三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法
一実施形態では、装置は、複数のディテクターとプロセッサーとを有する光学システムを含む。光学システムは、所与の時間で、各ディテクターで、第１の次元と第１の次元に実質的に直交する第２の次元とで、光源の画像を生成するように構成される。画像の各画像は、光源からの第１の方向の発光と、光源からの第１の方向とは異なる第２の方向の発光と、の干渉に基づく。プロセッサーは、画像に基づいて第３の次元で位置を計算するように構成される。第３の次元は、第１の次元と第２の次元とに実質的に直交する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８７１，３６６号ならびに「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００７年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９０８，３０７号（いずれも参照によりその全体が本明細書に援用されるものとする）に基づく優先権を主張する。本出願はまた、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称の米国特許出願第１１／９６１，６０１号（その全体が参照により本明細書に援用されるものとする）に基づく優先権を主張するものでありかつその継続出願である。
【０００２】
背景
本発明は、一般的には、干渉顕微鏡観察、たとえば、光活性蛍光タンパク質分子から光を内部放射するサンプルのように、空間分解可能な点光源で構成されたもしくは標識されたサンプルの干渉顕微鏡観察、および／または第３の次元（たとえばｚ座標）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で位置情報を測定するために位相差が測定される干渉顕微鏡観察に関する。
【背景技術】
【０００３】
干渉位相を測定する顕微鏡観察システムは公知である。たとえば、１つの公知の顕微鏡観察システムは、外部光源で対象物の延在表面を照明することにより干渉位相を測定する。サンプルから反射された光は、ビームスプリッター中で参照ビームと干渉する。干渉ビームは、ディテクター上に画像化される。参照ビームとサンプルビームとの光路差は、出力干渉ビームの振幅を変調して、対象物の高さの尺度を提供することが可能である。
【０００４】
また、対向する対物レンズを介してサンプルからの２つのビームを干渉させて１つの干渉出力ビームだけを測定する顕微鏡観察システムも公知である。そのような顕微鏡観察システムは、位相を明示的に測定しない。こうした顕微鏡観察システムは、軸方向次元で構造を解像することが可能である。
【０００５】
しかしながら、そのような公知の顕微鏡観察システムは、いくつかの欠点を抱えている。たとえば、そのようなシステムは、生物学で多く見受けられる蛍光標識サンプルに適用することができない。なぜなら、内部供給蛍光線が、蛍光励起に使用されるいずれの外部供給参照ビームに対しても使用可能な位相関係を有していないからである。参照ビームを用いなければ、干渉を達成することはできない。それに加えて、明滅する蛍光分子または他の単一光子源の場合のように、放射線が一過性であるかまたは強く時間変動する場合、単一位相型もしくは逐次位相型の干渉測定を用いて振幅から干渉位相を分離することはできない。したがって、単一の干渉測定または時系列の測定から、位相および位置情報の定量的尺度を導出することはできない。最後に、遠視野干渉システムの横方向分解能は、アッベ回折長λ／２ＮＡにより制限される。ただし、λは波長であり、かつＮＡは開口数である。したがって、改良された顕微鏡観察システムの必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
一実施形態では、装置は、複数のディテクターとプロセッサーとを有する光学システムを含む。光学システムは、所与の時間で、各ディテクターで、第１の次元と第１の次元に実質的に直交する第２の次元とで、光源の画像を生成するように構成される。画像の各画像は、光源からの第１の方向の発光と、光源からの第１の方向とは異なる第２の方向の発光と、の干渉に基づく。プロセッサーは、画像に基づいて第３の次元で位置を計算するように構成される。第３の次元は、第１の次元と第２の次元とに実質的に直交する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、蛍光標識でタグ付けされた対象分子は、回折限界よりも良好な確度で三次元で位置特定が可能である。そのような実施形態では、画像に関連付けられる位相情報を用いてｚ座標で分子の位置に関する情報を決定することが可能であり、結果的に、三次元でサブ回折確度＜＜λ／２を有する３Ｄ（三次元）表現を達成することが可能である。言い換えれば、第３の次元（たとえばｚ座標）で分子の位置に関する情報を得ることが可能であると同時に、２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で分子の位置に関する情報を得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の簡単な説明
【図１】本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのシステムブロック図を示している。
【図２】本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡システムおよび単一発光体サンプルのシステムブロック図を示している。
【図３】図２の２つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図４】本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡システムおよび延在サンプルのシステムブロック図を示している。
【図５】図４の２つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図６】本発明の実施形態に係る、ビーム位相表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図７Ａ】図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。
【図７Ｂ】図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。
【図７Ｃ】図７Ａに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフを示している。
【図７Ｄ】７Ｂに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフを示している。
【図８】本発明の実施形態に係る、三位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図８Ａ】本発明の実施形態に係る、三方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。
【図８Ｂ】本発明のさらに他の実施形態に係る、八方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。
【図９】図８の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図１０】本発明の実施形態に係る、三方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。
【図１０Ａ】本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。
【図１０Ｂ】本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。
【図１０Ｃ】本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。
【図１１】図１０に示される三方向ビームスプリッターの斜視図を示している。
【図１２】本発明の実施形態に係る、四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図１３】図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図１４】本発明の実施形態に係る、回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図１５】本発明の実施形態に係る、回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図１６】２つの異なる潜在位置にある単一量子発光体の概念図を示している。
【図１７】本発明の実施形態に係る、単一対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。
【図１８】図１７に示されるビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステムのシステムブロック図の例を示している。
【図１９】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。
【図２０】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図を示している。
【図２１】図１７に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうちの３つの斜視図を示している。
【図２２】図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図２３】本発明の他の実施形態に係る、アニュラーエキスパンダーの端面図を示している。
【図２４】ラインＸＸ−ＸＸに沿った図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。
【図２５】ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿った図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。
【図２６】本発明の実施形態に係る、多位相干渉顕微鏡システムのための校正プロセスのフロー図を示している。
【図２７】本発明の実施形態に係る、多位相干渉顕微鏡システム内の光活性サンプルの三次元位置情報を取得するためのプロセスのフロー図を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
広義には、本明細書に記載の１つ以上の実施形態により、公知の光学顕微鏡観察よりも良好な解像度を有する三次元レンダリングを生成することが可能である。いくつかの実施形態では、干渉顕微鏡で位相差を測定することにより、第３の次元（たとえばｚ座標）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で位置情報を測定することが可能である。いくつかの実施形態では、一群の点光源を含有するサンプル、たとえば、光活性蛍光標識から光を内部放射するサンプルを干渉顕微鏡で測定することが可能である。
【００１０】
たとえば、サンプル中の特定の標識タンパク質の三次元レンダリングを生成することが可能である。特定の標識タンパク質によりコントラストを与えることが可能であるが、なおかつ専用の光学顕微鏡を用いてコントラストを得ることが可能である。たとえば、１つ以上の実施形態を用いて、全３Ｄ位置で細胞内の蛍光標識タンパク質の位置を決定することが可能である。
【００１１】
公知の顕微鏡観察システムの１つは、光活性化位置特定顕微鏡観察（「ＰＡＬＭ」）システムである。このＰＡＬＭシステムは、次の参考文献（参照により本明細書に援用されるものとする）に記載されている。「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００５年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６８３，３３７号、「ほぼ分子分解能での細胞内蛍光タンパク質のイメージング(Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Near-Molecular Resolution)」という名称で２００６年３月１０日出願に出願された米国仮特許出願第６０／７８０，９６８号、「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００６年５月２３日に出願されかつＰＣＴ国際公開第２００６／１２７６８２号として２００５年１１月１１日に公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９８８７号、Betzig, E. et al., "Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution," Science, Vol. 313, September 15, 2006、およびBetzig, E. et al., "Supporting online Material for 'Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution'," Science Express, August 10, 2006, [online] www.sciencemag.org/cgi/content/full/1127344/DC1（本明細書中ではまとめて「Betzig参考文献」と記す）。
【００１２】
ＰＡＬＭシステムは、主に二次元のｘ，ｙ画像平面内で分子の位置を特定して、回折限界顕微鏡のものよりも優れた高解像度画像を提供する。第３の次元で標識分子の位置に関する情報を取得する公知の方式の１つは、いくつかのセクションでデータを取り出すかまたは焦点面までの距離に依存するデフォーカス分子の点広がり関数変動の定量化によるなどの逐次プロセスを含む。
【００１３】
２Ｄ ＰＡＬＭシステムの場合と同様に、ここでのスイッチャブル光学標識は、ＰＡ−ＧＦＰのような光活性蛍光タンパク質でありうる。ＰＡ−ＧＦＰは、ＧＦＰの光活性蛍光タンパク質変異体であり、４０５ｎｍの光を照射することにより非蛍光形からアニオン形に変換可能であり、アニオン形は、５００ｎｍの励起線を吸収して５２０ｎｍの蛍光線を発する。他の光活性タンパク質は、Ｄｒｏｎｐａ、Ｅｏｓ、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ−ＦＰ、ＰＡ−ＣＦＰであり、その多くは、単量体形、二量体形、および四量体形で使用可能である。そのようなタンパク質は、対象タンパク質を標識するように遺伝子発現および遺伝子結合が可能である。これによりタンパク質特異的画像を構築することが可能である。種々のケージド染料分子を使用することも可能であるが、それらは典型的には免疫標識スキームまたはそれに代わる結合スキームを必要とする。こうしたタンパク質／標識のいくつかは、十分に異なる光物理的性質、たとえば、発光波長、励起波長、または脱色速度を有するので、２つの異なるスイッチャブル光学標識を用いて画像を作成することが可能である。この場合、ビーム経路中にダイクロイックミラーを追加することにより、この３Ｄ干渉顕微鏡観察のための新しい第２さらには第３の一連の画像を得ることが可能である。１種のタンパク質の画像化および脱色を行ってから第２のタンパク質の画像化を行うように取得処理を順序付けることは、異なる標識タンパク質を画像化するもう１つの方法である。
【００１４】
しかしながら、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、光路長差の位相角情報を使用することにより、二次元強度画像（これから標識分子のｘ，ｙ位置を決定することが可能である）および位相依存性画像（これから標識分子のｚ位置を決定することが可能である）の両方を同時に取得することが可能であり、かつ再構築することが可能である。言い換えれば、サンプルからの２つ以上の発光ビームを２つ以上のビームにさらにスプリットして互いにペアワイズ干渉させ（それらの異なる位相に基づいて）、得られた干渉ビームで画像を形成し、画像を同時に記録してサンプルの局在化光源の経路長差の位相（すなわちｚ位置）を再構築する。それに加えて、いくつかの実施形態では、干渉振幅を抽出して垂直方向位置の追加的尺度として使用することも可能である。
【００１５】
そのような実施形態は、多くの点で有利である。たとえば、以上で述べたように、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、位相差を測定することにより、第３の次元（たとえばｚ座標）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で位置情報を測定することが可能である。これにより３つの次元すべてで測定が可能になり、この測定は、こうした測定がさまざま時点で行われる公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、たとえば、時間変化する明るさを有する光活性サンプルのように静的でないサンプルに特に有利でありうる。
【００１６】
以上にも述べたように、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、測定されるサンプルの成分は、サブ回折サイズの点光源として分離可能かつ同定可能である。これにより可能になる測定は、明確な画定が可能であるとともに、測定サンプル成分が位置の分布を有する拡張光源でありかつ光源の種々の部分が光源の他の部分と干渉する可能性がある公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、回折限界未満の確度で測定を行うのに特に有利でありうる。
【００１７】
図１は、本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのシステムブロック図を示している。図１に示されるように、顕微鏡観察システム１００は、光学素子１３０および１４０と、ビームスプリッター１５０と、光学素子１６０および１７０と、ディテクター１６５および１７５と、を含む。
【００１８】
光学素子１３０および１４０は、サンプルＳからビームスプリッター１５０までそれぞれ光路１３２および１４２を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１３０および１４０は、それぞれ、一連のミラー、レンズ、または対物レンズを含みうる。光学素子１３０および１４０は、たとえば、サンプルの点光源から放出される光エネルギーを平行化するレンズまたは対物レンズを含みうる。図１には２つの光学素子１３０および１４０中に至る２つの反対方向を向いて対向する経路１３２および１４２が示されているが、以下で論述されるいくつかの実施形態では、光学素子１４０のような単一の光学素子は、２つの対向しない経路１３２および１４２を含みうる。
【００１９】
光学素子１３０および／または１４０は、サンプルＳが１種以上の活性化源を受容できるようにする追加の素子および／特徴部を含みうる。たとえば、いくつかの実施形態では、光源（図１には示されていない）からの光エネルギーを用いることによりサンプルＳの蛍光応答を活性化させて励起光子を生成することが可能である。そのような実施形態では、たとえば、光学素子１３０および／または１４０は、アパーチャーを含みうる。そしてディテクター１６５および／または１７５に向かって逆行する励起レーザーからの迷光放射を最小限に抑えつつ、アパーチャーを介して光源からの光エネルギーをサンプルＳに照射することが可能である。また、主に蛍光がディテクターに達するように、ディテクター１６５および／または１７５に至るビーム経路中にレーザーラインフィルターを存在させることも可能である。第１のレーザー光源は、たとえば、活性化ビームをサンプルＳに照射することが可能であり、かつ第２のレーザー光源は、たとえば、励起ビームをサンプルＳに照射することが可能である。他の実施形態では、レーザー以外の光源、たとえば、発光ダイオード、白熱ランプなどを活性化用および／または励起用の光源として使用することが可能である。以上で参照により援用されたBetzig参考文献にさらに詳細に記載されているように、活性化ビームは、サンプル中の個別に解像可能な光活性標識の十分に散在したサブセットを活性化させるように構成され、かつ励起ビームは、サンプルＳの活性化部分を励起して蛍光に基づく光子を放出させるように構成される。
【００２０】
他の選択肢の実施形態では、１種以上の化学物質を用いてサンプルの蛍光応答を活性化させることが可能である。そのような他の選択肢の実施形態では、サンプルを第１の化学物質に暴露してサンプルの分子の蛍光性散在サブセットを活性化させることが可能であり、続いて、光脱色を用いない場合、第２の化学物質に暴露してサンプルの蛍光を失活させることが可能である。
【００２１】
ビームスプリッター１５０は、任意のタイプの適切な光学素子でありうる。ただし、この光学素子は、光路１３２および１４２に沿って光エネルギーを受け取って組み合わせて、かつ組み合わされ混合された光エネルギーを光路１５２および１５４（それぞれ本明細書中では「レッグ」とも記す）に沿って光学素子１６０および１７０に伝送する。たとえば、ビームスプリッター１５０は、５０：５０ビームスプリッターでありうる。この場合、組み合わされた光エネルギーはスプリットされて、組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５２で伝送され、かつ組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５４で伝送される。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０により干渉され混合されるので、光路１５２に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づく。同様に、光路１３２および１４２に沿った光エネルギーは、ビームスプリッター１５０中で干渉され混合されるので、光路１５４に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づき、この相対位相差は、光路１５２に沿った光エネルギーに関連付けられる相対位相差とは異なる。この実施形態では、光路１５２に沿って得られる光エネルギーと光路１５４に沿って得られる光エネルギーとは、位相が約１８０度異なる。他の選択肢として、ビームスプリッター１５０により、６６：３３、７０：３０などのような任意の所望の割合にビームを分割することが可能である。さらに他の実施形態では、ビームスプリッター１５０は、複数のビームスプリッターの組合せでありうる。そのようなビームスプリッターは、たとえば、２つのガラスセグメントと２つのガラスセグメント間に配設された薄膜コーティングとのブロックから構成可能である。そのようなビームスプリッターは、３つ以上の出力、すなわち、１５２および１５８の２つよりも多くの出力を生成することが可能である。これにより、２つのビームの場合の０度および１８０度ではなく、３つ以上の干渉位相角（たとえば、０度、１２０度、および２４０度）で３つ以上の出力ビームを表現することが可能になる。さらに他の実施形態では、薄膜コーティングを有するビームスプリッターに加えてまたはその代わりに、回折グレーティングをビームスプリッターとして使用することが可能であり、かつそれによりビームを２つ以上のビームに分割することが可能である。また、グレーティングにより複数の入力ビームを受け取って、それらを混合して干渉させ、種々の出力ビームを生成することが可能である。いくつかの実施形態では、スイッチャブル散乱中心を有する標識（たとえば、活性散乱特性を有する光スイッチャブル標識）のように実質的に同一の波長で発光する点光源を有するサンプルと組み合わせて、回折グレーティングを使用することが可能である。実質的に同一の波長で発光する点光源を有するそのようなサンプルでは、回折グレーティングにより、入力ビームの波長の関数である比較的狭い偏向角で入力ビームを有利に偏向させることが可能である。
【００２２】
他の実施形態では、ビームスプリッターのうちの１つ以上は、回折グレーティングまたは薄膜コーティングの代わりにストライプ状ミラー部分を含みうる。一実施形態では、ストライプ状ミラー部分は、回折次数により画像平面内に再集光されないように、十分に小さいストライプ周期を有する。波長λ、焦点距離ｆ、および画像サイズｄの場合、これは、ｆλ／ｄ未満の周期を意味する。正方形もしくは六角形のポルカドットのような他のパターンを使用することが可能である。しかしながら、画像中のゴースト発生を防止するために、同一条件のポルカドット周期（すなわちｆλ／ｄ未満）を保持しなければならない。
