ラットおよび他種由来の多能性細胞
多能性細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む無血清培養培地中で誘導されそして自己再生状態に維持される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞における自己再生表現型の維持に関する。提供される方法および組成物は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、特に、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタおよびヒトを含む哺乳動物の幹細胞の培養および単離に適する。特に、本発明は、ラット、マウスおよびヒトの多能性細胞の自己再生培養物、ならびにそのための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清および白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地の存在下でのインビトロ多能性幹細胞培養物の樹立および維持は、周知である（Smithら、（1998）Nature 336: 688-90）。このような方法は、「許容的」なマウスの系統から多くの継代にわたって多能性胚性幹（ＥＳ）細胞を維持するために用いられてきた。多能性幹細胞培養物の維持および自己再生は、フィーダー細胞またはその抽出物（通常はマウス線維芽細胞）の存在下で幹細胞が培養される場合にさらに支持される。このような条件下では、培養物中で多くの継代にわたってヒトＥＳ細胞を多能性状態に維持し得る。
【０００３】
多くの場合において、ＥＳ細胞は、血清または血清抽出物を含む（したがって、非限定である）培地を用いるか、またはヒトＥＳ細胞を維持するために用いられる線維芽細胞フィーダー細胞のような他の細胞の存在を必要とする細胞培養条件を用いる場合のみ維持され得るか、あるいは最もよく維持される。しかし、培地中のものであろうとまたは例えばフィーダー細胞によって産生されるものであろうと、何らかの不確定の構成成分が、ＥＳ細胞の増殖および分化についての研究を潜在的に妨害し、または邪魔する。これは、ＥＳ細胞およびその子孫の治療および他の適用のための良好な製造実施の発展を妨げる。いくつかの限定されたＥＳ細胞培地が知られているが、代替のおよび好ましくは改良された限定培地が必要とされる。
【０００４】
本出願人による先の出願であるWO-A-03/095628およびより後の未公開出願において、（１）ｇｐ１３０のアゴニスト（例えば、ＬＩＦ）および（２）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのアゴニスト（例えば、ＢＭＰ４）またはＩｄシグナリング経路のアゴニストを含む無血清培地中でＥＳ細胞のような多能性幹細胞を培養することは、複数の継代にわたって幹細胞の自己再生を促進するために用いられる。ｇｐ１３０シグナリングの存在下では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーまたはＩｄシグナリング経路のアゴニストは、驚くべきことに、分化前のシグナルよりもむしろ自己再生の刺激を提供した。それにもかかわらず、多能性細胞を自己再生状態に維持する効率、およびフィーダー細胞から離してまたはフィーダー条件培地から離して多能性細胞を移すための培地は、常に改良されることが望まれる。
【０００５】
Sato Nら、Nat. Med. 2004年1月 10(1) 55-63頁は、血清を含む培地中でのマウスおよびヒトＥＳ細胞に対する、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）インヒビターである６−ブロモインディルビン−３’−オキシムの効果を記載している。しかし、これらの効果は非常に短い時間枠にわたってのみ観察され、あまりにも短いため確かな結論を引き出し得なかった。そして、その研究に用いられた非限定培地中の未知の因子の影響は重要であり得る。本発明の発明者らは、その結果を反復することを試みたがこれに失敗し、そして実際にはそれらの記載と反対の効果を見出した。
【０００６】
ＥＳ細胞の培養培地の調製のためには、個々の培地構成成分をできる限り純粋な形態で提供することが望まれる。しかし、ほとんどの培地構成成分はサイトカインであり、その純度は、それらを細胞系で製造し、次に生産ブロスから潜在的な汚染物質を除去する必要によって損なわれる。いくつかのサイトカインに伴う別の問題は、それらが効果的かつ無毒性である濃度範囲が狭いことである。より広い範囲の濃度を有しおよび／またはより高い濃度でより毒性が低い培地構成成分は、非常に有用である。サイトカインはまた、貯蔵において安定性が限定され得、そしてより安定な培地構成成分が求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、当該技術分野における問題を克服しまたは少なくとも改善すること、好ましくは代替の、より好ましくは改良された、多くの継代にわたって該幹細胞の自己再生を支持し得る、多能性幹細胞に適した培養方法および培養培地を提供することである。本発明のさらなる目的は、細胞の分化が制御される様式で誘導され得るまで多能性幹細胞培養物のインビトロでの維持を可能にする、代替の培養系を提供することである。本発明のよりさらなる目的は、多能性幹細胞の誘導および単離を増強し、かつＥＳ細胞の単離が難しい生物からまたは多能性幹細胞がまだ単離されていない生物からのそれらの誘導および単離を促進する方法および組成物を提供することである。本発明のさらなる関連の目的は、そのような生物由来の多能性幹細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の局面によれば、多能性細胞でのＧＳＫ３およびＭＥＫおよびＦＧＦレセプターすべての阻害が、細胞の自己再生を促進するために用いられる。
【０００９】
本発明によれば、ＥＳ細胞のような多能性幹細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニスト（例えば、小分子ＧＳＫ３インヒビターおよび小分子ＭＥＫインヒビターおよび小分子ＦＧＦＲアンタゴニスト）を含む、（好ましくは無血清の）培地中で培養される。それによって、幹細胞の複数の継代にわたる自己再生が促進される。したがって、多能性細胞でのＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターシグナリングの阻害は、自己再生の刺激を提供する。
【００１０】
本発明は、多くの適用を有する。ＧＳＫ３およびＭＥＫの阻害の組み合わせ、ＭＥＫおよびＦＧＦＲの阻害の組み合わせ、またはＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦＲの阻害の組み合わせが、多能性細胞、特にＥＳ細胞を増殖させるため、およびそれらがフィーダー上で誘導または増殖されていた場合、多能性細胞、特にＥＳ細胞を、フィーダー細胞またはフィーダー細胞の層（しばしばフィーダーまたはフィーダー細胞という）を伴わずに増殖するように適応させるために用いられ得る。培養物中で幹細胞を増殖させる方法は、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターの存在下、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下、または好ましくはＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で細胞を培養する工程を含む。１以上のＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビター、１以上のＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニスト、ならびに必要に応じて１以上のＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを含む培養培地が調製され得る。ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを用いて、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを用いて、またはＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを用いて、ＥＳ細胞（ＥＳ細胞がこれまで単離されなかった生物由来のＥＳ細胞を含む）が誘導され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明によって誘導および維持されたマウスＥＳ細胞、およびこれらのＥＳ細胞によるキメラ寄与の高効率を示す。
【図２】本発明によって増殖された継代４マウスＥＳ細胞を示す。
【図３】本発明によって増殖されたマウスＥＳ細胞がＯｃｔ４陽性であることを示す。
【図４】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞のコロニーを示す。
【図５】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がＮａｎｏｇ陽性であることを示す。
【図６】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がＯｃｔ４陽性であることを示す。
【図７】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がＣｄｘ−２陽性であることを示す。
【図８】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がアルカリフォスファターゼ陽性であることを示す。
【図９】本発明によって単離された４つのラットＥＳ細胞系におけるＲＴ−ＰＣＲ発現データを示す。
【図１０】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞から生じた奇形腫の成熟分化組織切片を示す。
【図１１ａ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ａ.血清およびＬＩＦの存在下、または３ｉ中での培養３日後のＩＣＭのＯｃｔ４およびＣｄｘ２についての免疫蛍光染色。
【図１１ｂ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ｂ.培養されたラットＩＣＭ中のＯｃｔ４およびＣｄｘ２免疫陽性細胞の定量化。
【図１１ｃ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ｃ．３ｉ中での培養４日後のＩＣＭのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ免疫染色。
【図１１ｄ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ｄ．ＩＣＭ派生物の脱凝集４日後の３ｉ中の一次コロニー。
【図１２ａ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ａ．フィーダー上で、３ｉで継代された細胞の代表的なコロニー。
【図１２ｂ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｂ．３ｉ中のフィブロネクチン上でフィーダーなしで継代された細胞。
【図１２ｃ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｃ．３ｉコロニーのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇについての免疫蛍光染色。
【図１２ｄ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｄ．Ｅ１４Ｔｇ２ａマウスＥＳ細胞（ｍＥＳ）、ラットＥｘＳ細胞（ｒＥｘＳ）およびマウスＯｃｔおよびマウスＮａｎｏｇ導入遺伝子を発現するラットＥｘＳ細胞（ｒＥｘＳ＋ｍＯ／ｍＮ）と比較した、ラット胚由来３ｉ細胞におけるマーカー発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図１２ｅ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｅ．３ｉラットＥＳ細胞（Ｃ系）由来の中期染色体。
【図１３ａ】インビトロでのラット３ｉ細胞の分化を示す。ａ．フィーダー上で血清＋ＬＩＦへ曝露した後の細胞の位相差画像および免疫蛍光画像。
【図１３ｂ】インビトロでのラット３ｉ細胞の分化を示す。ｂ．３ｉなしの無血清培地中のゼラチン上の培養８日後の分化細胞。
【図１３ｃ】インビトロでのラット３ｉ細胞の分化を示す。ｃ．ＸＸラットＥＳ細胞におけるＸ染色体状態の特徴付け。未分化のＸＸラット３ｉ細胞および６日間分化させたＸＸラット３ｉ細胞およびＸＸラット神経幹（ＮＳ）細胞における、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（緑色）についての免疫蛍光。未分化細胞は染色の拡散を示し（不活性Ｘの欠如）、これに対して分化細胞および体性幹細胞はＨ３Ｋ２７ｍｅ３核小体（不活性Ｘ）の存在を示す。細胞は、Ｄａｐｉ（青色）で対比染色された。
【図１４ａ】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ａ．奇形腫の組織切片。角化上皮（Ｃ系）、横紋筋（Ｂ系）、腸上皮（Ｃ系）。
【図１４ｂ】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｂ．ＧＦＰ発現Ｄ系３ｉ細胞を用いて生じさせたＥ１０．５キメラの無傷胚および頭から尾までの横断切片（ｉ〜ｘ）の画像。緑色はＧＦＰ蛍光、青色はＤＡＰＩ核染色。
【図１４ｃ】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｃ．Ｃ系の細胞から誘導された毛色キメラ。アルビノの鼻はレシピエントのＦｉｓｃｈｅｒ系（頭巾斑のあるアルビノ）、体の色は導入されたＤＡ系細胞を示す。
【図１４ｄ１】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｄ．成体毛色キメラのゲノムＤＮＡのマイクロサテライト分析。多型のマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７を、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、アガロースゲルおよび蛍光検出法によって分析した。
【図１４ｄ２】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｄ．成体毛色キメラのゲノムＤＮＡのマイクロサテライト分析。多型のマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７を、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、アガロースゲルおよび蛍光検出法によって分析した。
【図１４ｄ３】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｄ．成体毛色キメラのゲノムＤＮＡのマイクロサテライト分析。多型のマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７を、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、アガロースゲルおよび蛍光検出法によって分析した。
【図１５】代表的なヒツジＥＳ細胞系（７ａ、継代５以上）のインビトロでの未分化状態および分化状態を示す。
【図１６】未分化状態の代表的なヒツジＥＳ細胞系（７ａ、継代５）のＲＴ−ＰＣＲデータを示す。
【図１７】培地１〜４で培養された胚間における胚派生物を形成したウシ胚および継代１にまでなったウシ胚の％割合の比較を示す。派生物％：χ２３＝１２．４９、ｐ＝０．００５９；継代％χ２３＝９．９６、ｐ＝０．０１８９。ａ 観察（すなわち、派生物％、継代％）と処理との間に正の相関がある。ｂ 観察と処理との間に負の相関がある。
【図１８】培地１〜４で培養された胚間における継代３（Ｐ３）または継代６（Ｐ６）まで胚性幹細胞系を形成した胚の％割合の比較を示す。Ｐ３：χ２３＝１２．０２、ｐ＝０．００７３；Ｐ６：χ２３＝１３．８１、ｐ＝０．００３２。ａ 観察（すなわち、Ｐ３またはＰ６の細胞系％）と処理との間に正の相関がある。ｂ 観察と処理との間に負の相関がある。
【図１９】培地１〜４で培養された胚由来のウシ胚性幹細胞コロニーの継代０でのコロニー増殖の比較を示す。
【図２０】培地１〜４で培養された樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−４）の最初の継代（すなわち、Ｐ２３＋１）の間のコロニー増殖の比較を示す。
【図２１】（ａ、ｂ）コントロール培地、（ｃ、ｄ）培地２、（ｅ、ｆ）培地３または（ｇ、ｈ）培地４で、（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）３７日間または（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）５７日間培養されたウシ胚性幹細胞コロニーの形態の比較を示す。培養は、継代４、５または６においてであった。
【図２２】（ａ）コントロール培地、（ｂ）培地２、（ｃ）培地３または（ｄ）培地４で１０日間培養された樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−１）由来のウシ胚性幹細胞コロニーの形態の比較を示す。培養は、Ｐ１９＋１においてであった。スケールバー＝２ｍｍ。
【図２３】（ａ）コントロール培地、（ｂ）培地２、（ｃ）培地３または（ｄ）培地４で単離されたコロニー由来のウシ胚性幹細胞の形態の比較を示す。培養は、Ｐ５またはＰ７においてであった。
【図２４】（ａ）コントロール培地、（ｂ）培地２、（ｃ）培地３または（ｄ）培地４で培養された樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−１）由来のウシ胚性幹細胞の形態の比較を示す。培養は、Ｐ１８＋１においてであった。
【図２５】培地１〜４で単離されたＥＳ細胞系由来のＥＳ細胞についての培養の間の多能性の遺伝子発現プロフィールの比較を示す。Ｐ１、Ｐ３、Ｐ７でコントロール（培地１）系；Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４で培地２系；Ｐ２、Ｐ３、Ｐ６で培地３系；Ｐ１、Ｐ３、Ｐ６で培地４系。すべてのゲルの図について、遺伝子順序は、左から右に向かって以下の通り：β−Ａｃｔｉｎ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ１、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇ。
【図２６】培地１〜４で単離されたＥＳ細胞系由来のウシＥＳ細胞についての多能性の遺伝子発現プロフィールの比較を示す。これは、（ａ）継代１と（ｂ）後の継代とでのいくらかの変化を示す。コントロールの例はＰ４およびＰ７由来であり、培地２の例はＰ４およびＰ６由来であり、培地３の例はＰ５およびＰ６由来であり、そして培地４の例はＰ４およびＰ６由来である。すべてのゲルの図について、遺伝子順序は、左から右に向かって以下の通り：β−Ａｃｔｉｎ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ１、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇ。
【図２７】１、４または５継代にわたって培地１〜４で培養された樹立ＥＳ細胞系（ＢＥＳ−４）由来のウシＥＳ細胞についての多能性の遺伝子発現プロフィールの比較を示す。すべてのゲルの図について、遺伝子順序は、左から右に向かって以下の通り：β−Ａｃｔｉｎ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ１、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇ。
【図２８】インビトロで分化を促進する条件に置かれた場合の樹立ウシＥＳ細胞系由来の外植片の応答の比較を示す。（ａ）培地２で培養された外植片から形成された胚様体。（ｂ）培地３で培養された外植片から形成された胚様体。（ｃ）および（ｄ）培地４で培養された外植片由来の細胞は、培養容器に付着し、分化し始めた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
多能性細胞とは、胚性幹（ＥＳ）細胞と呼ばれるものを含むが、これに限定されない。多能性細胞（ＥＳ細胞を含む）の特徴的な性質としては、多能性発生期に関わる複数の遺伝子の発現、供給源動物に存在するありとあらゆる組織タイプを代表する細胞に分化する能力、キメラに寄与する能力、および、特にキメラの生殖系列に寄与する能力が挙げられる。例えば、ＥＳ細胞のような真性多能性細胞は、多能性関連遺伝子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのすべてではないとしても多くを発現することが期待される。特に、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２の発現は、細胞がＥＳ細胞である決定的な最初の指標を提供すると広く考えられている。キメラにおける生殖系列遺伝および３つの一次胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてから分化した細胞を含む奇形腫または奇形癌を生じる能力もまた、細胞がＥＳ細胞であることの決定的な指標として広く考えられている。
【００１３】
ＧＳＫ３阻害とは、１以上のＧＳＫ３酵素の阻害をいう。したがって、ＧＳＫ３インヒビターはＧＳＫ３酵素ファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーを阻害し得る。ＧＳＫ３酵素ファミリーは周知であり、ＧＳＫ３−αおよびＧＳＫ３−βが挙げられるが、これらに限定されない。多くの変異型が記載されている（例えば、Schafferら; Gene 2003; 302（1-2）: 73-81参照）。特定の実施態様ではＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３−αインヒビターもまた適切であり、そして一般に本発明において使用されるインヒビターは両方ともを阻害する。広い範囲のＧＳＫ３インヒビターが公知である（例証として、インヒビターＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６）。他のインヒビターが公知であり、そして本発明において有用である。さらに、ＧＳＫ３−βの活性部位の構造は特徴付けられており、特異的なインヒビターおよび非特異的なインヒビターと相互作用する主要残基が同定されている（Bertrandら；J Mol Biol．2003；333（2）：393-407）。この構造特徴付けによって、さらなるＧＳＫインヒビターが容易に同定され得る。
【００１４】
ある実施態様のインヒビターは、ＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αに特異的であり、実質的にｅｒｋ２を阻害せず、そして実質的にｃｄｃ２を阻害しない。インヒビターは、ＩＣ５０値の比として測定した場合、マウスｅｒｋ２および／またはヒトｃｄｃ２よりもヒトＧＳＫ３に対して、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２００倍、非常に好ましくは少なくとも４００倍の選択性を有する。ここで、ＧＳＫ３ ＩＣ５０値とは、ヒトＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αについての平均値をいう。ＣＨＩＲ９９０２１およびＣＨＩＲ９８０１４について良好な結果が得られており、これらは両方ともＧＳＫ３に特異的である。ＧＳＫ３インヒビターの例は、Bennett Cら、J. Biol. Chem., 277巻, 34号, 2002年8月23日, 30998-31004頁およびRing DBら、Diabetes, 52巻, 2003年3月, 588-595頁に記載されている。ＣＨＩＲ９９０２１の使用に適した濃度は、０．０１〜１００、好ましくは０．１〜２０、より好ましくは０．３〜１０μＭの範囲にある。
【００１５】
ＧＳＫ３阻害はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて好都合に達成され得る。代表的に、ＧＳＫ３遺伝子のすべてまたは一部に対して相補的である２本鎖ＲＮＡ分子が多能性細胞に導入され、したがって、ＧＳＫ３をコードするｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後機構は、目的のＧＳＫ３遺伝子の発現を低減または停止させることとなる。ＲＮＡｉを用いてＧＳＫ３阻害を達成するための適切な技術およびプロトコールは、公知である。
【００１６】
本明細書中においてＭＥＫインヒビターとは、一般的なＭＥＫインヒビターをいう。したがって、ＭＥＫインヒビターとは、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２およびＭＥＫ３を含むタンパク質キナーゼのＭＥＫファミリーメンバーの任意のインヒビターをいう。また、ＭＥＫ１インヒビター、ＭＥＫ２インヒビターおよびＭＥＫ３インヒビターをいう。ＭＥＫインヒビターは、ＭＥＫキナーゼファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバーまたはすべてのメンバーを阻害し得る。当該技術分野で既に公知の適切なＭＥＫインヒビターの例としては、ＭＥＫ１インヒビターであるＰＤ１８４３５２およびＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２のインヒビターであるＵ０１２６およびＳＬ３２７、ならびに、Daviesら（2000）（Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J. 351, 95-105）に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＰＤ１８４３５２は、他の公知のＭＥＫインヒビターと比較した場合に、高い特異性および効力を有することが見出されている。他のＭＥＫインヒビターおよびＭＥＫインヒビターのクラスは、Zhangら（2000）Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 10:2825-2828に記載されている。炭疽菌の致死因子が、ＰＤ０９８０５９のものと同様のＭＡＰＫＫ阻害プロフィールを示すことも見出された（Duesberyら、1999）。さらなる適切なＭＥＫインヒビターとしては、ＰＤ０３２５０９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＣＩ−１０５５が挙げられる。
【００１７】
ＭＥＫキナーゼの阻害はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて好都合に達成され得る。代表的に、ＭＥＫ遺伝子のすべてまたは一部に対して相補的である２本鎖ＲＮＡ分子が多能性細胞に導入され、したがって、ＭＥＫをコードするｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後機構は、目的のＭＥＫ遺伝子の発現を低減または停止させることとなる。ＲＮＡｉを用いてＭＥＫ阻害を達成するための適切な技術およびプロトコールは、公知である。
【００１８】
ＭＥＫ阻害を達成するための他のアプローチとしては、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードの構成成分の活性を阻害または低減する化合物を用いることが挙げられる。例えば、化合物は、１つ以上のマイトジェン活性タンパク質キナーゼ（例えば、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２）を阻害する。あるいは、化合物は、例えば同様の効果を有するｇｐ１３０への酵素の結合を阻害することによって、ＳＨＰ−２を阻害する。さらなる実施態様では、インヒビターはＭＥＫを阻害する。
【００１９】
あるいは、ＭＥＫの阻害は、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードの構成成分のダウンレギュレーションによって達成され得る。ＭＫＰ−３は、ＭＡＰキナーゼフォスファターゼの一例およびＥＲＫの公知のダウンレギュレータであり、そして導入遺伝子としてＥＳ細胞に導入されている。
【００２０】
キナーゼインヒビター（ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを含む）を同定するための多くのアッセイが、公知である。例えば、Daviesら（2000）には、ペプチド基質および放射性標識ＡＴＰの存在下でキナーゼをインキュベートするキナーゼアッセイが記載されている。キナーゼによる基質のリン酸化は、基質への標識の取り込みを生じる。各反応のアリコートを、リン酸セルロース紙上に固定化し、そしてリン酸中で洗浄し、遊離ＡＴＰを除去する。次いでインキュベーション後の基質の活性を測定し、そしてキナーゼ活性の指標が提供される。キナーゼインヒビター候補の存在下および不在下における相対的なキナーゼ活性は、そのようなアッセイを用いることで容易に決定され得る。Downeyら（1996）J Biol Chem.；271（35）：21005-21011にもまた、キナーゼインヒビターの同定に用いられ得るキナーゼ活性についてのアッセイが記載されている。
【００２１】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター（ＦＧＦＲ）のアンタゴニストとは、代表的にＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦＲ２を阻害する、ＦＧＦレセプターのポリペプチドまたは小分子または他のアンタゴニストをいう。したがって、ＦＧＦレセプターアンタゴニストは、ＦＧＦレセプターファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーのアンタゴニストであり得、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＦＧＦレセプターファミリーのメンバーは、代表的に、３つの免疫グロブリン様ドメインを含み、そして酸性アミノ酸領域（酸性ボックス）を提示し、この領域は、ＦＧＦファミリーメンバーのＦＧＦレセプターへの結合に関与し得る。場合によっては、２つの免疫グロブリン様ドメインのみを含む分子もまた、ＦＧＦレセプターとして機能し得る。多くのＦＧＦＲアンタゴニストが公知であり、ＳＵ５４０２およびＰＤ１７３０７４が挙げられるがこれらに限定されない。ＳＵ５４０２の適切な濃度はμＭの範囲であり、例えば０．１〜２０μＭ、好ましくは０．５〜１０μＭ、特に１〜５μＭの範囲である。発明者らは、ＰＤ１７３０７４がＳＵ５４０２の代わりに用いられ得ること、そしてＰＤ１７３０７４は約１００倍低い濃度で十分に効果的であり、このことはＦＧＦレセプターに対して、より高い親和性を有することと一致することを見出した。したがって、ＰＤ１７３０７４の適切な濃度は、１〜２００ｎＭの範囲、好ましくは５〜１００ｎＭ、特に１０〜５０ｎＭの範囲である。ドミナントネガティブ変異体ＦＧＦレセプターの導入遺伝子発現によってＦＧＦレセプターシグナリングを阻害することもまた公知である。しかし、本発明の実施態様では、遺伝子導入ベースの拮抗ではなく、小分子アンタゴニストの使用が好ましい。
【００２２】
ＦＧＦレセプターのアンタゴニストを同定するための適切なアッセイは、公知である。例えば、ＦＧＦレセプター経由のシグナリングがレポーター遺伝子の発現を活性化する細胞系が、潜在的なアンタゴニストの活性を評価するために用いられ得る。
【００２３】
有利なことに、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストと組み合わせたＭＥＫインヒビターの使用は、ＥＳ細胞の増殖を改善することが見出された。
【００２４】
好ましい実施態様では、約０．１μＭと約２５μＭとの間のＭＥＫインヒビターが用いられる。さらに好ましくは、約０．１μＭと約５μＭとの間のＭＥＫインヒビターが用いられ、より好ましくは、０．２μＭから２μＭまでである。
【００２５】
本発明による特に好ましい培地は、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および／または３μＭのＳＵ５４０２を含む。特に好ましい培地は、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および３μＭのＳＵ５４０２を含み、好ましくはＮ２Ｂ２７培地中である。ＳＵ５４０２の濃度は、異なる多能性細胞系に合うように最適化され得、代表的には１〜５μＭの範囲（例えば、２μＭ）である。
【００２６】
以下の実施例において、発明者らは、自己再生を促進するために、ＭＥＫインヒビターとともに、および特定の実施例ではＦＧＦレセプターのアンタゴニストともともにＧＳＫ３インヒビターの存在下でマウスＥＳ細胞を培養した。他の特定の実施例において、培養物中でマウス多能性細胞の自己再生を促進する方法は、ＧＳＫ３およびＭＥＫを阻害する工程、またはＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターを阻害する工程を含む。
【００２７】
必要に応じて、ｇｐ１３０下流シグナリングの活性化は、ＧＳＫ３およびＭＥＫを阻害することによって自己再生の促進をさらに増強するためにもまた用いられ得る。ｇｐ１３０下流シグナリングを活性化する分子は、時に、ｇｐ１３０アクチベーターまたはｇｐ１３０アゴニストとも言われる。１以上のｇｐ１３０下流シグナリング経路の活性化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、例えばＬＩＦレセプターのサイトカインまたは他のアゴニストの使用によって達成され得る。ｇｐ１３０を介して作用し得、したがってｇｐ１３０シグナル伝達を活性化し得るサイトカインとしては、ＬＩＦ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６＋ｓＩＬ−６レセプター、ハイパーＩＬ−６およびＩＬ−１１が挙げられるが、これらに限定されない。適切なサイトカインには、ｇｐ１３０に結合し得および／またはｇｐ１３０を介してシグナリングを活性化し得る模倣物、融合タンパク質またはキメラが含まれる。血清存在下でｇｐ１３０を介して作用するサイトカインの役割は十分に確立されているが、血清不在下で未分化細胞を維持するそれらのサイトカインの能力は限られる。
【００２８】
本発明の利点は、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下では、多能性細胞が限定培地中で増殖し得ることである。ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの組み合わせを用いることによる特別な利点は、この培地がインスリン、Ｎ２Ｂ２７またはｇｐ１３０アゴニスト（例えば、ＬＩＦ）などの他の増殖因子を含有する必要がないことである。したがって、本発明は、血清、血清抽出物、フィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物不含である培地中でのＥＳ細胞の代替のおよび／または改良された培養を可能にする。
【００２９】
マウス（Bradleyら、(1984) Nature 309: 255-56）、アメリカミンク（Mol Reprod Dev (1992) 12月; 33(4): 418-31）、ブタおよびヒツジ（J Reprod Fertil Suppl (1991); 43: 255-60）、ハムスター（Dev Biol (1988) 5月; 127(1): 224-7）およびウシ（Roux Arch Dev Biol (1992); 201: 134-141）を含む多くの哺乳動物供給源から、目的の胚性幹細胞が報告されている。しかしながら、場合によっては、完全な特徴付けがなく、複能性（multipotent）または多能性（pluripotent）細胞が、「ＥＳ細胞」または「ＥＳ様細胞」と称されていることに留意される。ＥＳ細胞の状態は、時に、細胞形態（培養物中でのいくらかの自発的な分化、嚢胞性胚葉体の形成または多能性発生期に関わる遺伝子の発現の観察）に基づいて付与されている。しかしながら、目的のＥＳ細胞のより厳格な特徴付けが、細胞が確かにＥＳ細胞であるかどうかを立証するために望ましい。これはUS6,271,436で確証されており、この文献は、ＥＳ細胞（例えば、ブタＥＳ細胞）を誘導するためのこれまでの多くの試みが、報告された細胞が多能性ＥＳ細胞であると決定的に証明できなかったことを示している。
【００３０】
ＥＳ細胞の特徴的性質としては、多能性発生期に関わる複数の遺伝子の発現、供給源動物に存在するありとあらゆる組織タイプを代表する細胞に分化する能力、キメラに寄与する能力および特にキメラの生殖系列に寄与する能力が挙げられる。例えば、真性ＥＳ細胞は、多能性関連遺伝子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのすべてではないとしても多くを発現することが期待される。特に、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２の発現は、細胞がＥＳ細胞である決定的な最初の指標を提供すると広く考えられている。キメラにおける生殖系列遺伝および３つの一次胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてから分化した細胞を含む奇形腫または奇形癌を生じる能力もまた、細胞がＥＳ細胞であることの決定的な指標として広く考えられている。
【００３１】
本明細書の特定の実施例は、マウスおよびヒトのＥＳ細胞を用い、そして一次派生物由来のラット細胞もまた用いる。本発明の方法および組成物が、霊長類（特にヒト）、齧歯類（特にマウスおよびラット）、ウシ、ヒツジ、およびブタの多能性幹細胞、特にＥＳ細胞を含む他の哺乳動物または鳥類の多能性細胞培養物の培養への適応に適していることが理解される。他の実施態様では、本発明の方法および組成物は、ウシ、ヒツジおよびブタ胚の一次派生物由来の多能性細胞を培養するために用いられ得る。
【００３２】
本発明の方法および組成物は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち１つ以上、好ましくは任意の２つ以上を発現する多能性細胞（ＥＳ細胞を含む）を培養するのに特に適している。好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する。代表的に、多能性細胞は培養物中で形態的に未分化であり、培養物中で長期間（代表的に少なくとも１０、２０または５０継代を上回る）にわたって、著しい分化または生存力の低下または多能性細胞特性の損失なく維持され得る。本発明の培地中でまたは本発明の方法を用いて単離または培養された多能性細胞は、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得ることが予想される。例えば、細胞は、培養物中で４、６、８、１０、１２週またはそれ以上にわたって維持され得、そしてなお、それらの本来の特性（本明細書に記載の多能性細胞に特異的な特性を含む）を実質的に保持する。例証として、本明細書に記載の手順を用いて単離されたラット多能性細胞は、増殖速度の低下も著しい分化もなく、６ヶ月間にわたって連続培養に供された。
【００３３】
そのような特性としては、キメラに寄与する能力（キメラの生殖系列に寄与することを含む）が挙げられる。例えば、マウスＥＳ細胞は、例えばマウス胚盤胞に注入された場合に、キメラに寄与し得る。同様に、ラット多能性細胞およびＥＳ細胞（本明細書で初めて提供された）は、キメラの全細胞がラット細胞であるキメラに寄与し得る。他の哺乳動物（例えば、本明細書に記載のような）由来のＥＳ細胞も、同様にキメラに寄与し得る。ＥＳ細胞はまた、例えば免疫不全マウスへのＥＳ細胞の注入後、奇形腫または奇形癌を形成し得る。代表的に、奇形腫または奇形癌は、３つの胚葉のすべてから分化した細胞を含むが、場合によっては１つまたは２つの胚葉のみから分化した細胞が観察され得る。
【００３４】
本発明の第２の局面は、自己再生を促進するための多能性細胞、特にＥＳ細胞の培養方法を提供し、該方法は：
（１）ＧＳＫ３のインヒビター；
（２）ＭＥＫのインヒビター；および、必要に応じて、
（３）ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト、
を含む培地中で該細胞を維持する工程を含む。
【００３５】
本発明の方法は、一般的に、血清不含および血清抽出物不含である培地中で、血清または血清抽出物の存在下で予め継代された多能性細胞を増殖（ＥＳ細胞の増殖を含む）させるために用いられ得る。好ましくは、このような方法はまた、フィーダー細胞および／またはフィーダー細胞抽出物の不在下で行われる。例えば、以下の工程を含むＥＳ細胞の培養が行われ得る：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
該培地から血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去して、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物不含であるようにする工程；および
続いて、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程。
【００３６】
本発明は、ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法もまた提供し、該方法は：
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む。
【００３７】
さらに必要に応じて、細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養される。
【００３８】
選択マーカーは、抗生物質耐性をコードし得、例えばEP-A-0695351に記載のような、細胞表面マーカーまたは他の選択マーカーであり得、そして好ましくは、所望の細胞で選択マーカーを優先的に発現するプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
さらなる実施態様において、本発明は、多能性（特にＥＳ）細胞の培養方法を提供し、該方法は、培養容器（例えばプレート上の個々のウェル）へ個々の細胞を移す工程、および、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下で該細胞を培養する工程を含み、それにより、すべての細胞が単一細胞の子孫である多能性（特にＥＳ）細胞のクローン集団を得る。必要に応じて、細胞はまた、ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養され得る。
【００４０】
一旦、ＥＳ細胞の安定で均一な培養物が得られると、培養条件は、外胚葉、中胚葉または内胚葉の細胞運命から選択される１以上の細胞タイプへ細胞の分化を方向づけるように変更され得る。サイトカインおよびシグナリング因子の添加または除去は、高効率での特定の分化細胞集団の誘導を可能にし得る。非神経外胚葉運命へのＥＳ細胞の分化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下でＥＳ細胞を維持すること、ならびに次いで、サイトカインを除去する一方、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを維持すること、および／または分化を方向づけ得るさらなるシグナリング分子を添加することによって達成され得る。あるいは、細胞は、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で維持され得、次いで、該インヒビターの１つまたは両方を除去すること、および／または分化を方向づけ得るシグナリング分子を添加することによって分化を方向づけ得る。上記の方法はすべて、必要に応じて、プロセスの産物である分化した細胞を得る工程および／または単離する工程を含む。
【００４１】
本発明のさらなる局面は、細胞培養培地を提供する。ある培地は、多能性（特にＥＳ）細胞の自己再生のためであり、該培地は、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫのインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを含む。該培地は、必要に応じてｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターもまた含み得る。本発明の別の培地は、幹細胞培養培地であり、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを含む。すべての培地は、好ましくはさらに基本培地を含む。さらに、すべての培地は、好ましくはｇｐ１３０のアゴニスト不含であり、したがって、好ましくはＬＩＦ不含である。
【００４２】
本発明は、血清および血清抽出物不含である培地を提供する。１つのこのような培地は：
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＧＳＫ３インヒビター；および
鉄トランスポーター；
を含み、ここで、該培地は、必要に応じて、血清および血清抽出物不含である。
【００４３】
培地は、好ましくはＦＧＦＲアンタゴニストもまた含む。培地は、必要に応じてｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターもまた含み得る。
【００４４】
多能性幹細胞（特にラットまたはマウス細胞）に好ましい培地は、血清不含およびｇｐ１３０アゴニスト不含であり得、そしてＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む。培地構成成分の置換は、本明細書に記載のようになされ得る。
【００４５】
