ワクチン
【課題】改良肺炎球菌ワクチン組成物、特に高齢者および幼児における肺炎球菌疾患（特に肺炎）の防止または改善により効果的であるだろう改良肺炎球菌ワクチン組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、肺炎球菌多糖体抗原、典型的には、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニ由来の肺炎球菌多糖体接合物抗原および、所望によりＴｈ１誘導アジュバントを含むワクチンに関する。
【解決手段】本発明は、肺炎球菌多糖体抗原、典型的には、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニ由来の肺炎球菌多糖体接合物抗原および、所望によりＴｈ１誘導アジュバントを含むワクチンに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌性多糖体抗原ワクチン、その製造および該多糖体の医薬における使用に関する。
特に、本発明は肺炎球菌多糖体抗原、典型的には、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来の蛋白抗原および、所望によりＴｈ１誘導アジュバントと共に処方される、肺炎球菌多糖体接合抗原を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、（特に若者および老人において）深刻な罹患率および死亡率の原因となっているグラム陽性菌であり、肺炎、菌血症および髄膜炎のような侵襲性疾患や、急性中耳炎のようにコロニー形成に付随する疾患を引き起こしている。米国での６０歳を超える人々における肺炎球菌性肺炎の感染率は、１０万人あたり３〜８人と概算されている。これらのケースの２０％では、菌血症および髄膜炎のような症状に至り、抗生物質治療を用いているにも関わらず死亡率は３０％に近い。
肺炎球菌は、化学結合した多糖体の莢膜に入れられており、この多糖体が血清特異性を決定している。肺炎球菌には９０種の血清型が知られており、その莢膜が肺炎球菌の主要な病原性決定因子となっている。というのも、その莢膜は補体から細菌の内面を守るだけでなく、それ自体が殆ど免疫原性を持っていないからである。多糖体はＴ細胞非依存性抗原であるで、ＭＨＣ分子上でＴ細胞と相互作用するように抗原処理や抗原提示され得ない。しかしながら、多糖体はＢ細胞上の表面レセプターの架橋に関わる別の機構を通して、免疫系を刺激し得る。
侵襲性肺炎球菌による疾患の防御は、莢膜に特異的な抗原と最も強い相関関係があり、血清型に特異的であることがいくつかの実験により示されている。
【０００３】
多糖体抗原を用いるワクチンは当該分野でよく知られている。ヒトへの使用を認可されている４つのものとして、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）のＶｉ多糖体、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）由来のＰＲＰ多糖体、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹから成る４価髄膜炎菌ワクチン、ならびに血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３に対応する多糖体から成る２３価肺炎球菌ワクチン（少なくとも９０％の肺炎球菌を単離することによる）が挙げられる。
【０００４】
後者の３つのワクチンは、幼児における深刻な罹患率および死亡率を与える気道感染症を引き起こす細菌から保護するが、これらのワクチンは２歳未満の小児においては、この年齢のグループにおける免疫原性が不完全であるために、その使用が認可されていない［Peltola ら、(1984), N. Engl. J. Med. 310:1561-1566］。ストレプトコッカス・ニューモニエは幼児および小児における侵襲性細菌疾患および中耳炎の最も一般的な原因である。同様に、高齢者は肺炎球菌ワクチンに対する応答が乏しくなっており［Roghmannら、(1987), J. Gerontol. 42:265-270］、したがって、この人々において細菌性肺炎の罹患率が増加する［Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285］。
【０００５】
幼児において、この免疫原性の欠損を解決するよう考えられた方法は、多糖体類をラージ免疫原性蛋白に結合させることを含むものである。その蛋白は、バイスタンダー細胞である、Ｔ細胞の助けを与え、結合されている多糖体抗原に対する免疫学的記憶を誘導する。肺炎球菌糖蛋白接合ワクチンは、現在、種々の年齢層において、安全性、免疫原性および有効性に関して評価されている。
２３価の非結合肺炎球菌ワクチンは０％〜８１％という広く多様な範囲で臨床的有効性を示した（Fedsonら、(1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535）。その有効性は年配のホジキン病、脾臓摘出、鎌状赤血球、無ガンマグロブリン血症のような、免疫処理されるべき、危険性のあるグループと関連しているようであり（Fineら、(1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677）、更にはその患者の徴候にも関わっているように見える。その２３価のワクチンは（高齢者のようなあるハイリスクグループには）肺炎球菌性肺炎や中耳炎に対する防御を示さない。
したがって、改良肺炎球菌ワクチン組成物、特に高齢者および幼児における肺炎球菌疾患（特に肺炎）の防止または改善により効果的であるだろう改良肺炎球菌ワクチン組成物が必要とされている。
本発明は該改良ワクチンを提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原（好ましくは、蛋白担体に結合したもの）およびポリヒスチジントライアッドファミリー（Ｐｈｔ；例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥ）、Ｌｙｔファミリー（例えば、ＬｙｔＡ、ＬｙｔＢまたはＬｙｔＣ）、ＳｐｓＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物を、所望によりＴｈ１アジュバント（優先Ｔｈ１免疫応答を含むアジュバント）と共に含むワクチン組成物を提供する。好ましくは、肺炎球菌蛋白およびＴｈ１アジュバントの両方を含む。また、上記した本発明の肺炎球菌蛋白を互いに、および他の肺炎球菌と組み合わせて含む有利な組成物も記載する。本発明の組成物は、特に高齢者の肺炎の治療に適している。
【０００７】
肺炎球菌多糖体ワクチン（結合または非結合）は、肺炎の罹患率が非常に高い高齢者の人々における肺炎に対して保護することができない。肺炎球菌に対する主要な防御機構はオプソニン食菌作用（体液性Ｂ細胞／肺炎球菌多糖体に対する抗体の産生により引き起こされる好中球媒介事象、細菌が最終的に食菌される）であるが、オプソニン機構のいくつかの部分、すなわち、ＰＭＮ（多形核球細胞）、による過酸化物産生、他の活性酸素種産生、ＰＭＮの起動、ＰＭＮのアポトーシス、ＰＭＮの変形性は高齢者において十分に機能を果たさない。また、抗体も高齢者において十分に機能を果たすことができない。
【０００８】
通常受け入れられている定説とは反対に、正常なレベルの抗莢膜多糖体抗体は、肺炎球菌が宿主細胞に侵襲し免疫系のブランチを避けることができるので、細菌の完全なクリアランスに効果的でない。
意外にも、本発明は、免疫系の体液性ブランチ（Ｂ細胞媒介）に加えて免疫系の細胞媒介ブランチ（例えば、Ｔ細胞媒介免疫性）を同時に刺激することによる、相乗作用（または共同作用）により、宿主細胞からの肺炎球菌のクリアランスを増強させることができることを見出した。これは、一般的に肺炎球菌感染症の予防（または治療）を補助するであろうことの知見であるが、多糖体を用いるワクチンが効果を示さない高齢者における肺炎の予防（または治療）に関して特に重要であるだろう。
【０００９】
理論に縛られることなく、本発明者らは、肺炎球菌多糖体（好ましくは、蛋白担体に結合したもの）をＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３（感染哺乳類細胞の表面上のクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩに関連して、処理し、与えることができる蛋白）から成る群から選択される肺炎球菌蛋白と共に投与する場合、免疫系の両方の機構がかくのごとく相乗作用を与えることを見出した。１つまたはそれ以上のこれらの肺炎球菌蛋白はそれ自体細胞媒介免疫性を誘発できるが、本発明者らは、ワクチン処方中のＴｈ１含有アジュバントの存在がこの免疫系の機構を補助し、意外にも両方の免疫系の機構間の相乗作用を増強させることも見出した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、特に高齢者（および／または幼児および小児）の肺炎球菌感染症の防止または改善のための改良ワクチンを提供する。
本発明に関連して、患者が５５歳以上、典型的には６０歳を超える、より一般的には６５歳を超える年齢である場合、高齢者とみなす。
かくして、本発明の一の具体例において、高齢者（および／または幼児および小児）における使用に適した、少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０ａｎｄＳｐ１３３ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原（複数でも可）を含むワクチン組成物を提供する。ワクチンは、所望によりＴｈ１アジュバントを含んでいてもよい。
【００１１】
好ましい第２の具体例において、本発明は、少なくとも１つ（２、３、４、５、６，７、８、９または１０）のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原（複数でも可）およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原および好ましくはＴｈ１アジュバントを含むワクチン（高齢者における肺炎の予防に適当な）を提供する。
【００１２】
上記具体例において、有利には本発明の上記した肺炎球菌蛋白を互いに、および他の肺炎球菌蛋白と組み合わせて含むワクチンも以下に記載するように想定する。
また、ワクチンは幼児または小児のような他の高い危険性のある人々の群における肺炎球菌感染症（例えば、中耳炎）の治療においても有用であることが想定される。
【００１３】
本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原
典型的には、本発明のストレプトコッカス・ニューモニエワクチンは多糖体抗原（好ましくは、担体蛋白に結合したもの）を含み、ここに多糖体は少なくとも４つの肺炎球菌の血清型から誘導される。好ましくは、４つの血清型は、６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆを含む。より好ましくは、少なくとも７つの血清型、例えば血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のものが組成物に含まれる。さらにより好ましくは、少なくとも１１の血清型が組成物に含まれ、例えば一の具体例における組成物は、１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ（好ましくは、担体蛋白に結合したもの）由来の莢膜多糖体を含む。本発明の好ましい具体例において、さらに多糖体抗原、例えば２３価（例えば抗原型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）も本発明により考えられるが、少なくとも１３の多糖体抗原（好ましくは、担体蛋白に結合したもの）が含まれる。
【００１４】
高齢者のワクチン接取（例えば、肺炎の予防）に関しては、血清型８および１２Ｆ（および最も好ましくはさらに１５および２２）を上記の１１価の抗原性組成物に含み、１５価ワクチンを形成することが有利であるのに対して、幼児または小児（中耳炎の不安がある）に関しては、有利には抗原型血清型６Ａおよび１９Ａが１３価ワクチンを形成するために含まれる。
上記多糖体は全長、天然の形態で用いることができるが、また免疫原性がある大きさを減少させた多糖体も用いることができることは理解されるだろう（例えば、ＥＰ４９７５２４および４９７５２５）。
【００１５】
高齢者（＋５５歳）の人々の肺炎および幼児（１８ヶ月まで）ならびに小児（典型的には１８ヶ月〜５歳）の中耳炎の予防／改善に関して、上記のような多価ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体とＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白またはその免疫学的機能等価物とを組み合わせることが本発明の好ましい具体例である。また、肺炎球菌蛋白の組み合わせも以下に記載のように有利に利用できる。
【００１６】
本発明の肺炎球菌蛋白
本発明の目的に関して、「免疫学的機能等価物」を本発明の蛋白由来の少なくとも１つの防御エピトープを含む蛋白のペプチドとして定義する。該エピトープは、特徴的には、表面が露出し、高保存性であり、宿主細胞の殺菌性抗体応答を誘発するか、または毒性作用を防止することができる。好ましくは、機能等価物は本発明の蛋白由来の少なくとも１５個および好ましくは３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸を有する。最も好ましくは、蛋白のフラグメント、欠失、例えばその膜貫通型欠失変異体（すなわち、蛋白の細胞外ドメインの使用）、融合、化学的または遺伝学的脱毒性誘導体等を用いることができるが、ただし天然の蛋白と同様の免疫応答を実質的に惹起させることができることが条件である。蛋白配列における可能性あるＢ細胞エピトープの位置は、表面が露出し、抗原性であるペプチドを、２つの方法：２Ｄ構造予測および抗原指標予測を組み合わせて用いて同定することにより容易に決定できる。２Ｄ構造予測はＰＳＩＰＲＥＤプログラム（David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UKから入手）を用いて行うことができる。抗原性指標はJamesonおよびWolf（CABIOS 4:181-186 [1988]）により記載された方法に基いて計算できる。
【００１７】
本発明の蛋白は以下の蛋白、肺炎球菌の外部表面に曝された全てのもの（肺炎球菌の生活環の少なくとも一部の間に宿主の免疫系により認識され得るもの）または肺炎球菌により分泌されるか、または放出される蛋白である。
本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白は、好ましくはポリヒスチジントライアッドファミリー（Ｐｈｔ）由来の蛋白、Ｌｙｔファミリー由来の蛋白、コリン結合蛋白、ＬＰＸＴＦモチーフ（Ｘはいずれかのアミノ酸）、ＬＸＸＣ（Ｘはいずれかのアミノ酸）タイプＩＩシグナル配列モチーフを有する蛋白およびタイプＩシグナル配列モチーフを有する蛋白から成る群から選択される。これらのカテゴリー（またはモチーフ）の中の好ましい例は、以下の蛋白（またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物）である：
【００１８】
Ｐｈｔ（ポリヒスチジントライアッド）ファミリーはＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ蛋白を含む。このファミリーは、脂質化配列、プロリンに富む領域と金属またはヌクレオシドとの結合または酵素活性に関与している可能性のあるいくつかのヒスチジントライアッドにより分けられる二つのドメイン、（３−５）超らせん領域、保存されたＮ末端と異種Ｃ末端により特徴付けられている。これは検査された肺炎球菌の全ての系で存在した。同種の蛋白が、他の肺炎球菌とナイセリア属で発見された。このファミリーの好ましいメンバーはＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤを含む。より好ましくはＰｈｔＡ、ＰｈｔＤを含む。しかしながら、ＰｈｔＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅなる語は、下記の引用文献に開示されている配列を有する蛋白、ならびに対象となる蛋白と少なくとも９０％同一である配列相同性を有するその天然に存在する（および人工的な）変異体をいう、と解釈される。好ましくは少なくとも９５％同一、最も好ましくは９７％同一である。
Ｐｈｔ蛋白に関して、ＰｈｔＡはＷＯ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ３６とも言う。上記したように、これはポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。
【００１９】
ＰｈｔＤはＷＯ００／３７１０５に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄとも言う。上記したように、これもまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。
ＰｈｔＢはＷＯ００／３７１０５に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂとも言う。ＰｈｔＢファミリーのもう１つのメンバーはＣ３−分解ポリペプチドであり、ＷＯ００／１７３７０に開示されている。この蛋白もまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。好ましい免疫学的機能等価物は、ＷＯ９８／１８９３０に開示されているＳｐ４２蛋白である。ＰｈｔＢ末端切断物（おおよそ７９ｋＤ）はＷＯ９９／１５６７５に開示されており、ＰｈｔＸファミリーのメンバーであると考えられる。
ＰｈｔＥはＷＯ００／３０２９９に開示されており、ＢＶＨ−３と言う。
ＳｐｓＡはＷＯ９８／３９４５０に開示されているコリン結合蛋白（Ｃｂｐ）である。
【００２０】
Ｌｙｔファミリーは細胞溶解と関連する細胞膜結合蛋白である。Ｎ末端ドメインはコリン結合ドメインを含む。しかしながら、Ｌｙｔファミリーは、下記のコリン結合蛋白ファミリー（Ｃｂｐ）ファミリーにおいて見られる特徴をもっておらず、したがって本発明に関して、ＬｙｔファミリーはＣｂｐファミリーと異なると考えられる。Ｃｂｐファミリーとは対照的に、Ｃ末端ドメインはＬｙｔ蛋白ファミリーの触媒ドメインを含む。このファミリーはＬｙｔＡ、ＢおよびＣを含む。Ｌｙｔファミリーに関して、ＬｙｔＡはRondaら、Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)において開示されている。ＬｙｔＢはＷＯ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ４６とも言う。ＬｙｔＣもまたＷＯ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ９１とも言う。ファミリーの好ましいメンバーはＬｙｔＣである。
【００２１】
もう一つの好ましい具体例は、Ｌｙｔ末端切断物であり、「Ｌｙｔ」とは上記したとおりであり、「末端切断物」とはコリン結合領域の５０％またはそれ以上を欠く蛋白のことである。好ましくはそのような蛋白は全てのコリン結合領域を欠く。
Ｓｐ１２５はＬＰＸＴＧ（Ｘはいずれかのアミノ酸）の細胞壁固定モチーフを有する肺炎球菌表面蛋白の一例である。このモチーフを有する肺炎球菌表面蛋白のこの種の蛋白は全て、本発明の状況において有用であることが判り、そのため本発明の付加的な蛋白と見なされる。Ｓｐ１２５自体はＷＯ９８／１８９３０に開示されており、ＺｍｐＢ−亜鉛金属プロテイナーゼとして知られている。
Ｓｐ１０１はＷＯ９８／０６７３４（整理番号ｙ８５９９３）に開示されている。これはタイプＩシグナル配列によって特徴付けられる。
Ｓｐ１３３はＷＯ９８／０６７３４（整理番号ｙ８５９９２）に開示されている。これもまたはタイプＩシグナル配列によって特徴付けられる。
Ｓｐ１２８およびＳｐ１３０はＷＯ００／７６５４０に開示されている。
本発明において用いられる蛋白は、好ましくは、ＰｈｔＤおよびＰｈｔＡ群、またはこれらの両方の蛋白の組合せから選択される。
【００２２】
本発明の１つまたはそれ以上の肺炎球菌蛋白と他の肺炎球菌蛋白との有利な組合せ
本発明のワクチンにおいて、本発明の各々の上記した蛋白（好ましくは、ＰｈｔＤおよびＰｈｔＡのいずれかまたは両方）もまた１つまたはそれ以上の下記リスト：ニューモリシン（また、Ｐｌｙとも称される;好ましくは、化学処理または変異により弱化させる）［ＷＯ９６／０５８５９、ＷＯ９０／０６９５１、ＷＯ９９／０３８８４］、ＰｓａＡおよびその膜貫通型欠失変異体（Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62）、ＰｓｐＡおよびその膜貫通型欠失変異体（米国特許第５８０４１９３号、ＷＯ９２／１４４８８、ＷＯ９９／５３９４０）、Ｐｓｐその膜貫通型欠失変異体（ＷＯ９７／０９９９４、ＷＯ９９／５３９４０）、コリン結合蛋白（Ｃｂｐ）ファミリーの一員［例えば、ＣｂｐＡおよびその膜貫通型欠失変異体（ＷＯ９７／４１１５１；ＷＯ９９／５１２６６）］、 グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（Infect. Immun. 1996 64:3544)、ＨＳＯ７０（ＷＯ９６／４０９２８）、ＰｃｐＡ（Sanchez-Beatoら、FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14)、Ｍ様蛋白（ＳＢ特許出願番号ＥＰ０８３７１３０）および付着因子１８６２７（ＳＢ特許出願番号ＥＰ０８３４５６８）由来の蛋白と有利に組み合わせることができる。また、本発明は該蛋白（上記のような）の免疫学的機能等価物または末端切断物も含む。
【００２３】