【００２３】
光学素子１３０および１４０のときと同様に、光学素子１６０および１７０は、ビームスプリッター１５０からそれぞれディテクター１６５および１７５までそれぞれ光路１５２および１５４を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１６０および１７０は、光エネルギーがそれぞれディテクター１６５および１７５に集束するように、それぞれ光路１５２および１５４からの光エネルギーを非平行にするレンズでありうる。いくつかの実施形態では、光学素子１３０、１４０、１６０、および１７０、ならびに／またはビームスプリッター１５０のような光学素子のうちの１つ以上は、補償光学素子を含みうる。
【００２４】
使用時、サンプルＳ中の個別画像化標識の統計学的散在サブセットを活性化した後、測定が行われる。以上で述べたように、サンプルＳ中の標識の統計学的散在サブセットは、適切な技術により、たとえば、光活性化または化学的活性化により、活性化可能である。活性化の後、レーザーのような励起光源によりサンプルＳを励起することが可能である。この結果として、サンプルＳから光路１３２および１４２に沿って光子が放出されて光学素子１３０および１４０を介してビームスプリッター１５０に達する。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０で組み合わされ、そして経路１５２および１５４に沿って伝送されてそれぞれ光学素子１６０および１７０を介してディテクター１６５および１７５に達する。ビーム１３２および１４２の間の位相差により干渉が引き起こされ、そしてディテクター１６５および１７５において検出信号の強度が変調される。以下でさらに詳細に説明されるように、この強度を用いてｚ座標の位置を決定することが可能である。それに加えて、ディテクター１６５および１７５における検出信号は、ｘ、ｙ座標の位置情報をも提供する。検出信号を収集した後、それらの標識からさらなる光信号を検出できなくなるように、サンプルＳ中の標識の活性化散在サブセットを反復励起により脱色することが可能であり、次に、追加の測定に供すべく、標識のさらなる散在サブセットを活性化し励起することが可能であり、そしてプロセスは反復される。
【００２５】
図２は、本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび単一活性発光体を有するサンプルのシステムブロック図を示している。図２に示されるように、単一量子発光体Ｓは、中心位置２２０から距離δの位置に配置される。単一量子発光体Ｓは、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子は、量子発光体Ｓから上向きにレンズ２３０中にも下向きにレンズ２４０中にも逃散可能であり、これらのレンズでは、それぞれ、２つの平行ビーム２３２および２４２が形成される。平行ビーム２３２および２４２は、それぞれ、ミラー２３４および２４４により反射されて、ビームスプリッター２５０で受光される。
【００２６】
２つのビーム経路は、次のように画定される。すなわち、量子発光体Ｓからミラー２３４までおよびミラー２３４からビームスプリッター２５０までの第１のビーム経路（トップ経路とも呼ばれる）、ならびに量子発光体Ｓからミラー２４４までおよびミラー２４４からビームスプリッター２５０までの第２のビーム経路（ボトム経路とも呼ばれる）。ミラー２３４および２４４ならびにビームスプリッター２５０は、ビーム経路の長さがほぼ波長レベルまで一致するように、すなわち、（Ｌ１＋Ｌ２）ｔｏｐ＝（Ｌ１＋Ｌ２）ｂｏｔｔｏｍになるように、量子発光体Ｓに対して定置される。ただし、発光体の位置変位δおよびトップビーム経路での９０度の位相シフトは除く。式中、Ｌ１は、中心位置２２０とミラー２３４または２４４との間の経路長であり、かつＬ２は、ミラー２３４または２４４とビームスプリッター２５０との間の経路長である。この場合、トップビーム経路中の光ビームの電界は、次のとおりである。
Ｅ１＝Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）、
式中、ｋ＝２π／λ。
【００２７】
ボトムビーム経路中の光ビームの電界は、次のとおりである。
Ｅ２＝Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２）。
【００２８】
ビームスプリッター２５０で受光された時、光ビームは、組み合わされ、そしてレンズ２６０および２７０を介してそれぞれ２つのディテクター２６５および２７５に伝送される。各ディテクター２６５および２７０に向かって伝搬する１つの光源からの光ビームの電界は、次のとおりである。
Ｅ１２＝１／２０．５×（Ｅ１±Ｅ２）＝
１／２０．５×（Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）±Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２））。
【００２９】
この実施形態では、ディテクター２６５および２７５は、それぞれ、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）ディテクターまたは（単一蛍光分子に対する感度向上のために）電子増倍電荷結合ディテクター（ＥＭＣＣＤ）である。図３に示されるように、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５およびディテクター２７５で検出される放射光の強度３７５は、位相４πδ／λを有して正弦パターンで変化する。より詳細には、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５は、次のとおりである。
Ｉ１＝１／２×（Ｅ１＋Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ））。
【００３０】
ディテクター２７５で検出される放射光の強度２７５は、次のとおりである。
Ｉ２＝１／２０．５×（Ｅ１−Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ＋π））。
【００３１】
次に、２つの強度式の組合せおよび逆転を行うことにより、次のように変位を計算することが可能である。
（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２）＝ｓｉｎ（４πδ／λ）またはδ＝λａｒｃｓｉｎ（（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２））／４π
【００３２】
これは、図４に示されるような顕微鏡観察システムに一般化することができる。より詳細には、図４は、本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび延在サンプルのシステムブロック図を示している。図４に示されるように、顕微鏡観察システムは、画像平面がディテクター４６５および４７５に画定されるように、顕微鏡対物レンズ４３０および４４０ならびにレンズ４６０および４７０を含む。サンプルＳの任意の点光源は、ディテクター４６５および４７５に画定される各画像平面上に分解能限界のスポットを形成するであろう。
【００３３】
次に、空間的に一体化されたスポットの強度を用いて、以上に記載の強度式によりサンプルの点光源のｚ座標位置を計算することが可能である。ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、または他の大面積ディテクターを用いることにより、複数の画像スポットを同時に検出することが可能であり、かつサンプル３１０の各関連部分のｚ変位δを実質的に同時に確定することが可能である。検出される光信号の位相を１ラジアンの何分の一まで決定することが可能であるので、波長の何分の一よりも良好なレベル（たとえば＜２０％）で位置情報を決定することが可能である。たとえば、λ＝６００ｎｍの波長では、δ＝５０ｎｍに対応する１ラジアン未満まで位置情報を決定することが可能である。そのような干渉システムは、光源発光体のｘ，ｙ位置もまたナノメートルスケール分解能で測定できるように構成可能である。
【００３４】
サンプルの厚さは、一意的なｚ座標位置を測定しうる範囲に影響を及ぼす可能性がある。たとえば、図２または４に示される二位相の実施形態では、サンプル２１０の厚さはλ／４未満であり、その場合、一意的なｚ座標位置を測定することが可能である。こうした実施形態での変位δの感度は、一様でない。言い換えれば、図３および５に示されるように、強度が正弦波の最小または最大の近傍で決定されるような位相の場合、勾配はゼロに近づくので、感度はゼロに近づく。しかしながら、強度が正弦波の最小または最大から離れて決定されるような位相の場合、こうした実施形態での変位δの感度は、測定可能でありゼロではない。
【００３５】
図６は、本発明の実施形態に係る、ビーム位相表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。ビーム４３２は、ビーム４４２の位相とは異なる位相を有し、かつ出力ビーム４５２は、位相が異なる成分４５２’および４５２”を含む。ビーム成分４５２’および４５２”は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５２’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５２”はビーム４４２に由来する。同様に、出力ビーム４５４は、位相が異なる成分４５４’および４５４”を含む。ビーム成分４５４’および４５４”は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５４’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５４”はビーム４４２に由来する。この実施形態では、ビーム成分４５２’および４５２”の間の位相差は、ディテクターＣＣＤφ１で検出される強度を決定し、かつビーム成分４５４’および４５４”の間の位相差は、ディテクターＣＣＤφ２で検出される強度を決定する。
【００３６】
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。図６の出力ビーム４５２および４５４は、入力ビーム４３２および４４２の成分を含む。図７Ａに示されるように、４５２’および４５２”は、出力ビーム４５２の成分であり、かつ位相差４８０だけ位相が分離されている。図７Ｂに示されるように、４５４’および４５４”は、出力ビーム４５４の成分であり、位相差４９０だけ位相が分離されている。これらの位相差の差は、対象物の位置の関数として変化するであろう。図７Ａに示されるビームの二乗和は、図７Ｃに示される強度を有するビームを生成し、同様に、表示された図７Ｂ中のビームの二乗和は、図７Ｄに示される強度を有するビームを生成する。これらの２つのビームＩ１およびＩ２の相対強度は、干渉位相を決定し、それにより鉛直方向変位δを決定する。
【００３７】
他の選択肢の実施形態では、干渉顕微鏡観察システムは、二位相よりも多くの位相を有しうる。たとえば、図８は、本発明の実施形態に係る、三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図９は、適切に干渉されて図８の３つのディテクターで検出された場合の点光源からの放射光の強度のグラフを示している。
【００３８】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの実施形態を示している。２つの発光ビーム１０１０および１０２０は、５０−５０ビームスプリッティング表面１０５０に入る。２つの得られた干渉ビームは、上側６６：３３ビームスプリッティング表面１０４０および下側ミラー表面１０７０に進行する。上側ビームのほとんど（６６％）は、出力経路１０３０に入り、３３％は、経路１０２８に進行して、ミラー表面１０７０から反射されたビーム１０２４と干渉する。この最終干渉は、５０：５０ビームスプリッティング表面１０５２で起こり、第２および第３の出力ビーム１０３２および１０３４を生じる。３つの出力間でバランスのとれた三方向干渉（すなわち、出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４に対して類似の振幅）を得るために、ミラー１０７０の位置を変化させてギャップ１０６０を変化させることにより干渉ビーム１０２８および１０２４の位相を調整することが可能である。ガラスプリズムの底面上の残留反射率を最小限に抑えるために、ギャップ１０６０に屈折率整合油を充填することが可能である。
【００３９】
図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。ビーム経路中の望ましくない干渉を低減するために、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される各ストライプ状ミラーは、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される他のストライプ状ミラーに対して回転されている。
【００４０】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの実施形態を介して対象物および画像平面に関連付けられた波面の伝搬をさらに示している。波面１０１２および１０２２を有する発光ビーム１０１０および１０２０は、ビームスプリッティング表面１０５０に入る。波面１０１２および１０２２は、サンプルの対象物平面に関連付けられ、かつビームスプリッティング表面１０５０で互いに干渉される。得られた波面は、三方向ビームスプリッターを通って伝搬する時、ビームスプリッティング表面１０４０および１０５２で互いに干渉する。ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２は、ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２での干渉時に波面の歪みまたは広がりに適合するのに十分な表面積を有する。出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４は、１０３６、１０３８、および１０３９の相対位相シフトでビーム１０１０および１０２０を組み合わせた状態で三方向ビームスプリッターから送出される。これにより異なる強度のビーム１０３０、１０３２、および１０３が得られ、これらは、波面１０１２および１０２２のインタクトな干渉形であり、ディテクターの画像平面に伝搬する。
【００４１】
図１２は、本発明の実施形態に係る、四位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図１３は、図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。図８〜１２は、三位相もしくは四位相の干渉顕微鏡観察システムを有する実施形態を示しているが、四位相よりも多くの位相を有するシステム、たとえば、五位相干渉顕微鏡観察システム、六位相干渉顕微鏡観察システムなども可能である。
【００４２】
二位相干渉顕微鏡観察システムでは、たとえば、図２に示される５０：５０ビームスプリッター２５０のようなビームスプリッターを使用することが可能であるが、二位相よりも多くの位相を有する顕微鏡観察システム用のビームスプリッター（たとえば、図８に示されるもの）を多種多様な方法で具現化することが可能である。たとえば、図８に示されるように、ビームスプリッターは、複数の素子、すなわち、２つの５０：５０ビームスプリッター、６６：３３ビームスプリッター、およびミラーを含みうる。こうしたビームスプリッター素子は、たとえば、光学ベンチ上に手動で定置することが可能である。他の選択肢として、こうしたビームスプリッター素子を作製して１対の光学平面間に配設することが可能であり、そのようなビームスプリッター素子の位置を、たとえば、圧電トランスデューサーによる調整することが可能である。そのような調整を行えば、３本のレッグの位相シフトを２π／３だけ離間させたりまたはＮ本のレッグの実施形態の場合には２π／Ｎだけ離間させたりすることを保証できるようになり、しかも、スプリッティング平面の平行性を確保することも保証できるようになる。三方向ビームスプリッターの他の選択肢の実施形態を図８Ａに示す。
【００４３】
図８Ｂは、本発明のさらに他の実施形態に係る、八方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。図８Ｂに示されるように、ビームスプリッターは、複数のビームスプリッター素子を含む。それらはいずれも、破線で表されている。図８Ｂは、８本の出力ビームを生成する１６個のビームスプリッター素子を有するビームスプリッターを明示的に示しているが、当然のことながら、Ｎ本の出力ビームを生成するより多数もしくはより少数のビームスプリッター素子の場合にもこの基本構造に従うことが可能である。こうしたビームスプリッター素子は、０〜１００％の範囲内の反射率を有しうる。透過率は公称でありうる。ビームスプリッター素子の表面が実質的に互いに平行である場合、ビームの実質的に全部（またはビームの一部）（直径Ｄを有する）は、元の入力ビームＡおよびＢの反射ビーム部分またはそれらからスプリットされた他のビーム部分にコヒーレントに干渉可能である。ビームスプリッター素子の表面は、実質的に平行でありうる。たとえば、それぞれ、＜λ／Ｄの角度の範囲内である。また、ビームスプリッター素子は、入力ビームのコヒーレンス長λ２／（ｎΔλ）の範囲内で等しく離間される。ただし、λは波長であり、Δλは波長の範囲であり、かつｎは媒体の屈折率である。この隔間により、干渉は、対象のビーム波長範囲ｄｌにわたり実質的にコヒーレントであることが保証される。入力ビームＡおよびＢは、Ａ−Ｂがビームスプリッターの平面に対して法線方向のベクトルになるように方向ベクトルを有してビームスプリッターに入る。両入力ビームは、第１のビームスプリッター素子上の同一点に向けられる。ビームスプリッターが平行平面構造であれば、ある範囲内のビーム角で自己干渉が可能になり、このビーム角範囲は、たとえば、いわゆるＣＣＤディテクター（図８Ｂには示されていない）の画像平面上に集束する前のビームの平行部分の画像に関連付けられる角度範囲に対応しうる。いくつかの実施形態では、１本だけの入力ビーム（たとえば入力ビームＡまたは入力ビームＢ）が適用される場合、Ｎ本の出力ビーム（図８Ｂはｎ＝８の場合を示す）に実質的に等しくスプリットされることが保証されるように、各ビームスプリッター素子の反射率およびビームスプリッター素子間の微細間隔（コヒーレンス長未満であるが干渉角を制御するのに十分である）を変化させることが可能である。さらには、いくつかの実施形態では、入力ビームＡと入力ビームＢとの間の干渉角を３６０度／Ｎの異なる間隔に設定することが可能である。したがって、Ｎ＝８である図８Ｂに示される例では、４５度、９０度、１３５度の間隔に設定することが可能である。
【００４４】
以上に述べたように、いくつかの実施形態では、１つ以上のビームスプリッターは、薄膜コーティングを有するビームスプリッターの代わりに回折グレーティングに基づくものでありうる。たとえば、図１４は、本発明の実施形態に係る、回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。この実施形態では、ビームスプリッター１４５０は、回折グレーティング１４５１〜１４５４と、ミラー１４６２および１４６４と、位相シフター１４７２および１４７４と、を含む。回折グレーティング１４５１および１４５２は、それぞれ、ミラー１４３４および１４４４から光エネルギーを受け取る。回折グレーティング１４５１は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６２および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５２は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６４および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５３は、ミラー１４６２および位相シフター１４７４から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。同様に、回折グレーティング１４５４は、ミラー１４６４および位相シフター１４７２から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。図１５は、他の実施形態に係る、回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【００４５】
いくつかの実施形態では、スイッチャブル光源から放出された光エネルギーへの特定の光エネルギーの寄与を低減または防止するために、分光フィルター（たとえば、帯域幅フィルター、ローパスフィルター、またはハイパスフィルター）を光路中に配設することが可能である。たとえば、光路内の迷光およびノイズならびにディテクターに向かう伝搬を低減するために、光活性化時および／または光励起時に使用される光エネルギーを光路から除去することが可能である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、光路に沿った１つ以上のサンプル、対物レンズ、ミラー、光学素子、ビームスプリッター、レンズ、分光フィルター、および他の要素を、圧電アクチュエーターなどの多軸ポジショナーに個別に結合させることが可能である。そのような多軸ポジショナーを用いれば、自動もしくは非自動の校正および定置が可能になる。このほかに、そのような多軸ポジショナーを用いれば、定置および校正に関してマニュアル法よりも精度および確度を改良することが可能である。
【００４７】
干渉計システムの構成時ならびにその定置およびアライメントのためのガイドとして、２つの入力ビーム経路中に組み込まれたシャッターを有することが有用なこともある。これにより、各経路からの画像を独立して観測し、各経路が最適に焦点調整されていることを確認することが可能である。さらには、２つの部分の画像を観測できるので、両ビームに対してシャッターを開いた時に最適な干渉で重畳されるように、一方の画像を他方の画像に対して移動させることが可能である。
【００４８】
二位相よりも多い位相を有する他の選択肢の実施形態では、感度は位相不変でありうる。それに加えて、一意的な動作範囲をλ／２まで拡張することが可能である。変位が大きくなると、λ／２を法とする位置あいまい性を生じるであろう。これは、たとえば、空間領域および時間領域の両方でまたはサンプルのセクション化で選択的照射（励起または活性化）を行うなどの追加の技術を用いて、除去可能である。そのような実施形態では、たとえば、三位相もしくは四位相の干渉計測を行う実施形態では、サンプルの測定部分の位置は、以下の強度により決定される。
Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ）
式中、ｊ＝０、１、２、…は、多位相干渉計のレッグを表す、
Ｉｊ＝点光源のｊレッグの強度、オフセット補正なし、
βｊ＝ｊ番目のレッグの干渉補正係数、
Ｇｊ＝ｊ番目のレッグのゲイン、
Ｏｆｓｊ＝ｊ番目のレッグのオフセット、
ＡＵｉ＝ｉ番目の点光源の振幅、上側対物レンズ、
ＡＬｉ＝ｉ番目の点光源の振幅、下側対物レンズ、
φｊ＝ｊ番目のレッグの位相シフト、および
φｉ＝点光源（すなわち蛍光分子）の位相。
【００４９】
暗校正ＡＵｉ＝ＡＬｉ＝０を行ってｊ番目のディテクターからの暗信号を決定するが可能にする。
Ｉｏｊ＝Ｇｊ×Ｏｆｓｊ
Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ） 全振幅：ＡＴｉ２＝ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２
【００５０】
再スケール調整された干渉部分：
Ｘｉ＝２×ＡＵｉ×ＡＬｉ／ＡＴｉ２
【００５１】
したがって、これらの変数を用いれば、強度は以下のようになる。
Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００５２】
ｚに沿って基準光源をδだけ移動させた時の校正を用いて、残りの装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊを決定することが可能である。これにより、位相φｆ（ｚ）が約４×π／（ｎλ）δ（ｚ）だけ回転されている三位相の場合、各レッグ中で図７に類似して振動する強度信号が得られるであろう。ここで、ｎは、シフト経路長を有する媒体（たとえば液浸油）の屈折率である。
【００５３】
