上皮間葉転換のバイオマーカーとしてＡＸＬを使用する方法
本発明は、対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するためのバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。さらに具体的には、本発明は、Ａｘｌ発現及び／又は活性を測定することにより対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための様々な方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮間葉転換（ＥＭＴ，epithelial-to-mesenchymal transition）の発生を検出するためのバイオマーカー及び診断／予後法に関する。さらに具体的には、本発明は、Ａｘｌの発現及び／又は活性に関連する診断法、予後法及び治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｘｌは受容体型チロシンキナーゼサブファミリーの一員である。他の受容体型チロシンキナーゼに類似しているが、Ａｘｌタンパク質は、ＩｇＬとＦＮIII反復を隣接させている細胞外領域という独特の構造を表し、その一部がキナーゼドメインである細胞内ドメインを含有する細胞内領域を有する。Ａｘｌは、ビタミンＫ依存性タンパク質Ｇａｓ６（増殖停止特異的遺伝子６，growth-arrest-specific gene 6）のような増殖因子に結合することにより、細胞外マトリックスから細胞質にシグナルを伝達する。Ａｘｌの細胞外ドメインは切断されることが可能であり、６５ｋＤａの可溶性細胞外ドメインを放出することが可能である。切断により受容体の代謝回転が増強され、部分的に活性化されたキナーゼが生成される（O'Bryan JP, et al (1995) J Biol Chem. 270 (2): 551-557）。しかし、切断されたドメインの機能は分かっていない。
【０００３】
ヒトＡｘｌ遺伝子及び遺伝子産物に関する構造的情報は、国際公開第０３／０６８９８３号パンフレットに記載されている。以下の特許公表文献、米国特許第５，４６８，６３４号明細書、米国特許第６，０８７，１４４号明細書、米国特許第５，５３８，８６１号明細書、米国特許第５，９６８，５０８号明細書、米国特許第６，２１１，１４２号明細書、米国特許第６，２３５，７６９号明細書、国際公開第９９／４９８９４号パンフレット、国際公開第００／７６３０９号パンフレット、国際公開第０１／１６１８１号パンフレット、及び国際公開第０１／３２９２６号パンフレットもＡｘｌ又は他のチロシンキナーゼ受容体に関する。
【０００４】
Ａｘｌは細胞増殖の刺激作用に関与している。具体的には、Ａｘｌは慢性骨髄性白血病関連癌遺伝子であり、結腸癌及びメラノーマにも関連している。Ａｘｌは第１９染色体ｑ１３．１−ｑ１３．２にあるｂｃｌ３癌遺伝子に近接近している。Ａｘｌ遺伝子は脊椎動物種間で進化的に保存されており、間葉における発生中に発現される。
【０００５】
Ｇａｓ６リガンドと相互作用すると、Ａｘｌは自己リン酸化され、シグナル伝達事象のカスケードが起こる。Ｐｌ３Ｋ、ＡＫＴ、ｓｒｃ、Ｂａｄ、１４−３−３、ＰＬＣ、ＥＲＫ、Ｓ６Ｋ（マイトジェン調節キナーゼ）及びＳＴＡＴは、それぞれこのカスケードに関与していることが知られている。Ｇａｓ６は、膜リン脂質へのＣａ＋＋依存性結合を可能にするｙ−カルボキシグルタミン酸が豊富な領域（ＧＬＡドメイン）を有する。Ｇａｓ６は弱いマイトジェンであり、ＴＮＦ誘導細胞障害性又は増殖因子離脱によるストレスにさらされたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞において抗アポトーシス効果を及ぼす。ＮＩＨ３Ｔ３において、Ｇａｓ６のＡｘｌへの結合により、Ｐｌ３Ｋ、ＡＫＴ、ｓｒｃ及びＢａｄが活性化される。
【０００６】
Ａｘｌは腫瘍形成においていくつかの異なる役割を果たしていることが研究により明らかにされている。Ａｘｌは、内皮細胞遊走、増殖及び管形成を含む血管新生行動のキーとなる調節因子である。Ａｘｌは、ヒト乳癌細胞がインビボにおいて腫瘍を形成するのにも必要とされ、Ａｘｌが血管新生と腫瘍形成の両方に極めて重要であるプロセスを調節していることを示している（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。
【０００７】
Ａｘｌ受容体型チロシンキナーゼの活性は腫瘍転移と正の相関をしている。さらに具体的には、Ａｘｌは、Ａｘｌ媒介浸潤に必要とされるＭＭＰ−９の発現を増強することが研究により明らかにされている。Ａｘｌは、ＮＦ−Ｂκ及びＢｒｇ−１の活性化を通じてＭＭＰ−９活性を誘導することにより細胞浸潤を促進する（Tai, K-Y et al, Oncogene (2008), 27, 4044-4055）。
【０００８】
Ａｘｌはヒト神経膠腫細胞において過剰発現されており、Ａｘｌを使用して多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）を抱える患者における予後不良を予測することが可能である（Vajkoczy P, Knyazev P, Kunkel A, Capelle HH, Behrndt S, von Tengg-Kobligk H, Kiessling F, Eichelsbacher U, Essig M, Read TA, Erber R, Ullrich A Dominant-negative inhibition of the AxI receptor tyrosine kinase suppresses brain tumor cell growth and invasion and prolongs survival. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006)103:5799-804; Hutterer M. et al, Clinical Cancer Res 2008; 14 (1) Jan 1, 2008）。Ａｘｌは、その最小侵襲性相当物と比べて高度に侵襲性の肺癌細胞系統においても比較的過剰発現されている（Shieh, Y-S et al, Neoplasia, vol 7, no. 12, Dec 2005, 1058-1064）。したがって、Ａｘｌは腫瘍浸潤及び腫瘍進行において重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００９】
同様に、Ａｘｌは、高度に侵襲性の乳癌細胞において発現されているが、低侵襲性の乳癌細胞においては発現されていない。さらに具体的には、Ａｘｌシグナル伝達を阻害すると（ドミナントネガティブＡｘｌ変異体、Ａｘｌの細胞外ドメインに対する抗体により又はＡｘｌの低分子ヘアピン型ＲＮＡノックダウンにより）、高度に浸潤性の乳癌細胞の運動性及び浸潤性が減少した。低分子Ａｘｌ阻害剤は乳癌細胞の運動性及び侵襲性を妨げた。したがって、Ａｘｌは、乳癌細胞の運動性／侵襲性を支配するシグナル伝達ネットワークにおける決定的に重要な要素であると理解されている（Zhang, Y-X et al, Cancer Res 2008; 68 (6), March 15, 2008）。
【００１０】
メサンギウム細胞（mesangial cell）では、Ｇａｓ６は分裂促進的効果を有していることが見出されており、糸球体硬化症の進行における役割があり得ることを示していた。Ｇａｓ６／Ａｘｌ経路は糸球体腎炎においても役割を果たしていることが証拠により示唆されている（Yanagita M. et al, The Journal of Clinical Investigation, 2002, 110 (2) 239-246）。さらに、Ｇａｓ６は動脈損傷のモデルにおいて内皮細胞の生存を促進することが研究により明らかにされている。アンジオテンシンIIは、そのＡＴ１受容体を介して、血管平滑筋細胞においてＡｘｌ ｍＲＮＡ及びタンパク質受容体を増加することが明らかにされた（Melaragno M. G. et al, Circ Res., 1998, 83 (7): 697-704）。
【００１１】
Ａｘｌは、免疫系において細胞接着、細胞増殖及び恒常性の調節に関与していることも明らかにされている（Lu Q., 2001 Science 293 (5528): 306-311）。Ａｘｌ活性化に続いて、以下の現象：アポトーシスの阻害、線維芽細胞及び内皮細胞の「正常」細胞（非形質転換の）生存の増加、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ，Vascular Smooth Muscle Cell）の遊走（Ａｘｌキナーゼの不活化は遊走を遮断する）、血管壁における新生内膜形成の増強（Melaragno M.G. et al, Trends Cardiovasc Med., 1999, (Review) 9 (8): 250-253）並びに病変形成及びアテローム性動脈硬化症の進行への関与が観察されている。
【００１２】
本発明は、Ａｘｌに関連する新しい診断的、予後的及び治療的適用の提供を意図している。特に、本発明は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための方法を提供しようとしており、この方法は、癌、さらに具体的には、転移性及び薬物耐性癌の治療において治療的意義を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第０３／０６８９８３号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，４６８，６３４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０８７，１４４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５３８，８６１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９６８，５０８号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２１１，１４２号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２３５，７６９号明細書
【特許文献８】国際公開第９９／４９８９４号パンフレット
【特許文献９】国際公開第００／７６３０９号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０１／１６１８１号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０１／３２９２６号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】O'Bryan JP, et al (1995) J Biol Chem. 270 (2): 551-557
【非特許文献３】Tai, K-Y et al, Oncogene (2008), 27, 4044-4055
【非特許文献５】Hutterer M. et al, Clinical Cancer Res 2008; 14 (1) Jan 1, 2008
【非特許文献６】Shieh, Y-S et al, Neoplasia, vol 7, no. 12, Dec 2005, 1058-1064
【非特許文献７】Zhang, Y-X et al, Cancer Res 2008; 68 (6), March 15, 2008
【非特許文献８】Yanagita M. et al, The Journal of Clinical Investigation, 2002, 110 (2) 239-246
【非特許文献９】Melaragno M. G. et al, Circ Res., 1998, 83 (7): 697-704
【非特許文献１０】Lu Q., 2001 Science 293 (5528): 306-311
【非特許文献１１】Melaragno M.G. et al, Trends Cardiovasc Med., 1999, (Review) 9 (8): 250-253
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の態様は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するためのバイオマーカーとしての、Ａｘｌの使用に関する。
【００１６】
本発明は、Ａｘｌ発現は上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生と相関があるという所見に基づいている。本発明者らの知る限りでは、本発明は、そのような相関関係の最初の実証を表している。有利なことに、この所見は、癌、さらに具体的には、転移性及び薬物耐性癌の分野における診断法、予後法及び治療法を提供するための刺激的な新たな機会を開いている。
【００１７】
本発明者らは、浸潤−転移カスケードにおける必須のＥＭＴ誘導エフェクターとしての受容体型チロシンキナーゼＡｘｌのこれまで認識されていなかった役割を実証した。ＥＭＴプログラム活性化により、悪性乳癌細胞の侵襲性及び自然転移並びに薬物耐性表現型に不可欠であるＡｘｌ上方調節が生じることを結果は明らかにしている。Ａｘｌ発現は、間隔マンモグラフィー検出腫瘍及び臨床的に同定された乳腺腫瘍による乳癌患者死亡率と強い相関があり、Ａｘｌ活性化と転移性疾患の発生間の関連を示唆している。
【００１８】
本発明の第二の態様は、
（ｉ）試料を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、対照試料と比べてＡｘｌ発現の上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示すステップと、
を含む、試料中において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための方法に関する。
【００１９】
有利なことに、Ａｘｌの発現を決定することは、天然ではそれ自体一過性であるＥＭＴ事象の発生を検出するための「永久的」マーカーを提供する。したがって、Ａｘｌ発現の検出は、ＥＭＴ事象が起きたのかどうかを示す独特の永久的指標を提供する。
【００２０】
出願者による研究によれば、これは、ＥＭＴ関連活性化は悪性細胞に有利である自己分泌Ａｘｌ−Ｇａｓ６シグナル伝達ループを確立するという事実によることが明らかになった。Ａｘｌはパラ分泌機構を介しても活性化され得る。
【００２１】
ＥＭＴを起こした腫瘍細胞の検出は、現在のマーカー（例えば、ビメンチン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンの欠如）が正常ストローマ細胞に存在する間葉細胞骨格系及び接合部タンパク質に基づいているという事実により複雑化されている。腫瘍細胞と周囲のストローマ細胞を区別するのは困難である。Ａｘｌ発現は、悪性腫瘍細胞に際立った特徴を与える固形腫瘍中の腫瘍細胞に限定される可能性が高い。
【００２２】
ＥＭＴの可逆性は遠隔部位での転移形成に重要である。Ａｘｌ発現を使用して転移を検出することが可能である。
【００２３】
本発明の第三の態様は、対象由来の試料中のＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを決定することを含み、転移性癌のない対象中のレベルと比べて該ポリペプチドのレベルがより高いことが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示す、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することにより対象中の転移性癌を診断する方法に関する。
【００２４】
本発明の第四の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す（reversing）ことができる作用薬の活性をモニターする際のＡｘｌ又はＡｘｌをコードする遺伝子の使用に関する。
【００２５】
本発明の第五の態様は、作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、及びＡｘｌの活性及び／又は発現をモニターすることを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００２６】
本発明の第六の態様は、
（ｉ）作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与するステップと、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中においてＡｘｌ発現を測定するステップと、
（iii）上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す能力の指標として、未処置の試料と比べた場合の処置された試料中のＡｘｌの発現又は活性の増加又は減少を検出するステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を検出するための方法に関する。
【００２７】
本発明の第七の態様は、
（ｉ）Ａｘｌ阻害剤を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中のＡｘｌ発現を測定すること、並びに
（iii）Ａｘｌ阻害活性の指標として、未処置の試料中と比べた場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現又は活性の増加又は減少を検出すること、
により上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤の活性をモニターする方法に関する。
【００２８】
本発明の第八の態様は、
（ｉ）作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００２９】
本発明の第九の態様は、
（ｉ）複数の作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記複数の作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される前記活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
（iv）前記複数中に存在するどの作用薬又はどの複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すのかを個別に決定するステップと、
を含む、複数の作用薬をスクリーニングすることにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００３０】
第十の態様は、本発明の方法に従って同定される作用薬の、転移性癌の治療のための薬物の調製における使用に関する。
【００３１】
第十一の態様は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合される、本発明の方法に従って同定される作用薬を含む医薬組成物に関する。
【００３２】
第十二の態様は、
（ｉ）本発明に従った方法を使用して上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定すること、及び
（ii）前記作用薬を薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤と混合させること、
を含む、組成物を調製する方法に関する。
【００３３】
本発明の第十三の態様は、Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すための方法に関する。
【００３４】
本発明の第十四の態様は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことを含む、それを必要とする対象において転移性癌を治療するための方法に関する。
【００３５】
本発明の第十五の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【００３６】
本発明の第十六の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことにより転移性癌を治療するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【００３７】
本発明の第十七の態様は、抗Ａｘｌ抗体、Ａｘｌに対する核酸プローブ又はＡｘｌに対するＱＰＣＲプライマーを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【００３８】
第十八の態様は、本発明に従った方法における上で定義されるキットの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
転移は大多数の癌関連死の根底にある。したがって、腫瘍細胞播種を可能にする分子機構の理解を促進することは、極めて重要な健康問題である。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、癌細胞に悪性進行を促進する増強された遊走性及び生存属性を授ける。ＥＭＴエフェクターを特徴付ければ、転移についての新たな洞察及び治療のための新規の道を生み出す可能性がある。マンモグラフィー検出原発性乳癌における受容体型チロシンキナーゼＡｘｌの存在はそれだけで、全体的患者の生存を強力に減少させることを予測し、適合する患者の転移病変は増強されたＡｘｌ発現を示していることを本出願者は明らかにした。Ａｘｌは、前悪性乳腺上皮細胞において、そのリガンド、Ｇａｓ６と自己分泌シグナル伝達ループを確立する上皮間葉転換により強力に誘導されることも本出願者は実証した。転移性乳癌細胞におけるエピ対立形質（epi-allelic）ＲＮＡ干渉解析を使用して、間葉様インビトロ細胞侵襲性に対する、並びに外来及び組織操作された微小環境においてインビボで腫瘍を形成するためのＡｘｌ発現の明確な閾値を本出願者は描いた。重要なことに、Ａｘｌノックダウンは、２つの異なる光学画像ベースの実験乳癌モデルにおいて、乳腺からリンパ節及びいくつかの主要臓器への高度に転移性の乳癌細胞の拡散を完全に妨げ、全体的生存を増加した。したがって、Ａｘｌは、乳癌転移に必要とされる腫瘍細胞ＥＭＴの新規の下流エフェクターを表している。Ａｘｌ発現腫瘍の検出及び標的された治療は、乳癌に対する重要で新しい治療戦略を表す。
【００４０】
ＥＭＴ及び転移におけるＡｘｌの役割
間葉細胞の特徴を獲得すると、上皮癌細胞は、転移に伴う単細胞侵襲性細胞運動性を与えられる（Theirry, 2002 Weinberg, 2007）。
【００４１】
上で述べたように、本発明者らは、Ａｘｌが浸潤−転移カスケードにおいて必須のＥＭＴ誘導エフェクターであることを実証した。ＥＭＴプログラム活性化により、悪性乳癌細胞の侵襲性及び自然転移に不可欠であるＡｘｌ上方調節が生じることを結果は明らかにしている。Ａｘｌ発現は、間隔マンモグラフィー検出腫瘍による乳癌患者死亡率と強い相関があり、Ａｘｌ活性化と転移性疾患の発生間の関連を示唆している。
【００４２】
Ａｘｌは、最初に、機能的遺伝子スクリーニングにおいて浸潤性細胞遊走のキーとなる調節因子として同定された（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。悪性乳癌細胞におけるＡｘｌ発現は、様々な走化性誘導物質（血清、ＳＤＦ−１）に応答した三次元マトリックスにおける侵襲性に必要であることを本発明者らはここで実証している。これとは対照的に、プレートベースの２Ｄアッセイ（増殖、スクラッチ）における又は細胞接着に対するＡｘｌノックダウンの効果はごく僅かしか本発明者らは観察しなかった。Ａｘｌ阻害は、増殖に影響を与えることなく、神経膠腫及び肺癌細胞遊走も阻害する（Angelillo-Scherrer et al., 2005; Shieh et al., 2005）。したがって、共通の主題は、Ａｘｌシグナル伝達は悪性腫瘍細胞における間葉遊走性表現型に不可欠であることである。
【００４３】
これと一致して、Ａｘｌは、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＺＥＰ２を含むいくつかの転写因子により誘導されるＥＭＴの新規マーカーを表すことを本発明者らは実証している。上皮細胞におけるこれらの転写因子の発現は、上皮細胞において間葉特徴を一過性に上方調節する正常な発生プログラムを誘発する。前悪性上皮細胞は、局所的ストローマ細胞により産生されるＴＧＦベータなどのコンテクストシグナルを介してＥＭＴを活性化すると考えられている（Weinberg, 2007）。Ｅ−カドヘリンなどのＥＭＴ関連マーカー発現が腫瘍中では大きく異なるために、このプロセスはインビボでは動的である。実際、Ａｘｌは本発明者らの研究では独立した予後判定？因子であり、Ｅ−カドヘリンとの変化とは相関していない。ＥＭＴに対する臨床的証拠のこのような欠如はよく文書に取り上げられ議論されている。Ａｘｌ発現はもっと耐久性のあるＥＭＴ誘導変化を表していることを本出願者は明らかにしている。
【００４４】
Ａｘｌが乳腺微小環境からの転移に不可欠かどうかを決定するために、本発明者らは高度に転移性の（インビボ継代された）乳癌細胞系統（ＭＤＡ−２３１−ＤＨ２ＬＮ）を乳腺に移植し、ルシフェラーゼ生物発光のインビボ光学画像により拡散をモニターした。時間的全身光学画像により、全ての対照マウスにおいて移植の２８日以内に、リンパ節、肺、卵巣及び腎臓への広範囲なＭＤＡ−２３１−ＤＨ２ＬＮ拡散が明らかになった。自然なリンパ節転移は全ての動物において４週間目にはじめて検出された。臓器転移は９週間の経過観察中ずっと検出された。屠殺時、切除された臓器は個別にスキャンされ、転移を含有することが明らかにされ、後に組織診断により確証された。これとは対照的に、Ａｘｌノックダウン細胞（ＭＤＡ−２３１−ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ）を坦持するマウス由来の臓器の生物発光によっても組織診断によっても転移は検出されなかった。同所性乳腺部位からの拡散のこの強力な阻害は、Ａｘｌが転移に不可欠であることを明らかにしている。
【００４５】
総合すると、本発明者らの結果により、Ａｘｌ発現乳腺腫瘍の検出及びかかる腫瘍を標的にした治療が乳癌治療開発のための重要な新戦略を表していることが示されている。
【００４６】
診断ツール
本発明の一態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための診断ツールに関する。
【００４７】
したがって、第一の態様では、本発明は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するためのバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【００４８】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌは上皮間葉転換（ＥＭＴ）の誘導を検出するためのバイオマーカーである。
【００４９】
遠隔部位への転移は固形癌による最も一般的な死亡原因である（Gupta 2006, Sporn 1996）。これを実現するために、腫瘍細胞は上皮拘束を捨て、結合複合体を再定義し、基底膜境界を突破するための侵襲的運動性を獲得する。次に、これらの転移細胞はリンパ及び血行循環に血管内侵入し、身体の遠隔部位へ播種する。少数のこれらの転移細胞は毛細血管壁を通って血管外遊出することに成功し、稀に、外来組織ストローマにコロニーを形成する（Weinberg et al）。この悪性過程は、上皮細胞が原腸陥入及び器官形成中に一過性に間葉表現型を帯び、上皮層から離れる単細胞侵襲的運動を可能にする発生プログラムである、上皮間葉転換（ＥＭＴ）により促進される（Hall, 1985; Thierry, 2002）。ＥＭＴプログラムは、結合複合体タンパク質の発現を変化させる、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＺｅｂ２を含む転写調節因子の発現を誘導するモルフォゲンシグナル伝達経路のコンテクスト活性化により開始される（Thiery and SLeeman 2006）。ＥＭＴ遺伝子発現プロファイルは、表現型シフト、ビメンチン及びＮ−カドヘリンの誘導に伴うＥ−カドヘリン及びサイトケラチンの抑制を反映している（Weinberg et al 2007）。
【００５０】
本発明の別の態様は、悪性度を検出しモニターするためのバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【００５１】
本発明の別の態様は、腫瘍転移を検出するためのバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。好ましくは、腫瘍は癌腫であり、さらに好ましくは乳癌である。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、対象が、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療を受けるに適した候補であるかどうかを決定するための診断法を提供する。例えば、Ａｘｌ発現が上方調節されていることが示されている場合、これはＡｘｌ阻害剤を用いる治療に感受性である可能性がある対象を選択するための治療選択肢及び実行、すなわち、個別化医療適用における予後の指針として使用することが可能である。例えば、Ａｘｌ発現が原発性腫瘍において上方調節されていることが示されている場合、これは転移の可能性が増加していると推測するのに使用することが可能である。この情報は、根治的乳房切除術などのより積極的な抗癌外科的、化学療法的又は放射線治療的処置を必要とする可能性がある対象を選択するための治療選択肢、すなわち、個別化医療適用における予後の指針として使用することが可能である。
【００５３】
したがって、本発明の別の態様は、
（ｉ）細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから試料を単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定し、対照試料に対してＡｘｌ発現の上方調節がＡｘｌ阻害剤を用いる治療に感受性であることを示すステップと、
を含む、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性であるかどうかを決定するための方法に関する。
【００５４】
用語「マーカー」又は「バイオマーカー」とは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）が起こる場合、細胞又は哺乳動物由来の試料中のその発現が変化している又は調節されている、例えば、上方調節されている又は下方調節されている遺伝子又はタンパク質を指すのに本明細書では使用されている。バイオマーカーがタンパク質の場合、発現の調節又は変化は、異なる翻訳後修飾を通じた調節を包含する。
【００５５】
翻訳後修飾は、タンパク質切断により又は１若しくは２以上のアミノ酸への修飾基の付加によりタンパク質の特性を変える共有結合プロセッシング事象である。一般的翻訳後修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、アシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー、ユビキチン化などが挙げられる。検出のためのそのような修飾及び方法の概説は、Mann et al. Nature Biotechnology March 2003, Vol. 21, pages 255-261において見出し得る。
【００５６】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌの上方調節は上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示している。
【００５７】
本発明の別の態様は、
（ｉ）細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから試料を単離し、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定し、対照試料に対してＡｘｌ発現の上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）発生を示す、
ステップを含む、試料中の上皮間葉転換（ＥＭＴ）発生を検出するための方法に関する。
【００５８】
本発明の別の態様は、対象由来の試料におけるＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを決定し、転移性癌のない対象におけるレベルと比べてポリペプチドのより高いレベルが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示すことを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）発生を検出することにより対象の転移性癌を診断する方法に関する。