コリン結合蛋白ファミリーに関して、このファミリーのメンバーは、コリンアフィニティクロマトグラフィーによって精製されることができた肺炎球菌蛋白として初めて同定された。コリン結合蛋白は全て、細胞壁のタイコ酸および細胞膜結合リポタイコ酸のホスホリルコリン部分と共有結合していない。構造的にこれらは、蛋白の正確な性質（アミノ酸配列、長さなど）は多様であるが、全てのファミリーに共通したいくつかの領域を有している。一般的に、コリン結合蛋白は、Ｎ末端領域、保存反復領域（Ｒ１および／またはＲ２）、プロリンに富む領域（Ｐ）、複数の反復配列で形成されており、この蛋白のおよそ二分の一を構成する保存コリン結合領域（Ｃ）を含む。本願明細書において使用されている「コリン結合蛋白ファミリー（Ｃｂｐ）」なる語は、ＷＯ９７／４１１５１で同定されているコリン結合蛋白であるＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＤ、ＣｂｐＧからなる群より選択される。ＣｂｐＡはＷＯ９７／４１１５１に開示されている。ＣｂｐＤとＣｂｐＧはＷＯ００／２９４３４に開示されている。ＰｓｐＣはＷＯ９７／０９９９４に開示されている。ＰｂｃＡはＷＯ９８／２１３３７に開示されている。好ましくは、コリン結合蛋白はＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣからなる群より選択される。
【００２４】
Ｃｂｐが利用できるさらなる蛋白である場合、これはＣｂｐ末端切断物であってもよく、ここに「Ｃｂｐ」は上記と同意義であり、「末端切断物」はコリン結合領域（Ｃ）の５０％またはそれ以上が欠失している蛋白を意味する。好ましくは、該蛋白は完全なコリン結合領域が欠失している。より好ましくは、該末端切断蛋白は（ｉ）コリン結合領域および（ｉｉ）蛋白のＮ末端の半分の一部を欠失しているが、少なくとも一つの反復領域を保持する（Ｒ１またはＲ２）。さらにより好ましくは、末端切断物は２つの反復領域を有する（Ｒ１とＲ２）。該好ましい具体例は、ＷＯ９９／５１２６６またはＷＯ９９／５１１８８に記載のようにＮＲ１ｘＲ２およびＲ１ｘＲ２であるが、類似のコリン結合領域が欠失している他のコリン結合蛋白もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
また、Ｃｂｐ末端切断物−Ｌｙｔ末端切断物キメラ蛋白（または融合蛋白）も本発明のワクチンに用いることができる。好ましくは、これはＣｂｐのＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）およびＬｙｔ（例えば、ＬｙｔＣＣ末端またはＳｐ９１Ｃ末端）のＣ末端部（Ｃ末端、すなわちコリン結合領域が欠失している）を含む。より好ましくは、ＣｂｐはＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣから成る群から選択される。さらにより好ましくはＣｂｐＡである。好ましくは、ＬｙｔはＬｙｔＣ（Ｓｐ９１とも言う）である。
コリン結合領域（Ｃ）が欠失しており、Ｌｙｔとの融合蛋白として発現されるＰｓｐＡまたはＰｓａＡ末端切断物も用いることができる。好ましくは、ＬｙｔはＬｙｔＣである。
【００２６】
本発明の目的の肺炎球菌蛋白の好ましい組合せ
好ましくは、本発明の蛋白の組合せは、２またはそれ以上（３または４）の異なるカテゴリー、例えばＬＸＸＣ（Ｘはいずれかのアミノ酸、例えばポリヒスチジントライアッドファミリー（Ｐｈｔ））のタイプＩＩシグナル配列モチーフ、コリン結合蛋白（Ｃｂｐ）、タイプＩシグナル配列モチーフ（例えば、Ｓｐ１０１）を有する蛋白、ＬＰＸＴＧモチーフ（Ｘはいずれかのアミノ酸、例えばＳｐ１２８、Ｓｐ１３０）を有する蛋白、毒素（例えばＰｌｙ）等から選択される。これらのカテゴリー（またはモチーフ）の中の好ましい例は、上記した蛋白、またはその免疫学的機能等価物である。毒素＋Ｐｈｔ、毒素＋Ｃｂｐ、Ｐｈｔ＋Ｃｂｐおよび毒素＋Ｐｈｔ＋Ｃｂｐが好ましいカテゴリーの組合わせである。
【００２７】
好ましい有利な組合せは、限定するものではないが、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端キメラまたは融合蛋白、ＰｈｔＤ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＤ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＤ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＤ＋ＰｓｐＡ、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端キメラまたは融合蛋白、ＰｈｔＡ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＡ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＡ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＡ＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、Ｒ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＡを含む。好ましくは、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣ由来である。より好ましくは、ＣｂｐＡ由来である。
肺炎球菌蛋白の特に好ましい組合せは、Ｐｌｙ（またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物）＋ＰｈｔＤ（またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物）＋ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）を含む。好ましくは、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣ由来である。より好ましくは、ＣｂｐＡ由来である。
【００２８】
理論に縛られることなく、組成物中の本発明の肺炎球菌蛋白（または上記した組合せ）は、肺炎球菌による侵襲を阻害するための免疫系の体液性ブランチと協力する、肺炎球菌疾患−特に肺炎に対する保護を必要とする−に対するＴ細胞媒介応答を誘発すること、およびオプソニン食菌作用を刺激することに役立ち得る。蛋白抗原を含むことのさらなる利点は、オプソニン食菌作用プロセスに関するさらなる抗原を提示することである。
【００２９】
したがって、本発明の具体例において、少なくとも４の血清型、好ましくは少なくとも７の血清型、より好ましくは少なくとも１１の血清型由来の多糖体抗原を含む肺炎球菌多糖体接合ワクチン、およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３（または上記のような肺炎球菌蛋白組合せ）から成る群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２、３または４）のストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白を含むストレプトコッカス・ニューモニエワクチンを提供する。好ましくは、蛋白の１つはＰｈｔＡ（またはその免疫学的機能等価物）である。最も好ましくは、蛋白の１つはＰｈｔＤ（またはその免疫学的機能等価物である。
【００３０】
上記したように、ワクチン接種への多糖体の用い方に関連した問題は、多糖体それ自体は免疫原性に乏しいという事実である。これを解決するため、多糖体をバイスタンダー細胞であるＴ細胞の助けを付与する蛋白キャリアに結合させてもよい。そのため、本発明で利用される多糖体はそのような蛋白キャリアに結合されていることが好ましい。現在、一般的に多糖体の免疫原性を生むために使われる、そのような蛋白の例として、ジフテリアとテターヌストキソイド（ＤＴ、ＤＴ ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、エヌ・メニンジティディス由来のＯＭＰＣ、ツボクラリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）が挙げられる。
【００３１】
肺炎球菌多糖体を用いる免疫原性組成物（またはワクチン）のための他の担体は、ヘモフィルス・インフルエンザ（ＥＰ５９４６１０−Ｂ）由来の蛋白Ｄ、またはそのフラグメントである。使用に適したフラグメントはヘルパーＴ細胞エピトープを含むフラグメントである。特に、蛋白Ｄフラグメントは、好ましくは、蛋白のＮ末端３分の１を含むであろう。蛋白Ｄ担体は、意外にも、多肺炎球菌多糖体抗原が結合しているワクチンにおける担体として有用である。エピトープ抑制は、通常には、同様の担体が各々の多糖体に対して用いられる場合に生じやすい。意外にも、本発明者らは、蛋白Ｄが、特に、組合せワクチンにおける該エピトープ抑制効果を最小限にするのに適していることを見出した。組合せ中の１つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖体は、蛋白Ｄ上に有利に結合でき、好ましくはすべての抗原は、該組合せワクチンにおいて蛋白Ｄに結合している。
肺炎球菌多糖体に関するさらに好ましい担体は、肺炎球菌蛋白それ自体（「本発明の肺炎球菌蛋白」の節に上記したような）である。
多糖体は、あらゆる既知の方法（例えば、Likhiteによる米国特許第４，３７２，９４５号およびArmorらによる米国特許第４，４７４，７５７号）によって、キャリア蛋白に結合させることができる。好ましくは、ＣＤＰＡ結合を行う（ＷＯ９５／０８３４８）。
好ましくは、結合の蛋白：多糖体（重量：重量）比は、０．３：１〜１：１、より好ましくは０．６：１〜０．８：１および、最も好ましくは約０．７：１である。
本発明のワクチンはアジュバント処理されていることが好ましい。適当なアジュバントは水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩を含むが、カルシウム、マグネシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化されたチロシン、アシル化された糖、陽イオンまたは陰イオンに誘導された多糖体、ポリフォスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
アジュバントは、免疫応答の細胞媒介ブランチを補助するためにＴＨ１型反応の優先的誘発因子であるように選ばれることが好ましい。
【００３２】
本発明のＴＨ１アジュバント
高レベルなＴｈ１型サイトカインは、与えられた抗原に対して細胞性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にあるが、高レベルなＴＨ２型サイトカインは、抗原に対して体液性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にある。
Ｔｈ１型、Ｔｈ２型免疫反応の区別は確固としたものでないことを認識することが重要である。現実には、個人は、優勢的にＴｈ１であると、または優勢的にＴｈ２であるとして記載される免疫反応を支持する。しかしながら、MosmannとCoffmanにより、ネズミＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンに記載されているサイトカインである点から、サイトカインファミリーを考察することが好都合であることが多い（Mosmann,T.RおよびCoffman,R.L (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lympholine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology,７、145‐173頁）。伝統的に、Ｔｈ１型反応は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γとＩＬ−２サイトカインの産生と関連している。Ｔｈ１型免疫反応の誘発としばしば直接的に関連している、ＩＬ−１２のような他のサイトカインは、Ｔ細胞によって産生されない。対照的に、Ｔｈ２型反応は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連している。Ｔｈ１反応を優勢的に促進する適当なアジュバントは、モノホスホリル脂質Ａまたはその誘導体、特に３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製についてのＧＢ２２２０２１１Ａを参考のこと）、およびモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと、アルミニウム塩（例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）または水中油型エマルジョンの一方との組み合わせを包含する。そのような組み合わせにおいては、抗原と３Ｄ−ＭＰＬは同じ粒状構造物中に含まれ、抗原性シグナルと免疫刺激シグナルのより効率的なデリバリーを可能とする。研究によると、３Ｄ−ＭＰＬはミョウバン吸着抗原の免疫原性を一層亢進することができる。［Thoelenら、Vaccine（1998）16:708-14;ＥＰ６８９４５４−Ｂ１］
【００３３】
亢進された系は、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組み合わせ、特にＷＯ９４／００１５３に開示されているようにＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされた小さい反応原性組成物を包含する。
水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に効力のあるアジュバントの処方は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されており、好ましい処方である。
好ましくは、ワクチンは付加的にサポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。処方はまた、水中油型エマルジョンとトコフェロールを含む（ＷＯ９５／１７２１０）。
本発明はまた、本発明の蛋白と３Ｄ−ＭＰＬのような医薬上許容される賦形剤との混合よりなるワクチンの産生の方法を与える。
オリゴヌクレオチドを含む非メチル化ＣｐＧ（ＷＯ９６／０２５５５）はまた、ＴＨ１反応の優先誘発因子であり、本発明の利用に適している。
【００３４】
本発明の特に好ましい組成物は、１つまたはそれ以上の結合肺炎球菌多糖体、１つまたはそれ以上の本発明の肺炎球菌蛋白およびＴｈ１アジュバントを含む。理論に縛られることなく、肺炎球菌蛋白（上記した）による細胞媒介応答の惹起および両免疫系の機構の間の共同作用はＴｈ−１アジュバントを用いて補助することができ、その結果、高齢者における、一般的には肺炎球菌疾患に対して、および重要には、肺炎球菌ニューモニエに対して特に効果的なワクチンを与える。
【００３５】
本発明のさらなる態様において、医薬において用いるためのイムノゲンまたは上記したワクチンを提供する。
一の具体例において、高齢者（＋５５歳）における肺炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量の本明細書に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される肺炎球菌蛋白および所望によりＴｈ１アジュバントを含むワクチンを該高齢者に投与することを含む方法を提供する。
さらなる具体例において、幼児（１８ヶ月まで）または小児（典型的には１８ヶ月〜５歳）における中耳炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、ならびに所望によりＴｈ１アジュバントを含むワクチンを該幼児または小児に投与することを含む方法を提供する。
好ましくは、上記したような本明細書の方法において、多糖体抗原は多糖体蛋白接合物として存在する。
【００３６】
本発明のワクチンの調製法
本発明のワクチン調製物は、当該ワクチンを全身性または粘膜性経路を介して投与することにより、感染に感受性の哺乳類（好ましくはヒト患者）を保護または治療するために使われる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介する注射、経口／食事、呼吸、尿生殖器への粘膜投与を含む。（肺炎球菌の鼻咽頭での運搬はより効果的に妨げられ、そのためその初期段階で感染を減衰できるため）肺炎または中耳炎を治療するのにワクチンを鼻内投与することが好ましい。本発明のワクチンは単回用量として投与されるが、その成分はまた同時に、または違う時に投与することもできる（例えば、肺炎球菌多糖体は、同時に、または互いに関して免疫反応が最も良く協調するワクチンの細菌蛋白成分を投与した後１−２週間で別個に投与できる）。共投与に関しては、所望によるＴｈ１アジュバントは、異なる投与のいずれかまたはすべてにおいて存在できるが、ワクチンの細菌蛋白成分との組み合わせで存在することが好ましい。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を利用してもよい。例えば、ウイルス性抗原はＩＤ（皮内）投与され、一方細菌蛋白はＩＭ（筋肉内）またはＩＮ（鼻内）投与することができる。多糖体はＩＭ（またはＩＤ）投与され、細菌蛋白はＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。加えて、本発明のワクチンは、初回抗原用量としてＩＭ投与され、追加抗原用量としてＩＮ投与され得る。
【００３７】
各ワクチン中の結合抗原の量は、典型的なワクチン中で有意な副作用がなく免疫防御反応を誘発する量として選ばれる。そのような量は、どの特定の免疫原が利用され、どのように提示されたかによって異なる。一般的には、各々の投与量は、０．１〜１００μｇの多糖体、好ましくは０．１〜５０μｇ、好ましくは０．１〜１０μｇを含み、１〜５μｇが最も好ましい範囲であるだろうことが考えられる。
ワクチン中の蛋白抗原の含有量は、典型的には１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、最も典型的には５〜２５μｇの範囲である。
特定のワクチンの成分の最適量は、対象での適当な免疫反応を観察することを含む標準的な実験で確かめることができる。最初のワクチン接種に続いて、対象は適当に時間を置いて一つまたはいくつかの追加抗原免疫処置を受ける。
ワクチン調製物は一般的にVaccine Designに記載されている（「The subunit and adjuvant approach」（Power M.F.およびNewman M.J.編）（１９９５）Plenum Press New York）。リポソーム内での莢膜化はFullertonの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
【００３８】
本発明のワクチンはどんな経路でも投与されるが、本発明のワクチンの皮膚への投与（ＩＤ）は、本発明の一つの具体例を形成している。ヒトの皮膚は、角質層と呼ばれる、外側の「角質」表皮を含み、それが表皮の表面を覆っている。この表皮の真下が真皮と呼ばれる層で、これが順次皮下組織を覆っている。研究者は、皮膚、特に真皮へのワクチンの注射は免疫反応を刺激し、それは多くの付加的な有利性と関連していることを示している。本明細書に記載のワクチンでの皮内へのワクチン接種は、本発明の好ましい特徴を形成している。
皮内注射の従来の技術である「マントー処置」は、皮膚の洗浄、そして一方の手を伸ばし、狭いゲージの針（２６−３１ゲージ）の斜面を上に向けて、１０−１５°の間の角度で針を挿入するという工程を含む。いったん針の斜面が挿入されたら、針の筒は押し下げ、針が皮下に入っていくように小さい圧力を与えつつさらに押し進める。それから液体を極めてゆっくりと注入し、それによって皮膚の表面に小気泡または衝撃を形成させ、続いて針をゆっくりと抜く。
【００３９】
さらに最近では、液体作用薬を皮膚中または皮膚を横切って投与するよう特別に設計された装置が記載されており、例えばＷＯ９９／３４８５０とＥＰ１０９２４４４で記載されている装置や、また例えばＷＯ０１／１３９７７、米国特許第５,４８０,３８１号、米国特許第５,５９９,３０２号、米国特許第５,３３４,１４４号、米国特許第５,９９３,４１２号、米国特許第５,６４９,９１２号、米国特許第５,５６９,１８９号、米国特許第５,７０４,９１１号、米国特許第５,３８３,８５１号、米国特許第５,８９３,３９７号、米国特許第５,４６６,２２０号、米国特許第５,３３９,１６３号、米国特許第５,３１２,３３５号、米国特許第５,５０３,６２７号、米国特許第５,０６４,４１３号、米国特許第５,５２０,６３９号、米国特許第４,５９６,５５６号、米国特許第４,７９０,８２４号、米国特許第４,９４１,８８０号、米国特許第４,９４０,４６０号、ＷＯ９７／３７７０５、ＷＯ９７／１３５３７で記載されているジェット式注射装置である。ワクチン調製物の皮内投与の代替的な方法は、従来のシリンジと針、固形ワクチンの弾道デリバリー（ＷＯ９９／２７９６１）のために設計された装置、経皮的なパッチ（ＷＯ ９７／４８４４０、ＷＯ９８／２８０３７）、皮膚の表面への塗布（経皮的デリバリー、ＷＯ９８／２０７３４、ＷＯ９８／２８０３７）を含む。
【００４０】
本発明のワクチンが皮膚に投与された場合、またはより具体的には真皮に投与された場合、ワクチンは、液体容量が小さく、特に約０．０５ｍｌと０．２ｍｌの間の容量である。
皮膚にある抗原の含量、または本発明の皮内用ワクチンの含量は、筋肉内ワクチン（上記参照）で見られる従来の用量と類似していてもよい。しかしながら、処方を「低用量」としうることが皮膚または皮内用ワクチンの特徴である。そのため、好ましくは「低用量」のワクチン中の蛋白抗原は、用量当たり０．１から１０μｇ、好ましくは０．１から５μｇとほとんど配合されない。多糖体（好ましくは接合体）抗原は用量当たり多糖体が０．０１〜１μｇ、そして好ましくは０．０１μｇと０．５μｇの間の範囲で存在する。
本明細書で使用されるように、「皮内デリバリー」なる語は、皮膚の真皮の領域にワクチンをデリバリーすることを意味する。しかしながら、ワクチンは必ずしも真皮に独占的にある必要はない。真皮は、ヒトの皮膚の表面から約１．０ｍｍと約２．０ｍｍの間に位置する皮膚の層であるが、個体によって、および体の異なる部位によってある程度の違いがある。一般的に、皮膚の表面の下１．５ｍｍ行くことで真皮に達すると考えられる。真皮は、表面の角質層、表皮と下にある皮下層の間に位置する。デリバリーの形態によって、ワクチンは最終的に単独でまたは優位的に真皮内に位置し、または最終的に表皮と真皮内において分配される。
