リステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するための生化学的試験
本発明は、少なくとも１つのホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含むことを特徴とする、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための生化学的試験に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア属、より詳細にはリステリア・モノサイトゲネス種の病原性細菌の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネスの単離と同定は、食品加工衛生および医学細菌学を監視するうえでの主要な問題である。リステリア属の細菌の中で、リステリア・モノサイトゲネス種だけがヒトに対して病原性であることが知られている。リステリア・モノサイトゲネスは、免疫を抑制している個人、小児または妊婦において、時として致死的なリステリア症を引き起こし得る（症例の２５〜３０％）。リステリア属のその他の種は、病原性ではないか、または動物に対してのみ病原性である。これは特にリステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）に当てはまる。
【０００３】
ほとんどの先進国では、過去数十年間にヒトのリステリア症の危険度は後退しているが、現代社会はますます高い安全性を要求しており、散発性症例は受け入れ得るが伝染病は容認しない。
【０００４】
それゆえ、ヒトにおいて細菌の状態を診断する状況では、リステリア・モノサイトゲネスを、病原性ではないリステリア属のその他の種から明確に区別することが重要である。
【０００５】
リステリア属は現在６つの種を含み、そのうちリステリア・モノサイトゲネスだけがヒトに対して病原性である。
【０００６】
微生物は、食品起源の汚染後、ヒトにおいて重大な伝染病の原因となる。リステリア属の２つの種が主として食品（基本的に乳および乳製品）において単離されており、これらの種は非病原性リステリア・イノキュアおよび病原性リステリア・モノサイトゲネスである。
【０００７】
これら２つの種は共通の生化学的特徴を有しているため、それらを識別することは困難である。たとえば、β溶血試験は、細菌による赤血球の溶解を引き起こす物質（リステリオリシン）の産生に関連するβ溶血活性を測定することに基づく。この試験はヒツジまたはウシ血液寒天培地で実施されるが、その反応はしばしば軽度である。それゆえ、この試験の信頼性は低く、主要な２つの種を区別する、すなわちＬ．モノサイトゲネス（陽性反応）をＬ．イノキュア（陰性反応）から識別することはできるが、病原性種に特異的ではない。
【０００８】
ＣＡＭＰ試験は、先述のβ溶血試験に関連するもう１つの試験である。この試験は、５％の洗浄ヒツジ赤血球を含有するトリプチカーゼダイズ寒天培地で実施される。β溶血性黄色ブドウ球菌株ＣＩＰ ５７１０を、試験するリステリア属株の培養物によって形成された画線に対して垂直に画線播種する。２つの帯域の接触部分におけるブドウ球菌溶血の強化は陽性反応を示す。実際に、ＣＡＭＰ試験は実施が困難な手法であり、溶血試験と同様に、必ずしも信頼性が高いわけではない。
【０００９】
培養培地または同定培地を使用することも可能である。これに関して、出願人に許諾された特許文献１は、リステリア・モノサイトゲネス種をリステリア属のその他の細菌から識別するための細菌学的分析工程を述べている。この工程によれば、グリシンアミノペプチダーゼと呼ばれる酵素によって加水分解され得る発色性または発蛍光性基質を含有する反応培地が使用される。この非常に好都合な手法は、リステリア・モノサイトゲネス種がいかなるグリシンアミノペプチダーゼ酵素活性も有さない唯一の種であるという事実による難点を有する。リステリア・モノサイトゲネスの検出は陰性活性によって実施されるが、これは容易ではなく、陰性試験の使用は、突然変異体の場合またはその他の種がストレスを受け、正常な活性で応答しない場合は特異性を欠く。
【００１０】
ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）活性を明らかにすることにより、リステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビ種をその他のリステリア属から識別することが可能である。これは、ＰＩ−ＰＬＣが、リステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビのような特定種のリステリア属によって培養培地中に分泌されることが明らかにされたためである（非特許文献１）。これに関して、ＯＡＡ寒天培地（Ｏｔｔａｖｉａｎｉ Ａｇｏｓｔｉ Ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ）は、リステリア属のすべての種の検出と、コロニーの周りのハロの出現を介したリステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビのＰＩ−ＰＬＣ活性の実証とを可能にするβ−グルコシダーゼ基質を使用する発色性培地である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第ＥＰ４９６６８０号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗａｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５（２），ｐｐ．３６１−３６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
使用される手法にかかわりなく、一般に第二の培養培地を使用して、リステリア・モノサイトゲネスを確認するための試験を体系的に実施する必要があり、これには２４時間のインキュベーション工程が必要とされる。これに関して、ＡＬＯＡ Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ（ＡＥＳ）またはＣＨＲＯＭａｇａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｌｉｓｔｅｒｉａ（ＢＢＬ）確認試験が挙げられ得る。それゆえ、全体では、リステリア・モノサイトゲネスの存在を同定し、確認するために４８時間、すなわち、２４時間のインキュベーションを必要とする第一培養培地の使用、および次いで、同じく２４時間のインキュベーションを必要とする第二の確認工程からなる４８時間が必要である。この４８時間の期間は長く、できるだけ迅速に信頼し得る診断を提示するために、この期間を短縮することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、リステリア・モノサイトゲネス種をリステリア属のその他のすべての種から識別することを可能にする検出方法を提案することである。特に、本発明は、６時間未満で実施できるので非常に迅速な生化学的試験である、新規確認試験を提案する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の説明に進む前に、本発明の開示を容易にするために以下の定義を示す。
【００１６】
「生化学的試験」という用語は、細菌の存在を明らかにする生物学的反応を実施するための試験を意味する。そのような試験は、特に、増殖工程を行わずに、播種材料を使用して直接実施することができる。その場合、検出されるのは、細菌懸濁液によって提供されるあらかじめ形成された酵素である。
【００１７】
