Ｆターム（参考）】