リポペプチド及びその遺伝子
【課題】トル様受容体２（ＴＬＲ２）における炎症反応の抑制物質スクリーニングに有用なリポペプチドの提供。
【解決手段】歯周病原因菌であるポルフィロモナス ジンジバリス由来で、ＴＬＲ２により認識され、炎症反応を誘導するリポペプチド及びその遺伝子であり、リポタンパク（ポリペプチド）を単離、精製又はその構造から化学合成する。
【効果】本リポペプチドは、ＴＬＲ２を介する炎症反応を抑制する物質のスクリーニング等に応用することができ、歯周病の予防及び／又は治療において多大な貢献を期待できる。
【解決手段】歯周病原因菌であるポルフィロモナス ジンジバリス由来で、ＴＬＲ２により認識され、炎症反応を誘導するリポペプチド及びその遺伝子であり、リポタンパク（ポリペプチド）を単離、精製又はその構造から化学合成する。
【効果】本リポペプチドは、ＴＬＲ２を介する炎症反応を抑制する物質のスクリーニング等に応用することができ、歯周病の予防及び／又は治療において多大な貢献を期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トル様受容体２により認識されるポルフィロモナス ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来のリポペプチド、その遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、外来微生物に対して、直接シグナル伝達系を活性化できる膜タンパクシステムが明らかになってきた。これはトル（Ｔｏｌｌ）様受容体といわれる膜タンパクである。トル様受容体は、ヒトではＴｏｌｌ様受容体２，４を含め１０種類が知られている。Ｔｏｌｌ様受容体が、微生物由来の物質を認識すると、受容体が直接シグナル伝達系を刺激してサイトカインの発現が誘導され、炎症反応が生じる。
【０００３】
トル様受容体が認識する分子構造としては、リポ多糖（以下、ＬＰＳ）が知られている。ＬＰＳは、大腸菌（エシェリヒア コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に代表されるグラム陰性菌の細胞壁外膜に存在する複合糖質で、オリゴ糖の繰り返し構造を持つＯ抗原多糖部分と脂肪酸を含む疎水性のリピドＡと呼ばれる部分から構成されている。これは、菌体を温水−フェノール抽出することによって得られる画分中に含まれている（非特許文献１）。
【０００４】
ＬＰＳは、ヒトや動物に対して強力な炎症誘導作用や致死毒性等の内毒素活性とともに免疫賦活作用を示すことが知られている。すなわち、ＬＰＳは、マクロファージを活性化することによりサイトカイン等の炎症性因子を誘導し、グラム陰性菌による敗血症患者にみられるような炎症性疾患、多臓器不全を誘発し死に至らしめることがある。これら活性を示す最小構造は、ＬＰＳ中のリピドＡ部分であることが化学合成標品を用いた解析から明らかにされている。
【０００５】
具体的には、トル様受容体４（以下、ＴＬＲ４）及びその結合タンパク質であるＭＤ−２が、大腸菌由来ＬＰＳ（以下Ｅｃ−ＬＰＳ）画分を認識し、シグナル伝達受容体として働くことが示されている（非特許文献２）。また、他の腸内細菌科の細菌由来ＬＰＳ画分も同じ受容体と反応する。さらに、ＬＰＳの活性を示す最小構造であるリピドＡも、ＴＬＲ４やＭＤ−２を介して認識されることが明らかにされている。ＴＬＲ４やＭＤ−２は、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６等の細胞内シグナル伝達タンパク質を介して、ＮＦ−κＢを活性化し、種々の炎症性因子の産生を誘導することから、ＬＰＳの内毒素活性の主要な受容体であると考えられる。
【０００６】
一方、歯周病の主たる原因菌とされるポルフィロモナス ジンジバリス由来のＬＰＳ（以下、Ｐｇ−ＬＰＳ）画分やそのリピドＡ（以下、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡ）画分の受容体は、ＴＬＲ４やＭＤ２ではなく、ＴＬＲ２であることが報告されている（非特許文献３）。また、プレボテラ インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）やレプトスピラ インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）等の腸内細菌科に属さない細菌由来のＬＰＳ画分もＴＬＲ２を受容体とし、ＴＬＲ２依存的にシグナル伝達することが報告されている（非特許文献４，５）。これは、上記微生物由来ＬＰＳのリピドＡ分子の化学構造が、大腸菌由来のリピドＡと異なっていることから、受容体の認識に差異が生じると考えられてきた（非特許文献６）。
【０００７】
しかしながら、我々は最近、高度に精製したポルフィロモナス ジンジバリス由来のＰｇ−ｌｉｐｉｄＡ及びその化学合成標品を用いて検討した結果、その受容体として、ＴＬＲ２ではなく、Ｅｃ−ＬＰＳと同様にＴＬＲ４やＭＤ−２がシグナル伝達受容体として働いていることを明らかにした（非特許文献７）。また、高度に精製されたプレボテラ インターメディア由来のリピドＡにおいても同様の結果を得た（非特許文献８）。さらに別のグループの研究者らにより、Ｐｇ−ＬＰＳがＴＬＲ４と相互作用することにより、Ｅｃ−ＬＰＳのＴＬＲ４依存的な細胞活性化を抑制することが示された（非特許文献９）。これらの所見は、ポルフィロモナス ジンジバリスをはじめとする腸内細菌科に属さない細菌由来のＬＰＳもＴＬＲ４やＭＤ−２により認識されることを示しており、Ｐｇ−ＬＰＳ画分中にＴＬＲ２を受容体として、シグナル伝達する成分が混入していることを強く示唆しているものである。
【０００８】
ＴＬＲ２は、ほとんどすべての細菌に含まれる成分として知られるペプチドグリカンや細菌由来リポタンパク質を認識して細胞内のシグナル伝達を活性化する（非特許文献２）。市販のＥｃ−ＬＰＳもＴＬＲ４やＭＤ−２のみならず、ＴＬＲ２を受容体として、細胞内のシグナル伝達を活性化することが知られている（非特許文献１０）。しかしながら、このＴＬＲ２依存的シグナル伝達活性化は、デオキシコール酸−フェノール−水系を用いてＥｃ−ＬＰＳを再抽出することにより除去することが可能であり（非特許文献１０）、その微量成分がリポタンパク質であることが明らかにされた（非特許文献１１）。他方、Ｐｇ−ＬＰＳ画分中のＴＬＲ２により認識される成分は、再抽出により分離できないことが報告されており（非特許文献３，４）、その成分の本体については未だ不明のままであった。以上のことから、ポルフィロモナス ジンジバリス由来のトル様受容体２により認識される物質の解明が望まれていた。
【０００９】
【非特許文献１】リッシェル Ｅ．Ｔ．（Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ，Ｅ．Ｔ．）、「カレント トピックス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、１９９６年、第２１６巻、ｐ３９−８１
【非特許文献２】アンダーヒル Ｄ．Ｍ．（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．）、「カレント オピニオン イン イムノロジー（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００１年、１４巻、ｐ１０３−１１０
【非特許文献３】ハーシュフェルド Ｍ（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｍ．）、「インフェクション アンド イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）」、２００１年、６９巻、ｐ１４７７−１４８２
【非特許文献４】キリカ Ｔ（Ｋｉｒｉｋａｅ，Ｔ．）、「インフェクション アンド イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）」、１９９９年、６７巻、ｐ１７３６−１７４２
【非特許文献５】ベルツ Ｃ（Ｗｅｒｔｓ，Ｃ．）、「ネーチャー イムノロジー（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００１年、２巻、ｐ３４６−３５２
【非特許文献６】ネテア Ｍ．Ｇ．（Ｎｅｔｅａ，Ｍ．Ｇ．）、「トレンズ イン イムノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００２年、２３巻、ｐ１３５−１３９
【非特許文献７】オガワ Ｔ（Ｏｇａｗａ，Ｔ．）、「インターナショナル イムノロジー（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００２年、１４巻、ｐ１３２５−１３３２
【非特許文献８】ハシモト Ｍ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）、「ＦＥＢＳ レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）」、２００３年、５４３巻、ｐ９８−１０２
【非特許文献９】コーツ Ｓ．Ｒ．（Ｃｏａｔｓ，Ｓ．Ｒ．）、「インフェクション アンド イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）」、２００３年、７１巻、ｐ６７９９−６８０７
【非特許文献１０】ハーシュフェルド Ｍ（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｍ．）、「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２０００年、１６５巻、ｐ６１８−６２２
【非特許文献１１】リー Ｈ．Ｋ．（Ｌｅｅ Ｈ．Ｋ．）、「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００２年、１６８巻、ｐ４０１２−４０１７
【非特許文献１２】カーシュニング ＣＪ（Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．）、「ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）」、１９９８年、１８８巻、ｐ２０９１−２０９７
【非特許文献１３】ユタ Ｄ（Ｕｔａ，Ｄ．）、「イムノロジー レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」、２００２年、８４巻、ｐ８９−９５
【非特許文献１３】ユーリケ Ｓ（Ｕｌｒｉｋｅ，Ｓ．）、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）」１９９４年、１４巻、ｐ５８２０−５８３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、歯周病原因菌であるポルフィロモナス ジンジバリス由来で、ＴＬＲ２に認識されるリポタンパク及びリポペプチド、並びにその遺伝子を解明し、ＴＬＲ２を受容体とする炎症反応を抑制する物質のスクリーニング等に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、ポルフィロモナス ジンジバリス由来のＬＰＳ画分中に混入している、ＴＬＲ２に認識され、ＴＬＲ２を活性化する物質を分離した。この物質がリポタンパク（リポペプチド）であり、その化学構造を明らかにするとともに、大腸菌ＬＰＳに匹敵する免疫生物活性を有することを知見し、本発明をなすに至ったものである。本発明は、リポタンパク（リポペプチド）を単離、精製又はその構造から化学合成した標品を用いることにより、その生物活性を抑制する物質のスクリーニング等に応用し、抗体等の作製につながるものである。
【００１２】
従って、本発明は、
[１]．トル様受容体２により認識され、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含む又はからなるポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチド、
（ａ）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸が欠失し、他のアミノ酸で置換され、１個以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列
[２]．Ｎ末端が下記式１で表される[１]記載のリポペプチド、
