ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法
【課題】ＰＣＲを用いてラクトコッカス・ラクティス亜種を検出する方法、及び当該方法に好適なプライマーを含むキットの提供。
【解決手段】（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程と、を有するラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、前記ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法に用いられるプライマー。当該プライマーを含むラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キット。
【解決手段】（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程と、を有するラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、前記ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法に用いられるプライマー。当該プライマーを含むラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）を検出する方法、並びに、該方法に好適なプライマーを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトコッカス・ラクティス亜種は、自然界に広く存在する中温性乳酸菌であり、古くから、チーズをはじめとする発酵乳製品に幅広く用いられている。現在、ラクトコッカス・ラクティス亜種は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）の３亜種に分類されている。
【０００３】
近年では、特徴的な菌株を用いることによって特徴的な風味を有する乳発酵製品を作る試みも複数報告されている（例えば、特許文献１参照。）。また、乳酸菌及びその発酵物は、腸管内の腐敗防止作用など様々な生理活性を有することが報告されている。例えばラクトコッカス属菌では、プロテアーゼ処理した乳製品に、グルタミン酸デカルボキシラーゼ産生能を有するラクトコッカス属菌を接種して培養することにより、血圧低下作用を有するγーアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含有する発酵乳を製造する方法が報告されている（例えば、特許文献２参照。）。また、老化抑制作用と密接な関わりがある抗酸化能を有するラクトコッカス属菌も報告されている（例えば、特許文献３参照。）。このような様々な生理活性を有する菌株は、産業的価値の非常に高い乳酸菌として注目されている。
【０００４】
新しい乳酸菌株を自然界から得るためには、多種多様の微生物から分離・同定を行う必要がある。一般的に菌種の同定方法は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、発酵生産物、一般生物学的性状等を検査することにより行われている。しかしながら、表現形質を基にした同定法は、操作が煩雑であり、かつ多大な時間と労力を要し、さらに試験者の熟練を必要とする。また、乳酸菌の中には継代することで複数のコロニー形態を有する菌株が存在するため、コロニー形態から株を同定するには限界がある。
【０００５】
近年では分子生物学的手法の進歩により、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく菌種同定方法が普及し、この遺伝子をターゲットとするプライマーが多く報告されている。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列には、９箇所の可変領域が存在し、それぞれＶ１〜９領域と呼ばれている。これらの可変領域は、一般的に菌種特異的な配列であることが知られており（例えば、非特許文献１参照。）、このため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のなかでも、可変領域をターゲットとする菌種特異的なプライマーが多く報告されている。
【０００６】
一方で、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、菌株によって若干の違いを有している場合もあるが、多くは菌種特異的である。例えば、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ １９４３５株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、同一亜種に属するＳＫ１１株やＮＩＲＤ ９２４株との相同性が１００％である。このように、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は菌種特異的であることから、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて設計されたプライマーを用いて菌株を同定することは非常に困難である。このため、同一菌種に属する複数の菌株を区別するためには、別途菌株同定試験を行う必要がある。
【０００７】
菌種や菌株を同定するための一般的な分子生物学的手法としては、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）法、ｒｅｐ−ＰＣＲ（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ＰＣＲ）法、リボタイピング法、ＰＦＧＥ（ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＭＬＳＡ（Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）法などが挙げられる。このうち、リボタイピング法、ＰＦＧＥ法、及びＭＬＳＡ法は、菌株の識別能力は高いが、特別な装置を必要とする。また、ＲＦＬＰ法は、特別な装置は必要としないが、菌株を区別するには精度が不十分である。ＲＡＰＤ法及びｒｅｐ−ＰＣＲ法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応のみによって実施することが出来、さらに、用いるプライマー次第では菌株の識別能力も高いと考えられる。例えば、ラクトコッカス・ラクティス亜種では、ＲＡＰＤ法を用いて菌株特異的なＤＮＡマーカーを検索した結果、ＰＣＲ法により、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスの複数の菌株の中から、クレモリスＦＣ株のみを検出することができるプライマーが報告されている（例えば、特許文献４参照。）。
【０００８】
但し、菌種や菌株を十分な精度で同定可能なＰＣＲ用のプライマーを設計・作製することは非常に困難である。例えば、ＢＯＸＡ１Ｒプライマー（５’−ＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧ−３’）を用いてｒｅｐ−ＰＣＲを行うことにより、菌種特異的なバンドが検出されることが報告されているが（例えば、非特許文献２参照。）、複数の菌種間で共通して検出されるバンドも多く存在し、確実な菌種同定方法とは言い難い。
【０００９】
また、これらの方法では、菌種と菌株のいずれか一方を同定することができるものの、菌種と菌株とを共に同定することは難しく、これまでの報告では、菌種と菌株を同時に区別することができる方法はなかった。このため、従来は、菌種の同定を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく同定方法により行い、菌株の同定をＲＡＰＤ法などによる菌株の同定方法により行うというように、２段階の手法によって、菌種・菌株を同定する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１０９７５６号公報
【特許文献２】特開２００１−１２０１７９号公報
【特許文献３】特開２００６−２５６９９３号公報
【特許文献４】特開２００７−２４４３４８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Jean-Marc Neefs、他４名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第２１巻、第３０２５〜３０４９ページ、１９９３年。
【非特許文献２】Patricio J. De Urraza、他４名、ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ（Journal of Dairy Research）、第６７巻、第３８１〜３９２ページ、２０００年。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＰＣＲを用いてラクトコッカス・ラクティス亜種を検出する方法、及び当該方法に好適なプライマーを含むキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラクトコッカス・ラクティス亜種の複数株におけるゲノム配列情報から、ラクトコッカス・ラクティス亜種のみに特異的に存在する繰り返し配列を見出し、この繰り返し配列に基づいて、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株のみを検出し得るプライマーを設計することにより、発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１） ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）を検出する方法であって、
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程と、
を有することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（２） 前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする前記（１）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（３） 前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）として同定することを特徴とする前記（２）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（４） 前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）として同定することを特徴とする前記（２）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（５） さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程と、
を有することを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（６） 前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（５）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（７） 前記工程（ｂ）においてＰＣＲ産物が検出され、かつ前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（５）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（８） ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）に属する微生物の菌株を同定する方法であって、
２種以上の被験菌に対して、それぞれ、下記工程（ａ）及び（ｂ’）を行い、下記工程（ｂ’）により得られたバンドパターンを被験菌間で比較することにより、当該被験菌が同じ菌株に属する微生物であるか否かを同定することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法：
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程、
（ｂ’） 前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程、
（９） 前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする前記（８）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法、
（１０） 前記（１）〜（７）のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるプライマーであって、
配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とするプライマー、
（１１） 前記（１）〜（７）のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるキットであって、
配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号９で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１又は複数のプライマーを含むことを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法により、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株のみを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】表１に記載のＢＯＸＡ１Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図２】表１に記載のＥＲＩＣプライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図３】表１に記載の繰り返し配列１プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図４】表１に記載の繰り返し配列２プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図５】表２に記載の各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図６】表３に記載の各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に特異的に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いることを特徴とする。このように、ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に特異的に存在する繰り返し配列利用してｒｅｐ−ＰＣＲを行うことにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができる。また、適切な検出方法を選択することにより、検出されたラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種の同定や菌株の識別もすることができる。