【００４１】
本発明はまた、一連の異なる病原体に対して防御を与える混合ワクチンを意図する。多くの小児ワクチンは、現在、子供が受けねばならない注射の数を減らすために混合型ワクチンとして投与される。かくして、小児用ワクチンの場合、他の病原体由来の他の抗原を本発明のワクチンと共に処方することができる。例えば、本発明のワクチンは、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、テターヌストキソイド（ＴＴ）、百日咳菌成分［典型的には任意のペルタクチン（ＰＲＮ）および／または凝集素１＋２により無毒化された百日咳菌毒素（ＰＴ）と糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）］を含む、例えばＤＴ、ＴＴ、ＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮ抗原を含む市販ワクチンINFANRIX−DTPa（登録商標）（SmithKlineBeecham Biologicals）などの、周知の３価混合ワクチンと共に、または例えば、Tritanrix（登録商標）SmithKlineBeecham Biologicalsにより市販されているような全細胞百日咳菌ワクチンと共に、処方（または別々ではあるが同時に投与）され得る。混合ワクチンはまた、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）、ポリオウイルス抗原（例えば不活化３価ポリオウイルスであるＩＰＶ）、モラクセラ・カタラーリス膜外蛋白、分類不可能な特異的ヘモフィルス・インフルエンザ蛋白、髄膜炎菌Ｂ膜外蛋白のような他の抗原も含むことができる。
【００４２】
（特に中耳炎の予防の為の）混合ワクチンに配合することができるモラクセラ カタラーリス蛋白抗原の好ましい例は、ＯＭＰ１０６［ＷＯ ９７／４１７３１（Ａｎｔｅｘ）とＷＯ ９６／３４９６０（ＰＭＣ）］、ＯＭＰ２１、ＬｂｐＡおよび、またはＬｂｐＢ［ＷＯ ９８／５５６０６（ＰＭＣ）］、ＴｂｐＡおよび、またはＴｂｐＢ［ＷＯ ９７／１３７８５とＷＯ ９７／３２９８０（ＰＭＣ）］、ＣｏｐＢ［Ｈｅｌｍｉｎｅｎ ＭＥら（１９９３）Infect Immun６１：２００３−２０１０］、ＯｍｐＣＤ、ＨａｓＲ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２４）、ＰｉｌＱ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２３）、ＯＭＰ８５（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１４６８）、ｌｉｐｏ０６（ＧＢ９９１７９７７．２）、ｌｉｐｏ１０（ＧＢ９９１８２０８．１）、ｌｉｐｏ１１（ＧＢ９９１８３０２．２）、ｌｉｐｏ１８（ＧＢ９９１８０３８．２）、Ｐ６（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）、Ｄ１５（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２２）、Ｏｍｐ１Ａ１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６７８１）、Ｈｌｙ３（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）、ＯｍｐＥである。（特に中耳炎の予防の為の）混合ワクチンに配合することができる非特異的ヘモフィルス インフルエンザ抗原の例は、フィンブリン蛋白［（ＵＳ５７６６６０８−オハイオ州研究財団）］とそこから得られるペプチドよりなる融合蛋白［例えばＬＢ１（ｆ）ペプチド融合蛋白；ＵＳ５８４３４６４（ＯＳＵ）またはＷＯ ９９／６４０６７］、ＯＭＰ２６[ＷＯ ９７／０１６３８(Ｃｏｒｔｅｘ)]、Ｐ６［ＥＰ２８１６７３（ニューヨーク州立大学）］、ＴｂｐＡおよび、またはＴｂｐＢ、Ｈｉａ、Ｈｓｆ、Ｈｉｎ４７、Ｈｉｆ、Ｈｍｗ１、Ｈｍｗ２、Ｈｍｗ３、Ｈｍｗ４、Ｈａｐ、Ｄ１５（ＷＯ ９４／１２６４１）、蛋白Ｄ（ＥＰ５９４６１０）、Ｐ２、Ｐ５（ＷＯ ９４／２６３０４）である。
【００４３】
意図される他の組み合わせは、本発明の肺炎球菌ＰＳ＆蛋白と、例えばインフルエンザ（弱毒化された、スプリットまたはそのサブユニット［例えば、表面糖蛋白ノイラミニダーゼ（ＮＡ）と赤血球凝集素（ＨＡ）。例えばChaloupka IらEur.Journal Clin.Microbiol.Infect.Dis.1996,１５：１２１−１２７を参考のこと］）、ＲＳＶ（例えば、ＦとＧ抗原またはＦ／Ｇ融合蛋白。例えばSchmidt A.Cら、J Virol,May2001,P4594-4603を参考のこと）、ＰＩＶ３（例えば、ＨＮとＦ蛋白。前掲のSchmidtらを参考のこと）、水痘ウイルス（例えば弱毒化されたもの、糖蛋白Ｉ―Ｖなど）、ＭＭＲ（麻疹、おたふく風邪、風疹）のいずれかの（または全ての）成分からのウイルス性抗原との組合せである。
【００４４】
中耳炎の治療または予防に関して本発明により意図される好ましい小児用組合せは、１つまたはそれ以上のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原（複数でも可）（好ましくは蛋白Ｄに結合したもの）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される１つまたはそれ以上の肺炎球菌（またはその免疫学的機能等価物）、および１つまたはそれ以上のモラクセラ・カタラーリスおよび／または分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザからの表面露出抗原を含む。蛋白Ｄは、それ自体、分類不可能なエイチ・インフルエンザ（ｎｔＨｉ）に対するＢ細胞媒介保護を産生できるイムノゲンであるので、有利には、肺炎球菌多糖体に関する蛋白担体として用いることができ、エピトープ抑制問題（上記した）を解決できる。モラクセラ・カタラーリスおよび／または分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ抗原は、サブユニット形態のワクチンに含まれることができ、または細菌由来の外膜小胞（ｂｌｅｂｓ）の表面に存在する抗原として添加してもよい。
【００４５】
好ましくは、上記した抗原性組成物（およびワクチン）は、使用直前まで凍結乾燥され、その時点で即時に希釈剤で復元される。より好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの存在下で凍結乾燥され、即時に食塩水溶液で復元される。別法として、蛋白および多糖体は、ワクチン接取キット（成分のいずれか、または両方を凍結乾燥する）中に別個に貯蔵してもよく、使用前に復元して混合してもよく、または患者に別に投与してもよい。Ｔｈ１アジュバント（好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ）は、成分のいずれかまたは両方と共に存在できる。
【００４６】
ワクチンの凍結乾燥は、当該分野においてよく知られている。典型的には、液体ワクチンは、例えばシュークロースやラクトースのような糖（初期濃度は１０〜２００ｍｇ／ｍＬ）などの固化防止剤の存在下で凍結乾燥される。凍結乾燥は、典型的には、一連の工程、例えば、６９℃で始まり、徐々に３時間かけて−２４℃とし、それからこの温度を１８時間保持し、徐々に１時間かけて−１６℃とし、この温度を６時間保持し、徐々に３時間かけて＋３４℃とし、最終的にこの温度を９時間保持する、一のサイクルで起る。
組成物を凍結乾燥するとより安定な組成物（例えば、多糖体抗原の崩壊が防止される）となる。また、意外にも、この処理は肺炎球菌多糖体に対する高い抗体力価の原因である。このことは、特にＰＳ ６Ｂ結合が十分であることを示している。したがって、本発明の別の態様は、３Ｄ−ＭＰＬとのＰＳ ６Ｂ接合アジュバント（好ましくは、アルミニウム基材アジュバントを避ける）およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される肺炎球菌蛋白を含む凍結乾燥した抗原性組成物である。
【実施例】
【００４７】
実施例は本発明を説明するためのものであって、限定するものではない。
【００４８】
実施例１
エス・ニューモニエ莢膜多糖体
１１価の候補ワクチンは、実質的にＥＰ７２５１３に記載されているように調製した莢膜多糖体血清型１、３、４、５、６Ｂ，７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む。各々の多糖体を活性化し、ＣＤＡＰ化学（ＷＯ９８／０８３４８）を用いて誘導体化し、蛋白担体に結合させる。すべての多糖体は、血清型３（これはその粘度を減少させるために大きさを小さくした）を除いてそれらの天然の形態で結合する。
【００４９】
蛋白担体：
選択した蛋白担体は分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザから、イー・コリで発現した組換え蛋白Ｄ（ＰＤ）である。
【００５０】
蛋白Ｄの発現
ヘモフィルス・インフルエンザＤ
蛋白Ｄ発現に関する遺伝学的構築
出発物質
ＤＮＡをコードする蛋白Ｄ
蛋白Ｄはすべての血清型および分類不可能な株のエイチ・インフルエンザの中に多く貯蔵される。完全な蛋白Ｄ遺伝子をＤＮＡ配列を含むｐＨＩＣ３４８ベクターは、Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Swedenから得る。蛋白ＤのＤＮＡ配列は、Janson ら(1991) Infect. Immun. 59: 119-125により公にされている。
【００５１】
発現ベクターｐＭＧ１
発現ベクターｐＭＧ１は異質挿入遺伝子の転写および翻訳に関する制御要素由来のバクテリオファージλを取り込んだｐＢＲ３２２の誘導体（Grossら、1985）である。加えて、アンピシリン耐性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子と交換された。
【００５２】
イー・コリ株ＡＲ５８
イー・コリ株ＡＲ５８Ｎ９９をＳＡ５００誘導体（galE::TN10、ラムダKil- cI857 ΔH1）でのＰ１ファージストック予備増殖で形質導入することにより生産した。Ｎ９９およびＳＡ５００は国立保健研究所のDr. Martin Rosenbergの研究室から由来のイー・コリＫ１２株である。
【００５３】
発現ベクターｐＭＧ１
蛋白Ｄの産生に関して、蛋白をコードするＤＮＡは発現ベクターｐＭＧ１にクローン化される。このプラスミドは挿入された異質遺伝子の複写および翻訳を誘発するラムダファージＤＮＡからのシグナルを利用する。ベクターはプロモーターＰＬ、オペレーターＯＬおよび２つの利用部位（ＮｕｔＬおよびＮｕｔＲ）を含み、Ｎ蛋白が供給される場合、転写極性効果を軽減する（Grossら、1985）。ＰＬプロモーターを含むベクターはイー・コリ溶原性宿主に誘導され、プラスミドＤＮＡを安定化させる。溶原性宿主株はゲノムを取り入れた複製欠損ラムダファージＤＮＡを含む（Shatzmanら、1983）。染色体ラムダファージＤＮＡは、ベクターのＯＬリプレッサーに結合しリプレッサー蛋白の合成を導き、ＲＮＡポリメラーゼがＰＬプロモーターに結合して、それにより挿入された遺伝子の転写を防止する。発現株ＡＲ５８のｃＩ遺伝子は、温度感受性変異体を含み、したがって、転写を指示されるＰＬは温度変化により制御することができ、すなわち、培養温度を増加させることによりリプレッサーを不活性化し、異質蛋白の合成が開始される。この発現系は、特に、細胞への毒性があり得るこれらの異質蛋白の制御された合成を可能にする（Shimataka & Rosenberg, 1981）。
【００５４】
イー・コリ株ＡＲ５８
蛋白Ｄ担体の産生に用いられるＡＲ５８溶原性イー・コリ株は、標準ＮＩＥイー・コリＫ１２株Ｎ９９（F- su- galK2、lacZ- thr-）の誘導体である。これは欠損溶原性ラムダファージ（galE::TN10、ラムダKil- cI857 ΔH1）を含む。Ｋｉｌ−表現型は宿主マクロ分子合成の遮断を妨げる。ｃＩ８５７変異体は、温度感受性障害をｃＩリプレッサーに与える。ΔＨ１欠失は、ラムダファージライトオペロンおよび宿主バイオ、ｕｖｒ３、およびｃｈｌＡ座を排除する。ＡＲ５８株をＳＡ５００誘導体（galE::TN10、ラムダKil- cI857 ΔH1）でのＰ１ファージストック予備増殖で形質導入することにより生産した。欠損溶原のＮ９９への導入は、近接したｇａｌＥ遺伝子にテトラサイクリン耐性に関するＴＮ１０トランスポゾンコーディングの存在の効力によりテトラサイクリンで選択された。
【００５５】
ｐＭＧＭＤＰＰｒＤベクターの構築
インフルエンザウイルス（ｐＭＧＮＳＩ）の非構造的Ｓ１蛋白をコードする遺伝子を含むｐＭＧ１ベクターをｐＭＧＭＤＰＰｒＤを構築するために用いた。蛋白Ｄ遺伝子は、ｐＨＩＣ３４８ベクター（Jansonら、1991）から各々５’および３’末端でのＮｃｏＩおよびＸｂａＩ制限部位を含むＰＣＲプライマーでＰＣＲすることにより増幅させた。ついで、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩフラグメントをＮｃｏＩとＸｂａＩの間のｐＭＧＮＳ１に導入し、かくしてＮＳ１蛋白のＮ末端の８１個のアミノ酸ついでＰＤ蛋白を含む融合蛋白を作成した。このベクターは標識ｐＭＧＮＳ１ＰｒＤである。
【００５６】
上記した構築物に基いて、蛋白Ｄ発現の最終的な構築物を生成した。ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをｐＭＧＮＳ１ＰｒＤから除去した。このＤＮＡ加水分解は、最初の３つのＮ末端残基意外のＮＳ１コーディング領域を除去した。ベクターの再ライゲーションで、続くＮ末端アミノ酸配列で融合蛋白をコードする遺伝子を生成した：
-----ＭＤＰ ＳＳＨＳＳＮＭＡＮＴ-----
ＮＳ１ 蛋白Ｄ
【００５７】
蛋白Ｄは脂質鎖が正常に結合しているリーダーペプチドまたはＮ末端システインを含まない。したがって、該蛋白はペリプラズムに排泄されることも、脂質化されることもなく、可溶性形態の細胞質中に保持される。
最終構築物ｐＭＧ−ＭＤＰＰｒＤをＡＲ５８宿主株に、３７℃で貯蔵物を加熱することより導入する。細菌を含むプラスミドをカナマイシンの存在下で選択した。蛋白ＤコーディングＤＮＡ挿入の存在が、単離されたプラスミドＤＮＡを選択されたエンドヌクレアーゼで消化することにより示された。組換えイー・コリ株はＥＣＤ４として称される。
蛋白Ｄの発現はラムダＰＬプロモーター／ＯＬオペレーターの制御下で行う。宿主株ＡＲ５８は、温度感受性ｃＩ遺伝子を、ＯＬに結合することによる低温度でのラムダＰＬからの発現を遮断するゲノム中に含む。一旦温度を上げると、ｃＩはＯＬから放出され、蛋白Ｄが発現される。発酵の最後で、細胞を濃縮し、冷凍する。
【００５８】
収穫した細胞からの抽出および蛋白Ｄの精製は以下のように行った。冷凍細胞培養ペレットを解凍し、細胞破壊溶液中（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）に再懸濁させ、最終的なＯＤ６５０＝６０とした。懸濁液をＰ＝１０００バールで高圧ホモジナイザーに２回通した。細胞培養ホモジネートを遠心分離により浄化し、細胞の破片を濾過により除去する。第１の精製工程において、濾過した溶解物をカチオン交換クロマトグラフィーカラム（SP Sepharose Fast Flow）に付す。ＰＤをゲルマトリックスにイオン相互作用により結合させ、溶出緩衝液のイオン強度を増加させる工程により溶出する。
第２の精製工程において、不純物をアニオン交換マトリックス（Q Sepharose Fast Flow）に保持させる。ＰＤはゲルに結合せず、通りぬけた液体中に回収することができる。
両方のカラムクロマトグラフィー工程において、フラクション回収物をＯＤによりモニターする。アニオン交換カラムクロマトグラフィーの精製蛋白Ｄを含む通りぬけた液体を限外濾過により濃縮する。
限外濾過保有物を含む蛋白Ｄを最終的に０．２μｍの膜に通す。
【００５９】
化学：
活性化およびカップリング化学：
活性化およびカップリング化学は各々の多糖体に固有のものである。これらを表１に示す。天然の多糖体（ＰＳ３を除く）を２ＭのＮａＣｌまたは注射用水に溶解した。最適多糖体濃度をすべての血清型に関して評価した。
アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌの貯蔵物から、ＣＤＡＰ（ＣＤＡＰ／ＰＳ比０．７５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ）を多糖体溶液に加えた。１．５分後、０．２Ｍのトリエチルアミンを加え、特定の活性化ｐＨを得た。多糖体の活性化は、このｐＨで２分間２５℃で行った。蛋白Ｄ（質量は初期ＰＳ／ＰＤ比に依存する）を活性化多糖体に加え、カップリング反応を特定のｐＨで１時間行った。ついで、反応を、グリシンで３０分間２５℃および４℃で一晩でクエンチした。
結合物を２ＭのＮａＣｌで平衡化したSephacryl 500HRゲル濾過カラムを用いてゲル濾過により精製した。
溶出したフラクションの炭水化物および蛋白含有量を測定した。結合物をプールし、０．２２μｍの滅菌膜で滅菌濾過した。結合調製物のＰＳ／蛋白比を測定した。
【００６０】
特徴付け：
各々の結合物を特徴付け、表２に記載した詳細に対応させた。多糖体含有量（μｇ／ｍｌ）をResorcinol試験により、および蛋白含有量（μｇ／ｍｌ）をLowly試験により測定した。最終ＰＳ／ＰＤ比（ｗ／ｗ）を濃度の比により測定する。
【００６１】
残余ＤＭＡＰ含有量（ｎｇ／ｎｇ ＰＳ）：
多糖体のＣＤＡＰでの活性化は多糖体中のシアネート基を誘導し、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノ−ピリジン）を遊離させる。残余ＤＭＡＰ含有量をＳＢで開発された特定のアッセイにより測定した。
【００６２】
遊離多糖体含有量（％）：
４℃に維持するか、または３７℃で７日保存した結合物の遊離多糖体含有量を、α−ＰＤ抗体および飽和硫酸アンモニウムでインキュベートし、ついで遠心分離して得られた上清で測定した。
α−ＰＳ／α−ＰＳ ＥＬＩＳＡを上清中の遊離多糖体の定量化に用いた。また、結合物の欠乏をα−ＰＤ／α−ＰＳ ＥＬＩＳＡにより制御した。遊離多糖体の量を減少させて改善結合ワクチンを得る。
【００６３】
抗原性：
同様の結合物における抗原性を、抗体の捕獲および検出が、各々α−ＰＳおよびα−ＰＤであるサンドイッチ型ＥＬＩＳＡで分析した。
【００６４】
遊離蛋白含有量（％）：
「遊離」残余蛋白Ｄのレベルを試料のＳＤＳ処理が有る方法を用いて測定した。結合物を１０分間１００℃に、ＳＤＳ０．１％の存在下加熱し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣゲル濾過カラム（TSK 3000-PWXL）に注入した。蛋白Ｄは二量体であるので、ＳＤＳとの構築物を分離することによる「遊離」蛋白Ｄのレベルを過大評価する危険性がある。
【００６５】
分子の大きさ（Ｋａｖ）：
分子の大きさはＳＥＣ−ＨＰＬＣゲル濾過カラム（TSK 5000-PWXL）で測定した。
【００６６】
安定性：
安定性を４℃に維持した結合物および３７℃で７日間貯蔵した結合物に関してＨＰＬＣ−ＳＥＣゲル濾過（TSK 6000-PWXL）で測定した。
１１価特徴付けを表２に示す。
蛋白結合物をリン酸アルミニウムに吸着させ、プールして最終ワクチンを形成できる。
【００６７】
結論：
免疫原性結合物は生産せ、有望なワクチンの成分であることが示されている。最良の性質の最終結合肺炎球菌多糖体生成物に関する最適化ＣＤＡＰ条件が１１のワクチンの各々に関して見出された。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
実施例２−本発明の１またはそれ以上の肺炎球菌蛋白＋／−３Ｄ−ＭＰＬの添加の、マウスでの肺炎球菌肺コロニー形成に対するＰＤ−接合した１１−価の多糖体ワクチンの防御的効能における有益な効果
【００７２】
免疫学的表示
肺炎球菌特異的血清ＩｇＧのエライザ投与量
Maxisorp Nuncイムノプレートを、３７℃で２時間、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍｌの蛋白で、１００μｌ／ウェルにてコーティングする。プレートをＮａＣｌ（０．９％）ツィーン−２０（０．０５％）バッファーで３回洗浄する。ついで、標準曲線物として加えられた抗−蛋白血清対照（６７０ｎｇ／ｍｌのＩｇＧで開始する）および血清サンプル（１／１０の希釈度で開始する）の連続的な二倍希釈体（ＰＢＳ／ツィーン−２０（０．０５％）中、ウェル当たり１００μｌ）を攪拌しながら２０℃で３０分間インキュベートする。上記したように洗浄した後、ＰＢＳ／ツィーン−２０（０．０５％）中５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Jackson）を攪拌しながら２０℃で３０分間インキュベート（１００μｌ／ウェル）する。洗浄後、プレートを室温で１００μｌ／ウェルのレベレーション（revelation）バッファー（１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）中のＯＰＤＡ ０．４ｍｇ／ｍｌおよびＨ２Ｏ２ ０．０５％）と一緒にインキュベートする。５０μｌ／ウェルの１Ｎ塩酸を添加することでレベレーションを止める。光学濃度をＥｍａｘイムノリーダー（Molecular Devices）を用いて４９０および６２０ｎｍで読み取る。抗体力価をSoftMaxProソフトウェアを用いる４変数の数学的方法により算定する。
【００７３】
オプソニン食菌作用アッセイ
このアッセイの目的は、ＣＤＣの公開されている標準的方法に適合する方法（Steinerら、Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology ４：４１５、１９９７）を用いて、試験血清サンプルの、ストレプトコッカス・ニュモニエ血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆに拮抗するオプソニンの作用能を再現的に測定することである。
