ワクチンに対する免疫応答を増強する方法
本発明は、Ｔｈ１刺激サイトカイン、好ましくはインターフェロンの有効量を、抗原またはワクチンの十分量の投与と同時に実質的に口腔粘膜経由で投与することからなる、抗原またはワクチンに対する免疫反応を増強するための方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチン接種に対する免疫反応を増強するための方法に関する。特に、ワクチン投与に引き続く免疫反応を増強するための免疫アジュバントとしての、インターフェロン、および／または他のＴｈ１刺激サイトカインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは従来技術において既知である。一般的にワクチンは、不活化もしくは弱毒化抗原およびサブユニットワクチン、すなわち、それに対して免疫反応がのぞまれるような他の抗原からなるワクチンを含み、これらは感染病の予防、改善または治療の目的で投与される。
【０００３】
特に、サブユニットワクチンは、宿主免疫系によって仲介される防御のための重要な標的と考えられている病原体構成成分由来の抗原に基づいている。高い安全性は証明されているが、サブユニットワクチンは、その基礎となる抗原の免疫原性が乏しいかないために、しばしば不十分な免疫反応を導く。
【０００４】
このため、免疫原性を向上させるために、サブユニットワクチンは、アジュバントを含むかあるいはアジュバントとともに投与される必要がある。アジュバントは免疫学的観点から、「抗原性を増強するために用いられる賦形剤」（ステッドマン医学辞典、２００３）と定義される。このため、賦形剤は、抗原とともに投与される場合、抗原単独の場合と比較して抗原性を増強する物質である。
【０００５】
動物モデルならびに、時に不活化マイコバクテリア（フロイント不完全アジュバント）、抗原が吸収される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウムまたはリン酸）の懸濁液、サポニンおよびＬＰＳ抽出生成物を含有する抗原溶液を鉱物油中に乳化した油中水乳剤（フロイント不完全アジュバント）を含む古典的な標本において、多くの種類のアジュバントが使用されてきたが、最近は、アルミニウムに基づく金属塩が、ヒトにおけるワクチン製剤において通常含まれる唯一のアジュバントである。安全ではあるが、このような塩は、抗体誘導には弱いアジュバントであり、古典的細胞免疫反応を刺激することができない。
【０００６】
抗体および細胞性反応の両方の誘導は、抗原の拡散の制限および排除する目的で、抗原の進入を非常に効果的に防御する。ワクチンは、強力で防御的な免疫反応を誘導するための二種類のシグナルを提供または誘導する必要がある。第一に、ワクチンは、ＴおよびＢリンパ球上の抗原特異的受容体を誘発する抗原を供する必要がある。第二に、効果的なワクチンは、抗原提示細胞による副刺激分子の発現を誘導する必要があり、これによって、抗原により誘発されたリンパ球による強力な反応を促進する。この第二のシグナルは、生きた病原体を含むワクチンを使用するときに、感染に関連した要因によってしばしばもたらされるが、サブユニットワクチンにおいては欠如し、乏しい免疫原性となる。この第二のシグナルに寄与することのできるアジュバントの添加は、ワクチンの効果を増強し、さらに、誘導される免疫反応の種類を決定することができる。
【０００７】
これらのシグナルは、与えられた感染体に対する免疫反応の役割の種類および能力を特徴付けるエフェクター機構を引き続いて発現させる宿主免疫系を導く。
【０００８】
サイトカインは、抗原および感染体に対する免疫反応の経路において、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む免疫応答性細胞間の情報伝達に関わる重要な要素である。マウスおよびヒトＴヘルパー（Ｔｈ）クローンについての多くの研究が、Ｔｈ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２と呼ばれる）によって提示される異なる活性の存在について広範な証拠を供し、これはサイトカイン分泌の分析結果から推測された。このため、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４の生成が、それぞれＴｈ１またはＴｈ２反応の典型的な特質として考えられる。免疫反応のＴｈ１タイプは、通常マウスにおけるＩｇＧ２ａ生成および細胞性免疫の発現に関連し、一方反応のＴｈ２タイプはＩｇＥ生成、好酸球および肥満細胞生成に関連する。免疫反応のＴｈ１タイプの誘導が、ウイルスおよびある種のバクテリア感染に対する防御免疫反応の発生における手段であると通常考えられている。この点、アルミニウムに基づく金属塩といった、臨床的に利用可能なアジュバントが、免疫反応のＴｈ２タイプを誘導する傾向があり、これによって、のぞまれない副作用に寄与するアレルギー反応をもたらしうる。
【０００９】
インフルエンザワクチンは、罹患率ならびに高齢者および免疫反応不全者を含む高リスク群における死亡数を減じるが、全受容者においては全体としては予防的ではない（オックスホードら、２００３）。通常使用されるサブユニットワクチンによってもたらされる防御は、基本的にウイルス血球凝集素に対する抗体の生成によるものと考えられ、このようなワクチンは細胞障害性Ｔ細胞反応の誘導はとぼしく、そして血球凝集抑制（ＨＩ）抗体力価は、防御における代理マーカーとして通常使用される。ウイルス性抗原に対する中和抗体（ＩｇＧ２ａ）の生成は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の関与を要し、これはＭＨＣクラスＩＩ抗原と関連して抗原を認識し、そしてＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７多型性の増加頻度が、「危険にさらされている」インフルエンザワクチン接種に対する無反応者において観察される（ゲルダーら、２００２）。
【００１０】
高効率的なアジュバントの不在は、ワクチンの成功する開発に対する重大な障害となり、特に、細胞性免疫を必要とするような、細胞内抗原に対して向けられている場合にはそうである。現在、インフルエンザに対する抗体反応および他のワクチンを増強することの可能な効果的な無毒性の成分または方法はまだ満たされていない。
【００１１】
これに関連して、上記性質によれば、サイトカインは、および特にインターフェロン（ＩＦＮｓ）においては、従来技術においてアジュバントの可能性があると考えられている（ヒートら、１９９２）。
【００１２】
インターフェロンは、以下のように構造に基づいて分類されている多機能のサイトカインである。
ｉ）Ｉ型ＩＦＮｓ。イントロンを欠く遺伝子によってコードされ、少なくとも１３の機能ＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮ−αファミリー、ＩＮＦ−βおよびＩＦＮ−ωを含み、すべての細胞タイプによって効率的に生成される。
ｉｉ）ＩＩ型ＩＦＮ。単一イントロンを含む遺伝子によってコードされ、ＩＦＮ−γとも呼ばれ、基本的に特異的抗原もしくはマイトジェンに対して反応してＴ細胞およびＮＫ細胞によって生成される。
【００１３】
もともと単純抗ウイルス物質とされているＩ型ＩＦＮｓは、引き続いて種々の生物学的効果を示すことが明らかにされてきていて、これは患者におけるのと同様実験動物における抗腫瘍活性も含む。
【００１４】
Ｉ型およびＩＩ型ＩＦＮｓはともに、試験管内の抗体産生における潜在的な抑制効果およびＴ細胞増殖を引き出すことが示されていて、これらのサイトカインがどのように促進性または抑制性に生体内で働くかの疑問を提起している。異なるモデル系において得られたデータの総合が、免疫反応のＴｈ１タイプの誘導ならびにある種のＴ細胞集団の増殖、機能活性および生存の補助における、Ｉ型ＩＦＮの重要性を示している（ベラルデリＦおよびグレッサーＩ、１９９６；およびタフら、１９９６）。
【００１５】
Ｉ型インターフェロンは、現在臨床的用においてもっとも広く使用されているサイトカインである。特に、ＩＮＦ−αは、いくつかのウイルス性疾患（特にＣ型肝炎）ならびに、いくつかの血液悪性腫瘍（ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、いくつかのＢおよびＴ細胞リンパ腫）ならびにある種のメラノーマ、腎癌およびカポジ肉腫といった充実性腫瘍を含む、様々な種類のヒト腫瘍の治療のために、４０カ国を超える国々において世界的に使用されている。対照的に、少なくともある程度毒性のために、ＩＦＮ−γは臨床適用が限られていることが見出されている。この数年にわたって、いくつかの研究が、異なる実験系においてＩ型およびＩＩ型ＩＦＮｓによって与えられる生物学的効果が、活性の種類に基づいて実質的に異なるという証拠を供してきた。メラノーマおよび多発性硬化症においてといった、いくつかの例においては、ＩＦＮ−γの臨床的使用が、Ｉ型ＩＦＮによって達成されるのに対して副作用をもたらしている。
【００１６】
その幅広い臨床的な使用にもかかわらず、Ｉ型ＩＦＮはヒトにおいてワクチンアジュバントとしてはまだ使用されていない。
【００１７】
ワクチン中のアジュバントとしての生体内におけるＩＮＦｓの適切な使用は、ＩＩ型ＩＦＮ（すなわちＩＦＮγ）について示されてきた。特に、特許文献１において、ネズミマラリア原虫の悪性ＹＭ株に感染したマウスの血液細胞から単離された、粗蛋白抽出物を含むものとしてワクチンが記述されていて、これはＩＦＮ−γをアジュバントとして含む。ワクチンに含まれたＩＦＮ−γの量は、投与につき１，０００ないし１０，０００ユニットの範囲であることが示されていて、ここでアジュバント効果を生ずるＩＮＦ−γの量は１００ないし５０，０００ユニットであると示されている。使用された投与量は５，０００ユニットで、２００ユニットよりも少ない投与でも効果的であることが示されている。
【００１８】
アジュバントとしてのＩ型ＩＦＮの使用は、いくつかの従来技術の文献によって予想されていて、ワクチンアジュバントとして使用されるとき、Ｉ型ＩＦＮが生体内における防御ＴｈＩタイプ反応を増強することが示されている。
【００１９】
ＩＦＮ−αは強力なポリクローン性Ｂ細胞活性化剤で、ウイルスの攻撃に対するアイソタイプ転換および防御によって特徴付けられる強力な一次液性免疫反応を導く（レボンら、２００１）。実際、ウイルス感染に対して形質細胞様樹状細胞によって分泌されるＩＦＮ−αが、Ｂリンパ球を抗体生成形質細胞に分化させて、インフルエンザ感染に対して反応して特異的およびポリクローン性ＩｇＧｓともに生成するために必要であることが示された（ジェゴ、２００３）。さらに、ＩＦＮ−αが、ウイルス感染に対するＴｈ１免疫および防御の特徴であるＩｇＧ２ａ抗体反応を刺激することが示され（レボンら、２００１）、インフルエンザワクチンに混合し筋注されるときに異常に強力なアジュバントになることが示された（プロイエッティら、２００２）。対照的に、ミョウバンといったアジュバントは、Ｔｈ２反応の特徴であるＩｇＧ１生成を増強する。ＩＮＦ−αは、抗−ＩｇＭ抗体に反応して顕著にヒト扁桃Ｂ細胞の増殖を増強することが示されている。加えて、口腔粘膜から投与されたＩＦＮ−αは、ヒトインフルエンザワクチンと混合し共投与されると、分泌ＩｇＡのレベルを増強する活性粘膜アジュバントとなることが示されている（プロイエッティら、２００２）。
【００２０】
Ｉ型インターフェロン、主にインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）は、感染体に対する先天性免疫応答の一部として粘膜表面に生成される。組換えＩＦＮ−αの口腔粘膜投与は、ＩＦＮの口腔粘膜生成に類似し、ウイルス感染および腫瘍細胞増殖に対する防御を与えることが示された（トベイおよびマウリ、１９９９）。ＩＦＮの血中濃度がない細胞免疫の刺激を通じて毒性なく防御が生じる（エイドら、１９９９）。特に、ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与は、樹状細胞の成熟および抗原提示、ならびに外来抗原に対するＴヘルパーＩ型（Ｔｈ１）リンパ球の反応を刺激する（ベラルデッリら、２００２）。このため、口腔粘膜ＩＦＮ治療は、ウイルスまたは腫瘍抗原のどちらの反応であろうと、進行中の免疫反応における宿主防御を刺激するにもっとも効果的である。
【００２１】
特許文献２および特許文献３は、ワクチン組成のアジュバントとしての、特に抗ウイルスワクチン組成のアジュバントとしての、インターフェロン−αサブタイプの使用を開示している。
【００２２】
抗腫瘍ワクチンとの使用のための、効果的なアジュバントの必要性がある。たとえば、メラノーマは典型的な免疫原性腫瘍の一つであるが、多くの腫瘍抗原は自己抗原であり、自己抗原に対する寛容のために腫瘍ワクチンの治療効果を制限する。このため、多くのワクチン経路が使用されてきたが、チオシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３／ＭＡＧＥ−Ａ６、Ｔｒｐ−２、およびｇｐ１００を含むＭＡＧＥファミリーのメラノーマ抗原由来のワクチンは、細胞毒性Ｔ細胞の一次的活性化および制限的な臨床反応のみをもたらす。これらは直接免疫（ペプチドワクチン）、ウイルスベクターもしくはペプチドを発現する裸のＤＮＡ、または抗原をもつ樹状細胞（樹状細胞に基づくワクチン）といった負荷抗原発現細胞を含む。
【００２３】
細胞の養子免疫伝達は、Ｔ調節細胞のリンパ除去と組み合わせて高反応性Ｔ細胞亜母集団選択および活性化によって寛容を克服する手段を供する。このため、非骨髄機能廃絶性リンパ除去化学療法（シクロホスファミドおよびフルアラビン）に引き続く、高用量ＩＬ−２治療と一緒の自己腫瘍反応性Ｔ細胞の養子免疫伝達は、ＭＡＲＴ−１メラニン細胞分化抗原に特異的なＴ細胞クローン集団の生体内における急速な成長をもたらし、かつ転移性腫瘍の破壊および進行性疾患（ステージＩＶメラノーマ）をもった患者における目的の臨床反応をもたらす。同時性腫瘍緩解をもった患者のなかには、白斑および前部ブドウ膜炎を含むメラニン細胞の自己免疫性破壊の徴候も示す（ダドゥレイら、２００２）。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの添加は、非骨髄機能廃絶性リンパ除去化学療法に引き続く、高用量ＩＬ−２治療と一緒の自己腫瘍反応性Ｔ細胞の養子免疫伝達の抗腫瘍活性を増強する（レスティフォ、２００４）。
【００２４】
ＭＡＧＥ３蛋白質ワクチンを１．０ＣｐＧとともに使用するステージＩＶメラノーマの治療は、１ＣＲ、２ＰＲ、２ＳＤ、および２ＰＤをもたらす（デービス、２００４）。
【００２５】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、幅広い範囲の抗原に対して、液性および細胞性抗原特異的反応を増強する。非メチル化ＣｐＧモチーフは、いくつかの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）のうちの一つであり、これは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在するトール様受容体（ＴＬＲ）を通じて先天性免疫反応を活性化する。ＣｐＧは、ヒトＢ細胞および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の表面のみに見出されるＴＬＲ−９を活性化する。ＴＬＲ−９のようなトール様受容体は、先天性および適応免疫反応の橋わたしとして機能し、Ｂ細胞の直接活性化および免疫グロブリン産生、ｐＤＣの活性化、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の上方調節、Ｂ７発現、およびＣＤ４０発現、および増強した抗原提示、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化およびＴｈ１サイトカイン反応の活性化をもたらす。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの活性は、Ｉ型ＩＦＮ受容体シグナリングに依存していて、外因性Ｉ型ＩＦＮの添加は経路の上流をバイパスすることを可能にするとともにＣｐＧの代用をすることを可能にし、細菌刺激がない状態で副刺激分子の上方調節を導くことができる。さらに、ＩＦＮ−α／β受容体−／−マウス（ＩＮＦＡＲ１−／−）またはポリクローン性抗ＩＦＮ−α／β抗体で処理した正常マウスにおいて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはアジュバント活性を欠いている。（レボンら、２００１；およびプロイエッティら、２００２）。