【００１８】
本発明及び本願明細書において、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を検出する」とは、被験菌（菌種を同定する対象の菌）がラクトコッカス・ラクティス亜種であるか否かを決定することを意味する。
また、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を同定する」とは、被験菌が、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエのいずれであるかを決定することを意味する。
また、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株を同定する」とは、被験菌が、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株のいずれの菌株と同じであるかを決定することを意味する。つまり、菌株同士が区別できればよく、必ずしも正確な菌株名を決定することは要さない。
さらに、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定」には、ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を同定することと、ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株を同定することの両方が含まれる。
【００１９】
ゲノムＤＮＡ中の繰り返し配列は、連続して存在している場合が多い。特に非翻訳領域中では、繰り返し配列がほぼ等間隔で規則的に連続して存在している場合が多い。例えば、多くの細菌の非翻訳領域には、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）という規則的に間隔があいている短い回文構造の反復座位が存在している。規則的に間隔があいて連続している領域にのみ存在する繰り返し配列を認識するプライマーを用いてＰＣＲを行った場合には、得られるＰＣＲ産物の大きさがほぼ等しくなり、ＰＣＲ産物の種類ごとに区別して検出することが困難である。
【００２０】
本発明において用いられる、ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に特異的に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマー（以下、「特異的プライマー」ということがある。）は、このような繰り返し配列が連続して存在している領域以外に、ゲノムＤＮＡ中に少なくとも１の繰り返し配列部位が存在する配列に基づいて設計されることが好ましい。中でも、少なくとも１の繰り返し配列部位が、翻訳領域に存在している配列に基づいて設計されることがより好ましい。
【００２１】
＜特異的プライマー＞
本発明においてラクトコッカス・ラクティス亜種の検出及び同定に用いる特異的プライマーは、以下の手法により設計された。
１．ラクトコッカス・ラクティス亜種に特異的に存在する繰り返し配列の探索及びプライマーの設計
まず、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する複数の菌株のゲノムの塩基配列を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の塩基配列データベースから得た。得られたゲノムの塩基配列を基にして、インシリコモレキュラークローニング（ＩＭＣ）ｖｅｒ．１．０（インシリコバイオロジー社製）を用いて、繰り返し配列を探索した。この際、非翻訳領域に連続して存在する繰返し配列としてのみ検出された配列は除外した。なぜなら検出されるバンドの長さが均一になってしまうためである。得られた配列情報の中から、ラクトコッカス・ラクティス亜種以外の細菌ゲノムに存在していない配列を選抜し、これらをターゲットとしてプライマーを設計し、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のオリゴプライマー作成サービスを利用してプライマーを合成した。その一部を表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
２．プライマーの菌種特異性の確認１
上記１．で設計・合成したプライマーが、実際にラクトコッカス・ラクティス亜種に対してのみ特異性を有しているかを確認するため、ラクトコッカス属の全菌種の基準株（Ｔｙｐｅ Ｓｔｒａｉｎ）と、比較対照としてエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌）の基準株とを鋳型とした場合のプライマー反応性を検討した。
まず、全ての細菌を、それぞれ嫌気的に一晩純粋培養した。なお、ラクトコッカス属の全菌種の培養には、Ｍ１７培地（ニッスイ社製）にブドウ糖０．５％（ｗ／ｗ）を加えた培地を用いた。エッシェリヒア・コリの培養には、ＧＡＭ培地（栄研社製）を用いた。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
次いで、抽出されたＤＮＡをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用い、表１に記載の各プライマーを用いてＰＣＲを行った。比較対照として、ｒｅｐ−ＰＣＲにおいて一般的に用いられているＢＯＸＡ１Ｒプライマー（例えば、非特許文献２参照。）やＥＲＩＣプライマーを用いて、同様にしてＰＣＲを行った。具体的には、鋳型ＤＮＡ溶液と前記いずれかのプライマーとを含み、総液量が２５μＬであるＰＣＲ反応液を、Ｅｘ Ｔａｑ(タカラバイオ社製)を用いて調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、９４℃１分間の後、９４℃３０秒間、５２℃１分間、７２℃８分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った後、さらに７２℃１６分間を行う反応条件によるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、Ｖｅｒｉｔｉ ２００(アプライド・バイオシステム社製)を用いて行った。得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドパターンを確認した。
【００２４】
図１〜４は、得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。図１はＢＯＸＡ１Ｒプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果であり、図２はＥＲＩＣプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果であり、図３は繰り返し配列１からなるプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果であり、図４は繰り返し配列２からなるプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果である。また、図１〜４中、Ｍは分子量マーカーｗｉｄｅ−ｒａｎｇｅ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ５０−１００００ｂｐ（タカラバイオ社製）、Ａはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ１９４３５Ｔ株、Ｂはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス ＮＢＲＣ １００６７６Ｔ株、Ｃはラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ ＪＣＭ１１８０Ｔ株、Ｄはラクトコッカス・ラフィノラクティス ＪＣＭ５７０６Ｔ株、Ｅはラクトコッカス・ガルビアエ ＪＣＭ１０３４３Ｔ株、Ｆはラクトコッカス・ピシウム ＪＣＭ１１０５５Ｔ株、Ｇはラクトコッカス・プランタラム ＪＣＭ１１０５６Ｔ株、Ｈはエッシェリヒア・コリ ＪＣＭ１６４９Ｔ株を、それぞれ流したレーンである。
【００２５】
この結果、ＢＯＸＡ１ＲプライマーやＥＲＩＣプライマーは、すべての菌種に反応してしまい、菌種に対する特異性は認められなかった。また、上記１．で作製したプライマーのうち、繰り返し配列３〜７からなるプライマーでも、同様に特異性を見出すことは出来なかった。繰り返し配列１からなるプライマーを用いた場合には、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する３菌株に加えて、ラクトコッカス・ラフィノラクティス及びラクトコッカス・ピシウムの基準株でもＰＣＲ産物が得られており、特異性は不十分であった。これに対して、繰り返し配列２からなるプライマーを用いた場合には、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する３菌株由来のＤＮＡを鋳型とした場合にのみＰＣＲ産物が得られた。これにより、繰り返し配列２からなるプライマーが、ラクトコッカス・ラクティス亜種に高い特異性を有しており、当該プライマーを用いることにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物のみが検出できることが確認できた。
【００２６】
３．プライマーの菌種特異性の確認２
さらに、繰り返し配列２の１９塩基の中から、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定に必要な配列を見出すために、表２に示す繰り返し配列からなるプライマーを作製し、これらのプライマーのラクトコッカス・ラクティス亜種に対する特異性を調べた。具体的には、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ１９４３５Ｔ株から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、表２に記載の各プライマーを用いて、上記２．と同様にしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のバンドパターンを検出した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
図５は、得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。図５中、「Ｍ」は図１と同じであり、各レーンに振られている番号は、用いたプライマーの繰り返し配列の番号を示す。この結果、繰り返し配列２、８〜１２からなるプライマーを用いた場合には、いずれも良好なバンドパターンが得られたが、繰返し配列１３〜１５からなるプライマーを用いた場合には、バンドパターンが得られなかった。つまり、ラクトコッカス・ラクティス亜種を特異的に認識するためには、繰り返し配列２の５’末端側から連続した１４塩基が必要であることがわかった。
【００２９】
４．プライマーの菌種・菌株識別能力の確認
上記２．及び３．において、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定が可能であると確認された繰り返し配列２からなるプライマーが、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する３菌種の識別や、菌株の識別が可能かどうかを確認した、具体的には、下記表３に記載の菌株の菌体から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、繰り返し配列２からなるプライマーを用いて、上記２．と同様にしてＰＣＲを行った。
【００３０】
【表３】
【００３１】
図６（Ａ）は、得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。図６（Ｂ）は、図６（Ａ）のバンドパターンを模式的に示した図である。図６中、「Ｍ」は図１と同じである。また、レーンＡ〜Ｆは、表３のＡ〜Ｆに記載されている菌株由来のＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の結果を示す。この結果、いずれの菌株においても、少なくとも１のバンドが検出され、少なくとも１種類のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。
【００３２】
特に、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスに属する菌株（ＮＢＲＣ １００６７６Ｔ株及びＡＴＣＣ ９６２５株）では、いずれも、９５０〜１０５０ｂｐの領域に１本の特徴的な強いバンドが検出された。また、このバンドの近傍には、その他のバンドは検出されなかった。これにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスは、この特徴的なバンドの有無を指標として、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属するその他菌種と区別できることがわかった。
【００３３】
一方で、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエは、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとは異なり、３００〜１５０００ｂｐの領域に複数のバンドが観察された。これにより、９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが検出されず、かつ３００〜１５０００ｂｐの領域のうちの９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが検出されるか否かを指標として、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエを、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスから区別できることがわかった。
