ラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置
【課題】検出面の増強電場の増強度によらず、被検体の量や試料中の濃度を定量的に検出することができるラマンスペクトル検出方法を提供することにある。
【解決手段】被検体から生じるラマンスペクトルのとは異なるを１つ以上持つラマンスペクトルが既知のリファレンス物質と被検体とを混合した液体試料を検出面に接触させる液体試料接触ステップと、液体試料が接した検出面に励起光を照射し、液体試料から発生するラマン散乱光を検出する散乱光検出ステップと、散乱光検出ステップで検出したラマン散乱光のスペクトルから、リファレンス物質のラマンスペクトルと被検体のラマンスペクトルとを抽出し、リファレンス物質のラマンスペクトルに基づいて被検体のラマンスペクトルを規格化する規格化ステップとを有することで上記課題を解決する。
【解決手段】被検体から生じるラマンスペクトルのとは異なるを１つ以上持つラマンスペクトルが既知のリファレンス物質と被検体とを混合した液体試料を検出面に接触させる液体試料接触ステップと、液体試料が接した検出面に励起光を照射し、液体試料から発生するラマン散乱光を検出する散乱光検出ステップと、散乱光検出ステップで検出したラマン散乱光のスペクトルから、リファレンス物質のラマンスペクトルと被検体のラマンスペクトルとを抽出し、リファレンス物質のラマンスペクトルに基づいて被検体のラマンスペクトルを規格化する規格化ステップとを有することで上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体を載置した検出面に励起光を照射し、検出面に増強場を発生させた状態で被検体のラマン散乱光を検出するラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光法は、物質に単波長の光を照射して得られるラマン散乱光を分光して、ラマン散乱光のスペクトルを得る方法であり、物質の同定等に利用されている。ラマン分光法は、生体サンプルなどの測定（例えば、同定）に用いることができる。
また、特許文献１のラマン分光法による基質の定量分析方法に記載されているように、測定物質の濃度とラマン散乱光の強度との間には、相関関係があるため、ラマン散乱光の強度から被検体の濃度や量を検出することもできる。
【０００３】
ここで、通常、物質（つまり被検体）から得られるラマン散乱光は信号が微弱であるため高感度で検出することが困難である。
これに対して、特許文献２に記載されている局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの金属微粒子を多数配置され、光が照射されることで増強電場を形成し、ラマン散乱光を増幅させる検出面が形成された金属ナノ構造体（または微細構造体）を用いる方法がある。
このように検出面に増強電場を発生させてラマン散乱光の信号強度を大きくするＳＥＲＳ（表面増強ラマン）方式を用いることで、低濃度等により検出面上の被検体が少なくても被検体の検出が可能になる。
【０００４】
また、特許文献３には、ＳＥＲＳ方式で被検体を検出する方法であって、被検体のラマン散乱光の信号を抽出するために、検出した全体の信号から、被検体のラマン散乱光以外の信号（第２の信号）を除去する方法が記載されている。なお、第２の信号は、処理装置に記憶させているデータであり、被検体を載置していない状態で、ラマン散乱光を検出することにより検出すると記載されている。
【０００５】
また、特許文献４には、被測定物質に、被測定物質とは異なるラマン散乱光を射出する液状物質を付着させ、その後、被測定物質に光を照射してラマン散乱光を測定する方法が記載されている。この方法では、光を被測定物質内で多重反射の効果が生じ、強度の大きなラマンスペクトルを検出することができると記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２５８３４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１７２５６９号公報
【特許文献３】米国特許第６８８８６２９号明細書
【特許文献４】特開２００３−９８０９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ここで、生体分子の測定等では、被検体の量、濃度を測定する場合があるが、金属ナノ構造で発生させた増強電場でラマン散乱光を増強するＳＥＲＳ方式は、金属ナノ構造により信号の増強度が決まるため、金属ナノ構造に構造のバラツキが多いと、信号のバラツキも大きくなる。つまり、測定に用いる金属ナノ構造体毎に増強電場の強度が異なったり、１つの金属ナノ構造体の位置（または領域）毎に増強電場の強度が異なったりすると増強されるラマン散乱光の信号もばらついてしまう。
このように信号がばらついてしまうと、定量的に被検体の量、濃度を測定することが困難となる。
このため、金属ナノ構造を均一に作製するための多くの手法が提案されているが、完全に均一な金属ナノ構造を作製することは不可能であり、信号強度の均一性には限界があった。
【０００８】
また、特許文献３に記載の方法は、被検体のラマンスペクトルのみを検出するための方法であるため、被検体の定量的に測定することは記載されていないが、処置装置に記憶させたデータを用いる場合も、金属ナノ構造体毎に検出値が変化するため、同様に被検体を定量的に測定することは困難である。
また、仮に、被検体以外の物質に起因するラマンスペクトルは取り除くことはできても増強電場による増強度を検出することはできない。したがって、この点においても被検体を定量的に測定することは困難である。
【０００９】
また、特許文献４は、金属ナノ構造体を用いずに、強度の小さい入射光でラマン分光している装置であり、ＳＥＲＳ活性な金属ナノ構造体の不均一性が原因となる信号強度のばらつきを抑制することはできない。
また、特許文献４に記載のように液体により多重散乱をさせる方法は、ＳＥＲＳ方式で測定する方法よりもラマンスペクトルの増強効果が低いため、測定感度が低くなるという問題もある。
【００１０】
本発明の目的は、上記従来技術に基づく問題点を解消し、検出面の増強電場の増強度によらず、被検体の量や試料中の濃度を定量的に検出することができるラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明は、被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、前記被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質と前記被検体とを混合した液体試料を前記検出面に接触させる液体試料接触ステップと、前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出ステップと、前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法を提供するものである。
ここで、本発明において、ラマンスペクトルには、波形の全体のみならず、いずれかのピークのみのスペクトル分布も含む。
【００１２】
ここで、前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化することが好ましい。
また、前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同時に同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化することが好ましい。
さらに、液体試料が接触している前記検出面を乾燥させる乾燥ステップを有し、前記散乱光検出ステップは、前記液体試料を接触させた後、乾燥させた前記検出面に励起光を照射し、乾燥した液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出することが好ましい。
また、前記リファレンス物質は、前記被検体から生じる前記ラマンスペクトルの半値幅と異なる半値幅を持つ前記ラマンスペクトルを生じる物質であることが好ましい。
【００１３】
また、上記課題を解決するために、本発明は、被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する第１液体試料を前記検出面に接触させる第１液体試料接触ステップと、前記第１液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記検出面およびその近傍から生じる第１ラマン散乱光を、前記第１ラマンスペクトルの信号として検出する第１散乱光検出ステップと、前記被検体を含有する第２液体試料を前記検出面に接触させる第２液体試料接触ステップと、前記第２液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記検出面の前記第１散乱光を検出した領域と同一領域およびその近傍前記第２液体試料から生じる第２ラマン散乱光を、前記第２ラマンスペクトルの信号として検出する第２散乱光検出ステップと、前記第１散乱光検出ステップで検出した前記リファレンス物質の前記第１ラマンスペクトルの信号強度に基づいて前記第２散乱光検出ステップで検出した前記被検体の前記第２ラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法を提供するものである。
【００１４】
また、上記課題を解決するために、本発明は、励起光が照射されることで増強場を発生させる検出面が形成された基体と、この基体の前記検出面に、被検体、およびこの被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する液体試料を接触させる液体試料接触手段と、前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射する光照射手段と、前記励起光が照射された前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出手段と、前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化手段とを有することを特徴とするラマンスペクトル検出装置を提供するものである。
ここで、前記規格化手段は、さらに、規格化した前記被検体のラマンスペクトルの信号強度から前記被検体を同定し、前記被検体の量および前記液体試料中の濃度を算出することが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、表面増強ラマンにより、高い感度で被検体のラマンスペクトルを検出することができ、かつ、微細構造体の検出面に発生する増強電場の強度によらず、信号強度を規格化した被検体のラマンスペクトルの信号を検出することができる。これにより、高い精度で正確に被検体を同定し、さらに被検体の量及び濃度を検出することができる。
また、微細構造体の検出面に発生する増強電場の強度のよらず、高い精度で信号強度を規格化した被検体のラマンスペクトルの信号を検出できることで、微細構造体の製造誤差の許容範囲を大きくすることができ、歩留まりを高くし、かつ製造コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係るにラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置について、添付の図面に示す実施形態を基に詳細に説明する。
【００１７】
図１は、の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示した微細構造体の概略構成を示す斜視図である。
【００１８】
図１は、本発明のラマンスペクトル検出方法を用いる本発明のラマンスペクトル検出装置本発明の一実施形態であるラマンスペクトル検出装置１０の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示したラマンスペクトル検出装置１０の微細構造体１２の概略構成を示す上面図である。
【００１９】
図１に示すように、ラマンスペクトル検出装置１０は、微細構造体１２と、微細構造体１２に光を照射する光照射手段１４と、微細構造体１２で反射された反射光を検出する光検出手段１６と、微細構造体１２を支持するチップ支持手段１８と、被検体６０を一定量のリファレンス物質（参照物質ともいう。）６２とを含有する液体試料Ｓを微細構造体１２に滴下する液体試料滴下手段２０と、光検出手段１６の検出結果から被検体６０のラマンスペクトルの信号及び参照物質６２のラマンスペクトルの信号を抽出し、規格化する算出手段２２と、算出手段２２での算出結果を表示する表示手段２４とを有する。
なお、図示しないが、ラマンスペクトル検出装置１０は、微細構造体１２、光照射手段１４、光検出手段１６等の各部を覆う筐体や、ラマンスペクトル検出装置１０の内部で発生した迷光を除去するフィルタ等の各種の光学部材や、ラマンスペクトル検出装置１０の動作を制御する制御部等のラマンスペクトル検出装置１０に必要な各種の部材も有する。
【００２０】
図２に示すように、微細構造体１２は、誘電体基材３２および誘電体基材３２の一面に配置された導電体３４で構成された基体３０と、誘電体基材３２の導電体３４が配置された面とは反対側の面に配置された金属体３６とを有する。
【００２１】
基体３０は、金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）で形成された誘電体基材３２と、誘電体基材３２の一面に設けられ、陽極酸化されていない金属（Ａｌ）で形成された導電体３４とを有する。ここで、誘電体基材３２と導電体３４とは、一体で形成されている。
また、誘電体基材３２には、導電体３４が配置される面とは反対側の面から導電体３４側の面に向けて延びる略ストレートな形状（直管形状）の微細孔４０が複数の開孔されている。
複数の微細孔４０は、導電体３４が配置される面とは反対側の面側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通して開口が形成され、導電体３４側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通していない。つまり、微細孔４０は、導電体３４までは到達していない孔となる。また、複数の微細孔４０は、励起光の波長より小さい径及びピッチで略規則的に配列されている。