【化１】
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立に炭素数１５〜１６のアルキル基を示す。）
[３]．[１]記載のリポペプチドをコードする塩基配列を含む又は塩基配列からなる遺伝子、
[４]．ポルフィロモナス ジンジバリス由来であって、トル様受容体２により認識されるリポペプチドをコードし、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる遺伝子を提供する。
【００１３】
なお、本発明の配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸が欠失し、他のアミノ酸で置換され、１個以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列も含まれる。また、本発明に係るペプチドをコードする限りにおいて該ＤＮＡの相同物も包含する。相同物には、上記ＤＮＡの塩基配列において１個以上、好ましくは１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、トル様受容体２により認識され、炎症反応を誘導するポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチドの構造を解明する。これは、トル様受容体２を介する炎症反応を抑制する物質のスクリーニング等に応用することができ、歯周病の予防及び／又は治療において多大な貢献を期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について発明の実施の態様を説明する。以下の詳細な説明は例示であり、本発明を何ら限定するものではない。なお、本発明において、「認識する」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。「活性化する」とは、認識することにより細胞内のシグナル伝達系を刺激することをいう。本発明においては、単離され又は合成されたプロテイン、ポリペプチド、オリゴペプチドを意味する総称として「ペプチド」という用語を使用した。
【００１６】
本発明のリポペプチドは、配列表の配列番号１（ＣＮＳＱＡＫＴＥＥＡＡＤＳＴＡＭＤＳＡＴＬＶＥＤＡＡＰＶＶＤＴＡＡＭＱＩＤＳＡＡＭＫＡＥＥＡＴＥＱＡＡＱ）で表されるアミノ酸配列を含むもしくはからなるポルフィロモナス ジンジバリス由来のものであり、トル様受容体２により認識される。これにより、細胞が活性化されてサイトカイン等の炎症性因子を誘導するものである。
【００１７】
まず、ポルフィロモナス ジンジバリスの培養について説明する。本発明のポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチドは、当該菌を培養した菌体から得ることができる。また、上記式（１）で表される化学構造を基に化学合成することにより得ることもできる。
【００１８】
ポルフィロモナス ジンジバリスの培養法に関しては、特に限定されるものでない。ポルフィロモナス ジンジバリスは、公的な分譲機関、例えばアメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）から購入することができる。また、ヒト口腔内から分離・同定された株を保存している研究室から分与を受け入手することもできる。培地としては、通常、市販の培地にヘミン、メナジオンを添加したものを用いることができる。これらの中でもポルフィロモナス ジンジバリスの生育の観点から、ＧＡＭ培地（日水製薬製（株）製）、ブレインハートインフージョン、トリプチケースソイブロス（ディフコ製）が好ましい。培養条件は、通常、嫌気性条件下、３０〜４０℃で１２〜４８時間である。
【００１９】
得られた培養液から遠心分離により菌体を回収する。回収後、蒸留水又はＰＢＳ等のバッファーで充分洗浄する。得られた菌体を凍結乾燥し、この凍結乾燥物を温水−フェノール抽出することにより、ＬＰＳ画分を抽出する。抽出後、遠心分離により水層を分取し、蒸留水に対して透析し、透析膜内液からＬＰＳ画分を得ることができる。この際、混入する核酸を除去する目的でＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等により処理することもできる。
【００２０】
次に、Ｐｇ−ＬＰＳの分離とトル様受容体２認識・活性画分の精製について説明する。
得られたＬＰＳ画分から、疎水性クロマトグラフィーを用いて分画を行う。この場合、疎水クロマトグラフィーの担体は、一般的に市販されているフェニル基やベンジル基を有するものや、単鎖脂肪族（オクチル基〜ブチル基）を有する担体を用いて分離することができる。中でも、フェニル基やオクチル基等の疎水性の高い担体を用いることが好ましい。得られた画分を、レポータープラスミドや線維芽細胞を用いた活性測定法を用いて、ＴＬＲ２活性化能を測定し、トル様受容体２認識・活性画分を単離・精製する。
【００２１】
得られたトル様受容体２認識・活性画分は、さらに、精製し活性を測定することにより、トル様受容体２認識・活性を明らかにすることができる。精製の方法としては、電気泳動、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。活性の測定は、後述するレポータープラスミドや繊維芽細胞を用いた方法以外にも、ＴＬＲ２の活性化を測定できるものであれば適宜組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明においては、ポルフィロモナス ジンジバリス由来のトル様受容体２認識・活性成分を分離し、この成分がリポタンパク（リポペプチド）であり、その化学構造を明らかにするとともに、ポルフィロモナス ジンジバリス リポタンパク質ＰＧ１８２８であることを示した。本発明のリポペプチドは、大腸菌由来のＬＰＳ画分に匹敵する炎症誘導物質と考えられる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００２４】
１．ポルフィロモナス ジンジバリスの培養
ポルフィロモナス ジンジバリス ３８１菌体（フォーサイス デンタル センターより入手）は、ヘミンとメナジオンを添加したＧＡＭ培地（日水製薬（株）製）を用いて、嫌気性条件下３７℃で１２時間培養した。菌体は、培養液を遠心分離して回収し、生理食塩水で洗浄し凍結乾燥した。
【００２５】
２．Ｐｇ−ＬＰＳ画分の抽出
この凍結乾燥物から、温水−フェノール法を用いて、Ｐｇ−ＬＰＳ画分を抽出した。具体的には、菌体の凍結乾燥物を、蒸留水に分散させた後、超音波によって破砕した。これに、９０容積％フェノールを等量加え、６５℃、２０分間加熱撹拌した。この液を氷上で冷却後、遠心分離よって水層とフェノール層とを分離し、水層を回収した。フェノール層にさらに等量の蒸留水を加え、再度同操作にて抽出した。回収した水層を混合し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７（ＭＷＣＯ ３５００；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ） を用い、精製水に対して透析した後、透析膜内液を凍結乾燥し、Ｐｇ−ＬＰＳ画分を得た。この方法によりポルフィロモナス ジンジバリス ３８１培養液２０リットルから、凍結乾燥Ｐｇ−ＬＰＳ画分５１．６ｍｇを得た。これを繰り返すことにより凍結乾燥Ｐｇ−ＬＰＳ画分１９．６３ｇを調製した。
【００２６】
３．Ｐｇ−ＬＰＳの分離とトル様受容体２認識・活性画分の精製
３−１．疎水性クロマトグラフィーによる分離
Ｐｇ−ＬＰＳ２４０ｍｇを１５容積％１−プロパノールを含んだ０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．５）に溶解した。同バッファーで平衡化したＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラムを用いて、１５〜６０容積％の１−プロパノールの濃度勾配にて溶出させた。溶出液を６ｍｌずつ分取して１４０の画分を得た。
【００２７】
３−２．各画分のＴＬＲ２活性化能測定
得られた各画分のリン及びヘキソースの定量、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、並びにＴＬＲ２活性化能を、下記方法で測定した。
【００２８】
（１）リン及びヘキソースの定量を、それぞれモリブデン酸アンモニウム法、アントロン−硫酸法を用いて行った。
【００２９】
（２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析は、泳動装置ＡＥ６０５０Ａ（ＡＴＴＯ製）と１５容積％アクリルアミドゲルを用いて、トリス−グリシン法、２０ｍＡ／ｇｅｌ、８０分間の条件で行った。ゲルの可視化は、過ヨウ素酸−銀染色又はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色にて行った。
【００３０】
（３）レポータープラスミドを用いて、ＴＬＲ２活性化能を測定した。
レポータープラスミドを用いる方法としては、Ｂａ／Ｆ３細胞に、ＮＦ−κＢ／ＤＮＡ結合活性依存的ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐ５５ＩｇκＬｕｃ）を組み込んだ細胞株Ｂａ／κＢ、マウスＴＬＲ２とｐ５５ＩｇκＬｕｃとを組み込んだ細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２、マウスＴＬＲ４と、マウスＭＤ−２と、ｐ５５ＩｇκＬｕｃとを組み込んだ細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ４／ｍＭＤ−２を用いた。この方法は、非特許文献７，１２〜１４に記載されているが、本発明においては、これらの細胞は東京大学医科学研究所の三宅健介教授より供与を受けた。また、ＨＥＫ２９３細胞にＴＬＲ発現ベクター（ｐＵＮＯシリーズやｐＤＵＯシリーズ）やＮＦκＢ誘導性のＳＥＡＰ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）レポータープラスミドｐＮｉＦｔｙ−ＳＥＡＰをトランスフェクトした細胞（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用いてＴＬＲ２活性、ＴＬＲ４活性を測定することができる。
【００３１】
これらの細胞を、インターロイキン（ＩＬ）−３，２−メルカプトエタノール及び１０容積％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５容積％二酸化炭素雰囲気下にて培養した。
【００３２】
ルシフェラーゼレポーターアッセイは以下の手順で行った。細胞を１穴あたり１×１０5個の割合で９６プレートに分注し、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に、所定濃度の標品を添加し、３７℃、４時間培養した。ルシフェラーゼ基質Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｒｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と化学発光測定器ＴＤ−２０／２０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞中のルシフェラーゼ活性を調べた。
【００３３】
リン及びヘキソース含量の定量から、Ｐｇ−ＬＰＳの溶出図を作成したところ、２つのピークを示すことがわかった（図１−１）。第一ピークは、カラムを素通りした容量付近に観察された。ほとんどのリンとヘキソースは第一ピークに溶出しており、このピークはＰｇ−ＬＰＳ画分に混在していた核酸及び多糖由来であると考えられた。一方で、第二ピークはプロパノール濃度６０容積％付近の１０４画分から１４０画分にかけて溶出されており、カラムに吸着した成分であると考えられた。