【００３４】
また、図６に示す通り、菌株ごとにバンドパターンが異なっていた。これにより、繰り返し配列２からなるプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のバンドパターンを調べることにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株の同定が可能であることも確認された。
【００３５】
＜ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法＞
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマー（特異的プライマー）を用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程。
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程。
【００３６】
被験菌がラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物である場合には、特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、ＰＣＲ産物が得られるが、被験菌がラクトコッカス・ラクティス亜種以外に属する微生物である場合には、ＰＣＲ産物は検出されない。つまり、ＰＣＲ産物を検出することにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができる。
【００３７】
工程（ａ）において用いられる特異的プライマーは、前述の＜特異的プライマー＞に記載の方法により設計・製造することができる。本発明においては、表２に記載のプライマーのうち、繰り返し配列２、８〜１２のいずれかの塩基配列からなるプライマーを用いることが好ましい。
【００３８】
工程（ａ）において、被験菌からの核酸抽出及びＰＣＲは、当該技術分野において公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。また、ＰＣＲの反応条件は、使用するポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３９】
工程（ｂ）において、ＰＣＲ産物の検出は、ＰＣＲ産物を検出する場合に用いられる公知のいずれの方法で行ってもよいが、ＰＣＲ産物の大きさ（塩基対長）を指標として検出する方法であることが好ましく、ＰＣＲ産物を電気泳動法により分離してバンドパターンを検出する方法であることがより好ましい。
【００４０】
図６に示したように、特異的プライマーとして表２に記載の繰り返し配列２、８〜１２のいずれかの塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離してバンドパターンを検出した場合には、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスに属する微生物と、それ以外のラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物とを区別して検出することができる。
【００４１】
具体的には、９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが存在するバンドパターンが検出された場合には、当該被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスに属する菌株であると同定することができる。これに対して、３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された場合には、当該被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエに属する菌株であると判断することができる。
【００４２】
特異的プライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のバンドパターンは、菌株の種類ごとに異なる。このため、バンドパターンのみからでは、被検菌がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエのいずれに属する菌株であるかを、明確に区別することは難しいが、ＰＣＲ産物のバンドパターンとラクトース資化性から、両菌種を区別して同定することができる。ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスはラクトース資化能を有しているのに対して、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエは有していないためである。
【００４３】
よって、工程（ａ）及び（ｂ）に加えて、さらに、工程（ｃ）として、前記被験菌のラクトース（乳糖）資化能の有無を検出する工程を行うことにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとを識別することができる。具体的には、３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された被検菌のうち、ラクトース資化能を有している微生物はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、ラクトース資化能を有していない微生物はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエである、と同定することができる。
【００４４】
なお、工程（ａ）及び（ｂ）と工程（ｃ）とは、どちらを先に行ってもよい。被検菌のラクトース資化能を調べる方法は、特に限定されるものではなく、公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、被検菌を炭素原としてラクトースのみを含む培地中で培養し、生育の有無を観察することにより、ラクトース資化能を調べることができる。
【００４５】
その他、被検菌が、例えば炭水化物のほとんどがラクトースである乳製品等から分離された菌である場合には、被検菌のラクトース資化能を別個に調べない場合であっても、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエを区別して検出することができる。炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて分離された細菌は、ラクトース資化能を有していることが明らかなためである。
【００４６】
よって、炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて分離された細菌や、炭素原としてラクトースのみを含む分離源から得られた細菌を被検菌とした場合には、工程（ｃ）を行わない場合であっても、３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが得られた被検菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして同定することができる。
【００４７】
なお、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスはラクトース資化能を有している。つまり、ラクトコッカス・ラクティス亜種のうち、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエのみが、ラクトース資化能を有していない。よって、工程（ｂ）においてＰＣＲ産物が検出され、かつ、工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出されなかった被験菌は、ＰＣＲ産物のバンドパターンに関わらず、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することができる。
【００４８】
＜ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法＞
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法は、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物の菌株を同定する方法であって、２種以上の被験菌に対して、それぞれ、下記工程（ａ）及び（ｂ’）を行い、下記工程（ｂ’）により得られたバンドパターンを被験菌間で比較することにより、当該被験菌が同じ菌株に属する微生物であるか否かを同定することを特徴とする。
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマー（特異的プライマー）を用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程。
（ｂ’）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程。
【００４９】
工程（ｂ’）により得られるバンドパターンは、菌株ごとに異なる。つまり、同じバンドパターンが検出された被験菌は、同種の菌株に属する微生物であると同定することができる。一方、バンドパターンが異なる微生物同士は、互いに異なる種類の菌株に属する微生物であると同定することができる。
【００５０】
なお、工程（ａ）及び（ｂ’）は、ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法における工程と同様にして行うことができる。本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の同定方法においては、特異的プライマーとして、表２に記載のプライマーのうち、繰り返し配列２、８〜１２のいずれかの塩基配列からなるプライマーを用いることが好ましい。
【００５１】
＜キット＞
特異的プライマーを、ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法やラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法に使用する他の試薬等とともにキット化することも好ましい。このようなキットを用いることにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定をより簡便に行うことができる。このようなキットには、特異的プライマーの他に、被検菌の核酸抽出用試薬や、ＰＣＲ用試薬等を含めることができる。例えば、市販されているＰＣＲキットに、本発明の特異的プライマーを追加したものを、ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キットや、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定キットとすることができる。
【実施例】
【００５２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
［実施例１］ 未殺菌牛乳からのラクトコッカス・ラクティス亜種の分離・同定
未殺菌牛乳をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）、ＢＣＰ培地（栄研化学社製）、ＴＯＳプロピオン酸培地（ヤクルト薬品工業社製）、ＳＭ酢酸培地（ＳＭ ７ｇ、酢酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ １．５ｇ、クエン酸３アンモニウム ０．２ｇ、寒天 １．５ｇ、ＤＷ １００ｍＬ、酢酸 ０．１３２ｍＬ）を用いたプレートで２５〜４８℃にて嫌気培養した。得られたコロニーをグラム染色で確認後、グラム陽性菌１９２株をＭＲＳ液体培地で２５〜４８℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液をＥｘ Ｔａｑ (タカラバイオ社製)を用いて調製し、Ｖｅｒｉｔｉ ２００(アプライド・バイオシステム社製)を用いて、９４℃３分間の後、９４℃３０秒間、５２℃１分間、７２℃８分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った後、７２℃１６分間を行う反応条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は３２株であった。ＤＮＡを抽出した１９２株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された３２株のうち、１５株がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、１７株がラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであった。バンドが検出されなかった菌株の中には、ラクトコッカス・ラクティス亜種と同定された菌株はおらず、エンテロコッカス属やラクトバチラス属、ストレプトコッカス属などが主であった。ただし、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエと思われる菌株は認められなかった。さらに、得られたバンドのパターンを確認したところ、１８種類に分けられたが、これは、ランダムプライマー（５’−ＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’）を用いたＲＡＰＤ法（９４℃５分間、３６℃５分間、７２℃５分間のサイクルを４回繰り返した後、９４℃１分間、３６℃１分間、７２℃１分間のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃１０分間とするＰＣＲ反応）によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、様々な細菌が生息する未殺菌牛乳から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な最適な手法であることが明らかとなった。
【００５４】
［実施例２］ チーズからのラクトコッカス・ラクティス亜種の分離・同定