ここで、励起光として可視光を用いる場合は、微細孔４０の配置ピッチを２００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００２２】
金属体３６は、誘電体基材３２の微細孔４０内に充填されている充填部４５と、微細孔４０上に誘電体基材３２の表面より突出して形成され、充填部４５の外径よりも大きい外径を有し、局在プラズモンを誘起し得る大きさの突出部（つまり凸部）４６とからなる複数の棒部４４で構成されている。ここで、金属体３６を形成する材料としては、局在プラズモンを発生させる種々の金属を使用でき、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金等が挙げられる。また、金属体３６は、これらの金属を２種以上含むもので形成してもよい。また、電場増強効果をより高くすることができるため、金属体３６は、Ａｕ、Ａｇ等を用いて形成することがより好ましい。
また、金属体３６の複数の棒部４４は、突出部４６と隣接する突出部４６との離間距離を、数１０ｎｍ以下とすることが好ましい。
また、突出部４６同士の間隔を数１０ｎｍ以下とすることで、励起光の照射時に、突出部４６同士が近接している領域で、非常に増強された電場を形成することができる。なお、この突出部４６同士の間隔が数１０ｎｍ以下で、非常に増強された電場が形成される領域をホットスポットという。
微細構造体１２は、以上のような構成であり、金属体３６の複数の棒部４４の突出部４６が配置される面が、液体試料Ｓが接触する面、つまり、検出面１２ａとなる。
【００２３】
ここで、微細構造体１２の作製方法について説明する。
図３（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体１２の作製方法の一例を示す工程図である。
まず、図３（Ａ）に示すような直方体形状の被陽極酸化金属体４８に陽極酸化処理を行う。具体的には、被陽極酸化金属体４８を陽極とし、陰極と共に電解液に浸漬させ、陽極陰極間に電圧を印加することで陽極酸化する。
ここで、陰極としては、カーボンやアルミニウム等が使用される。電解液としては制限されず、硫酸、リン酸、クロム酸、シュウ酸、スルファミン酸、ベンゼンスルホン酸、アミドスルホン酸等の酸を、１種又は２種以上含む酸性電解液が好ましく用いられる。
なお、本実施形態では、被陽極酸化金属体４８を直方体形状としたが、その形状は制限されず、種々の形状とすることができる。また、支持体の上に被陽極酸化金属体４８が層状に成膜されたものなど、支持体付きの形態で用いることできる。
【００２４】
被陽極酸化金属体４８を陽極酸化すると、図３（Ｂ）に示すように、被陽極酸化金属体の表面から該面に対して略垂直方向に酸化反応が進行し、誘電体基材３２となる金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）が生成される。陽極酸化により生成される金属酸化物体（つまり、誘電体基材３２）は、多数の平面視略正六角形状の微細柱状体４２が隙間なく配列した構造を有するものとなる。
また、各微細柱状体４２は、底面が丸みを帯びた形状となり、さらに、略中心部には、表面から深さ方向（つまり、微細柱状体４２の軸方向）に略ストレートに延びる微細孔４０が開孔される。陽極酸化により生成される金属酸化物体の構造は、益田秀樹、「陽極酸化法によるメソポーラスアルミナの調製と機能材料としての応用」、材料技術Vol.15,No.10、1997年、p.34等に記載されている。
【００２５】
また、規則配列構造の金属酸化物体を生成する場合の好適な陽極酸化条件例としては、電解液としてシュウ酸を用いる場合、電解液濃度０．５Ｍ、液温１４〜１６℃、印加電圧４０〜４０±０．５Ｖ等が挙げられる。この条件で生成される微細孔４０は例えば、径が約３０ｎｍ、ピッチが約１００ｎｍである。
【００２６】
次に、誘電体基材３２の微細孔４０に電気メッキ処理を施すことにより、図３（Ｃ）に示すように、充填部４５と突出部４６とからなる棒部４４を形成する。
ここで、電気メッキを行うと、導電体３４が電極として機能し、電場が強い微細孔４０の底部から優先的に金属が析出する。この電気メッキ処理を継続して行うことにより、微細孔１２内に金属が充填されて棒部４４の充填部４５が形成される。充填部４５が形成された後、更に電気メッキ処理を続けると、微細孔４０から充填金属が溢れるが、微細孔４０付近の電場が強いことから、微細孔４０周辺に継続して金属が析出していき、充填部４５上に誘電体基材３２の表面より突出し、充填部４５の径よりも大きい径を有する突出部４６が形成される。
【００２７】
なお、本実施形態の微細構造体１２は、陽極酸化を利用して製造されたものであるので、誘電体基材３２の微細孔４０及び金属体３６の突出部４６が略規則配列された微細構造体１２を簡易に製造できる。また、これら微細孔の配列をランダム配列にすることもできる。
【００２８】
また、本実施形態では、誘電体基材３２の製造に用いる被陽極酸化金属体４８の主成分としてＡｌのみを挙げたが、陽極酸化可能で生成される金属酸化物であれば、任意の金属が使用できる。Ａｌ以外では、Ｔｉ、Ｔａ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｓｉ、Ｉｎ、Ｚｎ等が使用できる。被陽極酸化金属体４８は、陽極酸化可能な金属を２種以上含むものであってもよい。
微細構造体１２は以上のようにして作製される。
【００２９】
次に、光照射手段１４は、レーザ光源等の光源と光源から出射される励起光Ｌｅを導光する導光系とからなり、特定波長の光（励起光）Ｌｅを射出し、射出した励起光Ｌｅを微細構造体１２の検出面に照射する。
【００３０】
光検出手段（つまり分光手段）１６は分光検出器等からなり、光照射手段１４から励起光が照射されることにより微細構造体１２の検出面で発生する散乱光が入射する位置に配置されている。
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面１２ａで発生する散乱光を分光し、ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出する。
【００３１】
支持手段１８は、台座等であり、微細構造体１２を導電体３４側から支持し、所定位置に固定する。また、支持手段１８は、微細構造体１２に液体が滴下された場合に、液体が微細構造体１２上からこぼれないように、微細構造体１２の側面の外周を覆う囲いを有する。
【００３２】
液体試料滴下手段２０は、被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留する貯留部２０ａと、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓを微細構造体１２に滴下する滴下部２０ｂと、貯留部２０ａに参照物質６２を一定量混入させる参照物質混入部２０ｃとで構成され、微細構造体１２の検出面に対向して配置されている。
【００３３】
貯留部２０ａは、被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留する容器である。この貯留部２０ａは、一定量の液体試料Ｓを貯留している。
ここで、被検体６０が液体に含有されていない物質である場合は、被検体６０を溶媒に分散させて液体試料Ｓを作製すればよい。なお、被検体を分散する溶媒としては、種々の溶媒を用いることができ、例えば、水、エタノールや、種々の物質を溶解させた水溶液（例えば、クエン酸水溶液）等が挙げられる。ここで、本実施形態の場合は、溶媒として、揮発性の溶媒を用いることが好ましく、具体的には、エタノールを用いることが好ましい。
滴下部２０ｂは、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓを一定量微細構造体１２に滴下する。ここで、滴下部２０ｂとしては、スポイト等を用いることができる。
参照物質混入部２０ｃは、物性が既知の参照物質６２を保持しており、一定量の参照物質６２を貯留部２０ａに混入する。なお、参照物質混入部２０ｃは、参照物質を固体の状態で保持していても、液体の状態で保持していてもよい。
ここで、参照物質６２は、ラマンスペクトルが既知の物質であり、また被検体６０（より正確には、被検体６０として検出されうる物質）のラマンスペクトルのピークとは異なるピークを１つ以上持つラマンスペクトルを射出する物質である。つまり、参照物質は、被検体６０からは、射出されない波数のラマン散乱光を射出する物質である。参照物質としては、ラマン散乱光を発生させる種々の物質を用いることができ、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳ、キーバンド６７０ｃｍ−１のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、キーバンド６８０ｃｍ−１のＤＭＳＯ、キーバンド１３６０ｃｍ−１のＲ６Ｇ等を用いることができる。
液体試料滴下手段２０は、以上のような構成であり、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓに一定量の参照物質を混入した後、滴下部２０ｂにより所定量の液体試料Ｓを微細構造体１２の検出面１２ａ上に滴下する。
【００３４】
算出手段２２は、光検出手段１６から送られたデータを演算処理する演算部２６と、光検出手段１６から送られたデータや、演算部２６での演算結果、参照物質毎のラマンスペクトル等を記憶する記憶部２８とを有し、光検出手段１６で検出したラマンスペクトルの信号から被検体のラマンスペクトルの信号を抽出しかつ規格化し、規格化した結果から、被検体を同定し、被検体の量または濃度を算出する。
【００３５】
表示手段２４は、液晶ディスプレイ等の画像を表示する装置であり、算出手段２２から送られた算出結果、ラマンスペクトル等の情報を表示する。
ラマンスペクトル検出装置１０は、基本的に以上のような構成である。
【００３６】
以下、ラマンスペクトル検出装置１０の作用について説明することで、本発明のラマンスペクトル検出装置および被検体検出方法についてより詳細に説明する。
ここで、図４（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明の被検体検出方法の一実施形態を示す工程図である。
【００３７】
まず、微細構造体１２を支持手段１８の所定位置に載置し、所定位置に固定する。
また、液体試料滴下手段２０は、貯留部２０ａに貯留されている一定量の液体試料Ｓに参照物質混入部２０ｃから一定量の参照物質６２を投入する。これにより、貯留部２０ａ内に物性（具体的にはラマンスペクトル）が既知の参照物質６２が既知の濃度で混合され、かつ、検出対象である被検体６０を含有する液体試料Ｓが作製される。
次に、図４（Ａ）に示すような微細構造体１２の検出面１２ａ上に、液体試料滴下手段２０から液体試料Ｓを微細構造体１２の検出面１２ａ上に滴下する。
これにより、液体試料Ｓを微細構造体１２と支持手段１８とで貯留し保持している状態となり、図４（Ｂ）に示すように、微細構造体１２の検出面１２ａに被検体６０と参照物質６２を含有する液体試料Ｓが接触している状態となる。
【００３８】
次に、検出面１２ａを乾燥させて、接触している液体試料の液体成分（溶媒）を除去する。これにより、図４（Ｃ）に示すように、突出部４６の周りに被検体６０及び参照物質６２が付着した状態となる。
【００３９】
次に、光照射手段１４から励起光Ｌｅを射出し、被検体６０及び参照物質６２が付着している検出面１２ａを照明する。
【００４０】
微細構造体１２の検出面１２ａは、光照射手段１４から射出された光で照明されることで、金属体３６の突出部４６の表面で局在プラズモンが発生し、増強された電場が形成される。
さらに、微細構造体１２では、金属体３６の突出部４６の表面で電場をより増強させる局在プラズモン共鳴も効果的に発生する。ここで、局在プラズモン共鳴は、局在プラズモンにより局在的に集団運動している金属の自由電子が光の電場に共鳴して振動することで電場がより増強される現象である。微細構造体の凹凸形状である突出部４６（つまり凸部）では、入射した光の波長と凹凸形状の大きさとが一致した領域で、突出部４６の自由電子が光の電場に共鳴して振動し、入射された光が高い効率で電場に変化され、突出部４６の周辺の電場がより増強される。
このように、微細構造体では、検出面で電場増強効果を得ることができ、増強された電場が形成される。なお、微細構造体は、電場をより強くすることができるため、突出部で局在プラズモン共鳴が発生するように励起光の波長、突出部の大きさを設計、調整することが好ましいが、少なくとも突出部に局在プラズモンが発生すればよい。
【００４１】
また、検出面１２ａの被検体６０及び参照物質６２は、特定波長の励起光が入射されることによりそれぞれラマン散乱光を発生させる。被検体６０及び参照物質６２によりそれぞれ発生されたラマン散乱光は、局在プラズモンに起因して発生された増強電場によって増強される。つまり、ラマン散乱光は、ラマン増強効果により増強される。ここで、被検体６０から射出されるラマン散乱光は、検出する被検体の種類によってスペクトルが変化する。
【００４２】
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面１２ａの散乱光を分光し、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）の信号を検出する。その後、検出したラマンスペクトルの信号を算出手段２２に送る。
【００４３】
ここで、図５は、算出手段２２による被検体の量または濃度を算出する工程を示すフロー図である。
算出手段２２は、まず、演算部２６が、参照物質混入部２０ａで混入した参照物質６２の情報に基づいて、記憶部２８から参照物質６２のラマンスペクトル（の波形形状）を読み出す（ステップＳ１０）。
【００４４】
