ワクチン及びその製造方法
【課題】副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能なバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンの提供。
【解決手段】マウスに感染するバベシア原虫の１種、バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有するワクチンである。
【解決手段】マウスに感染するバベシア原虫の１種、バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有するワクチンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バベシア属に対するワクチン及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バベシア症は、赤血球内寄生原虫であるバベシア原虫によって引き起こされる溶血性の疾病であり、主にダニによって媒介される。バベシアの種類としては、７０種類以上が知られており、その種類によって寄生する動物種が異なる。
これらの中でもイヌに寄生するバベシアは、主にバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ））及びバベシア・キャニス（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ（Ｂ．ｃａｎｉｓ））の２種類が知られている。
バベシア症は、バベシアの種類によって地理的分布が限定されており、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）は主にアジアに分布しており、バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）は主にヨーロッパに分布しているため、我が国では、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染が問題となっている。
現在、日本国内のイヌの約７．４％が、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染しているといわれており（非特許文献１参照）、更に、その１０．６％のイヌが抗体陽性であり（非特許文献２参照）、無症状のキャリアー（保菌動物）も存在するため、その感染は全国に拡大している点で問題である。
【０００３】
バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染したイヌは、発熱、食欲不振、便秘、下痢、胃潰瘍、口内炎、浮腫、腹部膨満（腹水）、皮下出血、発疹（紫斑）、白血球数の減少、関節の腫脹、背中の痛み、てんかん発作、肝臓の酵素値（ＧＯＴ、ＧＰＴ）の増加、血小板の減少、リンパ節の肥大、脾臓の肥大、細菌性ショック、抑鬱状態などの慢性症状を呈し、急性症では、溶血性貧血、血尿、黄疸、リンパ節障害、嘔吐などの症状が現れる。また、劇症では、低体温、ショック、昏睡、ＤＩＣ（播種性血管内凝固）、代謝性アシドーシスなどの症状が現れ、幼犬又は老犬では、死に至る場合も少なくない。
【０００４】
バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症の治療薬としては、主としてジミナゼン製剤（商品名：ガナゼック、ノバルティスアニマルヘルス株式会社製）が用いられてきたが、前記ジミナゼン製剤は小脳出血に起因する神経症状、肝障害、腎障害などを惹起するなどの副作用があるため、その使用が制限されている（非特許文献３参照）。
事前の抗生物質（クリンダマイシン）の投与により感染抑制が可能であるが、事前に反復投与してしまうと、体内に常在する細菌が薬剤耐性を有し、耐性菌が出現する点で現実的ではない。
また、新たな抗原虫薬も注目されている（特許文献１〜４参照）が、耐性株の出現が示唆されている点で問題である。
【０００５】
前記したように、有効な治療薬が存在しないため、イヌがバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染しないよう、予防することが重要である。
一般に、感染症の予防としてはワクチンが使用される。バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）に対するワクチンは、Ｐｉｒｏｄｏｇ（登録商標）として市販されており、バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）株の培養物の上清から調製されている（特許文献５参照）。しかし、このワクチンは、一般に一部の野生型のバベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）による感染に対してほとんど保護効果がないことが報告されている。また、バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）とバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）とは種が異なるため、前記ワクチンは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンとして有効であるとの報告はない。
【０００６】
バベシア症と同様に原虫によって引き起こされるマラリア症においては、異なる種のマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）が、それぞれワクチン候補となる表面抗原の相同性は有するものの、そのワクチン効果は種によって異なることが知られており（非特許文献４〜５参照）、原虫においては、表面抗原の相同性の有無で、そのワクチン効果を予測することは非常に難しい。
また、マウスマラリア原虫であるプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ））でマウスを免疫し、プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ））で攻撃した場合、前記プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）はワクチン効果を示さず、マウスは前記プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）に感染するが、反対に、プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）でマウスを免疫し、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）で攻撃した場合は、前記プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）がワクチン効果を示し、前記プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）のマウスへの感染を抑制することができることが知られている（非特許文献６参照）。同様にして、マウスマラリア原虫であるプラスモディウム・シャバウディ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ））でマウスを免疫し、プラスモジウム・ビンケイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｎｃｋｅｉ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ））で攻撃した場合、前記プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）はワクチン効果を示さず、マウスは前記プラスモジウム・ビンケイ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ）に感染するが、反対に、プラスモジウム・ビンケイ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ）でマウスを免疫し、プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）で攻撃した場合は、前記プラスモジウム・ビンケイ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ）がワクチン効果を示し、前記プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）のマウスへの感染を抑制することができることが知られている（非特許文献６参照）。
このように、一の種でワクチン効果を示すことが知られていても、他の種でワクチン効果を示すとは限らない点で、原虫に対するワクチン開発は非常に困難である。
【０００７】
更に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）が大量培養できないため、その開発が困難とされている。
特許文献６では、主用抗原タンパク質Ｐ５０タンパク質を利用した、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンが報告されている（特許文献６参照）が、その感染防御率は４９．２％と十分満足するものではなく、またこのワクチンは、ヘマトクリット値を有意に低下させることができないため、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染症による貧血症状を緩和することができない点で問題である（非特許文献７参照）。
【０００８】
したがって、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能なバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンの提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−０５３９８７号公報
【特許文献２】特開２００５−３１４３４５号公報
【特許文献３】特開２００５−２４７７６７号公報
【特許文献４】特開２００８−５１９８４４号公報
【特許文献５】米国特許第４，７７７，０３６号明細書
【特許文献６】特開２００２−３００８８２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】大西 堂文ら， 日本獣医師会雑誌， １９９４， ４７：１， ｐ．２３−８
【非特許文献２】Ｋｏｎｉｓｈｉ．Ｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｔ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ， ２００８， １５５， ３−４， ｐ．２０４−８
【非特許文献３】Ｇｒｅｅｎｅ Ｃ． Ｅ． ｅｄ， Ｂ． Ｗ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９０， ｐ．７９６−８０３
【非特許文献４】Ｍ．Ｗ．Ｇｏｓｃｈｎｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， ２００４， ７２（１０）， ｐ．５８４０−５８４９
【非特許文献５】Ｃｒｅｗｔｈｅｒ ＰＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９６， ６４（８）， ｐ．３３１０−３３１７
【非特許文献６】Ａ．Ａ．ＭｃＣＯＬＭ ａｎｄ Ｌ．ＤＡＬＴＯＮ．, Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， １９８３， ７７（４）， ｐ．３５５−３７７
【非特許文献７】Ｓ． Ｆｕｋｕｍｏｔｏ． ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ， ２００７， ２５， ｐ．１３３４−１３４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能なバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、マウスに感染するバベシア原虫の１種であるバベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）が、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）の抗原性と交差しており、イヌにも感染可能であること、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）はマウスで効率よく増殖可能であること、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウスの赤血球をイヌに免疫することで、前記バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染率を低下させ、貧血症状も緩和できること、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウスの赤血球に、更にアジュバントを加えることで、その効果が増大することを知見し、本発明の完成に至った。
【００１３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有することを特徴とするワクチンである。
＜２＞ バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症を予防する前記＜１＞に記載のワクチンである。
＜３＞ アジュバントを含有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のワクチンである。
＜４＞ アジュバントが、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡの少なくともいずれかである前記＜３＞に記載のワクチンである。
＜５＞ 貧血症状を緩和する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のワクチンである。
＜６＞ マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる感染工程と、該マウスより赤血球を採取する採取工程と、を含むことを特徴とするワクチンの製造方法である。
＜７＞ 赤血球を可溶化乃至溶血する可溶化乃至溶血工程と、該赤血球とアジュバントとを混合した混合溶液を得る混合工程と、を含む前記＜６＞に記載のワクチンの製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能なバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＢＭ感染犬の赤血球を光学顕微鏡で観察した図である。
【図２】図２は、ＢＭ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を表した図である。
【図３】図３は、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬へのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉの感染を、ＰＣＲで確認した図である。
【図４】図４は、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬へのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉの感染を、間接蛍光抗体法で確認した図である。
【図５】図５は、ＢＭ−ＢＧ感染犬の感染率の経時変化を表した図である。
【図６】図６は、ＢＭ−ＢＧ感染犬の全赤血球数の経時変化を表した図である。
【図７】図７は、ＢＭ−ＢＧ感染犬のヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を表した図である。
【図８】図８は、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉに対するアジュバントの活性を検討した図である。
【図９】図９は、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の感染率の経時変化を表した図である。
【図１０】図１０は、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の全赤血球数の経時変化を表した図である。
【図１１】図１１は、溶血ＢＭ−サポニン感染犬のヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を表した図である。
【図１２】図１２は、ＢＲ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を表した図である。
【図１３】図１３は、ＢＲ−ＢＧ感染犬の感染率の経時変化を表した図である。
【図１４】図１４は、ＢＲ−ＢＧ感染犬の全赤血球数の経時変化を表した図である。
【図１５】図１５は、ＢＲ−ＢＧ感染犬のヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（ワクチン）
本発明のワクチンは、バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ））を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
前記ワクチンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、バベシア属に対するワクチンであることが好ましく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ））に対するワクチンであることがより好ましい。
前記ワクチンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不活性化ワクチン、生ワクチンなどが挙げられる。これらの中でも、生ワクチンが、獲得免疫力が強く、持続性が高い点で好ましい。
【００１７】
＜バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）＞
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は、マウスに感染するバベシア原虫である。前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は、非常に増殖率がよく、マウス１個体より１０９個以上の虫体が回収可能である点で有利である。
【００１８】
−入手方法−
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染したマウスより入手する方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００１９】
−含有量−
