リガンド分析
本明細書にはレセプター−リガンドペアの分析法が記載される。本法は、リガンドのレセプターに対する結合親和性に関する情報を提供すること、あるいは、リガンドのレセプターに対する結合速度動態に関する情報を提供することが可能である。いくつかの場合においては、本法は、レセプター-リガンド相互作用を評価および／または最適化するための極めて包括的なシステムであって、様々なタイプのレセプターリガンド相互作用、例えば、タンパク−小型分子相互作用に適用が可能なシステムを提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００３年３月１０日出願米国仮出願第６０／４５３，４７３号、２００３年３月１０日出願米国仮出願第６０／４５３，４５７号、２００３年４月７日出願米国仮出願第６０／４６０，９１０号、２００３年４月１５日出願米国仮出願第６０／４６３，０２５号、および、２００３年９月１２日出願米国仮出願６０／５０２，６７０号に対する優先権を主張する。なお、上記出願それぞれについて引用することによりその全体を本出願に含める。
【０００２】
（背景）
各種疾病を治療する薬剤を発見するための努力は、組み合わせ化学のような技術およびヒトゲノムの解明によって革新的な進歩を遂げている。ゲノミクスおよび生物学的スクリーニング両分野における高処理技術の発達は、コンピュータ技術における長足の進歩と相俟って、これらの道具を新薬の合理的探求法の一部として用いることを一層実現可能としている。
【０００３】
しかしながら、化学的ゲノミクスの潜在能力をフルに発揮するためには、組み合わせ化学のような技術力を、新たに発見された疾病標的用リード化合物の展開に利用するための効率的な一般ツールの開発が必要である。化学合成の分野ではタンパク機能探査用の各種化合物ライブラリーの構築において相当な洗練を可能とした進歩が見られているにも拘わらず、混合系でのリガンド結合メカニズムを直接評価したり、リガンド親和性を判定するための一般的技術は現在でもなお不足している。ゲノムおよびプロテオーム分析によって、ヒト疾患の小型分子療法の標的と特定されるヒトおよび細菌タンパクの数が急速に増えており、このために、機能的アッセイが利用できない新規標的に適用が可能なタンパク−リガンド結合の評価法に対して今後の展開の成否を決める要求が生じている。結合部位によってリガンドの化学タイプの親和性を序列化したり分類したりすることは、リガンド構造−活性関係について合理的解明をするのに共結晶Ｘ線構造を利用できない標的の場合には特に好ましい。
【０００４】
どの薬剤候補が残るのかを早期に予測できる予測因子は、そのＫｄ、すなわち、標的生体分子との平衡解離定数である。Ｋｄは、薬剤候補が、その標的にどれくらい緊密に結合するかを表す尺度であり、候補の効力、毒性の可能性、および副作用に関する予測因子である。薬剤候補の動態、例えば、薬剤候補が標的から解離する解離速度ｋ２も、薬剤候補が最終的に薬剤となるかどうかを早期に示す予測因子となり得る。ｋ２は、薬剤候補がその標的にどれくらい緊密に結合するかを表す尺度であり、候補の潜在的効力、毒性、および副作用のインディケーターとなり得る。Ｋｄおよびｋ２を含めた、各種結合特性を効率的に論理的矛盾無く評価できる能力があるならば、その能力は、創薬プロセスを目覚しく改善することができるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
アフィニティー選択質量分析（ＡＳ−ＭＳ）技術は、リガンド（例えば、小型分子および有機化合物）のレセプター（例えば、タンパクおよび酵素）に対する結合特性を評価するに当たって特に有望である。これらの技術により、複雑な混合物からタンパク結合成分が、その分子量、または衝突による断片パターンに基づいて一意に特定され、化合物ライブラリーの中から複数のリガンドを同時に評価することが可能になる。現代のＭＳ技術の感受性が高いので、極少量の精製生体分子レセプターを用いてＡＳ−ＭＳ実験を行うことが可能である。細胞、またはそれ以外の複雑な生化学アッセイとは異なり、ＡＳ−ＭＳは、対象標的に対して選択的に結合する化合物についてのみ結果を提示するものであり、従って、標的外活性から生じた擬似陽性を排除する。
【０００６】
本発明者らは、本明細書において、１つのタンパクレセプターに対する、複数のリガンドの親和度を同時に序列化し、一方、ある場合にはさらに、複数のリガンド同士が、選択競合リガンドとして同じ部位に結合するのか、または、アロステリックな結合部位において相互作用を介して影響を及ぼしあうのかを明らかにする多次元クロマトグラフィー質量分析法を記載する。２つのリガンドが異なる部位に結合する場合、本法は、それらの絶対的結合親和度、および、それらの間の結合協力度の定量評価をも与えることが可能な場合もある。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、レセプターＥ、リガンドＳｉ、および、レセプターリガンド結合対ＥＳｉを含む複数の混合物においてリガンドにたいするレセプターの結合親和度を分析する方法をその特質とする。本法は下記の工程を含む、すなわち、
（ａ）複数の混合物であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０、リガンド［Ｓｉ］０、および滴定剤Ｔを含み、ＴのＳと置き換わる相対的活性が定量可能となるようにＥ、Ｓｉ、Ｔの内の１つ以上の濃度が選択される複数の混合物を供給すること、
（ｂ）複数の混合物それぞれを平衡に達せしめること、
（ｃ）複数の混合物それぞれについて、未結合リガンドＳｉから、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉを分離すること、
（ｄ）複数の混合物それぞれにおいて、分析装置からの、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を定めること、および、
（ｅ）工程（ｄ）におけるレセプター-リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を評価し、リガンドＳｉのレセプターＥに対する結合親和度を定めること、
である。
【０００８】
ある場合には、各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの相対的濃度が、ＳｉのＴと置き換わる相対的活性の比較を可能とするように選ばれる。
【０００９】
ある場合には、本法は、複数の混合物であって、各混合物は、レセプター初期濃度［Ｅ］０、リガンド初期濃度［Ｓｉ］０、および、既知濃度の滴定剤Ｔを含み、複数の混合物のそれぞれにおいて［Ｅ］０および［Ｓｉ］０は一定であり、［Ｓｉ］０は、複数の混合物それぞれにおいてほぼ同じであり、滴定剤の濃度は複数の混合物内において変動させられる複数の混合物を供給することを含む。
【００１０】
ある場合には、複数の混合物は、それぞれ、複数のリガンドＳｉおよび複数のレセプター-リガンド結合対ＥＳｉを含み、信号応答は、前記レセプター-リガンド結合対の内の少なくとも２つについて定められ、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉの相対的結合度が定められる。
【００１１】
ある場合には、例えば、混合物が複数のリガンドを含む場合には、前記複数のリガンドＳｉの少なくとも約９０％は一意の分子量を持つ。
【００１２】
ある場合には、各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの相対的濃度が、第１リガンドＳ１の結合親和度が、第２リガンドＳ２の結合親和度と比較されて、それによってＥに対するＳ１とＥに対するＳ２の相対的結合親和度を測る尺度が得られるように選ばれる。
【００１３】
ある場合には、結合親和度は、相対的結合平衡定数ＫｄｉＳである。
【００１４】
ある場合には、本法は、１つ以上のリガンドのＡＣＥ５０、すなわち、レセプター-リガンドペアの信号応答が、滴定剤濃度０の時の値の５０％に達する時の滴定剤濃度を計算することを含む。
【００１５】
ある場合には、複数のリガンドの相対的ＫｄＳは、最低のＡＣＥ５０値を持つリガンドが、リガンド混合物の内で最高Ｋｄを持ち、最高ＡＣＥ５０値を持つリガンドが、リガンド混合物の内で最低Ｋｄを持つように定められる。
【００１６】
ある場合には、本法は、複数の混合物におけるレセプター-リガンド結合対ＥＳｉのＫｄｉを求めるに際し、滴定剤の濃度の関数で表した複数の混合物それぞれにおけるレセプター-リガンド結合対［ＥＳｉ］濃度の変化を、式（Ｉ）の等式：
【００１７】
【数４】
または、式（Ｉ）から導かれる等式に適合させることによって計算することを含む。
【００１８】
ある場合には、複数のリガンドＳｉの相対的ＫｄｉＳが定められる。
【００１９】
ある場合には、レセプターの初期濃度［Ｅ］０は既知であり、リガンドの初期濃度［Ｓｉ］０は既知である。
【００２０】
ある場合には、レセプターの濃度［Ｅ］０は、リガンドの濃度［Ｓｉ］０の合計よりも大きい。
【００２１】
ある場合には、本法はさらに、リガンドＳｉは、レセプターＥに競合的に、アロステリックに、または非競合的に結合するのかを判定することを含む。例えば、レセプター-リガンドペアＥＳｉが、複数の混合物のそれぞれにおいて比較的定常な信号応答を維持する場合、リガンドＳｉは、非競合的にレセプターＥに結合する。ある場合には、本法は、複数の混合物それぞれにおいて、レセプター-リガンドペアＥＳｉの信号応答の、レセプター-滴定剤ペアの反応に対する比の、滴定剤濃度に対する変動を定めることを含み、複数の混合物それぞれの前記比が滴定剤濃度と直線関係を持つならば、リガンドＳｉはレセプターに競合的に結合し、複数の混合物それぞれの前記比が非直線的関係を持つならば、リガンドＳｉはレセプターにアロステリックに結合するとされる。
【００２２】
ある場合には、レセプターは、生体分子、ポリペプチド、酵素、または核酸である。
【００２３】
ある場合には、リガンドは、有機分子、例えば、製薬化合物または小型分子（例えば、約６００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を持つ分子）、またはポリペプチドである。
【００２４】
ある場合には、複数の混合物は、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉ、未結合レセプター、および未結合リガンドから成る平衡を実現する。
【００２５】
ある場合には、本法は、レセプター-リガンド結合対を解離させる条件下で使用が可能な液体クロマトグラフィー、例えば、逆相液体クロマトグラフィーの使用を含む。
【００２６】
ある場合には、レセプター結合リガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは限外ろ過を用いて複数の混合物のそれぞれから分離される。
【００２７】
ある場合には、信号応答は質量分析を用いて定量される。
【００２８】
ある場合には、本法は、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉを破壊することを含む。
【００２９】
ある場合には、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉの信号応答は、複数の混合物それぞれにおいて、該レセプター-リガンド結合対ＥＳｉにおけるリガンドＳｉの相対的量を測定することによって定量される。
【００３０】
ある場合には、リガンドＳｉの相対量は、質量分析器から得られる信号応答を評価することによって定量される。
【００３１】
別の局面では、本発明は、レセプター-リガンド結合対の平衡解離定数Ｋｄを定量する方法を特質とする。前記方法は、下記の工程を含む。すなわち、
（ａ）レセプター-リガンド結合対のリガンドに対して較正された質量分析器を設けること、
（ｂ）複数の混合物であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０およびリガンド［Ｓ］０を含み、Ｅ０およびＳ０の内の１つ以上の濃度が、Ｅに対するＳの結合親和度が定量可能となるように選択される、複数の混合物を供給すること、
（ｃ）複数の混合物それぞれを、結合したレセプター-リガンド結合対ＥＳ、未結合レセプター、および未結合リガンドから成る平衡に達せしめること、
（ｄ）複数の混合物のそれぞれからレセプター結合リガンドを分離すること、
（ｅ）複数の混合物のそれぞれにおいて、質量分析器から得られるレセプター-リガンド結合対の信号応答を定量すること、および、
（ｆ）工程ａ−ｅにおいて知られ、測定され、または獲得された情報を用いて、複数の混合物それぞれについて、レセプター-リガンドペアの濃度［ＥＳ］、および、初期の、既知のリガンド濃度［Ｓ］０を、式（Ｉ）の等式：
【００３２】
【数５】
に適合させ、
レセプター-リガンド結合対のＫｄを生成すること。
【００３３】
ある場合には、複数の混合物は、それぞれ、レセプターの初期濃度［Ｅ］０、および、リガンドの、既知の初期濃度［Ｓ］０を含み、［Ｅ］０は、複数の混合物のそれぞれにおいて同じであり、［Ｓ］０は複数の混合物のそれぞれにおいて変動される。
【００３４】
ある場合には、本法はさらに、混合物におけるレセプター初期濃度［Ｅ］０を定量することを含む。
【００３５】
ある場合には、レセプターは、生体分子、ポリペプチド、酵素、または核酸である。
【００３６】
ある場合には、リガンドは、有機分子、例えば、製薬化合物または小型分子（例えば、約６００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を持つ分子）、またはポリペプチドである。
【００３７】
ある場合には、複数の混合物は、レセプター-リガンド結合対、未結合レセプター、および未結合リガンドの平衡を達成する。
【００３８】
ある場合には、レセプター結合リガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて混合物から分離される。
【００３９】
ある場合には、本法は、液体クロマトグラフィーを使用することを含む。
【００４０】
ある場合には、本法はさらに、例えば、高温条件下で逆相液体クロマトグラフィーを用いてレセプター-リガンド結合対ＥＳを破壊することを含む。
【００４１】
ある場合には、レセプター-リガンド結合対の濃度［ＥＳ］は、複数の混合物のそれぞれについて、レセプター-リガンド結合対ＥＳにおけるリガンドの量を測定することによって定量される。
【００４２】
別の局面において、本発明は、レセプター-リガンド結合対の結合速度動態の分析法を特質とする。この方法は下記の工程を含む。すなわち、
（ａ）レセプター［Ｅ］０、および、リガンド［Ｓｉ］０を含む混合物を供給すること、
（ｂ）混合物を、レセプター［Ｅ］、リガンド［Ｓｉ］、およびレセプター-リガンド結合対［ＥＳｉ］の平衡に達せしめること、
（ｃ）混合物を、過剰な競合的インヒビターＩによって処理すること、
（ｄ）複数の時点においてレセプター-リガンド結合対の減少を
（ｉ）未結合リガンドからレセプターリガンド結合対を分離すること
（ｉｉ）前記複数時点それぞれにおいて、レセプター-リガンド結合対の信号応答を分析装置によって定量することによって測定すること、および、
（ｅ）工程（ａ）−（ｄ）において知られ、測定され、または獲得された情報を用いて、レセプター-リガンド結合対の結合速度動態を評価することである。
【００４３】
ある場合では、レセプター-リガンド結合対の信号応答は分析装置によって測定される。
【００４４】
ある場合では、混合物は複数のリガンドＳｉを含む。
【００４５】
ある場合、例えば、混合物が複数のリガンドＳｉを含む場合、複数のリガンドＳｉの少なくとも９０％は一意の分子量を持つ。
【００４６】
ある場合では、結合速度動態は、知られ、測定され、または獲得された情報を用いて評価され、レセプター-リガンド結合対の信号応答の時間変化を、式（ＸＶＩＩＩ）の等式：
【００４７】
【数６】
またはその導関数に適合させることによって、レセプター-リガンド結合対の解離速度ｋｓ２を計算する。
【００４８】
ある場合では、本法は、非競合的に結合するリガンドを特定する工程であって、リガンド-レセプター結合対が、複数時点のそれぞれにおいて比較的定常な濃度を維持する場合、そのリガンドはレセプターに非競合的に結合するものとされる、特定工程を含む。
【００４９】
ある場合には、複数のリガンドＳｉの内の少なくとも２つの結合動態が比較される。
【００５０】
ある場合には、レセプターは、生体分子、ポリペプチド、酵素、または核酸である。
【００５１】
ある場合には、リガンドおよび／または競合的インヒビターは、有機分子、例えば、製薬化合物または小型分子（例えば、約６００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を持つ分子）、またはポリペプチドである。
【００５２】
ある場合には、本法は、レセプター結合リガンドを液体クロマトグラフィーの機能に委ねることを含む。
【００５３】
ある場合には、レセプター結合リガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて未結合リガンドから分離される。
【００５４】
ある場合には、信号応答は質量分析を用いて定量される。
【００５５】
ある場合には、本法はさらに、レセプター-リガンド結合対を破壊することを含む。
【００５６】
ある場合には、レセプター-リガンド結合対の信号応答は、該レセプター-リガンド結合対におけるリガンドの相対的量を測定することによって定量される。
【００５７】
ある場合には、本法はさらに、レセプター-リガンド結合対の半減期ｔ１／２を定めることを含む。
【００５８】
１つの局面において、本発明は、あるサンプルにおいてレセプター-リガンド複合体を特定する方法を特質とする。該方法は下記の工程を含む。すなわち、
（ａ）レセプター-リガンド複合体を含むサンプルを供給すること、
（ｂ）サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、サイズ排除クロマトグラフィーで得られる溶出液をＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブを通過させること、
（ｃ）ＵＶ検出器を用いてサンプル中のレセプター-リガンド複合体を検出する工程であって、該レセプター-リガンド複合体の検出は、ＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブと連通するコントローラーを活性化し、コントローラーはレセプター-リガンド複合体がサンプルループ中に存在する時点でマルチポートバルブを活性化するように較正され、マルチポートバルブの活性化はサンプルループ中のレセプター-リガンド複合体をクロマトグラフィー装置に転送させ、および、
（ｄ）レセプター-リガンド複合体中にリガンドを特定し、それによってレセプター-リガンド複合体を特定することである。
【００５９】
ある場合には、サンプルはまた未結合のリガンドを含む。
【００６０】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体は未結合リガンドから分離される。
【００６１】
ある場合には、方法はまたレセプター-リガンド複合体を解離することを含む。
【００６２】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体の解離はクロマトグラフィー装置で起こる。
【００６３】
レセプター-リガンド複合体のレセプターは、例えば、ポリペプチド、酵素、または核酸であってもよい。
【００６４】
レセプター-リガンド複合体のリガンドは、例えば、ポリペプチド、有機分子、または核酸であってもよい。
【００６５】
ある場合には、コントローラーは手動で較正される。また別のある場合には、コントローラーは、コンピュータソフトウェアプログラムによって較正される。
【００６６】
ある場合には、クロマトグラフィー装置は逆相カラムである。
【００６７】
ある場合には、解離リガンドは質量分析によって特定される。
【００６８】
ある場合には、リガンドは特定用タグを欠如する。ある場合には、リガンドは、特定用タグ、例えば、蛍光タグ、または放射性タグであってもよい特定用タグを持つ。
【００６９】
別の局面では、本発明は、サンプルにおいて複数のレセプター-リガンド複合体を特定する方法を特質とする。方法は下記を含む。すなわち、
（ａ）複数のレセプター-リガンド複合体を含むサンプルを供給すること、
（ｂ）サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、サイズ排除クロマトグラフィーで得られる溶出液をＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブを通過させること、
（ｃ）ＵＶ検出器を用いてサンプル中のレセプター-リガンド複合体を検出する工程であって、該レセプター-リガンド複合体の検出は、ＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブと連通するコントローラーを活性化し、コントローラーは、レセプター-リガンド複合体の少なくとも一部がサンプルループ中に存在する時点でマルチポートバルブを活性化するように較正され、マルチポートバルブの活性化はサンプルループ中に存在するレセプター-リガンド複合体をクロマトグラフィー装置に転送させ、および、
（ｄ）解離レセプター-リガンド複合体から得られた解離リガンドを特定することである。
【００７０】
ある場合には、サンプルはまた複数の未結合リガンドを含む。
【００７１】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体は未結合リガンドから分離される。
【００７２】
ある場合には、方法は、複数の解離リガンドを特定することを含む。
【００７３】
ある場合には、方法は単一レセプターを含む。
【００７４】
ある場合には、方法はまたレセプター-リガンド複合体を解離することを含む。
【００７５】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体の解離はクロマトグラフィー装置で起こる。
【００７６】
レセプター-リガンド複合体のレセプターは、例えば、ポリペプチド、酵素、または核酸であってもよい。レセプター-リガンド複合体のリガンドは、例えば、ポリペプチド、有機分子、または核酸であってもよい。
【００７７】
ある場合には、コントローラーは手動で較正される。また別のある場合には、コントローラーは、コンピュータソフトウェアプログラムによって較正される。
【００７８】
ある場合には、クロマトグラフィー装置は逆相カラムである。
【００７９】
ある場合には、１つ以上の解離リガンドが質量分析によって特定される。
【００８０】
ある場合には、リガンドは特定用タグを欠如する。ある場合には、リガンドは、特定用タグ、例えば、蛍光タグ、または放射性タグであってもよい特定用タグを持つ。
【００８１】
ある場合には、複数のリガンドの少なくとも約９０％が一意の分子量を持つ。例えば、リガンドの約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％が一意の分子量を持ってもよい。
【００８２】
ある場合には、本発明は、望ましい結合特性を持つ１つ以上の化学化合物を特定する過程に関する。一般に、そのような化合物は、下記の工程を用いて特定される。すなわち、（１）第１リガンドの化学的構造の構造的変種（すなわち、関連化合物）としてのリガンド混合物を供給すること（ある場合には、これらの化合物は、その分子量によって一意に特定することが可能である）、（２）構造変種の混合物を分析し、起源のリガンドのその生体分子レセプターに対する親和度に対し、構造的変種の相対的親和度を定性的に、および／または、定量的に序列化すること、および、（３）その結果を用いて望ましいリガンドを特定し、リガンドの混合、合成、および／または序列化から成る、その後のサイクルのための関連リガンドを設計することである。
【００８３】
本明細書に記載される方法のいずれのものも、繰り返し、すなわち反復的に、あるいは、継時的に、例えば、本明細書に記載される別の方法と交互に使用されてもよい。例えば、第１の方法を用いて、リガンド、またはリガンド混合物に関する結合情報（例えば、相対的結合親和度）を与えるのに用いたならば、別のリガンドは、第1の方法で得られた情報を用いるように設計または試験される。この別のリガンドは、例えば、第１の方法を用いて、あるいはそれと別に、本明細書に記載される第２の方法を用いてさらに評価されてもよい。例えば、リガンド混合物は、先ず、結合親和度の序列で評価し、次に、結合親和度情報を用いて新たなリガンドを設計し、その新たなリガンドを次に、親和度または結合動態によって序列化することも可能である。
【００８４】
本明細書に記載される１つ以上の方法の結果を用いて、評価のために、新たな追加リガンドの合成または集合を指令することが可能である一方、ある例では、単一リガンド、またはリガンド混合物を、方法の１つ以上の工程が再試行される複数の方法、または単一法を用いて評価することが可能である。例えば、単一リガンド、またはリガンド混合物は、結合親和度（例えば、Ｋｄ）を定量することによって、さらにまた、結合速度（例えば、ｋｏｆｆ）を定量することによって評価することが可能である。結合親和度および結合速度動態を定量するこれらの方法は、任意の順序で実行することが可能であり、また、反復的に実行することも可能である。ある場合には、方法の再現性を確かめるために、単一の方法が、同じリガンドまたはリガンド混合物について実行される。
【００８５】
本明細書に記載される方法は、サンプル中のレセプター-リガンド複合体を特定するのに極めて効率的な方法である。これらの方法は、レセプター-リガンド複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー段階から、分析装置、例えば、ＬＣ−ＭＳ装置に直接配送することが可能であり、この配置は、高速のサンプルスクリーニングを可能とするばかりでなく、分画収集器の使用、または、分析装置表面に対するサンプルの付着によるサンプル損失の低下をも可能とする。さらに、本法の望ましい出力は、単一リガンドではなく、リガンド混合物（例えば、結合ライブラリー）によって実現が可能であり、それらリガンドの生成を必要としない。ある場合には、本明細書に記載される方法は、サンプルをミクロンスケールで操作する能力を付与するという利点を持つ。従って、ある１つのレセプターに対して、一度に多数の化合物をスクリーニングすることが可能である。前述の方法はまた、高い感度を持つことが可能なので、マイクロスケールサンプルの正確な検出と特性解明が可能である。さらに、分析用の望ましい生成物を求める探求において分析装置から溶出される溶出液についてランダムサンプリングを行うのではなく、代表的サンプルを、試料が実際にサンプリングループの中にある時にのみ収集することが可能である。
【００８６】
本明細書に記載される過程は、レセプター-リガンド相互作用を最適化するための極めて一般的なシステムを提供することが可能であり、かつ、多様なたんぱく質クラス、例えば、可溶タンパク、膜関連タンパク、酵素、核ホルモンレセプター、および、Ｇタンパク結合レセプター（ＧＰＣＲ）を含むタンパク（ただし、それらに限定されない）と小型分子との相互作用に適用が可能である。さらに、本過程は、その出力について生化学アッセイを要せず、１回の実験当たり通常５μｇ未満の、ごく少量の精製タンパク、または他の生体分子レセプターしか利用しない。さらに、本明細書に記載される方法は、その実行に際してレセプターの構造に関する知識を要しない。さらに、方法の望ましい出力は、リガンドの混合物（例えば、結合ライブラリー）において実現が可能であり、リガンドの精製を要しない。
【００８７】
本発明の１つ以上の実施態様の詳細を、付属の図面と下記の説明において記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明と図面、および特許請求項から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８８】
（詳細な説明）
米国特許第６，２０７，８６１号は、質量符号化結合ライブラリーの製作法、および、それら質量符号化結合ライブラリーにおいて、１個以上の生体分子と会合する化合物を特定する（すなわち、スクリーニングする）方法に関する。この質量符号化ライブラリーは、個々の化合物の少なくとも約９０％（すなわち、９０以上１００以下の任意の整数パーセント）が、その質量符号化ライブラリーの他の個別化合物の分子量とは異なる分子量を持つように設計・合成される。
【００８９】
米国特許第６，２０７，８６１号のスクリーニング法は、自動化リガンド特定システム（ＡＬＩＳ）と呼ばれるシステムを記載する。このＡＬＩＳシステムは一般に下記のように機能する。（１）対象とする生体分子（例えば、タンパク）の溶液を、リガンド（例えば、小型有機分子、またはそのライブラリー）の存在下に、指定の時間インキュベートして、生体分子-リガンド複合体形成反応を平衡に達しさせる、（２）生体分子溶液、未結合リガンド、および生体分子-リガンド複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー段階を通過させ、生体分子、プラス生体分子-リガンド複合体を、未結合のリガンドから、分子サイズに基づいて分離する、すなわち、生体分子、プラス生体分子-リガンド複合体を、溶出流の先頭において共同溶出させる、（３）生体分子、プラス生体分子-リガンド複合体を含むが、未結合のリガンドを全く含まない、この溶出流部分を逆相クロマトグラフィー段階に載せて脱塩し、さらに、その有機分子が、分子量、または質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定され、較正された信号応答の測定によって定量化されるように質量分析装置に溶出させる。
【００９０】
本明細書に記載される方法は、米国特許第６，２０７，８６１号の技術を応用するもので、本法もまた、レセプター-リガンドペアの定量分析は、分析装置または検出器（例えば、質量分析器、ＨＰＬＣ、ＵＶ、ＩＲ、ＮＭＲ等）から得られる、ある範囲のリガンド濃度に渡って実行されたリガンド結合実験におけるリガンド回収に相当する信号応答を分析することによって実現可能であるという発見に一部基づく。この場合、リガンド回収は、未結合リガンドと結合リガンドの分離（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲルろ過、超遠心による）に基づく。これらの実験は、レセプター-リガンド結合の速度論および平衡熱力学を記載するモデルに数学的に一致させることが可能なデータを生む。このモデルは、レセプターとリガンドの混合物について、解離平衡定数（Ｋｄ）、レセプター初期濃度［Ｒ］０、および解離の絶対速度（オフ速度、ｋｏｆｆ）の推定値を与えることが可能である。
【００９１】
「解離平衡定数」（Ｋｄ）という用語は、Ｅ＋Ｓ＝ＥＳタイプの反応において、逆方向速度定数と前進方向速度定数の比を表す。平衡時には、解離平衡定数（Ｋｄ）は、反応物の濃度の積を、生成物の濃度で割ったものに等しい（Ｋｄ＝［Ｅ］［Ｓ］／［ＥＳ］）。Ｋｄの値が小さければ小さいほど、会合反応物同士の結合性相互作用は強い。親和（会合）定数は、該平衡定数の逆数である。
【００９２】
レセプターにたいするリガンドの可逆的結合は下記：
【００９３】
【数７】
のように表される。
【００９４】
Ｋｄは下記：
【００９５】
【数８】
のように表される。
【００９６】
ある場合には、ｋｏｎはｋ１と表され、ｋｏｆｆはｋ２と表される。
【００９７】
全レセプター初期濃度［Ｅ］０は、開放レセプターの濃度［Ｅ］、プラス、結合レセプターの濃度［ＥＳ］として定義される（［Ｅ］０＝［Ｅ］＋［ＥＳ］）。全リガンド濃度［Ｓ］０は、遊離リガンドの濃度、プラス、結合リガンドの濃度と定義される（［Ｓ］０＝［Ｓ］＋［ＥＳ］）。
【００９８】
従って、Ｋｄは、平衡複合体濃度［ＥＳ］と、初期受容濃度［Ｅ］０と基質濃度［Ｓ］０の項を用いて下記：
【００９９】
【数９】
のように表される。
【０１００】
Ｋｄを求めるためには、複合体平衡濃度［ＥＳ］、レセプター初期濃度［Ｅ］０および基質初期濃度［Ｓ］０を知るか、確定しなければならない。
【０１０１】
［ＥＳ］は、実験的に測定することが可能である（例えば、結合リガンドを、未結合リガンドから分離するためにサイズ排除クロマトグラフィーを用い、その後、液体クロマトグラフィーによってレセプター-リガンド複合体を分解し、さらにその後、リガンドに対して較正された質量分析器による質量分析によって）。
【０１０２】
［Ｓ］０は、既知か、または推定することが可能である。
【０１０３】
［Ｅ］０は条件によって変動する可能性があり、実験的に定められる。［Ｅ］０を測定するために、そのレセプターに対してリガンドを滴定することが可能である。複合体［ＥＳ］の復帰は［Ｅ］０の値で最大値に達し、対応する滴定曲線は下記の方程式：
【０１０４】
【数１０】
に一致させることが可能である。その結果は、レセプター-リガンド複合体の平衡濃度ＥＳを、パラメータＫｄ、［Ｓ］０、および［Ｅ］０の関数として表す。任意のＫｄおよび［Ｅ］０について、［ＥＳ］対［Ｓ］０のプロットは、図１に示す直角双曲線に従う。この曲線の厳密な形は、調べられるリガンドのＫｄに依存する。図２に示すように、［ＥＳ］へ向かう漸近極限値は［Ｅ］０に依存する。この態様は飽和結合と記述される。
【０１０５】
様々な［Ｓ］０値における較正実験によって測定された一組の［ＥＳ］値が与えられたならば、方程式を、数値による非直線性回帰技術を用いて［ＥＳ］、［Ｓ］０データペアに適合させ、パラメータＫｄおよび［Ｅ］０に対する最適合数値を見出すことが可能である（図３参照）。
【０１０６】
単一レセプターに対する単一リガンドの相互作用を記載するのに用いられたものと同じ式が、複数の化合物（例えば、複数のリガンド）の混合物と単一レセプター結合部位との相互作用を記載するのに、下記に示すように、使用することが可能である。
Ｅ＋Ｓ１＋Ｓ２＋．．．Ｓｉ→ＥＳ１＋ＥＳ２＋．．．ＥＳｉ
各リガンドＳｉに対するＫｄは下式：
【０１０７】
【数１１】
のように表される。この式は、単一リガンドの場合の前述のＫｄ式の類推によって、
【０１０８】
【数１２】
に拡張される。
【０１０９】
リガンドＳ１についてはある範囲の濃度、第２のリガンドＳ２については固定濃度という、理論的２成分混合物の式（Ｉ）の連立方程式解によって、図４に注記する条件に対して、図示のようなレセプター-リガンド複合体濃度［ＥＳ１］および［ＥＳ２］のグラフが得られる。既知のリガンドＳ１の初期濃度［Ｓ１］０が増すにつれて、対応するレセプター-リガンド複合体濃度［ＥＳ１］も増加する。ところが、Ｓ１およびＳ２がレセプターに競合的に結合する（例えば、オルソステリック結合）場合、レセプター-リガンド複合体濃度［ＥＳ２］は減少する。なぜなら、高濃度のＳ１が、レセプターＥの結合部位を争ってＳ２を押し退けるからである。
【０１１０】
混合物中に複数のリガンドが存在する場合、第２リガンドに比べて、受容器に対して相対的に弱い結合親和度を持つ第１リガンドは、滴定剤（例えば、既知の競合的リガンド）に対し、第２リガンドよりも低い濃度で押し退けられる。例えば、複数の未知のリガンドの存在下に、ある酵素の既知のインヒビターを滴定する場合、相対的結合親和度は、その複数のリガンドが、競合的リガンドによって酵素から押し退けられる順番を評価することによって定めることが可能である。
【０１１１】
「ＡＣＥ５０」という用語は、対象リガンドに対し、競合体不在の場合の対象リガンドの濃度値の１／２（５０％）に低下させるのに必要な競合化合物の濃度を指す。ＡＣＥ５０は、対象リガンドおよび競合因子の平衡結合定数Ｋｄ、および、レセプターおよびリガンド濃度等のパラメータに依存する。ＡＣＥ５０は、既知の化合物が、対象リガンドを押し退ける濃度を表す数値であるが、これは、生化学的または生物物理学的ＩＣ５０の定義と逆である。なぜなら、後者は、対象リガンドが、既知の化合物、例えば、放射性リガンドを押し退ける濃度を表すからである。従来のＩＣ５０値とは対照的に、より高いＡＣＥ５０は、より親和度の高いリガンドであることを示す。すなわち、対象化合物を結合部位から移動させるのに、競合因子のより高い濃度が必要とされるからである。
【０１１２】
レセプターＥが対象リガンドＳｉのプールに対して相対的に過剰に存在し、レセプター-リガンドプール混合物が別の競合リガンドによって滴定される実験条件下では、プールの成分間の競合は無関係であり、対象リガンドＳｉについて観察される外見上唯一の競合は、該リガンドＳｉと添加競合因子の間の競合だけである。
【０１１３】