次に、検出されたラマンスペクトルの信号から、読み出した参照物質６２に起因するラマンスペクトルの信号を取り除き、被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号を抽出する（ステップＳ１２）。具体的には、検出されたラマンスペクトルの信号と、読み出した参照物質６２に起因するラマンスペクトルのピークや、スペクトル分布に基づいてマッチングさせ、その結果重複した波長領域のラマンスペクトルの信号を検出されたラマンスペクトルの信号から取り除くことで被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号を抽出する。
【００４５】
次に、検出されたラマンスペクトルの信号と読み出した参照物質６２のラマンスペクトルの信号とをマッチングした結果に基づいて、被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号を規格化する（ステップＳ１４）。具体的には、検出したラマンスペクトルの信号に含まれる参照物質のラマンスペクトルの信号の信号強度と参照物質の既知の濃度との関係に基づいて、検出したラマンスペクトルの信号から抽出した被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号の信号強度を規格化する。
【００４６】
次に、規格化した被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号と、記憶部２８に記憶されている種々の物質のラマンスペクトルとを比較して被検体の種類を検出し、さらに、規格化されたラマンスペクトルの信号に基づいて、被検体の量、濃度を算出する（ステップＳ１６）。なお、濃度は、さらに、液体試料滴下手段２０から滴下された液体試料の量を加味することで算出することができる。
【００４７】
算出手段２２で算出した被検体の種類および被検体の量、濃度を表示手段２４で表示する。
ラマンスペクトル検出装置１０は、以上のようにして被検体を同定し、量及び濃度を算出する。
【００４８】
このように、ラマンスペクトル検出装置１０は、液体試料Ｓに、ラマンスペクトルが既知の参照物質６２を一定量混在させることで、参照物質６２のラマンスペクトルの信号強度に基づいて被検体６０のラマンスペクトルの信号強度を規格化することができる。
これにより、微細構造体の検出面に形成される突出部にバラツキがあり、検出面に形成される増強電場が微細構造体毎に不均一となり、ＳＡＲＳによるラマン散乱光の増強度が不均一となっても、高い精度で定量的に被検体を検出することができる。
また、参照物質６２として被検体６０のラマンスペクトルのピークとは異なるピークを１つ以上持つラマンスペクトルを生じる物質を用いることで、参照物質６２のラマンスペクトルと被検体６０とラマンスペクトルを混在させることなく、検出したラマンスペクトルの信号から両方のラマンスペクトルの信号を抽出することができる。
また、微細構造体の検出面での増強電場が不均一であっても高い精度で定量的に被検体を検出できることで、検出面で発生させる増強電場が不均一な微細構造体も、つまり、異なる強度の増強電場を発生させる微細構造体も用いることができる。これにより、利用できる微細構造体の許容範囲を大きくすることができ、歩留まりを高くすることができ、製造コストを抑制することができる。
【００４９】
以下、具体的実施例とともに本発明についてより詳細に説明する。
ここで、本具体例では、被検体としてキーバンドが７３０ｃｍ−１のアデニンを用い、キーバンド６８０ｃｍ−１のＤＭＳＯを参照物質とした。なお、本具体例では、濃度既知のＤＭＳＯが液体試料Ｓの溶媒としての役割も有する。また、液体試料は、アデニンの濃度を１００μＭとした。
また、微細構造体として、上述した図２に示す構造の微細構造体１２を用い、光照射手段１４として、出力２ｍＷ、励起波長６３３ｎｍの半導体レーザを用い、光検出手段１６として、顕微ラマン分光装置（堀場ジョバンイボン社製、ＬａｂＬＡＭ ＨＲ−８００）を用いた。
ここで、本具体例では、１つの検出面において、測定点１〜９の９つの測定点で７３０ｃｍ−１と６８０ｃｍ−１の信号強度を測定した。つまり、被検体と参照物質の濃度が同一の液体試料について、９つの測定点で測定を行った。
さらに、算出した７３０ｃｍ−１と６８０ｃｍ−１の信号強度を用いて、測定点毎に、７３０ｃｍ−１の信号強度を６８０ｃｍ−１の信号強度で規格化した値を算出した。
また、９つの測定点における７３０ｃｍ−１の信号強度の平均値と、７３０ｃｍ−１の信号強度のみで算出した標準偏差と、７３０ｃｍ−１の信号強度を６８０ｃｍ−１の信号強度で規格化した値の平均値と、標準偏差を算出した。
測定結果及び算出結果を下記表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１に示すように、アデニン（被検体）の信号強度（７３０ｃｍ−１の信号強度）をＤＭＳＯ（参照物質）の信号強度（６８０ｃｍ−１の信号強度）で規格化することで、被検体の信号強度の強さによらず、被検体を定量的に算出することができる。つまり、濃度既知の参照物質を基準とすることで、信号強度が大きい場合も小さい場合も定量的な測定が可能となる。つまり、微細構造体によるラマン散乱光の増強度によらず、被検体を定量的に検出することができる。
具体的には、同一濃度の被検体を測定しても、増強度によって、測定点７の場合は、信号強度が４５２となり、測定点３の場合は、１４１６となる。これに対して、参照物質の信号強度で規格化することで、測定点７の場合は、１．２４５となり、測定点３の場合は、２．３６０となる。このように、単に被検体の信号強度を測定した場合よりも差を小さくすることができる。
以上より、規格化することで、微細構造体の増強度により信号強度がばらついた場合も、濃度既知の参照物質により微細構造体の増強度を加味することができ、定量的な測定を行うことができることがわかる。
また、参照物質で規格化することで、バラツキを低減することもできる。具体的には、標準偏差のバラツキを０．３９９から０．２６６に小さくすることができる。
以上より本発明の効果は明らかである。
【００５２】
ここで、参照物質６２は、被検体６０とラマンスペクトルの半値幅も異なる物質であることが好ましい。参照物質６２を被検体６０のラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持ち、かつ半値幅も異なるラマンスペクトルのピークを生じる物質とすることで、光検出手段１６で検出したラマンスペクトルの信号から参照物質６２に起因するラマンスペクトルの信号と被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号とをより正確に抽出することができる。
また、参照物質６２は、ラマンスペクトルの波数が、被検体６０から生じるラマンスペクトルのピークと半値幅の２倍以上異なることが好ましい。両物質からそれぞれ生じるラマンスペクトルのピークが半値幅の２倍以上ことなることで、さらに的確に各ラマンスペクトルを抽出することができる。
【００５３】
さらに、参照物質６２には、被検体６０と同程度の強度のラマンスペクトルを射出する物質を用いることが好ましい。参照物質６２と被検体６０とから射出されるラマンスペクトルを同程度とすることで、被検体６０のラマンスペクトルの信号強度をより正確に規格化することができる。
【００５４】
また、参照物質混入部２０ｃは、複数の参照物質６２を有することが好ましく、被検体６０（または被検体６０と想定される物質）の種類（スペクトル強度、波数）に応じて、液体試料Ｓに混入する参照物質６２を選択することが好ましい。
このように、参照物質を選択することで、より適切に被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し規格化することができ、被検体を高い精度で定量的に検出することができる。
なお、参照物質を混入していない状態で、被検体のラマンスペクトルの信号を検出し、その検出値に応じて、最適な参照物質を特定してもよい。これにより、より適切な参照物質を選択することができる。
【００５５】
ここで、ラマンスペクトル検出装置１０は、微細構造体１２の突出部４６に特異的結合物質を固定することが好ましい。
微細構造体の突出部に特異的結合物質を配置することで、微細構造体の突出部と特定の被検体（つまり、特異的結合物質と結合する特性を有する被検体）とを結合させることができる。
なお、この場合は、被検体と特異的に結合する特異的に結合する特異的結合物質と、参照物質と特異的に結合する特異的結合物質の２種類の特異的結合物質を設けることが好ましい。被検体と参照物質に対して別々の特異的結合物質を設けることで、一方の物質により他方の物質が結合できず、検出値と実際の値がずれることを防止できる。
また、１種類の特異的結合物質に被検体６０と参照物質６２を結合させる場合は、特異的結合物質に被検体６０と参照物質６２とを同程度付着させるために、被検体６０と参照物質６２とは、一方の物質が他方の物質よりも特異的結合物質に対する結合力が過剰に強くないこと（つまり、結合力の比率が一定範囲内にあること）が好ましい。
【００５６】
特異的結合物質としては、以下のような物質を用いることができる。
被検体が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体とイオン結合する特異的結合物質としては、被検体と反対荷電を有する表面修飾基を用いることができ、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、第４級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジニウム基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
また、被検体が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体と共有結合する特異的結合物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクニンイミジルエステル等の反応性エステル基、カルボジイミド基、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基、ヒドラジド基、チオール基（スルファニル基）、反応性ジスルフィド基、マレイミド基、アルデヒド基、エポキシド基（エポキシ基）、（メタ）アクリレート基、ヒドロキシル基（ヒドロキシ基）、イソシアネート基、イソチオシアネート基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
ここで、特異的結合物質としては、例示した表面修飾基の中でも、反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等を用いることが好ましい。
なお、上記記載中、「反応性」とは被検体と反応性を有することを意味する。
【００５７】
さらに、突出部には、被検体とイオン結合する特異的結合物質及び共有結合する特異的結合物質の両方を固定することが特に好ましい。
この場合、突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とを同時に固定してもよいし、これらの特異的結合物質を順次固定してもよい。また、これらの特異的結合物質の表面修飾位置は特に制限されず、これらの特異的結合物質同士が互いに結合していてもよいし、これらの特異的結合物質が互いに独立して突出部に結合していてもよい。
【００５８】
また、突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質を固定し、さらにこの特異的結合物質を、被検体と共有結合する特異的結合物質で活性化することも特に好ましい。
例えば、はじめに突出部に被検体とイオン結合するカルボキシ基を導入し、さらに導入したカルボキシ基を反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等の被検体と共有結合する官能基の形態に誘導して、活性化することが好ましい。
被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とが互いに近接するため、１つ1つの被検体がイオン結合及び共有結合によって突出部の表面に対して強固に吸着させることができる。
【００５９】
ここで、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、７−カルボキシ−１−へプタンチオール、１６−メルカプトヘキサデカン酸、１１，１１’−チオジウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する分子；アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、及びセルロース等のヒドロゲル、又はこれらの誘導体（例えばカルボキシメチル誘導体）；ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、及びポリエチレングリコール等の水膨潤性有機ポリマー等が挙げられる。
例えば、被検体がアデニンの場合、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、及びカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等が好ましく用いられる。
【００６０】
ここで、微細構造体１２の検出面１２ａに液体試料Ｓを接触させた後、検出面１２ａを乾燥させる手段としては、種々の手段を用いることができ、滴下後、一定時間経過させることで自然乾燥させても、検出面を加熱する加熱機構を設け、積極的に溶媒を蒸発させてもよい。
【００６１】
また、ラマンスペクトル検出装置１０では、必ずしもラマン散乱光の検出時に検出面１２ａを乾燥させる必要はなく、検出面１２ａが濡れた状態、つまり液体試料Ｓの溶媒成分が検出面１２ａに接触している状態でラマン散乱光を検出してもよい。
特に、乾燥された状態では、被検体と参照物質が反応し、別の物質となる場合は、液体試料Ｓの溶媒が検出面１２ａに接触している状態でラマン散乱光を検出することが好ましい。