前記ワクチン中の前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の含有量としては、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染を予防することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ワクチンは、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）そのものであってもよく、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染した赤血球を含有する血液であってもよく、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染した赤血球そのものであってもよい。
【００２０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学上許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジュバント、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。これらの中でも、アジュバントを含有することが、ワクチンの活性が高くなる点で好ましい。前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
−アジュバント−
前記アジュバントとは、抗原の免疫原性を高める目的で抗原とともに生体に投与される助剤のことをいう。前記アジュバントの作用としては、その種類により様々な作用が知られており、抗原を吸着して抗原提示細胞への取り込みを高める作用、抗原を局所に長期間留めて徐々に放出することで抗原刺激を持続させる作用、直接免疫細胞を活性化する作用などが挙げられる。
前記アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、アルミニウム塩、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、モノホスホリルリピッドＡ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ：ＭＰＬ）などが挙げられる。前記アジュバントは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡの少なくともいずれかが、優れたアジュバント活性を示す点で好ましい。
【００２２】
−−サポニン−−
前記サポニンは植物に多く含まれ、その構造的としては、トリテルペンやステロイドに糖が結合した配糖体の１種である。糖の部分は水酸基が多く親水性であり、非糖部（トリテルペンやステロイド）は疎水性の性質を有する、両親媒性の構造であるため、界面活性様作用をもたらす。また、サポニンは、インターロイキンやインターフェロンなどのサイトカインの産生を高める作用を有することも知られている。この作用によって、細胞性免疫や抗体産生を活性化し、免疫力を高めることができる点で有利である。
【００２３】
−−モノホスホリルリピッドＡ−−
前記モノホスホリルリピッドＡは、細菌の細胞壁の構成成分であるリポ多糖の部分分解産物である。前記リポ多糖もアジュバント活性を有するが、毒性を有する点で問題である。一方、前記モノホスホリルリピッドＡは、リポ多糖と異なり毒性が非常に低い点で有利である。前記モノホスホリルリピッドＡは、直接免疫細胞を活性化することでそのアジュバント活性を示すことが知られている。
【００２４】
−−入手方法−−
前記アジュバントを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品より入手する方法、合成により入手する方法、植物より抽出して入手する方法などが挙げられる。
【００２５】
−−含有量−−
前記ワクチン中の前記アジュバントの含有量としては、アジュバント活性を発揮できれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ〜１，０００ｍｇが、優れたアジュバント活性を示す点で好ましい。
【００２６】
＜使用＞
前記ワクチンは、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記ワクチンは、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００２７】
＜剤型＞
前記ワクチンの剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。これらの中でも、注射剤が好ましい。
【００２８】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に、賦形剤、及び必要に応じて各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００２９】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
【００３０】
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３１】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３２】
−軟膏剤−
前記軟膏剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤などが挙げられる。
前記軟膏剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤などを配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３３】
−貼付剤−
前記貼付剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤などを、常法により塗布し、製造することができる。
前記支持体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタンなどのフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００３４】
−スプレー剤−
前記スプレー剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エアゾール剤、粉剤、乳剤、液剤、水和剤などが挙げられる。
スプレー剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、米国特許第２，８６８，６９１号明細書及び米国特許第３，０９５，３５５号明細書に記載の方法などを使用して製造することができる。
【００３５】
＜投与＞
前記ワクチンの投与方法、投与量、投与回数、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による投与方法、吸入による投与方法、スプレーによる投与方法などが挙げられる。これらの中でも、注射による投与方法が好ましい。
前記注射による投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、粘膜下投与、皮下投与などが挙げられる。
前記スプレーによる投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、眼、鼻、口腔、肛門、膣の粘膜上皮など、身体の少なくともいずれかの表皮にスプレーして非経口投与する方法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、イヌが好ましい。
【００３６】
＜用途＞
前記ワクチンは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能であるため、イヌへの投与（予防接種）に好適に利用可能である。なお、前記ワクチンをイヌに投与することを含む、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染症を予防するための予防接種方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３７】
（ワクチンの製造方法）
本発明のワクチンの製造方法は、マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる感染工程と、該マウスより赤血球を採取する採取工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００３８】
＜感染工程＞
前記感染工程は、マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる工程である。前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）をマウスに感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を腹腔内に投与する方法、静脈内に投与する方法などが挙げられる。これらの中でも、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）をマウスの腹腔内に投与する方法が、簡単であるため、好ましい。
【００３９】
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）がマウスに感染したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウスの血液を採取し、光学顕微鏡で赤血球を観察する方法、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の遺伝子配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲで確認する方法、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を抗原として作製した抗体を用いて蛍光染色で確認する方法などが挙げられる。
前記光学顕微鏡で観察する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記赤血球をライトギムザ液で染色する方法が、赤血球を簡便に区別することができる点で好ましい。
【００４０】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウス（以下、「ＢＭ感染マウス」と称することがある。）より赤血球を採取する工程である。
前記ＢＭ感染マウスより前記赤血球を含有する血液を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、心臓採血により採取する方法が、簡便であり、大量の血液を得ることができる点で好ましい。なお、前記採取の際に用いる注射器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヘパリンにより凝固防止処理を施した注射器であることが好ましい。
【００４１】
前記採取した血液中の赤血球へのバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染率を算出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、全赤血球数及び前記ライトギムザ染色した血液塗沫を、血球計算版を用いて計測した後、下記計算式により算出する方法などが挙げられる。
感染率（％）＝顕微鏡視野中の感染赤血球数／顕微鏡視野中の全赤血球×１００
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染した赤血球（以下、「ＢＭ感染赤血球」と称することがある。）の数は、前記全赤血球数及び前記感染率より算出することができる。
【００４２】
前記赤血球は、前記採血した血液の状態であってもよいし、前記赤血球のみを分離したものであってもよい。前記採取した血液より、前記赤血球を分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遠心分離による方法などが挙げられる。前記遠心分離により、赤血球は沈殿し、血漿やその他の血球成分は上清や中間層として分離することができる。
前記遠心分離により得られた赤血球は、そのまま用いてもよいが、洗浄することが、その他の血球成分などを取り除くことができる点で好ましい。前記洗浄する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記遠心により沈殿した赤血球とＰＢＳ（−）とを混合した後、再び遠心分離し、上清のＰＢＳ（−）を除去する方法などが挙げられる。
前記血液及び前記分離した赤血球の少なくともいずれかは、前記ＢＭ感染赤血球の数が所望の数となるように希釈して用いることが好ましい。前記希釈する溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＢＳ（−）が好ましい。
【００４３】
前記ＢＭ感染赤血球を保存する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、採取した血液を凍結する方法などが挙げられる。なお、前記希釈は、凍結前に行ってもよいし、凍結融解後の前記ＢＭ感染赤血球の使用前に行ってもよい。
【００４４】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＢＭ感染赤血球を、可溶化乃至溶血する可溶化乃至溶血工程、前記可溶化乃至溶血したＢＭ感染赤血球とアジュバントとを混合した混合溶液を得る混合工程などが挙げられる。
【００４５】
−可溶化乃至溶血工程−
前記可溶化乃至溶血工程は、前記ＢＭ感染赤血球を、可溶化乃至溶血する工程である。前記可溶化乃至溶血工程では、赤血球膜を破壊することにより、赤血球内に存在する前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を外界に露出せることができる。
前記ＢＭ感染赤血球を可溶化乃至溶血する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＢＭ感染赤血球と界面活性剤とを混合する方法、前記ＢＭ感染赤血球と蒸留水とを混合する方法などが挙げられる。前記界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などが挙げられる。前記蒸留水及び前記界面活性剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記ＢＭ感染赤血球と蒸留水とを混合する方法が、効率よく前記ＢＭ感染赤血球を、可溶化乃至溶血できる点で好ましい。
前記ＢＭ感染赤血球と前記蒸留水及び前記界面活性剤の少なくともいずれかとを混合する混合比としては、前記ＢＭ感染赤血球を可溶化することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
−混合工程−
前記混合工程は、前記可溶化乃至溶血したＢＭ感染赤血球とアジュバントとを混合した混合溶液を得る工程である。前記アジュバントとしては、例えば、前述したワクチンに含まれるアジュバントを用いることができる。前記可溶化乃至溶血したＢＭ感染赤血球とアジュバントとを混合する混合比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００４７】
以下に本発明の製造例、実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例などに何ら限定されるものではない。
【００４８】
（製造例１：Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉワクチンの製造）
＜感染工程＞
野外でバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染したマウスの血液を採取し、継代培養したバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）１×１０５個を、ｄｄｙマウス（ｎ＝２）（日本エスエルシー株式会社）に、注射器を用いて腹腔内投与することにより、マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させた（以下、「ＢＭ感染マウス」と称することがある。）。
【００４９】
＜採取工程＞
ＢＭ感染マウスの血液は、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後１０日目に、ヘパリンによる凝固防止処理を施した注射器を用いて心臓採血により採取した。
【００５０】
−調製−
採取した血液中の全赤血球数を、血球計算版を用いて計測した。次いで、ライトギムザ液（メルク社製）にて前記赤血球を染色し、染色した血液塗沫と、光学顕微鏡とを用いて感染率を計測した。感染率は、下記計算式より算出することができる。
感染率（％）＝顕微鏡視野中の感染赤血球数／顕微鏡視野中の全赤血球×１００
【００５１】
前記全赤血球数及び前記感染率より、感染赤血球数を算出した。感染赤血球数（以下、「ＢＭ感染赤血球」と称することがある）が１×１０８個となるように、採取した血液をＰＢＳ（−）（０．８質量％塩化ナトリウム、０．０２質量％塩化カリウム、０．１１５質量％リン酸水素二ナトリウム、０．００２質量％リン酸二水素カリウム）で希釈し、本発明のワクチンを得た。
【００５２】
（実施例１：ワクチン投与の効果）
＜バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染犬の作出＞
−ＢＭ感染赤血球によるイヌへの免疫−
製造例１のワクチン（ＢＭ感染赤血球１×１０８個を含有）を、ビーグル犬（ｎ＝２）（日本農産工業株式会社）の橈側皮静脈より静脈内投与することにより、ビーグル犬にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させ、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染犬（以下、「ＢＭ感染犬」と称することがある。）を作出した。ＢＭ感染犬は、２個体を後述する検査に用いた。また、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後４１週間後のＢＭ感染犬２個体を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００５３】
−ＢＭ感染犬の検査−
ＢＭ感染犬の全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を検査するため、ＢＭ感染犬へのバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）投与後３ヶ月間は週に２回（火曜日と金曜日）、それ以降は週に１回（火曜日）、ＢＭ感染犬の血液を頚静脈より採血した。採取した血液の全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数は、前述した方法と同様の方法で算出した。
また、採取した血液をヘマトクリット遠心管（ＶＩＴＲＥＸ ＭＥＤＩＣＡＬ社製）に充填し、ヘマトクリット遠心機にて１５，０００×ｇ、５分間、遠心分離を行い、ヘマトクリット計算版を用いてヘマトクリット値（Ｈｔ値）を計測した。
【００５４】
図１に、ＢＭ感染犬の赤血球を光学顕微鏡で観察した像を示す。なお、図１中、矢印はバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染を示す。
図２に、ＢＭ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を示す。図２より、全赤血球数は、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後３２日目で４．１×１０６個／μＬに低下した。また感染率は、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後５３日目で１．０％を示した。