【００２６】
従って、有効な可能性のある組換え抗原が利用できるにもかかわらず、ワクチンに対する反応性および患者のコンプライアンスの弱さまたは欠如が、予防または治療サブユニットワクチンのための重大な問題を残している。サブユニットワクチンの弱い免疫原性のために、十分な応答を引き出すために多くの回数の投与を要することとなり、患者のコンプライアンスの欠如を重要な問題としてしまう。
【００２７】
このため、抗原の免疫原性を向上させて一貫した強力な免疫反応を促進する組成は、セロコンバージョン／セロプロテクションを導くだめに要するワクチン投与の回数を減らし、あるいは一回のみにし、広範囲な応用をもたらす。
【００２８】
ここに引用したいかなる文献も、このような文献が適切な従来技術であると認めることを意図したものではなく、または本出願のいかなる請求項の特許性に対する材料と考えられることを意図したものではない。すべての文献の内容または日付のすべての記述は、出願時に本願出願人が利用可能な情報に基づいており、このような記述の正確性についての認定を構成するものではない。
【特許文献１】欧州特許第０２４１７２５号
【特許文献２】米国特許第６，００７，８０５号
【特許文献３】米国特許第６，４３６，３９１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、ワクチンに対する免疫反応を増強するに十分な、インターフェロンおよび／または他のＴｈ１刺激性サイトカインを、実質的に同時にワクチン投与とともに口腔粘膜投与することによって、免疫反応を増強する方法に関する。増強された免疫反応は、液性または細胞性反応のいずれかまたは両方であることができる。本発明は特に、防御性免疫治療においてワクチンに対する増強されたＴｈ１タイプの液性免疫反応において効果的である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は（ａ）口腔粘膜以外の手段から対象へ供することにより、有効量のワクチンまたは抗原を投与し、（ｂ）ワクチンに対する免疫反応を増強するのに十分量のインターフェロンおよび／または少なくとも一の他のＴｈ１刺激サイトカインを口腔粘膜から投与し、前記インターフェロンおよび／または他のサイトカイン投与は前記ワクチン投与と実質的に同時である、から構成される、ワクチンに対する免疫反応を増強する方法である。
【００３１】
口腔粘膜投与されたインターフェロンおよび／または他のサイトカインは、ワクチンに対する抗体および細胞性免疫反応を増強するので、ワクチン投与と実質的に同時に投与されるとき免疫アジュバントとして効果的にはたらく。増強された免疫反応は、長期的抗体産生および免疫記憶によって特徴付けられる。インターフェロン、および／または他のサイトカインの口腔粘膜投与は、血流へのインターフェロンおよび／または他のサイトカインの運搬を必要としないので、大量のインターフェロンおよび／または他のサイトカインを、毒性反応を誘発することなく安全に使用することができる。これは、ミョウバンといった、既知のおよび現在利用可能なアジュバントの使用について大きな向上となる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、口腔粘膜経路を通じた組換えインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）による動物の治療が、市販のインフルエンザワクチン（ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）、アヴァンティス・パスツールＭＳＤ）の遠位の筋注に対して顕著に液性反応を増強するという、驚くべき発見に基づく。事実、テストしたインフルエンザ特異的免疫グロブリンの全４種（全部でＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡ）は用量依存法でＩＦＮ−αの口腔粘膜（ｏｍ）投与に続くインフルエンザワクチン接種に応答して著しく増加することが見出された。さらに顕著にも、口腔粘膜投与したＩＦＮ−αの免疫アジュバント効果は一定の条件下に、ＩＦＮ−αをインフルエンザワクチンと混合し混合物を筋肉内注射（ｉｍ）したときに得られたものよりも大きかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
ＩＦＮタンパク質の全身的な吸収の不在下、Ｃｒｇ２（これはリンパ球運搬を調節する）といったケモカインの急速な誘導のために、ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与が、末梢リンパ節から抗原（腫瘍またはウイルス性抗原にかかわらず）が全身的に送り込まれた箇所への免疫担当細胞の急速な移動をもたらす結果となることを示す、以前の研究結果によって、これらの結果の一部を説明することができる。対照的に、ワクチン接種から遠位の部位におけるＩＦＮ−αの非経口的な注入が、ほぼ確実に樹状細胞および他の抗原提示細胞をＩＦＮ注入部位かつワクチン接種部位から離れた部位へ移動させ、このためインフルエンザワクチンに対する液性免疫反応を減じる。
【００３４】
これは、「免疫アジュバント」とここで称される物質が、ワクチン接種部位から離れた部位において投与されるとワクチンに対する免疫反応を増強することができるという、最初の証明である。用語「免疫アジュバント」は、インターフェロンが典型的なアジュバントとしてはたらいていないものとして使用されていて、ここで典型的なアジュバントはワクチンの抗原性を増強するためにワクチンと混合しなければならない。一方で、本発明におけるインターフェロンの役割は、たとえば米国特許第６，３６１，７６９号および第６，６６０，２５８号および米国特許出願第２００３／０１０８５１９号において開示されているような、免疫刺激効果にのみよるものではない。ウイルス、腫瘍、および他の病原体の治療のための口腔粘膜投与インターフェロンの免疫刺激効果に関する、以前のこれら特許開示は、急速な細胞免疫反応に基づく。このため、観察される治療効果は、効果的な抗体反応の確立に先立って生じ、したがって効果的な抗体反応は研究されておらず、いずれにしても、その中で報告された実験の多くの中には含まれていない。実際、インターフェロンが抗体産生における促進または阻害効果のいずれを及ぼすかは未解決の問題であった。従って、本明細書に報告する免疫アジュバント効果は、インターフェロンの免疫刺激効果またはインターフェロンのアジュバント効果についての以前の報告とは異なり、それらから期待されるものでもない。アジュバントとしてのＩＦＮ−αと混合したワクチンの口腔粘膜投与を含むプロイエッティ、２００２の実施例から本発明を区別するために、本発明は、口腔粘膜投与ワクチンと併用するＩＦＮの使用をここにはっきりと除外する。
【００３５】
錠剤またはトローチ剤といった剤形に含まれる口腔粘膜投与インターフェロンをワクチン接種時に接種すると、顕著に抗体反応そしてこれによる防御の程度が増大し、これはインフルエンザワクチンについてのみならずすべてのワクチンについて適用できるであろうことが期待される。口腔粘膜ＩＦＮ剤形の明確な長所は、ワクチンとの混合剤中に投与される必要がある新規アジュバントについての場合のようなその薬剤とワクチンについて再認可の必要なく、適切なチェック機関によって証明された特定のワクチンの防御効果を増強するために使用することができることである。
【００３６】
非常に多くの研究が、天然インフルエンザウイルス感染によって得られる粘膜免疫が、感染予防、特に変異ウイルス感染に対する感染予防において、非経口ワクチン接種によって誘導される血清ＩｇＧ全身性免疫に比べて、より効果的であることを示してきた。イトウら、２００３を参照。免疫性を与えられた個体における血清ＩｇＧは、感染予防よりも致死的な肺炎予防に重要であることが明らかである。ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与は、ＩＦＮ−αをワクチンと混合して混合物を静注するときと比べて、血清ＩｇＡ抗インフルエンザ抗体を同程度の量またはより多くの量まで増量する。同様の効果は、ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与後の肺における抗インフルエンザｓ−ＩｇＡ抗体産生においても観察された。実験結果はさらに、口腔粘膜ＩＦＮ−αも最大抗体反応およびそれによるワクチン接種に続く完全な保護に達するのに必要な時間も減じる。
【００３７】
Ｉ型ＩＦＮ−またはＩＦＮ−αによって導かれる免疫反応は、特異的Ｉｇプロフィールによって特徴付けられる、すなわち、マウスにおいて、循環ＩｇＧ２ａおよび／または分泌ＩｇＡの特異的誘導によって特徴付けられる、Ｔｈ１タイプ反応であり、これはバクテリアまたはウイルスといった病原体の攻撃からの保護を与える。
【００３８】
本発明の非毒性免疫アジュバント組成において、ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮファミリーに属する任意のインターフェロンであることができ、または時にＩＩ型ＩＦＮと称されるＩＦＮ−γであることができる。これに関連して、ヒトへの最も効果的な投与は、１０５ないし１０８ＩＵの範囲であり、好ましくは１０６ないし１０７ＩＵの範囲である。
【００３９】
以下は本発明において使用することができるＩＦＮ源の非制限的な実施例である：健康なドナーの刺激白血球由来の天然ＩＦＮ−α（異なるＩＦＮ−αサブタイプまたは特定人のＩＦＮ−αサブタイプの混合）またはＮａｍａｌｗａ細胞由来のリンパ芽球様ＩＦＮ−α：コンセンサスＩＦＮ（ＣＩＦＮ）といった合成Ｉ型ＩＦＮ；組換えＩＦＮ−β（ＲＥＢＩＦ（登録商標）、セロノ；ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、ビオゲン；およびＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）、ベルレックスとして市販）またはＩＦＮ−α２ａ（ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅとして市販）およびＩＦＮ−α２ｂ（ＩＮＲＯＮ−Ａ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｇｈとして市販）といった組換えＩＦＭ−α、もしくはＩＦＮ−ω；ＤＮＡシャフリング法もしくは部位特異的突然変異誘発法によって生成した新規ＩＦＮ分子；ならびに一またはそれ以上のアミノ酸置換体、欠失もしくは付加またはＧｅｎＯｄｙｓｓｅｅのポリペプチドといった天然発生多型性をもった組換えヒトＩＦＮ−αもしくはＩＦＮ−β分子、国際公開第０２／１０１０４８号（国際公開第０２／０８３７３３号、国際公開第０３／０００８９６号、およびその他を参照）。
【００４０】
本発明の口腔粘膜投与されるインターフェロン剤形のための薬剤製剤において、当業者には明らかであるとおり、ＩＦＮのためにさまざまな媒体および賦形剤を使用することができる。典型的な製剤技術は、とりわけ、レミングトン１９９５、およびそれ以前の版に教示されている。ＩＦＮ製剤は、米国特許第４，４９６，５３７号にあるように、グリシンまたはアラニンといった安定増強剤を含むことができ、および／または、担体タンパク質といった一またはそれ以上の担体を含むことができる。たとえば、ヒトの治療のために、医薬品等級ヒト血清アルブミンを、選択的に希釈液としてのリン酸緩衝食塩水とともに、通常使用する。ここで、ＩＦＮのための賦形剤はヒト血清アルブミンであり、このヒト血清アルブミンはヒト血清から抽出することができ、または組換え物であることができる。通常、血清アルブミンが使用されるときは同一源である。
【００４１】
同時に投与されるワクチンに対する免疫反応をインターフェロンが効果的に増強することができるに十分な時間、口腔粘膜腔とＩＦＮとの接触を供することができるような任意の手段によって、ＩＦＮを投与することができる。これは、インターフェロンおよび口腔粘膜の少なくとも５秒以上の時間の接触を要し、好ましくは１〜２分、および可能ならば５分程度であり、すなわち、５ないし３６０秒である。このため、口腔粘膜投与は、経口投与とは明確に区別される。経口投与のための錠剤または液体配合を単に飲み下すだけならば、インターフェロンと口腔粘膜の接触はワクチンに対する免疫反応の増強には十分な時間ではない。
【００４２】
これらの条件の中で、本発明において使用されるＩＮＦ投与剤形が、いかなる特定の製剤タイプに限定されるものではないということが、明らかに理解されるであろう。ＩＦＮは口腔粘膜腔の奥深くに投与されることができ、点鼻薬もしくは鼻噴霧同様に液体、固体、またはエアロゾルによっても達成することができる。このため、剤形は、液体、噴霧、シロップ、トローチ剤、口腔もしくは舌下錠、および噴霧製剤を含むが、これに制限されるものではない。当業者は、エアロゾルまたは噴霧製剤のために、調製の粒子サイズが重要でありに気づくであろうし、粒子サイズを修正することができる適切な手段に気づく。このため、エアロゾルまたは噴霧製剤のためには、粒子サイズは鼻咽頭粘膜中に必要時間とどまるよう、インターフェロンを沈着することができる大きさでなければならない。肺への投与を意図した製剤は口腔粘膜製剤であることを考慮せず、従って粒子サイズは鼻咽頭粘膜錠への沈着を回避して肺に直接到達するように小さいもので、ここでは肺は所望の作用部位で循環に取り入れられる。
【００４３】
口腔粘膜への使用のためのインターフェロンの代表的な剤形は、以下のものを含む（すべての％はｗ／ｗである）。
【００４４】
錠剤：Ｄ形グルコースＢＰ４５％；ゼラチンＢＰ３０％；小麦デンプンＢＰ１１％；カルメロースナトリウムＢＰ５％；卵アルブミンＢＰＣ４％、ロイシンＵＳＰ３％；プロピレングリコールＢＰ２％；および５×１０６ＩＵのＩＦＮ−α２。このような錠剤は、口中でゆっくりと溶解することができ、または水に溶解して口中に必要なだけとどまることができる。
【００４５】
米国特許第４，６７５，１８４号にあるように、グリセリン４５％、ナトリウムＣＭＣ２％、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）２５％、蒸留水を１００％まで、および５×１０６ＩＵのＩＦＮ−α２から、インターフェロンペーストを調製することができる。インターフェロンペーストは頬粘膜へ付着することができる。
【００４６】
同様に、市販のうがい薬または咳止めシロップ製剤へ、所望の量のインターフェロンを添加することによって、うがい薬またはシロップを調製することができる。
【００４７】
本明細書に記述の動物実験において、口腔粘膜投与は鼻腔深くへのＩＦＮ製剤の投与によって達成することができ、このため口腔咽頭腔へ、すなわち、受容哺乳動物の口腔及び咽頭へ、急速に分配され、この腔の粘膜層と接触する。
【００４８】
本発明者の研究室による前の研究により、インターフェロンの口腔粘膜投与はＩＦＮの循環量の出現をもたらさないことが既知である（エイドら、１９９９および米国特許第６，３６１，７６９号）。
【００４９】