このアッセイは侵入するストレプトコッカス・ニュモニエまたはニュモコッカスを排除する第一機構としてインビボにて起ることをインビトロにて再現する。それはニュモコッカスをオプソニン化し、つづいて食作用に付し、ついで殺菌するものである。「食作用」とは細胞が物質を飲み込み、細胞質にある小胞（ファゴソーム）中にそれを取り囲む過程である。肺炎球菌は健康な哺乳動物の食細胞によって食菌されると、当該細菌は死滅する。「オプソニン化」とは、オプソニン、例えば、抗体および補体を抗原上に堆積させることにより食作用が促進される過程である。
【００７４】
文献にて報告されている多数のオプソニン食菌作用アッセイがある。ＣＤＣの標準的方法はマルチ−ラブセッティングにて試験される（Steinerら、ＩＣＡＡＣ、トロント、２０００年９月１６日−２０日）。この後者のアッセイはＳＢで適合された。というのも、他の実験室にて比較するための基礎を提供し、それは一般に入手可能な試薬および対照を用い、生存肺炎球菌の５０％の死滅を促進する能力のある血清の力価（希釈度）、この型のアッセイに一般に使用される単位としての結果を表すからである。実際、その使用されたアッセイが４ヵ所の別の実験室で十分によく対応する結果を形成しうることが明らかにされた（Steinerら、ＩＣＡＡＣ、トロント、２０００年９月１６日−２０日）。
【００７５】
このアッセイで使用される食作用細胞はＨＬ６０細胞系であり、それは前骨髄球性白血病の個体から由来するものであり、Collinsらにより、１９７７年（Nature ２７０：３４７−９）にて連続する細胞系として確立された。この細胞系は、未分化の造血細胞、すなわち、８５％の芽細胞および前骨髄球、６％の骨髄球および９％の分化細胞からなる。極性化合物は該細胞の分化を少なくとも２つの異なる系統で誘発させることができる。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは顆粒細胞の分化を誘発し、多形核様細胞（４４％の骨髄球およびメタ骨髄球ならびに５３％バンドおよびセグメントのＰＭＮ）を生成する。
該アッセイにおけるバージョンＡ２において、試験すべき血清を熱不活化し、１／４で開始して連続的２倍希釈を８回、９６−ウェルマイクロプレートのＨＢＳＳ培地（０．３％ＢＳＡを含有する）にて行った。各ウェルにおける希釈された血清の最終容量は２５μｌである。
【００７６】
１０７個の細胞／ｍｌの４容量のＨＬ６０細胞（ジメチルホルムアミドで分化した５または６日後）、２容量のエス・ニュモニエ菌（適当な希釈度）および１容量の新生児ウサギの補体を使用直前に混合し、その２５μｌの混合物を９６−ウェルのマイクロプレートの希釈血清を含有する各ウェルに加える。血清型１および６Ｂでは、補体の量を最終濃度１２．５％にまで上げ、該アッセイのバージョンＡ３を得る。
軌道振盪の下、３７℃で２時間インキュベーションした後、プレートを氷上に置き、オプソニン食菌反応を停止させる。
【００７７】
３７℃で一夜インキュベートすることで、各ウェルにおけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）を評価する。「オプソニン力価」（ＯＴ）をウェル中のエス・ニュモニエ菌の数を少なくとも５０％まで減少させることができる血清の相互希釈度（reciprocal dilution）として（すなわち、５０％死菌）として定義する。
％死菌＝（対照ウェルの平均ＣＦＵ−サンプルのＣＦＵ）／対照ウェルの平均ＣＦＵ
ｘ１００
【００７８】
ＯＦ１マウスにおける肺炎球菌鼻腔内攻撃
７週齢の雌のＯＦ１マウスに、麻酔状態の下、５ｘ１０５個のＣＦＵのマウス適合エス・ニュモニエ血清型２、４または６Ｂを鼻腔内に接種する。肺を攻撃の６時間後に摘出し、Todd Hewith Broth（THB、Gibco）培地にて均質化する。肺ホモジネートの連続した１０倍希釈体を、酵母抽出物補足ＴＨＢ寒天上、３７℃で一夜平板培養する。肺炎球菌肺感染を、対数加重平均値として表される、ＣＦＵ／マウスの数として測定する。
【００７９】
実施例２Ａ ３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの抗蛋白免疫反応についての効果
この実施例において、本発明者らは３Ｄ−ＭＰＬアジュバント処理の本発明の蛋白に対する免疫応答の効果を評価することができる。
一群１０匹の雌の６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、Ａ：ＡＩＰＯ４ １００μｇ；またはＢ：ＡＩＰＯ４ １００μｇ＋５μｇ ３Ｄ−ＭＰＬ（３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ribi Immunochemから購入）のいずれかを含有する１μｇの蛋白で０、１４および２１日目に筋肉内に免疫処理する。エライザＩｇＧをポスト−ＩＩＩ血清にて測定する。
いずれの抗原であっても、３Ｄ−ＭＰＬを補足した処方でワクチン処理した動物にて最良の免疫応答が誘発されることがわかる。
【００８０】
実施例２Ｂ 本発明の蛋白＋／−３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを添加した、血清型２、４または６Ｂで鼻腔内攻撃したＯＦ１マウスにおける肺炎球菌肺コロニー形成に対するＰＤ−接合の１１−価の多糖体ワクチンの防御作用に対する有利な効果
この実施例において、本発明者らは、古典的なＡＩＰＯ４吸着の１１−価の多糖体−蛋白Ｄ接合体処方と比べて、１１−価の多糖体−蛋白Ｄ接合体、本発明の蛋白およびＡＩＰＯ４＋３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含有するワクチンの予防的効能を評価することができる。
一群１２匹の雌の４週齢のＯＦ１マウスを、Ａ：５０μｇのＡＩＰＯ４；Ｂ：０．１μｇのＰＳ／ＰＤ−接合した１１−価の多糖体ワクチンの血清型＋５０μｇのＡＩＰＯ４；またはＣ：０．１μｇのＰＳ／ＰＤ−接合した１１−価の多糖体ワクチンの血清型＋１０μｇの本発明の蛋白＋５０μｇのＡＩＰＯ４＋５μｇの３Ｄ−ＭＰＬ（Ribi Immunochemから購入）を含有する処方で０および１４日目に皮下的に免疫処理する。攻撃を上記したように２１日目に行う。
この方法から判るように、本発明の蛋白を補足し、ＡＩＰＯ４＋ＭＰＬでアジュバント処理した１１−価の多糖体接合体ワクチンで有意な防御が得られる。反対に、１１−価の多糖体接合体／ＡＩＰＯ４処方で免疫処理した動物では有意な防御は観察されない。この結果により、本発明の蛋白および３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの添加が１１−価の多糖体接合体ワクチンの肺炎に対する効力を亢進することを明らかにすることができる。
【００８１】
実施例２Ｃ 実施例２Ｂに示される防御の免疫相関性
本発明の蛋白および３Ｄ−ＭＰＬを補足した１１−価の多糖体接合体ワクチンによる、実施例２Ｂで得られた防御の免疫相関性を確立するために、上記したように、多糖体２、４または６Ｂおよび本発明の蛋白に対する攻撃前の血清抗体反応を測定することができる。
ついで、抗体力価を、攻撃の６時間後に集めた対応する動物の肺で測定された細菌性コロニーの数と比較する。Ｌｏｇ／Ｌｏｇの直線回帰上でＲ２を算定する。
算定されたＲ２から、体液性免疫応答と両抗原の防御との間に相関関係のないことが判る。抗−６Ｂ（あるいは２または４）抗体価は、１１−価の接合体ワクチンで、あるいは本発明の蛋白および３Ｄ−ＭＰＬを補足した同じワクチンで免疫処理した群にてあまり違わない。したがって、処方Ｃで認められる防御の改善は、多糖体６Ｂ（あるいは２または４）に対するより高い抗体力価によるだけではない。
総合すれば、これらの結果は、防御が体液性免疫応答だけで媒介されるものではなく、むしろ蛋白抗原（好ましくは３−ＭＰＬの存在下で）誘発される細胞介在免疫性によっても媒介されることを示唆しうる。このことは、免疫系の両腕が協調して最適な防御を得るのに、肺炎球菌多糖体接合体ワクチンに蛋白抗原（複数でも可）および強力なアジュバントを添加することにさらなる支持を与えることができる。
【００８２】
実施例３−本発明の蛋白で能動的に免疫処理され、肺炎球菌ＰＳに対する抗体で受動的に免疫処理されたマウスにおける免疫系の両腕の協調
実施例３Ａ−肺炎に拮抗して保護する受動的に投与される抗−６Ｂ−多糖体（抗−ＰＳ）の濃度の測定
方法
ワクチン群：一群１６匹の４群のマウスを−１日目に以下に詳説した群に従って希釈されていないラット抗−多糖体抗血清（１００μｌ）で受動的免疫処理（ｉ．ｐ．）に付した（合計６４匹のマウス）。
【００８３】
【表４】
【００８４】
動物：カナダ、Charles Riverから由来の６４匹の雄のＣＤ−１マウスであり、体重は約３５ｇ（約１０週齢）である。
麻酔状態：イソフルラン（３％）＋Ｏ２（１Ｌ／分）でマウスを麻酔に付した。
生物：エス・ニュモニエＮ１３８７（血清型６）を５％ウマ血を補足したトリプチケース大豆寒天（ＴＳＡ）プレートから収穫し、６ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。感染の直前に１ｍｌの細菌懸濁液を９ｍｌの冷却した融解滋養寒天（ＢＢＬ）中に希釈し、４１℃で保持した。マウスに５０μｌの容量にて約６．０対数１０ｃｆｕ／マウスを投与した。
感染：０日目に、マウスを上記したように麻酔処理に付し、手術を伴わない気管内挿管を介する気管支内注入によりエス・ニュモニエＮ１３８７（５０μｌの冷却細菌懸濁液）に感染させた。この方法はWooduntおよびBerryによって記載されている（Antimicrob. Ag. Chemotherap. ４３：２９（１９９９））。
サンプル：感染の３日目に、８匹のマウス／群をＣＯ２を過剰に摂取させて殺し、肺を摘出して１ｍｌのＰＢＳにホモジネートさせた。ＰＢＳの１０倍連続希釈体を調製し、生存している細菌の数を数えた。サンプルを５％ウマ血を補足したＴＳＡプレート上に３通りにて播種（２０μｌ）し、３７℃で一夜インキュベートし、評価した。さらに一連のマウスを７日目に殺し、上記したようにサンプリングした。
【００８５】
結果：
【表５】
括弧内の数字はサンプリング時間の前に死んだ動物の数である。
【００８６】
結論：一般に、いずれかの処理群より単離した細菌数には有意な違いはない。これは測定可能な防御が５μｇ／ｍｌを含むそれまでの濃度の抗−多糖体抗体で得られなかったことを示す。
これは数人のヒト臨床実験で観察されたことと類似しており、すなわち、抗−多糖体抗体はある集団におけるニュモコッカス肺炎に対する保護を付与するのに十分ではない。
【００８７】
実施例３Ｂ−本発明の蛋白をアジュバントと共にまたは無しで能動的に投与することにより得られる肺炎からの防御、および最適下限の抗−ＰＳ抗体との相乗作用の測定
方法
動物：カナダ、ケベック州、セント・コンスタント、Charles Riverからの１２８匹の雄のＣＤ−１マウス（免疫処理の際に６週齢で、感染の際に１０週齢である）であり、体重は６週で約２０ｇであり、１０週で約３８ｇであった。
免疫処理：一群１６匹のマウス６群を、−２２日目および−１４日目に、以下に詳説する１００μｌのワクチンで皮下注射して免疫処理する。（合計１２８匹のマウス）。３Ｄ−ＭＰＬをRibi／Corixaから入手する。
−１日目に、特定の群（以下の表を参照のこと）を４．２６μｇ／ｍｌ（４ｍｌの５μｇ／ｍｌ＋１．３ｍｌの２μｇ／ｍｌ）の濃度のマウス抗−多糖体抗体で受動的に免疫処理（ｉ．ｐ．１００μｌ）する。
【００８８】
【表６】
【００８９】
感染： ０日目に、マウスを上記したように麻酔処理（３％イソフルラン＋１Ｌ／分のＯ２）に付す。エス・ニュモニエＮ１３８７（血清型６）の培養体を５％ウマ血を補足したトリプチケース大豆寒天（ＴＳＡ）プレートから収穫し、６ｍｌのＰＢＳに懸濁させることにより細菌接種体を調製する。感染直前に、冷却した溶融滋養寒天（４１℃に保持）にて１０倍希釈体（１ｍｌ＋９ｍｌ）を調製する。マウスを気管内挿管を介する気管支内注入により感染させ、５０μｌの容量にて約６．０対数１０ｃｆｕ／マウスを投与する。この方法はWooduntおよびBerryによって記載されている（Antimicrob. Ag. Chemotherap. ４３：２９（１９９９））。
サンプル：感染後７２時間で、８匹のマウス／群をＣＯ２を過剰に摂取させて殺し、肺を摘出して１ｍｌのＰＢＳにホモジネートさせた。ＰＢＳの１０倍連続希釈体を調製し、生存している細菌の数を数えた。サンプルを５％ウマ血を補足したＴＳＡプレート上に３通りにて播種（２０μｌ）し、３７℃で一夜インキュベートし、評価した。さらに一連のマウスを８日目に殺し、上記したようにサンプリングした。
【００９０】
データ分析
治療効果を比較するための指標が感染した３および７日目に肺に存在する細菌の数である。結果を平均値と標準偏差として表すことができる。統計学的分析はスチューデントｔ−試験（Ｐ値が＜０．０５で有意であると考えられる）を用いて行うことができる。
上記したように、抗−多糖体抗体単独（群１−５）では肺における肺炎球菌の増殖に対する防御を付与できないことがわかる。ＡｌＰＯ４でアジュバント処理した肺炎球菌蛋白（群１−１）は保護を与えることができないが、蛋白を３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせた場合（群１−２）ではその効果はよくなるであろう。
最も有意な防御が抗−多糖体抗体と蛋白の両方の群で、特に３つのすべての要素、蛋白、３Ｄ−ＭＰＬおよび受動的に投与された抗−多糖体抗体を有する群（群１−４）で認められる。この結論はまた、死亡率でも支持され得る。群１−３、特に１−４は他の群と比べて死亡率が低いであろう。
【００９１】
結論：受動的に免疫処理した動物を用いて実験するため、さらに蛋白（＋／−ＭＰＬ）を用いて能動的に免疫処理することによる相乗作用は、多糖体抗原に対する抗体のレベルの増加によるものとすることができない。
肺炎球菌肺炎に対する有意な防御が、蛋白と受動的投与した抗−多糖体抗体の両方で免疫処理した群で観察され、特に３Ｄ−ＭＰＬも存在する場合に、この組み合わせが相乗作用を示すことがわかる。
抗−多糖体免疫処理を（好ましくは、多糖体との接合体を用いて）能動的に行うならば、この効果は、Ｂ−細胞記憶の効果として、さらに著しくなるであろうし、実験全体を通して抗−ＰＳ抗体の定常レベルが免疫反応協調に寄与するであろう。
【００９２】
実施例４−防御の相互作用による相乗効果の測定方法
人体が感染性肺炎球菌を排除するのに用いる原理機構は抗体介在のオプソニン食菌作用である（Bruynら、Clin. Infect. Dis. １４：２５１（１９９２））。防御との相関関数として莢膜多糖体に対する抗体濃度を測定するための、数種のエライザ法が開発されており、インビトロでのオプソニン食菌作用アッセイが防御とより相関していることが明らかとなった（Musherら、J. Infect. Dis. １８２：１５８（２０００））。
本発明の肺炎球菌蛋白は、抗体介在のオプソニン食菌作用とは異なる機構により肺炎球菌感染に対する防御を提供する。実施例２において、接合体および蛋白の両方での能動的免疫処理が、抗体濃度が両方の群で同じであるため、その違いで説明できない、相乗効果を示し得る。すなわち、観察され得る残りの防御作用は相乗作用に由来するものでなければならない。同様に、抗体が能動的に投与されているため、実施例３において同じ結論に到達することができる。
【００９３】
多くの場合において、本発明の肺炎球菌蛋白は表面に結合し、それ自体がオプソニン活性を提供すると考えられる。この場合、オプソニン活性の他の防御の相乗的機構に対する相対的寄与を評価するのに用いることができる、抗−肺炎球菌蛋白のオプソニン作用能を定量的に測定することで防御機構を区別することが可能である。
マウス肺コロニー形成モデルにおいて、各ワクチンの相対的保護を細菌の肺からのクリアランスで評価することができる。あるいは別法として、ワクチンの効力を、ワクチンで一般に測定される、症状率から評価することもできる。
％防御＝（ＣＦＵ／対照となる肺−ＣＦＵ／ワクチン処理した肺）／（ＣＦＵ／対照となる肺）
％効力＝（対照となる症状−ワクチン処理した症状）／（対照となる症状）
相乗作用に由来する防御または効力の部分を測定するために、オプソニン力価の割合に基づき、効力の部分と考えられる部分を決定することが問題である。
【００９４】
上記した実施例３において、蛋白または抗−多糖体単独ではそれ自体大きな防御を提供できないため、組み合わせたことによる％防御は、蛋白／抗体成分の間の相乗作用によるものである。
オプソニンの相対活性に基づいて、相乗作用の防御の量を評価することが可能である。抗−莢膜多糖体抗体により得られるオプソニン活性がＸであり、抗−肺炎球菌蛋白抗体により得られるオプソニン活性がＹであるとしたならば、オプソニン活性の合計はＸ＋Ｙであることがわかり、蛋白のオプソニン活性の相対的部分はＹ／Ｘ＋Ｙである。これをワクチンの相対的防御効力（ワクチンの抗−多糖体部分がＡ％の防御効力を提供し、ワクチンの多糖体＋蛋白の防御効力がＢ％である）と比較する。そして、オプソニン活性により説明することができない付加的な効力を残りの防御活性（相乗作用）＝Ｂ％−Ａ％−Ｂ％＊（Ｙ／Ｘ＋Ｙ）として評価する。
この実施例は相乗効果を評価するための方法を限定するものではない。防御との他の相関関係が同定されれば、この相乗作用を評価するのにその相関性を用いることができる。
【００９５】
本明細書に引用されている、特許および特許出願（これらの限定されない）を含め、すべての刊行物は、たとえ、個々の刊行物が、その内容を十分に開示している場合に、出典を明示することにより明細書の一部とすることを、具体的かつ個別的に意図するものであったとしても、その出典を明示することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細菌性多糖体抗原ワクチン、その製造および該多糖体の医薬における使用に関する。
特に、本発明は肺炎球菌多糖体抗原、典型的には、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）由来の蛋白抗原および、所望によりＴｈ１誘導アジュバントと共に処方される、肺炎球菌多糖体接合抗原を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカス・ニューモニエは、（特に若者および老人において）深刻な罹患率および死亡率の原因となっているグラム陽性菌であり、肺炎、菌血症および髄膜炎のような侵襲性疾患や、急性中耳炎のようにコロニー形成に付随する疾患を引き起こしている。米国での６０歳を超える人々における肺炎球菌性肺炎の感染率は、１０万人あたり３〜８人と概算されている。これらのケースの２０％では、菌血症および髄膜炎のような症状に至り、抗生物質治療を用いているにも関わらず死亡率は３０％に近い。
肺炎球菌は、化学結合した多糖体の莢膜に入れられており、この多糖体が血清特異性を決定している。肺炎球菌には９０種の血清型が知られており、その莢膜が肺炎球菌の主要な病原性決定因子となっている。というのも、その莢膜は補体から細菌の内面を守るだけでなく、それ自体が殆ど免疫原性を持っていないからである。多糖体はＴ細胞非依存性抗原であるで、ＭＨＣ分子上でＴ細胞と相互作用するように抗原処理や抗原提示され得ない。しかしながら、多糖体はＢ細胞上の表面レセプターの架橋に関わる別の機構を通して、免疫系を刺激し得る。
侵襲性肺炎球菌による疾患の防御は、莢膜に特異的な抗原と最も強い相関関係があり、血清型に特異的であることがいくつかの実験により示されている。
【０００３】
多糖体抗原を用いるワクチンは当該分野でよく知られている。ヒトへの使用を認可されている４つのものとして、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）のＶｉ多糖体、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）由来のＰＲＰ多糖体、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹから成る４価髄膜炎菌ワクチン、ならびに血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３に対応する多糖体から成る２３価肺炎球菌ワクチン（少なくとも９０％の肺炎球菌を単離することによる）が挙げられる。
【０００４】
後者の３つのワクチンは、幼児における深刻な罹患率および死亡率を与える気道感染症を引き起こす細菌から保護するが、これらのワクチンは２歳未満の小児においては、この年齢のグループにおける免疫原性が不完全であるために、その使用が認可されていない［Peltola ら、(1984), N. Engl. J. Med. 310:1561-1566］。ストレプトコッカス・ニューモニエは幼児および小児における侵襲性細菌疾患および中耳炎の最も一般的な原因である。同様に、高齢者は肺炎球菌ワクチンに対する応答が乏しくなっており［Roghmannら、(1987), J. Gerontol. 42:265-270］、したがって、この人々において細菌性肺炎の罹患率が増加する［Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285］。
【０００５】
幼児において、この免疫原性の欠損を解決するよう考えられた方法は、多糖体類をラージ免疫原性蛋白に結合させることを含むものである。その蛋白は、バイスタンダー細胞である、Ｔ細胞の助けを与え、結合されている多糖体抗原に対する免疫学的記憶を誘導する。肺炎球菌糖蛋白接合ワクチンは、現在、種々の年齢層において、安全性、免疫原性および有効性に関して評価されている。
２３価の非結合肺炎球菌ワクチンは０％〜８１％という広く多様な範囲で臨床的有効性を示した（Fedsonら、(1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535）。その有効性は年配のホジキン病、脾臓摘出、鎌状赤血球、無ガンマグロブリン血症のような、免疫処理されるべき、危険性のあるグループと関連しているようであり（Fineら、(1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677）、更にはその患者の徴候にも関わっているように見える。その２３価のワクチンは（高齢者のようなあるハイリスクグループには）肺炎球菌性肺炎や中耳炎に対する防御を示さない。