次に、そのような一群の校正データへのあてはめを行えば、参照基準で発光基準の干渉部分Ｘｆおよびその強度ＡＴｉ２＝Ｉｆを用いて各レッグｊに対して以下の式が決定されるであろう。この時点で、装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊが決定される。そのような校正は、位相シフト値が正確に１２０度（３本のレッグ）または２π／Ｎ（Ｎ本のレッグ）でない場合に有用でありうる。
Ｉｆｊ（ｚ）＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×Ｉｆ（１＋βｊ×Ｘｆ×ｃｏｓ（φｊ（ｚ）＋φｊ））。
【００５４】
Ｇｊ、βｊは、基準単位に規格化することにより定義可能である。
Ｉｆ＝１かつＸｆ＝１かつαｉ＝ＡＴｉ２／Ｉｆ
Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
Ｄｉｊ＝（Ｉｉｊ−Ｉｏｊ）／（Ｇｊ×Ｉｆ） 再スケール調整された強度データ
Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００５５】
図２６は、本発明の実施形態に係る、自動校正法を用いる多位相干渉顕微鏡システム用の校正プロセス２６００のフロー図を示している。２６１０では、サブ回折基準などの発光体をｚ平面内の種々の位置で画像化して画像フレームシーケンスを生成する。２６１０でのこのプロセスは、サブプロセス２６１１および２６１２を含み、サブプロセスをｚ平面内の種々の位置に対して反復して画像フレームシーケンスを生成する。２６１１では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで発光体の画像を取り込む。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性（たとえば、ｊ番目のディテクターのφｊβｊ）を含む。２６１２で発光体のｚ位置をインクリメントし、２６１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。画像フレームシーケンス中の各画像フレームは、発光体の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００５６】
２６２１では、発光体の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体発光分布を位置特定する。たとえば、特定の発光体は、ガウス分布に正確にあてはめることが可能な発光分布を有する。そのようなガウス分布により、たとえば、発光体の画像の点広がり関数の尤度を表すことが可能である。２６２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、２６２３でドリフト補正フレームを変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００５７】
２６２４では、ｚ平面内の各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた位相シフト画像フレームの合成体である。２６２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体の中心を決定する。
【００５８】
２６２６で変換フレームをガウス分布のような所定の分布にあてはめ、そして２６２５で決定されたｘ，ｙ平面内の発光体の中心で各フレーム中の発光体発光分布の振幅を測定する。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布（たとえば、三次元分布）の図心に基づきうる。２６２７では、発光体発光分布の振幅を２６２４で決定された和に規格化する。各画像に対して２６２７で決定された規格化振幅および関連ｚ位置を２６２８で記録する。たとえば、各フレームに対する規格化振幅および関連ｚ位置をルックアップテーブル内に記憶するかまたは上述の式によりパラメーター化してφｊおよびβｊを決定することが可能である。
【００５９】
以下の式は、干渉顕微鏡観察システムにより収集された強度データから光源の変位δ（すなわち、サンプルの相対ｚ座標位置）を決定しうることを説明するものである。
【００６０】
校正が終了した後、データをスケール調整することが可能であり、その場合、干渉計の各出力ビームに対する値βｊおよびφｊもわかる。ｊ個の式：
Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ（ｚ）＋φｊ））
を用いて軸方向に沿った発光体の位置を決定することが可能である。したがって、ｉ番目の分子の強度に関する３つ以上のデータ値Ｄｉ０、Ｄｉ１、Ｄｉ２、…から、３つの未知の値：αｉ、Ｘｉ、および（最も興味深い）φｉ（ｚ）を決定するための３つ以上の式が得られる。３つの位相だけが存在する場合、３つの式からこれらの３つの未知量の一意解が得られるであろう。この値、特にφｉの値は、たとえば、ニュートン法により解くことが可能である。
【００６１】
３つの位相よりも多くの位相が存在する場合、４つ以上の式から３つの未知の値を決定することが可能であり、連立方程式は制約過剰である。その場合、未知量の最良値は、χ２最小化法を用いて決定可能である。次式の誤差を最小化することによる。
χｉ＝Σｊ［Ｄｉｊ−αｉ（１＋βｊｃｏｓ（φｉ＋φｊ））］２
【００６２】
十分にバランスのとれた干渉計システム（カメラ間位相シフト増分および均等化ゲインおよび均等化干渉効率を意味する）の近似として、次式により与えられるφｉの最良値を得ることが可能である。
ｔａｎ（φｉ）≒−ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ）
【００６３】
ｉ番目の発光体の位相φｉがわかった後、ｚ軸に沿った垂直方向位置δｉを次式により第一近似で推定することが可能である。ｎがサンプル環境の屈折率であることに留意されたい。
δｉ≒λ×φｉ／（４πｎ）＝λ／（４πｎ）×ａｔａｎ（ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ））
【００６４】
変位δについて解いたこの最後の式は、強度データから位相シフトを記述する。言い換えれば、この最後の式は、干渉顕微鏡システムの各レッグに対するディテクターで検出された強度データに基づいてどのように変位δを計算するかを示している。たとえば、三位相干渉顕微鏡システムでは、（φｊ）≒−２π／３、０、２π／３である。四位相干渉顕微鏡では、（φｊ）≒０、π／２、π、３π／２である。
【００６５】
変位δを計算するための以上の式は、種々の仮定に基づいていることに留意されたい。他の選択肢の実施形態では、他の仮定を用いて、変位δを計算するための１つ以上の代替手段を得ることが可能である。たとえば、高次の補正を実数部から計算することが可能であり、これにより、各干渉計レッグのＮ位相が等間隔で離間されるかまたは干渉計レッグの感度が等しいという近似が取り除かれる。他の選択肢の実施形態は、バランスがとれていない強度感度および位相混合角を校正および補正するための手段を提供するさらなる精密化を含みうる。
【００６６】
要約すると、Ｎ位相干渉計のＮ個のスポット強度は、垂直方向位置変位δに変換可能なデータＤｊになる。
【００６７】
φｉは周期解であるので、全２πに対して、一意的に決定可能な範囲は、λ／２ｎにわたる。これより厚いサンプルでは、δを決定するうえで、整数Ｎに対して±Ｎλ／２ｎだけあいまい性が存在する。測定される点広がり関数および干渉効率のような他の属性を用いて、可能性が最も高いＮを見いだしたりまたは多値解の最良値を選択したりすることが可能である。事実上、デフォーカスの範囲は、発光体が位置する場所でλ／２ｎ以内で推定するための代替的でそれほど精密ではないが適切な方法である。これを干渉計測により推定された位置と組み合わせることにより、発光体の一意的な垂直方向位置を得ることが可能である。垂直方向位置を推定する際のさらなる検討対象の一つは、ほぼＲａｙｌｅｉｇｈ長の距離ｚＲにわたり焦点でπだけ余分に前進させる余分項であるＧｏｕｙ位相を考慮することである。この場合、δは、次式を解くことにより与えられる。
φｉ≒４πδ／（ｎλ）＋ａｔａｎ（δ／ｚＲ）。
【００６８】
図２７は、本発明の実施形態に係る、多位相干渉顕微鏡システム内の光活性サンプルの三次元位置情報を取得するためのプロセスのフロー図を示している。２７１０では、サブ回折基準などの種々のスイッチャブル光源を画像化させて画像フレームシーケンスを生成する。２７１０でのこのプロセスは、サブプロセス２７１１および２７１２を含み、サブプロセスをｚ平面内の種々の位置に対して反復して画像フレームシーケンスを生成する。２７１１では、スイッチャブル光源を活性化および励起する。２７１２では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで画像フレームを取り込んで、２７１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性を含む。画像フレームは、スイッチャブル光源の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００６９】
２７２１では、スイッチャブル光源の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の発光分布を位置特定する。たとえば、特定のスイッチャブル光源は、ガウス分布に正確にあてはめうる発光分布を有する。そのようなガウス分布は、たとえば、発光体の画像の点広がり関数を表すことが可能である。２７２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、ドリフト補正フレームを２７２３で変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレームシーケンスの画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００７０】
２７２４では、ｚ平面内の各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた位相シフト画像フレームの合成体である。２７２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心を決定する。
【００７１】
変換フレームを２７２６でガウス分布のような所定の分布にあてはめ、２７２５で決定されたｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心で、各フレーム中のスイッチャブル光源の発光分布の振幅を測定する。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布の図心に基づきうる。２７２７では、スイッチャブル光源の発光分布の振幅を２７２４で決定された和に規格化する。２７２８では、以上の工程２５２８で記録された校正データと相関付けることにより、２７２７で決定された規格化振幅を用いてスイッチャブル光源のｚ平面座標を取得する。そのような校正データは、たとえば、ルックアップテーブルに記憶可能である。ｚ平面座標は、たとえば、次式で表される最小χ２を決定することにより規格化振幅に基づいて計算可能である。
［ＣＡ１（ｚ）−ＰＡ１］２＋［ＣＡ２（ｚ）−ＰＡ２］２＋［ＣＡ３（ｚ）−ＰＡ３］２＋．．．＋［ＣＡＮ（ｚ）−ＰＡＮ］２
式中、Ｎ＝システム中のディテクターの数であり、
ＣＡｉ（ｚ）＝ｚ平面内の特定のサンプル位置に対して校正時に決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅であり、
ＰＡｉ＝現在のＰＡＬＭ画像フレームから決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅である。
【００７２】
他の実施形態では、干渉顕微鏡観察システムは、第３の次元ｚによって異なる経路長差をさらに生成する発光ビームの異なる部分を使用しうる。そのような他の選択肢の実施形態について図１６〜２２に関連させて論述する。より詳細には、図１６は、２つの異なる潜在位置の単一量子発光体の概念図を示しており、図１７および１８は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示しており、図１９〜２１は、図１８のアニュラーエキスパンダーの例を示しており、図２２は、図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。これらの図について以下で論述する。
【００７３】
図１６は、２つの可能な位置の単一量子発光体の例を示している。そのような量子発光体は、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子（波長λ）は、図１７に示される対物レンズから離れる上方向および図１７に示される対物レンズ中に入る下方向などの全方向に伝搬するであろう。対物レンズ中に伝搬する放射光子のエネルギー部分は、ほぼ等しい強度の２つの平行ビーム、すなわち、「Ｂ」と記された内側円柱状ビームおよび「Ｃ」と記された外側環状ビーム標識化とみなしうる。内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃのサイズは、それらの強度が実質的に等しくなるように選択可能であり、そのような実質的に等しい強度は、ビームの非線形強度プロファイルに基づいて異なるビーム部分領域に対応する（たとえば、ビームエネルギーのピークは、ビームの縁に向かって減少する強度を有するビームの中心にある）。たとえば、「Ｂ」と記された内側ビーム部分は、全ビーム半径のほぼ１／３に等しい半径を有しうる。「Ｃ」と記された外側ビーム部分は、内側ビーム部分「Ｂ」の半径に対応する内半径と全ビームの半径に対応する外半径とを有しうる。
【００７４】
サンプルが正確に焦点が合っている場合、これらのビーム部分は、一致して同位相である（図１６の左側に示されるように）。しかしながら、発光体の位置変位Δｚが存在する場合（図１６の右側に示されるように）、位相ビーム部分ＢおよびＣは、それぞれ、ΔｉｎｎｅｒおよびΔｏｕｔｅｒだけ変位する。ただし、ΔｉｎｎｅｒはΔｚに等しく、ΔｏｕｔｅｒはΔｚ×ｃｏｓ（θ）に等しい。位相ビーム部分ＢおよびＣのこの変位は、外側ビーム部分Ｃのほうが少ない光路変化を受けてｃｏｓ（θ）倍になるという事実に基づく。ただし、θは、発光体からの光線の初期円錐角である。したがって、２つのビーム間の位相シフト差が残り、これは次の値に等しい。
δ＝２π（Δｉｎｎｅｒ−Δｏｕｔｅｒ）／λ＝Δｚ×（１−ｃｏｓ（θ））×２πｎ／（λ）。
【００７５】
位相が３６０度にわたり増加し反復するｚ範囲は、λ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））である。この単一対物レンズの実施形態に対するこのｚ範囲は、図１〜１１に関連して以上で述べた対向する対物レンズの実施形態のｚ範囲よりも長い。発光体の周りの光学環境の屈折率ｎは、位相シフトを再スケール調整する。単一対物レンズシステムの実施形態については、図１７〜２０に関連して以下でより詳細に論述する。
【００７６】
図１７は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示している。図１８は、図１７に示されるビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステムのシステムブロック図の例を示している。図１７に示されるように、干渉顕微鏡観察システムは、対物レンズ１７３０と、ミラー１７４４と、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０と、ミラー１７５６と、ビームスプリッター１７５４、１７５５、および１７５８と、レンズ１７６０、１７７０、および１７８０と、ディテクター１７６５、１７７５、および１７８５と、を含む。図１８に示されるように、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０は、ビームスプリッター１７４１と、ミラー１７４２〜１７４７と、アニュラーエキスパンダー１７４８と、アニュラーリデューサー１７４９と、を含む。
【００７７】
アニュラーエキスパンダー１７４８は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を拡大する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーエキスパンダー１７４８は、ミラー１７４２からの光の内側円柱状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）、より大きい外径を有する環形状を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を縮小する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーリデューサー１７４９は、ミラー１７４２からの光の外側環状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）、より小さい内径を有する内側円柱形状（またはより小さい環形状）を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）。
【００７８】
図１９〜２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図１９は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２０は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、そして図２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうちの３つの斜視図を示している。図１９〜２１に示されるように、アニュラーエキスパンダー１７４８は、アニュラーエキスパンダー１７４８の中心線の近傍に離間して配置された６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆを有する。ただし、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの一方の端は、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの他方の端によりまとめて画定される環状多面表面のサイズとは異なるサイズを有する環状多面表面をまとめて画定する。図１９に示されるように、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端から出る。図２０は、より大きい環状多面表面から、より小さい環状多面表面に向かって、ページ中の方向に見たアニュラーエキスパンダー１７４８の端面図を示している。明示的に示されていないが、アニュラーリデューサー１７４９は、アニュラーエキスパンダー１７４８と同様に構成される。ただし、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズムの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズムの端から出る。
【００７９】
次に、図１７および１８に戻って、システムを介して伝搬する光を参照しながら、三位相干渉顕微鏡観察システムについて説明する。図１７に示されるように、エネルギーは、サンプル（図１７中で「Ｓ」と記される）から放射され、そしてミラー１７４４によりビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の方向に反射される。ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の５０：５０ビームスプリッター１７４１（図１７に示される）は、光の一部をミラー１７４２に伝送し、光の残りの部分をミラー１７４３に伝送する。光を２つのビーム部分に分離するために、ミラー１７４２は、外側ビーム部分Ｃをミラー１７４５の方向に反射するとともに、内側ビーム部分のビームＢをミラー１７４４の方向に反射する。ミラー１７４５および１７４４は、それぞれ、外側ビーム部分Ｃおよび内側ビーム部分Ｂを、それぞれ、アニュラーエキスパンダー１７４８およびアニュラーリデューサー１７４９の方向に反射する。アニュラーエキスパンダー１７４８は、受光した光をミラー１７４６の方向に拡大し、このミラーは、拡大された光をビームスプリッター１７５４の方向に反射する（図１７に示される）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、その受光した光の半径をミラー１７４７の方向に縮小し、このミラーは、縮小された光を５０：５０ビームスプリッター１７５４の方向に反射する。
【００８０】
５０：５０ビームスプリッター１７５４は、ミラー１７４６および１７４７から受光した光の半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５の方向に反射し、光の残りの半分をミラー１７５６に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５４も同様に、ミラー１７４３からの受光した光の半分をミラー１７５６の方向に反射し、光の残りの半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５に伝送する。６６：３３ビームスプリッター１７５５は、受光したビームの３３％を５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射し、受光したビームの残りの６６％をレンズ１７６０の方向に伝送する。ミラー１７５６は、受光したビームを５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射するとともに余分の位相シフトを追加する。５０：５０ビームスプリッター１７５８は、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に反射し、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５８も同様に、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に反射し、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に伝送する。
【００８１】
光路長に差が存在するように、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８、ミラー１７５６、ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５を配置しうることに留意されたい。より詳細には、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５の間の光路距離ｘは、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびにミラー１７５６の間の距離ｘ＋δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒよりも短くすることが可能である。たとえば、２つの距離間の光路差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒを波長λの１／８になるように選択することが可能でありかつ波長λが５８０ｎｍであると仮定すると、２つの距離間の差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒは、７２ｎｍに選択可能である。
【００８２】
レンズ１７６０に伝送されたビーム、レンズ１７７０に伝送されたビーム、およびレンズ１７８０に伝送されたビームは、それぞれ、実質的に等しい振幅を有する。レンズ１７６０、１７７０、および１７８０は、それぞれ、それぞれのビームをディテクター１７６５、１７７５、および１７８５に集束させる。３つのディテクター１７６５、１７７５および１７８５のそれぞれでの発光画像の強度は、位相／ｚ位置の関数として変化する。なぜなら、３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５間の相対強度は、約１２０度の位相シフトを有するからである。図２２は、図１７に示される３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５により検出される強度をモニタリングすることにより、内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃの間の初期オフセットの位相シフトは、図１〜１１に関連して先に記載したように推定可能である。
【００８３】