基本培地は、細胞のために炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラルの必須供給源を供給する培地である。基本培地は、一般的にタンパク質不含であり、そして細胞の自己再生をそれ自体で支持し得ない。鉄トランスポーターは、鉄の供給源を提供し、または培養培地から鉄を取り込む能力を提供する。適切な鉄トランスポーターとしては、トランスフェリンおよびアポトランスフェリンが挙げられる。培地は、１以上のインスリンまたはインスリン様増殖因子、およびアルブミン（好ましくは組換え体）またはアルブミン代替物をさらに含み、そしてフィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物不含であることが好ましい。培地は、アポトーシスのインヒビターまたは培養物中の多能性細胞の維持を促進する任意の他の構成成分もまた含み得る。例えば、培地は、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ−２７６３２（Watanabeら、Nature Biotechnology (2007) 25(6): 681-686）を含み得る。
【００４６】
本発明の特定の培地は、付加的な基本培地とともにまたはなしで、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビター、インスリン、アルブミンおよびトランスフェリンを含む。この培地では、ＬＩＦが、必要に応じて含まれ得、そしてｇｐ１３０シグナリングの他のアクチベーターによって置換され得る。しかし、好ましい培地は、ｇｐ１３０レセプター結合サイトカインであるＬＩＦを含み、その適切な濃度は、一般的には１０Ｕ／ｍｌと１０００Ｕ／ｍｌとの間、より好ましくは５０Ｕ／ｍｌと５００Ｕ／ｍｌとの間、さらにより好ましくは１００Ｕ／ｍｌの範囲にある。ＧＳＫ３およびＭＥＫインヒビターは、好ましくは本明細書により詳細に記載の通りである。
【００４７】
本発明は、胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法をさらに提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００４８】
必要に応じて、該単離した１または複数の細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターの存在下で培養される。ＦＧＦレセプターのアンタゴニストもまた存在させ得る。
【００４９】
好ましくは、前記方法は、胚盤胞をＬＩＦ中で、より好ましくは２〜４日の期間にわたって培養する工程を含む。単離した１または複数の細胞は、好ましくは無血清培地中で培養される。代表的には、これらの細胞は、凝集塊として再プレートされる。胚盤胞はまた、好ましくは、無血清培地中で、必要に応じてＢＭＰレセプターのアゴニストの不在下で、培養される。
【００５０】
本発明によれば、細胞の培養は、接着培養で行われることがさらに好ましく、これは培養基材上に細胞接着タンパク質を含むことによって促進され得る。本発明によれば、単層培養で多能性細胞を培養することもまた好ましいが、必要に応じて、細胞を懸濁培養でまたはプレ細胞凝集塊として増殖させる；細胞をビーズ上であるいは他の適切な足場（例えば膜または他の３次元構造物）上で増殖させることもできる。
【００５１】
驚くべきことに、本発明の組成物および方法は、ラットからの多能性細胞およびＥＳ細胞の誘導に特に適していることが見出された。いくつかの報告がラット多能性細胞が産生されたことを主張するが（Vassilievaら (2000) Exp Cell Res 258(2):361-373頁; Schultzeら (2006) Methods Mol Biol 329: 45-58頁）、提示された証拠は、全く決定的ではない。Schultzeらは、ラットＥＳ細胞系を誘導および維持するほとんどの試みが失敗し、研究者が研究のこの方針を断念することを余儀なくされたことを認めている。同様に、Vassilievaらは、ラットＥＳ細胞を生じさせるそれまでの試みが、目的のＥＳ細胞が培養物中で短期間維持し得るのみであったために、あるいは実験が反復可能でなかったために、失敗であったことを述べている。さらに、当該分野で記載された細胞系は、多能性ＥＳ細胞ではないことが証明された。目的の名称「ＥＳ細胞」は、培養物中の限定的な分化、胚様体の形成、または多能性関連マーカーの不完全なセット（多くの場合１つの遺伝子のみ）の発現の観察に基づいて付与されている。しかしながら、そのような指標では、ＥＳ細胞の一義的な同定は不可能であり、単に複能性の（多能性ではない）細胞が単離されたことを示すだけであり得る。多能性の多くの重要な指標は実証されておらず、ラットＥＳ細胞が実際に単離されたかどうかについてはかなりな疑問が残る。特に、（ｉ）３つの胚葉のすべてから分化した組織を含む奇形腫または奇形癌を形成する能力、（ｉｉ）キメラの生殖系列のコロニーを形成する能力、または（ｉｉｉ）複数の多能性関連遺伝子の連動された発現、特にＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２の連動された発現が実証されたものは、報告されたラット細胞系にない。
【００５２】
以下に詳述した比較例では、目的のラットＥＳ細胞を得る報告の再現は失敗に終わった。
【００５３】
しかしながら、本発明の方法はラット多能性細胞およびＥＳ細胞の誘導に適していることが示され、これらの細胞は、解離されたラット胚盤胞の内部細胞塊の一次派生物から単離した。したがって、本発明は、胚盤胞から多能性ラット細胞を誘導する方法を提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊の一次派生物を単離および解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊の一次派生物から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００５４】
代表的に、ラット胚盤胞を、２から４日間（例えば、３日間）にわたって培養する。胚盤胞はまた、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養し得る。単離されたラット多能性細胞は、代表的に、本明細書に記載の多能性細胞およびＥＳ細胞の性質を有する。
【００５５】
いくつかの実施態様では、本方法は、栄養外胚葉の除去によって胚盤胞から内部細胞塊を単離するように、ならびにＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で内部細胞塊を培養するように、改変される。
【００５６】
本明細書に記載の方法は、他の動物からの多能性細胞の誘導にもまた適している。例えば、本明細書に記載の工程は、ウシおよびヒツジ胚盤胞で行われ、したがって、ウシまたはヒツジ一次派生物からの多能性細胞の誘導が可能である。本明細書に記載の方法は、ヒト胚盤胞からヒト多能性細胞を誘導するためにもまた用いられる。本方法は、ブタ胚盤胞で、ブタ一次派生物から多能性細胞を誘導するためにもまた行われ得る。
【００５７】
本明細書に記載の方法は、非許容的なマウス系統から多能性細胞を誘導するためにもまた用いられる。したがって、本発明は、これまでＥＳ細胞の誘導に対して非許容的であると考えられてきたマウス系統由来のマウス多能性細胞もまた提供する。
【００５８】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法によって得られるラット多能性細胞を提供する。本発明はまた、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する多能性ラット細胞もまた提供する。好ましくは、多能性ラット細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する。多能性ラット細胞は、アルカリフォスファターゼもまた発現し得、そして本明細書に記載の多能性細胞およびＥＳ細胞のいずれかの特性、例えば、キメラの生殖系列のコロニーを形成する能力、および内胚葉、中胚葉および外胚葉から誘導された分化した組織を含む奇形腫または奇形癌を形成する能力を有し得る。
【００５９】
したがって、本発明は、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ（Ｄｐｐａ３）、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する多能性ラット細胞を提供する。本発明の多能性ラット細胞は、多能性状態の１つ以上のさらなるマーカーそしてまたは内部細胞塊に関わるマーカー（例えば、Ｅｒｒβ、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｂｘ３およびＧｂｘ２が挙げられる）もまた発現し得る。多能性ラット細胞は、ＦＧＦ５を発現しない。さらに、本発明のラット多能性細胞は、胚盤葉上層（epiblast）および初期胚葉に関わる遺伝子（例えば、Ｏｔｘ２、Ｅｏｍｅｓ、Ｆｏｘａ２、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７およびＣｅｒ１）を発現しないかまたは有意レベルで発現しない。本発明のラット多能性細胞の分析では、胚盤葉下層（hypoblast）および胚体内胚葉（definitive endoderm）マーカーＧａｔａ６およびＳｏｘ１７、中胚葉マーカーｂｒａｃｈｙｕｒｙおよびＦｌｋ１、および神経外胚葉（neurectoderm）マーカーＰａｘ６およびｎｅｓｔｉｎの発現を検出できなかった。これらの特性、および本発明のラット多能性細胞の他の特性は、本発明の他の哺乳動物多能性細胞によってもまた示される。
【００６０】
したがって、本発明の多能性細胞は、近年の着床後卵筒期の胚盤葉上層から誘導された幹細胞（ＥｐｉＳＣという）と見分けられ得る（Tesar P.J.ら Nature (2007) 448: 196-9; Brons I.G.M.ら Nature (2007) 448: 191-5）。この幹細胞は、着床前胚に再統合してキメラに寄与する能力をほとんどまたは全く示さない。本発明の多能性細胞と対照的に、ＥｐｉＳＣは、本発明の多能性細胞が分化するように誘導される条件下で、単一細胞への解離後容易に増殖できず、ＥＳ細胞または初期胚盤葉上層のマーカーを発現せず、そしてＦＧＦ２＋アクチビン中での維持を必要とする。
【００６１】
本発明の多能性細胞（ラット、ヒツジ、ウシおよびブタ多能性細胞を含む）は、培養物中で形態的に未分化である。本発明の多能性細胞は、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る。好ましくは、多能性細胞は、培養物中で４、６、８、１０または１２週間以上にわたって、より好ましくは、約３、６、９または１２ヶ月以上にわたって、維持され得る。培養物中に維持された後、多能性細胞の子孫は、原多能性細胞の特性のうち１つ以上、好ましくはすべてを保持する。
【００６２】
本発明の多能性細胞は、キメラに寄与し得る。特に、それらは、キメラの全細胞が多能性細胞と同種の細胞であるキメラに寄与し得る。例えば、多能性ラット細胞がキメラの産生に用いられた場合、キメラの細胞のすべてがラット細胞である。本発明の多能性細胞は、好ましくはキメラの生殖系列に寄与し得る。
【００６３】
本発明の多能性細胞は、３つの胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る。
【００６４】
本発明の多能性細胞が正常核型を有する、すなわち、多能性細胞の核型が、同種および／または同系列由来の細胞の正常核型に対応することもまた、好ましい。
【００６５】
代表的に、本発明の多能性細胞（ラット、ヒツジ、ウシおよびブタ多能性細胞を含む）は、以下の特性のうち１つ以上、好ましくは２つ、３つ、４つまたは５つ、そして最も好ましくはすべてを示す：
ａ）キメラを形成する能力；
ｂ）培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖する能力；
ｃ）Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２の発現；
ｄ）それらが、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない；
ｅ）それらが、アクチビンレセプター遮断によって分化が誘導されないかまたは死滅する；および
ｆ）該多能性細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される。
【００６６】
どんな特定の理論によっても束縛されることも望まないが、ＭＥＫ阻害が多能性表現型の維持に特に重要であると考えられる。したがって、本発明は、ＭＥＫインヒビターの存在下で維持される多能性幹細胞およびその集団もまた提供する。好ましくは、多能性細胞および集団は、ＭＥＫインヒビターおよび多能性状態を維持するために適切な１つ以上のさらなる因子（例えば、ＧＳＫ３インヒビター、ＦＧＦレセプターのアンタゴニストおよびｇｐ１３０を介して作用するサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない）の存在下で維持される。
【００６７】
本発明は、本明細書に記載の多能性ラット細胞の集団もまた提供する。本発明の特定の方法によって得られ、したがって本発明によって提供されるラット多能性細胞の集団は、均質性が高いことが見出され、上述の特性に従って評価された多能性細胞を、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％含有する。本発明の特定の実施態様では、９８％以上の純度のラット多能性細胞培養物が得られた。例えば、本発明は、細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する多能性ラット細胞の集団を提供する。好ましくは、細胞の少なくとも９５％が、Ｎａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する。
【００６８】
他の局面では、本発明は、多能性ラット細胞とＭＥＫインヒビターを含む培養培地とを含む、多能性ラット細胞の培養物を提供する。好ましくは、培地は、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む。必要に応じて、培地は、多能性細胞の増殖を支持するために適切な１つ以上のさらなる構成成分（例えば本明細書に記載の構成成分の１つ以上）を含有する。
【００６９】
本発明は、本発明の方法によって得られる、本明細書に記載の他の動物から誘導された多能性細胞、例えばウシ、ヒツジおよびブタ多能性細胞もまた提供する。本発明によれば、そのような多能性細胞は、本明細書に記載の多能性細胞およびＥＳ細胞の特性のうち１つ以上を有する。
【００７０】
したがって、本発明は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する、多能性マウス細胞以外の多能性哺乳動物細胞を提供する。好ましくは、多能性細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する。より好ましくは、多能性細胞は、アルカリフォスファターゼをさらに発現する。好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する。代表的に、多能性細胞はＦＧＦ５を発現しない。本発明の多能性細胞は、多能性状態の１つ以上のさらなるマーカーそしてまたは内部細胞塊に関わるマーカー（例えば、Ｅｒｒβ、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｂｘ３およびＧｂｘ２が挙げられる）もまた発現し得る。さらに、本発明の多能性細胞は、胚盤葉上層および初期胚葉に関わる遺伝子（例えば、Ｏｔｘ２、Ｅｏｍｅｓ、Ｆｏｘａ２、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７およびＣｅｒ１）を発現しないかまたは有意レベルで発現しない。
【００７１】
本発明は、本明細書に記載の多能性細胞の集団（ウシ、ヒツジおよびブタ多能性細胞の集団を含む）もまた提供する。本発明の特定の方法によって得られ、したがって本発明によって提供される多能性細胞の集団は、好ましくは、上述の特性に従って評価された多能性細胞を少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％含有する。いくつかの特定の実施態様では、本発明は、９８％以上の多能性細胞を含有する集団を提供する。例えば、本発明は、細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する多能性細胞の集団を提供する。好ましくは、細胞の少なくとも９５％が、Ｎａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する。
【００７２】
本明細書に記載の培地（特に、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地）で培養されたＥＳ細胞の集団が、例えば、ＮａｎｏｇまたはＯｃｔ４などの多能性関連マーカーについて免疫染色することによって分析される場合に、従来の培地中で維持されたＥＳ細胞よりも著しく高い均質性を示すことが見出された。本明細書に記載の培地を用いた多能性の維持は、多能性細胞の均質性の高い集団が、著しい細胞分化がなく、そして多能性細胞の正選択および分化した細胞タイプの逆選択を定期的に行う必要なく、培養物中で長期間にわたって維持され得るという点で、格別な利点を提供する。
【００７３】
他の局面では、本発明は、多能性細胞とＭＥＫインヒビターを含む培養培地とを含む、多能性細胞の培養物を提供する。好ましくは、培地は、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む。必要に応じて、培地は、多能性細胞の増殖を支持するために適切な１つ以上のさらなる構成成分（例えば本明細書に記載の構成成分の１つ以上）を含有する。
【００７４】
本発明の実施例で用いられる培養培地は、好ましくは血清アルブミンもまた含む。これは精製型または好ましくは組換型で用いることができ、そして組換型であれば、これは、潜在的な夾雑因子であるサイトカインなどが存在しないという利点がある。培養培地は血清アルブミンを含有する必要がなく、そしてこの構成成分は省くことができ、あるいは他のバルクタンパク質に、またはWilesらによって記載された合成ポリマー（ポリビニルアルコール）に、置き換えることができる。
【００７５】
本発明の特に好ましい培地は、完全限定の培地である。この培地は、非限定の構成成分（いわゆる、その内容が不明である、あるいは非限定の因子または非特定の変動因子を含有し得る、構成成分）を含有しない。完全限定培地を用いることの利点は、多能性細胞の培養およびその後の操作について、効率的および一貫したプロトコールが得られることである。さらに、多能性状態の細胞の維持が高効率および高い予測性で達成でき、そして限定培地を用いて培養された細胞で分化が誘導される場合に、非限定培地が用いられた場合と比べて、分化シグナルに対する応答がより均質であることが見出される。
【００７６】
本発明の方法は、分化細胞を得る方法もまた包含し、この方法は、記載のような多能性細胞を培養する工程、および細胞の分化を許容するまたは生じさせる工程を含み、ここで、該細胞は、他の細胞タイプ（多能性幹細胞を含む）と比較して所望の分化細胞の差次的発現を可能にする選択マーカーを含有し、それによって、選択マーカーの差次的発現が、所望の分化細胞の優先的な単離および／または生存および／または分割をもたらす。選択マーカーは、所望の分化細胞で発現し得るが、他の細胞タイプでは発現し得ず、または発現レベルが所望の分化細胞と他の細胞タイプとで異なり得、それによって、選択マーカーの発現を選択できる。分化細胞は、組織幹細胞または前駆細胞（複能性のまたは単分化能性の幹細胞または前駆細胞を含む）であり得、そして最終分化細胞であり得る。本発明は、前記方法によって得られる分化細胞およびそのような分化細胞の集団もまた提供する。
【００７７】
本発明によって得られる分化細胞の例としては、生殖幹細胞、体性幹／前駆細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞および神経幹細胞が挙げられる。１つの実施態様では、分化細胞は神経細胞である。他の分化細胞タイプおよび分化細胞の集団が、この方法によって得られることは明らかである。
【００７８】
一般的にまた、本発明は、本明細書に記載された発明の方法のいずれかに従うことにより得られた細胞にまで及ぶ。本発明の細胞は、創薬のためのアッセイに用いられ得る。本発明の細胞は、細胞治療にもまた用いられ得、したがって、本発明の方法は、ＭＥＫの阻害およびＧＳＫ３の阻害および必要に応じてＦＧＦシグナリングの拮抗の組み合わせを用いて、多能性細胞を誘導および／または維持する工程、そこから細胞治療のための細胞を誘導する工程、およびそれらの細胞を細胞治療に用いる工程を含む。必要に応じて、その組み合わせは、ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターの不在下で用いられる。
【００７９】
本発明は、ラット、ヒツジ、ウシおよびブタ多能性細胞、およびＥＳ細胞の誘導に対して非許容的であると考えられているマウス系統由来の多能性細胞を誘導する、さらなる方法をさらに提供する。
【００８０】
したがって、本発明は、胚盤胞から多能性ラット細胞を誘導する方法を提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊の一次派生物を単離および解離する工程；
（４）該内部細胞塊の解離した一次派生物から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００８１】
関連する局面では、本発明は、胚盤胞から多能性哺乳動物細胞を誘導する方法を提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００８２】
必要に応じて、方法は、ＬＩＦ中で胚盤胞を培養する工程を含む。好ましい実施態様では、胚盤胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する。
【００８３】
特定の実施態様では、胚盤胞は、ラット胚盤胞、ウシ胚盤胞、ヒツジ胚盤胞、ブタ胚盤胞、またはＥＳ細胞の誘導に対して非許容的なマウス系列由来のマウス胚盤胞である。
【００８４】
いくつかの実施態様では、工程（４）の１または複数の細胞は、内部細胞塊の解離した一次派生物から単離される。
【００８５】
本発明によって提供される多能性細胞を誘導する方法は、好ましくはＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち１つ以上を発現し、より好ましくはＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち任意の２つ以上を発現する多能性細胞を提供する。好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現し、そして好ましくは、多能性細胞は、アルカリフォスファターゼをさらに発現する。特に好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する。多能性細胞がＦＧＦ５を発現しないこともまた好ましい。
【００８６】
本発明の方法は、培養物中で形態的に未分化である多能性細胞の提供を可能にする。代表的に、多能性細胞は、本明細書に記載したように、培養物中で長期間にわたって維持され得る。例えば、多能性細胞は、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る。好ましくは、多能性細胞は、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る。代表的に、多能性哺乳動物細胞の子孫は、培養物中で維持された後、原多能性哺乳動物細胞の特性を保持する。
【００８７】
本発明の方法は、キメラに寄与し得る多能性細胞を提供する。特に、それらは、キメラの全細胞が多能性哺乳動物細胞と同種の細胞であるキメラに寄与し得る。好ましくは、多能性細胞は、キメラの生殖系列に寄与し得る。
【００８８】
本発明の方法によって産生された多能性細胞は、さらに、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る。多能性細胞は、培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖せず、そしてアクチビンレセプター遮断によって分化が誘導されない。多能性哺乳動物細胞の増殖および／または繁殖は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される。
【００８９】
本発明のさらなる局面では、本発明の方法によって得られるラット多能性細胞、ヒツジ多能性細胞、ウシ多能性細胞、ブタ多能性細胞および非許容的なマウス系列由来のマウス多能性細胞が提供される。本発明は、本発明の方法によって得られる多能性細胞の集団もまた提供する。
【００９０】
本発明のすべての局面の好ましい実施態様では、１または複数の多能性細胞は、ＥＳ細胞である。
【００９１】
本発明のさらなる局面は、遺伝子操作ラットを得る方法を提供し、該方法は、ラット多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞をラット胚に導入して遺伝子改変ラットを産生する工程を含む。
【００９２】
本発明のなおさらなる局面は、マウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物を得る方法を提供し、該方法は、哺乳動物多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞を非ヒト哺乳動物胚に導入して遺伝子改変哺乳動物を産生する工程を含む。
【００９３】
遺伝子操作哺乳動物は、例えば、任意の非ヒト哺乳動物であり得、ラット、ウシ、ヒツジまたはブタを含む。好ましい実施態様では、遺伝子操作哺乳動物は、目的の遺伝子についてのホモ接合性ヌルである。他の実施態様では、遺伝子改変は、ラットまたは非ヒト哺乳動物中の遺伝子を対応するヒト遺伝子と置き換えることを含む。さらなる実施態様では、遺伝子改変は、１以上の目的の遺伝子をノックアウトすること、または目的の遺伝子の標的挿入を含む。そのような遺伝子操作は、当業者が容易に利用可能な技術を用いて行われ得る。
【００９４】
本発明は、本発明の方法によって得られる、遺伝子操作ラットおよびマウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物もまた提供する。そのような遺伝子操作哺乳動物は、いくつかの適用、例えば、１以上の目的の遺伝子の生理学的な役割の評価において用いられ得る。本発明の遺伝子操作ラットまたは遺伝子操作非ヒト哺乳動物の他の用途は、創薬および／または試験におけるものである。いくつかの実施態様では、これは、例えば潜在医薬品の潜在副作用を評価するための、毒性の研究を含み得る。さらなる実施態様では、本発明の遺伝子操作ラットまたは遺伝子操作非ヒト哺乳動物は、ヒトまたは動物疾患のモデルとして用いられる。
【００９５】
本発明の遺伝子改変ラットの使用は、ラットが生体医学研究の多くの領域で好ましいモデル生物であるため、格別な利点であり得る。例えば、行動回復および認知修復の評価は、マウスよりもラットにおいて非常に精巧である。
【００９６】
本発明の多くの利点は、上記の通りでありまたは明らかである。比較的無毒性および細胞透過性である細胞培養構成成分が同定され得る。本発明の特定の実施態様において用いられるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストは、特に、例えばタンパク質サイトカインの精製と比較して、容易に精製され得る。組換えタンパク質は、作製が高価であり得、そして小分子の培地構成成分は、より安価に生産されかつ貯蔵がより安定であり得、より広い有効濃度範囲を伴い得る。さらに、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦＲアンタゴニストの使用は、以前は得られなかった哺乳動物多能性細胞タイプの誘導および維持を可能にする。
【００９７】
以下に記載の特定の実施態様は、無血清の完全限定培地でＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ１８４３５２およびＳＵ５４０２の組み合わせを用い、そしてマウスＥＳ細胞の自己再生の改善を示し、ほとんど分化を示さなかった。ＢＭＰの存在下でＥＳ細胞を培養する場合、いくつかの神経発生があることが時々報告される。これは、本発明の実施例においては見られなかった。
【００９８】
本発明を、ここで、特定の実施例においてさらに説明し、図によって示す。
【００９９】
実施例において、用語２ｉ培地または２ｉは、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地を示すために用いられる。用語３ｉ培地または３ｉは、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地を示すために用いられる。
【実施例】
【０１００】
実施例１
マウスＥＳ細胞を、ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ１８４３５２およびＳＵ５４０２を含む培地で増殖させ、該培地は以下のように調製した：
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
培地
ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地の調製
１００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco 42400-010）に対して、１ｍｌのＮ２ １００×ストック溶液を添加する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＮ２の各構成成分の最終濃度は：
インスリン ２５μｇ／ｍｌ
プトレシン １６μｇ／ｍｌ
トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ
亜セレン酸ナトリウム ３０ｎＭ
プロゲステロン ６ｎｇ／ｍｌ
ＢＳＡ ５０μｇ／ｍｌ
である。
【０１０３】
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７の調製：
１００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Gibco 21103-049）に対して、２ｍｌのＢ２７（Gibco 17504-044）および１〜２Ｍ Ｌ−グルタミン（ＴＣ保存 １：１００）を添加する。
【０１０４】
Ｎ２Ｂ２７培地の調製：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地と１：１の比で混合する。この培地を、すべての化合物の希釈および細胞の増殖に用いた。
【０１０５】
この培地は、１２９系統マウスからのＥＳ細胞の誘導および維持に用い、そして非許容的なマウス系統であるＣＢＡ、および部分的に許容する系統であるＣ５７ＢＬ／６からのＥＳ細胞の誘導にもまた用いた。この培地を、ラット胚の一次派生物中の細胞の維持に用い、多能性ラット細胞が培養物中でこの培地によって維持されることを示した。
【０１０６】
したがって、ＥＳ細胞は、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの組み合わせによって維持され、そして本発明は、そのための培養方法および培地もまた提供する。
【０１０７】
実施例２
４．５ｄｐｃのラット胚（Ｅ４．５）を収集し、透明帯を酸のタイロード中で除去し、そして栄養外胚葉を除去するために免疫手術を行った。内部細胞塊を、以下の培地（３Ｉ培地）中で、ガンマ線を照射されたＤＩＡ−Ｍ細胞（Buehrら、2003に記載）のフィーダー層上に４ウエルプレート中で培養した：
３μＭ Ｃｈｉｒｏｎ ９９０２１ （ＧＳＫインヒビター）
０．８μＭ ＰＤ１８４３５２ （ＭＥＫインヒビター）
２μＭ ＳＵ５４０２ （ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト）
Ｎ２Ｂ２７中。
【０１０８】
必要に応じて、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加しても良い。
【０１０９】
望ましい場合は、フィーダー細胞として、ＤＩＡ−Ｍ細胞よりもむしろマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の初代培養物を用い得る。
【０１１０】
これらの培養物を、３日間維持した。その期間後、小さな派生物を手動で脱凝集させ、そして小さな細胞塊を、同じ培地中の新しいＤＩＡ−Ｍフィーダー上に移動させた。
【０１１１】
これらの培養物を、２週間維持した。培地を２〜３日ごとに交換し、培養物を定期的に検査した。小さくて透明なコロニーが現れた場合、これらを同様の条件でさらに移し、十分に大きい場合は脱凝集させた。
【０１１２】
培養２週間後、いくつかの培養物中に未分化細胞のコロニーが見られた。これらのコロニーのうちのいくつかはフィーダーに付着したが、より多くは、それらは丸くなり、基材から剥離した。培養物を、トリプシンＥＤＴＡまたは手動（細長いピペットの中にコロニーを引き込んで、新しいウエルの中に細胞塊を吐き出すことによって）のいずれかでコロニーを脱凝集することによって継代した。培養物を、常時、ＤＩＡ−Ｍフィーダー上および３Ｉ培地中で維持した。
【０１１３】
このようにして誘導および培養された細胞は、形態的に未分化であり（図４）、そして多能性関連遺伝子Ｎａｎｏｇ（図５および９）およびＯｃｔ４（図６および９）ならびにＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２（図９）およびアルカリフォスファターゼ（図８）を発現する。ラット細胞は、栄養外胚葉マーカーＣｄｘ２もまた発現した（図７および９）。
【０１１４】
参考文献：
Buehr, M., Nichols, J., Stenhouse, F., Mountford, P., Greenhalgh, C.J., Kantachuvesiri, S., Brooker, G., Mullins, J.M., Smith, A.G. (2003). Rapid loss of oct-4 and pluripotency in cultured rodent blastocysts and derivative cell lines. Biol Reprod 68: 222-229.
【０１１５】
実施例３
実施例２に記載のように単離されたラット１４８Ｃ ＥＳ細胞系由来の細胞を、標準的な方法を用いて奇形腫を生じさせるために用いた。要するに、ラットＥＳ細胞を、免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓皮膜下に注入した。図１０は、そのような実験の１つで生じた奇形腫の切片を示す。動物は大きな腫瘍を発生し、これを注入の３３日後に屠殺した。
【０１１６】
成熟した分化組織、特に上皮、横紋筋および腸上皮が、切片において明らかに見られ得る。これらの組織は、それぞれ外胚葉、中胚葉および内胚葉から誘導される。したがって、これらの３つの一次胚葉のそれぞれから誘導される分化細胞が存在し、それはラット１４８Ｃ ＥＳ細胞が多能性であることを示す。
【０１１７】
実施例４
ラット胚盤胞からの多能性幹細胞の誘導
胚性幹（ＥＳ）細胞は、1981年以来近交系マウスから誘導されているが１，２、他の種については証明されていない。他の齧歯動物からのＥＳ細胞の樹立の度重なる失敗に加え、霊長動物胚由来細胞がマウスＥＳ細胞と主要な性質において異なるとの証拠によって３、胚の培養された幹細胞と多能性細胞との関連性が疑われる４−７。ここで、発明者らは、初期胚盤葉上層の多能性状態を分化誘導シグナルから保護するように設計した条件で、ラット胚を培養する。これは、多能性マーカーＯｃｔ４８およびＮａｎｏｇ９を発現する細胞の培養物の再現可能な樹立をもたらす。これらの細胞は形態的に未分化であり、そして安定した長期増殖を示す。これらは、マウスＥＳ細胞と分子特性を共有し、そしてインビトロでの分化を誘導し得、そして免疫無防備状態の成体マウスで複分化した奇形腫を形成する。表現型的にそして機能的に、それらは、近年記載された卵筒由来ＥｐｉＳＣ３，１０とは異なる。最も重要なことに、ラット胚盤胞への注入において、それらはキメラへの大きな寄与を与え得る。発明者らは、ＥＳ細胞の特性を備える多能性細胞がラット胚から単離され得ると結論付ける。発明者らは、非誘導性培養物中に置かれた未感作胚盤葉上層細胞からのＥＳ細胞誘導が、一般的な機能であり得ると示唆する。
【０１１８】
ＥＳ細胞は、合成の組織培養物の状況下で多能性マウス胚盤葉上層細胞から生じる４，６。ＥＳ細胞自体が、この人工環境の産物であるか、または培養中に捕獲される個体発生の特定相を表すのかは不明である１１。実験に基づいた経験から得た知識は、線維芽細胞フィーダーおよび／またはサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を、ウシ胎児血清または増殖因子骨形成タンパク質の選択されたバッチと組み合わせて用いることで、ＥＳ細胞が、特定の近交系マウス系統から再現可能に誘導され得ることである４，１２。しかし、同条件で、すべてのマウス系統からＥＳ細胞を生じるわけでなく、そしてラットからは全く生じていない１３，１４。発明者ら７および他１５，１６はラット胚からの細胞系の誘導を報告したが、該細胞系は、ＥＳ細胞と外見上の形態類似点を有するがＥＳ細胞同一性の主要な転写決定因子（Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ１７）を有意レベルで発現せず、そしてインビトロで、腫瘍またはキメラにおいて、決定的な胚葉分化をし得ない。発明者らの手では、そのような細胞は胚体外栄養外胚葉および胚盤葉下層系統だけを生じ、そして、発明者らは、それらを胚体外幹（ＥｘＳ）細胞と称している７。ラット胚から真性ＥＳ細胞を誘導することの度重なる失敗は、マウス胚の多能性胚盤葉上層とラット胚の多能性胚盤葉上層との間のなんらかの根本的な違いを反映している可能性がある１８。あるいは、この培養物構築が、特定の改変された遺伝的背景が実験マウスの大量の近親交配によって産生されること以外には、多能性の維持に不適切であり得る。
【０１１９】
発明者らは、マウスＥＳ細胞培養において分化誘導刺激を排除するために、３つの小分子インヒビター（３ｉ）の組み合わせを案出した（Yingら、提出中）。３ｉは、樹立細胞系で、およびマウス胚からのデノボ誘導の間の両方で、多能性の効率的な維持を可能にする。この法則がマウスに限られるのか、またはより広く適用し得るのかを決定するために、発明者らはラット胚細胞における３ｉの効果を調べた。転写決定因子Ｏｃｔ４の発現の保持を、一次派生物中の未分化細胞の存在に代わる代替アッセイとして用い得る７。Ｏｃｔ４は、血清含有培地中６，７または無血清培地中で培養されたＩＣＭ中で急速に消滅する。内部細胞塊（ＩＣＭ）を、免疫手術によってＥ４．５ラット胚盤胞から単離し、そして付着を容易にするために、およびまた白血病抑制因子（ＬＩＦ）の供給源として、フィーダー上にプレートした７。３または４日後、培養物を固定し、免疫染色によって分析した（図１１ａ−ｃ）。上記のＯｃｔ４の損失と同時に、発明者らは、Ｃｄｘ２（栄養外胚葉決定因子）およびＯｃｔ４のアンタゴニストのアップレギュレーションを観察した１９。これらの変化は、フィーダーまたは可溶性のＬＩＦによって、またはインヒビターなしの無血清培地中の培養によって妨げられなかった。対照的に、３ｉの存在下では、発明者らは、Ｏｃｔ４タンパク質が派生物中の細胞の多くで維持され、そしてＣｄｘ２の発現が抑制されることを見出した。さらに、培養ＩＣＭ中でＯｃｔ４と同様にダウンレギュレートされる多能性状態の第２の決定マーカー（Ｎａｎｏｇ９）は、３ｉが補充された無血清培地で維持された。発明者らは、３ｉ培地で３日間培養したＩＣＭを小塊に解離し、そしてそれらを同じ条件で再プレートした。４日後、細胞はなお生存中であり、そして繁殖し、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し続ける形態的に未分化の細胞コロニーを形成しているように見えた（図１ｄ）。
【０１２０】
３ｉが初代培養物中において方向付けられていない状態を持続させるというこれらの兆候から続けて、発明者らはより長期の効果を調べた。２つの異なる系統（ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ３４４）のラット胚由来の合計３５個のＩＣＭを、３ｉ中のフィーダー上にプレートした。３日後、１１個のＩＣＭが付着し繁殖し、よって、それらを機械的に小塊に分割し、そして新しいウエルに再プレートできた。これらの再プレートしたＩＣＭのうち４つから、形態的に未分化の小コロニーが発生した。１０日後、これらのコロニーのそれぞれを新しいウエルに無傷で移した。４日後、すべてのサイズがかなり大きくなった。次いで、これらのコロニーを手動で解離し、再プレートした。さらに、すべての場合に未分化コロニーが発生した。発明者らは、これらの培養物が次いで繰り返し継代され、４つの細胞系（２つはＦｉｓｃｈｅｒ胚由来および２つはＤＡ胚由来）の樹立をもたらすことを見出した。４系統はすべて、形態的および増殖特性において同様であった。それらは、密集した細胞の３次元凝集塊として繁殖している（図１２ａ）。このことは、３ｉで培養されたＥＳ細胞に特有である（Yingら、提出中）。個々の細胞は、ＥＳ細胞に特徴的な高い核対細胞質比率および突出した核小体を有する。それらは無極性であり、突起、細胞構築特性、または特殊化の他の兆候を欠く。細胞が大きくなりすぎるとフィーダー層から剥離する傾向があるため、通常通り、コロニーが中間のサイズに達する３〜４日毎に、細胞を継代した。発明者らは、未分化細胞を３ｉ中でゼラチンコートしたプラスチックの上で維持するのは難しいことを見出した。フィーダーなしでは接着は弱く、細胞は凝集して基材から剥離する傾向があった。しかし、フィブロネクチンでコートした皿上では、付着は改良され、未分化細胞の繁殖に十分であった（図１２ｂ）。これは、フィーダーの主要な貢献が、特定の自己再生シグナルを提供することよりも、細胞接着を支持することであることを示す。コロニーを、ピペッティングによって手動で、またはAccutaseを用いて酵素的に、容易に解離し得る。解離後、マイクロピペットによって単離された単一細胞は、連続して継代し得る未分化コロニーを容易に生じ得る（図１２ｂ）。細胞を、従来の手順によって凍結保存し、そして回収し得る。培養物は６ヶ月間にわたって連続的に増殖しており、増殖速度の低下なく、そして明らかな分化はほとんどまたは全くなかった。
【０１２１】
これらのラット細胞の潜在的同一性を評価するために、発明者らは、多能性および系統方向付けの主要なマーカーの発現を調べた。免疫蛍光によって、細胞はＯｃｔ−４およびＮａｎｏｇの核発現を示す（図１２ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析で、Ｒｅｘ−１、Ｅｒｒβ、Ｓｏｘ２、ＳｔｅｌｌａおよびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２標的Ｆｇｆ４とともにこれらの遺伝子の発現を確認した（図１２ｄ）。胚盤葉下層および限定的な内胚葉マーカーＧａｔａ６およびＳｏｘ１７、中胚葉マーカーｂｒａｃｈｙｕｒｙおよびＦｌｋ１、または神経外胚葉マーカーＰａｘ６およびｎｅｓｔｉｎについての転写は、検出されなかった。Ｎａｎｏｇ増幅のためのプライマーを、ラット遺伝子に特異的な配列に対して設計した。これらのプライマーは、ラット細胞由来の予想されるサイズの産物を一貫して生じたが、マウスＥＳ細胞由来のものは生じなかった。反対に、マウスに特異的なプライマーは、いかなるラット細胞由来の産物も生じなかった。細胞のラット同一性は、中期スプレッドの調製によって確認した（図１２ｅ）。４つの系はすべて、ラットに特徴的である中部動原体型（metacentric）染色体および次端部動原体型（acrocentric）染色体を含んだ。これは、末端部動原体型（telocentric）染色体しか有さないマウスとは異なる。
【０１２２】
２回の反復実験では、合計４１個のさらなるＩＣＭを３ｉで培養した。これらのうち、１３個が付着し、細胞塊を形成した。これらを３日後に脱凝集し、その後６ウエル中に一次未分化コロニーが生じた。これらの培養物の６個すべてが、連続的に増殖可能な未分化細胞系を生じた。これらの培養物は、もとの４つの系と形態的に見分けられず、そしてすべてがＯｃｔ４とＮａｎｏｇとの両方を発現する。次いで、発明者らは、１８個の脱凝集したＩＣＭからさらに４つの系を誘導した。発明者らは、誘導手順が再現可能であり、そして堅固であると結論付ける。
【０１２３】
発明者らは、未分化状態の維持に対する培養条件を変更することの効果について調べた。発明者らは、誘導に用いられるＬＩＦ産生ＤＩＡ−Ｍフィーダー７を、明らかな妥協なく、標準的なマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）と置き換え得ることを見出した。ＬＩＦは培養培地に含まれず、これはマウスＥＳ細胞のために３ｉが十分であることと一致する。３ｉから血清およびＬＩＦまたはＢＭＰおよびＬＩＦが補充された培地に移されたラット細胞は、種々の形態に分化し、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を喪失した（図１３ａ）。これらの観察は、３ｉラット細胞のｇｐ１３０／Ｓｔａｔ３シグナリングへの応答が、マウスＥＳ細胞２０，２１と比較して減少していたことを示す。これは、これまでのラットＥＳ細胞誘導の失敗への大きな寄与因子であり得る。
【０１２４】
インヒビターなしで培養された細胞は、種々の形態へと分化した（図１３ｂ）。ＦｇｆｒインヒビターおよびＭｅｋアクチベーションのインヒビター（２ｉ）中での培養は、マウスＥＳ細胞でも見られるように、ＧＳＫ３インヒビターなしでも未分化集団の維持に十分であった。これらの所見は、ＦＧＦ／Ｅｒｋシグナリングの遮断が未感作な多能性状態を持続させる決定的な要件であるという仮説（Yingら、提出中）と一致する。
【０１２５】
未分化雌ＥＳ細胞および未感作胚盤葉上層の特徴は、Ｘ染色体が両方とも活性であること、および分化に際して１つが不活性化することである２２−２４。発明者らは、ＸＸ３ｉラット細胞を、トリメチル化されたヒストン３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７）（中間期核の不活性Ｘ染色体を識別するエピジェネティックなサイレンシングマーク）２５に対する抗体で染色した。３ｉ中で維持された細胞は、拡散した免疫反応性のみを示し、これに対して６日間にわたって血清に曝露した後に分化した細胞は、不活性Ｘに特徴的な突出した核小体を示した（図１３ｃ）。これらのデータは、未分化ＸＸ３ｉラット細胞で２つのＸ染色体が活性であること、および１つのＸ染色体が分化の間に不活性化することを示す。したがって、３ｉラット細胞は、初期胚盤葉上層およびＥＳ細胞の適切なエピジェネティックな状態を示す。