そのような試験は、特にＡＰＩ（登録商標）シリーズまたはＶｉｔｅｋ ２システムにおいて使用される。脱水形態で包装されたこれらの試験を、インキュベーション下で、分析する試料と接触させる。求める生化学的反応は、試験物の状態の変化（着色、蛍光の出現または消失）によって検出される。次に、直接または展開試薬の添加後に、試験物を目視的にまたは読み取り装置によって読み取る。
【００１８】
ＡＰＩ（登録商標）シリーズは、クプラ（ｃｕｐｕｌｅｓ）中で、生化学的試験のストリップをデータベースと組み合わせた、数値的同定の確率法に基づく。試験の賢明な組み合わせにより、微生物群の特徴づけおよび種間での区別が行われる。
【００１９】
Ｖｉｔｅｋ ２システムは、６４マイクロウエルカードを使用する、完全に自動化された同定およびアンチバイオグラムシステムである。手操作工程を排除することにより、自動化は、検査の時間を節約し、均質な分析手順を保証することを可能にし、それによって結果の信頼性を改善する。このシステムで実施される同定は、ＡＰＩストリップと同様の確率法を利用する。読み取りの自動化は、実施される生化学的試験の動的読み取りを可能にするので、一般的なグラム陽性微生物について、およびリステリア・モノサイトゲネスについても、４〜８時間での同定を可能にする。
【００２０】
本発明による生化学的試験は、ＰＩ−ＰＬＣ基質およびα−マンノシダーゼ基質を含む、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための試験であるが、無機塩、ペプトン、炭水化物、ｐＨ変動を制限するための１または複数の化合物、１または複数の酵素誘導物質も含み得る。
【００２１】
「基質」という用語は、微生物の酵素活性または代謝活性に起因する検出可能なシグナルを直接または間接的に生成することができる何らかの分子を意味する。
【００２２】
基質は、特に酵素基質、すなわち微生物の直接または間接的検出を可能にする生成物を生じるように酵素によって加水分解され得る基質であり得る。
【００２３】
本発明に関して、この基質は、特にホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質またはα−マンノシダーゼ基質である。
【００２４】
この基質は、特に、明らかにされるべき酵素活性に特異的な第一部分と、本明細書の後述では標識部分と称する、標識として働く第二部分とを含有し得る。この標識部分は、発色性、発蛍光性、発光性等であり得、好ましくは、本発明において使用される基質は発色性である。特に、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質の場合に特に適切なインドキシルおよびその誘導体に基づく基質、α−マンノシダーゼ基質の場合に特に適切なニトロフェノールおよび誘導体に基づく基質を挙げることができ、さらにはヒドロキシキノリンまたはエスクレチンまたはアリザリンまたはカテコールまたはアミノフェノールに基づく基質ならびにナフトールおよびそれらの誘導体に基づく基質も挙げられる。発蛍光性標識については、クマリン類の誘導体、特にウンベリフェロン、ナフトール、レゾルフィンまたはフルオレセインが挙げられる。
【００２５】
本発明によれば、基質は、好ましくは、
・インドキシル（３−インドキシル、５−ブロモ−３−インドキシル、４−クロロ−３−インドキシル、５−ヨード−３−インドキシル、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、６−ブロモ−３−インドキシル、６−クロロ−３−インドキシル、６−フルオロ−３−インドキシル、４，６−ジクロロ−３−インドキシル、６，７−ジクロロ−３−インドキシル、４，６，７−トリクロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−４−クロロ−Ｎ−メチル−３−インドキシル、Ｎ−メチル−３−インドキシル等）、
・ニトロフェノール（オルト−ニトロフェノール、パラ−ニトロフェノール等）
に基づく基質から選択される。
【００２６】
好ましくは、ＰＩ−ＰＬＣ基質は発色性基質である。好ましくは、ＰＩ−ＰＬＣ基質はインドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトールであり、好ましくは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオイノシトールリン酸（Ｘ−インドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトール）である。
【００２７】
好ましくは、α−マンノシダーゼ基質は発色性または発蛍光性基質である。好ましくは、α−マンノシダーゼ基質は発色性基質である。好ましくは、α−マンノシダーゼ基質はマンノピラノシダーゼ基質である。好ましくは、マンノピラノシダーゼ基質は４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドである。
【００２８】
好ましくは、ＰＩ−ＰＬＣ基質の濃度は５〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１．５〜０．５ｇ／ｌである。
【００２９】
好ましくは、α−マンノシダーゼ基質の濃度は２〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１〜０．５ｇ／ｌである。
【００３０】
「反応培地」という用語は、代謝の発現および／または微生物の増殖のために必要なすべての成分を含有する培地を意味する。反応培地は、固形、半固形または液体であり得る。「固形培地」という用語は、たとえばゲル化培地を意味する。寒天培地は微生物を培養するための微生物学における従来のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。いくつかの製剤が市販されており、たとえばコロンビア寒天培地、トリプチカーゼダイズ寒天培地、マッコンキー寒天培地、サブロー寒天培地または、より一般的には、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているものが挙げられる。
【００３１】
反応培地は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、無機物、ビタミン、たとえば抗生物質、酵素、界面活性剤、緩衝剤、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、金属塩のような活性分子、酵素活性または代謝活性等を検出するための１または複数の基質のような、１または複数の成分を組み合わせて含有し得る。
【００３２】
培地はまた、着色剤も含有し得る。表示のために、着色剤として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、ヒツジ血液、ウマ血液、たとえば酸化チタンのような乳白剤、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン等が挙げられ得る。
【００３３】
リステリア属を検出するために、工業的に一般に使用されている従来の選択培地であるパルカム培地およびオックスフォード培地に特に言及する。これらは、リステリア・モノサイトゲネスの研究および計数の国際規格ＩＳＯ１１２９０−１および１１２９０−２に記載されている。あるいは、検出に加えて、Ｌ．モノサイトゲネスの仮同定を可能にするＯＡＡ培地のような発色性培地が挙げられる。
【００３４】
「生物学的試料」という用語は、生物学的液体標本に由来する臨床試料、または何らかのタイプの食品に由来する食品試料を意味する。それゆえ、この試料は、液体または固体であり得、限定を伴わずに、血液、脳脊髄液または胎盤の臨床試料、水からまたは乳もしくは果汁のような飲料由来の食品試料、ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズ、チーズ、魚由来の食品試料、または動物飼料に由来する食品試料が挙げられる。