日本国産のチェダーチーズ（森永乳業社製）１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルを、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は８株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された８株のうち、５株がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、３株がラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであった。バンドが検出されなかった２株は、ロイコノストック属細菌であった。さらに、得られたバンドのパターンを確認したところ、３種類に分けられたが、これは、実施例１と同様にして行ったランダムプライマーを用いたＲＡＰＤ法によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、高頻度にラクトコッカス・ラクティス亜種が生息するナチュラルチーズから、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な最適な手法であることが明らかとなった。
【００５５】
［実施例３］ キムチからのラクトコッカス・ラクティス亜種の同定
日本の家庭で漬けたキムチを生理食塩水で適宜希釈し、ＳＭ酢酸培地及びＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜４８℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜４８℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は１株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された１菌株はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであった。バンドが検出されなかった９菌株は、ラクトバチラス属細菌であった。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、植物性発酵食品から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出する最適な手法であることが明らかとなった。
【００５６】
［実施例４］ 植物からのラクトコッカス・ラクティス亜種の分離・同定
ゴム手袋を用いて採取したモモの葉を２ｃｍ四方に切断後、生理食塩水に浸し、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーに対してグラム染色及びカタラーゼ試験を行い、乳酸菌と考えられるコロニーからランダムで２０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は２株であった。この２株を、乳糖を単一の炭素源とする２菌株を、乳糖を単一の炭素源とするＭ１７培地（ニッスイ社製）で培養した結果、１株のみが良好に生育した。ＤＮＡを抽出した２０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された２菌株のうち、Ｍ１７培地で生育した菌株はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、生育しなかった株はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエであった。バンドが検出されなかった１８菌株は、主にエンテロコッカス属、ラクトバチラス属細菌であった。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、自然界から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な手法であることが明らかとなった。
【００５７】
［実施例５］ ラクトコッカス・ラクティス亜種及びその他乳酸菌を用いて製造した発酵乳より分離した菌株の同定
１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（ｗ／ｗ）酵母エキス入り１０％（ｗ／ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株、ラクトバチラス・ブルガリカス ＡＴＣＣ１１８４２株、及びストレプトコッカス・サーモフィラス ＪＣＭ２００２６株のシードカルチャーをそれぞれ１００ｍＬ、１０ｍＬ、及び３０ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪３．０％（ｗ／ｗ）、無脂乳固形分９．０％（ｗ／ｗ）、蔗糖６．０％（ｗ／ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったカルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃６時間培養して発酵乳を得た。得られた発酵乳１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルをＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）プレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は５株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された５菌株のすべてがラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであった。バンドが検出されなかった５菌株は、４菌株がストレプトコッカス・サーモフィラス、１菌株がビフィドバクテリウム・ロンガムであった。さらに、得られたバンドのパターンはすべて同一であり、これは、実施例１と同様にして行ったランダムプライマーを用いたＲＡＰＤ法によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、ラクトコッカス・ラクティス亜種を用いて製造した発酵乳から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な最適な手法であることが明らかとなった。
【００５８】
［実施例６］ アセプティック食品からのラクトコッカス・ラクティス亜種の検出
脱イオン水を７０℃に加温し、これにカゼインナトリウム４．５％、デキストリン１３．６％、及びミルクフレーバーを加えて混合した。これとは別に、容器中で大豆油を７０℃に加温した後に乳化剤を加えたものを、先に調製した水溶液に加えて混合した。得られた混合物について、高圧ホモジナイザーを使用して４９ＭＰｓ（５００ｋｇｆ／ｃｍ２）にて１回乳化を行った。得られた乳化物を１２１℃２０分間処理により滅菌することによって、アセプティック食品を調製した。得られたアセプティック食品に実施例５で作成した発酵乳を０．１％（ｖ／ｖ）混合し、擬似汚染食品を作製した。得られた擬似汚染食品１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルをＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）プレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は３株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された３菌株のすべてがラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであった。バンドが検出されなかった７菌株は、すべてストレプトコッカス・サーモフィラスであった。さらに、得られたバンドのパターンはすべて同一であり、これは、実施例１と同様にして行ったランダムプライマーを用いたＲＡＰＤ法によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、ラクトコッカス・ラクティス亜種が混入した食品から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な手法であることが明らかとなった。
【００５９】
［実施例７］ 菌種同定キットを用いたラクトコッカス属の検出の検出
ＴａＫａＲａ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ、もしくはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (いずれも、タカラバイオ社製)、又はｒＴａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅもしくはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）のいずれかに含まれるｄＮＴＰｓ溶液に、繰り返し配列２からなるプライマーを最終濃度が１００ｎｍｏｌとなるように添加したキットを作製した。これらのキットを用いて、実施例１と同様にして、実施例１で分離したグラム陽性菌１９２株の菌種の同定を行った。得られた結果は実施例１と全く同様であった。
【００６０】
［参考例１］ ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエの識別
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地にラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ １９４３５Ｔ株もしくはラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ ＪＣＭ１１８０Ｔ株を１％接種し、２５℃で一晩培養した。ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ １９４３５Ｔ株は培地が凝固し、生育が認められたが、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ ＪＣＭ１１８０Ｔ株は生育が認められなかった。以上より、炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて培養することによって、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとホルドニアエの識別が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法により、ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を精度よく容易に同定することができるため、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、飲食品の製造等の、ラクトコッカス・ラクティス亜種を使用する様々な分野において利用が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）を検出する方法、並びに、該方法に好適なプライマーを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトコッカス・ラクティス亜種は、自然界に広く存在する中温性乳酸菌であり、古くから、チーズをはじめとする発酵乳製品に幅広く用いられている。現在、ラクトコッカス・ラクティス亜種は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）の３亜種に分類されている。
【０００３】
近年では、特徴的な菌株を用いることによって特徴的な風味を有する乳発酵製品を作る試みも複数報告されている（例えば、特許文献１参照。）。また、乳酸菌及びその発酵物は、腸管内の腐敗防止作用など様々な生理活性を有することが報告されている。例えばラクトコッカス属菌では、プロテアーゼ処理した乳製品に、グルタミン酸デカルボキシラーゼ産生能を有するラクトコッカス属菌を接種して培養することにより、血圧低下作用を有するγーアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含有する発酵乳を製造する方法が報告されている（例えば、特許文献２参照。）。また、老化抑制作用と密接な関わりがある抗酸化能を有するラクトコッカス属菌も報告されている（例えば、特許文献３参照。）。このような様々な生理活性を有する菌株は、産業的価値の非常に高い乳酸菌として注目されている。
【０００４】
新しい乳酸菌株を自然界から得るためには、多種多様の微生物から分離・同定を行う必要がある。一般的に菌種の同定方法は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、発酵生産物、一般生物学的性状等を検査することにより行われている。しかしながら、表現形質を基にした同定法は、操作が煩雑であり、かつ多大な時間と労力を要し、さらに試験者の熟練を必要とする。また、乳酸菌の中には継代することで複数のコロニー形態を有する菌株が存在するため、コロニー形態から株を同定するには限界がある。
【０００５】
近年では分子生物学的手法の進歩により、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく菌種同定方法が普及し、この遺伝子をターゲットとするプライマーが多く報告されている。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列には、９箇所の可変領域が存在し、それぞれＶ１〜９領域と呼ばれている。これらの可変領域は、一般的に菌種特異的な配列であることが知られており（例えば、非特許文献１参照。）、このため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のなかでも、可変領域をターゲットとする菌種特異的なプライマーが多く報告されている。
【０００６】
一方で、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、菌株によって若干の違いを有している場合もあるが、多くは菌種特異的である。例えば、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ １９４３５株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、同一亜種に属するＳＫ１１株やＮＩＲＤ ９２４株との相同性が１００％である。このように、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は菌種特異的であることから、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて設計されたプライマーを用いて菌株を同定することは非常に困難である。このため、同一菌種に属する複数の菌株を区別するためには、別途菌株同定試験を行う必要がある。