この位相シフトδを用いて発光体のｚ位置を計算することが可能である。
Δｚ＝δλ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））。
【００８４】
いくつかの実施形態では、校正技術を用いて、ディテクターのバランスがとれていない強度感度および位相混合角を補正することが可能である。図１７〜２２に示される実施形態は、約１２０度の位相シフトを有する３つのディテクターに対して記述したものであるが、異なる数のディテクターを有する他の実施形態が可能である。さらに他の実施形態では、画像化スポット形状を用いて、いかなる周期的あいまい性または位置あいまい性をも解消することが可能である。他の選択肢として、位置計算用の追加情報として画像化スポット形状を使用することが可能である。
【００８５】
図２３〜２５は、本発明の他の実施形態に係る、アニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図２３は、アニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、図２４は、ラインＸＸ−ＸＸに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２５は、ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。図２３〜２５に示されるように、アニュラーエキスパンダー２３００は、６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆと、６つのミラー２３２０ａ〜２３２０ｆと、６つのミラー２３３０ａ〜２３３０ｆと、を有する。プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍に離間して配置される。ただし、６つのプリズムの一方の端は、６つのプリズムの他方の端によりまとめて画定される環状表面のサイズとは異なるサイズを有する環状表面をまとめて画定する。ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される内側中央部分内に配置される。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆ間の間隙により画定される外側部分の近傍に配置される。
【００８６】
図２４に示されるように、各プリズム２３１０は、入射面２３１０’および出射面２３１０”を含む。入射面２３１０’は、出射面２３１０”に平行であり、かつそれよりも小さい内半径および外半径を有する。各プリズム２３１０はまた、全内部反射（ＴＩＲ）の条件が満たされるように、入射面２３１０’および出射面２３１０”に対して角度を付けた２つの側壁２３１０’’’および２３１０’’’を含む。したがって、光は、入射面２３１０’で各プリズム２３１０に入り、側壁２３１０’’’でＴＩＲによる反射および側壁２３１０””でＴＩＲによる反射を受け、次に、出射面２３１０”から出る。このようにすれば、アニュラーエキスパンダー２３００を出る時に入射光の半径を拡大することが可能になる。
【００８７】
図２５に示されるように、ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、それぞれ、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線に沿ってかつその近傍でミラー２３３０ａ〜２３３０ｆの方向に外向きに光を反射する。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される間隙間に受光した光を反射する。たとえば、ミラー２３２０ａは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍で光の一部をミラー２３３０ａの方向に反射し、ミラー２３３０ａは、プリズム２３１０ａおよびプリズム２３１０ｂとの間に画定された間隙間にこの光を反射する。全体として、これにより光の中央部分を拡大して、増大されたスループットを提供することが可能になる。
【００８８】
明示的に示されていないが、アニュラーリデューサーは、アニュラーエキスパンダー２３１０と同様に構成することが可能である。ただし、光は、より大きい環状表面を画定するプリズムの端に入り、より小さい環状表面を画定するプリズムの端から出る。図１９〜２０および２３〜２５に示される実施形態は、特定の屈折素子および／または反射素子を用いて示されているが、他の実施形態および配置、たとえば、回折素子またはそれらの任意の組合せを有する実施形態も可能である。
【００８９】
いくつかの実施形態は、プロセッサーと、種々のプロセッサー実行操作を行うための命令またはコンピューターコードを有する関連プロセッサー可読媒体と、を含む。そのようなプロセッサーは、内蔵マイクロプロセッサー、コンピューターシステムの一部としてのマイクロプロセッサー、特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）、およびプログラマブルロジックデバイス（「ＰＬＤ」）のようなハードウェアモジュールとして実装可能である。そのようなプロセッサーはまた、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、Ｃ、アセンブラーのようなプログラミング言語、ハードウェア記述言語、または任意の他の好適なプログラミング言語で記述された１つ以上のソフトウェアモジュールとして実装することも可能である。いくつかの実施形態に係るプロセッサーは、１つもしくは複数の特定目的のために特別に設計および構成された媒体およびコンピューターコード（コードと呼ばれることもある）を含む。プロセッサー可読媒体の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。磁気記憶媒体、たとえば、ハードディスク、フロッピーディスク（登録商標）、および磁気テープ、光記憶媒体、たとえば、コンパクトディスク／ディジタルビデオディスク（「ＣＤ／ＤＶＤ」）、コンパクトディスクリードオンリーメモリー（「ＣＤ−ＲＯＭ」）、およびホログラフィックデバイス、光磁気記憶媒体、たとえば、フロッピーディスク（登録商標）ならびにリードオンリーメモリー（「ＲＯＭ」）デバイスおよびランダムアクセスメモリー（「ＲＡＭ」）デバイス。コンピューターコードの例としては、マイクロコードまたはマイクロ命令、機械命令、たとえば、コンパイラーにより生成されるもの、およびインタープリターを用いてコンピューターにより実行されるより高レベルの命令を含有するファイルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、本発明の実施形態は、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、または他のオブジェクト指向型プログラミング言語、および開発ツールを用いて実施可能である。コンピューターコードのそのほかの例としては、制御信号、暗号化コード、および圧縮コードが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
特定の実施形態を以上に示して説明してきたが、形態および細部にさまざまな変更を加えうることは、当業者であればわかるであろう。たとえば、照明技術の変更が可能であり、それにより強度データのモジュロλ／２周期性を改良することが可能である。それに加えて、Betzig参考文献に記載の種々の実施形態を本明細書に記載の種々の実施形態と組み合わせることが可能である。たとえば、一実施形態では、トップ／ボトムＴＩＲＦ照明を行って、一波長λまでの厚さを有するサンプルを測定することが可能である。他の選択肢の実施形態では、短パルスのコヒーレント再位相調整により照明平面を形成することが可能である。さらに他の実施形態では、サンプルの種々の高さのｚ座標でガウシアンウエストを形成する側方照明により、物理的セクション化に頼ることなくｚ座標方向の範囲をさらに拡張することが可能である。したがって、当然のことながら、本明細書に記載のシステムは、さまざまな記載の実施形態の素子および／または特徴部のさまざまな組合せおよび／または部分的組合せを含みうる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８７１，３６６号ならびに「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００７年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９０８，３０７号（いずれも参照によりその全体が本明細書に援用されるものとする）に基づく優先権を主張する。本出願はまた、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称の米国特許出願第１１／９６１，６０１号（その全体が参照により本明細書に援用されるものとする）に基づく優先権を主張するものでありかつその継続出願である。
【０００２】
背景
本発明は、一般的には、干渉顕微鏡観察、たとえば、光活性蛍光タンパク質分子から光を内部放射するサンプルのように、空間分解可能な点光源で構成されたもしくは標識されたサンプルの干渉顕微鏡観察、および／または第３の次元（たとえばｚ座標）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で位置情報を測定するために位相差が測定される干渉顕微鏡観察に関する。
【背景技術】
【０００３】
干渉位相を測定する顕微鏡観察システムは公知である。たとえば、１つの公知の顕微鏡観察システムは、外部光源で対象物の延在表面を照明することにより干渉位相を測定する。サンプルから反射された光は、ビームスプリッター中で参照ビームと干渉する。干渉ビームは、ディテクター上に画像化される。参照ビームとサンプルビームとの光路差は、出力干渉ビームの振幅を変調して、対象物の高さの尺度を提供することが可能である。
【０００４】
また、対向する対物レンズを介してサンプルからの２つのビームを干渉させて１つの干渉出力ビームだけを測定する顕微鏡観察システムも公知である。そのような顕微鏡観察システムは、位相を明示的に測定しない。こうした顕微鏡観察システムは、軸方向次元で構造を解像することが可能である。
【０００５】
しかしながら、そのような公知の顕微鏡観察システムは、いくつかの欠点を抱えている。たとえば、そのようなシステムは、生物学で多く見受けられる蛍光標識サンプルに適用することができない。なぜなら、内部供給蛍光線が、蛍光励起に使用されるいずれの外部供給参照ビームに対しても使用可能な位相関係を有していないからである。参照ビームを用いなければ、干渉を達成することはできない。それに加えて、明滅する蛍光分子または他の単一光子源の場合のように、放射線が一過性であるかまたは強く時間変動する場合、単一位相型もしくは逐次位相型の干渉測定を用いて振幅から干渉位相を分離することはできない。したがって、単一の干渉測定または時系列の測定から、位相および位置情報の定量的尺度を導出することはできない。最後に、遠視野干渉システムの横方向分解能は、アッベ回折長λ／２ＮＡにより制限される。ただし、λは波長であり、かつＮＡは開口数である。したがって、改良された顕微鏡観察システムの必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
一実施形態では、装置は、複数のディテクターとプロセッサーとを有する光学システムを含む。光学システムは、所与の時間で、各ディテクターで、第１の次元と第１の次元に実質的に直交する第２の次元とで、光源の画像を生成するように構成される。画像の各画像は、光源からの第１の方向の発光と、光源からの第１の方向とは異なる第２の方向の発光と、の干渉に基づく。プロセッサーは、画像に基づいて第３の次元で位置を計算するように構成される。第３の次元は、第１の次元と第２の次元とに実質的に直交する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、蛍光標識でタグ付けされた対象分子は、回折限界よりも良好な確度で三次元で位置特定が可能である。そのような実施形態では、画像に関連付けられる位相情報を用いてｚ座標で分子の位置に関する情報を決定することが可能であり、結果的に、三次元でサブ回折確度＜＜λ／２を有する３Ｄ（三次元）表現を達成することが可能である。言い換えれば、第３の次元（たとえばｚ座標）で分子の位置に関する情報を得ることが可能であると同時に、２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で分子の位置に関する情報を得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の簡単な説明
【図１】本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのシステムブロック図を示している。
【図２】本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡システムおよび単一発光体サンプルのシステムブロック図を示している。
【図３】図２の２つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図４】本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡システムおよび延在サンプルのシステムブロック図を示している。
【図５】図４の２つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図６】本発明の実施形態に係る、ビーム位相表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図７Ａ】図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。
【図７Ｂ】図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。
【図７Ｃ】図７Ａに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフを示している。
【図７Ｄ】７Ｂに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフを示している。
【図８】本発明の実施形態に係る、三位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図８Ａ】本発明の実施形態に係る、三方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。
【図８Ｂ】本発明のさらに他の実施形態に係る、八方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。
【図９】図８の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図１０】本発明の実施形態に係る、三方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。
【図１０Ａ】本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。
【図１０Ｂ】本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。
【図１０Ｃ】本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。
【図１１】図１０に示される三方向ビームスプリッターの斜視図を示している。
【図１２】本発明の実施形態に係る、四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図１３】図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図１４】本発明の実施形態に係る、回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図１５】本発明の実施形態に係る、回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【図１６】２つの異なる潜在位置にある単一量子発光体の概念図を示している。
【図１７】本発明の実施形態に係る、単一対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。
【図１８】図１７に示されるビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステムのシステムブロック図の例を示している。
【図１９】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。
【図２０】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図を示している。
【図２１】図１７に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうちの３つの斜視図を示している。
【図２２】図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。
【図２３】本発明の他の実施形態に係る、アニュラーエキスパンダーの端面図を示している。
【図２４】ラインＸＸ−ＸＸに沿った図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。
【図２５】ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿った図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。
【図２６】本発明の実施形態に係る、多位相干渉顕微鏡システムのための校正プロセスのフロー図を示している。
【図２７】本発明の実施形態に係る、多位相干渉顕微鏡システム内の光活性サンプルの三次元位置情報を取得するためのプロセスのフロー図を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
広義には、本明細書に記載の１つ以上の実施形態により、公知の光学顕微鏡観察よりも良好な解像度を有する三次元レンダリングを生成することが可能である。いくつかの実施形態では、干渉顕微鏡で位相差を測定することにより、第３の次元（たとえばｚ座標）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で位置情報を測定することが可能である。いくつかの実施形態では、一群の点光源を含有するサンプル、たとえば、光活性蛍光標識から光を内部放射するサンプルを干渉顕微鏡で測定することが可能である。
【００１０】
たとえば、サンプル中の特定の標識タンパク質の三次元レンダリングを生成することが可能である。特定の標識タンパク質によりコントラストを与えることが可能であるが、なおかつ専用の光学顕微鏡を用いてコントラストを得ることが可能である。たとえば、１つ以上の実施形態を用いて、全３Ｄ位置で細胞内の蛍光標識タンパク質の位置を決定することが可能である。
【００１１】
公知の顕微鏡観察システムの１つは、光活性化位置特定顕微鏡観察（「ＰＡＬＭ」）システムである。このＰＡＬＭシステムは、次の参考文献（参照により本明細書に援用されるものとする）に記載されている。「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００５年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６８３，３３７号、「ほぼ分子分解能での細胞内蛍光タンパク質のイメージング(Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Near-Molecular Resolution)」という名称で２００６年３月１０日出願に出願された米国仮特許出願第６０／７８０，９６８号、「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００６年５月２３日に出願されかつＰＣＴ国際公開第２００６／１２７６８２号として２００５年１１月１１日に公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９８８７号、Betzig, E. et al., "Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution," Science, Vol. 313, September 15, 2006、およびBetzig, E. et al., "Supporting online Material for 'Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution'," Science Express, August 10, 2006, [online] www.sciencemag.org/cgi/content/full/1127344/DC1（本明細書中ではまとめて「Betzig参考文献」と記す）。
【００１２】
ＰＡＬＭシステムは、主に二次元のｘ，ｙ画像平面内で分子の位置を特定して、回折限界顕微鏡のものよりも優れた高解像度画像を提供する。第３の次元で標識分子の位置に関する情報を取得する公知の方式の１つは、いくつかのセクションでデータを取り出すかまたは焦点面までの距離に依存するデフォーカス分子の点広がり関数変動の定量化によるなどの逐次プロセスを含む。
【００１３】
２Ｄ ＰＡＬＭシステムの場合と同様に、ここでのスイッチャブル光学標識は、ＰＡ−ＧＦＰのような光活性蛍光タンパク質でありうる。ＰＡ−ＧＦＰは、ＧＦＰの光活性蛍光タンパク質変異体であり、４０５ｎｍの光を照射することにより非蛍光形からアニオン形に変換可能であり、アニオン形は、５００ｎｍの励起線を吸収して５２０ｎｍの蛍光線を発する。他の光活性タンパク質は、Ｄｒｏｎｐａ、Ｅｏｓ、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ−ＦＰ、ＰＡ−ＣＦＰであり、その多くは、単量体形、二量体形、および四量体形で使用可能である。そのようなタンパク質は、対象タンパク質を標識するように遺伝子発現および遺伝子結合が可能である。これによりタンパク質特異的画像を構築することが可能である。種々のケージド染料分子を使用することも可能であるが、それらは典型的には免疫標識スキームまたはそれに代わる結合スキームを必要とする。こうしたタンパク質／標識のいくつかは、十分に異なる光物理的性質、たとえば、発光波長、励起波長、または脱色速度を有するので、２つの異なるスイッチャブル光学標識を用いて画像を作成することが可能である。この場合、ビーム経路中にダイクロイックミラーを追加することにより、この３Ｄ干渉顕微鏡観察のための新しい第２さらには第３の一連の画像を得ることが可能である。１種のタンパク質の画像化および脱色を行ってから第２のタンパク質の画像化を行うように取得処理を順序付けることは、異なる標識タンパク質を画像化するもう１つの方法である。
【００１４】
しかしながら、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、光路長差の位相角情報を使用することにより、二次元強度画像（これから標識分子のｘ，ｙ位置を決定することが可能である）および位相依存性画像（これから標識分子のｚ位置を決定することが可能である）の両方を同時に取得することが可能であり、かつ再構築することが可能である。言い換えれば、サンプルからの２つ以上の発光ビームを２つ以上のビームにさらにスプリットして互いにペアワイズ干渉させ（それらの異なる位相に基づいて）、得られた干渉ビームで画像を形成し、画像を同時に記録してサンプルの局在化光源の経路長差の位相（すなわちｚ位置）を再構築する。それに加えて、いくつかの実施形態では、干渉振幅を抽出して垂直方向位置の追加的尺度として使用することも可能である。
【００１５】
そのような実施形態は、多くの点で有利である。たとえば、以上で述べたように、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、位相差を測定することにより、第３の次元（たとえばｚ座標）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ座標およびｙ座標）で位置情報を測定することが可能である。これにより３つの次元すべてで測定が可能になり、この測定は、こうした測定がさまざま時点で行われる公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、たとえば、時間変化する明るさを有する光活性サンプルのように静的でないサンプルに特に有利でありうる。