【００３５】
これに関して、本発明は、少なくとも１つのホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含むことを特徴とする、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための生化学的試験に関する。
【００３６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ＰＩ−ＰＬＣ基質はインドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトール、好ましくは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオイノシトールリン酸である。
【００３７】
本発明の好ましい一実施形態によれば、α−マンノシダーゼ基質はマンノピラノシダーゼ基質、好ましくは４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドである。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、試験はまた、特にα−グリセロリン酸マグネシウムまたはウシ血清アルブミンのような、１または複数のＰＩ−ＰＬＣ活性化物質を含む。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ＰＩ−ＰＬＣ基質の濃度は５〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１．５〜０．５ｇ／ｌである。
【００４０】
本発明の好ましい一実施形態によれば、α−マンノシダーゼ基質の濃度は２〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１〜０．５ｇ／ｌである。
【００４１】
本発明はまた、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための、前述の生化学的試験、すなわち前記で定義した、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含む生化学的試験の使用に関する。
【００４２】
本発明による試験は、ＡＰＩ（登録商標）シリーズまたはＶｉｔｅｋ（登録商標）システムにおける同定装置を生み出すための単一ユニットとしての使用または一連の生化学的試験と組み合わせた使用に特に適している。現在、ＡＰＩストリップまたはＶｉｔｅｋシステムでのＬ．モノサイトゲネスの同定は、いくつかの単一生化学的試験の一連の陽性または陰性結果を結びつけることによって確立される反応プロフィールを利用する。本発明による試験は、試験の回数を低減するためにそのような装置に好都合に組み込むことができる。
【００４３】
本発明はまた、リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための反応培地を提供する工程、
ｂ）試験する生物学的試料を培地に播種する工程、
ｃ）インキュベートする工程、
ｄ）リステリア属の存在を明らかにする工程、
ｅ）前記で定義した、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含む、本発明による生化学的試験によってＬ．モノサイトゲネスの存在を確認する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００４４】
微生物の播種は、当業者に公知の播種手法のいずれかによって実施できる。播種する工程は、検出を所望する酵素活性のために最適な温度で実施することができ、当業者は検出しようとする酵素活性に応じて前記温度を容易に選択することが可能である。工程ｄ）は、目視検査によってまたは比色定量法もしくは蛍光定量法によって実施できる。
【００４５】
リステリア属を検出するために、特に、コロニーの青色着色（β−グルコシダーゼ活性）によってリステリア属の種を検出することが可能なＯＡＡ培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、参照番号４３６４１）が挙げられる。
【００４６】
本発明はまた、リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための生化学的試験または生化学的試験の組み合わせを提供する工程、
ｂ）リステリア属の存在を明らかにする工程、
ｃ）前記で定義した、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含む本発明による生化学的試験によって、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００４７】
リステリア属を検出するために、特に形態学とグラム反応が挙げられ、これらを、エスクリンおよびカタラーゼに関する試験およびキシロース、ラムノース、マンニトール、リボースまたはα−メチル−Ｄ−マンノシドのような糖類の発酵に関する試験と組み合わせる。
【００４８】
以下の実施例は説明のために提示するものであり、いかなる意味においても限定を意図しない。これらの実施例により、本発明をより明瞭に理解することが可能となる。
【実施例１】
【００４９】
Ａ）本発明による生化学的試験
本発明による生化学的試験は以下の成分をｇ／ｌ単位で含む。
トリス緩衝液 ３７．５
ペプトン抽出物 ２．５
酵母抽出物 ０．２５
α−グリセロリン酸マグネシウム １．２５
ウシ血清アルブミン ７．５
Ｘ−ミオ−イノシトール−１−リン酸 ２
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド ２．２５
最終ｐＨ＝７。
溶液２０μｌがプラスチック支持体に沈着した後、試験物を４０℃の温度で２４時間脱水した。
脱塩水５０μｌで再水和し、コロニーを添加した後、または０．５ＭｃＦに等しい不透明度を有する細菌懸濁液５０μｌで再水和した後、３７℃±２℃にて４〜６時間で反応を得ることに関して試験物を評価した。
【００５０】
Ｂ）試験の読み取りと解釈
３７℃±１℃で試験物を４時間および６時間インキュベートした後、試験物の着色を読み取り、以下の表に従って解釈した。
【００５１】
Ｃ）本発明による試験の有効性確認
本発明による試験を、最初に、あらかじめＯＡＡ培地（参照番号４３６４１）で培養しておいたリステリア属の９０の純株に０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの播種材料を使用して評価した。リステリア属の６つの種を以下のように分けた：Ｌ．モノサイトゲネス（３０株）、Ｌ．イバノビ（２０株）（亜種であるＬ．イバノビ・ロンドニエンシス（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ｓｐｐ ｌｏｎｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）およびＬ．イバノビ・イバノビ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ｓｐｐ ｉｖａｎｏｖｉｉ）の１０株を含む）、Ｌ．グレイ（Ｌ．ｇｒａｙｉｉ）（１０株）、Ｌ．シーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（１０株）、Ｌ．ウエルシュメリ（Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）（１０株）、Ｌ．イノキュア（１０株）。４時間目以降、ＯＡＡ培地上にハロを呈するＬ．モノサイトゲネス株の８０％（２５／２５）が陽性の緑色着色を示した。６時間のインキュベーション後、これらの菌株すべてが予想された緑色の着色を示した。２４時間後、反応は安定であり、３７℃±０．２℃で７２時間のインキュベーションまで安定なままであった。Ｌ．モノサイトゲネス以外の種に属する６０菌株のいずれもが緑色着色を示さなかった。試験は、それゆえ、６時間で１００％の感受性を示し、リステリア属内で１００％の特異性を示した。