【００５９】
特に、所望の癌は、いかなる癌腫でも、さらに好ましくは乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病でも含む。さらに好ましくは、癌は転移性乳癌である。
【００６０】
好ましくは、Ａｘｌ遺伝子の発現又はＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルは、抗Ａｘｌ抗体又は親和性作用薬を使用して測定される。
【００６１】
新たな治療薬のための診断
本発明の別の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができ、それによって癌などの増殖性障害の治療において潜在的治療適用を有する作用薬を同定するための診断アッセイに関する。
【００６２】
したがって、本発明の一態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬の活性をモニターする際のＡｘｌ又はＡｘｌをコードする遺伝子の使用に関する。
【００６３】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌの存在は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬の細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトへの投与後にモニターされる。
【００６４】
本発明の別の態様は、作用薬を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与し、Ａｘｌの活性及び／又は発現をモニターすることを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００６５】
好ましい一実施形態では、方法は、作用薬を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与し、未処置の対照試料と比べた場合の前記処置された試料においてＡｘｌの変化した発現を検出することを含む。
【００６６】
「変化した発現」とは、未処置の対照試料と比べた場合、処置された細胞由来の試料中における発現の増加、減少又はその他の方法では改変されたレベル又はパターンのことである。
【００６７】
用語「発現」とは、対応するｍＲＮＡを産生する遺伝子ＤＮＡ鋳型の転写及び対応する遺伝子産物（すなわち、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）を産生するこのｍＲＮＡの翻訳の他にも翻訳後に修飾されている可能性のある１又は２以上の形でのタンパク質の「発現」のことである。
【００６８】
遺伝子発現を含む変化した発現の検出は、当技術分野で公知の方法のうちのいずれか１つにより、特にマイクロアレイ解析、ウェスタンブロッティングにより又はＱＰＣＲなどのＰＣＲ技法により実施され得る。変化した発現は、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ又はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳなどの方法を使用して及び２Ｄゲル電気泳動などの解析技法をさらに使用して試料のタンパク質含有量を解析することによっても検出され得る。このような技法は、タンパク質の別の翻訳後修飾された形態の形で変化した発現を検出するのに特に有用であることが可能である。
【００６９】
本発明の別の態様は、
（ｉ）作用薬を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与すること、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料においてＡｘｌ発現を測定すること、並びに
（iii）上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す能力の指標として、未処置の試料と比較した場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現の増加又は減少を検出すること、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を検出するための方法に関する。
【００７０】
阻害はいかなるレベルで（例えば、遺伝子発現レベル又はタンパク質レベルで）あってもよい。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、
（ｉ）Ａｘｌ阻害剤を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与すること、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料においてＡｘｌ発現を測定すること、並びに
（iii）Ａｘｌ阻害活性の指標として、未処置の試料と比較した場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現又は活性の増加又は減少を検出すること、
により上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤の活性をモニターする方法に関する。
【００７２】
この態様では、好ましくは、試料はタンパク質解析により、さらに好ましくはＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ、フローサイトメトリー、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ又は２−Ｄ ＰＡＧＥにより解析される。
【００７３】
本明細書で使用されるように、処置された又は未処置の細胞由来の試料は、組織培養物又は動物又はヒト由来であることが可能である細胞の集団由来のライセート、抽出物又は核酸試料であることが可能である。タンパク質解析では、試料は組織培養物上清であることが可能である。細胞は個体から単離されることが可能である（例えば、血液、血清若しくは血漿試料由来の全細胞）又は生検などの組織試料の一部であることが可能である。
【００７４】
好ましくは、細胞の集団は細胞培養物である。
【００７５】
好ましい細胞型は、ＨＴ２９などの結腸腫瘍細胞系統、Ａ５４９などの肺腫瘍細胞系統、Ａ４９８などの腎腫瘍細胞系統、ＨＴ１３などの膀胱腫瘍細胞系統、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などの乳腺腫瘍細胞系統、ＡＮ３ＣＡなどの子宮内膜腫瘍細胞系統、ＭＥＳＳＡ ＤＨ６子宮肉腫細胞などの子宮腫瘍細胞系統、Ｈｅｐ２Ｇなどの肝腫瘍細胞系統、ＤＵ１４５などの前立腺腫瘍細胞系統、Ｃｅｍ Ｔ細胞などのＴ細胞腫瘍細胞系統、ＭｉａＰａＣａ２などの膵腫瘍細胞系統から選択される。代わりに、細胞は腫瘍生検の組織学的試料（例えば、レーザーキャプチャー顕微鏡手術により採取される試料）の形であり得る。生検試料中の遺伝子発現を検出するための適切な方法は、本明細書で同定される遺伝子を認識する抗体を使用するＦＩＳＨ又は免疫組織化学技法を使用することの他にも試料のタンパク質組成を解析するための方法を含む。
【００７６】
別の代案では、細胞はＰＢＭＣなどの血液細胞培養物でもよい。本明細書で使用されるように、用語「ＰＢＭＣ」とは、末梢血単核球のことであり、ＰＢＬ（末梢血リンパ球，peripheral blood lymphocyte）を誘導する。
【００７７】
適切には、遺伝子発現の変化を含む発現の変化は哺乳動物又はヒトから採取される試料においてモニターされる。適切な試料には、生検、血液、尿、頬スクレープ、等などの組織試料が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、遺伝子発現は好ましくは腫瘍細胞、特に乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病などの腫瘍、又はリンパ球などの血液細胞及び好ましくはＰＢＭＣなどの末梢リンパ球由来の細胞において検出される。
【００７８】
別の実施形態では、変化したタンパク質発現は、哺乳動物又はヒト由来の血清又は血漿又は組織培養上清試料において検出される。
【００７９】
本明細書に記載されるように、血清中、及び特に患者の血漿試料中のタンパク質の検出では、試料は取り出され、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳなどのタンパク質解析技法にかけられる。
【００８０】
好ましい一実施形態では、方法は、前記試料からＲＮＡを抽出し、ＱＰＣＲにより遺伝子発現を検出することを含む。
【００８１】
別の実施形態では、遺伝子発現は、例えば、ウェスタンブロットによるなどのタンパク質産物を検出することにより検出される。
【００８２】
本発明の別の態様は、
（ｉ）作用薬をＡｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記作用薬の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００８３】
好ましくは、測定される活性は、Ａｘｌ受容体の基質のチロシンリン酸化である。
【００８４】
さらに好ましくは、測定される活性は、Ａｘｌ受容体の自己リン酸化である。
【００８５】
この特定の実施形態では、好ましくは接触ステップ（ｉ）における細胞は既にＡｘｌ遺伝子によりトランスフェクトされている。
【００８６】
さらに好ましくは、トランスフェクトされた細胞は、一過的又は安定的にトランスフェクトされている。
【００８７】
好ましい一実施形態では、ステップ（iii）における対照条件は、作用薬を活性なＡｘｌ遺伝子を欠く細胞に接触させることを含む。さらに好ましくは、前記細胞は変異不活性化型のＡｘｌ遺伝子を有する。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、ステップ（iii）における対照条件は、前記活性を前記作用薬の不在下で測定される活性と比較することを含む。
【００８９】
特に好ましい一実施形態では、Ａｘｌ受容体は、細胞内ドメインの生物学的に活性な部分を含む。
【００９０】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌ受容体は、例えば、固相への付着により固定化される。
【００９１】
本発明の別の態様は、
（ｉ）複数の作用薬をＡｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記複数の作用薬の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される活性を対照条件下で測定される活性と比較し、減少によって、前記複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
（ｖ）前記複数のうちのどの作用薬又はどの複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すかを個別に決定するステップと、
を含む、複数の作用薬をスクリーニングすることにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００９２】
好ましくは、上記の本発明の方法において、作用薬は転移性癌を治療することを目的とする。
【００９３】
前記方法により同定される作用薬
別の態様は、転移性癌の治療のための薬物を調製する際に上記方法のうちのいずれかに従って同定される作用薬の使用に関する。
【００９４】
好ましくは、癌は、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病から選択される。さらに好ましくは、癌は乳癌である。
【００９５】
遺伝子／タンパク質マーカーの変化した発現を測定する
遺伝子及びタンパク質発現のレベルは、いくつかの異なる技法を使用して決定し得る。
【００９６】
（ａ）ＲＮＡレベルで
遺伝子発現はそのＲＮＡレベルで検出することが可能である。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジン イソチオシアン酸抽出（RNAzol B; Biogenesis社製）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Qiagen社製）又はＰＡＸｇｅｎｅ（PreAnalytix社製、Switzerland）を使用することを含むＲＮＡ抽出技法を使用して細胞から抽出し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイフォーマットは、核ランオンアッセイ(nuclear run-on assay)、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035）、ノーザンブロッティング法及びインサイチュハイブリダイゼーション法を含む。遺伝子発現は、下に記載されるマイクロアレイ解析により検出することも可能である。
【００９７】
ノーザンブロッティング法では、ＲＮＡ試料は、先ず変性条件下のアガロースゲル中での電気泳動を介してサイズにより分離される。次に、前記ＲＮＡは膜に移され、架橋され、標識プローブとハイブリダイズされる。ランダムプライムド（random-primed）、ニックトランスレイティッド（nick-translated）又はＰＣＲ作製ＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドを含む非同位体又は高度に特異的な活性放射性標識プローブを使用することが可能である。さらに、部分的にのみ相同性を有する配列（例えば、異なる種由来のｃＤＮＡ又はエキソンを含有する可能性のあるゲノムＤＮＡ断片）をプローブとして使用し得る。
【００９８】
ヌクレアーゼ保護アッセイ（Nuclease Protection Assays）（例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイとＳ１ヌクレアーゼアッセイの両方）は、特定のｍＲＮＡの検出及び定量化に極めて感受性の方法を提供する。ＮＰＡの基礎はＲＮＡ試料へのアンチセンスプローブ（放射性標識又は非同位体の）の溶液ハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーション後、一本鎖、非ハイブリダイズドプローブ及びＲＮＡはヌクレアーゼにより分解される。残りの保護された断片はアクリルアミドゲル上で分離される。ＮＰＡは、いくつかのＲＮＡ種の同時検出を可能にする。
【００９９】
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ，in situ hybridization）法は、細胞又は組織における特定のｍＲＮＡの局在化のための強力で多用途のツールである。プローブのハイブリダイゼーションは細胞又は組織内で起こる。細胞構造は前記手順の間ずっと維持されるために、ＩＳＨは組織試料内のｍＲＮＡの位置についての情報を提供する。
【０１００】
手順は、中性緩衝ホルマリンに試料を固定し、パラフィン内に組織を包埋することから始める。次に、前記試料は薄片にスライスされ、顕微鏡スライド上にのせられる。代わりに、組織は凍結したまま薄片にされ、パラホルムアルデヒドにポスト固定されることが可能である。前記切片を脱脂して再水和するための一連の洗浄後、プローブ接近性を増加させるためのプロテイナーゼＫ消化が実施され、次に、標識プローブが試料切片にハイブリダイズされる。放射性標識プローブは液体フィルムがスライド上で乾燥されて視覚化され、非同位体標識プローブは比色分析又は蛍光試薬を用いて都合よく検出される。検出のこの後者の方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ，Fluorescent In Situ Hybridisation）法の基礎である。
【０１０１】
用いることが可能な検出のための方法は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識及び他の適切な標識を含む。
【０１０２】
典型的には、ＲＴ−ＰＣＲを使用してＲＮＡ標的を増幅する。このプロセスでは、逆転写酵素を使用してＲＮＡを、その後検出を促進するために増幅することが可能な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。相対定量的ＲＴ−ＰＣＲは、所望の遺伝子と同時に内部標準を増幅することを含む。内部標準を使用して、前記試料を規準化する。規準化された後は、前記試料にわたって特定のｍＲＮＡの相対的存在量の直接比較を行うことが可能である。一般的に使用されている内部標準には、例えば、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、アクチン及びシクロフィリンが挙げられる。
【０１０３】
多くのＤＮＡ増幅法が公知であり、その大半が酵素的連鎖反応に頼っている（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、若しくは自家持続配列複製）、又はＤＮＡがクローニングされているベクターの全て若しくは一部の複製からである。
【０１０４】
多くの標的及びシグナル増幅（ＴＡＳ）法が文献、例えば、Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988)及び Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)におけるこれらの方法の概論に記載されている。
【０１０５】
ＰＣＲは、特に米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている核酸増幅法である。ＰＣＲを使用すれば診断状況においていかなる既知の核酸でも増幅することが可能である（Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252）。自家持続配列複製（３ＳＲ，self-sustained sequence replication）はＴＡＳの変異形であり、これは、酵素カクテル及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーにより媒介される逆転写酵素（ＲＴ，reverse transcriptase）、ポリメラーゼ及びヌクレアーゼ活性の順続的ラウンドを介した核酸鋳型の等温増幅を含む（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）。ライゲーション増幅反応又はライゲーション増幅システムは、ＤＮＡリガーゼ及び標的鎖あたり２種で４種のオリゴヌクレオチドを使用する。この技法はWu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560により記載されている。Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197により記載されるように、Ｑβレプリカーゼ技法では、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼを使用して標的ＤＮＡを増幅する。
【０１０６】
定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ，Quantitative PCR）は、試料内の転写物の相対量を決定することを可能にする技法である。ＱＰＣＲを実施するための適切な方法は本明細書に記載されている。
【０１０７】
代替の増幅技術は本発明において利用することが可能である。例えば、ローリングサークル増幅（Lizardi et al., 1998, Nat Genet 19:225）は、ＤＮＡポリメラーゼにより推進される市販の増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））であり、等温条件下で線形動力学又は幾何学的動力学のいずれかにより環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することが可能である。追加の技法、すなわち鎖置換増幅（ＳＤＡ，strand displacement amplification; Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:392）は、特定の標的に特有の明確に定義された配列から始める。
【０１０８】
本明細書で同定されるＡｘｌの発現を検出するのに適したプローブは、適切な容器に試験キットの形態で都合よくパッケージし得る。そのようなキットでは、プローブは、キットがそれ向けに設計されているアッセイフォーマットがそのような結合を必要とする固形支持体に結合され得る。前記キットは、プローブを試料中の核酸にハイブリダイズさせて、探索される試料を処理するのに適した試薬、コントロール試薬、使用説明書、などを含有していてもよい。適切なキットは、例えば、ＱＰＣＲ反応のためのプライマー又はＦＩＳＨを実施するための標識プローブを含み得る。
【０１０９】
（ｂ）ポリペプチドレベル
変化した遺伝子又はタンパク質発現は、Ａｘｌ遺伝子によりコードされるポリペプチドを測定することによっても検出し得る。これは、Ａｘｌ遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する分子を使用することにより実現され得る。前記タンパク質の存在を検出するために前記ポリペプチドに直接的に又は間接的に結合する適切な分子／作用薬には、ペプチド若しくはタンパク質、例えば、抗体などの天然に存在する分子が挙げられ、又は前記適切な分子／作用薬は合成分子でもよい。
【０１１０】
Ａｘｌ遺伝子又はタンパク質に対する抗体は、商業的供給源に由来していても又は当業者によく知られている技法を通じて得られてもよい。一実施形態では、及び変化した発現が、タンパク質バイオマーカーの翻訳後修飾された形態の変化の発現を通じて現れる場合、それらの異なる形態に特異的な抗体を使用し得る。
【０１１１】
抗体の作製のための方法は当業者には公知である。ポリクローナル抗体が望まれる場合、選択される哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、ポリペプチド由来のエピトープ（複数可）を坦持する免疫原性ポリペプチドで免疫される。前記免疫される動物由来の血清は、公知の手順に従って収集され処理される。ポリペプチド由来にエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、前記ポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することが可能である。ポリクローナル抗血清を作製し処理するための技法は当技術分野では公知である。より大きな免疫原性応答を生み出すためには、ポリペプチド又はその断片を、動物又はヒトにおける免疫原として使用するために別のポリペプチドにハプテン化し得る。
【０１１２】
ポリペプチド中のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体も当業者により容易に作製することが可能である。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体を作製するための一般的方法論は周知である。不死化抗体産生細胞株は、細胞融合により、及び発癌性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタイン・バーウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技法によっても作製することが可能である。本発明のポリペプチド中のエピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性について、すなわち、アイソトープ及びエピトープ親和性についてスクリーニングすることが可能である。
【０１１３】
代替の技法は、例えば、ファージが多種類の相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determing region）を有するその被膜表面上にｓｃＦｖ断片を発現するファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。この技法は当技術分野で周知である。
【０１１４】
本発明の目的のために、用語「抗体」は、それとは反対に特定されていなければ、全抗体、又は標的抗原に対するその結合活性を保持している全抗体の断片を含む。そのような断片には、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片の他にも一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。さらに、抗体及びその断片は、例えば、欧州特許出願公開第２３９４００Ａ号明細書に記載されているヒト化抗体でもよい。本明細書で使用される用語「抗体」は、抗体様アフィニティー試薬も包含する。例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体のタンパク質分解性及び組換え断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー）、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、ナノボディー、ＩｇＮＡＲ、ＶＮＡＲ）並びに抗体に無関係なタンパク質、これらは、以下の
名称 基盤
アフィボディー（Affibodies） プロテインＡ、Ｚドメイン ６ｋＤａ
アフィチン（Affitins） Ｓａｃ７ｄ（スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来）７ｋＤａ
アンチカリン（Anticalins） リポカリン ２０ｋＤａ
ＤＡＲＰｉｎｓ アンキリンリピートモチーフ １４ｋＤａ
ファイノマー（Fynomers） Ｆｙｎ、ＳＨ３ドメイン ７ｋＤａ
クニッツドメインペプチド 多様なプロテアーゼ阻害剤 ６ｋＤａ
モノボディー（Monobodies） フィブロネクチン
などの抗体様特異的結合を有するように操作されている。
【０１１５】
上記のイムノブロッティング法などの標準実験技法を使用して、同一細胞集団中の未処理の細胞と比べた場合のＡｘｌ活性の変化したレベルを検出することが可能である。
【０１１６】
遺伝子発現は、ポリペプチドの翻訳後プロセッシング又は核酸の転写後修飾の変化を検出することによっても決定し得る。例えば、ポリペプチドの差次的リン酸化、ポリペプチドの切断又はＲＮＡの選択的スプライシング、などを測定し得る。ポリペプチドなどの遺伝子産物の発現のレベルの他にもその翻訳後修飾は、特許で保護されたタンパク質アッセイ又は２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動などの技法を使用して検出し得る。
【０１１７】
（ａ）本発明の抗体を提供する；（ｂ）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で前記抗体と一緒に生体試料をインキュベートする；及び（ｃ）前記抗体を含む抗体抗原複合体が形成されているかどうかを決定することを含む方法により、Ａｘｌ発現を検出するための抗体を使用し得る。
【０１１８】
適切な試料には、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉及び骨組織などの組織又はそのような組織由来の腫瘍性増殖物由来の抽出物が挙げられる。他の適切な例には血液又は尿試料が挙げられる。
【０１１９】
Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する抗体は、体液又は組織におけるＡｘｌタンパク質の発現を検出する又は定量するために、当業者に周知である診断法又は予後法及びキットにおいて使用することが可能である。これらの試験の結果を使用して、癌の発生若しくは再発及び他の細胞運動性若しくは細胞生存媒介疾患を診断する若しくは予想する、又は薬物用量及び治療の有効性を評価することが可能である。
【０１２０】
当技術分野で公知のいかなる方法によっても免疫特異的結合について抗体をアッセイすることが可能である。使用することが可能な免疫アッセイには、ウェスタンブロット、免疫組織学、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ及びプロテインＡ免疫アッセイなどの技法を使用する競合的及び非競合的アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
そのようなアッセイは当技術分野では常用である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照。この文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。
【０１２２】
本発明において使用するための抗体は、好ましくは固形支持体に結合されている及び／又は適切な試薬、対照、使用説明書などと一緒に適切な容器中のキットにパッケージされている。
【０１２３】
他の方法には、２Ｄ−ＰＡＧＥが挙げられるが、これに限定されない。しかし、この２Ｄ−ＰＡＧＥは大規模スクリーニングには比較的適切ではない。もっと新しい技法には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ，matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry）が挙げられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析では、複合混合物中のタンパク質は固形金属マトリックスに貼り付けられ、パルスレーザービームで脱離されて、フィールドフリー飛行管を横断する気相イオンを生成し、次にその質量依存性速度に応じて分離される。個々のタンパク質及びペプチドは、タンパク質及びペプチド配列データベースを検索する情報学ツールの使用を通じて同定することが可能である。表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ，surface-enhanced laser desorption/ionisation time of flight MS）は、タンパク質が化学的修飾された固体表面に選択的に吸着され、不純物質は洗浄により除去され、エネルギー吸収マトリックスが適用され、前記タンパク質がレーザー脱離質量分析により同定される親和性ベースのＭＳ法である。
【０１２４】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは無傷のタンパク質又は特定のタンパク質の断片のいずれかの出現／消失の検出のために使用することが可能である。さらに、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、化学基の付加／除去により引き起こされる質量の差のせいによるタンパク質の翻訳後修飾の検出のためにも使用することが可能である。したがって、単一残基がリン酸化されると、前記リン酸基のせいで８０Ｄａの質量変化が起きる。翻訳後修飾のせいだと考えることが可能な分子量のデータベースは、インターネット上において無料でアクセス可能である（http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home?avgmass=all）。さらに、タンパク質の翻訳後修飾形態を特異的に認識する、又はタンパク質のあらゆる形態を同等によく認識することができる抗体を用いることにより、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する親和性ベースのアプローチにより特定のポリペプチドを捕捉することが可能である。
【０１２５】
アレイ
アレイ技術及びそれに関連する様々な技法及び適用は、一般に数多くの教科書及び文書に記載されている。これらには、Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4:277-289; Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips. in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky); Schena and Davis, 1999, Genes, Genomes and Chips. In DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999); The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; January 1999 Supplement); Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company); Cortes, 2000, The Scientist 14(17):25; Gwynne and Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 1999, August 6; Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218、及び様々なワールドワイドウェブサイトも挙げられる。