【００１６】
以上にも述べたように、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、測定されるサンプルの成分は、サブ回折サイズの点光源として分離可能かつ同定可能である。これにより可能になる測定は、明確な画定が可能であるとともに、測定サンプル成分が位置の分布を有する拡張光源でありかつ光源の種々の部分が光源の他の部分と干渉する可能性がある公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、回折限界未満の確度で測定を行うのに特に有利でありうる。
【００１７】
図１は、本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのシステムブロック図を示している。図１に示されるように、顕微鏡観察システム１００は、光学素子１３０および１４０と、ビームスプリッター１５０と、光学素子１６０および１７０と、ディテクター１６５および１７５と、を含む。
【００１８】
光学素子１３０および１４０は、サンプルＳからビームスプリッター１５０までそれぞれ光路１３２および１４２を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１３０および１４０は、それぞれ、一連のミラー、レンズ、または対物レンズを含みうる。光学素子１３０および１４０は、たとえば、サンプルの点光源から放出される光エネルギーを平行化するレンズまたは対物レンズを含みうる。図１には２つの光学素子１３０および１４０中に至る２つの反対方向を向いて対向する経路１３２および１４２が示されているが、以下で論述されるいくつかの実施形態では、光学素子１４０のような単一の光学素子は、２つの対向しない経路１３２および１４２を含みうる。
【００１９】
光学素子１３０および／または１４０は、サンプルＳが１種以上の活性化源を受容できるようにする追加の素子および／特徴部を含みうる。たとえば、いくつかの実施形態では、光源（図１には示されていない）からの光エネルギーを用いることによりサンプルＳの蛍光応答を活性化させて励起光子を生成することが可能である。そのような実施形態では、たとえば、光学素子１３０および／または１４０は、アパーチャーを含みうる。そしてディテクター１６５および／または１７５に向かって逆行する励起レーザーからの迷光放射を最小限に抑えつつ、アパーチャーを介して光源からの光エネルギーをサンプルＳに照射することが可能である。また、主に蛍光がディテクターに達するように、ディテクター１６５および／または１７５に至るビーム経路中にレーザーラインフィルターを存在させることも可能である。第１のレーザー光源は、たとえば、活性化ビームをサンプルＳに照射することが可能であり、かつ第２のレーザー光源は、たとえば、励起ビームをサンプルＳに照射することが可能である。他の実施形態では、レーザー以外の光源、たとえば、発光ダイオード、白熱ランプなどを活性化用および／または励起用の光源として使用することが可能である。以上で参照により援用されたBetzig参考文献にさらに詳細に記載されているように、活性化ビームは、サンプル中の個別に解像可能な光活性標識の十分に散在したサブセットを活性化させるように構成され、かつ励起ビームは、サンプルＳの活性化部分を励起して蛍光に基づく光子を放出させるように構成される。
【００２０】
他の選択肢の実施形態では、１種以上の化学物質を用いてサンプルの蛍光応答を活性化させることが可能である。そのような他の選択肢の実施形態では、サンプルを第１の化学物質に暴露してサンプルの分子の蛍光性散在サブセットを活性化させることが可能であり、続いて、光脱色を用いない場合、第２の化学物質に暴露してサンプルの蛍光を失活させることが可能である。
【００２１】
ビームスプリッター１５０は、任意のタイプの適切な光学素子でありうる。ただし、この光学素子は、光路１３２および１４２に沿って光エネルギーを受け取って組み合わせて、かつ組み合わされ混合された光エネルギーを光路１５２および１５４（それぞれ本明細書中では「レッグ」とも記す）に沿って光学素子１６０および１７０に伝送する。たとえば、ビームスプリッター１５０は、５０：５０ビームスプリッターでありうる。この場合、組み合わされた光エネルギーはスプリットされて、組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５２で伝送され、かつ組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５４で伝送される。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０により干渉され混合されるので、光路１５２に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づく。同様に、光路１３２および１４２に沿った光エネルギーは、ビームスプリッター１５０中で干渉され混合されるので、光路１５４に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づき、この相対位相差は、光路１５２に沿った光エネルギーに関連付けられる相対位相差とは異なる。この実施形態では、光路１５２に沿って得られる光エネルギーと光路１５４に沿って得られる光エネルギーとは、位相が約１８０度異なる。他の選択肢として、ビームスプリッター１５０により、６６：３３、７０：３０などのような任意の所望の割合にビームを分割することが可能である。さらに他の実施形態では、ビームスプリッター１５０は、複数のビームスプリッターの組合せでありうる。そのようなビームスプリッターは、たとえば、２つのガラスセグメントと２つのガラスセグメント間に配設された薄膜コーティングとのブロックから構成可能である。そのようなビームスプリッターは、３つ以上の出力、すなわち、１５２および１５８の２つよりも多くの出力を生成することが可能である。これにより、２つのビームの場合の０度および１８０度ではなく、３つ以上の干渉位相角（たとえば、０度、１２０度、および２４０度）で３つ以上の出力ビームを表現することが可能になる。さらに他の実施形態では、薄膜コーティングを有するビームスプリッターに加えてまたはその代わりに、回折グレーティングをビームスプリッターとして使用することが可能であり、かつそれによりビームを２つ以上のビームに分割することが可能である。また、グレーティングにより複数の入力ビームを受け取って、それらを混合して干渉させ、種々の出力ビームを生成することが可能である。いくつかの実施形態では、スイッチャブル散乱中心を有する標識（たとえば、活性散乱特性を有する光スイッチャブル標識）のように実質的に同一の波長で発光する点光源を有するサンプルと組み合わせて、回折グレーティングを使用することが可能である。実質的に同一の波長で発光する点光源を有するそのようなサンプルでは、回折グレーティングにより、入力ビームの波長の関数である比較的狭い偏向角で入力ビームを有利に偏向させることが可能である。
【００２２】
他の実施形態では、ビームスプリッターのうちの１つ以上は、回折グレーティングまたは薄膜コーティングの代わりにストライプ状ミラー部分を含みうる。一実施形態では、ストライプ状ミラー部分は、回折次数により画像平面内に再集光されないように、十分に小さいストライプ周期を有する。波長λ、焦点距離ｆ、および画像サイズｄの場合、これは、ｆλ／ｄ未満の周期を意味する。正方形もしくは六角形のポルカドットのような他のパターンを使用することが可能である。しかしながら、画像中のゴースト発生を防止するために、同一条件のポルカドット周期（すなわちｆλ／ｄ未満）を保持しなければならない。
【００２３】
光学素子１３０および１４０のときと同様に、光学素子１６０および１７０は、ビームスプリッター１５０からそれぞれディテクター１６５および１７５までそれぞれ光路１５２および１５４を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１６０および１７０は、光エネルギーがそれぞれディテクター１６５および１７５に集束するように、それぞれ光路１５２および１５４からの光エネルギーを非平行にするレンズでありうる。いくつかの実施形態では、光学素子１３０、１４０、１６０、および１７０、ならびに／またはビームスプリッター１５０のような光学素子のうちの１つ以上は、補償光学素子を含みうる。
【００２４】
使用時、サンプルＳ中の個別画像化標識の統計学的散在サブセットを活性化した後、測定が行われる。以上で述べたように、サンプルＳ中の標識の統計学的散在サブセットは、適切な技術により、たとえば、光活性化または化学的活性化により、活性化可能である。活性化の後、レーザーのような励起光源によりサンプルＳを励起することが可能である。この結果として、サンプルＳから光路１３２および１４２に沿って光子が放出されて光学素子１３０および１４０を介してビームスプリッター１５０に達する。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０で組み合わされ、そして経路１５２および１５４に沿って伝送されてそれぞれ光学素子１６０および１７０を介してディテクター１６５および１７５に達する。ビーム１３２および１４２の間の位相差により干渉が引き起こされ、そしてディテクター１６５および１７５において検出信号の強度が変調される。以下でさらに詳細に説明されるように、この強度を用いてｚ座標の位置を決定することが可能である。それに加えて、ディテクター１６５および１７５における検出信号は、ｘ、ｙ座標の位置情報をも提供する。検出信号を収集した後、それらの標識からさらなる光信号を検出できなくなるように、サンプルＳ中の標識の活性化散在サブセットを反復励起により脱色することが可能であり、次に、追加の測定に供すべく、標識のさらなる散在サブセットを活性化し励起することが可能であり、そしてプロセスは反復される。
【００２５】
図２は、本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび単一活性発光体を有するサンプルのシステムブロック図を示している。図２に示されるように、単一量子発光体Ｓは、中心位置２２０から距離δの位置に配置される。単一量子発光体Ｓは、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子は、量子発光体Ｓから上向きにレンズ２３０中にも下向きにレンズ２４０中にも逃散可能であり、これらのレンズでは、それぞれ、２つの平行ビーム２３２および２４２が形成される。平行ビーム２３２および２４２は、それぞれ、ミラー２３４および２４４により反射されて、ビームスプリッター２５０で受光される。
【００２６】
２つのビーム経路は、次のように画定される。すなわち、量子発光体Ｓからミラー２３４までおよびミラー２３４からビームスプリッター２５０までの第１のビーム経路（トップ経路とも呼ばれる）、ならびに量子発光体Ｓからミラー２４４までおよびミラー２４４からビームスプリッター２５０までの第２のビーム経路（ボトム経路とも呼ばれる）。ミラー２３４および２４４ならびにビームスプリッター２５０は、ビーム経路の長さがほぼ波長レベルまで一致するように、すなわち、（Ｌ１＋Ｌ２）ｔｏｐ＝（Ｌ１＋Ｌ２）ｂｏｔｔｏｍになるように、量子発光体Ｓに対して定置される。ただし、発光体の位置変位δおよびトップビーム経路での９０度の位相シフトは除く。式中、Ｌ１は、中心位置２２０とミラー２３４または２４４との間の経路長であり、かつＬ２は、ミラー２３４または２４４とビームスプリッター２５０との間の経路長である。この場合、トップビーム経路中の光ビームの電界は、次のとおりである。
Ｅ１＝Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）、
式中、ｋ＝２π／λ。
【００２７】
ボトムビーム経路中の光ビームの電界は、次のとおりである。
Ｅ２＝Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２）。
【００２８】
ビームスプリッター２５０で受光された時、光ビームは、組み合わされ、そしてレンズ２６０および２７０を介してそれぞれ２つのディテクター２６５および２７５に伝送される。各ディテクター２６５および２７０に向かって伝搬する１つの光源からの光ビームの電界は、次のとおりである。
Ｅ１２＝１／２０．５×（Ｅ１±Ｅ２）＝
１／２０．５×（Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）±Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２））。
【００２９】
この実施形態では、ディテクター２６５および２７５は、それぞれ、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）ディテクターまたは（単一蛍光分子に対する感度向上のために）電子増倍電荷結合ディテクター（ＥＭＣＣＤ）である。図３に示されるように、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５およびディテクター２７５で検出される放射光の強度３７５は、位相４πδ／λを有して正弦パターンで変化する。より詳細には、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５は、次のとおりである。
Ｉ１＝１／２×（Ｅ１＋Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ））。
【００３０】
ディテクター２７５で検出される放射光の強度２７５は、次のとおりである。
Ｉ２＝１／２０．５×（Ｅ１−Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ＋π））。
【００３１】
次に、２つの強度式の組合せおよび逆転を行うことにより、次のように変位を計算することが可能である。
（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２）＝ｓｉｎ（４πδ／λ）またはδ＝λａｒｃｓｉｎ（（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２））／４π
【００３２】
これは、図４に示されるような顕微鏡観察システムに一般化することができる。より詳細には、図４は、本発明の実施形態に係る、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび延在サンプルのシステムブロック図を示している。図４に示されるように、顕微鏡観察システムは、画像平面がディテクター４６５および４７５に画定されるように、顕微鏡対物レンズ４３０および４４０ならびにレンズ４６０および４７０を含む。サンプルＳの任意の点光源は、ディテクター４６５および４７５に画定される各画像平面上に分解能限界のスポットを形成するであろう。
【００３３】
次に、空間的に一体化されたスポットの強度を用いて、以上に記載の強度式によりサンプルの点光源のｚ座標位置を計算することが可能である。ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、または他の大面積ディテクターを用いることにより、複数の画像スポットを同時に検出することが可能であり、かつサンプル３１０の各関連部分のｚ変位δを実質的に同時に確定することが可能である。検出される光信号の位相を１ラジアンの何分の一まで決定することが可能であるので、波長の何分の一よりも良好なレベル（たとえば＜２０％）で位置情報を決定することが可能である。たとえば、λ＝６００ｎｍの波長では、δ＝５０ｎｍに対応する１ラジアン未満まで位置情報を決定することが可能である。そのような干渉システムは、光源発光体のｘ，ｙ位置もまたナノメートルスケール分解能で測定できるように構成可能である。
【００３４】
サンプルの厚さは、一意的なｚ座標位置を測定しうる範囲に影響を及ぼす可能性がある。たとえば、図２または４に示される二位相の実施形態では、サンプル２１０の厚さはλ／４未満であり、その場合、一意的なｚ座標位置を測定することが可能である。こうした実施形態での変位δの感度は、一様でない。言い換えれば、図３および５に示されるように、強度が正弦波の最小または最大の近傍で決定されるような位相の場合、勾配はゼロに近づくので、感度はゼロに近づく。しかしながら、強度が正弦波の最小または最大から離れて決定されるような位相の場合、こうした実施形態での変位δの感度は、測定可能でありゼロではない。
【００３５】
図６は、本発明の実施形態に係る、ビーム位相表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。ビーム４３２は、ビーム４４２の位相とは異なる位相を有し、かつ出力ビーム４５２は、位相が異なる成分４５２’および４５２”を含む。ビーム成分４５２’および４５２”は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５２’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５２”はビーム４４２に由来する。同様に、出力ビーム４５４は、位相が異なる成分４５４’および４５４”を含む。ビーム成分４５４’および４５４”は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５４’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５４”はビーム４４２に由来する。この実施形態では、ビーム成分４５２’および４５２”の間の位相差は、ディテクターＣＣＤφ１で検出される強度を決定し、かつビーム成分４５４’および４５４”の間の位相差は、ディテクターＣＣＤφ２で検出される強度を決定する。
【００３６】
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。図６の出力ビーム４５２および４５４は、入力ビーム４３２および４４２の成分を含む。図７Ａに示されるように、４５２’および４５２”は、出力ビーム４５２の成分であり、かつ位相差４８０だけ位相が分離されている。図７Ｂに示されるように、４５４’および４５４”は、出力ビーム４５４の成分であり、位相差４９０だけ位相が分離されている。これらの位相差の差は、対象物の位置の関数として変化するであろう。図７Ａに示されるビームの二乗和は、図７Ｃに示される強度を有するビームを生成し、同様に、表示された図７Ｂ中のビームの二乗和は、図７Ｄに示される強度を有するビームを生成する。これらの２つのビームＩ１およびＩ２の相対強度は、干渉位相を決定し、それにより鉛直方向変位δを決定する。
【００３７】
他の選択肢の実施形態では、干渉顕微鏡観察システムは、二位相よりも多くの位相を有しうる。たとえば、図８は、本発明の実施形態に係る、三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図９は、適切に干渉されて図８の３つのディテクターで検出された場合の点光源からの放射光の強度のグラフを示している。
【００３８】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの実施形態を示している。２つの発光ビーム１０１０および１０２０は、５０−５０ビームスプリッティング表面１０５０に入る。２つの得られた干渉ビームは、上側６６：３３ビームスプリッティング表面１０４０および下側ミラー表面１０７０に進行する。上側ビームのほとんど（６６％）は、出力経路１０３０に入り、３３％は、経路１０２８に進行して、ミラー表面１０７０から反射されたビーム１０２４と干渉する。この最終干渉は、５０：５０ビームスプリッティング表面１０５２で起こり、第２および第３の出力ビーム１０３２および１０３４を生じる。３つの出力間でバランスのとれた三方向干渉（すなわち、出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４に対して類似の振幅）を得るために、ミラー１０７０の位置を変化させてギャップ１０６０を変化させることにより干渉ビーム１０２８および１０２４の位相を調整することが可能である。ガラスプリズムの底面上の残留反射率を最小限に抑えるために、ギャップ１０６０に屈折率整合油を充填することが可能である。
【００３９】
図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、本発明の実施形態に係る、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。ビーム経路中の望ましくない干渉を低減するために、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される各ストライプ状ミラーは、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される他のストライプ状ミラーに対して回転されている。
【００４０】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの実施形態を介して対象物および画像平面に関連付けられた波面の伝搬をさらに示している。波面１０１２および１０２２を有する発光ビーム１０１０および１０２０は、ビームスプリッティング表面１０５０に入る。波面１０１２および１０２２は、サンプルの対象物平面に関連付けられ、かつビームスプリッティング表面１０５０で互いに干渉される。得られた波面は、三方向ビームスプリッターを通って伝搬する時、ビームスプリッティング表面１０４０および１０５２で互いに干渉する。ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２は、ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２での干渉時に波面の歪みまたは広がりに適合するのに十分な表面積を有する。出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４は、１０３６、１０３８、および１０３９の相対位相シフトでビーム１０１０および１０２０を組み合わせた状態で三方向ビームスプリッターから送出される。これにより異なる強度のビーム１０３０、１０３２、および１０３が得られ、これらは、波面１０１２および１０２２のインタクトな干渉形であり、ディテクターの画像平面に伝搬する。
【００４１】
図１２は、本発明の実施形態に係る、四位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図１３は、図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。図８〜１２は、三位相もしくは四位相の干渉顕微鏡観察システムを有する実施形態を示しているが、四位相よりも多くの位相を有するシステム、たとえば、五位相干渉顕微鏡観察システム、六位相干渉顕微鏡観察システムなども可能である。
【００４２】
二位相干渉顕微鏡観察システムでは、たとえば、図２に示される５０：５０ビームスプリッター２５０のようなビームスプリッターを使用することが可能であるが、二位相よりも多くの位相を有する顕微鏡観察システム用のビームスプリッター（たとえば、図８に示されるもの）を多種多様な方法で具現化することが可能である。たとえば、図８に示されるように、ビームスプリッターは、複数の素子、すなわち、２つの５０：５０ビームスプリッター、６６：３３ビームスプリッター、およびミラーを含みうる。こうしたビームスプリッター素子は、たとえば、光学ベンチ上に手動で定置することが可能である。他の選択肢として、こうしたビームスプリッター素子を作製して１対の光学平面間に配設することが可能であり、そのようなビームスプリッター素子の位置を、たとえば、圧電トランスデューサーによる調整することが可能である。そのような調整を行えば、３本のレッグの位相シフトを２π／３だけ離間させたりまたはＮ本のレッグの実施形態の場合には２π／Ｎだけ離間させたりすることを保証できるようになり、しかも、スプリッティング平面の平行性を確保することも保証できるようになる。三方向ビームスプリッターの他の選択肢の実施形態を図８Ａに示す。
【００４３】
