レシオメトリックであり、かつ赤色スペクトルで発光する蛍光カルシウム指示薬
カルシウムの細胞質ゾル濃度を測定するための蛍光イオン指示薬の新規な生成。これらの新規な指示薬は可視スペクトルの赤色部分で発光し、レシオメトリックである。レシオメトリーは、４８８ｎｍにてアルゴンレーザーで励起した場合にカルシウムに結合した際の発光のシフトからなる。これらの指示薬は、より長い波長にて可視光で励起した場合に赤色蛍光の著しい増加も示す。すべてのカルシウム指示薬と同様に、それらは、ＢＡＰＴＡ（ビスアミノフェニル四酢酸）をベースとする通常のキレート部分およびフルオロフォア部分、セミナフトフルオレセイン／セミナフトローダミンまたはジナフトフルオレセインを含み、レシオメトリーが可能となる。他のナフトフルオレセインと異なり、生物学的なカルシウム測定に適するようにするために、ｐＫａがナフト部位上で調節されている。本発明は、その指示薬の構造ならびにこれらの指示薬を合成する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
著者：ＡＫＷＡＳＩ ＭＩＮＴＡおよびＰＥＤＲＯ ＲＯＧＥＬＩＯ ＥＳＣＡＭＩＬＬＡ
【０００２】
関連出願
本出願は、出願人によって２０１０年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／２５２，６５４号明細書に関連し、その出願の優先日を主張する。
【０００３】
背景−本発明の分野
本出願は、長波長蛍光イオン指示薬の設計および合成に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景−先行技術
レシオメトリックである、最も一般的な蛍光カルシウム指示薬としては、Ｆｕｒａ−２（励起シフト）およびＩｎｄｏ−１（発光シフト）ｉが挙げられる。レシオメトリーは、指示薬の濃度、細胞ローディングの程度、光退色、検出器の感度、細胞の厚さ、および光路などのカルシウム測定における可変的影響を排除する、特有の利点を有する。それは本質的に、較正および定量的測定を可能にする理想的な特性である。しかしながら、これらの一般的なレシオメトリック色素は紫外線で機能する。ＵＶ光学装置類は高価であり、したがってこれらの色素の一般的な使用が制限されている。高エネルギー紫外線光は細胞に有害でもある。レシオメトリーはこの問題を減らすが、紫外線光で励起した場合、ヌクレオチドおよび一部のアミノ酸による自家蛍光も、測定中に干渉を引き起こす。
【０００５】
一般的な可視波長蛍光イオン指示薬、Ｆｌｕｏ色素ｉｉは、レシオメトリーを示さない。それらは単に、カルシウムに結合すると、発光強度を著しく高める。ベースラインは容易に線引きされないが、実験でマンガンまたはニッケルを使用して、ベースラインまたはバックグラウンドの有益な評価が可能である。
【０００６】
２種類のレシオメトリック長波長指示薬がある。第１のＢＴＣｉｉｉは非常に高い解離定数Ｋｄを有し、そのため、カルシウムの細胞質ゾル濃度（ナノモル）の小さな変化を測定することができない。第２のＦｕｒａ−Ｒｅｄｉｖは、それが疎水性であるため、水中で低い量子収量を有し、したがって、細胞研究においてあまり役に立たないことが分かっている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、可視スペクトルの赤色または近赤外で発光し、かつカルシウムに結合すると、励起波長に応じて発光波長をシフトする、カルシウム指示薬の新規なファミリーである。カルシウムに結合すると、その最大吸収波長で励起することによって、波長がシフトすることなく、蛍光が莫大に増加する。カルシウム指示薬のこの新規なファミリーは、４つの異なる化合物およびその変形体によって表される。
【０００８】
これらの化合物の第１化合物は、フルオロフォア、推定のセミナフトフルオレセインまたはセミナフトローダミンのいずれかに、炭素−炭素結合により結合されたＢＡＰＴＡ主鎖を含む。これらの色素の発光極大は赤外領域の６５０ｎｍにある。
【０００９】
セミナフトフルオレセインおよびセミナフトローダミンのｐＫａは、ナフトール部位をフッ素および塩素でハロゲン化することによって低減される。したがって、非ハロゲン化セミナフトフルオレセインのｐＫａは、ジ−オルトハロゲン化により７．８から５．５に低減され、それによって色素は、細胞における小さなｐＨ変化に対して応答しなくなる。
【００１０】
化合物Ｉ：
Ｘ、Ｙ、およびＺは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１１】
これらの化合物の第２化合物は、推定のナフトフルオレセインフルオロフォアに、炭素−炭素結合により共役されたＢＡＰＴＡ主鎖を含む。色素のｐＫａは、ナフトール部位上のフッ素および塩素の置換によって低減される。したがって、ナフトフルオレセインの通常のｐＫａは、８を超える値から５．６へと低減される。これらの色素の発光は、追加の芳香族環によって近赤外領域の６９０ｎｍに拡大される。
【００１２】
化合物ＩＩ：
ＸおよびＹは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１３】
化合物ＩおよびＩＩのどちらも、解離定数３００〜４００ｎＭおよびｐＫａ約５．５を有する。化合物Ｉは、励起最大５４０ｎｍおよび発光最大６５０ｎｍを有する（図１）。しかしながら、４８８ｎｍで励起した場合には、５２５ｎｍから６５０ｎｍへのカルシウム依存性発光シフトを示し、それによってレシオメトリック可能となる（図２）。化合物ＩＩは赤色励起最大６３５ｎｍおよび赤色発光最大６９０ｎｍを有する（図３）。レシオメトリーを得るために、４５８ｎｍで励起されている（図４）。
【００１４】
これらの化合物の第３の化合物は固有のキレート化主鎖を有する。ＢＡＰＴＡは、フルオロフォアに対してオルト位に追加のカルボキシル官能基を有する。このＢＡＰＴＡに共役した色素は、増大した量子収量に関して、６−アミノセミナフトローダミンに最もよく似ている。ナフトールは塩素またはフッ素置換を有し、８を超えるｐＫａから５．５へと低減される。この発光最大は、赤色領域の６５０ｎｍにある。
【００１５】
化合物ＩＩＩ：
ＸおよびＹは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１６】
第４の化合物は、化合物ＩＩＩと同じ固有のキレート化主鎖を有し、フルオロフォアに対してオルト位に追加のカルボキシル官能基を有し、６−アミノセミナフトフルオレセインによく似ている。ナフトールは塩素またはフッ素置換を有し、８を超えるｐＫａから５．５へと低減される。この発光最大は６５０ｎｍである。
【００１７】
化合物ＩＶ：
Ｘ，ＹおよびＺは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１８】
これらの４つの化合物は、必要に応じて細胞内でそれらに特別な機能を与える変形体を得るために、Ｒ２およびＲ３位置で修飾されている。
ａ．Ｒ２がＨであり、かつＲ３がメチルである場合、デフォルトの高親和性バージョンが得られる。
ｂ．Ｒ３がＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１として修飾される場合には、蛍光特性を変化させることなく、新規な漏れ抵抗性バージョンが得られる。
ｃ．Ｒ２およびＲ３がＦである場合、デフォルトの高親和性バージョンよりもほぼ２０倍高いカルシウムに対するＫｄを有し、蛍光特性も変化させることなく、低親和性バージョンが得られる。
ｄ．Ｒ３＝
である場合、ミトコンドリアバージョンが得られ、細胞質ゾルよりはむしろミトコンドリアにおけるカルシウム測定が可能となる。
ｅ．Ｒ３＝
である場合、膜付近バージョンが得られ、蛍光特性に影響することなく、膜付近のカルシウム測定が可能となる。
【００１９】
これらの変形形態は、細胞内のカルシウム研究に対する、新規な発明の有用性を広げる。
【００２０】
本発明のこれら、および他の目的かつ利点は、以下に示され、本発明における図面を参照することによってさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、５４０ｎｍ発光での励起、６５０ｎｍでの発光を有する、化合物Ｉの一般的な滴定である。
【図２】図２は、４８８ｎｍでの励起を有し、５２５ｎｍおよび６５０ｎｍでの発光を示す、化合物Ｉの一般的な滴定である。
【図３】図３は、６３５ｎｍでの励起および６９０ｎｍでの発光を有する化合物ＩＩの一般的な滴定である。
【図４】図４は、神経細胞におけるカルシウムに対する化合物Ｉの応答である。
【図５】図５は、ジオルトクロロ／フルオロハロゲン化でのナフタレンジオール前駆物質の合成スキームである。