【０１２６】
アレイ技術は、一般に「一実験一遺伝子」ベースで機能し、低処理量であり遺伝子機能の「全体像」を正しく認識できない分子生物学の従来の方法に関する不利な点を克服する。現在、アレイ技術の主要な応用には、配列（遺伝子／遺伝子変異）の同定及び遺伝子の発現レベル（量）の決定が挙げられる。遺伝子発現プロファイリングは、随意にプロテオミクス技法と組み合わせてアレイ技術を利用し得る（Celis et al., 2000, FEBS Lett, 480(1):2-16; Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836; Khan et al., 1999, 20(2):223-9）。アレイ技術の他の応用、例えば、遺伝子発見、癌研究（Marx, 2000, Science 289: 1670-1672; Scherf et al., 2000, Nat Genet 24(3):236-44; Ross et al., 2000, Nat Genet 2000, 24(3):227-35）、ＳＮＰ解析（Wang et al., 1998, Science 280(5366):1077-82）、創薬、薬理ゲノミクス、病気診断（例えば、マイクロフルイディクスデバイスを利用する：Chemical & Engineering News, February 22, 1999, 77(8):27-36）、毒性学（Rockett and Dix (2000), Xenobiotica 30(2):155-77; Afshari et al., 1999, Cancer Res 59(19):4759-60）、及びトキシコゲノミクス（機能的ゲノミクスと分子毒性学の複合型）も当技術分野では公知である。トキシコゲノミクスの目標は、毒物に対する毒性応答とそのような毒物に曝露される対象の遺伝子プロファイルの変化間の相関関係を見つけることである（Nuwaysir et al., 1999, Molecular Carcinogenesis 24:153-159）。
【０１２７】
本発明の関連では、アレイ技術は、例えば、Ａｘｌタンパク質の発現の解析において使用することが可能である。一実施形態では、アレイ技術を使用して、Ａｘｌ活性に対する候補化合物の効果をアッセイすることが可能である。
【０１２８】
一般に、試料のいかなるライブラリー又は集団も、前記ライブラリー又は集団のメンバーを空間的に分離することにより、アレイに規則正しく配置し得る。整列させるのに適したライブラリーには、核酸ライブラリー（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなどのライブラリーを含む）、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質ライブラリーの他にもとりわけリガンドライブラリー等の、任意の分子を含むライブラリーが挙げられる。したがって、本文書において「ライブラリー」に言及する場合、文脈が他の方法で指示しなければ、そのような言及はアレイの形態でのライブラリーへの言及を含むと解釈すべきである。
【０１２９】
試料（例えば、ライブラリーのメンバー）は、通常、前記試料の拡散及び混合を制限するために、固相、好ましくは固形基板に固定又は固定化される。好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合リガンドのライブラリーを調製し得る。特に、前記ライブラリーは、プラスチック及びガラスなどの膜及び非多孔性基板を含む実質的に平面の固相に固定化し得る。さらに、試料は好ましくは、インデクシング(indexing)（すなわち、特定の試料への参照又は接近）が促進されるように配置される。典型的には、試料は格子構造中のスポットとして貼り付けられる。一般的アッセイシステムは、この目的のために適合させ得る。例えば、アレイは、ウェル中複数の試料で又は各ウェル中単一試料のどちらかでマイクロプレートの表面に固定化し得る。さらに、固形基板は、ニトロセルロースなどの膜でもナイロン膜でもよい（例えば、ブロッティング実験において使用される膜）。代わりの基材には、ガラス又はシリカベースの基板が挙げられる。したがって、試料は、当技術分野で公知のいかなる適切な方法によっても、例えば、電荷相互作用により、又はウェルの壁若しくは底又は膜の表面への化学結合により固定化される。配置し固定する他の手段、例えば、ピペット操作、ドロップタッチ、圧電気法、インクジェットとバブルジェット技術、静電気応用などを使用し得る。シリコンベースチップの場合は、フォトリソグラフィーを利用して試料をチップ上に配置し固定し得る。
【０１３０】
試料は固体基板上に「スポット」されることにより配置され得、これは手動により、又は試料を付着させるロボット工学の利用により行い得る。一般に、アレイはマクロアレイ又はマイクロアレイと記載される場合があり、その違いは試料スポットのサイズである。マクロアレイは典型的には約３００ミクロン又はそれ以上の試料スポットサイズを含有し、既存のゲル及びブロットスキャナーにより容易に撮像し得る。マイクロアレイ中の試料スポットサイズは典型的には直径２００ミクロン未満であり、これらのアレイは通常数千のスポットを含有する。したがって、マイクロアレイは、特殊なロボット工学及び撮像装置を必要とする場合があり、これは特別注文製である必要があり得る。計測手段は、Cortese, 2000, The Scientist 14(11):26による概説に広く記載されている。
【０１３１】
ＤＮＡ分子の固定化されたライブラリーを作製するための技法は当技術分野では既に記載されている。一般的には、大半の先行技術の方法が、例えば、固形基材上の様々な別々の位置で配列の様々な並べ替えを構築するマスキング技法を使用して、一本鎖核酸分子ライブラリーを合成する方法を記載していた。米国特許第５，８３７，８３２号明細書は、大規模組込み技術に基づいてシリコン基材に固定化されるＤＮＡアレイを作製するための改良された方法を記載しており、この特許文献の内容は参照により本明細書に組み込まれている。特に、米国特許第５，８３７，８３２号明細書は、本発明の固定化ＤＮＡライブラリーを作製するために使用し得る基材上の空間的に定義された位置で特定の組のプローブを合成する「タイリング(tiling)」と呼ばれる戦略を記載している。米国特許第５，８３７，８３２号明細書は、以前の技法についての参考文献を提供しており、これらの技法も使用し得る。
【０１３２】
ペプチド（又はペプチド模倣剤）のアレイも、各異なるライブラリーメンバー（例えば、独特のペプチド配列）をアレイ中の別々の前定義された位置に置くような形で表面上で合成され得る。各ライブラリーメンバーの識別はアレイ中のその空間的位置により決定される。予定された分子（例えば、標的又はプローブ）と反応性ライブラリーメンバー間の結合相互作用が起こるアレイ中の位置が決定され、それによって空間的位置に基づいて反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号明細書、国際公開第９０／１５０７０号パンフレット及び国際公開第９２／１００９２号パンフレット；Fodor et al., 1991, Science 251:767; Dower and Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26:271に記載されている。
【０１３３】
検出を支援するため、標的及びプローブは、容易に検出可能な任意のレポーター、例えば、蛍光、生物発光、リン光、放射性などのレポーターで標識され得る。そのようなレポーター、その検出、標的／プローブへのカップリング、などは本文書の別の場所で考察されている。プローブ及び標的の標識化は、Shalon et al., 1996, Genome Res 6(7):639-45でも開示されている。
【０１３４】
ＤＮＡアレイの特定の例には以下の：
フォーマットＩ：プローブｃＤＮＡ（約５００〜約５０００塩基長）は、ロボットスポッティングを使用してガラスなどの固体表面に固定化され、別々に又は混合物のどちらかで一組の標的に曝露される。この方法は、スタンフォード大学で開発されたと広くみなされてきた（Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218）、
フォーマットII：オリゴヌクレオチド（約２０〜約２５ｍｅｒオリゴ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ，peptide nucleic acid）プローブのアレイは、インサイチュ（チップ上）で又は従来の合成に続いてチップ上での固定化により合成される。前記アレイは、標識試料ＤＮＡに曝露され、ハイブリダイズされ、相補的配列の識別／量が決定される。そのようなＤＮＡチップは、GeneChip（登録商標）登録商標下でAffymetrix, inc.より販売されている、
が挙げられる。
【０１３５】
いくつかの市販されているマイクロアレイフォーマットの例は、例えば、Marshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology 16(1):27-31に記載されている。
【０１３６】
データ解析は、アレイを含む実験の重要な部分でもある。マイクロアレイ実験の生データは典型的には画像であり、この画像は、列が例えば遺伝子を表し、カラムが例えば組織などの様々な試料又は実験条件を表し、各セル中の数が例えば特定の試料中の特定の遺伝子の発現レベルを特徴付ける遺伝子発現行列表に変換される必要がある。これらの行列は、根底にある生物学的過程についてのなにか知識を引き出すためには、さらに解析されなければならない。データ解析の方法（目的変数あり及び目的変数なしのデータ解析の他にも生物情報学アプローチを含む）は、Brazma and Vilo J, 2000, FEBS Lett 480(1):17-24に開示されている。
【０１３７】
上に開示されるように、タンパク質、ポリペプチド、などもアレイに固定化され得る。例えば、抗体は、タンパク質チップを使用するプロテオームのマイクロアレイ解析において使用されてきた（Borrebaeck CA, 2000, Immunol Today 21(8):379-82）。ポリペプチドアレイは、例えば、MacBeath and Schreiber, 2000, Science, 289(5485):1760-1763において概説されている。
【０１３８】
医薬組成物
追加の態様は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合される上記の方法のいずれかに従って同定される作用薬を含む医薬組成物に関する。
【０１３９】
別の態様は、
（ｉ）上記の方法のいずれかを使用して上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定すること、及び
（ii）前記作用薬を薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤と混合すること、
を含む組成物を調製する方法に関する。
【０１４０】
本発明のさらに別の態様は、増殖性障害、さらに好ましくは癌を治療するための薬物の調製における本発明の方法により同定される作用薬の使用に関する。
【０１４１】
本発明に従った使用のために、上の方法により同定される作用薬は、化合物又は生理的に許容される塩、エステル又は他の生理的に機能的なその誘導体を、１又は２以上の薬学的に許容される担体並びに随意に他の治療及び／若しくは予防成分と一緒に含む、医薬製剤として提示され得る。担体（複数可）は、前記製剤中のその他の成分と適合するという意味で許容されなければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。前記医薬組成物は、ヒト及び獣医学においてヒト又は動物使用を目的とし得る。
【０１４２】
本明細書に記載される医薬組成物の様々な異なる形態に適したそのような賦形剤の例は、"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Wellerに見出され得る。
【０１４３】
治療用途に許容される担体又は希釈剤は医薬分野では周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) に記載されている。
【０１４４】
適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ゾルビトールなどが挙げられる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール及び水が挙げられる。
【０１４５】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択肢は、意図される投与経路及び標準薬務に関して選択することが可能である。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はこれらに加えて、いかなる適切な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）、緩衝剤（複数可）、香味剤（複数可）、表面活性剤（複数可）、増粘剤（複数可）、保存剤（複数可）（抗酸化剤を含む）などでも、及び製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする目的で含まれる物質を含み得る。
【０１４６】
適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然の糖類、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータラクトース、コーン甘味料、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ガム、カルボキシメチルセルロース並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４７】
適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１４８】
保存剤、安定化剤、染料及び香味剤でさえも医薬組成物中に提供され得る。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁剤も使用し得る。
【０１４９】
医薬製剤は、経口、局所的（経皮、頬側及び舌下を含む）、直腸又は非経口（皮下、皮内、筋肉内及び静脈内を含む）、経鼻並びに肺投与、例えば、吸入による、に適した製剤を含む。製剤は、必要に応じて、個別の投与量単位で都合よく提示され得、薬学の分野で周知の方法のうちのいずれによっても調製され得る。全ての方法が、活性化合物を液体担体又は微粉化固形担体又は両方と結合させ、次に必要ならば前記産物を所望の製剤に成形するステップを含む。
【０１５０】
担体が固体である経口投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、それぞれが予定量の活性薬剤を含有するボーラス、カプセル又は錠剤などの単位用量製剤として提示される。錠剤は圧縮又は成形により作製され得、１又は２以上の副成分と一緒でもよい。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒などの流動性の形態で適切な機械で活性薬剤を圧縮することにより作製され得、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、平滑剤、表面活性剤又は分散剤と混合してもよい。成形錠剤は、活性薬剤を不活性液体希釈剤と成形することにより作製され得る。錠剤は被膜されてもよく、被膜されない場合は、刻み目を入れてもよい。カプセルは、活性薬剤を単独で又は１若しくは２以上の副成分と混合してカプセル殻に充填し、次に通常の方法でカプセル殻を密封することにより調製され得る。カシェー（cachets）は、活性薬剤がいかなる副成分（複数可）とでも一緒にライスペーパー包膜に密封されるカプセルに類似している。活性薬剤は分散性顆粒としても処方され得、この顆粒は例えば投与前に水に懸濁されても、食物に振りかけられてもよい。前記顆粒は、例えば、サシェー（sachet）に包装し得る。担体が液体である経口投与に適した製剤は、溶液又は水性若しくは非水性液体の懸濁液として、又は水中油型乳濁液として提示されてもよい。
【０１５１】
経口投与のための製剤には、活性薬剤が適当な放出制御マトリックスに処方される、又は適切な放出制御フィルムで被膜される徐放剤形、例えば、錠剤が挙げられる。そのような製剤は特に予防的使用に都合よくなり得る。
【０１５２】
担体が固体である直腸内投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは単位用量坐薬として提示される。適切な担体には、ココアバター及び当技術分野で一般的に使用されている他の物質が挙げられる。坐薬は、活性薬剤と軟化又は溶融担体（複数可）を混合し、続いて冷却して型で成形することにより都合よく形成され得る。
【０１５３】
非経口投与に適した医薬製剤には、水性又は油性媒体中の活性薬剤の減菌溶液又は懸濁液が挙げられる。
【０１５４】
注射用調製物は、ボーラス注入又は持続点滴に適合させ得る。そのような調製物は、使用のために必要となるまで製剤の導入後密封される単位用量又は複数用量容器で都合よく提示される。代わりに、活性薬剤は、使用前は減菌無発熱物質水などの適切な媒体で構成されている粉末形状でよい。
【０１５５】
活性化合物は、長時間作用型デポー製剤としても処方され得、この製剤は筋肉内注射により、又は移植により、例えば、皮下に又は筋肉内に投与され得る。デポー製剤は、例えば、適切な重合体若しくは疎水性物質、又はイオン交換樹脂を含み得る。そのような長時間作用型製剤は、特に予防的使用に都合がよい。
【０１５６】
頬側口腔を介した肺投与に適した製剤は、活性化合物を含有し望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子がレシピエントの気管支樹に送達されるように提示される。
【０１５７】
１つの可能性として、そのような製剤は、適切には、例えば吸入装置で使用するためのゼラチンの貫通性カプセルで、又は代わりに、活性薬剤、適切な液状若しくは気体状推進剤並びに随意に界面活性剤及び／若しくは固形希釈剤などの他の成分を含む自己推進製剤として都合よく提示され得る細かく砕かれた粉末の形状である。適切な液状推進剤には、プロパン及びクロロフルオロカーボンが挙げられ、適切な気体状推進剤には二酸化炭素が挙げられる。活性薬剤が溶液又は懸濁液の液滴の形状で分散している自己推進製剤を用いてもよい。
【０１５８】
そのような自己推進製剤は当技術分野で公知の自己推進製剤と類似しており、確立した手順により調製し得る。適切には、自己推進製剤は、望ましいスプレー特徴を有する手動操作可能な又は自動的に機能するバルブ付きで提供される容器で提示され、有利には前記バルブは、その操作ごとに一定の容量、例えば、２５〜１００マイクロリットルを送達する定量型である。
【０１５９】
追加の可能性として、活性薬剤は、加速気流又は超音波攪拌を用いて吸入のための細かい液滴のミストを作製するのに用いられる噴霧器又はネブライザーにおける使用のための溶液又は懸濁液の形状でよい。
【０１６０】
鼻腔投与に適した製剤には、肺投与のための上記の調製物に一般に類似する調製物が挙げられる。そのような製剤は、調剤されると、望ましくは鼻腔における保持を可能にする１０〜２００ミクロンの範囲の粒子径を有するはずであり、これは、必要に応じて、適切な粒子サイズの粉末の使用又は適当なバルブの選択により実現し得る。他の適切な製剤には、鼻端のすぐ近くまで持ち上げられる容器から鼻道を通じた急速吸入による投与のための２０〜５００ミクロンの範囲の粒子径を有する粗粒子、及び水性若しくは油性溶液又は懸濁液中の活性薬剤の０．２〜５％ｗ／ｖを含む点鼻薬が挙げられる。
【０１６１】
薬学的に許容される担体は当業者には周知であり、０．１Ｍ及び好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液又は０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、そのような薬学的に許容される担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液及び乳濁液でよい。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液が挙げられる。非経口媒体には、塩化ナトリウム水溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は固定油が挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等などの保存剤及び他の添加剤も存在し得る。
【０１６２】
局所製剤に適した製剤は、例えば、ゲル、クリーム又は軟膏として提供され得る。そのような調製物は、例えば、創傷若しくは潰瘍の表面に直接広げられて、又は治療される領域に及び全体に適用され得る包帯、ガーゼ、メッシュ若しくは同様のものなどの適切な支持物上に保持されて、創傷又は潰瘍に適用され得る。
【０１６３】
治療される部位、例えば、創傷又は潰瘍上に直接噴霧する又は振りかけることが可能な液体又は粉末製剤も提供され得る。代わりに、包帯、ガーゼ、メッシュ若しくは同様のものなどの担体は製剤を噴霧される又は振りかけられ、次に治療される部位に適用されることが可能である。
【０１６４】
本発明の追加の態様に従って、活性化合物（複数可）を例えば混合により担体と併せることを含む、上記の医薬又は獣医学組成物の調製のための方法が提供される。
【０１６５】
一般に、製剤は、活性薬剤を液体担体又は微粉化された固体担体又は両方と均一に及び密に併せ、次に必要であれば製品を成形することにより調製される。本発明は、作用薬を薬学的に又は獣医学的に許容される担体又は媒体と併せることを含む、医薬組成物を調製するための方法にまで及ぶ。
【０１６６】
治療的適応
別の態様では、本発明は、Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞及び他の細胞の増殖及び拡散を阻害する方法に関する。
【０１６７】
本明細書で使用される「上皮間葉転換を阻害する」とは、対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしている及び既に起こした細胞の数の減少のことである。
【０１６８】
好ましい一実施形態では、それを必要とする対象は癌に罹っている。
【０１６９】
好ましくは、対象が癌に罹っている場合、本発明の方法は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしている腫瘍細胞を、前記癌細胞が転移することができないような程度にまで阻害する、すなわち、前記阻害は、前記癌が転移性癌に成長しない、又は既に転移した細胞が身体内の遠隔部位で増殖することができない程度のものである。
【０１７０】
極めて好ましい一実施形態では、本発明の方法は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を完了している細胞が身体の遠隔部位まで拡散するのを妨げる、すなわち、前記阻害は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）に依存している転移性細胞の拡散が排除されている程度のものである。
【０１７１】
本発明の別の態様は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することにより、腫瘍細胞が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こすのを阻害することを含む、それを必要とする対象において転移性癌を治療するための方法に関する。
【０１７２】
本明細書で使用されるように、用語「Ａｘｌ阻害剤」とは、Ａｘｌ、Ａｘｌシグナル伝達経路又はＡｘｌシグナル伝達経路のいずれか１若しくは２以上の成分を阻害することができる分子のことである。一実施形態では、前記分子はＡｘｌ又はＡｘｌタンパク質発現を減少する又は妨げることができることになる。
【０１７３】
特に好ましい一実施形態では、Ａｘｌ阻害剤は抗Ａｘｌ抗体である。
【０１７４】
特に好ましい一実施形態では、Ａｘｌ阻害剤は小分子キナーゼ阻害剤である。そのような小分子阻害剤の例は、Holland et al. R428, a selective small molecule inhibitor of AxI kinase, blocks tumour spread and prolongs survival in models of metastatic cancer. Cancer Research; 70(4), February 15, 2010に記載されているＲ４２８である。
【０１７５】
特に好ましい一実施形態では、対象は哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。
【０１７６】
好ましくは、癌は乳癌、前立腺癌、グリオーマ、肺癌、膵臓癌である。
【０１７７】
転移は癌関連死亡率の９０％を占める。腫瘍細胞転移を可能にする分子機構を理解することは主要な健康問題である。本発明者らは、受容体型チロシンキナーゼＡｘｌが原発性乳癌のマンモグラフィー検出後の、患者の全生存率が低いことの強力な予想因子であることを実証した。
【０１７８】
転移性乳癌細胞は、侵襲性悪性表現型を維持し異なる微小環境において乳腺腫瘍を形成するためにはＡｘｌ発現を必要とする。乳房上皮細胞において上皮間葉転換（ＥＭＴ）が誘導されると、Ａｘｌ発現が上方調節されてそのリガンドであるＧａｓ６との自己分泌シグナル伝達ループを生成する。Ａｘｌ発現を阻害すれば、乳腺の同所性部位からリンパ節及び主要臓器への転移性拡散が妨げられる。したがって、初期の悪性移行中のＡｘｌの不適切なＥＭＴ依存性活性化は、転移を促進し全体的患者生存に悪影響を与え得る。したがって、確立した治療戦略を介してＡｘｌシグナル伝達を崩壊させることは、乳癌などの細胞増殖性障害並びに細胞運動性及び細胞生存媒介障害に対する処置の治療的開発への胸躍らせる道筋を表す。
【０１７９】
本発明の別の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８０】
本発明のさらに別の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）に依存している腫瘍細胞を阻害することにより転移性癌を治療するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８１】
別の態様では、本発明は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象における転移性癌又は末期癌を治療する方法に関する。
【０１８２】
別の態様では、本発明は、転移性癌又は末期癌を治療するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８３】
別の態様では、本発明は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象において転移を阻害する方法に関する。
【０１８４】
別の態様は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することを含む、癌に罹っている対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害する方法に関する。
【０１８５】
さらに別の態様は、癌に罹っている対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８６】
好ましくは、Ａｘｌ阻害剤は抗Ａｘｌ抗体又は小分子阻害剤である。
【０１８７】
投与
本発明の医薬組成物は、直腸、鼻腔、気管支内、局所的（頬側及び舌下を含む）、膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び皮内を含む）、腹腔内又はクモ膜下腔内投与に適合され得る。好ましくは、製剤は経口投与製剤である。製剤は、単位投与量の形態で、すなわち、単位用量又は複数の単位用量若しくは単位用量のサブユニットを含有する別々の部分の形態で都合よく提示され得る。例として、製剤は、錠剤及び徐放カプセルの形状であり得るし、薬学の分野で周知のいかなる方法によっても調製し得る。
【０１８８】
本発明における経口投与のための製剤は、それぞれが予定量の活性薬剤を含有するカプセル、ゲルーレ（gellules）、ドロップ、カシェー、ピル若しくは錠剤として；粉剤若しくは顆粒として；水溶液若しくは非水性溶液中の活性薬剤の溶液、乳濁液若しくは懸濁液として；又は水中油型の液体乳濁液若しくは油中水滴型液体乳濁液として；又はボーラスとして、等などの個別単位として提示し得る。好ましくは、これらの組成物は用量当たり１〜２５０ｍｇ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１８９】
経口投与（例えば、錠剤及びカプセル）のための組成物では、用語「許容される担体」には、一般的賦形剤、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖及びデンプンなどの媒体；充填剤及び担体、例えば、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、ショ糖、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、第二リン酸カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸；並びにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及び他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロールステアリン酸、シリコン油、タルクワックス、油及びコロイドシリカなどの潤滑剤が挙げられる。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料及び同類のものなどの香味剤も使用することが可能である。着色剤を添加して剤形を容易に識別できるようにすることが望ましい場合がある。錠剤は、当技術分野で周知の方法によって被膜されてもよい。
【０１９０】
錠剤は、１又は２以上の副成分と一緒に圧縮又は成形により作製してもよい。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤又は分散剤と混合して、粉末又は顆粒などの流動性の形状の活性薬物を適切な機械で圧縮することにより調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤に浸した粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することにより作製し得る。錠剤は、被膜される又は刻み目を入れてもよいし、活性成分の徐放又は制御放出を提供するように処方されてもよい。
【０１９１】
経口投与に適した他の製剤には、通常はショ糖とアカシア又はトラガントである香り付けされた基剤に活性薬剤を含むトローチ；ゼラチンとグリセリン、又はショ糖とアカシアなどの不活性基剤に活性薬剤を含むパステル剤；及び適切な液体担体に活性薬剤を含む口腔洗浄薬が挙げられる。
【０１９２】
他の投与形態は、静脈内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、皮下に、皮内に、腹腔内に又は筋肉内に注射され得る、及び減菌又は減菌可能溶液から調製される溶液又は乳濁液を含む。注射剤型は典型的には、用量あたり１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇの活性成分を含有する。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、坐薬、ペッサリー、懸濁液、乳濁液、ローション、軟膏、クリーム、ジェル、スプレー、溶液又は散布剤の形状でもよい。
【０１９４】
経皮投与の代わりの手段は、皮膚パッチの使用による。例えば、活性成分は、ポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性乳濁液からなるクリームに組み込むことが可能である。活性成分は、白蝋又は白色ワセリン基剤と、必要とされ得るような安定化剤及び保存剤とからなる軟膏に、１〜１０重量％の濃度で組み込むことも可能である。
【０１９５】
投与量
当業者であれば、過度の実験なしで対象に投与する即席組成物のうちの１つの適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医者が個々の患者に最も適していることになる実際の投与量を決定することになり、前記投与量は、用いられる特定の作用薬の活性、その作用薬の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄速度、合剤、特定の病状の重症度並びに個々の受けている治療を含む様々な要因によって決まることになる。本明細書に開示される投与量は平均的症例の例である。当然のことながら、もっと高い又はもっと低い投与量のほうがふさわしい個々の例が存在することがあり、そのような例は本発明の範囲内である。