図８Ｂは、本発明のさらに他の実施形態に係る、八方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。図８Ｂに示されるように、ビームスプリッターは、複数のビームスプリッター素子を含む。それらはいずれも、破線で表されている。図８Ｂは、８本の出力ビームを生成する１６個のビームスプリッター素子を有するビームスプリッターを明示的に示しているが、当然のことながら、Ｎ本の出力ビームを生成するより多数もしくはより少数のビームスプリッター素子の場合にもこの基本構造に従うことが可能である。こうしたビームスプリッター素子は、０〜１００％の範囲内の反射率を有しうる。透過率は公称でありうる。ビームスプリッター素子の表面が実質的に互いに平行である場合、ビームの実質的に全部（またはビームの一部）（直径Ｄを有する）は、元の入力ビームＡおよびＢの反射ビーム部分またはそれらからスプリットされた他のビーム部分にコヒーレントに干渉可能である。ビームスプリッター素子の表面は、実質的に平行でありうる。たとえば、それぞれ、＜λ／Ｄの角度の範囲内である。また、ビームスプリッター素子は、入力ビームのコヒーレンス長λ２／（ｎΔλ）の範囲内で等しく離間される。ただし、λは波長であり、Δλは波長の範囲であり、かつｎは媒体の屈折率である。この隔間により、干渉は、対象のビーム波長範囲ｄｌにわたり実質的にコヒーレントであることが保証される。入力ビームＡおよびＢは、Ａ−Ｂがビームスプリッターの平面に対して法線方向のベクトルになるように方向ベクトルを有してビームスプリッターに入る。両入力ビームは、第１のビームスプリッター素子上の同一点に向けられる。ビームスプリッターが平行平面構造であれば、ある範囲内のビーム角で自己干渉が可能になり、このビーム角範囲は、たとえば、いわゆるＣＣＤディテクター（図８Ｂには示されていない）の画像平面上に集束する前のビームの平行部分の画像に関連付けられる角度範囲に対応しうる。いくつかの実施形態では、１本だけの入力ビーム（たとえば入力ビームＡまたは入力ビームＢ）が適用される場合、Ｎ本の出力ビーム（図８Ｂはｎ＝８の場合を示す）に実質的に等しくスプリットされることが保証されるように、各ビームスプリッター素子の反射率およびビームスプリッター素子間の微細間隔（コヒーレンス長未満であるが干渉角を制御するのに十分である）を変化させることが可能である。さらには、いくつかの実施形態では、入力ビームＡと入力ビームＢとの間の干渉角を３６０度／Ｎの異なる間隔に設定することが可能である。したがって、Ｎ＝８である図８Ｂに示される例では、４５度、９０度、１３５度の間隔に設定することが可能である。
【００４４】
以上に述べたように、いくつかの実施形態では、１つ以上のビームスプリッターは、薄膜コーティングを有するビームスプリッターの代わりに回折グレーティングに基づくものでありうる。たとえば、図１４は、本発明の実施形態に係る、回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。この実施形態では、ビームスプリッター１４５０は、回折グレーティング１４５１〜１４５４と、ミラー１４６２および１４６４と、位相シフター１４７２および１４７４と、を含む。回折グレーティング１４５１および１４５２は、それぞれ、ミラー１４３４および１４４４から光エネルギーを受け取る。回折グレーティング１４５１は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６２および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５２は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６４および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５３は、ミラー１４６２および位相シフター１４７４から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。同様に、回折グレーティング１４５４は、ミラー１４６４および位相シフター１４７２から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。図１５は、他の実施形態に係る、回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【００４５】
いくつかの実施形態では、スイッチャブル光源から放出された光エネルギーへの特定の光エネルギーの寄与を低減または防止するために、分光フィルター（たとえば、帯域幅フィルター、ローパスフィルター、またはハイパスフィルター）を光路中に配設することが可能である。たとえば、光路内の迷光およびノイズならびにディテクターに向かう伝搬を低減するために、光活性化時および／または光励起時に使用される光エネルギーを光路から除去することが可能である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、光路に沿った１つ以上のサンプル、対物レンズ、ミラー、光学素子、ビームスプリッター、レンズ、分光フィルター、および他の要素を、圧電アクチュエーターなどの多軸ポジショナーに個別に結合させることが可能である。そのような多軸ポジショナーを用いれば、自動もしくは非自動の校正および定置が可能になる。このほかに、そのような多軸ポジショナーを用いれば、定置および校正に関してマニュアル法よりも精度および確度を改良することが可能である。
【００４７】
干渉計システムの構成時ならびにその定置およびアライメントのためのガイドとして、２つの入力ビーム経路中に組み込まれたシャッターを有することが有用なこともある。これにより、各経路からの画像を独立して観測し、各経路が最適に焦点調整されていることを確認することが可能である。さらには、２つの部分の画像を観測できるので、両ビームに対してシャッターを開いた時に最適な干渉で重畳されるように、一方の画像を他方の画像に対して移動させることが可能である。
【００４８】
二位相よりも多い位相を有する他の選択肢の実施形態では、感度は位相不変でありうる。それに加えて、一意的な動作範囲をλ／２まで拡張することが可能である。変位が大きくなると、λ／２を法とする位置あいまい性を生じるであろう。これは、たとえば、空間領域および時間領域の両方でまたはサンプルのセクション化で選択的照射（励起または活性化）を行うなどの追加の技術を用いて、除去可能である。そのような実施形態では、たとえば、三位相もしくは四位相の干渉計測を行う実施形態では、サンプルの測定部分の位置は、以下の強度により決定される。
Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ）
式中、ｊ＝０、１、２、…は、多位相干渉計のレッグを表す、
Ｉｊ＝点光源のｊレッグの強度、オフセット補正なし、
βｊ＝ｊ番目のレッグの干渉補正係数、
Ｇｊ＝ｊ番目のレッグのゲイン、
Ｏｆｓｊ＝ｊ番目のレッグのオフセット、
ＡＵｉ＝ｉ番目の点光源の振幅、上側対物レンズ、
ＡＬｉ＝ｉ番目の点光源の振幅、下側対物レンズ、
φｊ＝ｊ番目のレッグの位相シフト、および
φｉ＝点光源（すなわち蛍光分子）の位相。
【００４９】
暗校正ＡＵｉ＝ＡＬｉ＝０を行ってｊ番目のディテクターからの暗信号を決定するが可能にする。
Ｉｏｊ＝Ｇｊ×Ｏｆｓｊ
Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ） 全振幅：ＡＴｉ２＝ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２
【００５０】
再スケール調整された干渉部分：
Ｘｉ＝２×ＡＵｉ×ＡＬｉ／ＡＴｉ２
【００５１】
したがって、これらの変数を用いれば、強度は以下のようになる。
Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００５２】
ｚに沿って基準光源をδだけ移動させた時の校正を用いて、残りの装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊを決定することが可能である。これにより、位相φｆ（ｚ）が約４×π／（ｎλ）δ（ｚ）だけ回転されている三位相の場合、各レッグ中で図７に類似して振動する強度信号が得られるであろう。ここで、ｎは、シフト経路長を有する媒体（たとえば液浸油）の屈折率である。
【００５３】
次に、そのような一群の校正データへのあてはめを行えば、参照基準で発光基準の干渉部分Ｘｆおよびその強度ＡＴｉ２＝Ｉｆを用いて各レッグｊに対して以下の式が決定されるであろう。この時点で、装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊが決定される。そのような校正は、位相シフト値が正確に１２０度（３本のレッグ）または２π／Ｎ（Ｎ本のレッグ）でない場合に有用でありうる。
Ｉｆｊ（ｚ）＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×Ｉｆ（１＋βｊ×Ｘｆ×ｃｏｓ（φｊ（ｚ）＋φｊ））。
【００５４】
Ｇｊ、βｊは、基準単位に規格化することにより定義可能である。
Ｉｆ＝１かつＸｆ＝１かつαｉ＝ＡＴｉ２／Ｉｆ
Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
Ｄｉｊ＝（Ｉｉｊ−Ｉｏｊ）／（Ｇｊ×Ｉｆ） 再スケール調整された強度データ
Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００５５】
図２６は、本発明の実施形態に係る、自動校正法を用いる多位相干渉顕微鏡システム用の校正プロセス２６００のフロー図を示している。２６１０では、サブ回折基準などの発光体をｚ平面内の種々の位置で画像化して画像フレームシーケンスを生成する。２６１０でのこのプロセスは、サブプロセス２６１１および２６１２を含み、サブプロセスをｚ平面内の種々の位置に対して反復して画像フレームシーケンスを生成する。２６１１では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで発光体の画像を取り込む。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性（たとえば、ｊ番目のディテクターのφｊβｊ）を含む。２６１２で発光体のｚ位置をインクリメントし、２６１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。画像フレームシーケンス中の各画像フレームは、発光体の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００５６】
２６２１では、発光体の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体発光分布を位置特定する。たとえば、特定の発光体は、ガウス分布に正確にあてはめることが可能な発光分布を有する。そのようなガウス分布により、たとえば、発光体の画像の点広がり関数の尤度を表すことが可能である。２６２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、２６２３でドリフト補正フレームを変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００５７】
２６２４では、ｚ平面内の各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた位相シフト画像フレームの合成体である。２６２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体の中心を決定する。
【００５８】
２６２６で変換フレームをガウス分布のような所定の分布にあてはめ、そして２６２５で決定されたｘ，ｙ平面内の発光体の中心で各フレーム中の発光体発光分布の振幅を測定する。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布（たとえば、三次元分布）の図心に基づきうる。２６２７では、発光体発光分布の振幅を２６２４で決定された和に規格化する。各画像に対して２６２７で決定された規格化振幅および関連ｚ位置を２６２８で記録する。たとえば、各フレームに対する規格化振幅および関連ｚ位置をルックアップテーブル内に記憶するかまたは上述の式によりパラメーター化してφｊおよびβｊを決定することが可能である。
【００５９】
以下の式は、干渉顕微鏡観察システムにより収集された強度データから光源の変位δ（すなわち、サンプルの相対ｚ座標位置）を決定しうることを説明するものである。
【００６０】
校正が終了した後、データをスケール調整することが可能であり、その場合、干渉計の各出力ビームに対する値βｊおよびφｊもわかる。ｊ個の式：
Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ（ｚ）＋φｊ））
を用いて軸方向に沿った発光体の位置を決定することが可能である。したがって、ｉ番目の分子の強度に関する３つ以上のデータ値Ｄｉ０、Ｄｉ１、Ｄｉ２、…から、３つの未知の値：αｉ、Ｘｉ、および（最も興味深い）φｉ（ｚ）を決定するための３つ以上の式が得られる。３つの位相だけが存在する場合、３つの式からこれらの３つの未知量の一意解が得られるであろう。この値、特にφｉの値は、たとえば、ニュートン法により解くことが可能である。
【００６１】
３つの位相よりも多くの位相が存在する場合、４つ以上の式から３つの未知の値を決定することが可能であり、連立方程式は制約過剰である。その場合、未知量の最良値は、χ２最小化法を用いて決定可能である。次式の誤差を最小化することによる。
χｉ＝Σｊ［Ｄｉｊ−αｉ（１＋βｊｃｏｓ（φｉ＋φｊ））］２
【００６２】
十分にバランスのとれた干渉計システム（カメラ間位相シフト増分および均等化ゲインおよび均等化干渉効率を意味する）の近似として、次式により与えられるφｉの最良値を得ることが可能である。
ｔａｎ（φｉ）≒−ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ）
【００６３】
ｉ番目の発光体の位相φｉがわかった後、ｚ軸に沿った垂直方向位置δｉを次式により第一近似で推定することが可能である。ｎがサンプル環境の屈折率であることに留意されたい。
δｉ≒λ×φｉ／（４πｎ）＝λ／（４πｎ）×ａｔａｎ（ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ））
【００６４】
変位δについて解いたこの最後の式は、強度データから位相シフトを記述する。言い換えれば、この最後の式は、干渉顕微鏡システムの各レッグに対するディテクターで検出された強度データに基づいてどのように変位δを計算するかを示している。たとえば、三位相干渉顕微鏡システムでは、（φｊ）≒−２π／３、０、２π／３である。四位相干渉顕微鏡では、（φｊ）≒０、π／２、π、３π／２である。
【００６５】
変位δを計算するための以上の式は、種々の仮定に基づいていることに留意されたい。他の選択肢の実施形態では、他の仮定を用いて、変位δを計算するための１つ以上の代替手段を得ることが可能である。たとえば、高次の補正を実数部から計算することが可能であり、これにより、各干渉計レッグのＮ位相が等間隔で離間されるかまたは干渉計レッグの感度が等しいという近似が取り除かれる。他の選択肢の実施形態は、バランスがとれていない強度感度および位相混合角を校正および補正するための手段を提供するさらなる精密化を含みうる。
【００６６】
要約すると、Ｎ位相干渉計のＮ個のスポット強度は、垂直方向位置変位δに変換可能なデータＤｊになる。
【００６７】
φｉは周期解であるので、全２πに対して、一意的に決定可能な範囲は、λ／２ｎにわたる。これより厚いサンプルでは、δを決定するうえで、整数Ｎに対して±Ｎλ／２ｎだけあいまい性が存在する。測定される点広がり関数および干渉効率のような他の属性を用いて、可能性が最も高いＮを見いだしたりまたは多値解の最良値を選択したりすることが可能である。事実上、デフォーカスの範囲は、発光体が位置する場所でλ／２ｎ以内で推定するための代替的でそれほど精密ではないが適切な方法である。これを干渉計測により推定された位置と組み合わせることにより、発光体の一意的な垂直方向位置を得ることが可能である。垂直方向位置を推定する際のさらなる検討対象の一つは、ほぼＲａｙｌｅｉｇｈ長の距離ｚＲにわたり焦点でπだけ余分に前進させる余分項であるＧｏｕｙ位相を考慮することである。この場合、δは、次式を解くことにより与えられる。
φｉ≒４πδ／（ｎλ）＋ａｔａｎ（δ／ｚＲ）。
【００６８】
図２７は、本発明の実施形態に係る、多位相干渉顕微鏡システム内の光活性サンプルの三次元位置情報を取得するためのプロセスのフロー図を示している。２７１０では、サブ回折基準などの種々のスイッチャブル光源を画像化させて画像フレームシーケンスを生成する。２７１０でのこのプロセスは、サブプロセス２７１１および２７１２を含み、サブプロセスをｚ平面内の種々の位置に対して反復して画像フレームシーケンスを生成する。２７１１では、スイッチャブル光源を活性化および励起する。２７１２では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで画像フレームを取り込んで、２７１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性を含む。画像フレームは、スイッチャブル光源の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００６９】
２７２１では、スイッチャブル光源の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の発光分布を位置特定する。たとえば、特定のスイッチャブル光源は、ガウス分布に正確にあてはめうる発光分布を有する。そのようなガウス分布は、たとえば、発光体の画像の点広がり関数を表すことが可能である。２７２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、ドリフト補正フレームを２７２３で変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレームシーケンスの画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００７０】
２７２４では、ｚ平面内の各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた位相シフト画像フレームの合成体である。２７２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心を決定する。
【００７１】
変換フレームを２７２６でガウス分布のような所定の分布にあてはめ、２７２５で決定されたｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心で、各フレーム中のスイッチャブル光源の発光分布の振幅を測定する。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布の図心に基づきうる。２７２７では、スイッチャブル光源の発光分布の振幅を２７２４で決定された和に規格化する。２７２８では、以上の工程２５２８で記録された校正データと相関付けることにより、２７２７で決定された規格化振幅を用いてスイッチャブル光源のｚ平面座標を取得する。そのような校正データは、たとえば、ルックアップテーブルに記憶可能である。ｚ平面座標は、たとえば、次式で表される最小χ２を決定することにより規格化振幅に基づいて計算可能である。
［ＣＡ１（ｚ）−ＰＡ１］２＋［ＣＡ２（ｚ）−ＰＡ２］２＋［ＣＡ３（ｚ）−ＰＡ３］２＋．．．＋［ＣＡＮ（ｚ）−ＰＡＮ］２
式中、Ｎ＝システム中のディテクターの数であり、
ＣＡｉ（ｚ）＝ｚ平面内の特定のサンプル位置に対して校正時に決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅であり、
ＰＡｉ＝現在のＰＡＬＭ画像フレームから決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅である。
【００７２】
他の実施形態では、干渉顕微鏡観察システムは、第３の次元ｚによって異なる経路長差をさらに生成する発光ビームの異なる部分を使用しうる。そのような他の選択肢の実施形態について図１６〜２２に関連させて論述する。より詳細には、図１６は、２つの異なる潜在位置の単一量子発光体の概念図を示しており、図１７および１８は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示しており、図１９〜２１は、図１８のアニュラーエキスパンダーの例を示しており、図２２は、図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。これらの図について以下で論述する。
【００７３】
図１６は、２つの可能な位置の単一量子発光体の例を示している。そのような量子発光体は、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子（波長λ）は、図１７に示される対物レンズから離れる上方向および図１７に示される対物レンズ中に入る下方向などの全方向に伝搬するであろう。対物レンズ中に伝搬する放射光子のエネルギー部分は、ほぼ等しい強度の２つの平行ビーム、すなわち、「Ｂ」と記された内側円柱状ビームおよび「Ｃ」と記された外側環状ビーム標識化とみなしうる。内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃのサイズは、それらの強度が実質的に等しくなるように選択可能であり、そのような実質的に等しい強度は、ビームの非線形強度プロファイルに基づいて異なるビーム部分領域に対応する（たとえば、ビームエネルギーのピークは、ビームの縁に向かって減少する強度を有するビームの中心にある）。たとえば、「Ｂ」と記された内側ビーム部分は、全ビーム半径のほぼ１／３に等しい半径を有しうる。「Ｃ」と記された外側ビーム部分は、内側ビーム部分「Ｂ」の半径に対応する内半径と全ビームの半径に対応する外半径とを有しうる。
【００７４】
サンプルが正確に焦点が合っている場合、これらのビーム部分は、一致して同位相である（図１６の左側に示されるように）。しかしながら、発光体の位置変位Δｚが存在する場合（図１６の右側に示されるように）、位相ビーム部分ＢおよびＣは、それぞれ、ΔｉｎｎｅｒおよびΔｏｕｔｅｒだけ変位する。ただし、ΔｉｎｎｅｒはΔｚに等しく、ΔｏｕｔｅｒはΔｚ×ｃｏｓ（θ）に等しい。位相ビーム部分ＢおよびＣのこの変位は、外側ビーム部分Ｃのほうが少ない光路変化を受けてｃｏｓ（θ）倍になるという事実に基づく。ただし、θは、発光体からの光線の初期円錐角である。したがって、２つのビーム間の位相シフト差が残り、これは次の値に等しい。
δ＝２π（Δｉｎｎｅｒ−Δｏｕｔｅｒ）／λ＝Δｚ×（１−ｃｏｓ（θ））×２πｎ／（λ）。
【００７５】
位相が３６０度にわたり増加し反復するｚ範囲は、λ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））である。この単一対物レンズの実施形態に対するこのｚ範囲は、図１〜１１に関連して以上で述べた対向する対物レンズの実施形態のｚ範囲よりも長い。発光体の周りの光学環境の屈折率ｎは、位相シフトを再スケール調整する。単一対物レンズシステムの実施形態については、図１７〜２０に関連して以下でより詳細に論述する。
【００７６】
図１７は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示している。図１８は、図１７に示されるビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステムのシステムブロック図の例を示している。図１７に示されるように、干渉顕微鏡観察システムは、対物レンズ１７３０と、ミラー１７４４と、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０と、ミラー１７５６と、ビームスプリッター１７５４、１７５５、および１７５８と、レンズ１７６０、１７７０、および１７８０と、ディテクター１７６５、１７７５、および１７８５と、を含む。図１８に示されるように、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０は、ビームスプリッター１７４１と、ミラー１７４２〜１７４７と、アニュラーエキスパンダー１７４８と、アニュラーリデューサー１７４９と、を含む。
【００７７】
アニュラーエキスパンダー１７４８は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を拡大する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーエキスパンダー１７４８は、ミラー１７４２からの光の内側円柱状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）、より大きい外径を有する環形状を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を縮小する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーリデューサー１７４９は、ミラー１７４２からの光の外側環状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）、より小さい内径を有する内側円柱形状（またはより小さい環形状）を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）。