本記述の要旨は免疫アジュバントとしてのインターフェロンに関する一方で、本発明は、抗体産生および／またはＴｈ１反応の増強に働くことが知られている他のサイトカインの使用にも拡張される。本発明者による米国特許第６，６６０，２５８号は、宿主防御機構刺激効果を誘導するＴｈ１またはＴｈ２特異的サイトカイン投薬の口腔粘膜投与に関するものである。そこで開示されているＴｈ１サイトカインには、インターフェロンに加えて、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシン）が含まれる。このため、これらのサイトカインは、単独またはインターフェロンおよび／もしくはお互いと組み合わせで、インターフェロンについて本明細書に記述したのと同様の方法で、必要な変更をくわえて、本発明の免疫アジュバントとして使用することができる。このため、それぞれの効果的な投与は、過度の実験をすることなく当業者の通常の一によって容易に決定することができる。
【００５０】
抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物または脂肪抗原の精製または部分精製、および／または全細胞、特に抗原と混合される樹状細胞と関連する抗原を含む。全体的に見ると、任意の病原体または腫瘍および／または分化関連性抗原は、免疫アジュバントとしてＩＦＮと同時に与えられることが可能な免疫原として考えることができ、当業者によって容易に同定することができる。
【００５１】
本明細書の実験はインフルエンザワクチンＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）に関連する一方で、本発明が任意のワクチン接種に対する免疫反応を増強するであろうことが完全に期待される。しばしば用語「ワクチン」は予防を誘導することを意図したワクチン接種のみを言及するときに使用されるが、本明細書および請求項のすべてを通じてこの用語は治療目的のためのワクチン接種も同様に含むことを意図している。たとえば、腫瘍関連抗原を構成するワクチンは、腫瘍に対する免疫反応を導くことを意図している。ウイルス粒子に対するワクチンは、ウイルスに対する予防のみならず存在するウイルス感染の根絶としても使用することができる。このため、たとえば、ワクチンはＨＢＶに対して利用可能で、ＡＩＤＳおよびＨＣＶに対して利用可能で、これらは盛んに開発中である。アミロイド−β血栓に対する活性ワクチン接種もアルツハイマー疾患の治療に開発中である。従って、用語「ワクチン」は、抗原に対してまたはもとの状態で存在する交差反応抗原に対しての免疫反応を誘導する目的のための任意の抗原の投与に対して、適用される。好ましいワクチンは、インフルエンザ、天然痘、炭疽、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオ、結核または抗腫瘍ワクチンを含む。
【００５２】
インフルエンザワクチンについて示された結果から鑑みて本発明が任意のこのようなワクチンに応用可能なことが期待できるであろうことについての理由は、混合物において投与されるときにインターフェロンがアジュバントとして効果的であるということが既知であるという事実に基づく。たとえば、プロイエッティ、２００２、国際公開第０２／０８３１７０号およびレボンら、２００１参照。さらに、口腔粘膜投与インターフェロンが、遠位ではあるが同時に投与される抗原に対しての免疫反応を増強することがひとたび確立されると、免疫反応を引き起こす任意の抗原によって対象がワクチン接種されるときには同様ではないと信じる理由はない。治療のための口腔粘膜投与インターフェロンの既知の効果（たとえば、米国特許第６，３６１，７６９号参照）は、アジュバントとしてのインターフェロンの既知の効果と組み合わせて、インフルエンザワクチンについて示された結果を他の任意のワクチンに当てはめることを可能にするであろう。
【００５３】
たとえばミョウバンといった、ワクチンの抗原性を向上することを意図した現存のアジュバントは、深刻な副作用をもっていることが知られている。本発明において使用されるワクチンがその組成中にアジュバントを含むことができる一方で、そのようなアジュバントを除外することができかつ満足な免疫反応を持ったワクチンであることがのぞましい。口腔粘膜投与インターフェロン免疫アジュバントの使用は、この目的を供する。しかしながら、任意のワクチンがアジュバントなしには測定可能な免疫反応をもつことができない限りにおいては、本発明の免疫アジュバントの効果は個別的に基づいて試験しなければならない。
【００５４】
各ワクチン投与において存在する抗原の量は、アジュバントをもつか否かで、ワクチン接種された対象における防御免疫反応を導くことができる量として選択される。この量は、特異的抗原および典型的なアジュバントの存在の可能性に基づき、これは当業者によって同定することができる。通常、各投与は抗原を１ないし１０００マイクログラム含み、好ましくは１０ないし２００μｇ含む。さらなる成分もワクチン中またはアジュバント含有ワクチン中において有利に存在する。
【００５５】
いくつかの場合には、ワクチンまたはアジュバント化ワクチンは、所望の効果および使い勝手の観点から経皮的または筋注で注入することができる。いくつかのワクチンについて皮内注射は効果的に実施することができ、適量の樹状細胞を注射部位に補充するための適切な他の運搬系を考慮することができた。しかしながら、口腔粘膜投与は除外されている。
【００５６】
ワクチンの肺への経鼻投与および経口投与も、ウイルス性呼吸性感染、たとえば、インフルエンザウイルス感染、といった感染のこれらの経路で運搬された感染源について特に包含される。
【００５７】
さらには、ワクチンまたは直接アジュバント化ワクチンの経鼻、経口または任意の他の粘膜投与も有効な選択肢であり、これは、ワクチン運搬の非常に実用的手段を用いることによる局所および／または全身性の強力な防御免疫の誘導をもたらす。
【００５８】
当業者はこれに関連して、ワクチン接種が作用するように導かれる抗原としての機能の最も適切な製剤を決定することができる。
【００５９】
ワクチン組成は、食塩水、賦形剤、アジュバント（必要なら）、保存剤、安定剤等といった殺菌した生理学的に適合した担体を含む薬理学的組成として、任意の従来の方式によって製剤することができる。
【００６０】
使用に先立って殺菌した担体中に溶解するために、ワクチンは液体中または凍結乾燥製剤中にあることができる。製剤中のミョウバンまたはリポソーム様粒子の存在も可能であり、これらは抗原の離散を遅らせるために有用である。ワクチンのゆっくりとした離散を可能にする他の戦略は、当業者により容易に同定することができ、本発明の目的範囲に含まれる。
【００６１】
薬理学的に許容できる担体手段または補助剤は、当業者により各製剤について容易に同定することができる。
【００６２】
本発明の方法は、感染症および腫瘍の予防および治療上の処置の両方について使用することができる。特に、本発明の方法は、重度の慢性感染症のため（すなわち、治療ワクチン）と同様、ウイルス性および細菌性疾患の予防処置（すなわち、防御ワクチン）について使用することができる。さらに、本方法は、適切な抗原を使用すれば、腫瘍または他の疾患および状態の、予防および処置に使用することができる。
【００６３】
これは、たとえばＥＢＶ、ＨＰＶおよびヘリコバクターピロリ、または、たとえばＭＡＧＥ抗原、チロシナーゼｇａｐ１００、およびＭＡＲＴといった、明確な腫瘍関連抗原ヒト悪性腫瘍に関連した、ならびに他のヒト腫瘍に関連した感染源に対して、抗原を使用することによって、達成することができる。
【００６４】
特に、本発明の方法は、たとえば維持血液透析患者、移植患者およびＡＩＤＳ患者のようないわゆる低応答性または非応答性の対象へのワクチン接種のために、特に適する。通常、本発明の方法は、早期のセロコンバージョン／セロプロテクションがのぞまれるような状況にある高い感染の危険性のある個体へのワクチン接種に、有利に適している。
【００６５】
これらの特徴は、特にＨＢＶに対するワクチン接種にあてはまる。
【００６６】
付加的な実施例として、本発明の方法は、標準的なワクチン接種に対して反応が乏しい高齢の個体のインフルエンザウイルスに対する予防を誘導するために特に有用である。
【００６７】
他のウイルス性ワクチンについてと同様ＨＢＶワクチンについても、皮下注または筋注がのぞましく、他の場合、特に呼吸器系を通して宿主に感染することのできる感染源については、肺への経鼻投与が効率性および／または患者コンプライアンスの観点から利点を示す。
【００６８】
本発明の方法は、ワクチンが経口投与される場合にも使用することができる。ワクチンの経口投与は、ワクチンの嚥下を含み、このため、少なくとも５秒間の口腔粘膜との接触を必要とする口腔粘膜投与は含まない。従って、ワクチンが経口投与されるべき場合には、インターフェロンおよび／または他のＴｈ１刺激サイトカインを、ワクチンの経口投与の前後短時間内に、口腔粘膜投与することができる。肺へのワクチンの経鼻的な実質的に同時投与を伴った、インターフェロンおよび／または他のＴｈ１刺激サイトカインの口腔粘膜投与に関しても、同様である。
【００６９】
本発明の免疫アジュバントは、再接種とともにと同様最初のワクチン接種とともにも、ともに使用することができる。このため、抗原に対する免疫反応は、対象が抗原にさらされるときはいつでも増強することができ、これは個体が予防接種の対象とする抗原に対するワクチン接種後の暴露同様再接種時も含む。従って、免疫アジュバントの投与は、対象が問題の抗原に対して暴露されるときにも実施することができる。たとえば、生物テロ攻撃の可能性に対する予防のために、ヒトが炭疽菌に対して免疫化される場合、そしてそのしばらく後に前記対象がそのような攻撃で炭疽菌の存在に暴露した場合、本発明の免疫アジュバントの投与は、前記抗原に対する防御記憶免疫反応を増強する。免疫記憶反応は、ワクチン接種後の循環における記憶細胞の活性化に応答するものである。さらに、インターフェロンはポリクローン性Ｂ細胞活性化因子であるので、対象のワクチン接種の目標である特異的な抗原に対して彼または彼女を免疫反応が防御するであろうのみならず、対象が将来暴露される可能性のある関連するもしくは変異した抗原に対してある程度の交差防御を示すであろう。これは特に、抗原不連続変異および抗原連続変異の両方を示すことが知られているインフルエンザに対する予防に重要である。
【００７０】
従って、本発明の他の面は、以前対象に対して免疫アジュバントとしてのインターフェロンを記憶反応を増強する量、口腔粘膜投与によりワクチン接種したその目標である抗原に、感染または再度暴露したときの治療である。
【００７１】
本発明について大まかに述べてきたが、同じことを以下の実施例を通じることでより容易に理解することができるが、これは実例に基づいて供されていて、本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００７２】
最初のワクチン接種のインフルエンザワクチンに対する抗インフルエンザ抗体反応における口腔粘膜投与ＩＦＮ−αの効果
６ないし８週齢雄Ｃ５７Ｂ１／６のグループを、第０日に筋注（ｉｍ）投与によってＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）（アヴェンティス・パストゥールＭＳＤ）１５マイクログラムで処理したが、これは単独でまたは組換えマウスＩＦＮ―αもしくは組換えヒトＩＦＮ−αの逓増的な量（１０３、１０４、１０５、１０６、１０７ＩＵ）を含有する使用されたインターフェロンと同量のＰＢＳとともに、または使用されたインターフェロンと等価のＢＳＡを含有するＰＢＳとともに処理した。他のグループのマウスは筋注（ｉｍ）でワクチン接種して、動物へのワクチン接種時に対して−２、−１、０、＋１または＋２の各日に逓増的なインターフェロンを口腔粘膜経由（ｏｍ）で注入した。他のグループの動物は、ｉｍ注入またはｏｍ経由により、ＩＦＮまたはＢＳＡ単独で処理し、ワクチン接種は行わなかった。
【００７３】
抗体反応を１５日および３０日に、下記の免疫グロブリンサブタイプに特異的な抗原検出ＥＬＩＳＡ分析を用いて測定した。すなわち、血清中の全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡ、ならびに肺中の分泌ＩｇＡ。
【００７４】
結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａは、１５日後の抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。測定した各抗体について、左の棒柱はインターフェロンの同時投与のない単独でのワクチン投与後を示し、中央の棒柱はＩＦＮのｏｍ同時投与のあるワクチン投与後を示し、そして右の棒柱はワクチンおよびＩＦＮの混合物のｉｍ投与後を示す。図１Ｂは、３０日後の抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。どの場合においても、ｏｍインターフェロンとともにワクチン投与する場合の抗体反応が、インターフェロンなしに得られた反応と比して、より顕著である。
【００７５】
ワクチンと混合したインターフェロンの筋注による投与が、多くの場合ｏｍインターフェロン投与に比していくぶん良い結果を与えるが、なお舌下でのインターフェロン投与はｉｍに比して十分な利点がある。第一に、ｉｍインターフェロンの高用量投与ではしばしば重大な副作用がある。第二に、ワクチンとは別々ではあるが時間的に同時に投与される免疫アジュバントとしてのインターフェロンの使用は、インターフェロン含有製剤の登録のみを必要とする。言い換えれば、免疫アジュバントとしてｏｍインターフェロンを使用するには、既に認可されたワクチンの別個の再登録を要しない。インターフェロンがワクチンと混合されるアジュバントの場合、それが従来技術において既知のものであっても、ワクチン／アジュバント混合物の別個の認可が必要であり、これは費用及び時間がかかる。
【００７６】
ワクチンに対するＩｇＧ抗体反応のピークが最初のワクチン接種後約３０日で出現することは、ワクチンについての従来技術において一般的に既知である。図１Ａおよび図１Ｂを比較することで、ｏｍインターフェロン投与による加速的な効果の存在を確かにみることができる。
【００７７】
用量反応曲線（示されていない）は、最適な反応がインターフェロンの最大量（この実験における１０５）を投与する場合に得られることを示す。ヒトインターフェロンをマウスに使用する他の試験においては、用量反応曲線は、抗体反応があるレベルのピークまで上昇してから下降することを示す。従って、免疫アジュバントとしての使用のためのインターフェロンの最適量が存在することが予想されて、この量はヒトの治験を実施することで実験的に決定することができる。
表１は、一定の血清希釈における最適濃度というよりも終点力価として明示される免疫グロブリン力価の、１５日後の同様の実験の結果を示す。この実験も、ｏｍのＩＦＮ投与がワクチン単独よりも実質的によりよい結果を供することを裏付ける。しかしながら、この実験は、ｏｍのＩＦＮ投与による結果がｉｍインターフェロンおよびワクチンの混合投与による結果よりも実質的によりよいことを示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
マウスに対してインターフェロンを−２、−１、０、＋１、＋２日に投与した実験（示していない）の比較により、最適な効果はインターフェロンが第０日に投与されたときであることが確証された。第−１または−２日にｏｍ経路によって投与された場合、望ましい効果が起こらない。＋１日または＋２日にｏｍ経路によって投与された場合、インターフェロンをまったく投与しなかった場合と結果は実質的に同一である。このため、ＩＦＮ投与の最適時期は、ワクチンの投与と実質的に同時期であることが明らかであり、これはこのようなワクチン接種前後数時間であることを意味する。
【実施例２】
【００８０】
二回目のワクチン接種におけるインフルエンザワクチンに対する抗インフルエンザ抗体反応への口腔粘膜投与ＩＦＮ−αの効果