【００６２】
また、ラマンスペクトル検出装置１０では、液体試料Ｓに参照物質６２を混在させて、検出面の同一領域にある被検体と参照物質とのラマンスペクトルの信号を同時に検出したが、被検体のラマンスペクトルの信号と参照物質のラマンスペクトルの信号とを別々に検出してもよい。
例えば、検出面に一定濃度の参照物質を含有する液体を接触させて参照物質のラマンスペクトルの信号を検出し、その後、検出面に液体試料Ｓを接触させて被検体のラマンスペクトルの信号を検出してもよい。また逆に、検出面に液体試料Ｓを接触させて被検体のラマンスペクトルの信号を検出した後、検出面に一定濃度の参照物質を含有する液体を接触させて参照物質のラマンスペクトルの信号を検出してもよい。なお、この場合、ラマンスペクトル検出装置は、液体試料Ｓを貯留する貯留部と、参照物質を含有する液体を保持する貯留部とを別々に有する必要がある。
この場合も、被検体のラマンスペクトルの信号を検出した領域の検出面の増強電場の強度を、参照物質のラマンスペクトルの信号に基づいて、規格化することができる。したがって、参照物質のラマンスペクトルに基づいて、被検体のラマンスペクトルを規格化することで、被検体を高い精度で定量的に検出することができる。
【００６３】
ここで、被検体と参照物質のラマンスペクトルの信号を別々に検出する場合は、後で検出する物質の方が先に検出する物質よりも、突出部または特異的吸着物質と結合する結合力が高いことが好ましい。これにより、後で検出する物質の検出時に、先に検出する物質が検出面の表面に残っていても、後で検出する物質により置換することができ、後で検出する物質をより正確に検出することができる。
また、先に検出する物質を含有する液体が検出面に残っている状態で、後で検出する物質を含有する液体を滴下しても、後で検出する物質のラマンスペクトルの信号を適切に検出することができる。
【００６４】
また、微細構造体の形状は、微細構造体１２の形状に限定されず、基体上に局在プラズモンを誘起し得る大きさの凸部が形成されていればよく、種々の形状とすることができる。
【００６５】
図６（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図６（Ｂ）は、図６（Ａ）の上面図である。
図６（Ａ）及び図６（Ｂ）に示す微細構造体８０は、基体８２と基体８２上に配置された多数の金属微粒子８４とで構成されている。
基体８２は、板状の基板である。基体８２は、金属微粒子８４を電気的に絶縁して支持可能な材料で形成すればよく、材料としては、例えば、シリコン、ガラス、イットリウム安定化ジルコニア（ＹＳＺ）、サファイヤ、およびシリコンカーバイド等が挙げられる。
【００６６】
多数の金属微粒子８４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの微粒子であり、基体８２の一面上に分散された状態で固定されている。
ここで、金属微粒子８４は、上述した金属体３６で例示した各種金属で形成することができる。また、金属微粒子８４は、上述した金属微粒子６２と同様の金属微粒子でも異なる金属微粒子でもよい。また、金属微粒子の形状は特に限定されず、例えば、丸型で、直方体型でもよい。
このような構成の微細構造体８０も金属微粒子が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属微粒子の周りに局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
【００６７】
次に、図７は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
図７に示す微細構造体９０は、基体９２と基体９２上に配置された多数の金属ナノロッド９４とで構成されている。
ここで、基体９２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００６８】
金属ナノロッド９４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさであり、短軸長さと長軸長さが異なる棒状の金属ナノ粒子であり、基体９２の一面に、分散された状態で固定されている。金属ナノロッド９４は、その短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さは励起光の波長よりも小さいサイズのものである。金属ナノロッド９４は、上述した金属微粒子と同様の金属で作製することができる。なお、金属ナノロッドの詳細な構成については、例えば、特開２００７−１３９６１２号公報に記載されている。
ここで、微細構造体９０は、上述した微細構造体８０と同様の方法で作製することができる。
このような構成の微細構造体９０も金属ナノロッドが配置された検出面に励起光が照射されることで、金属ナノロットの周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体９０を用いた場合も、微細構造体１２及び微細構造体８０と同様に、微細構造体を作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００６９】
次に、図８（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図８（Ｂ）は、図８（Ａ）の断面図である。
図８に示す微細構造体１００は、基体１０２と基体１０２上に配置された多数の金属細線１０４とで構成されている。
ここで、基体１０２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００７０】
金属細線１０４は、局在プラズモンを誘起し得る線幅の線状部材であり、基体１０２の一面に格子状に配置されている。金属細線１０４は、上述した金属微粒子、金属体と同様の金属で作製することができる。また、金属細線１０４の作製方法は、特に限定されず、蒸着、メッキ等、金属配線を作製する種々の方法で作製することができる。
ここで、金属細線１０４の線幅は、具体的には５０ｎｍ以下、特に３０ｎｍ以下であることが好ましい。また、金属細線１０４の配置パターンは、特に限定されない。例えば、複数の金属細線を交差させずに、互いに平行に配置してもよい。また、金属細線の形状も直線に限定されず、曲線としてもよい。
【００７１】
このような構成の微細構造体１００も金属細線が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属細線の周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体１００を用いた場合も、微細構造体１２、微細構造体８０及び微細構造体９０と同様に、微細構造体を作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００７２】
また、微細構造体は、上述した微細構造体１２、微細構造体８０、微細構造体９０及び微細構造体１００にも限定されず、ぞれぞれの局在プラズモンを誘起し得る凸部を組み合わせた構成としてもよい。
また、基体に蒸着して金属微粒子を形成する場合は、基体上への蒸着を種々の方向から行うようにしてもよい。
ここで、微細構造体は、基体上に金属微粒子を配置してから、基体上へ、金属膜を蒸着し、凸部を形成することが好ましい。このように金属微粒子配置してから、金属膜を蒸着することで、金属微粒子の間に金属膜（微細な金属微粒子）を形成することができ、金属微粒子と金属膜とを近接させることができるため、微細構造体の検出面のホットスポットをより多くすることができる。
【００７３】
また、上記実施形態では、液体試料滴下手段により液体試料を微細構造体の検出面に滴下したが、本発明はこれに限定されず、微細構造体の表面に液体試料を供給する流路を形成し、この流路に液体試料を流すことで、検出面に液体試料を供給してもよい（つまり、検出面に液体試料を接触させてもよい）。
【００７４】
以上、本発明に係るラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置について詳細に説明したが、本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変更を行ってもよい。
【００７５】
例えば、上記実施形態では、ラマンスペクトルのピークとして、波数分布におけるピークを検出したが、分布の中の輝線（突出部）を検出できればよく、波長分布におけるピークで検出してもよい。さらに、上記実施形態では、ラマンスペクトルとして全体波形を検出したが、本発明はこれに限定されず、ラマンスペクトルとして、ピーク部分の波形のみを検出するようにしてもよい。つまり、ラマンスペクトルには、波形全体を用いることに限定されず、ピーク部分のみを用いるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明のラマンスペクトル検出方法を用いるラマンスペクトル検出装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図１に示すラマンスペクトル検出装置の微細構造体の一実施形態の概略構成を示す斜視図である。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体の作製方法を示す工程図である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明のラマンスペクトル検出方法の一実施形態を示す工程図である。
【図５】算出手段による被検体の量または濃度を算出する工程を示すフロー図である。
【図６】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の部分上面図である。
【図７】微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
【図８】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の断面図である。
【符号の説明】
【００７７】
１０ ラマンスペクトル検出装置
１２、８０、９０、１００ 微細構造体
１４ 光照射手段
１６ 光検出手段
１８ 支持手段
２０ 液体試料滴下手段
２０ａ 貯留部
２０ｂ 滴下部
２０ｃ 参照物質混入部
２２ 算出手段
２４ 表示手段
２６ 演算部
２８ 記憶部
３０、８２、９２、１０２ 基体
３２ 誘電体基材
３４ 導電体
３６ 金属体
４０ 微細孔
４２ 微細柱状体
４４ 棒部
４５ 充填部
４６ 突出部
４８ 被陽極酸化金属体
６０ 被検体
６２ 参照物質
９４ 金属ナノロッド
１０４ 金属細線
Ｓ 液体試料
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体を載置した検出面に励起光を照射し、検出面に増強場を発生させた状態で被検体のラマン散乱光を検出するラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光法は、物質に単波長の光を照射して得られるラマン散乱光を分光して、ラマン散乱光のスペクトルを得る方法であり、物質の同定等に利用されている。ラマン分光法は、生体サンプルなどの測定（例えば、同定）に用いることができる。
また、特許文献１のラマン分光法による基質の定量分析方法に記載されているように、測定物質の濃度とラマン散乱光の強度との間には、相関関係があるため、ラマン散乱光の強度から被検体の濃度や量を検出することもできる。
【０００３】
ここで、通常、物質（つまり被検体）から得られるラマン散乱光は信号が微弱であるため高感度で検出することが困難である。
これに対して、特許文献２に記載されている局在プラズモン共鳴を誘起し得る大きさの金属微粒子を多数配置され、光が照射されることで増強電場を形成し、ラマン散乱光を増幅させる検出面が形成された金属ナノ構造体（または微細構造体）を用いる方法がある。
このように検出面に増強電場を発生させてラマン散乱光の信号強度を大きくするＳＥＲＳ（表面増強ラマン）方式を用いることで、低濃度等により検出面上の被検体が少なくても被検体の検出が可能になる。
【０００４】
また、特許文献３には、ＳＥＲＳ方式で被検体を検出する方法であって、被検体のラマン散乱光の信号を抽出するために、検出した全体の信号から、被検体のラマン散乱光以外の信号（第２の信号）を除去する方法が記載されている。なお、第２の信号は、処理装置に記憶させているデータであり、被検体を載置していない状態で、ラマン散乱光を検出することにより検出すると記載されている。
【０００５】
また、特許文献４には、被測定物質に、被測定物質とは異なるラマン散乱光を射出する液状物質を付着させ、その後、被測定物質に光を照射してラマン散乱光を測定する方法が記載されている。この方法では、光を被測定物質内で多重反射の効果が生じ、強度の大きなラマンスペクトルを検出することができると記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２５８３４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１７２５６９号公報
【特許文献３】米国特許第６８８８６２９号明細書
【特許文献４】特開２００３−９８０９０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ここで、生体分子の測定等では、被検体の量、濃度を測定する場合があるが、金属ナノ構造で発生させた増強電場でラマン散乱光を増強するＳＥＲＳ方式は、金属ナノ構造により信号の増強度が決まるため、金属ナノ構造に構造のバラツキが多いと、信号のバラツキも大きくなる。つまり、測定に用いる金属ナノ構造体毎に増強電場の強度が異なったり、１つの金属ナノ構造体の位置（または領域）毎に増強電場の強度が異なったりすると増強されるラマン散乱光の信号もばらついてしまう。
このように信号がばらついてしまうと、定量的に被検体の量、濃度を測定することが困難となる。
このため、金属ナノ構造を均一に作製するための多くの手法が提案されているが、完全に均一な金属ナノ構造を作製することは不可能であり、信号強度の均一性には限界があった。
【０００８】