【００７８】
図１９〜２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図１９は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２０は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、そして図２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうちの３つの斜視図を示している。図１９〜２１に示されるように、アニュラーエキスパンダー１７４８は、アニュラーエキスパンダー１７４８の中心線の近傍に離間して配置された６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆを有する。ただし、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの一方の端は、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの他方の端によりまとめて画定される環状多面表面のサイズとは異なるサイズを有する環状多面表面をまとめて画定する。図１９に示されるように、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端から出る。図２０は、より大きい環状多面表面から、より小さい環状多面表面に向かって、ページ中の方向に見たアニュラーエキスパンダー１７４８の端面図を示している。明示的に示されていないが、アニュラーリデューサー１７４９は、アニュラーエキスパンダー１７４８と同様に構成される。ただし、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズムの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズムの端から出る。
【００７９】
次に、図１７および１８に戻って、システムを介して伝搬する光を参照しながら、三位相干渉顕微鏡観察システムについて説明する。図１７に示されるように、エネルギーは、サンプル（図１７中で「Ｓ」と記される）から放射され、そしてミラー１７４４によりビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の方向に反射される。ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の５０：５０ビームスプリッター１７４１（図１７に示される）は、光の一部をミラー１７４２に伝送し、光の残りの部分をミラー１７４３に伝送する。光を２つのビーム部分に分離するために、ミラー１７４２は、外側ビーム部分Ｃをミラー１７４５の方向に反射するとともに、内側ビーム部分のビームＢをミラー１７４４の方向に反射する。ミラー１７４５および１７４４は、それぞれ、外側ビーム部分Ｃおよび内側ビーム部分Ｂを、それぞれ、アニュラーエキスパンダー１７４８およびアニュラーリデューサー１７４９の方向に反射する。アニュラーエキスパンダー１７４８は、受光した光をミラー１７４６の方向に拡大し、このミラーは、拡大された光をビームスプリッター１７５４の方向に反射する（図１７に示される）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、その受光した光の半径をミラー１７４７の方向に縮小し、このミラーは、縮小された光を５０：５０ビームスプリッター１７５４の方向に反射する。
【００８０】
５０：５０ビームスプリッター１７５４は、ミラー１７４６および１７４７から受光した光の半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５の方向に反射し、光の残りの半分をミラー１７５６に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５４も同様に、ミラー１７４３からの受光した光の半分をミラー１７５６の方向に反射し、光の残りの半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５に伝送する。６６：３３ビームスプリッター１７５５は、受光したビームの３３％を５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射し、受光したビームの残りの６６％をレンズ１７６０の方向に伝送する。ミラー１７５６は、受光したビームを５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射するとともに余分の位相シフトを追加する。５０：５０ビームスプリッター１７５８は、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に反射し、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５８も同様に、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に反射し、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に伝送する。
【００８１】
光路長に差が存在するように、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８、ミラー１７５６、ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５を配置しうることに留意されたい。より詳細には、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５の間の光路距離ｘは、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびにミラー１７５６の間の距離ｘ＋δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒよりも短くすることが可能である。たとえば、２つの距離間の光路差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒを波長λの１／８になるように選択することが可能でありかつ波長λが５８０ｎｍであると仮定すると、２つの距離間の差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒは、７２ｎｍに選択可能である。
【００８２】
レンズ１７６０に伝送されたビーム、レンズ１７７０に伝送されたビーム、およびレンズ１７８０に伝送されたビームは、それぞれ、実質的に等しい振幅を有する。レンズ１７６０、１７７０、および１７８０は、それぞれ、それぞれのビームをディテクター１７６５、１７７５、および１７８５に集束させる。３つのディテクター１７６５、１７７５および１７８５のそれぞれでの発光画像の強度は、位相／ｚ位置の関数として変化する。なぜなら、３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５間の相対強度は、約１２０度の位相シフトを有するからである。図２２は、図１７に示される３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５により検出される強度をモニタリングすることにより、内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃの間の初期オフセットの位相シフトは、図１〜１１に関連して先に記載したように推定可能である。
【００８３】
この位相シフトδを用いて発光体のｚ位置を計算することが可能である。
Δｚ＝δλ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））。
【００８４】
いくつかの実施形態では、校正技術を用いて、ディテクターのバランスがとれていない強度感度および位相混合角を補正することが可能である。図１７〜２２に示される実施形態は、約１２０度の位相シフトを有する３つのディテクターに対して記述したものであるが、異なる数のディテクターを有する他の実施形態が可能である。さらに他の実施形態では、画像化スポット形状を用いて、いかなる周期的あいまい性または位置あいまい性をも解消することが可能である。他の選択肢として、位置計算用の追加情報として画像化スポット形状を使用することが可能である。
【００８５】
図２３〜２５は、本発明の他の実施形態に係る、アニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図２３は、アニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、図２４は、ラインＸＸ−ＸＸに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２５は、ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。図２３〜２５に示されるように、アニュラーエキスパンダー２３００は、６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆと、６つのミラー２３２０ａ〜２３２０ｆと、６つのミラー２３３０ａ〜２３３０ｆと、を有する。プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍に離間して配置される。ただし、６つのプリズムの一方の端は、６つのプリズムの他方の端によりまとめて画定される環状表面のサイズとは異なるサイズを有する環状表面をまとめて画定する。ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される内側中央部分内に配置される。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆ間の間隙により画定される外側部分の近傍に配置される。
【００８６】
図２４に示されるように、各プリズム２３１０は、入射面２３１０’および出射面２３１０”を含む。入射面２３１０’は、出射面２３１０”に平行であり、かつそれよりも小さい内半径および外半径を有する。各プリズム２３１０はまた、全内部反射（ＴＩＲ）の条件が満たされるように、入射面２３１０’および出射面２３１０”に対して角度を付けた２つの側壁２３１０’’’および２３１０’’’を含む。したがって、光は、入射面２３１０’で各プリズム２３１０に入り、側壁２３１０’’’でＴＩＲによる反射および側壁２３１０””でＴＩＲによる反射を受け、次に、出射面２３１０”から出る。このようにすれば、アニュラーエキスパンダー２３００を出る時に入射光の半径を拡大することが可能になる。
【００８７】
図２５に示されるように、ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、それぞれ、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線に沿ってかつその近傍でミラー２３３０ａ〜２３３０ｆの方向に外向きに光を反射する。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される間隙間に受光した光を反射する。たとえば、ミラー２３２０ａは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍で光の一部をミラー２３３０ａの方向に反射し、ミラー２３３０ａは、プリズム２３１０ａおよびプリズム２３１０ｂとの間に画定された間隙間にこの光を反射する。全体として、これにより光の中央部分を拡大して、増大されたスループットを提供することが可能になる。
【００８８】
明示的に示されていないが、アニュラーリデューサーは、アニュラーエキスパンダー２３１０と同様に構成することが可能である。ただし、光は、より大きい環状表面を画定するプリズムの端に入り、より小さい環状表面を画定するプリズムの端から出る。図１９〜２０および２３〜２５に示される実施形態は、特定の屈折素子および／または反射素子を用いて示されているが、他の実施形態および配置、たとえば、回折素子またはそれらの任意の組合せを有する実施形態も可能である。
【００８９】
いくつかの実施形態は、プロセッサーと、種々のプロセッサー実行操作を行うための命令またはコンピューターコードを有する関連プロセッサー可読媒体と、を含む。そのようなプロセッサーは、内蔵マイクロプロセッサー、コンピューターシステムの一部としてのマイクロプロセッサー、特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）、およびプログラマブルロジックデバイス（「ＰＬＤ」）のようなハードウェアモジュールとして実装可能である。そのようなプロセッサーはまた、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、Ｃ、アセンブラーのようなプログラミング言語、ハードウェア記述言語、または任意の他の好適なプログラミング言語で記述された１つ以上のソフトウェアモジュールとして実装することも可能である。いくつかの実施形態に係るプロセッサーは、１つもしくは複数の特定目的のために特別に設計および構成された媒体およびコンピューターコード（コードと呼ばれることもある）を含む。プロセッサー可読媒体の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。磁気記憶媒体、たとえば、ハードディスク、フロッピーディスク（登録商標）、および磁気テープ、光記憶媒体、たとえば、コンパクトディスク／ディジタルビデオディスク（「ＣＤ／ＤＶＤ」）、コンパクトディスクリードオンリーメモリー（「ＣＤ−ＲＯＭ」）、およびホログラフィックデバイス、光磁気記憶媒体、たとえば、フロッピーディスク（登録商標）ならびにリードオンリーメモリー（「ＲＯＭ」）デバイスおよびランダムアクセスメモリー（「ＲＡＭ」）デバイス。コンピューターコードの例としては、マイクロコードまたはマイクロ命令、機械命令、たとえば、コンパイラーにより生成されるもの、およびインタープリターを用いてコンピューターにより実行されるより高レベルの命令を含有するファイルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、本発明の実施形態は、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、または他のオブジェクト指向型プログラミング言語、および開発ツールを用いて実施可能である。コンピューターコードのそのほかの例としては、制御信号、暗号化コード、および圧縮コードが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
特定の実施形態を以上に示して説明してきたが、形態および細部にさまざまな変更を加えうることは、当業者であればわかるであろう。たとえば、照明技術の変更が可能であり、それにより強度データのモジュロλ／２周期性を改良することが可能である。それに加えて、Betzig参考文献に記載の種々の実施形態を本明細書に記載の種々の実施形態と組み合わせることが可能である。たとえば、一実施形態では、トップ／ボトムＴＩＲＦ照明を行って、一波長λまでの厚さを有するサンプルを測定することが可能である。他の選択肢の実施形態では、短パルスのコヒーレント再位相調整により照明平面を形成することが可能である。さらに他の実施形態では、サンプルの種々の高さのｚ座標でガウシアンウエストを形成する側方照明により、物理的セクション化に頼ることなくｚ座標方向の範囲をさらに拡張することが可能である。したがって、当然のことながら、本明細書に記載のシステムは、さまざまな記載の実施形態の素子および／または特徴部のさまざまな組合せおよび／または部分的組合せを含みうる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のディテクターを有する光学システムであって、光源の第１の方向の発光と光源の第２の方向の発光との干渉に基づいて、第１の次元および第１の次元に実質的に直交する第２の次元で、前記光源の複数の画像を生成するように構成され、前記第２の方向は前記第１の方向とは異なり、前記複数のディテクターの各ディテクターは、ある時間点で前記複数の画像の画像に一意的に関連付けられる光学システムと、
前記複数の画像に基づいて第３の次元で前記光源の位置を計算するように構成されたプロセッサーであって、前記第３の次元は、前記第１の次元および前記第２の次元に実質的に直交するプロセッサーと、
を含む、装置。
【請求項２】
前記プロセッサーが、前記光源に対応する少なくとも２つの画像の一部分間の振幅差に基づいて前記第３の次元で位置を計算するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記複数の画像が第１の画像および第２の画像を含み、前記第１の画像が、前記光源からの前記第１の方向の発光の第１の部分および前記光源からの前記第２の方向の発光の第１の部分に関連付けられ、前記第２の画像が、前記光源からの前記第１の方向の発光の第２の部分および前記光源からの前記第２の方向の発光の第２の部分に関連付けられ、
前記第１の方向の発光の前記第１の部分が、前記第１の方向の発光の前記第２の部分とは異なり、前記第２の方向の発光の前記第１の部分が、前記第２の方向の発光の前記第２の部分とは異なる、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記光学システムが、前記複数のディテクターの第１のディテクターに対して前記第１の方向の発光の前記第１の部分および前記第２の方向の発光の前記第２の部分をアライメントするように構成され、かつ
前記光学システムが、前記複数のディテクターの第２のディテクターに対して前記第１の方向の発光の前記第２の部分および前記第２の方向の発光の前記第１の部分をアライメントするように構成される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記光学システムが、ビームスプリッターを含み、かつ前記複数の画像を生成するように構成され、前記複数の画像の各画像は、前記ビームスプリッターにおける前記第１の方向の発光の位相と、前記第１の方向の発光の前記位相に依存しない、前記ビームスプリッターにおける前記第２の方向の発光の位相と、に基づくものとする、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記光学システムが、
前記光源からの前記第１の方向の発光と前記光源からの前記第２の方向の発光とを干渉させて少なくとも２本の出力ビームを生成するように構成されたビームスプリッターデバイスと、
前記光源と前記ビームスプリッターデバイスとの間に第１の光路を画定するように構成された第１の光学素子と、
前記光源と前記ビームスプリッターデバイスとの間に第２の光路を画定するように構成された第２の光学素子と、
前記ビームスプリッターデバイスの少なくとも２本の出力ビームから光エネルギーを検出するように構成された少なくとも２つの光ディテクターと、
を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記光学システムが、前記光源と前記少なくとも２つの光ディテクターとの間の光路に沿って配設された少なくとも１つの分光フィルターを含み、前記少なくとも１つの分光フィルターが、帯域幅フィルター、ローパスフィルター、またはハイパスフィルターである、請求項２に記載の装置。
【請求項８】
前記光学システムが、
前記ビームスプリッターデバイス、前記第１の光学素子、前記第２の光学素子、または少なくとも２つの光ディテクターのうちの少なくとも１つに結合された多軸ポジショナー、
を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項９】
前記光学システムが、
第１の位相を有する発光と第２の位相を有する発光とを干渉させて少なくとも３本の出力ビームを生成するように構成されたビームスプリッターデバイスと、
前記ビームスプリッターデバイスの少なくとも３本の出力ビームから光エネルギーを検出するように構成された少なくとも３つの光ディテクターと、
を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記複数のディテクターが第１の複数のディテクターであり、前記複数の画像が第１の複数の画像であり、前記光源が、ある波長を有する第１の光源であり、
前記光学システムが、第２の複数のディテクターと複数のダイクロイックフィルターとをさらに含み、構成された前記第２の複数のディテクターが、前記第１の光源の波長と異なる波長を有する第２の複数の画像を生成し、
前記複数のダイクロイックフィルターの各ダイクロイックフィルターが、前記第１の複数のディテクターのディテクターおよび前記第２の複数のディテクターのディテクターに一意的に関連付けられ、
前記複数のダイクロイックフィルターの各ダイクロイックフィルターが、第１の光源からの発光と第２の光源からの発光とを分離するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
ある時間点で光源から第１の位相を有する発光と第１の位相とは異なる第２の位相を有する発光とを受光して前記時間点に関連付けられた複数の画像を生成するように構成された光学システムと、
前記光学システムにより画定される回折限界未満の確度まで前記時間点での前記光源の三次元位置を計算するように構成されたプロセッサーと、
を含む、装置。
【請求項１２】
前記光学システムが、ある方向から前記第１の位相を有する発光を受光しかつ前記第１の位相を有する発光の方向と異なる方向から前記第２の位相を有する発光を受光するように構成される、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記プロセッサーが、前記光源に対応する複数の画像の一部分間の振幅差に基づいて前記光源の三次元位置を計算するように構成される、請求項１１に記載の装置。
【請求項１４】
光源から複数の方向に放出される光エネルギーを干渉させて複数の出力ビームを生成する工程と、
前記複数の出力ビームの各出力ビームの強度に基づいて前記光源の三次元位置情報を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記複数の方向の各方向からの光エネルギーが、前記複数の方向の少なくとも１つの異なる方向の光エネルギーの位相と異なる位相を有するように、前記光エネルギーを受け取る工程、
をさらに含み、
前記複数の出力ビームの各出力ビームが、前記複数のビームの残りの出力ビームの位相とは異なる位相を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の出力ビームに基づいて複数の画像を実質的に同時に検出する工程であって、前記複数の画像の各画像は、前記複数の出力ビームの出力ビームに一意的に基づく工程、
をさらに含み、
前記決定する工程が、前記複数の画像の各画像の強度に基づく、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の出力ビームに基づいて複数の画像を実質的に同時に検出する工程であって、前記複数の画像の各画像は、前記複数の出力ビームの出力ビームに一意的に基づく工程、
をさらに含み、
前記決定する工程が、前記複数の画像内の前記光源の画像に対応する前記複数の画像の各画像の一部分の強度に基づいて三次元位置情報を計算する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記光源がスイッチャブルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記光源から放出される光エネルギーが一連の単一光子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記光源がスイッチャブルであり、前記方法が、
前記干渉の前にスイッチャブル光源を活性化させる工程と、
前記スイッチャブル光源から放出される光エネルギーが、複数の方向の第１の方向および第２の方向に放出されるように、前記活性化の後かつ前記干渉の前に前記スイッチャブル光源を励起する工程と、
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記光源が点光源または準点光源である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