【００５２】
本発明による試験の有効性を、純株由来のまたは食品マトリックスに由来する菌株由来のコロニーの播種材料に関しても評価した。後者の場合、ＡＦＮＯＲ（ＢＩＯ １２−１４）短期プロトコールによって推奨されるように、１／２フレイザーブロスでのプレエンリッチメント後にマトリックスを検査した。この工程は、マトリックスの処理に関連するストレスを受けた可能性がある細菌株の再生を可能にする。
【００５３】
純株に関する検査
ＯＡＡ培地で３５℃±２℃にて２４時間培養した５０のＬ．モノサイトゲネス株を、滅菌水５０μｌで再水和した本発明による生化学的試験物中に１コロニーの割合で播種した。３５℃±２℃でインキュベートした試験物は、ＯＡＡ培地で特徴的なコロニー（ハロを有する青色コロニー）を示した菌株の９４％について４時間目で陽性であった。６時間後、すべてのＬ．モノサイトゲネス株が、本発明による生化学的試験物上で陽性（緑色）と検出された。
【００５４】
マトリックスに関する検査
２２の食品マトリックス上のＬ．モノサイトゲネスに関する検査を、ＡＦＮＯＲ（ＢＩＯ １２−１４）短期プロトコールに従って、すなわちマトリックス／ストマッカー２５ｇ、１／２フレイザーでのエンリッチメント（２４時間−３０℃）で実施した。このエンリッチメント段階後、１／２フレイザーブロス０．１ｍｌをＯＡＡ培地に播種した。次に、培地を３５℃±２℃で２４時間インキュベートした。培地の各々を確認し、推定上の特徴的なＬ．モノサイトゲネスコロニー（ハロを有する青色）が認められた場合、前記コロニーを本発明による試験物の播種のために採取した。前記試験物は、培地懸濁液（７０／７００）５０μｌであらかじめ再水和した。
【００５５】
試験した２２のマトリックスのうち、１１は２４時間後にＯＡＡ培地で細菌増殖を示した。６つのマトリックスはＬ．モノサイトゲネス種の特徴的なコロニー（ハロを有する青色）を示した。
【００５６】
本発明による試験は、４時間で、６つの推定菌株がＬ．モノサイトゲネス種に属することを確認した。６つの菌株のＬ．モノサイトゲネス種としての同定は、他の同定ツール（リステリアＡＰＩストリップ、Ｖｉｔｅｋ ＧＰカードおよび１６Ｓ配列決定による）によって確認された。
【００５７】
その他５つのマトリックスは、Ｌ．モノサイトゲネス以外のリステリア属または他の微生物で汚染されていた。これらすべての場合に、これらのマトリックスの各々の１つのコロニーに関して実施した本発明の試験は陰性反応を示した。
【実施例２】
【００５８】
本発明による試験の有効性を、以下の分類で試験した２５０の純株に関しても確認した。
・Ｌ．モノサイトゲネス、様々な血清型および起源の１５０株
・リステリア属、５０株：Ｌ．グレイ１株、Ｌ．イノキュア１１株、Ｌ．イバノビ２６株（Ｌ．イバノビ・イバノビ６株、Ｌ．イバノビ・ロンドニエンシス７株を含む）、Ｌ．シーリゲリ５株、Ｌ．ウエルシュメリ７株。
・他の属、５０株：バチルス属、乳酸杆菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属。
【００５９】
使用した菌株は、国際コレクション由来の菌株または食品マトリックスもしくは環境から単離した菌株のいずれかである。これらの菌株の同定は、検査の前に実験室によって確立されたものであり、指示同定（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であるとみなされる。リステリア属株はＡＰＩリステリア同定ストリップによって同定された。
【００６０】
純株に関する検査
純株に関して得られた結果を以下に示す。
【００６１】
３７℃で２４時間インキュベートしたＯＡＡ寒天培地を使用して、試験した１５０株から１４９のリステリア・モノサイトゲネス株が、６時間目以降、本発明による試験によって確認された。２４時間までインキュベーションを延長しても結果に変化はなかった。
【００６２】
５０のリステリア属株がＯＡＡ培地から発生した。
【００６３】
２６のＬ．イバノビ株だけが、ＯＡＡ寒天培地で特徴的なコロニーを示した。本発明による試験を使用して検査したこれらの単離物すべてが、６時間目および２４時間目に陰性結果を生じた。
【００６４】
試験した５０の他の属の菌株のうち、１２の株が、特徴的なコロニーを示さずにＯＡＡ培地で発生した。これらの単離物に関して実施した本発明による試験は陰性であった。
【００６５】
４時間のインキュベーション後の試験を読み取ったところ、１４８の単離物を検出することが可能であった。それゆえ、本発明による試験を用いて、４時間目以降に陽性結果（緑色）を得ることが可能である。陰性結果は６時間目以降に得ることができる。結果は、ＯＡＡ培地での４８時間の培養後も不変であった。
【００６６】
同等の結果がＯＡＡ以外の培養培地（ＴＳＡ（トリプチカーゼダイズ寒天培地）および血液寒天培地）で得られた。本発明による試験により、６時間でＬ．モノサイトゲネスの存在を確認することが可能であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア属、より詳細にはリステリア・モノサイトゲネス種の病原性細菌の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア・モノサイトゲネスの単離と同定は、食品加工衛生および医学細菌学を監視するうえでの主要な問題である。リステリア属の細菌の中で、リステリア・モノサイトゲネス種だけがヒトに対して病原性であることが知られている。リステリア・モノサイトゲネスは、免疫を抑制している個人、小児または妊婦において、時として致死的なリステリア症を引き起こし得る（症例の２５〜３０％）。リステリア属のその他の種は、病原性ではないか、または動物に対してのみ病原性である。これは特にリステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）に当てはまる。
【０００３】
ほとんどの先進国では、過去数十年間にヒトのリステリア症の危険度は後退しているが、現代社会はますます高い安全性を要求しており、散発性症例は受け入れ得るが伝染病は容認しない。
【０００４】
それゆえ、ヒトにおいて細菌の状態を診断する状況では、リステリア・モノサイトゲネスを、病原性ではないリステリア属のその他の種から明確に区別することが重要である。
【０００５】
リステリア属は現在６つの種を含み、そのうちリステリア・モノサイトゲネスだけがヒトに対して病原性である。
【０００６】
微生物は、食品起源の汚染後、ヒトにおいて重大な伝染病の原因となる。リステリア属の２つの種が主として食品（基本的に乳および乳製品）において単離されており、これらの種は非病原性リステリア・イノキュアおよび病原性リステリア・モノサイトゲネスである。
【０００７】
これら２つの種は共通の生化学的特徴を有しているため、それらを識別することは困難である。たとえば、β溶血試験は、細菌による赤血球の溶解を引き起こす物質（リステリオリシン）の産生に関連するβ溶血活性を測定することに基づく。この試験はヒツジまたはウシ血液寒天培地で実施されるが、その反応はしばしば軽度である。それゆえ、この試験の信頼性は低く、主要な２つの種を区別する、すなわちＬ．モノサイトゲネス（陽性反応）をＬ．イノキュア（陰性反応）から識別することはできるが、病原性種に特異的ではない。
【０００８】
ＣＡＭＰ試験は、先述のβ溶血試験に関連するもう１つの試験である。この試験は、５％の洗浄ヒツジ赤血球を含有するトリプチカーゼダイズ寒天培地で実施される。β溶血性黄色ブドウ球菌株ＣＩＰ ５７１０を、試験するリステリア属株の培養物によって形成された画線に対して垂直に画線播種する。２つの帯域の接触部分におけるブドウ球菌溶血の強化は陽性反応を示す。実際に、ＣＡＭＰ試験は実施が困難な手法であり、溶血試験と同様に、必ずしも信頼性が高いわけではない。