また、特許文献３に記載の方法は、被検体のラマンスペクトルのみを検出するための方法であるため、被検体の定量的に測定することは記載されていないが、処置装置に記憶させたデータを用いる場合も、金属ナノ構造体毎に検出値が変化するため、同様に被検体を定量的に測定することは困難である。
また、仮に、被検体以外の物質に起因するラマンスペクトルは取り除くことはできても増強電場による増強度を検出することはできない。したがって、この点においても被検体を定量的に測定することは困難である。
【０００９】
また、特許文献４は、金属ナノ構造体を用いずに、強度の小さい入射光でラマン分光している装置であり、ＳＥＲＳ活性な金属ナノ構造体の不均一性が原因となる信号強度のばらつきを抑制することはできない。
また、特許文献４に記載のように液体により多重散乱をさせる方法は、ＳＥＲＳ方式で測定する方法よりもラマンスペクトルの増強効果が低いため、測定感度が低くなるという問題もある。
【００１０】
本発明の目的は、上記従来技術に基づく問題点を解消し、検出面の増強電場の増強度によらず、被検体の量や試料中の濃度を定量的に検出することができるラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明は、被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、前記被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質と前記被検体とを混合した液体試料を前記検出面に接触させる液体試料接触ステップと、前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出ステップと、前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法を提供するものである。
ここで、本発明において、ラマンスペクトルには、波形の全体のみならず、いずれかのピークのみのスペクトル分布も含む。
【００１２】
ここで、前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化することが好ましい。
また、前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同時に同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化することが好ましい。
さらに、液体試料が接触している前記検出面を乾燥させる乾燥ステップを有し、前記散乱光検出ステップは、前記液体試料を接触させた後、乾燥させた前記検出面に励起光を照射し、乾燥した液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出することが好ましい。
また、前記リファレンス物質は、前記被検体から生じる前記ラマンスペクトルの半値幅と異なる半値幅を持つ前記ラマンスペクトルを生じる物質であることが好ましい。
【００１３】
また、上記課題を解決するために、本発明は、被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する第１液体試料を前記検出面に接触させる第１液体試料接触ステップと、前記第１液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記検出面およびその近傍から生じる第１ラマン散乱光を、前記第１ラマンスペクトルの信号として検出する第１散乱光検出ステップと、前記被検体を含有する第２液体試料を前記検出面に接触させる第２液体試料接触ステップと、前記第２液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記検出面の前記第１散乱光を検出した領域と同一領域およびその近傍前記第２液体試料から生じる第２ラマン散乱光を、前記第２ラマンスペクトルの信号として検出する第２散乱光検出ステップと、前記第１散乱光検出ステップで検出した前記リファレンス物質の前記第１ラマンスペクトルの信号強度に基づいて前記第２散乱光検出ステップで検出した前記被検体の前記第２ラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法を提供するものである。
【００１４】
また、上記課題を解決するために、本発明は、励起光が照射されることで増強場を発生させる検出面が形成された基体と、この基体の前記検出面に、被検体、およびこの被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する液体試料を接触させる液体試料接触手段と、前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射する光照射手段と、前記励起光が照射された前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出手段と、前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化手段とを有することを特徴とするラマンスペクトル検出装置を提供するものである。
ここで、前記規格化手段は、さらに、規格化した前記被検体のラマンスペクトルの信号強度から前記被検体を同定し、前記被検体の量および前記液体試料中の濃度を算出することが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、表面増強ラマンにより、高い感度で被検体のラマンスペクトルを検出することができ、かつ、微細構造体の検出面に発生する増強電場の強度によらず、信号強度を規格化した被検体のラマンスペクトルの信号を検出することができる。これにより、高い精度で正確に被検体を同定し、さらに被検体の量及び濃度を検出することができる。
また、微細構造体の検出面に発生する増強電場の強度のよらず、高い精度で信号強度を規格化した被検体のラマンスペクトルの信号を検出できることで、微細構造体の製造誤差の許容範囲を大きくすることができ、歩留まりを高くし、かつ製造コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係るにラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置について、添付の図面に示す実施形態を基に詳細に説明する。
【００１７】
図１は、の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示した微細構造体の概略構成を示す斜視図である。
【００１８】
図１は、本発明のラマンスペクトル検出方法を用いる本発明のラマンスペクトル検出装置本発明の一実施形態であるラマンスペクトル検出装置１０の概略構成を示す正面図であり、図２は、図１に示したラマンスペクトル検出装置１０の微細構造体１２の概略構成を示す上面図である。
【００１９】
図１に示すように、ラマンスペクトル検出装置１０は、微細構造体１２と、微細構造体１２に光を照射する光照射手段１４と、微細構造体１２で反射された反射光を検出する光検出手段１６と、微細構造体１２を支持するチップ支持手段１８と、被検体６０を一定量のリファレンス物質（参照物質ともいう。）６２とを含有する液体試料Ｓを微細構造体１２に滴下する液体試料滴下手段２０と、光検出手段１６の検出結果から被検体６０のラマンスペクトルの信号及び参照物質６２のラマンスペクトルの信号を抽出し、規格化する算出手段２２と、算出手段２２での算出結果を表示する表示手段２４とを有する。
なお、図示しないが、ラマンスペクトル検出装置１０は、微細構造体１２、光照射手段１４、光検出手段１６等の各部を覆う筐体や、ラマンスペクトル検出装置１０の内部で発生した迷光を除去するフィルタ等の各種の光学部材や、ラマンスペクトル検出装置１０の動作を制御する制御部等のラマンスペクトル検出装置１０に必要な各種の部材も有する。
【００２０】
図２に示すように、微細構造体１２は、誘電体基材３２および誘電体基材３２の一面に配置された導電体３４で構成された基体３０と、誘電体基材３２の導電体３４が配置された面とは反対側の面に配置された金属体３６とを有する。
【００２１】
基体３０は、金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）で形成された誘電体基材３２と、誘電体基材３２の一面に設けられ、陽極酸化されていない金属（Ａｌ）で形成された導電体３４とを有する。ここで、誘電体基材３２と導電体３４とは、一体で形成されている。
また、誘電体基材３２には、導電体３４が配置される面とは反対側の面から導電体３４側の面に向けて延びる略ストレートな形状（直管形状）の微細孔４０が複数の開孔されている。
複数の微細孔４０は、導電体３４が配置される面とは反対側の面側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通して開口が形成され、導電体３４側の端部は、誘電体基材３２の表面まで貫通していない。つまり、微細孔４０は、導電体３４までは到達していない孔となる。また、複数の微細孔４０は、励起光の波長より小さい径及びピッチで略規則的に配列されている。
ここで、励起光として可視光を用いる場合は、微細孔４０の配置ピッチを２００ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００２２】
金属体３６は、誘電体基材３２の微細孔４０内に充填されている充填部４５と、微細孔４０上に誘電体基材３２の表面より突出して形成され、充填部４５の外径よりも大きい外径を有し、局在プラズモンを誘起し得る大きさの突出部（つまり凸部）４６とからなる複数の棒部４４で構成されている。ここで、金属体３６を形成する材料としては、局在プラズモンを発生させる種々の金属を使用でき、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｎｉ、Ｔｉ、及びこれらの合金等が挙げられる。また、金属体３６は、これらの金属を２種以上含むもので形成してもよい。また、電場増強効果をより高くすることができるため、金属体３６は、Ａｕ、Ａｇ等を用いて形成することがより好ましい。
また、金属体３６の複数の棒部４４は、突出部４６と隣接する突出部４６との離間距離を、数１０ｎｍ以下とすることが好ましい。
また、突出部４６同士の間隔を数１０ｎｍ以下とすることで、励起光の照射時に、突出部４６同士が近接している領域で、非常に増強された電場を形成することができる。なお、この突出部４６同士の間隔が数１０ｎｍ以下で、非常に増強された電場が形成される領域をホットスポットという。
微細構造体１２は、以上のような構成であり、金属体３６の複数の棒部４４の突出部４６が配置される面が、液体試料Ｓが接触する面、つまり、検出面１２ａとなる。
【００２３】
ここで、微細構造体１２の作製方法について説明する。
図３（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体１２の作製方法の一例を示す工程図である。
まず、図３（Ａ）に示すような直方体形状の被陽極酸化金属体４８に陽極酸化処理を行う。具体的には、被陽極酸化金属体４８を陽極とし、陰極と共に電解液に浸漬させ、陽極陰極間に電圧を印加することで陽極酸化する。
ここで、陰極としては、カーボンやアルミニウム等が使用される。電解液としては制限されず、硫酸、リン酸、クロム酸、シュウ酸、スルファミン酸、ベンゼンスルホン酸、アミドスルホン酸等の酸を、１種又は２種以上含む酸性電解液が好ましく用いられる。
なお、本実施形態では、被陽極酸化金属体４８を直方体形状としたが、その形状は制限されず、種々の形状とすることができる。また、支持体の上に被陽極酸化金属体４８が層状に成膜されたものなど、支持体付きの形態で用いることできる。
【００２４】
被陽極酸化金属体４８を陽極酸化すると、図３（Ｂ）に示すように、被陽極酸化金属体の表面から該面に対して略垂直方向に酸化反応が進行し、誘電体基材３２となる金属酸化物体（Ａｌ２Ｏ３）が生成される。陽極酸化により生成される金属酸化物体（つまり、誘電体基材３２）は、多数の平面視略正六角形状の微細柱状体４２が隙間なく配列した構造を有するものとなる。
また、各微細柱状体４２は、底面が丸みを帯びた形状となり、さらに、略中心部には、表面から深さ方向（つまり、微細柱状体４２の軸方向）に略ストレートに延びる微細孔４０が開孔される。陽極酸化により生成される金属酸化物体の構造は、益田秀樹、「陽極酸化法によるメソポーラスアルミナの調製と機能材料としての応用」、材料技術Vol.15,No.10、1997年、p.34等に記載されている。
【００２５】
また、規則配列構造の金属酸化物体を生成する場合の好適な陽極酸化条件例としては、電解液としてシュウ酸を用いる場合、電解液濃度０．５Ｍ、液温１４〜１６℃、印加電圧４０〜４０±０．５Ｖ等が挙げられる。この条件で生成される微細孔４０は例えば、径が約３０ｎｍ、ピッチが約１００ｎｍである。
【００２６】
次に、誘電体基材３２の微細孔４０に電気メッキ処理を施すことにより、図３（Ｃ）に示すように、充填部４５と突出部４６とからなる棒部４４を形成する。
ここで、電気メッキを行うと、導電体３４が電極として機能し、電場が強い微細孔４０の底部から優先的に金属が析出する。この電気メッキ処理を継続して行うことにより、微細孔１２内に金属が充填されて棒部４４の充填部４５が形成される。充填部４５が形成された後、更に電気メッキ処理を続けると、微細孔４０から充填金属が溢れるが、微細孔４０付近の電場が強いことから、微細孔４０周辺に継続して金属が析出していき、充填部４５上に誘電体基材３２の表面より突出し、充填部４５の径よりも大きい径を有する突出部４６が形成される。
【００２７】
なお、本実施形態の微細構造体１２は、陽極酸化を利用して製造されたものであるので、誘電体基材３２の微細孔４０及び金属体３６の突出部４６が略規則配列された微細構造体１２を簡易に製造できる。また、これら微細孔の配列をランダム配列にすることもできる。
【００２８】