【００３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動図（図１−２）から、第二ピークの画分がＬＰＳを含んでいることが分かった。しかし、第二ピークのうち前述したルシフェラーゼレポーターアッセイで活性を測定した結果、ＴＬＲ２を受容体として、ＮＦ−κＢを活性化するのは、１０４〜１１２の画分のみであった（図１−３）。そこで、活性を持つ画分を混合し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７（ＭＷＣＯ ３５００；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を用い、精製水に対して透析を行ない、内液を凍結乾燥することにより認識・活性画分（以下、Ｐｇ−ＡＦ）１８．４ｍｇを得た。この方法を繰り返すことによりＰｇ−ＡＦ１２１５．６ｍｇを得た。
【００３５】
４．Ｐｇ−ＡＦの分離と認識・活性成分の検出
得られたＰｇ−ＡＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。さらに、Ｐｇ−ＡＦに対してプロテイナーゼＫ（タカラバイオ（株）製）を１質量％添加し、３７℃・１６時間処理したもの（Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ）、及びＰｇ−ＡＦをデオキシコール酸−フェノール−水系で再抽出したもの（Ｐｇ−ＡＦ／ＤＣＡ）も同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは上記と同様の条件で行った。
【００３６】
デオキシコール酸−フェノール−水系による再抽出は、Ｐｇ−ＡＦを０．５質量％デオキシコール酸含有０．２容積％トリエチルアミン水溶液に溶解し、そこに等量の９０容積％フェノールを加え、５分間ボルテックスにて撹拌した。サンプルを氷冷後、遠心分離し、水層を回収した。フェノール層を同操作にて再度抽出し、両方の水層を混合した。さらに水層を９０容積％フェノールで再抽出した。水層はエタノール沈澱した後、乾燥してＰｇ−ＡＦ／ＤＣＡを得た。
【００３７】
以上のようにして調製したＰｇ−ＡＦ、Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ及びＰｇ−ＡＦ／ＤＣＡを、単球ウェスタンブロットにより解析し、認識・活性成分を検出した。
【００３８】
単球ウェスタンブロット
Ｐｇ−ＡＦ、Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ及びＰｇ−ＡＦ／ＤＣＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、セミドライ転写装置ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＳＤ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて、１００ｍＡ／ｇｅｌ、３５分間の条件で、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は４ｍｍの短冊に切断し、それぞれを個別にＤＭＳＯに溶解した。得られた溶解液をＰＢＳに加えニトロセルロースを、粒子状に析出させた。粒子はＰＢＳで三回洗浄した後、上述のルシフェラーゼレポーターアッセイ（細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２）にて活性を測定した。
【００３９】
Ｐｇ−ＡＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図２−１）、銀染色では、１０、１２、１４、１６、１７ｋＤａのバンドと１８〜４０ｋＤａのバンドが観察された。この結果から、Ｐｇ−ＡＦには、ＬＰＳが含まれていることが認められた。ＣＢＢ染色では、１６ｋＤａにのみバンドが観察された。また、Ｐｇ−ＡＦ中のＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性は１４〜１８ｋＤａのバンドに検出された。一方、プロテイナーゼＫ処理したＰｇ−ＡＦ（Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２−２）では、銀染色の結果には変化がなかったものの、ＣＢＢ染色で１６ｋＤａのバンドが消失していた。さらに、ＮＦ−κＢ活性化能も１４〜１８ｋＤａには存在せず、ゲルの泳動先端に観察された。このことは、１６ｋＤａに泳動されるタンパク質成分（Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａ）が、ＮＦ−κＢ活性をになっていることを示している。Ｐｇ−ＡＦ／ＤＣＡの単球ウェスタンブロットの結果によると、この１６ｋＤａ成分は、デオキシコール酸−フェノール−水系での再抽出（Ｐｇ−ＡＦ／ＤＣＡ）でも除去できないことが確認された。このことは、ＮＦ−κＢ活性を有する成分は、Ｐｇ−ＬＰＳでないことを示唆している。
【００４０】
Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａを、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ装置（ＡＥ−６７５０Ｓ、ＡＴＴＯ、Ｔｏｋｙｏ）で単離した。すなわち、上述のようにして調製したＰｇ−ＡＦ１００ｍｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（和光純薬工業（株）製）に溶解し、１００℃、５分間処理した後、装置に設置した１５％のゲルチューブ上部に静置した。泳動は、１５ｍＡで行い、４分間の泳動ごとに分取した。溶出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる可視化によって分析した。１６ｋＤａに現れる画分Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａを集め、１ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．８）に対して透析した。透析膜内液を凍結乾燥後、精製水に溶解し、アセトン沈澱し、微量のＳＤＳを除去することによってＰｇ−Ｐ１６ｋＤａ０．９ｍｇを得た。この実験を繰り返すことによりＰｇ−Ｐ１６ｋＤａ８．２ｍｇを精製した。Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａは、精製水又は２０ｍＭオクチルグルコシドに溶解し、水溶液は構造解析に、オクチルグルコシド溶液は生物活性測定にそれぞれ用いた。
【００４１】
５．Ｐｇ−ＬＰの単離と構造決定
Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａを、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はリポプロテインリパーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて３７℃、１６時間消化した。ここで、トリプシン及びリポプロテインリパーゼの添加量は、Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａに対して、それぞれ２０質量％とした。このトリプシン消化物のルシフェラーゼレポーターアッセイによる活性測定（細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２）の結果、トリプシン消化では活性が約１／１０減弱し、リポプロテインリパーゼ消化ではほとんどの活性が消失した（図３）。この結果は、この成分がリポペプチドであることを示唆している。このことから、Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａをＰｇ−ＬＰとした。
【００４２】
Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａ（Ｐｇ−ＬＰ）のトリプシン消化物を、Ａｑｕａｐｏｒｅ ＯＤ−３００（１００×１．０ｍｍ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗｌｋ，ＣＴ）を接続した、Ｗａｔｅｒｓ ６２６−２４８７ ＨＰＬＣ装置を用いて分離した。リポペプチドの溶出は、濃度勾配プログラム（Ａ液：５％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ液：７０％アセトニトリル−０．０８５％トリフルオロ酢酸）により、流速０．０５ｍｌ／ｍｉｎで行い、２１０ｎｍの吸光度変化を検出した（図４）。ピークＡとピークＢの二つのピークを分取した。
【００４３】
ピークＡとピークＢとを、Ｗａｔｅｒｓ ６００−２４７５（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＰＬＣ）を用い、ＡｃｃＱ・Ｔａｇ（商標）法（Ｗａｔｅｒｓ）にてアミノ酸分析を行った。Ｐｇ−ＬＰ、ピークＡ及びピークＢのＮ末端アミノ酸配列は、自動ペプチドシーケンサ Ｍｏｄｅｌ ４９４−ｃＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いエドマン分解法で決定した。
【００４４】
Ｐｇ−ＬＰのエドマン分解では、Ｎ末端アミノ酸が検出されず、Ｎ末端のアミノ基が修飾されていることが示唆された。そこで内部アミノ酸の配列を解析した。ピークＡが「ＴＥＥＡＡＤＸＴＡＭＤＸＡＴＬＶＥ（配列番号３）」ピークＢが「ＴＥＥＡＡＤＸＴＡＭＤＸＡＴＬＶ（配列番号４）」であることが分かった（Ｘはアミノ酸が同定されなかった）。この配列について、ＦＡＳＴＡを用いて検索したところ、ポルフィロモナス ジンジバリス Ｗ８３ゲノムにコードされる推定リポプロテイン ＰＧ１８２８（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿９０５９２６）と高い相同性があることが分かった。
【００４５】
Ｐｇ−ＬＰの遺伝子配列決定及び組換え型タンパク質の作製
ポルフィロモナス ジンジバリス Ｗ８３ゲノムＰＧ１８２８の塩基配列情報を基に、合成オリゴヌクレオチドプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ，５´−ｃｇｃｔｇａａｔｇａｇａｃｔｃｔｃａａｇ−３´；ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号５），５´−ｃｃａｔｇａｃｇａａｇａｇｔｔｃｇａｇａ−３´（配列番号６））を用いた。ポルフィロモナス ジンジバリス３８１のゲノムＤＮＡを材料にして、ポルフィロモナス ジンジバリス３８１株のリポペプチド（ＰＧ１８２８）をコードする遺伝子を、サーマルサイクラーＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）とＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ，滋賀）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅した遺伝子断片を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込んだ。遺伝子断片を組み込んだＴベクターを、大腸菌ＤＨ５αに遺伝子導入し、増やした遺伝子断片をＤＮＡ配列の解析に用いた。
【００４６】
ＤＮＡ配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１と自動ＤＮＡ シーケンサ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）３１００−Ａｖａｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて決定した。ポルフィロモナス ジンジバリス３８１由来のＰＧ１８２８のＤＮＡ配列を決定したところ（配列番号２：ａｔｇａａｇａａａｔｔｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔｇｃａｇｃｔｇｔａａｔｃｇｃａｇｃｔｇｔａｔｃａｔｔｃｇｃｔｔｃｔｔｇｃａａｃｔｃｔｃａｇｇｃｔａａｇａｃｔｇａａｇａａｇｃｔｇｃｔｇａｃｔｃｔａｃｇｇｃｔａｔｇｇａｔｔｃｔｇｃｃａｃｔｔｔｇｇｔａｇａａｇａｃｇｃａｇｃｔｃｃｔｇｔａｇｔｔｇａｔａｃｇｇｃｔｇｃｔａｔｇｃａｇａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃｔｇｃａａｔｇａａｇｇｃｔｇａａｇａａｇｃｔａｃｔｇａａｃａａｇｃｃｇｃｔｃａａｔａａ）、その配列及びそこから推定されるアミノ酸配列（図５、配列番号７）は、上記Ｐｇ−ＬＰの配列と重複した。
【００４７】