【００５５】
−バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染の確認−
−−バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）遺伝子発現の確認−−
製造例１で作出したＢＭ感染マウス及び前記ＢＭ感染犬にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）が感染しているか否かについて確認するため、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬の赤血球、並びにコントロールとして、無処置マウス及び無処置犬の赤血球より、それぞれのＤＮＡを抽出し、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉの遺伝子配列に特異的な配列を有するプライマーを用いてＤＮＡを増幅した。各ＰＣＲ産物を電気泳動することにより、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の遺伝子発現の確認を行った。なお、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の遺伝子が発現していた場合、１５４ｂｐにバンドを検出することができる。
図３に、電気泳動像を示す。レーン１はＢＭ感染マウス、レーン２は無処置マウス、レーン３はＢＭ感染犬、及びレーン４は無処置犬の結果を示す。図３より、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬では目的の大きさのバンドが検出されたことから、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染していることが確認された。
【００５６】
−−抗血清の確認−−
次に、前記ＢＭ感染犬の赤血球へのバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染を、間接蛍光抗体法（ＩＦＡＴ）を用いて確認した。
前記ＢＭ感染マウス及び前記ＢＭ感染犬の赤血球をＩＦＡＴスライドにコートし、完全に乾燥させた後、無水アセトンで１０分間固定した。１次抗体として、ＢＭ感染マウスの抗血清、若しくはＢＭ感染犬の抗血清を用いた。前記固定したＩＦＡＴスライドに前記１次抗体を添加し、３７℃にて３０分間反応させた。次いで、ＰＢＳＴ（０．８質量％塩化ナトリウム、０．０２質量％塩化カリウム、０．１１５質量％リン酸水素二ナトリウム、０．００２質量％リン酸二水素カリウム、０．０５体積％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、２次抗体（１次抗体にＢＭ感染マウスの抗血清を用いた場合は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）、１次抗体にＢＭ感染犬の抗血清を用いた場合は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｄｏｇ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製））を用い、３７℃にて３０分間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した。
図４に、蛍光顕微鏡像を示す。図４中、光っている部位が感染を示す。図４より、ＢＭ感染犬の赤血球にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）が感染していることが確認された。
【００５７】
図１〜４の結果より、マウスに感染するバベシアであるバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は、イヌにも感染可能であることが示唆された。
【００５８】
＜バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染犬の作出＞
−バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球の調製−
野外でバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染した犬の血液を採取し、継代培養したバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球を用い、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球が７×１０８個となるように、ＰＢＳ（−）で希釈した。
ビーグル犬（ｎ＝１）の橈側皮静脈より、注射器を用いて前記バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球７×１０８個を静脈内投与することにより、ビーグル犬にバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた（以下、「Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ感染赤血球供与犬」と称することがある。）。
バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後３１日目に、ヘパリンによる凝固防止処理を施した注射器を用いて、Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ感染赤血球供与犬の血液を頚静脈により採取し、前述した方法と同様の方法で、全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を算出した。
なお、前記バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球は、Ｖｅｇａ ｙ Ｍａｒｔｉｎｅｚ(ＶＹＭ)リン酸緩衝液（２質量％グルコース、０．００１６質量％塩化カルシウム、０．０４質量％塩化カリウム、０．１４１５質量％リン酸二水素カリウム、０．０１５４質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．１９３７質量％リン酸水素ナトリウム十二水和物、０．７０７７質量％塩化ナトリウム）に、０．００４２３質量％アデニン（Ａ２７８５、シグマ社製）、及び０．００７０８質量％グアノシン（Ｇ６２６４、シグマ社製）を懸濁し、ｐＨ７．２に調整した溶液に懸濁し、凍結保しておくことが可能である。
【００５９】
−感染−
前記ＢＧ感染赤血球１×１０８個を、ＢＭ感染犬（ｎ＝２）、若しくは無処置犬（ｎ＝２）の橈側皮静脈より静脈内投与することによりバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた。以下、ＢＭ感染犬に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた犬を、「ＢＭ−ＢＧ感染犬」、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のみを感染させた犬を、「ＢＧ対照犬」と称することがある。
【００６０】
−ＢＭ−ＢＧ感染犬の検査−
ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬の全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を検査するため、ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬へのバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）投与後３ヶ月間は週に２回（火曜日と金曜日）、それ以降は週に１回（火曜日）、ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬の血液を頚静脈より採血した。採取した血液の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）は、前述した方法と同様の方法で算出した。
【００６１】
−−感染率−−
図５に、感染率の経時変化を示す。ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬ともにバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後１１日目の感染率が最も高く、ＢＧ対照犬では４．６％であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬では１．８％であったことから、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前に、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染することで、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）への感染率が６０％抑制された。
【００６２】
−−赤血球数−−
図６に、全赤血球数の経時変化を示す。全赤血球数が４×１０６個／μＬ（図６破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＭ−ＢＧ対照犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その全赤血球数は１．８×１０６個／μＬであったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２５日目であり、その全赤血球数は２．６×１０６個／μＬであった。また、全赤血球数が４×１０６個／μＬ以下であった期間（貧血状態であった期間）は、ＢＧ対照犬は３８日間であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬は２１日間であったことから、１７日間短縮していた。
これらの結果より、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染することで、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状が軽度になり、その期間が短縮することが認められた。
【００６３】
−−ヘマトクリット値（Ｈｔ値）−−
図７に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を示す。ヘマトクリット値（Ｈｔ値）が３５％（図７破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＭ−ＢＧ対照犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後１１日目であり、そのＨｔ値は１３．５％であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、そのＨｔ値は２１％であった。また、Ｈｔ値が３５％以下であった期間（貧血状態であった期間）は、ＢＧ対照犬は６０日間であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬は３５日間であったことから、２５日間短縮していた。
これらの結果からも図６と同様に、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染することで、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状が軽度になり、その期間が短縮することが認められた。
【００６４】
（実施例２：アジュバントの検討）
＜アジュバントの調製＞
アジュバントとして、サポニン（ＡＣＣＵＲＡＴＥ ＣＨＥＭ社製）及びモノホスホリルリピッドＡ（ＲＩＢＩ社製）を用いて以下の検討を行った。サポニンは、ＰＢＳ（−）で希釈し、１，０００ｍＬに調製した。モノホスホリルリピッドＡは、ＰＢＳ（−）で希釈し、０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。
【００６５】
＜ＢＭ感染赤血球の調製＞
製造例１のＢＭ感染マウスより、製造例１と同様の方法で血液を採取した。前記ＢＭ感染マウスの赤血球を、１，７５０×ｇ、５分間、遠心分離を行い、血漿及びバフィーコートを除去し、ＢＭ感染赤血球を得た。このＢＭ感染赤血球に、ＰＢＳ（−）１０ｍＬを添加し、転倒混和することによりＢＭ感染赤血球を洗浄した後、１，７５０×ｇ、５分間、遠心分離を行い、上清を除去した。前記洗浄は２回行った。
次いで、ライトギムザ液にて前記ＢＭ感染赤血球を染色し、実施例１と同様の方法で感染率を計測した。採取した血液は、ＢＭ感染赤血球が１×１０９個／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）を用いて希釈した。次いで、この希釈したＢＭ感染赤血球を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで可溶化、若しくは蒸留水で溶血させた。具体的には、前記ＢＭ感染赤血球にＴｒｉｔｏｎ−Ｘを、ＢＭ感染赤血球：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＝１：１５（Ｖ／Ｖ）の割合で添加することにより、ＢＭ感染赤血球を可溶化した。また、ＢＭ感染赤血球：蒸留水＝１：１（Ｖ／Ｖ）の割合で蒸留水を添加することにより、ＢＭ感染赤血球を溶血させた。
【００６６】
＜ＢＭ感染赤血球とアジュバントとの混合＞
−ＢＭ感染赤血球とサポニンとの混合−
前記可溶化乃至溶血させたＢＭ感染赤血球と、前記２５０μｇ／ｍＬサポニン溶液とを等量混合することにより、アジュバントを含有するワクチンを製造した（以下、可溶化したＢＭ感染赤血球とサポニン溶液とを混合した溶液を、「可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン」、溶血したＢＭ感染赤血球とサポニン溶液とを混合した溶液を、「溶血ＢＭ感染赤血球−サポニン」と称することがある。）。この可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン及び溶血ＢＭ感染赤血球−サポニンそれぞれ０．２ｍＬ（ＢＭ感染赤血球１×１０７個及びサポニン２５μｇを含有する）を、後述するマウスへの免疫に用いた。
【００６７】
−Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ感染赤血球とモノホスホリルリピッドＡとの混合−
前記可溶化乃至溶血させたＢＭ感染赤血球と、５００μｇ／ｍＬモノホスホリルリピッドＡ溶液とを等量混合することにより、アジュバントを含有するワクチンを製造した（以下、可溶化したＢＭ感染赤血球とモノホスホリルリピッドＡ溶液とを混合した溶液を、「可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ」、溶血したＢＭ感染赤血球とモノホスホリルリピッドＡ溶液とを混合した溶液を、「溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ」と称することがある。）。この可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ及び溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬそれぞれ０．２ｍＬ（ＢＭ感染赤血球１×１０７個及びモノホスホリルリピッドＡ ５０μｇを含有する）を、後述するマウスへの免疫に用いた。
【００６８】
＜アジュバントを含有するワクチンのマウスへの免疫＞
可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン、溶血ＢＭ感染赤血球−サポニン、可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ、及び溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬそれぞれ０．２ｍＬを、３週間ごとに３回、ｄｄｙマウスの背部皮下に投与（免疫）した（以下、可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニンを投与したマウスを、「可溶化ＢＭ−サポニン感染マウス」、溶血ＢＭ感染赤血球−サポニンを投与したマウスを、「溶血ＢＭ−サポニン感染マウス」、可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬを投与したマウスを、「可溶化ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス」、溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬを投与したマウスを、「溶血ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス」と称することがある（表１参照）。）。
最終免疫の３週間後に、可溶化ＢＭ−サポニン感染マウス（ｎ＝６）、溶血ＢＭ−サポニン感染マウス（ｎ＝６）、可溶化ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス（ｎ＝６）、及び溶血ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス（ｎ＝６）の血液を心臓より採取し、１，７５０×ｇ、５分間、遠心分離を行い、血清（ｎ＝６／群をプールしたもの）を得た。この血清を後述するアジュバントの検討に用いた。
【００６９】
【表１】
【００７０】
＜検討＞
アジュバントの検討は、ウエスタンブロットにて行った。即ち、ＳＤＳゲル（９．７質量％アクリルアミド、０．３質量％ Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、４．５質量％トリスヒドロキシメチルアミノメタン、０．１質量％ＳＤＳ、０．４質量％過硫酸アンモニウム、０．０５質量％ＴＥＭＥＤ）に、製造例１のＢＭ感染マウスの赤血球又はＢＭ非感染マウスの赤血球を、１ウエルあたり２０μｇアプライし、電気泳動を行った。次いで、メンブレン（ＡＴＴＯ社製）にブロッティングし、スキムミルク（北海道乳業株式会社製）でブロッキングを行った後、前記したように調製したＢＭ感染マウス、可溶化ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス、可溶化ＢＭ−サポニン感染マウス、溶血ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス、溶血ＢＭ−サポニン感染マウス、及びＢＭ感染マウスの血清を、それぞれＰＢＳ（−）で２００倍に希釈した血清を反応させ、ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)により検出した。
【００７１】
結果を、図８に示す。図８中、「ＢＭ」はＢＭ感染マウスの赤血球、「Ｍ−ＮＲＢＣ」はＢＭ非感染マウスの赤血球を示す。ＢＭ感染マウスの血清を反応させた場合、ＢＭ感染マウスの赤血球（レーン１３）は、ＢＭ非感染マウスの赤血球（レーン１４）では認められなかったバンドが検出されており、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉの感染による抗原が存在することが認められた。
