リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を高速で検出および／または測定する方法
本発明は、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する方法に関する。前記方法は、リパーゼまたはホスホリパーゼを含有している可能性のある試料を、前記リパーゼまたは前記ホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質の層で被覆した微量滴定プレートのウェルに添加すること；および前工程中に遊離されたα−エレオステアリン酸のＵＶスペクトルを測定することによって、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を検出および／または測定することからなることを特徴とする。また、本発明は、血漿リパーゼ濃度の上昇に関連する病理をインビトロ診断する、前記方法の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を高速でインビトロ検出および／または測定する方法、ならびにその利用である。
【０００２】
リパーゼの検出および検定の分析的方法の開発は、長年にわたる研究テーマである（BeissonF.、Tiss A.、Riviere C.およびVerger R. (2000); Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2: 133-153）。
【０００３】
「ファージディスプレイ」技術によって生じたリパーゼの動態およびエナンチオ選択性を特定するために、非常に低いリパーゼ活性を検出する天然の蛍光性トリグリセリドが使用されている（Beisson F.、Ferte N.、Nari J.、Noat G.、Arondel V.およびVerger R. (1999); Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedings. J. Lipid Res. 40: 2313-2321）。
【０００４】
一方、この方法の原理は、天然の蛍光性脂肪酸（パリナリン酸）がパリナリウム油（parinarium oil）に存在することであり、この酸は４個の共役二重結合を有するので、その結果、紫外領域の光を吸収し、その光を蛍光現象を介して放出する。リパーゼの加水分解作用を受けて元のトリグリセリドからパリナリン酸が放出され、これがミセル相に可溶化される。この（乳化相からミセル相への）相変化に伴って、蛍光スペクトル放射が変化するので、この変化を利用して、加水分解反応の経時的進行を高感度でモニターしている。
【０００５】
この蛍光法の制約の１つは、パリナリン酸の４個の共役二重結合が、大気中の酸素によって酸化されやすいことに関連する。この理由から、本発明者らは、アブラギリから抽出され、大昔から中国漆の製造に用いられている油（キリ油）に同上の測定原理を移した。この油は、高い割合でα−エレオステアリン酸を含有しており、この酸は共役二重結合を３個しか有しておらず、蛍光性はないが、紫外線を吸収する。また、この酸は、パリナリン酸よりもはるかに酸化されにくい。このため、本発明らは、一方ではα−エレオステアリン酸の紫外吸収特性を、他方では上記の（乳化相からミセル相への）相変化を利用することによって、Pencreac'h G.、Graille J.、Pina M.およびVerger R.の論文(2002); An ultraviolet spectrophotometric assay for measuring lipase activity using long-chain triacylglycerols from Aleurites fordii seeds. Anal. Biochem. 303: 17-24に記載されている、いわゆる「エマルション」法を発展させた。
【０００６】
これらの研究成果の枠組みの中で、本発明らは、キリ油の精製トリグリセリドを使用して、（紫外線を吸収しないプラスチック材料から構成される）微量滴定プレートのウェルを非常に薄い膜（数百の単分子層に相当）で被覆した。トリグリセリドのこの薄膜は各種の水性緩衝液ですすいだ後でもウェルの壁に完全に付着したままであることを本発明らは実証した。上記のように、各種リパーゼの加水分解作用（油水界面における）を受けて、α−エレオステアリン酸が遊離しミセル相中に可溶化される。結果として、α−エレオステアリン酸の紫外線吸収スペクトルが変化し、また他方では、吸着状態から溶解状態に移行した結果、光学経路が大幅に増大して、「被覆」技術にとって大きな利点となる。
【０００７】
本発明者は、脂質（天然トリグリセリドまたは合成エステル）で「被覆」するこの新規技術は従来の「エマルション」技術に比べて次のような利点を有している事実を実証し、本発明はそれにより作成された。
− 経時的保存性は、微量滴定プレートのウェルに吸着（または「被覆」）した脂質基質の方が良好である、
− リパーゼ活性は、エマルション基質上よりも「被覆」基質上の方が高い、
− 実験の再現性は、「被覆」基質を用いた方が良好である、
− 吸着状態から溶解状態への移行の結果として光学経路が増大されるため、信号対雑音比がより好ましくなる。
【０００８】
このため、本発明の目的は、リパーゼ活性の新規な測定方法であって、当技術分野で現在までに記載された方法よりもさらに特異的、定量的で感度がよく、そして、リパーゼの天然基質を使用して、極めて低い脂肪分解活性（サーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（Thermomyces lanuginosus Lipase）「ＴＬＬ」の約２ngという微少量に相当する）の測定を可能にする方法を提供する。
【０００９】
また、本発明の目的は、「ファージディスプレイ」技術によって生成される可能性のある多数のリパーゼ変異体を、高フローレートでスクリーニングするのを可能にする、リパーゼ活性の新規な測定方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明の目的は、高フローレートでリパーゼ活性を測定することにより、エナンチオ選択的な変異体とリパーゼを選択するために、医薬的およびバイオテクノロジー的に重要で、α−エレオステアリン酸を含有するキラルエステルを使用するリパーゼ活性の、新規な測定方法を提供することである。このようにして選択された突然変異体は、医薬および農業食品で重要な分子を不斉合成するための酵素触媒として役立つ可能性がある。
【００１１】
また、本発明の目的は、リパーゼ活性の新規な測定方法であって、種々の膵臓疾患の早期診断時に血漿中リパーゼ過剰症を測定するためのヒト臨床医療で使用できる方法の提供である。
【００１２】
本発明は、天然起源または合成起源のリパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料において、該リパーゼまたは該ホスホリパーゼの特性であるリパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する方法であって、
− 水溶液中に該リパーゼまたは該ホスホリパーゼを含有する可能性のある上記試料を、該リパーゼまたは該ホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を、遊離可能な脂質基質の厚さが約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの層で被覆した微量滴定プレートのウェルに添加し、遊離したα−エレオステアリン酸を、該水溶液中のミセル相に可溶化すること、
− 前工程中に遊離されたα−エレオステアリン酸の紫外線吸収スペクトルを分光光度測定することによって、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を検出および／または測定すること、
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１３】