【０１２６】
３ｉなしの無血清培地中で懸濁培養すると、細胞は死滅した。しかし、血清またはＭａｔｒｉｇｅｌを添加すると、細胞は、胚様体のような構造に凝集した（図１３ｄ）。これらの構造のＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇのダウンレギュレーション、ならびに内胚葉および中胚葉マーカーの出現を明らかにした（図１３ｅ）。３ｉラット細胞の分化能力をさらに特徴付けるために、発明者らは、ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ由来の系両方の細胞を、１１匹の免疫無防備状態のＳＣＩＤマウスの腎臓皮膜下に注入した。３０〜５５日後に、動物を屠殺した。７匹が、注入した部位に、１グラム未満から４グラム以上までの種々のサイズの肉眼で見える組織塊を示した。増殖は、試験した両方の系から得られた。各系由来の２つの試料の組織学的分析は奇形腫の古典的な特徴を明らかにし、これは、横紋筋、骨、軟骨、角化上皮、分泌腸上皮、および他の多くを含む複数の分化細胞タイプおよび構造を備えていた（図１４ａ）。発明者らは、３ｉラット細胞系が奇形腫を産生することができ、そして成熟多重系統分化の能力があると結論付ける。
【０１２７】
真性ＥＳ細胞の決定的な特徴は、ホスト胚をコロニー化し、そして分化した子孫をキメラ動物の３つの胚葉のすべてに寄与する、それらの能力である。リポフェクションおよびピューロマイシンによる選択に続いて、発明者らは、組み込まれたプラスミドから構造的に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞のプールを誘導した。これらの細胞を胚盤胞に注入し、発生中の胚への寄与を追跡した。Ｅ１０．５で採取された８個の胚のうちの２個は、ＧＦＰ標識した細胞の広範囲にわたる寄与を示した（図１４ｂ）。凍結切片の検査で、３つの胚葉のすべての組織に取り込まれたことを確認した。
【０１２８】
発明者らはまた、出生後キメラに寄与するそれらの潜在能を決定するために、未改変３ｉラット細胞を胚盤胞に注入した。アグーチＤＡとアルビノＦｉｓｃｈｅｒとの間の遺伝的に決定された毛色の違いは、１つの系統の細胞を他の系統の胚に導入した場合の、キメリズムの好都合な指標を提供する。移された胚から発生した１５匹の仔のうち、２匹の動物が、Ｆｉｓｈｅｒホスト中に導入されたＤＡ細胞の存在の特徴である毛色を示した（図１４ｂ）。これらの動物は、強く着色され、ＤＡ細胞の寄与を示す。アルビノホストの寄与は頭部でのみ見られ、これは、Ｆｉｓｃｈｅｒにおける頭巾斑の対立遺伝子の存在の結果である。このパターンは、頭巾斑のあるアルビノ系統と完全に着色された系統との間のラットキメラの特性である２６。これらの動物のキメラ性質を確認および定量するために、発明者らは、尾生検のマイクロサテライト分析を行った。これは、両方の寄与する遺伝子型由来の細胞が、これらの２匹の動物中にそれぞれ２５：７５および７５：２５（ＤＡ：Ｆｉｓｃｈｅｒ）の割合で存在したことを明らかにした（図１４ｄ）。これらのキメラは、健常で稔性の成体に発達した。しかしながらどちらも雄であり、したがって、導入された細胞からの配偶子（遡及的にＸＸとして特定される）の発生を支持するわけではない。
【０１２９】
近年、マウスおよびラットにおいて、着床後の卵筒期の胚盤葉上層由来の細胞系の誘導が報告されている３，１０。これらのいわゆるＥｐｉＳＣは、インビトロで多重系統分化の潜在能を有するが、真性ＥＳ細胞とは、表現型、分子および発生において種々の違いを示す。最も顕著には、それらは、着床前の胚に再び取り込まれてキメラに寄与する能力をほとんどまたは全く示さない。対照的に、３ｉラット細胞は、キメラに寄与する。それらは、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ（Ｄｐｐａ３）およびアルカリフォスファターゼ（ＥｐｉＳＣ中に存在しないＥＳ細胞および初期胚盤葉上層のマーカー）もまた発現する。さらに、３ｉラット細胞が、単一細胞への解離後容易に増殖し得るのに対し、維持された細胞−細胞接触がＥｐｉＳＣにとって重要であるように見える。発明者らは、３ｉラット細胞が、ＥｐｉＳＣを維持するために必要な特定の増殖条件（ＦＧＦ２＋アクチビン）において維持され得るかどうかを試験した。発明者らは、３ｉをアクチビン＋ＦＧＦ２に置き換えた場合、フィーダー上であるかフィブロネクチンでコートされた皿上であるかにかかわらず、それらがマウスＥＳ細胞のように挙動しそして分化することを見出した。さらに、アクチビンレセプターインヒビターＳＢ４３１４５２（ＥｐｉＳＣ１０の分化を誘導するが、マウスＥＳ細胞では誘導しない）は、未分化３ｉラット細胞の増殖を妨げなかった。３ｉ細胞とＥｐｉＳＣとの決定的な違いは、後者が胚盤胞ではなく着床後の胚から誘導されることである。発明者らはまた、胚盤胞由来のラットＥｘＳ細胞７が３ｉ中で維持され得るかどうかを試験し、それらが生き残らないことを見出した。したがって、３ｉラット細胞は、培養ラット胚から樹立された他の細胞系とは異なる。
【０１３０】
これらの所見は、まとめて、３ｉの使用が、ＥＳ細胞の基本特性：長期間の自己再生；多能性；および発生中の胚への取り込み能力を備えたラット細胞系の誘導を可能にすることを証明する。それらはまた、ＥＳ細胞状態の主要な分子マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＲｅｘ１を発現する。ラットＥＳ細胞の利用性は、生物医学研究の多くの分野での選択種における遺伝子ターゲッティングおよび関連するゲノム工学技術の適用への道を開く。３ｉラット細胞の利用性は、成体組織中で融合および機能し得る細胞を産生するインビトロでの幹細胞分化の能力を試験するためのより高度なインビボモデルを使用する機会をすぐに生み出す。例えば、認知修復の評価は、マウスよりもラットにおいて非常に精巧である。
【０１３１】
中和する３ｉ培養系を用いた培養ラット胚細胞における多能性の効率的な維持は、ＥＳ細胞の誘導が、実に、組織培養による創造物というよりもむしろ常在胚細胞の捕獲を表し得ることを示唆する。したがって、ＥＳ細胞の単離は、広範囲な転写またはエピジェネティックな再プログラミング５，６，２７を伴わなくとも良い。むしろ、ＥＳ細胞は、誘導シグナルが除去される場合の初期胚盤葉上層の繁殖の不履行による、単なる存続を表し得る（Yingら、提出中）。これは、３ｉ法則に基づく培養処方物が、家畜種を含む他の動物からのＥＳ細胞の誘導に十分であり得る可能性を上昇させる。
【０１３２】
方法
ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロサテライト分析、奇形腫発生、および抗体の詳細は、補足情報で提供する。
【０１３３】
免疫手術。透明帯を酸性のタイロードで４．５ｄｐｃラット胚盤胞から除去し、胚盤胞を２０％抗ラット全血清（Sigma）中で３時間、３７℃でインキュベートした。胚盤胞を洗浄し、補体の供給源としてラット血清中で２０分間インキュベートし、そして溶解した栄養外胚葉をピペッティングによって除去した。
【０１３４】
培養手順。フィーダー細胞を、４ウエルプレート中のゼラチン上に１ウエルにつき１．５×１０４細胞の密度でプレートした、ガンマ線を照射されたマウス線維芽細胞７から調製した。単離したＩＣＭおよび継代した細胞系を、ＦｇｆレセプターインヒビターＳＵ５４０２を２μＭ、Ｍｅｋ１／２アクチベーションのインヒビターＰＤ１８４３５２を０．８μＭ、およびＧＳＫ３インヒビターＣＨＩＲ９９０２１を３μＭ含む（３ｉ；Yingら、提出中）Ｎ２Ｂ２７培地２８中のフィーダー上にプレートした。この３ｉ細胞系を、細いピペットにコロニーを吸引し、得られた脱凝集された細胞および小塊を新しいプレートに移すことによって、型通りに継代した。胚様体形成のために、およそ２００の脱凝集された細胞の試料を、１０μｌ懸滴に移した。これらを２日間培養し、細胞凝集体を収集し、さらに５日間培養皿に移した。
【０１３５】
トランスフェクションプロトコール。コロニーをAccutase（Sigma）で解離し、１０％ＦＣＳ含有ＧＭＥＭ中でペレット化し、次いで無血清３ｉ培養培地中で再懸濁し、最終容量が４００μｌになるようにプレートした。０．２５μｇのＳｃａＩで線形化したｐＰｙＣＡＧｇｆｐＩＰプラスミド２９ＤＮＡ、０．２５μｌのＰＬＵＳ試薬および０．６２５μｌのLipofectamine LTX（Invitrogen Corporation）の混合物を添加し、培養物を一晩インキュベートした。この試薬を１８時間後に除去し、そして新しい無血清３ｉ培養培地と取り替えた。安定なトランスフェクタントは、トランスフェクションの４８時間後に０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加えて選択した。ポリクローナル系を、ピューロマイシン中で連続的に維持されるいくつかの耐性のあるコロニーを集めることによって得た。
【０１３６】
キメラ形成。４．５ｄｐｃラット胚を、注入した日の正午までに収集し、そして空洞化を最大にするためにＫＳＯＭ培地中でさらに２〜３時間培養した。細胞系を、Accutase中で脱凝集させ、そして１０〜１２細胞をレシピエント胚の胚盤胞の空洞に注入した。注入された胚を、３．５ｄｐｃ妊娠ラットの子宮に移した。精管切除された雄ラットは入手できないため、発明者らは本研究のために自然交配レシピエントを用いなければならず、それによって移された胚の着床の頻度が減少した。
【０１３７】
ビブラトーム切片作製。蛍光胚を、ＰＢＳ中２０％のゼラチンおよび２０％のアルブミンを１：１で含む混合物中に包理し、次いで、４℃で一晩、４％のパラホルムアルデヒド中に固定した。次いで、このゼラチンブロックを、４℃で一晩、１０％のグルタルアルデヒドを有する「硬化溶液（setting solution）」中に包理した。切片を、ビブラトーム（シリーズ１０００）で１００μｍで切断し、次いで、ＤＡＰＩ核蛍光染色液を含むVectashield（Vector Laboratories）中で、カバーグラスの下に取り付ける前に１０分間、ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で処理した。２４時間以内に、切片を共焦点顕微鏡法によって検査した。
【０１３８】
マイクロサテライト遺伝子型決定。蛍光タグ化したオリゴを、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡから、ラットのマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２（フォワードのオリゴ、６−ＦＡＭ−ＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＡＴＴ、リバースのオリゴ、ＴＣＣＣＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧ）およびＤ３Ｒａｔ１７（フォワードのオリゴ、ＶＩＣ−ＴＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡ、リバースのオリゴ、ＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡ）を増幅するために用いた。ＰＣＲ反応物は、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（MJ Research）で、GoTaq Flexi DNA Polymerase（Promega Corporation、商品番号M8305）を用いて、以下の条件下で増幅した；９５℃で２分間、続いて、９４℃で３０秒、５６℃または６２℃で３０秒、および７２℃で３０秒のサイクルを３５回、最後に７２℃で５分間伸長させる。アニーリング温度は、Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７でそれぞれ５６℃および６２℃であった。ＰＣＲ産物を、滅菌蒸留水で１００倍希釈した。この１μｌをLIZ-500内部サイズ標準（Applied Biosystems、商品番号4322682）を含むHi-Diホルムアミド（Applied Biosystems、商品番号4311320）９μｌ中に希釈した。得られた産物をABIキャピラリー3730ＤＮＡアナライザで検出し、４％のアガロースゲル上で視覚化した。Ｄ１Ｒａｔ１２２対立遺伝子は、ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒラット系統でそれぞれ２３０ｂｐおよび２５５ｂｐである。Ｄ３Ｒａｔ１７対立遺伝子は、ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ系統でそれぞれ１４０ｂｐおよび１７８ｂｐである。
【０１３９】
奇形腫形成。約２００〜４００細胞をＳＣＩＤマウス（BALB/c JHan Hsd-Prkdc scid.）の腎臓被膜下に注入した。種々の時点で腫瘍を収集し、その重量を、腫瘍および腎臓の重量を量り、体側の注入していない腎臓の重量を引くことによって決定した。腫瘍をパラフィンワックスに包理し、切片化し、そしてマッソン・トリクロームで染色した。
【０１４０】
抗体。細胞が増殖していたプレートをＰＢＳ中４％ＰＦＡ中に固定し、ＰＢＳＴ（PBS中に０．３％のTriton）で膜透過処理し、そして室温で２時間、ＰＢＳＴ中１％のＢＳＡおよび１０％のヤギ血清中でブロックした。この一次抗体は、抗ｏｃｔ−４Ｃ１０（Santa Cruz Biotechnology、1:200）、抗ｎａｎｏｇ（Abcam、1:200）および抗ｃｄｘ２（Abcam、1:80）であり、それらを４°Ｆで一晩、プレート上で放置した。二次抗体は、Ａｌｅｘａ ４８８ ＩｇＧ２ｂ ヤギ抗マウス（ｏｃｔ−４に対して）、Ａｌｅｘａ ５６８ ヤギ抗ウサギ ＩｇＧ（ｎａｎｏｇに対して）およびＡｌｅｘａ ５６８ ＩｇＧ１ ヤギ抗マウス（ｃｄｘ２に対して）であり（濃度はすべて１：１０００）、それらを室温で２時間、プレート上で放置した。プレートを、ＤＡＰＩで対比染色した。一次抗体を省略すると、蛍光が生じないか（ｎａｎｏｇ、ｃｄｘ２）、またはぼやけたバックグラウンド全体（ｏｃｔ−４）となった。Ｘ染色体免疫染色のために、細胞を顕微鏡用スライド（SuperFrost Plus、VWR international）上にプレートし、次いで約３時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞を、室温で１５分間、４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、そして１０分間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘで膜透過処理した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に対する抗血清（Thomas Jenuweinから寛大にも戴いた）は、１：５００で用いた。
【０１４１】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮＡを、RNeasy Mini Kit（Qiagen、商品番号74104）を用いて約５０コロニーから精製した。その後、ｃＤＮＡを、SuperScript First-Strand Synthesis System（Invitrogen Corporation、商品番号11904-018）を用いてOligo-dTプライミングによって生成した。代表的に、ｃＤＮＡの１０分の１は、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（MJ Research）で、GoTaq Flexi DNA Polymerase（Promega Corporation、商品番号M8305）を用いて、以下の条件下でＰＣＲ増幅した；９４℃で２分間、続いて、９４℃で２０秒、５０℃で２０秒、および７２℃で１分間のサイクルを３０回、最後に７２℃で５分間伸長させる。用いたプライマー配列およびプロダクトサイズを、以下に列挙する。
【０１４２】
ラットmRNA ラットプライマー配列 プロダクトサイズ
β-Actin フォワード−CACTGGCATTGTGATGGACT 427bp
リバース −ACGGATGTCAACGTCACACT
Brachyury フォワード−AACTGCGAGTGGGTCTGGAAG 451bp
リバース −TGGGTCTCGGGAAAGCAGTG
Cdx2 フォワード−CCGAATACCACGCACACCATC 394bp
リバース −CTTTCCTTGGCTCTGCGGTTC
Eras フォワード−CGAGCGGTGTGGGTAAAAGTG 501bp
リバース −GGTGTCGGGTCTTCTTGCTTG
Errβ フォワード−TGTGCGGGGACATTGCTTCTG 436bp
リバース −TCCCGATCTGCCAAGTCACAG
FGF4 フォワード−CGGGGTGTGGTGAGCATCTTC 202bp
リバース −CCTTCTTGGTCCGCCCGTTC
GATA-6 フォワード−TCATCACGACGGCTTGGACTG 467bp
リバース −GCCAGAGCACACCAAGAATCC
Kdr フォワード−ATACACCTGCACAGCGTACAG 271bp
リバース −TCCCGCATCTCTTTCACTCAC
Nanog フォワード−GCCCTGAGAAGAAAGAAGAG 356bp
リバース −CTGACTGCCCCATACTGGAA
Nestin フォワード−AGAGAAGCGCTGGAACAGAG 234bp
リバース −AGGTGTCTGCAACCGAGAGT
Oct-4 フォワード−GGGATGGCATACTGTGGAC 412bp
リバース −CTTCCTCCACCCACTTCTC
Pax6 フォワード−GAGACTGGCTCCATCAGACC 212bp
リバース −CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC
Rex-1 フォワード−TTCTTGCCAGGTTCTGGAAGC 277bp
リバース −TTTCCCACACTCTGCACACAC
Sox2 フォワード−GGCGGCAACCAGAAGAACAG 414bp
リバース −GTTGCTCCAGCCGTTCATGTG
Sox17 フォワード−AGGAGAGGTGGTGGCGAGTAG 268bp
リバース −GTTGGGATGGTCCTGCATGTG
Stella フォワード−TCCTACAACCAGAAACACTAG 304bp
リバース −GTGCAGAGACATCTGAATGG
【０１４３】
マウスmRNA マウスプライマー配列 プロダクトサイズ
Nanog フォワード−ATGAAGTGCAAGCGGTGGCAGAAA 464bp
リバース −CCTGGTGGAGTCACAGAGTAGTTC
【０１４４】
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28. Ying, Q. L. & Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol 365, 327-41 (2003).
29. Chambers, I.ら Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 113, 643-655 (2003).
【０１４５】
比較例１
EP1726640（発明者の名前は寺谷および落谷）は、ラット胚性幹細胞の提供を記載すると主張している。しかし、以下の実験において、本出願人は、寺谷および落谷によって記載された培養条件が、単離されたラットＩＣＭの生存または繁殖を支持せず、したがってこれらの条件はラットＥＳ細胞の誘導または維持に適さないことを示した。
【０１４６】
Ｉ．寺谷および落谷のプロトコールによる樹立ラットＥＳ細胞（３ｉ条件で誘導）の培養
Ａ．培地を、寺谷および落谷のプロトコールに記載されたように作製した（すなわち：ＤＭＥＭ中に、EP1726640に記載のｒＬＩＦ、ＫＳＲおよび他の構成成分を記載の濃度で含む）。
Ｂ．フィーダー層をガンマ線を照射されたＭＥＦから調製した（マウス胚線維芽細胞の初代培養物、継代３）。
Ｃ．樹立ラットＥＳ細胞系由来のコロニー（実施例４に記載された手順によって誘導した−ｏｃｔ−４ １系（継代１２）、ＤＡ２系（継代〜１０）、Ｃ系（継代２２）およびＤ系（継代２０））を脱凝集し、そして４ウエルプレートのウエルに移した（Ａの培地中およびＢのフィーダー上）。これを、プレート２５３とラベルした。同じ系から調製した培養物を、３ｉ条件下で並行して維持した。
Ｄ．結果
２日目。ｏｃｔ−４ １系およびＤＡ２系：不良：コロニーの表面に丸くなった細胞が現れている。Ｃ系およびＤ系：いまだ未分化に見える。
６日目。すべて不良。多くの細胞が死滅し、多くは分化し、皿の底に玉石様の細胞があり、また、丸くなった細胞が剥離している。細胞は繁殖しているように見えない。培地を交換した。
８日目。すべての細胞が分化または死滅した。培養物は、不透明な褐色物の大きな塊からなり、ウエルの底に多くの細胞が派生物を生じた。
コントロール培養物（３ｉ中）は未分化に見え、そして大量に繁殖していた。
Ｃ．結論。寺谷および落谷のプロトコールに記載の条件で培養されたすべての細胞が８日以内に死滅または分化した：したがって、このプロトコールは、ラットＥＳ細胞を生存可能な未分化の繁殖状態で維持することができない。
【０１４７】
ＩＩ．寺谷および落谷のプロトコールに記載の条件において試みられたラットＥＳ細胞系の誘導
Ａ．培地およびフィーダー層は、上記ＩＡおよびＢで記載した通りである。
Ｂ．ラット胚盤胞（４．５ｄｐｃ）を収集し、免疫手術に供した。
Ｃ．７個の単離した内部細胞塊（ＩＣＭ）を、寺谷および落谷に記載された培地（ｒＬＩＦ、ＫＳＲなど）に移した（プレート２５８Ｂ）。
Ｄ．コントロールとして、６個の単離したＩＣＭを３ｉ培地に移した（プレート２５８Ａ）。
Ｅ．コントロールのウエル（Ａ）ではいくつかの派生物が見られたが、寺谷および落谷条件のウエル（Ｂ）では何も見られなかった。培養物を固定した。
Ｆ．ＤＡＰＩ染色の後、３ｉコントロール群で５／６のＩＣＭ派生物を同定した。すべての細胞が大量に繁殖した。
Ｇ．寺谷／落谷群では１／７の派生物が同定できた。それは、非常に小さく、ＤＡＰＩ染色後にのみ派生物として同定可能であった。
Ｈ．結論。寺谷および落谷のプロトコールは、単離されたラットＩＣＭの生存または繁殖を支持しない。この方法によってラットＥＳ細胞が誘導され得るとの主張を支持する証拠は全くない。
【０１４８】
実施例５
ヒツジ多能性細胞の誘導および特徴付け
以下の実施例は、従来の方法によっては得られ得ないヒツジ胚性幹（ＥＳ）細胞の提供を記載する。ヒツジＥＳ細胞を、新規な無血清培養系を用いて、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む手順を実施することによって樹立し、産生した：
（Ａ）細胞が凝集した状態で残存している、ヒツジ胚盤胞の培養によって形成された内部細胞塊を解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊の培養物から生じる一次胚性幹細胞を、移せるかまたは継代できるまで培養する工程、
（Ｃ）細胞が凝集した状態で残存している、移せるかまたは継代できるようになった一次胚性幹細胞を解離し、その後それを継代および培養する工程、および
（Ｄ）細胞をさらに移すか継代し、そして培養し、胚性幹細胞系を樹立する工程。
【０１４９】
ヒツジＥＳ細胞樹立のための方法、樹立ヒツジＥＳ細胞を特徴付けるための方法およびヒツジＥＳ細胞を継代培養するための方法は、以下の通りである。
【０１５０】
１．ヒツジ。
これらの方法は、ヒツジの任意の系統からＥＳ細胞を誘導するのに適切である。例えば、ＥＳ細胞を、Merino系統などのヒツジ系統から誘導し得る。
【０１５１】
２．フィーダー細胞。
ヒツジＥＳ細胞の樹立およびその後の培養および移動のために、フィーダー細胞を用いることが好ましい。フィーダー細胞は、任意の種から誘導されたものであり得、そして好ましくはむしろ正常線維芽細胞であるが、遺伝子ベースの選択マーカーの有無にかかわらず、樹立および／または不滅化されたフィーダー細胞系（例えば、ＤＩＡＭ（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１）；Rathjen PD, Toth S, Willis A, Heath JK, Smith AG. Differentiation inhibiting activity is produced in matrix-associated and diffusible forms that are generated by alternative promoter usage. Cell 1990: 62:1105-1114）を除外しない。具体的には、正常マウス胚線維芽細胞が挙げられ得るが、しかし新生児または成体の線維芽細胞を除外しない。より具体的には、妊娠が１２日目から１６日目の間の正常マウス胚線維芽細胞の初代培養細胞を用い得る。正常線維芽細胞として、例えば、１２．５日目の１２９ｓｖ胎仔マウスの正常線維芽細胞が例示される。フィーダー細胞は、従来の方法によって調製でき、または市販の製品（マウス胎仔線維芽細胞；ＡＴＣＣ）を用いることもできる。マイトマイシンＣ、ガンマ線照射などの処理によって不活性化されたフィーダー細胞を用いることが好ましい。対象となる培養容器を、例えばゼラチン、フィブロネクチン、ラミニンなど（しかしこれらに限定されない）のマトリックスでプレコートすることもまた好ましいとされ得る。
【０１５２】
３．培養培地。
ヒツジＥＳ細胞の産生、樹立および培養のために、実質的に無血清の培養培地を用いた。用いた培養培地の具体的な組成を、以下に示す。
【０１５３】
ａ）ヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地。
胚盤胞から内部細胞塊形成までの工程で用いる培養培地を、「ヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地」という。組成の例は、Dattena Mら（Dattena M, Mara L, Bin T AA, Cappai P. Lambing rate using vitrified blastocysts is improved by culture with BSA and hyaluronan. Mol Reprod Dev. 2007年1月;74(1):42-7）に記載の通りである。
【０１５４】
ｂ）ヒツジＥＳ細胞のための培養培地。
内部細胞塊形成後の培養（樹立ヒツジＥＳ細胞の培養を含む）で用いる培養培地を、「ヒツジＥＳ細胞のための培養培地」または以下「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」という。組成の具体例；５ｍＭのＬ−アラニル−グルタミンまたは２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１００ｍＬのダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（Invitrogen/Gibco）（表ＩＩ）、１ｍＬの１００×Ｎ２補剤（表ＩＩ；２５μｇ／ｍＬのインシュリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、６ｎｇ／ｍＬのプロゲステロン、５０μｇ／ｍＬのウシまたはヒト血清アルブミン、最終濃度）が添加された１００ｍＬ（１：１ ｖ／ｖ）のNeurobasal培地（Invitrogen/Gibco）（表ＩＩ）、２ｍＬの５０×Ｂ２７補剤（表ＩＩ；２ｍｇ／ＬのＬ−アラニン、３．７ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、４４１ｍｇ／Ｌのｌ−グルタミン、７．７６ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、０．１０ｍｇ／Ｌのビオチン、０．３４ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、０．０２ｍｇ／Ｌのコルチコステロン、０．００６３ｍｇ／Ｌのプロゲステロン、０．１ｍｇ／ＬのビタミンＡ、０．１ｍｇ／Ｌの酢酸レチノール、４ｍｇ／Ｌのインシュリン、０．００２ｍｇ／Ｌのトリヨード−Ｌ−チロニン、２５ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、０．０４７ｍｇ／Ｌのリポ酸、１ｍｇ／ＬのビタミンＥ、１ｍｇ／ｍＬの酢酸Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール、２．５ｍｇ／Ｌのカタラーゼ、１ｍｇ／Ｌの還元型グルタチオン、２．５ｍｇ／Ｌのスーパーオキシドジスムターゼ、２ｍｇ／ＬのＬ−カルニチン、１ｍｇ／Ｌのエタノールアミン、１５ｍｇ／ＬのＤ（＋）−ガラクトース、２６００ｍｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、１６．１ｍｇ／Ｌのプトレシン、０．０１６ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、０．１９４ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、１ｍｇ／Ｌのリノール酸、１ｍｇ／Ｌのリノレン酸、２５００ｍｇ／Ｌのウシまたはヒト血清アルブミン、５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、最終濃度）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、２μＭのＳＵ５４０２［Antibiotic-Antimicrotics溶液（必要に応じて）］。
【０１５５】
４．培養条件。
ヒツジＥＳ細胞の産生、樹立および培養におけるヒツジＥＳ細胞培養の温度は、３５℃〜３７．５℃の範囲であった。好ましくは３７℃である。代表的な細胞培養に用いられる加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。
【０１５６】
５．ヒツジＥＳ細胞の樹立の方法。
ヒツジＥＳ細胞の樹立の方法の具体例を以下に記載する。
【０１５７】
ａ）卵母細胞（胚盤胞期の胚）の収集。
卵母細胞収集のためのヒツジを選択した。卵母細胞収集は、Dattena Mら（Dattena M, Mara L, Bin T AA, Cappai P. Lambing rate using vitrified blastocysts is improved by culture with BSA and hyaluronan. Mol Reprod Dev. 2007年1月;74(1):42-7）に記載された従来の方法によって行ったが、当然のことながら、他の従来の卵母細胞収集方法もまた用いることができる。具体的には、ヒツジを自然交配させ、膣栓検出後、卵母細胞サンプリングのための雌ヒツジを屠殺し、子宮を摘出した。この子宮を適切な培地で灌流し、受精卵母細胞（胚）を回収した。発生または成熟を、受精卵母細胞（胚）から桑実胚を経て胚盤胞（胚盤胞期の胚）まで進行させ、そして、発生が胚盤胞期まで進行したことを顕微鏡観察によって確認した。好ましくは、発生を、後期胚盤胞期まで、そして内部細胞塊が存在し見えるようになるまで、進行させる。
【０１５８】
ｂ）内部細胞塊の形成および単離。
上述の５ａ）で得られた胚盤胞を顕微鏡で確認し、そして、例えば酸性タイロード（ｐＨ２．５）、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼを用いて、透明帯を除去した。次いで、マイトマイシンＣで処理したフィーダー細胞を０．１％ゼラチン／ＰＢＳでコートした培養皿上に蒔き、５〜１０個の透明帯を除去したヒツジ胚盤胞を各皿に移し、そして上述のヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」を用いて培養を開始した。
【０１５９】
培養１日目から８日目の間、透明帯を除去したヒツジ胚盤胞（後期）はフィーダー細胞に接着した。接着後５〜１０日で、先細のガラスパスツールピペットなどを用いて胚盤胞由来の内部細胞塊を機械的に解離した。５〜２０細胞の内部細胞塊の断片または凝集塊を、上述のヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」を含む同様の培養皿に移した。そのとき、内部細胞塊は、トリプシン−ＥＤＴＡなどのようなプロテアーゼで解離するのではなく、上記のように機械的に解離した。
【０１６０】
ｃ）ヒツジＥＳ細胞の樹立。
フィーダー細胞が蒔かれた０．１％ゼラチン／ＰＢＳでコートした培養皿で、上記のように解離した内部細胞塊を、ヒツジＥＳ細胞のための培養培地「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」中で培養した。一次ＥＳ細胞コロニーは、培養４日目から１０日目の間で現れた。この一次ＥＳ細胞コロニーの出現を、顕微鏡観察で確認した。観察されたＥＳ細胞を「一次ＥＳ細胞」という。その後約５〜１０日にわたって培養を続けることによって、一次ＥＳ細胞コロニーは、さらに移すか継代できるようになった。本明細書で用いる「継代できる状態」とは、形成された一次ＥＳ細胞コロニーを構成する細胞の数が、約２００〜６００に達した状態をいう。それがそのような形態を有することを顕微鏡で確認しながら、ＥＳ細胞コロニーを先細のガラスパスツールピペットを用いて分離した。この分離されたＥＳ細胞コロニーを、ヒツジＥＳ細胞のための培養培地を含む無菌中間培養容器に移し、そして、トリプシン−ＥＤＴＡのようなプロテアーゼを用いて、好ましくはアポトーシスインヒビター（例えば、Y-27632; Watanabe Kら A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature 5月27日(2007)）の存在下で酵素的に単一細胞に解離するか、または機械的に約５〜２０細胞からなる細胞凝集塊に解離した。解離したＥＳ細胞コロニーを、フィーダー細胞が蒔かれた０．１％ゼラチン／ＰＢＳでコートした培養皿で、ヒツジＥＳ細胞のための培養培地中で、初代培養に供した（継代１の細胞）。ＥＳ細胞コロニーは約２〜４日後に現れ、培養を開始してから約５〜１０日後に継代できる状態になった。その後の細胞の継代は上記のように行った。
【０１６１】
６）ヒツジＥＳ細胞の提示。
ヒツジＥＳ細胞は、以下の性質（ａ）〜（ｍ）のうちいくつかまたはすべてが特徴付けられていることが期待され、その多くは実験的に確認された：
（ａ）ＥＳ細胞コロニーが、密集した近均質の状態で提示される、
（ｂ）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｓｔｅｌｌａ遺伝子、Ｒｅｘ１遺伝子、ＦＧＦ４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子を発現する、
（ｃ）アルカリフォスファターゼ活性が陽性である、
（ｄ）胚様体を形成する能力を有する、
（ｅ）ＳＳＥＡ（発生期特異的胚抗原：Stage-Specific Embryonic Antigen）−１、−３および−４を差次的に発現する、
（ｆ）ＴＲＡ（腫瘍拒絶抗原：Tumour Rejection Antigen）−１−６０、−１−８１を発現する、
（ｇ）正常ヒツジ細胞が有するのと同じ数の染色体を有する、
（ｈ）継代培養されてもなお未分化状態である、
（ｉ）インビトロで多能性状態である、
（ｊ）３つの胚性生殖系統の細胞に分化する潜在能を有する、
（ｋ）インビトロでの奇形腫形成能力を有する、
（ｌ）キメラヒツジを産生する能力を有する、そして
（ｍ）ヒツジの生殖系列になり得る能力を有する。
【０１６２】
本発明は、上述した（ａ）〜（ｍ）に示されるＥＳ細胞の性質のすべてを保持するヒツジＥＳ細胞を、初めて提供する。上述の特質（ａ）〜（ｍ）は、樹立ヒツジＥＳ細胞がＥＳ細胞としての性質（すなわち、未分化状態を維持するＥＳ細胞としての性質）を保持することを以下の方法によって分析し得る。
【０１６３】
６．１）形態。
ヒツジＥＳ細胞は、顕微鏡法によって視覚化されるように、密集した近均質の状態のコロニーを維持した。（図１５Ａ〜Ｄ）
【０１６４】
６．２）未分化状態についての遺伝子マーカーの発現。
Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ２およびＲｅｘ−１などの代表的な未分化状態の遺伝子マーカーの発現の存在または不在は、ＥＳ細胞の特性である。ヒツジＥＳ細胞の未分化状態遺伝子マーカーの発現について、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した（表Ｉ）。ハウスキーピング遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ）もまた用い、ｃＤＮＡの完全性を評価した。市販のキットを製造者の使用説明書に従って用いて、試料からｍＲＮＡを抽出、そしてＲＴ−ＰＣＲ（TRIzol reagentおよびSuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR、Invitrogen）によってｃＤＮＡの合成を行った。要するに、TRIzol抽出されたｍＲＮＡを、SuperScript III逆転写酵素によって、４μＬの５×First Strand Buffer、１μＬのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μＬのランダムプライマー（１０μＭ）、１μＬのＲＮＡインヒビター、１μＬのSuperScript IIIおよび７．５μＬのＨ２Ｏおよび３μＬのｍＲＮＡ試料を含む２０μＬのＲＴ反応容量で、ｃＤＮＡに変換した。対応するＲＴ陰性（SuperScript IIIなし）もまた、ゲノム夾雑測定のために調製した。次いで、サーマルサイクラー（Perkin Elmer）で、以下のサイクルパラメータで、反応を進行させた：５０℃で６０分間および７０℃で１５分間。次いで、このｃＤＮＡを、未分化状態遺伝子マーカーのプライマー（表Ｉ）とともにＰＣＲに用いた。２．５μＬの１０×ＰＣＲバッファー、１．５μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、０．５μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μＬのフォワードプライマー（１０μＭ）、１μＬのリバースプライマー（１０μＭ）、０．２μＬの組換型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１７．３μＬのＨ２Ｏおよび１μＬのＲＴ試料を含む、標準的な２５μＬのＰＣＲ反応容量を用いた。次いで、反応試料を以下のパラメータを用いてサイクルさせた：９４℃で５分間、（９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、および７２℃で４５秒）のサイクルを３５回、最後に７２℃で５分間伸長させる。Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現を、上述の最終反応物の少量を２．５％のアガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、そしてＵＶ照明の下で写真を撮ることによって視覚化した（図１６）。
【０１６５】
６．３）アルカリフォスファターゼ活性。
未分化ヒツジＥＳ細胞は、アルカリフォスファターゼを大量に発現することが観察された。アルカリフォスファターゼの発現は、種々の市販のアルカリフォスファターゼ検出キットを用いて容易に測定し得る。本実施例では、ＡＬＰ組織染色キット（Sigma）を、製造者の使用説明書に従って用いた。（図１５Ｂ）
【０１６６】
６．４）胚様体を形成する能力。
フィーダー細胞なしの条件下で、コートされていない培養皿を用いてＥＳ細胞および／または凝集塊を培養することによる胚様体の形成。コートされていない培養皿の中で、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、２μＭのＳＵ５４０２（「３ｉ」）なしのヒツジＥＳ細胞のための培養培地を用いて、約２日〜１４日間にわたってヒツジＥＳ細胞を培養した後、細胞凝集によって形成された規則的なまたは不規則な球状体の出現を顕微鏡で観察することによって、胚様体形成を確認した。（図１５Ｅおよび１５Ｆ）。
【０１６７】
６．５）核または細胞表面抗原の発現。
ＥＳ細胞を含む幹細胞の未分化状態の同定で用いられる特性のうちの１つは核のＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ、ならびに細胞表面抗原（ＳＳＥＡ（発生期特異的胚抗原：stage-specific embryonic antigen）−１、−３、−４；ＴＲＡ（腫瘍拒絶抗原：Tumour Rejection Antigen）−１−６０、−１−８１）の検出であり、その発現量が、それらの分化に際して結果として特異的に変化する。細胞表面マーカーの発現は、ES Cell Characterization Kit（Millipore）を製造者の使用説明書に従って用い、免疫染色することによって評価した（データは示さず）。
【０１６８】
６．５）染色体数。
ヒツジ二倍体細胞の正常な期待される染色体数は、Ｇバンド法（例えば、Sumner, A. T., Cancer Genet Cytogenet. 6: 59-87 （1982））によって染色体数を分析することによって、樹立ヒツジＥＳ細胞が、その起源となるヒツジの染色体数（２ｎ＝５４）を維持する正常ＥＳ細胞であることを確認し得る。
【０１６９】
６．６）未分化状態の維持。
樹立ＥＳ細胞は、継代培養されても未分化状態を維持し得、特徴的には、それを少なくとも３０継代まで継代培養され得る。未分化状態の維持は、ヒツジＥＳ細胞の継代培養法（上述３）に従って継代培養を行うことで、そしてヒツジＥＳ細胞の上述（６）の提示を決定することで、確認し得る。
【０１７０】
６．７）多能性。
ＥＳ細胞は、フィーダー細胞なしの条件下で培養することによって、胚様体を経て種々の細胞に自発的に分化する。ＥＳ細胞のこの性質は、上述６．４）に記載の方法によって胚様体を形成し、次いで胚様体をゼラチンコートされた培養皿に移し、そして約７日から１４日にわたって培養することによって観察され得る。神経細胞様細胞、脂肪細胞様細胞または上皮細胞様細胞などの出現を、各細胞の特徴的形態によって、確認し得る。
【０１７１】
６．８）血清の存在下での培養によるインビトロでの分化。
さらに、ＥＳ細胞は、血清２０％の存在下での培養によって分化する性質を有する。好ましくは、ヒツジＥＳ細胞は、血清２〜２０％の存在下での培養によって分化する。インビトロでのヒツジＥＳ細胞の分化を、アルカリフォスファターゼ活性の消失によって、またはＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇなどのＥＳ細胞未分化状態マーカー遺伝子の発現の消失によって、確認し得る（上述の６（ａ）〜（ｆ））。
【０１７２】
６．９）３つの胚性生殖系統の細胞に分化する潜在能。
ＥＳ細胞は、３つの胚性生殖（内胚葉、中胚葉、外胚葉）系統の細胞に分化する潜在能を有する。ＥＳ細胞のこの性質は、胚様体（上述の６．４）からＲＮＡを抽出し、そしてＲＴ−ＰＣＲによって、外胚葉細胞（例えば、神経細胞）、中胚葉細胞（例えば、心筋細胞）および内胚葉細胞（例えば、肝細胞）の各マーカー遺伝子の発現を分析することによって、確認し得る。
【０１７３】
６．１０）奇形腫形成能力。
同種の動物または先天的免疫不全の異種の動物へのＥＳ細胞の移植は、奇形腫形成を導き得る。奇形腫は、３つの胚性生殖（内胚葉、中胚葉および外胚葉）から誘導された種々の組織が腫瘍中にランダムに存在する混合腫瘍の名称である。奇形腫の形成は、同種の動物または原発性免疫不全の異種の動物の皮下などにヒツジＥＳ細胞を移植し、そして数ヵ月後に球状の増殖物の存在を肉眼観察することによって、確認し得る。形成された奇形腫が３つの胚性生殖構造物を有することは、摘出した奇形腫を切片化し、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、そして組織および細胞の形態を顕微鏡で観察することによって、確認し得る。
【０１７４】
６．１１）キメラヒツジ産生能力。
キメラヒツジは、ＥＳ細胞を同種または異種のヒツジに導入することによって産生し得る。キメラヒツジの産生は、例えば、以下の方法によって行われ得る。キメラヒツジの産生の確認を容易にするために、マーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰ、Ｘ−ｇａｌ、ルシフェラーゼなど）を前もってヒツジＥＳ細胞に導入しても良い。具体的には、このようなマーカー遺伝子を含むベクターをＥＳ細胞染色体に組み込んだ組換えヒツジＥＳ細胞を、上述のベクターをエレクトロポレーション法などによってヒツジＥＳ細胞染色体に組み込ませ、その後薬剤を補充した培養培地で選択することによって、樹立する。組換えヒツジＥＳ細胞を、例えば、ヒツジ胚盤胞の胞胚腔に、あるいは桑実胚期または１６細胞期の胚に、顕微鏡操作によって移植し、そして内部細胞塊とともにまたは内部細胞塊の一部として発生させる（マイクロインジェクション法：Gordon J. W.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7380-7384 （1980））。あるいは、２つの８細胞胚から透明帯を除去し、そしてこれらの胚を上述の組換えヒツジＥＳ細胞と共同培養し、凝集塊を形成させる。得られた凝集塊を培養すると、１つの胚盤胞が得られる（細胞凝集法：Dvorak P.ら, Int. J. Dev. Biol., 39: 645-652 （1995））。上記で得られる胚（移植のための卵）を、精管結紮処理後の雄ヒツジと自然交配させることによって調製された偽妊娠雌ヒツジの子宮に移植し、そして発生させ、このようにしてキメラヒツジを産生し得る。
【０１７５】
得られたキメラヒツジが、ＥＳ細胞から誘導された細胞および組織を有すること、または樹立ラットＥＳ細胞が、キメラヒツジ産生能力を有することは、例えば、テンプレートとしてキメラヒツジの種々の組織から抽出したゲノムＤＮＡとマーカー遺伝子（ＥＳ細胞に導入されたマーカー遺伝子）特異的プライマーとを用いたゲノムＰＣＲによって、確認し得る。さらに、ＥＳ細胞の各組織系統の細胞への分化は、例えば、キメラヒツジの各組織を切片化し、そして用いたマーカータンパク質の性質に基づくマーカー遺伝子発現産物（マーカータンパク質）の存在を検出することによって、確認し得る。
【０１７６】
【表２】
【０１７７】
【表３Ａ】
【０１７８】
【表３Ｂ】
【０１７９】
実施例６
ウシ多能性細胞の誘導および特徴付け。