したがって、改良肺炎球菌ワクチン組成物、特に高齢者および幼児における肺炎球菌疾患（特に肺炎）の防止または改善により効果的であるだろう改良肺炎球菌ワクチン組成物が必要とされている。
本発明は該改良ワクチンを提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原（好ましくは、蛋白担体に結合したもの）およびポリヒスチジントライアッドファミリー（Ｐｈｔ；例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥ）、Ｌｙｔファミリー（例えば、ＬｙｔＡ、ＬｙｔＢまたはＬｙｔＣ）、ＳｐｓＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物を、所望によりＴｈ１アジュバント（優先Ｔｈ１免疫応答を含むアジュバント）と共に含むワクチン組成物を提供する。好ましくは、肺炎球菌蛋白およびＴｈ１アジュバントの両方を含む。また、上記した本発明の肺炎球菌蛋白を互いに、および他の肺炎球菌と組み合わせて含む有利な組成物も記載する。本発明の組成物は、特に高齢者の肺炎の治療に適している。
【０００７】
肺炎球菌多糖体ワクチン（結合または非結合）は、肺炎の罹患率が非常に高い高齢者の人々における肺炎に対して保護することができない。肺炎球菌に対する主要な防御機構はオプソニン食菌作用（体液性Ｂ細胞／肺炎球菌多糖体に対する抗体の産生により引き起こされる好中球媒介事象、細菌が最終的に食菌される）であるが、オプソニン機構のいくつかの部分、すなわち、ＰＭＮ（多形核球細胞）、による過酸化物産生、他の活性酸素種産生、ＰＭＮの起動、ＰＭＮのアポトーシス、ＰＭＮの変形性は高齢者において十分に機能を果たさない。また、抗体も高齢者において十分に機能を果たすことができない。
【０００８】
通常受け入れられている定説とは反対に、正常なレベルの抗莢膜多糖体抗体は、肺炎球菌が宿主細胞に侵襲し免疫系のブランチを避けることができるので、細菌の完全なクリアランスに効果的でない。
意外にも、本発明は、免疫系の体液性ブランチ（Ｂ細胞媒介）に加えて免疫系の細胞媒介ブランチ（例えば、Ｔ細胞媒介免疫性）を同時に刺激することによる、相乗作用（または共同作用）により、宿主細胞からの肺炎球菌のクリアランスを増強させることができることを見出した。これは、一般的に肺炎球菌感染症の予防（または治療）を補助するであろうことの知見であるが、多糖体を用いるワクチンが効果を示さない高齢者における肺炎の予防（または治療）に関して特に重要であるだろう。
【０００９】
理論に縛られることなく、本発明者らは、肺炎球菌多糖体（好ましくは、蛋白担体に結合したもの）をＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３（感染哺乳類細胞の表面上のクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩに関連して、処理し、与えることができる蛋白）から成る群から選択される肺炎球菌蛋白と共に投与する場合、免疫系の両方の機構がかくのごとく相乗作用を与えることを見出した。１つまたはそれ以上のこれらの肺炎球菌蛋白はそれ自体細胞媒介免疫性を誘発できるが、本発明者らは、ワクチン処方中のＴｈ１含有アジュバントの存在がこの免疫系の機構を補助し、意外にも両方の免疫系の機構間の相乗作用を増強させることも見出した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、特に高齢者（および／または幼児および小児）の肺炎球菌感染症の防止または改善のための改良ワクチンを提供する。
本発明に関連して、患者が５５歳以上、典型的には６０歳を超える、より一般的には６５歳を超える年齢である場合、高齢者とみなす。
かくして、本発明の一の具体例において、高齢者（および／または幼児および小児）における使用に適した、少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０ａｎｄＳｐ１３３ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原（複数でも可）を含むワクチン組成物を提供する。ワクチンは、所望によりＴｈ１アジュバントを含んでいてもよい。
【００１１】
好ましい第２の具体例において、本発明は、少なくとも１つ（２、３、４、５、６，７、８、９または１０）のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原（複数でも可）およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原および好ましくはＴｈ１アジュバントを含むワクチン（高齢者における肺炎の予防に適当な）を提供する。
【００１２】
上記具体例において、有利には本発明の上記した肺炎球菌蛋白を互いに、および他の肺炎球菌蛋白と組み合わせて含むワクチンも以下に記載するように想定する。
また、ワクチンは幼児または小児のような他の高い危険性のある人々の群における肺炎球菌感染症（例えば、中耳炎）の治療においても有用であることが想定される。
【００１３】
本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原
典型的には、本発明のストレプトコッカス・ニューモニエワクチンは多糖体抗原（好ましくは、担体蛋白に結合したもの）を含み、ここに多糖体は少なくとも４つの肺炎球菌の血清型から誘導される。好ましくは、４つの血清型は、６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆを含む。より好ましくは、少なくとも７つの血清型、例えば血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来のものが組成物に含まれる。さらにより好ましくは、少なくとも１１の血清型が組成物に含まれ、例えば一の具体例における組成物は、１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ（好ましくは、担体蛋白に結合したもの）由来の莢膜多糖体を含む。本発明の好ましい具体例において、さらに多糖体抗原、例えば２３価（例えば抗原型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）も本発明により考えられるが、少なくとも１３の多糖体抗原（好ましくは、担体蛋白に結合したもの）が含まれる。
【００１４】
高齢者のワクチン接取（例えば、肺炎の予防）に関しては、血清型８および１２Ｆ（および最も好ましくはさらに１５および２２）を上記の１１価の抗原性組成物に含み、１５価ワクチンを形成することが有利であるのに対して、幼児または小児（中耳炎の不安がある）に関しては、有利には抗原型血清型６Ａおよび１９Ａが１３価ワクチンを形成するために含まれる。
上記多糖体は全長、天然の形態で用いることができるが、また免疫原性がある大きさを減少させた多糖体も用いることができることは理解されるだろう（例えば、ＥＰ４９７５２４および４９７５２５）。
【００１５】
高齢者（＋５５歳）の人々の肺炎および幼児（１８ヶ月まで）ならびに小児（典型的には１８ヶ月〜５歳）の中耳炎の予防／改善に関して、上記のような多価ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体とＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白またはその免疫学的機能等価物とを組み合わせることが本発明の好ましい具体例である。また、肺炎球菌蛋白の組み合わせも以下に記載のように有利に利用できる。
【００１６】
本発明の肺炎球菌蛋白
本発明の目的に関して、「免疫学的機能等価物」を本発明の蛋白由来の少なくとも１つの防御エピトープを含む蛋白のペプチドとして定義する。該エピトープは、特徴的には、表面が露出し、高保存性であり、宿主細胞の殺菌性抗体応答を誘発するか、または毒性作用を防止することができる。好ましくは、機能等価物は本発明の蛋白由来の少なくとも１５個および好ましくは３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸を有する。最も好ましくは、蛋白のフラグメント、欠失、例えばその膜貫通型欠失変異体（すなわち、蛋白の細胞外ドメインの使用）、融合、化学的または遺伝学的脱毒性誘導体等を用いることができるが、ただし天然の蛋白と同様の免疫応答を実質的に惹起させることができることが条件である。蛋白配列における可能性あるＢ細胞エピトープの位置は、表面が露出し、抗原性であるペプチドを、２つの方法：２Ｄ構造予測および抗原指標予測を組み合わせて用いて同定することにより容易に決定できる。２Ｄ構造予測はＰＳＩＰＲＥＤプログラム（David Jones, Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UKから入手）を用いて行うことができる。抗原性指標はJamesonおよびWolf（CABIOS 4:181-186 [1988]）により記載された方法に基いて計算できる。
【００１７】
本発明の蛋白は以下の蛋白、肺炎球菌の外部表面に曝された全てのもの（肺炎球菌の生活環の少なくとも一部の間に宿主の免疫系により認識され得るもの）または肺炎球菌により分泌されるか、または放出される蛋白である。
本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白は、好ましくはポリヒスチジントライアッドファミリー（Ｐｈｔ）由来の蛋白、Ｌｙｔファミリー由来の蛋白、コリン結合蛋白、ＬＰＸＴＦモチーフ（Ｘはいずれかのアミノ酸）、ＬＸＸＣ（Ｘはいずれかのアミノ酸）タイプＩＩシグナル配列モチーフを有する蛋白およびタイプＩシグナル配列モチーフを有する蛋白から成る群から選択される。これらのカテゴリー（またはモチーフ）の中の好ましい例は、以下の蛋白（またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物）である：
【００１８】
Ｐｈｔ（ポリヒスチジントライアッド）ファミリーはＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ蛋白を含む。このファミリーは、脂質化配列、プロリンに富む領域と金属またはヌクレオシドとの結合または酵素活性に関与している可能性のあるいくつかのヒスチジントライアッドにより分けられる二つのドメイン、（３−５）超らせん領域、保存されたＮ末端と異種Ｃ末端により特徴付けられている。これは検査された肺炎球菌の全ての系で存在した。同種の蛋白が、他の肺炎球菌とナイセリア属で発見された。このファミリーの好ましいメンバーはＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤを含む。より好ましくはＰｈｔＡ、ＰｈｔＤを含む。しかしながら、ＰｈｔＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅなる語は、下記の引用文献に開示されている配列を有する蛋白、ならびに対象となる蛋白と少なくとも９０％同一である配列相同性を有するその天然に存在する（および人工的な）変異体をいう、と解釈される。好ましくは少なくとも９５％同一、最も好ましくは９７％同一である。
Ｐｈｔ蛋白に関して、ＰｈｔＡはＷＯ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ３６とも言う。上記したように、これはポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。
【００１９】
ＰｈｔＤはＷＯ００／３７１０５に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄとも言う。上記したように、これもまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。
ＰｈｔＢはＷＯ００／３７１０５に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂとも言う。ＰｈｔＢファミリーのもう１つのメンバーはＣ３−分解ポリペプチドであり、ＷＯ００／１７３７０に開示されている。この蛋白もまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。好ましい免疫学的機能等価物は、ＷＯ９８／１８９３０に開示されているＳｐ４２蛋白である。ＰｈｔＢ末端切断物（おおよそ７９ｋＤ）はＷＯ９９／１５６７５に開示されており、ＰｈｔＸファミリーのメンバーであると考えられる。
ＰｈｔＥはＷＯ００／３０２９９に開示されており、ＢＶＨ−３と言う。
ＳｐｓＡはＷＯ９８／３９４５０に開示されているコリン結合蛋白（Ｃｂｐ）である。
【００２０】
Ｌｙｔファミリーは細胞溶解と関連する細胞膜結合蛋白である。Ｎ末端ドメインはコリン結合ドメインを含む。しかしながら、Ｌｙｔファミリーは、下記のコリン結合蛋白ファミリー（Ｃｂｐ）ファミリーにおいて見られる特徴をもっておらず、したがって本発明に関して、ＬｙｔファミリーはＣｂｐファミリーと異なると考えられる。Ｃｂｐファミリーとは対照的に、Ｃ末端ドメインはＬｙｔ蛋白ファミリーの触媒ドメインを含む。このファミリーはＬｙｔＡ、ＢおよびＣを含む。Ｌｙｔファミリーに関して、ＬｙｔＡはRondaら、Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)において開示されている。ＬｙｔＢはＷＯ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ４６とも言う。ＬｙｔＣもまたＷＯ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ９１とも言う。ファミリーの好ましいメンバーはＬｙｔＣである。
【００２１】
もう一つの好ましい具体例は、Ｌｙｔ末端切断物であり、「Ｌｙｔ」とは上記したとおりであり、「末端切断物」とはコリン結合領域の５０％またはそれ以上を欠く蛋白のことである。好ましくはそのような蛋白は全てのコリン結合領域を欠く。
Ｓｐ１２５はＬＰＸＴＧ（Ｘはいずれかのアミノ酸）の細胞壁固定モチーフを有する肺炎球菌表面蛋白の一例である。このモチーフを有する肺炎球菌表面蛋白のこの種の蛋白は全て、本発明の状況において有用であることが判り、そのため本発明の付加的な蛋白と見なされる。Ｓｐ１２５自体はＷＯ９８／１８９３０に開示されており、ＺｍｐＢ−亜鉛金属プロテイナーゼとして知られている。
Ｓｐ１０１はＷＯ９８／０６７３４（整理番号ｙ８５９９３）に開示されている。これはタイプＩシグナル配列によって特徴付けられる。
Ｓｐ１３３はＷＯ９８／０６７３４（整理番号ｙ８５９９２）に開示されている。これもまたはタイプＩシグナル配列によって特徴付けられる。
Ｓｐ１２８およびＳｐ１３０はＷＯ００／７６５４０に開示されている。
本発明において用いられる蛋白は、好ましくは、ＰｈｔＤおよびＰｈｔＡ群、またはこれらの両方の蛋白の組合せから選択される。
【００２２】
本発明の１つまたはそれ以上の肺炎球菌蛋白と他の肺炎球菌蛋白との有利な組合せ
本発明のワクチンにおいて、本発明の各々の上記した蛋白（好ましくは、ＰｈｔＤおよびＰｈｔＡのいずれかまたは両方）もまた１つまたはそれ以上の下記リスト：ニューモリシン（また、Ｐｌｙとも称される;好ましくは、化学処理または変異により弱化させる）［ＷＯ９６／０５８５９、ＷＯ９０／０６９５１、ＷＯ９９／０３８８４］、ＰｓａＡおよびその膜貫通型欠失変異体（Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62）、ＰｓｐＡおよびその膜貫通型欠失変異体（米国特許第５８０４１９３号、ＷＯ９２／１４４８８、ＷＯ９９／５３９４０）、Ｐｓｐその膜貫通型欠失変異体（ＷＯ９７／０９９９４、ＷＯ９９／５３９４０）、コリン結合蛋白（Ｃｂｐ）ファミリーの一員［例えば、ＣｂｐＡおよびその膜貫通型欠失変異体（ＷＯ９７／４１１５１；ＷＯ９９／５１２６６）］、 グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（Infect. Immun. 1996 64:3544)、ＨＳＯ７０（ＷＯ９６／４０９２８）、ＰｃｐＡ（Sanchez-Beatoら、FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14)、Ｍ様蛋白（ＳＢ特許出願番号ＥＰ０８３７１３０）および付着因子１８６２７（ＳＢ特許出願番号ＥＰ０８３４５６８）由来の蛋白と有利に組み合わせることができる。また、本発明は該蛋白（上記のような）の免疫学的機能等価物または末端切断物も含む。
【００２３】
コリン結合蛋白ファミリーに関して、このファミリーのメンバーは、コリンアフィニティクロマトグラフィーによって精製されることができた肺炎球菌蛋白として初めて同定された。コリン結合蛋白は全て、細胞壁のタイコ酸および細胞膜結合リポタイコ酸のホスホリルコリン部分と共有結合していない。構造的にこれらは、蛋白の正確な性質（アミノ酸配列、長さなど）は多様であるが、全てのファミリーに共通したいくつかの領域を有している。一般的に、コリン結合蛋白は、Ｎ末端領域、保存反復領域（Ｒ１および／またはＲ２）、プロリンに富む領域（Ｐ）、複数の反復配列で形成されており、この蛋白のおよそ二分の一を構成する保存コリン結合領域（Ｃ）を含む。本願明細書において使用されている「コリン結合蛋白ファミリー（Ｃｂｐ）」なる語は、ＷＯ９７／４１１５１で同定されているコリン結合蛋白であるＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＤ、ＣｂｐＧからなる群より選択される。ＣｂｐＡはＷＯ９７／４１１５１に開示されている。ＣｂｐＤとＣｂｐＧはＷＯ００／２９４３４に開示されている。ＰｓｐＣはＷＯ９７／０９９９４に開示されている。ＰｂｃＡはＷＯ９８／２１３３７に開示されている。好ましくは、コリン結合蛋白はＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣからなる群より選択される。
【００２４】
Ｃｂｐが利用できるさらなる蛋白である場合、これはＣｂｐ末端切断物であってもよく、ここに「Ｃｂｐ」は上記と同意義であり、「末端切断物」はコリン結合領域（Ｃ）の５０％またはそれ以上が欠失している蛋白を意味する。好ましくは、該蛋白は完全なコリン結合領域が欠失している。より好ましくは、該末端切断蛋白は（ｉ）コリン結合領域および（ｉｉ）蛋白のＮ末端の半分の一部を欠失しているが、少なくとも一つの反復領域を保持する（Ｒ１またはＲ２）。さらにより好ましくは、末端切断物は２つの反復領域を有する（Ｒ１とＲ２）。該好ましい具体例は、ＷＯ９９／５１２６６またはＷＯ９９／５１１８８に記載のようにＮＲ１ｘＲ２およびＲ１ｘＲ２であるが、類似のコリン結合領域が欠失している他のコリン結合蛋白もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
また、Ｃｂｐ末端切断物−Ｌｙｔ末端切断物キメラ蛋白（または融合蛋白）も本発明のワクチンに用いることができる。好ましくは、これはＣｂｐのＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）およびＬｙｔ（例えば、ＬｙｔＣＣ末端またはＳｐ９１Ｃ末端）のＣ末端部（Ｃ末端、すなわちコリン結合領域が欠失している）を含む。より好ましくは、ＣｂｐはＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣから成る群から選択される。さらにより好ましくはＣｂｐＡである。好ましくは、ＬｙｔはＬｙｔＣ（Ｓｐ９１とも言う）である。
コリン結合領域（Ｃ）が欠失しており、Ｌｙｔとの融合蛋白として発現されるＰｓｐＡまたはＰｓａＡ末端切断物も用いることができる。好ましくは、ＬｙｔはＬｙｔＣである。
【００２６】
本発明の目的の肺炎球菌蛋白の好ましい組合せ
好ましくは、本発明の蛋白の組合せは、２またはそれ以上（３または４）の異なるカテゴリー、例えばＬＸＸＣ（Ｘはいずれかのアミノ酸、例えばポリヒスチジントライアッドファミリー（Ｐｈｔ））のタイプＩＩシグナル配列モチーフ、コリン結合蛋白（Ｃｂｐ）、タイプＩシグナル配列モチーフ（例えば、Ｓｐ１０１）を有する蛋白、ＬＰＸＴＧモチーフ（Ｘはいずれかのアミノ酸、例えばＳｐ１２８、Ｓｐ１３０）を有する蛋白、毒素（例えばＰｌｙ）等から選択される。これらのカテゴリー（またはモチーフ）の中の好ましい例は、上記した蛋白、またはその免疫学的機能等価物である。毒素＋Ｐｈｔ、毒素＋Ｃｂｐ、Ｐｈｔ＋Ｃｂｐおよび毒素＋Ｐｈｔ＋Ｃｂｐが好ましいカテゴリーの組合わせである。
【００２７】
好ましい有利な組合せは、限定するものではないが、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端キメラまたは融合蛋白、ＰｈｔＤ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＤ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＤ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＤ＋ＰｓｐＡ、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端キメラまたは融合蛋白、ＰｈｔＡ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＡ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＡ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＡ＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、Ｒ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＡを含む。好ましくは、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣ由来である。より好ましくは、ＣｂｐＡ由来である。