【０００７】
菌種や菌株を同定するための一般的な分子生物学的手法としては、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍｌｙ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）法、ｒｅｐ−ＰＣＲ（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ＰＣＲ）法、リボタイピング法、ＰＦＧＥ（ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＭＬＳＡ（Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）法などが挙げられる。このうち、リボタイピング法、ＰＦＧＥ法、及びＭＬＳＡ法は、菌株の識別能力は高いが、特別な装置を必要とする。また、ＲＦＬＰ法は、特別な装置は必要としないが、菌株を区別するには精度が不十分である。ＲＡＰＤ法及びｒｅｐ−ＰＣＲ法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応のみによって実施することが出来、さらに、用いるプライマー次第では菌株の識別能力も高いと考えられる。例えば、ラクトコッカス・ラクティス亜種では、ＲＡＰＤ法を用いて菌株特異的なＤＮＡマーカーを検索した結果、ＰＣＲ法により、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスの複数の菌株の中から、クレモリスＦＣ株のみを検出することができるプライマーが報告されている（例えば、特許文献４参照。）。
【０００８】
但し、菌種や菌株を十分な精度で同定可能なＰＣＲ用のプライマーを設計・作製することは非常に困難である。例えば、ＢＯＸＡ１Ｒプライマー（５’−ＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧ−３’）を用いてｒｅｐ−ＰＣＲを行うことにより、菌種特異的なバンドが検出されることが報告されているが（例えば、非特許文献２参照。）、複数の菌種間で共通して検出されるバンドも多く存在し、確実な菌種同定方法とは言い難い。
【０００９】
また、これらの方法では、菌種と菌株のいずれか一方を同定することができるものの、菌種と菌株とを共に同定することは難しく、これまでの報告では、菌種と菌株を同時に区別することができる方法はなかった。このため、従来は、菌種の同定を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく同定方法により行い、菌株の同定をＲＡＰＤ法などによる菌株の同定方法により行うというように、２段階の手法によって、菌種・菌株を同定する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−１０９７５６号公報
【特許文献２】特開２００１−１２０１７９号公報
【特許文献３】特開２００６−２５６９９３号公報
【特許文献４】特開２００７−２４４３４８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Jean-Marc Neefs、他４名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第２１巻、第３０２５〜３０４９ページ、１９９３年。
【非特許文献２】Patricio J. De Urraza、他４名、ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ（Journal of Dairy Research）、第６７巻、第３８１〜３９２ページ、２０００年。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＰＣＲを用いてラクトコッカス・ラクティス亜種を検出する方法、及び当該方法に好適なプライマーを含むキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラクトコッカス・ラクティス亜種の複数株におけるゲノム配列情報から、ラクトコッカス・ラクティス亜種のみに特異的に存在する繰り返し配列を見出し、この繰り返し配列に基づいて、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株のみを検出し得るプライマーを設計することにより、発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１） ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）を検出する方法であって、
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程と、
を有することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（２） 前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする前記（１）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（３） 前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）として同定することを特徴とする前記（２）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（４） 前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）として同定することを特徴とする前記（２）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（５） さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程と、
を有することを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（６） 前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（５）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（７） 前記工程（ｂ）においてＰＣＲ産物が検出され、かつ前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（５）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法、
（８） ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）に属する微生物の菌株を同定する方法であって、
２種以上の被験菌に対して、それぞれ、下記工程（ａ）及び（ｂ’）を行い、下記工程（ｂ’）により得られたバンドパターンを被験菌間で比較することにより、当該被験菌が同じ菌株に属する微生物であるか否かを同定することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法：
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程、
（ｂ’） 前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程、
（９） 前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする前記（８）記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法、
（１０） 前記（１）〜（７）のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるプライマーであって、
配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とするプライマー、
（１１） 前記（１）〜（７）のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるキットであって、
配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号９で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１又は複数のプライマーを含むことを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法により、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株のみを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】表１に記載のＢＯＸＡ１Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図２】表１に記載のＥＲＩＣプライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図３】表１に記載の繰り返し配列１プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図４】表１に記載の繰り返し配列２プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図５】表２に記載の各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図６】表３に記載の各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に特異的に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いることを特徴とする。このように、ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に特異的に存在する繰り返し配列利用してｒｅｐ−ＰＣＲを行うことにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができる。また、適切な検出方法を選択することにより、検出されたラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種の同定や菌株の識別もすることができる。
【００１８】
本発明及び本願明細書において、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を検出する」とは、被験菌（菌種を同定する対象の菌）がラクトコッカス・ラクティス亜種であるか否かを決定することを意味する。
また、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を同定する」とは、被験菌が、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエのいずれであるかを決定することを意味する。
また、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株を同定する」とは、被験菌が、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株のいずれの菌株と同じであるかを決定することを意味する。つまり、菌株同士が区別できればよく、必ずしも正確な菌株名を決定することは要さない。
さらに、「ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定」には、ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を同定することと、ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株を同定することの両方が含まれる。
【００１９】
ゲノムＤＮＡ中の繰り返し配列は、連続して存在している場合が多い。特に非翻訳領域中では、繰り返し配列がほぼ等間隔で規則的に連続して存在している場合が多い。例えば、多くの細菌の非翻訳領域には、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）という規則的に間隔があいている短い回文構造の反復座位が存在している。規則的に間隔があいて連続している領域にのみ存在する繰り返し配列を認識するプライマーを用いてＰＣＲを行った場合には、得られるＰＣＲ産物の大きさがほぼ等しくなり、ＰＣＲ産物の種類ごとに区別して検出することが困難である。
【００２０】
本発明において用いられる、ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に特異的に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマー（以下、「特異的プライマー」ということがある。）は、このような繰り返し配列が連続して存在している領域以外に、ゲノムＤＮＡ中に少なくとも１の繰り返し配列部位が存在する配列に基づいて設計されることが好ましい。中でも、少なくとも１の繰り返し配列部位が、翻訳領域に存在している配列に基づいて設計されることがより好ましい。
【００２１】
＜特異的プライマー＞
本発明においてラクトコッカス・ラクティス亜種の検出及び同定に用いる特異的プライマーは、以下の手法により設計された。
１．ラクトコッカス・ラクティス亜種に特異的に存在する繰り返し配列の探索及びプライマーの設計
まず、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する複数の菌株のゲノムの塩基配列を、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の塩基配列データベースから得た。得られたゲノムの塩基配列を基にして、インシリコモレキュラークローニング（ＩＭＣ）ｖｅｒ．１．０（インシリコバイオロジー社製）を用いて、繰り返し配列を探索した。この際、非翻訳領域に連続して存在する繰返し配列としてのみ検出された配列は除外した。なぜなら検出されるバンドの長さが均一になってしまうためである。得られた配列情報の中から、ラクトコッカス・ラクティス亜種以外の細菌ゲノムに存在していない配列を選抜し、これらをターゲットとしてプライマーを設計し、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のオリゴプライマー作成サービスを利用してプライマーを合成した。その一部を表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