【０００９】
培養培地または同定培地を使用することも可能である。これに関して、出願人に許諾された特許文献１は、リステリア・モノサイトゲネス種をリステリア属のその他の細菌から識別するための細菌学的分析工程を述べている。この工程によれば、グリシンアミノペプチダーゼと呼ばれる酵素によって加水分解され得る発色性または発蛍光性基質を含有する反応培地が使用される。この非常に好都合な手法は、リステリア・モノサイトゲネス種がいかなるグリシンアミノペプチダーゼ酵素活性も有さない唯一の種であるという事実による難点を有する。リステリア・モノサイトゲネスの検出は陰性活性によって実施されるが、これは容易ではなく、陰性試験の使用は、突然変異体の場合またはその他の種がストレスを受け、正常な活性で応答しない場合は特異性を欠く。
【００１０】
ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）活性を明らかにすることにより、リステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビ種をその他のリステリア属から識別することが可能である。これは、ＰＩ−ＰＬＣが、リステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビのような特定種のリステリア属によって培養培地中に分泌されることが明らかにされたためである（非特許文献１）。これに関して、ＯＡＡ寒天培地（Ｏｔｔａｖｉａｎｉ Ａｇｏｓｔｉ Ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ）は、リステリア属のすべての種の検出と、コロニーの周りのハロの出現を介したリステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビのＰＩ−ＰＬＣ活性の実証とを可能にするβ−グルコシダーゼ基質を使用する発色性培地である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第ＥＰ４９６６８０号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗａｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５（２），ｐｐ．３６１−３６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
使用される手法にかかわりなく、一般に第二の培養培地を使用して、リステリア・モノサイトゲネスを確認するための試験を体系的に実施する必要があり、これには２４時間のインキュベーション工程が必要とされる。これに関して、ＡＬＯＡ Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ（ＡＥＳ）またはＣＨＲＯＭａｇａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｌｉｓｔｅｒｉａ（ＢＢＬ）確認試験が挙げられ得る。それゆえ、全体では、リステリア・モノサイトゲネスの存在を同定し、確認するために４８時間、すなわち、２４時間のインキュベーションを必要とする第一培養培地の使用、および次いで、同じく２４時間のインキュベーションを必要とする第二の確認工程からなる４８時間が必要である。この４８時間の期間は長く、できるだけ迅速に信頼し得る診断を提示するために、この期間を短縮することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、リステリア・モノサイトゲネス種をリステリア属のその他のすべての種から識別することを可能にする検出方法を提案することである。特に、本発明は、６時間未満で実施できるので非常に迅速な生化学的試験である、新規確認試験を提案する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の説明に進む前に、本発明の開示を容易にするために以下の定義を示す。
【００１６】
「生化学的試験」という用語は、細菌の存在を明らかにする生物学的反応を実施するための試験を意味する。そのような試験は、特に、増殖工程を行わずに、播種材料を使用して直接実施することができる。その場合、検出されるのは、細菌懸濁液によって提供されるあらかじめ形成された酵素である。
【００１７】
そのような試験は、特にＡＰＩ（登録商標）シリーズまたはＶｉｔｅｋ ２システムにおいて使用される。脱水形態で包装されたこれらの試験を、インキュベーション下で、分析する試料と接触させる。求める生化学的反応は、試験物の状態の変化（着色、蛍光の出現または消失）によって検出される。次に、直接または展開試薬の添加後に、試験物を目視的にまたは読み取り装置によって読み取る。
【００１８】
ＡＰＩ（登録商標）シリーズは、クプラ（ｃｕｐｕｌｅｓ）中で、生化学的試験のストリップをデータベースと組み合わせた、数値的同定の確率法に基づく。試験の賢明な組み合わせにより、微生物群の特徴づけおよび種間での区別が行われる。
【００１９】
Ｖｉｔｅｋ ２システムは、６４マイクロウエルカードを使用する、完全に自動化された同定およびアンチバイオグラムシステムである。手操作工程を排除することにより、自動化は、検査の時間を節約し、均質な分析手順を保証することを可能にし、それによって結果の信頼性を改善する。このシステムで実施される同定は、ＡＰＩストリップと同様の確率法を利用する。読み取りの自動化は、実施される生化学的試験の動的読み取りを可能にするので、一般的なグラム陽性微生物について、およびリステリア・モノサイトゲネスについても、４〜８時間での同定を可能にする。
【００２０】
本発明による生化学的試験は、ＰＩ−ＰＬＣ基質およびα−マンノシダーゼ基質を含む、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための試験であるが、無機塩、ペプトン、炭水化物、ｐＨ変動を制限するための１または複数の化合物、１または複数の酵素誘導物質も含み得る。
【００２１】
「基質」という用語は、微生物の酵素活性または代謝活性に起因する検出可能なシグナルを直接または間接的に生成することができる何らかの分子を意味する。
【００２２】
基質は、特に酵素基質、すなわち微生物の直接または間接的検出を可能にする生成物を生じるように酵素によって加水分解され得る基質であり得る。
【００２３】
本発明に関して、この基質は、特にホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質またはα−マンノシダーゼ基質である。
【００２４】
この基質は、特に、明らかにされるべき酵素活性に特異的な第一部分と、本明細書の後述では標識部分と称する、標識として働く第二部分とを含有し得る。この標識部分は、発色性、発蛍光性、発光性等であり得、好ましくは、本発明において使用される基質は発色性である。特に、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質の場合に特に適切なインドキシルおよびその誘導体に基づく基質、α−マンノシダーゼ基質の場合に特に適切なニトロフェノールおよび誘導体に基づく基質を挙げることができ、さらにはヒドロキシキノリンまたはエスクレチンまたはアリザリンまたはカテコールまたはアミノフェノールに基づく基質ならびにナフトールおよびそれらの誘導体に基づく基質も挙げられる。発蛍光性標識については、クマリン類の誘導体、特にウンベリフェロン、ナフトール、レゾルフィンまたはフルオレセインが挙げられる。
【００２５】
本発明によれば、基質は、好ましくは、