また、本実施形態では、誘電体基材３２の製造に用いる被陽極酸化金属体４８の主成分としてＡｌのみを挙げたが、陽極酸化可能で生成される金属酸化物であれば、任意の金属が使用できる。Ａｌ以外では、Ｔｉ、Ｔａ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｓｉ、Ｉｎ、Ｚｎ等が使用できる。被陽極酸化金属体４８は、陽極酸化可能な金属を２種以上含むものであってもよい。
微細構造体１２は以上のようにして作製される。
【００２９】
次に、光照射手段１４は、レーザ光源等の光源と光源から出射される励起光Ｌｅを導光する導光系とからなり、特定波長の光（励起光）Ｌｅを射出し、射出した励起光Ｌｅを微細構造体１２の検出面に照射する。
【００３０】
光検出手段（つまり分光手段）１６は分光検出器等からなり、光照射手段１４から励起光が照射されることにより微細構造体１２の検出面で発生する散乱光が入射する位置に配置されている。
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面１２ａで発生する散乱光を分光し、ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出する。
【００３１】
支持手段１８は、台座等であり、微細構造体１２を導電体３４側から支持し、所定位置に固定する。また、支持手段１８は、微細構造体１２に液体が滴下された場合に、液体が微細構造体１２上からこぼれないように、微細構造体１２の側面の外周を覆う囲いを有する。
【００３２】
液体試料滴下手段２０は、被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留する貯留部２０ａと、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓを微細構造体１２に滴下する滴下部２０ｂと、貯留部２０ａに参照物質６２を一定量混入させる参照物質混入部２０ｃとで構成され、微細構造体１２の検出面に対向して配置されている。
【００３３】
貯留部２０ａは、被検体６０を含有する液体試料Ｓを貯留する容器である。この貯留部２０ａは、一定量の液体試料Ｓを貯留している。
ここで、被検体６０が液体に含有されていない物質である場合は、被検体６０を溶媒に分散させて液体試料Ｓを作製すればよい。なお、被検体を分散する溶媒としては、種々の溶媒を用いることができ、例えば、水、エタノールや、種々の物質を溶解させた水溶液（例えば、クエン酸水溶液）等が挙げられる。ここで、本実施形態の場合は、溶媒として、揮発性の溶媒を用いることが好ましく、具体的には、エタノールを用いることが好ましい。
滴下部２０ｂは、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓを一定量微細構造体１２に滴下する。ここで、滴下部２０ｂとしては、スポイト等を用いることができる。
参照物質混入部２０ｃは、物性が既知の参照物質６２を保持しており、一定量の参照物質６２を貯留部２０ａに混入する。なお、参照物質混入部２０ｃは、参照物質を固体の状態で保持していても、液体の状態で保持していてもよい。
ここで、参照物質６２は、ラマンスペクトルが既知の物質であり、また被検体６０（より正確には、被検体６０として検出されうる物質）のラマンスペクトルのピークとは異なるピークを１つ以上持つラマンスペクトルを射出する物質である。つまり、参照物質は、被検体６０からは、射出されない波数のラマン散乱光を射出する物質である。参照物質としては、ラマン散乱光を発生させる種々の物質を用いることができ、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳ、キーバンド６７０ｃｍ−１のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、キーバンド６８０ｃｍ−１のＤＭＳＯ、キーバンド１３６０ｃｍ−１のＲ６Ｇ等を用いることができる。
液体試料滴下手段２０は、以上のような構成であり、貯留部２０ａに貯留されている液体試料Ｓに一定量の参照物質を混入した後、滴下部２０ｂにより所定量の液体試料Ｓを微細構造体１２の検出面１２ａ上に滴下する。
【００３４】
算出手段２２は、光検出手段１６から送られたデータを演算処理する演算部２６と、光検出手段１６から送られたデータや、演算部２６での演算結果、参照物質毎のラマンスペクトル等を記憶する記憶部２８とを有し、光検出手段１６で検出したラマンスペクトルの信号から被検体のラマンスペクトルの信号を抽出しかつ規格化し、規格化した結果から、被検体を同定し、被検体の量または濃度を算出する。
【００３５】
表示手段２４は、液晶ディスプレイ等の画像を表示する装置であり、算出手段２２から送られた算出結果、ラマンスペクトル等の情報を表示する。
ラマンスペクトル検出装置１０は、基本的に以上のような構成である。
【００３６】
以下、ラマンスペクトル検出装置１０の作用について説明することで、本発明のラマンスペクトル検出装置および被検体検出方法についてより詳細に説明する。
ここで、図４（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明の被検体検出方法の一実施形態を示す工程図である。
【００３７】
まず、微細構造体１２を支持手段１８の所定位置に載置し、所定位置に固定する。
また、液体試料滴下手段２０は、貯留部２０ａに貯留されている一定量の液体試料Ｓに参照物質混入部２０ｃから一定量の参照物質６２を投入する。これにより、貯留部２０ａ内に物性（具体的にはラマンスペクトル）が既知の参照物質６２が既知の濃度で混合され、かつ、検出対象である被検体６０を含有する液体試料Ｓが作製される。
次に、図４（Ａ）に示すような微細構造体１２の検出面１２ａ上に、液体試料滴下手段２０から液体試料Ｓを微細構造体１２の検出面１２ａ上に滴下する。
これにより、液体試料Ｓを微細構造体１２と支持手段１８とで貯留し保持している状態となり、図４（Ｂ）に示すように、微細構造体１２の検出面１２ａに被検体６０と参照物質６２を含有する液体試料Ｓが接触している状態となる。
【００３８】
次に、検出面１２ａを乾燥させて、接触している液体試料の液体成分（溶媒）を除去する。これにより、図４（Ｃ）に示すように、突出部４６の周りに被検体６０及び参照物質６２が付着した状態となる。
【００３９】
次に、光照射手段１４から励起光Ｌｅを射出し、被検体６０及び参照物質６２が付着している検出面１２ａを照明する。
【００４０】
微細構造体１２の検出面１２ａは、光照射手段１４から射出された光で照明されることで、金属体３６の突出部４６の表面で局在プラズモンが発生し、増強された電場が形成される。
さらに、微細構造体１２では、金属体３６の突出部４６の表面で電場をより増強させる局在プラズモン共鳴も効果的に発生する。ここで、局在プラズモン共鳴は、局在プラズモンにより局在的に集団運動している金属の自由電子が光の電場に共鳴して振動することで電場がより増強される現象である。微細構造体の凹凸形状である突出部４６（つまり凸部）では、入射した光の波長と凹凸形状の大きさとが一致した領域で、突出部４６の自由電子が光の電場に共鳴して振動し、入射された光が高い効率で電場に変化され、突出部４６の周辺の電場がより増強される。
このように、微細構造体では、検出面で電場増強効果を得ることができ、増強された電場が形成される。なお、微細構造体は、電場をより強くすることができるため、突出部で局在プラズモン共鳴が発生するように励起光の波長、突出部の大きさを設計、調整することが好ましいが、少なくとも突出部に局在プラズモンが発生すればよい。
【００４１】
また、検出面１２ａの被検体６０及び参照物質６２は、特定波長の励起光が入射されることによりそれぞれラマン散乱光を発生させる。被検体６０及び参照物質６２によりそれぞれ発生されたラマン散乱光は、局在プラズモンに起因して発生された増強電場によって増強される。つまり、ラマン散乱光は、ラマン増強効果により増強される。ここで、被検体６０から射出されるラマン散乱光は、検出する被検体の種類によってスペクトルが変化する。
【００４２】
光検出手段１６は、微細構造体１２の検出面１２ａの散乱光を分光し、ラマン散乱光のスペクトル（ラマンスペクトル）の信号を検出する。その後、検出したラマンスペクトルの信号を算出手段２２に送る。
【００４３】
ここで、図５は、算出手段２２による被検体の量または濃度を算出する工程を示すフロー図である。
算出手段２２は、まず、演算部２６が、参照物質混入部２０ａで混入した参照物質６２の情報に基づいて、記憶部２８から参照物質６２のラマンスペクトル（の波形形状）を読み出す（ステップＳ１０）。
【００４４】
次に、検出されたラマンスペクトルの信号から、読み出した参照物質６２に起因するラマンスペクトルの信号を取り除き、被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号を抽出する（ステップＳ１２）。具体的には、検出されたラマンスペクトルの信号と、読み出した参照物質６２に起因するラマンスペクトルのピークや、スペクトル分布に基づいてマッチングさせ、その結果重複した波長領域のラマンスペクトルの信号を検出されたラマンスペクトルの信号から取り除くことで被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号を抽出する。
【００４５】
次に、検出されたラマンスペクトルの信号と読み出した参照物質６２のラマンスペクトルの信号とをマッチングした結果に基づいて、被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号を規格化する（ステップＳ１４）。具体的には、検出したラマンスペクトルの信号に含まれる参照物質のラマンスペクトルの信号の信号強度と参照物質の既知の濃度との関係に基づいて、検出したラマンスペクトルの信号から抽出した被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号の信号強度を規格化する。
【００４６】
次に、規格化した被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号と、記憶部２８に記憶されている種々の物質のラマンスペクトルとを比較して被検体の種類を検出し、さらに、規格化されたラマンスペクトルの信号に基づいて、被検体の量、濃度を算出する（ステップＳ１６）。なお、濃度は、さらに、液体試料滴下手段２０から滴下された液体試料の量を加味することで算出することができる。
【００４７】
算出手段２２で算出した被検体の種類および被検体の量、濃度を表示手段２４で表示する。
ラマンスペクトル検出装置１０は、以上のようにして被検体を同定し、量及び濃度を算出する。
【００４８】
このように、ラマンスペクトル検出装置１０は、液体試料Ｓに、ラマンスペクトルが既知の参照物質６２を一定量混在させることで、参照物質６２のラマンスペクトルの信号強度に基づいて被検体６０のラマンスペクトルの信号強度を規格化することができる。
これにより、微細構造体の検出面に形成される突出部にバラツキがあり、検出面に形成される増強電場が微細構造体毎に不均一となり、ＳＡＲＳによるラマン散乱光の増強度が不均一となっても、高い精度で定量的に被検体を検出することができる。
また、参照物質６２として被検体６０のラマンスペクトルのピークとは異なるピークを１つ以上持つラマンスペクトルを生じる物質を用いることで、参照物質６２のラマンスペクトルと被検体６０とラマンスペクトルを混在させることなく、検出したラマンスペクトルの信号から両方のラマンスペクトルの信号を抽出することができる。
また、微細構造体の検出面での増強電場が不均一であっても高い精度で定量的に被検体を検出できることで、検出面で発生させる増強電場が不均一な微細構造体も、つまり、異なる強度の増強電場を発生させる微細構造体も用いることができる。これにより、利用できる微細構造体の許容範囲を大きくすることができ、歩留まりを高くすることができ、製造コストを抑制することができる。
【００４９】
以下、具体的実施例とともに本発明についてより詳細に説明する。
ここで、本具体例では、被検体としてキーバンドが７３０ｃｍ−１のアデニンを用い、キーバンド６８０ｃｍ−１のＤＭＳＯを参照物質とした。なお、本具体例では、濃度既知のＤＭＳＯが液体試料Ｓの溶媒としての役割も有する。また、液体試料は、アデニンの濃度を１００μＭとした。
また、微細構造体として、上述した図２に示す構造の微細構造体１２を用い、光照射手段１４として、出力２ｍＷ、励起波長６３３ｎｍの半導体レーザを用い、光検出手段１６として、顕微ラマン分光装置（堀場ジョバンイボン社製、ＬａｂＬＡＭ ＨＲ−８００）を用いた。
ここで、本具体例では、１つの検出面において、測定点１〜９の９つの測定点で７３０ｃｍ−１と６８０ｃｍ−１の信号強度を測定した。つまり、被検体と参照物質の濃度が同一の液体試料について、９つの測定点で測定を行った。
さらに、算出した７３０ｃｍ−１と６８０ｃｍ−１の信号強度を用いて、測定点毎に、７３０ｃｍ−１の信号強度を６８０ｃｍ−１の信号強度で規格化した値を算出した。
また、９つの測定点における７３０ｃｍ−１の信号強度の平均値と、７３０ｃｍ−１の信号強度のみで算出した標準偏差と、７３０ｃｍ−１の信号強度を６８０ｃｍ−１の信号強度で規格化した値の平均値と、標準偏差を算出した。
測定結果及び算出結果を下記表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１に示すように、アデニン（被検体）の信号強度（７３０ｃｍ−１の信号強度）をＤＭＳＯ（参照物質）の信号強度（６８０ｃｍ−１の信号強度）で規格化することで、被検体の信号強度の強さによらず、被検体を定量的に算出することができる。つまり、濃度既知の参照物質を基準とすることで、信号強度が大きい場合も小さい場合も定量的な測定が可能となる。つまり、微細構造体によるラマン散乱光の増強度によらず、被検体を定量的に検出することができる。
具体的には、同一濃度の被検体を測定しても、増強度によって、測定点７の場合は、信号強度が４５２となり、測定点３の場合は、１４１６となる。これに対して、参照物質の信号強度で規格化することで、測定点７の場合は、１．２４５となり、測定点３の場合は、２．３６０となる。このように、単に被検体の信号強度を測定した場合よりも差を小さくすることができる。