複数の化合物の親和度を同時にランク付けするためにＡＣＥ５０法がどのように使われるのかを示す、様々のＫｄを持つ３種のリガンドの混合物に関する結合移動シミュレーション実験が図５ａに提示される。このシミュレーションでは、全プール成分の全体濃度（[Ｓ１]０＝［Ｓ２］０＝［Ｓ３］０＝１．０μＭ）は、全体レセプター濃度（５．０μＭ）の桁である。この条件下では、ライブラリー間競合はごく少なく、個々のライブラリー成分は滴定剤とのみ競合する。ＡＣＥ５０値は、リガンド濃度に対しては感受性を持たない。任意の１つのリガンド濃度が９倍変動しても同じ親和度序列を与える。方法のこの特質は、リガンド濃度が、ブロック反応性の構築能力の差によって変動する可能性のある場合に、合成混合物を直接評価する際には有利となる。レセプター濃度よりもプール濃度の方が高い場合の結果が図５ｂに示される。このシミュレーションに示される極端な場合には、異なるＫｄを持つ３種のリガンドは、３種のライブラリー成分それぞれの全体リガンド濃度が５μＭであり、レセプター濃度が２μＭである場合、ほぼ等しいＡＣＥ５０値を与える。
【０１１４】
リガンド混合物から得られるＡＣＥ５０データからＫｄ情報を抽出することは、リガンドの二重混合物Ｓｉの溶液と添加競合因子に還元される。
【０１１５】
前述の原理を用いると、全体レセプター濃度を［Ｅ０］、リガンドＳｉの全体リガンド濃度を［Ｓｉ］０とすると、Ｋｄの式（すなわち、Ｋｄｉ）は、下記の式（Ｉ）：
【０１１６】
【数１３】
で表される。
【０１１７】
競合リガンドＳ１が不在の場合、リガンドＳ２のＫｄ式（すなわち、Ｋｄｉ）は、下記の式（ＩＩ）に示す式：
【０１１８】
【数１４】
に単純化される。
【０１１９】
単純に、かつ読み易くするために、下記の等式では、次の名称を使用する。
【０１２０】
ｋｄ１＝Ｋｄ１
ｋｄ２＝Ｋｄ２
ｓ１０＝［Ｓ１］０
ｓ２０＝［Ｓ２］０
ｅ０＝［Ｅ］０
ｅｓ１＝［ＥＳ１］
ｅｓ２＝［ＥＳ２］
。
【０１２１】
［ＥＳ２］に関する式（ＩＩ）を解くと２つの解が得られ、実数解は下記の式（ＩＩＩ）：
【０１２２】
【数１５】
で示される。
【０１２３】
この式は、競合因子Ｓ１欠如の場合の［ＥＳ２］の値を表す。この数値の半分は、定義により、競合因子Ｓ１の全体濃度［Ｓ１］０がＡＣＥ５０に等しい場合に存在する［ＥＳ２］の量である。
【０１２４】
［ＥＳ２］について式（ＩＩＩ）を解くと２つの解が得られ、実数解は下記の式（ＩＶ）：
【０１２５】
【数１６】
で示される。
【０１２６】
この式は、競合因子Ｓ１と競合している場合の［ＥＳ２］の値を与える。式（ＩＶ）の右辺（ｒｈｓ）を、右辺の１／２に等しいと設定し、［ＥＳ１］について解くと下記の式（Ｖ）：
【０１２７】
【数１７】
が得られる。
【０１２８】
式（Ｖ）は、［ＥＳ２］が競合因子Ｓ１不在時の値の１／２である場合の［ＥＳ１］の値を表す。言い換えれば、これは、［Ｓ１］０＝ＡＣＥ５０の場合の［ＥＳ１］の値である。
【０１２９】
類推から、［ＥＳ１］について解くと２つの解が得られ、実数解は、下記の式（ＶＩ）：
【０１３０】
【数１８】
に示すものとなる。
【０１３１】
ＡＣＥ５０における［ＥＳ２］の値−これは、式（ＩＩＩ）のｒｈｓの１／２である−を、競合因子Ｓ２と競合している時の［ＥＳ１］の値の式−式（ＶＩ）である−に代入すると、下記の式（ＶＩＩ）：
【０１３２】
【数１９】
が得られる。
【０１３３】
上の式（Ｖ）および（ＶＩＩ）の両方とも、［Ｓ１］０＝ＡＣＥ５０における［ＥＳ１］の式である。式（Ｖ）のｒｈｓを式（ＶＩＩ）のｒｈｓに等しく設定し、［Ｓ１］０について解くと、下記の式が得られる。これは、［ＥＳ２］が、競合因子不在時の値の１／２である場合の［Ｓ１］０の値である。言い換えれば、下式の［Ｓ１］０はＡＣＥ５０に等しく、競合因子Ｋｄ１および対象リガンドＫｄ２のＫｄ、レセプター全体濃度［Ｅ］０、および滴定されるリガンドの全体濃度［Ｓ２］０で表される：
【０１３４】
【数２０】
。
【０１３５】
式（ＶＩＩＩ）によって、任意の一組の実験パラメータＫｄ１、Ｋｄ２、Ｅ０、および［Ｓ２］０におけるＡＣＥ５０値を予想することが可能になる。さらにこの式を用いてＡＣＥ５０決定のためのパラメータを最適化することが可能なる。
【０１３６】
Ｋｄ２について、式（ＶＩＩＩ）を解くと４個の解が得られ、その内実数解は、Ｋｄ２を、ＡＣＥ５０、競合因子Ｋｄ１のＫｄ、レセプター全体濃度Ｅ０、および、滴定されるリガンドの全体濃度［Ｓ２］０で表した式である。図６に示すように、式（Ｉ）の厳密解は膨大で扱いにくく、ＡＣＥ５０、Ｋｄ１、Ｅ０および［Ｓ２］０の実験値からＫｄ２の値を導くための別法として、ＡＣＥ５０、Ｋｄ１、Ｅ０および［Ｓ２］０を入力パラメータとして用い、Ｋｄ２について、式（ＶＩＩＩ）の数値解を求めるやり方がある。
【０１３７】
図７は、化合物Ｓ１、Ｓ２およびＳ３の三重混合物を、既知のリガンドＳ１によって滴定した場合の理論的結果を示す。リガンドの全体濃度（添加競合因子を除く）は、レセプター全体濃度よりも低いことに注意されたい。この状況では、混合物中の化合物は互いに競合的ではなく、ただ、過剰に加えられたリガンドとのみ競合すると考えられる。
【０１３８】
Ｋｄ２＝０．５μＭの、２．０μＭのオルソステリック競合性リガンドＳ２の存在下に、Ｓ１で滴定すると、ＥＳ１についてより浅い結合曲線が得られ、タンパク-リガンド複合体ＥＳ２の濃度は、レセプターがＳ１によって飽和されるにつれて減少する。ＥＳ１のＥＳ２に対する比は、レセプターが制限的試薬である場合（すなわち、滴定剤とリガンドとが、レセプター部位を争って競合しなければならない場合）、滴定剤の全体濃度［Ｓ１］０と共に直線的に増加する。この直線関係は、もっとも単純にはレセプターとのオルソステリックな相互作用によって説明される、相互に排他的な競合結合を示し、下記の式：
【０１３９】
【数２１】
によって記述される。
【０１４０】
従って、ＥＳ２に対するＥＳ１のリガンド回収の比、対、滴定剤の全体濃度［Ｓ１］０のプロットは、［Ｓ１］０＞［Ｅ］０の場合、オルソステリックリガンド同士について直線を与える。もしも滴定剤とリガンドのＭＳ反応較正係数が既知であるならば、この直線の勾配は、リガンドと滴定剤の親和度の比を、リガンドの濃度で割った値に等しい。
【０１４１】
複数のリガンドが１つのレセプターに結合するのを記述する際に本明細書で用いる「オルソステリック」という用語は、同じレセプター部位に結合し、一般に互いに排他的に結合する複数のリガンドを指す。例えば、１つのリガンドがレセプターに結合する場合、それは、別のリガンドのレセプターに対する結合を物理的に阻止する。
【０１４２】
前述の方法の例を図８に示す。図７のデータの正規化プロットは、混合物中のリガンドのＡＣＥ５０値は、それぞれのＫｄの関数として変動することを示す。ある範囲の［Ｓ１］０値において測定された一組のＡＣＥ５０が与えられた場合、リガンド混合物の各成分の、タンパク標的に対する親和度をランク付けすることが可能である。さらに、各リガンドＳｉのＡＣＥ５０値に基づいて、図６に示した方程式を解くことによって、個々の結合親和度Ｋｄｉに関する定量的推定が得られる。
【０１４３】
アロステリック結合の三重複合体モデルを下記に示す。このモデルでは、リガンドＳ１およびＳ２は、それぞれ、解離定数Ｋｄ１およびＫｄ２を持ってレセプターＥの別々の部位に結合する。しかしながら、もしも両リガンドがレセプターに同時に結合した場合、両者は、係数αだけ相互の結合定数に影響を及ぼし合う。例えば、Ｓ１は、解定数Ｋｄ１においてＥに結合するが、二重複合体ＥＳ２に結合して、解離定数αＫｄ１において３重複合体ＥＳ１Ｓ２を形成する。α＞１の場合、複数のリガンドの一方によるアロステリック相互作用は、他方の解離定数を増し、負の協力性をもたらす。α＜１の場合は、一方のリガンドによるアロステリック相互作用は、他方の結合には影響を与えない。
【０１４４】
【数２２】
。
【０１４５】
混合成分を分離するためにサイズ排除法を用いることは、一般に、アロステリックに結合した３重複合体から、タンパク-リガンドの２重複合体を分離しない。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた場合、タンパク様分子種は全てＳＥＣ段階から共に溶出する。従って、ある特定のリガンドの回収測定値は、そのリガンドを含むタンパク-リガンド複合体の合計を表す。例えば、回収されたＳ１は、生成物ＥＳ１およびＥＳ１Ｓ２の合計濃度と相関する。図９は、Ｋｄ１＝２．０μＭを持つＳ１を、５．０μＭ濃度のレセプターＥと、Ｋｄ２＝０．５μＭを持つ、２．０μＭ濃度のＳ２との混合物において滴定した場合の、２つのアロステリックリガンドの回収シミュレーションを示す。協調係数α＝１０では、２つの部位の間の負の協調性のために、滴定剤の濃度の増加と共にＳ２の回収が減少する。しかしながら、その回収は、先にオルソステリック結合競合で見た場合のように、ゼロまで低下することはなく、むしろ、レセプター濃度は定常であり（Ｓ２の結合部位は滴定剤によって占拠されない）、一方、Ｋｄ２は係数αだけ増加するので、リガンド回収はプラトーに至る。これは、２つのリガンドの回収比に対して、重要かつ測定可能な影響を持つ。該比は、レセプター制限的条件下では、滴定剤濃度と共に直線的に増加するのではなく、下記の式（ＩＸ）：
【０１４６】
【数２３】
のように双曲線となる。その極限値は、式（Ｘ）：
【０１４７】
【数２４】
の値である。負の協力性が大きい場合、その相互関係は、相互に排他的な競合的結合と区別がつかない。この時式（ＩＸ）の右辺は、式（ＸＩ）：
【０１４８】
【数２５】
の右辺に還元される。
【０１４９】
リガンドのＫｄ、リガンドの全体濃度［Ｓ２］０、レセプター全体濃度［Ｅ］０、および、滴定剤とリガンドの相対的ＭＳ反応較正係数が与えられている場合、アロステリック競合リガンドに対するＡＣＥ５０滴定から得られた反応比データから、滴定剤のＫｄおよび協力性係数αが得られる。図１０のＡＣＥ５０反応比データの非直線性回帰分析によって、ＮＧＤ−２８８３５について、協力性係数α＝８．３±０．７、および３．０±０．３μＭのＫｄ値が得られた。このＫｄ値は、基本的キナーゼに対して行った独立の滴定実験によって測定された３．３±１．３μＭという値とよく一致する。
【０１５０】
図１１Ａ−Ｆは、いくつかのＡｋｔ−１について行った結合モードの同時決定を示す。滴定剤スタウロスポリンによる飽和結合は、これらのリガンドを定量的には押し退けることはしないが、反応比曲線対滴定剤濃度は漸近境界を持つ。これは、全リガンドが、ＡＴＰ／スタウロスポリン結合部位に関してアロステリックに結合することを示す（図１１ａと１１ｂ）。これと対照的に、最近知られるＡｋｔ−１リガンドＭ−１（メルク社）による競合は、この同じ化合物の混合物の各成分に対してオルソステリック結合競合を実現する。これらの結果は、Ｍ−１化合物と、それにたいして直接競合するリガンドは、ＡＴＰ／スタウロスポリン結合部位とは別の場所に結合することを示唆する（図１１ｃおよび１１ｄ）。
【０１５１】
この結論を独立して評価するために、図１２ａ−ｄに示すように、Ｍ−１およびスタウロスポリンによるＡｋｔ−１キナーゼ活性の抑制を、ＡＴＰ濃度を変動させて調べた。スタウロスポリンは、ＡＴＰ-結合部位に結合する。この含意と一致して、ＡＴＰ濃度を増加させると、ナノモルインヒビタースタウロスポリンのＩＣ５０測定値を５０倍以上増す。理論に拘束されることを望むものではないが、ＡＴＰ濃度増加によるスタウロスポリンＩＣ５０の増加は、主に、ＡＴＰ Ｋｍの増加による。この反応におけるスタウロスポリンのＶｍａｘに及ぼす作用は、ＡＴＰの高濃度においても僅かなものである。これらの結果は、スタウロスポリンが、ＡＴＰのオルソステリック競合因子であることを確実にする。（図１２ａおよび１２ｂ）。
【０１５２】
Ｍ−１のＩＣ５０はマイクロモルにしか過ぎないが、そのＩＣ５０は、同じＡＴＰ濃度範囲に対して、スタウロスポリンのナノモルＩＣ５０よりも小さい倍率でしか増加しない。ＡＴＰ濃度増加に伴うＭ−１ ＩＣ５０の増加は、Ｖｍａｘの５倍の減少と、スタウロスポリンにおいて観察されたものよりも小さいＫｍの増加とが合わさったためである。これらの結果は、Ｍ−１は、Ａｋｔ−１に対する混合型、非競合的インヒビターであり、ＡＴＰ変位（ＡＴＰ Ｋｍの増加）と、Ａｋｔ−１キナーゼ活性の遅滞（Ｖｍａｘ減少）を含む生化学的作用機構を示し、かつ、Ｍ−１は、Ａｋｔ−１における、ＡＴＰ−およびスタウロスポリン結合ポケットとは場所的には別の部位に結合することを裏付ける。（図１２ｃおよび１２ｄ）。この結論は、Ｍ−１とスタウロスポリンはＡｋｔ−１に同時に結合することを示唆するＡＣＥ５０の結果とも一致する。さらに、その結果は、ＡＣＥ５０技術が、どのようにしてリガンド混合物のオルソステリックおよびアロステリック結合機構を評価するのに用いられるかを例示する。
【０１５３】
Ａｋｔ−１結合メカニズムの詳細を示すことの他に、Ｍ−１滴定実験はまた、混合物成分の親和度ランキングを与える。ＮＧＤ−２８８３９は、最高のＡＣＥ５０値ｗ持つ。これは、この物質が、このテスト混合物の中でもっとも高い親和度を持つリガンドであることを示している。なぜなら、この物質は、移動のために、滴定物質Ｍ−１の最高濃度を要求するからである。ＮＧＤ−２８８３９は、混合物成分の中でもっとも優れた生化学活性を示す。すなわち、５０μＭ濃度においてＡｋｔ−１キナーゼ活性の４４±８％抑制を実現する。図５におけるＮＧＤ−２８８３９のＡＣＥ５０値は、Ｍ−１のＫｄが０．３±０．１の場合、Ｋｄが３．５±０．７μＭ（９５％信頼間隔１．５から１０．２μＭ）に一致して４．１μＭ（９５％信頼間隔３．４から５．０μＭ）である。この混合物における他のリガンドは、Ａｋｔ−１に対して、ＮＧＤ−２８８３９よりも弱い抑制活性を示した。これは、ＡＣＥ５０滴定実験によってそれらがより低い親和度を持つという所見と一致する。
【０１５４】
ＡＣＥ５０による化合物混合物における親和度ランキング付け、および親和度最適化はさらに図１３ａ−ｂに示される。この図では、ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ２、ＧＰＣＲに対して小規模ライブラリーのリガンドが用いられた。このリガンドプールは、ＡＳ−ＭＳによる、質量符号化ライブラリーの高処理スクリーニングによって発見されたいくつかの化合物を代表する化学タイプを始め、いくつかのＮＧＤ−３３４６の構造的類縁体を含む。既知のＭ２リガンド、アトロピンを、成分当たり０．５μＭの化合物プールの存在下に、２．０μＭ Ｍ２に対して滴定剤として用いた。反応比プロットは直線的であり（図１３ｂ）、試験リガンドは全てアトロピンとオルソステリックに競合することを示した。この結果と一致して、独立した生化学アッセイを行ったところ、試験リガンドは全て、アトロピン同様、Ｍ２の拮抗剤であることが示された。ＡＣＥ５０曲線は親和度における明瞭な差を示し、ＮＧＤ−３３５０は、同種の構造体ＮＧＤ−３３４８およびＮＧＤ−３３４６よりも１０倍高い親和度を示した（図１３ａ）。独立した生化学活性測定はこの結果を確認した。ＮＧＤ−３３５０は、細胞によるｃＡＭＰアッセイにおいて１．６μＭのＩＣ５０を示し、Ｍ２拮抗性に関する組織によるアッセイでは９．６μＭのＩＣ５０を示した。残りの化合物は全て、ｃＡＭＰアッセイにおいて僅かなＭ２拮抗活性を示したけれども、組織において目立った活性を示したのはＮＧＤ−３３５０のみであった。これらの結果は、複数の化合物、特に、組み合わせ化学技術によって合成された構造的類縁体の混合物について、親和度によってそれらを同時にランク付けし、前駆体に対して親和度を向上させた化合物、例えば、母体化合物ＮＧＤ−３３４６に対して親和度を向上させたＮＧＤ−３３５０を特定する点においてＡＣＥ５０法が有利であることを強調するものである。
【０１５５】
単一部位平衡結合における生成物と反応因子の平衡濃度は、平衡解離定数Ｋｄで表されるが、この平衡解離定数は、下式（ＸＩＩ）：
【０１５６】
【数２６】
に示されるように、解離速度定数ｋ２の会合速度定数ｋ１に対する比として表される。この式から、任意の会合速度定数ｋ１において、解離速度定数ｋ２の値がより低くなると、より小さいＫｄ値が得られ、従って、所望のタンパク-リガンド複合体の平衡濃度がより高くなることが見て取れる。
【０１５７】
レセプター-リガンド複合体Ｅ-Ｓ（または、もっと簡単に書くとＥＳ）濃度の、時間に対する全体変化率、ｄＥＳ／ｄｔは、形成速度と分解速度の差である（式（ＸＩＩＩ）参照）。
【０１５８】
【数２７】
ＥＳの形成速度は、会合速度定数ｋ１、レセプターＥ０の全体濃度、および、リガンドＳ０の全体濃度に依存し、一方、ＥＳの解離速度は、ＥＳ濃度、および解離速度定数ｋ２に依存する。従って、レセプターと単一リガンド間の、単一部位における可逆的結合については、下記の式（ＸＩＶ）：
【０１５９】
【数２８】
を用いて、ｄＥＳ／ｄｔをモデル化することが可能である。ｄＥＳ／ｄｔがゼロの場合（定義上、システムが平衡にある場合である）、式（ＸＩＶ）は、式（ＸＩＩ）の平衡式に還元されることに注意すべきである。
【０１６０】
前述の単一リガンド-単一部位平衡との類推に基づいて、リガンドＳと抑制性リガンドＩの間の競合的結合を下記に記述する。式（ＸＶ）：
【０１６１】
【数２９】
に示すように、開放レセプターＥは、遊離リガンドＳと反応して複合体ＥＳを形成するか、または、遊離インヒビターＩと反応して複合体ＥＩを形成することが可能である。タンパク-リガンド複合体ＥＳ、およびＥＩの濃度の全体変化速度は、それぞれ、式（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩ）：
【０１６２】
【数３０】
によって表される。本システムの挙動は、システムパラメータ、すなわち、Ｅ０、レセプター全体濃度；Ｓ０およびＩ０、リガンドおよびインヒビターの全体濃度；混合物中の相互作用成分における会合および解離速度ｋｓ１、ｋｓ２、ｋｉ１、およびｋｉ２；および、ＥＳおよびＥＩの初期濃度に関する数値が与えられた場合、前記２つの連立方程式の数値解を用いることによってモデル化することが可能である。
【０１６３】
ＥＳの初期値がゼロに等しく無い場合の連立方程式（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩ）を解くことによって、過剰のインヒビターが突然に添加された場合の、システムの時間的変動をモデル化することが可能である。大量の過剰なインヒビターＩがＥＳの溶液に添加された場合、ＥとＳの会合速度ｋｓ１はゼロと推定することができる。その理由は、レセプター-リガンド複合体ＥＳが解離すると、そのレセプターは次にインヒビターＩに結合されるからである。なぜなら、Ｉは大量に存在するので、ＥＳ複合体には解離しか残されておらず、ＥとＳにとって再会合する道は閉ざされているからである。従って、ＳとＩとがＥに対して競合的に結合する場合、大量で過剰なインヒビターＩは、Ｅの結合部位の実質的に全てを占拠する。式（ＸＶＩＩＩ）は、大量で過剰なインヒビターＩがＥＳの混合物に添加された場合の、式（ＸＶＩ）：
【０１６４】
【数３１】
の解を示す。
【０１６５】
図１４−１７は、インヒビター濃度の変化、および、図示の他のパラメータ、例えば、リガンドＳおよびインヒビターＩの会合速度および解離速度を含めたパラメータの変動に暴露した場合の、レセプター-リガンド複合体の反応の時間的変化をシミュレートする数学的モデル実験の例である。方程式を解くと、レセプター-リガンド複合体の解離速度ｋ２および半減期が得られる。ｋｓ２のｔ１／２に対する関係は式（ＸＩＸ）：
【０１６６】
【数３２】
に示される。
【０１６７】
図１４は、典型的な会合・解離速度を持つ５μＭのレセプターおよび１μＭのリガンドから成るシステムに、元のレセプター−リガンド平衡混合物の１：１希釈液と共に、大量で過剰なインヒビターを、リガンド濃度は定常に維持するようにしながら添加したものの数学的モデルである。前述したように、インヒビターが、レセプターを争ってリガンドと競合する速度は、レセプター−リガンド複合体の解離速度と、インヒビターとレセプターの会合速度に依存する。図１４の結果は、インヒビターが様々な会合速度を持つ場合について示される。レセプターを、平衡したレセプター−リガンド混合物と等しいリガンド全体濃度を含む非会合性インヒビター（ｋｉ１＝０）で希釈すると、最初に、元の値の５０％に至る低下があり、次に（活性なインヒビターが不在の場合）システムは自ずから新たな平衡に回復する。しかしながら、過剰な会合性インヒビターの存在下では（ｋｉ１≠０）、開放レセプターは、もしあれば、全てインヒビターによって、レセプター−リガンド複合体が再形成されないように塞がれてしまう。さらに、レセプター−リガンド複合体でもし自発的に解離するものでもあれば、その速度はｋｓ２に依存するのであるが、その開放されたレセプターは過剰なインヒビターによって塞がれる。従って、レセプター−リガンド複合体の相当濃度が、過剰なインヒビターの添加後時間と共に減少する。結合速度が極めて遅いインヒビターの場合でも（ｋｉ１＝０．００１μＭ−１秒−１）、分解曲線の勾配は、純粋な解離速度論から得られる理論的分解曲線［ＥＳ］０ｅ−ｋｓ２ｔ（式ＸＶＩＩＩ）のものに近づくことが見て取れる。分解が指数関数に従うにつれて、実験的分解曲線と理論的曲線の類似性は、図１５に示すように、プロットをログ空間で比較した場合にさらに明白である。
【０１６８】
例えば、過剰なＩを、複数のリガンドとレセプターとの混合物に導入した場合、その複数のリガンドの結合速度を相対的に決定することは可能である。Ｉが十分過剰の場合、リガンドは、一旦レセプターから離れたならばレセプターに再度結合することはないのであるから、リガンド混合物において、その信号応答がもっとも速く減少するリガンドは、それらのリガンドの内でもっとも早い解離速度を持つと判定することができる。
【０１６９】
この方法の例は図１６に示される。この図は、典型的なレセプター−リガンド会合速度を持ち、レセプター−リガンド解離速度を変えながら、５μＭタンパクおよび１μＭリガンドから成るシステムに、元のレセプター−リガンド平衡混合物の１：１希釈液と共に、大量で過剰なインヒビターを、リガンド濃度は定常に維持するようにしながら添加したものを数学的に示す。モデル化した各リガンド解離速度ごとに、純粋な解離速度論から得られる理論的分解曲線［ＥＳｕｂ］０ｅ−ｋｓｕｂ２．ｔ（式（ＸＶＩＩＩ））も示してある。モデルは、レセプター−リガンド複合体の減少速度は、絶対的解離速度の緊密に相関することを示す。
【０１７０】
モデル化された競合結合実験におけるレセプター−リガンド複合体の分解速度と、純粋な解離速度の測定から期待される理論的分解曲線との間の厳密な相関度は図１７において評価される。モデル化分解曲線はｋｓ１＝０．０１秒−１の場合について示され、理論曲線は、解離速度±この値の１０％として示される。結果から、測定解離速度は、実際値の〜１０％以内であり、これは、実験法の単純さと考え合わせると、実際の解離速度に関する極めて良好な近似である。
【０１７１】
実験的に測定された分解曲線が、第一次の解離速度論から期待される指数関数的分解曲線と緊密に合致するのであるから、各リガンドの解離速度と半減期情報を抽出するために、市販の曲線適合アルゴリスム、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）によって支給されるものを用いて、実験データを純粋の指数関数的分解関数に合致させることも可能である。過剰な競合的インヒビターを、タンパクと、１つの、または複数の対象リガンドとの平衡した混合物に添加した後に実行する逐次実験によって得られた、一組のタンパク−リガンド複合体測定濃度値の時間的変化が与えられた場合、各リガンドの解離速度を定量的に評価し、混合物における複数のリガンドの相対的速度を定量的にランク付けすることが可能である。
【０１７２】
「非競合的リガンド」という用語は、活性部位とは別の第２部位においてレセプターに結合するリガンドを指す。非競合的リガンドの結合は、別のリガンドと同時に起こり得るし（例えば、酵素の触媒部位で）、または、レセプターのみに結合してなおレセプターの反応に影響を及ぼすことも可能である。ある場合には、非競合的リガンド（例えば、酵素に対する非競合的リガンド）は、レセプターの効力を低減させる（例えば、酵素の効力を減らす、活性部位の配置を含めたレセプターの立体配置を変える）ことによって作用することが可能である。
【０１７３】
リガンドが非競合的リガンドである場合、過剰なインヒビターＩの導入は、その非競合的リガンドがレセプター−リガンド複合体から解離したとしても、その再会合を阻止するように作用しない。従って、非競合的リガンドの信号応答の時間変化は、過剰なインヒビターの添加後も、定常なままである。
【０１７４】
複数のリガンド同士を比較し、好ましい結合特性を持つリガンドを特定する、もう１つの方法は、「レセプター制限的」および「過剰なレセプター」条件下でリガンド結合を比較することを含む。固定濃度の「初発」（例えば、既知）リガンドＳｉ、および、第２の「変動」（例えば、関連または改善）リガンドＳｖから成る、理論的２成分混合物に関する下記の連立方程式（Ｉ）：
【０１７５】
【数３３】
を解くと、図に注した条件下で、図１８に示すレセプター−リガンド複合体濃度［ＥＳｉ］および［ＥＳｖ］のグラフ表示が得られる。レセプター全体濃度［Ｅ］０を、［Ｅ］０＜［Ｓｉ］０から［Ｅ］０＞［Ｓｉ］０まで増すにつれて、実験条件は「レセプター制限的」から「レセプター過剰」へと進行すると書き表せる。緊密なリガンドのレセプター−リガンド複合体の、弱いリガンドの複合体に対する比は、実験がレセプター制限的条件に近づくに従って増加する。これは、より緊密なリガンドが、存在する限定量のレセプターを争ってより弱いリガンドに打ち克つことを示す。従って、質量符号化混合物中のリガンドの結合親和度のランク付けは、初期化合物（例えば、元のリード化合物）を含む複数のリガンドの混合物を、レセプター制限的条件下と、レセプター過剰条件下別々に、レセプターに接触させ、レセプター−リガンド複合体をアフィニティー選択質量分析によって定量化し、各リガンドの信号応答比を比較することによって実現される。その際、比とは、１）レセプター不在下のリガンドの信号応答の、レセプター過剰下の各リガンドの信号応答に対する比、および、２）レセプター不在下のリガンドの信号の、レセプター制限的条件下における信号応答に対する比である。
【０１７６】
本明細書に記載される方法は、混合物の成分を、サイズ排除クロマトグラフィーによって未結合リガンドをレセプターおよびレセプター結合リガンドから分離し、次に液体クロマトグラフィーを用いることによって実行することが可能である。液体クロマトグラフィーは、リガンドからレセプターを解離する条件下で実行することが可能である。次に、この解離されたレセプターを質量分析器に通過させて、信号応答を得る。
【０１７７】
図１９は、左から右へ、本明細書に記載される方法においてサンプル内のレセプター−リガンド複合体が特定される際に、リガンドが辿る経路を示す。レセプター、リガンド、およびレセプター−リガンド複合体を含むサンプルは、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）を通過させられる。ここでは、溶出液は、ＵＶ検出器（ＵＶ１）によって監視される。次に、サンプルはサンプルループに入り、ここで、第２分析装置に転送されるか、または出口（例えば、廃棄口）に振り向けられ、ここでは、図１９に示すように、第２のＵＶ検出器（ＵＶ２）によって監視することが可能である。
【０１７８】
液体サンプル中のレセプターの有無を判定するために、多くのスクリーニングおよび分析技術は光吸収検出器（例えば、ＵＶ、蛍光）に依存する。ＵＶ検出器は、その検出器を通過する材料によるＵＶ光の吸収を測定する。通常、チャートにおいて、吸収は時間に対してプロットされる。材料は、サイズ排除クロマトグラフィー装置を通過した後、検出され、出力ピークがチャートまたはモニター上に形成される。ピークの大きさ（すなわち、容量）は、特定の波長におけるサンプルまたは材料による吸収の程度に一致する。
【０１７９】
サンプル材料をＵＶ検出器にかける前に、レセプター−リガンド複合体は、先ず、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、未結合リガンドおよびその他の不純物から分離される。サンプルの各分離成分は、ＵＶトレース中にピークを記録し、これはチャートに作成される。大きな物理的サイズを持つ分子種は、サイズ排除クロマトグラフィーから溶出される最初の分子種であり、早期のＵＶピークを記録する。例えば、タンパクであるレセプターと、小型分子であるリガンドを有し、レセプターおよびリガンドのあるものはレセプター−リガンド複合体を形成しているサンプルの場合、レセプターとレセプター−リガンド複合体とは、溶出流の先頭部において共同溶出する。これは、小型分子リガンドのはるかに小さいサイズに比べて、タンパクが比較的大型であるためである。
【０１８０】
「サイズ排除クロマトグラフィー」（ＳＥＣ）という用語は、異なるサイズを持つ分子を分離するために多孔性粒子を使用することを指す。このものは一般に生物分子を分離するため、分子量およびポリマーの分子量分布を決めるために用いられる。一般に、孔径よりも小さい分子は粒子の中に入ることができるので、粒子の中に入ることのできない比較的大型の分子よりも長い経路を経ることとなり、長い転送時間を要する。孔径よりも大きな分子は孔に侵入できないので、クロマトグラムにおいて第１ピークとして一緒に溶出されない。この条件を全的排除と呼ぶ。孔に入ることが可能な分子は、分子のサイズと形に依存する、粒子における平均滞在時間を持つ。従って、様々な分子は、カラムを通過するのに、異なる全体転送時間を持つことになる。ポアサイズよりも小さな分子は全ての孔に入ることができるので、カラムにおいて最長の滞在時間を持ち、クロマトグラムでは最終ピークとして共同溶出する。
【０１８１】
サンプルは、ＳＥＣを溶出流（「ＳＥＣ溶出流」）として脱け出し、ＵＶ検出器を通過する。図２０Ａに描くように、ＳＥＣ溶出流１０は、高速２位置６ポート選択バルブ４に取り付けられたサンプルループ１を通過し（例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００μｌサンプルループ）、溶出流出口１２に、ＵＶ検出器（図示せず）がレセプター−リガンド複合体を含むピークを検出するまで流れ込む。サンプルループ１とバルブ４の、この初期位置を「負荷」位置と呼ぶ。
【０１８２】
レセプター−リガンド複合体を検出すると、コンピュータ（図示せず）に接続されたコントローラーは、サンプルループ１をレセプター−リガンド複合体で満たすのに十分な指定の時間（例えば、２−５秒）にセットされたタイマーを起動する。一旦サンプルループ１がレセプター−リガンド複合体で満たされたならば、コントローラーは、２位置６ポート選択バルブ４におけるサンプルループ１を、図２０Ｂに描かれる位置に回転させる。従って、充填サンプルループは、サンプル中の全レセプター−リガンド複合体の代表的な見解を含む。
【０１８３】
この位置は「注入」位置と呼ばれる。図２０Ｂで見られるように、ＳＥＣ溶出液１０および溶出流出液１２はサンプルループ１にはもはや接続されず、サンプルループ１は、分析装置に接続される別の溶出流につながれる。分析装置溶出液１４ａ（例えば、溶媒）は、サンプルループ１に流入し、通過し、サンプルループ１を、サンプル溶出液１４ｂとして脱け出す。ここで、サンプル溶出液１４ｂは特定のために分析装置（図示せず）に流入する（例えば、質量分析）。
【０１８４】
分析装置の規模は、小型またはミクロサンプルを含む、各種サイズのサンプルを扱うように合わせることが可能である。１５μｌのサンプルループのサンプルパラメータは下記の通りである。ＳＥＣから複数ポートバルブ４への接続チューブは３５ｃｍｘ７５μｍ、サンプルループは８４ｃｍｘ１５０μｍ、分析装置溶出流１４ａをサンプルループに接続するチューブは４０ｃｍｘ２０μｍ、サンプルループから分析装置（すなわち、サンプル溶出液）１４ｂへの接続チューブは５０ｃｍｘ１００μｍ、および、サンプルループから溶出流出口１２への接続チューブは４５ｃｍｘ７５μｍである。ＳＥＣ後の溶出液を収集するのに用いられるサンプルループは、ポリマーでコートした毛細管で構成される。次に、所望の長さ（すなわち、所望の容量）の毛細管を巻いてループとし、占有スペースを低減させる。
【０１８５】
コントローラーは手動で、例えば、ＵＶピーク検出とタイマーを観察する人が操作することも可能である。あるいは別に、コントローラーはコンピュータに接続して、ソフトウェアプログラムによって操作することが可能である。例えば、ソフトウェアプログラムは、ＵＶ検出器がレセプター−リガンド複合体を検出するのと同時にタイマーをスタートし、その際、指定の時間に、コントローラーは、サンプルループ１を、図２０Ａに示す負荷位置から図２０Ｂに示す注入位置へと回転させる。
【０１８６】
ある場合には、コントローラーを操作するために用いられるソフトウェアは、ディジタルとアナログの両インプットを備えた、国立装置データ獲得（ＤＡＱ）ボードの周囲に構築される。サイズ排除クロマトグラフィーシステムの接点が、ディジタルインプットの内の１つに接続される。サンプル注入が実行されると、接点は閉鎖され、ディジタルインプットはトリガーされる。これは、コントローラーにサンプル分析試行が開始したことを告知する。
【０１８７】
本明細書に記載される方法は、各検出器がサンプルの吸収レベルに対して−１Ｖから＋１Ｖの範囲のアナログ信号を発する、２つのＵＶ検出器を用いることが可能である。例えば、第１ＵＶ検出器は、ＳＥＣカラム（すなわち、ＳＥＣ溶出液１０の流れの中に）と複数ポートバルブ４の間に配置してよい。第２ＵＶ検出器は、流出溶出流１２の流れの中に配置してもよい。信号は、コントローラーのアナログインプットの内の２つに接続される。信号は、１２ビットアナログディジタル（Ａ／Ｄ）変換器によってディジタルに変換される。次に、コントローラーは、このディジタル信号を用いて、ＵＶ検出器を通過したピークを追跡することが可能となる。
【０１８８】
サイズ排除クロマトグラフィーの性質のせいで、ＵＶ検出器を脱出する最初のピークは、一般に、レセプター−リガンド複合体と開放レセプターを含むピークである。コントローラーは、信号の最初の上昇を待ち構えていて、それをピークと登録する。サンプルループにおけるピーク（すなわち、サンプル）の捕捉は、このピークの検出と同時に起動されるタイマーに基づく。
【０１８９】
ＵＶ検出器を通過する溶媒を押し出すポンプの流速は定常で２ｍＬ／分であってもよい。この流速では、１００μＬサンプルループを充填するのに３．３秒かかる。従って、ピーク特定後サンプルループ１を検出される物質で満たすのに必要な遅延時間は約３．３秒である。しかしながら、ＵＶ検出器からコントローラーに至るまでに恐らく信号遅延が起こるので、遅延時間は、各システム構成毎に実験的に決定される（すなわち、システムは較正され、システムの各変更毎に改めて較正される）。容量と流速はサンプル毎に変わるものではないから、ＵＶ検出器からサンプルループまでの移動時間に変化がもしあるとすれば、それは、溶媒ポンプによって生じる流速のゆらぎのみに起因する。従って、チューブ配置に何かの変更が加えられた場合（例えば、システムが変更された場合、または何かの部品が交換または調整された場合）、そうとあからさまに表示はされないが、遅延時間に関する再評価が必要である。
【０１９０】
２つのＵＶ検出器を用いて、複数ポートバルブの回転−これによって、サンプルループに捕捉されたサンプルはＬＣ−ＭＳのような分析装置に振り向けられる−前後のデータを捕捉することが可能となる。２つのＵＶ検出器のデータをプロットすることによって、各サンプルのサンプル捕捉状態が視覚的に描かれる。一方の検出器は、レセプター−リガンド複合体を追跡し、コントローラーによって、サンプルループとバルブの回転タイミングを取るのに利用される。第２検出器は、分析装置から遠ざけられるサンプルフローに接続される。この検出器からのトレースは、サンプルループに捕捉されないものを明らかにする。上記２つのトレースを比較することによって、ピーク捕捉の効率が明らかにされる。
【０１９１】
ＵＶ装置におけるサンプル検出の正確度を向上させるために、アルゴリスムを用いてデータを収集・処理し、ピーク（すなわち、レセプター−リガンド複合体の存在）の存在を判定する。ＤＡＱボードは、２０ｋＨｚの最大周波数でデータを収集する。しかしながら、多くの場合、生のデータはピーク特定に用いるにはあまりにも不安定である。例えば、低タンパク濃度のサンプルは信号雑音のために見失うことがあり得る。従って、アルゴリスムを用いて、データを滑らかにし、高信頼度のデータ出力を得ることも可能である。
【０１９２】
現在使用されるアルゴリスムは、あらかじめ設定された時間間隔で複数セットの生データを収集し、平均する。次に、これら平均化セットをさらに処理して、データの移動平均を作成する。その結果をコントローラーはピークを求めて追跡する。例えば、１０ｋＨｚのサンプリングレート（毎秒１０，０００データポイント）では、５００ポイントの生データから成る複数セットが連続的に収集され、５０ミリ秒毎に平均される。最初の７セット（それぞれ５００ポイントの生データから成る）を、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと表示する。ＡからＥまでのセットを平均してデータポイント１を作成する。ＢからＦまでのセットを平均してデータポイント２を作成する。ＣからＧまでのセットを平均してデータポイント３を作成し、以下同様の手順を繰り返す。このデータポイントはコントロールシステムによってプロットされ、ピークの有無に関して検査される。
【０１９３】