実施例２においては、マウスが第９０日に再接種されることを除いて、実施例１と同様の方法でマウスにワクチン接種した。各ワクチン接種段階、すなわち、第一および再度の接種各段階は、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）単独、ＩＦＮ−αと混合したＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）、またはｏｍのＩＦＮ−α投与と同時のＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）によってそれぞれ実施された。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、図２Ａについて最初のワクチン接種から１０５日後、または図２Ｂおよび２Ｃについて最初のワクチン接種から１２０後にそれぞれ測定された、これらの実験結果を示す。Ｉｇ力価は、特定の血清希釈における最適な密度測定として示される。最適な密度は４５０ｎｍで測定された。再接種１５日後には、ｏｍのＩＦＮ投与マウスにおける抗体力価においていくらか上昇があり、特に、予防について最も重要なＩｇサブタイプであるＩｇＧ２ａについてそうである。３０日後（図２Ｂ）、ｏｍのインターフェロン投与について非常に重要な効果が存在することを観察できる。実際、インターフェロンがワクチンと混合された場合および筋注で投与された場合に得られるものと比較しても、効果は明らかに高い。同様に、３０日後（図２Ｃ）も、気管支肺胞洗浄液中の抗インフルエンザ分泌ｓ−ＩｇＡ産生においてｏｍのインターフェロン投与が非常に重要な効果をもつことが観察される。
【実施例３】
【００８１】
ヒトに対する免疫アジュバントの効果を試験するために、以下の臨床試験を実施する。１４０の対象
において、無作為に２グループに分け、一のグループはインターフェロンを口腔粘膜投与で処置してから、すみやかにＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）を筋注で接種する。もう一つのグループは、ｏｍのプラセボで処置してから、すみやかにＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）を筋注で接種する。インターフェロンは口腔粘膜を介した経路によって、５百万ユニットのＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）組換えＩＦＮ−αを含有する生理食塩水５ｍｌの用量で投与される。対象は、嚥下する前に２分間口の中に前記生理食塩水をとどめるように指導される。実験対照の対象は、生理食塩水のみを摂取してからｉｍのＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）をワクチン接種される。前記対象は年齢６５ないし８５歳であり、白血病もしくは充実性腫瘍、すなわち自己免疫疾患をもっておらず、扁桃が無傷である。前記対象はすべて最近５年間にインフルエンザワクチンを受けている。抗体反応は、免疫グロブリンサブクラスを決定するために赤血球凝集阻害および抗原捕捉ＥＬＩＳＡの両方によって、第２１日に測定される。唾液中の分泌ＩｇＡレベルも測定する。これらの結果は、実施例１および２で引用した前臨床動物実験において得られた結果と比較することがのぞまれる。
【００８２】
本発明をここで完全に記述してきたが、過度の実験をすることなくとも、本発明の精神と範囲から逸脱しない同等のパラメーター、濃度、および条件の範囲において、同様に実施することができることは当業者によって認められるであろう。
【００８３】
本発明はその具体的な実施例と関連して記述されてきたが、さらなる変更が可能であると理解されよう。本出願は、総合的に本発明の理念に従い、かつ本発明が関連する当業者に既知もしくは慣例的な範囲内であるような本明細書からの逸脱や、前述の本質的特徴に適用することができ以下に添付の請求項の目的内での本明細書からの逸脱を含むような、本発明の任意の変形、利用、または適用を包含することを意図している。
【００８４】
学術論文または要約、公開されあるいは対応する米国もしくは他国の特許出願、登録された米国もしくは他国の特許、または任意の他の参考文献を含む、ここに引用したすべての参照は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれ、これは参照文献中に存在するすべてのデータ、表、図、および文章を含む。加えて、ここに引用した参照中に引用された参照のすべての内容もまた、完全に参照として組み込まれる。
【００８５】
既知の処置方法、従来の処置方法、既知の方法または慣習的な方法は、いかなる意味においても、本発明のいかなる面、記述または具体化について、従来技術において開示、教示または示唆されたことを認めるものではない。
【００８６】
先の具体的な実施例の説明は、本発明の総合的な性質を完全に明らかにして、当業者の知識（ここに引用した参照の内容を含む）を適用することにより、過度の実験をすることなく、本発明の総合的な概念から逸脱することなく、容易に具体的な実施例のような種々の応用に変更および／または適用することができる。従って、このような適用および変更は、ここに明らかにされた教示および指示に基づいて、開示された具体化と等価の意味および範囲のなかにあることを意味する。本明細書の語法または専門用語は、記述的ではあるが制限的ではない目的であると理解すべきであり、このため、本明細書の語法または専門用語は当業者が本明細書中での教示および指示に基づき、当業者の一の知識と組み合わせることによって、解釈すべきものである。
【００８７】
参照
Belardelli F.およびGresser I.著、「Ｔ細胞反応におけるＩ型インターフェロンの無視されてきた役割：その臨床的使用への意味（The neglected role of type I interferon in the T-cell response: implication for its clinical use.）」、Immunol Today。１９９６年、１７、ｐ．３６９−３７２
Davis、H.、Coley Pharmaceuticles、カナダ、オタワ、キーストーン・シンポジウム、「ワクチンおよび免疫療法の合理的設計（Rational Design of Vaccines and Immunotherapeutics）」、キーストーン、２００４年、１月、ｐ．６−１１
Dudleyら著、サイエンス、２００２年、２９８、ｐ．８５０−８５４
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Gelderら著、J. Inf. Dis.、２００２年、１８５、ｐ．１１４−１１７
Jegoら著、Immunity、２００３年、１９、ｐ．２２５−２３４
Le Bonら著、Immunity、２００１年、１４、ｐ．４６１−４７３
LienおよびGolenbock著、Nature Immunology、２００３年、４、ｐ．１１６２−１１６４
Oxfordら著、Vaccine、２００３年、２１、ｐ．２７４３−２７４６
Proiettiら著、J. Immunol、２００２年、１６９、ｐ．３７５−３８３
Remington著、「薬の科学および実際（The Science and Practice of Pharmacy）、第１８９版」、Mack Publishing Co.、ペンシルバニア州イーストン、１９９５年
Restifo、N.、ＮＣＩ，キーストン・シンポジウム、「ワクチンおよび免疫療法の合理的設計（Rational Design of Vaccines and Immunotherapeutics）」、キーストーン、２００４年、１月、ｐ．６−１１
Spraycar、Marjory編、「ステッドマン医学辞書（Stedman’s Medical Dictionary）」、Williams and Wilkins、１９９５年
Tough DF、Borrow P、およびSprent J.著、「生体内でのウイルスおよびＩ型インターフェロンによるバイスタンダーＴ細胞増殖の誘導（Induction of bystander T cell proliferation by viruses and type I interferon in vivo.）」、１９９６年、サイエンス、２７２、ｐ．１９４７―１９５０
ToveyおよびMaury著、J. IFN and Cytokine Res.、１９９９年、１９、ｐ．１４５−１５５
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】図１Ａは、ワクチン接種後１５日の、抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。抗体反応は、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。各抗体サブクラスは、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチンを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に、投与してから調べた。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ワクチン接種後３０日の、抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。抗体反応は、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。各抗体サブクラスは、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチンを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に、投与してから調べた。
【図２Ａ】図２Ａは、ワクチン再接種後の抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。マウスは第０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に注入することによって、ワクチン接種された。マウスは第９０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと同時に注入することによって、ワクチンを再接種された。抗インフルエンザ抗体反応を第１０５日に、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ワクチン再接種後の抗インフルエンザ抗体におけるＩＦＮ−αの効果を示す。マウスは第０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に注入することによって、ワクチン接種された。マウスは第９０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと同時に注入することによって、ワクチンを再接種された。抗インフルエンザ抗体反応を第１２０日に、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ワクチン接種後の抗インフルエンザ分泌性ｓ−ＩｇＡ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。マウスは第０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に注入することによって、ワクチン接種された。マウスは第９０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと同時に注入することによって、ワクチンを再接種された。分泌性ｓ−ＩｇＡ抗インフルエンザ抗体反応を第１２０日に、図に示すように、分泌性ｓ−ＩｇＡ特異的な抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチン接種に対する免疫反応を増強するための方法に関する。特に、ワクチン投与に引き続く免疫反応を増強するための免疫アジュバントとしての、インターフェロン、および／または他のＴｈ１刺激サイトカインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは従来技術において既知である。一般的にワクチンは、不活化もしくは弱毒化抗原およびサブユニットワクチン、すなわち、それに対して免疫反応がのぞまれるような他の抗原からなるワクチンを含み、これらは感染病の予防、改善または治療の目的で投与される。
【０００３】
特に、サブユニットワクチンは、宿主免疫系によって仲介される防御のための重要な標的と考えられている病原体構成成分由来の抗原に基づいている。高い安全性は証明されているが、サブユニットワクチンは、その基礎となる抗原の免疫原性が乏しいかないために、しばしば不十分な免疫反応を導く。
【０００４】
このため、免疫原性を向上させるために、サブユニットワクチンは、アジュバントを含むかあるいはアジュバントとともに投与される必要がある。アジュバントは免疫学的観点から、「抗原性を増強するために用いられる賦形剤」（ステッドマン医学辞典、２００３）と定義される。このため、賦形剤は、抗原とともに投与される場合、抗原単独の場合と比較して抗原性を増強する物質である。
【０００５】
動物モデルならびに、時に不活化マイコバクテリア（フロイント不完全アジュバント）、抗原が吸収される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウムまたはリン酸）の懸濁液、サポニンおよびＬＰＳ抽出生成物を含有する抗原溶液を鉱物油中に乳化した油中水乳剤（フロイント不完全アジュバント）を含む古典的な標本において、多くの種類のアジュバントが使用されてきたが、最近は、アルミニウムに基づく金属塩が、ヒトにおけるワクチン製剤において通常含まれる唯一のアジュバントである。安全ではあるが、このような塩は、抗体誘導には弱いアジュバントであり、古典的細胞免疫反応を刺激することができない。
【０００６】
抗体および細胞性反応の両方の誘導は、抗原の拡散の制限および排除する目的で、抗原の進入を非常に効果的に防御する。ワクチンは、強力で防御的な免疫反応を誘導するための二種類のシグナルを提供または誘導する必要がある。第一に、ワクチンは、ＴおよびＢリンパ球上の抗原特異的受容体を誘発する抗原を供する必要がある。第二に、効果的なワクチンは、抗原提示細胞による副刺激分子の発現を誘導する必要があり、これによって、抗原により誘発されたリンパ球による強力な反応を促進する。この第二のシグナルは、生きた病原体を含むワクチンを使用するときに、感染に関連した要因によってしばしばもたらされるが、サブユニットワクチンにおいては欠如し、乏しい免疫原性となる。この第二のシグナルに寄与することのできるアジュバントの添加は、ワクチンの効果を増強し、さらに、誘導される免疫反応の種類を決定することができる。
【０００７】
これらのシグナルは、与えられた感染体に対する免疫反応の役割の種類および能力を特徴付けるエフェクター機構を引き続いて発現させる宿主免疫系を導く。
【０００８】
サイトカインは、抗原および感染体に対する免疫反応の経路において、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む免疫応答性細胞間の情報伝達に関わる重要な要素である。マウスおよびヒトＴヘルパー（Ｔｈ）クローンについての多くの研究が、Ｔｈ細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２と呼ばれる）によって提示される異なる活性の存在について広範な証拠を供し、これはサイトカイン分泌の分析結果から推測された。このため、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４の生成が、それぞれＴｈ１またはＴｈ２反応の典型的な特質として考えられる。免疫反応のＴｈ１タイプは、通常マウスにおけるＩｇＧ２ａ生成および細胞性免疫の発現に関連し、一方反応のＴｈ２タイプはＩｇＥ生成、好酸球および肥満細胞生成に関連する。免疫反応のＴｈ１タイプの誘導が、ウイルスおよびある種のバクテリア感染に対する防御免疫反応の発生における手段であると通常考えられている。この点、アルミニウムに基づく金属塩といった、臨床的に利用可能なアジュバントが、免疫反応のＴｈ２タイプを誘導する傾向があり、これによって、のぞまれない副作用に寄与するアレルギー反応をもたらしうる。