【図６】図６は、化合物Ｉの方法Ａ合成スキームである。
【図７】図７は、化合物ＩＩの方法Ｂ合成スキームである。
【図８】図８は、化合物ＩＩＩおよびＩＶの方法Ｃ合成スキームである。
【図９】図９は、化合物Ｉの合成スキームである。
【００２２】
図面の詳細な説明
本明細書で使用される用語の定義
本明細書および特許請求の範囲において、以下のように、本明細書で使用するために明確に定義される、当該技術分野のフレーズおよび用語が参照される：
【００２３】
本明細書で使用される［Ｃａ２＋］とは、細胞内遊離カルシウムを意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるＥＧＴＡとは、エチレングリコールビス−（−β−アミノエチルエーテル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される「ＢＡＰＴＡ様」とは、２つのビス（カルボキシエチル）アミノ置換フェニル環の本質的な特性を保持するＢＡＰＴＡの置換誘導体であって、前記環が、原子４個の架橋によってアミンに対してオルト位で結合しており、各フェニル環に隣接する原子がＯであり、２つの中心原子がそれぞれ炭素である、置換誘導体を意味する。フルオロフォアに結合するフェニル環のうちの１つの６位が、カルボキシル官能基またはＨであり得る。
【００２６】
本明細書で使用されるＡＭエステルとは、細胞ローディングを促進する、アセトキシメチルエステル、またはいずれかのエステル形態を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「μΜ」とは１０−６モル／リットルを意味し、「ｎＭ」は１０−９モル／リットルを意味する。
【００２８】
本明細書で使用されるＭＯＰＳとは、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の簡単な説明
本発明は、電磁スペクトルの赤色および近赤外領域での発光を有する、カルシウム指示薬の新規なファミリーを説明する。新規な指示薬は、カルシウムキレート化のためにＢＡＰＴＡまたはＢＡＰＴＡ様主鎖から誘導され、赤色または赤外蛍光は、塩素化およびフッ素化ベンゾ［ｃ］キサンテノンとキレート化部分を連結することによって達成される。キサンテノンがレゾルシノールとナフタレンジオールの組み合わせから誘導される場合、その発光は６５０ｎｍであり、２つのナフタレンジオールからの誘導体によって、６９０ｎｍの発光が得られる。それらはカルシウム指示薬として細胞内カルシウムに応答する。波長が長くなると、量子収量がわずかに減少する。
【００３０】
詳細な説明
図１は、化合物Ｉの非レシオメトリックなカルシウム滴定を示す。それぞれが化合物Ｉ ５μΜを含有する、適切な体積の１０ｍＭカリウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）および１０ｍＭカルシウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）を混合し、目的の遊離カルシウム濃度０ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、４５０ｎＭ、および３９μΜを得た。５４０ｎｍでの励起を有する、各溶液の発光スペクトルを記録し、カルシウム濃度の増加に伴って、６５０ｎｍで発光強度が激しく増加した。解離定数を計算し、約４００ｎＭが得られた。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−３でスペクトルを記録した。
【００３１】
図２は、化合物Ｉのレシオメトリックなカルシウム滴定を示す。それぞれが化合物Ｉ ５μΜを含有する、適切な体積の１０ｍＭカリウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）および１０ｍＭカルシウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）を混合し、目的の遊離カルシウム濃度０ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、４５０ｎＭ、および３９μΜを得た。４８８ｎｍでの励起を有する、各溶液の発光スペクトルを記録し、カルシウム濃度の増加に伴って、５２０ｎｍで発光強度が減少し、６５０ｎｍで発光強度が増加した。等吸収点が５７５ｎｍで生じる。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−３でスペクトルを記録した。
【００３２】
図３は、化合物ＩＩの非レシオメトリックなカルシウム滴定を示す。それぞれが化合物Ｉ ５μΜを含有する、適切な体積の１０ｍＭカリウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）および１０ｍＭカルシウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）を混合し、目的の遊離カルシウム濃度０ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、４５０ｎＭ、および３９μΜを得た。６３５ｎｍでの励起を有する、各溶液の発光スペクトルを記録し、カルシウム濃度の増加に伴って、６９０ｎｍで発光強度が増加した。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｍａｘ−３でスペクトルを記録した。
【００３３】
図４は、ラットの迷走神経細胞におけるカルシウムに対する化合物Ｉの応答を示す。ラットの迷走神経細胞におけるＡＴＰ誘発Ｃａ２＋トランジエントのレシオメトリックな発光測定である。ＳＤラット由来の迷走神経（結節）下神経節を酵素的に切り離した。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシンが補われたＬｉｅｂｏｗｉｔｚ Ｌ−１５培地に、結節神経細胞の収量を懸濁し、Ｎｏ．１ガラスカバースリップ上にプレーティングした。神経細胞を化合物Ｉ ３μΜ、ＡＭエステルと共に室温で５０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、新たなＬ−１５培地中で４０分間維持し、ＡＭエステルを細胞内で加水分解させて、完了まで続けた。指示薬がローティングされた神経細胞を倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ Ｚｅｉｓｓ）のステージ上に位置付け、Ｌｏｃｋｅ溶液（ＣＯ２ ５％とＯ２ ９５％の混合物で平衡化されている）で灌流した。ＬＳＭ ５１０システム（Ｚｅｉｓｓ）を用いて９×４０対物レンズ（開口数１．２；油浸）によってフレームレート０．５Ｈｚにて、共焦点イメージング顕微鏡法を行った。励起は４８８ｎｍであり；５４５ｎｍ二色性ミラーによって蛍光発光が、２つの構成要素：５００〜５５０ｎｍバンドパスフィルターを通過する短波長要素（Ｆ５２５と表される）と、５６０ｎｍロングパスフィルターを通過する長波長要素（Ｆ６５０）に分離された。灌流液を通して送達される１０秒パルスのＡＴＰ１００μｍで神経細胞を刺激した。
【００３４】
図５は、ハロゲン化ナフトール前駆物質を合成するための合成スキームを示す。６−ヒドロキシナフトエ酸をエステル化し、得られたエステルをＳｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒでジェミナルに二フッ素化し、（２）を得て、続いて直ぐに、亜鉛および酢酸で還元し、モノフルオロ化合物（３）を得た；そのフッ素化化合物を塩素化して（４）を得て、次いでフェノールを臭化ベンジルで保護して（５）を得た。水素化アルミニウムリチウムで（５）のメチルエステルを最初にアルコールに還元し、そのアルコールをクロロクロム酸ピリジニウムでアルデヒド（７）に酸化することによって、最終化合物を得た。バイヤー・ビリガー反応によって、アルデヒドをナフトール（８）へと転化し、ＢＢｒ３でベンジル保護を脱保護することによって（９）を得た。
【００３５】
図６は、化合物Ｉを合成するための方法Ａを示す。市販の３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸をエステル化し、次いで２−ブロモエトキシ−４−メチル−ニトロベンゼンと共役させ、ＢＡＰＴＡ主鎖が形成された。エステルを遊離酸へと加水分解した後、混合無水物が形成し、それを４−ハロレゾルシノールと反応させて、ベンゾフェノンを得た。塩化第一スズでニトロ基を還元し、得られたアニリンをアルキル化する前に、そのフェノール基をベンジルエーテルとして保護した。パラジムと水素での脱ベンジル化によってケトンが製造され、メタンスルホン酸の存在下で５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンとカップリングすることによって色素が形成された。この色素を続いて、カルシウムキレート化カリウム塩へと加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、次いで酢酸ブロモメチルでそれをアルキル化し、膜透過性のアセトキシメチル（ＡＭ）エステルが得られた。