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで可溶化した場合は、ＢＭ感染マウスの赤血球（レーン１、３、及び５）とＢＭ非感染マウスの赤血球（レーン２、４、及び６）とでバンドパターンに違いは認められなかった。
蒸留水で溶血した場合は、ＢＭ感染マウスの赤血球（レーン７、９、及び１１）は、ＢＭ非感染マウスの赤血球（レーン８、１０、及び１２）では認められなかったバンドが検出されており、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染による抗原が存在することが認められた。
これらの結果より、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡは、アジュバントとして好適に用いることができることが確認された。また、ＢＭ感染赤血球は、蒸留水で溶血させる方法が、本発明のワクチンとして適していることが示唆された。以下の実施例では、安価で使用しやすいことからサポニンをアジュバントとして用いた。
【００７２】
（実施例３：アジュバントを含有するワクチンの効果）
＜アジュバントを含有するワクチンの投与＞
実施例２と同様の方法で、可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニンを調製した。この可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン（溶血ＢＭ感染赤血球１×１０８個及びサポニン５００ｍｇを含有する）を、３週間ごとに３回、ビーグル犬（ｎ＝２）の背部皮下に投与した（以下、可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニンを投与したイヌを「溶血ＢＭ−サポニン感染犬」と称することがある。）。最終免疫の５週間後に、溶血ＢＭ−サポニン感染犬を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００７３】
＜非感染赤血球−サポニン対照犬の作出＞
バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）非感染マウスの赤血球を前記した方法と同様の方法で溶血させ、前記サポニン溶液を、前記した方法と同様の方法で混合し、イヌへ投与することで、対照犬（以下、「非感染赤血球−サポニン対照犬」と称することがある。）（ｎ＝２）を作出した。
なお、本実施例では、何も投与していない無処置犬（ｎ＝２）も使用した（表２参照）。
最終免疫の５週間後に、非感染赤血球−サポニン対照犬及び無処置犬を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００７４】
【表２】
【００７５】
＜感染＞
実施例１と同様の方法でＢＧ感染赤血球供与犬よりＢＧ感染赤血球を調製した。
ＢＧ感染赤血球１×１０８個を、溶血ＢＭ−サポニン感染犬、非感染赤血球−サポニン対照犬、及び無処置犬の橈側皮静脈より静脈内投与に投与することによりバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた。
【００７６】
＜溶血ＢＭ−サポニン感染犬の検査＞
溶血ＢＭ−サポニン感染犬、非感染赤血球−サポニン対照犬、及び無処置犬の全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）を検査するため、各群へのＢＧ感染赤血球投与後３ヶ月間は週に２回（火曜日と金曜日）、それ以降は週に１回（火曜日）、各群の血液を頚静脈より採血した。採取した血液の全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）は、実施例１と同様の方法で算出した。
【００７７】
−感染率−
図９に感染率の経時変化を示す。非感染赤血球−サポニン対照犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その感染率は６．８％であり、また無処置犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２４日目であり、その感染率は８．５％であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その感染率は２．５％であった。即ち、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の感染率は、非感染赤血球−サポニン対照犬に対して６３％、無処置犬に対して７０％抑制された。
【００７８】
−赤血球数−
図１０に、全赤血球数の経時変化を示す。実施例１と同様に、全赤血球数が、４×１０６個／μＬ（図１０破線）以下の場合、貧血状態となる。非感染赤血球−サポニン対照犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、その全赤血球数は１．２×１０６個／μＬであり、また無処置犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、その全赤血球数は１．４×１０６個／μＬであったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２４日目であり、その全赤血球数は３．４×１０６個／μＬであった。また、非感染赤血球−サポニン対照犬及び無処置犬の全赤血球数が、４×１０６個／μＬ以下であった期間（貧血状態であった期間）は４２日間であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬は７日間であったことから、３５日間短縮していた。
これらの結果より、ＢＭ感染赤血球を単独で投与した場合（図６）と比較して、アジュバントとともにＢＭ感染赤血球を投与（図１０）することで、貧血症状を呈する期間は更に短縮し、その貧血の程度も更に軽度になることが認められた。
【００７９】
−ヘマトクリット値（Ｈｔ値）−
図１１に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を示す。実施例１と同様に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）が３５％（図１１破線）以下の場合、貧血状態となる。非感染赤血球−サポニン対照犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、そのＨｔ値は１１％であり、また無処置犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、そのＨｔ値は１４％であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、そのＨｔ値は２５％であった。また、Ｈｔ値が３５％以下であった期間（貧血状態であった期間）は、非感染赤血球−サポニン対照犬は５１日間、無処置犬は６９日間であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬は１７日間であった。即ち、溶血ＢＭ−サポニン感染犬のＨｔ値が３５％以下であった期間は、非感染赤血球−サポニン対照犬に対して３４日間、無処置犬に対して５２日間短縮していた。
これらの結果からも、ＢＭ感染赤血球を単独で投与した場合（図７）と比較して、アジュバントとともにＢＭ感染赤血球を投与（図１１）することで、貧血症状を呈する期間は更に短縮し、その貧血の程度も更に軽度になることが認められた。
【００８０】
（比較例１：バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）による免疫）
バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）とは異なる種のマウスバベシアであるバベシア・ロドハイニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｒｏｄｈａｉｎｉ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ））によりイヌを免疫し、その後バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）をさせ、検討を行った。
【００８１】
＜バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染赤血球の調製＞
−感染−
野外でバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）に感染したマウスの血液を採取し、継代培養したバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）１×１０４個を、ｄｄｙマウス（ｎ＝４）に、注射器を用いて腹腔内投与することにより、マウスにバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）を感染させた（以下、「ＢＲ感染マウス」と称することがある。）。
【００８２】
−採取−
ＢＲ感染マウスの血液は、バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染後８日目に、ヘパリンによる凝固防止処理を施した注射器を用いて、ＢＲ感染マウスの血液を心臓採血により採取した。
【００８３】
−−調製−−
採取した血液は、実施例１と同様の方法で、全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を算出した。感染赤血球数（以下、「ＢＲ感染赤血球」と称することがある）は、過剰量の７．５×１０８個／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）を用いて希釈した。
【００８４】
＜ＢＲ感染赤血球によるイヌへの免疫＞
前記希釈した血液２ｍＬ（ＢＲ感染赤血球１．５×１０９個を含有する）を、ビーグル犬（ｎ＝２）の橈側皮静脈より静脈内投与することにより、ビーグル犬にバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）を感染させ、バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染犬（以下、「ＢＲ感染犬」と称することがある。）を作出した。ＢＲ感染犬は、２個体を後述する検査に用いた。また、バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染後１０３日目のＢＲ感染犬２個体を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００８５】
＜ＢＲ感染犬の検査＞
前記ＢＲ感染犬について、実施例１と同様の方法で、全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）を算出した。
【００８６】
図１２に、ＢＲ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を示す。バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染後１７日目の感染率は、０．１４％であり、ほとんど感染は認められず、全赤血球数及びＨｔ値にも変化は認められなかった。
【００８７】
＜バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染＞
実施例１と同様の方法でＢＧ感染赤血球を調製し、ＢＧ感染赤血球１×１０８個を含有する血液を、前記ＢＲ感染犬、若しくは対照犬（ｎ＝２）の橈側皮静脈より静脈内投与することによりバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた。以下、ＢＲ感染犬に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させたイヌを、「ＢＲ−ＢＧ感染犬」、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のみを感染させたイヌを、「ＢＧ対照犬」と称することがある。
【００８８】
＜ＢＲ−ＢＧ感染犬の検査＞
前記ＢＲ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬について、実施例１と同様の方法で、全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）を算出した。
【００８９】
−感染率−
図１３に、感染率の経時変化を示す。ＢＧ対照犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２４日目であり、その感染率は８．５％であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その感染率は９．５％であったことから、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染しても、その感染率はほとんど変化しなかった。
【００９０】
−赤血球数−
図１４に、全赤血球数の経時変化を示す。全赤血球数が４×１０６個／μＬ（図１４破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＧ対照犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、その全赤血球数は１．４×１０６個／μＬであったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後３１日目であり、その全赤血球数は２．３×１０６個／μＬであった。また、全赤血球数が４×１０６個／μＬ以下であった期間（貧血状態であった期間）は、ＢＧ対照犬は４２日間であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬は２８日間であったことから、１４日間短縮していた。
【００９１】
−ヘマトクリット値（Ｈｔ値）−
図１５に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を示す。ヘマトクリット値（Ｈｔ値）が３５％（図１５破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＲ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬ともにバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目のＨｔ値が最も低く、ＢＧ対照犬では１４％であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬では１７％であった。また、ＢＧ対照犬のＨｔ値が、３５％以下であった期間は、６９日間であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬は４５日間であったことから、２４日間短縮していた。
【００９２】
実施例１及び３、並びに比較例１の結果を下記表３に示す。アジュバント（サポニン）を添加した溶血ＢＭ感染赤血球（実施例３）は、ＢＭ感染赤血球単独の場合（実施例１）と比較して、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染率を抑制し、貧血の緩和効果も優れていることが認められた。
一方、ＢＲ感染赤血球を感染させたイヌ（ＢＲ−ＢＧ感染犬）は、全赤血球数の抑制やＨｔ低下の抑制作用は認められたものの、その効果はＢＭ感染赤血球を感染させたイヌ（ＢＭ感染犬）より低く、また感染率はほとんど抑制できなかった（比較例１）。これより、マウスバベシアでも種類が異なるとバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染に対するワクチン効果はないことが示唆された。
【００９３】
【表３】
【００９４】
実施例１〜３では、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染したマウスの赤血球そのものを投与したことから、複数抗原が関与していることが示唆される。原虫の感染予防には、複数の抗原が関与していることが示唆されている（Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２：１， １９８１， ｐ．４５−５６、 Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２７， ２００５， ４３９−４５参照）ことから、本発明のワクチンはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の複数抗原に有効であることが推測される。
また、マウスの自己免疫性溶血性貧血に関与する抗体はイヌの赤血球膜を認識しないため副作用を抑制できることが知られている（Ｃｈｉａ−Ｒｕｉ Ｓｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２００３， １０２（１５）， ｐ．３８００−３８０６、Ｄｅｂｒａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ， １９８８， ２６３（２０）， ｐ．１００２２−１００２８）ことから、本発明のワクチンは、イヌのバベシアバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に優れた予防効果を有し、貧血症状を緩和でき、副作用のない安全性の高いワクチンとして有用である。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明のバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有するワクチンは、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能であるため、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症の予防に好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バベシア属に対するワクチン及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バベシア症は、赤血球内寄生原虫であるバベシア原虫によって引き起こされる溶血性の疾病であり、主にダニによって媒介される。バベシアの種類としては、７０種類以上が知られており、その種類によって寄生する動物種が異なる。
これらの中でもイヌに寄生するバベシアは、主にバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ））及びバベシア・キャニス（Ｂａｂｅｓｉａ ｃａｎｉｓ（Ｂ．ｃａｎｉｓ））の２種類が知られている。
バベシア症は、バベシアの種類によって地理的分布が限定されており、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）は主にアジアに分布しており、バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）は主にヨーロッパに分布しているため、我が国では、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染が問題となっている。