肺炎球菌蛋白の特に好ましい組合せは、Ｐｌｙ（またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物）＋ＰｈｔＤ（またはその末端切断物もしくは免疫学的機能等価物）＋ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）を含む。好ましくは、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣ由来である。より好ましくは、ＣｂｐＡ由来である。
【００２８】
理論に縛られることなく、組成物中の本発明の肺炎球菌蛋白（または上記した組合せ）は、肺炎球菌による侵襲を阻害するための免疫系の体液性ブランチと協力する、肺炎球菌疾患−特に肺炎に対する保護を必要とする−に対するＴ細胞媒介応答を誘発すること、およびオプソニン食菌作用を刺激することに役立ち得る。蛋白抗原を含むことのさらなる利点は、オプソニン食菌作用プロセスに関するさらなる抗原を提示することである。
【００２９】
したがって、本発明の具体例において、少なくとも４の血清型、好ましくは少なくとも７の血清型、より好ましくは少なくとも１１の血清型由来の多糖体抗原を含む肺炎球菌多糖体接合ワクチン、およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３（または上記のような肺炎球菌蛋白組合せ）から成る群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２、３または４）のストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白を含むストレプトコッカス・ニューモニエワクチンを提供する。好ましくは、蛋白の１つはＰｈｔＡ（またはその免疫学的機能等価物）である。最も好ましくは、蛋白の１つはＰｈｔＤ（またはその免疫学的機能等価物である。
【００３０】
上記したように、ワクチン接種への多糖体の用い方に関連した問題は、多糖体それ自体は免疫原性に乏しいという事実である。これを解決するため、多糖体をバイスタンダー細胞であるＴ細胞の助けを付与する蛋白キャリアに結合させてもよい。そのため、本発明で利用される多糖体はそのような蛋白キャリアに結合されていることが好ましい。現在、一般的に多糖体の免疫原性を生むために使われる、そのような蛋白の例として、ジフテリアとテターヌストキソイド（ＤＴ、ＤＴ ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、エヌ・メニンジティディス由来のＯＭＰＣ、ツボクラリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）が挙げられる。
【００３１】
肺炎球菌多糖体を用いる免疫原性組成物（またはワクチン）のための他の担体は、ヘモフィルス・インフルエンザ（ＥＰ５９４６１０−Ｂ）由来の蛋白Ｄ、またはそのフラグメントである。使用に適したフラグメントはヘルパーＴ細胞エピトープを含むフラグメントである。特に、蛋白Ｄフラグメントは、好ましくは、蛋白のＮ末端３分の１を含むであろう。蛋白Ｄ担体は、意外にも、多肺炎球菌多糖体抗原が結合しているワクチンにおける担体として有用である。エピトープ抑制は、通常には、同様の担体が各々の多糖体に対して用いられる場合に生じやすい。意外にも、本発明者らは、蛋白Ｄが、特に、組合せワクチンにおける該エピトープ抑制効果を最小限にするのに適していることを見出した。組合せ中の１つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖体は、蛋白Ｄ上に有利に結合でき、好ましくはすべての抗原は、該組合せワクチンにおいて蛋白Ｄに結合している。
肺炎球菌多糖体に関するさらに好ましい担体は、肺炎球菌蛋白それ自体（「本発明の肺炎球菌蛋白」の節に上記したような）である。
多糖体は、あらゆる既知の方法（例えば、Likhiteによる米国特許第４，３７２，９４５号およびArmorらによる米国特許第４，４７４，７５７号）によって、キャリア蛋白に結合させることができる。好ましくは、ＣＤＰＡ結合を行う（ＷＯ９５／０８３４８）。
好ましくは、結合の蛋白：多糖体（重量：重量）比は、０．３：１〜１：１、より好ましくは０．６：１〜０．８：１および、最も好ましくは約０．７：１である。
本発明のワクチンはアジュバント処理されていることが好ましい。適当なアジュバントは水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩を含むが、カルシウム、マグネシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化されたチロシン、アシル化された糖、陽イオンまたは陰イオンに誘導された多糖体、ポリフォスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
アジュバントは、免疫応答の細胞媒介ブランチを補助するためにＴＨ１型反応の優先的誘発因子であるように選ばれることが好ましい。
【００３２】
本発明のＴＨ１アジュバント
高レベルなＴｈ１型サイトカインは、与えられた抗原に対して細胞性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にあるが、高レベルなＴＨ２型サイトカインは、抗原に対して体液性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にある。
Ｔｈ１型、Ｔｈ２型免疫反応の区別は確固としたものでないことを認識することが重要である。現実には、個人は、優勢的にＴｈ１であると、または優勢的にＴｈ２であるとして記載される免疫反応を支持する。しかしながら、MosmannとCoffmanにより、ネズミＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンに記載されているサイトカインである点から、サイトカインファミリーを考察することが好都合であることが多い（Mosmann,T.RおよびCoffman,R.L (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lympholine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology,７、145‐173頁）。伝統的に、Ｔｈ１型反応は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γとＩＬ−２サイトカインの産生と関連している。Ｔｈ１型免疫反応の誘発としばしば直接的に関連している、ＩＬ−１２のような他のサイトカインは、Ｔ細胞によって産生されない。対照的に、Ｔｈ２型反応は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連している。Ｔｈ１反応を優勢的に促進する適当なアジュバントは、モノホスホリル脂質Ａまたはその誘導体、特に３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製についてのＧＢ２２２０２１１Ａを参考のこと）、およびモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと、アルミニウム塩（例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）または水中油型エマルジョンの一方との組み合わせを包含する。そのような組み合わせにおいては、抗原と３Ｄ−ＭＰＬは同じ粒状構造物中に含まれ、抗原性シグナルと免疫刺激シグナルのより効率的なデリバリーを可能とする。研究によると、３Ｄ−ＭＰＬはミョウバン吸着抗原の免疫原性を一層亢進することができる。［Thoelenら、Vaccine（1998）16:708-14;ＥＰ６８９４５４−Ｂ１］
【００３３】
亢進された系は、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組み合わせ、特にＷＯ９４／００１５３に開示されているようにＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされた小さい反応原性組成物を包含する。
水中油型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に効力のあるアジュバントの処方は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されており、好ましい処方である。
好ましくは、ワクチンは付加的にサポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。処方はまた、水中油型エマルジョンとトコフェロールを含む（ＷＯ９５／１７２１０）。
本発明はまた、本発明の蛋白と３Ｄ−ＭＰＬのような医薬上許容される賦形剤との混合よりなるワクチンの産生の方法を与える。
オリゴヌクレオチドを含む非メチル化ＣｐＧ（ＷＯ９６／０２５５５）はまた、ＴＨ１反応の優先誘発因子であり、本発明の利用に適している。
【００３４】
本発明の特に好ましい組成物は、１つまたはそれ以上の結合肺炎球菌多糖体、１つまたはそれ以上の本発明の肺炎球菌蛋白およびＴｈ１アジュバントを含む。理論に縛られることなく、肺炎球菌蛋白（上記した）による細胞媒介応答の惹起および両免疫系の機構の間の共同作用はＴｈ−１アジュバントを用いて補助することができ、その結果、高齢者における、一般的には肺炎球菌疾患に対して、および重要には、肺炎球菌ニューモニエに対して特に効果的なワクチンを与える。
【００３５】
本発明のさらなる態様において、医薬において用いるためのイムノゲンまたは上記したワクチンを提供する。
一の具体例において、高齢者（＋５５歳）における肺炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量の本明細書に記載のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される肺炎球菌蛋白および所望によりＴｈ１アジュバントを含むワクチンを該高齢者に投与することを含む方法を提供する。
さらなる具体例において、幼児（１８ヶ月まで）または小児（典型的には１８ヶ月〜５歳）における中耳炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、ならびに所望によりＴｈ１アジュバントを含むワクチンを該幼児または小児に投与することを含む方法を提供する。
好ましくは、上記したような本明細書の方法において、多糖体抗原は多糖体蛋白接合物として存在する。
【００３６】
本発明のワクチンの調製法
本発明のワクチン調製物は、当該ワクチンを全身性または粘膜性経路を介して投与することにより、感染に感受性の哺乳類（好ましくはヒト患者）を保護または治療するために使われる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介する注射、経口／食事、呼吸、尿生殖器への粘膜投与を含む。（肺炎球菌の鼻咽頭での運搬はより効果的に妨げられ、そのためその初期段階で感染を減衰できるため）肺炎または中耳炎を治療するのにワクチンを鼻内投与することが好ましい。本発明のワクチンは単回用量として投与されるが、その成分はまた同時に、または違う時に投与することもできる（例えば、肺炎球菌多糖体は、同時に、または互いに関して免疫反応が最も良く協調するワクチンの細菌蛋白成分を投与した後１−２週間で別個に投与できる）。共投与に関しては、所望によるＴｈ１アジュバントは、異なる投与のいずれかまたはすべてにおいて存在できるが、ワクチンの細菌蛋白成分との組み合わせで存在することが好ましい。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を利用してもよい。例えば、ウイルス性抗原はＩＤ（皮内）投与され、一方細菌蛋白はＩＭ（筋肉内）またはＩＮ（鼻内）投与することができる。多糖体はＩＭ（またはＩＤ）投与され、細菌蛋白はＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。加えて、本発明のワクチンは、初回抗原用量としてＩＭ投与され、追加抗原用量としてＩＮ投与され得る。
【００３７】
各ワクチン中の結合抗原の量は、典型的なワクチン中で有意な副作用がなく免疫防御反応を誘発する量として選ばれる。そのような量は、どの特定の免疫原が利用され、どのように提示されたかによって異なる。一般的には、各々の投与量は、０．１〜１００μｇの多糖体、好ましくは０．１〜５０μｇ、好ましくは０．１〜１０μｇを含み、１〜５μｇが最も好ましい範囲であるだろうことが考えられる。
ワクチン中の蛋白抗原の含有量は、典型的には１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、最も典型的には５〜２５μｇの範囲である。
特定のワクチンの成分の最適量は、対象での適当な免疫反応を観察することを含む標準的な実験で確かめることができる。最初のワクチン接種に続いて、対象は適当に時間を置いて一つまたはいくつかの追加抗原免疫処置を受ける。
ワクチン調製物は一般的にVaccine Designに記載されている（「The subunit and adjuvant approach」（Power M.F.およびNewman M.J.編）（１９９５）Plenum Press New York）。リポソーム内での莢膜化はFullertonの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。
【００３８】
本発明のワクチンはどんな経路でも投与されるが、本発明のワクチンの皮膚への投与（ＩＤ）は、本発明の一つの具体例を形成している。ヒトの皮膚は、角質層と呼ばれる、外側の「角質」表皮を含み、それが表皮の表面を覆っている。この表皮の真下が真皮と呼ばれる層で、これが順次皮下組織を覆っている。研究者は、皮膚、特に真皮へのワクチンの注射は免疫反応を刺激し、それは多くの付加的な有利性と関連していることを示している。本明細書に記載のワクチンでの皮内へのワクチン接種は、本発明の好ましい特徴を形成している。
皮内注射の従来の技術である「マントー処置」は、皮膚の洗浄、そして一方の手を伸ばし、狭いゲージの針（２６−３１ゲージ）の斜面を上に向けて、１０−１５°の間の角度で針を挿入するという工程を含む。いったん針の斜面が挿入されたら、針の筒は押し下げ、針が皮下に入っていくように小さい圧力を与えつつさらに押し進める。それから液体を極めてゆっくりと注入し、それによって皮膚の表面に小気泡または衝撃を形成させ、続いて針をゆっくりと抜く。
【００３９】
さらに最近では、液体作用薬を皮膚中または皮膚を横切って投与するよう特別に設計された装置が記載されており、例えばＷＯ９９／３４８５０とＥＰ１０９２４４４で記載されている装置や、また例えばＷＯ０１／１３９７７、米国特許第５,４８０,３８１号、米国特許第５,５９９,３０２号、米国特許第５,３３４,１４４号、米国特許第５,９９３,４１２号、米国特許第５,６４９,９１２号、米国特許第５,５６９,１８９号、米国特許第５,７０４,９１１号、米国特許第５,３８３,８５１号、米国特許第５,８９３,３９７号、米国特許第５,４６６,２２０号、米国特許第５,３３９,１６３号、米国特許第５,３１２,３３５号、米国特許第５,５０３,６２７号、米国特許第５,０６４,４１３号、米国特許第５,５２０,６３９号、米国特許第４,５９６,５５６号、米国特許第４,７９０,８２４号、米国特許第４,９４１,８８０号、米国特許第４,９４０,４６０号、ＷＯ９７／３７７０５、ＷＯ９７／１３５３７で記載されているジェット式注射装置である。ワクチン調製物の皮内投与の代替的な方法は、従来のシリンジと針、固形ワクチンの弾道デリバリー（ＷＯ９９／２７９６１）のために設計された装置、経皮的なパッチ（ＷＯ ９７／４８４４０、ＷＯ９８／２８０３７）、皮膚の表面への塗布（経皮的デリバリー、ＷＯ９８／２０７３４、ＷＯ９８／２８０３７）を含む。
【００４０】
本発明のワクチンが皮膚に投与された場合、またはより具体的には真皮に投与された場合、ワクチンは、液体容量が小さく、特に約０．０５ｍｌと０．２ｍｌの間の容量である。
皮膚にある抗原の含量、または本発明の皮内用ワクチンの含量は、筋肉内ワクチン（上記参照）で見られる従来の用量と類似していてもよい。しかしながら、処方を「低用量」としうることが皮膚または皮内用ワクチンの特徴である。そのため、好ましくは「低用量」のワクチン中の蛋白抗原は、用量当たり０．１から１０μｇ、好ましくは０．１から５μｇとほとんど配合されない。多糖体（好ましくは接合体）抗原は用量当たり多糖体が０．０１〜１μｇ、そして好ましくは０．０１μｇと０．５μｇの間の範囲で存在する。
本明細書で使用されるように、「皮内デリバリー」なる語は、皮膚の真皮の領域にワクチンをデリバリーすることを意味する。しかしながら、ワクチンは必ずしも真皮に独占的にある必要はない。真皮は、ヒトの皮膚の表面から約１．０ｍｍと約２．０ｍｍの間に位置する皮膚の層であるが、個体によって、および体の異なる部位によってある程度の違いがある。一般的に、皮膚の表面の下１．５ｍｍ行くことで真皮に達すると考えられる。真皮は、表面の角質層、表皮と下にある皮下層の間に位置する。デリバリーの形態によって、ワクチンは最終的に単独でまたは優位的に真皮内に位置し、または最終的に表皮と真皮内において分配される。
【００４１】
本発明はまた、一連の異なる病原体に対して防御を与える混合ワクチンを意図する。多くの小児ワクチンは、現在、子供が受けねばならない注射の数を減らすために混合型ワクチンとして投与される。かくして、小児用ワクチンの場合、他の病原体由来の他の抗原を本発明のワクチンと共に処方することができる。例えば、本発明のワクチンは、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、テターヌストキソイド（ＴＴ）、百日咳菌成分［典型的には任意のペルタクチン（ＰＲＮ）および／または凝集素１＋２により無毒化された百日咳菌毒素（ＰＴ）と糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）］を含む、例えばＤＴ、ＴＴ、ＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮ抗原を含む市販ワクチンINFANRIX−DTPa（登録商標）（SmithKlineBeecham Biologicals）などの、周知の３価混合ワクチンと共に、または例えば、Tritanrix（登録商標）SmithKlineBeecham Biologicalsにより市販されているような全細胞百日咳菌ワクチンと共に、処方（または別々ではあるが同時に投与）され得る。混合ワクチンはまた、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）、ポリオウイルス抗原（例えば不活化３価ポリオウイルスであるＩＰＶ）、モラクセラ・カタラーリス膜外蛋白、分類不可能な特異的ヘモフィルス・インフルエンザ蛋白、髄膜炎菌Ｂ膜外蛋白のような他の抗原も含むことができる。
【００４２】
（特に中耳炎の予防の為の）混合ワクチンに配合することができるモラクセラ カタラーリス蛋白抗原の好ましい例は、ＯＭＰ１０６［ＷＯ ９７／４１７３１（Ａｎｔｅｘ）とＷＯ ９６／３４９６０（ＰＭＣ）］、ＯＭＰ２１、ＬｂｐＡおよび、またはＬｂｐＢ［ＷＯ ９８／５５６０６（ＰＭＣ）］、ＴｂｐＡおよび、またはＴｂｐＢ［ＷＯ ９７／１３７８５とＷＯ ９７／３２９８０（ＰＭＣ）］、ＣｏｐＢ［Ｈｅｌｍｉｎｅｎ ＭＥら（１９９３）Infect Immun６１：２００３−２０１０］、ＯｍｐＣＤ、ＨａｓＲ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２４）、ＰｉｌＱ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２３）、ＯＭＰ８５（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１４６８）、ｌｉｐｏ０６（ＧＢ９９１７９７７．２）、ｌｉｐｏ１０（ＧＢ９９１８２０８．１）、ｌｉｐｏ１１（ＧＢ９９１８３０２．２）、ｌｉｐｏ１８（ＧＢ９９１８０３８．２）、Ｐ６（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）、Ｄ１５（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２２）、Ｏｍｐ１Ａ１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６７８１）、Ｈｌｙ３（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）、ＯｍｐＥである。（特に中耳炎の予防の為の）混合ワクチンに配合することができる非特異的ヘモフィルス インフルエンザ抗原の例は、フィンブリン蛋白［（ＵＳ５７６６６０８−オハイオ州研究財団）］とそこから得られるペプチドよりなる融合蛋白［例えばＬＢ１（ｆ）ペプチド融合蛋白；ＵＳ５８４３４６４（ＯＳＵ）またはＷＯ ９９／６４０６７］、ＯＭＰ２６[ＷＯ ９７／０１６３８(Ｃｏｒｔｅｘ)]、Ｐ６［ＥＰ２８１６７３（ニューヨーク州立大学）］、ＴｂｐＡおよび、またはＴｂｐＢ、Ｈｉａ、Ｈｓｆ、Ｈｉｎ４７、Ｈｉｆ、Ｈｍｗ１、Ｈｍｗ２、Ｈｍｗ３、Ｈｍｗ４、Ｈａｐ、Ｄ１５（ＷＯ ９４／１２６４１）、蛋白Ｄ（ＥＰ５９４６１０）、Ｐ２、Ｐ５（ＷＯ ９４／２６３０４）である。
【００４３】
意図される他の組み合わせは、本発明の肺炎球菌ＰＳ＆蛋白と、例えばインフルエンザ（弱毒化された、スプリットまたはそのサブユニット［例えば、表面糖蛋白ノイラミニダーゼ（ＮＡ）と赤血球凝集素（ＨＡ）。例えばChaloupka IらEur.Journal Clin.Microbiol.Infect.Dis.1996,１５：１２１−１２７を参考のこと］）、ＲＳＶ（例えば、ＦとＧ抗原またはＦ／Ｇ融合蛋白。例えばSchmidt A.Cら、J Virol,May2001,P4594-4603を参考のこと）、ＰＩＶ３（例えば、ＨＮとＦ蛋白。前掲のSchmidtらを参考のこと）、水痘ウイルス（例えば弱毒化されたもの、糖蛋白Ｉ―Ｖなど）、ＭＭＲ（麻疹、おたふく風邪、風疹）のいずれかの（または全ての）成分からのウイルス性抗原との組合せである。
【００４４】