【０１８０】
目的
ウシＥＳ細胞の単離およびウシＥＳ細胞系の維持についての３ｉ培地の有効性を評価すること。
【０１８１】
材料および方法
実験計画
ＥＳ細胞の単離を評価するために、インビトロで産生した７または８日目の胚盤胞（ｎ＝１０５）を、４つの処理の各々に無作為に割り当てた：
１．コントロール（Ｎ２Ｂ２７）
２．３ｉ培地（ｈＬＩＦあり）
３．３ｉ培地（ｈＬＩＦなし）
４．Millipore-Chemicon ESGRO Complete
【０１８２】
推定ＥＳ細胞が増殖された場合、それらを継代し、そしてこの時点で遺伝子発現の特徴付けのために試料を収集した。培養３０日後にＥＳ細胞培養および処理を評価し、ＥＳ細胞系を生じなかった処理は中止した。ＥＳ細胞系をさらに６０日間、合計９０日間にわたって培養した。胚派生物を形成した、および継代１、継代３および継代６にまで培養された、各々の処理における胚盤胞の割合を、処理を比較するために用いた。多能性遺伝子（すなわち、ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、ｓｏｘ２、ｓｓｅａ１、アルカリフォスファターゼ、ｎａｎｏｇ）の形態および発現もまた、異なる処理におけるウシＥＳ細胞を比較するために用いた。すべてのプライマーは、培養されたウシＥＳ細胞で、これまで胚盤胞でのみバンドを生じたＮａｎｏｇを除いて、バンドを生じる。
【０１８３】
樹立ウシＥＳ細胞系の維持を評価するために、樹立系（ｎ＝３）を、ＥＳ細胞単離実験で用いたものと同じ４つの処理（すなわち、上記の培地１〜４）に継代した。これらの樹立細胞系を６継代まで培養した（約６０日間）。多能性遺伝子（すなわち、ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、ｎａｎｏｇ、ｓｓｅａ１）の形態および発現を、異なる処理で培養された、樹立ウシＥＳ細胞系を比較するために用いた。
【０１８４】
インビトロでの胚の産生
インビトロで４週間連続で胚盤胞を生じさせるために、卵母細胞を週に１度収集した。卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、食肉処理場から得た卵巣から吸引し、ウシ胚盤胞を、前述の方法（１、２）を用いてインビトロで産生させた。要するに、卵巣から吸引したＣＯＣを、卵母細胞成熟を誘発するために、β−エストラジオール、黄体形成ホルモン、およびウシ胎仔血清を補充したＴＣＭ−１９９中で、２４時間培養した。卵丘が膨張したＣＯＣを、成熟卵母細胞を含有すると推測し、そしてヘパリン、ペニシラミン、エピネフリンおよびヒポタウリンを含有するＩＶＦ−ＴＡＬＰ培地中でウシ精子とともに２４時間共同培養した。次いで、推定受精卵を、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、クエン酸三ナトリウム無水物、ミオイノシトールおよびウシ血清アルブミンを補充したＳＯＦ培地（３）で６〜７日間にわたって培養した。配偶子を、空気中に５％ＣＯ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養し、そして胚を、５％ＣＯ２／５％Ｏ２／９０％Ｎ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養した。胚盤胞の全セットから、いくつかの胚盤胞（ｎ＝１５）を特徴付けのために処理し（ＲＴ−ＰＣＲのための陽性コントロール）そして残り（ｎ＝１０５）をＥＳ細胞単離のために用いた。
【０１８５】
ＥＳ細胞単離および培養
透明帯を胚盤胞から機械的に除去し、そして胚盤胞を、マイトマイシンＣ処理によって不活性化したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上に押し付けた。研究の間ＭＥＦフィーダーの異なるバッチを用いたが、各バッチをすべての処理に用いた。ＭＥＦ上に押し付けた胚盤胞を、血清、非必須アミノ酸および増殖因子（ヒトＬＩＦ、βＦＧＦ、ＥＧＦ）を補充した複合培地（α−ＭＥＭ）を用いて、空気中に５％ＣＯ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養した。７〜９日後、胚は、推定ウシＥＳ細胞を含む胚派生物を形成し、この推定ウシＥＳ細胞を初代培養から機械的に切り取り（継代０）、そして新たなフィーダー層に押し付けた（継代１）。推定ＥＳ細胞が増殖した場合（範囲：６〜２６日間）、それらは新たなフィーダー層に継代される。継代の時に、推定ＥＳ細胞の試料を、溶解バッファー（５００μｌ 溶解バッファー：４５８．５μｌ ＤＥＰＣ水、２５μｌ ＤＴＴ（０．１Ｍ）、４μｌ ＩＰＥＧＡＬおよび１２．５μｌ ＲＮＡインヒビター）に入れ、そしてその後の多能性遺伝子転写物の分析のために−８０℃で保存した。培養の間、培養培地を２〜３日ごとに交換した。本研究で単離された細胞系の継代数をいうために用いられる用語はＰｘであり、ここで、ｘ＝本研究における継代の数である。
【０１８６】
樹立されたウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−１：Ｐ１９、１８３日；ＢＥＳ−３：Ｐ１８、２０６日；ＢＥＳ−４：Ｐ２３、２１０日）を、４つの処理の各々に継代した。これらの樹立系を、上記のように培養した。本研究のために割り当てられた後の樹立細胞系の継代数をいうために用いられる用語はＰｘ＋ｙであり、ここで、ｘ＝本研究の前の継代数であり、ｙ＝本研究における継代の数である。
【０１８７】
遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
近年単離されまたは樹立ウシＥＳ細胞系由来の胚盤胞（陽性コントロール）および推定ウシＥＳ細胞を、多能性遺伝子ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、ｓｏｘ２、ｓｓｅａ１、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）およびＮａｎｏｇの発現について、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。ハウスキーピング遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ）をｃＤＮＡの質の評価のために用いた。試料からｍＲＮＡを抽出するために市販のキットを用いた（Dynabeads（登録商標） mRNA DIRECTTM Micro Kit, Invitrogen）。製造者が推奨する標準的なプロトコールを用いてｍＲＮＡを抽出した。要するに、逆転写によってｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。２０μｌＲＴ系を用いた：４μｌの５×First Strand Buffer、１μＬのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ）、１μＬのランダムプライマー（１０μＭ）、１μＬのＲＮＡインヒビター、１μＬのSuperScript IIIおよび７．５μＬのＨ２Ｏおよび３μＬの試料。対応するＲＴ陰性（SuperScript IIIなし）を、ゲノム夾雑のチェックのために調製した。すべての試薬はInvitrogenから購入した。調製した溶液を、Mycycler Thermal Cycler （Bio-rad）で、以下のプログラムで処理した：５０℃で６０分間および７０℃で１５分間。ｃＤＮＡの質を、β−Ａｃｔｉｎプライマーを用いてＰＣＲによってチェックした。次いで、確認されたｃＤＮＡを、多能性マーカーのプライマーとともにＰＣＲに用いた。標準的な２５μｌのＰＣＲ系を用いた：２．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー、１．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、０．５μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ）、１μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、１μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、０．２μｌの組換型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１７．３μｌのＨ２Ｏおよび１μｌの試料。すべての試薬はFisher Biotecから購入した。調製した溶液を、Mycycler Thermal Cycler （Bio-rad）で、以下のプログラムで処理した：９４℃で５分間、（９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、および７２℃で４５秒）のサイクルを３５回、７２℃で５分間。
【０１８８】
ＯＣＴ４およびＲｅｘ１についてのＰＣＲ産物を、配列決定によって確認した。ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇについてのＰＣＲ産物は未だ配列決定していないが、産物のサイズは標的遺伝子と同じである。
【０１８９】
本研究に用いたプライマーは以下の通りである。
【０１９０】
【表４】
【０１９１】
インビトロでの分化
ウシＥＳ細胞コロニーから切り取った外植片を、ランダムな分化を促進する条件下（すなわち、接着力の低い培養容器、フィーダー層なし、ＬＩＦなし、増殖因子なし）に置き、そして空気中に５％ＣＯ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養した。培養の間、培養培地を３〜４日ごとに交換した。
【０１９２】
データ分析
連続データ（培養日数）を、算術平均±平均標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）として報告する。これらのデータは限られたものであったので、統計学的に分析しなかった。カテゴリーデータを、分割表のカイ２乗分析によって分析した（４、５）。この分析がデータセットにおける有意差を回帰した場合（すなわちｐ≦０．０５）、標準化残差および偏差率を用い、帰無仮説に基づいて、どの観察されたカイ２乗頻度が期待される頻度と最も異なるかを決定した（５）。これらの差異を、観察と処理との間の正または負の相関として報告する。
【０１９３】
結果
培養物中の増殖
ウシＥＳ細胞の単離および継代
胚派生物を形成した胚の割合は、処理間で有意に異なり（χ２３＝１２．４９、ｐ＝０．００５９）、そして培地２〜４で培養された胚の８０％以上が派生物を形成した（図１７）。派生物％とコントロール群との間には負の相関があり、コントロール培地で培養した場合、派生物を形成した胚はより少数であった。継代された胚派生物の割合は、処理間で有意に異なり（χ２３＝９．９６、ｐ＝０．０１８９）、そしてＳＣＳ１またはＳＣＳ２で培養された胚盤胞の６５％以上が継代された（図１７）。継代％と培地２（３ｉ＋ｈＬＩＦ）との間には正の相関があり、そして継代％とコントロール群との間には負の相関があった。継代３（χ２３＝１２．０２、ｐ＝０．００７３）および継代６（χ２３＝１３．８１、ｐ＝０．００３２）のウシＥＳ細胞系の割合は、処理間で有意に異なった（図１８）。培地２および３（ｈＬＩＦありまたはなしの３ｉ）で培養された胚盤胞の６０％より多くが継代３にまで継代され、そしてＰ３の細胞系％とコントロール群との間には負の相関があった。培地２または３で培養された胚盤胞の４０％より多くが継代６にまで継代され、そしてＰ６の細胞系％と培地２および３群との間には正の相関があり、Ｐ６の細胞系％と培地４およびコントロール群との間には負の相関があった。継代０での単離の間、４つの培地のうちのいずれかで培養した場合、ＥＳ細胞コロニーは同様の速度で増殖した（図３）。培養５０日後、培地２（５２．８±０．５６日間）または培地３（５４．０±１．１３日間）で単離したすべての細胞系がＰ６以降に進行していたのに対し、コントロール（ｎ＝２）または培地４（ｎ＝３）で単離したいくつかの細胞系は未だ継代６に継代されていなかった（すなわち、なお継代５にある）。
【０１９４】
樹立ウシＥＳ細胞系の培養
樹立ウシＥＳ細胞系のうちの１つ（ＢＥＳ−１）の増殖は、完全に不活性化されなかったＭＥＦフィーダーによって遅延した（結果：培養物中の一般的な形態を参照）。この細胞系は、３継代にわたって処理で培養しただけであり、データは分析しなかったが、ＢＥＳ−１由来の外植片を、その処理で培養した後のそれらのインビトロでの分化の潜在能について試験した（下記参照）。他の２つの樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−３およびＢＥＳ−４）は、４つの培地の各々で８継代にわたって培養した。外植片生存、支持された継代数、または８継代が完了する日数において、処理間あるいは細胞系間で明らかな差異はなかった（表３）。培地１〜４の各々を用いた培養の間、樹立ウシＥＳ細胞系由来のＥＳ細胞コロニーは同様の速度で増殖した（図２０）。
【０１９５】
【表５】
【０１９６】
培養物中の一般的な形態
新たに単離したウシＥＳ細胞と樹立細胞系から形成されたものとの間で、コロニーの形態に明らかな差異はなかった。コントロール培地で培養されたウシＥＳ細胞コロニーは、長円状に丸くなっており、起伏した境界を有した（図２１ａ、２１ｂ、２２ａ）。これらのコロニーはほとんど平面状（すなわち、２次元）であり、垂直方向の起伏がほとんどなかった。推定幹細胞は、大部分がコロニーの中央に向かって集中し、そしてコロニーの外側領域は明らかなＥＳ細胞を含有しなかった。いくつかの領域では、ＥＳ細胞とフィーダーとの間に流体が堆積し、ＥＳ細胞層を浮き上がらせ、半球および球状構造物を形成した。培地２（３ｉ＋ｈＬＩＦ）（図２１ｃ、２１ｄ、２２ｂ）または培地３（ｈＬＩＦなしの３ｉ）（図２１ｅ、２１ｆ、２２ｃ）で培養されたＥＳ細胞コロニーは、長円状に丸くなっており、非常に明確な起伏した境界を有した。これらのコロニーは、コントロール培地で培養されたものと比較して、形状がより３次元であり、密集した中央部分を有し、多くの垂直方向の起伏がその中央から放射状に広がっていた。いくつかのコロニーの下に流体が堆積したため、それらは凸状であった。コロニーには、密集し隆起した線状構造物が存在し、中央から放射状に広がっていた。推定ＥＳ細胞は、それらがコロニーから持ち上がった、これらの線状構造物の基底部に集中した。推定ＥＳ細胞がより密集していない領域が、これらの構造物から離れて、大部分はコロニーの中央に向かって位置し、そしていくつかはコロニーの端近くに位置した。１０日以上の培養の後、球状の流体で満たされた構造物（胚様体に似ている）が、隆起した線状構造物の近くに形成された。培地４で培養されたＥＳ細胞コロニーは、コントロール培地で培養されたコロニーと同様に、不規則な形状であり、起伏した明確な境界を有した（図２１ｇ、２１ｈ、２２ｄ）。これらのコロニーは３次元であり、細胞の密集領域が、コロニー中にわたって繊維状の起伏した網目構造を形成し、これには規則的なパターンがなかった。いくつかの領域では、ＥＳ細胞とフィーダーとの間に流体が堆積し、半球および球状構造物を形成した。コロニー中の細胞は、拡散しまばらであったが、コロニーの中央は、より密集し隆起していた。個々の細胞が非常に明確であり、そして推定ＥＳ細胞はコロニー中でまばらであったが、コロニーの端近くでは見られなかった。これらの異なる処理はコロニー形態に差異を引き起こしたが、推定ＥＳ細胞の形態の差異は促進しなかったようである（図２３および２４）。
【０１９７】
コントロール培地で培養されたＭＥＦフィーダーのいくつかのバッチは代表的な形態を有し、それらは培養容器上に均一層を形成し、継代を通して比較的変化しないままであった。培地２〜４のいずれかで培養した場合、フィーダーの細胞は、継代３日目までに、丸くなって、フィーダー層から剥離し始めたが、この応答は培地４でより激しかった。ＭＥＦフィーダーの他のバッチは、コントロール培地で培養された場合に、代表的な様態で挙動せず、層中に濁った領域が現れ、そして細胞が増殖し続けているようであった。これらのＭＥＦフィーダーは、継代約１２日目までに、培養容器から剥離した。培地２または３で培養した場合、ＭＥＦのこれらのバッチは、非常に健常に見え、そしてコントロール培地で培養されたフィーダーに特有の形態であった。これらのＭＥＦバッチを培地４で培養した場合、フィーダーの細胞は、継代６〜８日目までに丸くなってフィーダー層から剥離した。
【０１９８】
継代の間の外観および挙動
ウシＥＳ細胞のシート（外植片）を、コントロール培地で培養したコロニーから２９Ｇニードルを用いて機械的に切り取るのはかなり容易であった。機械的に継代する間、ウシＥＳ細胞コロニー全体の動きはほとんどなかった。外植片を切り取るとき、ＥＳ細胞コロニーはＭＥＦフィーダー層の上を覆うように増殖した細胞の単一層であるように見えた。培地２または３で培養されたＥＳ細胞コロニー由来の外植片は、ＥＳ細胞コロニーがより密集し、スポンジ状で柔軟であるように見えるため、切り取りがさらに困難であった。細胞のシートを切り開くためにニードルを用いると、コロニーの大部分が動いた。培地２または３で培養された外植片は、一般的に、コントロール培地で培養されたコロニー由来の外植片よりも、継代での新たなＭＥＦフィーダープレートへの付着がより容易であった。培地４で培養されたＥＳ細胞コロニーは、培地２または培地３で培養されたコロニーと同様に、継代する間著しく動いた。培地４で培養されたコロニーの中央近くの推定ウシＥＳ細胞は、継代で非常に砕けやすく、より小さな凝集塊に容易に分散したので、継代のため外植片の切り取りが難しくなった。培地４の外植片は、外観上非常に屈折していた。
【０１９９】
多能性遺伝子の発現
Ｏｃｔ４は、４つの培地のいずれで単離されたウシＥＳ細胞でも頻繁かつよく発現し、そして他の遺伝子はｏｃｔ４なしでは決して発現しなかった（図２５および２６）。Ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１もまた、４つの培地のいずれで単離されたウシＥＳ細胞でも頻繁に発現し、そしてほとんど常に同時に発現した。ｒｅｘ１がｓｓｅａ１なしで発現することはあったが（図２５および２６：コントロールおよび培地３：示さず）、ｓｓｅａ１はｒｅｘ１なしでは決して発現しなかった。Ｓｏｘ２およびＡＰはそれ程頻繁には発現せず、そして常にｏｃｔ４、ｒｅｘ１、およびｓｓｅａ１と同時に発現した。Ｓｏｘ２およびＡＰは、４つの培地のいずれで単離されたウシＥＳ細胞でも発現したが、それらの発現は、より初期の継代において、そして３ｉ培地（培地２または３）で単離されたウシＥＳ細胞において、より一般的であった。Ｎａｎｏｇは、ごくたまにしか発現せず、そしてどちらの場合も（図２６：コントロールおよび培地３）、ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、およびｓｓｅａ１と同時に発現した。６個の多能性遺伝子のすべてを発現したことが分析された細胞の集団は、培地３（ｈＬＩＦなしの３ｉ）で単離された継代１のウシＥＳ細胞のみであった（図２６）。
【０２００】
４つの培地の各々で培養された樹立ＥＳ細胞系由来のウシＥＳ細胞の遺伝子発現は、２つの局面で異なった（図２７）。第一に、ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１がｏｃｔ４の不在下で発現したことであり、そして第二に、最もよく発現した遺伝子は、ｏｃｔ４よりはむしろｒｅｘ１およびｓｓｅａ１であったことである。培地２〜４で培養された多くの継代の後の樹立細胞系においては、より初期の継代では存在しなかったｏｃｔ４を含む、より多くの遺伝子が発現した。
【０２０１】
インビトロで分化する能力
３日以内に、培地２または３で培養されたコロニーから切り取った樹立系の１つ（ＢＥＳ−１）の外植片は、インビトロでの分化を促進する条件に置かれた場合に、胚様体（ＥＢ）に特有の、流体で満たされた球状構造物および細胞凝集塊を形成した（図２８ａ、２８ｂ）。これらのＥＢは、コントロール培地で培養されたコロニーから切り取った外植片によって形成されたものと同様の形状であった。培地２中の１つの外植片は、培養皿に付着した。３日以内に、培地４で培養されたコロニーから切り取った２つの外植片が、培養皿に付着した。個々の細胞が培養容器に付着し、そして分化し始め、それらは中心細胞体から伸長している多くの長い突起を有した（図２８ｃ、２８ｄ）。１つの外植片が、小胞が付着した細胞の凝集塊を形成した。ＢＥＳ−１由来のＥＢ培養物は、培養１０日後に細菌に汚染され始め、廃棄した。本研究で単離されたコロニー由来の外植片もまた、インビトロで分化を促進する条件に置かれた場合に、ＥＢを形成し、コロニーを付着した。
【０２０２】
考察
顕微鏡観察および継代での挙動によって示されるように、異なる培地が、コロニー形態、細胞相互作用およびフィーダー層への付着の変動を誘発した。機械的に継代する間、コントロール培地で培養されたウシＥＳ細胞コロニーはほとんど動かず、これはウシＥＳ細胞がフィーダー層または培養容器に付着したことを示唆した。ヒトまたはマウスＥＳ細胞コロニーとは異なり、ウシＥＳ細胞コロニーは、フィーダー層の上を覆うように増殖した。３ｉ培地で培養されたウシＥＳ細胞コロニーの密集したスポンジ状の柔軟な形状は、これらのコロニーが多層であり得ることを示す。機械的に継代する間、培地２〜４で培養されたウシＥＳ細胞コロニーは著しく動き、これはＭＥＦまたは培養容器との結合がほとんどなかったことを示唆した。これは驚くべきことではなく、これらの３つの培地にはＭＥＦフィーダー細胞に有害な効果があるため、これらを丸くさせ、フィーダーから剥離することとなった。培地４で培養されたコロニーでは、推定ウシＥＳ細胞領域中、個々の細胞が非常に明確であり、おそらく細胞間の結合がほとんどなかったと思われることを示した。コロニーの形態は培地間で大きく異なったが、細胞形態の差異はあまり見られなかった。コロニーの形態および継代での挙動は、新たに単離されたウシＥＳ細胞および樹立された細胞系の形状を形成したものについても同様であった。
【０２０３】
３ｉ培地（培地２および３）はウシＥＳ細胞の単離により効率的であり、より多くの胚盤胞が胚派生物を形成しそして継代１に導かれた。これらの２つの培地はまた、ウシＥＳ細胞の増殖および維持に優れ、継代３および継代６の細胞系がより多く存在した。本研究の終了時、培地４およびコントロール培地で培養されたいくつかの細胞系がなお継代５での生存であったのに対し、３ｉ培地（培地２および３）ではすべての細胞系が継代６以降であった。これは、ウシＥＳ細胞の増殖および発生が、３ｉ培地でより速かったことを示唆する。本研究では、コントロール培地が、ウシＥＳ細胞の単離およびその後の維持について最も効率的でなく、派生物を形成して継代された胚がより少数であり、継代３および継代６の細胞系がより少数であった（すなわち、分析されたすべてのパラメータ）。
【０２０４】
本研究で用いられるいくつかのＭＥＦフィーダー層に関して、それらが増殖し続け、おそらくはマイトマイシンＣ処理によって完全に不活性化されなかったという問題があった。培地２〜４がＭＥＦフィーダーに有害であるように見え、そしていずれの非不活性化フィーダー細胞の増殖も遅らせたが、コントロール培地は、フィーダーの増殖に影響がなかったため、このことは、コントロール群に選択的に不都合であると思われた。しかし、本研究では４つの処理群のすべてでＭＥＦフィーダーの同じバッチを用いたので、処理間の比較が有効である。４つの培地間で、樹立ウシＥＳ細胞系の増殖および発生における差異は見られなかった。
【０２０５】
ＯＣＴ４、Ｒｅｘ１およびＳＳＥＡ１は、ウシＥＳ細胞の強力で強固な多能性マーカーであり、これは、近年単離されたＥＳ細胞および樹立ウシＥＳ細胞系についても当てはまった。Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１は、ウシＥＳ細胞系で通常発現し、そして本研究では、他の多能性遺伝子は、これらが不在では決して発現しなかった。新たに単離されたウシＥＳ細胞では、ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１の発現は、ｏｃｔ４の発現に依存し、そしてｓｓｅａ１の発現は、ｒｅｘ１の発現に依存した。これらの３つの遺伝子の発現は、処理群からは独立していた。他の多能性遺伝子の発現は不規則であり散発的でありそして培養培地に関連し、そして３ｉ培地での培養は他の多能性遺伝子の発現を誘導した。樹立ウシＥＳ細胞系では、本研究の初期継代でｏｃｔ４を発現しないことが多く、それにもかかわらずｒｅｘ１およびｓｓｅａ１を発現した。興味深いことに、ｏｃｔ４は、より初期の継代で検出されなかったとしても、培地２〜４での培養後の樹立ＥＳ細胞系では発現した。これは、この培地が、他の多能性遺伝子の発現を誘導したことを示唆し、このことは、新たに単離されたＥＳ細胞と同様である。本研究で用いられるＯＣＴ４プライマーは、胚盤胞およびインビボ胚に１つのはっきりしたバンドを生じ、しかしインビトロで単離されたＥＳ細胞では２つのバンドを生じる。小さな方のバンドを配列決定してＯＣＴ４であることを確認した。大きな方のバンドは、陰性コントロールがこのバンドの存在を示さなかったので、ゲノムＤＮＡではない。発明者らのインビトロ培養系は、ｏｃｔ４の偽遺伝子またはアイソフォームが発現されることを誘導し得、そしてこれを確認するために、第２のバンドを配列決定する。
【０２０６】
培地２または３（３ｉ培地）で培養されたウシＥＳ細胞に有意な差異はなかった。これらの培地の差は、培地２にｈＬＩＦが存在することだけであった。これは、ｈＬＩＦにウシＥＳ細胞に対する付加効果がほとんどなかったことを示す。
【０２０７】
結論
試験を行った４つの培地では、２つの３ｉ培地がウシＥＳ細胞の単離に最も効率的であった。ウシＥＳ細胞の増殖および発生ならびに多能性遺伝子の発現は、これらの２つの培地において優れていた。さらに、３ｉ培地で単離されたウシＥＳ細胞は、インビトロで分化する潜在能を示した。増殖および発生におけるこのような著しい差異は、樹立ウシＥＳ細胞系では見られなかった。しかし、３ｉ培地での培養後、より多くの多能性遺伝子が発現したので、これらの培地はウシＥＳ細胞系の多能性構成要素を強化すると思われる。
【０２０８】
参考文献
1. Lonergan P, O'Kearney-Flynn M, Boland, M. P. (1999) Effect of protein supplementation and presence of an antioxidant on the development of bovine zygotes in synthetic oviduct fluid medium under high or low oxygen tension. Theriogenology 51: 1565-1576
2. Holm P, Booth PJ, Schmidt MH, Greve T, Callesen H (1999) High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins. Theriogenology 52: 683-700
3. Tervit HR, Whittingham, DG, Rowson LEA (1972) Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. Journal of Reproduction and Fertility 30: 493-497
4. Zar JH (1999) Biostatistical Analysis. IE 4th edn, Prentice Hall, Upper Saddle River
5. Fowler J, Cohen L, Jarvis P (1998) Practical Statistics for Field Biology. 2nd Edn, John Wiley and Sons, New York
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞における自己再生表現型の維持に関する。提供される方法および組成物は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、特に、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタおよびヒトを含む哺乳動物の幹細胞の培養および単離に適する。特に、本発明は、ラット、マウスおよびヒトの多能性細胞の自己再生培養物、ならびにそのための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清および白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培地の存在下でのインビトロ多能性幹細胞培養物の樹立および維持は、周知である（Smithら、（1998）Nature 336: 688-90）。このような方法は、「許容的」なマウスの系統から多くの継代にわたって多能性胚性幹（ＥＳ）細胞を維持するために用いられてきた。多能性幹細胞培養物の維持および自己再生は、フィーダー細胞またはその抽出物（通常はマウス線維芽細胞）の存在下で幹細胞が培養される場合にさらに支持される。このような条件下では、培養物中で多くの継代にわたってヒトＥＳ細胞を多能性状態に維持し得る。
【０００３】
多くの場合において、ＥＳ細胞は、血清または血清抽出物を含む（したがって、非限定である）培地を用いるか、またはヒトＥＳ細胞を維持するために用いられる線維芽細胞フィーダー細胞のような他の細胞の存在を必要とする細胞培養条件を用いる場合のみ維持され得るか、あるいは最もよく維持される。しかし、培地中のものであろうとまたは例えばフィーダー細胞によって産生されるものであろうと、何らかの不確定の構成成分が、ＥＳ細胞の増殖および分化についての研究を潜在的に妨害し、または邪魔する。これは、ＥＳ細胞およびその子孫の治療および他の適用のための良好な製造実施の発展を妨げる。いくつかの限定されたＥＳ細胞培地が知られているが、代替のおよび好ましくは改良された限定培地が必要とされる。
【０００４】
本出願人による先の出願であるWO-A-03/095628およびより後の未公開出願において、（１）ｇｐ１３０のアゴニスト（例えば、ＬＩＦ）および（２）ＴＧＦ−βスーパーファミリーのアゴニスト（例えば、ＢＭＰ４）またはＩｄシグナリング経路のアゴニストを含む無血清培地中でＥＳ細胞のような多能性幹細胞を培養することは、複数の継代にわたって幹細胞の自己再生を促進するために用いられる。ｇｐ１３０シグナリングの存在下では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーまたはＩｄシグナリング経路のアゴニストは、驚くべきことに、分化前のシグナルよりもむしろ自己再生の刺激を提供した。それにもかかわらず、多能性細胞を自己再生状態に維持する効率、およびフィーダー細胞から離してまたはフィーダー条件培地から離して多能性細胞を移すための培地は、常に改良されることが望まれる。
【０００５】
Sato Nら、Nat. Med. 2004年1月 10(1) 55-63頁は、血清を含む培地中でのマウスおよびヒトＥＳ細胞に対する、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）インヒビターである６−ブロモインディルビン−３’−オキシムの効果を記載している。しかし、これらの効果は非常に短い時間枠にわたってのみ観察され、あまりにも短いため確かな結論を引き出し得なかった。そして、その研究に用いられた非限定培地中の未知の因子の影響は重要であり得る。本発明の発明者らは、その結果を反復することを試みたがこれに失敗し、そして実際にはそれらの記載と反対の効果を見出した。
【０００６】
ＥＳ細胞の培養培地の調製のためには、個々の培地構成成分をできる限り純粋な形態で提供することが望まれる。しかし、ほとんどの培地構成成分はサイトカインであり、その純度は、それらを細胞系で製造し、次に生産ブロスから潜在的な汚染物質を除去する必要によって損なわれる。いくつかのサイトカインに伴う別の問題は、それらが効果的かつ無毒性である濃度範囲が狭いことである。より広い範囲の濃度を有しおよび／またはより高い濃度でより毒性が低い培地構成成分は、非常に有用である。サイトカインはまた、貯蔵において安定性が限定され得、そしてより安定な培地構成成分が求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、当該技術分野における問題を克服しまたは少なくとも改善すること、好ましくは代替の、より好ましくは改良された、多くの継代にわたって該幹細胞の自己再生を支持し得る、多能性幹細胞に適した培養方法および培養培地を提供することである。本発明のさらなる目的は、細胞の分化が制御される様式で誘導され得るまで多能性幹細胞培養物のインビトロでの維持を可能にする、代替の培養系を提供することである。本発明のよりさらなる目的は、多能性幹細胞の誘導および単離を増強し、かつＥＳ細胞の単離が難しい生物からまたは多能性幹細胞がまだ単離されていない生物からのそれらの誘導および単離を促進する方法および組成物を提供することである。本発明のさらなる関連の目的は、そのような生物由来の多能性幹細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の局面によれば、多能性細胞でのＧＳＫ３およびＭＥＫおよびＦＧＦレセプターすべての阻害が、細胞の自己再生を促進するために用いられる。
【０００９】
本発明によれば、ＥＳ細胞のような多能性幹細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニスト（例えば、小分子ＧＳＫ３インヒビターおよび小分子ＭＥＫインヒビターおよび小分子ＦＧＦＲアンタゴニスト）を含む、（好ましくは無血清の）培地中で培養される。それによって、幹細胞の複数の継代にわたる自己再生が促進される。したがって、多能性細胞でのＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターシグナリングの阻害は、自己再生の刺激を提供する。
【００１０】
本発明は、多くの適用を有する。ＧＳＫ３およびＭＥＫの阻害の組み合わせ、ＭＥＫおよびＦＧＦＲの阻害の組み合わせ、またはＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦＲの阻害の組み合わせが、多能性細胞、特にＥＳ細胞を増殖させるため、およびそれらがフィーダー上で誘導または増殖されていた場合、多能性細胞、特にＥＳ細胞を、フィーダー細胞またはフィーダー細胞の層（しばしばフィーダーまたはフィーダー細胞という）を伴わずに増殖するように適応させるために用いられ得る。培養物中で幹細胞を増殖させる方法は、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターの存在下、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下、または好ましくはＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で細胞を培養する工程を含む。１以上のＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビター、１以上のＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニスト、ならびに必要に応じて１以上のＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを含む培養培地が調製され得る。ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを用いて、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを用いて、またはＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを用いて、ＥＳ細胞（ＥＳ細胞がこれまで単離されなかった生物由来のＥＳ細胞を含む）が誘導され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明によって誘導および維持されたマウスＥＳ細胞、およびこれらのＥＳ細胞によるキメラ寄与の高効率を示す。
【図２】本発明によって増殖された継代４マウスＥＳ細胞を示す。
【図３】本発明によって増殖されたマウスＥＳ細胞がＯｃｔ４陽性であることを示す。
【図４】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞のコロニーを示す。
【図５】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がＮａｎｏｇ陽性であることを示す。
【図６】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がＯｃｔ４陽性であることを示す。
【図７】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がＣｄｘ−２陽性であることを示す。
【図８】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞がアルカリフォスファターゼ陽性であることを示す。
【図９】本発明によって単離された４つのラットＥＳ細胞系におけるＲＴ−ＰＣＲ発現データを示す。
【図１０】本発明によって単離されたラットＥＳ細胞から生じた奇形腫の成熟分化組織切片を示す。
【図１１ａ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ａ.血清およびＬＩＦの存在下、または３ｉ中での培養３日後のＩＣＭのＯｃｔ４およびＣｄｘ２についての免疫蛍光染色。
【図１１ｂ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ｂ.培養されたラットＩＣＭ中のＯｃｔ４およびＣｄｘ２免疫陽性細胞の定量化。
【図１１ｃ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ｃ．３ｉ中での培養４日後のＩＣＭのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ免疫染色。
【図１１ｄ】３ｉ中でＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を保持するラットＩＣＭ派生物および一次コロニーを示す。ｄ．ＩＣＭ派生物の脱凝集４日後の３ｉ中の一次コロニー。
【図１２ａ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ａ．フィーダー上で、３ｉで継代された細胞の代表的なコロニー。
【図１２ｂ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｂ．３ｉ中のフィブロネクチン上でフィーダーなしで継代された細胞。
【図１２ｃ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｃ．３ｉコロニーのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇについての免疫蛍光染色。
【図１２ｄ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｄ．Ｅ１４Ｔｇ２ａマウスＥＳ細胞（ｍＥＳ）、ラットＥｘＳ細胞（ｒＥｘＳ）およびマウスＯｃｔおよびマウスＮａｎｏｇ導入遺伝子を発現するラットＥｘＳ細胞（ｒＥｘＳ＋ｍＯ／ｍＮ）と比較した、ラット胚由来３ｉ細胞におけるマーカー発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図１２ｅ】３ｉ中で増殖したラット胚由来細胞の形態、クローン性増殖、染色体相補体が、細胞を誘導したことを示す。ｅ．３ｉラットＥＳ細胞（Ｃ系）由来の中期染色体。
【図１３ａ】インビトロでのラット３ｉ細胞の分化を示す。ａ．フィーダー上で血清＋ＬＩＦへ曝露した後の細胞の位相差画像および免疫蛍光画像。
【図１３ｂ】インビトロでのラット３ｉ細胞の分化を示す。ｂ．３ｉなしの無血清培地中のゼラチン上の培養８日後の分化細胞。
【図１３ｃ】インビトロでのラット３ｉ細胞の分化を示す。ｃ．ＸＸラットＥＳ細胞におけるＸ染色体状態の特徴付け。未分化のＸＸラット３ｉ細胞および６日間分化させたＸＸラット３ｉ細胞およびＸＸラット神経幹（ＮＳ）細胞における、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（緑色）についての免疫蛍光。未分化細胞は染色の拡散を示し（不活性Ｘの欠如）、これに対して分化細胞および体性幹細胞はＨ３Ｋ２７ｍｅ３核小体（不活性Ｘ）の存在を示す。細胞は、Ｄａｐｉ（青色）で対比染色された。
【図１４ａ】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ａ．奇形腫の組織切片。角化上皮（Ｃ系）、横紋筋（Ｂ系）、腸上皮（Ｃ系）。
【図１４ｂ】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｂ．ＧＦＰ発現Ｄ系３ｉ細胞を用いて生じさせたＥ１０．５キメラの無傷胚および頭から尾までの横断切片（ｉ〜ｘ）の画像。緑色はＧＦＰ蛍光、青色はＤＡＰＩ核染色。
【図１４ｃ】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｃ．Ｃ系の細胞から誘導された毛色キメラ。アルビノの鼻はレシピエントのＦｉｓｃｈｅｒ系（頭巾斑のあるアルビノ）、体の色は導入されたＤＡ系細胞を示す。
【図１４ｄ１】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｄ．成体毛色キメラのゲノムＤＮＡのマイクロサテライト分析。多型のマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７を、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、アガロースゲルおよび蛍光検出法によって分析した。
【図１４ｄ２】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｄ．成体毛色キメラのゲノムＤＮＡのマイクロサテライト分析。多型のマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７を、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、アガロースゲルおよび蛍光検出法によって分析した。
【図１４ｄ３】奇形腫の形成およびキメラへの寄与を示す。ｄ．成体毛色キメラのゲノムＤＮＡのマイクロサテライト分析。多型のマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７を、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、アガロースゲルおよび蛍光検出法によって分析した。
【図１５】代表的なヒツジＥＳ細胞系（７ａ、継代５以上）のインビトロでの未分化状態および分化状態を示す。
【図１６】未分化状態の代表的なヒツジＥＳ細胞系（７ａ、継代５）のＲＴ−ＰＣＲデータを示す。
【図１７】培地１〜４で培養された胚間における胚派生物を形成したウシ胚および継代１にまでなったウシ胚の％割合の比較を示す。派生物％：χ２３＝１２．４９、ｐ＝０．００５９；継代％χ２３＝９．９６、ｐ＝０．０１８９。ａ 観察（すなわち、派生物％、継代％）と処理との間に正の相関がある。ｂ 観察と処理との間に負の相関がある。
【図１８】培地１〜４で培養された胚間における継代３（Ｐ３）または継代６（Ｐ６）まで胚性幹細胞系を形成した胚の％割合の比較を示す。Ｐ３：χ２３＝１２．０２、ｐ＝０．００７３；Ｐ６：χ２３＝１３．８１、ｐ＝０．００３２。ａ 観察（すなわち、Ｐ３またはＰ６の細胞系％）と処理との間に正の相関がある。ｂ 観察と処理との間に負の相関がある。
【図１９】培地１〜４で培養された胚由来のウシ胚性幹細胞コロニーの継代０でのコロニー増殖の比較を示す。
【図２０】培地１〜４で培養された樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−４）の最初の継代（すなわち、Ｐ２３＋１）の間のコロニー増殖の比較を示す。
【図２１】（ａ、ｂ）コントロール培地、（ｃ、ｄ）培地２、（ｅ、ｆ）培地３または（ｇ、ｈ）培地４で、（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）３７日間または（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）５７日間培養されたウシ胚性幹細胞コロニーの形態の比較を示す。培養は、継代４、５または６においてであった。
【図２２】（ａ）コントロール培地、（ｂ）培地２、（ｃ）培地３または（ｄ）培地４で１０日間培養された樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−１）由来のウシ胚性幹細胞コロニーの形態の比較を示す。培養は、Ｐ１９＋１においてであった。スケールバー＝２ｍｍ。
【図２３】（ａ）コントロール培地、（ｂ）培地２、（ｃ）培地３または（ｄ）培地４で単離されたコロニー由来のウシ胚性幹細胞の形態の比較を示す。培養は、Ｐ５またはＰ７においてであった。
【図２４】（ａ）コントロール培地、（ｂ）培地２、（ｃ）培地３または（ｄ）培地４で培養された樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−１）由来のウシ胚性幹細胞の形態の比較を示す。培養は、Ｐ１８＋１においてであった。
【図２５】培地１〜４で単離されたＥＳ細胞系由来のＥＳ細胞についての培養の間の多能性の遺伝子発現プロフィールの比較を示す。Ｐ１、Ｐ３、Ｐ７でコントロール（培地１）系；Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４で培地２系；Ｐ２、Ｐ３、Ｐ６で培地３系；Ｐ１、Ｐ３、Ｐ６で培地４系。すべてのゲルの図について、遺伝子順序は、左から右に向かって以下の通り：β−Ａｃｔｉｎ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ１、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇ。
【図２６】培地１〜４で単離されたＥＳ細胞系由来のウシＥＳ細胞についての多能性の遺伝子発現プロフィールの比較を示す。これは、（ａ）継代１と（ｂ）後の継代とでのいくらかの変化を示す。コントロールの例はＰ４およびＰ７由来であり、培地２の例はＰ４およびＰ６由来であり、培地３の例はＰ５およびＰ６由来であり、そして培地４の例はＰ４およびＰ６由来である。すべてのゲルの図について、遺伝子順序は、左から右に向かって以下の通り：β−Ａｃｔｉｎ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ１、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇ。