天然起源または合成起源のリパーゼまたはホスホリパーゼとは、哺乳類または微生物（バクテリア、菌類など）の任意のリパーゼまたはホスホリパーゼであって、適切であれば、１種以上のアミノ酸の突然変異によって変性されるものを意味する。リパーゼ活性は、特にBeissonら（Beisson F. Tiss A. Riviere C.およびVerger R. (2000); Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2: 133-153）に記載されている方法に従う、標準的な仕方で測定することができる。リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性は、例えば、Wolfら（Wolf C. Sagaert L.およびBereziat G. (1981) A sensitive assay of phospholipases using the fluorescent probe 2-parinaroyllecithin. Biochem. Biophys. Res. Com. 99: 275-283）に記載されている方法で測定することができ、その文献では、パリナリン酸を含有する合成リン脂質を用いて、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２の酵素活性が測定された。
【００１４】
より詳細には、本発明は、前記リパーゼまたは前記ホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質が、α−エレオステアラート（eleostearate）基が共有結合されている、工業上および／または医薬上重要な分子から選択される脂質であり、特に：
− 一般式、
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、約１２〜２０個の炭素原子を含み、好ましくは１８個の炭素原子を含み、場合により１以上の不飽和を有する、同一のまたは異なる脂肪酸の残基を表する）のキリ油の精製トリグリセリド、（ｓｎは、立体位置特定の番号付けを意味する）
− 目的のリパーゼまたはホスホリパーゼの位置選択性の種類に応じて、適切な位置に１個または２個のα−エレオステアラート（eleostearate）鎖を含む、ジグリセリドおよびモノグリセリド、またはコレステロールエステルもしくはリン脂質、
− 次式のシトロネロールα−エレオステアラート、
【化４】
− または、他のアルコールまたはプロキラルまたはキラルな医薬的に重要な分子、例えばβ−ブロッカーとして用いられるプロパノロール、ソタロールもしくはカルベジロール、または工業的に重要な分子、例えばメントール（香料として重要なテルペン誘導体）とのα−エレオステアラートの酸エステル、
から選択されることを特徴とする、前記の方法に関する。
【００１５】
特に、上記のＲ１およびＲ３が、約１２〜２０個の炭素原子、好ましくは１８個の炭素原子を含み、場合により１個以上の不飽和を有する、同一のまたは異なる脂肪酸の残基を表しており、かつ、Ｒ２がα−エレオステアリン酸を表わす合成トリグリセリドは、特異的なｓｎ−２リパーゼ（すなわち、トリグリセリドのｓｎ−２位置に存在する脂肪酸を遊離することができる）のスクリーニングを可能にする。同様に、ｓｎ−１位置および／またはｓｎ−２位置にα−エレオステアリン酸を含む合成リン脂質は、ホスホリパーゼＡ１および／またはホスホリパーゼＡ２の酵素活性を測定することを可能にする。ここで、ホスホリパーゼＡ１は、グリセロリン脂質のｓｎ−１位置に存在する脂肪酸を遊離できる酵素として定義され、ホスホリパーゼＡ２は、グリセロリン脂質のｓｎ−２位置に存在する脂肪酸を遊離できる酵素として定義される。
【００１６】
キリ油における有意量の脂肪酸は、α−エレオステアリン酸（７０〜８０％）、オレイン酸（１０％）、およびリノール酸（１５％）であり、これは特にRadunzら（A. Radunz, P. HeおよびG. H. Schmid; Analysis of the seed lipids of Aleurites montana. Z. Naturforsch. 53 (1998), pp. 305-310）に記載されている。
【００１７】
また、本発明は、リパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料を微量滴定プレートのウェルに添加する前に、トリス塩および胆汁塩（ＮａＴＤＣ）と、適切であればβ−シクロデキストリンとから構成され、特にＮａＴＤＣ（４mM）およびβ−シクロデキストリン（３mg／mL）の割合の緩衝液を、脂質基質で被覆された微量滴定プレートのウェルに添加する工程を含むことを特徴とする、上記の方法に関する。
【００１８】
また、本発明の主題は、脂質基質で被覆された微量滴定プレートを作成するために:
− 脂質基質を溶液中に含む組成物を、真空下で蒸発可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテルに添加すること、この添加を行う前に、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄すること、
− 前記溶媒を真空下で蒸発させ、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの前記脂質基質の被覆を、微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
を特徴とする上記の方法でもある。
【００１９】
本発明のさらに特別な主題は、ヒトまたは動物における血漿リパーゼ過剰症のインビトロ測定方法であって、リパーゼを含有する試料が、ヒトまたは動物から採取された血液試料であることを特徴とする上記の方法である。
【００２０】
したがって、本発明は、ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇に関連する病理を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比においてインビトロ診断するのに、前記に定義した方法を利用することに関する。
【００２１】
本発明は、より詳細には：
− ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇を特徴とする膵臓疾患、例えば急性膵炎、慢性膵炎を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比において、
− または腎不全、腹部外傷（虚血、腸間膜梗塞、腸穿孔、または腸閉塞）を、
インビトロ診断するのに、前記に定義した方法を利用することに関する。
【００２２】
また、本発明は、リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離することが可能な脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートの製造方法であって、以下の工程：
− 脂質基質を溶液中に含む組成物を、真空下で蒸発可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテルに添加すること、この添加を行う前に、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄すること、
− 前記溶媒を真空下で蒸発させ、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの該脂質基質の被覆を、微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２３】
また、本発明の主題は、リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離することが可能な、脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートであって、これを上記方法によって作成し、該微量滴定プレートのウェルの壁に形成される前記脂質基質の被覆が、厚さ約０．５〜５μm、好ましくは１μmである微量滴定プレートである。
【００２４】
本発明のさらに特別な主題は、上記に定義されたリパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する方法を実施するにあたり、または、脂肪分解酵素の阻害剤（リパーゼまたはホスホリパーゼの阻害剤）をスクリーニングする方法を実施するにあたり、脂質基質で被覆されたウェルを含む上記の微量滴定プレートの使用であって、リパーゼまたはホスホリパーゼの活性をインビトロで検出および／または測定する本発明の方法によって、該酵素に対する阻害能を測定する工程を含む使用である。