ピーク検出のための基準は、単に、初期閾値に対して数値の上で増えている連続する３データポイントの位置を求めることである。この閾値は、その期間はサンプルバッファーしかＵＶ検出器を通過しない、データ捕捉の最初の２秒間データポイントを追跡して決める。この時の最高データポイントを閾値に設定する。これによって、バッファーによるＵＶ吸収を始め、基線ノイズによる信号変動のために生じる擬似陽性ピークへのヒットが排除される。この閾値は、ユーザーによって、要すれば随意にさらに指定の量だけ増やされてもよい。
【０１９４】
サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー５０ｍｍカラムの上に、リン酸バッファーを用いて２ｍＬ／分の流速で流した場合のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とリガンドの分離・特定の代表的結果を図２１に示す。ＵＶ１およびＵＶ２トレースの相対的高さは、各ピークが、再現可能的に、同じ量だけ（〜６０％相対的ピーク面積）カットされていることを示す。ピークの保持時間はほとんど同一であるが、これは適正なシステム操作にとって必要ではない。ピークの検出とカットは、ピークの位置について相対的に動的に行われるので、保持時間は無関係である。
【０１９５】
ピークカット時間の変更は簡単に修正され、ＨＳＡシステムにおいてそのようにした結果が図２２Ａ−２２Ｆに示される。従って、記載の方法を用いた場合、注入ポートバルブの負荷位置から注入位置への変更のタイミングは、ユーザーが収集したいのはピークのどの部分なのかに応じて調整することが可能である。図２２Ａは、２秒後にサンプルループに捕捉されたピークの部分を示す。図２２Ｂは、２．５秒後にサンプルループに捕捉されたピークの部分を示す。図２２Ｃ−２２Ｆは、それぞれ、３．０秒、３．５秒、４．０秒、４．５秒後にサンプルループに捕捉されたピークの部分を示す。図２２Ａ−２２Ｆに見られるように、検出からサンプルループの回転までの遅延時間をコントローラーによって変えることによって、サンプルループにおいて、ピークの異なる部分（例えば、検出されるレセプター−リガンド複合体の異なる部分）の捕捉が可能である。プロットの垂直線は、サンプルループに捕捉されたサンプルの１００μＬ部分にほぼ相当する。図示のデータでは、３秒（図２２Ｃ参照）が遅延時間として最適値である。
【０１９６】
予想サンプル移動時間は計算されるけれども、バルブ死腔やＵＶ検出器の指定値からのバラツキは較正を必要とする。検出器出力の時間遅れも、考慮しなければならない要因である。各場合について、サンプルの較正試行を行うことによって、これらの要因による移動時間の変動を確定することが可能である。
【０１９７】
サンプルループのサイズを増すことによってサンプルピークのより大きな部分を捕捉することが可能である。しかしながら、多くの場合、ピークの先頭部分がもっとも望ましい部分である。なぜなら、この部分は、レセプター−リガンド複合体を含むばかりでなく、何かの理由で紛れ込む未結合リガンドを含む可能性がもっとも低いからである。紛れ込みとは、小型の分子が、その実際の質量よりも、見かけ上はるかに大きい質量と共にサイズ排除クロマトグラフィーを通過し、タンパク信号と見分けられないピークとして現れることが観察される現象である。
【０１９８】
「信号応答」という用語は、分析装置または検出器（例えば、質量分析器、ＵＶ、蛍光、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＩＲ等）の出力であって、その分析装置に存在する対象物質の量と測定可能なやり方で相関する出力を指す。特定の物質の信号応答は、物質そのものに関係するいくつかの要因（例えば、ＵＶ活性、イオン化電位等）を始め、分析装置または検出器に関係する要因（例えば、感度）にも依存する。ある物質の信号応答は、物質量に関して直線的であってもよい。しかしながら、信号応答は、物質の量に関して直線的である必要はなく、むしろ、信号応答は、評価される物質の量に測定可能なやり方で依存することだけが必要とされる。例えば、信号応答は、分析装置または検出器において分析される物質の量に対して対数的な、または指数関数的な関係を持ってもよい。
【０１９９】
「較正」という用語は、測定によって、または標準との比較によって、計器またはその他の測定装置の各スケール読み取りの適正値を確定することを指す。例えば、分析または測定装置（例えば、質量分析器）は、その真の値が既知の分析対象（例えば、複数濃度の複数リガンド）について複数の値を測定する、または判定することによって較正することが可能である。測定値は、真の測定結果である「絶対的」なものであってもよいし、測定値に相関する「相対的」なもので、数値範囲の上に測定値を表示するものであってもよい。
【０２００】
「質量分析器」とは、イオン化された原子または分子の質量対電荷比（ｍ／ｅ）における差を利用して、それらの原子または分子を相互に分離する分析装置を指す。従って、質量分析器は、原子または分子の定量、および分子に関する化学的、構造的情報を定めるのに有用である。分子はそれぞれに異なる断片化パターンを持ち、これが、構造成分を特定するための構造情報を与える。質量分析器の一般的操作は、（ａ）気体相イオンを作製すること、（ｂ）イオンを、それらの質量対電荷比に基づいて空間または時間において分離すること、および、（ｃ）各質量対電荷比のイオンの量を測定することである。質量分析器のイオン分離力は、その解像度によって表される。
【０２０１】
従来技術においてはたくさんのイオン源が知られる。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、電子イオン化（ＥＩ）、高速原子衝突イオン化（ＦＡＢ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電子捕捉（陰イオン化学的イオン化またはＮＩＣＩと呼ばれることもある）、および、大気圧化学イオン化（ＡｐＣＩ）である。上記イオン化法から任意に選ばれるもので生産されたイオンは、典型的には磁場である質量分離器、４重極電磁石、または飛行時間質量分離器を通過させられ、イオンの質量が区別され、各質量レベルにおけるイオンの数が定量されるように分離される。
【０２０２】
質量分析（ＭＳ）は、有機化学と無機化学の両方において分子の特性解明と特定のために広く利用されている技術である。ＭＳは、分子に関する分子量情報を提供する。ある分子の分子量は、複数の分子の混合物において特定の分子を特定するに当たって、決定的に重要な情報部分である。ＭＳ分析は、例えば、薬剤開発および製造、汚染コントロール分析、および化学的品質管理に利用される。
【０２０３】
「リガンド」という用語は、レセプターと会合する（例えば、共有的に、または非共有的に）分子を指す。ある場合には、リガンドのレセプターに対する結合は生物学的作用（例えば、共働作用、または拮抗作用）を持つことが可能である。例えば、リガンドは、生体分子（例えば、ＤＮＡ分子）に結合するポリペプチド（例えば、タンパク）であって、その際、タンパクのＤＮＡに対する結合がｍＲＮＡ合成を起動してもよい。リガンドはまた、酵素（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ）に結合する有機分子（例えば、製薬化合物）であって、その際、酵素に対する有機分子の結合が酵素活性を抑制してもよい。
【０２０４】
「異種リガンド」という用語は、元のリガンドと関連するが、そのリガンドとは異なる分子を指す。例えば、異種リガンドは、元のリガンドと同じコア構造を持つが、そのコア構造に１個以上の異なる末端基を付着させてもよい。この異種基は、例えば、メチル基をエチル基に変えただけの僅かな変動であってもよい。あるいは別に、異種基は、さらに大きな、例えば、アミド基を芳香基に変えるような著明な変動であってもよい。異種リガンドはまた、元のリガンドのコア構造を元にした変化、例えば、フェニル環をピリジル環に変化させる等の変化を含んでもよい。
【０２０５】
「ｉ」という単語は、レセプターと複数のリガンドの混合物における、１とリガンド数の間の整数であって、「ｉ」はその混合物における個別リガンドを表す。
【０２０６】
「有機分子」という用語は、非ペプチド化合物であって、炭素と水素を含み、さらに、窒素、酸素、リン、ハロゲン元素、または硫黄のような、さらに別の元素を含む分子（例えば、製薬化合物）を指す。製薬学的に受容可能な塩（例えば、マレイン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、酢酸、フマール酸、サリチル酸、クエン酸、乳酸、マンデル酸、酒石酸、および、メタンスルフォン酸の各塩）も「有機分子」という用語の意味の中に含まれる。
【０２０７】
「インヒビター」という用語は、レセプターに会合する分子であって、レセプターに会合することによって、レセプターの機能に作用する、または、レセプターの、別のリガンドとの会合を阻害する分子を指す。ある場合には、インヒビターは、リガンドと競合的なやり方で会合する。
【０２０８】
「レセプター」という用語は、第２分子と会合することによって、作用（例えば、生物学的活性または検出可能な信号）を可能とする、または、作用を起動する分子を指す。例えば、レセプターは、特定の細胞外信号分子（例えば、リガンド）に結合し、細胞中に反応を起動するタンパクであってもよい。細胞表面レセプターの例としては、アセチルコリンレセプター、およびインスリンレセプターが挙げられる。細胞内レセプターの例としてはホルモンであって、細胞膜を横切って細胞中に拡散するリガンドに結合するホルモンが挙げられる。レセプターの他の例としてはポリペプチド、タンパク、酵素、リボザイム、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および、生体分子模倣体が挙げられる。
【０２０９】
「生体分子」という用語は、生物活性（例えば、代謝、拮抗作用、共働作用、信号発射、または、転写）に作用を及ぼす分子を指す。生体分子は、生きている生物体に見出されるが、生体分子という用語は、天然に見られる生体分子に限定されず、天然に見られる生体分子の合成版を始め、それらの断片および改変をも含む。生体分子の例としてはポリペプチド、タンパク、酵素、リボザイム、ＲＮＡ、およびＤＮＡが挙げられる。
【０２１０】
「ポリペプチド」という用語は、複数のアミノ酸から構成されるポリマーを指す。タンパクはポリペプチドの１つの例となり得る。
【０２１１】
「酵素」という用語は、化学的または生化学的反応の反応速度を増すことによって（生体）触媒として機能する巨大分子、通常はタンパクを指す。一般に、酵素は、ただ１つの反応タイプ（すなわち、反応選択性）のみを触媒し、かつ、ただ１つのタイプの基質にしか作用しない（すなわち、基質選択性）。基質分子は、同じ部位で変形され（領域選択性）、一般に、基質のラセミペアの内ただ一方のキラル基質のみが変形される（エナンチオマー選択性、立体選択性の特殊形態）。
【０２１２】
「核酸」という用語は、ヌクレオチドサブユニットから構成されるポリマーを指す。ヌクレオチドサブユニットは、フォスフォジエステル結合によって繋ぎ合わせることが可能である。
【０２１３】
「レセプター−リガンド結合対」という用語は、一般に、可逆的なやり方で、非共有的な相互作用（例えば、水素結合、イオン相互作用、または疎水性相互作用）によって接合されるレセプターとリガンドを持つ複合体を指す。
【０２１４】
「滴定剤」という用語は、滴定反応における分析対象（例えば、レセプター）と定量的に反応する、および／または、相互作用を持つ物質（例えば、リガンド）を指す。滴定剤は、通常、反応および／または相互作用が完了するまで注意深く分析対象に添加される標準液である。分析対象の量は、反応完了に必要とされる滴定剤の容量から計算される。
【０２１５】
「滴定」という用語は、過程であって、それによって、１つの液（例えば、既知のＫｄを持つリガンド液）が、もう１つの液（例えば、基質とＫｄ既知のリガンドの混合液）に、前記２つの溶質（例えば、基質と推定Ｋｄを有するリガンド）の間の相互作用が完了するまで添加され、その時点で、一方のリガンド液の濃度（例えば、既知の、または推定Ｋｄを有するリガンドの濃度）が既知とされる、またはほぼ既知とされる過程を指す。
【０２１６】
「平衡」という用語は、化学的および／または生化学的可逆反応および／または相互作用における状態であって、反応物質が生成物に、生成物が反応物質に復帰するのと同じ速度で変換され、そのために、各反応物質および生成物の量は事実上定常のままであり続ける状態を指す。
【０２１７】
「レセプター−リガンド結合対を破壊する」という言説は、レセプター−リガンド結合対を解離させて未結合レセプターとリガンドに分離することを指す。レセプター−リガンド結合対の破壊は、様々の方法で、例えば、クロマトグラフィーの使用（例えば、高温下における高解像度逆相クロマトグラフィー）；圧、ｐＨ、塩濃度、温度、または有機溶媒濃度の変化；あるいは、レセプターに対する既知のリガンドとの競合、あるいは、上記技術の任意の組み合わせによって実現することが可能である。
【０２１８】
「液体クロマトグラフィー」という用語は、溶媒に溶解する複数のイオンおよび／または分子を分離するために使用されるクロマトグラフィー分析法を指す。サンプル溶液が第２の固相または液相に接すると、様々な溶質が、吸着、イオン交換、分配、またはサイズの違いによって異なる程度でその他相と相互作用を持つ。この違いを用いて、カラムを通過する各溶質の移動時間を定めることによって、混合物成分をそれぞれ分離することが可能である。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、液体に溶解した化合物を分離するための液体クロマトグラフィーの１つの形である。ＨＰＬＣ装置は、展開相の貯留槽、ポンプ、注入器、分離カラム、および検出器から成る。化合物は、プラグ一杯のサンプル混合液をカラムに注入することによって分離される。混合物中の異なる複数の成分は、液体の展開相と固定相の間の分配態様の違いによって異なる速度でカラムを通過する。
【０２１９】
「競合的結合因子」という用語は、ある特定部位（例えば、酵素の触媒部位）においてレセプターに結合するリガンドであって、その際に、動的平衡様過程において、別のリガンドと結合を競合するリガンドを指す。
【０２２０】
「質量符号化」という用語は、化学的化合物のセット（例えば、関連化合物、初期化合物、それらの異種または任意の組み合わせ）の品質であって、化合物セットの個別化合物の少なくとも約９０％が、該セットの他の化学的化合物全ての分子量とは異なる分子量を持つ化合物セット品質を指す。
【０２２１】
「閾値結合特性」という用語は、リガンドの任意の定義された特性であって、そのリガンドが標的と会合する能力の客観的特定を可能とする特性である。例えば、閾値結合特性は、リガンドの特定のＫｄ、例えば、Ｋｄ＜５０μＭ，＜２０μＭ、＜１０μＭ、＜１μＭ、＜０．５μＭ、＜０．１μＭ、＜０．０１μＭ等と定義することができる。閾値結合特性は、他の既知のリガンドに対して、例えば、ユーザー選択の、または望みの標準化合物に対して定性的または定量的に定義することが可能である。あるいは別に、リガンドの閾値結合特性は、他の複数のリガンドに対して定性的に定義する、例えば、閾値結合特性は、混合物内の最強結合リガンドと定義することも可能であるし、例えば、閾値結合特性は、混合物中のリガンドの半分よりも緊密に結合するリガンドと定義することも可能であるし、混合物のリガンドの３／４よりも緊密に結合するリガンド、混合物中の既知のリガンドよりも緊密に結合するリガンドと定義することも可能である。リガンドのｋｏｆｆ、半減期ｔ１／２、またはその他の結合特性を分析することによって、同じタイプの定量的、相対的結合特性を用いることも可能である。
【０２２２】
熟練した技術者によって了解されるように、本発明に使用される化合物（例えば、構造的に関連する変異種）を合成する方法は当業者にとっては明白である。さらに、各種合成工程は、所望の化合物を得るのに、別配列または別順序で実行することも可能である。本明細書に記載される化合物を合成するのに有用な、合成化学変形および保護基方法論（保護および脱保護）は従来技術で既知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、および、その後続版に記載されるものを含む。さらに、化合物、および／または、化合物ライブラリーは、商業供給源から購入が可能である。さらに、化合物は、前駆化合物を購入し、その後追加合成操作を行って所望の化合物を得、それらを組み合わせて製造することが可能である。
【実施例】
【０２２３】
（実施例１：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＫｄの決定および小型分子ワルファリン）
０．１２５ｐｍｏｌ、０．２５ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、および、４ｐｍｏｌのワルファリンを含む６個の実験サンプルを分析し、ワルファリンについて質量分析信号を関連付ける較正曲線を確立する。較正の正確度を上げるために、０．１２５ｐｍｏｌサンプルについては２個のデータポイントを得る。
【０２２４】
既知のワルファリン濃度［Ｓ］０を含む７つの実験サンプルを連続希釈で調製する。特に、８０、４０、２０、１０、５、２．５、または１．０ｕＭの全体［ワルファリン］から成る２ｕＬサンプルでは、ワルファリンについての較正信号強度は二重に測定される。このサンプルのそれぞれに、その濃度が厳密にではないが名目上は既知である一定量のＨＳＡを加える。この場合、名目上０．２ｕＭの［ＨＳＡ］を用いた。これらのサンプル液を、レセプター−リガンド（ＨＳＡ−ワルファリン）複合体が平衡に達するのに十分な時間、ざっと３０分共にインキュベートする。
【０２２５】
次に、この、ＨＳＡ、未結合ワルファリン、およびＨＳＡ−ワルファリン複合体から成る溶液をサイズ排除クロマトグラフィー段階に通過させ、分子サイズに基づいて、ＨＳＡとＨＳＡ−ワルファリン複合体とを溶出流の先頭部分において共に溶出させて、未結合ワルファリンから分離する。
【０２２６】
ＨＳＡとＨＳＡ−ワルファリン複合体とを含むが、未結合ワルファリンを全く含まない溶出流部分は、脱塩および質量分析器への溶出のために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。逆相クロマトグラフィーは事実上ＨＳＡ−ワルファリン複合体を破壊する。分離後、ワルファリンは、その分子量、または質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定される。次に、ワルファリンは、その較正信号応答測定によって定量される。
【０２２７】
ＨＳＡに結合していないワルファリンは全てサイズ排除によってＨＳＡ−ワルファリン複合体から分離されるので、質量分析器に到達したワルファリン（すなわち、回収リガンド）は全て、ＨＳＡ−ワルファリン複合体由来のものである。従って、ワルファリンの較正信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したＨＳＡ−ワルファリンの量と相関する。
【０２２８】
［ＨＳＡ−ワルファリン］と［ワルファリン］のデータペアは下記の式：
【０２２９】
【数３４】
に適合する。これによって、数値による非直線回帰法によってパラメータＫｄと［ＨＳＡ］０について最良適合値が得られる。
【０２３０】
前述の実験の結果が図２３に示される。パラメータＫｄと［ＨＳＡ］０は、数値により非直線回帰法によって、それぞれ、４．９ｕＭおよび０．１４ｕＭと推定された。Ｋｄの値は文献の値と良く一致する。［ＨＳＡ］０の値は、名目上のタンパク濃度の〜７５％は活性を持つ、すなわち、実験においてリガンドに結合する能力を持つことを示す。
【０２３１】
（実施例２：ブタ・ムスカリン性レセプター（ｐＭ２Ｒ）のレセプター−リガンドシステム）
一定濃度（４．０μＭ）のブタ・ムスカリン性レセプター（ｐＭ２Ｒ）、定常濃度（１μＭ）のリガンドＳｉ混合物（下記の表１参照）、および、漸増する濃度を持つ（０、０．１、０．２２、０．４６、１．０、２．２、４．６、１０、２２、４６、および１００μＭ）別の、既知のリガンド［Ｓ１］０（アトロピン）を含む、７個からなる一連の実験サンプルを調製する。これらのサンプル液を、各サンプルにおいて反応を形成するレセプター−リガンド複合体が平衡に達するのに十分な時間、ざっと３０分共にインキュベートする。
【０２３２】
次に、ｐＭ２Ｒ、未結合リガンド、およびｐＭ２Ｒ−リガンド複合体から成るこの溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに通過させ、分子サイズに基づいて、ｐＭ２ＲプラスｐＭ２Ｒ−リガンド複合体を溶出流の先頭部において共同溶出させて、未結合リガンドから分離する。次に、ｐＭ２ＲプラスｐＭ２Ｒ−リガンド複合体を含むが、未結合リガンドを全く含まない溶出流部分は、脱塩と質量分析器への溶出のために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。逆相クロマトグラフィーはレセプター−リガンド結合対を破壊・分離する。このようにして、逆相クロマトグラフィー後、リガンドは質量分析（ＭＳ）にかけられ、その分子量、または、質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定される。
【０２３３】
ｐＭ２Ｒに結合していないリガンドがあったとしてもそれらは全てサイズ排除によってｐＭ２Ｒ−リガンド複合体から分離される。従って、質量分析器に到達したリガンド（すなわち、回収リガンド）は全て、対応するｐＭ２Ｒ−リガンド複合体由来のものであり、各リガンドＳｉの質量分析信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したｐＭ２Ｒ−リガンドＲＬｉの量と相関する。
【０２３４】
一定濃度のリガンドとｐＭ２Ｒ濃度を持ち、添加される競合因子アトロピンの濃度を漸増させた場合の各実験サンプルのリガンド回収をプロットし、５０％抑制濃度点（ＡＣＥ５０値）を、混合物の各リガンドについて求める（図２４参照）。定量的化合物親和度は、ＡＣＥ５０値に基づいて決定される。ＡＣＥ５０値が高ければ高いほどＫｄは低い。
【０２３５】
Ｋｄの定量的確定のためには、ＡＣＥ５０値、ｐＭ２Ｒレセプター初期濃度［Ｅ］０、研究対象である混合物中の化合物の初期リガンド濃度［Ｓｉ］、および、競合因子アトロピンＫｄを、式（Ｉ）の解である図６に示す式に代入する。結果は図２５に示される。
【０２３６】
（表１：ＮＧＤ構造の表）
【０２３７】
【表１−１】
【０２３８】
【表１−２】
（実施例３：セリンキナーゼＺａｐ−７０、ＮＧＤ−６３８０およびスタウロスポリンのレセプター−リガンドシステム）
９μＭ Ｚａｐ−７０および１μＭ ＮＧＤ−６３８０の混合物を調製し、室温で３０分、すなわち、混合物において結合および未結合成分が平衡に達するのに十分な時間インキュベートする。Ｚａｐ−７０およびＮＧＤ−６３８０から成るこの混合液に、１００μＭのスタウロスポリンおよび１μＭのＮＧＤ−６３８０を含む混合液を加える（インヒビターの添加によってリガンド濃度を不変に保つ）。表２は、スタウロスポリンとＮＧＤ−６３８０の構造を示す。
【０２３９】
ＮＧＤ−６３８０の解離の時間的変化を、２０、３０、４０、６０、７０、８０、および１００分間隔で測定する。ＮＧＤ−６３８０の解離は下記のようにして測定する。Ｚａｐ−７０、未結合ＮＧＤ−６３８０、およびＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体から成る溶液の分液を、サイズ排除クロマトグラフィーに通過させて分子サイズに基づいて、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体を溶出流の先頭部において共同溶出させて、未結合のＮＧＤ−６３８０から分離する。次に、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体を含むが、未結合ＮＧＤ−６３８０を全く含まない溶出流部分は、脱塩とレセプター−リガンド結合対の分離のために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。このようにして、逆相クロマトグラフィー後、ＮＧＤ−６３８０は質量分析（ＭＳ）にかけられ、その際信号応答が記録される。
【０２４０】
Ｚａｐ−７０に結合していないＮＧＤ−６３８０があったとしてもそれは全てサイズ排除工程によってＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体から分離される。従って、質量分析器に到達したＮＧＤ−６３８０（すなわち、回収リガンド）は全て、対応するＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体由来のものであり、ＮＧＤ−６３８０の質量分析信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０の量と相関する。従って、Ｚａｐ−７０のＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体からの解離は、ＮＧＤ−６３８０の信号応答の時間的減少から見て取られる。
【０２４１】
ＮＧＤ−６３８０の信号応答の減少を時間の関数としてプロットし、この実験データを、プログラムＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標）（Ｗｏｌｆｒａｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，４．１バージョン）を用いて、式（ＸＶＩＩＩ）：
【０２４２】
【数３５】
の分解指数関数にフィットさせる。解離速度ｋｓ２および半減期ｔ１／２の両方を示す結果が図２６に示される。
【０２４３】
（表２：スタウロスポリンおよびＮＧＤ−６３８０の構造の表）
【０２４４】
【表２】
（実施例４：セリンキナーゼＺａｐ−７０、ＮＧＤ−７４６およびスタウロスポリンのレセプター−リガンドシステム）
９μＭ Ｚａｐ−７０および１μＭ ＮＧＤ−７４６の混合物を調製し、室温で３０分、すなわち、混合物において結合および未結合成分が平衡に達するのに十分な時間インキュベートする。Ｚａｐ−７０およびＮＧＤ−７４６から成るこの混合液に、１００μＭのスタウロスポリンおよび１μＭのＮＧＤ−７４６を含む混合液を加える（インヒビターの添加によってリガンド濃度を不変に保つ）。表３は、スタウロスポリンとＮＧＤ−７４６の構造を示す。
【０２４５】
ＮＧＤ−７４６の解離の時間的変化を、２０、３０、４０、５０、６０、および９０分間隔で測定する。ＮＧＤ−７４６の信号応答の減少を時間の関数としてプロットし、この実験データを、プログラムＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標）を用いて、式８の分解指数関数にフィットさせる。
【０２４６】
［ＥＳ］＝［ＥＳ］０ｅ−ｋｓ２ｔ
式（ＸＶＩＩ）
解離速度ｋｓ２および半減期ｔ１／２を示す結果が図２６に示される。
【０２４７】
（表３：スタウロスポリンおよびＮＧＤ−７４６の表）
【０２４８】
【表３】
（実施例５：セリンキナーゼＺａｐ−７０，リガンド混合物、およびスタウロスポリンのレセプター−リガンドシステム）
９μＭ Ｚａｐ−７０および、表３に示すリガンドの１μＭ混合液を調製し、室温で３０分、すなわち、混合物において結合および未結合成分が平衡に達するのに十分な時間インキュベートする。Ｚａｐ−７０およびリガンドから成るこの混合液に、１００μＭのスタウロスポリンおよび１μＭのリガンドを含む混合液を加える（インヒビターの添加によってリガンド濃度を不変に保つ）。
【０２４９】
リガンドの解離の時間的変化を、実施例３の場合のように、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、および１２０分間隔で測定する。リガンドの信号応答の減少を時間の関数としてプロットし、この実験データを、プログラムＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標）を用いて、式（ＸＶＩＩＩ）の分解指数関数にフィットさせる。
【０２５０】
［ＥＳｉ］＝［ＥＳｉ］０ｅ−ｋｓ２ｔ
式（ＸＶＩＩ）
半減期ｔ１／２を示す結果は図２７に示される。解離速度ｋｓ２は表４に示される。
【０２５１】
（表４：スタウロスポリンおよびＮＧＤ構造の表）
【０２５２】
【表４−１】
【０２５３】
【表４−２】
【０２５４】
【表４−３】
（実施例６：濃度漸増競合リガンドと、起源リガンドプラス構造変異種との間の競合による、混合物アフィニティー選択質量分析によるＫｄ評価）
ＺＡＰ−７０キナーゼ、高処理スクリーニング技術によって発見された、既知の、初発リガンドＮＧＤ−７４６、複数のＮＧＤ−７４６の構造変異種の質量符号化混合物から成るタンパク-リガンドモデルシステムについて下記の工程が実行される。
【０２５５】
１０μＭ名目濃度のレセプターＺＡＰ−７０、初発リガンドＮＧＤ−７４６を含む一定濃度（１μＭ）のリガンド混合液、および、漸増濃度（０、０．２２、０．４６、１、２．２、４．６、１０、２２、４６、１００μＭ）のＺａｐ−７０リガンドスタウロスポリンを含む実験サンプルを調製する。サンプルを、各サンプルの反応を形成するレセプター−リガンド複合体が平衡に達するのに十分な時間、ほぼ３０分であるが、インキュベートする。
【０２５６】
Ｚａｐ−７０、未結合リガンド、およびＺａｐ−７０−リガンド複合体から成る溶液を、サイズ排除クロマトグラフィーに通過させて分子サイズに基づいて、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−リガンド複合体を溶出流の先頭部において共同溶出させて、未結合リガンドから分離する。次に、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−リガンド複合体を含むが、未結合リガンドを全く含まない溶出流部分は、脱塩と、その後の質量分析器への溶出ために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。逆相クロマトグラフィーはレセプター−リガンド結合対を破壊・分離する。このようにして、逆相クロマトグラフィー後、リガンドは質量分析（ＭＳ）にかけられ、信号応答が決定され、リガンドは、分子量、または、質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定される。
【０２５７】
ＺＡＰ−７０に結合していないリガンドがあったとしてもそれらは全てサイズ排除工程によってＺＡＰ−７０−リガンド複合体から分離される。従って、質量分析器に到達したリガンド（すなわち、回収リガンド）は全て、対応するＺＡＰ−７０−リガンド複合体由来のものであり、各リガンドの質量分析信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したＺＡＰ−７０−リガンド複合体の量と相関する。
【０２５８】
各実験サンプルにおける、各混合成分の正規化リガンド回収、および競合リガンドを図２８に示す。競合リガンドとしてスタウロスポリンを用い、各リガンドの反応を、該競合因子不在時のその値の半分に減少させるのに必要なスタウロスポリンの濃度、すなわち、そのリガンドのＡＣＥ５０を求めると、各リガンドのＡＣＥ５０値は、そのリガンドのＫｄと逆相関を持つ。図２８には、混合物中の各構造変異体について、ＡＣＥ５０値、および、各ＡＣＥ５０値から計算されるＫｄ値も示されている。これらのデータは、興味の結合特性を持つリガンドを特定するために、また、さらにそれに続く最適化混合物シリーズ（例えば、異種化合物から成る新しい混合物）を生成するために使用される。
【０２５９】
（実施例７：初発リガンドＮＧＤ−１４６、および、その誘導体ＮＧＤ−６０３７、６３６７、６３７１、６３８０、６３９０、６４２３、６４３２、６８６２の質量符号化混合物の合成）
２００ｍＬの氷酢酸に溶解した５−イオドイサチン１（１０ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）およびマロン酸（７．５ｇ、７２ｍｍｏｌ）を一晩環流した。沈殿をろ過して集め、ＡｃＯＨとアセトンで洗浄した。次に、この固体を、ＥｔＯＨで１時間環流した。ろ過し、ＥｔＯＨおよびＥｔ２Ｏで洗浄したところ、生成物として６-イオド-２-オキソ-１，２-ジヒドロ-キノリン-４-カルボン酸２が８．８ｇ（７６％）得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１４．０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１２．１３（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７，１．８Ｈｚ），７．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．９３（ｓ，１Ｈ）。
【０２６０】
【化１】
６０ｍＬの脱気したＨ２Ｏに溶解した６-イオド-２-オキソ-１，２-ジヒドロ-キノリン-４-カルボン酸２（３．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）、３，４-（メチレンジオキシル）フェニルボロン酸（２．４９ｇ、１５ｍｍｏｌ）、Ｋ３ＰＯ４（８．４９ｇ、４０ｍｍｏｌ）、およびＰｄ（ＯＡｃ）２（１１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の混合液をアルゴン下に６０oＣで２時間加熱した。室温に冷却後、固形分をろ過で収集し、Ｈ２Ｏとアセトンで洗浄した。次に、これを、２０ｍＬの１Ｍ ＨＣｌで処理し、得られた緑黄色固体を再びろ過し、Ｈ２Ｏで洗浄した。Ｐ２Ｏ５上で減圧乾燥したところ、２．５３ｇ（８２％）の生成物３が緑黄色固体として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１４．０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１２．１１（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４０(ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ)，７．１８（ｓ，１Ｈ）、７．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），７．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．９１（ｓ，１Ｈ），６．０６（ｓ，２Ｈ）。
【０２６１】
【化２】
３０ｍＬのＮＭＰに溶解した酸３（２．０ｇ、１０．５７ｍｍｏｌ）、ペンタフルオロフェノール（２．９２ｇ、１５．８５ｍｍｏｌ）、およびＥＤＣ（３．０４ｇ、１５．８５ｍｍｏｌ）の混合液を室温で６時間攪拌した。ＮＭＰの助けを借りて沈殿をろ過し、溶液を６０ｍＬの氷水に注いだ。これによって生じた固体をろ過で収集し、氷水とＥｔＯＡｃで洗浄し、減圧乾燥したところエステル４（２．８０ｇ、９１％）が得られた。これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
【０２６２】
【化３】
０．５ｍＬのＤＭＦに溶解したエステル４（１２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を、１ｍＬのＤＭＦに溶解したピロリジノピロリジン（７．７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）基礎レジン（５０ｍｇ）の混合液に加えた。この反応混合液を室温で１２時間攪拌し、イソシアネートレジン（９０ｍｇ）を加え、３時間攪拌を続けた。次に、この溶液をろ過によって収集し、減圧濃縮して生成物ＮＧＤ−７４６を得た。ＭＳｍ／ｚ４４６．２（Ｍ＋＋１）。
【０２６３】
【化４】
１０ｍＬのオキシフォスフォラスクロリドに溶解した６−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−４−カルボン酸３（１．０ｇ、３．２ｍｏｌ）を４時間環流し、室温に冷却した。溶液を濃縮して乾燥させ、黄褐色固体を得た。次に、この固体を２０ｍＬのメチレンジクロリドに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１．５０ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）と、２−（Ｓ）−ピロルジニルメチルピロリジン（０．５９ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）を０oＣでその溶液にゆっくりと加えた。この混合物を室温で１２時間攪拌した。回転蒸発による溶媒除去後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および食塩水にて洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥して濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ（６−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−クロロ−キノリン−４−イル）−（２−ピロリジン−１−イルメチル−ピロリジン−１−イル）−メタノン５（１．２０ｇ、８１％）が得られた。ＭＳｍ／ｚ４６４．２（Ｍ＋＋１）；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．０５（ｍ、１Ｈ）、７．９３（ｍ、１Ｈ），７．８５（ｂｒ ｓ、１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｍ，１Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），４．５８（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），３．７５（ｍ，０．５Ｈ），３．３８−３．１３（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，３Ｈ），２．３５−２．１５（ｍ，２Ｈ），２．０４（ｍ，３Ｈ），２．０１−１．８５（ｍ，４Ｈ），１．８３（ｍ，１Ｈ）。