・インドキシル（３−インドキシル、５−ブロモ−３−インドキシル、４−クロロ−３−インドキシル、５−ヨード−３−インドキシル、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、６−ブロモ−３−インドキシル、６−クロロ−３−インドキシル、６−フルオロ−３−インドキシル、４，６−ジクロロ−３−インドキシル、６，７−ジクロロ−３−インドキシル、４，６，７−トリクロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−４−クロロ−Ｎ−メチル−３−インドキシル、Ｎ−メチル−３−インドキシル等）、
・ニトロフェノール（オルト−ニトロフェノール、パラ−ニトロフェノール等）
に基づく基質から選択される。
【００２６】
好ましくは、ＰＩ−ＰＬＣ基質は発色性基質である。好ましくは、ＰＩ−ＰＬＣ基質はインドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトールであり、好ましくは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオイノシトールリン酸（Ｘ−インドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトール）である。
【００２７】
好ましくは、α−マンノシダーゼ基質は発色性または発蛍光性基質である。好ましくは、α−マンノシダーゼ基質は発色性基質である。好ましくは、α−マンノシダーゼ基質はマンノピラノシダーゼ基質である。好ましくは、マンノピラノシダーゼ基質は４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドである。
【００２８】
好ましくは、ＰＩ−ＰＬＣ基質の濃度は５〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１．５〜０．５ｇ／ｌである。
【００２９】
好ましくは、α−マンノシダーゼ基質の濃度は２〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１〜０．５ｇ／ｌである。
【００３０】
「反応培地」という用語は、代謝の発現および／または微生物の増殖のために必要なすべての成分を含有する培地を意味する。反応培地は、固形、半固形または液体であり得る。「固形培地」という用語は、たとえばゲル化培地を意味する。寒天培地は微生物を培養するための微生物学における従来のゲル化剤であるが、ゼラチンまたはアガロースを使用することも可能である。いくつかの製剤が市販されており、たとえばコロンビア寒天培地、トリプチカーゼダイズ寒天培地、マッコンキー寒天培地、サブロー寒天培地または、より一般的には、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているものが挙げられる。
【００３１】
反応培地は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、無機物、ビタミン、たとえば抗生物質、酵素、界面活性剤、緩衝剤、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、金属塩のような活性分子、酵素活性または代謝活性等を検出するための１または複数の基質のような、１または複数の成分を組み合わせて含有し得る。
【００３２】
培地はまた、着色剤も含有し得る。表示のために、着色剤として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、ヒツジ血液、ウマ血液、たとえば酸化チタンのような乳白剤、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン等が挙げられ得る。
【００３３】
リステリア属を検出するために、工業的に一般に使用されている従来の選択培地であるパルカム培地およびオックスフォード培地に特に言及する。これらは、リステリア・モノサイトゲネスの研究および計数の国際規格ＩＳＯ１１２９０−１および１１２９０−２に記載されている。あるいは、検出に加えて、Ｌ．モノサイトゲネスの仮同定を可能にするＯＡＡ培地のような発色性培地が挙げられる。
【００３４】
「生物学的試料」という用語は、生物学的液体標本に由来する臨床試料、または何らかのタイプの食品に由来する食品試料を意味する。それゆえ、この試料は、液体または固体であり得、限定を伴わずに、血液、脳脊髄液または胎盤の臨床試料、水からまたは乳もしくは果汁のような飲料由来の食品試料、ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズ、チーズ、魚由来の食品試料、または動物飼料に由来する食品試料が挙げられる。
【００３５】
これに関して、本発明は、少なくとも１つのホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含むことを特徴とする、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための生化学的試験に関する。
【００３６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ＰＩ−ＰＬＣ基質はインドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトール、好ましくは５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオイノシトールリン酸である。
【００３７】
本発明の好ましい一実施形態によれば、α−マンノシダーゼ基質はマンノピラノシダーゼ基質、好ましくは４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドである。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、試験はまた、特にα−グリセロリン酸マグネシウムまたはウシ血清アルブミンのような、１または複数のＰＩ−ＰＬＣ活性化物質を含む。
【００３９】
本発明の好ましい一実施形態によれば、ＰＩ−ＰＬＣ基質の濃度は５〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１．５〜０．５ｇ／ｌである。
【００４０】
本発明の好ましい一実施形態によれば、α−マンノシダーゼ基質の濃度は２〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１〜０．５ｇ／ｌである。
【００４１】
本発明はまた、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための、前述の生化学的試験、すなわち前記で定義した、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含む生化学的試験の使用に関する。
【００４２】
本発明による試験は、ＡＰＩ（登録商標）シリーズまたはＶｉｔｅｋ（登録商標）システムにおける同定装置を生み出すための単一ユニットとしての使用または一連の生化学的試験と組み合わせた使用に特に適している。現在、ＡＰＩストリップまたはＶｉｔｅｋシステムでのＬ．モノサイトゲネスの同定は、いくつかの単一生化学的試験の一連の陽性または陰性結果を結びつけることによって確立される反応プロフィールを利用する。本発明による試験は、試験の回数を低減するためにそのような装置に好都合に組み込むことができる。
【００４３】
本発明はまた、リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための反応培地を提供する工程、
ｂ）試験する生物学的試料を培地に播種する工程、
ｃ）インキュベートする工程、
ｄ）リステリア属の存在を明らかにする工程、