現在、日本国内のイヌの約７．４％が、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染しているといわれており（非特許文献１参照）、更に、その１０．６％のイヌが抗体陽性であり（非特許文献２参照）、無症状のキャリアー（保菌動物）も存在するため、その感染は全国に拡大している点で問題である。
【０００３】
バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染したイヌは、発熱、食欲不振、便秘、下痢、胃潰瘍、口内炎、浮腫、腹部膨満（腹水）、皮下出血、発疹（紫斑）、白血球数の減少、関節の腫脹、背中の痛み、てんかん発作、肝臓の酵素値（ＧＯＴ、ＧＰＴ）の増加、血小板の減少、リンパ節の肥大、脾臓の肥大、細菌性ショック、抑鬱状態などの慢性症状を呈し、急性症では、溶血性貧血、血尿、黄疸、リンパ節障害、嘔吐などの症状が現れる。また、劇症では、低体温、ショック、昏睡、ＤＩＣ（播種性血管内凝固）、代謝性アシドーシスなどの症状が現れ、幼犬又は老犬では、死に至る場合も少なくない。
【０００４】
バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症の治療薬としては、主としてジミナゼン製剤（商品名：ガナゼック、ノバルティスアニマルヘルス株式会社製）が用いられてきたが、前記ジミナゼン製剤は小脳出血に起因する神経症状、肝障害、腎障害などを惹起するなどの副作用があるため、その使用が制限されている（非特許文献３参照）。
事前の抗生物質（クリンダマイシン）の投与により感染抑制が可能であるが、事前に反復投与してしまうと、体内に常在する細菌が薬剤耐性を有し、耐性菌が出現する点で現実的ではない。
また、新たな抗原虫薬も注目されている（特許文献１〜４参照）が、耐性株の出現が示唆されている点で問題である。
【０００５】
前記したように、有効な治療薬が存在しないため、イヌがバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染しないよう、予防することが重要である。
一般に、感染症の予防としてはワクチンが使用される。バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）に対するワクチンは、Ｐｉｒｏｄｏｇ（登録商標）として市販されており、バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）株の培養物の上清から調製されている（特許文献５参照）。しかし、このワクチンは、一般に一部の野生型のバベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）による感染に対してほとんど保護効果がないことが報告されている。また、バベシア・キャニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）とバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）とは種が異なるため、前記ワクチンは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンとして有効であるとの報告はない。
【０００６】
バベシア症と同様に原虫によって引き起こされるマラリア症においては、異なる種のマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）が、それぞれワクチン候補となる表面抗原の相同性は有するものの、そのワクチン効果は種によって異なることが知られており（非特許文献４〜５参照）、原虫においては、表面抗原の相同性の有無で、そのワクチン効果を予測することは非常に難しい。
また、マウスマラリア原虫であるプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ））でマウスを免疫し、プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ））で攻撃した場合、前記プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）はワクチン効果を示さず、マウスは前記プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）に感染するが、反対に、プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）でマウスを免疫し、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）で攻撃した場合は、前記プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ）がワクチン効果を示し、前記プラスモディウム・ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）のマウスへの感染を抑制することができることが知られている（非特許文献６参照）。同様にして、マウスマラリア原虫であるプラスモディウム・シャバウディ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ））でマウスを免疫し、プラスモジウム・ビンケイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｎｃｋｅｉ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ））で攻撃した場合、前記プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）はワクチン効果を示さず、マウスは前記プラスモジウム・ビンケイ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ）に感染するが、反対に、プラスモジウム・ビンケイ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ）でマウスを免疫し、プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）で攻撃した場合は、前記プラスモジウム・ビンケイ（Ｐ．ｖｉｎｃｋｅｉ）がワクチン効果を示し、前記プラスモディウム・シャバウディ（Ｐ．ｃｈａｂａｕｄｉ）のマウスへの感染を抑制することができることが知られている（非特許文献６参照）。
このように、一の種でワクチン効果を示すことが知られていても、他の種でワクチン効果を示すとは限らない点で、原虫に対するワクチン開発は非常に困難である。
【０００７】
更に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）が大量培養できないため、その開発が困難とされている。
特許文献６では、主用抗原タンパク質Ｐ５０タンパク質を利用した、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンが報告されている（特許文献６参照）が、その感染防御率は４９．２％と十分満足するものではなく、またこのワクチンは、ヘマトクリット値を有意に低下させることができないため、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染症による貧血症状を緩和することができない点で問題である（非特許文献７参照）。
【０００８】
したがって、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能なバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンの提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−０５３９８７号公報
【特許文献２】特開２００５−３１４３４５号公報
【特許文献３】特開２００５−２４７７６７号公報
【特許文献４】特開２００８−５１９８４４号公報
【特許文献５】米国特許第４，７７７，０３６号明細書
【特許文献６】特開２００２−３００８８２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】大西 堂文ら， 日本獣医師会雑誌， １９９４， ４７：１， ｐ．２３−８
【非特許文献２】Ｋｏｎｉｓｈｉ．Ｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｖｅｔ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ， ２００８， １５５， ３−４， ｐ．２０４−８
【非特許文献３】Ｇｒｅｅｎｅ Ｃ． Ｅ． ｅｄ， Ｂ． Ｗ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９０， ｐ．７９６−８０３
【非特許文献４】Ｍ．Ｗ．Ｇｏｓｃｈｎｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， ２００４， ７２（１０）， ｐ．５８４０−５８４９
【非特許文献５】Ｃｒｅｗｔｈｅｒ ＰＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ， １９９６， ６４（８）， ｐ．３３１０−３３１７
【非特許文献６】Ａ．Ａ．ＭｃＣＯＬＭ ａｎｄ Ｌ．ＤＡＬＴＯＮ．, Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， １９８３， ７７（４）， ｐ．３５５−３７７
【非特許文献７】Ｓ． Ｆｕｋｕｍｏｔｏ． ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ， ２００７， ２５， ｐ．１３３４−１３４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能なバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、マウスに感染するバベシア原虫の１種であるバベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）が、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）の抗原性と交差しており、イヌにも感染可能であること、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）はマウスで効率よく増殖可能であること、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウスの赤血球をイヌに免疫することで、前記バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染率を低下させ、貧血症状も緩和できること、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウスの赤血球に、更にアジュバントを加えることで、その効果が増大することを知見し、本発明の完成に至った。
【００１３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有することを特徴とするワクチンである。
＜２＞ バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症を予防する前記＜１＞に記載のワクチンである。
＜３＞ アジュバントを含有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のワクチンである。
＜４＞ アジュバントが、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡの少なくともいずれかである前記＜３＞に記載のワクチンである。
＜５＞ 貧血症状を緩和する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のワクチンである。
＜６＞ マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる感染工程と、該マウスより赤血球を採取する採取工程と、を含むことを特徴とするワクチンの製造方法である。
＜７＞ 赤血球を可溶化乃至溶血する可溶化乃至溶血工程と、該赤血球とアジュバントとを混合した混合溶液を得る混合工程と、を含む前記＜６＞に記載のワクチンの製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能なバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）に対するワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＢＭ感染犬の赤血球を光学顕微鏡で観察した図である。
【図２】図２は、ＢＭ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を表した図である。
【図３】図３は、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬へのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉの感染を、ＰＣＲで確認した図である。
【図４】図４は、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬へのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉの感染を、間接蛍光抗体法で確認した図である。
【図５】図５は、ＢＭ−ＢＧ感染犬の感染率の経時変化を表した図である。
【図６】図６は、ＢＭ−ＢＧ感染犬の全赤血球数の経時変化を表した図である。
【図７】図７は、ＢＭ−ＢＧ感染犬のヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を表した図である。
【図８】図８は、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉに対するアジュバントの活性を検討した図である。
【図９】図９は、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の感染率の経時変化を表した図である。
【図１０】図１０は、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の全赤血球数の経時変化を表した図である。
【図１１】図１１は、溶血ＢＭ−サポニン感染犬のヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を表した図である。
【図１２】図１２は、ＢＲ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を表した図である。
【図１３】図１３は、ＢＲ−ＢＧ感染犬の感染率の経時変化を表した図である。
【図１４】図１４は、ＢＲ−ＢＧ感染犬の全赤血球数の経時変化を表した図である。
【図１５】図１５は、ＢＲ−ＢＧ感染犬のヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（ワクチン）
本発明のワクチンは、バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ））を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
前記ワクチンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、バベシア属に対するワクチンであることが好ましく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ））に対するワクチンであることがより好ましい。
前記ワクチンの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、不活性化ワクチン、生ワクチンなどが挙げられる。これらの中でも、生ワクチンが、獲得免疫力が強く、持続性が高い点で好ましい。
【００１７】
＜バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）＞
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は、マウスに感染するバベシア原虫である。前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は、非常に増殖率がよく、マウス１個体より１０９個以上の虫体が回収可能である点で有利である。
【００１８】
−入手方法−
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染したマウスより入手する方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００１９】
−含有量−
前記ワクチン中の前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の含有量としては、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染を予防することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ワクチンは、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）そのものであってもよく、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染した赤血球を含有する血液であってもよく、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染した赤血球そのものであってもよい。
【００２０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、薬理学上許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジュバント、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。これらの中でも、アジュバントを含有することが、ワクチンの活性が高くなる点で好ましい。前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
−アジュバント−
前記アジュバントとは、抗原の免疫原性を高める目的で抗原とともに生体に投与される助剤のことをいう。前記アジュバントの作用としては、その種類により様々な作用が知られており、抗原を吸着して抗原提示細胞への取り込みを高める作用、抗原を局所に長期間留めて徐々に放出することで抗原刺激を持続させる作用、直接免疫細胞を活性化する作用などが挙げられる。
前記アジュバントの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、アルミニウム塩、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、モノホスホリルリピッドＡ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ：ＭＰＬ）などが挙げられる。前記アジュバントは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡの少なくともいずれかが、優れたアジュバント活性を示す点で好ましい。