中耳炎の治療または予防に関して本発明により意図される好ましい小児用組合せは、１つまたはそれ以上のストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原（複数でも可）（好ましくは蛋白Ｄに結合したもの）、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される１つまたはそれ以上の肺炎球菌（またはその免疫学的機能等価物）、および１つまたはそれ以上のモラクセラ・カタラーリスおよび／または分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザからの表面露出抗原を含む。蛋白Ｄは、それ自体、分類不可能なエイチ・インフルエンザ（ｎｔＨｉ）に対するＢ細胞媒介保護を産生できるイムノゲンであるので、有利には、肺炎球菌多糖体に関する蛋白担体として用いることができ、エピトープ抑制問題（上記した）を解決できる。モラクセラ・カタラーリスおよび／または分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ抗原は、サブユニット形態のワクチンに含まれることができ、または細菌由来の外膜小胞（ｂｌｅｂｓ）の表面に存在する抗原として添加してもよい。
【００４５】
好ましくは、上記した抗原性組成物（およびワクチン）は、使用直前まで凍結乾燥され、その時点で即時に希釈剤で復元される。より好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの存在下で凍結乾燥され、即時に食塩水溶液で復元される。別法として、蛋白および多糖体は、ワクチン接取キット（成分のいずれか、または両方を凍結乾燥する）中に別個に貯蔵してもよく、使用前に復元して混合してもよく、または患者に別に投与してもよい。Ｔｈ１アジュバント（好ましくは３Ｄ−ＭＰＬ）は、成分のいずれかまたは両方と共に存在できる。
【００４６】
ワクチンの凍結乾燥は、当該分野においてよく知られている。典型的には、液体ワクチンは、例えばシュークロースやラクトースのような糖（初期濃度は１０〜２００ｍｇ／ｍＬ）などの固化防止剤の存在下で凍結乾燥される。凍結乾燥は、典型的には、一連の工程、例えば、６９℃で始まり、徐々に３時間かけて−２４℃とし、それからこの温度を１８時間保持し、徐々に１時間かけて−１６℃とし、この温度を６時間保持し、徐々に３時間かけて＋３４℃とし、最終的にこの温度を９時間保持する、一のサイクルで起る。
組成物を凍結乾燥するとより安定な組成物（例えば、多糖体抗原の崩壊が防止される）となる。また、意外にも、この処理は肺炎球菌多糖体に対する高い抗体力価の原因である。このことは、特にＰＳ ６Ｂ結合が十分であることを示している。したがって、本発明の別の態様は、３Ｄ−ＭＰＬとのＰＳ ６Ｂ接合アジュバント（好ましくは、アルミニウム基材アジュバントを避ける）およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される肺炎球菌蛋白を含む凍結乾燥した抗原性組成物である。
【実施例】
【００４７】
実施例は本発明を説明するためのものであって、限定するものではない。
【００４８】
実施例１
エス・ニューモニエ莢膜多糖体
１１価の候補ワクチンは、実質的にＥＰ７２５１３に記載されているように調製した莢膜多糖体血清型１、３、４、５、６Ｂ，７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆを含む。各々の多糖体を活性化し、ＣＤＡＰ化学（ＷＯ９８／０８３４８）を用いて誘導体化し、蛋白担体に結合させる。すべての多糖体は、血清型３（これはその粘度を減少させるために大きさを小さくした）を除いてそれらの天然の形態で結合する。
【００４９】
蛋白担体：
選択した蛋白担体は分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザから、イー・コリで発現した組換え蛋白Ｄ（ＰＤ）である。
【００５０】
蛋白Ｄの発現
ヘモフィルス・インフルエンザＤ
蛋白Ｄ発現に関する遺伝学的構築
出発物質
ＤＮＡをコードする蛋白Ｄ
蛋白Ｄはすべての血清型および分類不可能な株のエイチ・インフルエンザの中に多く貯蔵される。完全な蛋白Ｄ遺伝子をＤＮＡ配列を含むｐＨＩＣ３４８ベクターは、Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Swedenから得る。蛋白ＤのＤＮＡ配列は、Janson ら(1991) Infect. Immun. 59: 119-125により公にされている。
【００５１】
発現ベクターｐＭＧ１
発現ベクターｐＭＧ１は異質挿入遺伝子の転写および翻訳に関する制御要素由来のバクテリオファージλを取り込んだｐＢＲ３２２の誘導体（Grossら、1985）である。加えて、アンピシリン耐性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子と交換された。
【００５２】
イー・コリ株ＡＲ５８
イー・コリ株ＡＲ５８Ｎ９９をＳＡ５００誘導体（galE::TN10、ラムダKil- cI857 ΔH1）でのＰ１ファージストック予備増殖で形質導入することにより生産した。Ｎ９９およびＳＡ５００は国立保健研究所のDr. Martin Rosenbergの研究室から由来のイー・コリＫ１２株である。
【００５３】
発現ベクターｐＭＧ１
蛋白Ｄの産生に関して、蛋白をコードするＤＮＡは発現ベクターｐＭＧ１にクローン化される。このプラスミドは挿入された異質遺伝子の複写および翻訳を誘発するラムダファージＤＮＡからのシグナルを利用する。ベクターはプロモーターＰＬ、オペレーターＯＬおよび２つの利用部位（ＮｕｔＬおよびＮｕｔＲ）を含み、Ｎ蛋白が供給される場合、転写極性効果を軽減する（Grossら、1985）。ＰＬプロモーターを含むベクターはイー・コリ溶原性宿主に誘導され、プラスミドＤＮＡを安定化させる。溶原性宿主株はゲノムを取り入れた複製欠損ラムダファージＤＮＡを含む（Shatzmanら、1983）。染色体ラムダファージＤＮＡは、ベクターのＯＬリプレッサーに結合しリプレッサー蛋白の合成を導き、ＲＮＡポリメラーゼがＰＬプロモーターに結合して、それにより挿入された遺伝子の転写を防止する。発現株ＡＲ５８のｃＩ遺伝子は、温度感受性変異体を含み、したがって、転写を指示されるＰＬは温度変化により制御することができ、すなわち、培養温度を増加させることによりリプレッサーを不活性化し、異質蛋白の合成が開始される。この発現系は、特に、細胞への毒性があり得るこれらの異質蛋白の制御された合成を可能にする（Shimataka & Rosenberg, 1981）。
【００５４】
イー・コリ株ＡＲ５８
蛋白Ｄ担体の産生に用いられるＡＲ５８溶原性イー・コリ株は、標準ＮＩＥイー・コリＫ１２株Ｎ９９（F- su- galK2、lacZ- thr-）の誘導体である。これは欠損溶原性ラムダファージ（galE::TN10、ラムダKil- cI857 ΔH1）を含む。Ｋｉｌ−表現型は宿主マクロ分子合成の遮断を妨げる。ｃＩ８５７変異体は、温度感受性障害をｃＩリプレッサーに与える。ΔＨ１欠失は、ラムダファージライトオペロンおよび宿主バイオ、ｕｖｒ３、およびｃｈｌＡ座を排除する。ＡＲ５８株をＳＡ５００誘導体（galE::TN10、ラムダKil- cI857 ΔH1）でのＰ１ファージストック予備増殖で形質導入することにより生産した。欠損溶原のＮ９９への導入は、近接したｇａｌＥ遺伝子にテトラサイクリン耐性に関するＴＮ１０トランスポゾンコーディングの存在の効力によりテトラサイクリンで選択された。
【００５５】
ｐＭＧＭＤＰＰｒＤベクターの構築
インフルエンザウイルス（ｐＭＧＮＳＩ）の非構造的Ｓ１蛋白をコードする遺伝子を含むｐＭＧ１ベクターをｐＭＧＭＤＰＰｒＤを構築するために用いた。蛋白Ｄ遺伝子は、ｐＨＩＣ３４８ベクター（Jansonら、1991）から各々５’および３’末端でのＮｃｏＩおよびＸｂａＩ制限部位を含むＰＣＲプライマーでＰＣＲすることにより増幅させた。ついで、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩフラグメントをＮｃｏＩとＸｂａＩの間のｐＭＧＮＳ１に導入し、かくしてＮＳ１蛋白のＮ末端の８１個のアミノ酸ついでＰＤ蛋白を含む融合蛋白を作成した。このベクターは標識ｐＭＧＮＳ１ＰｒＤである。
【００５６】
上記した構築物に基いて、蛋白Ｄ発現の最終的な構築物を生成した。ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをｐＭＧＮＳ１ＰｒＤから除去した。このＤＮＡ加水分解は、最初の３つのＮ末端残基意外のＮＳ１コーディング領域を除去した。ベクターの再ライゲーションで、続くＮ末端アミノ酸配列で融合蛋白をコードする遺伝子を生成した：
-----ＭＤＰ ＳＳＨＳＳＮＭＡＮＴ-----
ＮＳ１ 蛋白Ｄ
【００５７】
蛋白Ｄは脂質鎖が正常に結合しているリーダーペプチドまたはＮ末端システインを含まない。したがって、該蛋白はペリプラズムに排泄されることも、脂質化されることもなく、可溶性形態の細胞質中に保持される。
最終構築物ｐＭＧ−ＭＤＰＰｒＤをＡＲ５８宿主株に、３７℃で貯蔵物を加熱することより導入する。細菌を含むプラスミドをカナマイシンの存在下で選択した。蛋白ＤコーディングＤＮＡ挿入の存在が、単離されたプラスミドＤＮＡを選択されたエンドヌクレアーゼで消化することにより示された。組換えイー・コリ株はＥＣＤ４として称される。
蛋白Ｄの発現はラムダＰＬプロモーター／ＯＬオペレーターの制御下で行う。宿主株ＡＲ５８は、温度感受性ｃＩ遺伝子を、ＯＬに結合することによる低温度でのラムダＰＬからの発現を遮断するゲノム中に含む。一旦温度を上げると、ｃＩはＯＬから放出され、蛋白Ｄが発現される。発酵の最後で、細胞を濃縮し、冷凍する。
【００５８】
収穫した細胞からの抽出および蛋白Ｄの精製は以下のように行った。冷凍細胞培養ペレットを解凍し、細胞破壊溶液中（クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）に再懸濁させ、最終的なＯＤ６５０＝６０とした。懸濁液をＰ＝１０００バールで高圧ホモジナイザーに２回通した。細胞培養ホモジネートを遠心分離により浄化し、細胞の破片を濾過により除去する。第１の精製工程において、濾過した溶解物をカチオン交換クロマトグラフィーカラム（SP Sepharose Fast Flow）に付す。ＰＤをゲルマトリックスにイオン相互作用により結合させ、溶出緩衝液のイオン強度を増加させる工程により溶出する。
第２の精製工程において、不純物をアニオン交換マトリックス（Q Sepharose Fast Flow）に保持させる。ＰＤはゲルに結合せず、通りぬけた液体中に回収することができる。
両方のカラムクロマトグラフィー工程において、フラクション回収物をＯＤによりモニターする。アニオン交換カラムクロマトグラフィーの精製蛋白Ｄを含む通りぬけた液体を限外濾過により濃縮する。
限外濾過保有物を含む蛋白Ｄを最終的に０．２μｍの膜に通す。
【００５９】
化学：
活性化およびカップリング化学：
活性化およびカップリング化学は各々の多糖体に固有のものである。これらを表１に示す。天然の多糖体（ＰＳ３を除く）を２ＭのＮａＣｌまたは注射用水に溶解した。最適多糖体濃度をすべての血清型に関して評価した。
アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌの貯蔵物から、ＣＤＡＰ（ＣＤＡＰ／ＰＳ比０．７５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ）を多糖体溶液に加えた。１．５分後、０．２Ｍのトリエチルアミンを加え、特定の活性化ｐＨを得た。多糖体の活性化は、このｐＨで２分間２５℃で行った。蛋白Ｄ（質量は初期ＰＳ／ＰＤ比に依存する）を活性化多糖体に加え、カップリング反応を特定のｐＨで１時間行った。ついで、反応を、グリシンで３０分間２５℃および４℃で一晩でクエンチした。
結合物を２ＭのＮａＣｌで平衡化したSephacryl 500HRゲル濾過カラムを用いてゲル濾過により精製した。
溶出したフラクションの炭水化物および蛋白含有量を測定した。結合物をプールし、０．２２μｍの滅菌膜で滅菌濾過した。結合調製物のＰＳ／蛋白比を測定した。
【００６０】
特徴付け：
各々の結合物を特徴付け、表２に記載した詳細に対応させた。多糖体含有量（μｇ／ｍｌ）をResorcinol試験により、および蛋白含有量（μｇ／ｍｌ）をLowly試験により測定した。最終ＰＳ／ＰＤ比（ｗ／ｗ）を濃度の比により測定する。
【００６１】
残余ＤＭＡＰ含有量（ｎｇ／ｎｇ ＰＳ）：
多糖体のＣＤＡＰでの活性化は多糖体中のシアネート基を誘導し、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノ−ピリジン）を遊離させる。残余ＤＭＡＰ含有量をＳＢで開発された特定のアッセイにより測定した。
【００６２】
遊離多糖体含有量（％）：
４℃に維持するか、または３７℃で７日保存した結合物の遊離多糖体含有量を、α−ＰＤ抗体および飽和硫酸アンモニウムでインキュベートし、ついで遠心分離して得られた上清で測定した。
α−ＰＳ／α−ＰＳ ＥＬＩＳＡを上清中の遊離多糖体の定量化に用いた。また、結合物の欠乏をα−ＰＤ／α−ＰＳ ＥＬＩＳＡにより制御した。遊離多糖体の量を減少させて改善結合ワクチンを得る。
【００６３】
抗原性：
同様の結合物における抗原性を、抗体の捕獲および検出が、各々α−ＰＳおよびα−ＰＤであるサンドイッチ型ＥＬＩＳＡで分析した。
【００６４】
遊離蛋白含有量（％）：
「遊離」残余蛋白Ｄのレベルを試料のＳＤＳ処理が有る方法を用いて測定した。結合物を１０分間１００℃に、ＳＤＳ０．１％の存在下加熱し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣゲル濾過カラム（TSK 3000-PWXL）に注入した。蛋白Ｄは二量体であるので、ＳＤＳとの構築物を分離することによる「遊離」蛋白Ｄのレベルを過大評価する危険性がある。
【００６５】
分子の大きさ（Ｋａｖ）：
分子の大きさはＳＥＣ−ＨＰＬＣゲル濾過カラム（TSK 5000-PWXL）で測定した。
【００６６】
安定性：
安定性を４℃に維持した結合物および３７℃で７日間貯蔵した結合物に関してＨＰＬＣ−ＳＥＣゲル濾過（TSK 6000-PWXL）で測定した。
１１価特徴付けを表２に示す。
蛋白結合物をリン酸アルミニウムに吸着させ、プールして最終ワクチンを形成できる。
【００６７】
結論：
免疫原性結合物は生産せ、有望なワクチンの成分であることが示されている。最良の性質の最終結合肺炎球菌多糖体生成物に関する最適化ＣＤＡＰ条件が１１のワクチンの各々に関して見出された。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【表２】
【００７０】
【表３】
【００７１】
実施例２−本発明の１またはそれ以上の肺炎球菌蛋白＋／−３Ｄ−ＭＰＬの添加の、マウスでの肺炎球菌肺コロニー形成に対するＰＤ−接合した１１−価の多糖体ワクチンの防御的効能における有益な効果
【００７２】
免疫学的表示
肺炎球菌特異的血清ＩｇＧのエライザ投与量
Maxisorp Nuncイムノプレートを、３７℃で２時間、ＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍｌの蛋白で、１００μｌ／ウェルにてコーティングする。プレートをＮａＣｌ（０．９％）ツィーン−２０（０．０５％）バッファーで３回洗浄する。ついで、標準曲線物として加えられた抗−蛋白血清対照（６７０ｎｇ／ｍｌのＩｇＧで開始する）および血清サンプル（１／１０の希釈度で開始する）の連続的な二倍希釈体（ＰＢＳ／ツィーン−２０（０．０５％）中、ウェル当たり１００μｌ）を攪拌しながら２０℃で３０分間インキュベートする。上記したように洗浄した後、ＰＢＳ／ツィーン−２０（０．０５％）中５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Jackson）を攪拌しながら２０℃で３０分間インキュベート（１００μｌ／ウェル）する。洗浄後、プレートを室温で１００μｌ／ウェルのレベレーション（revelation）バッファー（１００ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）中のＯＰＤＡ ０．４ｍｇ／ｍｌおよびＨ２Ｏ２ ０．０５％）と一緒にインキュベートする。５０μｌ／ウェルの１Ｎ塩酸を添加することでレベレーションを止める。光学濃度をＥｍａｘイムノリーダー（Molecular Devices）を用いて４９０および６２０ｎｍで読み取る。抗体力価をSoftMaxProソフトウェアを用いる４変数の数学的方法により算定する。
【００７３】
オプソニン食菌作用アッセイ
このアッセイの目的は、ＣＤＣの公開されている標準的方法に適合する方法（Steinerら、Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology ４：４１５、１９９７）を用いて、試験血清サンプルの、ストレプトコッカス・ニュモニエ血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆに拮抗するオプソニンの作用能を再現的に測定することである。
このアッセイは侵入するストレプトコッカス・ニュモニエまたはニュモコッカスを排除する第一機構としてインビボにて起ることをインビトロにて再現する。それはニュモコッカスをオプソニン化し、つづいて食作用に付し、ついで殺菌するものである。「食作用」とは細胞が物質を飲み込み、細胞質にある小胞（ファゴソーム）中にそれを取り囲む過程である。肺炎球菌は健康な哺乳動物の食細胞によって食菌されると、当該細菌は死滅する。「オプソニン化」とは、オプソニン、例えば、抗体および補体を抗原上に堆積させることにより食作用が促進される過程である。
【００７４】
文献にて報告されている多数のオプソニン食菌作用アッセイがある。ＣＤＣの標準的方法はマルチ−ラブセッティングにて試験される（Steinerら、ＩＣＡＡＣ、トロント、２０００年９月１６日−２０日）。この後者のアッセイはＳＢで適合された。というのも、他の実験室にて比較するための基礎を提供し、それは一般に入手可能な試薬および対照を用い、生存肺炎球菌の５０％の死滅を促進する能力のある血清の力価（希釈度）、この型のアッセイに一般に使用される単位としての結果を表すからである。実際、その使用されたアッセイが４ヵ所の別の実験室で十分によく対応する結果を形成しうることが明らかにされた（Steinerら、ＩＣＡＡＣ、トロント、２０００年９月１６日−２０日）。
【００７５】
このアッセイで使用される食作用細胞はＨＬ６０細胞系であり、それは前骨髄球性白血病の個体から由来するものであり、Collinsらにより、１９７７年（Nature ２７０：３４７−９）にて連続する細胞系として確立された。この細胞系は、未分化の造血細胞、すなわち、８５％の芽細胞および前骨髄球、６％の骨髄球および９％の分化細胞からなる。極性化合物は該細胞の分化を少なくとも２つの異なる系統で誘発させることができる。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは顆粒細胞の分化を誘発し、多形核様細胞（４４％の骨髄球およびメタ骨髄球ならびに５３％バンドおよびセグメントのＰＭＮ）を生成する。
該アッセイにおけるバージョンＡ２において、試験すべき血清を熱不活化し、１／４で開始して連続的２倍希釈を８回、９６−ウェルマイクロプレートのＨＢＳＳ培地（０．３％ＢＳＡを含有する）にて行った。各ウェルにおける希釈された血清の最終容量は２５μｌである。
【００７６】
１０７個の細胞／ｍｌの４容量のＨＬ６０細胞（ジメチルホルムアミドで分化した５または６日後）、２容量のエス・ニュモニエ菌（適当な希釈度）および１容量の新生児ウサギの補体を使用直前に混合し、その２５μｌの混合物を９６−ウェルのマイクロプレートの希釈血清を含有する各ウェルに加える。血清型１および６Ｂでは、補体の量を最終濃度１２．５％にまで上げ、該アッセイのバージョンＡ３を得る。
軌道振盪の下、３７℃で２時間インキュベーションした後、プレートを氷上に置き、オプソニン食菌反応を停止させる。
【００７７】
３７℃で一夜インキュベートすることで、各ウェルにおけるコロニー形成単位（ＣＦＵ）を評価する。「オプソニン力価」（ＯＴ）をウェル中のエス・ニュモニエ菌の数を少なくとも５０％まで減少させることができる血清の相互希釈度（reciprocal dilution）として（すなわち、５０％死菌）として定義する。
％死菌＝（対照ウェルの平均ＣＦＵ−サンプルのＣＦＵ）／対照ウェルの平均ＣＦＵ
ｘ１００
【００７８】
ＯＦ１マウスにおける肺炎球菌鼻腔内攻撃
７週齢の雌のＯＦ１マウスに、麻酔状態の下、５ｘ１０５個のＣＦＵのマウス適合エス・ニュモニエ血清型２、４または６Ｂを鼻腔内に接種する。肺を攻撃の６時間後に摘出し、Todd Hewith Broth（THB、Gibco）培地にて均質化する。肺ホモジネートの連続した１０倍希釈体を、酵母抽出物補足ＴＨＢ寒天上、３７℃で一夜平板培養する。肺炎球菌肺感染を、対数加重平均値として表される、ＣＦＵ／マウスの数として測定する。
【００７９】
実施例２Ａ ３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの抗蛋白免疫反応についての効果
この実施例において、本発明者らは３Ｄ−ＭＰＬアジュバント処理の本発明の蛋白に対する免疫応答の効果を評価することができる。
一群１０匹の雌の６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、Ａ：ＡＩＰＯ４ １００μｇ；またはＢ：ＡＩＰＯ４ １００μｇ＋５μｇ ３Ｄ−ＭＰＬ（３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ribi Immunochemから購入）のいずれかを含有する１μｇの蛋白で０、１４および２１日目に筋肉内に免疫処理する。エライザＩｇＧをポスト−ＩＩＩ血清にて測定する。
いずれの抗原であっても、３Ｄ−ＭＰＬを補足した処方でワクチン処理した動物にて最良の免疫応答が誘発されることがわかる。
【００８０】
実施例２Ｂ 本発明の蛋白＋／−３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを添加した、血清型２、４または６Ｂで鼻腔内攻撃したＯＦ１マウスにおける肺炎球菌肺コロニー形成に対するＰＤ−接合の１１−価の多糖体ワクチンの防御作用に対する有利な効果
この実施例において、本発明者らは、古典的なＡＩＰＯ４吸着の１１−価の多糖体−蛋白Ｄ接合体処方と比べて、１１−価の多糖体−蛋白Ｄ接合体、本発明の蛋白およびＡＩＰＯ４＋３Ｄ−ＭＰＬアジュバントを含有するワクチンの予防的効能を評価することができる。