【００３６】
図９は、化合物Ｉを合成するための方法Ｂを示す。メタンスルホン酸の存在下にて、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚらからのアルデヒド前駆物質を４−ハロレゾルシノールおよび５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンにカップリングした。次いで、そのエステルをカルシウムキレート化カリウム塩へと加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、それをアルキル化してアセトキシメチル（ＡＭ）形が得られた。
【００３７】
図７は、化合物ＩＩを合成するための方法Ｂを示す。Ｇｒｙｎｋｅｗｉｃｚら１からのアルデヒド前駆物質をメタンスルホン酸の存在下にて５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンにカップリングした。次いで、エステルをカルシウムキレート化カリウム塩に加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、それをアルキル化してアセトキシメチル（ＡＭ）形が得られた。
【００３８】
図８は、化合物ＩＩＩおよびＩＶを合成するための方法Ｃを示す。５位でニトロ化する前に、市販の４−ヒドロキシフタル酸をジメチルフタレートにエステル化した。２−ブロモエトキシ−４−メチル−ニトロベンゼンとの反応によって、ＢＡＰＴＡ主鎖が形成された。メチルエステルを加水分解した後、無水酢酸におけるフタル酸が環状無水物を形成した。４−ハロレゾルシノールでのフリーデル・クラフツのアシル化によって、異性体ベンゾフェノンが形成され、さらに進行する前に、カラムクロマトグラフィーによってそれを分離した。塩化第一スズでニトロ基を還元する前に、フェノールおよび遊離酸をベンジル化し、続いて得られたアニリンをアルキル化した。パラジウムおよび水素で脱ベンジル化することによって、メタンスルホン酸の存在下にて５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンにカップリングした場合に色素が形成された。その色素をカルシウムキレート化カリウム塩へと加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、それをアルキル化し、膜透過性ＡＭ形が得られた。
【実施例】
【００３９】
化合物ＩおよびＩＩの合成
本発明の一態様は、セミナフトフルオレセイン、ジナフトフルオレセイン、およびセミナフトローダミン様フルオロフォアのｐＫａを下げる能力である。かかる変化を可能にする前駆物質は、５−フルオロ−７−クロロ−１，６−ナフタレンジオール（図５、化合物９）である。
【００４０】
実験的な図５からの化合物９の合成：
メチル−５−フルオロ−６−ヒドロキシナフトエート（３）
６−ヒドロキシナフトエ酸（２５ｇ）をメタノール（２５０ｍｌ）に溶解し、硫酸（２５ｍｌ）を添加した。混合物を８０℃で一晩加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、次いで重炭酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させ、クリーム色の固形物（２４ｇ）としてエステルを得た。そのエステル（１０ｇ）をアセトニトリル（５００ｍｌ）に溶解し、Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ ２当量を添加し、室温で３時間攪拌し、その時点で出発原料は消費されていた。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて、クリーム色の固形物（７ｇ）としてジェミナルに二フッ素化された化合物（２）が得られた。酢酸２００ｍＬ中の亜鉛粉末２ｇを使用して、この固形物をモノフルオロ化合物へと還元した。固形物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル６：１）によって、化合物３を６ｇ得た。
【００４１】
メチル−５−フルオロ−６−ベンジルオキシ−７−クロロ−ナフトエ酸エステル（５）
化合物（３）５ｇをトルエン（５０ｍｌ）に溶解し、ｓ−ブチルアミン（５００μｌ）を添加し、反応混合物を油浴で６６℃に維持し、塩化スルフリル（１．２当量）を３時間にわたって添加した。混合物を酢酸エチルで希釈し、ブライン、５％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、（４）を得た。残留物をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（４ｇ）に続いて臭化ベンジル（３ｍｌ）を添加した。すべての出発原料が消費されたことがＴＬＣで分かった時に、混合物を還流下にて２時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、油状残留物を得て、それをヘキサン：酢酸エチル（９：１）のカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固形物（３ｇ）として（５）を得た。
【００４２】
５−フルオロ−６−ベンジルオキシ−７−クロロ−ナフトアルデヒド（６）
化合物（５）（５．８ｇ）をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に溶解し、無水エーテル７５ｍＬ中の水素化アルミニウムリチウム（２当量）に一滴ずつ添加した。添加が完了した時、攪拌をさらに３０分間続け、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、希硫酸と共に攪拌した。有機抽出物を乾燥させ、蒸発させて、クリーム色の残留物を得た。その残留物を無水塩化メチレン（７５ｍｌ）に溶解し、ＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍｌ）中のクロロクロム酸ピリジニウム（１．５当量）に添加し、室温で２時間攪拌した。酢酸エチルを反応混合物に添加し、次いで３００ｃｍ３のシリカに通してそれを濾過した。有機濾液を蒸発させて、淡褐色の固形物４ｇとして（６）を得た。
【００４３】
５−フルオロ−６ベンジルオキシ−７−クロロナフトール（８）
化合物６（３ｇ）をベンゼン（３０ｍｌ）に溶解し、ｍ−クロロ過安息香酸（２当量）を添加し、混合物を７０℃で２４時間加熱した。混合物を攪拌しながら、１Ｍ ＫＯＨ１０ｍｌを添加し、ギ酸エステルを加水分解した。反応混合物を１Ｍ ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、ゴム状残留物が得られ、ヘキサン：酢酸エチル４：１のカラムクロマトグラフィーによって精製して、クリーム色の固形物２ｇとして（８）を得た。
【００４４】
５−フルオロ−７−クロロ−１，６−ナフタレンジオール（９）
化合物８（２ｇ）を塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解し、三臭化ホウ素（ＣＨ２Ｃｌ２中で１Ｍ、３当量）を添加し、溶液を３時間攪拌した。氷水を反応に添加し、塩化メチレン、続いて酢酸エチルで抽出することによって、洗浄および蒸発後に淡褐色の固形物（１ｇ）として（９）を得た。色素の合成に直接使用できる状態であった。
【００４５】
実験的な化合物Ｉの合成：
化合物Ｉ、エチルエステル：
Ｇｒｙｎｋｅｗｉｃｚら１からのＢＡＰＴＡアルデヒド（１ｍｍｏｌ）、４−フルオロレゾルシノール（１ｍｍｏｌ）、および５−フルオロ−７−クロロ−１，６−ナフタレンジオール（１ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸１０ｍＬに室温で１時間溶解させた。氷中の３Ｍ酢酸ナトリウム２００ｍＬに反応を注ぎ、紫色の沈殿物を濾過した。真空下にて五酸化リンで乾燥させた後、固形物をクロロホルム／メタノール（１：１）２０ｍＬに溶解し、ｐ−クロラニル（２当量）を添加した。溶液を一晩還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、次いで紫色の固形物をメタノールに溶解した。不溶性ｐ−クロラニルを濾過除去した。濾液を蒸発させ、メタノール／クロロホルム勾配５〜１５％を用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物Ｉ、エチルエステルを得た。