【００２５】
本発明を更に説明するために、微量滴定プレートを用いてリパーゼ活性を測定する本発明の方法（いわゆる「被覆」法）の実施を、いわゆる「エマルション」法との対比において、以下に詳細説明する。
【００２６】
この研究の実施にあたり、リパーゼ活性の検討を並行して行うために、脂質（天然トリグリセリドまたは合成エステル）で「被覆」するか、または管内に予めエマルションを製造してからその試料をマイクロプレートウエルに分配した（図１）。
【００２７】
この研究では、鏡像異性体エステル（ＲまたはＳシトロネロールα−エレオステアラート）を用いて「被覆」と「エマルション」が対比され、これらの基質をマイクロプレート上に「被覆」すると、数種の利点があることが明確に示された。
【００２８】
１． 経時的な保存性は被覆基質の方が良好であること
シトロネロールα−エレオステアラートの溶液を、マイクロプレートの９６個のウェルに「被覆」した（ウェルごとに８０μg）。次に、「被覆」から異なる日数が経過した後に、サーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（ＴＬＬ）（最終濃度１０nM）の活性を試験した。マイクロプレートを、ウェル内に緩衝剤があり、またはなしに、４℃で保存した。図２ａのグラフから見られるように、リパーゼの活性は時間が経過しても一定に保たれており、マイクロプレートへの基質の結合は、再現可能で、少なくとも２０日間安定していることが示される。
【００２９】
並行して、２０μm／mLのＳシトロネロールα−エレオステアラートのエマルションを製造するために、１２μLのエステル溶液（エタノール−ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）０．００１％中に５mg／mL）をリパーゼ活性緩衝剤（ｑｓ ３mL）に注入し、次にエタノールのフラッシュを行う。次に、この溶液を２分間「ボルテックス」で攪拌する。乳化後の異なる時点においてＴＬＬ（１０nM）の活性を測定することによって、エマルションの安定性を試験した。リパーゼの活性は、時間の経過に伴って一定ではなく、エマルションの作成後３０分で大幅に低下する（図２ｂ）。これらの結果から、エマルションは保存することができず、作成後直ちに使用しなければならないことが判る。これは、前もつて数日前に作成することができるマイクロプレート基質の「被覆」に比べ、大きな欠点である。
【００３０】
２． リパーゼ活性がエマルションよりも「被覆された」基質で高いこと
リパーゼ活性は、エマルション基質よりも「被覆された」基質における方に高い（図３参照）。
【００３１】
３． 実験の再現性は「被覆された」基質の方が良好であること
８回の実験にわたる平均および標準偏差を計算して得られた結果の分散は、エマルション基質の方が大きい（図３）。さらに、再現可能な方法でエマルションを作成することは、困難である（上記を参照）。
【００３２】
結論として、このマイクロプレート試験の成果は、天然トリグリセリドを用いてリパーゼを迅速に、そして連続して測定する従来のあらゆる方法（Beissonら；Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000, 2: 133 - 153）に比べると、革新的な特徴を提示する方法であって、その特徴は、α−エレオステアリン酸が紫外部にスペクトル特性を有することに存する。これは感度がよく、再現可能な試験である。基質の「被覆」によって、マイクロプレートを予め作製し、格別の留意なしに少なくとも２週間冷所に保存することが可能である。他方、Pencreac'hらによって公開されている乳化技術（Anal Biochem. 2002; 303: 17-24）には、エマルションが不安定で、脂肪分解活性が低い等、数多くの欠点がある。
【００３３】
従来の公開物（Pencreac'hら；Anal Biochem. 2002; 303: 17-24）に比べ、本発明は、技術上の２つの重要な改良を提案する。
− 高フローレート： 公開された方法（Pencreac'hら、Anal Biochem. 2002; 303: 17-24）の原理を高フローレートシステム（９６穴ウェルのマイクロプレート）に適用すること、
− 微量滴定プレートのウェルに脂質基質を「被覆」することで、保存期間を大幅に延長すること。
【００３４】
脂肪分解酵素の阻害剤をスクリーニングする方法の実施に本発明プレートの使用
リパーゼまたはホスホリパーゼＡ１もしくはＡ２によって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質で被覆したウェルを含む、本発明の方法によって得られた、微量滴定プレートはリパーゼまたはホスホリパーゼＡ１もしくはＡ２の阻害剤の高フローレートによるスクリーニング、およびその阻害度の測定に使用される。
【００３５】
テトラヒドロリプスタチンの例（オルリスタットまたはＴＨＬ）： 消化リパーゼの強力な阻害剤（次の諸論文を参照：Digestive lipases inhibition: an in vitro study. Tiss A. Miled N. Verger R. Gargouri Y. Abousalham A. (2004); Lipases and phospholipases in drug development from biochemistry to molecular pharmacology, Wiley VCH （Muller G.およびPetry S., Eds）、155, 193; Covalent inactivation of lipases. Ransac S. Gargouri Y. Marguet F. Buono G. Beglinger C. Hildebrand P. Lengsfeld H. Hadvary P. Verger R. (1997); Methods in Enzymol., 286, 190-231）。
【００３６】
脂質基質の「被覆」を有する微量滴定プレートを、上記の方法で作製する。トリス緩衝剤とβ−シクロデキストリン（３mg／ml）から構成される溶液をウェルに添加する。２７０nmでの光学濃度を時間の関数として５〜１０分間記録する（図４Ａおよび図４Ｂ参照）。ヒト膵リパーゼ（ＨＰＬ）溶液を、単独でまたはＴＨＬ（阻害剤）と共にプレインキュベートしてからウェルに注入する。次に酵素活性を時間の関数として記録するために、２７２nmでのＯＤを測定する（方法Ａ、図４Ａ）。ＨＰＬをＴＨＬと共に１〜１００または１〜５０のモル過剰で、１０分間プレインキュベーションすることによって、最初のリパーゼ活性をそれぞれ７５％または４０％減少する（図４Ａ参照）。
【００３７】
リパーゼ活性に対するＴＨＬの効果を測定するために、脂肪分解中にＴＨＬを注入する（方法Ｂ、図４Ｂ）。ＴＨＬ（最終濃度１０nMでの）の注入によって、ＨＰＬの活性は約４０％減少する。
【００３８】
結論
図４Ａおよび図４Ｂに示した結果を見ると、本発明がリパーゼの阻害度を高フローレートで測定するのに、したがってリパーゼならびにホスホリパーゼＡ１およびＡ２の阻害剤をスクリーニングするのに、完全に適していることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マイクロプレートの作製手順を「被覆」とエマルションの対比で表わす。脂質基質をマイクロプレートの各ウェルに吸着させる（「被覆」）か、エマルション中に作製してからマイクロプレートに沈着させる（エマルション）。
【図２ａ】吸着または乳化された脂質基質の安定性を表わす。図２ａでは、Ｓシトロネロール−α−エレオステアラート・エステル（ウェルごとに８０μg）による「被覆」によってマイクロプレートを調製し、４℃で数日間保存した。緩衝剤トリス（１０mM ｐＨ８．０）、ＣａＣｌ２（６mM）、ＥＤＴＡ（１mM）、ＢＨＴ（０．００１％）、およびβ−シクロデキストリン（３mg／mL）中のエステルによる「被覆」から異なる日数が経過した時点において、サーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（ＴＬＬ）（最終濃度１０nM）の脂肪分解活性を測定することによって、被覆の安定性を検討した。図２ａは、「被覆」後の数日間における相対酵素活性（％）を表わす。