【００２２】
−−サポニン−−
前記サポニンは植物に多く含まれ、その構造的としては、トリテルペンやステロイドに糖が結合した配糖体の１種である。糖の部分は水酸基が多く親水性であり、非糖部（トリテルペンやステロイド）は疎水性の性質を有する、両親媒性の構造であるため、界面活性様作用をもたらす。また、サポニンは、インターロイキンやインターフェロンなどのサイトカインの産生を高める作用を有することも知られている。この作用によって、細胞性免疫や抗体産生を活性化し、免疫力を高めることができる点で有利である。
【００２３】
−−モノホスホリルリピッドＡ−−
前記モノホスホリルリピッドＡは、細菌の細胞壁の構成成分であるリポ多糖の部分分解産物である。前記リポ多糖もアジュバント活性を有するが、毒性を有する点で問題である。一方、前記モノホスホリルリピッドＡは、リポ多糖と異なり毒性が非常に低い点で有利である。前記モノホスホリルリピッドＡは、直接免疫細胞を活性化することでそのアジュバント活性を示すことが知られている。
【００２４】
−−入手方法−−
前記アジュバントを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品より入手する方法、合成により入手する方法、植物より抽出して入手する方法などが挙げられる。
【００２５】
−−含有量−−
前記ワクチン中の前記アジュバントの含有量としては、アジュバント活性を発揮できれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５００ｍｇ〜１，０００ｍｇが、優れたアジュバント活性を示す点で好ましい。
【００２６】
＜使用＞
前記ワクチンは、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記ワクチンは、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００２７】
＜剤型＞
前記ワクチンの剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。これらの中でも、注射剤が好ましい。
【００２８】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に、賦形剤、及び必要に応じて各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００２９】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
【００３０】
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３１】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３２】
−軟膏剤−
前記軟膏剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤などが挙げられる。
前記軟膏剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤などを配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。
前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００３３】
−貼付剤−
前記貼付剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤などを、常法により塗布し、製造することができる。
前記支持体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタンなどのフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００３４】
−スプレー剤−
前記スプレー剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エアゾール剤、粉剤、乳剤、液剤、水和剤などが挙げられる。
スプレー剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、米国特許第２，８６８，６９１号明細書及び米国特許第３，０９５，３５５号明細書に記載の方法などを使用して製造することができる。
【００３５】
＜投与＞
前記ワクチンの投与方法、投与量、投与回数、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による投与方法、吸入による投与方法、スプレーによる投与方法などが挙げられる。これらの中でも、注射による投与方法が好ましい。
前記注射による投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、粘膜下投与、皮下投与などが挙げられる。
前記スプレーによる投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、眼、鼻、口腔、肛門、膣の粘膜上皮など、身体の少なくともいずれかの表皮にスプレーして非経口投与する方法などが挙げられる。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、イヌが好ましい。
【００３６】
＜用途＞
前記ワクチンは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能であるため、イヌへの投与（予防接種）に好適に利用可能である。なお、前記ワクチンをイヌに投与することを含む、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染症を予防するための予防接種方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３７】
（ワクチンの製造方法）
本発明のワクチンの製造方法は、マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる感染工程と、該マウスより赤血球を採取する採取工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００３８】
＜感染工程＞
前記感染工程は、マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる工程である。前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）をマウスに感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を腹腔内に投与する方法、静脈内に投与する方法などが挙げられる。これらの中でも、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）をマウスの腹腔内に投与する方法が、簡単であるため、好ましい。
【００３９】
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）がマウスに感染したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウスの血液を採取し、光学顕微鏡で赤血球を観察する方法、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の遺伝子配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲで確認する方法、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を抗原として作製した抗体を用いて蛍光染色で確認する方法などが挙げられる。
前記光学顕微鏡で観察する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記赤血球をライトギムザ液で染色する方法が、赤血球を簡便に区別することができる点で好ましい。
【００４０】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させたマウス（以下、「ＢＭ感染マウス」と称することがある。）より赤血球を採取する工程である。
前記ＢＭ感染マウスより前記赤血球を含有する血液を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、心臓採血により採取する方法が、簡便であり、大量の血液を得ることができる点で好ましい。なお、前記採取の際に用いる注射器としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヘパリンにより凝固防止処理を施した注射器であることが好ましい。
【００４１】
前記採取した血液中の赤血球へのバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染率を算出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、全赤血球数及び前記ライトギムザ染色した血液塗沫を、血球計算版を用いて計測した後、下記計算式により算出する方法などが挙げられる。
感染率（％）＝顕微鏡視野中の感染赤血球数／顕微鏡視野中の全赤血球×１００
前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染した赤血球（以下、「ＢＭ感染赤血球」と称することがある。）の数は、前記全赤血球数及び前記感染率より算出することができる。
【００４２】
前記赤血球は、前記採血した血液の状態であってもよいし、前記赤血球のみを分離したものであってもよい。前記採取した血液より、前記赤血球を分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遠心分離による方法などが挙げられる。前記遠心分離により、赤血球は沈殿し、血漿やその他の血球成分は上清や中間層として分離することができる。
前記遠心分離により得られた赤血球は、そのまま用いてもよいが、洗浄することが、その他の血球成分などを取り除くことができる点で好ましい。前記洗浄する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記遠心により沈殿した赤血球とＰＢＳ（−）とを混合した後、再び遠心分離し、上清のＰＢＳ（−）を除去する方法などが挙げられる。
前記血液及び前記分離した赤血球の少なくともいずれかは、前記ＢＭ感染赤血球の数が所望の数となるように希釈して用いることが好ましい。前記希釈する溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＰＢＳ（−）が好ましい。
【００４３】
前記ＢＭ感染赤血球を保存する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、採取した血液を凍結する方法などが挙げられる。なお、前記希釈は、凍結前に行ってもよいし、凍結融解後の前記ＢＭ感染赤血球の使用前に行ってもよい。
【００４４】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＢＭ感染赤血球を、可溶化乃至溶血する可溶化乃至溶血工程、前記可溶化乃至溶血したＢＭ感染赤血球とアジュバントとを混合した混合溶液を得る混合工程などが挙げられる。
【００４５】
−可溶化乃至溶血工程−
前記可溶化乃至溶血工程は、前記ＢＭ感染赤血球を、可溶化乃至溶血する工程である。前記可溶化乃至溶血工程では、赤血球膜を破壊することにより、赤血球内に存在する前記バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を外界に露出せることができる。
前記ＢＭ感染赤血球を可溶化乃至溶血する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＢＭ感染赤血球と界面活性剤とを混合する方法、前記ＢＭ感染赤血球と蒸留水とを混合する方法などが挙げられる。前記界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などが挙げられる。前記蒸留水及び前記界面活性剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記ＢＭ感染赤血球と蒸留水とを混合する方法が、効率よく前記ＢＭ感染赤血球を、可溶化乃至溶血できる点で好ましい。
前記ＢＭ感染赤血球と前記蒸留水及び前記界面活性剤の少なくともいずれかとを混合する混合比としては、前記ＢＭ感染赤血球を可溶化することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４６】
−混合工程−
前記混合工程は、前記可溶化乃至溶血したＢＭ感染赤血球とアジュバントとを混合した混合溶液を得る工程である。前記アジュバントとしては、例えば、前述したワクチンに含まれるアジュバントを用いることができる。前記可溶化乃至溶血したＢＭ感染赤血球とアジュバントとを混合する混合比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【実施例】
【００４７】
以下に本発明の製造例、実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例などに何ら限定されるものではない。
【００４８】
（製造例１：Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉワクチンの製造）
＜感染工程＞
野外でバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染したマウスの血液を採取し、継代培養したバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）１×１０５個を、ｄｄｙマウス（ｎ＝２）（日本エスエルシー株式会社）に、注射器を用いて腹腔内投与することにより、マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させた（以下、「ＢＭ感染マウス」と称することがある。）。
【００４９】
＜採取工程＞
ＢＭ感染マウスの血液は、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後１０日目に、ヘパリンによる凝固防止処理を施した注射器を用いて心臓採血により採取した。
【００５０】
−調製−
採取した血液中の全赤血球数を、血球計算版を用いて計測した。次いで、ライトギムザ液（メルク社製）にて前記赤血球を染色し、染色した血液塗沫と、光学顕微鏡とを用いて感染率を計測した。感染率は、下記計算式より算出することができる。
感染率（％）＝顕微鏡視野中の感染赤血球数／顕微鏡視野中の全赤血球×１００
【００５１】
前記全赤血球数及び前記感染率より、感染赤血球数を算出した。感染赤血球数（以下、「ＢＭ感染赤血球」と称することがある）が１×１０８個となるように、採取した血液をＰＢＳ（−）（０．８質量％塩化ナトリウム、０．０２質量％塩化カリウム、０．１１５質量％リン酸水素二ナトリウム、０．００２質量％リン酸二水素カリウム）で希釈し、本発明のワクチンを得た。
【００５２】
（実施例１：ワクチン投与の効果）
＜バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染犬の作出＞
−ＢＭ感染赤血球によるイヌへの免疫−
製造例１のワクチン（ＢＭ感染赤血球１×１０８個を含有）を、ビーグル犬（ｎ＝２）（日本農産工業株式会社）の橈側皮静脈より静脈内投与することにより、ビーグル犬にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させ、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染犬（以下、「ＢＭ感染犬」と称することがある。）を作出した。ＢＭ感染犬は、２個体を後述する検査に用いた。また、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後４１週間後のＢＭ感染犬２個体を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００５３】
−ＢＭ感染犬の検査−
ＢＭ感染犬の全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を検査するため、ＢＭ感染犬へのバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）投与後３ヶ月間は週に２回（火曜日と金曜日）、それ以降は週に１回（火曜日）、ＢＭ感染犬の血液を頚静脈より採血した。採取した血液の全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数は、前述した方法と同様の方法で算出した。
また、採取した血液をヘマトクリット遠心管（ＶＩＴＲＥＸ ＭＥＤＩＣＡＬ社製）に充填し、ヘマトクリット遠心機にて１５，０００×ｇ、５分間、遠心分離を行い、ヘマトクリット計算版を用いてヘマトクリット値（Ｈｔ値）を計測した。
【００５４】
図１に、ＢＭ感染犬の赤血球を光学顕微鏡で観察した像を示す。なお、図１中、矢印はバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染を示す。
図２に、ＢＭ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を示す。図２より、全赤血球数は、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後３２日目で４．１×１０６個／μＬに低下した。また感染率は、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染後５３日目で１．０％を示した。
【００５５】
−バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）感染の確認−
−−バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）遺伝子発現の確認−−
製造例１で作出したＢＭ感染マウス及び前記ＢＭ感染犬にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）が感染しているか否かについて確認するため、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬の赤血球、並びにコントロールとして、無処置マウス及び無処置犬の赤血球より、それぞれのＤＮＡを抽出し、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉの遺伝子配列に特異的な配列を有するプライマーを用いてＤＮＡを増幅した。各ＰＣＲ産物を電気泳動することにより、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の遺伝子発現の確認を行った。なお、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の遺伝子が発現していた場合、１５４ｂｐにバンドを検出することができる。
図３に、電気泳動像を示す。レーン１はＢＭ感染マウス、レーン２は無処置マウス、レーン３はＢＭ感染犬、及びレーン４は無処置犬の結果を示す。図３より、ＢＭ感染マウス及びＢＭ感染犬では目的の大きさのバンドが検出されたことから、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染していることが確認された。