【０２６４】
【化５】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）およびＮ−メチルベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６０７３が得られた。ＭＳｍ／ｚ５４９．３（Ｍ＋＋１）。
【０２６５】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および３′−フルオロベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３６７が得られた。ＭＳｍ／ｚ５５３．３（Ｍ＋＋１）。
【０２６６】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および４′−クロロベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３７１が得られた。ＭＳｍ／ｚ５６９．２（Ｍ＋＋１）。
【０２６７】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および４′−トリフルオロメチルベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３８０が得られた。ＭＳｍ／ｚ６０３．３（Ｍ＋＋１）。
【０２６８】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および２−メチルフェネチルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３９０が得られた。ＭＳｍ／ｚ５６３．２（Ｍ＋＋１）。
【０２６９】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）およびＮ−エチルベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６４２３が得られた。ＭＳｍ／ｚ５６３．２（Ｍ＋＋１）。
【０２７０】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）およびＮ−メチル−３‘，４’−ジクロロベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６４３２が得られた。ＭＳｍ／ｚ６１７．２（Ｍ＋＋１）。
【０２７１】
２０ｍＬのオキシフォスフォラスクロリドに溶解した６−イオド−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−４−カルボン酸２（５．９７ｇ、１８．９３ｍｍｏｌ）を１００oＣで４時間環流し、室温に冷却した。溶液を濃縮して乾燥させ、黄褐色固体を得た。次に、この固体を１００ｍＬのメチレンジクロリドに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（２０ｍｌ、１００ｍｍｏｌ）と、２−（Ｓ）−ピロルジニルメチルピロリジン（３．５ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）を０oＣでその溶液にゆっくりと加えた。この混合物を室温で一晩攪拌した。この混合液を室温で一晩攪拌した。混合液を二塩化メチレン（２００ｍｌ）で希釈し、水（２ｘ４０ｍｌ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および食塩水にて洗浄した。
【０２７２】
【化６】
有機相はＮａ２ＳＯ４上で乾燥して濃縮し、未精製の生成物６（６．５ｇ）を得た。ＬＣ−ＭＳによって、この化合物は次工程に十分なほど純粋となっていたので、全く精製することなく直接用いた。ＭＳｍ／ｚ４７０．０（Ｍ＋＋１）。
【０２７３】
【化７】
ＮＭＰ（２０ｍＬ）に溶解した２−クロロキノリン化合物６（３．１２ｇ、６．６４ｍｇ）およびｐ−トリフルオロベンジルアミン（５．８１ｇ、３３ｍｍｏｌ）を１２０oＣで３６時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈した。有機相を水と食塩水で洗浄しＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。濃縮によって未精製生成物が得られた。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｅｔ３Ｎ−ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ ２：９５：５）で精製したところ所望の生成物７（３．２ｇ）が得られた。ＭＳｍ／ｚ６０９．１（Ｍ＋＋１）。
【０２７４】
【化８】
ビス（ピナコラト）ジボロン（２７９ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（２９４、３．０ｍｍｏｌ）、およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（２４．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を充填した２５ｍｌ丸底フラスコに、ＤＭＳＯ（６ｍｌ）に溶解した６−イオドキノリン７（６０７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、フラスコを真空とアルゴンに交互につなぐことによって徹底的にガス抜きした。次に、得られた混合物を８０oＣで一晩加熱し、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、セライトを通過させてろ過した。得られた生成物８を、濃縮後それ以上精製することなく次の工程に用いた。ＭＳｍ／ｚ６０９（Ｍ＋＋１）。
【０２７５】
【化９】
アルゴン下、ジオキサン（２．０ｍＬ）に溶解した６−ボロネート８（１５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２ｍｇ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１７ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）、および３，４−エチレンジオキシイオドベンゼン（１５ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を充填したフラスコに加えた。この混合物を、フラスコを真空とアルゴンに交互につなぐことによって徹底的にガス抜きした。得られた混合物を７０oＣで加熱し一晩攪拌した。室温に冷却後ＥｔＯＡｃで希釈した。固体を、セライト通過ろ過によって除去し、若干のＥｔＯＡｃで洗浄した。有機相を濃縮して溶媒を除去した。得られた残渣を調製的ＬＣによって精製したところ生成物９（ＮＧＤ−６８６２）が得られた。ＭＳｍ／ｚ６１７（Ｍ＋＋１）。
【０２７６】
前記ＮＧＤ化合物の質量符号化混合物が、単に、ＮＧＤ−６０３７、６３６７、６３７１、６３８０、６３９０、６４２３、６４３２およびＮＧＤ−６８６２を、下記の実験において要求される様々な濃度において混合することによって調製された。同じ混合物は、当業者であれば、混合による合成、または従来技術で既知の別法を用いて直接製造することが可能である。
【０２７７】
（実施例８：サンプルループ経由のＳＥＣからＭＳへのサンプル転送）
ヒト血清アルブミンを複数のリガンドと混合し、得られた混合液を、レセプター−リガンド複合体が平衡に達するのに十分な時間緩衝溶媒中でインキュベートする。混合液が平衡に達したならば、混合液をサイズ排除カラムに注入する。レセプター−リガンド複合体がサイズ排除カラムから溶出するにつれ、それら複合体はＵＶ検出器によって検出される。検出と同時に、コンピュータによって駆動されるコントローラーは、２−位置６−ポート選択バルブに接続されるサンプルループがレセプター−リガンド混合液の代表サンプルによって満たされるのに十分な時間に較正されるタイマーをスタートさせる。サンプルループがレセプター-リガンド複合体で満たされたならば、コントローラーは、選択バルブのサンプルループの、レセプターリガンド複合体を負荷するための位置を、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）装置の方に振り向ける。ＲＰ−ＬＣ通過中、レセプター−リガンド複合体は破壊され、レセプターをリガンドから解離する。ＲＰ−ＬＣから溶出されると同時に、解離リガンドは質量分析器に転送されそこで特定される。
【０２７８】
本明細書で引用された参照文献は全て、それが印刷、電子、コンピュータの読み取り可能な保存媒体、またはその他のいずれの形式であるとを問わず、要約、論文、雑誌、公刊物、教科書、学位論文、インターネットウェブサイト、データベース、特許、および特許公報を含め、参照することによりその全体を本明細書に含めることを明言する。
【０２７９】
以上、本発明のいくつかの実施態様が説明された。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく各種改変を実行することが可能であることが理解されよう。従って、その他の実施態様も下記の特許請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】図１は、様々なＫｄにおける、レセプター-リガンド複合体ＥＳのリガンド回収対リガンド初期濃度［Ｓ］０の理論的プロットを表すグラフである。
【図２】図２は、様々な活性レセプター初期濃度［Ｅ］０における、レセプター-リガンド複合体ＥＳのリガンド回収対リガンド初期濃度［Ｓ］０の理論的プロットを表すグラフである。
【図３】図３は、１０％ランダム誤差を含む理論的データにおける、レセプター-リガンド複合体のリガンド回収データ［ＥＳ］対リガンド濃度［Ｓ］０の数学的適合である。
【図４】図４は、単一化合物Ｓ２および添加競合因子Ｓ１間の競合における、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉ対競合リガンド初期濃度［Ｓ１］０の理論的プロットを示す。
【図５】図５Ａは、レセプター過剰条件下における、異なるＫｄを持つ３種のリガンドの混合物に関するＡＣＥ５０シミュレーション実験を示す。実線は、全体１μＭ濃度における任意のリガンドの回収をしめす。破線は、０．３３または３．０μＭにおける回収を示す。図５Ｂは、図５Ａに示したものと同様のＡＣＥ５０シミュレーションを示す。ただし、この実験では、レセプター濃度は、全体リガンド濃度（１５μＭ）に対して制限的である（２μＭ）。
【図６】図６は、式（Ｉ）に対する解を示す。
【図７】図７は、３化合物混合物における、レセプター-リガンド複合体、対、競合リガンド初期濃度［Ｓ１］０の理論的プロットを示す。
【図８】図８は、３成分混合物について、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉ、対、競合リガンド初期濃度［Ｓ１］０の理論的正規化プロットを示す。
【図９】図９は、アロステリック競合性滴定剤およびリガンドの信号応答（ＡＳ−ＭＳ実験から得られたもの）シミュレーションであり、滴定剤濃度を増加した場合の、滴定剤とリガンドの濃度比を示す。
【図１０】図１０は、Ａｋｔ−１−ＮＧＤ−２８８３５およびＡｋｔ−１−スタウロスポリン複合体の、ＡＳ−ＭＳ測定濃度、および、滴定剤濃度を増加させた場合の、両者の濃度比を示す。漸近線に境界される比プロットはアロステリック結合であることを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、スタウロスポリンと、質量符号化結合ライブラリーのスクリーニングによって発見されたリガンドの混合物との間の、ＡＣＥ５０実験で得られたＡＳ−ＭＳ測定による滴定剤とリガンド反応の関係を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アロステリック競合を示す、（Ｃ）のデータに基づく滴定剤-リガンド回収比を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃ−Ｄは、それぞれ、Ｍ−１および（Ａ）と（Ｂ）のリガンド混合物の間のＡＣＥ５０実験で得られた、ＡＳ−ＭＳ測定によるタンパク-リガンド複合体濃度と比のプロットを示す。プールメンバーとＭ−１の間には、スタウロスポリンにおける結果とは対照的に、オルソステリック結合競合が観察される。
【図１１Ｄ】図１１Ｃ−Ｄは、それぞれ、Ｍ−１および（Ａ）と（Ｂ）のリガンド混合物の間のＡＣＥ５０実験で得られた、ＡＳ−ＭＳ測定によるタンパク-リガンド複合体濃度と比のプロットを示す。プールメンバーとＭ−１の間には、スタウロスポリンにおける結果とは対照的に、オルソステリック結合競合が観察される。
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１２Ｃ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１２Ｄ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ２に対する対アトロピン結合競合において、リガンドプールの親和度ランキング、および競合モードの決定を示すグラフである。１３Ａは、ＡＣＥ５０実験結果のログプロットであり、ＮＧＤ−３３５０が、同種化合物ＮＧＤ−３３４８およびＮＧＤ−３３４６や、他のプール成分よりも高い親和度を持つことを示す。１３Ｂは、滴定剤-リガンド反応比の直線性プロットであり、アトロピンとプール成分の間にはオルソステリック競合のあることを示す。
【図１４】図１４は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩと共に、会合速度ｋｉ１をゼロから０．１μＭ−１秒−１（０−＞１０５Ｍ−１秒−１）まで変えながら添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表す数学的モデルである。理論的分解曲線［ＥＳ］０ｅ−ｋｓ２ｔを（Ｅ）に示す。
【図１５】図１５は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩと共に、会合速度ｋｉ１をゼロから０．１μＭ−１秒−１（０−＞１０５Ｍ−１秒−１）まで変えながら添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表すログプロット数学的モデルである。理論的分解曲線［ＥＳ］０ｋｓ２ｔ（勾配＝ｋｓ２）を（Ｅ）に示す。
【図１６】図１６は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩと共に添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表す数学的モデルである。ｋｓ２は１から０．００１秒−１まで変動する。理論的分解曲線［ＥＳ］０ｋｓ２ｔ（勾配＝ｋｓ２）を（Ｅ）に示す。
【図１７】図１７は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩ、ｉｎｈ（Ｉ）と共に添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表す数学的モデルである。モデルとしたｋｓ２＝０．０１秒−１（Ａ）。ｋｓ２＝０．０１±０．００１秒−１の場合の理論的分解曲線（Ｅ）。
【図１８】図１８は、レセプター過剰からレセプター制限状態下で、レセプター濃度［Ｅ］０の関数として表した、Ｅ＋Ｓｉ＋Ｓｖの平衡液におけるレセプター-リガンド複合体［ＥＳｉ］および［ＥＳｖ］の、アフィニティー選択質量分析反応および比のシミュレーションを示す。
【図１９】図１９は、レセプター-リガンド複合体のリガンドの辿る経路を示すフローダイアグラムである。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｂは、２つの異なる位置、２０Ａおよび２０Ｂにある複数ポートバルブを示す。
【図２１】図２１は、４回の連続サンプル注入に対する波長２３０ｎｍにおけるＵＶデータを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｄ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｅ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｆ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２３】図２３は、ヒト血清アルブミン＋ワルファリンにおいて、レセプター-リガンド複合体［ＥＳ］リガンド回収データ、対、リガンド初期濃度［Ｓ］０の関係を表す数学的適合線である。
【図２４】図２４は、５成分混合物対ブタ・ムスカリン性レセプターにおける、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉの正規化数値、対、競合リガンド（アトロピン）初期濃度［Ｓ１］０のプロット、およびそれから得られたＡＣＥ５０値を示す。
【図２５】図２５は、５成分混合物から選ばれた２個のリガンドにおける、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉの正規化数値、対、競合リガンド（アトロピン）初期濃度［Ｓ１］０のプロット、およびそれらリガンドのＫｄ値を示す。
【図２６】図２６は、Ｚａｐ−７０の複合体、すなわち、Ｚａｐ−７０−ＮＧＤ−７４６およびＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０のｋ２と半減期を与えるグラフによる解法を示す。
【図２７】図２７は、Ｚａｐ−７０のリガンド混合物との複合体のｋ２と半減期を与えるグラフによる解法を示す。
【図２８】図２８は、最適化ライブラリーから得られたレセプター-リガンド複合体のアフィニティー選択質量分析反応の正規化数値、対、競合リガンド全体のプロットを示す。スタウロスポリン濃度、および誘導ＡＣＥ５０およびＫｄ値も掲げる。スタウロスポリンＫｄ＝１００ｎＭ。
【背景技術】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００３年３月１０日出願米国仮出願第６０／４５３，４７３号、２００３年３月１０日出願米国仮出願第６０／４５３，４５７号、２００３年４月７日出願米国仮出願第６０／４６０，９１０号、２００３年４月１５日出願米国仮出願第６０／４６３，０２５号、および、２００３年９月１２日出願米国仮出願６０／５０２，６７０号に対する優先権を主張する。なお、上記出願それぞれについて引用することによりその全体を本出願に含める。
【０００２】
（背景）
各種疾病を治療する薬剤を発見するための努力は、組み合わせ化学のような技術およびヒトゲノムの解明によって革新的な進歩を遂げている。ゲノミクスおよび生物学的スクリーニング両分野における高処理技術の発達は、コンピュータ技術における長足の進歩と相俟って、これらの道具を新薬の合理的探求法の一部として用いることを一層実現可能としている。
【０００３】
しかしながら、化学的ゲノミクスの潜在能力をフルに発揮するためには、組み合わせ化学のような技術力を、新たに発見された疾病標的用リード化合物の展開に利用するための効率的な一般ツールの開発が必要である。化学合成の分野ではタンパク機能探査用の各種化合物ライブラリーの構築において相当な洗練を可能とした進歩が見られているにも拘わらず、混合系でのリガンド結合メカニズムを直接評価したり、リガンド親和性を判定するための一般的技術は現在でもなお不足している。ゲノムおよびプロテオーム分析によって、ヒト疾患の小型分子療法の標的と特定されるヒトおよび細菌タンパクの数が急速に増えており、このために、機能的アッセイが利用できない新規標的に適用が可能なタンパク−リガンド結合の評価法に対して今後の展開の成否を決める要求が生じている。結合部位によってリガンドの化学タイプの親和性を序列化したり分類したりすることは、リガンド構造−活性関係について合理的解明をするのに共結晶Ｘ線構造を利用できない標的の場合には特に好ましい。
【０００４】
どの薬剤候補が残るのかを早期に予測できる予測因子は、そのＫｄ、すなわち、標的生体分子との平衡解離定数である。Ｋｄは、薬剤候補が、その標的にどれくらい緊密に結合するかを表す尺度であり、候補の効力、毒性の可能性、および副作用に関する予測因子である。薬剤候補の動態、例えば、薬剤候補が標的から解離する解離速度ｋ２も、薬剤候補が最終的に薬剤となるかどうかを早期に示す予測因子となり得る。ｋ２は、薬剤候補がその標的にどれくらい緊密に結合するかを表す尺度であり、候補の潜在的効力、毒性、および副作用のインディケーターとなり得る。Ｋｄおよびｋ２を含めた、各種結合特性を効率的に論理的矛盾無く評価できる能力があるならば、その能力は、創薬プロセスを目覚しく改善することができるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
アフィニティー選択質量分析（ＡＳ−ＭＳ）技術は、リガンド（例えば、小型分子および有機化合物）のレセプター（例えば、タンパクおよび酵素）に対する結合特性を評価するに当たって特に有望である。これらの技術により、複雑な混合物からタンパク結合成分が、その分子量、または衝突による断片パターンに基づいて一意に特定され、化合物ライブラリーの中から複数のリガンドを同時に評価することが可能になる。現代のＭＳ技術の感受性が高いので、極少量の精製生体分子レセプターを用いてＡＳ−ＭＳ実験を行うことが可能である。細胞、またはそれ以外の複雑な生化学アッセイとは異なり、ＡＳ−ＭＳは、対象標的に対して選択的に結合する化合物についてのみ結果を提示するものであり、従って、標的外活性から生じた擬似陽性を排除する。
【０００６】
本発明者らは、本明細書において、１つのタンパクレセプターに対する、複数のリガンドの親和度を同時に序列化し、一方、ある場合にはさらに、複数のリガンド同士が、選択競合リガンドとして同じ部位に結合するのか、または、アロステリックな結合部位において相互作用を介して影響を及ぼしあうのかを明らかにする多次元クロマトグラフィー質量分析法を記載する。２つのリガンドが異なる部位に結合する場合、本法は、それらの絶対的結合親和度、および、それらの間の結合協力度の定量評価をも与えることが可能な場合もある。
【０００７】
１つの局面において、本発明は、レセプターＥ、リガンドＳｉ、および、レセプターリガンド結合対ＥＳｉを含む複数の混合物においてリガンドにたいするレセプターの結合親和度を分析する方法をその特質とする。本法は下記の工程を含む、すなわち、
（ａ）複数の混合物であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０、リガンド［Ｓｉ］０、および滴定剤Ｔを含み、ＴのＳと置き換わる相対的活性が定量可能となるようにＥ、Ｓｉ、Ｔの内の１つ以上の濃度が選択される複数の混合物を供給すること、
（ｂ）複数の混合物それぞれを平衡に達せしめること、
（ｃ）複数の混合物それぞれについて、未結合リガンドＳｉから、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉを分離すること、
（ｄ）複数の混合物それぞれにおいて、分析装置からの、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を定めること、および、
（ｅ）工程（ｄ）におけるレセプター-リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を評価し、リガンドＳｉのレセプターＥに対する結合親和度を定めること、
である。
【０００８】
ある場合には、各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの相対的濃度が、ＳｉのＴと置き換わる相対的活性の比較を可能とするように選ばれる。
【０００９】
ある場合には、本法は、複数の混合物であって、各混合物は、レセプター初期濃度［Ｅ］０、リガンド初期濃度［Ｓｉ］０、および、既知濃度の滴定剤Ｔを含み、複数の混合物のそれぞれにおいて［Ｅ］０および［Ｓｉ］０は一定であり、［Ｓｉ］０は、複数の混合物それぞれにおいてほぼ同じであり、滴定剤の濃度は複数の混合物内において変動させられる複数の混合物を供給することを含む。
【００１０】
ある場合には、複数の混合物は、それぞれ、複数のリガンドＳｉおよび複数のレセプター-リガンド結合対ＥＳｉを含み、信号応答は、前記レセプター-リガンド結合対の内の少なくとも２つについて定められ、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉの相対的結合度が定められる。
【００１１】
ある場合には、例えば、混合物が複数のリガンドを含む場合には、前記複数のリガンドＳｉの少なくとも約９０％は一意の分子量を持つ。
【００１２】
ある場合には、各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの相対的濃度が、第１リガンドＳ１の結合親和度が、第２リガンドＳ２の結合親和度と比較されて、それによってＥに対するＳ１とＥに対するＳ２の相対的結合親和度を測る尺度が得られるように選ばれる。
【００１３】
ある場合には、結合親和度は、相対的結合平衡定数ＫｄｉＳである。
【００１４】
ある場合には、本法は、１つ以上のリガンドのＡＣＥ５０、すなわち、レセプター-リガンドペアの信号応答が、滴定剤濃度０の時の値の５０％に達する時の滴定剤濃度を計算することを含む。
【００１５】
ある場合には、複数のリガンドの相対的ＫｄＳは、最低のＡＣＥ５０値を持つリガンドが、リガンド混合物の内で最高Ｋｄを持ち、最高ＡＣＥ５０値を持つリガンドが、リガンド混合物の内で最低Ｋｄを持つように定められる。
【００１６】
ある場合には、本法は、複数の混合物におけるレセプター-リガンド結合対ＥＳｉのＫｄｉを求めるに際し、滴定剤の濃度の関数で表した複数の混合物それぞれにおけるレセプター-リガンド結合対［ＥＳｉ］濃度の変化を、式（Ｉ）の等式：
【００１７】
【数４】
または、式（Ｉ）から導かれる等式に適合させることによって計算することを含む。
【００１８】
ある場合には、複数のリガンドＳｉの相対的ＫｄｉＳが定められる。
【００１９】
ある場合には、レセプターの初期濃度［Ｅ］０は既知であり、リガンドの初期濃度［Ｓｉ］０は既知である。
【００２０】
ある場合には、レセプターの濃度［Ｅ］０は、リガンドの濃度［Ｓｉ］０の合計よりも大きい。
【００２１】
ある場合には、本法はさらに、リガンドＳｉは、レセプターＥに競合的に、アロステリックに、または非競合的に結合するのかを判定することを含む。例えば、レセプター-リガンドペアＥＳｉが、複数の混合物のそれぞれにおいて比較的定常な信号応答を維持する場合、リガンドＳｉは、非競合的にレセプターＥに結合する。ある場合には、本法は、複数の混合物それぞれにおいて、レセプター-リガンドペアＥＳｉの信号応答の、レセプター-滴定剤ペアの反応に対する比の、滴定剤濃度に対する変動を定めることを含み、複数の混合物それぞれの前記比が滴定剤濃度と直線関係を持つならば、リガンドＳｉはレセプターに競合的に結合し、複数の混合物それぞれの前記比が非直線的関係を持つならば、リガンドＳｉはレセプターにアロステリックに結合するとされる。
【００２２】
ある場合には、レセプターは、生体分子、ポリペプチド、酵素、または核酸である。
【００２３】
ある場合には、リガンドは、有機分子、例えば、製薬化合物または小型分子（例えば、約６００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を持つ分子）、またはポリペプチドである。
【００２４】
ある場合には、複数の混合物は、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉ、未結合レセプター、および未結合リガンドから成る平衡を実現する。
【００２５】
ある場合には、本法は、レセプター-リガンド結合対を解離させる条件下で使用が可能な液体クロマトグラフィー、例えば、逆相液体クロマトグラフィーの使用を含む。
【００２６】
ある場合には、レセプター結合リガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは限外ろ過を用いて複数の混合物のそれぞれから分離される。
【００２７】
ある場合には、信号応答は質量分析を用いて定量される。
【００２８】
ある場合には、本法は、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉを破壊することを含む。
【００２９】
ある場合には、レセプター-リガンド結合対ＥＳｉの信号応答は、複数の混合物それぞれにおいて、該レセプター-リガンド結合対ＥＳｉにおけるリガンドＳｉの相対的量を測定することによって定量される。
【００３０】
ある場合には、リガンドＳｉの相対量は、質量分析器から得られる信号応答を評価することによって定量される。
【００３１】
別の局面では、本発明は、レセプター-リガンド結合対の平衡解離定数Ｋｄを定量する方法を特質とする。前記方法は、下記の工程を含む。すなわち、
（ａ）レセプター-リガンド結合対のリガンドに対して較正された質量分析器を設けること、
（ｂ）複数の混合物であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０およびリガンド［Ｓ］０を含み、Ｅ０およびＳ０の内の１つ以上の濃度が、Ｅに対するＳの結合親和度が定量可能となるように選択される、複数の混合物を供給すること、
（ｃ）複数の混合物それぞれを、結合したレセプター-リガンド結合対ＥＳ、未結合レセプター、および未結合リガンドから成る平衡に達せしめること、
（ｄ）複数の混合物のそれぞれからレセプター結合リガンドを分離すること、
（ｅ）複数の混合物のそれぞれにおいて、質量分析器から得られるレセプター-リガンド結合対の信号応答を定量すること、および、
（ｆ）工程ａ−ｅにおいて知られ、測定され、または獲得された情報を用いて、複数の混合物それぞれについて、レセプター-リガンドペアの濃度［ＥＳ］、および、初期の、既知のリガンド濃度［Ｓ］０を、式（Ｉ）の等式：
【００３２】
【数５】
に適合させ、
レセプター-リガンド結合対のＫｄを生成すること。
【００３３】
ある場合には、複数の混合物は、それぞれ、レセプターの初期濃度［Ｅ］０、および、リガンドの、既知の初期濃度［Ｓ］０を含み、［Ｅ］０は、複数の混合物のそれぞれにおいて同じであり、［Ｓ］０は複数の混合物のそれぞれにおいて変動される。
【００３４】
ある場合には、本法はさらに、混合物におけるレセプター初期濃度［Ｅ］０を定量することを含む。
【００３５】
ある場合には、レセプターは、生体分子、ポリペプチド、酵素、または核酸である。
【００３６】
ある場合には、リガンドは、有機分子、例えば、製薬化合物または小型分子（例えば、約６００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を持つ分子）、またはポリペプチドである。
【００３７】
ある場合には、複数の混合物は、レセプター-リガンド結合対、未結合レセプター、および未結合リガンドの平衡を達成する。
【００３８】
ある場合には、レセプター結合リガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて混合物から分離される。
【００３９】
ある場合には、本法は、液体クロマトグラフィーを使用することを含む。
【００４０】
ある場合には、本法はさらに、例えば、高温条件下で逆相液体クロマトグラフィーを用いてレセプター-リガンド結合対ＥＳを破壊することを含む。
【００４１】
ある場合には、レセプター-リガンド結合対の濃度［ＥＳ］は、複数の混合物のそれぞれについて、レセプター-リガンド結合対ＥＳにおけるリガンドの量を測定することによって定量される。
【００４２】
別の局面において、本発明は、レセプター-リガンド結合対の結合速度動態の分析法を特質とする。この方法は下記の工程を含む。すなわち、
（ａ）レセプター［Ｅ］０、および、リガンド［Ｓｉ］０を含む混合物を供給すること、
（ｂ）混合物を、レセプター［Ｅ］、リガンド［Ｓｉ］、およびレセプター-リガンド結合対［ＥＳｉ］の平衡に達せしめること、
（ｃ）混合物を、過剰な競合的インヒビターＩによって処理すること、
（ｄ）複数の時点においてレセプター-リガンド結合対の減少を
（ｉ）未結合リガンドからレセプターリガンド結合対を分離すること
（ｉｉ）前記複数時点それぞれにおいて、レセプター-リガンド結合対の信号応答を分析装置によって定量することによって測定すること、および、
（ｅ）工程（ａ）−（ｄ）において知られ、測定され、または獲得された情報を用いて、レセプター-リガンド結合対の結合速度動態を評価することである。
【００４３】
ある場合では、レセプター-リガンド結合対の信号応答は分析装置によって測定される。
【００４４】
ある場合では、混合物は複数のリガンドＳｉを含む。
【００４５】
ある場合、例えば、混合物が複数のリガンドＳｉを含む場合、複数のリガンドＳｉの少なくとも９０％は一意の分子量を持つ。
【００４６】
ある場合では、結合速度動態は、知られ、測定され、または獲得された情報を用いて評価され、レセプター-リガンド結合対の信号応答の時間変化を、式（ＸＶＩＩＩ）の等式：
【００４７】
【数６】
またはその導関数に適合させることによって、レセプター-リガンド結合対の解離速度ｋｓ２を計算する。
【００４８】
ある場合では、本法は、非競合的に結合するリガンドを特定する工程であって、リガンド-レセプター結合対が、複数時点のそれぞれにおいて比較的定常な濃度を維持する場合、そのリガンドはレセプターに非競合的に結合するものとされる、特定工程を含む。
【００４９】
ある場合には、複数のリガンドＳｉの内の少なくとも２つの結合動態が比較される。
【００５０】
ある場合には、レセプターは、生体分子、ポリペプチド、酵素、または核酸である。
【００５１】
ある場合には、リガンドおよび／または競合的インヒビターは、有機分子、例えば、製薬化合物または小型分子（例えば、約６００ａ．ｍ．ｕ．未満の分子量を持つ分子）、またはポリペプチドである。
【００５２】
ある場合には、本法は、レセプター結合リガンドを液体クロマトグラフィーの機能に委ねることを含む。
【００５３】
ある場合には、レセプター結合リガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて未結合リガンドから分離される。
【００５４】
ある場合には、信号応答は質量分析を用いて定量される。
【００５５】
ある場合には、本法はさらに、レセプター-リガンド結合対を破壊することを含む。
【００５６】
ある場合には、レセプター-リガンド結合対の信号応答は、該レセプター-リガンド結合対におけるリガンドの相対的量を測定することによって定量される。
【００５７】
ある場合には、本法はさらに、レセプター-リガンド結合対の半減期ｔ１／２を定めることを含む。
【００５８】
１つの局面において、本発明は、あるサンプルにおいてレセプター-リガンド複合体を特定する方法を特質とする。該方法は下記の工程を含む。すなわち、
（ａ）レセプター-リガンド複合体を含むサンプルを供給すること、
（ｂ）サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、サイズ排除クロマトグラフィーで得られる溶出液をＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブを通過させること、
（ｃ）ＵＶ検出器を用いてサンプル中のレセプター-リガンド複合体を検出する工程であって、該レセプター-リガンド複合体の検出は、ＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブと連通するコントローラーを活性化し、コントローラーはレセプター-リガンド複合体がサンプルループ中に存在する時点でマルチポートバルブを活性化するように較正され、マルチポートバルブの活性化はサンプルループ中のレセプター-リガンド複合体をクロマトグラフィー装置に転送させ、および、