ＰＧ１８２８のオープンリーディングフレームは、７０残基のアミノ酸をコードしている。この配列は特徴的な原核生物リポプロテインシグナルペプチドを持っており、この部分が切断され、Ｎ末端が脂肪酸で修飾されることが推測される。その結果、成熟タンパク質は５２残基のアミノ酸と脂肪酸残基を持つことになるため、分子量約６ｋＤａと推定された。そこで、脂肪酸を持たない変異リコンビナントタンパク質ＰＧ１８２８１９−７０−Ｃ１９Ｍを作製し、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の挙動を調べた。その結果、約１５ｋＤａに泳動されることが明らかとなり、異常な泳動挙動を示すことが明らかとなった。成熟ＰＧ１８２８はｐＩ＝３．７の酸性タンパク質であると計算されるので、ＳＤＳの結合量が少なく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異常な泳動挙動を示すことが原因と考えられた。
【００４８】
細菌由来リポプロテインは、Ｎ末端にＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システインを持つことが知られている。そこで、Ｐｇ−ＬＰのＮ末端構造について調べた。Ｐｇ−ＬＰのトリプシン消化物を、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＳＩＬ（１５０×４．６ｍｍ；ＹＭＣ製）を接続したＷａｔｅｒｓ ６００ ＨＰＬＣ装置を用いて分離した。リポペプチドの溶出は、濃度勾配プログラム（Ａ液：クロロホルム−メタノール−水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）、Ｂ液：クロロホルム−メタノール−水（６５／４０／４，ｖ／ｖ／ｖ））によって行い、１ｍｌづつ分取した。溶出したリポペプチドは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによる活性測定（細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２）によって検出した。８〜１０画分にかけてＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性化能を持つ物質が分画された（図６）。
【００４９】
活性８〜１０画分を、質量分析（ＭＳ）によって構造解析した。分析は、ｏＭＡＬＤＩイオンソースを接続したＱＡＴＡＲ ＸＬ装置を用い、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）にて行った。サンプルは、クロロホルム−メタノール−水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）に溶解し、同溶媒に溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）と混合し、サンプルプレートに塗布、乾燥した。リポペプチドの質量は陽イオンモードで測定した（図７）。
【００５０】
活性８〜１０画分を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析したところ、ｍ／ｚ１４１１．０及びｍ／ｚ１４２５．０のピークが主に観測された（図７）。また、ｍ／ｚ１３９７．０とｍ／ｚ１４３９．０にも弱いピークが観測された。そこで、ｍ／ｚ１４２５．０のピークに関してタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を測定した（図８）。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、アルゴンガスを用いた衝突誘起解離（ＣＩＤ）モードで測定した。その結果、ｍ／ｚ５４７．３、４３３．２、３４６．２、２１８．１、１４７．１にＣ末端のｙイオンフラグメントが観測された。解析の結果、これらのイオンはアミノ酸配列「ＮＳＱＡＫ」に相当することが分かった。また、ｍ／ｚ８７８．７はＮ末端のｂイオンフラグメントであり、脂肪酸を３残基持つＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システインに相当することが分かった。さらに、ｍ／ｚ８５４．５、８４０．５には、２，３−ジアシルプロピルチオ基がβ脱離して生成したモノアシルデヒドロアラニルＮＳＱＡＫに相当するフラグメントも観測された。他のピークに対するＭＳ／ＭＳでも同様のフラグメントが観測されており、同配列のアミノ酸に異なるアシル基の結合したものであることが分かった。ＭＳ／ＭＳによって得られたＰｇ−ＬＰの構造を図９に示す。このリポペプチドのアミノ酸配列は、Ｐｇ−ＬＰの推定成熟構造のＮ末端配列（図５）と一致しており、Ｐｇ−ＬＰがリポペプチドであることが明らかになった。また、脂肪酸を３残基持つ型のリポペプチドは、ＴＬＲ２依存的免疫活性化能を持つことから、Ｐｇ−ＬＰがＴＬＲ２依存的免疫活性化能を持つ成分であることが確認できた。
【００５１】
６．精製されたＰｇ−ＬＰの生物活性
Ｐｇ−ＬＰの生物活性を、線維芽細胞を用いた活性測定法に基づき測定した。生物活性をＰｇ−ＬＰＳ、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡ、大腸菌ＬＰＳ（Ｅｃ−ＬＰＳ）と比較した。
【００５２】
６−１．サンプル調製
Ｐｇ−ＬＰはＰｇ−ＬＰを２０ｍＭオクチルグルコシドに溶解したオクチルグルコシド溶液を用いた。Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡは、Ｐｇ−ＬＰＳ２００ｍｇを酢酸加水分解した後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分離し、精製したものを用いた。すなわち、Ｐｇ−ＬＰＳを、０．６％酢酸を用いて１００℃、２．５時間加熱し加水分解した。反応液に対してクロロホルムとメタノールを３：２：１（容積比）になるように加え、ボルテックスで撹拌後、遠心分離を行い、有機層と水層に分配した。有機層は再度同操作にて抽出し、窒素気流下乾燥した。生成物は、クロロホルム−メタノール−水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）を用いてＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ ５７２１、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で展開し分離した。Ｒｆ＝０．３の移動度を示す生成物をクロロホルム−メタノール−水−トリエチルアミン（５０／５０／１５／１，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）にて抽出した。さらに抽出物をクロロホルム−メタノール−２５％アンモニア水（６５／２５／５、ｖ／ｖ／ｖ）を用いてＴＬＣで展開し、Ｒｆ＝０．０３の移動度を示す成分を抽出し、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡ １．１ｍｇを得た。また、Ｅｃ−ＬＰＳは、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）より購入したものを用いた。
【００５３】
６−２．線維芽細胞を用いた活性測定法
ヒト歯肉組織を、ゲンタマイシン及びアンホテリシンを含むα−ＭＥＭ培地中で細片し、３回洗浄後、１０％ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地でヒト線維芽細胞を培養した。増殖した細胞は、α−ＭＥＭ培地において継代培養し、継代５〜１５代を実験に用いた。この細胞のＩＬ−８産生誘導能を以下の手順で測定した。すなわち、細胞を１穴あたり２×１０5個の割合で９６プレートに分注し、１０％ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地に、所定濃度の標品を添加し、３７℃・２４時間培養した。その培養上清を回収し、ＩＬ−８ ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてＩＬ−８産生量を測定した。結果を図１０に示す。
【００５４】
図１０に示すようにＰｇ−ＬＰは、ＮＦ−κＢ活性化だけでなく、ヒト歯肉繊維芽細胞に対してＩＬ−８の産生を誘導した。Ｐｇ−ＬＰのＩＬ−８産生誘導能は、Ｐｇ−ＬＰＳに比べて強力であった。また、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡは、Ｐｇ−ＬＰＳに比べて大幅に弱いＩＬ−８産生誘導能しか持たなかった。このことは、Ｐｇ−ＬＰＳ中の免疫生物活性をになう本体が、ＬＰＳ分子ではなくＰｇ−ＬＰであることを示している。ポルフィロモナス ジンジバリスは、歯周病の原因菌であると考えられていることから、Ｐｇ−ＬＰが歯周病における炎症症状の病原因子である可能性は高いと考えられる。さらに、Ｐｇ−ＬＰのＩＬ−８産生誘導能はＥｃ−ＬＰＳのそれとほぼ同等であり、Ｅｃ−ＬＰＳに匹敵する炎症誘導物質であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１−１】Ｐｇ−ＬＰＳの溶出図
【図１−２】各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図
【図１−３】各画分のＴＬＲ２又はＴＬＲ４を受容体とするＮＦ−κＢ活性化を示す図
【図２−１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＰｇ−ＡＦのＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性を示す図
【図２−２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＰｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫのＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性を示す図
【図３】Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａと、Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａのトリプシン又はリポプロテインリパーゼ消化物のＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性を示す図
【図４】Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａのトリプシン消化物の逆相ＨＰＬＣ溶出図
【図５】ポルフィロモナス ジンジバリス３８１株のＰｇ−ＬＰ推定アミノ酸配列
【図６】Ｐｇ−ＬＰのトリプシン消化物の順相ＨＰＬＣ溶出図
【図７】活性８〜１０画分のＭＳスペクトル
【図８】Ｐｇ−ＬＰ由来ピークｍ／ｚ１４２５．０のＭＳ／ＭＳスペクトル
【図９】リポペプチドのＮ末端構造
【図１０】ヒト歯肉繊維芽細胞における、Ｐｇ−ＬＰ、Ｐｇ−ＬＰＳ、Ｅｃ−ＬＰＳ及びＰｇ−ｌｉｐｉｄＡによるＩＬ−８産生を示す図
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列表の配列番号１：トル様受容体に認識されるリポペプチド
配列表の配列番号３：トリプシン消化Ｐｇ−ＬＰの逆相ＨＰＬＣを用いた溶出曲線におけるピークＡ
配列表の配列番号４：トリプシン消化Ｐｇ−ＬＰの逆相ＨＰＬＣを用いた溶出曲線におけるピークＢ
配列表の配列番号５：ＰＣＲ（ＰＧ１８２８）に用いるフォワードプライマー
配列表の配列番号６：ＰＣＲ（ＰＧ１８２８）に用いるリバースプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トル様受容体２により認識されるポルフィロモナス ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来のリポペプチド、その遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、外来微生物に対して、直接シグナル伝達系を活性化できる膜タンパクシステムが明らかになってきた。これはトル（Ｔｏｌｌ）様受容体といわれる膜タンパクである。トル様受容体は、ヒトではＴｏｌｌ様受容体２，４を含め１０種類が知られている。Ｔｏｌｌ様受容体が、微生物由来の物質を認識すると、受容体が直接シグナル伝達系を刺激してサイトカインの発現が誘導され、炎症反応が生じる。