【０１９６】
本発明に従えば、有効量の作用薬がＡｘｌを阻害するために投与され得る。当然のことながら、この投与量は作用薬の投与の種類に応じてさらに修正されることになる。例えば、救急治療のための「有効量」を実現するためには、非経口投与が好ましい。５％ブドウ糖の水又は生理食塩水中の化合物、又は適切な賦形剤を有する類似の製剤の静脈内注射が最も有効であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。典型的には、キナーゼを阻害するのに有効な濃度で血漿中の薬物の濃度を維持するように、非経口投与量は約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇになる。前記作用薬は、約０．４〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日の日総投与量を実現するレベルで毎日１〜４回投与され得る。治療的に有効である活性薬剤の正確な量、及びそのような作用薬が最もうまく投与される経路は、前記作用薬の血液レベルと治療効果があるために必要とされる濃度を比較することにより、当業者により容易に決定される。
【０１９７】
本発明の作用薬は、薬物の濃度が本明細書に開示される治療指標のうちの１又は２以上を達成するのに十分であるような形でも患者に経口投与され得る。典型的には、前記作用薬を含有する医薬組成物は、患者の病状と合致するように約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの経口量で投与される。好ましくは、経口量は約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇになると考えられる。
【０１９８】
本発明の作用薬は、所与の薬理学的効果を有するのに必要とされる作用薬の濃度を決定するためにいくつかの生物学的アッセイのうちの１つにおいて試験され得る。
【０１９９】
パーツのキット
本発明の別の態様は、抗Ａｘｌ抗体を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【０２００】
本発明のさらに別の態様は、Ａｘｌに対する核酸プローブを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【０２０１】
本発明のさらに別の態様は、Ａｘｌに対する少なくとも１つのＱＰＣＲプライマーを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【０２０２】
本発明の追加の態様は、上記の方法のいずれかにおける上に定義されるキットの使用に関する。
【０２０３】
診断及び予後
本発明は、特にＡｘｌ阻害剤を用いて治療されている個人において、増殖活性により特徴付けられる疾患の診断又は予後におけるバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【０２０４】
本明細書で使用されるように、用語「予後法」は、疾患、特に癌と診断されたヒト又は動物の疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。さらに具体的には、所望の癌には、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病が挙げられる。
【０２０５】
本明細書で使用される用語「診断法」は、ヒト又は動物の中又は表面における癌の存在又は種類の決定を可能にする方法を意味する。適切には、マーカーがあれば、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療の成功を評価することが可能になる。上で考察したように、適切な診断法は、例えば、ＱＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブその他などの本明細書で同定される遺伝子のいずれかに向けられるプローブを含む。
【０２０６】
本明細書で使用される用語「予後法」は、対象が特定の作用薬／投薬計画を用いた治療に対して感受性である又は応答性である可能性の決定を可能にする方法を意味する。そのような予後法は、特定の治療計画の可能性のある結果、例えば、対象が前記治療に応答する可能性に関する情報、並びに／又は個人が特定の治療計画内でどれほど積極的な治療を受けたらよいのか及び／若しくは個人が放射線／化学療法などの従来の治療法を用いてどれほど積極的な治療を受けたらよいのかに関する情報を提供する。したがって、本明細書に記載される予後法は、個別化医療の分野で重要な適用を有する。
【０２０７】
したがって、好ましい一実施形態は、個別化医療適用における上記のバイオマーカーの使用に関する。
【０２０８】
好ましい一実施形態では、個別化医療適用は、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性である又は応答性であるのかどうかを決定することを目的とする。
【０２０９】
好ましい一実施形態では、個別化医療適用は、対象が特に転移性癌にかかりやすいかどうかを決定することを目的とする。
【０２１０】
本発明の別の態様は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性かどうかを決定するための予後法に関する。
【０２１１】
本発明の別の態様は、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性である又は応答性であるのかどうかを決定するための予後薬剤中のバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【０２１２】
本発明の別の態様は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、対象が特に転移性癌にかかりやすいかどうかを決定するための予後法に関する。
【０２１３】
好ましくは、上記の予後法は、
（ｉ）前記対象から試料を得るステップと、
（ii）前記試料におけるＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、対照試料に対するＡｘｌ発現の上方調節が、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対する感受性及び転移性癌に罹る増加した可能性を示すステップと、
を含む。
【０２１４】
明細書全体を通じて、好ましくは本明細書に記載される方法はエクスビボで実施される。
【０２１５】
好ましくは、試料はタンパク質解析により、さらに好ましくは、ＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ、フローサイトメトリー、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ又は２−Ｄ ＰＡＧＥにより解析される。
【０２１６】
本発明は、以下の非限定的実施例により、及び以下の図の参照によりさらに例証される。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】Ａｘｌ発現が乳癌生存率に対する負の予後因子であることを示す図である。（Ａ）免疫化学的に弱い発現（６０％）及び強いＡｘｌ発現。（Ｂ）８年間の臨床的追跡のカプランマイヤー分析。（Ｃ）多変量解析。（Ｄ）原発性及び転移性ヒト乳癌のマッチドペア（ｎ＝１６）におけるＡｘｌ発現：原発性腫瘍は左側（上．Ａｘｌ陰性、下．Ａｘｌ陽性）、転移は右側（上．肝臓、下．骨）。Ａｘｌ発現は、対応する原発性腫瘍と比べた場合転移のほうが強い傾向であった（ｐ＝０．１１、マクニマーの検定）。
【図２】Ａｘｌが乳癌細胞侵襲性に必要であることを示す図である。エピ対立形質ＭＢ−ＭＤＡ−２３１乳癌細胞系列におけるＡｘｌ発現の（Ａ）ＦＡＣＳ及び（Ｂ）ウェスタンブロット解析。（Ｃ）Ａｘｌはリン酸化されている。血清（Ｄ）又はＳＤＦ−１（Ｅ）により誘導されるマトリゲル浸潤アッセイのエピ対立形質解析。ＭＢ−ＭＤＡ−２３１／ｓｈＬｕｃ（上パネル）及びＭＢ−ＭＤＡ−２３１／ｓｈＡｘｌ２（下パネル）の３Ｄマトリゲル解析（Ｆ、Ｇ）。
【図３】乳房上皮細胞においてＡｘｌ活性がＥＭＴ誘導因子により上方調節されていることを示す図である。（Ａ）Ｔｗｉｓｔを安定的に発現するＭＣＦ１０ａ細胞株でのＡｘｌの表面レベルのフローサイトメトリー解析。（Ｂ）対照（ｗｔ）及びＴｗｉｓｔ発現ＭＣＦ１０ａ細胞からの抽出物は、上皮（Ｅ−カドヘリン、β−カテニン）及び間葉（Ｎ−カドヘリン）マーカーの変化について解析された。条件培地は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＧａｓ６に対する抗体を使用するイムノブロッティング法により解析された。（Ｃ）Ｔｗｉｓｔ、Ｚｅｂ２、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌをコードするレトロウイルスベクター又はベクター対照（ＧＦＰ）で形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞は、Ａｘｌ表面発現（左）及び幾何平均蛍光（右）についてフローサイトメトリーにより解析された。（Ｄ）Ｔｗｉｓｔ、Ｚｅｂ２、Ｓｌｕｇ又はＳｎａｉｌレトロウイルスベクターで形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞からの抽出物は、上皮（Ｅ−カドヘリン、β−カテニン）及び間葉（Ｎ−カドヘリン、ビメンチン）マーカーの変化についてイムノブロッティング法により解析された。（Ｅ）播種後７２時間目のＴｗｉｓｔ、Ｚｅｂ２、Ｓｌｕｇ又はＳｎａｉｌレトロウイルスベクターで形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞の形態。
【図４】組織操作された乳腺腫瘍はＡｘｌ発現を必要とすることを示す図である。（Ａ）ＮＯＤＳＣＩＤマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ腫瘍組織操作移植片のインビボ画像。時間的腫瘍増殖は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞からルシフェラーゼ生物発光のインビボ光学画像によりモニターされた（ｉ）。腫瘍細胞数（総光粒子）及び放射状浸潤（シグナル径）測定の程度は対照移植片（実線）からであり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２を発現する細胞移植片（破線）は、ポリ乳酸組織操作スキャフォールド内の腫瘍増殖及びコロニー形成のＡｘｌ依存性を示している（ii）。切除時の両側スキャフォールドの外観（iii）。移植後２８日目の抗ヒトＡｘｌを用いた組織操作腫瘍の免疫組織化学解析（左パネル、ベクター対照；右パネル、ｓｈＡｘｌ２）（iv）。野生型対照（左パネル）及びｓｈＡｘｌ２発現細胞（右パネル）を用いた腫瘍組織操作移植片は、抗ヒトＡｘｌを用いた免疫組織化学により解析された（Ｖ）。黒色四角形はコロニー形成及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞の放射状拡散の境界を画定している。対照と比べて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（ペアードｔ検定）。Ｎ＝６マウス／群。（Ｂ）初代ヒト微小血管細胞（ＥＣ）、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ Ｌｕｃ細胞を含む三細胞移植片の時間的インビボ画像（ｉ）。組織操作脈管構造の存在下で解析された対照（実線）及びｓｈＡｘｌ２発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞移植片（破線）における腫瘍増殖（総光粒子）及び放射状拡散（直径）測定（ii）。切除された腫瘍（２８日目）は操作されたヒト微小血管により高度に血管新生化されている（iii）。免疫組織化学解析は、操作された抗ヒトＣＤ３１染色血管が開存性及び灌流を示す内腔赤血球（挿入図）を含有することを示している（iv：左パネル．ベクター対照；右パネル．ｓｈＡｘｌ−２）。対照と比べて＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５（ペアードｔ検定）。Ｎ＝７マウス／群。スキャフォールド内血管径（左）は影響を受けておらず、微小血管密度（右）はｓｈＡｘｌ２発現により阻害される組織操作ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍においてわずかに増強されている。
【図５】インビボエピ対立形質解析が乳腺腫瘍形成に必要とされる明確なＡｘｌ発現閾値を明らかにしていることを示す図である。（Ａ）無効なＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈＡｘｌ２７９）対照と比べたＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ ｓｈＡｘｌ２７８（ｉ）、ｓｈＡｘｌ２８０（ii）及びｓｈＡｘｌ２（iii）による段階的Ａｘｌ発現を含むＮＯＤ／ＳＣＩＤ ！２ｍｎｕｌｌマウスにおける皮下エピ対立形質ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ異種移植片からの生物発光の時間的インビボ画像。（Ｃ）棒グラフは、腫瘍の光学画像解析に基づく光粒子及び腫瘍径の平均変化を示している。エピ対立形質ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ腫瘍増殖（総光粒子）及び放射状浸潤（シグナル径）測定はｓｈＡｘｌ２７９（無効なｓｈＲＮＡ）に合わせて正規化されていた（ii）。（Ｄ）Ａｘｌノックダウンに対してプロットされた腫瘍増殖（２８日測定）は治療閾値（８０％減少発現）を明らかにしている。対照と比べた＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（ペアードｔ検定）。Ｎ＝６マウス／群。
【図６】Ａｘｌが乳癌細胞の転移に必要であることを示す図である。（Ａ）インビボモニターされた原発性腫瘍及び転移、Ｉ、同所性増殖（上パネル）及び時間をかけたリンパ節への転移（下パネル）。II、野生型（実線）及びＡｘｌ ＲＮＡｉ移植片（破線）のインビボ光学画像（GE Explore Optix）によりモニターされた原発性腫瘍増殖。（Ｂ）異なる臓器における転移の検出。（Ｃ）乳癌細胞のエクスビボ検出。Ｉ、切除された臓器の画像が示されている。II、同一組織の組織学的解析は、異なる臓器への転移を確証した（矢印）。（Ｄ）対照（ベクター）とｓｈＡｘｌ２同所的に注射されたマウス間のマンホイットニー（ログランク）検定は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ／ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２坦腫瘍マウスにおける生存の増加を示している（Ｐ＝０．０１３）。
【図７】ＡｘｌがＢＡＬＢ／ｃマウスにおける同系乳癌細胞の免疫後応答再発及び転移に不可欠であることを示す図である。（Ａ）マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＡｘｌ２）又はヒトＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈＡｘｌ２７９）を発現している４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃマウス乳癌細胞は、マウスＡｘｌ表面発現又はアイソタイプ対照についてフローサイトメトリーにより解析された。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−ＬｕｃｓｈｍＡｘｌ２）又は陰性対照ヒト特異的ｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２７９）のどちらかを発現している同所的（乳腺脂肪体）注入４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞からの生物発光の時間的インビボ画像（ｉ）。８週間にわたる対照（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２７９、実線）及びＡｘｌノックダウン（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２、灰色線）注入ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける全身生物発光（総光粒子）の定量化（ii）。＊ｐ＜０．０５（ｔ−検定）、Ｎ＝７マウス／群。（Ｃ）対照又はＡｘｌノックダウン坦腫瘍ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の切除臓器における４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞のエクスビボ生物発光検出によりモニターされた異なる臓器への自然転移（同所的移植８週間後）の調査。
【図８】ベクターＬ３８３ ｐＣＳＩ Ｐｕｒｏ２ＡＧＦＰ２ＡＬｕｃ２の配列を示す図である。
【図９Ａ】ＧＦＰの同時発現を使用して解析された、Ｓｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ（ｐＢＡＢＥ ｐｕｒｏ Ｈ−Ｒａｓ Ｖ１２、Addgene製）構築物で形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。Ｈａ−Ｒａｓ発現は４８時間のピューロマイシン処置により選択された。ＭＣＦ１０ａ細胞におけるＳｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現により、癌幹細胞マーカーＣＤ４４の表面発現が激しく増加した。
【図９Ｂ】Ｌｓｕｇ、ＲａｓをコードするＭＣＦ１０ａ細胞におけるＡｘｌ表面発現を示す図である。Ａｘｌ表面発現は、Ｓｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ誘導ＥＭＴの両方におけるＣＤ４４及び間葉形質の存在と相関している。
【図９Ｃ】ＣＤ４４高（ＣＤ４４＋）及び低（ＣＤ４４−）ＣＤ４４発現亜集団についてＦＡＣＳにより分類される播種７２時間後のＳｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞の間葉形態を示す図である。ＣＤ４４−細胞は、上皮形態を示しており、ＣＤ４４＋ＭＣＦ１０細胞は細長い間葉形態を示している。
【図９Ｄ】Ｓｌｕｇ、Ｒａｓをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたＣＤ４４−及びＣＤ４４＋ＭＣＦ１０ａ細胞のウェスタンブロット解析を示す図である。ＣＤ４４−ＭＣＦ１０ａ細胞は上皮接合部及び細胞骨格タンパク質発現を保持していた。これとは対照的に、ＣＤ４４＋細胞は強い間葉マーカー発現（ビメンチン、Ｎ−カドヘリン）及びＥ−カドヘリンの消失を示しており、ＥＭＴを実証していた。
【図９Ｅ】３−ＤマトリゲルにおけるＣＤ４４＋及びＣＤ４４−Ｓｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞の増殖を示す図である。ＣＤ４４＋、Ａｘｌ発現ＭＣＦ１０ａ細胞は侵襲性であり、間葉表現型と一致している。
【図１０】ＭＣＦ１０ａ細胞が、Ｓｌｕｇ−及びＳｎａｉｌ−誘導Ａｘｌ発現時に細胞関連になる（下、抗Ｇａｓ６、フローサイトメトリー解析）Ｇａｓ６を構成的に発現し（上、ウェスタンブロット、全ライセート）、分泌する（中、ウェスタンブロット、条件培地）ことを示す図である。
【図１１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＡｘｌリガンドのＧａｓ６を構成的に発現することを示す図である（上、ウェスタンブロット、優勢的に細胞関連である全ライセート；中、ウェスタンブロット、条件培地；下、抗Ｇａｓ６フローサイトメトリー解析）。Ａｘｌノックダウンは細胞関連Ｇａｓ６を減少させ、全発現に影響を与えることなく条件培地（Ｇａｓ６＊）においてレベルが増加する。［実施例］
【０２１８】
材料及び方法
プラスミド及び抗体
ｓｈＲＮＡは全て、レトロウイルス感染を介してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を形質転換するために使用されるレトロウイルスベクターＲＲＩ−Ｒｅｄ／Ｌ０８７（Genbank: EU424173）のＬＴＲにおいて改変ヒトＵ６プロモーターから発現された。ＲＲＩ−ＲｅｄはＰｕｒｏ２ＡｍＲｅｄ１も発現し、首尾よく形質転換された細胞においてピューロマイシン耐性及び赤色蛍光を生じる。全てのＡｘｌ ｃＤＮＡヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ： ＢＣ０３２２２９のように付番される。
【０２１９】
以下の配列が使用された：Ａｘｌ２；（ヘアピンは小文字）
GACATCCTCTTTCTCCTGCGAAGCCCATctggtcATGGGCTTCGCAGGAGAAAGAGGATGTC、shAxl278;
ACGGGTCTCCTTCTTTCGCCGttggatccctggtcggatccaaCGGCGAAAGAAGGAGACCCG、shAxl279;
GCTTCAGGCGATTTCCCCGGCGttggatccctggtcggatccaaCGCCGGGGAAATCGCCTGAAGC、shAxl280;
ATGCACGCCCAGCCGCACAGCGttggatccctggtcggatccaaCGCTGTGCGGCTGGGCGTGCAT shLuc;
GATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGctggtcCCGGATTGTTTACATAACCGGACATAATC。
【０２２０】
レトロウイルス発現ベクターＬ３８３ ｐＣＳＩ Ｐｕｒｏ２ＡＧＦＰ２ＡＬｕｃ２（図８参照）は、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＥＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼのコード配列をＣＲＵ５−レトロウイルス発現ベクターにクローニングすることにより数段階で作製された（Blo et al., 2007）。各オープンリーディングフレームは、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ領域（ＸＸＳＧＬＲＳＧＱＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）をコードするリンカーにより隣から分離された。この配列は同時翻訳的に切断され、およそ化学量論的量の各タンパク質が産生される（Lorens 2004）。ｈＳｎａｉｌ、ｈＳｌｕｇ及びｈＺＥＢ２を発現するプラスミドは、それぞれ構築物ＢＣ０１２９１０、ＢＣ０１５８９５及びＢＣ０６０８１９（Open Biosystems社製）由来の適切な断片をＣＲＵ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウイルスベクターにクローニングすることにより構築された（Lorens et al 2000）。ヒトＡｘｌに対する２つの抗体；マウスモノクローナル抗ヒトＡｘｌ（MAB154, R&D Systems社製）及びヤギ抗ヒトＡｘｌ（M-20, Santa Cruz社製）が使用された。さらに、以下の抗体；ウサギ抗ヒトｐＡｘｌ（Y779, R&D社製）、ラット抗ヒトＳｎａｉｌ（SN9H2, Cell Signaling社製）、マウス抗ヒトＳｌｕｇ（L40Cb, Cell Signaling社製）、ウサギ抗ヒトＥ−カドヘリン（24E10, Cell Signaling社製）、ウサギ抗ヒトＮ−カドヘリン（ab18203, Abcam社製）、アクチン、マウス抗ヒトｂ−カテニン（L54E2, Cell Signaling社製）、マウス抗ヒトＧａｓ６（R&D Systems社製）、ウサギ抗ヒトＴｗｉｓｔ（Twist2C1a, Abcam社製）が用いられた。
【０２２１】
細胞培養、レトロウイルス形質導入及び細胞増殖アッセイ
全細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養された。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａ細胞（Dr. Gary Nolan, Stanford）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房上皮癌細胞（米国細胞培養保存機関（American Type Culture Collection）, Rockville, MD）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ，human dermal microvascular endothelial cell）及び肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ，pulmonary artery smooth muscle cell）（Cambrex社製, Walkersville, MD, USA）は、既に記載された通りに維持された（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。クローン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＤＨ３Ｌ２Ｎ（Xenogen Corporation社製, Alameda, CA, USA）は、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン及び１％ピルビン酸ナトリウムを補充されたＥＢＳＳ（アールズ平衡塩溶液）ＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地を有する最小必須培地において培養された。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａ細胞は、リン酸カルシウム法を使用してトランスフェクトされた（Swift, 1999）。トランスフェクションの約３０時間後、培地は細胞が感染されるように、１０％ＦＢＳを補充された増殖培地に変えられた。感染上清はトランスフェクションの約４８時間後に収集された。標的細胞は、一晩５ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを含有する上清に曝露された。感染された細胞は、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択された。細胞増殖アッセイは、Promega社製のＭＴＳアッセイを使用して対照細胞株と比べた異なるＡｘｌノックダウン細胞の増殖能を解析するために実施された。細胞は、未処理の又は２０μｌコラーゲン（ラットテイル由来、Roche社製）、フィブロネクチン（Sigma社製）若しくはマトリゲル（BD Biosciences社製）のいずれかで被膜された９６ウェル組織培養プレートに播種された。１００μｌ培地中２０００細胞が９６ウェルプレートに三通り播種され、Promega社製のＭＴＳアッセイを製造業者の使用説明書に従って使用して２４時間ごとにアッセイされた。
【０２２２】
免疫染色、フローサイトメトリー及び細胞選別
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は標準手順を使用してトリプシン処理され、室温で４０分間、最終濃度PBS−０．２％BSA中５ｍｇ／ｍｌの抗Ａｘｌ（#MAB154, R&D Systems社製）で染色する前に、PBS−０．２％BSA中で洗浄された。細胞はPBS−０．２％BSA中で２回洗浄され、暗所中室温で３０分間、最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌの二次抗体（ヤギ抗マウスＡＰＣ（アロフィコシアニン，Allophycocyanin（Allophyocyanin））、架橋されている、Molecular Probes））と一緒にインキュベートされた。細胞はPBS−２％BSAで２回洗浄され、FacsCalibur Flow Cytometer（BD Biosciences社製）上での解析前に３００ｍｌのPBS−０．２％BSA中に再懸濁された。データ解析は、FlowJo software（Tree Star, Inc.社製, Ashland, OR, USA）を使用して実施された。高レベルのＧＦＰ、ＲＦＰ及び低Ａｘｌ（ｓｈＲＮＡ）を発現している細胞は、安定した均一な細胞集団を樹立するためにFACS Aria SORPによりレーザー４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、６３８ｎｍ及び４０７ｎｍを用いて単離された。
【０２２３】
タンパク質抽出物、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング法及び免疫沈降法
細胞は、プロテアーゼ阻害剤（Complete Mini, EDTA-free, Roche社製 #13457200）及び０．２ｍＭ ＰＭＳＦで補充されたＲＩＰＡ緩衝液（１％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）を有するPBS、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）に溶解された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法は、標準手順に従って実施された。免疫沈降法では、細胞は、プロテアーゼ阻害剤及びＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche社製）で補充されたＮＰ−４０緩衝液（１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ Tris ｐＨ７．４、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に溶解された。抽出物は４０℃で１時間、ｐｒｏｔＡ／Ｇビーズに結合された抗体と一緒にインキュベートされ、前記ビーズは溶出前にＮＰ−４０緩衝液で４回洗浄された。
【０２２４】
浸潤アッセイ及び３Ｄマトリゲルアッセイ
ボイデンチャンバー化学浸潤アッセイ（Albini et al 2004）は、Becton Dickinson（BDFalcon細胞培養インサート（８μｍ））、FalconマルチウェルTM 24ウェルプレート及びＢＤからの増殖因子減少マトリゲルを使用して実施された。インサートは、インサートごとに最終濃度３０μｇマトリゲルまで無血清培地希釈されたマトリゲルを用いて内部に被膜された。マトリゲル作業は、３７℃で３０分間の凝固まで４℃で操作される。５×１０５細胞が０．１％BSAを有する無血清細胞培地に再懸濁され、各インサート上に添加された。ＦＢＳ濃縮細胞培地は走化性因子として機能する。３７℃、５％ＣＯ２での２０時間インキュベーション後、チャンバー内部の細胞は綿棒により取り除かれた。膜の反対側の細胞は固定され、次に、ＤＡＰＩで染色された。写真は蛍光顕微鏡を使用して撮影され、細胞はImageJ（http://rsb.info.nih.gov/nih-imageJ, Wayne Rasband,National）を使用して計数された。
【０２２５】
３ＤアッセイはSandal et al 2007から改変され、３００００細胞がゲル上に播種され、培養物は解析されるまで１０〜１２日間増殖させた。
【０２２６】
臨床試料
一連の本乳癌は、２ビューマンモグラフィーが２４カ月ごとに行われる１９９６年に始まった集団ベースのノルウェー乳癌スクリーニング計画（Norwegian Breast Cancer Screening Program）（Hordaland County）から選択された。手短に言えば、９５浸潤性中間期癌が最初の２回のスクリーニング中間期（１９９６〜２００１）中に発生し、これらは最初の２ラウンド中、総数３１７浸潤性腫瘍由来の９５スクリーニング検出された腫瘍とサイズによりマッチされた（中位径はそれぞれ１５．６及び１５．７ｍｍ）。マッチング後、スクリーニング検出された場合と中間期の場合の平均腫瘍サイズはそれぞれ２５．１と２３．１ｍｍであり、これらの群中の対応する平均年齢は６２歳と５９歳であった。年齢と腫瘍径（病理検査による）に加えて、診断時の乳房密度、組織型、組織学的悪性度、リンパ節転移、及び遠隔転移などの基本的特徴が記録された。最後のマンモグラフから中間期癌の診断までの平均時間は１７．１カ月であった。経過観察の最後の日付は２００４年１１月３１日であり、追跡期間中央値（生存者の）は７２カ月であった。追跡期間中、３１患者が乳癌で亡くなった。