（ｄ）レセプター-リガンド複合体中にリガンドを特定し、それによってレセプター-リガンド複合体を特定することである。
【００５９】
ある場合には、サンプルはまた未結合のリガンドを含む。
【００６０】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体は未結合リガンドから分離される。
【００６１】
ある場合には、方法はまたレセプター-リガンド複合体を解離することを含む。
【００６２】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体の解離はクロマトグラフィー装置で起こる。
【００６３】
レセプター-リガンド複合体のレセプターは、例えば、ポリペプチド、酵素、または核酸であってもよい。
【００６４】
レセプター-リガンド複合体のリガンドは、例えば、ポリペプチド、有機分子、または核酸であってもよい。
【００６５】
ある場合には、コントローラーは手動で較正される。また別のある場合には、コントローラーは、コンピュータソフトウェアプログラムによって較正される。
【００６６】
ある場合には、クロマトグラフィー装置は逆相カラムである。
【００６７】
ある場合には、解離リガンドは質量分析によって特定される。
【００６８】
ある場合には、リガンドは特定用タグを欠如する。ある場合には、リガンドは、特定用タグ、例えば、蛍光タグ、または放射性タグであってもよい特定用タグを持つ。
【００６９】
別の局面では、本発明は、サンプルにおいて複数のレセプター-リガンド複合体を特定する方法を特質とする。方法は下記を含む。すなわち、
（ａ）複数のレセプター-リガンド複合体を含むサンプルを供給すること、
（ｂ）サンプルをサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、サイズ排除クロマトグラフィーで得られる溶出液をＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブを通過させること、
（ｃ）ＵＶ検出器を用いてサンプル中のレセプター-リガンド複合体を検出する工程であって、該レセプター-リガンド複合体の検出は、ＵＶ検出器と、サンプルループを含むマルチポートバルブと連通するコントローラーを活性化し、コントローラーは、レセプター-リガンド複合体の少なくとも一部がサンプルループ中に存在する時点でマルチポートバルブを活性化するように較正され、マルチポートバルブの活性化はサンプルループ中に存在するレセプター-リガンド複合体をクロマトグラフィー装置に転送させ、および、
（ｄ）解離レセプター-リガンド複合体から得られた解離リガンドを特定することである。
【００７０】
ある場合には、サンプルはまた複数の未結合リガンドを含む。
【００７１】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体は未結合リガンドから分離される。
【００７２】
ある場合には、方法は、複数の解離リガンドを特定することを含む。
【００７３】
ある場合には、方法は単一レセプターを含む。
【００７４】
ある場合には、方法はまたレセプター-リガンド複合体を解離することを含む。
【００７５】
ある場合には、レセプター-リガンド複合体の解離はクロマトグラフィー装置で起こる。
【００７６】
レセプター-リガンド複合体のレセプターは、例えば、ポリペプチド、酵素、または核酸であってもよい。レセプター-リガンド複合体のリガンドは、例えば、ポリペプチド、有機分子、または核酸であってもよい。
【００７７】
ある場合には、コントローラーは手動で較正される。また別のある場合には、コントローラーは、コンピュータソフトウェアプログラムによって較正される。
【００７８】
ある場合には、クロマトグラフィー装置は逆相カラムである。
【００７９】
ある場合には、１つ以上の解離リガンドが質量分析によって特定される。
【００８０】
ある場合には、リガンドは特定用タグを欠如する。ある場合には、リガンドは、特定用タグ、例えば、蛍光タグ、または放射性タグであってもよい特定用タグを持つ。
【００８１】
ある場合には、複数のリガンドの少なくとも約９０％が一意の分子量を持つ。例えば、リガンドの約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％が一意の分子量を持ってもよい。
【００８２】
ある場合には、本発明は、望ましい結合特性を持つ１つ以上の化学化合物を特定する過程に関する。一般に、そのような化合物は、下記の工程を用いて特定される。すなわち、（１）第１リガンドの化学的構造の構造的変種（すなわち、関連化合物）としてのリガンド混合物を供給すること（ある場合には、これらの化合物は、その分子量によって一意に特定することが可能である）、（２）構造変種の混合物を分析し、起源のリガンドのその生体分子レセプターに対する親和度に対し、構造的変種の相対的親和度を定性的に、および／または、定量的に序列化すること、および、（３）その結果を用いて望ましいリガンドを特定し、リガンドの混合、合成、および／または序列化から成る、その後のサイクルのための関連リガンドを設計することである。
【００８３】
本明細書に記載される方法のいずれのものも、繰り返し、すなわち反復的に、あるいは、継時的に、例えば、本明細書に記載される別の方法と交互に使用されてもよい。例えば、第１の方法を用いて、リガンド、またはリガンド混合物に関する結合情報（例えば、相対的結合親和度）を与えるのに用いたならば、別のリガンドは、第1の方法で得られた情報を用いるように設計または試験される。この別のリガンドは、例えば、第１の方法を用いて、あるいはそれと別に、本明細書に記載される第２の方法を用いてさらに評価されてもよい。例えば、リガンド混合物は、先ず、結合親和度の序列で評価し、次に、結合親和度情報を用いて新たなリガンドを設計し、その新たなリガンドを次に、親和度または結合動態によって序列化することも可能である。
【００８４】
本明細書に記載される１つ以上の方法の結果を用いて、評価のために、新たな追加リガンドの合成または集合を指令することが可能である一方、ある例では、単一リガンド、またはリガンド混合物を、方法の１つ以上の工程が再試行される複数の方法、または単一法を用いて評価することが可能である。例えば、単一リガンド、またはリガンド混合物は、結合親和度（例えば、Ｋｄ）を定量することによって、さらにまた、結合速度（例えば、ｋｏｆｆ）を定量することによって評価することが可能である。結合親和度および結合速度動態を定量するこれらの方法は、任意の順序で実行することが可能であり、また、反復的に実行することも可能である。ある場合には、方法の再現性を確かめるために、単一の方法が、同じリガンドまたはリガンド混合物について実行される。
【００８５】
本明細書に記載される方法は、サンプル中のレセプター-リガンド複合体を特定するのに極めて効率的な方法である。これらの方法は、レセプター-リガンド複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー段階から、分析装置、例えば、ＬＣ−ＭＳ装置に直接配送することが可能であり、この配置は、高速のサンプルスクリーニングを可能とするばかりでなく、分画収集器の使用、または、分析装置表面に対するサンプルの付着によるサンプル損失の低下をも可能とする。さらに、本法の望ましい出力は、単一リガンドではなく、リガンド混合物（例えば、結合ライブラリー）によって実現が可能であり、それらリガンドの生成を必要としない。ある場合には、本明細書に記載される方法は、サンプルをミクロンスケールで操作する能力を付与するという利点を持つ。従って、ある１つのレセプターに対して、一度に多数の化合物をスクリーニングすることが可能である。前述の方法はまた、高い感度を持つことが可能なので、マイクロスケールサンプルの正確な検出と特性解明が可能である。さらに、分析用の望ましい生成物を求める探求において分析装置から溶出される溶出液についてランダムサンプリングを行うのではなく、代表的サンプルを、試料が実際にサンプリングループの中にある時にのみ収集することが可能である。
【００８６】
本明細書に記載される過程は、レセプター-リガンド相互作用を最適化するための極めて一般的なシステムを提供することが可能であり、かつ、多様なたんぱく質クラス、例えば、可溶タンパク、膜関連タンパク、酵素、核ホルモンレセプター、および、Ｇタンパク結合レセプター（ＧＰＣＲ）を含むタンパク（ただし、それらに限定されない）と小型分子との相互作用に適用が可能である。さらに、本過程は、その出力について生化学アッセイを要せず、１回の実験当たり通常５μｇ未満の、ごく少量の精製タンパク、または他の生体分子レセプターしか利用しない。さらに、本明細書に記載される方法は、その実行に際してレセプターの構造に関する知識を要しない。さらに、方法の望ましい出力は、リガンドの混合物（例えば、結合ライブラリー）において実現が可能であり、リガンドの精製を要しない。
【００８７】
本発明の１つ以上の実施態様の詳細を、付属の図面と下記の説明において記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明と図面、および特許請求項から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８８】
（詳細な説明）
米国特許第６，２０７，８６１号は、質量符号化結合ライブラリーの製作法、および、それら質量符号化結合ライブラリーにおいて、１個以上の生体分子と会合する化合物を特定する（すなわち、スクリーニングする）方法に関する。この質量符号化ライブラリーは、個々の化合物の少なくとも約９０％（すなわち、９０以上１００以下の任意の整数パーセント）が、その質量符号化ライブラリーの他の個別化合物の分子量とは異なる分子量を持つように設計・合成される。
【００８９】
米国特許第６，２０７，８６１号のスクリーニング法は、自動化リガンド特定システム（ＡＬＩＳ）と呼ばれるシステムを記載する。このＡＬＩＳシステムは一般に下記のように機能する。（１）対象とする生体分子（例えば、タンパク）の溶液を、リガンド（例えば、小型有機分子、またはそのライブラリー）の存在下に、指定の時間インキュベートして、生体分子-リガンド複合体形成反応を平衡に達しさせる、（２）生体分子溶液、未結合リガンド、および生体分子-リガンド複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー段階を通過させ、生体分子、プラス生体分子-リガンド複合体を、未結合のリガンドから、分子サイズに基づいて分離する、すなわち、生体分子、プラス生体分子-リガンド複合体を、溶出流の先頭において共同溶出させる、（３）生体分子、プラス生体分子-リガンド複合体を含むが、未結合のリガンドを全く含まない、この溶出流部分を逆相クロマトグラフィー段階に載せて脱塩し、さらに、その有機分子が、分子量、または質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定され、較正された信号応答の測定によって定量化されるように質量分析装置に溶出させる。
【００９０】
本明細書に記載される方法は、米国特許第６，２０７，８６１号の技術を応用するもので、本法もまた、レセプター-リガンドペアの定量分析は、分析装置または検出器（例えば、質量分析器、ＨＰＬＣ、ＵＶ、ＩＲ、ＮＭＲ等）から得られる、ある範囲のリガンド濃度に渡って実行されたリガンド結合実験におけるリガンド回収に相当する信号応答を分析することによって実現可能であるという発見に一部基づく。この場合、リガンド回収は、未結合リガンドと結合リガンドの分離（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲルろ過、超遠心による）に基づく。これらの実験は、レセプター-リガンド結合の速度論および平衡熱力学を記載するモデルに数学的に一致させることが可能なデータを生む。このモデルは、レセプターとリガンドの混合物について、解離平衡定数（Ｋｄ）、レセプター初期濃度［Ｒ］０、および解離の絶対速度（オフ速度、ｋｏｆｆ）の推定値を与えることが可能である。
【００９１】
「解離平衡定数」（Ｋｄ）という用語は、Ｅ＋Ｓ＝ＥＳタイプの反応において、逆方向速度定数と前進方向速度定数の比を表す。平衡時には、解離平衡定数（Ｋｄ）は、反応物の濃度の積を、生成物の濃度で割ったものに等しい（Ｋｄ＝［Ｅ］［Ｓ］／［ＥＳ］）。Ｋｄの値が小さければ小さいほど、会合反応物同士の結合性相互作用は強い。親和（会合）定数は、該平衡定数の逆数である。
【００９２】
レセプターにたいするリガンドの可逆的結合は下記：
【００９３】
【数７】
のように表される。
【００９４】
Ｋｄは下記：
【００９５】
【数８】
のように表される。
【００９６】
ある場合には、ｋｏｎはｋ１と表され、ｋｏｆｆはｋ２と表される。
【００９７】
全レセプター初期濃度［Ｅ］０は、開放レセプターの濃度［Ｅ］、プラス、結合レセプターの濃度［ＥＳ］として定義される（［Ｅ］０＝［Ｅ］＋［ＥＳ］）。全リガンド濃度［Ｓ］０は、遊離リガンドの濃度、プラス、結合リガンドの濃度と定義される（［Ｓ］０＝［Ｓ］＋［ＥＳ］）。
【００９８】
従って、Ｋｄは、平衡複合体濃度［ＥＳ］と、初期受容濃度［Ｅ］０と基質濃度［Ｓ］０の項を用いて下記：
【００９９】
【数９】
のように表される。
【０１００】
Ｋｄを求めるためには、複合体平衡濃度［ＥＳ］、レセプター初期濃度［Ｅ］０および基質初期濃度［Ｓ］０を知るか、確定しなければならない。
【０１０１】
［ＥＳ］は、実験的に測定することが可能である（例えば、結合リガンドを、未結合リガンドから分離するためにサイズ排除クロマトグラフィーを用い、その後、液体クロマトグラフィーによってレセプター-リガンド複合体を分解し、さらにその後、リガンドに対して較正された質量分析器による質量分析によって）。
【０１０２】
［Ｓ］０は、既知か、または推定することが可能である。
【０１０３】
［Ｅ］０は条件によって変動する可能性があり、実験的に定められる。［Ｅ］０を測定するために、そのレセプターに対してリガンドを滴定することが可能である。複合体［ＥＳ］の復帰は［Ｅ］０の値で最大値に達し、対応する滴定曲線は下記の方程式：
【０１０４】
【数１０】
に一致させることが可能である。その結果は、レセプター-リガンド複合体の平衡濃度ＥＳを、パラメータＫｄ、［Ｓ］０、および［Ｅ］０の関数として表す。任意のＫｄおよび［Ｅ］０について、［ＥＳ］対［Ｓ］０のプロットは、図１に示す直角双曲線に従う。この曲線の厳密な形は、調べられるリガンドのＫｄに依存する。図２に示すように、［ＥＳ］へ向かう漸近極限値は［Ｅ］０に依存する。この態様は飽和結合と記述される。
【０１０５】
様々な［Ｓ］０値における較正実験によって測定された一組の［ＥＳ］値が与えられたならば、方程式を、数値による非直線性回帰技術を用いて［ＥＳ］、［Ｓ］０データペアに適合させ、パラメータＫｄおよび［Ｅ］０に対する最適合数値を見出すことが可能である（図３参照）。
【０１０６】
単一レセプターに対する単一リガンドの相互作用を記載するのに用いられたものと同じ式が、複数の化合物（例えば、複数のリガンド）の混合物と単一レセプター結合部位との相互作用を記載するのに、下記に示すように、使用することが可能である。
Ｅ＋Ｓ１＋Ｓ２＋．．．Ｓｉ→ＥＳ１＋ＥＳ２＋．．．ＥＳｉ
各リガンドＳｉに対するＫｄは下式：
【０１０７】
【数１１】
のように表される。この式は、単一リガンドの場合の前述のＫｄ式の類推によって、
【０１０８】
【数１２】
に拡張される。
【０１０９】
リガンドＳ１についてはある範囲の濃度、第２のリガンドＳ２については固定濃度という、理論的２成分混合物の式（Ｉ）の連立方程式解によって、図４に注記する条件に対して、図示のようなレセプター-リガンド複合体濃度［ＥＳ１］および［ＥＳ２］のグラフが得られる。既知のリガンドＳ１の初期濃度［Ｓ１］０が増すにつれて、対応するレセプター-リガンド複合体濃度［ＥＳ１］も増加する。ところが、Ｓ１およびＳ２がレセプターに競合的に結合する（例えば、オルソステリック結合）場合、レセプター-リガンド複合体濃度［ＥＳ２］は減少する。なぜなら、高濃度のＳ１が、レセプターＥの結合部位を争ってＳ２を押し退けるからである。
【０１１０】
混合物中に複数のリガンドが存在する場合、第２リガンドに比べて、受容器に対して相対的に弱い結合親和度を持つ第１リガンドは、滴定剤（例えば、既知の競合的リガンド）に対し、第２リガンドよりも低い濃度で押し退けられる。例えば、複数の未知のリガンドの存在下に、ある酵素の既知のインヒビターを滴定する場合、相対的結合親和度は、その複数のリガンドが、競合的リガンドによって酵素から押し退けられる順番を評価することによって定めることが可能である。
【０１１１】
「ＡＣＥ５０」という用語は、対象リガンドに対し、競合体不在の場合の対象リガンドの濃度値の１／２（５０％）に低下させるのに必要な競合化合物の濃度を指す。ＡＣＥ５０は、対象リガンドおよび競合因子の平衡結合定数Ｋｄ、および、レセプターおよびリガンド濃度等のパラメータに依存する。ＡＣＥ５０は、既知の化合物が、対象リガンドを押し退ける濃度を表す数値であるが、これは、生化学的または生物物理学的ＩＣ５０の定義と逆である。なぜなら、後者は、対象リガンドが、既知の化合物、例えば、放射性リガンドを押し退ける濃度を表すからである。従来のＩＣ５０値とは対照的に、より高いＡＣＥ５０は、より親和度の高いリガンドであることを示す。すなわち、対象化合物を結合部位から移動させるのに、競合因子のより高い濃度が必要とされるからである。
【０１１２】
レセプターＥが対象リガンドＳｉのプールに対して相対的に過剰に存在し、レセプター-リガンドプール混合物が別の競合リガンドによって滴定される実験条件下では、プールの成分間の競合は無関係であり、対象リガンドＳｉについて観察される外見上唯一の競合は、該リガンドＳｉと添加競合因子の間の競合だけである。
【０１１３】
複数の化合物の親和度を同時にランク付けするためにＡＣＥ５０法がどのように使われるのかを示す、様々のＫｄを持つ３種のリガンドの混合物に関する結合移動シミュレーション実験が図５ａに提示される。このシミュレーションでは、全プール成分の全体濃度（[Ｓ１]０＝［Ｓ２］０＝［Ｓ３］０＝１．０μＭ）は、全体レセプター濃度（５．０μＭ）の桁である。この条件下では、ライブラリー間競合はごく少なく、個々のライブラリー成分は滴定剤とのみ競合する。ＡＣＥ５０値は、リガンド濃度に対しては感受性を持たない。任意の１つのリガンド濃度が９倍変動しても同じ親和度序列を与える。方法のこの特質は、リガンド濃度が、ブロック反応性の構築能力の差によって変動する可能性のある場合に、合成混合物を直接評価する際には有利となる。レセプター濃度よりもプール濃度の方が高い場合の結果が図５ｂに示される。このシミュレーションに示される極端な場合には、異なるＫｄを持つ３種のリガンドは、３種のライブラリー成分それぞれの全体リガンド濃度が５μＭであり、レセプター濃度が２μＭである場合、ほぼ等しいＡＣＥ５０値を与える。
【０１１４】
リガンド混合物から得られるＡＣＥ５０データからＫｄ情報を抽出することは、リガンドの二重混合物Ｓｉの溶液と添加競合因子に還元される。
【０１１５】
前述の原理を用いると、全体レセプター濃度を［Ｅ０］、リガンドＳｉの全体リガンド濃度を［Ｓｉ］０とすると、Ｋｄの式（すなわち、Ｋｄｉ）は、下記の式（Ｉ）：
【０１１６】
【数１３】
で表される。
【０１１７】
競合リガンドＳ１が不在の場合、リガンドＳ２のＫｄ式（すなわち、Ｋｄｉ）は、下記の式（ＩＩ）に示す式：
【０１１８】
【数１４】
に単純化される。
【０１１９】
単純に、かつ読み易くするために、下記の等式では、次の名称を使用する。
【０１２０】
ｋｄ１＝Ｋｄ１
ｋｄ２＝Ｋｄ２
ｓ１０＝［Ｓ１］０
ｓ２０＝［Ｓ２］０
ｅ０＝［Ｅ］０
ｅｓ１＝［ＥＳ１］
ｅｓ２＝［ＥＳ２］
。
【０１２１】
［ＥＳ２］に関する式（ＩＩ）を解くと２つの解が得られ、実数解は下記の式（ＩＩＩ）：
【０１２２】
【数１５】
で示される。
【０１２３】
この式は、競合因子Ｓ１欠如の場合の［ＥＳ２］の値を表す。この数値の半分は、定義により、競合因子Ｓ１の全体濃度［Ｓ１］０がＡＣＥ５０に等しい場合に存在する［ＥＳ２］の量である。
【０１２４】
［ＥＳ２］について式（ＩＩＩ）を解くと２つの解が得られ、実数解は下記の式（ＩＶ）：
【０１２５】
【数１６】
で示される。
【０１２６】
この式は、競合因子Ｓ１と競合している場合の［ＥＳ２］の値を与える。式（ＩＶ）の右辺（ｒｈｓ）を、右辺の１／２に等しいと設定し、［ＥＳ１］について解くと下記の式（Ｖ）：
【０１２７】
【数１７】
が得られる。
【０１２８】
式（Ｖ）は、［ＥＳ２］が競合因子Ｓ１不在時の値の１／２である場合の［ＥＳ１］の値を表す。言い換えれば、これは、［Ｓ１］０＝ＡＣＥ５０の場合の［ＥＳ１］の値である。
【０１２９】
類推から、［ＥＳ１］について解くと２つの解が得られ、実数解は、下記の式（ＶＩ）：
【０１３０】
【数１８】
に示すものとなる。
【０１３１】
ＡＣＥ５０における［ＥＳ２］の値−これは、式（ＩＩＩ）のｒｈｓの１／２である−を、競合因子Ｓ２と競合している時の［ＥＳ１］の値の式−式（ＶＩ）である−に代入すると、下記の式（ＶＩＩ）：
【０１３２】
【数１９】
が得られる。
【０１３３】
上の式（Ｖ）および（ＶＩＩ）の両方とも、［Ｓ１］０＝ＡＣＥ５０における［ＥＳ１］の式である。式（Ｖ）のｒｈｓを式（ＶＩＩ）のｒｈｓに等しく設定し、［Ｓ１］０について解くと、下記の式が得られる。これは、［ＥＳ２］が、競合因子不在時の値の１／２である場合の［Ｓ１］０の値である。言い換えれば、下式の［Ｓ１］０はＡＣＥ５０に等しく、競合因子Ｋｄ１および対象リガンドＫｄ２のＫｄ、レセプター全体濃度［Ｅ］０、および滴定されるリガンドの全体濃度［Ｓ２］０で表される：
【０１３４】
【数２０】
。
【０１３５】
式（ＶＩＩＩ）によって、任意の一組の実験パラメータＫｄ１、Ｋｄ２、Ｅ０、および［Ｓ２］０におけるＡＣＥ５０値を予想することが可能になる。さらにこの式を用いてＡＣＥ５０決定のためのパラメータを最適化することが可能なる。
【０１３６】
Ｋｄ２について、式（ＶＩＩＩ）を解くと４個の解が得られ、その内実数解は、Ｋｄ２を、ＡＣＥ５０、競合因子Ｋｄ１のＫｄ、レセプター全体濃度Ｅ０、および、滴定されるリガンドの全体濃度［Ｓ２］０で表した式である。図６に示すように、式（Ｉ）の厳密解は膨大で扱いにくく、ＡＣＥ５０、Ｋｄ１、Ｅ０および［Ｓ２］０の実験値からＫｄ２の値を導くための別法として、ＡＣＥ５０、Ｋｄ１、Ｅ０および［Ｓ２］０を入力パラメータとして用い、Ｋｄ２について、式（ＶＩＩＩ）の数値解を求めるやり方がある。
【０１３７】
図７は、化合物Ｓ１、Ｓ２およびＳ３の三重混合物を、既知のリガンドＳ１によって滴定した場合の理論的結果を示す。リガンドの全体濃度（添加競合因子を除く）は、レセプター全体濃度よりも低いことに注意されたい。この状況では、混合物中の化合物は互いに競合的ではなく、ただ、過剰に加えられたリガンドとのみ競合すると考えられる。
【０１３８】
Ｋｄ２＝０．５μＭの、２．０μＭのオルソステリック競合性リガンドＳ２の存在下に、Ｓ１で滴定すると、ＥＳ１についてより浅い結合曲線が得られ、タンパク-リガンド複合体ＥＳ２の濃度は、レセプターがＳ１によって飽和されるにつれて減少する。ＥＳ１のＥＳ２に対する比は、レセプターが制限的試薬である場合（すなわち、滴定剤とリガンドとが、レセプター部位を争って競合しなければならない場合）、滴定剤の全体濃度［Ｓ１］０と共に直線的に増加する。この直線関係は、もっとも単純にはレセプターとのオルソステリックな相互作用によって説明される、相互に排他的な競合結合を示し、下記の式：
【０１３９】
【数２１】
によって記述される。
【０１４０】
従って、ＥＳ２に対するＥＳ１のリガンド回収の比、対、滴定剤の全体濃度［Ｓ１］０のプロットは、［Ｓ１］０＞［Ｅ］０の場合、オルソステリックリガンド同士について直線を与える。もしも滴定剤とリガンドのＭＳ反応較正係数が既知であるならば、この直線の勾配は、リガンドと滴定剤の親和度の比を、リガンドの濃度で割った値に等しい。
【０１４１】
複数のリガンドが１つのレセプターに結合するのを記述する際に本明細書で用いる「オルソステリック」という用語は、同じレセプター部位に結合し、一般に互いに排他的に結合する複数のリガンドを指す。例えば、１つのリガンドがレセプターに結合する場合、それは、別のリガンドのレセプターに対する結合を物理的に阻止する。
【０１４２】
前述の方法の例を図８に示す。図７のデータの正規化プロットは、混合物中のリガンドのＡＣＥ５０値は、それぞれのＫｄの関数として変動することを示す。ある範囲の［Ｓ１］０値において測定された一組のＡＣＥ５０が与えられた場合、リガンド混合物の各成分の、タンパク標的に対する親和度をランク付けすることが可能である。さらに、各リガンドＳｉのＡＣＥ５０値に基づいて、図６に示した方程式を解くことによって、個々の結合親和度Ｋｄｉに関する定量的推定が得られる。
【０１４３】
アロステリック結合の三重複合体モデルを下記に示す。このモデルでは、リガンドＳ１およびＳ２は、それぞれ、解離定数Ｋｄ１およびＫｄ２を持ってレセプターＥの別々の部位に結合する。しかしながら、もしも両リガンドがレセプターに同時に結合した場合、両者は、係数αだけ相互の結合定数に影響を及ぼし合う。例えば、Ｓ１は、解定数Ｋｄ１においてＥに結合するが、二重複合体ＥＳ２に結合して、解離定数αＫｄ１において３重複合体ＥＳ１Ｓ２を形成する。α＞１の場合、複数のリガンドの一方によるアロステリック相互作用は、他方の解離定数を増し、負の協力性をもたらす。α＜１の場合は、一方のリガンドによるアロステリック相互作用は、他方の結合には影響を与えない。
【０１４４】
【数２２】
。
【０１４５】
混合成分を分離するためにサイズ排除法を用いることは、一般に、アロステリックに結合した３重複合体から、タンパク-リガンドの２重複合体を分離しない。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた場合、タンパク様分子種は全てＳＥＣ段階から共に溶出する。従って、ある特定のリガンドの回収測定値は、そのリガンドを含むタンパク-リガンド複合体の合計を表す。例えば、回収されたＳ１は、生成物ＥＳ１およびＥＳ１Ｓ２の合計濃度と相関する。図９は、Ｋｄ１＝２．０μＭを持つＳ１を、５．０μＭ濃度のレセプターＥと、Ｋｄ２＝０．５μＭを持つ、２．０μＭ濃度のＳ２との混合物において滴定した場合の、２つのアロステリックリガンドの回収シミュレーションを示す。協調係数α＝１０では、２つの部位の間の負の協調性のために、滴定剤の濃度の増加と共にＳ２の回収が減少する。しかしながら、その回収は、先にオルソステリック結合競合で見た場合のように、ゼロまで低下することはなく、むしろ、レセプター濃度は定常であり（Ｓ２の結合部位は滴定剤によって占拠されない）、一方、Ｋｄ２は係数αだけ増加するので、リガンド回収はプラトーに至る。これは、２つのリガンドの回収比に対して、重要かつ測定可能な影響を持つ。該比は、レセプター制限的条件下では、滴定剤濃度と共に直線的に増加するのではなく、下記の式（ＩＸ）：
【０１４６】
【数２３】
のように双曲線となる。その極限値は、式（Ｘ）：
【０１４７】
【数２４】
の値である。負の協力性が大きい場合、その相互関係は、相互に排他的な競合的結合と区別がつかない。この時式（ＩＸ）の右辺は、式（ＸＩ）：
【０１４８】
【数２５】
の右辺に還元される。
【０１４９】
リガンドのＫｄ、リガンドの全体濃度［Ｓ２］０、レセプター全体濃度［Ｅ］０、および、滴定剤とリガンドの相対的ＭＳ反応較正係数が与えられている場合、アロステリック競合リガンドに対するＡＣＥ５０滴定から得られた反応比データから、滴定剤のＫｄおよび協力性係数αが得られる。図１０のＡＣＥ５０反応比データの非直線性回帰分析によって、ＮＧＤ−２８８３５について、協力性係数α＝８．３±０．７、および３．０±０．３μＭのＫｄ値が得られた。このＫｄ値は、基本的キナーゼに対して行った独立の滴定実験によって測定された３．３±１．３μＭという値とよく一致する。
【０１５０】
図１１Ａ−Ｆは、いくつかのＡｋｔ−１について行った結合モードの同時決定を示す。滴定剤スタウロスポリンによる飽和結合は、これらのリガンドを定量的には押し退けることはしないが、反応比曲線対滴定剤濃度は漸近境界を持つ。これは、全リガンドが、ＡＴＰ／スタウロスポリン結合部位に関してアロステリックに結合することを示す（図１１ａと１１ｂ）。これと対照的に、最近知られるＡｋｔ−１リガンドＭ−１（メルク社）による競合は、この同じ化合物の混合物の各成分に対してオルソステリック結合競合を実現する。これらの結果は、Ｍ−１化合物と、それにたいして直接競合するリガンドは、ＡＴＰ／スタウロスポリン結合部位とは別の場所に結合することを示唆する（図１１ｃおよび１１ｄ）。
【０１５１】
この結論を独立して評価するために、図１２ａ−ｄに示すように、Ｍ−１およびスタウロスポリンによるＡｋｔ−１キナーゼ活性の抑制を、ＡＴＰ濃度を変動させて調べた。スタウロスポリンは、ＡＴＰ-結合部位に結合する。この含意と一致して、ＡＴＰ濃度を増加させると、ナノモルインヒビタースタウロスポリンのＩＣ５０測定値を５０倍以上増す。理論に拘束されることを望むものではないが、ＡＴＰ濃度増加によるスタウロスポリンＩＣ５０の増加は、主に、ＡＴＰ Ｋｍの増加による。この反応におけるスタウロスポリンのＶｍａｘに及ぼす作用は、ＡＴＰの高濃度においても僅かなものである。これらの結果は、スタウロスポリンが、ＡＴＰのオルソステリック競合因子であることを確実にする。（図１２ａおよび１２ｂ）。
【０１５２】
Ｍ−１のＩＣ５０はマイクロモルにしか過ぎないが、そのＩＣ５０は、同じＡＴＰ濃度範囲に対して、スタウロスポリンのナノモルＩＣ５０よりも小さい倍率でしか増加しない。ＡＴＰ濃度増加に伴うＭ−１ ＩＣ５０の増加は、Ｖｍａｘの５倍の減少と、スタウロスポリンにおいて観察されたものよりも小さいＫｍの増加とが合わさったためである。これらの結果は、Ｍ−１は、Ａｋｔ−１に対する混合型、非競合的インヒビターであり、ＡＴＰ変位（ＡＴＰ Ｋｍの増加）と、Ａｋｔ−１キナーゼ活性の遅滞（Ｖｍａｘ減少）を含む生化学的作用機構を示し、かつ、Ｍ−１は、Ａｋｔ−１における、ＡＴＰ−およびスタウロスポリン結合ポケットとは場所的には別の部位に結合することを裏付ける。（図１２ｃおよび１２ｄ）。この結論は、Ｍ−１とスタウロスポリンはＡｋｔ−１に同時に結合することを示唆するＡＣＥ５０の結果とも一致する。さらに、その結果は、ＡＣＥ５０技術が、どのようにしてリガンド混合物のオルソステリックおよびアロステリック結合機構を評価するのに用いられるかを例示する。
【０１５３】
Ａｋｔ−１結合メカニズムの詳細を示すことの他に、Ｍ−１滴定実験はまた、混合物成分の親和度ランキングを与える。ＮＧＤ−２８８３９は、最高のＡＣＥ５０値ｗ持つ。これは、この物質が、このテスト混合物の中でもっとも高い親和度を持つリガンドであることを示している。なぜなら、この物質は、移動のために、滴定物質Ｍ−１の最高濃度を要求するからである。ＮＧＤ−２８８３９は、混合物成分の中でもっとも優れた生化学活性を示す。すなわち、５０μＭ濃度においてＡｋｔ−１キナーゼ活性の４４±８％抑制を実現する。図５におけるＮＧＤ−２８８３９のＡＣＥ５０値は、Ｍ−１のＫｄが０．３±０．１の場合、Ｋｄが３．５±０．７μＭ（９５％信頼間隔１．５から１０．２μＭ）に一致して４．１μＭ（９５％信頼間隔３．４から５．０μＭ）である。この混合物における他のリガンドは、Ａｋｔ−１に対して、ＮＧＤ−２８８３９よりも弱い抑制活性を示した。これは、ＡＣＥ５０滴定実験によってそれらがより低い親和度を持つという所見と一致する。
【０１５４】
ＡＣＥ５０による化合物混合物における親和度ランキング付け、および親和度最適化はさらに図１３ａ−ｂに示される。この図では、ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ２、ＧＰＣＲに対して小規模ライブラリーのリガンドが用いられた。このリガンドプールは、ＡＳ−ＭＳによる、質量符号化ライブラリーの高処理スクリーニングによって発見されたいくつかの化合物を代表する化学タイプを始め、いくつかのＮＧＤ−３３４６の構造的類縁体を含む。既知のＭ２リガンド、アトロピンを、成分当たり０．５μＭの化合物プールの存在下に、２．０μＭ Ｍ２に対して滴定剤として用いた。反応比プロットは直線的であり（図１３ｂ）、試験リガンドは全てアトロピンとオルソステリックに競合することを示した。この結果と一致して、独立した生化学アッセイを行ったところ、試験リガンドは全て、アトロピン同様、Ｍ２の拮抗剤であることが示された。ＡＣＥ５０曲線は親和度における明瞭な差を示し、ＮＧＤ−３３５０は、同種の構造体ＮＧＤ−３３４８およびＮＧＤ−３３４６よりも１０倍高い親和度を示した（図１３ａ）。独立した生化学活性測定はこの結果を確認した。ＮＧＤ−３３５０は、細胞によるｃＡＭＰアッセイにおいて１．６μＭのＩＣ５０を示し、Ｍ２拮抗性に関する組織によるアッセイでは９．６μＭのＩＣ５０を示した。残りの化合物は全て、ｃＡＭＰアッセイにおいて僅かなＭ２拮抗活性を示したけれども、組織において目立った活性を示したのはＮＧＤ−３３５０のみであった。これらの結果は、複数の化合物、特に、組み合わせ化学技術によって合成された構造的類縁体の混合物について、親和度によってそれらを同時にランク付けし、前駆体に対して親和度を向上させた化合物、例えば、母体化合物ＮＧＤ−３３４６に対して親和度を向上させたＮＧＤ−３３５０を特定する点においてＡＣＥ５０法が有利であることを強調するものである。
【０１５５】
単一部位平衡結合における生成物と反応因子の平衡濃度は、平衡解離定数Ｋｄで表されるが、この平衡解離定数は、下式（ＸＩＩ）：
【０１５６】
【数２６】
に示されるように、解離速度定数ｋ２の会合速度定数ｋ１に対する比として表される。この式から、任意の会合速度定数ｋ１において、解離速度定数ｋ２の値がより低くなると、より小さいＫｄ値が得られ、従って、所望のタンパク-リガンド複合体の平衡濃度がより高くなることが見て取れる。
【０１５７】
レセプター-リガンド複合体Ｅ-Ｓ（または、もっと簡単に書くとＥＳ）濃度の、時間に対する全体変化率、ｄＥＳ／ｄｔは、形成速度と分解速度の差である（式（ＸＩＩＩ）参照）。
【０１５８】
【数２７】
ＥＳの形成速度は、会合速度定数ｋ１、レセプターＥ０の全体濃度、および、リガンドＳ０の全体濃度に依存し、一方、ＥＳの解離速度は、ＥＳ濃度、および解離速度定数ｋ２に依存する。従って、レセプターと単一リガンド間の、単一部位における可逆的結合については、下記の式（ＸＩＶ）：
【０１５９】
【数２８】
を用いて、ｄＥＳ／ｄｔをモデル化することが可能である。ｄＥＳ／ｄｔがゼロの場合（定義上、システムが平衡にある場合である）、式（ＸＩＶ）は、式（ＸＩＩ）の平衡式に還元されることに注意すべきである。
【０１６０】
前述の単一リガンド-単一部位平衡との類推に基づいて、リガンドＳと抑制性リガンドＩの間の競合的結合を下記に記述する。式（ＸＶ）：
【０１６１】
【数２９】
に示すように、開放レセプターＥは、遊離リガンドＳと反応して複合体ＥＳを形成するか、または、遊離インヒビターＩと反応して複合体ＥＩを形成することが可能である。タンパク-リガンド複合体ＥＳ、およびＥＩの濃度の全体変化速度は、それぞれ、式（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩ）：
【０１６２】
【数３０】
によって表される。本システムの挙動は、システムパラメータ、すなわち、Ｅ０、レセプター全体濃度；Ｓ０およびＩ０、リガンドおよびインヒビターの全体濃度；混合物中の相互作用成分における会合および解離速度ｋｓ１、ｋｓ２、ｋｉ１、およびｋｉ２；および、ＥＳおよびＥＩの初期濃度に関する数値が与えられた場合、前記２つの連立方程式の数値解を用いることによってモデル化することが可能である。
【０１６３】
ＥＳの初期値がゼロに等しく無い場合の連立方程式（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩ）を解くことによって、過剰のインヒビターが突然に添加された場合の、システムの時間的変動をモデル化することが可能である。大量の過剰なインヒビターＩがＥＳの溶液に添加された場合、ＥとＳの会合速度ｋｓ１はゼロと推定することができる。その理由は、レセプター-リガンド複合体ＥＳが解離すると、そのレセプターは次にインヒビターＩに結合されるからである。なぜなら、Ｉは大量に存在するので、ＥＳ複合体には解離しか残されておらず、ＥとＳにとって再会合する道は閉ざされているからである。従って、ＳとＩとがＥに対して競合的に結合する場合、大量で過剰なインヒビターＩは、Ｅの結合部位の実質的に全てを占拠する。式（ＸＶＩＩＩ）は、大量で過剰なインヒビターＩがＥＳの混合物に添加された場合の、式（ＸＶＩ）：
【０１６４】
【数３１】
の解を示す。
【０１６５】
図１４−１７は、インヒビター濃度の変化、および、図示の他のパラメータ、例えば、リガンドＳおよびインヒビターＩの会合速度および解離速度を含めたパラメータの変動に暴露した場合の、レセプター-リガンド複合体の反応の時間的変化をシミュレートする数学的モデル実験の例である。方程式を解くと、レセプター-リガンド複合体の解離速度ｋ２および半減期が得られる。ｋｓ２のｔ１／２に対する関係は式（ＸＩＸ）：
【０１６６】
【数３２】
に示される。
【０１６７】