【図２７】１、４または５継代にわたって培地１〜４で培養された樹立ＥＳ細胞系（ＢＥＳ−４）由来のウシＥＳ細胞についての多能性の遺伝子発現プロフィールの比較を示す。すべてのゲルの図について、遺伝子順序は、左から右に向かって以下の通り：β−Ａｃｔｉｎ、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ１、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇ。
【図２８】インビトロで分化を促進する条件に置かれた場合の樹立ウシＥＳ細胞系由来の外植片の応答の比較を示す。（ａ）培地２で培養された外植片から形成された胚様体。（ｂ）培地３で培養された外植片から形成された胚様体。（ｃ）および（ｄ）培地４で培養された外植片由来の細胞は、培養容器に付着し、分化し始めた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
多能性細胞とは、胚性幹（ＥＳ）細胞と呼ばれるものを含むが、これに限定されない。多能性細胞（ＥＳ細胞を含む）の特徴的な性質としては、多能性発生期に関わる複数の遺伝子の発現、供給源動物に存在するありとあらゆる組織タイプを代表する細胞に分化する能力、キメラに寄与する能力、および、特にキメラの生殖系列に寄与する能力が挙げられる。例えば、ＥＳ細胞のような真性多能性細胞は、多能性関連遺伝子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのすべてではないとしても多くを発現することが期待される。特に、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２の発現は、細胞がＥＳ細胞である決定的な最初の指標を提供すると広く考えられている。キメラにおける生殖系列遺伝および３つの一次胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてから分化した細胞を含む奇形腫または奇形癌を生じる能力もまた、細胞がＥＳ細胞であることの決定的な指標として広く考えられている。
【００１３】
ＧＳＫ３阻害とは、１以上のＧＳＫ３酵素の阻害をいう。したがって、ＧＳＫ３インヒビターはＧＳＫ３酵素ファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーを阻害し得る。ＧＳＫ３酵素ファミリーは周知であり、ＧＳＫ３−αおよびＧＳＫ３−βが挙げられるが、これらに限定されない。多くの変異型が記載されている（例えば、Schafferら; Gene 2003; 302（1-2）: 73-81参照）。特定の実施態様ではＧＳＫ３−βが阻害される。ＧＳＫ３−αインヒビターもまた適切であり、そして一般に本発明において使用されるインヒビターは両方ともを阻害する。広い範囲のＧＳＫ３インヒビターが公知である（例証として、インヒビターＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６）。他のインヒビターが公知であり、そして本発明において有用である。さらに、ＧＳＫ３−βの活性部位の構造は特徴付けられており、特異的なインヒビターおよび非特異的なインヒビターと相互作用する主要残基が同定されている（Bertrandら；J Mol Biol．2003；333（2）：393-407）。この構造特徴付けによって、さらなるＧＳＫインヒビターが容易に同定され得る。
【００１４】
ある実施態様のインヒビターは、ＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αに特異的であり、実質的にｅｒｋ２を阻害せず、そして実質的にｃｄｃ２を阻害しない。インヒビターは、ＩＣ５０値の比として測定した場合、マウスｅｒｋ２および／またはヒトｃｄｃ２よりもヒトＧＳＫ３に対して、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも２００倍、非常に好ましくは少なくとも４００倍の選択性を有する。ここで、ＧＳＫ３ ＩＣ５０値とは、ヒトＧＳＫ３−βおよびＧＳＫ３−αについての平均値をいう。ＣＨＩＲ９９０２１およびＣＨＩＲ９８０１４について良好な結果が得られており、これらは両方ともＧＳＫ３に特異的である。ＧＳＫ３インヒビターの例は、Bennett Cら、J. Biol. Chem., 277巻, 34号, 2002年8月23日, 30998-31004頁およびRing DBら、Diabetes, 52巻, 2003年3月, 588-595頁に記載されている。ＣＨＩＲ９９０２１の使用に適した濃度は、０．０１〜１００、好ましくは０．１〜２０、より好ましくは０．３〜１０μＭの範囲にある。
【００１５】
ＧＳＫ３阻害はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて好都合に達成され得る。代表的に、ＧＳＫ３遺伝子のすべてまたは一部に対して相補的である２本鎖ＲＮＡ分子が多能性細胞に導入され、したがって、ＧＳＫ３をコードするｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後機構は、目的のＧＳＫ３遺伝子の発現を低減または停止させることとなる。ＲＮＡｉを用いてＧＳＫ３阻害を達成するための適切な技術およびプロトコールは、公知である。
【００１６】
本明細書中においてＭＥＫインヒビターとは、一般的なＭＥＫインヒビターをいう。したがって、ＭＥＫインヒビターとは、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２およびＭＥＫ３を含むタンパク質キナーゼのＭＥＫファミリーメンバーの任意のインヒビターをいう。また、ＭＥＫ１インヒビター、ＭＥＫ２インヒビターおよびＭＥＫ３インヒビターをいう。ＭＥＫインヒビターは、ＭＥＫキナーゼファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバーまたはすべてのメンバーを阻害し得る。当該技術分野で既に公知の適切なＭＥＫインヒビターの例としては、ＭＥＫ１インヒビターであるＰＤ１８４３５２およびＰＤ９８０５９、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２のインヒビターであるＵ０１２６およびＳＬ３２７、ならびに、Daviesら（2000）（Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J. 351, 95-105）に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。特に、ＰＤ１８４３５２は、他の公知のＭＥＫインヒビターと比較した場合に、高い特異性および効力を有することが見出されている。他のＭＥＫインヒビターおよびＭＥＫインヒビターのクラスは、Zhangら（2000）Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 10:2825-2828に記載されている。炭疽菌の致死因子が、ＰＤ０９８０５９のものと同様のＭＡＰＫＫ阻害プロフィールを示すことも見出された（Duesberyら、1999）。さらなる適切なＭＥＫインヒビターとしては、ＰＤ０３２５０９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＣＩ−１０５５が挙げられる。
【００１７】
ＭＥＫキナーゼの阻害はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて好都合に達成され得る。代表的に、ＭＥＫ遺伝子のすべてまたは一部に対して相補的である２本鎖ＲＮＡ分子が多能性細胞に導入され、したがって、ＭＥＫをコードするｍＲＮＡ分子の特異的な分解を促進する。この転写後機構は、目的のＭＥＫ遺伝子の発現を低減または停止させることとなる。ＲＮＡｉを用いてＭＥＫ阻害を達成するための適切な技術およびプロトコールは、公知である。
【００１８】
ＭＥＫ阻害を達成するための他のアプローチとしては、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードの構成成分の活性を阻害または低減する化合物を用いることが挙げられる。例えば、化合物は、１つ以上のマイトジェン活性タンパク質キナーゼ（例えば、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２）を阻害する。あるいは、化合物は、例えば同様の効果を有するｇｐ１３０への酵素の結合を阻害することによって、ＳＨＰ−２を阻害する。さらなる実施態様では、インヒビターはＭＥＫを阻害する。
【００１９】
あるいは、ＭＥＫの阻害は、ｒａｓ／ＭＡＰＫカスケードの構成成分のダウンレギュレーションによって達成され得る。ＭＫＰ−３は、ＭＡＰキナーゼフォスファターゼの一例およびＥＲＫの公知のダウンレギュレータであり、そして導入遺伝子としてＥＳ細胞に導入されている。
【００２０】
キナーゼインヒビター（ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを含む）を同定するための多くのアッセイが、公知である。例えば、Daviesら（2000）には、ペプチド基質および放射性標識ＡＴＰの存在下でキナーゼをインキュベートするキナーゼアッセイが記載されている。キナーゼによる基質のリン酸化は、基質への標識の取り込みを生じる。各反応のアリコートを、リン酸セルロース紙上に固定化し、そしてリン酸中で洗浄し、遊離ＡＴＰを除去する。次いでインキュベーション後の基質の活性を測定し、そしてキナーゼ活性の指標が提供される。キナーゼインヒビター候補の存在下および不在下における相対的なキナーゼ活性は、そのようなアッセイを用いることで容易に決定され得る。Downeyら（1996）J Biol Chem.；271（35）：21005-21011にもまた、キナーゼインヒビターの同定に用いられ得るキナーゼ活性についてのアッセイが記載されている。
【００２１】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）レセプター（ＦＧＦＲ）のアンタゴニストとは、代表的にＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦＲ２を阻害する、ＦＧＦレセプターのポリペプチドまたは小分子または他のアンタゴニストをいう。したがって、ＦＧＦレセプターアンタゴニストは、ＦＧＦレセプターファミリーの１つのメンバー、いくつかのメンバー、またはすべてのメンバーのアンタゴニストであり得、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＦＧＦレセプターファミリーのメンバーは、代表的に、３つの免疫グロブリン様ドメインを含み、そして酸性アミノ酸領域（酸性ボックス）を提示し、この領域は、ＦＧＦファミリーメンバーのＦＧＦレセプターへの結合に関与し得る。場合によっては、２つの免疫グロブリン様ドメインのみを含む分子もまた、ＦＧＦレセプターとして機能し得る。多くのＦＧＦＲアンタゴニストが公知であり、ＳＵ５４０２およびＰＤ１７３０７４が挙げられるがこれらに限定されない。ＳＵ５４０２の適切な濃度はμＭの範囲であり、例えば０．１〜２０μＭ、好ましくは０．５〜１０μＭ、特に１〜５μＭの範囲である。発明者らは、ＰＤ１７３０７４がＳＵ５４０２の代わりに用いられ得ること、そしてＰＤ１７３０７４は約１００倍低い濃度で十分に効果的であり、このことはＦＧＦレセプターに対して、より高い親和性を有することと一致することを見出した。したがって、ＰＤ１７３０７４の適切な濃度は、１〜２００ｎＭの範囲、好ましくは５〜１００ｎＭ、特に１０〜５０ｎＭの範囲である。ドミナントネガティブ変異体ＦＧＦレセプターの導入遺伝子発現によってＦＧＦレセプターシグナリングを阻害することもまた公知である。しかし、本発明の実施態様では、遺伝子導入ベースの拮抗ではなく、小分子アンタゴニストの使用が好ましい。
【００２２】
ＦＧＦレセプターのアンタゴニストを同定するための適切なアッセイは、公知である。例えば、ＦＧＦレセプター経由のシグナリングがレポーター遺伝子の発現を活性化する細胞系が、潜在的なアンタゴニストの活性を評価するために用いられ得る。
【００２３】
有利なことに、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストと組み合わせたＭＥＫインヒビターの使用は、ＥＳ細胞の増殖を改善することが見出された。
【００２４】
好ましい実施態様では、約０．１μＭと約２５μＭとの間のＭＥＫインヒビターが用いられる。さらに好ましくは、約０．１μＭと約５μＭとの間のＭＥＫインヒビターが用いられ、より好ましくは、０．２μＭから２μＭまでである。
【００２５】
本発明による特に好ましい培地は、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および／または３μＭのＳＵ５４０２を含む。特に好ましい培地は、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および３μＭのＳＵ５４０２を含み、好ましくはＮ２Ｂ２７培地中である。ＳＵ５４０２の濃度は、異なる多能性細胞系に合うように最適化され得、代表的には１〜５μＭの範囲（例えば、２μＭ）である。
【００２６】
以下の実施例において、発明者らは、自己再生を促進するために、ＭＥＫインヒビターとともに、および特定の実施例ではＦＧＦレセプターのアンタゴニストともともにＧＳＫ３インヒビターの存在下でマウスＥＳ細胞を培養した。他の特定の実施例において、培養物中でマウス多能性細胞の自己再生を促進する方法は、ＧＳＫ３およびＭＥＫを阻害する工程、またはＧＳＫ３、ＭＥＫおよびＦＧＦレセプターを阻害する工程を含む。
【００２７】
必要に応じて、ｇｐ１３０下流シグナリングの活性化は、ＧＳＫ３およびＭＥＫを阻害することによって自己再生の促進をさらに増強するためにもまた用いられ得る。ｇｐ１３０下流シグナリングを活性化する分子は、時に、ｇｐ１３０アクチベーターまたはｇｐ１３０アゴニストとも言われる。１以上のｇｐ１３０下流シグナリング経路の活性化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、例えばＬＩＦレセプターのサイトカインまたは他のアゴニストの使用によって達成され得る。ｇｐ１３０を介して作用し得、したがってｇｐ１３０シグナル伝達を活性化し得るサイトカインとしては、ＬＩＦ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６＋ｓＩＬ−６レセプター、ハイパーＩＬ−６およびＩＬ−１１が挙げられるが、これらに限定されない。適切なサイトカインには、ｇｐ１３０に結合し得および／またはｇｐ１３０を介してシグナリングを活性化し得る模倣物、融合タンパク質またはキメラが含まれる。血清存在下でｇｐ１３０を介して作用するサイトカインの役割は十分に確立されているが、血清不在下で未分化細胞を維持するそれらのサイトカインの能力は限られる。
【００２８】
本発明の利点は、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下では、多能性細胞が限定培地中で増殖し得ることである。ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの組み合わせを用いることによる特別な利点は、この培地がインスリン、Ｎ２Ｂ２７またはｇｐ１３０アゴニスト（例えば、ＬＩＦ）などの他の増殖因子を含有する必要がないことである。したがって、本発明は、血清、血清抽出物、フィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物不含である培地中でのＥＳ細胞の代替のおよび／または改良された培養を可能にする。
【００２９】
マウス（Bradleyら、(1984) Nature 309: 255-56）、アメリカミンク（Mol Reprod Dev (1992) 12月; 33(4): 418-31）、ブタおよびヒツジ（J Reprod Fertil Suppl (1991); 43: 255-60）、ハムスター（Dev Biol (1988) 5月; 127(1): 224-7）およびウシ（Roux Arch Dev Biol (1992); 201: 134-141）を含む多くの哺乳動物供給源から、目的の胚性幹細胞が報告されている。しかしながら、場合によっては、完全な特徴付けがなく、複能性（multipotent）または多能性（pluripotent）細胞が、「ＥＳ細胞」または「ＥＳ様細胞」と称されていることに留意される。ＥＳ細胞の状態は、時に、細胞形態（培養物中でのいくらかの自発的な分化、嚢胞性胚葉体の形成または多能性発生期に関わる遺伝子の発現の観察）に基づいて付与されている。しかしながら、目的のＥＳ細胞のより厳格な特徴付けが、細胞が確かにＥＳ細胞であるかどうかを立証するために望ましい。これはUS6,271,436で確証されており、この文献は、ＥＳ細胞（例えば、ブタＥＳ細胞）を誘導するためのこれまでの多くの試みが、報告された細胞が多能性ＥＳ細胞であると決定的に証明できなかったことを示している。
【００３０】
ＥＳ細胞の特徴的性質としては、多能性発生期に関わる複数の遺伝子の発現、供給源動物に存在するありとあらゆる組織タイプを代表する細胞に分化する能力、キメラに寄与する能力および特にキメラの生殖系列に寄与する能力が挙げられる。例えば、真性ＥＳ細胞は、多能性関連遺伝子Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのすべてではないとしても多くを発現することが期待される。特に、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２の発現は、細胞がＥＳ細胞である決定的な最初の指標を提供すると広く考えられている。キメラにおける生殖系列遺伝および３つの一次胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてから分化した細胞を含む奇形腫または奇形癌を生じる能力もまた、細胞がＥＳ細胞であることの決定的な指標として広く考えられている。
【００３１】
本明細書の特定の実施例は、マウスおよびヒトのＥＳ細胞を用い、そして一次派生物由来のラット細胞もまた用いる。本発明の方法および組成物が、霊長類（特にヒト）、齧歯類（特にマウスおよびラット）、ウシ、ヒツジ、およびブタの多能性幹細胞、特にＥＳ細胞を含む他の哺乳動物または鳥類の多能性細胞培養物の培養への適応に適していることが理解される。他の実施態様では、本発明の方法および組成物は、ウシ、ヒツジおよびブタ胚の一次派生物由来の多能性細胞を培養するために用いられ得る。
【００３２】
本発明の方法および組成物は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち１つ以上、好ましくは任意の２つ以上を発現する多能性細胞（ＥＳ細胞を含む）を培養するのに特に適している。好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する。代表的に、多能性細胞は培養物中で形態的に未分化であり、培養物中で長期間（代表的に少なくとも１０、２０または５０継代を上回る）にわたって、著しい分化または生存力の低下または多能性細胞特性の損失なく維持され得る。本発明の培地中でまたは本発明の方法を用いて単離または培養された多能性細胞は、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得ることが予想される。例えば、細胞は、培養物中で４、６、８、１０、１２週またはそれ以上にわたって維持され得、そしてなお、それらの本来の特性（本明細書に記載の多能性細胞に特異的な特性を含む）を実質的に保持する。例証として、本明細書に記載の手順を用いて単離されたラット多能性細胞は、増殖速度の低下も著しい分化もなく、６ヶ月間にわたって連続培養に供された。
【００３３】
そのような特性としては、キメラに寄与する能力（キメラの生殖系列に寄与することを含む）が挙げられる。例えば、マウスＥＳ細胞は、例えばマウス胚盤胞に注入された場合に、キメラに寄与し得る。同様に、ラット多能性細胞およびＥＳ細胞（本明細書で初めて提供された）は、キメラの全細胞がラット細胞であるキメラに寄与し得る。他の哺乳動物（例えば、本明細書に記載のような）由来のＥＳ細胞も、同様にキメラに寄与し得る。ＥＳ細胞はまた、例えば免疫不全マウスへのＥＳ細胞の注入後、奇形腫または奇形癌を形成し得る。代表的に、奇形腫または奇形癌は、３つの胚葉のすべてから分化した細胞を含むが、場合によっては１つまたは２つの胚葉のみから分化した細胞が観察され得る。
【００３４】
本発明の第２の局面は、自己再生を促進するための多能性細胞、特にＥＳ細胞の培養方法を提供し、該方法は：
（１）ＧＳＫ３のインヒビター；
（２）ＭＥＫのインヒビター；および、必要に応じて、
（３）ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト、
を含む培地中で該細胞を維持する工程を含む。
【００３５】
本発明の方法は、一般的に、血清不含および血清抽出物不含である培地中で、血清または血清抽出物の存在下で予め継代された多能性細胞を増殖（ＥＳ細胞の増殖を含む）させるために用いられ得る。好ましくは、このような方法はまた、フィーダー細胞および／またはフィーダー細胞抽出物の不在下で行われる。例えば、以下の工程を含むＥＳ細胞の培養が行われ得る：
必要に応じてフィーダー上で、培養物中でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程；
少なくとも１回該ＥＳ細胞を継代する工程；
該培地から血清または血清抽出物を除去しそして（存在する場合）該フィーダーを除去して、該培地がフィーダー、血清および血清抽出物不含であるようにする工程；および
続いて、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下でＥＳ細胞を多能性状態に維持する工程。
【００３６】
本発明は、ＥＳ細胞のトランスフェクトされた集団を得る方法もまた提供し、該方法は：
選択マーカーをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程；
該ＥＳ細胞をプレートする工程；
ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下で該ＥＳ細胞を培養する工程；および
該選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
を含む。
【００３７】
さらに必要に応じて、細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養される。
【００３８】
選択マーカーは、抗生物質耐性をコードし得、例えばEP-A-0695351に記載のような、細胞表面マーカーまたは他の選択マーカーであり得、そして好ましくは、所望の細胞で選択マーカーを優先的に発現するプロモーターに作動可能に連結した選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
さらなる実施態様において、本発明は、多能性（特にＥＳ）細胞の培養方法を提供し、該方法は、培養容器（例えばプレート上の個々のウェル）へ個々の細胞を移す工程、および、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよび必要に応じてＦＧＦＲアンタゴニストの存在下で該細胞を培養する工程を含み、それにより、すべての細胞が単一細胞の子孫である多能性（特にＥＳ）細胞のクローン集団を得る。必要に応じて、細胞はまた、ｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターの存在下で培養され得る。
【００４０】
一旦、ＥＳ細胞の安定で均一な培養物が得られると、培養条件は、外胚葉、中胚葉または内胚葉の細胞運命から選択される１以上の細胞タイプへ細胞の分化を方向づけるように変更され得る。サイトカインおよびシグナリング因子の添加または除去は、高効率での特定の分化細胞集団の誘導を可能にし得る。非神経外胚葉運命へのＥＳ細胞の分化は、ｇｐ１３０を介して作用するサイトカイン、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下でＥＳ細胞を維持すること、ならびに次いで、サイトカインを除去する一方、ＧＳＫ３インヒビターおよびＭＥＫインヒビターを維持すること、および／または分化を方向づけ得るさらなるシグナリング分子を添加することによって達成され得る。あるいは、細胞は、ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で維持され得、次いで、該インヒビターの１つまたは両方を除去すること、および／または分化を方向づけ得るシグナリング分子を添加することによって分化を方向づけ得る。上記の方法はすべて、必要に応じて、プロセスの産物である分化した細胞を得る工程および／または単離する工程を含む。
【００４１】
本発明のさらなる局面は、細胞培養培地を提供する。ある培地は、多能性（特にＥＳ）細胞の自己再生のためであり、該培地は、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫのインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを含む。該培地は、必要に応じてｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターもまた含み得る。本発明の別の培地は、幹細胞培養培地であり、ＧＳＫ３のインヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストを含む。すべての培地は、好ましくはさらに基本培地を含む。さらに、すべての培地は、好ましくはｇｐ１３０のアゴニスト不含であり、したがって、好ましくはＬＩＦ不含である。
【００４２】
本発明は、血清および血清抽出物不含である培地を提供する。１つのこのような培地は：
基本培地；
ＭＥＫインヒビター；
ＧＳＫ３インヒビター；および
鉄トランスポーター；
を含み、ここで、該培地は、必要に応じて、血清および血清抽出物不含である。
【００４３】
培地は、好ましくはＦＧＦＲアンタゴニストもまた含む。培地は、必要に応じてｇｐ１３０下流シグナリング経路のアクチベーターもまた含み得る。
【００４４】
多能性幹細胞（特にラットまたはマウス細胞）に好ましい培地は、血清不含およびｇｐ１３０アゴニスト不含であり得、そしてＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む。培地構成成分の置換は、本明細書に記載のようになされ得る。
【００４５】
基本培地は、細胞のために炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラルの必須供給源を供給する培地である。基本培地は、一般的にタンパク質不含であり、そして細胞の自己再生をそれ自体で支持し得ない。鉄トランスポーターは、鉄の供給源を提供し、または培養培地から鉄を取り込む能力を提供する。適切な鉄トランスポーターとしては、トランスフェリンおよびアポトランスフェリンが挙げられる。培地は、１以上のインスリンまたはインスリン様増殖因子、およびアルブミン（好ましくは組換え体）またはアルブミン代替物をさらに含み、そしてフィーダー細胞およびフィーダー細胞抽出物不含であることが好ましい。培地は、アポトーシスのインヒビターまたは培養物中の多能性細胞の維持を促進する任意の他の構成成分もまた含み得る。例えば、培地は、ＲＯＣＫインヒビター、例えばＹ−２７６３２（Watanabeら、Nature Biotechnology (2007) 25(6): 681-686）を含み得る。
【００４６】
本発明の特定の培地は、付加的な基本培地とともにまたはなしで、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビター、インスリン、アルブミンおよびトランスフェリンを含む。この培地では、ＬＩＦが、必要に応じて含まれ得、そしてｇｐ１３０シグナリングの他のアクチベーターによって置換され得る。しかし、好ましい培地は、ｇｐ１３０レセプター結合サイトカインであるＬＩＦを含み、その適切な濃度は、一般的には１０Ｕ／ｍｌと１０００Ｕ／ｍｌとの間、より好ましくは５０Ｕ／ｍｌと５００Ｕ／ｍｌとの間、さらにより好ましくは１００Ｕ／ｍｌの範囲にある。ＧＳＫ３およびＭＥＫインヒビターは、好ましくは本明細書により詳細に記載の通りである。
【００４７】
本発明は、胚盤胞から多能性細胞を誘導する方法をさらに提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００４８】
必要に応じて、該単離した１または複数の細胞は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターの存在下で培養される。ＦＧＦレセプターのアンタゴニストもまた存在させ得る。
【００４９】
好ましくは、前記方法は、胚盤胞をＬＩＦ中で、より好ましくは２〜４日の期間にわたって培養する工程を含む。単離した１または複数の細胞は、好ましくは無血清培地中で培養される。代表的には、これらの細胞は、凝集塊として再プレートされる。胚盤胞はまた、好ましくは、無血清培地中で、必要に応じてＢＭＰレセプターのアゴニストの不在下で、培養される。
【００５０】
本発明によれば、細胞の培養は、接着培養で行われることがさらに好ましく、これは培養基材上に細胞接着タンパク質を含むことによって促進され得る。本発明によれば、単層培養で多能性細胞を培養することもまた好ましいが、必要に応じて、細胞を懸濁培養でまたはプレ細胞凝集塊として増殖させる；細胞をビーズ上であるいは他の適切な足場（例えば膜または他の３次元構造物）上で増殖させることもできる。
【００５１】
驚くべきことに、本発明の組成物および方法は、ラットからの多能性細胞およびＥＳ細胞の誘導に特に適していることが見出された。いくつかの報告がラット多能性細胞が産生されたことを主張するが（Vassilievaら (2000) Exp Cell Res 258(2):361-373頁; Schultzeら (2006) Methods Mol Biol 329: 45-58頁）、提示された証拠は、全く決定的ではない。Schultzeらは、ラットＥＳ細胞系を誘導および維持するほとんどの試みが失敗し、研究者が研究のこの方針を断念することを余儀なくされたことを認めている。同様に、Vassilievaらは、ラットＥＳ細胞を生じさせるそれまでの試みが、目的のＥＳ細胞が培養物中で短期間維持し得るのみであったために、あるいは実験が反復可能でなかったために、失敗であったことを述べている。さらに、当該分野で記載された細胞系は、多能性ＥＳ細胞ではないことが証明された。目的の名称「ＥＳ細胞」は、培養物中の限定的な分化、胚様体の形成、または多能性関連マーカーの不完全なセット（多くの場合１つの遺伝子のみ）の発現の観察に基づいて付与されている。しかしながら、そのような指標では、ＥＳ細胞の一義的な同定は不可能であり、単に複能性の（多能性ではない）細胞が単離されたことを示すだけであり得る。多能性の多くの重要な指標は実証されておらず、ラットＥＳ細胞が実際に単離されたかどうかについてはかなりな疑問が残る。特に、（ｉ）３つの胚葉のすべてから分化した組織を含む奇形腫または奇形癌を形成する能力、（ｉｉ）キメラの生殖系列のコロニーを形成する能力、または（ｉｉｉ）複数の多能性関連遺伝子の連動された発現、特にＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２の連動された発現が実証されたものは、報告されたラット細胞系にない。
【００５２】
以下に詳述した比較例では、目的のラットＥＳ細胞を得る報告の再現は失敗に終わった。
【００５３】
しかしながら、本発明の方法はラット多能性細胞およびＥＳ細胞の誘導に適していることが示され、これらの細胞は、解離されたラット胚盤胞の内部細胞塊の一次派生物から単離した。したがって、本発明は、胚盤胞から多能性ラット細胞を誘導する方法を提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊の一次派生物を単離および解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊の一次派生物から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００５４】
代表的に、ラット胚盤胞を、２から４日間（例えば、３日間）にわたって培養する。胚盤胞はまた、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養し得る。単離されたラット多能性細胞は、代表的に、本明細書に記載の多能性細胞およびＥＳ細胞の性質を有する。
【００５５】
いくつかの実施態様では、本方法は、栄養外胚葉の除去によって胚盤胞から内部細胞塊を単離するように、ならびにＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で内部細胞塊を培養するように、改変される。
【００５６】
本明細書に記載の方法は、他の動物からの多能性細胞の誘導にもまた適している。例えば、本明細書に記載の工程は、ウシおよびヒツジ胚盤胞で行われ、したがって、ウシまたはヒツジ一次派生物からの多能性細胞の誘導が可能である。本明細書に記載の方法は、ヒト胚盤胞からヒト多能性細胞を誘導するためにもまた用いられる。本方法は、ブタ胚盤胞で、ブタ一次派生物から多能性細胞を誘導するためにもまた行われ得る。
【００５７】
本明細書に記載の方法は、非許容的なマウス系統から多能性細胞を誘導するためにもまた用いられる。したがって、本発明は、これまでＥＳ細胞の誘導に対して非許容的であると考えられてきたマウス系統由来のマウス多能性細胞もまた提供する。
【００５８】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法によって得られるラット多能性細胞を提供する。本発明はまた、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する多能性ラット細胞もまた提供する。好ましくは、多能性ラット細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する。多能性ラット細胞は、アルカリフォスファターゼもまた発現し得、そして本明細書に記載の多能性細胞およびＥＳ細胞のいずれかの特性、例えば、キメラの生殖系列のコロニーを形成する能力、および内胚葉、中胚葉および外胚葉から誘導された分化した組織を含む奇形腫または奇形癌を形成する能力を有し得る。
【００５９】
したがって、本発明は、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ（Ｄｐｐａ３）、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する多能性ラット細胞を提供する。本発明の多能性ラット細胞は、多能性状態の１つ以上のさらなるマーカーそしてまたは内部細胞塊に関わるマーカー（例えば、Ｅｒｒβ、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｂｘ３およびＧｂｘ２が挙げられる）もまた発現し得る。多能性ラット細胞は、ＦＧＦ５を発現しない。さらに、本発明のラット多能性細胞は、胚盤葉上層（epiblast）および初期胚葉に関わる遺伝子（例えば、Ｏｔｘ２、Ｅｏｍｅｓ、Ｆｏｘａ２、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７およびＣｅｒ１）を発現しないかまたは有意レベルで発現しない。本発明のラット多能性細胞の分析では、胚盤葉下層（hypoblast）および胚体内胚葉（definitive endoderm）マーカーＧａｔａ６およびＳｏｘ１７、中胚葉マーカーｂｒａｃｈｙｕｒｙおよびＦｌｋ１、および神経外胚葉（neurectoderm）マーカーＰａｘ６およびｎｅｓｔｉｎの発現を検出できなかった。これらの特性、および本発明のラット多能性細胞の他の特性は、本発明の他の哺乳動物多能性細胞によってもまた示される。
【００６０】
したがって、本発明の多能性細胞は、近年の着床後卵筒期の胚盤葉上層から誘導された幹細胞（ＥｐｉＳＣという）と見分けられ得る（Tesar P.J.ら Nature (2007) 448: 196-9; Brons I.G.M.ら Nature (2007) 448: 191-5）。この幹細胞は、着床前胚に再統合してキメラに寄与する能力をほとんどまたは全く示さない。本発明の多能性細胞と対照的に、ＥｐｉＳＣは、本発明の多能性細胞が分化するように誘導される条件下で、単一細胞への解離後容易に増殖できず、ＥＳ細胞または初期胚盤葉上層のマーカーを発現せず、そしてＦＧＦ２＋アクチビン中での維持を必要とする。
【００６１】
本発明の多能性細胞（ラット、ヒツジ、ウシおよびブタ多能性細胞を含む）は、培養物中で形態的に未分化である。本発明の多能性細胞は、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る。好ましくは、多能性細胞は、培養物中で４、６、８、１０または１２週間以上にわたって、より好ましくは、約３、６、９または１２ヶ月以上にわたって、維持され得る。培養物中に維持された後、多能性細胞の子孫は、原多能性細胞の特性のうち１つ以上、好ましくはすべてを保持する。
【００６２】
本発明の多能性細胞は、キメラに寄与し得る。特に、それらは、キメラの全細胞が多能性細胞と同種の細胞であるキメラに寄与し得る。例えば、多能性ラット細胞がキメラの産生に用いられた場合、キメラの細胞のすべてがラット細胞である。本発明の多能性細胞は、好ましくはキメラの生殖系列に寄与し得る。
【００６３】
本発明の多能性細胞は、３つの胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る。
【００６４】
本発明の多能性細胞が正常核型を有する、すなわち、多能性細胞の核型が、同種および／または同系列由来の細胞の正常核型に対応することもまた、好ましい。
【００６５】
代表的に、本発明の多能性細胞（ラット、ヒツジ、ウシおよびブタ多能性細胞を含む）は、以下の特性のうち１つ以上、好ましくは２つ、３つ、４つまたは５つ、そして最も好ましくはすべてを示す：
ａ）キメラを形成する能力；
ｂ）培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖する能力；
ｃ）Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２の発現；
ｄ）それらが、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない；
ｅ）それらが、アクチビンレセプター遮断によって分化が誘導されないかまたは死滅する；および
ｆ）該多能性細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される。
【００６６】
どんな特定の理論によっても束縛されることも望まないが、ＭＥＫ阻害が多能性表現型の維持に特に重要であると考えられる。したがって、本発明は、ＭＥＫインヒビターの存在下で維持される多能性幹細胞およびその集団もまた提供する。好ましくは、多能性細胞および集団は、ＭＥＫインヒビターおよび多能性状態を維持するために適切な１つ以上のさらなる因子（例えば、ＧＳＫ３インヒビター、ＦＧＦレセプターのアンタゴニストおよびｇｐ１３０を介して作用するサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない）の存在下で維持される。
【００６７】
本発明は、本明細書に記載の多能性ラット細胞の集団もまた提供する。本発明の特定の方法によって得られ、したがって本発明によって提供されるラット多能性細胞の集団は、均質性が高いことが見出され、上述の特性に従って評価された多能性細胞を、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％含有する。本発明の特定の実施態様では、９８％以上の純度のラット多能性細胞培養物が得られた。例えば、本発明は、細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する多能性ラット細胞の集団を提供する。好ましくは、細胞の少なくとも９５％が、Ｎａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する。
【００６８】
他の局面では、本発明は、多能性ラット細胞とＭＥＫインヒビターを含む培養培地とを含む、多能性ラット細胞の培養物を提供する。好ましくは、培地は、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む。必要に応じて、培地は、多能性細胞の増殖を支持するために適切な１つ以上のさらなる構成成分（例えば本明細書に記載の構成成分の１つ以上）を含有する。
【００６９】
本発明は、本発明の方法によって得られる、本明細書に記載の他の動物から誘導された多能性細胞、例えばウシ、ヒツジおよびブタ多能性細胞もまた提供する。本発明によれば、そのような多能性細胞は、本明細書に記載の多能性細胞およびＥＳ細胞の特性のうち１つ以上を有する。
【００７０】
したがって、本発明は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する、多能性マウス細胞以外の多能性哺乳動物細胞を提供する。好ましくは、多能性細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する。より好ましくは、多能性細胞は、アルカリフォスファターゼをさらに発現する。好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する。代表的に、多能性細胞はＦＧＦ５を発現しない。本発明の多能性細胞は、多能性状態の１つ以上のさらなるマーカーそしてまたは内部細胞塊に関わるマーカー（例えば、Ｅｒｒβ、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｂｘ３およびＧｂｘ２が挙げられる）もまた発現し得る。さらに、本発明の多能性細胞は、胚盤葉上層および初期胚葉に関わる遺伝子（例えば、Ｏｔｘ２、Ｅｏｍｅｓ、Ｆｏｘａ２、ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７およびＣｅｒ１）を発現しないかまたは有意レベルで発現しない。
【００７１】
本発明は、本明細書に記載の多能性細胞の集団（ウシ、ヒツジおよびブタ多能性細胞の集団を含む）もまた提供する。本発明の特定の方法によって得られ、したがって本発明によって提供される多能性細胞の集団は、好ましくは、上述の特性に従って評価された多能性細胞を少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％含有する。いくつかの特定の実施態様では、本発明は、９８％以上の多能性細胞を含有する集団を提供する。例えば、本発明は、細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する多能性細胞の集団を提供する。好ましくは、細胞の少なくとも９５％が、Ｎａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する。
【００７２】
本明細書に記載の培地（特に、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地）で培養されたＥＳ細胞の集団が、例えば、ＮａｎｏｇまたはＯｃｔ４などの多能性関連マーカーについて免疫染色することによって分析される場合に、従来の培地中で維持されたＥＳ細胞よりも著しく高い均質性を示すことが見出された。本明細書に記載の培地を用いた多能性の維持は、多能性細胞の均質性の高い集団が、著しい細胞分化がなく、そして多能性細胞の正選択および分化した細胞タイプの逆選択を定期的に行う必要なく、培養物中で長期間にわたって維持され得るという点で、格別な利点を提供する。
【００７３】
他の局面では、本発明は、多能性細胞とＭＥＫインヒビターを含む培養培地とを含む、多能性細胞の培養物を提供する。好ましくは、培地は、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む。必要に応じて、培地は、多能性細胞の増殖を支持するために適切な１つ以上のさらなる構成成分（例えば本明細書に記載の構成成分の１つ以上）を含有する。
【００７４】
本発明の実施例で用いられる培養培地は、好ましくは血清アルブミンもまた含む。これは精製型または好ましくは組換型で用いることができ、そして組換型であれば、これは、潜在的な夾雑因子であるサイトカインなどが存在しないという利点がある。培養培地は血清アルブミンを含有する必要がなく、そしてこの構成成分は省くことができ、あるいは他のバルクタンパク質に、またはWilesらによって記載された合成ポリマー（ポリビニルアルコール）に、置き換えることができる。
【００７５】
本発明の特に好ましい培地は、完全限定の培地である。この培地は、非限定の構成成分（いわゆる、その内容が不明である、あるいは非限定の因子または非特定の変動因子を含有し得る、構成成分）を含有しない。完全限定培地を用いることの利点は、多能性細胞の培養およびその後の操作について、効率的および一貫したプロトコールが得られることである。さらに、多能性状態の細胞の維持が高効率および高い予測性で達成でき、そして限定培地を用いて培養された細胞で分化が誘導される場合に、非限定培地が用いられた場合と比べて、分化シグナルに対する応答がより均質であることが見出される。
【００７６】
本発明の方法は、分化細胞を得る方法もまた包含し、この方法は、記載のような多能性細胞を培養する工程、および細胞の分化を許容するまたは生じさせる工程を含み、ここで、該細胞は、他の細胞タイプ（多能性幹細胞を含む）と比較して所望の分化細胞の差次的発現を可能にする選択マーカーを含有し、それによって、選択マーカーの差次的発現が、所望の分化細胞の優先的な単離および／または生存および／または分割をもたらす。選択マーカーは、所望の分化細胞で発現し得るが、他の細胞タイプでは発現し得ず、または発現レベルが所望の分化細胞と他の細胞タイプとで異なり得、それによって、選択マーカーの発現を選択できる。分化細胞は、組織幹細胞または前駆細胞（複能性のまたは単分化能性の幹細胞または前駆細胞を含む）であり得、そして最終分化細胞であり得る。本発明は、前記方法によって得られる分化細胞およびそのような分化細胞の集団もまた提供する。
【００７７】