【００４６】
化合物Ｉ、五カリウム塩：
純粋な化合物Ｉ、メチルエステル（０．５ｍｍｏｌ）をメタノール４ｍＬ中の２Ｍ ＫＯＨ水溶液（４．０ｍｍｏｌ）で室温にて３０分間加水分解した。水２ｍＬを添加し、メタノールを減圧下で除去した。完全に水性の反応を室温で１時間攪拌し、その時点でＣ１８ＴＬＣ（メタノール／ブライン３：２）によって加水分解が完了したことが分かった。氷を反応混合物に添加し、ｐＨが７．５〜８．５になるまで、２Ｍ ＨＣｌを添加した。水中で充填されたＬＨ−２０カラム３０ｇ上に弱い塩基性の溶液をローディングし、水で溶出した。純粋な生成物画分を真空下にて４５℃で溶媒から取り除き、化合物Ｉ、五カリウム塩を得た。
【００４７】
化合物Ｉ、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル：
化合物Ｉ、五カリウム塩（０．１ｍｍｏｌ）を氷水１ｍＬに溶解した。２Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨを１．５とし、沈殿した遊離酸を濾過した。紫色の固形物を真空下にて五酸化リンで乾燥させた。次いで、無水ジメチルホルムアミド１ｍＬにそれを溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１．５ｍｍｏｌを添加した。室温で５分間攪拌した後、酢酸ブロモメチル１ｍｍｏｌを添加し、反応を室温で２時間攪拌した。混合物を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、０．１Ｍクエン酸５０ｍＬで２回洗浄し、ブライン５０ｍＬで１回洗浄した。有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下にて溶媒から取り除いた。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル１：１）によって純粋な化合物Ｉ、ＡＭエステルが得られた。
【００４８】
化合物ＩＩ、エチルエステル：
Ｇｒｙｎｋｅｗｉｃｚら１からのＢＡＰＴＡアルデヒド（１ｍｍｏｌ）および５−フルオロ−７−クロロ−ｌ，６−ナフタレンジオール（２．２ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸１０ｍＬに室温にて１時間溶解した。氷中の３Ｍ酢酸ナトリウム２００ｍＬに反応を注ぎ、青紫色の沈殿物を濾過した。真空下にて五酸化リンで乾燥させた後、固形物をクロロホルム／メタノール（１：１）２０ｍＬに溶解し、ｐ−クロラニル（２当量）を添加した。溶液を一晩還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、次いで青紫色の固形物をメタノールに再び溶解した。不溶性ｐ−クロラニルを濾過除去した。濾液を蒸発させ、メタノール／クロロホルム勾配５〜１０％を用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物ＩＩ、エチルエステルを得た。
【００４９】
化合物ＩＩ、五カリウム塩：
メタノール４ｍｌ中の２Ｍ ＫＯＨ水溶液（４．０ｍｍｏｌ）で、純粋な化合物ＩＩ、エチルエステル（０．５ｍｍｏｌ）を室温にて３０分間加水分解した。水２ｍＬを添加し、減圧下にてメタノールを除去した。完全に水性の反応を室温で１時間攪拌し、その時点でＣ１８ＴＬＣ（メタノール／ブライン３：２）によって加水分解が完了したことが分かった。氷を反応混合物に添加し、ｐＨが７．５〜８．５になるまで、２Ｍ ＨＣ１を添加した。水中で充填されたＬＨ−２０カラム３０ｇ上に弱い塩基性の溶液をローディングし、水で溶出した。純粋な生成物画分を真空下にて４５℃で溶媒から取り除き、化合物ＩＩ、五カリウム塩を得た。
【００５０】
化合物ＩＩ、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル：
化合物ＩＩ、五カリウム塩（０．１ｍｍｏｌ）を氷水１ｍＬに溶解した。２Ｍ ＨＣｌを添加して、ｐＨを１．５とし、沈殿した遊離酸を濾過した。青紫色の固形物を真空下にて五酸化リンで乾燥させた。次いで、無水ジメチルホルムアミド１ｍＬにそれを溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１．５ｍｍｏｌを添加した。室温で５分間攪拌した後、酢酸ブロモメチル１ｍｍｏｌを添加し、反応を室温で２時間攪拌し、時間が経つにつれて無色になった。混合物を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、０．１Ｍクエン酸５０ｍＬで２回洗浄し、ブライン５０ｍＬで１回洗浄した。有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下にて溶媒から取り除いた。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル２：１）によって純粋な化合物ＩＩ、ＡＭエステルが得られた。
【００５１】
参考文献
特許文献
米国特許第４，８４９，３６２号明細書；ＤｅＭａｒｉｎｉｓら、１９８９年７月
米国特許第５，０４９，６７３号明細書；Ｔｓｉｅｎら、１９８９年９月
米国特許第４，６０３，２０９号明細書；Ｔｓｉｅｎら、１９８６年７月
非特許文献
ｉ Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ， Ｇ．，Ｐｏｅｎｉｅ，Ｍ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０，３４４０−３４５０．
ｉｉ Ｍｉｎｔａ，Ａ．，Ｋａｏ，Ｊ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４，８１７１−８１７８．
ｉｉｉ ｌａｔｒｉｄｏｕ，Ｈ．，Ｆｏｕｋａｒａｋｉ，Ｉ．，Ｋｕｈｎ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｋａｔｅｒｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．Ｅ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，（１９９４）１５，１９０−１９８．
ｉｖ ＤｅＭａｒｉｎｉｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｋａｔｅｒｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．Ｅ．，Ｍｕｉｒｈｅａｄ，Ｋ．Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９０）１１２，３８１
【技術分野】
【０００１】
著者：ＡＫＷＡＳＩ ＭＩＮＴＡおよびＰＥＤＲＯ ＲＯＧＥＬＩＯ ＥＳＣＡＭＩＬＬＡ
【０００２】
関連出願
本出願は、出願人によって２０１０年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／２５２，６５４号明細書に関連し、その出願の優先日を主張する。
【０００３】
背景−本発明の分野
本出願は、長波長蛍光イオン指示薬の設計および合成に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景−先行技術
レシオメトリックである、最も一般的な蛍光カルシウム指示薬としては、Ｆｕｒａ−２（励起シフト）およびＩｎｄｏ−１（発光シフト）ｉが挙げられる。レシオメトリーは、指示薬の濃度、細胞ローディングの程度、光退色、検出器の感度、細胞の厚さ、および光路などのカルシウム測定における可変的影響を排除する、特有の利点を有する。それは本質的に、較正および定量的測定を可能にする理想的な特性である。しかしながら、これらの一般的なレシオメトリック色素は紫外線で機能する。ＵＶ光学装置類は高価であり、したがってこれらの色素の一般的な使用が制限されている。高エネルギー紫外線光は細胞に有害でもある。レシオメトリーはこの問題を減らすが、紫外線光で励起した場合、ヌクレオチドおよび一部のアミノ酸による自家蛍光も、測定中に干渉を引き起こす。
【０００５】
一般的な可視波長蛍光イオン指示薬、Ｆｌｕｏ色素ｉｉは、レシオメトリーを示さない。それらは単に、カルシウムに結合すると、発光強度を著しく高める。ベースラインは容易に線引きされないが、実験でマンガンまたはニッケルを使用して、ベースラインまたはバックグラウンドの有益な評価が可能である。