【図２ｂ】吸着または乳化された脂質基質の安定性を表わす。図２ｂでは、Ｓシトロネロールα−エレオステアラートを２０μg／mL含むエマルションを製造し、微量滴定プレートの各ウェルに分配（２００μL）した。図２ａに関して上述したように、エマルションの安定性を試験するために、乳化後の異なる時点でＴＬＬの活性を測定する。
【図３】「被覆された」またはエマルション中の、Ｓシトロネロール−α−エレオステアラート・エステルについて測定されたＴＴＬの活性の再現性を表わす。緩衝剤トリス（１０mM ｐＨ８．０）、ＣａＣｌ２（６mM）、ＥＤＴＡ（１mM）、ＢＨＴ（０．００１％）およびβ−シクロデキストリン（３mg／mL）中で、マイクロプレート内で、吸着したＳシトロネロール−α−エレオステアラート・エステル（ウェルごとに８０μg）、またはエマルション中のＳシトロネロール−α−エレオステアラート・エステル（２０μg／mL）について、ＴＴＬ（４nM）の活性を試験した。速度は、１分ごとに現れるミリ単位の吸収度（mAU／min）で示されている。結果の変動は、実験条件ごとに行った８回の実験にわたって計算した。
【図４Ａ】ＴＨＯ（テトラヒドロリプスタチン）によるＨＰＬ（ヒト膵リパーゼ）の阻害の動力学を表わす。マイクロプレートを作製するために、キリ油から抽出しα−エレオステアリン酸を多く含有するトリグリセリドを「被覆」（ウェルごとに５０μm）した。トリス緩衝剤の溶液（２００μl）をウェルに添加する。ＨＰＬ単独の活性、またはＴＨＬと共にプレインキュベートしたＨＰＬの活性を測定するために光学濃度を記録する（方法Ａ、図４Ａ）。図４Ａは、２７２nmでの光学濃度（ＯＤ）を時間の関数として表わす。黒い円の付いた曲線は、単独のリパーゼＨＰＬに対応し、黒い四角の付いた曲線は、１：１００の比率でＴＨＬでプレインキュベートしたリパーゼＨＰＬに対応し、白い円の付いた曲線は、１：５０の比率でＴＨＬでプレインキュベートしたリパーゼＨＰＬに対応する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、異なる手順（方法Ｂ）に対応しており、ＨＰＬを（最終濃度２nMで）注入後、脂肪分解中にＴＨＬを（最終濃度１０nMで）反応媒体に注入する。
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を高速でインビトロ検出および／または測定する方法、ならびにその利用である。
【０００２】
リパーゼの検出および検定の分析的方法の開発は、長年にわたる研究テーマである（BeissonF.、Tiss A.、Riviere C.およびVerger R. (2000); Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2: 133-153）。
【０００３】
「ファージディスプレイ」技術によって生じたリパーゼの動態およびエナンチオ選択性を特定するために、非常に低いリパーゼ活性を検出する天然の蛍光性トリグリセリドが使用されている（Beisson F.、Ferte N.、Nari J.、Noat G.、Arondel V.およびVerger R. (1999); Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedings. J. Lipid Res. 40: 2313-2321）。
【０００４】
一方、この方法の原理は、天然の蛍光性脂肪酸（パリナリン酸）がパリナリウム油（parinarium oil）に存在することであり、この酸は４個の共役二重結合を有するので、その結果、紫外領域の光を吸収し、その光を蛍光現象を介して放出する。リパーゼの加水分解作用を受けて元のトリグリセリドからパリナリン酸が放出され、これがミセル相に可溶化される。この（乳化相からミセル相への）相変化に伴って、蛍光スペクトル放射が変化するので、この変化を利用して、加水分解反応の経時的進行を高感度でモニターしている。
【０００５】
この蛍光法の制約の１つは、パリナリン酸の４個の共役二重結合が、大気中の酸素によって酸化されやすいことに関連する。この理由から、本発明者らは、アブラギリから抽出され、大昔から中国漆の製造に用いられている油（キリ油）に同上の測定原理を移した。この油は、高い割合でα−エレオステアリン酸を含有しており、この酸は共役二重結合を３個しか有しておらず、蛍光性はないが、紫外線を吸収する。また、この酸は、パリナリン酸よりもはるかに酸化されにくい。このため、本発明らは、一方ではα−エレオステアリン酸の紫外吸収特性を、他方では上記の（乳化相からミセル相への）相変化を利用することによって、Pencreac'h G.、Graille J.、Pina M.およびVerger R.の論文(2002); An ultraviolet spectrophotometric assay for measuring lipase activity using long-chain triacylglycerols from Aleurites fordii seeds. Anal. Biochem. 303: 17-24に記載されている、いわゆる「エマルション」法を発展させた。
【０００６】
これらの研究成果の枠組みの中で、本発明らは、キリ油の精製トリグリセリドを使用して、（紫外線を吸収しないプラスチック材料から構成される）微量滴定プレートのウェルを非常に薄い膜（数百の単分子層に相当）で被覆した。トリグリセリドのこの薄膜は各種の水性緩衝液ですすいだ後でもウェルの壁に完全に付着したままであることを本発明らは実証した。上記のように、各種リパーゼの加水分解作用（油水界面における）を受けて、α−エレオステアリン酸が遊離しミセル相中に可溶化される。結果として、α−エレオステアリン酸の紫外線吸収スペクトルが変化し、また他方では、吸着状態から溶解状態に移行した結果、光学経路が大幅に増大して、「被覆」技術にとって大きな利点となる。
【０００７】
本発明者は、脂質（天然トリグリセリドまたは合成エステル）で「被覆」するこの新規技術は従来の「エマルション」技術に比べて次のような利点を有している事実を実証し、本発明はそれにより作成された。
− 経時的保存性は、微量滴定プレートのウェルに吸着（または「被覆」）した脂質基質の方が良好である、
− リパーゼ活性は、エマルション基質上よりも「被覆」基質上の方が高い、
− 実験の再現性は、「被覆」基質を用いた方が良好である、
− 吸着状態から溶解状態への移行の結果として光学経路が増大されるため、信号対雑音比がより好ましくなる。
【０００８】
このため、本発明の目的は、リパーゼ活性の新規な測定方法であって、当技術分野で現在までに記載された方法よりもさらに特異的、定量的で感度がよく、そして、リパーゼの天然基質を使用して、極めて低い脂肪分解活性（サーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（Thermomyces lanuginosus Lipase）「ＴＬＬ」の約２ngという微少量に相当する）の測定を可能にする方法を提供する。
【０００９】
また、本発明の目的は、「ファージディスプレイ」技術によって生成される可能性のある多数のリパーゼ変異体を、高フローレートでスクリーニングするのを可能にする、リパーゼ活性の新規な測定方法を提供することである。
【００１０】
また、本発明の目的は、高フローレートでリパーゼ活性を測定することにより、エナンチオ選択的な変異体とリパーゼを選択するために、医薬的およびバイオテクノロジー的に重要で、α−エレオステアリン酸を含有するキラルエステルを使用するリパーゼ活性の、新規な測定方法を提供することである。このようにして選択された突然変異体は、医薬および農業食品で重要な分子を不斉合成するための酵素触媒として役立つ可能性がある。
【００１１】
また、本発明の目的は、リパーゼ活性の新規な測定方法であって、種々の膵臓疾患の早期診断時に血漿中リパーゼ過剰症を測定するためのヒト臨床医療で使用できる方法の提供である。
【００１２】
本発明は、天然起源または合成起源のリパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料において、該リパーゼまたは該ホスホリパーゼの特性であるリパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する方法であって、