本発明によって得られる分化細胞の例としては、生殖幹細胞、体性幹／前駆細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞および神経幹細胞が挙げられる。１つの実施態様では、分化細胞は神経細胞である。他の分化細胞タイプおよび分化細胞の集団が、この方法によって得られることは明らかである。
【００７８】
一般的にまた、本発明は、本明細書に記載された発明の方法のいずれかに従うことにより得られた細胞にまで及ぶ。本発明の細胞は、創薬のためのアッセイに用いられ得る。本発明の細胞は、細胞治療にもまた用いられ得、したがって、本発明の方法は、ＭＥＫの阻害およびＧＳＫ３の阻害および必要に応じてＦＧＦシグナリングの拮抗の組み合わせを用いて、多能性細胞を誘導および／または維持する工程、そこから細胞治療のための細胞を誘導する工程、およびそれらの細胞を細胞治療に用いる工程を含む。必要に応じて、その組み合わせは、ｇｐ１３０下流シグナリングのアクチベーターの不在下で用いられる。
【００７９】
本発明は、ラット、ヒツジ、ウシおよびブタ多能性細胞、およびＥＳ細胞の誘導に対して非許容的であると考えられているマウス系統由来の多能性細胞を誘導する、さらなる方法をさらに提供する。
【００８０】
したがって、本発明は、胚盤胞から多能性ラット細胞を誘導する方法を提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊の一次派生物を単離および解離する工程；
（４）該内部細胞塊の解離した一次派生物から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００８１】
関連する局面では、本発明は、胚盤胞から多能性哺乳動物細胞を誘導する方法を提供し、該方法は：
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む。
【００８２】
必要に応じて、方法は、ＬＩＦ中で胚盤胞を培養する工程を含む。好ましい実施態様では、胚盤胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する。
【００８３】
特定の実施態様では、胚盤胞は、ラット胚盤胞、ウシ胚盤胞、ヒツジ胚盤胞、ブタ胚盤胞、またはＥＳ細胞の誘導に対して非許容的なマウス系列由来のマウス胚盤胞である。
【００８４】
いくつかの実施態様では、工程（４）の１または複数の細胞は、内部細胞塊の解離した一次派生物から単離される。
【００８５】
本発明によって提供される多能性細胞を誘導する方法は、好ましくはＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち１つ以上を発現し、より好ましくはＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち任意の２つ以上を発現する多能性細胞を提供する。好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現し、そして好ましくは、多能性細胞は、アルカリフォスファターゼをさらに発現する。特に好ましい実施態様では、多能性細胞は、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する。多能性細胞がＦＧＦ５を発現しないこともまた好ましい。
【００８６】
本発明の方法は、培養物中で形態的に未分化である多能性細胞の提供を可能にする。代表的に、多能性細胞は、本明細書に記載したように、培養物中で長期間にわたって維持され得る。例えば、多能性細胞は、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る。好ましくは、多能性細胞は、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る。代表的に、多能性哺乳動物細胞の子孫は、培養物中で維持された後、原多能性哺乳動物細胞の特性を保持する。
【００８７】
本発明の方法は、キメラに寄与し得る多能性細胞を提供する。特に、それらは、キメラの全細胞が多能性哺乳動物細胞と同種の細胞であるキメラに寄与し得る。好ましくは、多能性細胞は、キメラの生殖系列に寄与し得る。
【００８８】
本発明の方法によって産生された多能性細胞は、さらに、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る。多能性細胞は、培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖せず、そしてアクチビンレセプター遮断によって分化が誘導されない。多能性哺乳動物細胞の増殖および／または繁殖は、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される。
【００８９】
本発明のさらなる局面では、本発明の方法によって得られるラット多能性細胞、ヒツジ多能性細胞、ウシ多能性細胞、ブタ多能性細胞および非許容的なマウス系列由来のマウス多能性細胞が提供される。本発明は、本発明の方法によって得られる多能性細胞の集団もまた提供する。
【００９０】
本発明のすべての局面の好ましい実施態様では、１または複数の多能性細胞は、ＥＳ細胞である。
【００９１】
本発明のさらなる局面は、遺伝子操作ラットを得る方法を提供し、該方法は、ラット多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞をラット胚に導入して遺伝子改変ラットを産生する工程を含む。
【００９２】
本発明のなおさらなる局面は、マウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物を得る方法を提供し、該方法は、哺乳動物多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞を非ヒト哺乳動物胚に導入して遺伝子改変哺乳動物を産生する工程を含む。
【００９３】
遺伝子操作哺乳動物は、例えば、任意の非ヒト哺乳動物であり得、ラット、ウシ、ヒツジまたはブタを含む。好ましい実施態様では、遺伝子操作哺乳動物は、目的の遺伝子についてのホモ接合性ヌルである。他の実施態様では、遺伝子改変は、ラットまたは非ヒト哺乳動物中の遺伝子を対応するヒト遺伝子と置き換えることを含む。さらなる実施態様では、遺伝子改変は、１以上の目的の遺伝子をノックアウトすること、または目的の遺伝子の標的挿入を含む。そのような遺伝子操作は、当業者が容易に利用可能な技術を用いて行われ得る。
【００９４】
本発明は、本発明の方法によって得られる、遺伝子操作ラットおよびマウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物もまた提供する。そのような遺伝子操作哺乳動物は、いくつかの適用、例えば、１以上の目的の遺伝子の生理学的な役割の評価において用いられ得る。本発明の遺伝子操作ラットまたは遺伝子操作非ヒト哺乳動物の他の用途は、創薬および／または試験におけるものである。いくつかの実施態様では、これは、例えば潜在医薬品の潜在副作用を評価するための、毒性の研究を含み得る。さらなる実施態様では、本発明の遺伝子操作ラットまたは遺伝子操作非ヒト哺乳動物は、ヒトまたは動物疾患のモデルとして用いられる。
【００９５】
本発明の遺伝子改変ラットの使用は、ラットが生体医学研究の多くの領域で好ましいモデル生物であるため、格別な利点であり得る。例えば、行動回復および認知修復の評価は、マウスよりもラットにおいて非常に精巧である。
【００９６】
本発明の多くの利点は、上記の通りでありまたは明らかである。比較的無毒性および細胞透過性である細胞培養構成成分が同定され得る。本発明の特定の実施態様において用いられるＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦＲアンタゴニストは、特に、例えばタンパク質サイトカインの精製と比較して、容易に精製され得る。組換えタンパク質は、作製が高価であり得、そして小分子の培地構成成分は、より安価に生産されかつ貯蔵がより安定であり得、より広い有効濃度範囲を伴い得る。さらに、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦＲアンタゴニストの使用は、以前は得られなかった哺乳動物多能性細胞タイプの誘導および維持を可能にする。
【００９７】
以下に記載の特定の実施態様は、無血清の完全限定培地でＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ１８４３５２およびＳＵ５４０２の組み合わせを用い、そしてマウスＥＳ細胞の自己再生の改善を示し、ほとんど分化を示さなかった。ＢＭＰの存在下でＥＳ細胞を培養する場合、いくつかの神経発生があることが時々報告される。これは、本発明の実施例においては見られなかった。
【００９８】
本発明を、ここで、特定の実施例においてさらに説明し、図によって示す。
【００９９】
実施例において、用語２ｉ培地または２ｉは、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地を示すために用いられる。用語３ｉ培地または３ｉは、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストを含む培地を示すために用いられる。
【実施例】
【０１００】
実施例１
マウスＥＳ細胞を、ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ１８４３５２およびＳＵ５４０２を含む培地で増殖させ、該培地は以下のように調製した：
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
培地
ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地の調製
１００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco 42400-010）に対して、１ｍｌのＮ２ １００×ストック溶液を添加する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＮ２の各構成成分の最終濃度は：
インスリン ２５μｇ／ｍｌ
プトレシン １６μｇ／ｍｌ
トランスフェリン １００μｇ／ｍｌ
亜セレン酸ナトリウム ３０ｎＭ
プロゲステロン ６ｎｇ／ｍｌ
ＢＳＡ ５０μｇ／ｍｌ
である。
【０１０３】
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７の調製：
１００ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Gibco 21103-049）に対して、２ｍｌのＢ２７（Gibco 17504-044）および１〜２Ｍ Ｌ−グルタミン（ＴＣ保存 １：１００）を添加する。
【０１０４】
Ｎ２Ｂ２７培地の調製：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２−Ｎ２培地をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地と１：１の比で混合する。この培地を、すべての化合物の希釈および細胞の増殖に用いた。
【０１０５】
この培地は、１２９系統マウスからのＥＳ細胞の誘導および維持に用い、そして非許容的なマウス系統であるＣＢＡ、および部分的に許容する系統であるＣ５７ＢＬ／６からのＥＳ細胞の誘導にもまた用いた。この培地を、ラット胚の一次派生物中の細胞の維持に用い、多能性ラット細胞が培養物中でこの培地によって維持されることを示した。
【０１０６】
したがって、ＥＳ細胞は、ＧＳＫ３インヒビター、ＭＥＫインヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの組み合わせによって維持され、そして本発明は、そのための培養方法および培地もまた提供する。
【０１０７】
実施例２
４．５ｄｐｃのラット胚（Ｅ４．５）を収集し、透明帯を酸のタイロード中で除去し、そして栄養外胚葉を除去するために免疫手術を行った。内部細胞塊を、以下の培地（３Ｉ培地）中で、ガンマ線を照射されたＤＩＡ−Ｍ細胞（Buehrら、2003に記載）のフィーダー層上に４ウエルプレート中で培養した：
３μＭ Ｃｈｉｒｏｎ ９９０２１ （ＧＳＫインヒビター）
０．８μＭ ＰＤ１８４３５２ （ＭＥＫインヒビター）
２μＭ ＳＵ５４０２ （ＦＧＦレセプターのアンタゴニスト）
Ｎ２Ｂ２７中。
【０１０８】
必要に応じて、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加しても良い。
【０１０９】
望ましい場合は、フィーダー細胞として、ＤＩＡ−Ｍ細胞よりもむしろマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の初代培養物を用い得る。
【０１１０】
これらの培養物を、３日間維持した。その期間後、小さな派生物を手動で脱凝集させ、そして小さな細胞塊を、同じ培地中の新しいＤＩＡ−Ｍフィーダー上に移動させた。
【０１１１】
これらの培養物を、２週間維持した。培地を２〜３日ごとに交換し、培養物を定期的に検査した。小さくて透明なコロニーが現れた場合、これらを同様の条件でさらに移し、十分に大きい場合は脱凝集させた。
【０１１２】
培養２週間後、いくつかの培養物中に未分化細胞のコロニーが見られた。これらのコロニーのうちのいくつかはフィーダーに付着したが、より多くは、それらは丸くなり、基材から剥離した。培養物を、トリプシンＥＤＴＡまたは手動（細長いピペットの中にコロニーを引き込んで、新しいウエルの中に細胞塊を吐き出すことによって）のいずれかでコロニーを脱凝集することによって継代した。培養物を、常時、ＤＩＡ−Ｍフィーダー上および３Ｉ培地中で維持した。
【０１１３】
このようにして誘導および培養された細胞は、形態的に未分化であり（図４）、そして多能性関連遺伝子Ｎａｎｏｇ（図５および９）およびＯｃｔ４（図６および９）ならびにＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２（図９）およびアルカリフォスファターゼ（図８）を発現する。ラット細胞は、栄養外胚葉マーカーＣｄｘ２もまた発現した（図７および９）。
【０１１４】
参考文献：
Buehr, M., Nichols, J., Stenhouse, F., Mountford, P., Greenhalgh, C.J., Kantachuvesiri, S., Brooker, G., Mullins, J.M., Smith, A.G. (2003). Rapid loss of oct-4 and pluripotency in cultured rodent blastocysts and derivative cell lines. Biol Reprod 68: 222-229.
【０１１５】
実施例３
実施例２に記載のように単離されたラット１４８Ｃ ＥＳ細胞系由来の細胞を、標準的な方法を用いて奇形腫を生じさせるために用いた。要するに、ラットＥＳ細胞を、免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓皮膜下に注入した。図１０は、そのような実験の１つで生じた奇形腫の切片を示す。動物は大きな腫瘍を発生し、これを注入の３３日後に屠殺した。
【０１１６】
成熟した分化組織、特に上皮、横紋筋および腸上皮が、切片において明らかに見られ得る。これらの組織は、それぞれ外胚葉、中胚葉および内胚葉から誘導される。したがって、これらの３つの一次胚葉のそれぞれから誘導される分化細胞が存在し、それはラット１４８Ｃ ＥＳ細胞が多能性であることを示す。
【０１１７】
実施例４
ラット胚盤胞からの多能性幹細胞の誘導
胚性幹（ＥＳ）細胞は、1981年以来近交系マウスから誘導されているが１，２、他の種については証明されていない。他の齧歯動物からのＥＳ細胞の樹立の度重なる失敗に加え、霊長動物胚由来細胞がマウスＥＳ細胞と主要な性質において異なるとの証拠によって３、胚の培養された幹細胞と多能性細胞との関連性が疑われる４−７。ここで、発明者らは、初期胚盤葉上層の多能性状態を分化誘導シグナルから保護するように設計した条件で、ラット胚を培養する。これは、多能性マーカーＯｃｔ４８およびＮａｎｏｇ９を発現する細胞の培養物の再現可能な樹立をもたらす。これらの細胞は形態的に未分化であり、そして安定した長期増殖を示す。これらは、マウスＥＳ細胞と分子特性を共有し、そしてインビトロでの分化を誘導し得、そして免疫無防備状態の成体マウスで複分化した奇形腫を形成する。表現型的にそして機能的に、それらは、近年記載された卵筒由来ＥｐｉＳＣ３，１０とは異なる。最も重要なことに、ラット胚盤胞への注入において、それらはキメラへの大きな寄与を与え得る。発明者らは、ＥＳ細胞の特性を備える多能性細胞がラット胚から単離され得ると結論付ける。発明者らは、非誘導性培養物中に置かれた未感作胚盤葉上層細胞からのＥＳ細胞誘導が、一般的な機能であり得ると示唆する。
【０１１８】
ＥＳ細胞は、合成の組織培養物の状況下で多能性マウス胚盤葉上層細胞から生じる４，６。ＥＳ細胞自体が、この人工環境の産物であるか、または培養中に捕獲される個体発生の特定相を表すのかは不明である１１。実験に基づいた経験から得た知識は、線維芽細胞フィーダーおよび／またはサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を、ウシ胎児血清または増殖因子骨形成タンパク質の選択されたバッチと組み合わせて用いることで、ＥＳ細胞が、特定の近交系マウス系統から再現可能に誘導され得ることである４，１２。しかし、同条件で、すべてのマウス系統からＥＳ細胞を生じるわけでなく、そしてラットからは全く生じていない１３，１４。発明者ら７および他１５，１６はラット胚からの細胞系の誘導を報告したが、該細胞系は、ＥＳ細胞と外見上の形態類似点を有するがＥＳ細胞同一性の主要な転写決定因子（Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ１７）を有意レベルで発現せず、そしてインビトロで、腫瘍またはキメラにおいて、決定的な胚葉分化をし得ない。発明者らの手では、そのような細胞は胚体外栄養外胚葉および胚盤葉下層系統だけを生じ、そして、発明者らは、それらを胚体外幹（ＥｘＳ）細胞と称している７。ラット胚から真性ＥＳ細胞を誘導することの度重なる失敗は、マウス胚の多能性胚盤葉上層とラット胚の多能性胚盤葉上層との間のなんらかの根本的な違いを反映している可能性がある１８。あるいは、この培養物構築が、特定の改変された遺伝的背景が実験マウスの大量の近親交配によって産生されること以外には、多能性の維持に不適切であり得る。
【０１１９】
発明者らは、マウスＥＳ細胞培養において分化誘導刺激を排除するために、３つの小分子インヒビター（３ｉ）の組み合わせを案出した（Yingら、提出中）。３ｉは、樹立細胞系で、およびマウス胚からのデノボ誘導の間の両方で、多能性の効率的な維持を可能にする。この法則がマウスに限られるのか、またはより広く適用し得るのかを決定するために、発明者らはラット胚細胞における３ｉの効果を調べた。転写決定因子Ｏｃｔ４の発現の保持を、一次派生物中の未分化細胞の存在に代わる代替アッセイとして用い得る７。Ｏｃｔ４は、血清含有培地中６，７または無血清培地中で培養されたＩＣＭ中で急速に消滅する。内部細胞塊（ＩＣＭ）を、免疫手術によってＥ４．５ラット胚盤胞から単離し、そして付着を容易にするために、およびまた白血病抑制因子（ＬＩＦ）の供給源として、フィーダー上にプレートした７。３または４日後、培養物を固定し、免疫染色によって分析した（図１１ａ−ｃ）。上記のＯｃｔ４の損失と同時に、発明者らは、Ｃｄｘ２（栄養外胚葉決定因子）およびＯｃｔ４のアンタゴニストのアップレギュレーションを観察した１９。これらの変化は、フィーダーまたは可溶性のＬＩＦによって、またはインヒビターなしの無血清培地中の培養によって妨げられなかった。対照的に、３ｉの存在下では、発明者らは、Ｏｃｔ４タンパク質が派生物中の細胞の多くで維持され、そしてＣｄｘ２の発現が抑制されることを見出した。さらに、培養ＩＣＭ中でＯｃｔ４と同様にダウンレギュレートされる多能性状態の第２の決定マーカー（Ｎａｎｏｇ９）は、３ｉが補充された無血清培地で維持された。発明者らは、３ｉ培地で３日間培養したＩＣＭを小塊に解離し、そしてそれらを同じ条件で再プレートした。４日後、細胞はなお生存中であり、そして繁殖し、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現し続ける形態的に未分化の細胞コロニーを形成しているように見えた（図１ｄ）。
【０１２０】
３ｉが初代培養物中において方向付けられていない状態を持続させるというこれらの兆候から続けて、発明者らはより長期の効果を調べた。２つの異なる系統（ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ３４４）のラット胚由来の合計３５個のＩＣＭを、３ｉ中のフィーダー上にプレートした。３日後、１１個のＩＣＭが付着し繁殖し、よって、それらを機械的に小塊に分割し、そして新しいウエルに再プレートできた。これらの再プレートしたＩＣＭのうち４つから、形態的に未分化の小コロニーが発生した。１０日後、これらのコロニーのそれぞれを新しいウエルに無傷で移した。４日後、すべてのサイズがかなり大きくなった。次いで、これらのコロニーを手動で解離し、再プレートした。さらに、すべての場合に未分化コロニーが発生した。発明者らは、これらの培養物が次いで繰り返し継代され、４つの細胞系（２つはＦｉｓｃｈｅｒ胚由来および２つはＤＡ胚由来）の樹立をもたらすことを見出した。４系統はすべて、形態的および増殖特性において同様であった。それらは、密集した細胞の３次元凝集塊として繁殖している（図１２ａ）。このことは、３ｉで培養されたＥＳ細胞に特有である（Yingら、提出中）。個々の細胞は、ＥＳ細胞に特徴的な高い核対細胞質比率および突出した核小体を有する。それらは無極性であり、突起、細胞構築特性、または特殊化の他の兆候を欠く。細胞が大きくなりすぎるとフィーダー層から剥離する傾向があるため、通常通り、コロニーが中間のサイズに達する３〜４日毎に、細胞を継代した。発明者らは、未分化細胞を３ｉ中でゼラチンコートしたプラスチックの上で維持するのは難しいことを見出した。フィーダーなしでは接着は弱く、細胞は凝集して基材から剥離する傾向があった。しかし、フィブロネクチンでコートした皿上では、付着は改良され、未分化細胞の繁殖に十分であった（図１２ｂ）。これは、フィーダーの主要な貢献が、特定の自己再生シグナルを提供することよりも、細胞接着を支持することであることを示す。コロニーを、ピペッティングによって手動で、またはAccutaseを用いて酵素的に、容易に解離し得る。解離後、マイクロピペットによって単離された単一細胞は、連続して継代し得る未分化コロニーを容易に生じ得る（図１２ｂ）。細胞を、従来の手順によって凍結保存し、そして回収し得る。培養物は６ヶ月間にわたって連続的に増殖しており、増殖速度の低下なく、そして明らかな分化はほとんどまたは全くなかった。
【０１２１】
これらのラット細胞の潜在的同一性を評価するために、発明者らは、多能性および系統方向付けの主要なマーカーの発現を調べた。免疫蛍光によって、細胞はＯｃｔ−４およびＮａｎｏｇの核発現を示す（図１２ｃ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析で、Ｒｅｘ−１、Ｅｒｒβ、Ｓｏｘ２、ＳｔｅｌｌａおよびＯｃｔ４／Ｓｏｘ２標的Ｆｇｆ４とともにこれらの遺伝子の発現を確認した（図１２ｄ）。胚盤葉下層および限定的な内胚葉マーカーＧａｔａ６およびＳｏｘ１７、中胚葉マーカーｂｒａｃｈｙｕｒｙおよびＦｌｋ１、または神経外胚葉マーカーＰａｘ６およびｎｅｓｔｉｎについての転写は、検出されなかった。Ｎａｎｏｇ増幅のためのプライマーを、ラット遺伝子に特異的な配列に対して設計した。これらのプライマーは、ラット細胞由来の予想されるサイズの産物を一貫して生じたが、マウスＥＳ細胞由来のものは生じなかった。反対に、マウスに特異的なプライマーは、いかなるラット細胞由来の産物も生じなかった。細胞のラット同一性は、中期スプレッドの調製によって確認した（図１２ｅ）。４つの系はすべて、ラットに特徴的である中部動原体型（metacentric）染色体および次端部動原体型（acrocentric）染色体を含んだ。これは、末端部動原体型（telocentric）染色体しか有さないマウスとは異なる。
【０１２２】
２回の反復実験では、合計４１個のさらなるＩＣＭを３ｉで培養した。これらのうち、１３個が付着し、細胞塊を形成した。これらを３日後に脱凝集し、その後６ウエル中に一次未分化コロニーが生じた。これらの培養物の６個すべてが、連続的に増殖可能な未分化細胞系を生じた。これらの培養物は、もとの４つの系と形態的に見分けられず、そしてすべてがＯｃｔ４とＮａｎｏｇとの両方を発現する。次いで、発明者らは、１８個の脱凝集したＩＣＭからさらに４つの系を誘導した。発明者らは、誘導手順が再現可能であり、そして堅固であると結論付ける。
【０１２３】
発明者らは、未分化状態の維持に対する培養条件を変更することの効果について調べた。発明者らは、誘導に用いられるＬＩＦ産生ＤＩＡ−Ｍフィーダー７を、明らかな妥協なく、標準的なマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）と置き換え得ることを見出した。ＬＩＦは培養培地に含まれず、これはマウスＥＳ細胞のために３ｉが十分であることと一致する。３ｉから血清およびＬＩＦまたはＢＭＰおよびＬＩＦが補充された培地に移されたラット細胞は、種々の形態に分化し、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を喪失した（図１３ａ）。これらの観察は、３ｉラット細胞のｇｐ１３０／Ｓｔａｔ３シグナリングへの応答が、マウスＥＳ細胞２０，２１と比較して減少していたことを示す。これは、これまでのラットＥＳ細胞誘導の失敗への大きな寄与因子であり得る。
【０１２４】
インヒビターなしで培養された細胞は、種々の形態へと分化した（図１３ｂ）。ＦｇｆｒインヒビターおよびＭｅｋアクチベーションのインヒビター（２ｉ）中での培養は、マウスＥＳ細胞でも見られるように、ＧＳＫ３インヒビターなしでも未分化集団の維持に十分であった。これらの所見は、ＦＧＦ／Ｅｒｋシグナリングの遮断が未感作な多能性状態を持続させる決定的な要件であるという仮説（Yingら、提出中）と一致する。
【０１２５】
未分化雌ＥＳ細胞および未感作胚盤葉上層の特徴は、Ｘ染色体が両方とも活性であること、および分化に際して１つが不活性化することである２２−２４。発明者らは、ＸＸ３ｉラット細胞を、トリメチル化されたヒストン３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７）（中間期核の不活性Ｘ染色体を識別するエピジェネティックなサイレンシングマーク）２５に対する抗体で染色した。３ｉ中で維持された細胞は、拡散した免疫反応性のみを示し、これに対して６日間にわたって血清に曝露した後に分化した細胞は、不活性Ｘに特徴的な突出した核小体を示した（図１３ｃ）。これらのデータは、未分化ＸＸ３ｉラット細胞で２つのＸ染色体が活性であること、および１つのＸ染色体が分化の間に不活性化することを示す。したがって、３ｉラット細胞は、初期胚盤葉上層およびＥＳ細胞の適切なエピジェネティックな状態を示す。
【０１２６】
３ｉなしの無血清培地中で懸濁培養すると、細胞は死滅した。しかし、血清またはＭａｔｒｉｇｅｌを添加すると、細胞は、胚様体のような構造に凝集した（図１３ｄ）。これらの構造のＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇのダウンレギュレーション、ならびに内胚葉および中胚葉マーカーの出現を明らかにした（図１３ｅ）。３ｉラット細胞の分化能力をさらに特徴付けるために、発明者らは、ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ由来の系両方の細胞を、１１匹の免疫無防備状態のＳＣＩＤマウスの腎臓皮膜下に注入した。３０〜５５日後に、動物を屠殺した。７匹が、注入した部位に、１グラム未満から４グラム以上までの種々のサイズの肉眼で見える組織塊を示した。増殖は、試験した両方の系から得られた。各系由来の２つの試料の組織学的分析は奇形腫の古典的な特徴を明らかにし、これは、横紋筋、骨、軟骨、角化上皮、分泌腸上皮、および他の多くを含む複数の分化細胞タイプおよび構造を備えていた（図１４ａ）。発明者らは、３ｉラット細胞系が奇形腫を産生することができ、そして成熟多重系統分化の能力があると結論付ける。
【０１２７】
真性ＥＳ細胞の決定的な特徴は、ホスト胚をコロニー化し、そして分化した子孫をキメラ動物の３つの胚葉のすべてに寄与する、それらの能力である。リポフェクションおよびピューロマイシンによる選択に続いて、発明者らは、組み込まれたプラスミドから構造的に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する細胞のプールを誘導した。これらの細胞を胚盤胞に注入し、発生中の胚への寄与を追跡した。Ｅ１０．５で採取された８個の胚のうちの２個は、ＧＦＰ標識した細胞の広範囲にわたる寄与を示した（図１４ｂ）。凍結切片の検査で、３つの胚葉のすべての組織に取り込まれたことを確認した。
【０１２８】
発明者らはまた、出生後キメラに寄与するそれらの潜在能を決定するために、未改変３ｉラット細胞を胚盤胞に注入した。アグーチＤＡとアルビノＦｉｓｃｈｅｒとの間の遺伝的に決定された毛色の違いは、１つの系統の細胞を他の系統の胚に導入した場合の、キメリズムの好都合な指標を提供する。移された胚から発生した１５匹の仔のうち、２匹の動物が、Ｆｉｓｈｅｒホスト中に導入されたＤＡ細胞の存在の特徴である毛色を示した（図１４ｂ）。これらの動物は、強く着色され、ＤＡ細胞の寄与を示す。アルビノホストの寄与は頭部でのみ見られ、これは、Ｆｉｓｃｈｅｒにおける頭巾斑の対立遺伝子の存在の結果である。このパターンは、頭巾斑のあるアルビノ系統と完全に着色された系統との間のラットキメラの特性である２６。これらの動物のキメラ性質を確認および定量するために、発明者らは、尾生検のマイクロサテライト分析を行った。これは、両方の寄与する遺伝子型由来の細胞が、これらの２匹の動物中にそれぞれ２５：７５および７５：２５（ＤＡ：Ｆｉｓｃｈｅｒ）の割合で存在したことを明らかにした（図１４ｄ）。これらのキメラは、健常で稔性の成体に発達した。しかしながらどちらも雄であり、したがって、導入された細胞からの配偶子（遡及的にＸＸとして特定される）の発生を支持するわけではない。
【０１２９】
近年、マウスおよびラットにおいて、着床後の卵筒期の胚盤葉上層由来の細胞系の誘導が報告されている３，１０。これらのいわゆるＥｐｉＳＣは、インビトロで多重系統分化の潜在能を有するが、真性ＥＳ細胞とは、表現型、分子および発生において種々の違いを示す。最も顕著には、それらは、着床前の胚に再び取り込まれてキメラに寄与する能力をほとんどまたは全く示さない。対照的に、３ｉラット細胞は、キメラに寄与する。それらは、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ（Ｄｐｐａ３）およびアルカリフォスファターゼ（ＥｐｉＳＣ中に存在しないＥＳ細胞および初期胚盤葉上層のマーカー）もまた発現する。さらに、３ｉラット細胞が、単一細胞への解離後容易に増殖し得るのに対し、維持された細胞−細胞接触がＥｐｉＳＣにとって重要であるように見える。発明者らは、３ｉラット細胞が、ＥｐｉＳＣを維持するために必要な特定の増殖条件（ＦＧＦ２＋アクチビン）において維持され得るかどうかを試験した。発明者らは、３ｉをアクチビン＋ＦＧＦ２に置き換えた場合、フィーダー上であるかフィブロネクチンでコートされた皿上であるかにかかわらず、それらがマウスＥＳ細胞のように挙動しそして分化することを見出した。さらに、アクチビンレセプターインヒビターＳＢ４３１４５２（ＥｐｉＳＣ１０の分化を誘導するが、マウスＥＳ細胞では誘導しない）は、未分化３ｉラット細胞の増殖を妨げなかった。３ｉ細胞とＥｐｉＳＣとの決定的な違いは、後者が胚盤胞ではなく着床後の胚から誘導されることである。発明者らはまた、胚盤胞由来のラットＥｘＳ細胞７が３ｉ中で維持され得るかどうかを試験し、それらが生き残らないことを見出した。したがって、３ｉラット細胞は、培養ラット胚から樹立された他の細胞系とは異なる。
【０１３０】
これらの所見は、まとめて、３ｉの使用が、ＥＳ細胞の基本特性：長期間の自己再生；多能性；および発生中の胚への取り込み能力を備えたラット細胞系の誘導を可能にすることを証明する。それらはまた、ＥＳ細胞状態の主要な分子マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＲｅｘ１を発現する。ラットＥＳ細胞の利用性は、生物医学研究の多くの分野での選択種における遺伝子ターゲッティングおよび関連するゲノム工学技術の適用への道を開く。３ｉラット細胞の利用性は、成体組織中で融合および機能し得る細胞を産生するインビトロでの幹細胞分化の能力を試験するためのより高度なインビボモデルを使用する機会をすぐに生み出す。例えば、認知修復の評価は、マウスよりもラットにおいて非常に精巧である。
【０１３１】
中和する３ｉ培養系を用いた培養ラット胚細胞における多能性の効率的な維持は、ＥＳ細胞の誘導が、実に、組織培養による創造物というよりもむしろ常在胚細胞の捕獲を表し得ることを示唆する。したがって、ＥＳ細胞の単離は、広範囲な転写またはエピジェネティックな再プログラミング５，６，２７を伴わなくとも良い。むしろ、ＥＳ細胞は、誘導シグナルが除去される場合の初期胚盤葉上層の繁殖の不履行による、単なる存続を表し得る（Yingら、提出中）。これは、３ｉ法則に基づく培養処方物が、家畜種を含む他の動物からのＥＳ細胞の誘導に十分であり得る可能性を上昇させる。
【０１３２】
方法
ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロサテライト分析、奇形腫発生、および抗体の詳細は、補足情報で提供する。
【０１３３】
免疫手術。透明帯を酸性のタイロードで４．５ｄｐｃラット胚盤胞から除去し、胚盤胞を２０％抗ラット全血清（Sigma）中で３時間、３７℃でインキュベートした。胚盤胞を洗浄し、補体の供給源としてラット血清中で２０分間インキュベートし、そして溶解した栄養外胚葉をピペッティングによって除去した。
【０１３４】
培養手順。フィーダー細胞を、４ウエルプレート中のゼラチン上に１ウエルにつき１．５×１０４細胞の密度でプレートした、ガンマ線を照射されたマウス線維芽細胞７から調製した。単離したＩＣＭおよび継代した細胞系を、ＦｇｆレセプターインヒビターＳＵ５４０２を２μＭ、Ｍｅｋ１／２アクチベーションのインヒビターＰＤ１８４３５２を０．８μＭ、およびＧＳＫ３インヒビターＣＨＩＲ９９０２１を３μＭ含む（３ｉ；Yingら、提出中）Ｎ２Ｂ２７培地２８中のフィーダー上にプレートした。この３ｉ細胞系を、細いピペットにコロニーを吸引し、得られた脱凝集された細胞および小塊を新しいプレートに移すことによって、型通りに継代した。胚様体形成のために、およそ２００の脱凝集された細胞の試料を、１０μｌ懸滴に移した。これらを２日間培養し、細胞凝集体を収集し、さらに５日間培養皿に移した。
【０１３５】
トランスフェクションプロトコール。コロニーをAccutase（Sigma）で解離し、１０％ＦＣＳ含有ＧＭＥＭ中でペレット化し、次いで無血清３ｉ培養培地中で再懸濁し、最終容量が４００μｌになるようにプレートした。０．２５μｇのＳｃａＩで線形化したｐＰｙＣＡＧｇｆｐＩＰプラスミド２９ＤＮＡ、０．２５μｌのＰＬＵＳ試薬および０．６２５μｌのLipofectamine LTX（Invitrogen Corporation）の混合物を添加し、培養物を一晩インキュベートした。この試薬を１８時間後に除去し、そして新しい無血清３ｉ培養培地と取り替えた。安定なトランスフェクタントは、トランスフェクションの４８時間後に０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加えて選択した。ポリクローナル系を、ピューロマイシン中で連続的に維持されるいくつかの耐性のあるコロニーを集めることによって得た。
【０１３６】
キメラ形成。４．５ｄｐｃラット胚を、注入した日の正午までに収集し、そして空洞化を最大にするためにＫＳＯＭ培地中でさらに２〜３時間培養した。細胞系を、Accutase中で脱凝集させ、そして１０〜１２細胞をレシピエント胚の胚盤胞の空洞に注入した。注入された胚を、３．５ｄｐｃ妊娠ラットの子宮に移した。精管切除された雄ラットは入手できないため、発明者らは本研究のために自然交配レシピエントを用いなければならず、それによって移された胚の着床の頻度が減少した。
【０１３７】
ビブラトーム切片作製。蛍光胚を、ＰＢＳ中２０％のゼラチンおよび２０％のアルブミンを１：１で含む混合物中に包理し、次いで、４℃で一晩、４％のパラホルムアルデヒド中に固定した。次いで、このゼラチンブロックを、４℃で一晩、１０％のグルタルアルデヒドを有する「硬化溶液（setting solution）」中に包理した。切片を、ビブラトーム（シリーズ１０００）で１００μｍで切断し、次いで、ＤＡＰＩ核蛍光染色液を含むVectashield（Vector Laboratories）中で、カバーグラスの下に取り付ける前に１０分間、ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０で処理した。２４時間以内に、切片を共焦点顕微鏡法によって検査した。
【０１３８】
マイクロサテライト遺伝子型決定。蛍光タグ化したオリゴを、尾、耳および血液のゲノムＤＮＡから、ラットのマイクロサテライト領域Ｄ１Ｒａｔ１２２（フォワードのオリゴ、６−ＦＡＭ−ＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＡＴＴ、リバースのオリゴ、ＴＣＣＣＴＴＴＧＣＡＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧ）およびＤ３Ｒａｔ１７（フォワードのオリゴ、ＶＩＣ−ＴＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡ、リバースのオリゴ、ＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡ）を増幅するために用いた。ＰＣＲ反応物は、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（MJ Research）で、GoTaq Flexi DNA Polymerase（Promega Corporation、商品番号M8305）を用いて、以下の条件下で増幅した；９５℃で２分間、続いて、９４℃で３０秒、５６℃または６２℃で３０秒、および７２℃で３０秒のサイクルを３５回、最後に７２℃で５分間伸長させる。アニーリング温度は、Ｄ１Ｒａｔ１２２およびＤ３Ｒａｔ１７でそれぞれ５６℃および６２℃であった。ＰＣＲ産物を、滅菌蒸留水で１００倍希釈した。この１μｌをLIZ-500内部サイズ標準（Applied Biosystems、商品番号4322682）を含むHi-Diホルムアミド（Applied Biosystems、商品番号4311320）９μｌ中に希釈した。得られた産物をABIキャピラリー3730ＤＮＡアナライザで検出し、４％のアガロースゲル上で視覚化した。Ｄ１Ｒａｔ１２２対立遺伝子は、ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒラット系統でそれぞれ２３０ｂｐおよび２５５ｂｐである。Ｄ３Ｒａｔ１７対立遺伝子は、ＤＡおよびＦｉｓｃｈｅｒ系統でそれぞれ１４０ｂｐおよび１７８ｂｐである。
【０１３９】
奇形腫形成。約２００〜４００細胞をＳＣＩＤマウス（BALB/c JHan Hsd-Prkdc scid.）の腎臓被膜下に注入した。種々の時点で腫瘍を収集し、その重量を、腫瘍および腎臓の重量を量り、体側の注入していない腎臓の重量を引くことによって決定した。腫瘍をパラフィンワックスに包理し、切片化し、そしてマッソン・トリクロームで染色した。
【０１４０】
抗体。細胞が増殖していたプレートをＰＢＳ中４％ＰＦＡ中に固定し、ＰＢＳＴ（PBS中に０．３％のTriton）で膜透過処理し、そして室温で２時間、ＰＢＳＴ中１％のＢＳＡおよび１０％のヤギ血清中でブロックした。この一次抗体は、抗ｏｃｔ−４Ｃ１０（Santa Cruz Biotechnology、1:200）、抗ｎａｎｏｇ（Abcam、1:200）および抗ｃｄｘ２（Abcam、1:80）であり、それらを４°Ｆで一晩、プレート上で放置した。二次抗体は、Ａｌｅｘａ ４８８ ＩｇＧ２ｂ ヤギ抗マウス（ｏｃｔ−４に対して）、Ａｌｅｘａ ５６８ ヤギ抗ウサギ ＩｇＧ（ｎａｎｏｇに対して）およびＡｌｅｘａ ５６８ ＩｇＧ１ ヤギ抗マウス（ｃｄｘ２に対して）であり（濃度はすべて１：１０００）、それらを室温で２時間、プレート上で放置した。プレートを、ＤＡＰＩで対比染色した。一次抗体を省略すると、蛍光が生じないか（ｎａｎｏｇ、ｃｄｘ２）、またはぼやけたバックグラウンド全体（ｏｃｔ−４）となった。Ｘ染色体免疫染色のために、細胞を顕微鏡用スライド（SuperFrost Plus、VWR international）上にプレートし、次いで約３時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞を、室温で１５分間、４％のパラホルムアルデヒド中に固定し、そして１０分間、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘで膜透過処理した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３に対する抗血清（Thomas Jenuweinから寛大にも戴いた）は、１：５００で用いた。
【０１４１】
ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮＡを、RNeasy Mini Kit（Qiagen、商品番号74104）を用いて約５０コロニーから精製した。その後、ｃＤＮＡを、SuperScript First-Strand Synthesis System（Invitrogen Corporation、商品番号11904-018）を用いてOligo-dTプライミングによって生成した。代表的に、ｃＤＮＡの１０分の１は、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（MJ Research）で、GoTaq Flexi DNA Polymerase（Promega Corporation、商品番号M8305）を用いて、以下の条件下でＰＣＲ増幅した；９４℃で２分間、続いて、９４℃で２０秒、５０℃で２０秒、および７２℃で１分間のサイクルを３０回、最後に７２℃で５分間伸長させる。用いたプライマー配列およびプロダクトサイズを、以下に列挙する。
【０１４２】
ラットmRNA ラットプライマー配列 プロダクトサイズ
β-Actin フォワード−CACTGGCATTGTGATGGACT 427bp
リバース −ACGGATGTCAACGTCACACT
Brachyury フォワード−AACTGCGAGTGGGTCTGGAAG 451bp
リバース −TGGGTCTCGGGAAAGCAGTG
Cdx2 フォワード−CCGAATACCACGCACACCATC 394bp
リバース −CTTTCCTTGGCTCTGCGGTTC
Eras フォワード−CGAGCGGTGTGGGTAAAAGTG 501bp
リバース −GGTGTCGGGTCTTCTTGCTTG
Errβ フォワード−TGTGCGGGGACATTGCTTCTG 436bp
リバース −TCCCGATCTGCCAAGTCACAG
FGF4 フォワード−CGGGGTGTGGTGAGCATCTTC 202bp
リバース −CCTTCTTGGTCCGCCCGTTC
GATA-6 フォワード−TCATCACGACGGCTTGGACTG 467bp
リバース −GCCAGAGCACACCAAGAATCC
Kdr フォワード−ATACACCTGCACAGCGTACAG 271bp
リバース −TCCCGCATCTCTTTCACTCAC
Nanog フォワード−GCCCTGAGAAGAAAGAAGAG 356bp
リバース −CTGACTGCCCCATACTGGAA
Nestin フォワード−AGAGAAGCGCTGGAACAGAG 234bp
リバース −AGGTGTCTGCAACCGAGAGT
Oct-4 フォワード−GGGATGGCATACTGTGGAC 412bp
リバース −CTTCCTCCACCCACTTCTC
Pax6 フォワード−GAGACTGGCTCCATCAGACC 212bp
リバース −CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC
Rex-1 フォワード−TTCTTGCCAGGTTCTGGAAGC 277bp
リバース −TTTCCCACACTCTGCACACAC
Sox2 フォワード−GGCGGCAACCAGAAGAACAG 414bp
リバース −GTTGCTCCAGCCGTTCATGTG
Sox17 フォワード−AGGAGAGGTGGTGGCGAGTAG 268bp
リバース −GTTGGGATGGTCCTGCATGTG
Stella フォワード−TCCTACAACCAGAAACACTAG 304bp
リバース −GTGCAGAGACATCTGAATGG
【０１４３】
マウスmRNA マウスプライマー配列 プロダクトサイズ
Nanog フォワード−ATGAAGTGCAAGCGGTGGCAGAAA 464bp
リバース −CCTGGTGGAGTCACAGAGTAGTTC
【０１４４】
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【０１４５】
比較例１
EP1726640（発明者の名前は寺谷および落谷）は、ラット胚性幹細胞の提供を記載すると主張している。しかし、以下の実験において、本出願人は、寺谷および落谷によって記載された培養条件が、単離されたラットＩＣＭの生存または繁殖を支持せず、したがってこれらの条件はラットＥＳ細胞の誘導または維持に適さないことを示した。
【０１４６】
Ｉ．寺谷および落谷のプロトコールによる樹立ラットＥＳ細胞（３ｉ条件で誘導）の培養
Ａ．培地を、寺谷および落谷のプロトコールに記載されたように作製した（すなわち：ＤＭＥＭ中に、EP1726640に記載のｒＬＩＦ、ＫＳＲおよび他の構成成分を記載の濃度で含む）。
Ｂ．フィーダー層をガンマ線を照射されたＭＥＦから調製した（マウス胚線維芽細胞の初代培養物、継代３）。
Ｃ．樹立ラットＥＳ細胞系由来のコロニー（実施例４に記載された手順によって誘導した−ｏｃｔ−４ １系（継代１２）、ＤＡ２系（継代〜１０）、Ｃ系（継代２２）およびＤ系（継代２０））を脱凝集し、そして４ウエルプレートのウエルに移した（Ａの培地中およびＢのフィーダー上）。これを、プレート２５３とラベルした。同じ系から調製した培養物を、３ｉ条件下で並行して維持した。
Ｄ．結果
２日目。ｏｃｔ−４ １系およびＤＡ２系：不良：コロニーの表面に丸くなった細胞が現れている。Ｃ系およびＤ系：いまだ未分化に見える。