一群１２匹の雌の４週齢のＯＦ１マウスを、Ａ：５０μｇのＡＩＰＯ４；Ｂ：０．１μｇのＰＳ／ＰＤ−接合した１１−価の多糖体ワクチンの血清型＋５０μｇのＡＩＰＯ４；またはＣ：０．１μｇのＰＳ／ＰＤ−接合した１１−価の多糖体ワクチンの血清型＋１０μｇの本発明の蛋白＋５０μｇのＡＩＰＯ４＋５μｇの３Ｄ−ＭＰＬ（Ribi Immunochemから購入）を含有する処方で０および１４日目に皮下的に免疫処理する。攻撃を上記したように２１日目に行う。
この方法から判るように、本発明の蛋白を補足し、ＡＩＰＯ４＋ＭＰＬでアジュバント処理した１１−価の多糖体接合体ワクチンで有意な防御が得られる。反対に、１１−価の多糖体接合体／ＡＩＰＯ４処方で免疫処理した動物では有意な防御は観察されない。この結果により、本発明の蛋白および３Ｄ−ＭＰＬアジュバントの添加が１１−価の多糖体接合体ワクチンの肺炎に対する効力を亢進することを明らかにすることができる。
【００８１】
実施例２Ｃ 実施例２Ｂに示される防御の免疫相関性
本発明の蛋白および３Ｄ−ＭＰＬを補足した１１−価の多糖体接合体ワクチンによる、実施例２Ｂで得られた防御の免疫相関性を確立するために、上記したように、多糖体２、４または６Ｂおよび本発明の蛋白に対する攻撃前の血清抗体反応を測定することができる。
ついで、抗体力価を、攻撃の６時間後に集めた対応する動物の肺で測定された細菌性コロニーの数と比較する。Ｌｏｇ／Ｌｏｇの直線回帰上でＲ２を算定する。
算定されたＲ２から、体液性免疫応答と両抗原の防御との間に相関関係のないことが判る。抗−６Ｂ（あるいは２または４）抗体価は、１１−価の接合体ワクチンで、あるいは本発明の蛋白および３Ｄ−ＭＰＬを補足した同じワクチンで免疫処理した群にてあまり違わない。したがって、処方Ｃで認められる防御の改善は、多糖体６Ｂ（あるいは２または４）に対するより高い抗体力価によるだけではない。
総合すれば、これらの結果は、防御が体液性免疫応答だけで媒介されるものではなく、むしろ蛋白抗原（好ましくは３−ＭＰＬの存在下で）誘発される細胞介在免疫性によっても媒介されることを示唆しうる。このことは、免疫系の両腕が協調して最適な防御を得るのに、肺炎球菌多糖体接合体ワクチンに蛋白抗原（複数でも可）および強力なアジュバントを添加することにさらなる支持を与えることができる。
【００８２】
実施例３−本発明の蛋白で能動的に免疫処理され、肺炎球菌ＰＳに対する抗体で受動的に免疫処理されたマウスにおける免疫系の両腕の協調
実施例３Ａ−肺炎に拮抗して保護する受動的に投与される抗−６Ｂ−多糖体（抗−ＰＳ）の濃度の測定
方法
ワクチン群：一群１６匹の４群のマウスを−１日目に以下に詳説した群に従って希釈されていないラット抗−多糖体抗血清（１００μｌ）で受動的免疫処理（ｉ．ｐ．）に付した（合計６４匹のマウス）。
【００８３】
【表４】
【００８４】
動物：カナダ、Charles Riverから由来の６４匹の雄のＣＤ−１マウスであり、体重は約３５ｇ（約１０週齢）である。
麻酔状態：イソフルラン（３％）＋Ｏ２（１Ｌ／分）でマウスを麻酔に付した。
生物：エス・ニュモニエＮ１３８７（血清型６）を５％ウマ血を補足したトリプチケース大豆寒天（ＴＳＡ）プレートから収穫し、６ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。感染の直前に１ｍｌの細菌懸濁液を９ｍｌの冷却した融解滋養寒天（ＢＢＬ）中に希釈し、４１℃で保持した。マウスに５０μｌの容量にて約６．０対数１０ｃｆｕ／マウスを投与した。
感染：０日目に、マウスを上記したように麻酔処理に付し、手術を伴わない気管内挿管を介する気管支内注入によりエス・ニュモニエＮ１３８７（５０μｌの冷却細菌懸濁液）に感染させた。この方法はWooduntおよびBerryによって記載されている（Antimicrob. Ag. Chemotherap. ４３：２９（１９９９））。
サンプル：感染の３日目に、８匹のマウス／群をＣＯ２を過剰に摂取させて殺し、肺を摘出して１ｍｌのＰＢＳにホモジネートさせた。ＰＢＳの１０倍連続希釈体を調製し、生存している細菌の数を数えた。サンプルを５％ウマ血を補足したＴＳＡプレート上に３通りにて播種（２０μｌ）し、３７℃で一夜インキュベートし、評価した。さらに一連のマウスを７日目に殺し、上記したようにサンプリングした。
【００８５】
結果：
【表５】
括弧内の数字はサンプリング時間の前に死んだ動物の数である。
【００８６】
結論：一般に、いずれかの処理群より単離した細菌数には有意な違いはない。これは測定可能な防御が５μｇ／ｍｌを含むそれまでの濃度の抗−多糖体抗体で得られなかったことを示す。
これは数人のヒト臨床実験で観察されたことと類似しており、すなわち、抗−多糖体抗体はある集団におけるニュモコッカス肺炎に対する保護を付与するのに十分ではない。
【００８７】
実施例３Ｂ−本発明の蛋白をアジュバントと共にまたは無しで能動的に投与することにより得られる肺炎からの防御、および最適下限の抗−ＰＳ抗体との相乗作用の測定
方法
動物：カナダ、ケベック州、セント・コンスタント、Charles Riverからの１２８匹の雄のＣＤ−１マウス（免疫処理の際に６週齢で、感染の際に１０週齢である）であり、体重は６週で約２０ｇであり、１０週で約３８ｇであった。
免疫処理：一群１６匹のマウス６群を、−２２日目および−１４日目に、以下に詳説する１００μｌのワクチンで皮下注射して免疫処理する。（合計１２８匹のマウス）。３Ｄ−ＭＰＬをRibi／Corixaから入手する。
−１日目に、特定の群（以下の表を参照のこと）を４．２６μｇ／ｍｌ（４ｍｌの５μｇ／ｍｌ＋１．３ｍｌの２μｇ／ｍｌ）の濃度のマウス抗−多糖体抗体で受動的に免疫処理（ｉ．ｐ．１００μｌ）する。
【００８８】
【表６】
【００８９】
感染： ０日目に、マウスを上記したように麻酔処理（３％イソフルラン＋１Ｌ／分のＯ２）に付す。エス・ニュモニエＮ１３８７（血清型６）の培養体を５％ウマ血を補足したトリプチケース大豆寒天（ＴＳＡ）プレートから収穫し、６ｍｌのＰＢＳに懸濁させることにより細菌接種体を調製する。感染直前に、冷却した溶融滋養寒天（４１℃に保持）にて１０倍希釈体（１ｍｌ＋９ｍｌ）を調製する。マウスを気管内挿管を介する気管支内注入により感染させ、５０μｌの容量にて約６．０対数１０ｃｆｕ／マウスを投与する。この方法はWooduntおよびBerryによって記載されている（Antimicrob. Ag. Chemotherap. ４３：２９（１９９９））。
サンプル：感染後７２時間で、８匹のマウス／群をＣＯ２を過剰に摂取させて殺し、肺を摘出して１ｍｌのＰＢＳにホモジネートさせた。ＰＢＳの１０倍連続希釈体を調製し、生存している細菌の数を数えた。サンプルを５％ウマ血を補足したＴＳＡプレート上に３通りにて播種（２０μｌ）し、３７℃で一夜インキュベートし、評価した。さらに一連のマウスを８日目に殺し、上記したようにサンプリングした。
【００９０】
データ分析
治療効果を比較するための指標が感染した３および７日目に肺に存在する細菌の数である。結果を平均値と標準偏差として表すことができる。統計学的分析はスチューデントｔ−試験（Ｐ値が＜０．０５で有意であると考えられる）を用いて行うことができる。
上記したように、抗−多糖体抗体単独（群１−５）では肺における肺炎球菌の増殖に対する防御を付与できないことがわかる。ＡｌＰＯ４でアジュバント処理した肺炎球菌蛋白（群１−１）は保護を与えることができないが、蛋白を３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせた場合（群１−２）ではその効果はよくなるであろう。
最も有意な防御が抗−多糖体抗体と蛋白の両方の群で、特に３つのすべての要素、蛋白、３Ｄ−ＭＰＬおよび受動的に投与された抗−多糖体抗体を有する群（群１−４）で認められる。この結論はまた、死亡率でも支持され得る。群１−３、特に１−４は他の群と比べて死亡率が低いであろう。
【００９１】
結論：受動的に免疫処理した動物を用いて実験するため、さらに蛋白（＋／−ＭＰＬ）を用いて能動的に免疫処理することによる相乗作用は、多糖体抗原に対する抗体のレベルの増加によるものとすることができない。
肺炎球菌肺炎に対する有意な防御が、蛋白と受動的投与した抗−多糖体抗体の両方で免疫処理した群で観察され、特に３Ｄ−ＭＰＬも存在する場合に、この組み合わせが相乗作用を示すことがわかる。
抗−多糖体免疫処理を（好ましくは、多糖体との接合体を用いて）能動的に行うならば、この効果は、Ｂ−細胞記憶の効果として、さらに著しくなるであろうし、実験全体を通して抗−ＰＳ抗体の定常レベルが免疫反応協調に寄与するであろう。
【００９２】
実施例４−防御の相互作用による相乗効果の測定方法
人体が感染性肺炎球菌を排除するのに用いる原理機構は抗体介在のオプソニン食菌作用である（Bruynら、Clin. Infect. Dis. １４：２５１（１９９２））。防御との相関関数として莢膜多糖体に対する抗体濃度を測定するための、数種のエライザ法が開発されており、インビトロでのオプソニン食菌作用アッセイが防御とより相関していることが明らかとなった（Musherら、J. Infect. Dis. １８２：１５８（２０００））。
本発明の肺炎球菌蛋白は、抗体介在のオプソニン食菌作用とは異なる機構により肺炎球菌感染に対する防御を提供する。実施例２において、接合体および蛋白の両方での能動的免疫処理が、抗体濃度が両方の群で同じであるため、その違いで説明できない、相乗効果を示し得る。すなわち、観察され得る残りの防御作用は相乗作用に由来するものでなければならない。同様に、抗体が能動的に投与されているため、実施例３において同じ結論に到達することができる。
【００９３】
多くの場合において、本発明の肺炎球菌蛋白は表面に結合し、それ自体がオプソニン活性を提供すると考えられる。この場合、オプソニン活性の他の防御の相乗的機構に対する相対的寄与を評価するのに用いることができる、抗−肺炎球菌蛋白のオプソニン作用能を定量的に測定することで防御機構を区別することが可能である。
マウス肺コロニー形成モデルにおいて、各ワクチンの相対的保護を細菌の肺からのクリアランスで評価することができる。あるいは別法として、ワクチンの効力を、ワクチンで一般に測定される、症状率から評価することもできる。
％防御＝（ＣＦＵ／対照となる肺−ＣＦＵ／ワクチン処理した肺）／（ＣＦＵ／対照となる肺）
％効力＝（対照となる症状−ワクチン処理した症状）／（対照となる症状）
相乗作用に由来する防御または効力の部分を測定するために、オプソニン力価の割合に基づき、効力の部分と考えられる部分を決定することが問題である。
【００９４】
上記した実施例３において、蛋白または抗−多糖体単独ではそれ自体大きな防御を提供できないため、組み合わせたことによる％防御は、蛋白／抗体成分の間の相乗作用によるものである。
オプソニンの相対活性に基づいて、相乗作用の防御の量を評価することが可能である。抗−莢膜多糖体抗体により得られるオプソニン活性がＸであり、抗−肺炎球菌蛋白抗体により得られるオプソニン活性がＹであるとしたならば、オプソニン活性の合計はＸ＋Ｙであることがわかり、蛋白のオプソニン活性の相対的部分はＹ／Ｘ＋Ｙである。これをワクチンの相対的防御効力（ワクチンの抗−多糖体部分がＡ％の防御効力を提供し、ワクチンの多糖体＋蛋白の防御効力がＢ％である）と比較する。そして、オプソニン活性により説明することができない付加的な効力を残りの防御活性（相乗作用）＝Ｂ％−Ａ％−Ｂ％＊（Ｙ／Ｘ＋Ｙ）として評価する。
この実施例は相乗効果を評価するための方法を限定するものではない。防御との他の相関関係が同定されれば、この相乗作用を評価するのにその相関性を用いることができる。
【００９５】
本明細書に引用されている、特許および特許出願（これらの限定されない）を含め、すべての刊行物は、たとえ、個々の刊行物が、その内容を十分に開示している場合に、出典を明示することにより明細書の一部とすることを、具体的かつ個別的に意図するものであったとしても、その出典を明示することにより本明細書の一部とされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原と、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原またはその免疫学的機能等価物とを含んで成る免疫原性組成物。
【請求項２】
多糖体抗原が多糖体蛋白担体接合物の形態で提供される請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
担体蛋白がジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７、キーホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ツベルクリンの蛋白誘導体およびＨ．インフルエンザ由来の蛋白Ｄから成る群から選択される請求項２記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ワクチンが少なくとも４つの別の血清型由来の肺炎球菌多糖体抗原を含む請求項１〜３いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
さらにアジュバントを含む前記請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
アジュバントがアルミニウム塩を含む請求項５記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
アジュバントがＴＨ１応答の優先的誘導物質である請求項５記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
アジュバントが少なくとも１つの３Ｄ−ＭＰＬ、サポニン免疫活性化剤または免疫活性化ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む請求項７記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
アジュバントが水中油型エマルジョン、リポソームおよびアルミニウム塩から成る群から選択される担体を含む請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
医薬として用いる前記請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９の免疫原性組成物を含んで成るワクチン。
【請求項１２】
５５歳を超える患者におけるストレプトコッカス・ニューモニエ感染症の防止または改善方法であって、有効量の、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白、および任意にＴＨ１誘発アジュバントを含むワクチンを投与することを特徴とする方法。
【請求項１３】
５５歳を超える患者における肺炎の予防または治療のための医薬の製造における、肺炎球菌多糖体抗原のＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、および任意のＴＨ１誘発アジュバントとの組み合わせにおける使用。
【請求項１４】
幼児または小児の中耳炎の予防または治療のための医薬の製造における、肺炎球菌多糖体抗原のＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、および任意のＴＨ１誘発アジュバントとの組み合わせにおける使用。
【請求項１５】
１つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖体抗原（複数でも可）を選択する工程；
１つまたはそれ以上のＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白を選択する工程；および
上記多糖体および蛋白抗原を適当な賦形剤と混合する工程；
を含む前記請求項記載の免疫原性組成物の製造方法。
【請求項１６】
幼児における中耳炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量の、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗体と、任意にＴＨ１アジュバントと共に含むワクチンを幼児に投与することを特徴とする方法。
【請求項１】
少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原と、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原またはその免疫学的機能等価物とを含んで成る免疫原性組成物。
【請求項２】
多糖体抗原が多糖体蛋白担体接合物の形態で提供される請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
担体蛋白がジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７、キーホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ツベルクリンの蛋白誘導体およびＨ．インフルエンザ由来の蛋白Ｄから成る群から選択される請求項２記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ワクチンが少なくとも４つの別の血清型由来の肺炎球菌多糖体抗原を含む請求項１〜３いずれか１項記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
さらにアジュバントを含む前記請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
アジュバントがアルミニウム塩を含む請求項５記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
アジュバントがＴＨ１応答の優先的誘導物質である請求項５記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
アジュバントが少なくとも１つの３Ｄ−ＭＰＬ、サポニン免疫活性化剤または免疫活性化ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む請求項７記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
アジュバントが水中油型エマルジョン、リポソームおよびアルミニウム塩から成る群から選択される担体を含む請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
医薬として用いる前記請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９の免疫原性組成物を含んで成るワクチン。
【請求項１２】
５５歳を超える患者におけるストレプトコッカス・ニューモニエ感染症の防止または改善方法であって、有効量の、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択される少なくとも１つのストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白、および任意にＴＨ１誘発アジュバントを含むワクチンを投与することを特徴とする方法。
【請求項１３】
５５歳を超える患者における肺炎の予防または治療のための医薬の製造における、肺炎球菌多糖体抗原のＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、および任意のＴＨ１誘発アジュバントとの組み合わせにおける使用。
【請求項１４】
幼児または小児の中耳炎の予防または治療のための医薬の製造における、肺炎球菌多糖体抗原のＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗原、および任意のＴＨ１誘発アジュバントとの組み合わせにおける使用。
【請求項１５】
１つまたはそれ以上の肺炎球菌多糖体抗原（複数でも可）を選択する工程；
１つまたはそれ以上のＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白を選択する工程；および
上記多糖体および蛋白抗原を適当な賦形剤と混合する工程；
を含む前記請求項記載の免疫原性組成物の製造方法。
【請求項１６】
幼児における中耳炎の防止または改善方法であって、安全かつ有効な量の、ストレプトコッカス・ニューモニエ多糖体抗原およびＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３３から成る群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエ蛋白抗体と、任意にＴＨ１アジュバントと共に含むワクチンを幼児に投与することを特徴とする方法。
【公開番号】特開２０１２−６９６９（Ｐ２０１２−６９６９Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１９８２７７（Ｐ２０１１−１９８２７７）
【出願日】平成２３年９月１２日（２０１１．９．１２）
【分割の表示】特願２００２−５２６４１６（Ｐ２００２−５２６４１６）の分割
【原出願日】平成１３年９月１２日（２００１．９．１２）
【出願人】（５９５１３６３８０）グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム (10)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９８２７７（Ｐ２０１１−１９８２７７）
【出願日】平成２３年９月１２日（２０１１．９．１２）
【分割の表示】特願２００２−５２６４１６（Ｐ２００２−５２６４１６）の分割
【原出願日】平成１３年９月１２日（２００１．９．１２）
【出願人】（５９５１３６３８０）グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム (10)
【氏名又は名称原語表記】ＧＬＡＸＯＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＳ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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