− 水溶液中に該リパーゼまたは該ホスホリパーゼを含有する可能性のある上記試料を、該リパーゼまたは該ホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を、遊離可能な脂質基質の厚さが約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの層で被覆した微量滴定プレートのウェルに添加し、遊離したα−エレオステアリン酸を、該水溶液中のミセル相に可溶化すること、
− 前工程中に遊離されたα−エレオステアリン酸の紫外線吸収スペクトルを分光光度測定することによって、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を検出および／または測定すること、
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００１３】
天然起源または合成起源のリパーゼまたはホスホリパーゼとは、哺乳類または微生物（バクテリア、菌類など）の任意のリパーゼまたはホスホリパーゼであって、適切であれば、１種以上のアミノ酸の突然変異によって変性されるものを意味する。リパーゼ活性は、特にBeissonら（Beisson F. Tiss A. Riviere C.およびVerger R. (2000); Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2: 133-153）に記載されている方法に従う、標準的な仕方で測定することができる。リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性は、例えば、Wolfら（Wolf C. Sagaert L.およびBereziat G. (1981) A sensitive assay of phospholipases using the fluorescent probe 2-parinaroyllecithin. Biochem. Biophys. Res. Com. 99: 275-283）に記載されている方法で測定することができ、その文献では、パリナリン酸を含有する合成リン脂質を用いて、ヘビ毒ホスホリパーゼＡ２の酵素活性が測定された。
【００１４】
より詳細には、本発明は、前記リパーゼまたは前記ホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質が、α−エレオステアラート（eleostearate）基が共有結合されている、工業上および／または医薬上重要な分子から選択される脂質であり、特に：
− 一般式、
【化３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、約１２〜２０個の炭素原子を含み、好ましくは１８個の炭素原子を含み、場合により１以上の不飽和を有する、同一のまたは異なる脂肪酸の残基を表する）のキリ油の精製トリグリセリド、（ｓｎは、立体位置特定の番号付けを意味する）
− 目的のリパーゼまたはホスホリパーゼの位置選択性の種類に応じて、適切な位置に１個または２個のα−エレオステアラート（eleostearate）鎖を含む、ジグリセリドおよびモノグリセリド、またはコレステロールエステルもしくはリン脂質、
− 次式のシトロネロールα−エレオステアラート、
【化４】
− または、他のアルコールまたはプロキラルまたはキラルな医薬的に重要な分子、例えばβ−ブロッカーとして用いられるプロパノロール、ソタロールもしくはカルベジロール、または工業的に重要な分子、例えばメントール（香料として重要なテルペン誘導体）とのα−エレオステアラートの酸エステル、
から選択されることを特徴とする、前記の方法に関する。
【００１５】
特に、上記のＲ１およびＲ３が、約１２〜２０個の炭素原子、好ましくは１８個の炭素原子を含み、場合により１個以上の不飽和を有する、同一のまたは異なる脂肪酸の残基を表しており、かつ、Ｒ２がα−エレオステアリン酸を表わす合成トリグリセリドは、特異的なｓｎ−２リパーゼ（すなわち、トリグリセリドのｓｎ−２位置に存在する脂肪酸を遊離することができる）のスクリーニングを可能にする。同様に、ｓｎ−１位置および／またはｓｎ−２位置にα−エレオステアリン酸を含む合成リン脂質は、ホスホリパーゼＡ１および／またはホスホリパーゼＡ２の酵素活性を測定することを可能にする。ここで、ホスホリパーゼＡ１は、グリセロリン脂質のｓｎ−１位置に存在する脂肪酸を遊離できる酵素として定義され、ホスホリパーゼＡ２は、グリセロリン脂質のｓｎ−２位置に存在する脂肪酸を遊離できる酵素として定義される。
【００１６】
キリ油における有意量の脂肪酸は、α−エレオステアリン酸（７０〜８０％）、オレイン酸（１０％）、およびリノール酸（１５％）であり、これは特にRadunzら（A. Radunz, P. HeおよびG. H. Schmid; Analysis of the seed lipids of Aleurites montana. Z. Naturforsch. 53 (1998), pp. 305-310）に記載されている。
【００１７】
また、本発明は、リパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料を微量滴定プレートのウェルに添加する前に、トリス塩および胆汁塩（ＮａＴＤＣ）と、適切であればβ−シクロデキストリンとから構成され、特にＮａＴＤＣ（４mM）およびβ−シクロデキストリン（３mg／mL）の割合の緩衝液を、脂質基質で被覆された微量滴定プレートのウェルに添加する工程を含むことを特徴とする、上記の方法に関する。
【００１８】
また、本発明の主題は、脂質基質で被覆された微量滴定プレートを作成するために:
− 脂質基質を溶液中に含む組成物を、真空下で蒸発可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテルに添加すること、この添加を行う前に、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄すること、
− 前記溶媒を真空下で蒸発させ、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの前記脂質基質の被覆を、微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
を特徴とする上記の方法でもある。
【００１９】
本発明のさらに特別な主題は、ヒトまたは動物における血漿リパーゼ過剰症のインビトロ測定方法であって、リパーゼを含有する試料が、ヒトまたは動物から採取された血液試料であることを特徴とする上記の方法である。
【００２０】
したがって、本発明は、ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇に関連する病理を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比においてインビトロ診断するのに、前記に定義した方法を利用することに関する。
【００２１】
本発明は、より詳細には：
− ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇を特徴とする膵臓疾患、例えば急性膵炎、慢性膵炎を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比において、
− または腎不全、腹部外傷（虚血、腸間膜梗塞、腸穿孔、または腸閉塞）を、
インビトロ診断するのに、前記に定義した方法を利用することに関する。
【００２２】
また、本発明は、リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離することが可能な脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートの製造方法であって、以下の工程：
− 脂質基質を溶液中に含む組成物を、真空下で蒸発可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテルに添加すること、この添加を行う前に、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄すること、
− 前記溶媒を真空下で蒸発させ、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの該脂質基質の被覆を、微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００２３】
また、本発明の主題は、リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離することが可能な、脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートであって、これを上記方法によって作成し、該微量滴定プレートのウェルの壁に形成される前記脂質基質の被覆が、厚さ約０．５〜５μm、好ましくは１μmである微量滴定プレートである。
【００２４】
本発明のさらに特別な主題は、上記に定義されたリパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する方法を実施するにあたり、または、脂肪分解酵素の阻害剤（リパーゼまたはホスホリパーゼの阻害剤）をスクリーニングする方法を実施するにあたり、脂質基質で被覆されたウェルを含む上記の微量滴定プレートの使用であって、リパーゼまたはホスホリパーゼの活性をインビトロで検出および／または測定する本発明の方法によって、該酵素に対する阻害能を測定する工程を含む使用である。
【００２５】
本発明を更に説明するために、微量滴定プレートを用いてリパーゼ活性を測定する本発明の方法（いわゆる「被覆」法）の実施を、いわゆる「エマルション」法との対比において、以下に詳細説明する。
【００２６】
この研究の実施にあたり、リパーゼ活性の検討を並行して行うために、脂質（天然トリグリセリドまたは合成エステル）で「被覆」するか、または管内に予めエマルションを製造してからその試料をマイクロプレートウエルに分配した（図１）。
【００２７】
この研究では、鏡像異性体エステル（ＲまたはＳシトロネロールα−エレオステアラート）を用いて「被覆」と「エマルション」が対比され、これらの基質をマイクロプレート上に「被覆」すると、数種の利点があることが明確に示された。
【００２８】
１． 経時的な保存性は被覆基質の方が良好であること
シトロネロールα−エレオステアラートの溶液を、マイクロプレートの９６個のウェルに「被覆」した（ウェルごとに８０μg）。次に、「被覆」から異なる日数が経過した後に、サーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（ＴＬＬ）（最終濃度１０nM）の活性を試験した。マイクロプレートを、ウェル内に緩衝剤があり、またはなしに、４℃で保存した。図２ａのグラフから見られるように、リパーゼの活性は時間が経過しても一定に保たれており、マイクロプレートへの基質の結合は、再現可能で、少なくとも２０日間安定していることが示される。
【００２９】
並行して、２０μm／mLのＳシトロネロールα−エレオステアラートのエマルションを製造するために、１２μLのエステル溶液（エタノール−ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）０．００１％中に５mg／mL）をリパーゼ活性緩衝剤（ｑｓ ３mL）に注入し、次にエタノールのフラッシュを行う。次に、この溶液を２分間「ボルテックス」で攪拌する。乳化後の異なる時点においてＴＬＬ（１０nM）の活性を測定することによって、エマルションの安定性を試験した。リパーゼの活性は、時間の経過に伴って一定ではなく、エマルションの作成後３０分で大幅に低下する（図２ｂ）。これらの結果から、エマルションは保存することができず、作成後直ちに使用しなければならないことが判る。これは、前もつて数日前に作成することができるマイクロプレート基質の「被覆」に比べ、大きな欠点である。
【００３０】
２． リパーゼ活性がエマルションよりも「被覆された」基質で高いこと
リパーゼ活性は、エマルション基質よりも「被覆された」基質における方に高い（図３参照）。
【００３１】
３． 実験の再現性は「被覆された」基質の方が良好であること
８回の実験にわたる平均および標準偏差を計算して得られた結果の分散は、エマルション基質の方が大きい（図３）。さらに、再現可能な方法でエマルションを作成することは、困難である（上記を参照）。
【００３２】
結論として、このマイクロプレート試験の成果は、天然トリグリセリドを用いてリパーゼを迅速に、そして連続して測定する従来のあらゆる方法（Beissonら；Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000, 2: 133 - 153）に比べると、革新的な特徴を提示する方法であって、その特徴は、α−エレオステアリン酸が紫外部にスペクトル特性を有することに存する。これは感度がよく、再現可能な試験である。基質の「被覆」によって、マイクロプレートを予め作製し、格別の留意なしに少なくとも２週間冷所に保存することが可能である。他方、Pencreac'hらによって公開されている乳化技術（Anal Biochem. 2002; 303: 17-24）には、エマルションが不安定で、脂肪分解活性が低い等、数多くの欠点がある。
【００３３】
従来の公開物（Pencreac'hら；Anal Biochem. 2002; 303: 17-24）に比べ、本発明は、技術上の２つの重要な改良を提案する。
− 高フローレート： 公開された方法（Pencreac'hら、Anal Biochem. 2002; 303: 17-24）の原理を高フローレートシステム（９６穴ウェルのマイクロプレート）に適用すること、
− 微量滴定プレートのウェルに脂質基質を「被覆」することで、保存期間を大幅に延長すること。
【００３４】
脂肪分解酵素の阻害剤をスクリーニングする方法の実施に本発明プレートの使用
リパーゼまたはホスホリパーゼＡ１もしくはＡ２によって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質で被覆したウェルを含む、本発明の方法によって得られた、微量滴定プレートはリパーゼまたはホスホリパーゼＡ１もしくはＡ２の阻害剤の高フローレートによるスクリーニング、およびその阻害度の測定に使用される。
【００３５】
テトラヒドロリプスタチンの例（オルリスタットまたはＴＨＬ）： 消化リパーゼの強力な阻害剤（次の諸論文を参照：Digestive lipases inhibition: an in vitro study. Tiss A. Miled N. Verger R. Gargouri Y. Abousalham A. (2004); Lipases and phospholipases in drug development from biochemistry to molecular pharmacology, Wiley VCH （Muller G.およびPetry S., Eds）、155, 193; Covalent inactivation of lipases. Ransac S. Gargouri Y. Marguet F. Buono G. Beglinger C. Hildebrand P. Lengsfeld H. Hadvary P. Verger R. (1997); Methods in Enzymol., 286, 190-231）。
【００３６】
脂質基質の「被覆」を有する微量滴定プレートを、上記の方法で作製する。トリス緩衝剤とβ−シクロデキストリン（３mg／ml）から構成される溶液をウェルに添加する。２７０nmでの光学濃度を時間の関数として５〜１０分間記録する（図４Ａおよび図４Ｂ参照）。ヒト膵リパーゼ（ＨＰＬ）溶液を、単独でまたはＴＨＬ（阻害剤）と共にプレインキュベートしてからウェルに注入する。次に酵素活性を時間の関数として記録するために、２７２nmでのＯＤを測定する（方法Ａ、図４Ａ）。ＨＰＬをＴＨＬと共に１〜１００または１〜５０のモル過剰で、１０分間プレインキュベーションすることによって、最初のリパーゼ活性をそれぞれ７５％または４０％減少する（図４Ａ参照）。
【００３７】
リパーゼ活性に対するＴＨＬの効果を測定するために、脂肪分解中にＴＨＬを注入する（方法Ｂ、図４Ｂ）。ＴＨＬ（最終濃度１０nMでの）の注入によって、ＨＰＬの活性は約４０％減少する。
【００３８】
結論