【０００９】
インフルエンザワクチンは、罹患率ならびに高齢者および免疫反応不全者を含む高リスク群における死亡数を減じるが、全受容者においては全体としては予防的ではない（オックスホードら、２００３）。通常使用されるサブユニットワクチンによってもたらされる防御は、基本的にウイルス血球凝集素に対する抗体の生成によるものと考えられ、このようなワクチンは細胞障害性Ｔ細胞反応の誘導はとぼしく、そして血球凝集抑制（ＨＩ）抗体力価は、防御における代理マーカーとして通常使用される。ウイルス性抗原に対する中和抗体（ＩｇＧ２ａ）の生成は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の関与を要し、これはＭＨＣクラスＩＩ抗原と関連して抗原を認識し、そしてＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７多型性の増加頻度が、「危険にさらされている」インフルエンザワクチン接種に対する無反応者において観察される（ゲルダーら、２００２）。
【００１０】
高効率的なアジュバントの不在は、ワクチンの成功する開発に対する重大な障害となり、特に、細胞性免疫を必要とするような、細胞内抗原に対して向けられている場合にはそうである。現在、インフルエンザに対する抗体反応および他のワクチンを増強することの可能な効果的な無毒性の成分または方法はまだ満たされていない。
【００１１】
これに関連して、上記性質によれば、サイトカインは、および特にインターフェロン（ＩＦＮｓ）においては、従来技術においてアジュバントの可能性があると考えられている（ヒートら、１９９２）。
【００１２】
インターフェロンは、以下のように構造に基づいて分類されている多機能のサイトカインである。
ｉ）Ｉ型ＩＦＮｓ。イントロンを欠く遺伝子によってコードされ、少なくとも１３の機能ＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮ−αファミリー、ＩＮＦ−βおよびＩＦＮ−ωを含み、すべての細胞タイプによって効率的に生成される。
ｉｉ）ＩＩ型ＩＦＮ。単一イントロンを含む遺伝子によってコードされ、ＩＦＮ−γとも呼ばれ、基本的に特異的抗原もしくはマイトジェンに対して反応してＴ細胞およびＮＫ細胞によって生成される。
【００１３】
もともと単純抗ウイルス物質とされているＩ型ＩＦＮｓは、引き続いて種々の生物学的効果を示すことが明らかにされてきていて、これは患者におけるのと同様実験動物における抗腫瘍活性も含む。
【００１４】
Ｉ型およびＩＩ型ＩＦＮｓはともに、試験管内の抗体産生における潜在的な抑制効果およびＴ細胞増殖を引き出すことが示されていて、これらのサイトカインがどのように促進性または抑制性に生体内で働くかの疑問を提起している。異なるモデル系において得られたデータの総合が、免疫反応のＴｈ１タイプの誘導ならびにある種のＴ細胞集団の増殖、機能活性および生存の補助における、Ｉ型ＩＦＮの重要性を示している（ベラルデリＦおよびグレッサーＩ、１９９６；およびタフら、１９９６）。
【００１５】
Ｉ型インターフェロンは、現在臨床的用においてもっとも広く使用されているサイトカインである。特に、ＩＮＦ−αは、いくつかのウイルス性疾患（特にＣ型肝炎）ならびに、いくつかの血液悪性腫瘍（ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、いくつかのＢおよびＴ細胞リンパ腫）ならびにある種のメラノーマ、腎癌およびカポジ肉腫といった充実性腫瘍を含む、様々な種類のヒト腫瘍の治療のために、４０カ国を超える国々において世界的に使用されている。対照的に、少なくともある程度毒性のために、ＩＦＮ−γは臨床適用が限られていることが見出されている。この数年にわたって、いくつかの研究が、異なる実験系においてＩ型およびＩＩ型ＩＦＮｓによって与えられる生物学的効果が、活性の種類に基づいて実質的に異なるという証拠を供してきた。メラノーマおよび多発性硬化症においてといった、いくつかの例においては、ＩＦＮ−γの臨床的使用が、Ｉ型ＩＦＮによって達成されるのに対して副作用をもたらしている。
【００１６】
その幅広い臨床的な使用にもかかわらず、Ｉ型ＩＦＮはヒトにおいてワクチンアジュバントとしてはまだ使用されていない。
【００１７】
ワクチン中のアジュバントとしての生体内におけるＩＮＦｓの適切な使用は、ＩＩ型ＩＦＮ（すなわちＩＦＮγ）について示されてきた。特に、特許文献１において、ネズミマラリア原虫の悪性ＹＭ株に感染したマウスの血液細胞から単離された、粗蛋白抽出物を含むものとしてワクチンが記述されていて、これはＩＦＮ−γをアジュバントとして含む。ワクチンに含まれたＩＦＮ−γの量は、投与につき１，０００ないし１０，０００ユニットの範囲であることが示されていて、ここでアジュバント効果を生ずるＩＮＦ−γの量は１００ないし５０，０００ユニットであると示されている。使用された投与量は５，０００ユニットで、２００ユニットよりも少ない投与でも効果的であることが示されている。
【００１８】
アジュバントとしてのＩ型ＩＦＮの使用は、いくつかの従来技術の文献によって予想されていて、ワクチンアジュバントとして使用されるとき、Ｉ型ＩＦＮが生体内における防御ＴｈＩタイプ反応を増強することが示されている。
【００１９】
ＩＦＮ−αは強力なポリクローン性Ｂ細胞活性化剤で、ウイルスの攻撃に対するアイソタイプ転換および防御によって特徴付けられる強力な一次液性免疫反応を導く（レボンら、２００１）。実際、ウイルス感染に対して形質細胞様樹状細胞によって分泌されるＩＦＮ−αが、Ｂリンパ球を抗体生成形質細胞に分化させて、インフルエンザ感染に対して反応して特異的およびポリクローン性ＩｇＧｓともに生成するために必要であることが示された（ジェゴ、２００３）。さらに、ＩＦＮ−αが、ウイルス感染に対するＴｈ１免疫および防御の特徴であるＩｇＧ２ａ抗体反応を刺激することが示され（レボンら、２００１）、インフルエンザワクチンに混合し筋注されるときに異常に強力なアジュバントになることが示された（プロイエッティら、２００２）。対照的に、ミョウバンといったアジュバントは、Ｔｈ２反応の特徴であるＩｇＧ１生成を増強する。ＩＮＦ−αは、抗−ＩｇＭ抗体に反応して顕著にヒト扁桃Ｂ細胞の増殖を増強することが示されている。加えて、口腔粘膜から投与されたＩＦＮ−αは、ヒトインフルエンザワクチンと混合し共投与されると、分泌ＩｇＡのレベルを増強する活性粘膜アジュバントとなることが示されている（プロイエッティら、２００２）。
【００２０】
Ｉ型インターフェロン、主にインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）は、感染体に対する先天性免疫応答の一部として粘膜表面に生成される。組換えＩＦＮ−αの口腔粘膜投与は、ＩＦＮの口腔粘膜生成に類似し、ウイルス感染および腫瘍細胞増殖に対する防御を与えることが示された（トベイおよびマウリ、１９９９）。ＩＦＮの血中濃度がない細胞免疫の刺激を通じて毒性なく防御が生じる（エイドら、１９９９）。特に、ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与は、樹状細胞の成熟および抗原提示、ならびに外来抗原に対するＴヘルパーＩ型（Ｔｈ１）リンパ球の反応を刺激する（ベラルデッリら、２００２）。このため、口腔粘膜ＩＦＮ治療は、ウイルスまたは腫瘍抗原のどちらの反応であろうと、進行中の免疫反応における宿主防御を刺激するにもっとも効果的である。
【００２１】
特許文献２および特許文献３は、ワクチン組成のアジュバントとしての、特に抗ウイルスワクチン組成のアジュバントとしての、インターフェロン−αサブタイプの使用を開示している。
【００２２】
抗腫瘍ワクチンとの使用のための、効果的なアジュバントの必要性がある。たとえば、メラノーマは典型的な免疫原性腫瘍の一つであるが、多くの腫瘍抗原は自己抗原であり、自己抗原に対する寛容のために腫瘍ワクチンの治療効果を制限する。このため、多くのワクチン経路が使用されてきたが、チオシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３／ＭＡＧＥ−Ａ６、Ｔｒｐ−２、およびｇｐ１００を含むＭＡＧＥファミリーのメラノーマ抗原由来のワクチンは、細胞毒性Ｔ細胞の一次的活性化および制限的な臨床反応のみをもたらす。これらは直接免疫（ペプチドワクチン）、ウイルスベクターもしくはペプチドを発現する裸のＤＮＡ、または抗原をもつ樹状細胞（樹状細胞に基づくワクチン）といった負荷抗原発現細胞を含む。
【００２３】
細胞の養子免疫伝達は、Ｔ調節細胞のリンパ除去と組み合わせて高反応性Ｔ細胞亜母集団選択および活性化によって寛容を克服する手段を供する。このため、非骨髄機能廃絶性リンパ除去化学療法（シクロホスファミドおよびフルアラビン）に引き続く、高用量ＩＬ−２治療と一緒の自己腫瘍反応性Ｔ細胞の養子免疫伝達は、ＭＡＲＴ−１メラニン細胞分化抗原に特異的なＴ細胞クローン集団の生体内における急速な成長をもたらし、かつ転移性腫瘍の破壊および進行性疾患（ステージＩＶメラノーマ）をもった患者における目的の臨床反応をもたらす。同時性腫瘍緩解をもった患者のなかには、白斑および前部ブドウ膜炎を含むメラニン細胞の自己免疫性破壊の徴候も示す（ダドゥレイら、２００２）。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの添加は、非骨髄機能廃絶性リンパ除去化学療法に引き続く、高用量ＩＬ−２治療と一緒の自己腫瘍反応性Ｔ細胞の養子免疫伝達の抗腫瘍活性を増強する（レスティフォ、２００４）。
【００２４】
ＭＡＧＥ３蛋白質ワクチンを１．０ＣｐＧとともに使用するステージＩＶメラノーマの治療は、１ＣＲ、２ＰＲ、２ＳＤ、および２ＰＤをもたらす（デービス、２００４）。
【００２５】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、幅広い範囲の抗原に対して、液性および細胞性抗原特異的反応を増強する。非メチル化ＣｐＧモチーフは、いくつかの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）のうちの一つであり、これは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在するトール様受容体（ＴＬＲ）を通じて先天性免疫反応を活性化する。ＣｐＧは、ヒトＢ細胞および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の表面のみに見出されるＴＬＲ−９を活性化する。ＴＬＲ−９のようなトール様受容体は、先天性および適応免疫反応の橋わたしとして機能し、Ｂ細胞の直接活性化および免疫グロブリン産生、ｐＤＣの活性化、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の上方調節、Ｂ７発現、およびＣＤ４０発現、および増強した抗原提示、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化およびＴｈ１サイトカイン反応の活性化をもたらす。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの活性は、Ｉ型ＩＦＮ受容体シグナリングに依存していて、外因性Ｉ型ＩＦＮの添加は経路の上流をバイパスすることを可能にするとともにＣｐＧの代用をすることを可能にし、細菌刺激がない状態で副刺激分子の上方調節を導くことができる。さらに、ＩＦＮ−α／β受容体−／−マウス（ＩＮＦＡＲ１−／−）またはポリクローン性抗ＩＦＮ−α／β抗体で処理した正常マウスにおいて、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはアジュバント活性を欠いている。（レボンら、２００１；およびプロイエッティら、２００２）。
【００２６】
従って、有効な可能性のある組換え抗原が利用できるにもかかわらず、ワクチンに対する反応性および患者のコンプライアンスの弱さまたは欠如が、予防または治療サブユニットワクチンのための重大な問題を残している。サブユニットワクチンの弱い免疫原性のために、十分な応答を引き出すために多くの回数の投与を要することとなり、患者のコンプライアンスの欠如を重要な問題としてしまう。
【００２７】
このため、抗原の免疫原性を向上させて一貫した強力な免疫反応を促進する組成は、セロコンバージョン／セロプロテクションを導くだめに要するワクチン投与の回数を減らし、あるいは一回のみにし、広範囲な応用をもたらす。
【００２８】
ここに引用したいかなる文献も、このような文献が適切な従来技術であると認めることを意図したものではなく、または本出願のいかなる請求項の特許性に対する材料と考えられることを意図したものではない。すべての文献の内容または日付のすべての記述は、出願時に本願出願人が利用可能な情報に基づいており、このような記述の正確性についての認定を構成するものではない。
【特許文献１】欧州特許第０２４１７２５号
【特許文献２】米国特許第６，００７，８０５号
【特許文献３】米国特許第６，４３６，３９１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、ワクチンに対する免疫反応を増強するに十分な、インターフェロンおよび／または他のＴｈ１刺激性サイトカインを、実質的に同時にワクチン投与とともに口腔粘膜投与することによって、免疫反応を増強する方法に関する。増強された免疫反応は、液性または細胞性反応のいずれかまたは両方であることができる。本発明は特に、防御性免疫治療においてワクチンに対する増強されたＴｈ１タイプの液性免疫反応において効果的である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は（ａ）口腔粘膜以外の手段から対象へ供することにより、有効量のワクチンまたは抗原を投与し、（ｂ）ワクチンに対する免疫反応を増強するのに十分量のインターフェロンおよび／または少なくとも一の他のＴｈ１刺激サイトカインを口腔粘膜から投与し、前記インターフェロンおよび／または他のサイトカイン投与は前記ワクチン投与と実質的に同時である、から構成される、ワクチンに対する免疫反応を増強する方法である。
【００３１】
口腔粘膜投与されたインターフェロンおよび／または他のサイトカインは、ワクチンに対する抗体および細胞性免疫反応を増強するので、ワクチン投与と実質的に同時に投与されるとき免疫アジュバントとして効果的にはたらく。増強された免疫反応は、長期的抗体産生および免疫記憶によって特徴付けられる。インターフェロン、および／または他のサイトカインの口腔粘膜投与は、血流へのインターフェロンおよび／または他のサイトカインの運搬を必要としないので、大量のインターフェロンおよび／または他のサイトカインを、毒性反応を誘発することなく安全に使用することができる。これは、ミョウバンといった、既知のおよび現在利用可能なアジュバントの使用について大きな向上となる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、口腔粘膜経路を通じた組換えインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）による動物の治療が、市販のインフルエンザワクチン（ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）、アヴァンティス・パスツールＭＳＤ）の遠位の筋注に対して顕著に液性反応を増強するという、驚くべき発見に基づく。事実、テストしたインフルエンザ特異的免疫グロブリンの全４種（全部でＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡ）は用量依存法でＩＦＮ−αの口腔粘膜（ｏｍ）投与に続くインフルエンザワクチン接種に応答して著しく増加することが見出された。さらに顕著にも、口腔粘膜投与したＩＦＮ−αの免疫アジュバント効果は一定の条件下に、ＩＦＮ−αをインフルエンザワクチンと混合し混合物を筋肉内注射（ｉｍ）したときに得られたものよりも大きかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