図１４は、典型的な会合・解離速度を持つ５μＭのレセプターおよび１μＭのリガンドから成るシステムに、元のレセプター−リガンド平衡混合物の１：１希釈液と共に、大量で過剰なインヒビターを、リガンド濃度は定常に維持するようにしながら添加したものの数学的モデルである。前述したように、インヒビターが、レセプターを争ってリガンドと競合する速度は、レセプター−リガンド複合体の解離速度と、インヒビターとレセプターの会合速度に依存する。図１４の結果は、インヒビターが様々な会合速度を持つ場合について示される。レセプターを、平衡したレセプター−リガンド混合物と等しいリガンド全体濃度を含む非会合性インヒビター（ｋｉ１＝０）で希釈すると、最初に、元の値の５０％に至る低下があり、次に（活性なインヒビターが不在の場合）システムは自ずから新たな平衡に回復する。しかしながら、過剰な会合性インヒビターの存在下では（ｋｉ１≠０）、開放レセプターは、もしあれば、全てインヒビターによって、レセプター−リガンド複合体が再形成されないように塞がれてしまう。さらに、レセプター−リガンド複合体でもし自発的に解離するものでもあれば、その速度はｋｓ２に依存するのであるが、その開放されたレセプターは過剰なインヒビターによって塞がれる。従って、レセプター−リガンド複合体の相当濃度が、過剰なインヒビターの添加後時間と共に減少する。結合速度が極めて遅いインヒビターの場合でも（ｋｉ１＝０．００１μＭ−１秒−１）、分解曲線の勾配は、純粋な解離速度論から得られる理論的分解曲線［ＥＳ］０ｅ−ｋｓ２ｔ（式ＸＶＩＩＩ）のものに近づくことが見て取れる。分解が指数関数に従うにつれて、実験的分解曲線と理論的曲線の類似性は、図１５に示すように、プロットをログ空間で比較した場合にさらに明白である。
【０１６８】
例えば、過剰なＩを、複数のリガンドとレセプターとの混合物に導入した場合、その複数のリガンドの結合速度を相対的に決定することは可能である。Ｉが十分過剰の場合、リガンドは、一旦レセプターから離れたならばレセプターに再度結合することはないのであるから、リガンド混合物において、その信号応答がもっとも速く減少するリガンドは、それらのリガンドの内でもっとも早い解離速度を持つと判定することができる。
【０１６９】
この方法の例は図１６に示される。この図は、典型的なレセプター−リガンド会合速度を持ち、レセプター−リガンド解離速度を変えながら、５μＭタンパクおよび１μＭリガンドから成るシステムに、元のレセプター−リガンド平衡混合物の１：１希釈液と共に、大量で過剰なインヒビターを、リガンド濃度は定常に維持するようにしながら添加したものを数学的に示す。モデル化した各リガンド解離速度ごとに、純粋な解離速度論から得られる理論的分解曲線［ＥＳｕｂ］０ｅ−ｋｓｕｂ２．ｔ（式（ＸＶＩＩＩ））も示してある。モデルは、レセプター−リガンド複合体の減少速度は、絶対的解離速度の緊密に相関することを示す。
【０１７０】
モデル化された競合結合実験におけるレセプター−リガンド複合体の分解速度と、純粋な解離速度の測定から期待される理論的分解曲線との間の厳密な相関度は図１７において評価される。モデル化分解曲線はｋｓ１＝０．０１秒−１の場合について示され、理論曲線は、解離速度±この値の１０％として示される。結果から、測定解離速度は、実際値の〜１０％以内であり、これは、実験法の単純さと考え合わせると、実際の解離速度に関する極めて良好な近似である。
【０１７１】
実験的に測定された分解曲線が、第一次の解離速度論から期待される指数関数的分解曲線と緊密に合致するのであるから、各リガンドの解離速度と半減期情報を抽出するために、市販の曲線適合アルゴリスム、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）によって支給されるものを用いて、実験データを純粋の指数関数的分解関数に合致させることも可能である。過剰な競合的インヒビターを、タンパクと、１つの、または複数の対象リガンドとの平衡した混合物に添加した後に実行する逐次実験によって得られた、一組のタンパク−リガンド複合体測定濃度値の時間的変化が与えられた場合、各リガンドの解離速度を定量的に評価し、混合物における複数のリガンドの相対的速度を定量的にランク付けすることが可能である。
【０１７２】
「非競合的リガンド」という用語は、活性部位とは別の第２部位においてレセプターに結合するリガンドを指す。非競合的リガンドの結合は、別のリガンドと同時に起こり得るし（例えば、酵素の触媒部位で）、または、レセプターのみに結合してなおレセプターの反応に影響を及ぼすことも可能である。ある場合には、非競合的リガンド（例えば、酵素に対する非競合的リガンド）は、レセプターの効力を低減させる（例えば、酵素の効力を減らす、活性部位の配置を含めたレセプターの立体配置を変える）ことによって作用することが可能である。
【０１７３】
リガンドが非競合的リガンドである場合、過剰なインヒビターＩの導入は、その非競合的リガンドがレセプター−リガンド複合体から解離したとしても、その再会合を阻止するように作用しない。従って、非競合的リガンドの信号応答の時間変化は、過剰なインヒビターの添加後も、定常なままである。
【０１７４】
複数のリガンド同士を比較し、好ましい結合特性を持つリガンドを特定する、もう１つの方法は、「レセプター制限的」および「過剰なレセプター」条件下でリガンド結合を比較することを含む。固定濃度の「初発」（例えば、既知）リガンドＳｉ、および、第２の「変動」（例えば、関連または改善）リガンドＳｖから成る、理論的２成分混合物に関する下記の連立方程式（Ｉ）：
【０１７５】
【数３３】
を解くと、図に注した条件下で、図１８に示すレセプター−リガンド複合体濃度［ＥＳｉ］および［ＥＳｖ］のグラフ表示が得られる。レセプター全体濃度［Ｅ］０を、［Ｅ］０＜［Ｓｉ］０から［Ｅ］０＞［Ｓｉ］０まで増すにつれて、実験条件は「レセプター制限的」から「レセプター過剰」へと進行すると書き表せる。緊密なリガンドのレセプター−リガンド複合体の、弱いリガンドの複合体に対する比は、実験がレセプター制限的条件に近づくに従って増加する。これは、より緊密なリガンドが、存在する限定量のレセプターを争ってより弱いリガンドに打ち克つことを示す。従って、質量符号化混合物中のリガンドの結合親和度のランク付けは、初期化合物（例えば、元のリード化合物）を含む複数のリガンドの混合物を、レセプター制限的条件下と、レセプター過剰条件下別々に、レセプターに接触させ、レセプター−リガンド複合体をアフィニティー選択質量分析によって定量化し、各リガンドの信号応答比を比較することによって実現される。その際、比とは、１）レセプター不在下のリガンドの信号応答の、レセプター過剰下の各リガンドの信号応答に対する比、および、２）レセプター不在下のリガンドの信号の、レセプター制限的条件下における信号応答に対する比である。
【０１７６】
本明細書に記載される方法は、混合物の成分を、サイズ排除クロマトグラフィーによって未結合リガンドをレセプターおよびレセプター結合リガンドから分離し、次に液体クロマトグラフィーを用いることによって実行することが可能である。液体クロマトグラフィーは、リガンドからレセプターを解離する条件下で実行することが可能である。次に、この解離されたレセプターを質量分析器に通過させて、信号応答を得る。
【０１７７】
図１９は、左から右へ、本明細書に記載される方法においてサンプル内のレセプター−リガンド複合体が特定される際に、リガンドが辿る経路を示す。レセプター、リガンド、およびレセプター−リガンド複合体を含むサンプルは、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）を通過させられる。ここでは、溶出液は、ＵＶ検出器（ＵＶ１）によって監視される。次に、サンプルはサンプルループに入り、ここで、第２分析装置に転送されるか、または出口（例えば、廃棄口）に振り向けられ、ここでは、図１９に示すように、第２のＵＶ検出器（ＵＶ２）によって監視することが可能である。
【０１７８】
液体サンプル中のレセプターの有無を判定するために、多くのスクリーニングおよび分析技術は光吸収検出器（例えば、ＵＶ、蛍光）に依存する。ＵＶ検出器は、その検出器を通過する材料によるＵＶ光の吸収を測定する。通常、チャートにおいて、吸収は時間に対してプロットされる。材料は、サイズ排除クロマトグラフィー装置を通過した後、検出され、出力ピークがチャートまたはモニター上に形成される。ピークの大きさ（すなわち、容量）は、特定の波長におけるサンプルまたは材料による吸収の程度に一致する。
【０１７９】
サンプル材料をＵＶ検出器にかける前に、レセプター−リガンド複合体は、先ず、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、未結合リガンドおよびその他の不純物から分離される。サンプルの各分離成分は、ＵＶトレース中にピークを記録し、これはチャートに作成される。大きな物理的サイズを持つ分子種は、サイズ排除クロマトグラフィーから溶出される最初の分子種であり、早期のＵＶピークを記録する。例えば、タンパクであるレセプターと、小型分子であるリガンドを有し、レセプターおよびリガンドのあるものはレセプター−リガンド複合体を形成しているサンプルの場合、レセプターとレセプター−リガンド複合体とは、溶出流の先頭部において共同溶出する。これは、小型分子リガンドのはるかに小さいサイズに比べて、タンパクが比較的大型であるためである。
【０１８０】
「サイズ排除クロマトグラフィー」（ＳＥＣ）という用語は、異なるサイズを持つ分子を分離するために多孔性粒子を使用することを指す。このものは一般に生物分子を分離するため、分子量およびポリマーの分子量分布を決めるために用いられる。一般に、孔径よりも小さい分子は粒子の中に入ることができるので、粒子の中に入ることのできない比較的大型の分子よりも長い経路を経ることとなり、長い転送時間を要する。孔径よりも大きな分子は孔に侵入できないので、クロマトグラムにおいて第１ピークとして一緒に溶出されない。この条件を全的排除と呼ぶ。孔に入ることが可能な分子は、分子のサイズと形に依存する、粒子における平均滞在時間を持つ。従って、様々な分子は、カラムを通過するのに、異なる全体転送時間を持つことになる。ポアサイズよりも小さな分子は全ての孔に入ることができるので、カラムにおいて最長の滞在時間を持ち、クロマトグラムでは最終ピークとして共同溶出する。
【０１８１】
サンプルは、ＳＥＣを溶出流（「ＳＥＣ溶出流」）として脱け出し、ＵＶ検出器を通過する。図２０Ａに描くように、ＳＥＣ溶出流１０は、高速２位置６ポート選択バルブ４に取り付けられたサンプルループ１を通過し（例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００μｌサンプルループ）、溶出流出口１２に、ＵＶ検出器（図示せず）がレセプター−リガンド複合体を含むピークを検出するまで流れ込む。サンプルループ１とバルブ４の、この初期位置を「負荷」位置と呼ぶ。
【０１８２】
レセプター−リガンド複合体を検出すると、コンピュータ（図示せず）に接続されたコントローラーは、サンプルループ１をレセプター−リガンド複合体で満たすのに十分な指定の時間（例えば、２−５秒）にセットされたタイマーを起動する。一旦サンプルループ１がレセプター−リガンド複合体で満たされたならば、コントローラーは、２位置６ポート選択バルブ４におけるサンプルループ１を、図２０Ｂに描かれる位置に回転させる。従って、充填サンプルループは、サンプル中の全レセプター−リガンド複合体の代表的な見解を含む。
【０１８３】
この位置は「注入」位置と呼ばれる。図２０Ｂで見られるように、ＳＥＣ溶出液１０および溶出流出液１２はサンプルループ１にはもはや接続されず、サンプルループ１は、分析装置に接続される別の溶出流につながれる。分析装置溶出液１４ａ（例えば、溶媒）は、サンプルループ１に流入し、通過し、サンプルループ１を、サンプル溶出液１４ｂとして脱け出す。ここで、サンプル溶出液１４ｂは特定のために分析装置（図示せず）に流入する（例えば、質量分析）。
【０１８４】
分析装置の規模は、小型またはミクロサンプルを含む、各種サイズのサンプルを扱うように合わせることが可能である。１５μｌのサンプルループのサンプルパラメータは下記の通りである。ＳＥＣから複数ポートバルブ４への接続チューブは３５ｃｍｘ７５μｍ、サンプルループは８４ｃｍｘ１５０μｍ、分析装置溶出流１４ａをサンプルループに接続するチューブは４０ｃｍｘ２０μｍ、サンプルループから分析装置（すなわち、サンプル溶出液）１４ｂへの接続チューブは５０ｃｍｘ１００μｍ、および、サンプルループから溶出流出口１２への接続チューブは４５ｃｍｘ７５μｍである。ＳＥＣ後の溶出液を収集するのに用いられるサンプルループは、ポリマーでコートした毛細管で構成される。次に、所望の長さ（すなわち、所望の容量）の毛細管を巻いてループとし、占有スペースを低減させる。
【０１８５】
コントローラーは手動で、例えば、ＵＶピーク検出とタイマーを観察する人が操作することも可能である。あるいは別に、コントローラーはコンピュータに接続して、ソフトウェアプログラムによって操作することが可能である。例えば、ソフトウェアプログラムは、ＵＶ検出器がレセプター−リガンド複合体を検出するのと同時にタイマーをスタートし、その際、指定の時間に、コントローラーは、サンプルループ１を、図２０Ａに示す負荷位置から図２０Ｂに示す注入位置へと回転させる。
【０１８６】
ある場合には、コントローラーを操作するために用いられるソフトウェアは、ディジタルとアナログの両インプットを備えた、国立装置データ獲得（ＤＡＱ）ボードの周囲に構築される。サイズ排除クロマトグラフィーシステムの接点が、ディジタルインプットの内の１つに接続される。サンプル注入が実行されると、接点は閉鎖され、ディジタルインプットはトリガーされる。これは、コントローラーにサンプル分析試行が開始したことを告知する。
【０１８７】
本明細書に記載される方法は、各検出器がサンプルの吸収レベルに対して−１Ｖから＋１Ｖの範囲のアナログ信号を発する、２つのＵＶ検出器を用いることが可能である。例えば、第１ＵＶ検出器は、ＳＥＣカラム（すなわち、ＳＥＣ溶出液１０の流れの中に）と複数ポートバルブ４の間に配置してよい。第２ＵＶ検出器は、流出溶出流１２の流れの中に配置してもよい。信号は、コントローラーのアナログインプットの内の２つに接続される。信号は、１２ビットアナログディジタル（Ａ／Ｄ）変換器によってディジタルに変換される。次に、コントローラーは、このディジタル信号を用いて、ＵＶ検出器を通過したピークを追跡することが可能となる。
【０１８８】
サイズ排除クロマトグラフィーの性質のせいで、ＵＶ検出器を脱出する最初のピークは、一般に、レセプター−リガンド複合体と開放レセプターを含むピークである。コントローラーは、信号の最初の上昇を待ち構えていて、それをピークと登録する。サンプルループにおけるピーク（すなわち、サンプル）の捕捉は、このピークの検出と同時に起動されるタイマーに基づく。
【０１８９】
ＵＶ検出器を通過する溶媒を押し出すポンプの流速は定常で２ｍＬ／分であってもよい。この流速では、１００μＬサンプルループを充填するのに３．３秒かかる。従って、ピーク特定後サンプルループ１を検出される物質で満たすのに必要な遅延時間は約３．３秒である。しかしながら、ＵＶ検出器からコントローラーに至るまでに恐らく信号遅延が起こるので、遅延時間は、各システム構成毎に実験的に決定される（すなわち、システムは較正され、システムの各変更毎に改めて較正される）。容量と流速はサンプル毎に変わるものではないから、ＵＶ検出器からサンプルループまでの移動時間に変化がもしあるとすれば、それは、溶媒ポンプによって生じる流速のゆらぎのみに起因する。従って、チューブ配置に何かの変更が加えられた場合（例えば、システムが変更された場合、または何かの部品が交換または調整された場合）、そうとあからさまに表示はされないが、遅延時間に関する再評価が必要である。
【０１９０】
２つのＵＶ検出器を用いて、複数ポートバルブの回転−これによって、サンプルループに捕捉されたサンプルはＬＣ−ＭＳのような分析装置に振り向けられる−前後のデータを捕捉することが可能となる。２つのＵＶ検出器のデータをプロットすることによって、各サンプルのサンプル捕捉状態が視覚的に描かれる。一方の検出器は、レセプター−リガンド複合体を追跡し、コントローラーによって、サンプルループとバルブの回転タイミングを取るのに利用される。第２検出器は、分析装置から遠ざけられるサンプルフローに接続される。この検出器からのトレースは、サンプルループに捕捉されないものを明らかにする。上記２つのトレースを比較することによって、ピーク捕捉の効率が明らかにされる。
【０１９１】
ＵＶ装置におけるサンプル検出の正確度を向上させるために、アルゴリスムを用いてデータを収集・処理し、ピーク（すなわち、レセプター−リガンド複合体の存在）の存在を判定する。ＤＡＱボードは、２０ｋＨｚの最大周波数でデータを収集する。しかしながら、多くの場合、生のデータはピーク特定に用いるにはあまりにも不安定である。例えば、低タンパク濃度のサンプルは信号雑音のために見失うことがあり得る。従って、アルゴリスムを用いて、データを滑らかにし、高信頼度のデータ出力を得ることも可能である。
【０１９２】
現在使用されるアルゴリスムは、あらかじめ設定された時間間隔で複数セットの生データを収集し、平均する。次に、これら平均化セットをさらに処理して、データの移動平均を作成する。その結果をコントローラーはピークを求めて追跡する。例えば、１０ｋＨｚのサンプリングレート（毎秒１０，０００データポイント）では、５００ポイントの生データから成る複数セットが連続的に収集され、５０ミリ秒毎に平均される。最初の７セット（それぞれ５００ポイントの生データから成る）を、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと表示する。ＡからＥまでのセットを平均してデータポイント１を作成する。ＢからＦまでのセットを平均してデータポイント２を作成する。ＣからＧまでのセットを平均してデータポイント３を作成し、以下同様の手順を繰り返す。このデータポイントはコントロールシステムによってプロットされ、ピークの有無に関して検査される。
【０１９３】
ピーク検出のための基準は、単に、初期閾値に対して数値の上で増えている連続する３データポイントの位置を求めることである。この閾値は、その期間はサンプルバッファーしかＵＶ検出器を通過しない、データ捕捉の最初の２秒間データポイントを追跡して決める。この時の最高データポイントを閾値に設定する。これによって、バッファーによるＵＶ吸収を始め、基線ノイズによる信号変動のために生じる擬似陽性ピークへのヒットが排除される。この閾値は、ユーザーによって、要すれば随意にさらに指定の量だけ増やされてもよい。
【０１９４】
サンプルを、サイズ排除クロマトグラフィー５０ｍｍカラムの上に、リン酸バッファーを用いて２ｍＬ／分の流速で流した場合のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とリガンドの分離・特定の代表的結果を図２１に示す。ＵＶ１およびＵＶ２トレースの相対的高さは、各ピークが、再現可能的に、同じ量だけ（〜６０％相対的ピーク面積）カットされていることを示す。ピークの保持時間はほとんど同一であるが、これは適正なシステム操作にとって必要ではない。ピークの検出とカットは、ピークの位置について相対的に動的に行われるので、保持時間は無関係である。
【０１９５】
ピークカット時間の変更は簡単に修正され、ＨＳＡシステムにおいてそのようにした結果が図２２Ａ−２２Ｆに示される。従って、記載の方法を用いた場合、注入ポートバルブの負荷位置から注入位置への変更のタイミングは、ユーザーが収集したいのはピークのどの部分なのかに応じて調整することが可能である。図２２Ａは、２秒後にサンプルループに捕捉されたピークの部分を示す。図２２Ｂは、２．５秒後にサンプルループに捕捉されたピークの部分を示す。図２２Ｃ−２２Ｆは、それぞれ、３．０秒、３．５秒、４．０秒、４．５秒後にサンプルループに捕捉されたピークの部分を示す。図２２Ａ−２２Ｆに見られるように、検出からサンプルループの回転までの遅延時間をコントローラーによって変えることによって、サンプルループにおいて、ピークの異なる部分（例えば、検出されるレセプター−リガンド複合体の異なる部分）の捕捉が可能である。プロットの垂直線は、サンプルループに捕捉されたサンプルの１００μＬ部分にほぼ相当する。図示のデータでは、３秒（図２２Ｃ参照）が遅延時間として最適値である。
【０１９６】
予想サンプル移動時間は計算されるけれども、バルブ死腔やＵＶ検出器の指定値からのバラツキは較正を必要とする。検出器出力の時間遅れも、考慮しなければならない要因である。各場合について、サンプルの較正試行を行うことによって、これらの要因による移動時間の変動を確定することが可能である。
【０１９７】
サンプルループのサイズを増すことによってサンプルピークのより大きな部分を捕捉することが可能である。しかしながら、多くの場合、ピークの先頭部分がもっとも望ましい部分である。なぜなら、この部分は、レセプター−リガンド複合体を含むばかりでなく、何かの理由で紛れ込む未結合リガンドを含む可能性がもっとも低いからである。紛れ込みとは、小型の分子が、その実際の質量よりも、見かけ上はるかに大きい質量と共にサイズ排除クロマトグラフィーを通過し、タンパク信号と見分けられないピークとして現れることが観察される現象である。
【０１９８】
「信号応答」という用語は、分析装置または検出器（例えば、質量分析器、ＵＶ、蛍光、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、ＩＲ等）の出力であって、その分析装置に存在する対象物質の量と測定可能なやり方で相関する出力を指す。特定の物質の信号応答は、物質そのものに関係するいくつかの要因（例えば、ＵＶ活性、イオン化電位等）を始め、分析装置または検出器に関係する要因（例えば、感度）にも依存する。ある物質の信号応答は、物質量に関して直線的であってもよい。しかしながら、信号応答は、物質の量に関して直線的である必要はなく、むしろ、信号応答は、評価される物質の量に測定可能なやり方で依存することだけが必要とされる。例えば、信号応答は、分析装置または検出器において分析される物質の量に対して対数的な、または指数関数的な関係を持ってもよい。
【０１９９】
「較正」という用語は、測定によって、または標準との比較によって、計器またはその他の測定装置の各スケール読み取りの適正値を確定することを指す。例えば、分析または測定装置（例えば、質量分析器）は、その真の値が既知の分析対象（例えば、複数濃度の複数リガンド）について複数の値を測定する、または判定することによって較正することが可能である。測定値は、真の測定結果である「絶対的」なものであってもよいし、測定値に相関する「相対的」なもので、数値範囲の上に測定値を表示するものであってもよい。
【０２００】
「質量分析器」とは、イオン化された原子または分子の質量対電荷比（ｍ／ｅ）における差を利用して、それらの原子または分子を相互に分離する分析装置を指す。従って、質量分析器は、原子または分子の定量、および分子に関する化学的、構造的情報を定めるのに有用である。分子はそれぞれに異なる断片化パターンを持ち、これが、構造成分を特定するための構造情報を与える。質量分析器の一般的操作は、（ａ）気体相イオンを作製すること、（ｂ）イオンを、それらの質量対電荷比に基づいて空間または時間において分離すること、および、（ｃ）各質量対電荷比のイオンの量を測定することである。質量分析器のイオン分離力は、その解像度によって表される。
【０２０１】
従来技術においてはたくさんのイオン源が知られる。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、電子イオン化（ＥＩ）、高速原子衝突イオン化（ＦＡＢ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電子捕捉（陰イオン化学的イオン化またはＮＩＣＩと呼ばれることもある）、および、大気圧化学イオン化（ＡｐＣＩ）である。上記イオン化法から任意に選ばれるもので生産されたイオンは、典型的には磁場である質量分離器、４重極電磁石、または飛行時間質量分離器を通過させられ、イオンの質量が区別され、各質量レベルにおけるイオンの数が定量されるように分離される。
【０２０２】
質量分析（ＭＳ）は、有機化学と無機化学の両方において分子の特性解明と特定のために広く利用されている技術である。ＭＳは、分子に関する分子量情報を提供する。ある分子の分子量は、複数の分子の混合物において特定の分子を特定するに当たって、決定的に重要な情報部分である。ＭＳ分析は、例えば、薬剤開発および製造、汚染コントロール分析、および化学的品質管理に利用される。
【０２０３】
「リガンド」という用語は、レセプターと会合する（例えば、共有的に、または非共有的に）分子を指す。ある場合には、リガンドのレセプターに対する結合は生物学的作用（例えば、共働作用、または拮抗作用）を持つことが可能である。例えば、リガンドは、生体分子（例えば、ＤＮＡ分子）に結合するポリペプチド（例えば、タンパク）であって、その際、タンパクのＤＮＡに対する結合がｍＲＮＡ合成を起動してもよい。リガンドはまた、酵素（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ）に結合する有機分子（例えば、製薬化合物）であって、その際、酵素に対する有機分子の結合が酵素活性を抑制してもよい。
【０２０４】
「異種リガンド」という用語は、元のリガンドと関連するが、そのリガンドとは異なる分子を指す。例えば、異種リガンドは、元のリガンドと同じコア構造を持つが、そのコア構造に１個以上の異なる末端基を付着させてもよい。この異種基は、例えば、メチル基をエチル基に変えただけの僅かな変動であってもよい。あるいは別に、異種基は、さらに大きな、例えば、アミド基を芳香基に変えるような著明な変動であってもよい。異種リガンドはまた、元のリガンドのコア構造を元にした変化、例えば、フェニル環をピリジル環に変化させる等の変化を含んでもよい。
【０２０５】
「ｉ」という単語は、レセプターと複数のリガンドの混合物における、１とリガンド数の間の整数であって、「ｉ」はその混合物における個別リガンドを表す。
【０２０６】
「有機分子」という用語は、非ペプチド化合物であって、炭素と水素を含み、さらに、窒素、酸素、リン、ハロゲン元素、または硫黄のような、さらに別の元素を含む分子（例えば、製薬化合物）を指す。製薬学的に受容可能な塩（例えば、マレイン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、酢酸、フマール酸、サリチル酸、クエン酸、乳酸、マンデル酸、酒石酸、および、メタンスルフォン酸の各塩）も「有機分子」という用語の意味の中に含まれる。
【０２０７】
「インヒビター」という用語は、レセプターに会合する分子であって、レセプターに会合することによって、レセプターの機能に作用する、または、レセプターの、別のリガンドとの会合を阻害する分子を指す。ある場合には、インヒビターは、リガンドと競合的なやり方で会合する。
【０２０８】
「レセプター」という用語は、第２分子と会合することによって、作用（例えば、生物学的活性または検出可能な信号）を可能とする、または、作用を起動する分子を指す。例えば、レセプターは、特定の細胞外信号分子（例えば、リガンド）に結合し、細胞中に反応を起動するタンパクであってもよい。細胞表面レセプターの例としては、アセチルコリンレセプター、およびインスリンレセプターが挙げられる。細胞内レセプターの例としてはホルモンであって、細胞膜を横切って細胞中に拡散するリガンドに結合するホルモンが挙げられる。レセプターの他の例としてはポリペプチド、タンパク、酵素、リボザイム、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および、生体分子模倣体が挙げられる。
【０２０９】
「生体分子」という用語は、生物活性（例えば、代謝、拮抗作用、共働作用、信号発射、または、転写）に作用を及ぼす分子を指す。生体分子は、生きている生物体に見出されるが、生体分子という用語は、天然に見られる生体分子に限定されず、天然に見られる生体分子の合成版を始め、それらの断片および改変をも含む。生体分子の例としてはポリペプチド、タンパク、酵素、リボザイム、ＲＮＡ、およびＤＮＡが挙げられる。
【０２１０】
「ポリペプチド」という用語は、複数のアミノ酸から構成されるポリマーを指す。タンパクはポリペプチドの１つの例となり得る。
【０２１１】
「酵素」という用語は、化学的または生化学的反応の反応速度を増すことによって（生体）触媒として機能する巨大分子、通常はタンパクを指す。一般に、酵素は、ただ１つの反応タイプ（すなわち、反応選択性）のみを触媒し、かつ、ただ１つのタイプの基質にしか作用しない（すなわち、基質選択性）。基質分子は、同じ部位で変形され（領域選択性）、一般に、基質のラセミペアの内ただ一方のキラル基質のみが変形される（エナンチオマー選択性、立体選択性の特殊形態）。
【０２１２】
「核酸」という用語は、ヌクレオチドサブユニットから構成されるポリマーを指す。ヌクレオチドサブユニットは、フォスフォジエステル結合によって繋ぎ合わせることが可能である。
【０２１３】
「レセプター−リガンド結合対」という用語は、一般に、可逆的なやり方で、非共有的な相互作用（例えば、水素結合、イオン相互作用、または疎水性相互作用）によって接合されるレセプターとリガンドを持つ複合体を指す。
【０２１４】
「滴定剤」という用語は、滴定反応における分析対象（例えば、レセプター）と定量的に反応する、および／または、相互作用を持つ物質（例えば、リガンド）を指す。滴定剤は、通常、反応および／または相互作用が完了するまで注意深く分析対象に添加される標準液である。分析対象の量は、反応完了に必要とされる滴定剤の容量から計算される。
【０２１５】
「滴定」という用語は、過程であって、それによって、１つの液（例えば、既知のＫｄを持つリガンド液）が、もう１つの液（例えば、基質とＫｄ既知のリガンドの混合液）に、前記２つの溶質（例えば、基質と推定Ｋｄを有するリガンド）の間の相互作用が完了するまで添加され、その時点で、一方のリガンド液の濃度（例えば、既知の、または推定Ｋｄを有するリガンドの濃度）が既知とされる、またはほぼ既知とされる過程を指す。
【０２１６】
「平衡」という用語は、化学的および／または生化学的可逆反応および／または相互作用における状態であって、反応物質が生成物に、生成物が反応物質に復帰するのと同じ速度で変換され、そのために、各反応物質および生成物の量は事実上定常のままであり続ける状態を指す。
【０２１７】
「レセプター−リガンド結合対を破壊する」という言説は、レセプター−リガンド結合対を解離させて未結合レセプターとリガンドに分離することを指す。レセプター−リガンド結合対の破壊は、様々の方法で、例えば、クロマトグラフィーの使用（例えば、高温下における高解像度逆相クロマトグラフィー）；圧、ｐＨ、塩濃度、温度、または有機溶媒濃度の変化；あるいは、レセプターに対する既知のリガンドとの競合、あるいは、上記技術の任意の組み合わせによって実現することが可能である。
【０２１８】
「液体クロマトグラフィー」という用語は、溶媒に溶解する複数のイオンおよび／または分子を分離するために使用されるクロマトグラフィー分析法を指す。サンプル溶液が第２の固相または液相に接すると、様々な溶質が、吸着、イオン交換、分配、またはサイズの違いによって異なる程度でその他相と相互作用を持つ。この違いを用いて、カラムを通過する各溶質の移動時間を定めることによって、混合物成分をそれぞれ分離することが可能である。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、液体に溶解した化合物を分離するための液体クロマトグラフィーの１つの形である。ＨＰＬＣ装置は、展開相の貯留槽、ポンプ、注入器、分離カラム、および検出器から成る。化合物は、プラグ一杯のサンプル混合液をカラムに注入することによって分離される。混合物中の異なる複数の成分は、液体の展開相と固定相の間の分配態様の違いによって異なる速度でカラムを通過する。
【０２１９】
「競合的結合因子」という用語は、ある特定部位（例えば、酵素の触媒部位）においてレセプターに結合するリガンドであって、その際に、動的平衡様過程において、別のリガンドと結合を競合するリガンドを指す。
【０２２０】
「質量符号化」という用語は、化学的化合物のセット（例えば、関連化合物、初期化合物、それらの異種または任意の組み合わせ）の品質であって、化合物セットの個別化合物の少なくとも約９０％が、該セットの他の化学的化合物全ての分子量とは異なる分子量を持つ化合物セット品質を指す。
【０２２１】
「閾値結合特性」という用語は、リガンドの任意の定義された特性であって、そのリガンドが標的と会合する能力の客観的特定を可能とする特性である。例えば、閾値結合特性は、リガンドの特定のＫｄ、例えば、Ｋｄ＜５０μＭ，＜２０μＭ、＜１０μＭ、＜１μＭ、＜０．５μＭ、＜０．１μＭ、＜０．０１μＭ等と定義することができる。閾値結合特性は、他の既知のリガンドに対して、例えば、ユーザー選択の、または望みの標準化合物に対して定性的または定量的に定義することが可能である。あるいは別に、リガンドの閾値結合特性は、他の複数のリガンドに対して定性的に定義する、例えば、閾値結合特性は、混合物内の最強結合リガンドと定義することも可能であるし、例えば、閾値結合特性は、混合物中のリガンドの半分よりも緊密に結合するリガンドと定義することも可能であるし、混合物のリガンドの３／４よりも緊密に結合するリガンド、混合物中の既知のリガンドよりも緊密に結合するリガンドと定義することも可能である。リガンドのｋｏｆｆ、半減期ｔ１／２、またはその他の結合特性を分析することによって、同じタイプの定量的、相対的結合特性を用いることも可能である。
【０２２２】
熟練した技術者によって了解されるように、本発明に使用される化合物（例えば、構造的に関連する変異種）を合成する方法は当業者にとっては明白である。さらに、各種合成工程は、所望の化合物を得るのに、別配列または別順序で実行することも可能である。本明細書に記載される化合物を合成するのに有用な、合成化学変形および保護基方法論（保護および脱保護）は従来技術で既知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、および、その後続版に記載されるものを含む。さらに、化合物、および／または、化合物ライブラリーは、商業供給源から購入が可能である。さらに、化合物は、前駆化合物を購入し、その後追加合成操作を行って所望の化合物を得、それらを組み合わせて製造することが可能である。
【実施例】
【０２２３】
（実施例１：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＫｄの決定および小型分子ワルファリン）
０．１２５ｐｍｏｌ、０．２５ｐｍｏｌ、０．５ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、２ｐｍｏｌ、および、４ｐｍｏｌのワルファリンを含む６個の実験サンプルを分析し、ワルファリンについて質量分析信号を関連付ける較正曲線を確立する。較正の正確度を上げるために、０．１２５ｐｍｏｌサンプルについては２個のデータポイントを得る。
【０２２４】
既知のワルファリン濃度［Ｓ］０を含む７つの実験サンプルを連続希釈で調製する。特に、８０、４０、２０、１０、５、２．５、または１．０ｕＭの全体［ワルファリン］から成る２ｕＬサンプルでは、ワルファリンについての較正信号強度は二重に測定される。このサンプルのそれぞれに、その濃度が厳密にではないが名目上は既知である一定量のＨＳＡを加える。この場合、名目上０．２ｕＭの［ＨＳＡ］を用いた。これらのサンプル液を、レセプター−リガンド（ＨＳＡ−ワルファリン）複合体が平衡に達するのに十分な時間、ざっと３０分共にインキュベートする。
【０２２５】
次に、この、ＨＳＡ、未結合ワルファリン、およびＨＳＡ−ワルファリン複合体から成る溶液をサイズ排除クロマトグラフィー段階に通過させ、分子サイズに基づいて、ＨＳＡとＨＳＡ−ワルファリン複合体とを溶出流の先頭部分において共に溶出させて、未結合ワルファリンから分離する。
【０２２６】
ＨＳＡとＨＳＡ−ワルファリン複合体とを含むが、未結合ワルファリンを全く含まない溶出流部分は、脱塩および質量分析器への溶出のために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。逆相クロマトグラフィーは事実上ＨＳＡ−ワルファリン複合体を破壊する。分離後、ワルファリンは、その分子量、または質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定される。次に、ワルファリンは、その較正信号応答測定によって定量される。
【０２２７】
ＨＳＡに結合していないワルファリンは全てサイズ排除によってＨＳＡ−ワルファリン複合体から分離されるので、質量分析器に到達したワルファリン（すなわち、回収リガンド）は全て、ＨＳＡ−ワルファリン複合体由来のものである。従って、ワルファリンの較正信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したＨＳＡ−ワルファリンの量と相関する。
【０２２８】
［ＨＳＡ−ワルファリン］と［ワルファリン］のデータペアは下記の式：