【０００３】
トル様受容体が認識する分子構造としては、リポ多糖（以下、ＬＰＳ）が知られている。ＬＰＳは、大腸菌（エシェリヒア コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に代表されるグラム陰性菌の細胞壁外膜に存在する複合糖質で、オリゴ糖の繰り返し構造を持つＯ抗原多糖部分と脂肪酸を含む疎水性のリピドＡと呼ばれる部分から構成されている。これは、菌体を温水−フェノール抽出することによって得られる画分中に含まれている（非特許文献１）。
【０００４】
ＬＰＳは、ヒトや動物に対して強力な炎症誘導作用や致死毒性等の内毒素活性とともに免疫賦活作用を示すことが知られている。すなわち、ＬＰＳは、マクロファージを活性化することによりサイトカイン等の炎症性因子を誘導し、グラム陰性菌による敗血症患者にみられるような炎症性疾患、多臓器不全を誘発し死に至らしめることがある。これら活性を示す最小構造は、ＬＰＳ中のリピドＡ部分であることが化学合成標品を用いた解析から明らかにされている。
【０００５】
具体的には、トル様受容体４（以下、ＴＬＲ４）及びその結合タンパク質であるＭＤ−２が、大腸菌由来ＬＰＳ（以下Ｅｃ−ＬＰＳ）画分を認識し、シグナル伝達受容体として働くことが示されている（非特許文献２）。また、他の腸内細菌科の細菌由来ＬＰＳ画分も同じ受容体と反応する。さらに、ＬＰＳの活性を示す最小構造であるリピドＡも、ＴＬＲ４やＭＤ−２を介して認識されることが明らかにされている。ＴＬＲ４やＭＤ−２は、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６等の細胞内シグナル伝達タンパク質を介して、ＮＦ−κＢを活性化し、種々の炎症性因子の産生を誘導することから、ＬＰＳの内毒素活性の主要な受容体であると考えられる。
【０００６】
一方、歯周病の主たる原因菌とされるポルフィロモナス ジンジバリス由来のＬＰＳ（以下、Ｐｇ−ＬＰＳ）画分やそのリピドＡ（以下、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡ）画分の受容体は、ＴＬＲ４やＭＤ２ではなく、ＴＬＲ２であることが報告されている（非特許文献３）。また、プレボテラ インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）やレプトスピラ インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）等の腸内細菌科に属さない細菌由来のＬＰＳ画分もＴＬＲ２を受容体とし、ＴＬＲ２依存的にシグナル伝達することが報告されている（非特許文献４，５）。これは、上記微生物由来ＬＰＳのリピドＡ分子の化学構造が、大腸菌由来のリピドＡと異なっていることから、受容体の認識に差異が生じると考えられてきた（非特許文献６）。
【０００７】
しかしながら、我々は最近、高度に精製したポルフィロモナス ジンジバリス由来のＰｇ−ｌｉｐｉｄＡ及びその化学合成標品を用いて検討した結果、その受容体として、ＴＬＲ２ではなく、Ｅｃ−ＬＰＳと同様にＴＬＲ４やＭＤ−２がシグナル伝達受容体として働いていることを明らかにした（非特許文献７）。また、高度に精製されたプレボテラ インターメディア由来のリピドＡにおいても同様の結果を得た（非特許文献８）。さらに別のグループの研究者らにより、Ｐｇ−ＬＰＳがＴＬＲ４と相互作用することにより、Ｅｃ−ＬＰＳのＴＬＲ４依存的な細胞活性化を抑制することが示された（非特許文献９）。これらの所見は、ポルフィロモナス ジンジバリスをはじめとする腸内細菌科に属さない細菌由来のＬＰＳもＴＬＲ４やＭＤ−２により認識されることを示しており、Ｐｇ−ＬＰＳ画分中にＴＬＲ２を受容体として、シグナル伝達する成分が混入していることを強く示唆しているものである。
【０００８】
ＴＬＲ２は、ほとんどすべての細菌に含まれる成分として知られるペプチドグリカンや細菌由来リポタンパク質を認識して細胞内のシグナル伝達を活性化する（非特許文献２）。市販のＥｃ−ＬＰＳもＴＬＲ４やＭＤ−２のみならず、ＴＬＲ２を受容体として、細胞内のシグナル伝達を活性化することが知られている（非特許文献１０）。しかしながら、このＴＬＲ２依存的シグナル伝達活性化は、デオキシコール酸−フェノール−水系を用いてＥｃ−ＬＰＳを再抽出することにより除去することが可能であり（非特許文献１０）、その微量成分がリポタンパク質であることが明らかにされた（非特許文献１１）。他方、Ｐｇ−ＬＰＳ画分中のＴＬＲ２により認識される成分は、再抽出により分離できないことが報告されており（非特許文献３，４）、その成分の本体については未だ不明のままであった。以上のことから、ポルフィロモナス ジンジバリス由来のトル様受容体２により認識される物質の解明が望まれていた。
【０００９】
【非特許文献１】リッシェル Ｅ．Ｔ．（Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ，Ｅ．Ｔ．）、「カレント トピックス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、１９９６年、第２１６巻、ｐ３９−８１
【非特許文献２】アンダーヒル Ｄ．Ｍ．（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｄ．Ｍ．）、「カレント オピニオン イン イムノロジー（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００１年、１４巻、ｐ１０３−１１０
【非特許文献３】ハーシュフェルド Ｍ（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｍ．）、「インフェクション アンド イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）」、２００１年、６９巻、ｐ１４７７−１４８２
【非特許文献４】キリカ Ｔ（Ｋｉｒｉｋａｅ，Ｔ．）、「インフェクション アンド イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）」、１９９９年、６７巻、ｐ１７３６−１７４２
【非特許文献５】ベルツ Ｃ（Ｗｅｒｔｓ，Ｃ．）、「ネーチャー イムノロジー（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００１年、２巻、ｐ３４６−３５２
【非特許文献６】ネテア Ｍ．Ｇ．（Ｎｅｔｅａ，Ｍ．Ｇ．）、「トレンズ イン イムノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００２年、２３巻、ｐ１３５−１３９
【非特許文献７】オガワ Ｔ（Ｏｇａｗａ，Ｔ．）、「インターナショナル イムノロジー（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００２年、１４巻、ｐ１３２５−１３３２
【非特許文献８】ハシモト Ｍ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）、「ＦＥＢＳ レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）」、２００３年、５４３巻、ｐ９８−１０２
【非特許文献９】コーツ Ｓ．Ｒ．（Ｃｏａｔｓ，Ｓ．Ｒ．）、「インフェクション アンド イミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）」、２００３年、７１巻、ｐ６７９９−６８０７
【非特許文献１０】ハーシュフェルド Ｍ（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｍ．）、「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２０００年、１６５巻、ｐ６１８−６２２
【非特許文献１１】リー Ｈ．Ｋ．（Ｌｅｅ Ｈ．Ｋ．）、「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」、２００２年、１６８巻、ｐ４０１２−４０１７
【非特許文献１２】カーシュニング ＣＪ（Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．）、「ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）」、１９９８年、１８８巻、ｐ２０９１−２０９７
【非特許文献１３】ユタ Ｄ（Ｕｔａ，Ｄ．）、「イムノロジー レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」、２００２年、８４巻、ｐ８９−９５
【非特許文献１３】ユーリケ Ｓ（Ｕｌｒｉｋｅ，Ｓ．）、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）」１９９４年、１４巻、ｐ５８２０−５８３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、歯周病原因菌であるポルフィロモナス ジンジバリス由来で、ＴＬＲ２に認識されるリポタンパク及びリポペプチド、並びにその遺伝子を解明し、ＴＬＲ２を受容体とする炎症反応を抑制する物質のスクリーニング等に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、ポルフィロモナス ジンジバリス由来のＬＰＳ画分中に混入している、ＴＬＲ２に認識され、ＴＬＲ２を活性化する物質を分離した。この物質がリポタンパク（リポペプチド）であり、その化学構造を明らかにするとともに、大腸菌ＬＰＳに匹敵する免疫生物活性を有することを知見し、本発明をなすに至ったものである。本発明は、リポタンパク（リポペプチド）を単離、精製又はその構造から化学合成した標品を用いることにより、その生物活性を抑制する物質のスクリーニング等に応用し、抗体等の作製につながるものである。
【００１２】
従って、本発明は、
[１]．トル様受容体２により認識され、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を含む又はからなるポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチド、
（ａ）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸が欠失し、他のアミノ酸で置換され、１個以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列
[２]．Ｎ末端が下記式１で表される[１]記載のリポペプチド、
【化１】
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立に炭素数１５〜１６のアルキル基を示す。）
[３]．[１]記載のリポペプチドをコードする塩基配列を含む又は塩基配列からなる遺伝子、
[４]．ポルフィロモナス ジンジバリス由来であって、トル様受容体２により認識されるリポペプチドをコードし、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる遺伝子を提供する。
【００１３】
なお、本発明の配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列は、当該アミノ酸配列中の１個以上のアミノ酸が欠失し、他のアミノ酸で置換され、１個以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列も含まれる。また、本発明に係るペプチドをコードする限りにおいて該ＤＮＡの相同物も包含する。相同物には、上記ＤＮＡの塩基配列において１個以上、好ましくは１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列からなるＤＮＡが含まれる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、トル様受容体２により認識され、炎症反応を誘導するポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチドの構造を解明する。これは、トル様受容体２を介する炎症反応を抑制する物質のスクリーニング等に応用することができ、歯周病の予防及び／又は治療において多大な貢献を期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について発明の実施の態様を説明する。以下の詳細な説明は例示であり、本発明を何ら限定するものではない。なお、本発明において、「認識する」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。「活性化する」とは、認識することにより細胞内のシグナル伝達系を刺激することをいう。本発明においては、単離され又は合成されたプロテイン、ポリペプチド、オリゴペプチドを意味する総称として「ペプチド」という用語を使用した。