ＩＦＮタンパク質の全身的な吸収の不在下、Ｃｒｇ２（これはリンパ球運搬を調節する）といったケモカインの急速な誘導のために、ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与が、末梢リンパ節から抗原（腫瘍またはウイルス性抗原にかかわらず）が全身的に送り込まれた箇所への免疫担当細胞の急速な移動をもたらす結果となることを示す、以前の研究結果によって、これらの結果の一部を説明することができる。対照的に、ワクチン接種から遠位の部位におけるＩＦＮ−αの非経口的な注入が、ほぼ確実に樹状細胞および他の抗原提示細胞をＩＦＮ注入部位かつワクチン接種部位から離れた部位へ移動させ、このためインフルエンザワクチンに対する液性免疫反応を減じる。
【００３４】
これは、「免疫アジュバント」とここで称される物質が、ワクチン接種部位から離れた部位において投与されるとワクチンに対する免疫反応を増強することができるという、最初の証明である。用語「免疫アジュバント」は、インターフェロンが典型的なアジュバントとしてはたらいていないものとして使用されていて、ここで典型的なアジュバントはワクチンの抗原性を増強するためにワクチンと混合しなければならない。一方で、本発明におけるインターフェロンの役割は、たとえば米国特許第６，３６１，７６９号および第６，６６０，２５８号および米国特許出願第２００３／０１０８５１９号において開示されているような、免疫刺激効果にのみよるものではない。ウイルス、腫瘍、および他の病原体の治療のための口腔粘膜投与インターフェロンの免疫刺激効果に関する、以前のこれら特許開示は、急速な細胞免疫反応に基づく。このため、観察される治療効果は、効果的な抗体反応の確立に先立って生じ、したがって効果的な抗体反応は研究されておらず、いずれにしても、その中で報告された実験の多くの中には含まれていない。実際、インターフェロンが抗体産生における促進または阻害効果のいずれを及ぼすかは未解決の問題であった。従って、本明細書に報告する免疫アジュバント効果は、インターフェロンの免疫刺激効果またはインターフェロンのアジュバント効果についての以前の報告とは異なり、それらから期待されるものでもない。アジュバントとしてのＩＦＮ−αと混合したワクチンの口腔粘膜投与を含むプロイエッティ、２００２の実施例から本発明を区別するために、本発明は、口腔粘膜投与ワクチンと併用するＩＦＮの使用をここにはっきりと除外する。
【００３５】
錠剤またはトローチ剤といった剤形に含まれる口腔粘膜投与インターフェロンをワクチン接種時に接種すると、顕著に抗体反応そしてこれによる防御の程度が増大し、これはインフルエンザワクチンについてのみならずすべてのワクチンについて適用できるであろうことが期待される。口腔粘膜ＩＦＮ剤形の明確な長所は、ワクチンとの混合剤中に投与される必要がある新規アジュバントについての場合のようなその薬剤とワクチンについて再認可の必要なく、適切なチェック機関によって証明された特定のワクチンの防御効果を増強するために使用することができることである。
【００３６】
非常に多くの研究が、天然インフルエンザウイルス感染によって得られる粘膜免疫が、感染予防、特に変異ウイルス感染に対する感染予防において、非経口ワクチン接種によって誘導される血清ＩｇＧ全身性免疫に比べて、より効果的であることを示してきた。イトウら、２００３を参照。免疫性を与えられた個体における血清ＩｇＧは、感染予防よりも致死的な肺炎予防に重要であることが明らかである。ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与は、ＩＦＮ−αをワクチンと混合して混合物を静注するときと比べて、血清ＩｇＡ抗インフルエンザ抗体を同程度の量またはより多くの量まで増量する。同様の効果は、ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与後の肺における抗インフルエンザｓ−ＩｇＡ抗体産生においても観察された。実験結果はさらに、口腔粘膜ＩＦＮ−αも最大抗体反応およびそれによるワクチン接種に続く完全な保護に達するのに必要な時間も減じる。
【００３７】
Ｉ型ＩＦＮ−またはＩＦＮ−αによって導かれる免疫反応は、特異的Ｉｇプロフィールによって特徴付けられる、すなわち、マウスにおいて、循環ＩｇＧ２ａおよび／または分泌ＩｇＡの特異的誘導によって特徴付けられる、Ｔｈ１タイプ反応であり、これはバクテリアまたはウイルスといった病原体の攻撃からの保護を与える。
【００３８】
本発明の非毒性免疫アジュバント組成において、ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮファミリーに属する任意のインターフェロンであることができ、または時にＩＩ型ＩＦＮと称されるＩＦＮ−γであることができる。これに関連して、ヒトへの最も効果的な投与は、１０５ないし１０８ＩＵの範囲であり、好ましくは１０６ないし１０７ＩＵの範囲である。
【００３９】
以下は本発明において使用することができるＩＦＮ源の非制限的な実施例である：健康なドナーの刺激白血球由来の天然ＩＦＮ−α（異なるＩＦＮ−αサブタイプまたは特定人のＩＦＮ−αサブタイプの混合）またはＮａｍａｌｗａ細胞由来のリンパ芽球様ＩＦＮ−α：コンセンサスＩＦＮ（ＣＩＦＮ）といった合成Ｉ型ＩＦＮ；組換えＩＦＮ−β（ＲＥＢＩＦ（登録商標）、セロノ；ＡＶＯＮＥＸ（登録商標）、ビオゲン；およびＢＥＴＡＳＥＲＯＮ（登録商標）、ベルレックスとして市販）またはＩＦＮ−α２ａ（ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅとして市販）およびＩＦＮ−α２ｂ（ＩＮＲＯＮ−Ａ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｇｈとして市販）といった組換えＩＦＭ−α、もしくはＩＦＮ−ω；ＤＮＡシャフリング法もしくは部位特異的突然変異誘発法によって生成した新規ＩＦＮ分子；ならびに一またはそれ以上のアミノ酸置換体、欠失もしくは付加またはＧｅｎＯｄｙｓｓｅｅのポリペプチドといった天然発生多型性をもった組換えヒトＩＦＮ−αもしくはＩＦＮ−β分子、国際公開第０２／１０１０４８号（国際公開第０２／０８３７３３号、国際公開第０３／０００８９６号、およびその他を参照）。
【００４０】
本発明の口腔粘膜投与されるインターフェロン剤形のための薬剤製剤において、当業者には明らかであるとおり、ＩＦＮのためにさまざまな媒体および賦形剤を使用することができる。典型的な製剤技術は、とりわけ、レミングトン１９９５、およびそれ以前の版に教示されている。ＩＦＮ製剤は、米国特許第４，４９６，５３７号にあるように、グリシンまたはアラニンといった安定増強剤を含むことができ、および／または、担体タンパク質といった一またはそれ以上の担体を含むことができる。たとえば、ヒトの治療のために、医薬品等級ヒト血清アルブミンを、選択的に希釈液としてのリン酸緩衝食塩水とともに、通常使用する。ここで、ＩＦＮのための賦形剤はヒト血清アルブミンであり、このヒト血清アルブミンはヒト血清から抽出することができ、または組換え物であることができる。通常、血清アルブミンが使用されるときは同一源である。
【００４１】
同時に投与されるワクチンに対する免疫反応をインターフェロンが効果的に増強することができるに十分な時間、口腔粘膜腔とＩＦＮとの接触を供することができるような任意の手段によって、ＩＦＮを投与することができる。これは、インターフェロンおよび口腔粘膜の少なくとも５秒以上の時間の接触を要し、好ましくは１〜２分、および可能ならば５分程度であり、すなわち、５ないし３６０秒である。このため、口腔粘膜投与は、経口投与とは明確に区別される。経口投与のための錠剤または液体配合を単に飲み下すだけならば、インターフェロンと口腔粘膜の接触はワクチンに対する免疫反応の増強には十分な時間ではない。
【００４２】
これらの条件の中で、本発明において使用されるＩＮＦ投与剤形が、いかなる特定の製剤タイプに限定されるものではないということが、明らかに理解されるであろう。ＩＦＮは口腔粘膜腔の奥深くに投与されることができ、点鼻薬もしくは鼻噴霧同様に液体、固体、またはエアロゾルによっても達成することができる。このため、剤形は、液体、噴霧、シロップ、トローチ剤、口腔もしくは舌下錠、および噴霧製剤を含むが、これに制限されるものではない。当業者は、エアロゾルまたは噴霧製剤のために、調製の粒子サイズが重要でありに気づくであろうし、粒子サイズを修正することができる適切な手段に気づく。このため、エアロゾルまたは噴霧製剤のためには、粒子サイズは鼻咽頭粘膜中に必要時間とどまるよう、インターフェロンを沈着することができる大きさでなければならない。肺への投与を意図した製剤は口腔粘膜製剤であることを考慮せず、従って粒子サイズは鼻咽頭粘膜錠への沈着を回避して肺に直接到達するように小さいもので、ここでは肺は所望の作用部位で循環に取り入れられる。
【００４３】
口腔粘膜への使用のためのインターフェロンの代表的な剤形は、以下のものを含む（すべての％はｗ／ｗである）。
【００４４】
錠剤：Ｄ形グルコースＢＰ４５％；ゼラチンＢＰ３０％；小麦デンプンＢＰ１１％；カルメロースナトリウムＢＰ５％；卵アルブミンＢＰＣ４％、ロイシンＵＳＰ３％；プロピレングリコールＢＰ２％；および５×１０６ＩＵのＩＦＮ−α２。このような錠剤は、口中でゆっくりと溶解することができ、または水に溶解して口中に必要なだけとどまることができる。
【００４５】
米国特許第４，６７５，１８４号にあるように、グリセリン４５％、ナトリウムＣＭＣ２％、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）２５％、蒸留水を１００％まで、および５×１０６ＩＵのＩＦＮ−α２から、インターフェロンペーストを調製することができる。インターフェロンペーストは頬粘膜へ付着することができる。
【００４６】
同様に、市販のうがい薬または咳止めシロップ製剤へ、所望の量のインターフェロンを添加することによって、うがい薬またはシロップを調製することができる。
【００４７】
本明細書に記述の動物実験において、口腔粘膜投与は鼻腔深くへのＩＦＮ製剤の投与によって達成することができ、このため口腔咽頭腔へ、すなわち、受容哺乳動物の口腔及び咽頭へ、急速に分配され、この腔の粘膜層と接触する。
【００４８】
本発明者の研究室による前の研究により、インターフェロンの口腔粘膜投与はＩＦＮの循環量の出現をもたらさないことが既知である（エイドら、１９９９および米国特許第６，３６１，７６９号）。
【００４９】
本記述の要旨は免疫アジュバントとしてのインターフェロンに関する一方で、本発明は、抗体産生および／またはＴｈ１反応の増強に働くことが知られている他のサイトカインの使用にも拡張される。本発明者による米国特許第６，６６０，２５８号は、宿主防御機構刺激効果を誘導するＴｈ１またはＴｈ２特異的サイトカイン投薬の口腔粘膜投与に関するものである。そこで開示されているＴｈ１サイトカインには、インターフェロンに加えて、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシン）が含まれる。このため、これらのサイトカインは、単独またはインターフェロンおよび／もしくはお互いと組み合わせで、インターフェロンについて本明細書に記述したのと同様の方法で、必要な変更をくわえて、本発明の免疫アジュバントとして使用することができる。このため、それぞれの効果的な投与は、過度の実験をすることなく当業者の通常の一によって容易に決定することができる。
【００５０】
抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物または脂肪抗原の精製または部分精製、および／または全細胞、特に抗原と混合される樹状細胞と関連する抗原を含む。全体的に見ると、任意の病原体または腫瘍および／または分化関連性抗原は、免疫アジュバントとしてＩＦＮと同時に与えられることが可能な免疫原として考えることができ、当業者によって容易に同定することができる。
【００５１】
本明細書の実験はインフルエンザワクチンＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）に関連する一方で、本発明が任意のワクチン接種に対する免疫反応を増強するであろうことが完全に期待される。しばしば用語「ワクチン」は予防を誘導することを意図したワクチン接種のみを言及するときに使用されるが、本明細書および請求項のすべてを通じてこの用語は治療目的のためのワクチン接種も同様に含むことを意図している。たとえば、腫瘍関連抗原を構成するワクチンは、腫瘍に対する免疫反応を導くことを意図している。ウイルス粒子に対するワクチンは、ウイルスに対する予防のみならず存在するウイルス感染の根絶としても使用することができる。このため、たとえば、ワクチンはＨＢＶに対して利用可能で、ＡＩＤＳおよびＨＣＶに対して利用可能で、これらは盛んに開発中である。アミロイド−β血栓に対する活性ワクチン接種もアルツハイマー疾患の治療に開発中である。従って、用語「ワクチン」は、抗原に対してまたはもとの状態で存在する交差反応抗原に対しての免疫反応を誘導する目的のための任意の抗原の投与に対して、適用される。好ましいワクチンは、インフルエンザ、天然痘、炭疽、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオ、結核または抗腫瘍ワクチンを含む。
【００５２】
インフルエンザワクチンについて示された結果から鑑みて本発明が任意のこのようなワクチンに応用可能なことが期待できるであろうことについての理由は、混合物において投与されるときにインターフェロンがアジュバントとして効果的であるということが既知であるという事実に基づく。たとえば、プロイエッティ、２００２、国際公開第０２／０８３１７０号およびレボンら、２００１参照。さらに、口腔粘膜投与インターフェロンが、遠位ではあるが同時に投与される抗原に対しての免疫反応を増強することがひとたび確立されると、免疫反応を引き起こす任意の抗原によって対象がワクチン接種されるときには同様ではないと信じる理由はない。治療のための口腔粘膜投与インターフェロンの既知の効果（たとえば、米国特許第６，３６１，７６９号参照）は、アジュバントとしてのインターフェロンの既知の効果と組み合わせて、インフルエンザワクチンについて示された結果を他の任意のワクチンに当てはめることを可能にするであろう。
【００５３】
たとえばミョウバンといった、ワクチンの抗原性を向上することを意図した現存のアジュバントは、深刻な副作用をもっていることが知られている。本発明において使用されるワクチンがその組成中にアジュバントを含むことができる一方で、そのようなアジュバントを除外することができかつ満足な免疫反応を持ったワクチンであることがのぞましい。口腔粘膜投与インターフェロン免疫アジュバントの使用は、この目的を供する。しかしながら、任意のワクチンがアジュバントなしには測定可能な免疫反応をもつことができない限りにおいては、本発明の免疫アジュバントの効果は個別的に基づいて試験しなければならない。
【００５４】
各ワクチン投与において存在する抗原の量は、アジュバントをもつか否かで、ワクチン接種された対象における防御免疫反応を導くことができる量として選択される。この量は、特異的抗原および典型的なアジュバントの存在の可能性に基づき、これは当業者によって同定することができる。通常、各投与は抗原を１ないし１０００マイクログラム含み、好ましくは１０ないし２００μｇ含む。さらなる成分もワクチン中またはアジュバント含有ワクチン中において有利に存在する。