【０００６】
２種類のレシオメトリック長波長指示薬がある。第１のＢＴＣｉｉｉは非常に高い解離定数Ｋｄを有し、そのため、カルシウムの細胞質ゾル濃度（ナノモル）の小さな変化を測定することができない。第２のＦｕｒａ−Ｒｅｄｉｖは、それが疎水性であるため、水中で低い量子収量を有し、したがって、細胞研究においてあまり役に立たないことが分かっている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、可視スペクトルの赤色または近赤外で発光し、かつカルシウムに結合すると、励起波長に応じて発光波長をシフトする、カルシウム指示薬の新規なファミリーである。カルシウムに結合すると、その最大吸収波長で励起することによって、波長がシフトすることなく、蛍光が莫大に増加する。カルシウム指示薬のこの新規なファミリーは、４つの異なる化合物およびその変形体によって表される。
【０００８】
これらの化合物の第１化合物は、フルオロフォア、推定のセミナフトフルオレセインまたはセミナフトローダミンのいずれかに、炭素−炭素結合により結合されたＢＡＰＴＡ主鎖を含む。これらの色素の発光極大は赤外領域の６５０ｎｍにある。
【０００９】
セミナフトフルオレセインおよびセミナフトローダミンのｐＫａは、ナフトール部位をフッ素および塩素でハロゲン化することによって低減される。したがって、非ハロゲン化セミナフトフルオレセインのｐＫａは、ジ−オルトハロゲン化により７．８から５．５に低減され、それによって色素は、細胞における小さなｐＨ変化に対して応答しなくなる。
【００１０】
化合物Ｉ：
Ｘ、Ｙ、およびＺは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１１】
これらの化合物の第２化合物は、推定のナフトフルオレセインフルオロフォアに、炭素−炭素結合により共役されたＢＡＰＴＡ主鎖を含む。色素のｐＫａは、ナフトール部位上のフッ素および塩素の置換によって低減される。したがって、ナフトフルオレセインの通常のｐＫａは、８を超える値から５．６へと低減される。これらの色素の発光は、追加の芳香族環によって近赤外領域の６９０ｎｍに拡大される。
【００１２】
化合物ＩＩ：
ＸおよびＹは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１３】
化合物ＩおよびＩＩのどちらも、解離定数３００〜４００ｎＭおよびｐＫａ約５．５を有する。化合物Ｉは、励起最大５４０ｎｍおよび発光最大６５０ｎｍを有する（図１）。しかしながら、４８８ｎｍで励起した場合には、５２５ｎｍから６５０ｎｍへのカルシウム依存性発光シフトを示し、それによってレシオメトリック可能となる（図２）。化合物ＩＩは赤色励起最大６３５ｎｍおよび赤色発光最大６９０ｎｍを有する（図３）。レシオメトリーを得るために、４５８ｎｍで励起されている（図４）。
【００１４】
これらの化合物の第３の化合物は固有のキレート化主鎖を有する。ＢＡＰＴＡは、フルオロフォアに対してオルト位に追加のカルボキシル官能基を有する。このＢＡＰＴＡに共役した色素は、増大した量子収量に関して、６−アミノセミナフトローダミンに最もよく似ている。ナフトールは塩素またはフッ素置換を有し、８を超えるｐＫａから５．５へと低減される。この発光最大は、赤色領域の６５０ｎｍにある。
【００１５】
化合物ＩＩＩ：
ＸおよびＹは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１６】
第４の化合物は、化合物ＩＩＩと同じ固有のキレート化主鎖を有し、フルオロフォアに対してオルト位に追加のカルボキシル官能基を有し、６−アミノセミナフトフルオレセインによく似ている。ナフトールは塩素またはフッ素置換を有し、８を超えるｐＫａから５．５へと低減される。この発光最大は６５０ｎｍである。
【００１７】
化合物ＩＶ：
Ｘ，ＹおよびＺは、Ｈ、Ｆ、またはＣｌのいずれかの組み合わせであり、
Ｒ１＝Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）である。
【００１８】
これらの４つの化合物は、必要に応じて細胞内でそれらに特別な機能を与える変形体を得るために、Ｒ２およびＲ３位置で修飾されている。
ａ．Ｒ２がＨであり、かつＲ３がメチルである場合、デフォルトの高親和性バージョンが得られる。
ｂ．Ｒ３がＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１として修飾される場合には、蛍光特性を変化させることなく、新規な漏れ抵抗性バージョンが得られる。
ｃ．Ｒ２およびＲ３がＦである場合、デフォルトの高親和性バージョンよりもほぼ２０倍高いカルシウムに対するＫｄを有し、蛍光特性も変化させることなく、低親和性バージョンが得られる。
ｄ．Ｒ３＝
である場合、ミトコンドリアバージョンが得られ、細胞質ゾルよりはむしろミトコンドリアにおけるカルシウム測定が可能となる。
ｅ．Ｒ３＝
である場合、膜付近バージョンが得られ、蛍光特性に影響することなく、膜付近のカルシウム測定が可能となる。
【００１９】
これらの変形形態は、細胞内のカルシウム研究に対する、新規な発明の有用性を広げる。
【００２０】
本発明のこれら、および他の目的かつ利点は、以下に示され、本発明における図面を参照することによってさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、５４０ｎｍ発光での励起、６５０ｎｍでの発光を有する、化合物Ｉの一般的な滴定である。
【図２】図２は、４８８ｎｍでの励起を有し、５２５ｎｍおよび６５０ｎｍでの発光を示す、化合物Ｉの一般的な滴定である。
【図３】図３は、６３５ｎｍでの励起および６９０ｎｍでの発光を有する化合物ＩＩの一般的な滴定である。
【図４】図４は、神経細胞におけるカルシウムに対する化合物Ｉの応答である。
【図５】図５は、ジオルトクロロ／フルオロハロゲン化でのナフタレンジオール前駆物質の合成スキームである。
【図６】図６は、化合物Ｉの方法Ａ合成スキームである。
【図７】図７は、化合物ＩＩの方法Ｂ合成スキームである。
【図８】図８は、化合物ＩＩＩおよびＩＶの方法Ｃ合成スキームである。
【図９】図９は、化合物Ｉの合成スキームである。
【００２２】
図面の詳細な説明
本明細書で使用される用語の定義
本明細書および特許請求の範囲において、以下のように、本明細書で使用するために明確に定義される、当該技術分野のフレーズおよび用語が参照される：
【００２３】
本明細書で使用される［Ｃａ２＋］とは、細胞内遊離カルシウムを意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるＥＧＴＡとは、エチレングリコールビス−（−β−アミノエチルエーテル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される「ＢＡＰＴＡ様」とは、２つのビス（カルボキシエチル）アミノ置換フェニル環の本質的な特性を保持するＢＡＰＴＡの置換誘導体であって、前記環が、原子４個の架橋によってアミンに対してオルト位で結合しており、各フェニル環に隣接する原子がＯであり、２つの中心原子がそれぞれ炭素である、置換誘導体を意味する。フルオロフォアに結合するフェニル環のうちの１つの６位が、カルボキシル官能基またはＨであり得る。
【００２６】
本明細書で使用されるＡＭエステルとは、細胞ローディングを促進する、アセトキシメチルエステル、またはいずれかのエステル形態を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「μΜ」とは１０−６モル／リットルを意味し、「ｎＭ」は１０−９モル／リットルを意味する。
【００２８】
本明細書で使用されるＭＯＰＳとは、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の簡単な説明
本発明は、電磁スペクトルの赤色および近赤外領域での発光を有する、カルシウム指示薬の新規なファミリーを説明する。新規な指示薬は、カルシウムキレート化のためにＢＡＰＴＡまたはＢＡＰＴＡ様主鎖から誘導され、赤色または赤外蛍光は、塩素化およびフッ素化ベンゾ［ｃ］キサンテノンとキレート化部分を連結することによって達成される。キサンテノンがレゾルシノールとナフタレンジオールの組み合わせから誘導される場合、その発光は６５０ｎｍであり、２つのナフタレンジオールからの誘導体によって、６９０ｎｍの発光が得られる。それらはカルシウム指示薬として細胞内カルシウムに応答する。波長が長くなると、量子収量がわずかに減少する。