２．プライマーの菌種特異性の確認１
上記１．で設計・合成したプライマーが、実際にラクトコッカス・ラクティス亜種に対してのみ特異性を有しているかを確認するため、ラクトコッカス属の全菌種の基準株（Ｔｙｐｅ Ｓｔｒａｉｎ）と、比較対照としてエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌）の基準株とを鋳型とした場合のプライマー反応性を検討した。
まず、全ての細菌を、それぞれ嫌気的に一晩純粋培養した。なお、ラクトコッカス属の全菌種の培養には、Ｍ１７培地（ニッスイ社製）にブドウ糖０．５％（ｗ／ｗ）を加えた培地を用いた。エッシェリヒア・コリの培養には、ＧＡＭ培地（栄研社製）を用いた。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
次いで、抽出されたＤＮＡをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用い、表１に記載の各プライマーを用いてＰＣＲを行った。比較対照として、ｒｅｐ−ＰＣＲにおいて一般的に用いられているＢＯＸＡ１Ｒプライマー（例えば、非特許文献２参照。）やＥＲＩＣプライマーを用いて、同様にしてＰＣＲを行った。具体的には、鋳型ＤＮＡ溶液と前記いずれかのプライマーとを含み、総液量が２５μＬであるＰＣＲ反応液を、Ｅｘ Ｔａｑ(タカラバイオ社製)を用いて調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、９４℃１分間の後、９４℃３０秒間、５２℃１分間、７２℃８分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った後、さらに７２℃１６分間を行う反応条件によるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、Ｖｅｒｉｔｉ ２００(アプライド・バイオシステム社製)を用いて行った。得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドパターンを確認した。
【００２４】
図１〜４は、得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。図１はＢＯＸＡ１Ｒプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果であり、図２はＥＲＩＣプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果であり、図３は繰り返し配列１からなるプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果であり、図４は繰り返し配列２からなるプライマーを用いたＰＣＲ産物の結果である。また、図１〜４中、Ｍは分子量マーカーｗｉｄｅ−ｒａｎｇｅ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ５０−１００００ｂｐ（タカラバイオ社製）、Ａはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ１９４３５Ｔ株、Ｂはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス ＮＢＲＣ １００６７６Ｔ株、Ｃはラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ ＪＣＭ１１８０Ｔ株、Ｄはラクトコッカス・ラフィノラクティス ＪＣＭ５７０６Ｔ株、Ｅはラクトコッカス・ガルビアエ ＪＣＭ１０３４３Ｔ株、Ｆはラクトコッカス・ピシウム ＪＣＭ１１０５５Ｔ株、Ｇはラクトコッカス・プランタラム ＪＣＭ１１０５６Ｔ株、Ｈはエッシェリヒア・コリ ＪＣＭ１６４９Ｔ株を、それぞれ流したレーンである。
【００２５】
この結果、ＢＯＸＡ１ＲプライマーやＥＲＩＣプライマーは、すべての菌種に反応してしまい、菌種に対する特異性は認められなかった。また、上記１．で作製したプライマーのうち、繰り返し配列３〜７からなるプライマーでも、同様に特異性を見出すことは出来なかった。繰り返し配列１からなるプライマーを用いた場合には、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する３菌株に加えて、ラクトコッカス・ラフィノラクティス及びラクトコッカス・ピシウムの基準株でもＰＣＲ産物が得られており、特異性は不十分であった。これに対して、繰り返し配列２からなるプライマーを用いた場合には、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する３菌株由来のＤＮＡを鋳型とした場合にのみＰＣＲ産物が得られた。これにより、繰り返し配列２からなるプライマーが、ラクトコッカス・ラクティス亜種に高い特異性を有しており、当該プライマーを用いることにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物のみが検出できることが確認できた。
【００２６】
３．プライマーの菌種特異性の確認２
さらに、繰り返し配列２の１９塩基の中から、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定に必要な配列を見出すために、表２に示す繰り返し配列からなるプライマーを作製し、これらのプライマーのラクトコッカス・ラクティス亜種に対する特異性を調べた。具体的には、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ１９４３５Ｔ株から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、表２に記載の各プライマーを用いて、上記２．と同様にしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のバンドパターンを検出した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
図５は、得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。図５中、「Ｍ」は図１と同じであり、各レーンに振られている番号は、用いたプライマーの繰り返し配列の番号を示す。この結果、繰り返し配列２、８〜１２からなるプライマーを用いた場合には、いずれも良好なバンドパターンが得られたが、繰返し配列１３〜１５からなるプライマーを用いた場合には、バンドパターンが得られなかった。つまり、ラクトコッカス・ラクティス亜種を特異的に認識するためには、繰り返し配列２の５’末端側から連続した１４塩基が必要であることがわかった。
【００２９】
４．プライマーの菌種・菌株識別能力の確認
上記２．及び３．において、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定が可能であると確認された繰り返し配列２からなるプライマーが、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する３菌種の識別や、菌株の識別が可能かどうかを確認した、具体的には、下記表３に記載の菌株の菌体から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、繰り返し配列２からなるプライマーを用いて、上記２．と同様にしてＰＣＲを行った。
【００３０】
【表３】
【００３１】
図６（Ａ）は、得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。図６（Ｂ）は、図６（Ａ）のバンドパターンを模式的に示した図である。図６中、「Ｍ」は図１と同じである。また、レーンＡ〜Ｆは、表３のＡ〜Ｆに記載されている菌株由来のＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の結果を示す。この結果、いずれの菌株においても、少なくとも１のバンドが検出され、少なくとも１種類のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。
【００３２】
特に、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスに属する菌株（ＮＢＲＣ １００６７６Ｔ株及びＡＴＣＣ ９６２５株）では、いずれも、９５０〜１０５０ｂｐの領域に１本の特徴的な強いバンドが検出された。また、このバンドの近傍には、その他のバンドは検出されなかった。これにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスは、この特徴的なバンドの有無を指標として、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属するその他菌種と区別できることがわかった。
【００３３】
一方で、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエは、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとは異なり、３００〜１５０００ｂｐの領域に複数のバンドが観察された。これにより、９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが検出されず、かつ３００〜１５０００ｂｐの領域のうちの９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが検出されるか否かを指標として、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエを、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスから区別できることがわかった。
【００３４】
また、図６に示す通り、菌株ごとにバンドパターンが異なっていた。これにより、繰り返し配列２からなるプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のバンドパターンを調べることにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する菌株の同定が可能であることも確認された。
【００３５】
＜ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法＞
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマー（特異的プライマー）を用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程。
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程。
【００３６】
被験菌がラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物である場合には、特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、ＰＣＲ産物が得られるが、被験菌がラクトコッカス・ラクティス亜種以外に属する微生物である場合には、ＰＣＲ産物は検出されない。つまり、ＰＣＲ産物を検出することにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができる。
【００３７】
工程（ａ）において用いられる特異的プライマーは、前述の＜特異的プライマー＞に記載の方法により設計・製造することができる。本発明においては、表２に記載のプライマーのうち、繰り返し配列２、８〜１２のいずれかの塩基配列からなるプライマーを用いることが好ましい。
【００３８】
工程（ａ）において、被験菌からの核酸抽出及びＰＣＲは、当該技術分野において公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。また、ＰＣＲの反応条件は、使用するポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００３９】
工程（ｂ）において、ＰＣＲ産物の検出は、ＰＣＲ産物を検出する場合に用いられる公知のいずれの方法で行ってもよいが、ＰＣＲ産物の大きさ（塩基対長）を指標として検出する方法であることが好ましく、ＰＣＲ産物を電気泳動法により分離してバンドパターンを検出する方法であることがより好ましい。
【００４０】
図６に示したように、特異的プライマーとして表２に記載の繰り返し配列２、８〜１２のいずれかの塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離してバンドパターンを検出した場合には、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスに属する微生物と、それ以外のラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物とを区別して検出することができる。
【００４１】
具体的には、９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが存在するバンドパターンが検出された場合には、当該被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスに属する菌株であると同定することができる。これに対して、３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された場合には、当該被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエに属する菌株であると判断することができる。
【００４２】
特異的プライマーを用いて得られたＰＣＲ産物のバンドパターンは、菌株の種類ごとに異なる。このため、バンドパターンのみからでは、被検菌がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエのいずれに属する菌株であるかを、明確に区別することは難しいが、ＰＣＲ産物のバンドパターンとラクトース資化性から、両菌種を区別して同定することができる。ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスはラクトース資化能を有しているのに対して、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエは有していないためである。
【００４３】