【００５５】
いくつかの場合には、ワクチンまたはアジュバント化ワクチンは、所望の効果および使い勝手の観点から経皮的または筋注で注入することができる。いくつかのワクチンについて皮内注射は効果的に実施することができ、適量の樹状細胞を注射部位に補充するための適切な他の運搬系を考慮することができた。しかしながら、口腔粘膜投与は除外されている。
【００５６】
ワクチンの肺への経鼻投与および経口投与も、ウイルス性呼吸性感染、たとえば、インフルエンザウイルス感染、といった感染のこれらの経路で運搬された感染源について特に包含される。
【００５７】
さらには、ワクチンまたは直接アジュバント化ワクチンの経鼻、経口または任意の他の粘膜投与も有効な選択肢であり、これは、ワクチン運搬の非常に実用的手段を用いることによる局所および／または全身性の強力な防御免疫の誘導をもたらす。
【００５８】
当業者はこれに関連して、ワクチン接種が作用するように導かれる抗原としての機能の最も適切な製剤を決定することができる。
【００５９】
ワクチン組成は、食塩水、賦形剤、アジュバント（必要なら）、保存剤、安定剤等といった殺菌した生理学的に適合した担体を含む薬理学的組成として、任意の従来の方式によって製剤することができる。
【００６０】
使用に先立って殺菌した担体中に溶解するために、ワクチンは液体中または凍結乾燥製剤中にあることができる。製剤中のミョウバンまたはリポソーム様粒子の存在も可能であり、これらは抗原の離散を遅らせるために有用である。ワクチンのゆっくりとした離散を可能にする他の戦略は、当業者により容易に同定することができ、本発明の目的範囲に含まれる。
【００６１】
薬理学的に許容できる担体手段または補助剤は、当業者により各製剤について容易に同定することができる。
【００６２】
本発明の方法は、感染症および腫瘍の予防および治療上の処置の両方について使用することができる。特に、本発明の方法は、重度の慢性感染症のため（すなわち、治療ワクチン）と同様、ウイルス性および細菌性疾患の予防処置（すなわち、防御ワクチン）について使用することができる。さらに、本方法は、適切な抗原を使用すれば、腫瘍または他の疾患および状態の、予防および処置に使用することができる。
【００６３】
これは、たとえばＥＢＶ、ＨＰＶおよびヘリコバクターピロリ、または、たとえばＭＡＧＥ抗原、チロシナーゼｇａｐ１００、およびＭＡＲＴといった、明確な腫瘍関連抗原ヒト悪性腫瘍に関連した、ならびに他のヒト腫瘍に関連した感染源に対して、抗原を使用することによって、達成することができる。
【００６４】
特に、本発明の方法は、たとえば維持血液透析患者、移植患者およびＡＩＤＳ患者のようないわゆる低応答性または非応答性の対象へのワクチン接種のために、特に適する。通常、本発明の方法は、早期のセロコンバージョン／セロプロテクションがのぞまれるような状況にある高い感染の危険性のある個体へのワクチン接種に、有利に適している。
【００６５】
これらの特徴は、特にＨＢＶに対するワクチン接種にあてはまる。
【００６６】
付加的な実施例として、本発明の方法は、標準的なワクチン接種に対して反応が乏しい高齢の個体のインフルエンザウイルスに対する予防を誘導するために特に有用である。
【００６７】
他のウイルス性ワクチンについてと同様ＨＢＶワクチンについても、皮下注または筋注がのぞましく、他の場合、特に呼吸器系を通して宿主に感染することのできる感染源については、肺への経鼻投与が効率性および／または患者コンプライアンスの観点から利点を示す。
【００６８】
本発明の方法は、ワクチンが経口投与される場合にも使用することができる。ワクチンの経口投与は、ワクチンの嚥下を含み、このため、少なくとも５秒間の口腔粘膜との接触を必要とする口腔粘膜投与は含まない。従って、ワクチンが経口投与されるべき場合には、インターフェロンおよび／または他のＴｈ１刺激サイトカインを、ワクチンの経口投与の前後短時間内に、口腔粘膜投与することができる。肺へのワクチンの経鼻的な実質的に同時投与を伴った、インターフェロンおよび／または他のＴｈ１刺激サイトカインの口腔粘膜投与に関しても、同様である。
【００６９】
本発明の免疫アジュバントは、再接種とともにと同様最初のワクチン接種とともにも、ともに使用することができる。このため、抗原に対する免疫反応は、対象が抗原にさらされるときはいつでも増強することができ、これは個体が予防接種の対象とする抗原に対するワクチン接種後の暴露同様再接種時も含む。従って、免疫アジュバントの投与は、対象が問題の抗原に対して暴露されるときにも実施することができる。たとえば、生物テロ攻撃の可能性に対する予防のために、ヒトが炭疽菌に対して免疫化される場合、そしてそのしばらく後に前記対象がそのような攻撃で炭疽菌の存在に暴露した場合、本発明の免疫アジュバントの投与は、前記抗原に対する防御記憶免疫反応を増強する。免疫記憶反応は、ワクチン接種後の循環における記憶細胞の活性化に応答するものである。さらに、インターフェロンはポリクローン性Ｂ細胞活性化因子であるので、対象のワクチン接種の目標である特異的な抗原に対して彼または彼女を免疫反応が防御するであろうのみならず、対象が将来暴露される可能性のある関連するもしくは変異した抗原に対してある程度の交差防御を示すであろう。これは特に、抗原不連続変異および抗原連続変異の両方を示すことが知られているインフルエンザに対する予防に重要である。
【００７０】
従って、本発明の他の面は、以前対象に対して免疫アジュバントとしてのインターフェロンを記憶反応を増強する量、口腔粘膜投与によりワクチン接種したその目標である抗原に、感染または再度暴露したときの治療である。
【００７１】
本発明について大まかに述べてきたが、同じことを以下の実施例を通じることでより容易に理解することができるが、これは実例に基づいて供されていて、本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００７２】
最初のワクチン接種のインフルエンザワクチンに対する抗インフルエンザ抗体反応における口腔粘膜投与ＩＦＮ−αの効果
６ないし８週齢雄Ｃ５７Ｂ１／６のグループを、第０日に筋注（ｉｍ）投与によってＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）（アヴェンティス・パストゥールＭＳＤ）１５マイクログラムで処理したが、これは単独でまたは組換えマウスＩＦＮ―αもしくは組換えヒトＩＦＮ−αの逓増的な量（１０３、１０４、１０５、１０６、１０７ＩＵ）を含有する使用されたインターフェロンと同量のＰＢＳとともに、または使用されたインターフェロンと等価のＢＳＡを含有するＰＢＳとともに処理した。他のグループのマウスは筋注（ｉｍ）でワクチン接種して、動物へのワクチン接種時に対して−２、−１、０、＋１または＋２の各日に逓増的なインターフェロンを口腔粘膜経由（ｏｍ）で注入した。他のグループの動物は、ｉｍ注入またはｏｍ経由により、ＩＦＮまたはＢＳＡ単独で処理し、ワクチン接種は行わなかった。
【００７３】
抗体反応を１５日および３０日に、下記の免疫グロブリンサブタイプに特異的な抗原検出ＥＬＩＳＡ分析を用いて測定した。すなわち、血清中の全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡ、ならびに肺中の分泌ＩｇＡ。
【００７４】
結果を図１Ａおよび図１Ｂに示す。図１Ａは、１５日後の抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。測定した各抗体について、左の棒柱はインターフェロンの同時投与のない単独でのワクチン投与後を示し、中央の棒柱はＩＦＮのｏｍ同時投与のあるワクチン投与後を示し、そして右の棒柱はワクチンおよびＩＦＮの混合物のｉｍ投与後を示す。図１Ｂは、３０日後の抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。どの場合においても、ｏｍインターフェロンとともにワクチン投与する場合の抗体反応が、インターフェロンなしに得られた反応と比して、より顕著である。
【００７５】
ワクチンと混合したインターフェロンの筋注による投与が、多くの場合ｏｍインターフェロン投与に比していくぶん良い結果を与えるが、なお舌下でのインターフェロン投与はｉｍに比して十分な利点がある。第一に、ｉｍインターフェロンの高用量投与ではしばしば重大な副作用がある。第二に、ワクチンとは別々ではあるが時間的に同時に投与される免疫アジュバントとしてのインターフェロンの使用は、インターフェロン含有製剤の登録のみを必要とする。言い換えれば、免疫アジュバントとしてｏｍインターフェロンを使用するには、既に認可されたワクチンの別個の再登録を要しない。インターフェロンがワクチンと混合されるアジュバントの場合、それが従来技術において既知のものであっても、ワクチン／アジュバント混合物の別個の認可が必要であり、これは費用及び時間がかかる。
【００７６】
ワクチンに対するＩｇＧ抗体反応のピークが最初のワクチン接種後約３０日で出現することは、ワクチンについての従来技術において一般的に既知である。図１Ａおよび図１Ｂを比較することで、ｏｍインターフェロン投与による加速的な効果の存在を確かにみることができる。
【００７７】
用量反応曲線（示されていない）は、最適な反応がインターフェロンの最大量（この実験における１０５）を投与する場合に得られることを示す。ヒトインターフェロンをマウスに使用する他の試験においては、用量反応曲線は、抗体反応があるレベルのピークまで上昇してから下降することを示す。従って、免疫アジュバントとしての使用のためのインターフェロンの最適量が存在することが予想されて、この量はヒトの治験を実施することで実験的に決定することができる。
表１は、一定の血清希釈における最適濃度というよりも終点力価として明示される免疫グロブリン力価の、１５日後の同様の実験の結果を示す。この実験も、ｏｍのＩＦＮ投与がワクチン単独よりも実質的によりよい結果を供することを裏付ける。しかしながら、この実験は、ｏｍのＩＦＮ投与による結果がｉｍインターフェロンおよびワクチンの混合投与による結果よりも実質的によりよいことを示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
マウスに対してインターフェロンを−２、−１、０、＋１、＋２日に投与した実験（示していない）の比較により、最適な効果はインターフェロンが第０日に投与されたときであることが確証された。第−１または−２日にｏｍ経路によって投与された場合、望ましい効果が起こらない。＋１日または＋２日にｏｍ経路によって投与された場合、インターフェロンをまったく投与しなかった場合と結果は実質的に同一である。このため、ＩＦＮ投与の最適時期は、ワクチンの投与と実質的に同時期であることが明らかであり、これはこのようなワクチン接種前後数時間であることを意味する。
【実施例２】
【００８０】
二回目のワクチン接種におけるインフルエンザワクチンに対する抗インフルエンザ抗体反応への口腔粘膜投与ＩＦＮ−αの効果
実施例２においては、マウスが第９０日に再接種されることを除いて、実施例１と同様の方法でマウスにワクチン接種した。各ワクチン接種段階、すなわち、第一および再度の接種各段階は、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）単独、ＩＦＮ−αと混合したＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）、またはｏｍのＩＦＮ−α投与と同時のＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）によってそれぞれ実施された。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、図２Ａについて最初のワクチン接種から１０５日後、または図２Ｂおよび２Ｃについて最初のワクチン接種から１２０後にそれぞれ測定された、これらの実験結果を示す。Ｉｇ力価は、特定の血清希釈における最適な密度測定として示される。最適な密度は４５０ｎｍで測定された。再接種１５日後には、ｏｍのＩＦＮ投与マウスにおける抗体力価においていくらか上昇があり、特に、予防について最も重要なＩｇサブタイプであるＩｇＧ２ａについてそうである。３０日後（図２Ｂ）、ｏｍのインターフェロン投与について非常に重要な効果が存在することを観察できる。実際、インターフェロンがワクチンと混合された場合および筋注で投与された場合に得られるものと比較しても、効果は明らかに高い。同様に、３０日後（図２Ｃ）も、気管支肺胞洗浄液中の抗インフルエンザ分泌ｓ−ＩｇＡ産生においてｏｍのインターフェロン投与が非常に重要な効果をもつことが観察される。
【実施例３】
【００８１】
ヒトに対する免疫アジュバントの効果を試験するために、以下の臨床試験を実施する。１４０の対象
において、無作為に２グループに分け、一のグループはインターフェロンを口腔粘膜投与で処置してから、すみやかにＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）を筋注で接種する。もう一つのグループは、ｏｍのプラセボで処置してから、すみやかにＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）を筋注で接種する。インターフェロンは口腔粘膜を介した経路によって、５百万ユニットのＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）組換えＩＦＮ−αを含有する生理食塩水５ｍｌの用量で投与される。対象は、嚥下する前に２分間口の中に前記生理食塩水をとどめるように指導される。実験対照の対象は、生理食塩水のみを摂取してからｉｍのＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）をワクチン接種される。前記対象は年齢６５ないし８５歳であり、白血病もしくは充実性腫瘍、すなわち自己免疫疾患をもっておらず、扁桃が無傷である。前記対象はすべて最近５年間にインフルエンザワクチンを受けている。抗体反応は、免疫グロブリンサブクラスを決定するために赤血球凝集阻害および抗原捕捉ＥＬＩＳＡの両方によって、第２１日に測定される。唾液中の分泌ＩｇＡレベルも測定する。これらの結果は、実施例１および２で引用した前臨床動物実験において得られた結果と比較することがのぞまれる。
【００８２】
本発明をここで完全に記述してきたが、過度の実験をすることなくとも、本発明の精神と範囲から逸脱しない同等のパラメーター、濃度、および条件の範囲において、同様に実施することができることは当業者によって認められるであろう。
【００８３】
本発明はその具体的な実施例と関連して記述されてきたが、さらなる変更が可能であると理解されよう。本出願は、総合的に本発明の理念に従い、かつ本発明が関連する当業者に既知もしくは慣例的な範囲内であるような本明細書からの逸脱や、前述の本質的特徴に適用することができ以下に添付の請求項の目的内での本明細書からの逸脱を含むような、本発明の任意の変形、利用、または適用を包含することを意図している。
【００８４】
学術論文または要約、公開されあるいは対応する米国もしくは他国の特許出願、登録された米国もしくは他国の特許、または任意の他の参考文献を含む、ここに引用したすべての参照は、参照することにより本明細書に完全に組み込まれ、これは参照文献中に存在するすべてのデータ、表、図、および文章を含む。加えて、ここに引用した参照中に引用された参照のすべての内容もまた、完全に参照として組み込まれる。
【００８５】
既知の処置方法、従来の処置方法、既知の方法または慣習的な方法は、いかなる意味においても、本発明のいかなる面、記述または具体化について、従来技術において開示、教示または示唆されたことを認めるものではない。
【００８６】