【００３０】
詳細な説明
図１は、化合物Ｉの非レシオメトリックなカルシウム滴定を示す。それぞれが化合物Ｉ ５μΜを含有する、適切な体積の１０ｍＭカリウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）および１０ｍＭカルシウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）を混合し、目的の遊離カルシウム濃度０ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、４５０ｎＭ、および３９μΜを得た。５４０ｎｍでの励起を有する、各溶液の発光スペクトルを記録し、カルシウム濃度の増加に伴って、６５０ｎｍで発光強度が激しく増加した。解離定数を計算し、約４００ｎＭが得られた。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−３でスペクトルを記録した。
【００３１】
図２は、化合物Ｉのレシオメトリックなカルシウム滴定を示す。それぞれが化合物Ｉ ５μΜを含有する、適切な体積の１０ｍＭカリウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）および１０ｍＭカルシウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）を混合し、目的の遊離カルシウム濃度０ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、４５０ｎＭ、および３９μΜを得た。４８８ｎｍでの励起を有する、各溶液の発光スペクトルを記録し、カルシウム濃度の増加に伴って、５２０ｎｍで発光強度が減少し、６５０ｎｍで発光強度が増加した。等吸収点が５７５ｎｍで生じる。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−３でスペクトルを記録した。
【００３２】
図３は、化合物ＩＩの非レシオメトリックなカルシウム滴定を示す。それぞれが化合物Ｉ ５μΜを含有する、適切な体積の１０ｍＭカリウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）および１０ｍＭカルシウム−ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．２０）を混合し、目的の遊離カルシウム濃度０ｎＭ、５０ｎＭ、１５０ｎＭ、４５０ｎＭ、および３９μΜを得た。６３５ｎｍでの励起を有する、各溶液の発光スペクトルを記録し、カルシウム濃度の増加に伴って、６９０ｎｍで発光強度が増加した。ＳＰＥＸ Ｆｌｕｏｒｍａｘ−３でスペクトルを記録した。
【００３３】
図４は、ラットの迷走神経細胞におけるカルシウムに対する化合物Ｉの応答を示す。ラットの迷走神経細胞におけるＡＴＰ誘発Ｃａ２＋トランジエントのレシオメトリックな発光測定である。ＳＤラット由来の迷走神経（結節）下神経節を酵素的に切り離した。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシンが補われたＬｉｅｂｏｗｉｔｚ Ｌ−１５培地に、結節神経細胞の収量を懸濁し、Ｎｏ．１ガラスカバースリップ上にプレーティングした。神経細胞を化合物Ｉ ３μΜ、ＡＭエステルと共に室温で５０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、新たなＬ−１５培地中で４０分間維持し、ＡＭエステルを細胞内で加水分解させて、完了まで続けた。指示薬がローティングされた神経細胞を倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００Ｍ Ｚｅｉｓｓ）のステージ上に位置付け、Ｌｏｃｋｅ溶液（ＣＯ２ ５％とＯ２ ９５％の混合物で平衡化されている）で灌流した。ＬＳＭ ５１０システム（Ｚｅｉｓｓ）を用いて９×４０対物レンズ（開口数１．２；油浸）によってフレームレート０．５Ｈｚにて、共焦点イメージング顕微鏡法を行った。励起は４８８ｎｍであり；５４５ｎｍ二色性ミラーによって蛍光発光が、２つの構成要素：５００〜５５０ｎｍバンドパスフィルターを通過する短波長要素（Ｆ５２５と表される）と、５６０ｎｍロングパスフィルターを通過する長波長要素（Ｆ６５０）に分離された。灌流液を通して送達される１０秒パルスのＡＴＰ１００μｍで神経細胞を刺激した。
【００３４】
図５は、ハロゲン化ナフトール前駆物質を合成するための合成スキームを示す。６−ヒドロキシナフトエ酸をエステル化し、得られたエステルをＳｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒでジェミナルに二フッ素化し、（２）を得て、続いて直ぐに、亜鉛および酢酸で還元し、モノフルオロ化合物（３）を得た；そのフッ素化化合物を塩素化して（４）を得て、次いでフェノールを臭化ベンジルで保護して（５）を得た。水素化アルミニウムリチウムで（５）のメチルエステルを最初にアルコールに還元し、そのアルコールをクロロクロム酸ピリジニウムでアルデヒド（７）に酸化することによって、最終化合物を得た。バイヤー・ビリガー反応によって、アルデヒドをナフトール（８）へと転化し、ＢＢｒ３でベンジル保護を脱保護することによって（９）を得た。
【００３５】
図６は、化合物Ｉを合成するための方法Ａを示す。市販の３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸をエステル化し、次いで２−ブロモエトキシ−４−メチル−ニトロベンゼンと共役させ、ＢＡＰＴＡ主鎖が形成された。エステルを遊離酸へと加水分解した後、混合無水物が形成し、それを４−ハロレゾルシノールと反応させて、ベンゾフェノンを得た。塩化第一スズでニトロ基を還元し、得られたアニリンをアルキル化する前に、そのフェノール基をベンジルエーテルとして保護した。パラジムと水素での脱ベンジル化によってケトンが製造され、メタンスルホン酸の存在下で５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンとカップリングすることによって色素が形成された。この色素を続いて、カルシウムキレート化カリウム塩へと加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、次いで酢酸ブロモメチルでそれをアルキル化し、膜透過性のアセトキシメチル（ＡＭ）エステルが得られた。
【００３６】
図９は、化合物Ｉを合成するための方法Ｂを示す。メタンスルホン酸の存在下にて、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚらからのアルデヒド前駆物質を４−ハロレゾルシノールおよび５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンにカップリングした。次いで、そのエステルをカルシウムキレート化カリウム塩へと加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、それをアルキル化してアセトキシメチル（ＡＭ）形が得られた。
【００３７】
図７は、化合物ＩＩを合成するための方法Ｂを示す。Ｇｒｙｎｋｅｗｉｃｚら１からのアルデヒド前駆物質をメタンスルホン酸の存在下にて５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンにカップリングした。次いで、エステルをカルシウムキレート化カリウム塩に加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、それをアルキル化してアセトキシメチル（ＡＭ）形が得られた。
【００３８】
図８は、化合物ＩＩＩおよびＩＶを合成するための方法Ｃを示す。５位でニトロ化する前に、市販の４−ヒドロキシフタル酸をジメチルフタレートにエステル化した。２−ブロモエトキシ−４−メチル−ニトロベンゼンとの反応によって、ＢＡＰＴＡ主鎖が形成された。メチルエステルを加水分解した後、無水酢酸におけるフタル酸が環状無水物を形成した。４−ハロレゾルシノールでのフリーデル・クラフツのアシル化によって、異性体ベンゾフェノンが形成され、さらに進行する前に、カラムクロマトグラフィーによってそれを分離した。塩化第一スズでニトロ基を還元する前に、フェノールおよび遊離酸をベンジル化し、続いて得られたアニリンをアルキル化した。パラジウムおよび水素で脱ベンジル化することによって、メタンスルホン酸の存在下にて５，７−ジハロ−１，６−ジヒドロキシナフタレンにカップリングした場合に色素が形成された。その色素をカルシウムキレート化カリウム塩へと加水分解した。酸性化によって遊離酸が形成され、それをアルキル化し、膜透過性ＡＭ形が得られた。