ｅ）前記で定義した、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含む、本発明による生化学的試験によってＬ．モノサイトゲネスの存在を確認する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００４４】
微生物の播種は、当業者に公知の播種手法のいずれかによって実施できる。播種する工程は、検出を所望する酵素活性のために最適な温度で実施することができ、当業者は検出しようとする酵素活性に応じて前記温度を容易に選択することが可能である。工程ｄ）は、目視検査によってまたは比色定量法もしくは蛍光定量法によって実施できる。
【００４５】
リステリア属を検出するために、特に、コロニーの青色着色（β−グルコシダーゼ活性）によってリステリア属の種を検出することが可能なＯＡＡ培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、参照番号４３６４１）が挙げられる。
【００４６】
本発明はまた、リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための生化学的試験または生化学的試験の組み合わせを提供する工程、
ｂ）リステリア属の存在を明らかにする工程、
ｃ）前記で定義した、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含む本発明による生化学的試験によって、Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００４７】
リステリア属を検出するために、特に形態学とグラム反応が挙げられ、これらを、エスクリンおよびカタラーゼに関する試験およびキシロース、ラムノース、マンニトール、リボースまたはα−メチル−Ｄ−マンノシドのような糖類の発酵に関する試験と組み合わせる。
【００４８】
以下の実施例は説明のために提示するものであり、いかなる意味においても限定を意図しない。これらの実施例により、本発明をより明瞭に理解することが可能となる。
【実施例１】
【００４９】
Ａ）本発明による生化学的試験
本発明による生化学的試験は以下の成分をｇ／ｌ単位で含む。
トリス緩衝液 ３７．５
ペプトン抽出物 ２．５
酵母抽出物 ０．２５
α−グリセロリン酸マグネシウム １．２５
ウシ血清アルブミン ７．５
Ｘ−ミオ−イノシトール−１−リン酸 ２
４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド ２．２５
最終ｐＨ＝７。
溶液２０μｌがプラスチック支持体に沈着した後、試験物を４０℃の温度で２４時間脱水した。
脱塩水５０μｌで再水和し、コロニーを添加した後、または０．５ＭｃＦに等しい不透明度を有する細菌懸濁液５０μｌで再水和した後、３７℃±２℃にて４〜６時間で反応を得ることに関して試験物を評価した。
【００５０】
Ｂ）試験の読み取りと解釈
３７℃±１℃で試験物を４時間および６時間インキュベートした後、試験物の着色を読み取り、以下の表に従って解釈した。
【００５１】
Ｃ）本発明による試験の有効性確認
本発明による試験を、最初に、あらかじめＯＡＡ培地（参照番号４３６４１）で培養しておいたリステリア属の９０の純株に０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの播種材料を使用して評価した。リステリア属の６つの種を以下のように分けた：Ｌ．モノサイトゲネス（３０株）、Ｌ．イバノビ（２０株）（亜種であるＬ．イバノビ・ロンドニエンシス（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ｓｐｐ ｌｏｎｄｏｎｉｅｎｓｉｓ）およびＬ．イバノビ・イバノビ（Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ｓｐｐ ｉｖａｎｏｖｉｉ）の１０株を含む）、Ｌ．グレイ（Ｌ．ｇｒａｙｉｉ）（１０株）、Ｌ．シーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（１０株）、Ｌ．ウエルシュメリ（Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）（１０株）、Ｌ．イノキュア（１０株）。４時間目以降、ＯＡＡ培地上にハロを呈するＬ．モノサイトゲネス株の８０％（２５／２５）が陽性の緑色着色を示した。６時間のインキュベーション後、これらの菌株すべてが予想された緑色の着色を示した。２４時間後、反応は安定であり、３７℃±０．２℃で７２時間のインキュベーションまで安定なままであった。Ｌ．モノサイトゲネス以外の種に属する６０菌株のいずれもが緑色着色を示さなかった。試験は、それゆえ、６時間で１００％の感受性を示し、リステリア属内で１００％の特異性を示した。
【００５２】
本発明による試験の有効性を、純株由来のまたは食品マトリックスに由来する菌株由来のコロニーの播種材料に関しても評価した。後者の場合、ＡＦＮＯＲ（ＢＩＯ １２−１４）短期プロトコールによって推奨されるように、１／２フレイザーブロスでのプレエンリッチメント後にマトリックスを検査した。この工程は、マトリックスの処理に関連するストレスを受けた可能性がある細菌株の再生を可能にする。
【００５３】
純株に関する検査
ＯＡＡ培地で３５℃±２℃にて２４時間培養した５０のＬ．モノサイトゲネス株を、滅菌水５０μｌで再水和した本発明による生化学的試験物中に１コロニーの割合で播種した。３５℃±２℃でインキュベートした試験物は、ＯＡＡ培地で特徴的なコロニー（ハロを有する青色コロニー）を示した菌株の９４％について４時間目で陽性であった。６時間後、すべてのＬ．モノサイトゲネス株が、本発明による生化学的試験物上で陽性（緑色）と検出された。
【００５４】
マトリックスに関する検査
２２の食品マトリックス上のＬ．モノサイトゲネスに関する検査を、ＡＦＮＯＲ（ＢＩＯ １２−１４）短期プロトコールに従って、すなわちマトリックス／ストマッカー２５ｇ、１／２フレイザーでのエンリッチメント（２４時間−３０℃）で実施した。このエンリッチメント段階後、１／２フレイザーブロス０．１ｍｌをＯＡＡ培地に播種した。次に、培地を３５℃±２℃で２４時間インキュベートした。培地の各々を確認し、推定上の特徴的なＬ．モノサイトゲネスコロニー（ハロを有する青色）が認められた場合、前記コロニーを本発明による試験物の播種のために採取した。前記試験物は、培地懸濁液（７０／７００）５０μｌであらかじめ再水和した。
【００５５】
試験した２２のマトリックスのうち、１１は２４時間後にＯＡＡ培地で細菌増殖を示した。６つのマトリックスはＬ．モノサイトゲネス種の特徴的なコロニー（ハロを有する青色）を示した。
【００５６】
本発明による試験は、４時間で、６つの推定菌株がＬ．モノサイトゲネス種に属することを確認した。６つの菌株のＬ．モノサイトゲネス種としての同定は、他の同定ツール（リステリアＡＰＩストリップ、Ｖｉｔｅｋ ＧＰカードおよび１６Ｓ配列決定による）によって確認された。
【００５７】
その他５つのマトリックスは、Ｌ．モノサイトゲネス以外のリステリア属または他の微生物で汚染されていた。これらすべての場合に、これらのマトリックスの各々の１つのコロニーに関して実施した本発明の試験は陰性反応を示した。
【実施例２】
【００５８】
本発明による試験の有効性を、以下の分類で試験した２５０の純株に関しても確認した。
・Ｌ．モノサイトゲネス、様々な血清型および起源の１５０株
・リステリア属、５０株：Ｌ．グレイ１株、Ｌ．イノキュア１１株、Ｌ．イバノビ２６株（Ｌ．イバノビ・イバノビ６株、Ｌ．イバノビ・ロンドニエンシス７株を含む）、Ｌ．シーリゲリ５株、Ｌ．ウエルシュメリ７株。
・他の属、５０株：バチルス属、乳酸杆菌属、ブドウ球菌属、エンテロコッカス属。
【００５９】