【０２２７】
免疫組織化学
組織マイクロアレイスライドが本研究において使用された。組織マイクロアレイ法は組織保存的であり、いくつかの研究において検証された。免疫組織化学は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織の５μｍ厚切片上で実施された。抗原回復は、電子レンジでＴＲＳ（抗原賦活用溶液，Target Retrieval Solution；DakoCytomation社製, Denmark, AS）緩衝液、ｐＨ６．０中７５０Ｗで１０分間及び３５０Ｗで２０分間煮沸することにより実施された。DakoCytomation Autostainerは染色のために使用された。
【０２２８】
スライドは、Ａｘｌ（Ｈ−１２４；カタログ番号２０７４１）、希釈１対２００（Santa Cruz社製, USA）に対するポリクローナル抗体と一緒に室温で一晩インキュベートされた。免疫ペルオキシダーゼ染色は、メイヤーズヘマトキシリン（DakoCytomation社製, Denmark AS）を用いた対比染色に先立って基質としてジアミノベンジジン四塩化ペルオキシダーゼを用いるDakoCytomation Envision Kit（DakoCytomation社製, Denmark AS）を使用して実施された。
【０２２９】
染色法の評価
染色は大部分が細胞質であるが、細胞質膜において染色のある程度の集中が存在した。染色は、染色の強度及び陽性反応を示す腫瘍細胞の割合を考慮して、半定量的及び主観的類別方式により記録された。各症例からの３つのコア全てが評価された。強度は、０（無染色）〜３（強染色）として記録され；膜染色面積の割合は０（無陽性腫瘍細胞）、１（１０％未満）、２（１０％〜５０％）及び３（５０％を超える腫瘍細胞）として記録された。染色指標（ＳＩ）は、染色強度と面積の積として計算された。免疫組織化学登録は、患者の特徴及び予後について盲検で行われた。
【０２３０】
統計
群の比較はピアソンのカイ二乗検定（Pearson χ２ test）により実施された。全統計的解析では、染色指数（ＳＩ）カテゴリーのカットオフ値は中央値に基づいていた。単変量生存解析（終了点として子宮内膜癌による死亡を使用する；他の原因による死亡は打ち切られた）は、入力日として初回手術の時間を用いる積極限推定値法（カプランマイヤー法）を使用して実施された。
【０２３１】
ログランク（Mantel-Cox）検定を使用して各変数の異なるカテゴリーについて生存曲線を比較した。単変量解析における生存への影響を有する変数（Ｐ≦．１５）はｌｏｇ−ｌｏｇプロットにより試験して、これらの変数をコックスの比例ハザード回帰モデル（Cox' proportional hazards regression model）にどのようにして組み込むことができるかどうかを決定した。
【０２３２】
マウス系統及び動物飼育
本研究では、生後８〜１０週間、体重２０〜２５ｇのＰｒｋｄｃＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌと略記される）重症複合免疫不全マウス（GADES Institute製, Norway）のメスマウスを使用した。マウスは１２時間明／暗サイクルの標準条件下で飼われ、実験の開始に先立って新しい環境条件に順応するのに少なくとも７日間与えられた。この調査は、動物の数と苦痛を最小限にするように設計されているが、ノルウェー動物実験に関する規制（Norwegian Regulation on Animal Experimentation）、科学的目的のために使用される脊椎動物の保護についての欧州協定（European Convention for the Protection of Vertebrate Animals）、及びノルウェー動物研究局（Norwegian Animal Research Authority）の指針に従って実施された。
【０２３３】
生物発光画像（ＢＬＩ）
ＢＬＩは、標本箱に搭載されたeXplore Optix（GE Healtcare社製）カメラを使用して実施された。撮像及びシグナルの定量化は、eXplore Optixソフトウェアを使用して行われた。インビボ撮像では、動物は腹腔内注射（ｉ．ｐ）を介して基質Ｄ−ルシフェリン（Biosynth社製）をPBS（リン酸緩衝食塩水，Phosphate Buffered Saline）中１５０ｍｇ／ｋｇ受け、イソフルランを用いて麻酔された。マウスはカメラボックス内部の温めた台に置かれ、１〜２％イソフルランに連続曝露され、腫瘍モデルに応じて異なるビューについて撮像された。所望の領域が同定され、eXplore Optixソフトウェア（GE eXplore Optix）を使用して全光粒子／秒−１として定量された。インビボ背景生物発光は２〜３×１０光粒子カウントの範囲であった。エクスビボ画像では、１５０ｍｇ／ｋｇ Ｄ−ルシフェリンが部検の直前にマウスに注射された。所望の組織は切除され、プレート内に置かれて撮像された。
【０２３４】
インビボ腫瘍モデル
組織操作
ＧＦＰ−Ｌｕｃバイオマーカー及びＡｘｌ発現を調節する異なるＲＮＡ干渉を発現する１×１０６ ＭＤＡ−ＭＢ ２３１細胞は、Ｆ−１２ Ｋａｉｇｈｎ’ｓ（Invitrogen社製）対マトリゲル（BD Biosciences社製）の１対１混合物に懸濁され、６×６ｍｍポリ乳酸（ＰＬＬＡ）スキャフォールドに播種された。
【０２３５】
メスＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌは、移植手順の間及びその後の撮像の日は１〜２％イソフルラン（Isoba vet.-Schering-Plough社製 A/S）への曝露により麻酔された。２つのスキャフォールドは、Nor et al. Lab Invest.; 81 (4) 453; 2001に従って各マウスにおいて皮下（ｓ．ｃ）に移植された。Ａｘｌを発現する細胞を有するスキャフォールドは各マウスの左側に移植され、Ａｘｌがノックダウンされている細胞を有するスキャフォールドは右側に移植された。外科的処置後、麻酔されたマウスは撮像システムに置かれ、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（Biosynth社製）の腹腔内注射の１０〜１５分後、左側と右側の両方を撮像された。腫瘍発生は４週間、撮像により週１回インビボでモニターされた。
【０２３６】
異種移植片アッセイ
ｓｈＲＮＡベクター及びＧＦＰ−Ｌｕｃを感染させた１×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１００μｌのＦ１２Ｋ培地＋１０％ＦＢＳ／マトリゲル（１対１比、BD Biosciences社製）に懸濁され、２９ゲージインスリン針を用いてメスＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍの両側腹部の皮下に注入された。左側腹部にＡｘｌ発現に関して陽性細胞が注入され、右側腹部にはＡｘｌ発現に陰性の細胞が注入された。
【０２３７】
三細胞移植では、ｓｈＲＮＡベクター及びＧＦＰ−Ｌｕｃを感染させたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）及び肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）と１対２対２の割合で混合された。腫瘍増殖は４連続週間、撮像によりインビボで毎週モニターされた。
【０２３８】
乳腺脂肪体自然転移モデル
ＧＦＰ−Ｌｕｃバイオマーカー及びＡｘｌ発現を調節する異なるＲＮＡ干渉を発現するヒトＭＤＡ−ＭＢ ２３１細胞（ＭＤＡ−ＭＢ ２３１ ＤＨ３Ｌ２Ｎと呼ばれる−Xenogen社製）の亜系統は、マウスの乳腺パッドに注入された。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌマウスは、１〜３％イソフルランへの曝露により麻酔にかけられ、ＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地／マトリゲル（１対１）に懸濁された５０μｌの２×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ ＤＨ３Ｌ２Ｎ細胞を腹腔乳腺脂肪体に注入された。Ｄ−ルシフェリン（Biosynth社製）注射の１０〜１５分後、マウスはeXplore Optix撮像システムに置かれ腹側面から撮像された。腫瘍増殖及び転移拡散は、最長９週間生物発光画像により隔週でモニターされた。転移性領域からのシグナルをインビボで観察することができるように原発性腫瘍からの生物発光を最小限にするために再撮像前に各動物の下半身は覆われた。
【０２３９】
組織収集
各実験の終了時、腫瘍組織移植片及び異なる臓器はマウスから回収され、さらに解析するために１０％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich社製）中で保存された。組織は病理組織診断のために調製され（パラフィン包埋、セクショニング及び染色）、顕微鏡評価により解析された。
【０２４０】
モデル動物の結果の統計的解析
平均生物発光（光粒子／秒−１）、腫瘍径及び対応する標準誤差は、実験ごとに決定された。回帰プロットを使用して、生物発光、細胞数と腫瘍径の関係を記述した。統計的解析はペアードｔ−検定に基づいていた。
【０２４１】
結果
Ａｘｌ発現は乳癌患者の全生存に対する強力な予後因子である
乳癌病因におけるＡｘｌの役割を評価するために、年２回の２ビューマンモグラフィーを必要とする１９９６年に始まったノルウェー乳癌スクリーニング計画中に同定された一連の乳癌患者由来の腫瘍におけるＡｘｌ発現を調査した（Wang, H., et al., Mammography screening in Norway: results from the first screening round in four counties and cost-effectiveness of a modeled nationwide screening. Cancer Causes Control, 2001. 12(1): p. 39-45）。手短に言えば、９５浸潤性中間期癌が最初の２つのスクリーニング中間期（１９９６〜２００１）中に発生し、これらは最初の２ラウンド中、総数３１７浸潤性腫瘍由来の９５スクリーニング検出された腫瘍とサイズによりマッチされた（中位径はそれぞれ１５．６及び１５．７ｍｍ（Collett, K., et al., A basal epithelial phenotype is more frequent in interval breast cancers compared with screen detected tumors. Cancer Epidemiol Biomarkers））。マッチング後、スクリーニング検出された場合と中間期の場合の平均腫瘍サイズはそれぞれ２５．１と２３．１ｍｍであり、これらの群中の対応する平均年齢は６２歳と５９歳であった。年齢と腫瘍径（病理検査による）に加えて、診断時の乳房密度、組織型、組織学的悪性度、リンパ節転移、及び遠隔転移などの基本的特徴が記録された。最後のマンモグラフから中間期癌の診断までの平均時間は１７．１カ月であった。臨床パラメータがモニターされ、経過観察の最後の日付は２００４年１１月３１日であり、追跡期間中央値（生存者の）は７２カ月であった。追跡期間中、３１患者が乳癌で亡くなった。
【０２４２】
Ａｘｌ発現（中央値染色指標により２群に分けられた；図１Ａ）と組織学的悪性度、腫瘍径、エストロゲン及びプロゲステロン受容体の発現並びに腋窩リンパ節状態などの重要な臨床病理学的特徴間に顕著な関連性はなかった。その上、Ａｘｌ発現はＨＥＲ２、Ｅ−カドヘリン、基底分化のマーカー（サイトケラチン５／６、Ｐ−カドヘリン）、ＥＺＨ２又はＫｉ−６７発現による腫瘍細胞増殖と関連はなかった。
【０２４３】
しかし、単変量生存解析（カプランマイヤー法、ログランク検定）Ａｘｌ発現は患者生存の減少と顕著な関連があった（ｐ＝０．０３５；図１Ｂ）。Ａｘｌ発現（第一ステップ）に加えて、腫瘍径、組織学的悪性度及びリンパ節状態のような基本的予後因子を含む多変量解析（比例ハザード法）では、Ａｘｌ発現状態は、組織学的悪性度及びリンパ節状態に加えて最終モデルにおける独立した負の予後因子として残った（ｐ＝０．０２１）（図１Ｃ参照）。したがって、Ａｘｌ発現は乳癌患者における臨床転帰不良の強力な予後因子である。
【０２４４】
次に、原発性及び転移乳癌のマッチドペア（ｎ＝１６）の患者生検におけるＡｘｌ発現を調べた。Ａｘｌ発現は、対応する原発性ヒト乳癌と比べた場合、転移においてさらに高められている傾向があり（ｐ＝０．１１、マクニマーの検定；図１ｄ；転移は右側、肝臓（上）及び骨（下））、Ａｘｌ発現は乳癌患者における臨床転帰不良の強力な予後因子であり、転移拡散と関連していることを示唆していた。
【０２４５】
Ａｘｌは乳癌細胞侵襲性に必要とされる
悪い生存率と初期乳癌におけるＡｘｌ発現の強い相関は、全疾患病因におけるＡｘｌの重要な役割を示している。乳癌関連死亡率は常に転移性疾患の合併症の結果であるために、Ａｘｌ発現が悪性乳癌細胞侵襲性に必要とされるかどうかを評価した。Ａｘｌは、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１を含むいくつかの高度に転移性のヒト乳癌細胞株において発現されている。ＡｘｌリガンドのＧａｓ６は同時発現されることが多く、自己分泌活性化をもたらす（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞におけるＡｘｌ発現レベルを特定の細胞挙動と効果的に相関させるために、本発明者らは、最近開発されたＦＡＣＳベースのＲＮＡｉアプローチ、ＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔＲＮＡｉを使用して用量依存性の形でＡｘｌ発現を減少させるＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡのエピ対立形質系列を開発した（図２Ａ；Micklem et al.、発表準備中）。このＡｘｌ ｓｈＲＮＡコレクションを使用して、段階的全体（図２Ｂ）及びリン酸化（図２Ｃ）Ａｘｌタンパク質レベルを有するエピ対立形質Ａｘｌ ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞系列を作製した。
【０２４６】
悪性癌細胞は、インビボ転移能と相関する間葉細胞侵襲性を三次元細胞外マトリックスタンパク質ゲル（マトリゲル）において示す（Bissell）。エピ対立形質解析は、血清（図２Ｄ）又は乳癌転移における重要な因子であるＳＤＦ−１ケモカイン（図２Ｅ）に対する応答におけるＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞浸潤のためのＡｘｌ発現の用量依存的必要量を実証した。これとは対照的に、ＡｘｌノックダウンはＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞増殖に対してはまったく効果はなく、二次元（側面上皮創傷治癒）遊走には中程度の効果しかなかった。これは、三次元増殖及び侵襲性におけるＡｘｌの特定の必要量を示した。したがって、本発明者らは、３ＤマトリゲルアッセイにおけるＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞に対するＡｘｌノックダウンの効果を評価した。正常な乳房表皮細胞は３Ｄマトリゲルにおいて極性球状腺房構造体に自己組織化するが、悪性ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞は増殖して高悪性度の腫瘍を反映する浸潤性星状増殖を有する大きな組織の乱れたコロニーを形成する（Bissell）。Ａｘｌ発現のノックダウンは、３Ｄ−マトリゲルにおけるＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞の悪性表現型を強く回復させ、悪性増殖のない小さな丸いコロニーを生み出した（図２Ｆ，Ｇ）。合わせると、これらのデータは、Ａｘｌシグナル伝達は、転移性乳癌細胞の間葉様侵襲性を維持するのに必要とされることを示唆している。
【０２４７】
Ａｘｌは乳房上皮細胞におけるＥＭＴ誘導転写因子により上方調節される
間葉侵襲性、すなわちＥＣＭを遊走し侵入する能力の獲得は、ＥＭＴの機能的特徴である。ＥＭＴ誘導転写因子Ｔｗｉｓｔは乳癌細胞の転移に必要とされる（Yang J, Mani SA, Donaher JL1 Ramaswamy S, Itzykson RA, Come C, Savagner P, Gitelman I, Richardson A, Weinberg RA.Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 2004 117:927-39）。したがって、Ｔｗｉｓｔ発現が乳房上皮細胞においてＡｘｌを上方調節するかどうかを調べた。正常な乳房上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）におけるＴｗｉｓｔ発現はＥＭＴを誘導する（図３Ａ；Glackin et al.、発表準備中）。驚くことに、ＡｘｌはＴｗｉｓｔ発現ＭＣＦ１０Ａ細胞においても強く上方調節されている（図３Ａ−Ｂ）。さらに、Ｇａｓ６は正常な乳房上皮細胞により構成的に発現されているので、このＴｗｉｓｔ誘導Ａｘｌ発現は自己分泌活性化ループを確立しており、細胞関連Ｇａｓ６及びチロシンリン酸化Ａｘｌの増加により証拠だてられている（図３Ａ、Ｃ）。他のＥＭＴ誘導転写因子がＡｘｌ発現を同様に上方調節するのかどうかを決定するために、ＺＥＢ２、Ｓｎａｉｌ及びＳｌｕｇを発現しているＭＣＦ１０Ａ細胞を解析した。これらのＥＭＴ転写因子のそれぞれが、ＭＣＦ１０Ａ細胞において間葉転換を誘導し、Ａｘｌ発現を上方調節した。これらの結果は、ＥＭＴ誘導がＡｘｌ発現をもたらし自己分泌シグナル伝達を確立することができることを示唆している。
【０２４８】
Ａｘｌ発現は実験組織操作乳腺腫瘍における腫瘍形成に必要である
インビボでの悪性増殖のためのＡｘｌの必要量を評価するために、効率的なインビボ光学撮像のためのＧＦＰ−ルシフェラーゼ構築物を発現するＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞を含む組織操作アプローチを使用し（ＣＳＩ；Tiron et al.、結果未公表）、ポリ乳酸組織操作スキャフォールドにマトリゲルと一緒に播種し、免疫無防備状態のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。腫瘍細胞はスキャフォールドにコロニー形成するので、操作された腫瘍微小環境内の増殖は腫瘍細胞間葉特徴と関連している（Mooney）。ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞は容易に腫瘍、この生物模倣型の微小環境を形成し、スキャフォールドの侵襲性コロニー形成を示す（図４Ａ）。Ａｘｌノックダウンは、腫瘍形成、側面拡散及び悪性形態を強く阻害した（図４Ａ）。
【０２４９】
Ａｘｌが血管を引き付け吸収する乳癌細胞の能力に影響するかどうかを確かめるために、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞が原発性ヒト微小血管内皮（ＨｕＭＶＥＣ，human microvascular endothelial）及び血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）と一緒に播種されて腫瘍血管構造を作り出すことを含む三細胞移植片アプローチを開発した。ヒトＥＣ−ｖＳＭＣ細胞の移植片は、２週間以内にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて灌流スキャフォールド内ヒト微小血管系を容易に形成する（Hegen et al.、発表準備中）。図４Ｂにおいて示されるように、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞は、この三細胞移植片モデルにおいて侵襲性の高度に血管新生化している腫瘍を形成する。操作されたヒト腫瘍血管構造は、管腔内赤血球と共に均等に分布しており灌流している。これとは対照的に、Ａｘｌノックダウンは、灌流ヒト微小血管系の成長に影響することなく腫瘍形成を妨げた。これは、誘導された血管新生の必要性をおそらく除去する微小血管系の存在下でさえＡｘｌは腫瘍形成に必要とされることを示している。
【０２５０】
明確なＡｘｌ発現閾値は乳腺腫瘍形成に必要とされる
腫瘍を形成するのに必要なＡｘｌ発現のレベルを評価するために、皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍においてＡｘｌのインビボエピ対立形質解析を行った。Ａｘｌエピ対立形質ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系列（図１）は皮下に注射され、生物発光スキャニングにより腫瘍形成について時間的にモニターされた。このアプローチにより、腫瘍増殖に対するＡｘｌ用量応答が明らかにされた（図５）。表面Ａｘｌレベルとの相関は、腫瘍形成に必要とされるＡｘｌ発現の閾値を明らかにした（図５Ｂ、Ｃ）。この用量応答は、侵襲性に対するＡｘｌ阻害の用量依存的効果と一致している（図２）。
【０２５１】
Ａｘｌは乳癌細胞の転移に不可欠である
乳癌転移に対するＡｘｌの必要量を評価するために、急速増殖及び高度に転移性のインビボＭＤＡ−２３１分離株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮを乳腺脂肪体に同所的に注射した。全身生物発光撮像を使用して、９週間にわたり自然転移発症を時間的にモニターした。対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞は、５〜６週間以内に壊死性になる大きな同所性乳腺腫瘍を生じた（図６Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮにおけるＡｘｌノックダウンは、原発性乳腺腫瘍形成の速度を下げたが、実質的な原発性乳腺腫瘍も生じた（図６Ａ）。自然転移は、４週間目に対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ注射マウスの胸部センチネルリンパ節において最初に検出された（図６Ａ）。これとは対照的に、ＭＤＡ−２３１ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ移植マウスにおいて転移は検出されなかった。９週間目に屠殺されると、切除された臓器は、転移細胞の存在による生物発光について個別にスキャンされた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ注射マウスは、リンパ節、肺、卵巣及び腎臓を含む、全てのマウスで広範な自然転移を形成していた。これとは対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ細胞は検出可能な転移を形成しなかった（１匹のマウスの腎臓での単一病変は別として）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ注射マウスの臓器由来の組織生検の組織学的解析により、生物発光総光粒子測定により予想されたように、全ての臓器における複数の微小転移及びマクロ転移の存在が確証された（図６Ｃ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ注射マウス由来の組織生検においては微小転移もマクロ転移も観察されず、観察される生物発光の欠如は、転移形成が阻害されたせいであることを確証した。これらの結果は、Ａｘｌが乳癌転移に不可欠であることを示している。
【０２５２】
同所的に注射されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ／ＧＦＰ−Ｌｕｃ対照又はＡｘｌノックダウン細胞を用いて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの全生存に対するＡｘｌの機能的貢献を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ／ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２坦腫瘍マウスにおいては、全体生存は著しく増加していた（Ｐ＝０．０１３、ログランク検定；図６ｄ）。これらの結果は本発明者らの臨床観察と合わせて、Ａｘｌが転移性疾患の発生及び全患者生存にとり重要であるという結論を支持している。
【０２５３】
異なる転移モデルにおいて本発明者らの結果を検証するために、ＣＳＩ構築物を用いて高度に転移性のマウス乳癌４Ｔ１細胞株に形質導入し、ＦＡＣＳによりＧＦＰルシフェラーゼ発現について選択した（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ）。４Ｔ１細胞は転移をＴｗｉｓｔ発現に依存しており、高レベルのＡｘｌ発現を示す（図７ａ）。
【０２５４】
４Ｔ１細胞においてマウスＡｘｌ表面レベルを効果的に抑制するマウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＡｘｌ２）を発現するレトロウイルスベクターを開発した（図７ａ）。ミスマッチドヒトＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈＡｘｌ２７９）はマウスＡｘｌ発現にはまったく効果はなかった。４Ｔ１細胞におけるＴｗｉｓｔノックダウン及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた結果に類似して、Ａｘｌノックダウン４Ｔ１細胞の組織培養拡大は著しい影響を受けなかった（データは示されていない）。
【０２５５】
メス正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺に導入されると、同質遺伝子的４Ｔ１腫瘍細胞は、白血球浸潤及び壊死に伴う腫瘍退縮と、それに続く複数の臓器への広範な転移と同時に起こる原発部位での再増殖をもたらす厳密な免疫応答のせいで二相性増殖パターンを示す。４Ｔ１−ＧＦＰＬｕｃ細胞は、免疫無防備状態のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいては単相性増殖のみを示す（データは示されていない）。マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２）又は陰性対照ヒト特異的ｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−ＬｕｃｓｈＡｘｌ２７９）のいずれかを発現している４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞をメスＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に注射し、時間的全身インビボ光学画像により腫瘍増殖及び転移を定量化した（図７ｂ）。対照４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２細胞は、急速な原発増殖を示し１週間後に最大に達した。これに続いて、５週間持続される急峻な退縮が起きた（図７ｂ）。６週目、原発部位での再発及び続いて急速に増殖する複数の遠隔転移が観察され、８週目までに全てのマウスが瀕死と致死に至った。マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２）を発現している４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞は最初、急速な原発腫瘍増殖、Ａｘｌ抑制によりわずかに減弱し、続いて退縮するという類似の経過をたどった（図７ｂ）。しかし、それに続く原発腫瘍の再発及び急速な増殖遠隔転移の出現はまったくなかった（図７ｂ）。実際、４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２細胞を注射されたマウスは全て、屠殺時（８週目）には健康なままであった。４Ｔ１モデルに特徴的な白血病反応に伴う脾腫も、Ａｘｌノックダウン腫瘍を坦持するマウスにおいては減少していた（データは示されていない）。８週目に屠殺されると、個々の切除された臓器は撮像され全光発光は定量化され、４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２７９腫瘍を坦持する全マウスにおける一般的播種部位での転移の存在が確証された（図７ｃ−ｄ）。これとは対照的に、４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２腫瘍を有するマウス由来の臓器において生物発光腫瘍細胞は検出されなかった（図７ｄ−ｅ）。これらの結果は、Ａｘｌが乳腺腫瘍転移の不可欠な調節因子であるという結論を支持している。
【０２５６】
Ｇａｓ６による自己分泌調節
ＡｘｌリガンドであるＧａｓ６はＡｘｌと同時発現されることが多く、自己分泌活性化と一致している。自己分泌シグナル伝達を示す細胞関連Ｇａｓ６及びリン酸化Ａｘｌレベルは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＡｘｌノックダウンにより減少する（図１１）。ＭＣＦ１０Ａ細胞において、Ｇａｓ６は構成的に発現されており、ＥＭＴ誘導Ａｘｌ発現により細胞関連になった（図１１）。これらの結果は、ＥＭＴプログラム誘導がＡｘｌ発現をもたらし、胸部上皮細胞において自己分泌シグナル伝達を確立することができることを示唆している。Ａｘｌは、Ｇａｓ６と同時発現されることが多いが、多くの転移性癌において検出されるので、自己分泌Ａｘｌシグナル伝達は多くの腫瘍型においてＥＭＴの頻繁な結果であり得る。Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＴｗｉｓなどのＥＭＴ誘導転写因子はＡｘｌ発現を強く誘導し、Ａｘｌが腫瘍細胞の悪性間葉表現型を持続するポジティブフィードバックループに関与する可能性があることを示唆している。この考えは、転移性病変においてＡｘｌ発現が上昇していることを観察したことと一致している。
【０２５７】
ＣＤ４４＋表現型はＡｘｌ発現と関連している
ＭＣＦ１０ａ細胞はＳｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ（ｐＢＡＢＥ ｐｕｒｏ Ｈ−Ｒａｓ Ｖ１２、Addgene製）構築物を用いて形質導入された。Ｓｌｕｇ形質導入された細胞は、ＧＦＰの同時発現を使用するフローサイトメトリーにより解析され、Ｈａ−Ｒａｓ発現は４８時間のピューロマイシン処置により選択された。フローサイトメトリーにより示されるように（図９、パネルＡ）、ＭＣＦ１０ａ細胞におけるＳｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現は、癌幹細胞マーカーＣＤ４４の発現表面発現の強い増加をもたらした。Ｓｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓを用いて形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞のフローサイトメトリー解析により、表面Ａｘｌ発現の強い増加がさらに示された。Ｓｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞は、ＣＤ４４高（ＣＤ４４＋）及び低（ＣＤ４４−）ＣＤ４４発現亜集団についてＦＡＣＳにより識別された。ＣＤ４４−細胞は上皮形態を示し、ＣＤ４４＋ＭＣＦ１０細胞は伸長した間葉形態を示した（図９、パネルＣ）。これらの細胞のウェスタンブロット解析により（図９、パネルＤ）、ＣＤ４４−ＭＣＦ１０ａ細胞が上皮結合部及び細胞骨格タンパク質発現を保持することが実証された。これとは対照的に、ＣＤ４４＋細胞は、強い間葉マーカー発現（ビメンチン、Ｎ−カドヘリン）及びＥ−カドヘリンの消失を示し、ＥＴＭを示していた。Ａｘｌ発現はＳｌｕｇとＨａ−Ｒａｓ誘導ＥＭＴの両方におけるＣＤ４４及び間葉形質の存在と相関していた（図９、パネルＢ、Ｄ）。３ＤマトリゲルにおけるＣＤ４４＋及びＣＤ４４−Ｓｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞の増殖（図９、パネルＥ）は、ＣＤ４４＋、Ａｘｌ発現ＭＣＦ１０ａ細胞が侵襲性であり、間葉表現型と一致していることを実証した。これらの結果により、ＡｘｌがＭＣＦ１０ａ細胞においてはＳｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現により上方調節されており、間葉及び癌幹細胞形質と相関していることが実証された。
【０２５８】
本発明の記載された態様の様々な修正及び変動は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求の範囲に記載される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、当業者には明白である本発明を実施する記載されている様式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