６日目。すべて不良。多くの細胞が死滅し、多くは分化し、皿の底に玉石様の細胞があり、また、丸くなった細胞が剥離している。細胞は繁殖しているように見えない。培地を交換した。
８日目。すべての細胞が分化または死滅した。培養物は、不透明な褐色物の大きな塊からなり、ウエルの底に多くの細胞が派生物を生じた。
コントロール培養物（３ｉ中）は未分化に見え、そして大量に繁殖していた。
Ｃ．結論。寺谷および落谷のプロトコールに記載の条件で培養されたすべての細胞が８日以内に死滅または分化した：したがって、このプロトコールは、ラットＥＳ細胞を生存可能な未分化の繁殖状態で維持することができない。
【０１４７】
ＩＩ．寺谷および落谷のプロトコールに記載の条件において試みられたラットＥＳ細胞系の誘導
Ａ．培地およびフィーダー層は、上記ＩＡおよびＢで記載した通りである。
Ｂ．ラット胚盤胞（４．５ｄｐｃ）を収集し、免疫手術に供した。
Ｃ．７個の単離した内部細胞塊（ＩＣＭ）を、寺谷および落谷に記載された培地（ｒＬＩＦ、ＫＳＲなど）に移した（プレート２５８Ｂ）。
Ｄ．コントロールとして、６個の単離したＩＣＭを３ｉ培地に移した（プレート２５８Ａ）。
Ｅ．コントロールのウエル（Ａ）ではいくつかの派生物が見られたが、寺谷および落谷条件のウエル（Ｂ）では何も見られなかった。培養物を固定した。
Ｆ．ＤＡＰＩ染色の後、３ｉコントロール群で５／６のＩＣＭ派生物を同定した。すべての細胞が大量に繁殖した。
Ｇ．寺谷／落谷群では１／７の派生物が同定できた。それは、非常に小さく、ＤＡＰＩ染色後にのみ派生物として同定可能であった。
Ｈ．結論。寺谷および落谷のプロトコールは、単離されたラットＩＣＭの生存または繁殖を支持しない。この方法によってラットＥＳ細胞が誘導され得るとの主張を支持する証拠は全くない。
【０１４８】
実施例５
ヒツジ多能性細胞の誘導および特徴付け
以下の実施例は、従来の方法によっては得られ得ないヒツジ胚性幹（ＥＳ）細胞の提供を記載する。ヒツジＥＳ細胞を、新規な無血清培養系を用いて、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む手順を実施することによって樹立し、産生した：
（Ａ）細胞が凝集した状態で残存している、ヒツジ胚盤胞の培養によって形成された内部細胞塊を解離する工程、
（Ｂ）解離した内部細胞塊の培養物から生じる一次胚性幹細胞を、移せるかまたは継代できるまで培養する工程、
（Ｃ）細胞が凝集した状態で残存している、移せるかまたは継代できるようになった一次胚性幹細胞を解離し、その後それを継代および培養する工程、および
（Ｄ）細胞をさらに移すか継代し、そして培養し、胚性幹細胞系を樹立する工程。
【０１４９】
ヒツジＥＳ細胞樹立のための方法、樹立ヒツジＥＳ細胞を特徴付けるための方法およびヒツジＥＳ細胞を継代培養するための方法は、以下の通りである。
【０１５０】
１．ヒツジ。
これらの方法は、ヒツジの任意の系統からＥＳ細胞を誘導するのに適切である。例えば、ＥＳ細胞を、Merino系統などのヒツジ系統から誘導し得る。
【０１５１】
２．フィーダー細胞。
ヒツジＥＳ細胞の樹立およびその後の培養および移動のために、フィーダー細胞を用いることが好ましい。フィーダー細胞は、任意の種から誘導されたものであり得、そして好ましくはむしろ正常線維芽細胞であるが、遺伝子ベースの選択マーカーの有無にかかわらず、樹立および／または不滅化されたフィーダー細胞系（例えば、ＤＩＡＭ（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１）；Rathjen PD, Toth S, Willis A, Heath JK, Smith AG. Differentiation inhibiting activity is produced in matrix-associated and diffusible forms that are generated by alternative promoter usage. Cell 1990: 62:1105-1114）を除外しない。具体的には、正常マウス胚線維芽細胞が挙げられ得るが、しかし新生児または成体の線維芽細胞を除外しない。より具体的には、妊娠が１２日目から１６日目の間の正常マウス胚線維芽細胞の初代培養細胞を用い得る。正常線維芽細胞として、例えば、１２．５日目の１２９ｓｖ胎仔マウスの正常線維芽細胞が例示される。フィーダー細胞は、従来の方法によって調製でき、または市販の製品（マウス胎仔線維芽細胞；ＡＴＣＣ）を用いることもできる。マイトマイシンＣ、ガンマ線照射などの処理によって不活性化されたフィーダー細胞を用いることが好ましい。対象となる培養容器を、例えばゼラチン、フィブロネクチン、ラミニンなど（しかしこれらに限定されない）のマトリックスでプレコートすることもまた好ましいとされ得る。
【０１５２】
３．培養培地。
ヒツジＥＳ細胞の産生、樹立および培養のために、実質的に無血清の培養培地を用いた。用いた培養培地の具体的な組成を、以下に示す。
【０１５３】
ａ）ヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地。
胚盤胞から内部細胞塊形成までの工程で用いる培養培地を、「ヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地」という。組成の例は、Dattena Mら（Dattena M, Mara L, Bin T AA, Cappai P. Lambing rate using vitrified blastocysts is improved by culture with BSA and hyaluronan. Mol Reprod Dev. 2007年1月;74(1):42-7）に記載の通りである。
【０１５４】
ｂ）ヒツジＥＳ細胞のための培養培地。
内部細胞塊形成後の培養（樹立ヒツジＥＳ細胞の培養を含む）で用いる培養培地を、「ヒツジＥＳ細胞のための培養培地」または以下「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」という。組成の具体例；５ｍＭのＬ−アラニル−グルタミンまたは２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１００ｍＬのダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２（Invitrogen/Gibco）（表ＩＩ）、１ｍＬの１００×Ｎ２補剤（表ＩＩ；２５μｇ／ｍＬのインシュリン、１６μｇ／ｍＬのプトレシン、１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、６ｎｇ／ｍＬのプロゲステロン、５０μｇ／ｍＬのウシまたはヒト血清アルブミン、最終濃度）が添加された１００ｍＬ（１：１ ｖ／ｖ）のNeurobasal培地（Invitrogen/Gibco）（表ＩＩ）、２ｍＬの５０×Ｂ２７補剤（表ＩＩ；２ｍｇ／ＬのＬ−アラニン、３．７ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、４４１ｍｇ／Ｌのｌ−グルタミン、７．７６ｍｇ／ＬのＬ−プロリン、０．１０ｍｇ／Ｌのビオチン、０．３４ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、０．０２ｍｇ／Ｌのコルチコステロン、０．００６３ｍｇ／Ｌのプロゲステロン、０．１ｍｇ／ＬのビタミンＡ、０．１ｍｇ／Ｌの酢酸レチノール、４ｍｇ／Ｌのインシュリン、０．００２ｍｇ／Ｌのトリヨード−Ｌ−チロニン、２５ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、０．０４７ｍｇ／Ｌのリポ酸、１ｍｇ／ＬのビタミンＥ、１ｍｇ／ｍＬの酢酸Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール、２．５ｍｇ／Ｌのカタラーゼ、１ｍｇ／Ｌの還元型グルタチオン、２．５ｍｇ／Ｌのスーパーオキシドジスムターゼ、２ｍｇ／ＬのＬ−カルニチン、１ｍｇ／Ｌのエタノールアミン、１５ｍｇ／ＬのＤ（＋）−ガラクトース、２６００ｍｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、１６．１ｍｇ／Ｌのプトレシン、０．０１６ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、０．１９４ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、１ｍｇ／Ｌのリノール酸、１ｍｇ／Ｌのリノレン酸、２５００ｍｇ／Ｌのウシまたはヒト血清アルブミン、５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン、最終濃度）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、２μＭのＳＵ５４０２［Antibiotic-Antimicrotics溶液（必要に応じて）］。
【０１５５】
４．培養条件。
ヒツジＥＳ細胞の産生、樹立および培養におけるヒツジＥＳ細胞培養の温度は、３５℃〜３７．５℃の範囲であった。好ましくは３７℃である。代表的な細胞培養に用いられる加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で培養を行った。
【０１５６】
５．ヒツジＥＳ細胞の樹立の方法。
ヒツジＥＳ細胞の樹立の方法の具体例を以下に記載する。
【０１５７】
ａ）卵母細胞（胚盤胞期の胚）の収集。
卵母細胞収集のためのヒツジを選択した。卵母細胞収集は、Dattena Mら（Dattena M, Mara L, Bin T AA, Cappai P. Lambing rate using vitrified blastocysts is improved by culture with BSA and hyaluronan. Mol Reprod Dev. 2007年1月;74(1):42-7）に記載された従来の方法によって行ったが、当然のことながら、他の従来の卵母細胞収集方法もまた用いることができる。具体的には、ヒツジを自然交配させ、膣栓検出後、卵母細胞サンプリングのための雌ヒツジを屠殺し、子宮を摘出した。この子宮を適切な培地で灌流し、受精卵母細胞（胚）を回収した。発生または成熟を、受精卵母細胞（胚）から桑実胚を経て胚盤胞（胚盤胞期の胚）まで進行させ、そして、発生が胚盤胞期まで進行したことを顕微鏡観察によって確認した。好ましくは、発生を、後期胚盤胞期まで、そして内部細胞塊が存在し見えるようになるまで、進行させる。
【０１５８】
ｂ）内部細胞塊の形成および単離。
上述の５ａ）で得られた胚盤胞を顕微鏡で確認し、そして、例えば酸性タイロード（ｐＨ２．５）、ヒアルロニダーゼ、プロナーゼを用いて、透明帯を除去した。次いで、マイトマイシンＣで処理したフィーダー細胞を０．１％ゼラチン／ＰＢＳでコートした培養皿上に蒔き、５〜１０個の透明帯を除去したヒツジ胚盤胞を各皿に移し、そして上述のヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」を用いて培養を開始した。
【０１５９】
培養１日目から８日目の間、透明帯を除去したヒツジ胚盤胞（後期）はフィーダー細胞に接着した。接着後５〜１０日で、先細のガラスパスツールピペットなどを用いて胚盤胞由来の内部細胞塊を機械的に解離した。５〜２０細胞の内部細胞塊の断片または凝集塊を、上述のヒツジＥＳ細胞樹立のための培養培地「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」を含む同様の培養皿に移した。そのとき、内部細胞塊は、トリプシン−ＥＤＴＡなどのようなプロテアーゼで解離するのではなく、上記のように機械的に解離した。
【０１６０】
ｃ）ヒツジＥＳ細胞の樹立。
フィーダー細胞が蒔かれた０．１％ゼラチン／ＰＢＳでコートした培養皿で、上記のように解離した内部細胞塊を、ヒツジＥＳ細胞のための培養培地「Ｎ２Ｂ２７＋３ｉ」中で培養した。一次ＥＳ細胞コロニーは、培養４日目から１０日目の間で現れた。この一次ＥＳ細胞コロニーの出現を、顕微鏡観察で確認した。観察されたＥＳ細胞を「一次ＥＳ細胞」という。その後約５〜１０日にわたって培養を続けることによって、一次ＥＳ細胞コロニーは、さらに移すか継代できるようになった。本明細書で用いる「継代できる状態」とは、形成された一次ＥＳ細胞コロニーを構成する細胞の数が、約２００〜６００に達した状態をいう。それがそのような形態を有することを顕微鏡で確認しながら、ＥＳ細胞コロニーを先細のガラスパスツールピペットを用いて分離した。この分離されたＥＳ細胞コロニーを、ヒツジＥＳ細胞のための培養培地を含む無菌中間培養容器に移し、そして、トリプシン−ＥＤＴＡのようなプロテアーゼを用いて、好ましくはアポトーシスインヒビター（例えば、Y-27632; Watanabe Kら A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature 5月27日(2007)）の存在下で酵素的に単一細胞に解離するか、または機械的に約５〜２０細胞からなる細胞凝集塊に解離した。解離したＥＳ細胞コロニーを、フィーダー細胞が蒔かれた０．１％ゼラチン／ＰＢＳでコートした培養皿で、ヒツジＥＳ細胞のための培養培地中で、初代培養に供した（継代１の細胞）。ＥＳ細胞コロニーは約２〜４日後に現れ、培養を開始してから約５〜１０日後に継代できる状態になった。その後の細胞の継代は上記のように行った。
【０１６１】
６）ヒツジＥＳ細胞の提示。
ヒツジＥＳ細胞は、以下の性質（ａ）〜（ｍ）のうちいくつかまたはすべてが特徴付けられていることが期待され、その多くは実験的に確認された：
（ａ）ＥＳ細胞コロニーが、密集した近均質の状態で提示される、
（ｂ）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｓｔｅｌｌａ遺伝子、Ｒｅｘ１遺伝子、ＦＧＦ４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子を発現する、
（ｃ）アルカリフォスファターゼ活性が陽性である、
（ｄ）胚様体を形成する能力を有する、
（ｅ）ＳＳＥＡ（発生期特異的胚抗原：Stage-Specific Embryonic Antigen）−１、−３および−４を差次的に発現する、
（ｆ）ＴＲＡ（腫瘍拒絶抗原：Tumour Rejection Antigen）−１−６０、−１−８１を発現する、
（ｇ）正常ヒツジ細胞が有するのと同じ数の染色体を有する、
（ｈ）継代培養されてもなお未分化状態である、
（ｉ）インビトロで多能性状態である、
（ｊ）３つの胚性生殖系統の細胞に分化する潜在能を有する、
（ｋ）インビトロでの奇形腫形成能力を有する、
（ｌ）キメラヒツジを産生する能力を有する、そして
（ｍ）ヒツジの生殖系列になり得る能力を有する。
【０１６２】
本発明は、上述した（ａ）〜（ｍ）に示されるＥＳ細胞の性質のすべてを保持するヒツジＥＳ細胞を、初めて提供する。上述の特質（ａ）〜（ｍ）は、樹立ヒツジＥＳ細胞がＥＳ細胞としての性質（すなわち、未分化状態を維持するＥＳ細胞としての性質）を保持することを以下の方法によって分析し得る。
【０１６３】
６．１）形態。
ヒツジＥＳ細胞は、顕微鏡法によって視覚化されるように、密集した近均質の状態のコロニーを維持した。（図１５Ａ〜Ｄ）
【０１６４】
６．２）未分化状態についての遺伝子マーカーの発現。
Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ２およびＲｅｘ−１などの代表的な未分化状態の遺伝子マーカーの発現の存在または不在は、ＥＳ細胞の特性である。ヒツジＥＳ細胞の未分化状態遺伝子マーカーの発現について、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した（表Ｉ）。ハウスキーピング遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ）もまた用い、ｃＤＮＡの完全性を評価した。市販のキットを製造者の使用説明書に従って用いて、試料からｍＲＮＡを抽出、そしてＲＴ−ＰＣＲ（TRIzol reagentおよびSuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR、Invitrogen）によってｃＤＮＡの合成を行った。要するに、TRIzol抽出されたｍＲＮＡを、SuperScript III逆転写酵素によって、４μＬの５×First Strand Buffer、１μＬのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μＬのランダムプライマー（１０μＭ）、１μＬのＲＮＡインヒビター、１μＬのSuperScript IIIおよび７．５μＬのＨ２Ｏおよび３μＬのｍＲＮＡ試料を含む２０μＬのＲＴ反応容量で、ｃＤＮＡに変換した。対応するＲＴ陰性（SuperScript IIIなし）もまた、ゲノム夾雑測定のために調製した。次いで、サーマルサイクラー（Perkin Elmer）で、以下のサイクルパラメータで、反応を進行させた：５０℃で６０分間および７０℃で１５分間。次いで、このｃＤＮＡを、未分化状態遺伝子マーカーのプライマー（表Ｉ）とともにＰＣＲに用いた。２．５μＬの１０×ＰＣＲバッファー、１．５μＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、０．５μＬのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１μＬのフォワードプライマー（１０μＭ）、１μＬのリバースプライマー（１０μＭ）、０．２μＬの組換型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１７．３μＬのＨ２Ｏおよび１μＬのＲＴ試料を含む、標準的な２５μＬのＰＣＲ反応容量を用いた。次いで、反応試料を以下のパラメータを用いてサイクルさせた：９４℃で５分間、（９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、および７２℃で４５秒）のサイクルを３５回、最後に７２℃で５分間伸長させる。Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現を、上述の最終反応物の少量を２．５％のアガロースゲル上で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、そしてＵＶ照明の下で写真を撮ることによって視覚化した（図１６）。
【０１６５】
６．３）アルカリフォスファターゼ活性。
未分化ヒツジＥＳ細胞は、アルカリフォスファターゼを大量に発現することが観察された。アルカリフォスファターゼの発現は、種々の市販のアルカリフォスファターゼ検出キットを用いて容易に測定し得る。本実施例では、ＡＬＰ組織染色キット（Sigma）を、製造者の使用説明書に従って用いた。（図１５Ｂ）
【０１６６】
６．４）胚様体を形成する能力。
フィーダー細胞なしの条件下で、コートされていない培養皿を用いてＥＳ細胞および／または凝集塊を培養することによる胚様体の形成。コートされていない培養皿の中で、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、０．８μＭのＰＤ１８４３５２、２μＭのＳＵ５４０２（「３ｉ」）なしのヒツジＥＳ細胞のための培養培地を用いて、約２日〜１４日間にわたってヒツジＥＳ細胞を培養した後、細胞凝集によって形成された規則的なまたは不規則な球状体の出現を顕微鏡で観察することによって、胚様体形成を確認した。（図１５Ｅおよび１５Ｆ）。
【０１６７】
６．５）核または細胞表面抗原の発現。
ＥＳ細胞を含む幹細胞の未分化状態の同定で用いられる特性のうちの１つは核のＯｃｔ３／４およびＮａｎｏｇ、ならびに細胞表面抗原（ＳＳＥＡ（発生期特異的胚抗原：stage-specific embryonic antigen）−１、−３、−４；ＴＲＡ（腫瘍拒絶抗原：Tumour Rejection Antigen）−１−６０、−１−８１）の検出であり、その発現量が、それらの分化に際して結果として特異的に変化する。細胞表面マーカーの発現は、ES Cell Characterization Kit（Millipore）を製造者の使用説明書に従って用い、免疫染色することによって評価した（データは示さず）。
【０１６８】
６．５）染色体数。
ヒツジ二倍体細胞の正常な期待される染色体数は、Ｇバンド法（例えば、Sumner, A. T., Cancer Genet Cytogenet. 6: 59-87 （1982））によって染色体数を分析することによって、樹立ヒツジＥＳ細胞が、その起源となるヒツジの染色体数（２ｎ＝５４）を維持する正常ＥＳ細胞であることを確認し得る。
【０１６９】
６．６）未分化状態の維持。
樹立ＥＳ細胞は、継代培養されても未分化状態を維持し得、特徴的には、それを少なくとも３０継代まで継代培養され得る。未分化状態の維持は、ヒツジＥＳ細胞の継代培養法（上述３）に従って継代培養を行うことで、そしてヒツジＥＳ細胞の上述（６）の提示を決定することで、確認し得る。
【０１７０】
６．７）多能性。
ＥＳ細胞は、フィーダー細胞なしの条件下で培養することによって、胚様体を経て種々の細胞に自発的に分化する。ＥＳ細胞のこの性質は、上述６．４）に記載の方法によって胚様体を形成し、次いで胚様体をゼラチンコートされた培養皿に移し、そして約７日から１４日にわたって培養することによって観察され得る。神経細胞様細胞、脂肪細胞様細胞または上皮細胞様細胞などの出現を、各細胞の特徴的形態によって、確認し得る。
【０１７１】
６．８）血清の存在下での培養によるインビトロでの分化。
さらに、ＥＳ細胞は、血清２０％の存在下での培養によって分化する性質を有する。好ましくは、ヒツジＥＳ細胞は、血清２〜２０％の存在下での培養によって分化する。インビトロでのヒツジＥＳ細胞の分化を、アルカリフォスファターゼ活性の消失によって、またはＯｃｔ３／４、ＮａｎｏｇなどのＥＳ細胞未分化状態マーカー遺伝子の発現の消失によって、確認し得る（上述の６（ａ）〜（ｆ））。
【０１７２】
６．９）３つの胚性生殖系統の細胞に分化する潜在能。
ＥＳ細胞は、３つの胚性生殖（内胚葉、中胚葉、外胚葉）系統の細胞に分化する潜在能を有する。ＥＳ細胞のこの性質は、胚様体（上述の６．４）からＲＮＡを抽出し、そしてＲＴ−ＰＣＲによって、外胚葉細胞（例えば、神経細胞）、中胚葉細胞（例えば、心筋細胞）および内胚葉細胞（例えば、肝細胞）の各マーカー遺伝子の発現を分析することによって、確認し得る。
【０１７３】
６．１０）奇形腫形成能力。
同種の動物または先天的免疫不全の異種の動物へのＥＳ細胞の移植は、奇形腫形成を導き得る。奇形腫は、３つの胚性生殖（内胚葉、中胚葉および外胚葉）から誘導された種々の組織が腫瘍中にランダムに存在する混合腫瘍の名称である。奇形腫の形成は、同種の動物または原発性免疫不全の異種の動物の皮下などにヒツジＥＳ細胞を移植し、そして数ヵ月後に球状の増殖物の存在を肉眼観察することによって、確認し得る。形成された奇形腫が３つの胚性生殖構造物を有することは、摘出した奇形腫を切片化し、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、そして組織および細胞の形態を顕微鏡で観察することによって、確認し得る。
【０１７４】
６．１１）キメラヒツジ産生能力。
キメラヒツジは、ＥＳ細胞を同種または異種のヒツジに導入することによって産生し得る。キメラヒツジの産生は、例えば、以下の方法によって行われ得る。キメラヒツジの産生の確認を容易にするために、マーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰ、Ｘ−ｇａｌ、ルシフェラーゼなど）を前もってヒツジＥＳ細胞に導入しても良い。具体的には、このようなマーカー遺伝子を含むベクターをＥＳ細胞染色体に組み込んだ組換えヒツジＥＳ細胞を、上述のベクターをエレクトロポレーション法などによってヒツジＥＳ細胞染色体に組み込ませ、その後薬剤を補充した培養培地で選択することによって、樹立する。組換えヒツジＥＳ細胞を、例えば、ヒツジ胚盤胞の胞胚腔に、あるいは桑実胚期または１６細胞期の胚に、顕微鏡操作によって移植し、そして内部細胞塊とともにまたは内部細胞塊の一部として発生させる（マイクロインジェクション法：Gordon J. W.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7380-7384 （1980））。あるいは、２つの８細胞胚から透明帯を除去し、そしてこれらの胚を上述の組換えヒツジＥＳ細胞と共同培養し、凝集塊を形成させる。得られた凝集塊を培養すると、１つの胚盤胞が得られる（細胞凝集法：Dvorak P.ら, Int. J. Dev. Biol., 39: 645-652 （1995））。上記で得られる胚（移植のための卵）を、精管結紮処理後の雄ヒツジと自然交配させることによって調製された偽妊娠雌ヒツジの子宮に移植し、そして発生させ、このようにしてキメラヒツジを産生し得る。
【０１７５】
得られたキメラヒツジが、ＥＳ細胞から誘導された細胞および組織を有すること、または樹立ラットＥＳ細胞が、キメラヒツジ産生能力を有することは、例えば、テンプレートとしてキメラヒツジの種々の組織から抽出したゲノムＤＮＡとマーカー遺伝子（ＥＳ細胞に導入されたマーカー遺伝子）特異的プライマーとを用いたゲノムＰＣＲによって、確認し得る。さらに、ＥＳ細胞の各組織系統の細胞への分化は、例えば、キメラヒツジの各組織を切片化し、そして用いたマーカータンパク質の性質に基づくマーカー遺伝子発現産物（マーカータンパク質）の存在を検出することによって、確認し得る。
【０１７６】
【表２】
【０１７７】
【表３Ａ】
【０１７８】
【表３Ｂ】
【０１７９】
実施例６
ウシ多能性細胞の誘導および特徴付け。
【０１８０】
目的
ウシＥＳ細胞の単離およびウシＥＳ細胞系の維持についての３ｉ培地の有効性を評価すること。
【０１８１】
材料および方法
実験計画
ＥＳ細胞の単離を評価するために、インビトロで産生した７または８日目の胚盤胞（ｎ＝１０５）を、４つの処理の各々に無作為に割り当てた：
１．コントロール（Ｎ２Ｂ２７）
２．３ｉ培地（ｈＬＩＦあり）
３．３ｉ培地（ｈＬＩＦなし）
４．Millipore-Chemicon ESGRO Complete
【０１８２】
推定ＥＳ細胞が増殖された場合、それらを継代し、そしてこの時点で遺伝子発現の特徴付けのために試料を収集した。培養３０日後にＥＳ細胞培養および処理を評価し、ＥＳ細胞系を生じなかった処理は中止した。ＥＳ細胞系をさらに６０日間、合計９０日間にわたって培養した。胚派生物を形成した、および継代１、継代３および継代６にまで培養された、各々の処理における胚盤胞の割合を、処理を比較するために用いた。多能性遺伝子（すなわち、ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、ｓｏｘ２、ｓｓｅａ１、アルカリフォスファターゼ、ｎａｎｏｇ）の形態および発現もまた、異なる処理におけるウシＥＳ細胞を比較するために用いた。すべてのプライマーは、培養されたウシＥＳ細胞で、これまで胚盤胞でのみバンドを生じたＮａｎｏｇを除いて、バンドを生じる。
【０１８３】
樹立ウシＥＳ細胞系の維持を評価するために、樹立系（ｎ＝３）を、ＥＳ細胞単離実験で用いたものと同じ４つの処理（すなわち、上記の培地１〜４）に継代した。これらの樹立細胞系を６継代まで培養した（約６０日間）。多能性遺伝子（すなわち、ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、ｎａｎｏｇ、ｓｓｅａ１）の形態および発現を、異なる処理で培養された、樹立ウシＥＳ細胞系を比較するために用いた。
【０１８４】
インビトロでの胚の産生
インビトロで４週間連続で胚盤胞を生じさせるために、卵母細胞を週に１度収集した。卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、食肉処理場から得た卵巣から吸引し、ウシ胚盤胞を、前述の方法（１、２）を用いてインビトロで産生させた。要するに、卵巣から吸引したＣＯＣを、卵母細胞成熟を誘発するために、β−エストラジオール、黄体形成ホルモン、およびウシ胎仔血清を補充したＴＣＭ−１９９中で、２４時間培養した。卵丘が膨張したＣＯＣを、成熟卵母細胞を含有すると推測し、そしてヘパリン、ペニシラミン、エピネフリンおよびヒポタウリンを含有するＩＶＦ−ＴＡＬＰ培地中でウシ精子とともに２４時間共同培養した。次いで、推定受精卵を、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、クエン酸三ナトリウム無水物、ミオイノシトールおよびウシ血清アルブミンを補充したＳＯＦ培地（３）で６〜７日間にわたって培養した。配偶子を、空気中に５％ＣＯ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養し、そして胚を、５％ＣＯ２／５％Ｏ２／９０％Ｎ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養した。胚盤胞の全セットから、いくつかの胚盤胞（ｎ＝１５）を特徴付けのために処理し（ＲＴ−ＰＣＲのための陽性コントロール）そして残り（ｎ＝１０５）をＥＳ細胞単離のために用いた。
【０１８５】
ＥＳ細胞単離および培養
透明帯を胚盤胞から機械的に除去し、そして胚盤胞を、マイトマイシンＣ処理によって不活性化したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上に押し付けた。研究の間ＭＥＦフィーダーの異なるバッチを用いたが、各バッチをすべての処理に用いた。ＭＥＦ上に押し付けた胚盤胞を、血清、非必須アミノ酸および増殖因子（ヒトＬＩＦ、βＦＧＦ、ＥＧＦ）を補充した複合培地（α−ＭＥＭ）を用いて、空気中に５％ＣＯ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養した。７〜９日後、胚は、推定ウシＥＳ細胞を含む胚派生物を形成し、この推定ウシＥＳ細胞を初代培養から機械的に切り取り（継代０）、そして新たなフィーダー層に押し付けた（継代１）。推定ＥＳ細胞が増殖した場合（範囲：６〜２６日間）、それらは新たなフィーダー層に継代される。継代の時に、推定ＥＳ細胞の試料を、溶解バッファー（５００μｌ 溶解バッファー：４５８．５μｌ ＤＥＰＣ水、２５μｌ ＤＴＴ（０．１Ｍ）、４μｌ ＩＰＥＧＡＬおよび１２．５μｌ ＲＮＡインヒビター）に入れ、そしてその後の多能性遺伝子転写物の分析のために−８０℃で保存した。培養の間、培養培地を２〜３日ごとに交換した。本研究で単離された細胞系の継代数をいうために用いられる用語はＰｘであり、ここで、ｘ＝本研究における継代の数である。
【０１８６】
樹立されたウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−１：Ｐ１９、１８３日；ＢＥＳ−３：Ｐ１８、２０６日；ＢＥＳ−４：Ｐ２３、２１０日）を、４つの処理の各々に継代した。これらの樹立系を、上記のように培養した。本研究のために割り当てられた後の樹立細胞系の継代数をいうために用いられる用語はＰｘ＋ｙであり、ここで、ｘ＝本研究の前の継代数であり、ｙ＝本研究における継代の数である。
【０１８７】
遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
近年単離されまたは樹立ウシＥＳ細胞系由来の胚盤胞（陽性コントロール）および推定ウシＥＳ細胞を、多能性遺伝子ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、ｓｏｘ２、ｓｓｅａ１、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）およびＮａｎｏｇの発現について、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。ハウスキーピング遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ）をｃＤＮＡの質の評価のために用いた。試料からｍＲＮＡを抽出するために市販のキットを用いた（Dynabeads（登録商標） mRNA DIRECTTM Micro Kit, Invitrogen）。製造者が推奨する標準的なプロトコールを用いてｍＲＮＡを抽出した。要するに、逆転写によってｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。２０μｌＲＴ系を用いた：４μｌの５×First Strand Buffer、１μＬのＤＴＴ（０．１Ｍ）、１μＬのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ）、１μＬのランダムプライマー（１０μＭ）、１μＬのＲＮＡインヒビター、１μＬのSuperScript IIIおよび７．５μＬのＨ２Ｏおよび３μＬの試料。対応するＲＴ陰性（SuperScript IIIなし）を、ゲノム夾雑のチェックのために調製した。すべての試薬はInvitrogenから購入した。調製した溶液を、Mycycler Thermal Cycler （Bio-rad）で、以下のプログラムで処理した：５０℃で６０分間および７０℃で１５分間。ｃＤＮＡの質を、β−Ａｃｔｉｎプライマーを用いてＰＣＲによってチェックした。次いで、確認されたｃＤＮＡを、多能性マーカーのプライマーとともにＰＣＲに用いた。標準的な２５μｌのＰＣＲ系を用いた：２．５μｌの１０×ＰＣＲバッファー、１．５μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、０．５μｌのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１０ｍＭ）、１μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、１μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、０．２μｌの組換型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１７．３μｌのＨ２Ｏおよび１μｌの試料。すべての試薬はFisher Biotecから購入した。調製した溶液を、Mycycler Thermal Cycler （Bio-rad）で、以下のプログラムで処理した：９４℃で５分間、（９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、および７２℃で４５秒）のサイクルを３５回、７２℃で５分間。
【０１８８】
ＯＣＴ４およびＲｅｘ１についてのＰＣＲ産物を、配列決定によって確認した。ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２、アルカリフォスファターゼおよびＮａｎｏｇについてのＰＣＲ産物は未だ配列決定していないが、産物のサイズは標的遺伝子と同じである。
【０１８９】
本研究に用いたプライマーは以下の通りである。
【０１９０】
【表４】
【０１９１】
インビトロでの分化
ウシＥＳ細胞コロニーから切り取った外植片を、ランダムな分化を促進する条件下（すなわち、接着力の低い培養容器、フィーダー層なし、ＬＩＦなし、増殖因子なし）に置き、そして空気中に５％ＣＯ２の加湿気体環境下で３９℃にて培養した。培養の間、培養培地を３〜４日ごとに交換した。
【０１９２】
データ分析
連続データ（培養日数）を、算術平均±平均標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）として報告する。これらのデータは限られたものであったので、統計学的に分析しなかった。カテゴリーデータを、分割表のカイ２乗分析によって分析した（４、５）。この分析がデータセットにおける有意差を回帰した場合（すなわちｐ≦０．０５）、標準化残差および偏差率を用い、帰無仮説に基づいて、どの観察されたカイ２乗頻度が期待される頻度と最も異なるかを決定した（５）。これらの差異を、観察と処理との間の正または負の相関として報告する。
【０１９３】
結果
培養物中の増殖
ウシＥＳ細胞の単離および継代
胚派生物を形成した胚の割合は、処理間で有意に異なり（χ２３＝１２．４９、ｐ＝０．００５９）、そして培地２〜４で培養された胚の８０％以上が派生物を形成した（図１７）。派生物％とコントロール群との間には負の相関があり、コントロール培地で培養した場合、派生物を形成した胚はより少数であった。継代された胚派生物の割合は、処理間で有意に異なり（χ２３＝９．９６、ｐ＝０．０１８９）、そしてＳＣＳ１またはＳＣＳ２で培養された胚盤胞の６５％以上が継代された（図１７）。継代％と培地２（３ｉ＋ｈＬＩＦ）との間には正の相関があり、そして継代％とコントロール群との間には負の相関があった。継代３（χ２３＝１２．０２、ｐ＝０．００７３）および継代６（χ２３＝１３．８１、ｐ＝０．００３２）のウシＥＳ細胞系の割合は、処理間で有意に異なった（図１８）。培地２および３（ｈＬＩＦありまたはなしの３ｉ）で培養された胚盤胞の６０％より多くが継代３にまで継代され、そしてＰ３の細胞系％とコントロール群との間には負の相関があった。培地２または３で培養された胚盤胞の４０％より多くが継代６にまで継代され、そしてＰ６の細胞系％と培地２および３群との間には正の相関があり、Ｐ６の細胞系％と培地４およびコントロール群との間には負の相関があった。継代０での単離の間、４つの培地のうちのいずれかで培養した場合、ＥＳ細胞コロニーは同様の速度で増殖した（図３）。培養５０日後、培地２（５２．８±０．５６日間）または培地３（５４．０±１．１３日間）で単離したすべての細胞系がＰ６以降に進行していたのに対し、コントロール（ｎ＝２）または培地４（ｎ＝３）で単離したいくつかの細胞系は未だ継代６に継代されていなかった（すなわち、なお継代５にある）。
【０１９４】
樹立ウシＥＳ細胞系の培養
樹立ウシＥＳ細胞系のうちの１つ（ＢＥＳ−１）の増殖は、完全に不活性化されなかったＭＥＦフィーダーによって遅延した（結果：培養物中の一般的な形態を参照）。この細胞系は、３継代にわたって処理で培養しただけであり、データは分析しなかったが、ＢＥＳ−１由来の外植片を、その処理で培養した後のそれらのインビトロでの分化の潜在能について試験した（下記参照）。他の２つの樹立ウシＥＳ細胞系（ＢＥＳ−３およびＢＥＳ−４）は、４つの培地の各々で８継代にわたって培養した。外植片生存、支持された継代数、または８継代が完了する日数において、処理間あるいは細胞系間で明らかな差異はなかった（表３）。培地１〜４の各々を用いた培養の間、樹立ウシＥＳ細胞系由来のＥＳ細胞コロニーは同様の速度で増殖した（図２０）。
【０１９５】
【表５】
【０１９６】
培養物中の一般的な形態
新たに単離したウシＥＳ細胞と樹立細胞系から形成されたものとの間で、コロニーの形態に明らかな差異はなかった。コントロール培地で培養されたウシＥＳ細胞コロニーは、長円状に丸くなっており、起伏した境界を有した（図２１ａ、２１ｂ、２２ａ）。これらのコロニーはほとんど平面状（すなわち、２次元）であり、垂直方向の起伏がほとんどなかった。推定幹細胞は、大部分がコロニーの中央に向かって集中し、そしてコロニーの外側領域は明らかなＥＳ細胞を含有しなかった。いくつかの領域では、ＥＳ細胞とフィーダーとの間に流体が堆積し、ＥＳ細胞層を浮き上がらせ、半球および球状構造物を形成した。培地２（３ｉ＋ｈＬＩＦ）（図２１ｃ、２１ｄ、２２ｂ）または培地３（ｈＬＩＦなしの３ｉ）（図２１ｅ、２１ｆ、２２ｃ）で培養されたＥＳ細胞コロニーは、長円状に丸くなっており、非常に明確な起伏した境界を有した。これらのコロニーは、コントロール培地で培養されたものと比較して、形状がより３次元であり、密集した中央部分を有し、多くの垂直方向の起伏がその中央から放射状に広がっていた。いくつかのコロニーの下に流体が堆積したため、それらは凸状であった。コロニーには、密集し隆起した線状構造物が存在し、中央から放射状に広がっていた。推定ＥＳ細胞は、それらがコロニーから持ち上がった、これらの線状構造物の基底部に集中した。推定ＥＳ細胞がより密集していない領域が、これらの構造物から離れて、大部分はコロニーの中央に向かって位置し、そしていくつかはコロニーの端近くに位置した。１０日以上の培養の後、球状の流体で満たされた構造物（胚様体に似ている）が、隆起した線状構造物の近くに形成された。培地４で培養されたＥＳ細胞コロニーは、コントロール培地で培養されたコロニーと同様に、不規則な形状であり、起伏した明確な境界を有した（図２１ｇ、２１ｈ、２２ｄ）。これらのコロニーは３次元であり、細胞の密集領域が、コロニー中にわたって繊維状の起伏した網目構造を形成し、これには規則的なパターンがなかった。いくつかの領域では、ＥＳ細胞とフィーダーとの間に流体が堆積し、半球および球状構造物を形成した。コロニー中の細胞は、拡散しまばらであったが、コロニーの中央は、より密集し隆起していた。個々の細胞が非常に明確であり、そして推定ＥＳ細胞はコロニー中でまばらであったが、コロニーの端近くでは見られなかった。これらの異なる処理はコロニー形態に差異を引き起こしたが、推定ＥＳ細胞の形態の差異は促進しなかったようである（図２３および２４）。
【０１９７】
コントロール培地で培養されたＭＥＦフィーダーのいくつかのバッチは代表的な形態を有し、それらは培養容器上に均一層を形成し、継代を通して比較的変化しないままであった。培地２〜４のいずれかで培養した場合、フィーダーの細胞は、継代３日目までに、丸くなって、フィーダー層から剥離し始めたが、この応答は培地４でより激しかった。ＭＥＦフィーダーの他のバッチは、コントロール培地で培養された場合に、代表的な様態で挙動せず、層中に濁った領域が現れ、そして細胞が増殖し続けているようであった。これらのＭＥＦフィーダーは、継代約１２日目までに、培養容器から剥離した。培地２または３で培養した場合、ＭＥＦのこれらのバッチは、非常に健常に見え、そしてコントロール培地で培養されたフィーダーに特有の形態であった。これらのＭＥＦバッチを培地４で培養した場合、フィーダーの細胞は、継代６〜８日目までに丸くなってフィーダー層から剥離した。
【０１９８】
継代の間の外観および挙動
ウシＥＳ細胞のシート（外植片）を、コントロール培地で培養したコロニーから２９Ｇニードルを用いて機械的に切り取るのはかなり容易であった。機械的に継代する間、ウシＥＳ細胞コロニー全体の動きはほとんどなかった。外植片を切り取るとき、ＥＳ細胞コロニーはＭＥＦフィーダー層の上を覆うように増殖した細胞の単一層であるように見えた。培地２または３で培養されたＥＳ細胞コロニー由来の外植片は、ＥＳ細胞コロニーがより密集し、スポンジ状で柔軟であるように見えるため、切り取りがさらに困難であった。細胞のシートを切り開くためにニードルを用いると、コロニーの大部分が動いた。培地２または３で培養された外植片は、一般的に、コントロール培地で培養されたコロニー由来の外植片よりも、継代での新たなＭＥＦフィーダープレートへの付着がより容易であった。培地４で培養されたＥＳ細胞コロニーは、培地２または培地３で培養されたコロニーと同様に、継代する間著しく動いた。培地４で培養されたコロニーの中央近くの推定ウシＥＳ細胞は、継代で非常に砕けやすく、より小さな凝集塊に容易に分散したので、継代のため外植片の切り取りが難しくなった。培地４の外植片は、外観上非常に屈折していた。
【０１９９】
多能性遺伝子の発現
Ｏｃｔ４は、４つの培地のいずれで単離されたウシＥＳ細胞でも頻繁かつよく発現し、そして他の遺伝子はｏｃｔ４なしでは決して発現しなかった（図２５および２６）。Ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１もまた、４つの培地のいずれで単離されたウシＥＳ細胞でも頻繁に発現し、そしてほとんど常に同時に発現した。ｒｅｘ１がｓｓｅａ１なしで発現することはあったが（図２５および２６：コントロールおよび培地３：示さず）、ｓｓｅａ１はｒｅｘ１なしでは決して発現しなかった。Ｓｏｘ２およびＡＰはそれ程頻繁には発現せず、そして常にｏｃｔ４、ｒｅｘ１、およびｓｓｅａ１と同時に発現した。Ｓｏｘ２およびＡＰは、４つの培地のいずれで単離されたウシＥＳ細胞でも発現したが、それらの発現は、より初期の継代において、そして３ｉ培地（培地２または３）で単離されたウシＥＳ細胞において、より一般的であった。Ｎａｎｏｇは、ごくたまにしか発現せず、そしてどちらの場合も（図２６：コントロールおよび培地３）、ｏｃｔ４、ｒｅｘ１、およびｓｓｅａ１と同時に発現した。６個の多能性遺伝子のすべてを発現したことが分析された細胞の集団は、培地３（ｈＬＩＦなしの３ｉ）で単離された継代１のウシＥＳ細胞のみであった（図２６）。
【０２００】
４つの培地の各々で培養された樹立ＥＳ細胞系由来のウシＥＳ細胞の遺伝子発現は、２つの局面で異なった（図２７）。第一に、ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１がｏｃｔ４の不在下で発現したことであり、そして第二に、最もよく発現した遺伝子は、ｏｃｔ４よりはむしろｒｅｘ１およびｓｓｅａ１であったことである。培地２〜４で培養された多くの継代の後の樹立細胞系においては、より初期の継代では存在しなかったｏｃｔ４を含む、より多くの遺伝子が発現した。
【０２０１】
インビトロで分化する能力
３日以内に、培地２または３で培養されたコロニーから切り取った樹立系の１つ（ＢＥＳ−１）の外植片は、インビトロでの分化を促進する条件に置かれた場合に、胚様体（ＥＢ）に特有の、流体で満たされた球状構造物および細胞凝集塊を形成した（図２８ａ、２８ｂ）。これらのＥＢは、コントロール培地で培養されたコロニーから切り取った外植片によって形成されたものと同様の形状であった。培地２中の１つの外植片は、培養皿に付着した。３日以内に、培地４で培養されたコロニーから切り取った２つの外植片が、培養皿に付着した。個々の細胞が培養容器に付着し、そして分化し始め、それらは中心細胞体から伸長している多くの長い突起を有した（図２８ｃ、２８ｄ）。１つの外植片が、小胞が付着した細胞の凝集塊を形成した。ＢＥＳ−１由来のＥＢ培養物は、培養１０日後に細菌に汚染され始め、廃棄した。本研究で単離されたコロニー由来の外植片もまた、インビトロで分化を促進する条件に置かれた場合に、ＥＢを形成し、コロニーを付着した。
【０２０２】
考察
顕微鏡観察および継代での挙動によって示されるように、異なる培地が、コロニー形態、細胞相互作用およびフィーダー層への付着の変動を誘発した。機械的に継代する間、コントロール培地で培養されたウシＥＳ細胞コロニーはほとんど動かず、これはウシＥＳ細胞がフィーダー層または培養容器に付着したことを示唆した。ヒトまたはマウスＥＳ細胞コロニーとは異なり、ウシＥＳ細胞コロニーは、フィーダー層の上を覆うように増殖した。３ｉ培地で培養されたウシＥＳ細胞コロニーの密集したスポンジ状の柔軟な形状は、これらのコロニーが多層であり得ることを示す。機械的に継代する間、培地２〜４で培養されたウシＥＳ細胞コロニーは著しく動き、これはＭＥＦまたは培養容器との結合がほとんどなかったことを示唆した。これは驚くべきことではなく、これらの３つの培地にはＭＥＦフィーダー細胞に有害な効果があるため、これらを丸くさせ、フィーダーから剥離することとなった。培地４で培養されたコロニーでは、推定ウシＥＳ細胞領域中、個々の細胞が非常に明確であり、おそらく細胞間の結合がほとんどなかったと思われることを示した。コロニーの形態は培地間で大きく異なったが、細胞形態の差異はあまり見られなかった。コロニーの形態および継代での挙動は、新たに単離されたウシＥＳ細胞および樹立された細胞系の形状を形成したものについても同様であった。