先の具体的な実施例の説明は、本発明の総合的な性質を完全に明らかにして、当業者の知識（ここに引用した参照の内容を含む）を適用することにより、過度の実験をすることなく、本発明の総合的な概念から逸脱することなく、容易に具体的な実施例のような種々の応用に変更および／または適用することができる。従って、このような適用および変更は、ここに明らかにされた教示および指示に基づいて、開示された具体化と等価の意味および範囲のなかにあることを意味する。本明細書の語法または専門用語は、記述的ではあるが制限的ではない目的であると理解すべきであり、このため、本明細書の語法または専門用語は当業者が本明細書中での教示および指示に基づき、当業者の一の知識と組み合わせることによって、解釈すべきものである。
【００８７】
参照
Belardelli F.およびGresser I.著、「Ｔ細胞反応におけるＩ型インターフェロンの無視されてきた役割：その臨床的使用への意味（The neglected role of type I interferon in the T-cell response: implication for its clinical use.）」、Immunol Today。１９９６年、１７、ｐ．３６９−３７２
Davis、H.、Coley Pharmaceuticles、カナダ、オタワ、キーストーン・シンポジウム、「ワクチンおよび免疫療法の合理的設計（Rational Design of Vaccines and Immunotherapeutics）」、キーストーン、２００４年、１月、ｐ．６−１１
Dudleyら著、サイエンス、２００２年、２９８、ｐ．８５０−８５４
Eidら著、J. IFN and Cytokine Res.、１９９９年、１９、ｐ．１５７−１６９
Gelderら著、J. Inf. Dis.、２００２年、１８５、ｐ．１１４−１１７
Jegoら著、Immunity、２００３年、１９、ｐ．２２５−２３４
Le Bonら著、Immunity、２００１年、１４、ｐ．４６１−４７３
LienおよびGolenbock著、Nature Immunology、２００３年、４、ｐ．１１６２−１１６４
Oxfordら著、Vaccine、２００３年、２１、ｐ．２７４３−２７４６
Proiettiら著、J. Immunol、２００２年、１６９、ｐ．３７５−３８３
Remington著、「薬の科学および実際（The Science and Practice of Pharmacy）、第１８９版」、Mack Publishing Co.、ペンシルバニア州イーストン、１９９５年
Restifo、N.、ＮＣＩ，キーストン・シンポジウム、「ワクチンおよび免疫療法の合理的設計（Rational Design of Vaccines and Immunotherapeutics）」、キーストーン、２００４年、１月、ｐ．６−１１
Spraycar、Marjory編、「ステッドマン医学辞書（Stedman’s Medical Dictionary）」、Williams and Wilkins、１９９５年
Tough DF、Borrow P、およびSprent J.著、「生体内でのウイルスおよびＩ型インターフェロンによるバイスタンダーＴ細胞増殖の誘導（Induction of bystander T cell proliferation by viruses and type I interferon in vivo.）」、１９９６年、サイエンス、２７２、ｐ．１９４７―１９５０
ToveyおよびMaury著、J. IFN and Cytokine Res.、１９９９年、１９、ｐ．１４５−１５５
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１Ａ】図１Ａは、ワクチン接種後１５日の、抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。抗体反応は、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。各抗体サブクラスは、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチンを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に、投与してから調べた。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ワクチン接種後３０日の、抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。抗体反応は、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。各抗体サブクラスは、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチンを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に、投与してから調べた。
【図２Ａ】図２Ａは、ワクチン再接種後の抗インフルエンザ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。マウスは第０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に注入することによって、ワクチン接種された。マウスは第９０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと同時に注入することによって、ワクチンを再接種された。抗インフルエンザ抗体反応を第１０５日に、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ワクチン再接種後の抗インフルエンザ抗体におけるＩＦＮ−αの効果を示す。マウスは第０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に注入することによって、ワクチン接種された。マウスは第９０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと同時に注入することによって、ワクチンを再接種された。抗インフルエンザ抗体反応を第１２０日に、特異的免疫グロブリンサブクラス：全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＡについて図に示すように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ワクチン接種後の抗インフルエンザ分泌性ｓ−ＩｇＡ抗体反応におけるＩＦＮ−αの効果を示す。マウスは第０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと同時に注入することによって、ワクチン接種された。マウスは第９０日に、ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）抗インフルエンザワクチン１５μｇを単独、または１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αと混合もしくは１０５ＩＵの組換えＩＦＮ−αｏｍと同時に注入することによって、ワクチンを再接種された。分泌性ｓ−ＩｇＡ抗インフルエンザ抗体反応を第１２０日に、図に示すように、分泌性ｓ−ＩｇＡ特異的な抗原捕捉ＥＬＩＳＡ分析を使用して決定した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）口腔粘膜以外の手段から対象へ供することにより、有効量のワクチンまたは抗原を投与し、（ｂ）ワクチンに対する免疫反応を増強するのに十分量のインターフェロンおよび／または少なくとも一の他のＴｈ１刺激サイトカインを口腔粘膜から投与し、前記インターフェロンおよび／または他のサイトカイン投与は前記ワクチン投与と実質的に同時である、から構成される、ワクチンに対する免疫反応を増強する方法。
【請求項２】
前記免疫反応が液性反応である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記免疫反応が細胞性反応である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ワクチンが筋注によって投与される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ワクチンが経口または経鼻によって肺へ投与される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ワクチンが皮下または皮内投与される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記インターフェロンが少なくとも５秒間口腔粘膜と接触するように維持される方法で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記インターフェロンが少なくとも１分間間口腔粘膜と接触するように維持される方法で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記インターフェロンが５ないし３００秒間口腔粘膜と接触するように維持される方法で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクチンがアジュバントの存在なしに投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクチンがアジュバント化ワクチンである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチンが、インフルエンザ、天然痘、炭疽、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオ、結核または抗腫瘍ワクチンである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記十分量のインターフェロンが１０５ないし１０８ＩＵの範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記十分量のインターフェロンが１０６ないし１０７ＩＵの範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記インターフェロンがＩ型インターフェロンまたはＩＦＮ−γを構成するグループから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
対象が先に免疫化されている抗原に対して暴露している際に、前記抗原に対する免疫記憶反応を刺激するのに十分な量の、インターフェロン、および／または一またはそれ以上の他のＴｈ１刺激サイトカインを口腔粘膜投与することから構成される、前記抗原に対する暴露の際の免疫反応を増強する方法。
【請求項１】
（ａ）口腔粘膜以外の手段から対象へ供することにより、有効量のワクチンまたは抗原を投与し、（ｂ）ワクチンに対する免疫反応を増強するのに十分量のインターフェロンおよび／または少なくとも一の他のＴｈ１刺激サイトカインを口腔粘膜から投与し、前記インターフェロンおよび／または他のサイトカイン投与は前記ワクチン投与と実質的に同時である、から構成される、ワクチンに対する免疫反応を増強する方法。
【請求項２】
前記免疫反応が液性反応である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記免疫反応が細胞性反応である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ワクチンが筋注によって投与される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ワクチンが経口または経鼻によって肺へ投与される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ワクチンが皮下または皮内投与される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記インターフェロンが少なくとも５秒間口腔粘膜と接触するように維持される方法で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記インターフェロンが少なくとも１分間間口腔粘膜と接触するように維持される方法で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記インターフェロンが５ないし３００秒間口腔粘膜と接触するように維持される方法で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクチンがアジュバントの存在なしに投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクチンがアジュバント化ワクチンである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチンが、インフルエンザ、天然痘、炭疽、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオ、結核または抗腫瘍ワクチンである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記十分量のインターフェロンが１０５ないし１０８ＩＵの範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記十分量のインターフェロンが１０６ないし１０７ＩＵの範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記インターフェロンがＩ型インターフェロンまたはＩＦＮ−γを構成するグループから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
対象が先に免疫化されている抗原に対して暴露している際に、前記抗原に対する免疫記憶反応を刺激するのに十分な量の、インターフェロン、および／または一またはそれ以上の他のＴｈ１刺激サイトカインを口腔粘膜投与することから構成される、前記抗原に対する暴露の際の免疫反応を増強する方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【公表番号】特表２００８−５０２７３２（Ｐ２００８−５０２７３２Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２７７６７（Ｐ２００７−５２７７６７）
【出願日】平成１７年６月１３日（２００５．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２０５００
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２３１１２
【国際公開日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【出願人】（５０６４１２５７２）ファーマ パシフィック プロプリエタリイ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月１３日（２００５．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２０５００
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１２３１１２
【国際公開日】平成１７年１２月２９日（２００５．１２．２９）
【出願人】（５０６４１２５７２）ファーマ パシフィック プロプリエタリイ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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