【０２２９】
【数３４】
に適合する。これによって、数値による非直線回帰法によってパラメータＫｄと［ＨＳＡ］０について最良適合値が得られる。
【０２３０】
前述の実験の結果が図２３に示される。パラメータＫｄと［ＨＳＡ］０は、数値により非直線回帰法によって、それぞれ、４．９ｕＭおよび０．１４ｕＭと推定された。Ｋｄの値は文献の値と良く一致する。［ＨＳＡ］０の値は、名目上のタンパク濃度の〜７５％は活性を持つ、すなわち、実験においてリガンドに結合する能力を持つことを示す。
【０２３１】
（実施例２：ブタ・ムスカリン性レセプター（ｐＭ２Ｒ）のレセプター−リガンドシステム）
一定濃度（４．０μＭ）のブタ・ムスカリン性レセプター（ｐＭ２Ｒ）、定常濃度（１μＭ）のリガンドＳｉ混合物（下記の表１参照）、および、漸増する濃度を持つ（０、０．１、０．２２、０．４６、１．０、２．２、４．６、１０、２２、４６、および１００μＭ）別の、既知のリガンド［Ｓ１］０（アトロピン）を含む、７個からなる一連の実験サンプルを調製する。これらのサンプル液を、各サンプルにおいて反応を形成するレセプター−リガンド複合体が平衡に達するのに十分な時間、ざっと３０分共にインキュベートする。
【０２３２】
次に、ｐＭ２Ｒ、未結合リガンド、およびｐＭ２Ｒ−リガンド複合体から成るこの溶液をサイズ排除クロマトグラフィーに通過させ、分子サイズに基づいて、ｐＭ２ＲプラスｐＭ２Ｒ−リガンド複合体を溶出流の先頭部において共同溶出させて、未結合リガンドから分離する。次に、ｐＭ２ＲプラスｐＭ２Ｒ−リガンド複合体を含むが、未結合リガンドを全く含まない溶出流部分は、脱塩と質量分析器への溶出のために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。逆相クロマトグラフィーはレセプター−リガンド結合対を破壊・分離する。このようにして、逆相クロマトグラフィー後、リガンドは質量分析（ＭＳ）にかけられ、その分子量、または、質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定される。
【０２３３】
ｐＭ２Ｒに結合していないリガンドがあったとしてもそれらは全てサイズ排除によってｐＭ２Ｒ−リガンド複合体から分離される。従って、質量分析器に到達したリガンド（すなわち、回収リガンド）は全て、対応するｐＭ２Ｒ−リガンド複合体由来のものであり、各リガンドＳｉの質量分析信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したｐＭ２Ｒ−リガンドＲＬｉの量と相関する。
【０２３４】
一定濃度のリガンドとｐＭ２Ｒ濃度を持ち、添加される競合因子アトロピンの濃度を漸増させた場合の各実験サンプルのリガンド回収をプロットし、５０％抑制濃度点（ＡＣＥ５０値）を、混合物の各リガンドについて求める（図２４参照）。定量的化合物親和度は、ＡＣＥ５０値に基づいて決定される。ＡＣＥ５０値が高ければ高いほどＫｄは低い。
【０２３５】
Ｋｄの定量的確定のためには、ＡＣＥ５０値、ｐＭ２Ｒレセプター初期濃度［Ｅ］０、研究対象である混合物中の化合物の初期リガンド濃度［Ｓｉ］、および、競合因子アトロピンＫｄを、式（Ｉ）の解である図６に示す式に代入する。結果は図２５に示される。
【０２３６】
（表１：ＮＧＤ構造の表）
【０２３７】
【表１−１】
【０２３８】
【表１−２】
（実施例３：セリンキナーゼＺａｐ−７０、ＮＧＤ−６３８０およびスタウロスポリンのレセプター−リガンドシステム）
９μＭ Ｚａｐ−７０および１μＭ ＮＧＤ−６３８０の混合物を調製し、室温で３０分、すなわち、混合物において結合および未結合成分が平衡に達するのに十分な時間インキュベートする。Ｚａｐ−７０およびＮＧＤ−６３８０から成るこの混合液に、１００μＭのスタウロスポリンおよび１μＭのＮＧＤ−６３８０を含む混合液を加える（インヒビターの添加によってリガンド濃度を不変に保つ）。表２は、スタウロスポリンとＮＧＤ−６３８０の構造を示す。
【０２３９】
ＮＧＤ−６３８０の解離の時間的変化を、２０、３０、４０、６０、７０、８０、および１００分間隔で測定する。ＮＧＤ−６３８０の解離は下記のようにして測定する。Ｚａｐ−７０、未結合ＮＧＤ−６３８０、およびＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体から成る溶液の分液を、サイズ排除クロマトグラフィーに通過させて分子サイズに基づいて、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体を溶出流の先頭部において共同溶出させて、未結合のＮＧＤ−６３８０から分離する。次に、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体を含むが、未結合ＮＧＤ−６３８０を全く含まない溶出流部分は、脱塩とレセプター−リガンド結合対の分離のために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。このようにして、逆相クロマトグラフィー後、ＮＧＤ−６３８０は質量分析（ＭＳ）にかけられ、その際信号応答が記録される。
【０２４０】
Ｚａｐ−７０に結合していないＮＧＤ−６３８０があったとしてもそれは全てサイズ排除工程によってＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体から分離される。従って、質量分析器に到達したＮＧＤ−６３８０（すなわち、回収リガンド）は全て、対応するＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体由来のものであり、ＮＧＤ−６３８０の質量分析信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０の量と相関する。従って、Ｚａｐ−７０のＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０複合体からの解離は、ＮＧＤ−６３８０の信号応答の時間的減少から見て取られる。
【０２４１】
ＮＧＤ−６３８０の信号応答の減少を時間の関数としてプロットし、この実験データを、プログラムＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標）（Ｗｏｌｆｒａｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，４．１バージョン）を用いて、式（ＸＶＩＩＩ）：
【０２４２】
【数３５】
の分解指数関数にフィットさせる。解離速度ｋｓ２および半減期ｔ１／２の両方を示す結果が図２６に示される。
【０２４３】
（表２：スタウロスポリンおよびＮＧＤ−６３８０の構造の表）
【０２４４】
【表２】
（実施例４：セリンキナーゼＺａｐ−７０、ＮＧＤ−７４６およびスタウロスポリンのレセプター−リガンドシステム）
９μＭ Ｚａｐ−７０および１μＭ ＮＧＤ−７４６の混合物を調製し、室温で３０分、すなわち、混合物において結合および未結合成分が平衡に達するのに十分な時間インキュベートする。Ｚａｐ−７０およびＮＧＤ−７４６から成るこの混合液に、１００μＭのスタウロスポリンおよび１μＭのＮＧＤ−７４６を含む混合液を加える（インヒビターの添加によってリガンド濃度を不変に保つ）。表３は、スタウロスポリンとＮＧＤ−７４６の構造を示す。
【０２４５】
ＮＧＤ−７４６の解離の時間的変化を、２０、３０、４０、５０、６０、および９０分間隔で測定する。ＮＧＤ−７４６の信号応答の減少を時間の関数としてプロットし、この実験データを、プログラムＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標）を用いて、式８の分解指数関数にフィットさせる。
【０２４６】
［ＥＳ］＝［ＥＳ］０ｅ−ｋｓ２ｔ
式（ＸＶＩＩ）
解離速度ｋｓ２および半減期ｔ１／２を示す結果が図２６に示される。
【０２４７】
（表３：スタウロスポリンおよびＮＧＤ−７４６の表）
【０２４８】
【表３】
（実施例５：セリンキナーゼＺａｐ−７０，リガンド混合物、およびスタウロスポリンのレセプター−リガンドシステム）
９μＭ Ｚａｐ−７０および、表３に示すリガンドの１μＭ混合液を調製し、室温で３０分、すなわち、混合物において結合および未結合成分が平衡に達するのに十分な時間インキュベートする。Ｚａｐ−７０およびリガンドから成るこの混合液に、１００μＭのスタウロスポリンおよび１μＭのリガンドを含む混合液を加える（インヒビターの添加によってリガンド濃度を不変に保つ）。
【０２４９】
リガンドの解離の時間的変化を、実施例３の場合のように、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、および１２０分間隔で測定する。リガンドの信号応答の減少を時間の関数としてプロットし、この実験データを、プログラムＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ（登録商標）を用いて、式（ＸＶＩＩＩ）の分解指数関数にフィットさせる。
【０２５０】
［ＥＳｉ］＝［ＥＳｉ］０ｅ−ｋｓ２ｔ
式（ＸＶＩＩ）
半減期ｔ１／２を示す結果は図２７に示される。解離速度ｋｓ２は表４に示される。
【０２５１】
（表４：スタウロスポリンおよびＮＧＤ構造の表）
【０２５２】
【表４−１】
【０２５３】
【表４−２】
【０２５４】
【表４−３】
（実施例６：濃度漸増競合リガンドと、起源リガンドプラス構造変異種との間の競合による、混合物アフィニティー選択質量分析によるＫｄ評価）
ＺＡＰ−７０キナーゼ、高処理スクリーニング技術によって発見された、既知の、初発リガンドＮＧＤ−７４６、複数のＮＧＤ−７４６の構造変異種の質量符号化混合物から成るタンパク-リガンドモデルシステムについて下記の工程が実行される。
【０２５５】
１０μＭ名目濃度のレセプターＺＡＰ−７０、初発リガンドＮＧＤ−７４６を含む一定濃度（１μＭ）のリガンド混合液、および、漸増濃度（０、０．２２、０．４６、１、２．２、４．６、１０、２２、４６、１００μＭ）のＺａｐ−７０リガンドスタウロスポリンを含む実験サンプルを調製する。サンプルを、各サンプルの反応を形成するレセプター−リガンド複合体が平衡に達するのに十分な時間、ほぼ３０分であるが、インキュベートする。
【０２５６】
Ｚａｐ−７０、未結合リガンド、およびＺａｐ−７０−リガンド複合体から成る溶液を、サイズ排除クロマトグラフィーに通過させて分子サイズに基づいて、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−リガンド複合体を溶出流の先頭部において共同溶出させて、未結合リガンドから分離する。次に、Ｚａｐ−７０プラスＺａｐ−７０−リガンド複合体を含むが、未結合リガンドを全く含まない溶出流部分は、脱塩と、その後の質量分析器への溶出ために逆相クロマトグラフィー段階に振り向けられる。逆相クロマトグラフィーはレセプター−リガンド結合対を破壊・分離する。このようにして、逆相クロマトグラフィー後、リガンドは質量分析（ＭＳ）にかけられ、信号応答が決定され、リガンドは、分子量、または、質量分析-質量分析断片化パターンに基づいて特定される。
【０２５７】
ＺＡＰ−７０に結合していないリガンドがあったとしてもそれらは全てサイズ排除工程によってＺＡＰ−７０−リガンド複合体から分離される。従って、質量分析器に到達したリガンド（すなわち、回収リガンド）は全て、対応するＺＡＰ−７０−リガンド複合体由来のものであり、各リガンドの質量分析信号は、サイズ排除クロマトグラフィーの開始時に存在したＺＡＰ−７０−リガンド複合体の量と相関する。
【０２５８】
各実験サンプルにおける、各混合成分の正規化リガンド回収、および競合リガンドを図２８に示す。競合リガンドとしてスタウロスポリンを用い、各リガンドの反応を、該競合因子不在時のその値の半分に減少させるのに必要なスタウロスポリンの濃度、すなわち、そのリガンドのＡＣＥ５０を求めると、各リガンドのＡＣＥ５０値は、そのリガンドのＫｄと逆相関を持つ。図２８には、混合物中の各構造変異体について、ＡＣＥ５０値、および、各ＡＣＥ５０値から計算されるＫｄ値も示されている。これらのデータは、興味の結合特性を持つリガンドを特定するために、また、さらにそれに続く最適化混合物シリーズ（例えば、異種化合物から成る新しい混合物）を生成するために使用される。
【０２５９】
（実施例７：初発リガンドＮＧＤ−１４６、および、その誘導体ＮＧＤ−６０３７、６３６７、６３７１、６３８０、６３９０、６４２３、６４３２、６８６２の質量符号化混合物の合成）
２００ｍＬの氷酢酸に溶解した５−イオドイサチン１（１０ｇ、３６．３ｍｍｏｌ）およびマロン酸（７．５ｇ、７２ｍｍｏｌ）を一晩環流した。沈殿をろ過して集め、ＡｃＯＨとアセトンで洗浄した。次に、この固体を、ＥｔＯＨで１時間環流した。ろ過し、ＥｔＯＨおよびＥｔ２Ｏで洗浄したところ、生成物として６-イオド-２-オキソ-１，２-ジヒドロ-キノリン-４-カルボン酸２が８．８ｇ（７６％）得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１４．０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１２．１３（ｓ，１Ｈ），８．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７，１．８Ｈｚ），７．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．９３（ｓ，１Ｈ）。
【０２６０】
【化１】
６０ｍＬの脱気したＨ２Ｏに溶解した６-イオド-２-オキソ-１，２-ジヒドロ-キノリン-４-カルボン酸２（３．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）、３，４-（メチレンジオキシル）フェニルボロン酸（２．４９ｇ、１５ｍｍｏｌ）、Ｋ３ＰＯ４（８．４９ｇ、４０ｍｍｏｌ）、およびＰｄ（ＯＡｃ）２（１１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の混合液をアルゴン下に６０oＣで２時間加熱した。室温に冷却後、固形分をろ過で収集し、Ｈ２Ｏとアセトンで洗浄した。次に、これを、２０ｍＬの１Ｍ ＨＣｌで処理し、得られた緑黄色固体を再びろ過し、Ｈ２Ｏで洗浄した。Ｐ２Ｏ５上で減圧乾燥したところ、２．５３ｇ（８２％）の生成物３が緑黄色固体として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１４．０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１２．１１（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４０(ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ)，７．１８（ｓ，１Ｈ）、７．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），７．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．９１（ｓ，１Ｈ），６．０６（ｓ，２Ｈ）。
【０２６１】
【化２】
３０ｍＬのＮＭＰに溶解した酸３（２．０ｇ、１０．５７ｍｍｏｌ）、ペンタフルオロフェノール（２．９２ｇ、１５．８５ｍｍｏｌ）、およびＥＤＣ（３．０４ｇ、１５．８５ｍｍｏｌ）の混合液を室温で６時間攪拌した。ＮＭＰの助けを借りて沈殿をろ過し、溶液を６０ｍＬの氷水に注いだ。これによって生じた固体をろ過で収集し、氷水とＥｔＯＡｃで洗浄し、減圧乾燥したところエステル４（２．８０ｇ、９１％）が得られた。これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
【０２６２】
【化３】
０．５ｍＬのＤＭＦに溶解したエステル４（１２ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を、１ｍＬのＤＭＦに溶解したピロリジノピロリジン（７．７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）基礎レジン（５０ｍｇ）の混合液に加えた。この反応混合液を室温で１２時間攪拌し、イソシアネートレジン（９０ｍｇ）を加え、３時間攪拌を続けた。次に、この溶液をろ過によって収集し、減圧濃縮して生成物ＮＧＤ−７４６を得た。ＭＳｍ／ｚ４４６．２（Ｍ＋＋１）。
【０２６３】
【化４】
１０ｍＬのオキシフォスフォラスクロリドに溶解した６−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−４−カルボン酸３（１．０ｇ、３．２ｍｏｌ）を４時間環流し、室温に冷却した。溶液を濃縮して乾燥させ、黄褐色固体を得た。次に、この固体を２０ｍＬのメチレンジクロリドに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１．５０ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）と、２−（Ｓ）−ピロルジニルメチルピロリジン（０．５９ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）を０oＣでその溶液にゆっくりと加えた。この混合物を室温で１２時間攪拌した。回転蒸発による溶媒除去後、残渣を酢酸エチルに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および食塩水にて洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥して濃縮した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製したところ（６−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−クロロ−キノリン−４−イル）−（２−ピロリジン−１−イルメチル−ピロリジン−１−イル）−メタノン５（１．２０ｇ、８１％）が得られた。ＭＳｍ／ｚ４６４．２（Ｍ＋＋１）；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ８．０５（ｍ、１Ｈ）、７．９３（ｍ、１Ｈ），７．８５（ｂｒ ｓ、１Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｓ，１Ｈ），６．９２（ｍ，１Ｈ），６．０３（ｓ，１Ｈ），４．５８（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｍ，０．５Ｈ），３．７５（ｍ，０．５Ｈ），３．３８−３．１３（ｍ，２Ｈ），２．９４（ｍ，３Ｈ），２．３５−２．１５（ｍ，２Ｈ），２．０４（ｍ，３Ｈ），２．０１−１．８５（ｍ，４Ｈ），１．８３（ｍ，１Ｈ）。
【０２６４】
【化５】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）およびＮ−メチルベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６０７３が得られた。ＭＳｍ／ｚ５４９．３（Ｍ＋＋１）。
【０２６５】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および３′−フルオロベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３６７が得られた。ＭＳｍ／ｚ５５３．３（Ｍ＋＋１）。
【０２６６】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および４′−クロロベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３７１が得られた。ＭＳｍ／ｚ５６９．２（Ｍ＋＋１）。
【０２６７】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および４′−トリフルオロメチルベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３８０が得られた。ＭＳｍ／ｚ６０３．３（Ｍ＋＋１）。
【０２６８】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）および２−メチルフェネチルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６３９０が得られた。ＭＳｍ／ｚ５６３．２（Ｍ＋＋１）。
【０２６９】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）およびＮ−エチルベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６４２３が得られた。ＭＳｍ／ｚ５６３．２（Ｍ＋＋１）。
【０２７０】
０．３ｍＬのＮＭＰに溶解した２−クロロキノリン５（２０ｍｇ、０．０４２５ｍｇ）およびＮ−メチル−３‘，４’−ジクロロベンジルアミン（０．１２７５ｍｍｏｌ、３当量）を１２０oＣで１２時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を１ｍＬのＤＭＳＯ／ＣＨ３ＣＮ（３：１）に溶解し、調製的ＬＣで精製したところ、ＮＧＤ−６４３２が得られた。ＭＳｍ／ｚ６１７．２（Ｍ＋＋１）。
【０２７１】
２０ｍＬのオキシフォスフォラスクロリドに溶解した６−イオド−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−キノリン−４−カルボン酸２（５．９７ｇ、１８．９３ｍｍｏｌ）を１００oＣで４時間環流し、室温に冷却した。溶液を濃縮して乾燥させ、黄褐色固体を得た。次に、この固体を１００ｍＬのメチレンジクロリドに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（２０ｍｌ、１００ｍｍｏｌ）と、２−（Ｓ）−ピロルジニルメチルピロリジン（３．５ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）を０oＣでその溶液にゆっくりと加えた。この混合物を室温で一晩攪拌した。この混合液を室温で一晩攪拌した。混合液を二塩化メチレン（２００ｍｌ）で希釈し、水（２ｘ４０ｍｌ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および食塩水にて洗浄した。
【０２７２】
【化６】
有機相はＮａ２ＳＯ４上で乾燥して濃縮し、未精製の生成物６（６．５ｇ）を得た。ＬＣ−ＭＳによって、この化合物は次工程に十分なほど純粋となっていたので、全く精製することなく直接用いた。ＭＳｍ／ｚ４７０．０（Ｍ＋＋１）。
【０２７３】
【化７】
ＮＭＰ（２０ｍＬ）に溶解した２−クロロキノリン化合物６（３．１２ｇ、６．６４ｍｇ）およびｐ−トリフルオロベンジルアミン（５．８１ｇ、３３ｍｍｏｌ）を１２０oＣで３６時間加熱した。ＬＣ−ＭＳ分析によって反応は完了したことが示された。次に、この反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈した。有機相を水と食塩水で洗浄しＮａ２ＳＯ４上で乾燥した。濃縮によって未精製生成物が得られた。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｅｔ３Ｎ−ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ ２：９５：５）で精製したところ所望の生成物７（３．２ｇ）が得られた。ＭＳｍ／ｚ６０９．１（Ｍ＋＋１）。
【０２７４】
【化８】
ビス（ピナコラト）ジボロン（２７９ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ＫＯＡｃ（２９４、３．０ｍｍｏｌ）、およびＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）（２４．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を充填した２５ｍｌ丸底フラスコに、ＤＭＳＯ（６ｍｌ）に溶解した６−イオドキノリン７（６０７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、フラスコを真空とアルゴンに交互につなぐことによって徹底的にガス抜きした。次に、得られた混合物を８０oＣで一晩加熱し、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、セライトを通過させてろ過した。得られた生成物８を、濃縮後それ以上精製することなく次の工程に用いた。ＭＳｍ／ｚ６０９（Ｍ＋＋１）。
【０２７５】
【化９】
アルゴン下、ジオキサン（２．０ｍＬ）に溶解した６−ボロネート８（１５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２ｍｇ）、Ｃｓ２ＣＯ３（１７ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）、および３，４−エチレンジオキシイオドベンゼン（１５ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を充填したフラスコに加えた。この混合物を、フラスコを真空とアルゴンに交互につなぐことによって徹底的にガス抜きした。得られた混合物を７０oＣで加熱し一晩攪拌した。室温に冷却後ＥｔＯＡｃで希釈した。固体を、セライト通過ろ過によって除去し、若干のＥｔＯＡｃで洗浄した。有機相を濃縮して溶媒を除去した。得られた残渣を調製的ＬＣによって精製したところ生成物９（ＮＧＤ−６８６２）が得られた。ＭＳｍ／ｚ６１７（Ｍ＋＋１）。
【０２７６】
前記ＮＧＤ化合物の質量符号化混合物が、単に、ＮＧＤ−６０３７、６３６７、６３７１、６３８０、６３９０、６４２３、６４３２およびＮＧＤ−６８６２を、下記の実験において要求される様々な濃度において混合することによって調製された。同じ混合物は、当業者であれば、混合による合成、または従来技術で既知の別法を用いて直接製造することが可能である。
【０２７７】
（実施例８：サンプルループ経由のＳＥＣからＭＳへのサンプル転送）
ヒト血清アルブミンを複数のリガンドと混合し、得られた混合液を、レセプター−リガンド複合体が平衡に達するのに十分な時間緩衝溶媒中でインキュベートする。混合液が平衡に達したならば、混合液をサイズ排除カラムに注入する。レセプター−リガンド複合体がサイズ排除カラムから溶出するにつれ、それら複合体はＵＶ検出器によって検出される。検出と同時に、コンピュータによって駆動されるコントローラーは、２−位置６−ポート選択バルブに接続されるサンプルループがレセプター−リガンド混合液の代表サンプルによって満たされるのに十分な時間に較正されるタイマーをスタートさせる。サンプルループがレセプター-リガンド複合体で満たされたならば、コントローラーは、選択バルブのサンプルループの、レセプターリガンド複合体を負荷するための位置を、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＬＣ）装置の方に振り向ける。ＲＰ−ＬＣ通過中、レセプター−リガンド複合体は破壊され、レセプターをリガンドから解離する。ＲＰ−ＬＣから溶出されると同時に、解離リガンドは質量分析器に転送されそこで特定される。
【０２７８】
本明細書で引用された参照文献は全て、それが印刷、電子、コンピュータの読み取り可能な保存媒体、またはその他のいずれの形式であるとを問わず、要約、論文、雑誌、公刊物、教科書、学位論文、インターネットウェブサイト、データベース、特許、および特許公報を含め、参照することによりその全体を本明細書に含めることを明言する。
【０２７９】
以上、本発明のいくつかの実施態様が説明された。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく各種改変を実行することが可能であることが理解されよう。従って、その他の実施態様も下記の特許請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】図１は、様々なＫｄにおける、レセプター-リガンド複合体ＥＳのリガンド回収対リガンド初期濃度［Ｓ］０の理論的プロットを表すグラフである。
【図２】図２は、様々な活性レセプター初期濃度［Ｅ］０における、レセプター-リガンド複合体ＥＳのリガンド回収対リガンド初期濃度［Ｓ］０の理論的プロットを表すグラフである。
【図３】図３は、１０％ランダム誤差を含む理論的データにおける、レセプター-リガンド複合体のリガンド回収データ［ＥＳ］対リガンド濃度［Ｓ］０の数学的適合である。
【図４】図４は、単一化合物Ｓ２および添加競合因子Ｓ１間の競合における、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉ対競合リガンド初期濃度［Ｓ１］０の理論的プロットを示す。
【図５】図５Ａは、レセプター過剰条件下における、異なるＫｄを持つ３種のリガンドの混合物に関するＡＣＥ５０シミュレーション実験を示す。実線は、全体１μＭ濃度における任意のリガンドの回収をしめす。破線は、０．３３または３．０μＭにおける回収を示す。図５Ｂは、図５Ａに示したものと同様のＡＣＥ５０シミュレーションを示す。ただし、この実験では、レセプター濃度は、全体リガンド濃度（１５μＭ）に対して制限的である（２μＭ）。
【図６】図６は、式（Ｉ）に対する解を示す。
【図７】図７は、３化合物混合物における、レセプター-リガンド複合体、対、競合リガンド初期濃度［Ｓ１］０の理論的プロットを示す。
【図８】図８は、３成分混合物について、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉ、対、競合リガンド初期濃度［Ｓ１］０の理論的正規化プロットを示す。
【図９】図９は、アロステリック競合性滴定剤およびリガンドの信号応答（ＡＳ−ＭＳ実験から得られたもの）シミュレーションであり、滴定剤濃度を増加した場合の、滴定剤とリガンドの濃度比を示す。
【図１０】図１０は、Ａｋｔ−１−ＮＧＤ−２８８３５およびＡｋｔ−１−スタウロスポリン複合体の、ＡＳ−ＭＳ測定濃度、および、滴定剤濃度を増加させた場合の、両者の濃度比を示す。漸近線に境界される比プロットはアロステリック結合であることを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、スタウロスポリンと、質量符号化結合ライブラリーのスクリーニングによって発見されたリガンドの混合物との間の、ＡＣＥ５０実験で得られたＡＳ−ＭＳ測定による滴定剤とリガンド反応の関係を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アロステリック競合を示す、（Ｃ）のデータに基づく滴定剤-リガンド回収比を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃ−Ｄは、それぞれ、Ｍ−１および（Ａ）と（Ｂ）のリガンド混合物の間のＡＣＥ５０実験で得られた、ＡＳ−ＭＳ測定によるタンパク-リガンド複合体濃度と比のプロットを示す。プールメンバーとＭ−１の間には、スタウロスポリンにおける結果とは対照的に、オルソステリック結合競合が観察される。
【図１１Ｄ】図１１Ｃ−Ｄは、それぞれ、Ｍ−１および（Ａ）と（Ｂ）のリガンド混合物の間のＡＣＥ５０実験で得られた、ＡＳ−ＭＳ測定によるタンパク-リガンド複合体濃度と比のプロットを示す。プールメンバーとＭ−１の間には、スタウロスポリンにおける結果とは対照的に、オルソステリック結合競合が観察される。
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１２Ｃ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１２Ｄ】図１２Ａ−Ｄは、ＡＴＰ濃度を増した場合の、スタウロスポリンとＭ−１によるＡｋｔ−１生化学活性の抑制を示すグラフである。１２Ａと１２Ｂは、スタウロスポリンの結果を示し、スタウロスポリンとＡＴＰの間に競合的結合のあることを示す。１２Ｃと１２Ｄは、Ｍ−１の結果であって、Ｍ−１とＡＴＰの間には、混合型の、非競合的結合のあることを示す。注記：スタウロスポリンはナノモル濃度軸に対してプロットされ、Ｍ−１は、マイクロモル軸に対してプロットされている。
【図１３】図１３Ａ−Ｂは、ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ２に対する対アトロピン結合競合において、リガンドプールの親和度ランキング、および競合モードの決定を示すグラフである。１３Ａは、ＡＣＥ５０実験結果のログプロットであり、ＮＧＤ−３３５０が、同種化合物ＮＧＤ−３３４８およびＮＧＤ−３３４６や、他のプール成分よりも高い親和度を持つことを示す。１３Ｂは、滴定剤-リガンド反応比の直線性プロットであり、アトロピンとプール成分の間にはオルソステリック競合のあることを示す。
【図１４】図１４は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩと共に、会合速度ｋｉ１をゼロから０．１μＭ−１秒−１（０−＞１０５Ｍ−１秒−１）まで変えながら添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表す数学的モデルである。理論的分解曲線［ＥＳ］０ｅ−ｋｓ２ｔを（Ｅ）に示す。
【図１５】図１５は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩと共に、会合速度ｋｉ１をゼロから０．１μＭ−１秒−１（０−＞１０５Ｍ−１秒−１）まで変えながら添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表すログプロット数学的モデルである。理論的分解曲線［ＥＳ］０ｋｓ２ｔ（勾配＝ｋｓ２）を（Ｅ）に示す。
【図１６】図１６は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩと共に添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表す数学的モデルである。ｋｓ２は１から０．００１秒−１まで変動する。理論的分解曲線［ＥＳ］０ｋｓ２ｔ（勾配＝ｋｓ２）を（Ｅ）に示す。
【図１７】図１７は、ゼロ時点において、Ｅ＋Ｓ平衡液の１：１希釈液を、高濃度のインヒビターＩ、ｉｎｈ（Ｉ）と共に添加した場合の［ＥＳ］に及ぼす作用を表す数学的モデルである。モデルとしたｋｓ２＝０．０１秒−１（Ａ）。ｋｓ２＝０．０１±０．００１秒−１の場合の理論的分解曲線（Ｅ）。
【図１８】図１８は、レセプター過剰からレセプター制限状態下で、レセプター濃度［Ｅ］０の関数として表した、Ｅ＋Ｓｉ＋Ｓｖの平衡液におけるレセプター-リガンド複合体［ＥＳｉ］および［ＥＳｖ］の、アフィニティー選択質量分析反応および比のシミュレーションを示す。
【図１９】図１９は、レセプター-リガンド複合体のリガンドの辿る経路を示すフローダイアグラムである。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｂは、２つの異なる位置、２０Ａおよび２０Ｂにある複数ポートバルブを示す。
【図２１】図２１は、４回の連続サンプル注入に対する波長２３０ｎｍにおけるＵＶデータを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｃ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｄ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｅ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２２Ｆ】図２２Ａ−２２Ｆは、複数ポートバルブのピークカット遅延時間変更の作用を示す。
【図２３】図２３は、ヒト血清アルブミン＋ワルファリンにおいて、レセプター-リガンド複合体［ＥＳ］リガンド回収データ、対、リガンド初期濃度［Ｓ］０の関係を表す数学的適合線である。
【図２４】図２４は、５成分混合物対ブタ・ムスカリン性レセプターにおける、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉの正規化数値、対、競合リガンド（アトロピン）初期濃度［Ｓ１］０のプロット、およびそれから得られたＡＣＥ５０値を示す。
【図２５】図２５は、５成分混合物から選ばれた２個のリガンドにおける、レセプター-リガンド複合体ＥＳｉの正規化数値、対、競合リガンド（アトロピン）初期濃度［Ｓ１］０のプロット、およびそれらリガンドのＫｄ値を示す。
【図２６】図２６は、Ｚａｐ−７０の複合体、すなわち、Ｚａｐ−７０−ＮＧＤ−７４６およびＺａｐ−７０−ＮＧＤ−６３８０のｋ２と半減期を与えるグラフによる解法を示す。
【図２７】図２７は、Ｚａｐ−７０のリガンド混合物との複合体のｋ２と半減期を与えるグラフによる解法を示す。