（参考文献）
Camp, R.L., V. Neumeister, and D.L. Rimm, A Decade of Tissue Microarrays: Progress in the Discovery and Validation of Cancer Biomarkers. J Clin Oncol, 2008
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Gupta PB, Mani S, Yang J, Hartwell K, Weinberg RA. The evolving portrait of cancer metastasis. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2005;70:291-7
Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303
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Vajkoczy P, Knyazev P, Kunkel A, Capelle HH, Behrndt S, von Tengg-Kobligk H, Kiessling F, Eichelsbacher U, Essig M, Read TA, Erber R, Ullrich A Dominant-negative inhibition of the AxI receptor tyrosine kinase suppresses brain tumor cell growth and invasion and prolongs survival. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006)103:5799-804
Yang J, Mani SA, Weinberg RA Exploring a new twist on tumor metastasis. Cancer Res 2006 66:4549-52
Yang J, Mani SA, Donaher JL1 Ramaswamy S, Itzykson RA, Come C, Savagner P, Gitelman I, Richardson A, Weinberg RA.Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 2004 117:927-39
Yang J, Weinberg RA. Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev Cell. 2008 Jun;14(6):818-29
Wang, H., et al., Mammography screening in Norway: results from the first screening round in four counties and cost-effectiveness of a modeled nationwide screening. Cancer Causes Control, 2001. 12(1): p. 39-45
Holland et al. R428, a selective small molecule inhibitor of AxI kinase, blocks tumour spread and prolongs survival in models of metastatic cancer. Cancer Research; 70(4), February 15, 2010
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮間葉転換（ＥＭＴ，epithelial-to-mesenchymal transition）の発生を検出するためのバイオマーカー及び診断／予後法に関する。さらに具体的には、本発明は、Ａｘｌの発現及び／又は活性に関連する診断法、予後法及び治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａｘｌは受容体型チロシンキナーゼサブファミリーの一員である。他の受容体型チロシンキナーゼに類似しているが、Ａｘｌタンパク質は、ＩｇＬとＦＮIII反復を隣接させている細胞外領域という独特の構造を表し、その一部がキナーゼドメインである細胞内ドメインを含有する細胞内領域を有する。Ａｘｌは、ビタミンＫ依存性タンパク質Ｇａｓ６（増殖停止特異的遺伝子６，growth-arrest-specific gene 6）のような増殖因子に結合することにより、細胞外マトリックスから細胞質にシグナルを伝達する。Ａｘｌの細胞外ドメインは切断されることが可能であり、６５ｋＤａの可溶性細胞外ドメインを放出することが可能である。切断により受容体の代謝回転が増強され、部分的に活性化されたキナーゼが生成される（O'Bryan JP, et al (1995) J Biol Chem. 270 (2): 551-557）。しかし、切断されたドメインの機能は分かっていない。
【０００３】
ヒトＡｘｌ遺伝子及び遺伝子産物に関する構造的情報は、国際公開第０３／０６８９８３号パンフレットに記載されている。以下の特許公表文献、米国特許第５，４６８，６３４号明細書、米国特許第６，０８７，１４４号明細書、米国特許第５，５３８，８６１号明細書、米国特許第５，９６８，５０８号明細書、米国特許第６，２１１，１４２号明細書、米国特許第６，２３５，７６９号明細書、国際公開第９９／４９８９４号パンフレット、国際公開第００／７６３０９号パンフレット、国際公開第０１／１６１８１号パンフレット、及び国際公開第０１／３２９２６号パンフレットもＡｘｌ又は他のチロシンキナーゼ受容体に関する。
【０００４】
Ａｘｌは細胞増殖の刺激作用に関与している。具体的には、Ａｘｌは慢性骨髄性白血病関連癌遺伝子であり、結腸癌及びメラノーマにも関連している。Ａｘｌは第１９染色体ｑ１３．１−ｑ１３．２にあるｂｃｌ３癌遺伝子に近接近している。Ａｘｌ遺伝子は脊椎動物種間で進化的に保存されており、間葉における発生中に発現される。
【０００５】
Ｇａｓ６リガンドと相互作用すると、Ａｘｌは自己リン酸化され、シグナル伝達事象のカスケードが起こる。Ｐｌ３Ｋ、ＡＫＴ、ｓｒｃ、Ｂａｄ、１４−３−３、ＰＬＣ、ＥＲＫ、Ｓ６Ｋ（マイトジェン調節キナーゼ）及びＳＴＡＴは、それぞれこのカスケードに関与していることが知られている。Ｇａｓ６は、膜リン脂質へのＣａ＋＋依存性結合を可能にするｙ−カルボキシグルタミン酸が豊富な領域（ＧＬＡドメイン）を有する。Ｇａｓ６は弱いマイトジェンであり、ＴＮＦ誘導細胞障害性又は増殖因子離脱によるストレスにさらされたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞において抗アポトーシス効果を及ぼす。ＮＩＨ３Ｔ３において、Ｇａｓ６のＡｘｌへの結合により、Ｐｌ３Ｋ、ＡＫＴ、ｓｒｃ及びＢａｄが活性化される。
【０００６】
Ａｘｌは腫瘍形成においていくつかの異なる役割を果たしていることが研究により明らかにされている。Ａｘｌは、内皮細胞遊走、増殖及び管形成を含む血管新生行動のキーとなる調節因子である。Ａｘｌは、ヒト乳癌細胞がインビボにおいて腫瘍を形成するのにも必要とされ、Ａｘｌが血管新生と腫瘍形成の両方に極めて重要であるプロセスを調節していることを示している（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。
【０００７】
Ａｘｌ受容体型チロシンキナーゼの活性は腫瘍転移と正の相関をしている。さらに具体的には、Ａｘｌは、Ａｘｌ媒介浸潤に必要とされるＭＭＰ−９の発現を増強することが研究により明らかにされている。Ａｘｌは、ＮＦ−Ｂκ及びＢｒｇ−１の活性化を通じてＭＭＰ−９活性を誘導することにより細胞浸潤を促進する（Tai, K-Y et al, Oncogene (2008), 27, 4044-4055）。
【０００８】
Ａｘｌはヒト神経膠腫細胞において過剰発現されており、Ａｘｌを使用して多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）を抱える患者における予後不良を予測することが可能である（Vajkoczy P, Knyazev P, Kunkel A, Capelle HH, Behrndt S, von Tengg-Kobligk H, Kiessling F, Eichelsbacher U, Essig M, Read TA, Erber R, Ullrich A Dominant-negative inhibition of the AxI receptor tyrosine kinase suppresses brain tumor cell growth and invasion and prolongs survival. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006)103:5799-804; Hutterer M. et al, Clinical Cancer Res 2008; 14 (1) Jan 1, 2008）。Ａｘｌは、その最小侵襲性相当物と比べて高度に侵襲性の肺癌細胞系統においても比較的過剰発現されている（Shieh, Y-S et al, Neoplasia, vol 7, no. 12, Dec 2005, 1058-1064）。したがって、Ａｘｌは腫瘍浸潤及び腫瘍進行において重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００９】
同様に、Ａｘｌは、高度に侵襲性の乳癌細胞において発現されているが、低侵襲性の乳癌細胞においては発現されていない。さらに具体的には、Ａｘｌシグナル伝達を阻害すると（ドミナントネガティブＡｘｌ変異体、Ａｘｌの細胞外ドメインに対する抗体により又はＡｘｌの低分子ヘアピン型ＲＮＡノックダウンにより）、高度に浸潤性の乳癌細胞の運動性及び浸潤性が減少した。低分子Ａｘｌ阻害剤は乳癌細胞の運動性及び侵襲性を妨げた。したがって、Ａｘｌは、乳癌細胞の運動性／侵襲性を支配するシグナル伝達ネットワークにおける決定的に重要な要素であると理解されている（Zhang, Y-X et al, Cancer Res 2008; 68 (6), March 15, 2008）。
【００１０】
メサンギウム細胞（mesangial cell）では、Ｇａｓ６は分裂促進的効果を有していることが見出されており、糸球体硬化症の進行における役割があり得ることを示していた。Ｇａｓ６／Ａｘｌ経路は糸球体腎炎においても役割を果たしていることが証拠により示唆されている（Yanagita M. et al, The Journal of Clinical Investigation, 2002, 110 (2) 239-246）。さらに、Ｇａｓ６は動脈損傷のモデルにおいて内皮細胞の生存を促進することが研究により明らかにされている。アンジオテンシンIIは、そのＡＴ１受容体を介して、血管平滑筋細胞においてＡｘｌ ｍＲＮＡ及びタンパク質受容体を増加することが明らかにされた（Melaragno M. G. et al, Circ Res., 1998, 83 (7): 697-704）。
【００１１】
Ａｘｌは、免疫系において細胞接着、細胞増殖及び恒常性の調節に関与していることも明らかにされている（Lu Q., 2001 Science 293 (5528): 306-311）。Ａｘｌ活性化に続いて、以下の現象：アポトーシスの阻害、線維芽細胞及び内皮細胞の「正常」細胞（非形質転換の）生存の増加、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ，Vascular Smooth Muscle Cell）の遊走（Ａｘｌキナーゼの不活化は遊走を遮断する）、血管壁における新生内膜形成の増強（Melaragno M.G. et al, Trends Cardiovasc Med., 1999, (Review) 9 (8): 250-253）並びに病変形成及びアテローム性動脈硬化症の進行への関与が観察されている。
【００１２】
本発明は、Ａｘｌに関連する新しい診断的、予後的及び治療的適用の提供を意図している。特に、本発明は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための方法を提供しようとしており、この方法は、癌、さらに具体的には、転移性及び薬物耐性癌の治療において治療的意義を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第０３／０６８９８３号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，４６８，６３４号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０８７，１４４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５３８，８６１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，９６８，５０８号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２１１，１４２号明細書
【特許文献７】米国特許第６，２３５，７６９号明細書
【特許文献８】国際公開第９９／４９８９４号パンフレット
【特許文献９】国際公開第００／７６３０９号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０１／１６１８１号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０１／３２９２６号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】O'Bryan JP, et al (1995) J Biol Chem. 270 (2): 551-557
【非特許文献３】Tai, K-Y et al, Oncogene (2008), 27, 4044-4055
【非特許文献５】Hutterer M. et al, Clinical Cancer Res 2008; 14 (1) Jan 1, 2008
【非特許文献６】Shieh, Y-S et al, Neoplasia, vol 7, no. 12, Dec 2005, 1058-1064
【非特許文献７】Zhang, Y-X et al, Cancer Res 2008; 68 (6), March 15, 2008
【非特許文献８】Yanagita M. et al, The Journal of Clinical Investigation, 2002, 110 (2) 239-246
【非特許文献９】Melaragno M. G. et al, Circ Res., 1998, 83 (7): 697-704
【非特許文献１０】Lu Q., 2001 Science 293 (5528): 306-311
【非特許文献１１】Melaragno M.G. et al, Trends Cardiovasc Med., 1999, (Review) 9 (8): 250-253
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一の態様は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するためのバイオマーカーとしての、Ａｘｌの使用に関する。
【００１６】
本発明は、Ａｘｌ発現は上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生と相関があるという所見に基づいている。本発明者らの知る限りでは、本発明は、そのような相関関係の最初の実証を表している。有利なことに、この所見は、癌、さらに具体的には、転移性及び薬物耐性癌の分野における診断法、予後法及び治療法を提供するための刺激的な新たな機会を開いている。
【００１７】
本発明者らは、浸潤−転移カスケードにおける必須のＥＭＴ誘導エフェクターとしての受容体型チロシンキナーゼＡｘｌのこれまで認識されていなかった役割を実証した。ＥＭＴプログラム活性化により、悪性乳癌細胞の侵襲性及び自然転移並びに薬物耐性表現型に不可欠であるＡｘｌ上方調節が生じることを結果は明らかにしている。Ａｘｌ発現は、間隔マンモグラフィー検出腫瘍及び臨床的に同定された乳腺腫瘍による乳癌患者死亡率と強い相関があり、Ａｘｌ活性化と転移性疾患の発生間の関連を示唆している。
【００１８】
本発明の第二の態様は、
（ｉ）試料を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、対照試料と比べてＡｘｌ発現の上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示すステップと、
を含む、試料中において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための方法に関する。
【００１９】
有利なことに、Ａｘｌの発現を決定することは、天然ではそれ自体一過性であるＥＭＴ事象の発生を検出するための「永久的」マーカーを提供する。したがって、Ａｘｌ発現の検出は、ＥＭＴ事象が起きたのかどうかを示す独特の永久的指標を提供する。
【００２０】
出願者による研究によれば、これは、ＥＭＴ関連活性化は悪性細胞に有利である自己分泌Ａｘｌ−Ｇａｓ６シグナル伝達ループを確立するという事実によることが明らかになった。Ａｘｌはパラ分泌機構を介しても活性化され得る。
【００２１】
ＥＭＴを起こした腫瘍細胞の検出は、現在のマーカー（例えば、ビメンチン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンの欠如）が正常ストローマ細胞に存在する間葉細胞骨格系及び接合部タンパク質に基づいているという事実により複雑化されている。腫瘍細胞と周囲のストローマ細胞を区別するのは困難である。Ａｘｌ発現は、悪性腫瘍細胞に際立った特徴を与える固形腫瘍中の腫瘍細胞に限定される可能性が高い。
【００２２】
ＥＭＴの可逆性は遠隔部位での転移形成に重要である。Ａｘｌ発現を使用して転移を検出することが可能である。
【００２３】
本発明の第三の態様は、対象由来の試料中のＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを決定することを含み、転移性癌のない対象中のレベルと比べて該ポリペプチドのレベルがより高いことが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示す、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することにより対象中の転移性癌を診断する方法に関する。
【００２４】
本発明の第四の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す（reversing）ことができる作用薬の活性をモニターする際のＡｘｌ又はＡｘｌをコードする遺伝子の使用に関する。
【００２５】
本発明の第五の態様は、作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、及びＡｘｌの活性及び／又は発現をモニターすることを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００２６】
本発明の第六の態様は、
（ｉ）作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与するステップと、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中においてＡｘｌ発現を測定するステップと、
（iii）上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す能力の指標として、未処置の試料と比べた場合の処置された試料中のＡｘｌの発現又は活性の増加又は減少を検出するステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を検出するための方法に関する。
【００２７】
本発明の第七の態様は、
（ｉ）Ａｘｌ阻害剤を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中のＡｘｌ発現を測定すること、並びに
（iii）Ａｘｌ阻害活性の指標として、未処置の試料中と比べた場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現又は活性の増加又は減少を検出すること、
により上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤の活性をモニターする方法に関する。
【００２８】
本発明の第八の態様は、
（ｉ）作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００２９】
本発明の第九の態様は、
（ｉ）複数の作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記複数の作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される前記活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
（iv）前記複数中に存在するどの作用薬又はどの複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すのかを個別に決定するステップと、
を含む、複数の作用薬をスクリーニングすることにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００３０】
第十の態様は、本発明の方法に従って同定される作用薬の、転移性癌の治療のための薬物の調製における使用に関する。
【００３１】
第十一の態様は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合される、本発明の方法に従って同定される作用薬を含む医薬組成物に関する。
【００３２】
第十二の態様は、
（ｉ）本発明に従った方法を使用して上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定すること、及び
（ii）前記作用薬を薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤と混合させること、
を含む、組成物を調製する方法に関する。
【００３３】
本発明の第十三の態様は、Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すための方法に関する。
【００３４】
本発明の第十四の態様は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことを含む、それを必要とする対象において転移性癌を治療するための方法に関する。
【００３５】
本発明の第十五の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【００３６】
本発明の第十六の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことにより転移性癌を治療するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【００３７】
本発明の第十七の態様は、抗Ａｘｌ抗体、Ａｘｌに対する核酸プローブ又はＡｘｌに対するＱＰＣＲプライマーを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【００３８】
第十八の態様は、本発明に従った方法における上で定義されるキットの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
転移は大多数の癌関連死の根底にある。したがって、腫瘍細胞播種を可能にする分子機構の理解を促進することは、極めて重要な健康問題である。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、癌細胞に悪性進行を促進する増強された遊走性及び生存属性を授ける。ＥＭＴエフェクターを特徴付ければ、転移についての新たな洞察及び治療のための新規の道を生み出す可能性がある。マンモグラフィー検出原発性乳癌における受容体型チロシンキナーゼＡｘｌの存在はそれだけで、全体的患者の生存を強力に減少させることを予測し、適合する患者の転移病変は増強されたＡｘｌ発現を示していることを本出願者は明らかにした。Ａｘｌは、前悪性乳腺上皮細胞において、そのリガンド、Ｇａｓ６と自己分泌シグナル伝達ループを確立する上皮間葉転換により強力に誘導されることも本出願者は実証した。転移性乳癌細胞におけるエピ対立形質（epi-allelic）ＲＮＡ干渉解析を使用して、間葉様インビトロ細胞侵襲性に対する、並びに外来及び組織操作された微小環境においてインビボで腫瘍を形成するためのＡｘｌ発現の明確な閾値を本出願者は描いた。重要なことに、Ａｘｌノックダウンは、２つの異なる光学画像ベースの実験乳癌モデルにおいて、乳腺からリンパ節及びいくつかの主要臓器への高度に転移性の乳癌細胞の拡散を完全に妨げ、全体的生存を増加した。したがって、Ａｘｌは、乳癌転移に必要とされる腫瘍細胞ＥＭＴの新規の下流エフェクターを表している。Ａｘｌ発現腫瘍の検出及び標的された治療は、乳癌に対する重要で新しい治療戦略を表す。
【００４０】
ＥＭＴ及び転移におけるＡｘｌの役割
間葉細胞の特徴を獲得すると、上皮癌細胞は、転移に伴う単細胞侵襲性細胞運動性を与えられる（Theirry, 2002 Weinberg, 2007）。
【００４１】
上で述べたように、本発明者らは、Ａｘｌが浸潤−転移カスケードにおいて必須のＥＭＴ誘導エフェクターであることを実証した。ＥＭＴプログラム活性化により、悪性乳癌細胞の侵襲性及び自然転移に不可欠であるＡｘｌ上方調節が生じることを結果は明らかにしている。Ａｘｌ発現は、間隔マンモグラフィー検出腫瘍による乳癌患者死亡率と強い相関があり、Ａｘｌ活性化と転移性疾患の発生間の関連を示唆している。
【００４２】
Ａｘｌは、最初に、機能的遺伝子スクリーニングにおいて浸潤性細胞遊走のキーとなる調節因子として同定された（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。悪性乳癌細胞におけるＡｘｌ発現は、様々な走化性誘導物質（血清、ＳＤＦ−１）に応答した三次元マトリックスにおける侵襲性に必要であることを本発明者らはここで実証している。これとは対照的に、プレートベースの２Ｄアッセイ（増殖、スクラッチ）における又は細胞接着に対するＡｘｌノックダウンの効果はごく僅かしか本発明者らは観察しなかった。Ａｘｌ阻害は、増殖に影響を与えることなく、神経膠腫及び肺癌細胞遊走も阻害する（Angelillo-Scherrer et al., 2005; Shieh et al., 2005）。したがって、共通の主題は、Ａｘｌシグナル伝達は悪性腫瘍細胞における間葉遊走性表現型に不可欠であることである。
【００４３】
これと一致して、Ａｘｌは、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＺＥＰ２を含むいくつかの転写因子により誘導されるＥＭＴの新規マーカーを表すことを本発明者らは実証している。上皮細胞におけるこれらの転写因子の発現は、上皮細胞において間葉特徴を一過性に上方調節する正常な発生プログラムを誘発する。前悪性上皮細胞は、局所的ストローマ細胞により産生されるＴＧＦベータなどのコンテクストシグナルを介してＥＭＴを活性化すると考えられている（Weinberg, 2007）。Ｅ−カドヘリンなどのＥＭＴ関連マーカー発現が腫瘍中では大きく異なるために、このプロセスはインビボでは動的である。実際、Ａｘｌは本発明者らの研究では独立した予後判定？因子であり、Ｅ−カドヘリンとの変化とは相関していない。ＥＭＴに対する臨床的証拠のこのような欠如はよく文書に取り上げられ議論されている。Ａｘｌ発現はもっと耐久性のあるＥＭＴ誘導変化を表していることを本出願者は明らかにしている。
【００４４】
Ａｘｌが乳腺微小環境からの転移に不可欠かどうかを決定するために、本発明者らは高度に転移性の（インビボ継代された）乳癌細胞系統（ＭＤＡ−２３１−ＤＨ２ＬＮ）を乳腺に移植し、ルシフェラーゼ生物発光のインビボ光学画像により拡散をモニターした。時間的全身光学画像により、全ての対照マウスにおいて移植の２８日以内に、リンパ節、肺、卵巣及び腎臓への広範囲なＭＤＡ−２３１−ＤＨ２ＬＮ拡散が明らかになった。自然なリンパ節転移は全ての動物において４週間目にはじめて検出された。臓器転移は９週間の経過観察中ずっと検出された。屠殺時、切除された臓器は個別にスキャンされ、転移を含有することが明らかにされ、後に組織診断により確証された。これとは対照的に、Ａｘｌノックダウン細胞（ＭＤＡ−２３１−ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ）を坦持するマウス由来の臓器の生物発光によっても組織診断によっても転移は検出されなかった。同所性乳腺部位からの拡散のこの強力な阻害は、Ａｘｌが転移に不可欠であることを明らかにしている。
【００４５】
総合すると、本発明者らの結果により、Ａｘｌ発現乳腺腫瘍の検出及びかかる腫瘍を標的にした治療が乳癌治療開発のための重要な新戦略を表していることが示されている。
【００４６】
診断ツール
本発明の一態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための診断ツールに関する。
【００４７】
したがって、第一の態様では、本発明は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するためのバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【００４８】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌは上皮間葉転換（ＥＭＴ）の誘導を検出するためのバイオマーカーである。
【００４９】
遠隔部位への転移は固形癌による最も一般的な死亡原因である（Gupta 2006, Sporn 1996）。これを実現するために、腫瘍細胞は上皮拘束を捨て、結合複合体を再定義し、基底膜境界を突破するための侵襲的運動性を獲得する。次に、これらの転移細胞はリンパ及び血行循環に血管内侵入し、身体の遠隔部位へ播種する。少数のこれらの転移細胞は毛細血管壁を通って血管外遊出することに成功し、稀に、外来組織ストローマにコロニーを形成する（Weinberg et al）。この悪性過程は、上皮細胞が原腸陥入及び器官形成中に一過性に間葉表現型を帯び、上皮層から離れる単細胞侵襲的運動を可能にする発生プログラムである、上皮間葉転換（ＥＭＴ）により促進される（Hall, 1985; Thierry, 2002）。ＥＭＴプログラムは、結合複合体タンパク質の発現を変化させる、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＺｅｂ２を含む転写調節因子の発現を誘導するモルフォゲンシグナル伝達経路のコンテクスト活性化により開始される（Thiery and SLeeman 2006）。ＥＭＴ遺伝子発現プロファイルは、表現型シフト、ビメンチン及びＮ−カドヘリンの誘導に伴うＥ−カドヘリン及びサイトケラチンの抑制を反映している（Weinberg et al 2007）。
【００５０】
本発明の別の態様は、悪性度を検出しモニターするためのバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【００５１】
本発明の別の態様は、腫瘍転移を検出するためのバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。好ましくは、腫瘍は癌腫であり、さらに好ましくは乳癌である。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、対象が、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療を受けるに適した候補であるかどうかを決定するための診断法を提供する。例えば、Ａｘｌ発現が上方調節されていることが示されている場合、これはＡｘｌ阻害剤を用いる治療に感受性である可能性がある対象を選択するための治療選択肢及び実行、すなわち、個別化医療適用における予後の指針として使用することが可能である。例えば、Ａｘｌ発現が原発性腫瘍において上方調節されていることが示されている場合、これは転移の可能性が増加していると推測するのに使用することが可能である。この情報は、根治的乳房切除術などのより積極的な抗癌外科的、化学療法的又は放射線治療的処置を必要とする可能性がある対象を選択するための治療選択肢、すなわち、個別化医療適用における予後の指針として使用することが可能である。
【００５３】