図４Ａおよび図４Ｂに示した結果を見ると、本発明がリパーゼの阻害度を高フローレートで測定するのに、したがってリパーゼならびにホスホリパーゼＡ１およびＡ２の阻害剤をスクリーニングするのに、完全に適していることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マイクロプレートの作製手順を「被覆」とエマルションの対比で表わす。脂質基質をマイクロプレートの各ウェルに吸着させる（「被覆」）か、エマルション中に作製してからマイクロプレートに沈着させる（エマルション）。
【図２ａ】吸着または乳化された脂質基質の安定性を表わす。図２ａでは、Ｓシトロネロール−α−エレオステアラート・エステル（ウェルごとに８０μg）による「被覆」によってマイクロプレートを調製し、４℃で数日間保存した。緩衝剤トリス（１０mM ｐＨ８．０）、ＣａＣｌ２（６mM）、ＥＤＴＡ（１mM）、ＢＨＴ（０．００１％）、およびβ−シクロデキストリン（３mg／mL）中のエステルによる「被覆」から異なる日数が経過した時点において、サーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（ＴＬＬ）（最終濃度１０nM）の脂肪分解活性を測定することによって、被覆の安定性を検討した。図２ａは、「被覆」後の数日間における相対酵素活性（％）を表わす。
【図２ｂ】吸着または乳化された脂質基質の安定性を表わす。図２ｂでは、Ｓシトロネロールα−エレオステアラートを２０μg／mL含むエマルションを製造し、微量滴定プレートの各ウェルに分配（２００μL）した。図２ａに関して上述したように、エマルションの安定性を試験するために、乳化後の異なる時点でＴＬＬの活性を測定する。
【図３】「被覆された」またはエマルション中の、Ｓシトロネロール−α−エレオステアラート・エステルについて測定されたＴＴＬの活性の再現性を表わす。緩衝剤トリス（１０mM ｐＨ８．０）、ＣａＣｌ２（６mM）、ＥＤＴＡ（１mM）、ＢＨＴ（０．００１％）およびβ−シクロデキストリン（３mg／mL）中で、マイクロプレート内で、吸着したＳシトロネロール−α−エレオステアラート・エステル（ウェルごとに８０μg）、またはエマルション中のＳシトロネロール−α−エレオステアラート・エステル（２０μg／mL）について、ＴＴＬ（４nM）の活性を試験した。速度は、１分ごとに現れるミリ単位の吸収度（mAU／min）で示されている。結果の変動は、実験条件ごとに行った８回の実験にわたって計算した。
【図４Ａ】ＴＨＯ（テトラヒドロリプスタチン）によるＨＰＬ（ヒト膵リパーゼ）の阻害の動力学を表わす。マイクロプレートを作製するために、キリ油から抽出しα−エレオステアリン酸を多く含有するトリグリセリドを「被覆」（ウェルごとに５０μm）した。トリス緩衝剤の溶液（２００μl）をウェルに添加する。ＨＰＬ単独の活性、またはＴＨＬと共にプレインキュベートしたＨＰＬの活性を測定するために光学濃度を記録する（方法Ａ、図４Ａ）。図４Ａは、２７２nmでの光学濃度（ＯＤ）を時間の関数として表わす。黒い円の付いた曲線は、単独のリパーゼＨＰＬに対応し、黒い四角の付いた曲線は、１：１００の比率でＴＨＬでプレインキュベートしたリパーゼＨＰＬに対応し、白い円の付いた曲線は、１：５０の比率でＴＨＬでプレインキュベートしたリパーゼＨＰＬに対応する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、異なる手順（方法Ｂ）に対応しており、ＨＰＬを（最終濃度２nMで）注入後、脂肪分解中にＴＨＬを（最終濃度１０nMで）反応媒体に注入する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然起源または合成起源のリパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料において、リパーゼまたはホスホリパーゼの特性であるリパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する方法であって、
− 水溶液の前記リパーゼまたは前記ホスホリパーゼを含有する可能性のある試料を、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの、前記リパーゼまたは前記ホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質の層で被覆した微量滴定プレートのウェルに添加し、遊離したα−エレオステアリン酸を前記水溶液中のミセル相に可溶化すること、
− 前工程中に遊離されたα−エレオステアリン酸の紫外線吸収スペクトルを、分光光度測定することによって、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を検出および／または測定すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質が、以下：
− 一般式、
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、約１２〜２０個、好ましくは１８個の炭素原子を含み、場合により１以上の不飽和を有する、同一のまたは異なる脂肪酸の残基を表す）
のキリ油の精製トリグリセリド、
− 目的のリパーゼまたはホスホリパーゼの位置選択性の種類に応じて適切な位置に、１個または２個のα−エレオステアラート鎖を含む、ジグリセリドおよびモノグリセリド、またはコレステロールエステルもしくはリン脂質、
− 次式のシトロネロールα−エレオステアラート、
【化２】
− あるいは、他のアルコールまたはプロキラルまたはキラルな医薬素材の分子（例えばプロパノロール、ソタロールもしくはカルベジロール）または工業素材の分子（例えばメントール）とのα−エレオステアラートの酸エステル、
から選択されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料を微量滴定プレートのウェルに添加する前に、トリスおよび胆汁塩（ＮａＴＤＣ）と、適切であればβ−シクロデキストリンとから構成される緩衝液を、脂質基質で被覆された該微量滴定プレートのウェルに添加する工程を含むことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
脂質基質で被覆された微量滴定プレートを、
− 脂質基質を溶液中に含む組成物を、真空下で留去可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテルに添加すること、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄した後に、この添加を行うこと、
− 前記溶媒を真空下で留去し、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの前記脂質基質の被覆を微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
によって得ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
リパーゼを含有する試料が、ヒトまたは動物から採取された血液試料であることを特徴とする、ヒトまたは動物の血漿リパーゼ過剰症をインビトロで測定するための請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇に関連する病理を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比においてインビトロ診断するための、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法の利用。
【請求項７】
− ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇を特徴とする膵臓疾患、例えば急性膵炎、慢性膵炎を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比において、
− または腎不全、腹部外傷（虚血、腸間膜梗塞、腸穿孔、腸閉塞）を、
インビトロ診断するにあたり、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法の、請求項６記載の利用。
【請求項８】
リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートの製造方法であって、以下の工程：