【００５６】
−−抗血清の確認−−
次に、前記ＢＭ感染犬の赤血球へのバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染を、間接蛍光抗体法（ＩＦＡＴ）を用いて確認した。
前記ＢＭ感染マウス及び前記ＢＭ感染犬の赤血球をＩＦＡＴスライドにコートし、完全に乾燥させた後、無水アセトンで１０分間固定した。１次抗体として、ＢＭ感染マウスの抗血清、若しくはＢＭ感染犬の抗血清を用いた。前記固定したＩＦＡＴスライドに前記１次抗体を添加し、３７℃にて３０分間反応させた。次いで、ＰＢＳＴ（０．８質量％塩化ナトリウム、０．０２質量％塩化カリウム、０．１１５質量％リン酸水素二ナトリウム、０．００２質量％リン酸二水素カリウム、０．０５体積％ Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、２次抗体（１次抗体にＢＭ感染マウスの抗血清を用いた場合は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）、１次抗体にＢＭ感染犬の抗血清を用いた場合は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ−Ｄｏｇ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製））を用い、３７℃にて３０分間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した。
図４に、蛍光顕微鏡像を示す。図４中、光っている部位が感染を示す。図４より、ＢＭ感染犬の赤血球にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）が感染していることが確認された。
【００５７】
図１〜４の結果より、マウスに感染するバベシアであるバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）は、イヌにも感染可能であることが示唆された。
【００５８】
＜バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染犬の作出＞
−バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球の調製−
野外でバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染した犬の血液を採取し、継代培養したバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球を用い、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球が７×１０８個となるように、ＰＢＳ（−）で希釈した。
ビーグル犬（ｎ＝１）の橈側皮静脈より、注射器を用いて前記バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球７×１０８個を静脈内投与することにより、ビーグル犬にバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた（以下、「Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ感染赤血球供与犬」と称することがある。）。
バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後３１日目に、ヘパリンによる凝固防止処理を施した注射器を用いて、Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ感染赤血球供与犬の血液を頚静脈により採取し、前述した方法と同様の方法で、全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を算出した。
なお、前記バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染赤血球は、Ｖｅｇａ ｙ Ｍａｒｔｉｎｅｚ(ＶＹＭ)リン酸緩衝液（２質量％グルコース、０．００１６質量％塩化カルシウム、０．０４質量％塩化カリウム、０．１４１５質量％リン酸二水素カリウム、０．０１５４質量％硫酸マグネシウム七水和物、０．１９３７質量％リン酸水素ナトリウム十二水和物、０．７０７７質量％塩化ナトリウム）に、０．００４２３質量％アデニン（Ａ２７８５、シグマ社製）、及び０．００７０８質量％グアノシン（Ｇ６２６４、シグマ社製）を懸濁し、ｐＨ７．２に調整した溶液に懸濁し、凍結保しておくことが可能である。
【００５９】
−感染−
前記ＢＧ感染赤血球１×１０８個を、ＢＭ感染犬（ｎ＝２）、若しくは無処置犬（ｎ＝２）の橈側皮静脈より静脈内投与することによりバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた。以下、ＢＭ感染犬に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた犬を、「ＢＭ−ＢＧ感染犬」、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のみを感染させた犬を、「ＢＧ対照犬」と称することがある。
【００６０】
−ＢＭ−ＢＧ感染犬の検査−
ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬の全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を検査するため、ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬へのバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）投与後３ヶ月間は週に２回（火曜日と金曜日）、それ以降は週に１回（火曜日）、ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬の血液を頚静脈より採血した。採取した血液の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）は、前述した方法と同様の方法で算出した。
【００６１】
−−感染率−−
図５に、感染率の経時変化を示す。ＢＭ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬ともにバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後１１日目の感染率が最も高く、ＢＧ対照犬では４．６％であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬では１．８％であったことから、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前に、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染することで、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）への感染率が６０％抑制された。
【００６２】
−−赤血球数−−
図６に、全赤血球数の経時変化を示す。全赤血球数が４×１０６個／μＬ（図６破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＭ−ＢＧ対照犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その全赤血球数は１．８×１０６個／μＬであったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２５日目であり、その全赤血球数は２．６×１０６個／μＬであった。また、全赤血球数が４×１０６個／μＬ以下であった期間（貧血状態であった期間）は、ＢＧ対照犬は３８日間であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬は２１日間であったことから、１７日間短縮していた。
これらの結果より、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染することで、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状が軽度になり、その期間が短縮することが認められた。
【００６３】
−−ヘマトクリット値（Ｈｔ値）−−
図７に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を示す。ヘマトクリット値（Ｈｔ値）が３５％（図７破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＭ−ＢＧ対照犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後１１日目であり、そのＨｔ値は１３．５％であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、そのＨｔ値は２１％であった。また、Ｈｔ値が３５％以下であった期間（貧血状態であった期間）は、ＢＧ対照犬は６０日間であったのに対し、ＢＭ−ＢＧ感染犬は３５日間であったことから、２５日間短縮していた。
これらの結果からも図６と同様に、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前にバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染することで、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状が軽度になり、その期間が短縮することが認められた。
【００６４】
（実施例２：アジュバントの検討）
＜アジュバントの調製＞
アジュバントとして、サポニン（ＡＣＣＵＲＡＴＥ ＣＨＥＭ社製）及びモノホスホリルリピッドＡ（ＲＩＢＩ社製）を用いて以下の検討を行った。サポニンは、ＰＢＳ（−）で希釈し、１，０００ｍＬに調製した。モノホスホリルリピッドＡは、ＰＢＳ（−）で希釈し、０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。
【００６５】
＜ＢＭ感染赤血球の調製＞
製造例１のＢＭ感染マウスより、製造例１と同様の方法で血液を採取した。前記ＢＭ感染マウスの赤血球を、１，７５０×ｇ、５分間、遠心分離を行い、血漿及びバフィーコートを除去し、ＢＭ感染赤血球を得た。このＢＭ感染赤血球に、ＰＢＳ（−）１０ｍＬを添加し、転倒混和することによりＢＭ感染赤血球を洗浄した後、１，７５０×ｇ、５分間、遠心分離を行い、上清を除去した。前記洗浄は２回行った。
次いで、ライトギムザ液にて前記ＢＭ感染赤血球を染色し、実施例１と同様の方法で感染率を計測した。採取した血液は、ＢＭ感染赤血球が１×１０９個／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）を用いて希釈した。次いで、この希釈したＢＭ感染赤血球を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで可溶化、若しくは蒸留水で溶血させた。具体的には、前記ＢＭ感染赤血球にＴｒｉｔｏｎ−Ｘを、ＢＭ感染赤血球：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ＝１：１５（Ｖ／Ｖ）の割合で添加することにより、ＢＭ感染赤血球を可溶化した。また、ＢＭ感染赤血球：蒸留水＝１：１（Ｖ／Ｖ）の割合で蒸留水を添加することにより、ＢＭ感染赤血球を溶血させた。
【００６６】
＜ＢＭ感染赤血球とアジュバントとの混合＞
−ＢＭ感染赤血球とサポニンとの混合−
前記可溶化乃至溶血させたＢＭ感染赤血球と、前記２５０μｇ／ｍＬサポニン溶液とを等量混合することにより、アジュバントを含有するワクチンを製造した（以下、可溶化したＢＭ感染赤血球とサポニン溶液とを混合した溶液を、「可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン」、溶血したＢＭ感染赤血球とサポニン溶液とを混合した溶液を、「溶血ＢＭ感染赤血球−サポニン」と称することがある。）。この可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン及び溶血ＢＭ感染赤血球−サポニンそれぞれ０．２ｍＬ（ＢＭ感染赤血球１×１０７個及びサポニン２５μｇを含有する）を、後述するマウスへの免疫に用いた。
【００６７】
−Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ感染赤血球とモノホスホリルリピッドＡとの混合−
前記可溶化乃至溶血させたＢＭ感染赤血球と、５００μｇ／ｍＬモノホスホリルリピッドＡ溶液とを等量混合することにより、アジュバントを含有するワクチンを製造した（以下、可溶化したＢＭ感染赤血球とモノホスホリルリピッドＡ溶液とを混合した溶液を、「可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ」、溶血したＢＭ感染赤血球とモノホスホリルリピッドＡ溶液とを混合した溶液を、「溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ」と称することがある。）。この可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ及び溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬそれぞれ０．２ｍＬ（ＢＭ感染赤血球１×１０７個及びモノホスホリルリピッドＡ ５０μｇを含有する）を、後述するマウスへの免疫に用いた。
【００６８】
＜アジュバントを含有するワクチンのマウスへの免疫＞
可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン、溶血ＢＭ感染赤血球−サポニン、可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬ、及び溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬそれぞれ０．２ｍＬを、３週間ごとに３回、ｄｄｙマウスの背部皮下に投与（免疫）した（以下、可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニンを投与したマウスを、「可溶化ＢＭ−サポニン感染マウス」、溶血ＢＭ感染赤血球−サポニンを投与したマウスを、「溶血ＢＭ−サポニン感染マウス」、可溶化ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬを投与したマウスを、「可溶化ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス」、溶血ＢＭ感染赤血球−ＭＰＬを投与したマウスを、「溶血ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス」と称することがある（表１参照）。）。
最終免疫の３週間後に、可溶化ＢＭ−サポニン感染マウス（ｎ＝６）、溶血ＢＭ−サポニン感染マウス（ｎ＝６）、可溶化ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス（ｎ＝６）、及び溶血ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス（ｎ＝６）の血液を心臓より採取し、１，７５０×ｇ、５分間、遠心分離を行い、血清（ｎ＝６／群をプールしたもの）を得た。この血清を後述するアジュバントの検討に用いた。
【００６９】
【表１】
【００７０】
＜検討＞
アジュバントの検討は、ウエスタンブロットにて行った。即ち、ＳＤＳゲル（９．７質量％アクリルアミド、０．３質量％ Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、４．５質量％トリスヒドロキシメチルアミノメタン、０．１質量％ＳＤＳ、０．４質量％過硫酸アンモニウム、０．０５質量％ＴＥＭＥＤ）に、製造例１のＢＭ感染マウスの赤血球又はＢＭ非感染マウスの赤血球を、１ウエルあたり２０μｇアプライし、電気泳動を行った。次いで、メンブレン（ＡＴＴＯ社製）にブロッティングし、スキムミルク（北海道乳業株式会社製）でブロッキングを行った後、前記したように調製したＢＭ感染マウス、可溶化ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス、可溶化ＢＭ−サポニン感染マウス、溶血ＢＭ−ＭＰＬ感染マウス、溶血ＢＭ−サポニン感染マウス、及びＢＭ感染マウスの血清を、それぞれＰＢＳ（−）で２００倍に希釈した血清を反応させ、ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)により検出した。
【００７１】
結果を、図８に示す。図８中、「ＢＭ」はＢＭ感染マウスの赤血球、「Ｍ−ＮＲＢＣ」はＢＭ非感染マウスの赤血球を示す。ＢＭ感染マウスの血清を反応させた場合、ＢＭ感染マウスの赤血球（レーン１３）は、ＢＭ非感染マウスの赤血球（レーン１４）では認められなかったバンドが検出されており、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉの感染による抗原が存在することが認められた。
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで可溶化した場合は、ＢＭ感染マウスの赤血球（レーン１、３、及び５）とＢＭ非感染マウスの赤血球（レーン２、４、及び６）とでバンドパターンに違いは認められなかった。
蒸留水で溶血した場合は、ＢＭ感染マウスの赤血球（レーン７、９、及び１１）は、ＢＭ非感染マウスの赤血球（レーン８、１０、及び１２）では認められなかったバンドが検出されており、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）の感染による抗原が存在することが認められた。
これらの結果より、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡは、アジュバントとして好適に用いることができることが確認された。また、ＢＭ感染赤血球は、蒸留水で溶血させる方法が、本発明のワクチンとして適していることが示唆された。以下の実施例では、安価で使用しやすいことからサポニンをアジュバントとして用いた。
【００７２】
（実施例３：アジュバントを含有するワクチンの効果）
＜アジュバントを含有するワクチンの投与＞
実施例２と同様の方法で、可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニンを調製した。この可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニン（溶血ＢＭ感染赤血球１×１０８個及びサポニン５００ｍｇを含有する）を、３週間ごとに３回、ビーグル犬（ｎ＝２）の背部皮下に投与した（以下、可溶化ＢＭ感染赤血球−サポニンを投与したイヌを「溶血ＢＭ−サポニン感染犬」と称することがある。）。最終免疫の５週間後に、溶血ＢＭ−サポニン感染犬を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００７３】
＜非感染赤血球−サポニン対照犬の作出＞
バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）非感染マウスの赤血球を前記した方法と同様の方法で溶血させ、前記サポニン溶液を、前記した方法と同様の方法で混合し、イヌへ投与することで、対照犬（以下、「非感染赤血球−サポニン対照犬」と称することがある。）（ｎ＝２）を作出した。
なお、本実施例では、何も投与していない無処置犬（ｎ＝２）も使用した（表２参照）。
最終免疫の５週間後に、非感染赤血球−サポニン対照犬及び無処置犬を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００７４】
【表２】
【００７５】
＜感染＞
実施例１と同様の方法でＢＧ感染赤血球供与犬よりＢＧ感染赤血球を調製した。
ＢＧ感染赤血球１×１０８個を、溶血ＢＭ−サポニン感染犬、非感染赤血球−サポニン対照犬、及び無処置犬の橈側皮静脈より静脈内投与に投与することによりバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた。
【００７６】
＜溶血ＢＭ−サポニン感染犬の検査＞
溶血ＢＭ−サポニン感染犬、非感染赤血球−サポニン対照犬、及び無処置犬の全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）を検査するため、各群へのＢＧ感染赤血球投与後３ヶ月間は週に２回（火曜日と金曜日）、それ以降は週に１回（火曜日）、各群の血液を頚静脈より採血した。採取した血液の全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）は、実施例１と同様の方法で算出した。
【００７７】
−感染率−
図９に感染率の経時変化を示す。非感染赤血球−サポニン対照犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その感染率は６．８％であり、また無処置犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２４日目であり、その感染率は８．５％であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その感染率は２．５％であった。即ち、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の感染率は、非感染赤血球−サポニン対照犬に対して６３％、無処置犬に対して７０％抑制された。
【００７８】
−赤血球数−
図１０に、全赤血球数の経時変化を示す。実施例１と同様に、全赤血球数が、４×１０６個／μＬ（図１０破線）以下の場合、貧血状態となる。非感染赤血球−サポニン対照犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、その全赤血球数は１．２×１０６個／μＬであり、また無処置犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、その全赤血球数は１．４×１０６個／μＬであったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２４日目であり、その全赤血球数は３．４×１０６個／μＬであった。また、非感染赤血球−サポニン対照犬及び無処置犬の全赤血球数が、４×１０６個／μＬ以下であった期間（貧血状態であった期間）は４２日間であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬は７日間であったことから、３５日間短縮していた。
これらの結果より、ＢＭ感染赤血球を単独で投与した場合（図６）と比較して、アジュバントとともにＢＭ感染赤血球を投与（図１０）することで、貧血症状を呈する期間は更に短縮し、その貧血の程度も更に軽度になることが認められた。
【００７９】
−ヘマトクリット値（Ｈｔ値）−
図１１に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を示す。実施例１と同様に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）が３５％（図１１破線）以下の場合、貧血状態となる。非感染赤血球−サポニン対照犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、そのＨｔ値は１１％であり、また無処置犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、そのＨｔ値は１４％であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬のＨｔ値が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、そのＨｔ値は２５％であった。また、Ｈｔ値が３５％以下であった期間（貧血状態であった期間）は、非感染赤血球−サポニン対照犬は５１日間、無処置犬は６９日間であったのに対し、溶血ＢＭ−サポニン感染犬は１７日間であった。即ち、溶血ＢＭ−サポニン感染犬のＨｔ値が３５％以下であった期間は、非感染赤血球−サポニン対照犬に対して３４日間、無処置犬に対して５２日間短縮していた。
これらの結果からも、ＢＭ感染赤血球を単独で投与した場合（図７）と比較して、アジュバントとともにＢＭ感染赤血球を投与（図１１）することで、貧血症状を呈する期間は更に短縮し、その貧血の程度も更に軽度になることが認められた。
【００８０】
（比較例１：バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）による免疫）
バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）とは異なる種のマウスバベシアであるバベシア・ロドハイニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｒｏｄｈａｉｎｉ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ））によりイヌを免疫し、その後バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）をさせ、検討を行った。
【００８１】
＜バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染赤血球の調製＞
−感染−
野外でバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）に感染したマウスの血液を採取し、継代培養したバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）１×１０４個を、ｄｄｙマウス（ｎ＝４）に、注射器を用いて腹腔内投与することにより、マウスにバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）を感染させた（以下、「ＢＲ感染マウス」と称することがある。）。
【００８２】
−採取−
ＢＲ感染マウスの血液は、バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染後８日目に、ヘパリンによる凝固防止処理を施した注射器を用いて、ＢＲ感染マウスの血液を心臓採血により採取した。
【００８３】
−−調製−−
採取した血液は、実施例１と同様の方法で、全赤血球数、感染率、及び感染赤血球数を算出した。感染赤血球数（以下、「ＢＲ感染赤血球」と称することがある）は、過剰量の７．５×１０８個／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）を用いて希釈した。
【００８４】
＜ＢＲ感染赤血球によるイヌへの免疫＞
前記希釈した血液２ｍＬ（ＢＲ感染赤血球１．５×１０９個を含有する）を、ビーグル犬（ｎ＝２）の橈側皮静脈より静脈内投与することにより、ビーグル犬にバベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）を感染させ、バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染犬（以下、「ＢＲ感染犬」と称することがある。）を作出した。ＢＲ感染犬は、２個体を後述する検査に用いた。また、バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染後１０３日目のＢＲ感染犬２個体を、後述するバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に用いた。
【００８５】
＜ＢＲ感染犬の検査＞
前記ＢＲ感染犬について、実施例１と同様の方法で、全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）を算出した。
【００８６】
図１２に、ＢＲ感染犬の全赤血球数、感染率、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時的変化を示す。バベシア・ロドハイニ（Ｂ．ｒｏｄｈａｉｎｉ）感染後１７日目の感染率は、０．１４％であり、ほとんど感染は認められず、全赤血球数及びＨｔ値にも変化は認められなかった。
【００８７】
＜バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染＞
実施例１と同様の方法でＢＧ感染赤血球を調製し、ＢＧ感染赤血球１×１０８個を含有する血液を、前記ＢＲ感染犬、若しくは対照犬（ｎ＝２）の橈側皮静脈より静脈内投与することによりバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させた。以下、ＢＲ感染犬に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）を感染させたイヌを、「ＢＲ−ＢＧ感染犬」、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のみを感染させたイヌを、「ＢＧ対照犬」と称することがある。
【００８８】
＜ＢＲ−ＢＧ感染犬の検査＞
前記ＢＲ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬について、実施例１と同様の方法で、全赤血球数、感染率、感染赤血球数、及びヘマトクリット値（Ｈｔ値）を算出した。
【００８９】
−感染率−
図１３に、感染率の経時変化を示す。ＢＧ対照犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２４日目であり、その感染率は８．５％であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬の感染率が最も高かったのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目であり、その感染率は９．５％であったことから、イヌは、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染前に、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）に感染しても、その感染率はほとんど変化しなかった。
【００９０】
−赤血球数−
図１４に、全赤血球数の経時変化を示す。全赤血球数が４×１０６個／μＬ（図１４破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＧ対照犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２８日目であり、その全赤血球数は１．４×１０６個／μＬであったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬の全赤血球数が最も減少したのはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後３１日目であり、その全赤血球数は２．３×１０６個／μＬであった。また、全赤血球数が４×１０６個／μＬ以下であった期間（貧血状態であった期間）は、ＢＧ対照犬は４２日間であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬は２８日間であったことから、１４日間短縮していた。
【００９１】
−ヘマトクリット値（Ｈｔ値）−
図１５に、ヘマトクリット値（Ｈｔ値）の経時変化を示す。ヘマトクリット値（Ｈｔ値）が３５％（図１５破線）以下の場合、貧血状態となる。ＢＲ−ＢＧ感染犬及びＢＧ対照犬ともにバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染後２１日目のＨｔ値が最も低く、ＢＧ対照犬では１４％であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬では１７％であった。また、ＢＧ対照犬のＨｔ値が、３５％以下であった期間は、６９日間であったのに対し、ＢＲ−ＢＧ感染犬は４５日間であったことから、２４日間短縮していた。
【００９２】
実施例１及び３、並びに比較例１の結果を下記表３に示す。アジュバント（サポニン）を添加した溶血ＢＭ感染赤血球（実施例３）は、ＢＭ感染赤血球単独の場合（実施例１）と比較して、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）のイヌへの感染率を抑制し、貧血の緩和効果も優れていることが認められた。
一方、ＢＲ感染赤血球を感染させたイヌ（ＢＲ−ＢＧ感染犬）は、全赤血球数の抑制やＨｔ低下の抑制作用は認められたものの、その効果はＢＭ感染赤血球を感染させたイヌ（ＢＭ感染犬）より低く、また感染率はほとんど抑制できなかった（比較例１）。これより、マウスバベシアでも種類が異なるとバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）感染に対するワクチン効果はないことが示唆された。
【００９３】
【表３】
【００９４】
実施例１〜３では、バベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）に感染したマウスの赤血球そのものを投与したことから、複数抗原が関与していることが示唆される。原虫の感染予防には、複数の抗原が関与していることが示唆されている（Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２：１， １９８１， ｐ．４５−５６、 Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２７， ２００５， ４３９−４５参照）ことから、本発明のワクチンはバベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）の複数抗原に有効であることが推測される。
また、マウスの自己免疫性溶血性貧血に関与する抗体はイヌの赤血球膜を認識しないため副作用を抑制できることが知られている（Ｃｈｉａ−Ｒｕｉ Ｓｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２００３， １０２（１５）， ｐ．３８００−３８０６、Ｄｅｂｒａ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ， １９８８， ２６３（２０）， ｐ．１００２２−１００２８）ことから、本発明のワクチンは、イヌのバベシアバベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）の感染に優れた予防効果を有し、貧血症状を緩和でき、副作用のない安全性の高いワクチンとして有用である。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明のバベシア・マイクロッティ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有するワクチンは、副作用がなく、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症に対する優れた予防効果を有し、バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）による貧血症状を緩和することができ、効率よく大量に製造可能であるため、バベシア・ギブソニ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症の予防に好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有することを特徴とするワクチン。
【請求項２】
バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症を予防する請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
アジュバントを含有する請求項１から２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項４】
アジュバントが、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡの少なくともいずれかである請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
貧血症状を緩和する請求項１から４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる感染工程と、
該マウスより赤血球を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とするワクチンの製造方法。
【請求項１】
バベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を含有することを特徴とするワクチン。
【請求項２】
バベシア・ギブソニ（Ｂａｂｅｓｉａ ｇｉｂｓｏｎｉ）によるイヌの感染症を予防する請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
アジュバントを含有する請求項１から２のいずれかに記載のワクチン。
【請求項４】
アジュバントが、サポニン及びモノホスホリルリピッドＡの少なくともいずれかである請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
貧血症状を緩和する請求項１から４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
マウスにバベシア・マイクロッティ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）を感染させる感染工程と、
該マウスより赤血球を採取する採取工程と、
を含むことを特徴とするワクチンの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−２６２４１（Ｐ２０１１−２６２４１Ａ）
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７３５６５（Ｐ２００９−１７３５６５）
【出願日】平成２１年７月２４日（２００９．７．２４）
【出願人】（０００１７３８６５）財団法人日本生物科学研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２４日（２００９．７．２４）
【出願人】（０００１７３８６５）財団法人日本生物科学研究所 (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]