使用した菌株は、国際コレクション由来の菌株または食品マトリックスもしくは環境から単離した菌株のいずれかである。これらの菌株の同定は、検査の前に実験室によって確立されたものであり、指示同定（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であるとみなされる。リステリア属株はＡＰＩリステリア同定ストリップによって同定された。
【００６０】
純株に関する検査
純株に関して得られた結果を以下に示す。
【００６１】
３７℃で２４時間インキュベートしたＯＡＡ寒天培地を使用して、試験した１５０株から１４９のリステリア・モノサイトゲネス株が、６時間目以降、本発明による試験によって確認された。２４時間までインキュベーションを延長しても結果に変化はなかった。
【００６２】
５０のリステリア属株がＯＡＡ培地から発生した。
【００６３】
２６のＬ．イバノビ株だけが、ＯＡＡ寒天培地で特徴的なコロニーを示した。本発明による試験を使用して検査したこれらの単離物すべてが、６時間目および２４時間目に陰性結果を生じた。
【００６４】
試験した５０の他の属の菌株のうち、１２の株が、特徴的なコロニーを示さずにＯＡＡ培地で発生した。これらの単離物に関して実施した本発明による試験は陰性であった。
【００６５】
４時間のインキュベーション後の試験を読み取ったところ、１４８の単離物を検出することが可能であった。それゆえ、本発明による試験を用いて、４時間目以降に陽性結果（緑色）を得ることが可能である。陰性結果は６時間目以降に得ることができる。結果は、ＯＡＡ培地での４８時間の培養後も不変であった。
【００６６】
同等の結果がＯＡＡ以外の培養培地（ＴＳＡ（トリプチカーゼダイズ寒天培地）および血液寒天培地）で得られた。本発明による試験により、６時間でＬ．モノサイトゲネスの存在を確認することが可能であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するための生化学的試験。
【請求項２】
ＰＩ−ＰＬＣ基質がインドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトールである、請求項１に記載の生化学的試験。
【請求項３】
インドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトールが５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオイノシトールリン酸である、請求項２に記載の生化学的試験。
【請求項４】
ＰＩ−ＰＬＣ基質の濃度が５〜０．１ｇ／ｌである、請求項１から３のいずれか一項に記載の生化学的試験。
【請求項５】
α−マンノシダーゼ基質がマンノピラノシダーゼ基質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の生化学的試験。
【請求項６】
マンノピラノシダーゼ基質がｐ−ニトロフェニルマンノピラノシドである、請求項５に記載の生化学的試験。
【請求項７】
α−マンノシダーゼ基質の濃度が２〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１〜０．５ｇ／ｌである、請求項１から６のいずれか一項に記載の生化学的試験。
【請求項８】
Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の生化学的試験の使用。
【請求項９】
リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための反応培地を提供するステップ、
ｂ）試験する生物学的試料を培地に播種するステップ、
ｃ）インキュベートするステップ、
ｄ）リステリア属の存在を明らかにするステップ、
ｅ）請求項１から７のいずれか一項に記載の生化学的試験によってリステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための生化学的試験または生化学的試験の組み合わせを提供するステップ、
ｂ）リステリア属の存在を明らかにするステップ、
ｃ）請求項１から７のいずれか一項に記載の生化学的試験によってリステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
少なくとも１つのホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）基質および少なくとも１つのα−マンノシダーゼ基質を含むことを特徴とする、リステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するための生化学的試験。
【請求項２】
ＰＩ−ＰＬＣ基質がインドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトールである、請求項１に記載の生化学的試験。
【請求項３】
インドリル−ホスファチジル−ミオ−イノシトールが５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオイノシトールリン酸である、請求項２に記載の生化学的試験。
【請求項４】
ＰＩ−ＰＬＣ基質の濃度が５〜０．１ｇ／ｌである、請求項１から３のいずれか一項に記載の生化学的試験。
【請求項５】
α−マンノシダーゼ基質がマンノピラノシダーゼ基質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の生化学的試験。
【請求項６】
マンノピラノシダーゼ基質がｐ−ニトロフェニルマンノピラノシドである、請求項５に記載の生化学的試験。
【請求項７】
α−マンノシダーゼ基質の濃度が２〜０．１ｇ／ｌ、好ましくは１〜０．５ｇ／ｌである、請求項１から６のいずれか一項に記載の生化学的試験。
【請求項８】
Ｌ．モノサイトゲネスの存在を確認するための、請求項１から７のいずれか一項に記載の生化学的試験の使用。
【請求項９】
リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための反応培地を提供するステップ、
ｂ）試験する生物学的試料を培地に播種するステップ、
ｃ）インキュベートするステップ、
ｄ）リステリア属の存在を明らかにするステップ、
ｅ）請求項１から７のいずれか一項に記載の生化学的試験によってリステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
リステリア・モノサイトゲネスを同定するための方法であって、
ａ）リステリア属を検出するための生化学的試験または生化学的試験の組み合わせを提供するステップ、
ｂ）リステリア属の存在を明らかにするステップ、
ｃ）請求項１から７のいずれか一項に記載の生化学的試験によってリステリア・モノサイトゲネスの存在を確認するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【公表番号】特表２０１１−５０００９７（Ｐ２０１１−５０００９７Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１５６４（Ｐ２０１０−５３１５６４）
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１９４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５６７６２
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５１９４６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５６７６２
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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