したがって、本発明の別の態様は、
（ｉ）細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから試料を単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定し、対照試料に対してＡｘｌ発現の上方調節がＡｘｌ阻害剤を用いる治療に感受性であることを示すステップと、
を含む、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性であるかどうかを決定するための方法に関する。
【００５４】
用語「マーカー」又は「バイオマーカー」とは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）が起こる場合、細胞又は哺乳動物由来の試料中のその発現が変化している又は調節されている、例えば、上方調節されている又は下方調節されている遺伝子又はタンパク質を指すのに本明細書では使用されている。バイオマーカーがタンパク質の場合、発現の調節又は変化は、異なる翻訳後修飾を通じた調節を包含する。
【００５５】
翻訳後修飾は、タンパク質切断により又は１若しくは２以上のアミノ酸への修飾基の付加によりタンパク質の特性を変える共有結合プロセッシング事象である。一般的翻訳後修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、アシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー、ユビキチン化などが挙げられる。検出のためのそのような修飾及び方法の概説は、Mann et al. Nature Biotechnology March 2003, Vol. 21, pages 255-261において見出し得る。
【００５６】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌの上方調節は上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示している。
【００５７】
本発明の別の態様は、
（ｉ）細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから試料を単離し、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定し、対照試料に対してＡｘｌ発現の上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）発生を示す、
ステップを含む、試料中の上皮間葉転換（ＥＭＴ）発生を検出するための方法に関する。
【００５８】
本発明の別の態様は、対象由来の試料におけるＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを決定し、転移性癌のない対象におけるレベルと比べてポリペプチドのより高いレベルが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示すことを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）発生を検出することにより対象の転移性癌を診断する方法に関する。
【００５９】
特に、所望の癌は、いかなる癌腫でも、さらに好ましくは乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病でも含む。さらに好ましくは、癌は転移性乳癌である。
【００６０】
好ましくは、Ａｘｌ遺伝子の発現又はＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルは、抗Ａｘｌ抗体又は親和性作用薬を使用して測定される。
【００６１】
新たな治療薬のための診断
本発明の別の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができ、それによって癌などの増殖性障害の治療において潜在的治療適用を有する作用薬を同定するための診断アッセイに関する。
【００６２】
したがって、本発明の一態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬の活性をモニターする際のＡｘｌ又はＡｘｌをコードする遺伝子の使用に関する。
【００６３】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌの存在は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬の細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトへの投与後にモニターされる。
【００６４】
本発明の別の態様は、作用薬を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与し、Ａｘｌの活性及び／又は発現をモニターすることを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００６５】
好ましい一実施形態では、方法は、作用薬を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与し、未処置の対照試料と比べた場合の前記処置された試料においてＡｘｌの変化した発現を検出することを含む。
【００６６】
「変化した発現」とは、未処置の対照試料と比べた場合、処置された細胞由来の試料中における発現の増加、減少又はその他の方法では改変されたレベル又はパターンのことである。
【００６７】
用語「発現」とは、対応するｍＲＮＡを産生する遺伝子ＤＮＡ鋳型の転写及び対応する遺伝子産物（すなわち、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）を産生するこのｍＲＮＡの翻訳の他にも翻訳後に修飾されている可能性のある１又は２以上の形でのタンパク質の「発現」のことである。
【００６８】
遺伝子発現を含む変化した発現の検出は、当技術分野で公知の方法のうちのいずれか１つにより、特にマイクロアレイ解析、ウェスタンブロッティングにより又はＱＰＣＲなどのＰＣＲ技法により実施され得る。変化した発現は、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ又はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳなどの方法を使用して及び２Ｄゲル電気泳動などの解析技法をさらに使用して試料のタンパク質含有量を解析することによっても検出され得る。このような技法は、タンパク質の別の翻訳後修飾された形態の形で変化した発現を検出するのに特に有用であることが可能である。
【００６９】
本発明の別の態様は、
（ｉ）作用薬を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与すること、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料においてＡｘｌ発現を測定すること、並びに
（iii）上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す能力の指標として、未処置の試料と比較した場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現の増加又は減少を検出すること、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を検出するための方法に関する。
【００７０】
阻害はいかなるレベルで（例えば、遺伝子発現レベル又はタンパク質レベルで）あってもよい。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、
（ｉ）Ａｘｌ阻害剤を細胞、細胞集団、モデル動物又はヒトに投与すること、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料においてＡｘｌ発現を測定すること、並びに
（iii）Ａｘｌ阻害活性の指標として、未処置の試料と比較した場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現又は活性の増加又は減少を検出すること、
により上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤の活性をモニターする方法に関する。
【００７２】
この態様では、好ましくは、試料はタンパク質解析により、さらに好ましくはＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ、フローサイトメトリー、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ又は２−Ｄ ＰＡＧＥにより解析される。
【００７３】
本明細書で使用されるように、処置された又は未処置の細胞由来の試料は、組織培養物又は動物又はヒト由来であることが可能である細胞の集団由来のライセート、抽出物又は核酸試料であることが可能である。タンパク質解析では、試料は組織培養物上清であることが可能である。細胞は個体から単離されることが可能である（例えば、血液、血清若しくは血漿試料由来の全細胞）又は生検などの組織試料の一部であることが可能である。
【００７４】
好ましくは、細胞の集団は細胞培養物である。
【００７５】
好ましい細胞型は、ＨＴ２９などの結腸腫瘍細胞系統、Ａ５４９などの肺腫瘍細胞系統、Ａ４９８などの腎腫瘍細胞系統、ＨＴ１３などの膀胱腫瘍細胞系統、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などの乳腺腫瘍細胞系統、ＡＮ３ＣＡなどの子宮内膜腫瘍細胞系統、ＭＥＳＳＡ ＤＨ６子宮肉腫細胞などの子宮腫瘍細胞系統、Ｈｅｐ２Ｇなどの肝腫瘍細胞系統、ＤＵ１４５などの前立腺腫瘍細胞系統、Ｃｅｍ Ｔ細胞などのＴ細胞腫瘍細胞系統、ＭｉａＰａＣａ２などの膵腫瘍細胞系統から選択される。代わりに、細胞は腫瘍生検の組織学的試料（例えば、レーザーキャプチャー顕微鏡手術により採取される試料）の形であり得る。生検試料中の遺伝子発現を検出するための適切な方法は、本明細書で同定される遺伝子を認識する抗体を使用するＦＩＳＨ又は免疫組織化学技法を使用することの他にも試料のタンパク質組成を解析するための方法を含む。
【００７６】
別の代案では、細胞はＰＢＭＣなどの血液細胞培養物でもよい。本明細書で使用されるように、用語「ＰＢＭＣ」とは、末梢血単核球のことであり、ＰＢＬ（末梢血リンパ球，peripheral blood lymphocyte）を誘導する。
【００７７】
適切には、遺伝子発現の変化を含む発現の変化は哺乳動物又はヒトから採取される試料においてモニターされる。適切な試料には、生検、血液、尿、頬スクレープ、等などの組織試料が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、遺伝子発現は好ましくは腫瘍細胞、特に乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病などの腫瘍、又はリンパ球などの血液細胞及び好ましくはＰＢＭＣなどの末梢リンパ球由来の細胞において検出される。
【００７８】
別の実施形態では、変化したタンパク質発現は、哺乳動物又はヒト由来の血清又は血漿又は組織培養上清試料において検出される。
【００７９】
本明細書に記載されるように、血清中、及び特に患者の血漿試料中のタンパク質の検出では、試料は取り出され、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳなどのタンパク質解析技法にかけられる。
【００８０】
好ましい一実施形態では、方法は、前記試料からＲＮＡを抽出し、ＱＰＣＲにより遺伝子発現を検出することを含む。
【００８１】
別の実施形態では、遺伝子発現は、例えば、ウェスタンブロットによるなどのタンパク質産物を検出することにより検出される。
【００８２】
本発明の別の態様は、
（ｉ）作用薬をＡｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記作用薬の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００８３】
好ましくは、測定される活性は、Ａｘｌ受容体の基質のチロシンリン酸化である。
【００８４】
さらに好ましくは、測定される活性は、Ａｘｌ受容体の自己リン酸化である。
【００８５】
この特定の実施形態では、好ましくは接触ステップ（ｉ）における細胞は既にＡｘｌ遺伝子によりトランスフェクトされている。
【００８６】
さらに好ましくは、トランスフェクトされた細胞は、一過的又は安定的にトランスフェクトされている。
【００８７】
好ましい一実施形態では、ステップ（iii）における対照条件は、作用薬を活性なＡｘｌ遺伝子を欠く細胞に接触させることを含む。さらに好ましくは、前記細胞は変異不活性化型のＡｘｌ遺伝子を有する。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、ステップ（iii）における対照条件は、前記活性を前記作用薬の不在下で測定される活性と比較することを含む。
【００８９】
特に好ましい一実施形態では、Ａｘｌ受容体は、細胞内ドメインの生物学的に活性な部分を含む。
【００９０】
好ましい一実施形態では、Ａｘｌ受容体は、例えば、固相への付着により固定化される。
【００９１】
本発明の別の態様は、
（ｉ）複数の作用薬をＡｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記複数の作用薬の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される活性を対照条件下で測定される活性と比較し、減少によって、前記複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
（ｖ）前記複数のうちのどの作用薬又はどの複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すかを個別に決定するステップと、
を含む、複数の作用薬をスクリーニングすることにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法に関する。
【００９２】
好ましくは、上記の本発明の方法において、作用薬は転移性癌を治療することを目的とする。
【００９３】
前記方法により同定される作用薬
別の態様は、転移性癌の治療のための薬物を調製する際に上記方法のうちのいずれかに従って同定される作用薬の使用に関する。
【００９４】
好ましくは、癌は、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病から選択される。さらに好ましくは、癌は乳癌である。
【００９５】
遺伝子／タンパク質マーカーの変化した発現を測定する
遺伝子及びタンパク質発現のレベルは、いくつかの異なる技法を使用して決定し得る。
【００９６】
（ａ）ＲＮＡレベルで
遺伝子発現はそのＲＮＡレベルで検出することが可能である。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジン イソチオシアン酸抽出（RNAzol B; Biogenesis社製）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Qiagen社製）又はＰＡＸｇｅｎｅ（PreAnalytix社製、Switzerland）を使用することを含むＲＮＡ抽出技法を使用して細胞から抽出し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイフォーマットは、核ランオンアッセイ(nuclear run-on assay)、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035）、ノーザンブロッティング法及びインサイチュハイブリダイゼーション法を含む。遺伝子発現は、下に記載されるマイクロアレイ解析により検出することも可能である。
【００９７】
ノーザンブロッティング法では、ＲＮＡ試料は、先ず変性条件下のアガロースゲル中での電気泳動を介してサイズにより分離される。次に、前記ＲＮＡは膜に移され、架橋され、標識プローブとハイブリダイズされる。ランダムプライムド（random-primed）、ニックトランスレイティッド（nick-translated）又はＰＣＲ作製ＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドを含む非同位体又は高度に特異的な活性放射性標識プローブを使用することが可能である。さらに、部分的にのみ相同性を有する配列（例えば、異なる種由来のｃＤＮＡ又はエキソンを含有する可能性のあるゲノムＤＮＡ断片）をプローブとして使用し得る。
【００９８】
ヌクレアーゼ保護アッセイ（Nuclease Protection Assays）（例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイとＳ１ヌクレアーゼアッセイの両方）は、特定のｍＲＮＡの検出及び定量化に極めて感受性の方法を提供する。ＮＰＡの基礎はＲＮＡ試料へのアンチセンスプローブ（放射性標識又は非同位体の）の溶液ハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーション後、一本鎖、非ハイブリダイズドプローブ及びＲＮＡはヌクレアーゼにより分解される。残りの保護された断片はアクリルアミドゲル上で分離される。ＮＰＡは、いくつかのＲＮＡ種の同時検出を可能にする。
【００９９】
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ，in situ hybridization）法は、細胞又は組織における特定のｍＲＮＡの局在化のための強力で多用途のツールである。プローブのハイブリダイゼーションは細胞又は組織内で起こる。細胞構造は前記手順の間ずっと維持されるために、ＩＳＨは組織試料内のｍＲＮＡの位置についての情報を提供する。
【０１００】
手順は、中性緩衝ホルマリンに試料を固定し、パラフィン内に組織を包埋することから始める。次に、前記試料は薄片にスライスされ、顕微鏡スライド上にのせられる。代わりに、組織は凍結したまま薄片にされ、パラホルムアルデヒドにポスト固定されることが可能である。前記切片を脱脂して再水和するための一連の洗浄後、プローブ接近性を増加させるためのプロテイナーゼＫ消化が実施され、次に、標識プローブが試料切片にハイブリダイズされる。放射性標識プローブは液体フィルムがスライド上で乾燥されて視覚化され、非同位体標識プローブは比色分析又は蛍光試薬を用いて都合よく検出される。検出のこの後者の方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ，Fluorescent In Situ Hybridisation）法の基礎である。
【０１０１】
用いることが可能な検出のための方法は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識及び他の適切な標識を含む。
【０１０２】
典型的には、ＲＴ−ＰＣＲを使用してＲＮＡ標的を増幅する。このプロセスでは、逆転写酵素を使用してＲＮＡを、その後検出を促進するために増幅することが可能な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換する。相対定量的ＲＴ−ＰＣＲは、所望の遺伝子と同時に内部標準を増幅することを含む。内部標準を使用して、前記試料を規準化する。規準化された後は、前記試料にわたって特定のｍＲＮＡの相対的存在量の直接比較を行うことが可能である。一般的に使用されている内部標準には、例えば、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ、アクチン及びシクロフィリンが挙げられる。
【０１０３】
多くのＤＮＡ増幅法が公知であり、その大半が酵素的連鎖反応に頼っている（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、若しくは自家持続配列複製）、又はＤＮＡがクローニングされているベクターの全て若しくは一部の複製からである。
【０１０４】
多くの標的及びシグナル増幅（ＴＡＳ）法が文献、例えば、Landegren, U. et al., Science 242:229-237 (1988)及び Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990)におけるこれらの方法の概論に記載されている。
【０１０５】
ＰＣＲは、特に米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている核酸増幅法である。ＰＣＲを使用すれば診断状況においていかなる既知の核酸でも増幅することが可能である（Mok et al., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252）。自家持続配列複製（３ＳＲ，self-sustained sequence replication）はＴＡＳの変異形であり、これは、酵素カクテル及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーにより媒介される逆転写酵素（ＲＴ，reverse transcriptase）、ポリメラーゼ及びヌクレアーゼ活性の順続的ラウンドを介した核酸鋳型の等温増幅を含む（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）。ライゲーション増幅反応又はライゲーション増幅システムは、ＤＮＡリガーゼ及び標的鎖あたり２種で４種のオリゴヌクレオチドを使用する。この技法はWu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560により記載されている。Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197により記載されるように、Ｑβレプリカーゼ技法では、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼを使用して標的ＤＮＡを増幅する。
【０１０６】
定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ，Quantitative PCR）は、試料内の転写物の相対量を決定することを可能にする技法である。ＱＰＣＲを実施するための適切な方法は本明細書に記載されている。
【０１０７】
代替の増幅技術は本発明において利用することが可能である。例えば、ローリングサークル増幅（Lizardi et al., 1998, Nat Genet 19:225）は、ＤＮＡポリメラーゼにより推進される市販の増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））であり、等温条件下で線形動力学又は幾何学的動力学のいずれかにより環状オリゴヌクレオチドプローブを複製することが可能である。追加の技法、すなわち鎖置換増幅（ＳＤＡ，strand displacement amplification; Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:392）は、特定の標的に特有の明確に定義された配列から始める。
【０１０８】
本明細書で同定されるＡｘｌの発現を検出するのに適したプローブは、適切な容器に試験キットの形態で都合よくパッケージし得る。そのようなキットでは、プローブは、キットがそれ向けに設計されているアッセイフォーマットがそのような結合を必要とする固形支持体に結合され得る。前記キットは、プローブを試料中の核酸にハイブリダイズさせて、探索される試料を処理するのに適した試薬、コントロール試薬、使用説明書、などを含有していてもよい。適切なキットは、例えば、ＱＰＣＲ反応のためのプライマー又はＦＩＳＨを実施するための標識プローブを含み得る。
【０１０９】
（ｂ）ポリペプチドレベル
変化した遺伝子又はタンパク質発現は、Ａｘｌ遺伝子によりコードされるポリペプチドを測定することによっても検出し得る。これは、Ａｘｌ遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する分子を使用することにより実現され得る。前記タンパク質の存在を検出するために前記ポリペプチドに直接的に又は間接的に結合する適切な分子／作用薬には、ペプチド若しくはタンパク質、例えば、抗体などの天然に存在する分子が挙げられ、又は前記適切な分子／作用薬は合成分子でもよい。
【０１１０】
Ａｘｌ遺伝子又はタンパク質に対する抗体は、商業的供給源に由来していても又は当業者によく知られている技法を通じて得られてもよい。一実施形態では、及び変化した発現が、タンパク質バイオマーカーの翻訳後修飾された形態の変化の発現を通じて現れる場合、それらの異なる形態に特異的な抗体を使用し得る。
【０１１１】
抗体の作製のための方法は当業者には公知である。ポリクローナル抗体が望まれる場合、選択される哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、ポリペプチド由来のエピトープ（複数可）を坦持する免疫原性ポリペプチドで免疫される。前記免疫される動物由来の血清は、公知の手順に従って収集され処理される。ポリペプチド由来にエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、前記ポリクローナル抗体は免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することが可能である。ポリクローナル抗血清を作製し処理するための技法は当技術分野では公知である。より大きな免疫原性応答を生み出すためには、ポリペプチド又はその断片を、動物又はヒトにおける免疫原として使用するために別のポリペプチドにハプテン化し得る。
【０１１２】
ポリペプチド中のエピトープに対して向けられるモノクローナル抗体も当業者により容易に作製することが可能である。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体を作製するための一般的方法論は周知である。不死化抗体産生細胞株は、細胞融合により、及び発癌性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタイン・バーウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技法によっても作製することが可能である。本発明のポリペプチド中のエピトープに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性について、すなわち、アイソトープ及びエピトープ親和性についてスクリーニングすることが可能である。
【０１１３】
代替の技法は、例えば、ファージが多種類の相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity determing region）を有するその被膜表面上にｓｃＦｖ断片を発現するファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。この技法は当技術分野で周知である。
【０１１４】
本発明の目的のために、用語「抗体」は、それとは反対に特定されていなければ、全抗体、又は標的抗原に対するその結合活性を保持している全抗体の断片を含む。そのような断片には、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片の他にも一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。さらに、抗体及びその断片は、例えば、欧州特許出願公開第２３９４００Ａ号明細書に記載されているヒト化抗体でもよい。本明細書で使用される用語「抗体」は、抗体様アフィニティー試薬も包含する。例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、組換え抗体、抗体のタンパク質分解性及び組換え断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー）、単一ドメイン抗体（ＶＨＨ、ｓｄＡｂ、ナノボディー、ＩｇＮＡＲ、ＶＮＡＲ）並びに抗体に無関係なタンパク質、これらは、以下の
名称 基盤
アフィボディー（Affibodies） プロテインＡ、Ｚドメイン ６ｋＤａ
アフィチン（Affitins） Ｓａｃ７ｄ（スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来）７ｋＤａ
アンチカリン（Anticalins） リポカリン ２０ｋＤａ
ＤＡＲＰｉｎｓ アンキリンリピートモチーフ １４ｋＤａ
ファイノマー（Fynomers） Ｆｙｎ、ＳＨ３ドメイン ７ｋＤａ
クニッツドメインペプチド 多様なプロテアーゼ阻害剤 ６ｋＤａ
モノボディー（Monobodies） フィブロネクチン
などの抗体様特異的結合を有するように操作されている。
【０１１５】
上記のイムノブロッティング法などの標準実験技法を使用して、同一細胞集団中の未処理の細胞と比べた場合のＡｘｌ活性の変化したレベルを検出することが可能である。
【０１１６】
遺伝子発現は、ポリペプチドの翻訳後プロセッシング又は核酸の転写後修飾の変化を検出することによっても決定し得る。例えば、ポリペプチドの差次的リン酸化、ポリペプチドの切断又はＲＮＡの選択的スプライシング、などを測定し得る。ポリペプチドなどの遺伝子産物の発現のレベルの他にもその翻訳後修飾は、特許で保護されたタンパク質アッセイ又は２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動などの技法を使用して検出し得る。
【０１１７】
（ａ）本発明の抗体を提供する；（ｂ）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で前記抗体と一緒に生体試料をインキュベートする；及び（ｃ）前記抗体を含む抗体抗原複合体が形成されているかどうかを決定することを含む方法により、Ａｘｌ発現を検出するための抗体を使用し得る。
【０１１８】
適切な試料には、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉及び骨組織などの組織又はそのような組織由来の腫瘍性増殖物由来の抽出物が挙げられる。他の適切な例には血液又は尿試料が挙げられる。
【０１１９】
Ａｘｌタンパク質に特異的に結合する抗体は、体液又は組織におけるＡｘｌタンパク質の発現を検出する又は定量するために、当業者に周知である診断法又は予後法及びキットにおいて使用することが可能である。これらの試験の結果を使用して、癌の発生若しくは再発及び他の細胞運動性若しくは細胞生存媒介疾患を診断する若しくは予想する、又は薬物用量及び治療の有効性を評価することが可能である。
【０１２０】
当技術分野で公知のいかなる方法によっても免疫特異的結合について抗体をアッセイすることが可能である。使用することが可能な免疫アッセイには、ウェスタンブロット、免疫組織学、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光免疫アッセイ及びプロテインＡ免疫アッセイなどの技法を使用する競合的及び非競合的アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
そのようなアッセイは当技術分野では常用である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照。この文献は参照によりその全体を本明細書に組み込まれている）。
【０１２２】
本発明において使用するための抗体は、好ましくは固形支持体に結合されている及び／又は適切な試薬、対照、使用説明書などと一緒に適切な容器中のキットにパッケージされている。
【０１２３】
他の方法には、２Ｄ−ＰＡＧＥが挙げられるが、これに限定されない。しかし、この２Ｄ−ＰＡＧＥは大規模スクリーニングには比較的適切ではない。もっと新しい技法には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ，matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry）が挙げられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析では、複合混合物中のタンパク質は固形金属マトリックスに貼り付けられ、パルスレーザービームで脱離されて、フィールドフリー飛行管を横断する気相イオンを生成し、次にその質量依存性速度に応じて分離される。個々のタンパク質及びペプチドは、タンパク質及びペプチド配列データベースを検索する情報学ツールの使用を通じて同定することが可能である。表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ，surface-enhanced laser desorption/ionisation time of flight MS）は、タンパク質が化学的修飾された固体表面に選択的に吸着され、不純物質は洗浄により除去され、エネルギー吸収マトリックスが適用され、前記タンパク質がレーザー脱離質量分析により同定される親和性ベースのＭＳ法である。