【００１６】
本発明のリポペプチドは、配列表の配列番号１（ＣＮＳＱＡＫＴＥＥＡＡＤＳＴＡＭＤＳＡＴＬＶＥＤＡＡＰＶＶＤＴＡＡＭＱＩＤＳＡＡＭＫＡＥＥＡＴＥＱＡＡＱ）で表されるアミノ酸配列を含むもしくはからなるポルフィロモナス ジンジバリス由来のものであり、トル様受容体２により認識される。これにより、細胞が活性化されてサイトカイン等の炎症性因子を誘導するものである。
【００１７】
まず、ポルフィロモナス ジンジバリスの培養について説明する。本発明のポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチドは、当該菌を培養した菌体から得ることができる。また、上記式（１）で表される化学構造を基に化学合成することにより得ることもできる。
【００１８】
ポルフィロモナス ジンジバリスの培養法に関しては、特に限定されるものでない。ポルフィロモナス ジンジバリスは、公的な分譲機関、例えばアメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）から購入することができる。また、ヒト口腔内から分離・同定された株を保存している研究室から分与を受け入手することもできる。培地としては、通常、市販の培地にヘミン、メナジオンを添加したものを用いることができる。これらの中でもポルフィロモナス ジンジバリスの生育の観点から、ＧＡＭ培地（日水製薬製（株）製）、ブレインハートインフージョン、トリプチケースソイブロス（ディフコ製）が好ましい。培養条件は、通常、嫌気性条件下、３０〜４０℃で１２〜４８時間である。
【００１９】
得られた培養液から遠心分離により菌体を回収する。回収後、蒸留水又はＰＢＳ等のバッファーで充分洗浄する。得られた菌体を凍結乾燥し、この凍結乾燥物を温水−フェノール抽出することにより、ＬＰＳ画分を抽出する。抽出後、遠心分離により水層を分取し、蒸留水に対して透析し、透析膜内液からＬＰＳ画分を得ることができる。この際、混入する核酸を除去する目的でＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等により処理することもできる。
【００２０】
次に、Ｐｇ−ＬＰＳの分離とトル様受容体２認識・活性画分の精製について説明する。
得られたＬＰＳ画分から、疎水性クロマトグラフィーを用いて分画を行う。この場合、疎水クロマトグラフィーの担体は、一般的に市販されているフェニル基やベンジル基を有するものや、単鎖脂肪族（オクチル基〜ブチル基）を有する担体を用いて分離することができる。中でも、フェニル基やオクチル基等の疎水性の高い担体を用いることが好ましい。得られた画分を、レポータープラスミドや線維芽細胞を用いた活性測定法を用いて、ＴＬＲ２活性化能を測定し、トル様受容体２認識・活性画分を単離・精製する。
【００２１】
得られたトル様受容体２認識・活性画分は、さらに、精製し活性を測定することにより、トル様受容体２認識・活性を明らかにすることができる。精製の方法としては、電気泳動、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。活性の測定は、後述するレポータープラスミドや繊維芽細胞を用いた方法以外にも、ＴＬＲ２の活性化を測定できるものであれば適宜組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明においては、ポルフィロモナス ジンジバリス由来のトル様受容体２認識・活性成分を分離し、この成分がリポタンパク（リポペプチド）であり、その化学構造を明らかにするとともに、ポルフィロモナス ジンジバリス リポタンパク質ＰＧ１８２８であることを示した。本発明のリポペプチドは、大腸菌由来のＬＰＳ画分に匹敵する炎症誘導物質と考えられる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００２４】
１．ポルフィロモナス ジンジバリスの培養
ポルフィロモナス ジンジバリス ３８１菌体（フォーサイス デンタル センターより入手）は、ヘミンとメナジオンを添加したＧＡＭ培地（日水製薬（株）製）を用いて、嫌気性条件下３７℃で１２時間培養した。菌体は、培養液を遠心分離して回収し、生理食塩水で洗浄し凍結乾燥した。
【００２５】
２．Ｐｇ−ＬＰＳ画分の抽出
この凍結乾燥物から、温水−フェノール法を用いて、Ｐｇ−ＬＰＳ画分を抽出した。具体的には、菌体の凍結乾燥物を、蒸留水に分散させた後、超音波によって破砕した。これに、９０容積％フェノールを等量加え、６５℃、２０分間加熱撹拌した。この液を氷上で冷却後、遠心分離よって水層とフェノール層とを分離し、水層を回収した。フェノール層にさらに等量の蒸留水を加え、再度同操作にて抽出した。回収した水層を混合し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７（ＭＷＣＯ ３５００；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ） を用い、精製水に対して透析した後、透析膜内液を凍結乾燥し、Ｐｇ−ＬＰＳ画分を得た。この方法によりポルフィロモナス ジンジバリス ３８１培養液２０リットルから、凍結乾燥Ｐｇ−ＬＰＳ画分５１．６ｍｇを得た。これを繰り返すことにより凍結乾燥Ｐｇ−ＬＰＳ画分１９．６３ｇを調製した。
【００２６】
３．Ｐｇ−ＬＰＳの分離とトル様受容体２認識・活性画分の精製
３−１．疎水性クロマトグラフィーによる分離
Ｐｇ−ＬＰＳ２４０ｍｇを１５容積％１−プロパノールを含んだ０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ４．５）に溶解した。同バッファーで平衡化したＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂカラムを用いて、１５〜６０容積％の１−プロパノールの濃度勾配にて溶出させた。溶出液を６ｍｌずつ分取して１４０の画分を得た。
【００２７】
３−２．各画分のＴＬＲ２活性化能測定
得られた各画分のリン及びヘキソースの定量、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、並びにＴＬＲ２活性化能を、下記方法で測定した。
【００２８】
（１）リン及びヘキソースの定量を、それぞれモリブデン酸アンモニウム法、アントロン−硫酸法を用いて行った。
【００２９】
（２）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析は、泳動装置ＡＥ６０５０Ａ（ＡＴＴＯ製）と１５容積％アクリルアミドゲルを用いて、トリス−グリシン法、２０ｍＡ／ｇｅｌ、８０分間の条件で行った。ゲルの可視化は、過ヨウ素酸−銀染色又はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色にて行った。
【００３０】
（３）レポータープラスミドを用いて、ＴＬＲ２活性化能を測定した。
レポータープラスミドを用いる方法としては、Ｂａ／Ｆ３細胞に、ＮＦ−κＢ／ＤＮＡ結合活性依存的ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐ５５ＩｇκＬｕｃ）を組み込んだ細胞株Ｂａ／κＢ、マウスＴＬＲ２とｐ５５ＩｇκＬｕｃとを組み込んだ細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２、マウスＴＬＲ４と、マウスＭＤ−２と、ｐ５５ＩｇκＬｕｃとを組み込んだ細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ４／ｍＭＤ−２を用いた。この方法は、非特許文献７，１２〜１４に記載されているが、本発明においては、これらの細胞は東京大学医科学研究所の三宅健介教授より供与を受けた。また、ＨＥＫ２９３細胞にＴＬＲ発現ベクター（ｐＵＮＯシリーズやｐＤＵＯシリーズ）やＮＦκＢ誘導性のＳＥＡＰ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）レポータープラスミドｐＮｉＦｔｙ−ＳＥＡＰをトランスフェクトした細胞（ｉｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）を用いてＴＬＲ２活性、ＴＬＲ４活性を測定することができる。
【００３１】
これらの細胞を、インターロイキン（ＩＬ）−３，２−メルカプトエタノール及び１０容積％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５容積％二酸化炭素雰囲気下にて培養した。
【００３２】
ルシフェラーゼレポーターアッセイは以下の手順で行った。細胞を１穴あたり１×１０5個の割合で９６プレートに分注し、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に、所定濃度の標品を添加し、３７℃、４時間培養した。ルシフェラーゼ基質Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｒｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と化学発光測定器ＴＤ−２０／２０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞中のルシフェラーゼ活性を調べた。
【００３３】
リン及びヘキソース含量の定量から、Ｐｇ−ＬＰＳの溶出図を作成したところ、２つのピークを示すことがわかった（図１−１）。第一ピークは、カラムを素通りした容量付近に観察された。ほとんどのリンとヘキソースは第一ピークに溶出しており、このピークはＰｇ−ＬＰＳ画分に混在していた核酸及び多糖由来であると考えられた。一方で、第二ピークはプロパノール濃度６０容積％付近の１０４画分から１４０画分にかけて溶出されており、カラムに吸着した成分であると考えられた。
【００３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動図（図１−２）から、第二ピークの画分がＬＰＳを含んでいることが分かった。しかし、第二ピークのうち前述したルシフェラーゼレポーターアッセイで活性を測定した結果、ＴＬＲ２を受容体として、ＮＦ−κＢを活性化するのは、１０４〜１１２の画分のみであった（図１−３）。そこで、活性を持つ画分を混合し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７（ＭＷＣＯ ３５００；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ）を用い、精製水に対して透析を行ない、内液を凍結乾燥することにより認識・活性画分（以下、Ｐｇ−ＡＦ）１８．４ｍｇを得た。この方法を繰り返すことによりＰｇ−ＡＦ１２１５．６ｍｇを得た。
【００３５】
４．Ｐｇ−ＡＦの分離と認識・活性成分の検出
得られたＰｇ−ＡＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。さらに、Ｐｇ−ＡＦに対してプロテイナーゼＫ（タカラバイオ（株）製）を１質量％添加し、３７℃・１６時間処理したもの（Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ）、及びＰｇ−ＡＦをデオキシコール酸−フェノール−水系で再抽出したもの（Ｐｇ−ＡＦ／ＤＣＡ）も同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは上記と同様の条件で行った。
【００３６】