以上より、規格化することで、微細構造体の増強度により信号強度がばらついた場合も、濃度既知の参照物質により微細構造体の増強度を加味することができ、定量的な測定を行うことができることがわかる。
また、参照物質で規格化することで、バラツキを低減することもできる。具体的には、標準偏差のバラツキを０．３９９から０．２６６に小さくすることができる。
以上より本発明の効果は明らかである。
【００５２】
ここで、参照物質６２は、被検体６０とラマンスペクトルの半値幅も異なる物質であることが好ましい。参照物質６２を被検体６０のラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持ち、かつ半値幅も異なるラマンスペクトルのピークを生じる物質とすることで、光検出手段１６で検出したラマンスペクトルの信号から参照物質６２に起因するラマンスペクトルの信号と被検体６０に起因するラマンスペクトルの信号とをより正確に抽出することができる。
また、参照物質６２は、ラマンスペクトルの波数が、被検体６０から生じるラマンスペクトルのピークと半値幅の２倍以上異なることが好ましい。両物質からそれぞれ生じるラマンスペクトルのピークが半値幅の２倍以上ことなることで、さらに的確に各ラマンスペクトルを抽出することができる。
【００５３】
さらに、参照物質６２には、被検体６０と同程度の強度のラマンスペクトルを射出する物質を用いることが好ましい。参照物質６２と被検体６０とから射出されるラマンスペクトルを同程度とすることで、被検体６０のラマンスペクトルの信号強度をより正確に規格化することができる。
【００５４】
また、参照物質混入部２０ｃは、複数の参照物質６２を有することが好ましく、被検体６０（または被検体６０と想定される物質）の種類（スペクトル強度、波数）に応じて、液体試料Ｓに混入する参照物質６２を選択することが好ましい。
このように、参照物質を選択することで、より適切に被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し規格化することができ、被検体を高い精度で定量的に検出することができる。
なお、参照物質を混入していない状態で、被検体のラマンスペクトルの信号を検出し、その検出値に応じて、最適な参照物質を特定してもよい。これにより、より適切な参照物質を選択することができる。
【００５５】
ここで、ラマンスペクトル検出装置１０は、微細構造体１２の突出部４６に特異的結合物質を固定することが好ましい。
微細構造体の突出部に特異的結合物質を配置することで、微細構造体の突出部と特定の被検体（つまり、特異的結合物質と結合する特性を有する被検体）とを結合させることができる。
なお、この場合は、被検体と特異的に結合する特異的に結合する特異的結合物質と、参照物質と特異的に結合する特異的結合物質の２種類の特異的結合物質を設けることが好ましい。被検体と参照物質に対して別々の特異的結合物質を設けることで、一方の物質により他方の物質が結合できず、検出値と実際の値がずれることを防止できる。
また、１種類の特異的結合物質に被検体６０と参照物質６２を結合させる場合は、特異的結合物質に被検体６０と参照物質６２とを同程度付着させるために、被検体６０と参照物質６２とは、一方の物質が他方の物質よりも特異的結合物質に対する結合力が過剰に強くないこと（つまり、結合力の比率が一定範囲内にあること）が好ましい。
【００５６】
特異的結合物質としては、以下のような物質を用いることができる。
被検体が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体とイオン結合する特異的結合物質としては、被検体と反対荷電を有する表面修飾基を用いることができ、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基、アミノ基、第４級アンモニウム基、イミダゾール基、グアニジニウム基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
また、被検体が蛋白質、ペプチド、及びアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である場合、被検体と共有結合する特異的結合物質としては、Ｎ−ヒドロキシスクニンイミジルエステル等の反応性エステル基、カルボジイミド基、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基、ヒドラジド基、チオール基（スルファニル基）、反応性ジスルフィド基、マレイミド基、アルデヒド基、エポキシド基（エポキシ基）、（メタ）アクリレート基、ヒドロキシル基（ヒドロキシ基）、イソシアネート基、イソチオシアネート基、及びこれらの誘導体基等の表面修飾基が挙げられる。また、突出部は、これらの表面修飾基を２種以上有していてもよい。
ここで、特異的結合物質としては、例示した表面修飾基の中でも、反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等を用いることが好ましい。
なお、上記記載中、「反応性」とは被検体と反応性を有することを意味する。
【００５７】
さらに、突出部には、被検体とイオン結合する特異的結合物質及び共有結合する特異的結合物質の両方を固定することが特に好ましい。
この場合、突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とを同時に固定してもよいし、これらの特異的結合物質を順次固定してもよい。また、これらの特異的結合物質の表面修飾位置は特に制限されず、これらの特異的結合物質同士が互いに結合していてもよいし、これらの特異的結合物質が互いに独立して突出部に結合していてもよい。
【００５８】
また、突出部に対して、被検体とイオン結合する特異的結合物質を固定し、さらにこの特異的結合物質を、被検体と共有結合する特異的結合物質で活性化することも特に好ましい。
例えば、はじめに突出部に被検体とイオン結合するカルボキシ基を導入し、さらに導入したカルボキシ基を反応性エステル基、ヒドラジド基、チオール基、及び反応性ジスルフィド基等の被検体と共有結合する官能基の形態に誘導して、活性化することが好ましい。
被検体とイオン結合する特異的結合物質と、被検体と共有結合する特異的結合物質とが互いに近接するため、１つ1つの被検体がイオン結合及び共有結合によって突出部の表面に対して強固に吸着させることができる。
【００５９】
ここで、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、１０−カルボキシ−１−デカンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール、７−カルボキシ−１−へプタンチオール、１６−メルカプトヘキサデカン酸、１１，１１’−チオジウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する分子；アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、デンプン、及びセルロース等のヒドロゲル、又はこれらの誘導体（例えばカルボキシメチル誘導体）；ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、及びポリエチレングリコール等の水膨潤性有機ポリマー等が挙げられる。
例えば、被検体がアデニンの場合、被検体とイオン結合する表面修飾基と、被検体と共有結合する表面修飾基とを両方備えた特異的結合物質としては、４，４−ジチオジブチル酸（ＤＤＡ）、及びカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等が好ましく用いられる。
【００６０】
ここで、微細構造体１２の検出面１２ａに液体試料Ｓを接触させた後、検出面１２ａを乾燥させる手段としては、種々の手段を用いることができ、滴下後、一定時間経過させることで自然乾燥させても、検出面を加熱する加熱機構を設け、積極的に溶媒を蒸発させてもよい。
【００６１】
また、ラマンスペクトル検出装置１０では、必ずしもラマン散乱光の検出時に検出面１２ａを乾燥させる必要はなく、検出面１２ａが濡れた状態、つまり液体試料Ｓの溶媒成分が検出面１２ａに接触している状態でラマン散乱光を検出してもよい。
特に、乾燥された状態では、被検体と参照物質が反応し、別の物質となる場合は、液体試料Ｓの溶媒が検出面１２ａに接触している状態でラマン散乱光を検出することが好ましい。
【００６２】
また、ラマンスペクトル検出装置１０では、液体試料Ｓに参照物質６２を混在させて、検出面の同一領域にある被検体と参照物質とのラマンスペクトルの信号を同時に検出したが、被検体のラマンスペクトルの信号と参照物質のラマンスペクトルの信号とを別々に検出してもよい。
例えば、検出面に一定濃度の参照物質を含有する液体を接触させて参照物質のラマンスペクトルの信号を検出し、その後、検出面に液体試料Ｓを接触させて被検体のラマンスペクトルの信号を検出してもよい。また逆に、検出面に液体試料Ｓを接触させて被検体のラマンスペクトルの信号を検出した後、検出面に一定濃度の参照物質を含有する液体を接触させて参照物質のラマンスペクトルの信号を検出してもよい。なお、この場合、ラマンスペクトル検出装置は、液体試料Ｓを貯留する貯留部と、参照物質を含有する液体を保持する貯留部とを別々に有する必要がある。
この場合も、被検体のラマンスペクトルの信号を検出した領域の検出面の増強電場の強度を、参照物質のラマンスペクトルの信号に基づいて、規格化することができる。したがって、参照物質のラマンスペクトルに基づいて、被検体のラマンスペクトルを規格化することで、被検体を高い精度で定量的に検出することができる。
【００６３】
ここで、被検体と参照物質のラマンスペクトルの信号を別々に検出する場合は、後で検出する物質の方が先に検出する物質よりも、突出部または特異的吸着物質と結合する結合力が高いことが好ましい。これにより、後で検出する物質の検出時に、先に検出する物質が検出面の表面に残っていても、後で検出する物質により置換することができ、後で検出する物質をより正確に検出することができる。
また、先に検出する物質を含有する液体が検出面に残っている状態で、後で検出する物質を含有する液体を滴下しても、後で検出する物質のラマンスペクトルの信号を適切に検出することができる。
【００６４】
また、微細構造体の形状は、微細構造体１２の形状に限定されず、基体上に局在プラズモンを誘起し得る大きさの凸部が形成されていればよく、種々の形状とすることができる。
【００６５】
図６（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図６（Ｂ）は、図６（Ａ）の上面図である。
図６（Ａ）及び図６（Ｂ）に示す微細構造体８０は、基体８２と基体８２上に配置された多数の金属微粒子８４とで構成されている。
基体８２は、板状の基板である。基体８２は、金属微粒子８４を電気的に絶縁して支持可能な材料で形成すればよく、材料としては、例えば、シリコン、ガラス、イットリウム安定化ジルコニア（ＹＳＺ）、サファイヤ、およびシリコンカーバイド等が挙げられる。
【００６６】
多数の金属微粒子８４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさの微粒子であり、基体８２の一面上に分散された状態で固定されている。
ここで、金属微粒子８４は、上述した金属体３６で例示した各種金属で形成することができる。また、金属微粒子８４は、上述した金属微粒子６２と同様の金属微粒子でも異なる金属微粒子でもよい。また、金属微粒子の形状は特に限定されず、例えば、丸型で、直方体型でもよい。
このような構成の微細構造体８０も金属微粒子が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属微粒子の周りに局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
【００６７】
次に、図７は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
図７に示す微細構造体９０は、基体９２と基体９２上に配置された多数の金属ナノロッド９４とで構成されている。
ここで、基体９２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００６８】
金属ナノロッド９４は、局在プラズモンを誘起し得る大きさであり、短軸長さと長軸長さが異なる棒状の金属ナノ粒子であり、基体９２の一面に、分散された状態で固定されている。金属ナノロッド９４は、その短軸長さが３ｎｍ〜５０ｎｍ程度、長軸長さが２５ｎｍ〜１０００ｎｍ程度であり、長軸長さは励起光の波長よりも小さいサイズのものである。金属ナノロッド９４は、上述した金属微粒子と同様の金属で作製することができる。なお、金属ナノロッドの詳細な構成については、例えば、特開２００７−１３９６１２号公報に記載されている。
ここで、微細構造体９０は、上述した微細構造体８０と同様の方法で作製することができる。
このような構成の微細構造体９０も金属ナノロッドが配置された検出面に励起光が照射されることで、金属ナノロットの周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体９０を用いた場合も、微細構造体１２及び微細構造体８０と同様に、微細構造体を作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００６９】
次に、図８（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、図８（Ｂ）は、図８（Ａ）の断面図である。
図８に示す微細構造体１００は、基体１０２と基体１０２上に配置された多数の金属細線１０４とで構成されている。
ここで、基体１０２は、上述した基体８２と同様の構成であるのでその詳細な説明は省略する。
【００７０】
金属細線１０４は、局在プラズモンを誘起し得る線幅の線状部材であり、基体１０２の一面に格子状に配置されている。金属細線１０４は、上述した金属微粒子、金属体と同様の金属で作製することができる。また、金属細線１０４の作製方法は、特に限定されず、蒸着、メッキ等、金属配線を作製する種々の方法で作製することができる。