よって、工程（ａ）及び（ｂ）に加えて、さらに、工程（ｃ）として、前記被験菌のラクトース（乳糖）資化能の有無を検出する工程を行うことにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとを識別することができる。具体的には、３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された被検菌のうち、ラクトース資化能を有している微生物はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、ラクトース資化能を有していない微生物はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエである、と同定することができる。
【００４４】
なお、工程（ａ）及び（ｂ）と工程（ｃ）とは、どちらを先に行ってもよい。被検菌のラクトース資化能を調べる方法は、特に限定されるものではなく、公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、被検菌を炭素原としてラクトースのみを含む培地中で培養し、生育の有無を観察することにより、ラクトース資化能を調べることができる。
【００４５】
その他、被検菌が、例えば炭水化物のほとんどがラクトースである乳製品等から分離された菌である場合には、被検菌のラクトース資化能を別個に調べない場合であっても、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエを区別して検出することができる。炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて分離された細菌は、ラクトース資化能を有していることが明らかなためである。
【００４６】
よって、炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて分離された細菌や、炭素原としてラクトースのみを含む分離源から得られた細菌を被検菌とした場合には、工程（ｃ）を行わない場合であっても、３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが得られた被検菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして同定することができる。
【００４７】
なお、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスはラクトース資化能を有している。つまり、ラクトコッカス・ラクティス亜種のうち、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエのみが、ラクトース資化能を有していない。よって、工程（ｂ）においてＰＣＲ産物が検出され、かつ、工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出されなかった被験菌は、ＰＣＲ産物のバンドパターンに関わらず、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することができる。
【００４８】
＜ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法＞
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法は、ラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物の菌株を同定する方法であって、２種以上の被験菌に対して、それぞれ、下記工程（ａ）及び（ｂ’）を行い、下記工程（ｂ’）により得られたバンドパターンを被験菌間で比較することにより、当該被験菌が同じ菌株に属する微生物であるか否かを同定することを特徴とする。
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマー（特異的プライマー）を用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程。
（ｂ’）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程。
【００４９】
工程（ｂ’）により得られるバンドパターンは、菌株ごとに異なる。つまり、同じバンドパターンが検出された被験菌は、同種の菌株に属する微生物であると同定することができる。一方、バンドパターンが異なる微生物同士は、互いに異なる種類の菌株に属する微生物であると同定することができる。
【００５０】
なお、工程（ａ）及び（ｂ’）は、ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法における工程と同様にして行うことができる。本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の同定方法においては、特異的プライマーとして、表２に記載のプライマーのうち、繰り返し配列２、８〜１２のいずれかの塩基配列からなるプライマーを用いることが好ましい。
【００５１】
＜キット＞
特異的プライマーを、ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法やラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法に使用する他の試薬等とともにキット化することも好ましい。このようなキットを用いることにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定をより簡便に行うことができる。このようなキットには、特異的プライマーの他に、被検菌の核酸抽出用試薬や、ＰＣＲ用試薬等を含めることができる。例えば、市販されているＰＣＲキットに、本発明の特異的プライマーを追加したものを、ラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キットや、ラクトコッカス・ラクティス亜種の同定キットとすることができる。
【実施例】
【００５２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
［実施例１］ 未殺菌牛乳からのラクトコッカス・ラクティス亜種の分離・同定
未殺菌牛乳をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）、ＢＣＰ培地（栄研化学社製）、ＴＯＳプロピオン酸培地（ヤクルト薬品工業社製）、ＳＭ酢酸培地（ＳＭ ７ｇ、酢酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ １．５ｇ、クエン酸３アンモニウム ０．２ｇ、寒天 １．５ｇ、ＤＷ １００ｍＬ、酢酸 ０．１３２ｍＬ）を用いたプレートで２５〜４８℃にて嫌気培養した。得られたコロニーをグラム染色で確認後、グラム陽性菌１９２株をＭＲＳ液体培地で２５〜４８℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液をＥｘ Ｔａｑ (タカラバイオ社製)を用いて調製し、Ｖｅｒｉｔｉ ２００(アプライド・バイオシステム社製)を用いて、９４℃３分間の後、９４℃３０秒間、５２℃１分間、７２℃８分間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った後、７２℃１６分間を行う反応条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は３２株であった。ＤＮＡを抽出した１９２株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された３２株のうち、１５株がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、１７株がラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであった。バンドが検出されなかった菌株の中には、ラクトコッカス・ラクティス亜種と同定された菌株はおらず、エンテロコッカス属やラクトバチラス属、ストレプトコッカス属などが主であった。ただし、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエと思われる菌株は認められなかった。さらに、得られたバンドのパターンを確認したところ、１８種類に分けられたが、これは、ランダムプライマー（５’−ＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’）を用いたＲＡＰＤ法（９４℃５分間、３６℃５分間、７２℃５分間のサイクルを４回繰り返した後、９４℃１分間、３６℃１分間、７２℃１分間のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃１０分間とするＰＣＲ反応）によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、様々な細菌が生息する未殺菌牛乳から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な最適な手法であることが明らかとなった。
【００５４】
［実施例２］ チーズからのラクトコッカス・ラクティス亜種の分離・同定
日本国産のチェダーチーズ（森永乳業社製）１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルを、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は８株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された８株のうち、５株がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、３株がラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであった。バンドが検出されなかった２株は、ロイコノストック属細菌であった。さらに、得られたバンドのパターンを確認したところ、３種類に分けられたが、これは、実施例１と同様にして行ったランダムプライマーを用いたＲＡＰＤ法によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、高頻度にラクトコッカス・ラクティス亜種が生息するナチュラルチーズから、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な最適な手法であることが明らかとなった。
【００５５】
［実施例３］ キムチからのラクトコッカス・ラクティス亜種の同定
日本の家庭で漬けたキムチを生理食塩水で適宜希釈し、ＳＭ酢酸培地及びＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜４８℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜４８℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は１株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された１菌株はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであった。バンドが検出されなかった９菌株は、ラクトバチラス属細菌であった。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、植物性発酵食品から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出する最適な手法であることが明らかとなった。
【００５６】
［実施例４］ 植物からのラクトコッカス・ラクティス亜種の分離・同定
ゴム手袋を用いて採取したモモの葉を２ｃｍ四方に切断後、生理食塩水に浸し、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーに対してグラム染色及びカタラーゼ試験を行い、乳酸菌と考えられるコロニーからランダムで２０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は２株であった。この２株を、乳糖を単一の炭素源とする２菌株を、乳糖を単一の炭素源とするＭ１７培地（ニッスイ社製）で培養した結果、１株のみが良好に生育した。ＤＮＡを抽出した２０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された２菌株のうち、Ｍ１７培地で生育した菌株はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、生育しなかった株はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエであった。バンドが検出されなかった１８菌株は、主にエンテロコッカス属、ラクトバチラス属細菌であった。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、自然界から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な手法であることが明らかとなった。
【００５７】
［実施例５］ ラクトコッカス・ラクティス亜種及びその他乳酸菌を用いて製造した発酵乳より分離した菌株の同定
１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（ｗ／ｗ）酵母エキス入り１０％（ｗ／ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガム ＦＥＲＭ ＢＰ−７７８７株、ラクトバチラス・ブルガリカス ＡＴＣＣ１１８４２株、及びストレプトコッカス・サーモフィラス ＪＣＭ２００２６株のシードカルチャーをそれぞれ１００ｍＬ、１０ｍＬ、及び３０ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪３．０％（ｗ／ｗ）、無脂乳固形分９．０％（ｗ／ｗ）、蔗糖６．０％（ｗ／ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったカルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃６時間培養して発酵乳を得た。得られた発酵乳１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルをＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）プレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は５株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された５菌株のすべてがラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであった。バンドが検出されなかった５菌株は、４菌株がストレプトコッカス・サーモフィラス、１菌株がビフィドバクテリウム・ロンガムであった。さらに、得られたバンドのパターンはすべて同一であり、これは、実施例１と同様にして行ったランダムプライマーを用いたＲＡＰＤ法によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、ラクトコッカス・ラクティス亜種を用いて製造した発酵乳から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な最適な手法であることが明らかとなった。