【実施例】
【００３９】
化合物ＩおよびＩＩの合成
本発明の一態様は、セミナフトフルオレセイン、ジナフトフルオレセイン、およびセミナフトローダミン様フルオロフォアのｐＫａを下げる能力である。かかる変化を可能にする前駆物質は、５−フルオロ−７−クロロ−１，６−ナフタレンジオール（図５、化合物９）である。
【００４０】
実験的な図５からの化合物９の合成：
メチル−５−フルオロ−６−ヒドロキシナフトエート（３）
６−ヒドロキシナフトエ酸（２５ｇ）をメタノール（２５０ｍｌ）に溶解し、硫酸（２５ｍｌ）を添加した。混合物を８０℃で一晩加熱した。反応混合物を冷却し、酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、次いで重炭酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させ、クリーム色の固形物（２４ｇ）としてエステルを得た。そのエステル（１０ｇ）をアセトニトリル（５００ｍｌ）に溶解し、Ｓｅｌｅｃｔｆｌｕｏｒ ２当量を添加し、室温で３時間攪拌し、その時点で出発原料は消費されていた。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて、クリーム色の固形物（７ｇ）としてジェミナルに二フッ素化された化合物（２）が得られた。酢酸２００ｍＬ中の亜鉛粉末２ｇを使用して、この固形物をモノフルオロ化合物へと還元した。固形物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル６：１）によって、化合物３を６ｇ得た。
【００４１】
メチル−５−フルオロ−６−ベンジルオキシ−７−クロロ−ナフトエ酸エステル（５）
化合物（３）５ｇをトルエン（５０ｍｌ）に溶解し、ｓ−ブチルアミン（５００μｌ）を添加し、反応混合物を油浴で６６℃に維持し、塩化スルフリル（１．２当量）を３時間にわたって添加した。混合物を酢酸エチルで希釈し、ブライン、５％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、（４）を得た。残留物をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（４ｇ）に続いて臭化ベンジル（３ｍｌ）を添加した。すべての出発原料が消費されたことがＴＬＣで分かった時に、混合物を還流下にて２時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、油状残留物を得て、それをヘキサン：酢酸エチル（９：１）のカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固形物（３ｇ）として（５）を得た。
【００４２】
５−フルオロ−６−ベンジルオキシ−７−クロロ−ナフトアルデヒド（６）
化合物（５）（５．８ｇ）をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に溶解し、無水エーテル７５ｍＬ中の水素化アルミニウムリチウム（２当量）に一滴ずつ添加した。添加が完了した時、攪拌をさらに３０分間続け、反応混合物を酢酸エチルで希釈し、希硫酸と共に攪拌した。有機抽出物を乾燥させ、蒸発させて、クリーム色の残留物を得た。その残留物を無水塩化メチレン（７５ｍｌ）に溶解し、ＣＨ２Ｃｌ２（７５ｍｌ）中のクロロクロム酸ピリジニウム（１．５当量）に添加し、室温で２時間攪拌した。酢酸エチルを反応混合物に添加し、次いで３００ｃｍ３のシリカに通してそれを濾過した。有機濾液を蒸発させて、淡褐色の固形物４ｇとして（６）を得た。
【００４３】
５−フルオロ−６ベンジルオキシ−７−クロロナフトール（８）
化合物６（３ｇ）をベンゼン（３０ｍｌ）に溶解し、ｍ−クロロ過安息香酸（２当量）を添加し、混合物を７０℃で２４時間加熱した。混合物を攪拌しながら、１Ｍ ＫＯＨ１０ｍｌを添加し、ギ酸エステルを加水分解した。反応混合物を１Ｍ ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて、ゴム状残留物が得られ、ヘキサン：酢酸エチル４：１のカラムクロマトグラフィーによって精製して、クリーム色の固形物２ｇとして（８）を得た。
【００４４】
５−フルオロ−７−クロロ−１，６−ナフタレンジオール（９）
化合物８（２ｇ）を塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶解し、三臭化ホウ素（ＣＨ２Ｃｌ２中で１Ｍ、３当量）を添加し、溶液を３時間攪拌した。氷水を反応に添加し、塩化メチレン、続いて酢酸エチルで抽出することによって、洗浄および蒸発後に淡褐色の固形物（１ｇ）として（９）を得た。色素の合成に直接使用できる状態であった。
【００４５】
実験的な化合物Ｉの合成：
化合物Ｉ、エチルエステル：
Ｇｒｙｎｋｅｗｉｃｚら１からのＢＡＰＴＡアルデヒド（１ｍｍｏｌ）、４−フルオロレゾルシノール（１ｍｍｏｌ）、および５−フルオロ−７−クロロ−１，６−ナフタレンジオール（１ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸１０ｍＬに室温で１時間溶解させた。氷中の３Ｍ酢酸ナトリウム２００ｍＬに反応を注ぎ、紫色の沈殿物を濾過した。真空下にて五酸化リンで乾燥させた後、固形物をクロロホルム／メタノール（１：１）２０ｍＬに溶解し、ｐ−クロラニル（２当量）を添加した。溶液を一晩還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、次いで紫色の固形物をメタノールに溶解した。不溶性ｐ−クロラニルを濾過除去した。濾液を蒸発させ、メタノール／クロロホルム勾配５〜１５％を用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物Ｉ、エチルエステルを得た。
【００４６】
化合物Ｉ、五カリウム塩：
純粋な化合物Ｉ、メチルエステル（０．５ｍｍｏｌ）をメタノール４ｍＬ中の２Ｍ ＫＯＨ水溶液（４．０ｍｍｏｌ）で室温にて３０分間加水分解した。水２ｍＬを添加し、メタノールを減圧下で除去した。完全に水性の反応を室温で１時間攪拌し、その時点でＣ１８ＴＬＣ（メタノール／ブライン３：２）によって加水分解が完了したことが分かった。氷を反応混合物に添加し、ｐＨが７．５〜８．５になるまで、２Ｍ ＨＣｌを添加した。水中で充填されたＬＨ−２０カラム３０ｇ上に弱い塩基性の溶液をローディングし、水で溶出した。純粋な生成物画分を真空下にて４５℃で溶媒から取り除き、化合物Ｉ、五カリウム塩を得た。
【００４７】
化合物Ｉ、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル：
化合物Ｉ、五カリウム塩（０．１ｍｍｏｌ）を氷水１ｍＬに溶解した。２Ｍ ＨＣｌを添加してｐＨを１．５とし、沈殿した遊離酸を濾過した。紫色の固形物を真空下にて五酸化リンで乾燥させた。次いで、無水ジメチルホルムアミド１ｍＬにそれを溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１．５ｍｍｏｌを添加した。室温で５分間攪拌した後、酢酸ブロモメチル１ｍｍｏｌを添加し、反応を室温で２時間攪拌した。混合物を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、０．１Ｍクエン酸５０ｍＬで２回洗浄し、ブライン５０ｍＬで１回洗浄した。有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下にて溶媒から取り除いた。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル１：１）によって純粋な化合物Ｉ、ＡＭエステルが得られた。
【００４８】
化合物ＩＩ、エチルエステル：
Ｇｒｙｎｋｅｗｉｃｚら１からのＢＡＰＴＡアルデヒド（１ｍｍｏｌ）および５−フルオロ−７−クロロ−ｌ，６−ナフタレンジオール（２．２ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸１０ｍＬに室温にて１時間溶解した。氷中の３Ｍ酢酸ナトリウム２００ｍＬに反応を注ぎ、青紫色の沈殿物を濾過した。真空下にて五酸化リンで乾燥させた後、固形物をクロロホルム／メタノール（１：１）２０ｍＬに溶解し、ｐ−クロラニル（２当量）を添加した。溶液を一晩還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、次いで青紫色の固形物をメタノールに再び溶解した。不溶性ｐ−クロラニルを濾過除去した。濾液を蒸発させ、メタノール／クロロホルム勾配５〜１０％を用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物ＩＩ、エチルエステルを得た。