ここで、金属細線１０４の線幅は、具体的には５０ｎｍ以下、特に３０ｎｍ以下であることが好ましい。また、金属細線１０４の配置パターンは、特に限定されない。例えば、複数の金属細線を交差させずに、互いに平行に配置してもよい。また、金属細線の形状も直線に限定されず、曲線としてもよい。
【００７１】
このような構成の微細構造体１００も金属細線が配置された検出面に励起光が照射されることで、金属細線の周囲に局在プラズモンを発生させ、増強電場を発生させる。
以上のような構成の微細構造体１００を用いた場合も、微細構造体１２、微細構造体８０及び微細構造体９０と同様に、微細構造体を作製することができ、さらに、被検体を高い感度で検出することができる。
【００７２】
また、微細構造体は、上述した微細構造体１２、微細構造体８０、微細構造体９０及び微細構造体１００にも限定されず、ぞれぞれの局在プラズモンを誘起し得る凸部を組み合わせた構成としてもよい。
また、基体に蒸着して金属微粒子を形成する場合は、基体上への蒸着を種々の方向から行うようにしてもよい。
ここで、微細構造体は、基体上に金属微粒子を配置してから、基体上へ、金属膜を蒸着し、凸部を形成することが好ましい。このように金属微粒子配置してから、金属膜を蒸着することで、金属微粒子の間に金属膜（微細な金属微粒子）を形成することができ、金属微粒子と金属膜とを近接させることができるため、微細構造体の検出面のホットスポットをより多くすることができる。
【００７３】
また、上記実施形態では、液体試料滴下手段により液体試料を微細構造体の検出面に滴下したが、本発明はこれに限定されず、微細構造体の表面に液体試料を供給する流路を形成し、この流路に液体試料を流すことで、検出面に液体試料を供給してもよい（つまり、検出面に液体試料を接触させてもよい）。
【００７４】
以上、本発明に係るラマンスペクトル検出方法及びラマンスペクトル検出装置について詳細に説明したが、本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の改良や変更を行ってもよい。
【００７５】
例えば、上記実施形態では、ラマンスペクトルのピークとして、波数分布におけるピークを検出したが、分布の中の輝線（突出部）を検出できればよく、波長分布におけるピークで検出してもよい。さらに、上記実施形態では、ラマンスペクトルとして全体波形を検出したが、本発明はこれに限定されず、ラマンスペクトルとして、ピーク部分の波形のみを検出するようにしてもよい。つまり、ラマンスペクトルには、波形全体を用いることに限定されず、ピーク部分のみを用いるようにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明のラマンスペクトル検出方法を用いるラマンスペクトル検出装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図１に示すラマンスペクトル検出装置の微細構造体の一実施形態の概略構成を示す斜視図である。
【図３】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ微細構造体の作製方法を示す工程図である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ本発明のラマンスペクトル検出方法の一実施形態を示す工程図である。
【図５】算出手段による被検体の量または濃度を算出する工程を示すフロー図である。
【図６】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の部分上面図である。
【図７】微細構造体の他の一例の概略構成を示す上面図である。
【図８】（Ａ）は、微細構造体の他の一例の概略構成を示す斜視図であり、（Ｂ）は、（Ａ）の断面図である。
【符号の説明】
【００７７】
１０ ラマンスペクトル検出装置
１２、８０、９０、１００ 微細構造体
１４ 光照射手段
１６ 光検出手段
１８ 支持手段
２０ 液体試料滴下手段
２０ａ 貯留部
２０ｂ 滴下部
２０ｃ 参照物質混入部
２２ 算出手段
２４ 表示手段
２６ 演算部
２８ 記憶部
３０、８２、９２、１０２ 基体
３２ 誘電体基材
３４ 導電体
３６ 金属体
４０ 微細孔
４２ 微細柱状体
４４ 棒部
４５ 充填部
４６ 突出部
４８ 被陽極酸化金属体
６０ 被検体
６２ 参照物質
９４ 金属ナノロッド
１０４ 金属細線
Ｓ 液体試料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、
前記被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質と前記被検体とを混合した液体試料を前記検出面に接触させる液体試料接触ステップと、
前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出ステップと、
前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法。
【請求項２】
前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化する請求項１に記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項３】
前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同時に同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化する請求項１に記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項４】
さらに、液体試料が接触している前記検出面を乾燥させる乾燥ステップを有し、
前記散乱光検出ステップは、前記液体試料を接触させた後、乾燥させた前記検出面に励起光を照射し、乾燥した液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する請求項１〜３のいずれかに記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項５】
前記リファレンス物質は、前記被検体から生じる前記ラマンスペクトルの半値幅と異なる半値幅を持つ前記ラマンスペクトルを生じる物質である請求項１〜４のいずれかに記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項６】
被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、
既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する第１液体試料を前記検出面に接触させる第１液体試料接触ステップと、
前記第１液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記第１液体試料から生じる第１ラマン散乱光を、前記第１ラマンスペクトルの信号として検出する第１散乱光検出ステップと、
前記被検体を含有する第２液体試料を前記検出面に接触させる第２液体試料接触ステップと、
前記第２液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記検出面の前記第１散乱光を検出した領域と同一領域およびその近傍の前記第２液体試料から生じる第２ラマン散乱光を、前記第２ラマンスペクトルの信号として検出する第２散乱光検出ステップと、
前記第１散乱光検出ステップで検出した前記リファレンス物質の前記第１ラマンスペクトルの信号強度に基づいて前記第２散乱光検出ステップで検出した前記被検体の前記第２ラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法。
【請求項７】
励起光が照射されることで増強場を発生させる検出面が形成された基体と、
この基体の前記検出面に、被検体、およびこの被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する液体試料を接触させる液体試料接触手段と、
前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射する光照射手段と、
前記励起光が照射された前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出手段と、
前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化手段とを有することを特徴とするラマンスペクトル検出装置。
【請求項８】
前記規格化手段は、さらに、規格化した前記被検体のラマンスペクトルの信号強度から前記被検体を同定し、前記被検体の量および前記液体試料中の濃度を算出する請求項７に記載のラマンスペクトル検出装置。
【請求項１】
被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、
前記被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質と前記被検体とを混合した液体試料を前記検出面に接触させる液体試料接触ステップと、
前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出ステップと、
前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法。
【請求項２】
前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化する請求項１に記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項３】
前記規格化ステップは、前記散乱光検出ステップで同時に同一領域から検出したラマンスペクトルの信号に基づいて規格化する請求項１に記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項４】
さらに、液体試料が接触している前記検出面を乾燥させる乾燥ステップを有し、
前記散乱光検出ステップは、前記液体試料を接触させた後、乾燥させた前記検出面に励起光を照射し、乾燥した液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する請求項１〜３のいずれかに記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項５】
前記リファレンス物質は、前記被検体から生じる前記ラマンスペクトルの半値幅と異なる半値幅を持つ前記ラマンスペクトルを生じる物質である請求項１〜４のいずれかに記載のラマンスペクトル検出方法。
【請求項６】
被検体を検出面に接触させ、または前記検出面の近傍に位置させ、前記検出面に励起光を照射し、前記被検体から生じるラマン散乱光を増強させ、増強させた前記ラマン散乱光をラマンスペクトルの信号として検出するラマンスペクトル検出方法であって、
既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する第１液体試料を前記検出面に接触させる第１液体試料接触ステップと、
前記第１液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記第１液体試料から生じる第１ラマン散乱光を、前記第１ラマンスペクトルの信号として検出する第１散乱光検出ステップと、
前記被検体を含有する第２液体試料を前記検出面に接触させる第２液体試料接触ステップと、
前記第２液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射し、前記検出面の前記第１散乱光を検出した領域と同一領域およびその近傍の前記第２液体試料から生じる第２ラマン散乱光を、前記第２ラマンスペクトルの信号として検出する第２散乱光検出ステップと、
前記第１散乱光検出ステップで検出した前記リファレンス物質の前記第１ラマンスペクトルの信号強度に基づいて前記第２散乱光検出ステップで検出した前記被検体の前記第２ラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化ステップとを有することを特徴とするラマンスペクトル検出方法。
【請求項７】
励起光が照射されることで増強場を発生させる検出面が形成された基体と、
この基体の前記検出面に、被検体、およびこの被検体から生じるラマンスペクトルのピークと異なるピークを１つ以上持つ既知のラマンスペクトルを生じるリファレンス物質を含有する液体試料を接触させる液体試料接触手段と、
前記液体試料が接触している前記検出面に前記励起光を照射する光照射手段と、
前記励起光が照射された前記液体試料から生じる前記ラマン散乱光を、前記ラマンスペクトルの信号として検出する散乱光検出手段と、
前記散乱光検出ステップで検出した前記ラマンスペクトルの信号から、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号および前記被検体のラマンスペクトルの信号を抽出し、前記リファレンス物質の前記ラマンスペクトルの信号強度から前記被検体のラマンスペクトルの信号強度を規格化する規格化手段とを有することを特徴とするラマンスペクトル検出装置。
【請求項８】
前記規格化手段は、さらに、規格化した前記被検体のラマンスペクトルの信号強度から前記被検体を同定し、前記被検体の量および前記液体試料中の濃度を算出する請求項７に記載のラマンスペクトル検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−２７０８５２（Ｐ２００９−２７０８５２Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１９５３１（Ｐ２００８−１１９５３１）
【出願日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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