【００５８】
［実施例６］ アセプティック食品からのラクトコッカス・ラクティス亜種の検出
脱イオン水を７０℃に加温し、これにカゼインナトリウム４．５％、デキストリン１３．６％、及びミルクフレーバーを加えて混合した。これとは別に、容器中で大豆油を７０℃に加温した後に乳化剤を加えたものを、先に調製した水溶液に加えて混合した。得られた混合物について、高圧ホモジナイザーを使用して４９ＭＰｓ（５００ｋｇｆ／ｃｍ２）にて１回乳化を行った。得られた乳化物を１２１℃２０分間処理により滅菌することによって、アセプティック食品を調製した。得られたアセプティック食品に実施例５で作成した発酵乳を０．１％（ｖ／ｖ）混合し、擬似汚染食品を作製した。得られた擬似汚染食品１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルをＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）プレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及び繰り返し配列２からなるプライマーを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は３株であった。ＤＮＡを抽出した１０株すべてについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された３菌株のすべてがラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであった。バンドが検出されなかった７菌株は、すべてストレプトコッカス・サーモフィラスであった。さらに、得られたバンドのパターンはすべて同一であり、これは、実施例１と同様にして行ったランダムプライマーを用いたＲＡＰＤ法によっても同様の結果が得られた。以上の結果より、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、ラクトコッカス・ラクティス亜種が混入した食品から、ラクトコッカス・ラクティス亜種を精度よく検出することができ、かつ菌株レベルまで同定可能な手法であることが明らかとなった。
【００５９】
［実施例７］ 菌種同定キットを用いたラクトコッカス属の検出の検出
ＴａＫａＲａ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ、もしくはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (いずれも、タカラバイオ社製)、又はｒＴａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅもしくはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）のいずれかに含まれるｄＮＴＰｓ溶液に、繰り返し配列２からなるプライマーを最終濃度が１００ｎｍｏｌとなるように添加したキットを作製した。これらのキットを用いて、実施例１と同様にして、実施例１で分離したグラム陽性菌１９２株の菌種の同定を行った。得られた結果は実施例１と全く同様であった。
【００６０】
［参考例１］ ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエの識別
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地にラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ １９４３５Ｔ株もしくはラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ ＪＣＭ１１８０Ｔ株を１％接種し、２５℃で一晩培養した。ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス ＡＴＣＣ １９４３５Ｔ株は培地が凝固し、生育が認められたが、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ ＪＣＭ１１８０Ｔ株は生育が認められなかった。以上より、炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて培養することによって、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとホルドニアエの識別が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法により、ラクトコッカス・ラクティス亜種の菌種を精度よく容易に同定することができるため、本発明のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法は、飲食品の製造等の、ラクトコッカス・ラクティス亜種を使用する様々な分野において利用が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）を検出する方法であって、
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程と、
を有することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項２】
前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項１記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）として同定することを特徴とする請求項２記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）として同定することを特徴とする請求項２記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項５】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程と、
を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項５記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）においてＰＣＲ産物が検出され、かつ前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項５記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項８】
ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）に属する微生物の菌株を同定する方法であって、
２種以上の被験菌に対して、それぞれ、下記工程（ａ）及び（ｂ’）を行い、下記工程（ｂ’）により得られたバンドパターンを被験菌間で比較することにより、当該被験菌が同じ菌株に属する微生物であるか否かを同定することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法：
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程、
（ｂ’） 前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程。
【請求項９】
前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項８記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるプライマーであって、
配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とするプライマー。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるキットであって、
配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号９で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１又は複数のプライマーを含むことを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キット。
【請求項１】
ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）を検出する方法であって、
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出する工程と、
を有することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項２】
前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項１記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
９５０〜１０５０ｂｐの領域にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）として同定することを特徴とする請求項２記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）として同定することを特徴とする請求項２記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項５】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程と、
を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）が、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程であり、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、
３００〜１５０００ｂｐの領域のうち、９５０〜１０５０ｂｐの領域以外にバンドが存在するバンドパターンが検出され、かつ、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項５記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）においてＰＣＲ産物が検出され、かつ前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項５記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の検出方法。
【請求項８】
ラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）に属する微生物の菌株を同定する方法であって、
２種以上の被験菌に対して、それぞれ、下記工程（ａ）及び（ｂ’）を行い、下記工程（ｂ’）により得られたバンドパターンを被験菌間で比較することにより、当該被験菌が同じ菌株に属する微生物であるか否かを同定することを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法：
（ａ）ラクトコッカス・ラクティス亜種のゲノムＤＮＡ中に存在する繰り返し配列を特異的に認識するプライマーを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程、
（ｂ’） 前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離して、バンドパターンを検出する工程。
【請求項９】
前記プライマーが、配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする請求項８記載のラクトコッカス・ラクティス亜種の菌株同定方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるプライマーであって、
配列番号２で表される塩基配列、配列番号８で表される塩基配列、配列番号９で表される塩基配列、配列番号１０で表される塩基配列、配列番号１１で表される塩基配列、及び配列番号１２で表される塩基配列からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とするプライマー。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．）の検出方法に用いられるキットであって、
配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号８で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号９で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号１１で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１又は複数のプライマーを含むことを特徴とするラクトコッカス・ラクティス亜種の検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１９３８４４（Ｐ２０１１−１９３８４４Ａ）
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６６５７３（Ｐ２０１０−６６５７３）
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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