デオキシコール酸−フェノール−水系による再抽出は、Ｐｇ−ＡＦを０．５質量％デオキシコール酸含有０．２容積％トリエチルアミン水溶液に溶解し、そこに等量の９０容積％フェノールを加え、５分間ボルテックスにて撹拌した。サンプルを氷冷後、遠心分離し、水層を回収した。フェノール層を同操作にて再度抽出し、両方の水層を混合した。さらに水層を９０容積％フェノールで再抽出した。水層はエタノール沈澱した後、乾燥してＰｇ−ＡＦ／ＤＣＡを得た。
【００３７】
以上のようにして調製したＰｇ−ＡＦ、Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ及びＰｇ−ＡＦ／ＤＣＡを、単球ウェスタンブロットにより解析し、認識・活性成分を検出した。
【００３８】
単球ウェスタンブロット
Ｐｇ−ＡＦ、Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ及びＰｇ−ＡＦ／ＤＣＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、セミドライ転写装置ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴ ＳＤ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて、１００ｍＡ／ｇｅｌ、３５分間の条件で、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は４ｍｍの短冊に切断し、それぞれを個別にＤＭＳＯに溶解した。得られた溶解液をＰＢＳに加えニトロセルロースを、粒子状に析出させた。粒子はＰＢＳで三回洗浄した後、上述のルシフェラーゼレポーターアッセイ（細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２）にて活性を測定した。
【００３９】
Ｐｇ−ＡＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図２−１）、銀染色では、１０、１２、１４、１６、１７ｋＤａのバンドと１８〜４０ｋＤａのバンドが観察された。この結果から、Ｐｇ−ＡＦには、ＬＰＳが含まれていることが認められた。ＣＢＢ染色では、１６ｋＤａにのみバンドが観察された。また、Ｐｇ−ＡＦ中のＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性は１４〜１８ｋＤａのバンドに検出された。一方、プロテイナーゼＫ処理したＰｇ−ＡＦ（Ｐｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２−２）では、銀染色の結果には変化がなかったものの、ＣＢＢ染色で１６ｋＤａのバンドが消失していた。さらに、ＮＦ−κＢ活性化能も１４〜１８ｋＤａには存在せず、ゲルの泳動先端に観察された。このことは、１６ｋＤａに泳動されるタンパク質成分（Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａ）が、ＮＦ−κＢ活性をになっていることを示している。Ｐｇ−ＡＦ／ＤＣＡの単球ウェスタンブロットの結果によると、この１６ｋＤａ成分は、デオキシコール酸−フェノール−水系での再抽出（Ｐｇ−ＡＦ／ＤＣＡ）でも除去できないことが確認された。このことは、ＮＦ−κＢ活性を有する成分は、Ｐｇ−ＬＰＳでないことを示唆している。
【００４０】
Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａを、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ装置（ＡＥ−６７５０Ｓ、ＡＴＴＯ、Ｔｏｋｙｏ）で単離した。すなわち、上述のようにして調製したＰｇ−ＡＦ１００ｍｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（和光純薬工業（株）製）に溶解し、１００℃、５分間処理した後、装置に設置した１５％のゲルチューブ上部に静置した。泳動は、１５ｍＡで行い、４分間の泳動ごとに分取した。溶出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる可視化によって分析した。１６ｋＤａに現れる画分Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａを集め、１ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．８）に対して透析した。透析膜内液を凍結乾燥後、精製水に溶解し、アセトン沈澱し、微量のＳＤＳを除去することによってＰｇ−Ｐ１６ｋＤａ０．９ｍｇを得た。この実験を繰り返すことによりＰｇ−Ｐ１６ｋＤａ８．２ｍｇを精製した。Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａは、精製水又は２０ｍＭオクチルグルコシドに溶解し、水溶液は構造解析に、オクチルグルコシド溶液は生物活性測定にそれぞれ用いた。
【００４１】
５．Ｐｇ−ＬＰの単離と構造決定
Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａを、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はリポプロテインリパーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて３７℃、１６時間消化した。ここで、トリプシン及びリポプロテインリパーゼの添加量は、Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａに対して、それぞれ２０質量％とした。このトリプシン消化物のルシフェラーゼレポーターアッセイによる活性測定（細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２）の結果、トリプシン消化では活性が約１／１０減弱し、リポプロテインリパーゼ消化ではほとんどの活性が消失した（図３）。この結果は、この成分がリポペプチドであることを示唆している。このことから、Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａをＰｇ−ＬＰとした。
【００４２】
Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａ（Ｐｇ−ＬＰ）のトリプシン消化物を、Ａｑｕａｐｏｒｅ ＯＤ−３００（１００×１．０ｍｍ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗｌｋ，ＣＴ）を接続した、Ｗａｔｅｒｓ ６２６−２４８７ ＨＰＬＣ装置を用いて分離した。リポペプチドの溶出は、濃度勾配プログラム（Ａ液：５％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ液：７０％アセトニトリル−０．０８５％トリフルオロ酢酸）により、流速０．０５ｍｌ／ｍｉｎで行い、２１０ｎｍの吸光度変化を検出した（図４）。ピークＡとピークＢの二つのピークを分取した。
【００４３】
ピークＡとピークＢとを、Ｗａｔｅｒｓ ６００−２４７５（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＰＬＣ）を用い、ＡｃｃＱ・Ｔａｇ（商標）法（Ｗａｔｅｒｓ）にてアミノ酸分析を行った。Ｐｇ−ＬＰ、ピークＡ及びピークＢのＮ末端アミノ酸配列は、自動ペプチドシーケンサ Ｍｏｄｅｌ ４９４−ｃＬＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いエドマン分解法で決定した。
【００４４】
Ｐｇ−ＬＰのエドマン分解では、Ｎ末端アミノ酸が検出されず、Ｎ末端のアミノ基が修飾されていることが示唆された。そこで内部アミノ酸の配列を解析した。ピークＡが「ＴＥＥＡＡＤＸＴＡＭＤＸＡＴＬＶＥ（配列番号３）」ピークＢが「ＴＥＥＡＡＤＸＴＡＭＤＸＡＴＬＶ（配列番号４）」であることが分かった（Ｘはアミノ酸が同定されなかった）。この配列について、ＦＡＳＴＡを用いて検索したところ、ポルフィロモナス ジンジバリス Ｗ８３ゲノムにコードされる推定リポプロテイン ＰＧ１８２８（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿９０５９２６）と高い相同性があることが分かった。
【００４５】
Ｐｇ−ＬＰの遺伝子配列決定及び組換え型タンパク質の作製
ポルフィロモナス ジンジバリス Ｗ８３ゲノムＰＧ１８２８の塩基配列情報を基に、合成オリゴヌクレオチドプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ，５´−ｃｇｃｔｇａａｔｇａｇａｃｔｃｔｃａａｇ−３´；ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号５），５´−ｃｃａｔｇａｃｇａａｇａｇｔｔｃｇａｇａ−３´（配列番号６））を用いた。ポルフィロモナス ジンジバリス３８１のゲノムＤＮＡを材料にして、ポルフィロモナス ジンジバリス３８１株のリポペプチド（ＰＧ１８２８）をコードする遺伝子を、サーマルサイクラーＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）とＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ，滋賀）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅した遺伝子断片を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に組み込んだ。遺伝子断片を組み込んだＴベクターを、大腸菌ＤＨ５αに遺伝子導入し、増やした遺伝子断片をＤＮＡ配列の解析に用いた。
【００４６】
ＤＮＡ配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１と自動ＤＮＡ シーケンサ ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）３１００−Ａｖａｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて決定した。ポルフィロモナス ジンジバリス３８１由来のＰＧ１８２８のＤＮＡ配列を決定したところ（配列番号２：ａｔｇａａｇａａａｔｔｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔｇｃａｇｃｔｇｔａａｔｃｇｃａｇｃｔｇｔａｔｃａｔｔｃｇｃｔｔｃｔｔｇｃａａｃｔｃｔｃａｇｇｃｔａａｇａｃｔｇａａｇａａｇｃｔｇｃｔｇａｃｔｃｔａｃｇｇｃｔａｔｇｇａｔｔｃｔｇｃｃａｃｔｔｔｇｇｔａｇａａｇａｃｇｃａｇｃｔｃｃｔｇｔａｇｔｔｇａｔａｃｇｇｃｔｇｃｔａｔｇｃａｇａｔｃｇａｔｔｃｔｇｃｔｇｃａａｔｇａａｇｇｃｔｇａａｇａａｇｃｔａｃｔｇａａｃａａｇｃｃｇｃｔｃａａｔａａ）、その配列及びそこから推定されるアミノ酸配列（図５、配列番号７）は、上記Ｐｇ−ＬＰの配列と重複した。
【００４７】
ＰＧ１８２８のオープンリーディングフレームは、７０残基のアミノ酸をコードしている。この配列は特徴的な原核生物リポプロテインシグナルペプチドを持っており、この部分が切断され、Ｎ末端が脂肪酸で修飾されることが推測される。その結果、成熟タンパク質は５２残基のアミノ酸と脂肪酸残基を持つことになるため、分子量約６ｋＤａと推定された。そこで、脂肪酸を持たない変異リコンビナントタンパク質ＰＧ１８２８１９−７０−Ｃ１９Ｍを作製し、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の挙動を調べた。その結果、約１５ｋＤａに泳動されることが明らかとなり、異常な泳動挙動を示すことが明らかとなった。成熟ＰＧ１８２８はｐＩ＝３．７の酸性タンパク質であると計算されるので、ＳＤＳの結合量が少なく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で異常な泳動挙動を示すことが原因と考えられた。
【００４８】