【０２０３】
３ｉ培地（培地２および３）はウシＥＳ細胞の単離により効率的であり、より多くの胚盤胞が胚派生物を形成しそして継代１に導かれた。これらの２つの培地はまた、ウシＥＳ細胞の増殖および維持に優れ、継代３および継代６の細胞系がより多く存在した。本研究の終了時、培地４およびコントロール培地で培養されたいくつかの細胞系がなお継代５での生存であったのに対し、３ｉ培地（培地２および３）ではすべての細胞系が継代６以降であった。これは、ウシＥＳ細胞の増殖および発生が、３ｉ培地でより速かったことを示唆する。本研究では、コントロール培地が、ウシＥＳ細胞の単離およびその後の維持について最も効率的でなく、派生物を形成して継代された胚がより少数であり、継代３および継代６の細胞系がより少数であった（すなわち、分析されたすべてのパラメータ）。
【０２０４】
本研究で用いられるいくつかのＭＥＦフィーダー層に関して、それらが増殖し続け、おそらくはマイトマイシンＣ処理によって完全に不活性化されなかったという問題があった。培地２〜４がＭＥＦフィーダーに有害であるように見え、そしていずれの非不活性化フィーダー細胞の増殖も遅らせたが、コントロール培地は、フィーダーの増殖に影響がなかったため、このことは、コントロール群に選択的に不都合であると思われた。しかし、本研究では４つの処理群のすべてでＭＥＦフィーダーの同じバッチを用いたので、処理間の比較が有効である。４つの培地間で、樹立ウシＥＳ細胞系の増殖および発生における差異は見られなかった。
【０２０５】
ＯＣＴ４、Ｒｅｘ１およびＳＳＥＡ１は、ウシＥＳ細胞の強力で強固な多能性マーカーであり、これは、近年単離されたＥＳ細胞および樹立ウシＥＳ細胞系についても当てはまった。Ｏｃｔ４、Ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１は、ウシＥＳ細胞系で通常発現し、そして本研究では、他の多能性遺伝子は、これらが不在では決して発現しなかった。新たに単離されたウシＥＳ細胞では、ｒｅｘ１およびｓｓｅａ１の発現は、ｏｃｔ４の発現に依存し、そしてｓｓｅａ１の発現は、ｒｅｘ１の発現に依存した。これらの３つの遺伝子の発現は、処理群からは独立していた。他の多能性遺伝子の発現は不規則であり散発的でありそして培養培地に関連し、そして３ｉ培地での培養は他の多能性遺伝子の発現を誘導した。樹立ウシＥＳ細胞系では、本研究の初期継代でｏｃｔ４を発現しないことが多く、それにもかかわらずｒｅｘ１およびｓｓｅａ１を発現した。興味深いことに、ｏｃｔ４は、より初期の継代で検出されなかったとしても、培地２〜４での培養後の樹立ＥＳ細胞系では発現した。これは、この培地が、他の多能性遺伝子の発現を誘導したことを示唆し、このことは、新たに単離されたＥＳ細胞と同様である。本研究で用いられるＯＣＴ４プライマーは、胚盤胞およびインビボ胚に１つのはっきりしたバンドを生じ、しかしインビトロで単離されたＥＳ細胞では２つのバンドを生じる。小さな方のバンドを配列決定してＯＣＴ４であることを確認した。大きな方のバンドは、陰性コントロールがこのバンドの存在を示さなかったので、ゲノムＤＮＡではない。発明者らのインビトロ培養系は、ｏｃｔ４の偽遺伝子またはアイソフォームが発現されることを誘導し得、そしてこれを確認するために、第２のバンドを配列決定する。
【０２０６】
培地２または３（３ｉ培地）で培養されたウシＥＳ細胞に有意な差異はなかった。これらの培地の差は、培地２にｈＬＩＦが存在することだけであった。これは、ｈＬＩＦにウシＥＳ細胞に対する付加効果がほとんどなかったことを示す。
【０２０７】
結論
試験を行った４つの培地では、２つの３ｉ培地がウシＥＳ細胞の単離に最も効率的であった。ウシＥＳ細胞の増殖および発生ならびに多能性遺伝子の発現は、これらの２つの培地において優れていた。さらに、３ｉ培地で単離されたウシＥＳ細胞は、インビトロで分化する潜在能を示した。増殖および発生におけるこのような著しい差異は、樹立ウシＥＳ細胞系では見られなかった。しかし、３ｉ培地での培養後、より多くの多能性遺伝子が発現したので、これらの培地はウシＥＳ細胞系の多能性構成要素を強化すると思われる。
【０２０８】
参考文献
1. Lonergan P, O'Kearney-Flynn M, Boland, M. P. (1999) Effect of protein supplementation and presence of an antioxidant on the development of bovine zygotes in synthetic oviduct fluid medium under high or low oxygen tension. Theriogenology 51: 1565-1576
2. Holm P, Booth PJ, Schmidt MH, Greve T, Callesen H (1999) High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins. Theriogenology 52: 683-700
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4. Zar JH (1999) Biostatistical Analysis. IE 4th edn, Prentice Hall, Upper Saddle River
5. Fowler J, Cohen L, Jarvis P (1998) Practical Statistics for Field Biology. 2nd Edn, John Wiley and Sons, New York
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する多能性ラット細胞。
【請求項２】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項１に記載の多能性ラット細胞。
【請求項３】
さらにアルカリフォスファターゼを発現する、請求項１または２に記載の多能性ラット細胞。
【請求項４】
Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項５】
前記多能性細胞がＦＧＦ５を発現しない、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項６】
前記多能性ラット細胞が、培養物中で形態的に未分化である、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項７】
前記多能性ラット細胞が、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項８】
前記多能性ラット細胞が、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項９】
前記多能性ラット細胞の子孫が、培養物中で維持された後に、原多能性ラット細胞の特性を保持する、請求項７または８に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１０】
前記多能性ラット細胞がキメラに寄与し得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１１】
前記キメラの全細胞がラット細胞である、請求項１０に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１２】
前記多能性ラット細胞がキメラの生殖系列に寄与し得る、請求項１０または１１に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１３】
前記多能性細胞が、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１５】
前記多能性ラット細胞が、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１６】
前記多能性ラット細胞の分化が、アクチビンレセプター遮断によって誘導されない、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１７】
前記多能性ラット細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１８】
前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞の集団。
【請求項１９】
細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する、多能性ラット細胞の集団。
【請求項２０】
細胞の少なくとも９５％がＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する、請求項１９に記載の多能性ラット細胞の集団。
【請求項２１】
多能性ラット細胞とＭＥＫインヒビターを含む培養培地とを含む、多能性ラット細胞の培養物。
【請求項２２】
前記培地が、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項２１に記載の培養物。
【請求項２３】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する、多能性マウス細胞以外の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２４】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項２３に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２５】
さらにアルカリフォスファターゼを発現する、請求項２３または２４に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２６】
Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項２３から２５のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２７】
前記多能性細胞がＦＧＦ５を発現しない、請求項２３から２６のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２８】
前記多能性哺乳動物細胞が、培養物中で形態的に未分化である、請求項２３から２７のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２９】
前記多能性哺乳動物細胞が、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る、請求項２３から２８のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３０】
前記多能性哺乳動物細胞が、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る、請求項２３から２９のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３１】
前記多能性哺乳動物細胞の子孫が、培養物中で維持された後に、原多能性哺乳動物細胞の特性を保持する、請求項２９または３０に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３２】
前記多能性哺乳動物細胞がキメラに寄与し得る、請求項２３から３１のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３３】
前記キメラの全細胞が、多能性哺乳動物細胞と同種の細胞である、請求項３２に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３４】
前記多能性哺乳動物細胞がキメラの生殖系列に寄与し得る、請求項３２または３３に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３５】
前記多能性細胞が、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る、請求項２３から３４のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３６】
前記細胞が培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得る、請求項２３から３５のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３７】
前記多能性哺乳動物細胞が、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない、請求項２３から３６のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３８】
前記多能性哺乳動物細胞の分化が、アクチビンレセプター遮断によって誘導されない、請求項２３から３７のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３９】
前記多能性哺乳動物細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される、請求項２３から３８のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項４０】
請求項２３から３９のいずれかに記載の多能性ウシ細胞。
【請求項４１】
請求項２３から３９のいずれかに記載の多能性ヒツジ細胞。
【請求項４２】
請求項２３から３９のいずれかに記載の多能性ブタ細胞。
【請求項４３】
請求項２３から４２のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞の集団。
【請求項４４】
細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する、多能性哺乳動物細胞の集団。
【請求項４５】
前記細胞の少なくとも９５％がＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する、請求項４４に記載の多能性哺乳動物細胞の集団。
【請求項４６】
多能性哺乳動物細胞とＭＥＫインヒビターとを含む培養培地を含む、多能性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項４７】
前記培地が、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項４６に記載の培養物。
【請求項４８】
胚盤胞から多能性ラット細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊の一次派生物を単離および解離する工程；
（４）該内部細胞塊の解離した一次派生物から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項４９】
胚盤胞から多能性哺乳動物細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項５０】
前記胚盤胞をＬＩＦ中で培養する工程を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記胚盤胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程を含む、請求項４８から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記胚盤胞がラット胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記胚盤胞がウシ胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記胚盤胞がヒツジ胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記胚盤胞がブタ胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記胚盤胞が、ＥＳ細胞の誘導に対して非許容的であるマウス系統由来のマウス胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記工程（４）の前記１または複数の細胞が、前記内部細胞塊の解離した一次派生物から単離される、請求項４９から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記多能性細胞が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち１つ以上を発現する、請求項４８から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記多能性細胞が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち任意の２つ以上を発現する、請求項４８から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記多能性細胞が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項４８から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記多能性細胞が、さらにアルカリフォスファターゼを発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記多能性細胞が、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項４８から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記多能性細胞が、ＦＧＦ５を発現しない、請求項４８から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記多能性細胞が、培養物中で形態的に未分化である、請求項４８から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記多能性細胞が、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る、請求項４８から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記多能性細胞が、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る、請求項４８から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記多能性哺乳動物細胞の子孫が、培養物中で維持された後に、原多能性哺乳動物細胞の特性を保持する、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記多能性細胞がキメラに寄与し得る、請求項４８から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記キメラの全細胞が、多能性哺乳動物細胞と同種の細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記多能性細胞がキメラの生殖系列に寄与し得る、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記多能性細胞が、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る、請求項４８から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記多能性細胞が、培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得る、請求項４８から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記多能性細胞が、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない、請求項４８から７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記多能性哺乳動物細胞の分化が、アクチビンレセプター遮断によって誘導されない、請求項４８から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記多能性哺乳動物細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される、請求項４８から７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
請求項４８から５２または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ラット多能性細胞。
【請求項７７】
請求項４８から５１、５３、または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ウシ多能性細胞。
【請求項７８】
請求項４８から５１、５４、または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ヒツジ多能性細胞。
【請求項７９】
請求項４８から５１、５５、または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ブタ多能性細胞。
【請求項８０】
請求項４８から５１または５６から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、非許容的であるマウス系統由来のマウス多能性細胞。
【請求項８１】
請求項７６から８０のいずれかに記載の多能性細胞の集団。
【請求項８２】
前記１または複数の多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項１から４７または７６から８１のいずれかに記載の細胞、集団または培養物。
【請求項８３】
前記１または複数の多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項４８から７５のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
遺伝子操作ラットを得る方法であって、ラット多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞をラット胚に導入して遺伝子改変ラットを産生する工程を含む、方法。
【請求項８５】
マウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物を得る方法であって、哺乳動物多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞を非ヒト哺乳動物胚に導入して遺伝子改変哺乳動物を産生する工程を含む、方法。
【請求項８６】
前記遺伝子操作哺乳動物が、目的の遺伝子についてのホモ接合性ヌルである、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記遺伝子改変する工程が、ラットまたは非ヒト哺乳動物中の遺伝子の対応するヒト遺伝子への置換を含む、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記遺伝子改変する工程が、１以上の目的の遺伝子のノックアウトを含む、請求項８４から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記遺伝子改変する工程が、目的の遺伝子の標的挿入を含む、請求項８４から８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
請求項８４から８９のいずれかに記載の方法によって得られる、遺伝子操作ラット。
【請求項９１】
請求項８４から８９のいずれかに記載の方法によって得られる、マウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物。
【請求項９２】
１以上の目的の遺伝子の生理学的な役割の評価における、請求項９０に記載の遺伝子操作ラットまたは請求項９１に記載の遺伝子操作非ヒト哺乳動物の使用。
【請求項９３】
創薬および／または試験における、請求項９０に記載の遺伝子操作ラットまたは請求項９１に記載の遺伝子操作非ヒト哺乳動物の使用。
【請求項９４】
ヒトまたは動物疾患のモデルとしての、請求項９０に記載の遺伝子操作ラットまたは請求項９１に記載の遺伝子操作非ヒト哺乳動物の使用。
【請求項１】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する多能性ラット細胞。
【請求項２】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項１に記載の多能性ラット細胞。
【請求項３】
さらにアルカリフォスファターゼを発現する、請求項１または２に記載の多能性ラット細胞。
【請求項４】
Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項５】
前記多能性細胞がＦＧＦ５を発現しない、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項６】
前記多能性ラット細胞が、培養物中で形態的に未分化である、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項７】
前記多能性ラット細胞が、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項８】
前記多能性ラット細胞が、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項９】
前記多能性ラット細胞の子孫が、培養物中で維持された後に、原多能性ラット細胞の特性を保持する、請求項７または８に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１０】
前記多能性ラット細胞がキメラに寄与し得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１１】
前記キメラの全細胞がラット細胞である、請求項１０に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１２】
前記多能性ラット細胞がキメラの生殖系列に寄与し得る、請求項１０または１１に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１３】
前記多能性細胞が、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得る、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１５】
前記多能性ラット細胞が、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１６】
前記多能性ラット細胞の分化が、アクチビンレセプター遮断によって誘導されない、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１７】
前記多能性ラット細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される、前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞。
【請求項１８】
前記いずれかの請求項に記載の多能性ラット細胞の集団。
【請求項１９】
細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する、多能性ラット細胞の集団。
【請求項２０】
細胞の少なくとも９５％がＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する、請求項１９に記載の多能性ラット細胞の集団。
【請求項２１】
多能性ラット細胞とＭＥＫインヒビターを含む培養培地とを含む、多能性ラット細胞の培養物。
【請求項２２】
前記培地が、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項２１に記載の培養物。
【請求項２３】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２のうち２つ以上を発現する、多能性マウス細胞以外の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２４】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項２３に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２５】
さらにアルカリフォスファターゼを発現する、請求項２３または２４に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２６】
Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項２３から２５のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２７】
前記多能性細胞がＦＧＦ５を発現しない、請求項２３から２６のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２８】
前記多能性哺乳動物細胞が、培養物中で形態的に未分化である、請求項２３から２７のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項２９】
前記多能性哺乳動物細胞が、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る、請求項２３から２８のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３０】
前記多能性哺乳動物細胞が、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る、請求項２３から２９のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３１】
前記多能性哺乳動物細胞の子孫が、培養物中で維持された後に、原多能性哺乳動物細胞の特性を保持する、請求項２９または３０に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３２】
前記多能性哺乳動物細胞がキメラに寄与し得る、請求項２３から３１のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３３】
前記キメラの全細胞が、多能性哺乳動物細胞と同種の細胞である、請求項３２に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３４】
前記多能性哺乳動物細胞がキメラの生殖系列に寄与し得る、請求項３２または３３に記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３５】
前記多能性細胞が、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る、請求項２３から３４のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３６】
前記細胞が培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得る、請求項２３から３５のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３７】
前記多能性哺乳動物細胞が、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない、請求項２３から３６のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３８】
前記多能性哺乳動物細胞の分化が、アクチビンレセプター遮断によって誘導されない、請求項２３から３７のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項３９】
前記多能性哺乳動物細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される、請求項２３から３８のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞。
【請求項４０】
請求項２３から３９のいずれかに記載の多能性ウシ細胞。
【請求項４１】
請求項２３から３９のいずれかに記載の多能性ヒツジ細胞。
【請求項４２】
請求項２３から３９のいずれかに記載の多能性ブタ細胞。
【請求項４３】
請求項２３から４２のいずれかに記載の多能性哺乳動物細胞の集団。
【請求項４４】
細胞の少なくとも９５％が多能性細胞の特性を保持する、多能性哺乳動物細胞の集団。
【請求項４５】
前記細胞の少なくとも９５％がＮａｎｏｇおよび／またはＯｃｔ４を発現する、請求項４４に記載の多能性哺乳動物細胞の集団。
【請求項４６】
多能性哺乳動物細胞とＭＥＫインヒビターとを含む培養培地を含む、多能性哺乳動物細胞の培養物。
【請求項４７】
前記培地が、ＧＳＫ３インヒビターおよび／またはＦＧＦレセプターのアンタゴニストをさらに含む、請求項４６に記載の培養物。
【請求項４８】
胚盤胞から多能性ラット細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）ＭＥＫインヒビターおよびＧＳＫ３インヒビターの存在下で該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊の一次派生物を単離および解離する工程；
（４）該内部細胞塊の解離した一次派生物から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項４９】
胚盤胞から多能性哺乳動物細胞を誘導する方法であって、
（１）胚盤胞を得る工程；
（２）該胚盤胞を培養して、内部細胞塊を得る工程；
（３）該内部細胞塊を解離する工程；
（４）該解離した内部細胞塊から１または複数の細胞を単離する工程；および
（５）該単離した１または複数の細胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよびＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程、
を含む、方法。
【請求項５０】
前記胚盤胞をＬＩＦ中で培養する工程を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記胚盤胞を、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在下で培養する工程を含む、請求項４８から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記胚盤胞がラット胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記胚盤胞がウシ胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記胚盤胞がヒツジ胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記胚盤胞がブタ胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記胚盤胞が、ＥＳ細胞の誘導に対して非許容的であるマウス系統由来のマウス胚盤胞である、請求項４９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記工程（４）の前記１または複数の細胞が、前記内部細胞塊の解離した一次派生物から単離される、請求項４９から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記多能性細胞が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち１つ以上を発現する、請求項４８から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記多能性細胞が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＦＧＦ４、Ｓｏｘ−２およびアルカリフォスファターゼのうち任意の２つ以上を発現する、請求項４８から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記多能性細胞が、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項４８から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記多能性細胞が、さらにアルカリフォスファターゼを発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記多能性細胞が、Ｒｅｘ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＦＧＦ４およびＳｏｘ−２を発現する、請求項４８から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記多能性細胞が、ＦＧＦ５を発現しない、請求項４８から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記多能性細胞が、培養物中で形態的に未分化である、請求項４８から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記多能性細胞が、培養物中で約２週間以上にわたって維持され得る、請求項４８から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記多能性細胞が、培養物中で約６ヶ月以上にわたって維持され得る、請求項４８から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記多能性哺乳動物細胞の子孫が、培養物中で維持された後に、原多能性哺乳動物細胞の特性を保持する、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記多能性細胞がキメラに寄与し得る、請求項４８から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
前記キメラの全細胞が、多能性哺乳動物細胞と同種の細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記多能性細胞がキメラの生殖系列に寄与し得る、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記多能性細胞が、３つの胚葉のすべてから分化した細胞が存在する奇形腫または奇形癌を形成し得る、請求項４８から７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記多能性細胞が、培養物中で単一細胞として増殖および／または繁殖し得る、請求項４８から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記多能性細胞が、アクチビンおよび／またはＦＧＦの存在下で分化が誘導されるかまたは増殖しない、請求項４８から７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記多能性哺乳動物細胞の分化が、アクチビンレセプター遮断によって誘導されない、請求項４８から７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記多能性哺乳動物細胞の増殖および／または繁殖が、ＭＥＫインヒビター、ＧＳＫ３インヒビターおよび必要に応じてＦＧＦレセプターのアンタゴニストの存在によって支持される、請求項４８から７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
請求項４８から５２または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ラット多能性細胞。
【請求項７７】
請求項４８から５１、５３、または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ウシ多能性細胞。
【請求項７８】
請求項４８から５１、５４、または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ヒツジ多能性細胞。
【請求項７９】
請求項４８から５１、５５、または５７から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、ブタ多能性細胞。
【請求項８０】
請求項４８から５１または５６から７５のいずれかに記載の方法によって得られる、非許容的であるマウス系統由来のマウス多能性細胞。
【請求項８１】
請求項７６から８０のいずれかに記載の多能性細胞の集団。
【請求項８２】
前記１または複数の多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項１から４７または７６から８１のいずれかに記載の細胞、集団または培養物。
【請求項８３】
前記１または複数の多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項４８から７５のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
遺伝子操作ラットを得る方法であって、ラット多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞をラット胚に導入して遺伝子改変ラットを産生する工程を含む、方法。
【請求項８５】
マウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物を得る方法であって、哺乳動物多能性細胞を遺伝子改変する工程および該多能性細胞を非ヒト哺乳動物胚に導入して遺伝子改変哺乳動物を産生する工程を含む、方法。
【請求項８６】
前記遺伝子操作哺乳動物が、目的の遺伝子についてのホモ接合性ヌルである、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記遺伝子改変する工程が、ラットまたは非ヒト哺乳動物中の遺伝子の対応するヒト遺伝子への置換を含む、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記遺伝子改変する工程が、１以上の目的の遺伝子のノックアウトを含む、請求項８４から８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記遺伝子改変する工程が、目的の遺伝子の標的挿入を含む、請求項８４から８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
請求項８４から８９のいずれかに記載の方法によって得られる、遺伝子操作ラット。
【請求項９１】
請求項８４から８９のいずれかに記載の方法によって得られる、マウス以外の遺伝子操作非ヒト哺乳動物。
【請求項９２】
１以上の目的の遺伝子の生理学的な役割の評価における、請求項９０に記載の遺伝子操作ラットまたは請求項９１に記載の遺伝子操作非ヒト哺乳動物の使用。
【請求項９３】
創薬および／または試験における、請求項９０に記載の遺伝子操作ラットまたは請求項９１に記載の遺伝子操作非ヒト哺乳動物の使用。
【請求項９４】
ヒトまたは動物疾患のモデルとしての、請求項９０に記載の遺伝子操作ラットまたは請求項９１に記載の遺伝子操作非ヒト哺乳動物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ１】
【図１４ｄ２】
【図１４ｄ３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１１ｄ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１２ｄ】
【図１２ｅ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１４ｄ１】
【図１４ｄ２】
【図１４ｄ３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公表番号】特表２００９−５４５３０２（Ｐ２００９−５４５３０２Ａ）
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２２３２８（Ｐ２００９−５２２３２８）
【出願日】平成１９年８月１日（２００７．８．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００２９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１５４１８
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５００２１９６１８）ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (21)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１日（２００７．８．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００２９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１５４１８
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５００２１９６１８）ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (21)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ
【Ｆターム（参考）】
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