【００４９】
化合物ＩＩ、五カリウム塩：
メタノール４ｍｌ中の２Ｍ ＫＯＨ水溶液（４．０ｍｍｏｌ）で、純粋な化合物ＩＩ、エチルエステル（０．５ｍｍｏｌ）を室温にて３０分間加水分解した。水２ｍＬを添加し、減圧下にてメタノールを除去した。完全に水性の反応を室温で１時間攪拌し、その時点でＣ１８ＴＬＣ（メタノール／ブライン３：２）によって加水分解が完了したことが分かった。氷を反応混合物に添加し、ｐＨが７．５〜８．５になるまで、２Ｍ ＨＣ１を添加した。水中で充填されたＬＨ−２０カラム３０ｇ上に弱い塩基性の溶液をローディングし、水で溶出した。純粋な生成物画分を真空下にて４５℃で溶媒から取り除き、化合物ＩＩ、五カリウム塩を得た。
【００５０】
化合物ＩＩ、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル：
化合物ＩＩ、五カリウム塩（０．１ｍｍｏｌ）を氷水１ｍＬに溶解した。２Ｍ ＨＣｌを添加して、ｐＨを１．５とし、沈殿した遊離酸を濾過した。青紫色の固形物を真空下にて五酸化リンで乾燥させた。次いで、無水ジメチルホルムアミド１ｍＬにそれを溶解し、ジイソプロピルエチルアミン１．５ｍｍｏｌを添加した。室温で５分間攪拌した後、酢酸ブロモメチル１ｍｍｏｌを添加し、反応を室温で２時間攪拌し、時間が経つにつれて無色になった。混合物を酢酸エチル５０ｍＬで希釈し、０．１Ｍクエン酸５０ｍＬで２回洗浄し、ブライン５０ｍＬで１回洗浄した。有機物質を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下にて溶媒から取り除いた。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル２：１）によって純粋な化合物ＩＩ、ＡＭエステルが得られた。
【００５１】
参考文献
特許文献
米国特許第４，８４９，３６２号明細書；ＤｅＭａｒｉｎｉｓら、１９８９年７月
米国特許第５，０４９，６７３号明細書；Ｔｓｉｅｎら、１９８９年９月
米国特許第４，６０３，２０９号明細書；Ｔｓｉｅｎら、１９８６年７月
非特許文献
ｉ Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ， Ｇ．，Ｐｏｅｎｉｅ，Ｍ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０，３４４０−３４５０．
ｉｉ Ｍｉｎｔａ，Ａ．，Ｋａｏ，Ｊ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４，８１７１−８１７８．
ｉｉｉ ｌａｔｒｉｄｏｕ，Ｈ．，Ｆｏｕｋａｒａｋｉ，Ｉ．，Ｋｕｈｎ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｒｃｕｓ，Ｅ．Ｍ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｋａｔｅｒｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．Ｅ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，（１９９４）１５，１９０−１９８．
ｉｖ ＤｅＭａｒｉｎｉｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｋａｔｅｒｉｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｈ．Ｅ．，Ｍｕｉｒｈｅａｄ，Ｋ．Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９０）１１２，３８１
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
（式中、Ｒ１は、Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、またはＣＩであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｍｅ、Ｆ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１、
または
であり、
Ｒ４は、ＨまたはＣＯ２Ｒ１であり、
Ｒ５は、ＯＲ１またはＮ（ＣＨ３）２であり、
Ｘ、Ｙ、およびＺが独立して、Ｈ、Ｆ、またはＣｌである）
を有することを特徴とする、化学的化合物およびその薬学的に許容される非毒性塩およびそのエステル。
【請求項２】
一般式：
（式中、Ｒ１は、Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、またはＣｌであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｍｅ、Ｆ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１、
または
であり、
ＸおよびＹが独立して、Ｈ、Ｆ、またはＣｌである）
を有することを特徴とする、化学的化合物およびその薬学的に許容される非毒性塩およびそのエステル。
【請求項１】
一般式：
（式中、Ｒ１は、Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、またはＣＩであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｍｅ、Ｆ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１、
または
であり、
Ｒ４は、ＨまたはＣＯ２Ｒ１であり、
Ｒ５は、ＯＲ１またはＮ（ＣＨ３）２であり、
Ｘ、Ｙ、およびＺが独立して、Ｈ、Ｆ、またはＣｌである）
を有することを特徴とする、化学的化合物およびその薬学的に許容される非毒性塩およびそのエステル。
【請求項２】
一般式：
（式中、Ｒ１は、Ｈ、塩（つまり、Ｋ＋）、またはＣＨ２ＯＣＯＣＨ３（ＡＭエステル）であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、またはＣｌであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ｍｅ、Ｆ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１、
または
であり、
ＸおよびＹが独立して、Ｈ、Ｆ、またはＣｌである）
を有することを特徴とする、化学的化合物およびその薬学的に許容される非毒性塩およびそのエステル。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８−１】
【図８−９】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７】
【図８−１】
【図８−９】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５０８３０４（Ｐ２０１３−５０８３０４Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４４４０（Ｐ２０１２−５３４４４０）
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３０８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４７３９１
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９９８５１）アサンテ リサーチ，エルエルシー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＡＮＴＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５３０８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４７３９１
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９９８５１）アサンテ リサーチ，エルエルシー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＡＮＴＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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