細菌由来リポプロテインは、Ｎ末端にＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システインを持つことが知られている。そこで、Ｐｇ−ＬＰのＮ末端構造について調べた。Ｐｇ−ＬＰのトリプシン消化物を、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＳＩＬ（１５０×４．６ｍｍ；ＹＭＣ製）を接続したＷａｔｅｒｓ ６００ ＨＰＬＣ装置を用いて分離した。リポペプチドの溶出は、濃度勾配プログラム（Ａ液：クロロホルム−メタノール−水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）、Ｂ液：クロロホルム−メタノール−水（６５／４０／４，ｖ／ｖ／ｖ））によって行い、１ｍｌづつ分取した。溶出したリポペプチドは、ルシフェラーゼレポーターアッセイによる活性測定（細胞株Ｂａ／ｍＴＬＲ２）によって検出した。８〜１０画分にかけてＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性化能を持つ物質が分画された（図６）。
【００４９】
活性８〜１０画分を、質量分析（ＭＳ）によって構造解析した。分析は、ｏＭＡＬＤＩイオンソースを接続したＱＡＴＡＲ ＸＬ装置を用い、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）にて行った。サンプルは、クロロホルム−メタノール−水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）に溶解し、同溶媒に溶解した２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ）と混合し、サンプルプレートに塗布、乾燥した。リポペプチドの質量は陽イオンモードで測定した（図７）。
【００５０】
活性８〜１０画分を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析したところ、ｍ／ｚ１４１１．０及びｍ／ｚ１４２５．０のピークが主に観測された（図７）。また、ｍ／ｚ１３９７．０とｍ／ｚ１４３９．０にも弱いピークが観測された。そこで、ｍ／ｚ１４２５．０のピークに関してタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を測定した（図８）。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、アルゴンガスを用いた衝突誘起解離（ＣＩＤ）モードで測定した。その結果、ｍ／ｚ５４７．３、４３３．２、３４６．２、２１８．１、１４７．１にＣ末端のｙイオンフラグメントが観測された。解析の結果、これらのイオンはアミノ酸配列「ＮＳＱＡＫ」に相当することが分かった。また、ｍ／ｚ８７８．７はＮ末端のｂイオンフラグメントであり、脂肪酸を３残基持つＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システインに相当することが分かった。さらに、ｍ／ｚ８５４．５、８４０．５には、２，３−ジアシルプロピルチオ基がβ脱離して生成したモノアシルデヒドロアラニルＮＳＱＡＫに相当するフラグメントも観測された。他のピークに対するＭＳ／ＭＳでも同様のフラグメントが観測されており、同配列のアミノ酸に異なるアシル基の結合したものであることが分かった。ＭＳ／ＭＳによって得られたＰｇ−ＬＰの構造を図９に示す。このリポペプチドのアミノ酸配列は、Ｐｇ−ＬＰの推定成熟構造のＮ末端配列（図５）と一致しており、Ｐｇ−ＬＰがリポペプチドであることが明らかになった。また、脂肪酸を３残基持つ型のリポペプチドは、ＴＬＲ２依存的免疫活性化能を持つことから、Ｐｇ−ＬＰがＴＬＲ２依存的免疫活性化能を持つ成分であることが確認できた。
【００５１】
６．精製されたＰｇ−ＬＰの生物活性
Ｐｇ−ＬＰの生物活性を、線維芽細胞を用いた活性測定法に基づき測定した。生物活性をＰｇ−ＬＰＳ、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡ、大腸菌ＬＰＳ（Ｅｃ−ＬＰＳ）と比較した。
【００５２】
６−１．サンプル調製
Ｐｇ−ＬＰはＰｇ−ＬＰを２０ｍＭオクチルグルコシドに溶解したオクチルグルコシド溶液を用いた。Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡは、Ｐｇ−ＬＰＳ２００ｍｇを酢酸加水分解した後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分離し、精製したものを用いた。すなわち、Ｐｇ−ＬＰＳを、０．６％酢酸を用いて１００℃、２．５時間加熱し加水分解した。反応液に対してクロロホルムとメタノールを３：２：１（容積比）になるように加え、ボルテックスで撹拌後、遠心分離を行い、有機層と水層に分配した。有機層は再度同操作にて抽出し、窒素気流下乾燥した。生成物は、クロロホルム−メタノール−水（６５／２５／４，ｖ／ｖ／ｖ）を用いてＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ ５７２１、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で展開し分離した。Ｒｆ＝０．３の移動度を示す生成物をクロロホルム−メタノール−水−トリエチルアミン（５０／５０／１５／１，ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）にて抽出した。さらに抽出物をクロロホルム−メタノール−２５％アンモニア水（６５／２５／５、ｖ／ｖ／ｖ）を用いてＴＬＣで展開し、Ｒｆ＝０．０３の移動度を示す成分を抽出し、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡ １．１ｍｇを得た。また、Ｅｃ−ＬＰＳは、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）より購入したものを用いた。
【００５３】
６−２．線維芽細胞を用いた活性測定法
ヒト歯肉組織を、ゲンタマイシン及びアンホテリシンを含むα−ＭＥＭ培地中で細片し、３回洗浄後、１０％ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地でヒト線維芽細胞を培養した。増殖した細胞は、α−ＭＥＭ培地において継代培養し、継代５〜１５代を実験に用いた。この細胞のＩＬ−８産生誘導能を以下の手順で測定した。すなわち、細胞を１穴あたり２×１０5個の割合で９６プレートに分注し、１０％ＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地に、所定濃度の標品を添加し、３７℃・２４時間培養した。その培養上清を回収し、ＩＬ−８ ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてＩＬ−８産生量を測定した。結果を図１０に示す。
【００５４】
図１０に示すようにＰｇ−ＬＰは、ＮＦ−κＢ活性化だけでなく、ヒト歯肉繊維芽細胞に対してＩＬ−８の産生を誘導した。Ｐｇ−ＬＰのＩＬ−８産生誘導能は、Ｐｇ−ＬＰＳに比べて強力であった。また、Ｐｇ−ｌｉｐｉｄＡは、Ｐｇ−ＬＰＳに比べて大幅に弱いＩＬ−８産生誘導能しか持たなかった。このことは、Ｐｇ−ＬＰＳ中の免疫生物活性をになう本体が、ＬＰＳ分子ではなくＰｇ−ＬＰであることを示している。ポルフィロモナス ジンジバリスは、歯周病の原因菌であると考えられていることから、Ｐｇ−ＬＰが歯周病における炎症症状の病原因子である可能性は高いと考えられる。さらに、Ｐｇ−ＬＰのＩＬ−８産生誘導能はＥｃ−ＬＰＳのそれとほぼ同等であり、Ｅｃ−ＬＰＳに匹敵する炎症誘導物質であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１−１】Ｐｇ−ＬＰＳの溶出図
【図１−２】各画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動図
【図１−３】各画分のＴＬＲ２又はＴＬＲ４を受容体とするＮＦ−κＢ活性化を示す図
【図２−１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＰｇ−ＡＦのＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性を示す図
【図２−２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＰｇ−ＡＦ／ＰｒｏＫのＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性を示す図
【図３】Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａと、Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａのトリプシン又はリポプロテインリパーゼ消化物のＴＬＲ２を受容体とするＮＦ−κＢ活性を示す図
【図４】Ｐｇ−Ｐ１６ｋＤａのトリプシン消化物の逆相ＨＰＬＣ溶出図
【図５】ポルフィロモナス ジンジバリス３８１株のＰｇ−ＬＰ推定アミノ酸配列
【図６】Ｐｇ−ＬＰのトリプシン消化物の順相ＨＰＬＣ溶出図
【図７】活性８〜１０画分のＭＳスペクトル
【図８】Ｐｇ−ＬＰ由来ピークｍ／ｚ１４２５．０のＭＳ／ＭＳスペクトル
【図９】リポペプチドのＮ末端構造
【図１０】ヒト歯肉繊維芽細胞における、Ｐｇ−ＬＰ、Ｐｇ−ＬＰＳ、Ｅｃ−ＬＰＳ及びＰｇ−ｌｉｐｉｄＡによるＩＬ−８産生を示す図
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列表の配列番号１：トル様受容体に認識されるリポペプチド
配列表の配列番号３：トリプシン消化Ｐｇ−ＬＰの逆相ＨＰＬＣを用いた溶出曲線におけるピークＡ
配列表の配列番号４：トリプシン消化Ｐｇ−ＬＰの逆相ＨＰＬＣを用いた溶出曲線におけるピークＢ
配列表の配列番号５：ＰＣＲ（ＰＧ１８２８）に用いるフォワードプライマー
配列表の配列番号６：ＰＣＲ（ＰＧ１８２８）に用いるリバースプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トル様受容体２により認識され、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端が下記式（１）で表される請求項１記載のリポペプチド。
【化１】
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立に炭素数１５〜１６のアルキル基を示す。）
【請求項３】
請求項１記載のリポペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項４】
ポルフィロモナス ジンジバリス由来であって、トル様受容体２により認識されるリポペプチドをコードし、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる遺伝子。
【請求項１】
トル様受容体２により認識され、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポルフィロモナス ジンジバリス由来のリポペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端が下記式（１）で表される請求項１記載のリポペプチド。
【化１】
（式中、Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ独立に炭素数１５〜１６のアルキル基を示す。）
【請求項３】
請求項１記載のリポペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子。
【請求項４】
ポルフィロモナス ジンジバリス由来であって、トル様受容体２により認識されるリポペプチドをコードし、配列表の配列番号２で示される塩基配列からなる遺伝子。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１−２】
【図１−３】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−１０９７３４（Ｐ２００６−１０９７３４Ａ）
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９９１７９（Ｐ２００４−２９９１７９）
【出願日】平成１６年１０月１３日（２００４．１０．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１３日（２００４．１０．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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