入力ビームスプリッターを有する光学素子と、前記光学素子内に配設された第１の出力ビームスプリッターおよび第２の出力ビームスプリッターとを含む装置であって、前記入力ビームスプリッターは、画像平面を有する画像に関連付けられた光信号を受け取るように構成され、前記第１の出力ビームスプリッターは、前記入力ビームスプリッターから受け取った光信号の一部分と前記第２の出力ビームスプリッターから受け取った光信号の一部分とを干渉させるように構成される、装置。
【請求項２３】
前記入力ビームスプリッターが、第１の方向で受け取った光信号の第１の部分と、前記第１の方向とは異なる第２の方向で受け取った光信号の第２の部分と、を干渉させるように構成される、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記入力ビームスプリッターが、第１の方向で受け取った光信号の第１の部分と、前記第１の方向とは異なる第２の方向で受け取った光信号の第２の部分と、を干渉させて第１のビームおよび第２のビームを生成するように構成され、
前記光学素子が、前記第１のビームを前記入力ビームスプリッターから前記第１の出力ビームスプリッターまで伝送するように構成され、
前記光学素子が、前記第２のビームを前記入力ビームスプリッターから前記第２の出力ビームスプリッターまで伝送するように構成される、請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
前記光学素子が、前記光信号に基づいて少なくとも３本の出力光ビームを出力するように構成され、前記少なくとも３本の出力光ビームのそれぞれの出力光ビームの振幅が、前記少なくとも３本の出力光ビームのそれぞれの残りの出力光ビームの振幅に実質的に等しい、請求項２２に記載の装置。
【請求項２６】
第１の入力光ビームおよび第２の入力光ビームを受け取るように構成された光学素子であって、複数の入力光ビームの前記第１の入力光ビームは、複数の入力光ビームの前記第２の入力光ビームの位相とは異なる位相を有し、前記第１の入力光ビームは画像平面を含み、かつ前記第２の入力光ビームは画像平面を含む光学素子、
を含む装置であって、
前記光学素子が、第１の出力光ビーム、第２の出力光ビーム、および第３の出力光ビームを伝送し、前記第１の出力光ビームが、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分と、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分間の位相差と、を含み、前記第２の出力光ビームが、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分と、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分間の位相差と、を含み、前記第３の出力光ビームが、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分と、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分間の位相差と、を含む、装置。
【請求項２７】
前記光学素子が、入力ビームスプリッター、第１の出力ビームスプリッター、および第２の出力ビームスプリッターを含み、
前記入力ビームスプリッターが、複数の入力光ビームの少なくとも２本の入力光ビームを受け取るように構成され、
前記第１の出力ビームスプリッターが、前記少なくとも３本の出力光ビームの少なくとも１本の出力光ビームを伝送するように構成され、
前記第２の出力ビームスプリッターが、前記少なくとも３本の出力光ビームの少なくとも２本の出力光ビームを伝送するように構成される、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記第１の出力ビームに関連付けられた位相差、前記第２の出力ビームに関連付けられた位相差、および前記第３の出力ビームに関連付けられた位相差が異なる、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
第１の入力光ビームおよび第２の入力光ビームを受け取る工程であって、複数の入力光ビームの前記第１の入力光ビームは、複数の入力光ビームの前記第２の入力光ビームの位相とは異なる位相を有し、前記第１の入力光ビームは画像平面を含み、かつ前記第２の入力光ビームは画像平面を含む工程と、
前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームから、第１の出力光ビーム、第２の出力光ビーム、および第３の出力ビームを生成する工程であって、前記第１の出力光ビームは、前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分と、前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差と、を含み、前記第２の出力光ビームは、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分と、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分の間の位相差と、を含み、前記第３の出力光ビームは、前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分と、前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分の間の位相差と、を含む工程と、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差が、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分の間の位相差とは異なり、前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差が、前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分の間の位相差とは異なる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分の間の位相差、ならびに前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分の間の位相差に基づいて光源の位置を決定する工程、
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ｚ平面内の複数の所定位置で光源の位相シフト画像を逐次的に取得して複数の画像フレームシーケンスを形成する工程と、
前記複数の画像フレームシーケンスから、ｚ平面内の前記光源の各所定位置に関連付けられる少なくとも１つの位相関連特性を決定する工程と、
前記少なくとも１つの位相関連特性およびｚ平面内の前記光源の所定位置を記憶する工程と、
を含む、方法。
【請求項３３】
複数の画像フレームに基づいて、ｚ平面内の光源の位置に関連付けられる少なくとも１つの位相関連特性を決定する工程と、
前記少なくとも１つの位相関連特性を、ｚ平面内の光源の複数の所定位置に関連付けられる複数の位相関連特性と相関付けて、ｚ平面内の光源の位置を特定する工程と、
を含む、方法。
【請求項３４】
前記光源の複数の位相シフト発光を検出して複数の画像フレームを形成する工程と、
前記複数の画像フレームに基づいてｘ，ｙ平面内の光源の位置を特定する工程と、
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
複数のディテクターを有する光学システムであって、光源の第１の方向の発光と光源の第２の方向の発光との干渉に基づいて、第１の次元および第１の次元に実質的に直交する第２の次元で、前記光源の複数の画像を生成するように構成され、前記第２の方向は前記第１の方向とは異なり、前記複数のディテクターの各ディテクターは、ある時間点で前記複数の画像の画像に一意的に関連付けられる光学システムと、
前記複数の画像に基づいて第３の次元で前記光源の位置を計算するように構成されたプロセッサーであって、前記第３の次元は、前記第１の次元および前記第２の次元に実質的に直交するプロセッサーと、
を含む、装置。
【請求項２】
前記プロセッサーが、前記光源に対応する少なくとも２つの画像の一部分間の振幅差に基づいて前記第３の次元で位置を計算するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記複数の画像が第１の画像および第２の画像を含み、前記第１の画像が、前記光源からの前記第１の方向の発光の第１の部分および前記光源からの前記第２の方向の発光の第１の部分に関連付けられ、前記第２の画像が、前記光源からの前記第１の方向の発光の第２の部分および前記光源からの前記第２の方向の発光の第２の部分に関連付けられ、
前記第１の方向の発光の前記第１の部分が、前記第１の方向の発光の前記第２の部分とは異なり、前記第２の方向の発光の前記第１の部分が、前記第２の方向の発光の前記第２の部分とは異なる、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記光学システムが、前記複数のディテクターの第１のディテクターに対して前記第１の方向の発光の前記第１の部分および前記第２の方向の発光の前記第２の部分をアライメントするように構成され、かつ
前記光学システムが、前記複数のディテクターの第２のディテクターに対して前記第１の方向の発光の前記第２の部分および前記第２の方向の発光の前記第１の部分をアライメントするように構成される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記光学システムが、ビームスプリッターを含み、かつ前記複数の画像を生成するように構成され、前記複数の画像の各画像は、前記ビームスプリッターにおける前記第１の方向の発光の位相と、前記第１の方向の発光の前記位相に依存しない、前記ビームスプリッターにおける前記第２の方向の発光の位相と、に基づくものとする、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記光学システムが、
前記光源からの前記第１の方向の発光と前記光源からの前記第２の方向の発光とを干渉させて少なくとも２本の出力ビームを生成するように構成されたビームスプリッターデバイスと、
前記光源と前記ビームスプリッターデバイスとの間に第１の光路を画定するように構成された第１の光学素子と、
前記光源と前記ビームスプリッターデバイスとの間に第２の光路を画定するように構成された第２の光学素子と、
前記ビームスプリッターデバイスの少なくとも２本の出力ビームから光エネルギーを検出するように構成された少なくとも２つの光ディテクターと、
を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記光学システムが、前記光源と前記少なくとも２つの光ディテクターとの間の光路に沿って配設された少なくとも１つの分光フィルターを含み、前記少なくとも１つの分光フィルターが、帯域幅フィルター、ローパスフィルター、またはハイパスフィルターである、請求項２に記載の装置。
【請求項８】
前記光学システムが、
前記ビームスプリッターデバイス、前記第１の光学素子、前記第２の光学素子、または少なくとも２つの光ディテクターのうちの少なくとも１つに結合された多軸ポジショナー、
を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項９】
前記光学システムが、
第１の位相を有する発光と第２の位相を有する発光とを干渉させて少なくとも３本の出力ビームを生成するように構成されたビームスプリッターデバイスと、
前記ビームスプリッターデバイスの少なくとも３本の出力ビームから光エネルギーを検出するように構成された少なくとも３つの光ディテクターと、
を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記複数のディテクターが第１の複数のディテクターであり、前記複数の画像が第１の複数の画像であり、前記光源が、ある波長を有する第１の光源であり、
前記光学システムが、第２の複数のディテクターと複数のダイクロイックフィルターとをさらに含み、構成された前記第２の複数のディテクターが、前記第１の光源の波長と異なる波長を有する第２の複数の画像を生成し、
前記複数のダイクロイックフィルターの各ダイクロイックフィルターが、前記第１の複数のディテクターのディテクターおよび前記第２の複数のディテクターのディテクターに一意的に関連付けられ、
前記複数のダイクロイックフィルターの各ダイクロイックフィルターが、第１の光源からの発光と第２の光源からの発光とを分離するように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
ある時間点で光源から第１の位相を有する発光と第１の位相とは異なる第２の位相を有する発光とを受光して前記時間点に関連付けられた複数の画像を生成するように構成された光学システムと、
前記光学システムにより画定される回折限界未満の確度まで前記時間点での前記光源の三次元位置を計算するように構成されたプロセッサーと、
を含む、装置。
【請求項１２】
前記光学システムが、ある方向から前記第１の位相を有する発光を受光しかつ前記第１の位相を有する発光の方向と異なる方向から前記第２の位相を有する発光を受光するように構成される、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記プロセッサーが、前記光源に対応する複数の画像の一部分間の振幅差に基づいて前記光源の三次元位置を計算するように構成される、請求項１１に記載の装置。
【請求項１４】
光源から複数の方向に放出される光エネルギーを干渉させて複数の出力ビームを生成する工程と、
前記複数の出力ビームの各出力ビームの強度に基づいて前記光源の三次元位置情報を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記複数の方向の各方向からの光エネルギーが、前記複数の方向の少なくとも１つの異なる方向の光エネルギーの位相と異なる位相を有するように、前記光エネルギーを受け取る工程、
をさらに含み、
前記複数の出力ビームの各出力ビームが、前記複数のビームの残りの出力ビームの位相とは異なる位相を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の出力ビームに基づいて複数の画像を実質的に同時に検出する工程であって、前記複数の画像の各画像は、前記複数の出力ビームの出力ビームに一意的に基づく工程、
をさらに含み、
前記決定する工程が、前記複数の画像の各画像の強度に基づく、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の出力ビームに基づいて複数の画像を実質的に同時に検出する工程であって、前記複数の画像の各画像は、前記複数の出力ビームの出力ビームに一意的に基づく工程、
をさらに含み、
前記決定する工程が、前記複数の画像内の前記光源の画像に対応する前記複数の画像の各画像の一部分の強度に基づいて三次元位置情報を計算する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記光源がスイッチャブルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記光源から放出される光エネルギーが一連の単一光子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記光源がスイッチャブルであり、前記方法が、
前記干渉の前にスイッチャブル光源を活性化させる工程と、
前記スイッチャブル光源から放出される光エネルギーが、複数の方向の第１の方向および第２の方向に放出されるように、前記活性化の後かつ前記干渉の前に前記スイッチャブル光源を励起する工程と、
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記光源が点光源または準点光源である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
入力ビームスプリッターを有する光学素子と、前記光学素子内に配設された第１の出力ビームスプリッターおよび第２の出力ビームスプリッターとを含む装置であって、前記入力ビームスプリッターは、画像平面を有する画像に関連付けられた光信号を受け取るように構成され、前記第１の出力ビームスプリッターは、前記入力ビームスプリッターから受け取った光信号の一部分と前記第２の出力ビームスプリッターから受け取った光信号の一部分とを干渉させるように構成される、装置。
【請求項２３】
前記入力ビームスプリッターが、第１の方向で受け取った光信号の第１の部分と、前記第１の方向とは異なる第２の方向で受け取った光信号の第２の部分と、を干渉させるように構成される、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記入力ビームスプリッターが、第１の方向で受け取った光信号の第１の部分と、前記第１の方向とは異なる第２の方向で受け取った光信号の第２の部分と、を干渉させて第１のビームおよび第２のビームを生成するように構成され、
前記光学素子が、前記第１のビームを前記入力ビームスプリッターから前記第１の出力ビームスプリッターまで伝送するように構成され、
前記光学素子が、前記第２のビームを前記入力ビームスプリッターから前記第２の出力ビームスプリッターまで伝送するように構成される、請求項２２に記載の装置。
【請求項２５】
前記光学素子が、前記光信号に基づいて少なくとも３本の出力光ビームを出力するように構成され、前記少なくとも３本の出力光ビームのそれぞれの出力光ビームの振幅が、前記少なくとも３本の出力光ビームのそれぞれの残りの出力光ビームの振幅に実質的に等しい、請求項２２に記載の装置。
【請求項２６】
第１の入力光ビームおよび第２の入力光ビームを受け取るように構成された光学素子であって、複数の入力光ビームの前記第１の入力光ビームは、複数の入力光ビームの前記第２の入力光ビームの位相とは異なる位相を有し、前記第１の入力光ビームは画像平面を含み、かつ前記第２の入力光ビームは画像平面を含む光学素子、
を含む装置であって、
前記光学素子が、第１の出力光ビーム、第２の出力光ビーム、および第３の出力光ビームを伝送し、前記第１の出力光ビームが、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分と、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分間の位相差と、を含み、前記第２の出力光ビームが、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分と、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分間の位相差と、を含み、前記第３の出力光ビームが、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分と、前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームの一部分間の位相差と、を含む、装置。
【請求項２７】
前記光学素子が、入力ビームスプリッター、第１の出力ビームスプリッター、および第２の出力ビームスプリッターを含み、
前記入力ビームスプリッターが、複数の入力光ビームの少なくとも２本の入力光ビームを受け取るように構成され、
前記第１の出力ビームスプリッターが、前記少なくとも３本の出力光ビームの少なくとも１本の出力光ビームを伝送するように構成され、
前記第２の出力ビームスプリッターが、前記少なくとも３本の出力光ビームの少なくとも２本の出力光ビームを伝送するように構成される、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記第１の出力ビームに関連付けられた位相差、前記第２の出力ビームに関連付けられた位相差、および前記第３の出力ビームに関連付けられた位相差が異なる、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
第１の入力光ビームおよび第２の入力光ビームを受け取る工程であって、複数の入力光ビームの前記第１の入力光ビームは、複数の入力光ビームの前記第２の入力光ビームの位相とは異なる位相を有し、前記第１の入力光ビームは画像平面を含み、かつ前記第２の入力光ビームは画像平面を含む工程と、
前記第１の入力光ビームおよび前記第２の入力光ビームから、第１の出力光ビーム、第２の出力光ビーム、および第３の出力ビームを生成する工程であって、前記第１の出力光ビームは、前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分と、前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差と、を含み、前記第２の出力光ビームは、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分と、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分の間の位相差と、を含み、前記第３の出力光ビームは、前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分と、前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分の間の位相差と、を含む工程と、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差が、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分の間の位相差とは異なり、前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差が、前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分の間の位相差とは異なる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の入力光ビームの第１の部分および前記第２の入力光ビームの第１の部分の間の位相差、前記第１の入力光ビームの第２の部分および前記第２の入力光ビームの第２の部分の間の位相差、ならびに前記第１の入力光ビームの第３の部分および前記第２の入力光ビームの第３の部分の間の位相差に基づいて光源の位置を決定する工程、
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ｚ平面内の複数の所定位置で光源の位相シフト画像を逐次的に取得して複数の画像フレームシーケンスを形成する工程と、
前記複数の画像フレームシーケンスから、ｚ平面内の前記光源の各所定位置に関連付けられる少なくとも１つの位相関連特性を決定する工程と、
前記少なくとも１つの位相関連特性およびｚ平面内の前記光源の所定位置を記憶する工程と、
を含む、方法。
【請求項３３】
複数の画像フレームに基づいて、ｚ平面内の光源の位置に関連付けられる少なくとも１つの位相関連特性を決定する工程と、
前記少なくとも１つの位相関連特性を、ｚ平面内の光源の複数の所定位置に関連付けられる複数の位相関連特性と相関付けて、ｚ平面内の光源の位置を特定する工程と、
を含む、方法。
【請求項３４】
前記光源の複数の位相シフト発光を検出して複数の画像フレームを形成する工程と、
前記複数の画像フレームに基づいてｘ，ｙ平面内の光源の位置を特定する工程と、
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公表番号】特表２０１０−５１５０８４（Ｐ２０１０−５１５０８４Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４３２４８（Ｐ２００９−５４３２４８）
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８４８８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８００３２
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０２３５２４２７）ハワード ヒューズ メディカル インスティチュート (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８４８８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８００３２
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０２３５２４２７）ハワード ヒューズ メディカル インスティチュート (3)
【Ｆターム（参考）】
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