【図２８】図２８は、最適化ライブラリーから得られたレセプター-リガンド複合体のアフィニティー選択質量分析反応の正規化数値、対、競合リガンド全体のプロットを示す。スタウロスポリン濃度、および誘導ＡＣＥ５０およびＫｄ値も掲げる。スタウロスポリンＫｄ＝１００ｎＭ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レセプターＥ、リガンドＳｉ、および、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉを含む複数の混合物においてリガンドに対するレセプターの結合親和性を分析する方法であって、該方法は、
（ａ）複数の混合物を提供する工程であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０、リガンド［Ｓｉ］０、および滴定剤Ｔを含み、ＴのＳと置き換わる相対的活性が定量され得るようにＥ、Ｓｉ、Ｔのうちの１つ以上の濃度が選択される、工程；
（ｂ）該複数の混合物のそれぞれが平衡に到達することを可能にする工程；
（ｃ）該複数の混合物のそれぞれについて、未結合リガンドＳｉから、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉを分離する工程；
（ｄ）該複数の混合物のそれぞれにおいて、分析装置からの、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を測定する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）に由来するレセプター−リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を評価して、リガンドＳｉのレセプターＥに対する結合親和性を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの濃度が、ＳｉのＴと置き換わる相対的活性の比較を可能にするように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、複数の混合物を提供する工程を包含し、各混合物は、レセプターの初期濃度［Ｅ］０、リガンドの初期濃度［Ｓｉ］０、および既知濃度の滴定剤を含み、該複数の混合物のそれぞれにわたって、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０は一定であり、該［Ｓｉ］０は、該複数の混合物それぞれにおいてほぼ同じであり、該滴定剤の濃度は、該複数の混合物において変動される、方法。
【請求項４】
前記複数の混合物はそれぞれ、複数のリガンドＳｉ、および複数のレセプター−リガンド結合対ＥＳｉを含み、前記信号応答は、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉのうちの少なくとも２つについて測定され、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉの相対的結合性が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のリガンドＳｉのうちの少なくとも約９０％は、一意的な分子量を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの濃度が、第１リガンドＳ１の結合親和性が、第２リガンドＳ２の結合親和性と比較されて、Ｅに対するＳ１とＥに対するＳ２との相対的結合親和性の測定を提供するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結合親和性は、相対的結合平衡定数Ｋｄｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｅ）は、ＡＣＥ５０を算出することを包含し、該ＡＣＥ５０は、滴定剤濃度が０のときにレセプター−リガンド対の信号応答がその値の５０％に到達する滴定剤濃度である、方法。
【請求項９】
複数のリガンドの相対的Ｋｄは、最低のＡＣＥ５０値を有するリガンドが、リガンド混合物のうちで最高のＫｄを有し、かつ最高のＡＣＥ５０値を有するリガンドが、リガンド混合物のうちで最低のＫｄを有するように決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｅ）は、以下の式（Ｉ）の等式：
【数１】
または式（Ｉ）に由来する等式に対する前記滴定剤の関数として、前記複数の混合物のそれぞれにおける前記レセプター−リガンド結合対の濃度［ＥＳｉ］の変化をフィッティングすることによって、該複数の混合物における該レセプター−リガンド結合対ＥＳｉのＫｄｉを算出することを包含する、方法。
【請求項１１】
前記複数のリガンドＳｉの相対的Ｋｄｉが決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レセプターの初期濃度［Ｅ］０は既知であり、前記リガンドの初期濃度［Ｓｉ］０は既知である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記レセプターの濃度［Ｅ］０は、前記リガンドの濃度［Ｓｉ］０の合計よりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記レセプターＥに結合するリガンドＳｉが、競合的な様式、アロステリックな様式、または非競合的な様式で結合するのかどうかを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
レセプター−リガンド対ＥＳｉが、前記複数の混合物のそれぞれにおいて比較的一定の信号応答を維持している場合、前記リガンドＳｉは、レセプターＥに対して非競合的な様式で結合していること、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記レセプター−滴定剤対の応答に対するレセプター−リガンド対ＥＳｉの信号応答 対 前記複数の混合物についての前記滴定剤の濃度の比の変化を測定する工程を包含し、ここで、該複数の混合物のそれぞれについての該比が該滴定剤濃度と直線関係を有する場合、前記リガンドＳｉは前記レセプターに対して競合的な様式で結合し、そして該複数の混合物のそれぞれについての該比が直線関係でない場合、該リガンドＳｉは前記レセプターに対してアロステリックな様式で結合する、方法。
【請求項１７】
前記レセプターは生体分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記レセプターはポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記レセプターは酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記レセプターは核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記リガンドは有機分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンドはポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の混合物は、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉ、結合していないレセプター、および結合していないリガンドの平衡に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
液体クロマトグラフィーを使用する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記レセプターが結合したリガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記複数の混合物のそれぞれから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記レセプターが結合したリガンドは、限外ろ過を使用して前記複数の混合物のそれぞれから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記信号応答は質量分析法を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記レセプター−リガンド結合対ＥＳｉを分断する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記レセプター−リガンド結合対ＥＳｉの信号応答は、前記複数の混合物のそれぞれにおいて、該レセプター−リガンド結合対ＥＳｉにおけるリガンドＳｉの相対量を測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記リガンドＳｉの相対量は、質量分析器からの信号応答を評価することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
レセプター−リガンド結合対の平衡解離定数Ｋｄを決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）レセプター−リガンド結合対のリガンドに対して較正された質量分析器を提供する工程；
（ｂ）複数の混合物を提供する工程であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０およびリガンド［Ｓ］０を含み、１つ以上のＥ０およびＳ０の濃度は、Ｅに対するＳの結合親和性が決定され得るように選択される、工程；
（ｃ）該複数の混合物のそれぞれを、結合したレセプター−リガンド結合対ＥＳ、結合していないレセプター、および結合していないリガンドの平衡に達することを可能にする工程；
（ｄ）該複数の混合物のそれぞれから該レセプターに結合したリガンドを分離する工程；
（ｅ）該複数の混合物のそれぞれにおけるレセプター−リガンド結合対について、質量分析器からの信号応答を測定する工程；ならびに
（ｆ）工程ａ〜ｅにおける既知の情報、測定した情報、または取得した情報を使用して、該複数の混合物それぞれについて、レセプター−リガンド対の濃度［ＥＳ］および初期の既知のリガンド濃度［Ｓ］０を、式（Ｉ）の等式：
【数２】
にフィッティングして、該レセプター−リガンド結合対のＫｄを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記複数の混合物のそれぞれは、レセプターの初期濃度［Ｅ］０、および、リガンドの既知の初期濃度［Ｓ］０を含み、［Ｅ］０は、該複数の混合物のそれぞれにおいて同じであり、［Ｓ］０は該複数の混合物のそれぞれにおいて変化される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ｂ）の混合物における前記レセプター初期濃度［Ｅ］０を測定する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記レセプターは生体分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記レセプターはポリペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記レセプターは酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記レセプターは核酸である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記リガンドは有機分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記リガンドはポリペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の混合物は、レセプター−リガンド結合対、結合していないレセプター、および結合していないリガンドの平衡に達する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記レセプターが結合したリガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して混合物から分離される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
液体クロマトグラフィーを使用する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記レセプター−リガンド結合対ＥＳを分断する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記レセプター−リガンド結合対の濃度［ＥＳ］は、前記複数の混合物それぞれにおいて、該レセプター−リガンド結合対ＥＳにおけるリガンドの量を測定することによって、工程（ｅ）で決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
レセプター−リガンド結合対の結合速度論を分析する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）レセプター［Ｅ］０、およびリガンド［Ｓｉ］０を含む混合物を提供する工程；
（ｂ）該混合物を、レセプター［Ｅ］、リガンド［Ｓｉ］、およびレセプター−リガンド結合対［ＥＳｉ］の平衡に達することを可能にする工程；
（ｃ）該混合物を、過剰な競合的インヒビターＩで処理する工程；
（ｄ）複数の時点において該レセプター−リガンド結合対の減少を、以下：
（ｉ）該結合していないリガンドから該レセプターリガンド結合対を分離すること；および
（ｉｉ）該複数の時点のそれぞれに対して、該レセプター−リガンド結合対の信号応答を分析装置を用いて測定すること
によって測定する工程；ならびに
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）からの既知の情報、測定した情報、または取得した情報を使用して、該レセプター−リガンド結合対の結合速度論を評価する工程
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記レセプター−リガンド結合対の信号応答は、分析装置を用いて測定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記工程（ａ）の混合物は、複数のリガンドＳｉを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数のリガンドＳｉのうちの少なくとも９０％は一意的な分子量を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記結合速度論は、工程（ａ）〜（ｄ）からの既知の情報、測定した情報、または取得した情報を使用して、前記レセプター−リガンド結合対の信号応答の経時的変化を式（ＸＶＩＩＩ）の等式：
【数３】
またはその導関数に対してフィッティングすることによって、該レセプター−リガンド結合対の解離速度ｋｓ２を算出して評価される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４５に記載の方法であって、非競合的な様式で結合するリガンドを同定する工程を包含し、リガンド−レセプター結合対が、前記複数時点のそれぞれにおいて比較的一定の濃度を維持する場合、該リガンドは前記レセプターに対して非競合的に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記複数のリガンドＳｉのうちの少なくとも２つの結合速度論が比較される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記レセプターは生体分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記レセプターはポリペプチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記レセプターは酵素である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記レセプターは核酸である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記リガンドは有機分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
前記リガンドはポリペプチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記競合的インヒビターは有機分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記競合的インヒビターはポリペプチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記レセプターが結合した結合リガンドを液体クロマトグラフィーに供する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記レセプターが結合したリガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して結合してないリガンドから分離される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記信号応答は、質量分析法を使用して決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記レセプター−リガンド結合対を分断する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
前記レセプター−リガンド結合対の信号応答は、該レセプター−リガンド結合対におけるリガンドの相対量を測定することによって決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
前記レセプター−リガンド結合対の半減期ｔ１／２を決定する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項１】
レセプターＥ、リガンドＳｉ、および、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉを含む複数の混合物においてリガンドに対するレセプターの結合親和性を分析する方法であって、該方法は、
（ａ）複数の混合物を提供する工程であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０、リガンド［Ｓｉ］０、および滴定剤Ｔを含み、ＴのＳと置き換わる相対的活性が定量され得るようにＥ、Ｓｉ、Ｔのうちの１つ以上の濃度が選択される、工程；
（ｂ）該複数の混合物のそれぞれが平衡に到達することを可能にする工程；
（ｃ）該複数の混合物のそれぞれについて、未結合リガンドＳｉから、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉを分離する工程；
（ｄ）該複数の混合物のそれぞれにおいて、分析装置からの、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を測定する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）に由来するレセプター−リガンド結合対ＥＳｉの信号応答を評価して、リガンドＳｉのレセプターＥに対する結合親和性を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの濃度が、ＳｉのＴと置き換わる相対的活性の比較を可能にするように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、複数の混合物を提供する工程を包含し、各混合物は、レセプターの初期濃度［Ｅ］０、リガンドの初期濃度［Ｓｉ］０、および既知濃度の滴定剤を含み、該複数の混合物のそれぞれにわたって、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０は一定であり、該［Ｓｉ］０は、該複数の混合物それぞれにおいてほぼ同じであり、該滴定剤の濃度は、該複数の混合物において変動される、方法。
【請求項４】
前記複数の混合物はそれぞれ、複数のリガンドＳｉ、および複数のレセプター−リガンド結合対ＥＳｉを含み、前記信号応答は、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉのうちの少なくとも２つについて測定され、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉの相対的結合性が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のリガンドＳｉのうちの少なくとも約９０％は、一意的な分子量を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各混合物は、［Ｅ］０および［Ｓｉ］０に対するＴの濃度が、第１リガンドＳ１の結合親和性が、第２リガンドＳ２の結合親和性と比較されて、Ｅに対するＳ１とＥに対するＳ２との相対的結合親和性の測定を提供するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記結合親和性は、相対的結合平衡定数Ｋｄｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｅ）は、ＡＣＥ５０を算出することを包含し、該ＡＣＥ５０は、滴定剤濃度が０のときにレセプター−リガンド対の信号応答がその値の５０％に到達する滴定剤濃度である、方法。
【請求項９】
複数のリガンドの相対的Ｋｄは、最低のＡＣＥ５０値を有するリガンドが、リガンド混合物のうちで最高のＫｄを有し、かつ最高のＡＣＥ５０値を有するリガンドが、リガンド混合物のうちで最低のＫｄを有するように決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｅ）は、以下の式（Ｉ）の等式：
【数１】
または式（Ｉ）に由来する等式に対する前記滴定剤の関数として、前記複数の混合物のそれぞれにおける前記レセプター−リガンド結合対の濃度［ＥＳｉ］の変化をフィッティングすることによって、該複数の混合物における該レセプター−リガンド結合対ＥＳｉのＫｄｉを算出することを包含する、方法。
【請求項１１】
前記複数のリガンドＳｉの相対的Ｋｄｉが決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記レセプターの初期濃度［Ｅ］０は既知であり、前記リガンドの初期濃度［Ｓｉ］０は既知である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記レセプターの濃度［Ｅ］０は、前記リガンドの濃度［Ｓｉ］０の合計よりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記レセプターＥに結合するリガンドＳｉが、競合的な様式、アロステリックな様式、または非競合的な様式で結合するのかどうかを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
レセプター−リガンド対ＥＳｉが、前記複数の混合物のそれぞれにおいて比較的一定の信号応答を維持している場合、前記リガンドＳｉは、レセプターＥに対して非競合的な様式で結合していること、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記レセプター−滴定剤対の応答に対するレセプター−リガンド対ＥＳｉの信号応答 対 前記複数の混合物についての前記滴定剤の濃度の比の変化を測定する工程を包含し、ここで、該複数の混合物のそれぞれについての該比が該滴定剤濃度と直線関係を有する場合、前記リガンドＳｉは前記レセプターに対して競合的な様式で結合し、そして該複数の混合物のそれぞれについての該比が直線関係でない場合、該リガンドＳｉは前記レセプターに対してアロステリックな様式で結合する、方法。
【請求項１７】
前記レセプターは生体分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記レセプターはポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記レセプターは酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記レセプターは核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記リガンドは有機分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンドはポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の混合物は、レセプター−リガンド結合対ＥＳｉ、結合していないレセプター、および結合していないリガンドの平衡に達する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
液体クロマトグラフィーを使用する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記レセプターが結合したリガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して前記複数の混合物のそれぞれから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記レセプターが結合したリガンドは、限外ろ過を使用して前記複数の混合物のそれぞれから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記信号応答は質量分析法を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記レセプター−リガンド結合対ＥＳｉを分断する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記レセプター−リガンド結合対ＥＳｉの信号応答は、前記複数の混合物のそれぞれにおいて、該レセプター−リガンド結合対ＥＳｉにおけるリガンドＳｉの相対量を測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記リガンドＳｉの相対量は、質量分析器からの信号応答を評価することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
レセプター−リガンド結合対の平衡解離定数Ｋｄを決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）レセプター−リガンド結合対のリガンドに対して較正された質量分析器を提供する工程；
（ｂ）複数の混合物を提供する工程であって、各混合物は、レセプター［Ｅ］０およびリガンド［Ｓ］０を含み、１つ以上のＥ０およびＳ０の濃度は、Ｅに対するＳの結合親和性が決定され得るように選択される、工程；
（ｃ）該複数の混合物のそれぞれを、結合したレセプター−リガンド結合対ＥＳ、結合していないレセプター、および結合していないリガンドの平衡に達することを可能にする工程；
（ｄ）該複数の混合物のそれぞれから該レセプターに結合したリガンドを分離する工程；
（ｅ）該複数の混合物のそれぞれにおけるレセプター−リガンド結合対について、質量分析器からの信号応答を測定する工程；ならびに
（ｆ）工程ａ〜ｅにおける既知の情報、測定した情報、または取得した情報を使用して、該複数の混合物それぞれについて、レセプター−リガンド対の濃度［ＥＳ］および初期の既知のリガンド濃度［Ｓ］０を、式（Ｉ）の等式：
【数２】
にフィッティングして、該レセプター−リガンド結合対のＫｄを得る工程
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記複数の混合物のそれぞれは、レセプターの初期濃度［Ｅ］０、および、リガンドの既知の初期濃度［Ｓ］０を含み、［Ｅ］０は、該複数の混合物のそれぞれにおいて同じであり、［Ｓ］０は該複数の混合物のそれぞれにおいて変化される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記工程（ｂ）の混合物における前記レセプター初期濃度［Ｅ］０を測定する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記レセプターは生体分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記レセプターはポリペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記レセプターは酵素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記レセプターは核酸である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記リガンドは有機分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記リガンドはポリペプチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の混合物は、レセプター−リガンド結合対、結合していないレセプター、および結合していないリガンドの平衡に達する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記レセプターが結合したリガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して混合物から分離される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
液体クロマトグラフィーを使用する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記レセプター−リガンド結合対ＥＳを分断する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記レセプター−リガンド結合対の濃度［ＥＳ］は、前記複数の混合物それぞれにおいて、該レセプター−リガンド結合対ＥＳにおけるリガンドの量を測定することによって、工程（ｅ）で決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
レセプター−リガンド結合対の結合速度論を分析する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）レセプター［Ｅ］０、およびリガンド［Ｓｉ］０を含む混合物を提供する工程；
（ｂ）該混合物を、レセプター［Ｅ］、リガンド［Ｓｉ］、およびレセプター−リガンド結合対［ＥＳｉ］の平衡に達することを可能にする工程；
（ｃ）該混合物を、過剰な競合的インヒビターＩで処理する工程；
（ｄ）複数の時点において該レセプター−リガンド結合対の減少を、以下：
（ｉ）該結合していないリガンドから該レセプターリガンド結合対を分離すること；および
（ｉｉ）該複数の時点のそれぞれに対して、該レセプター−リガンド結合対の信号応答を分析装置を用いて測定すること
によって測定する工程；ならびに
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）からの既知の情報、測定した情報、または取得した情報を使用して、該レセプター−リガンド結合対の結合速度論を評価する工程
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記レセプター−リガンド結合対の信号応答は、分析装置を用いて測定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記工程（ａ）の混合物は、複数のリガンドＳｉを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数のリガンドＳｉのうちの少なくとも９０％は一意的な分子量を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記結合速度論は、工程（ａ）〜（ｄ）からの既知の情報、測定した情報、または取得した情報を使用して、前記レセプター−リガンド結合対の信号応答の経時的変化を式（ＸＶＩＩＩ）の等式：
【数３】
またはその導関数に対してフィッティングすることによって、該レセプター−リガンド結合対の解離速度ｋｓ２を算出して評価される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
請求項４５に記載の方法であって、非競合的な様式で結合するリガンドを同定する工程を包含し、リガンド−レセプター結合対が、前記複数時点のそれぞれにおいて比較的一定の濃度を維持する場合、該リガンドは前記レセプターに対して非競合的に結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記複数のリガンドＳｉのうちの少なくとも２つの結合速度論が比較される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記レセプターは生体分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記レセプターはポリペプチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記レセプターは酵素である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記レセプターは核酸である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記リガンドは有機分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
前記リガンドはポリペプチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記競合的インヒビターは有機分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記競合的インヒビターはポリペプチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記レセプターが結合した結合リガンドを液体クロマトグラフィーに供する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記レセプターが結合したリガンドは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して結合してないリガンドから分離される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記信号応答は、質量分析法を使用して決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記レセプター−リガンド結合対を分断する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
前記レセプター−リガンド結合対の信号応答は、該レセプター−リガンド結合対におけるリガンドの相対量を測定することによって決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
前記レセプター−リガンド結合対の半減期ｔ１／２を決定する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２２Ｅ】
【図２２Ｆ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２２Ｄ】
【図２２Ｅ】
【図２２Ｆ】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【公表番号】特表２００６−５１９９９８（Ｐ２００６−５１９９９８Ａ）
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７０５８（Ｐ２００６−５０７０５８）
【出願日】平成１６年３月１０日（２００４．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７３６４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１５３１
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１０日（２００４．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７３６４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１５３１
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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