− 脂質基質を、真空下で留去可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテル中の溶液に含む組成物を、上記プレートのウェルに添加すること、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄した後に、この添加を行うこと、
− 前記溶媒を真空下で留去させ、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの前記脂質基質の被覆を微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８の方法によって得られるリパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートであって、微量滴定プレートのウェルの壁に形成される前記脂質基質の被覆が、厚さ約０．５〜５μm、好ましくは１μmである微量滴定プレート。
【請求項１０】
リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する請求項１〜７のいずれか一項記載の方法を実施するための、または、脂肪分解酵素の阻害剤をスクリーニングする方法を実施するための、請求項９記載のプレートの使用。
【請求項１】
天然起源または合成起源のリパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料において、リパーゼまたはホスホリパーゼの特性であるリパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する方法であって、
− 水溶液の前記リパーゼまたは前記ホスホリパーゼを含有する可能性のある試料を、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの、前記リパーゼまたは前記ホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質の層で被覆した微量滴定プレートのウェルに添加し、遊離したα−エレオステアリン酸を前記水溶液中のミセル相に可溶化すること、
− 前工程中に遊離されたα−エレオステアリン酸の紫外線吸収スペクトルを、分光光度測定することによって、リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性を検出および／または測定すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質が、以下：
− 一般式、
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、約１２〜２０個、好ましくは１８個の炭素原子を含み、場合により１以上の不飽和を有する、同一のまたは異なる脂肪酸の残基を表す）
のキリ油の精製トリグリセリド、
− 目的のリパーゼまたはホスホリパーゼの位置選択性の種類に応じて適切な位置に、１個または２個のα−エレオステアラート鎖を含む、ジグリセリドおよびモノグリセリド、またはコレステロールエステルもしくはリン脂質、
− 次式のシトロネロールα−エレオステアラート、
【化２】
− あるいは、他のアルコールまたはプロキラルまたはキラルな医薬素材の分子（例えばプロパノロール、ソタロールもしくはカルベジロール）または工業素材の分子（例えばメントール）とのα−エレオステアラートの酸エステル、
から選択されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リパーゼまたはホスホリパーゼを含有する可能性のある試料を微量滴定プレートのウェルに添加する前に、トリスおよび胆汁塩（ＮａＴＤＣ）と、適切であればβ−シクロデキストリンとから構成される緩衝液を、脂質基質で被覆された該微量滴定プレートのウェルに添加する工程を含むことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
脂質基質で被覆された微量滴定プレートを、
− 脂質基質を溶液中に含む組成物を、真空下で留去可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテルに添加すること、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄した後に、この添加を行うこと、
− 前記溶媒を真空下で留去し、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの前記脂質基質の被覆を微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
によって得ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
リパーゼを含有する試料が、ヒトまたは動物から採取された血液試料であることを特徴とする、ヒトまたは動物の血漿リパーゼ過剰症をインビトロで測定するための請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇に関連する病理を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比においてインビトロ診断するための、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法の利用。
【請求項７】
− ヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度の上昇を特徴とする膵臓疾患、例えば急性膵炎、慢性膵炎を、健常なヒトまたは動物における血漿リパーゼ濃度との対比において、
− または腎不全、腹部外傷（虚血、腸間膜梗塞、腸穿孔、腸閉塞）を、
インビトロ診断するにあたり、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法の、請求項６記載の利用。
【請求項８】
リパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートの製造方法であって、以下の工程：
− 脂質基質を、真空下で留去可能な適切な溶媒、例えばヘキサンまたは石油エーテル中の溶液に含む組成物を、上記プレートのウェルに添加すること、適切であれば、前記プレートのウェルを前記溶媒で洗浄した後に、この添加を行うこと、
− 前記溶媒を真空下で留去させ、厚さ約０．５〜約５μm、好ましくは約１μmの前記脂質基質の被覆を微量滴定プレートのウェルの壁に形成すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８の方法によって得られるリパーゼまたはホスホリパーゼによって加水分解されてα−エレオステアリン酸を遊離可能な脂質基質で被覆したウェルを含む微量滴定プレートであって、微量滴定プレートのウェルの壁に形成される前記脂質基質の被覆が、厚さ約０．５〜５μm、好ましくは１μmである微量滴定プレート。
【請求項１０】
リパーゼ活性またはホスホリパーゼ活性をインビトロで検出および／または測定する請求項１〜７のいずれか一項記載の方法を実施するための、または、脂肪分解酵素の阻害剤をスクリーニングする方法を実施するための、請求項９記載のプレートの使用。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５２９５１２（Ｐ２００８−５２９５１２Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５４６０２（Ｐ２００７−５５４６０２）
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００３１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５００９
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００６／０００３１０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５００９
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
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