【０１２４】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは無傷のタンパク質又は特定のタンパク質の断片のいずれかの出現／消失の検出のために使用することが可能である。さらに、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、化学基の付加／除去により引き起こされる質量の差のせいによるタンパク質の翻訳後修飾の検出のためにも使用することが可能である。したがって、単一残基がリン酸化されると、前記リン酸基のせいで８０Ｄａの質量変化が起きる。翻訳後修飾のせいだと考えることが可能な分子量のデータベースは、インターネット上において無料でアクセス可能である（http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home?avgmass=all）。さらに、タンパク質の翻訳後修飾形態を特異的に認識する、又はタンパク質のあらゆる形態を同等によく認識することができる抗体を用いることにより、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを使用する親和性ベースのアプローチにより特定のポリペプチドを捕捉することが可能である。
【０１２５】
アレイ
アレイ技術及びそれに関連する様々な技法及び適用は、一般に数多くの教科書及び文書に記載されている。これらには、Lemieux et al., 1998, Molecular Breeding 4:277-289; Schena and Davis. Parallel Analysis with Biological Chips. in PCR Methods Manual (eds. M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky); Schena and Davis, 1999, Genes, Genomes and Chips. In DNA Microarrays: A Practical Approach (ed. M. Schena), Oxford University Press, Oxford, UK, 1999); The Chipping Forecast (Nature Genetics special issue; January 1999 Supplement); Mark Schena (Ed.), Microarray Biochip Technology, (Eaton Publishing Company); Cortes, 2000, The Scientist 14(17):25; Gwynne and Page, Microarray analysis: the next revolution in molecular biology, Science, 1999, August 6; Eakins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218、及び様々なワールドワイドウェブサイトも挙げられる。
【０１２６】
アレイ技術は、一般に「一実験一遺伝子」ベースで機能し、低処理量であり遺伝子機能の「全体像」を正しく認識できない分子生物学の従来の方法に関する不利な点を克服する。現在、アレイ技術の主要な応用には、配列（遺伝子／遺伝子変異）の同定及び遺伝子の発現レベル（量）の決定が挙げられる。遺伝子発現プロファイリングは、随意にプロテオミクス技法と組み合わせてアレイ技術を利用し得る（Celis et al., 2000, FEBS Lett, 480(1):2-16; Lockhart and Winzeler, 2000, Nature 405(6788):827-836; Khan et al., 1999, 20(2):223-9）。アレイ技術の他の応用、例えば、遺伝子発見、癌研究（Marx, 2000, Science 289: 1670-1672; Scherf et al., 2000, Nat Genet 24(3):236-44; Ross et al., 2000, Nat Genet 2000, 24(3):227-35）、ＳＮＰ解析（Wang et al., 1998, Science 280(5366):1077-82）、創薬、薬理ゲノミクス、病気診断（例えば、マイクロフルイディクスデバイスを利用する：Chemical & Engineering News, February 22, 1999, 77(8):27-36）、毒性学（Rockett and Dix (2000), Xenobiotica 30(2):155-77; Afshari et al., 1999, Cancer Res 59(19):4759-60）、及びトキシコゲノミクス（機能的ゲノミクスと分子毒性学の複合型）も当技術分野では公知である。トキシコゲノミクスの目標は、毒物に対する毒性応答とそのような毒物に曝露される対象の遺伝子プロファイルの変化間の相関関係を見つけることである（Nuwaysir et al., 1999, Molecular Carcinogenesis 24:153-159）。
【０１２７】
本発明の関連では、アレイ技術は、例えば、Ａｘｌタンパク質の発現の解析において使用することが可能である。一実施形態では、アレイ技術を使用して、Ａｘｌ活性に対する候補化合物の効果をアッセイすることが可能である。
【０１２８】
一般に、試料のいかなるライブラリー又は集団も、前記ライブラリー又は集団のメンバーを空間的に分離することにより、アレイに規則正しく配置し得る。整列させるのに適したライブラリーには、核酸ライブラリー（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなどのライブラリーを含む）、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質ライブラリーの他にもとりわけリガンドライブラリー等の、任意の分子を含むライブラリーが挙げられる。したがって、本文書において「ライブラリー」に言及する場合、文脈が他の方法で指示しなければ、そのような言及はアレイの形態でのライブラリーへの言及を含むと解釈すべきである。
【０１２９】
試料（例えば、ライブラリーのメンバー）は、通常、前記試料の拡散及び混合を制限するために、固相、好ましくは固形基板に固定又は固定化される。好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合リガンドのライブラリーを調製し得る。特に、前記ライブラリーは、プラスチック及びガラスなどの膜及び非多孔性基板を含む実質的に平面の固相に固定化し得る。さらに、試料は好ましくは、インデクシング(indexing)（すなわち、特定の試料への参照又は接近）が促進されるように配置される。典型的には、試料は格子構造中のスポットとして貼り付けられる。一般的アッセイシステムは、この目的のために適合させ得る。例えば、アレイは、ウェル中複数の試料で又は各ウェル中単一試料のどちらかでマイクロプレートの表面に固定化し得る。さらに、固形基板は、ニトロセルロースなどの膜でもナイロン膜でもよい（例えば、ブロッティング実験において使用される膜）。代わりの基材には、ガラス又はシリカベースの基板が挙げられる。したがって、試料は、当技術分野で公知のいかなる適切な方法によっても、例えば、電荷相互作用により、又はウェルの壁若しくは底又は膜の表面への化学結合により固定化される。配置し固定する他の手段、例えば、ピペット操作、ドロップタッチ、圧電気法、インクジェットとバブルジェット技術、静電気応用などを使用し得る。シリコンベースチップの場合は、フォトリソグラフィーを利用して試料をチップ上に配置し固定し得る。
【０１３０】
試料は固体基板上に「スポット」されることにより配置され得、これは手動により、又は試料を付着させるロボット工学の利用により行い得る。一般に、アレイはマクロアレイ又はマイクロアレイと記載される場合があり、その違いは試料スポットのサイズである。マクロアレイは典型的には約３００ミクロン又はそれ以上の試料スポットサイズを含有し、既存のゲル及びブロットスキャナーにより容易に撮像し得る。マイクロアレイ中の試料スポットサイズは典型的には直径２００ミクロン未満であり、これらのアレイは通常数千のスポットを含有する。したがって、マイクロアレイは、特殊なロボット工学及び撮像装置を必要とする場合があり、これは特別注文製である必要があり得る。計測手段は、Cortese, 2000, The Scientist 14(11):26による概説に広く記載されている。
【０１３１】
ＤＮＡ分子の固定化されたライブラリーを作製するための技法は当技術分野では既に記載されている。一般的には、大半の先行技術の方法が、例えば、固形基材上の様々な別々の位置で配列の様々な並べ替えを構築するマスキング技法を使用して、一本鎖核酸分子ライブラリーを合成する方法を記載していた。米国特許第５，８３７，８３２号明細書は、大規模組込み技術に基づいてシリコン基材に固定化されるＤＮＡアレイを作製するための改良された方法を記載しており、この特許文献の内容は参照により本明細書に組み込まれている。特に、米国特許第５，８３７，８３２号明細書は、本発明の固定化ＤＮＡライブラリーを作製するために使用し得る基材上の空間的に定義された位置で特定の組のプローブを合成する「タイリング(tiling)」と呼ばれる戦略を記載している。米国特許第５，８３７，８３２号明細書は、以前の技法についての参考文献を提供しており、これらの技法も使用し得る。
【０１３２】
ペプチド（又はペプチド模倣剤）のアレイも、各異なるライブラリーメンバー（例えば、独特のペプチド配列）をアレイ中の別々の前定義された位置に置くような形で表面上で合成され得る。各ライブラリーメンバーの識別はアレイ中のその空間的位置により決定される。予定された分子（例えば、標的又はプローブ）と反応性ライブラリーメンバー間の結合相互作用が起こるアレイ中の位置が決定され、それによって空間的位置に基づいて反応性ライブラリーメンバーの配列を同定する。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号明細書、国際公開第９０／１５０７０号パンフレット及び国際公開第９２／１００９２号パンフレット；Fodor et al., 1991, Science 251:767; Dower and Fodor, 1991, Ann. Rep. Med. Chem. 26:271に記載されている。
【０１３３】
検出を支援するため、標的及びプローブは、容易に検出可能な任意のレポーター、例えば、蛍光、生物発光、リン光、放射性などのレポーターで標識され得る。そのようなレポーター、その検出、標的／プローブへのカップリング、などは本文書の別の場所で考察されている。プローブ及び標的の標識化は、Shalon et al., 1996, Genome Res 6(7):639-45でも開示されている。
【０１３４】
ＤＮＡアレイの特定の例には以下の：
フォーマットＩ：プローブｃＤＮＡ（約５００〜約５０００塩基長）は、ロボットスポッティングを使用してガラスなどの固体表面に固定化され、別々に又は混合物のどちらかで一組の標的に曝露される。この方法は、スタンフォード大学で開発されたと広くみなされてきた（Ekins and Chu, 1999, Trends in Biotechnology, 17:217-218）、
フォーマットII：オリゴヌクレオチド（約２０〜約２５ｍｅｒオリゴ）又はペプチド核酸（ＰＮＡ，peptide nucleic acid）プローブのアレイは、インサイチュ（チップ上）で又は従来の合成に続いてチップ上での固定化により合成される。前記アレイは、標識試料ＤＮＡに曝露され、ハイブリダイズされ、相補的配列の識別／量が決定される。そのようなＤＮＡチップは、GeneChip（登録商標）登録商標下でAffymetrix, inc.より販売されている、
が挙げられる。
【０１３５】
いくつかの市販されているマイクロアレイフォーマットの例は、例えば、Marshall and Hodgson, 1998, Nature Biotechnology 16(1):27-31に記載されている。
【０１３６】
データ解析は、アレイを含む実験の重要な部分でもある。マイクロアレイ実験の生データは典型的には画像であり、この画像は、列が例えば遺伝子を表し、カラムが例えば組織などの様々な試料又は実験条件を表し、各セル中の数が例えば特定の試料中の特定の遺伝子の発現レベルを特徴付ける遺伝子発現行列表に変換される必要がある。これらの行列は、根底にある生物学的過程についてのなにか知識を引き出すためには、さらに解析されなければならない。データ解析の方法（目的変数あり及び目的変数なしのデータ解析の他にも生物情報学アプローチを含む）は、Brazma and Vilo J, 2000, FEBS Lett 480(1):17-24に開示されている。
【０１３７】
上に開示されるように、タンパク質、ポリペプチド、などもアレイに固定化され得る。例えば、抗体は、タンパク質チップを使用するプロテオームのマイクロアレイ解析において使用されてきた（Borrebaeck CA, 2000, Immunol Today 21(8):379-82）。ポリペプチドアレイは、例えば、MacBeath and Schreiber, 2000, Science, 289(5485):1760-1763において概説されている。
【０１３８】
医薬組成物
追加の態様は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合される上記の方法のいずれかに従って同定される作用薬を含む医薬組成物に関する。
【０１３９】
別の態様は、
（ｉ）上記の方法のいずれかを使用して上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定すること、及び
（ii）前記作用薬を薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤と混合すること、
を含む組成物を調製する方法に関する。
【０１４０】
本発明のさらに別の態様は、増殖性障害、さらに好ましくは癌を治療するための薬物の調製における本発明の方法により同定される作用薬の使用に関する。
【０１４１】
本発明に従った使用のために、上の方法により同定される作用薬は、化合物又は生理的に許容される塩、エステル又は他の生理的に機能的なその誘導体を、１又は２以上の薬学的に許容される担体並びに随意に他の治療及び／若しくは予防成分と一緒に含む、医薬製剤として提示され得る。担体（複数可）は、前記製剤中のその他の成分と適合するという意味で許容されなければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。前記医薬組成物は、ヒト及び獣医学においてヒト又は動物使用を目的とし得る。
【０１４２】
本明細書に記載される医薬組成物の様々な異なる形態に適したそのような賦形剤の例は、"Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Wellerに見出され得る。
【０１４３】
治療用途に許容される担体又は希釈剤は医薬分野では周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) に記載されている。
【０１４４】
適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ゾルビトールなどが挙げられる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール及び水が挙げられる。
【０１４５】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選択肢は、意図される投与経路及び標準薬務に関して選択することが可能である。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はこれらに加えて、いかなる適切な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）、緩衝剤（複数可）、香味剤（複数可）、表面活性剤（複数可）、増粘剤（複数可）、保存剤（複数可）（抗酸化剤を含む）などでも、及び製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする目的で含まれる物質を含み得る。
【０１４６】
適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然の糖類、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータラクトース、コーン甘味料、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ガム、カルボキシメチルセルロース並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１４７】
適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１４８】
保存剤、安定化剤、染料及び香味剤でさえも医薬組成物中に提供され得る。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁剤も使用し得る。
【０１４９】
医薬製剤は、経口、局所的（経皮、頬側及び舌下を含む）、直腸又は非経口（皮下、皮内、筋肉内及び静脈内を含む）、経鼻並びに肺投与、例えば、吸入による、に適した製剤を含む。製剤は、必要に応じて、個別の投与量単位で都合よく提示され得、薬学の分野で周知の方法のうちのいずれによっても調製され得る。全ての方法が、活性化合物を液体担体又は微粉化固形担体又は両方と結合させ、次に必要ならば前記産物を所望の製剤に成形するステップを含む。
【０１５０】
担体が固体である経口投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは、それぞれが予定量の活性薬剤を含有するボーラス、カプセル又は錠剤などの単位用量製剤として提示される。錠剤は圧縮又は成形により作製され得、１又は２以上の副成分と一緒でもよい。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒などの流動性の形態で適切な機械で活性薬剤を圧縮することにより作製され得、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、平滑剤、表面活性剤又は分散剤と混合してもよい。成形錠剤は、活性薬剤を不活性液体希釈剤と成形することにより作製され得る。錠剤は被膜されてもよく、被膜されない場合は、刻み目を入れてもよい。カプセルは、活性薬剤を単独で又は１若しくは２以上の副成分と混合してカプセル殻に充填し、次に通常の方法でカプセル殻を密封することにより調製され得る。カシェー（cachets）は、活性薬剤がいかなる副成分（複数可）とでも一緒にライスペーパー包膜に密封されるカプセルに類似している。活性薬剤は分散性顆粒としても処方され得、この顆粒は例えば投与前に水に懸濁されても、食物に振りかけられてもよい。前記顆粒は、例えば、サシェー（sachet）に包装し得る。担体が液体である経口投与に適した製剤は、溶液又は水性若しくは非水性液体の懸濁液として、又は水中油型乳濁液として提示されてもよい。
【０１５１】
経口投与のための製剤には、活性薬剤が適当な放出制御マトリックスに処方される、又は適切な放出制御フィルムで被膜される徐放剤形、例えば、錠剤が挙げられる。そのような製剤は特に予防的使用に都合よくなり得る。
【０１５２】
担体が固体である直腸内投与に適した医薬製剤は、最も好ましくは単位用量坐薬として提示される。適切な担体には、ココアバター及び当技術分野で一般的に使用されている他の物質が挙げられる。坐薬は、活性薬剤と軟化又は溶融担体（複数可）を混合し、続いて冷却して型で成形することにより都合よく形成され得る。
【０１５３】
非経口投与に適した医薬製剤には、水性又は油性媒体中の活性薬剤の減菌溶液又は懸濁液が挙げられる。
【０１５４】
注射用調製物は、ボーラス注入又は持続点滴に適合させ得る。そのような調製物は、使用のために必要となるまで製剤の導入後密封される単位用量又は複数用量容器で都合よく提示される。代わりに、活性薬剤は、使用前は減菌無発熱物質水などの適切な媒体で構成されている粉末形状でよい。
【０１５５】
活性化合物は、長時間作用型デポー製剤としても処方され得、この製剤は筋肉内注射により、又は移植により、例えば、皮下に又は筋肉内に投与され得る。デポー製剤は、例えば、適切な重合体若しくは疎水性物質、又はイオン交換樹脂を含み得る。そのような長時間作用型製剤は、特に予防的使用に都合がよい。
【０１５６】
頬側口腔を介した肺投与に適した製剤は、活性化合物を含有し望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子がレシピエントの気管支樹に送達されるように提示される。
【０１５７】
１つの可能性として、そのような製剤は、適切には、例えば吸入装置で使用するためのゼラチンの貫通性カプセルで、又は代わりに、活性薬剤、適切な液状若しくは気体状推進剤並びに随意に界面活性剤及び／若しくは固形希釈剤などの他の成分を含む自己推進製剤として都合よく提示され得る細かく砕かれた粉末の形状である。適切な液状推進剤には、プロパン及びクロロフルオロカーボンが挙げられ、適切な気体状推進剤には二酸化炭素が挙げられる。活性薬剤が溶液又は懸濁液の液滴の形状で分散している自己推進製剤を用いてもよい。
【０１５８】
そのような自己推進製剤は当技術分野で公知の自己推進製剤と類似しており、確立した手順により調製し得る。適切には、自己推進製剤は、望ましいスプレー特徴を有する手動操作可能な又は自動的に機能するバルブ付きで提供される容器で提示され、有利には前記バルブは、その操作ごとに一定の容量、例えば、２５〜１００マイクロリットルを送達する定量型である。
【０１５９】
追加の可能性として、活性薬剤は、加速気流又は超音波攪拌を用いて吸入のための細かい液滴のミストを作製するのに用いられる噴霧器又はネブライザーにおける使用のための溶液又は懸濁液の形状でよい。
【０１６０】
鼻腔投与に適した製剤には、肺投与のための上記の調製物に一般に類似する調製物が挙げられる。そのような製剤は、調剤されると、望ましくは鼻腔における保持を可能にする１０〜２００ミクロンの範囲の粒子径を有するはずであり、これは、必要に応じて、適切な粒子サイズの粉末の使用又は適当なバルブの選択により実現し得る。他の適切な製剤には、鼻端のすぐ近くまで持ち上げられる容器から鼻道を通じた急速吸入による投与のための２０〜５００ミクロンの範囲の粒子径を有する粗粒子、及び水性若しくは油性溶液又は懸濁液中の活性薬剤の０．２〜５％ｗ／ｖを含む点鼻薬が挙げられる。
【０１６１】
薬学的に許容される担体は当業者には周知であり、０．１Ｍ及び好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液又は０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、そのような薬学的に許容される担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液及び乳濁液でよい。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液又は懸濁液が挙げられる。非経口媒体には、塩化ナトリウム水溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は固定油が挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等などの保存剤及び他の添加剤も存在し得る。
【０１６２】
局所製剤に適した製剤は、例えば、ゲル、クリーム又は軟膏として提供され得る。そのような調製物は、例えば、創傷若しくは潰瘍の表面に直接広げられて、又は治療される領域に及び全体に適用され得る包帯、ガーゼ、メッシュ若しくは同様のものなどの適切な支持物上に保持されて、創傷又は潰瘍に適用され得る。
【０１６３】
治療される部位、例えば、創傷又は潰瘍上に直接噴霧する又は振りかけることが可能な液体又は粉末製剤も提供され得る。代わりに、包帯、ガーゼ、メッシュ若しくは同様のものなどの担体は製剤を噴霧される又は振りかけられ、次に治療される部位に適用されることが可能である。
【０１６４】
本発明の追加の態様に従って、活性化合物（複数可）を例えば混合により担体と併せることを含む、上記の医薬又は獣医学組成物の調製のための方法が提供される。
【０１６５】
一般に、製剤は、活性薬剤を液体担体又は微粉化された固体担体又は両方と均一に及び密に併せ、次に必要であれば製品を成形することにより調製される。本発明は、作用薬を薬学的に又は獣医学的に許容される担体又は媒体と併せることを含む、医薬組成物を調製するための方法にまで及ぶ。
【０１６６】
治療的適応
別の態様では、本発明は、Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞及び他の細胞の増殖及び拡散を阻害する方法に関する。
【０１６７】
本明細書で使用される「上皮間葉転換を阻害する」とは、対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしている及び既に起こした細胞の数の減少のことである。
【０１６８】
好ましい一実施形態では、それを必要とする対象は癌に罹っている。
【０１６９】
好ましくは、対象が癌に罹っている場合、本発明の方法は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしている腫瘍細胞を、前記癌細胞が転移することができないような程度にまで阻害する、すなわち、前記阻害は、前記癌が転移性癌に成長しない、又は既に転移した細胞が身体内の遠隔部位で増殖することができない程度のものである。
【０１７０】
極めて好ましい一実施形態では、本発明の方法は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を完了している細胞が身体の遠隔部位まで拡散するのを妨げる、すなわち、前記阻害は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）に依存している転移性細胞の拡散が排除されている程度のものである。
【０１７１】
本発明の別の態様は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することにより、腫瘍細胞が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こすのを阻害することを含む、それを必要とする対象において転移性癌を治療するための方法に関する。
【０１７２】
本明細書で使用されるように、用語「Ａｘｌ阻害剤」とは、Ａｘｌ、Ａｘｌシグナル伝達経路又はＡｘｌシグナル伝達経路のいずれか１若しくは２以上の成分を阻害することができる分子のことである。一実施形態では、前記分子はＡｘｌ又はＡｘｌタンパク質発現を減少する又は妨げることができることになる。
【０１７３】
特に好ましい一実施形態では、Ａｘｌ阻害剤は抗Ａｘｌ抗体である。
【０１７４】
特に好ましい一実施形態では、Ａｘｌ阻害剤は小分子キナーゼ阻害剤である。そのような小分子阻害剤の例は、Holland et al. R428, a selective small molecule inhibitor of AxI kinase, blocks tumour spread and prolongs survival in models of metastatic cancer. Cancer Research; 70(4), February 15, 2010に記載されているＲ４２８である。
【０１７５】
特に好ましい一実施形態では、対象は哺乳動物、さらに好ましくはヒトである。
【０１７６】
好ましくは、癌は乳癌、前立腺癌、グリオーマ、肺癌、膵臓癌である。
【０１７７】
転移は癌関連死亡率の９０％を占める。腫瘍細胞転移を可能にする分子機構を理解することは主要な健康問題である。本発明者らは、受容体型チロシンキナーゼＡｘｌが原発性乳癌のマンモグラフィー検出後の、患者の全生存率が低いことの強力な予想因子であることを実証した。
【０１７８】
転移性乳癌細胞は、侵襲性悪性表現型を維持し異なる微小環境において乳腺腫瘍を形成するためにはＡｘｌ発現を必要とする。乳房上皮細胞において上皮間葉転換（ＥＭＴ）が誘導されると、Ａｘｌ発現が上方調節されてそのリガンドであるＧａｓ６との自己分泌シグナル伝達ループを生成する。Ａｘｌ発現を阻害すれば、乳腺の同所性部位からリンパ節及び主要臓器への転移性拡散が妨げられる。したがって、初期の悪性移行中のＡｘｌの不適切なＥＭＴ依存性活性化は、転移を促進し全体的患者生存に悪影響を与え得る。したがって、確立した治療戦略を介してＡｘｌシグナル伝達を崩壊させることは、乳癌などの細胞増殖性障害並びに細胞運動性及び細胞生存媒介障害に対する処置の治療的開発への胸躍らせる道筋を表す。
【０１７９】
本発明の別の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８０】
本発明のさらに別の態様は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）に依存している腫瘍細胞を阻害することにより転移性癌を治療するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８１】
別の態様では、本発明は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象における転移性癌又は末期癌を治療する方法に関する。
【０１８２】
別の態様では、本発明は、転移性癌又は末期癌を治療するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８３】
別の態様では、本発明は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象において転移を阻害する方法に関する。
【０１８４】
別の態様は、対象にＡｘｌ阻害剤を投与することを含む、癌に罹っている対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害する方法に関する。
【０１８５】
さらに別の態様は、癌に罹っている対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害するための薬物の調製におけるＡｘｌ阻害剤の使用に関する。
【０１８６】
好ましくは、Ａｘｌ阻害剤は抗Ａｘｌ抗体又は小分子阻害剤である。
【０１８７】
投与
本発明の医薬組成物は、直腸、鼻腔、気管支内、局所的（頬側及び舌下を含む）、膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、動脈内及び皮内を含む）、腹腔内又はクモ膜下腔内投与に適合され得る。好ましくは、製剤は経口投与製剤である。製剤は、単位投与量の形態で、すなわち、単位用量又は複数の単位用量若しくは単位用量のサブユニットを含有する別々の部分の形態で都合よく提示され得る。例として、製剤は、錠剤及び徐放カプセルの形状であり得るし、薬学の分野で周知のいかなる方法によっても調製し得る。
【０１８８】
本発明における経口投与のための製剤は、それぞれが予定量の活性薬剤を含有するカプセル、ゲルーレ（gellules）、ドロップ、カシェー、ピル若しくは錠剤として；粉剤若しくは顆粒として；水溶液若しくは非水性溶液中の活性薬剤の溶液、乳濁液若しくは懸濁液として；又は水中油型の液体乳濁液若しくは油中水滴型液体乳濁液として；又はボーラスとして、等などの個別単位として提示し得る。好ましくは、これらの組成物は用量当たり１〜２５０ｍｇ、さらに好ましくは１０〜１００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１８９】
経口投与（例えば、錠剤及びカプセル）のための組成物では、用語「許容される担体」には、一般的賦形剤、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖及びデンプンなどの媒体；充填剤及び担体、例えば、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、ショ糖、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、第二リン酸カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸；並びにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及び他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロールステアリン酸、シリコン油、タルクワックス、油及びコロイドシリカなどの潤滑剤が挙げられる。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料及び同類のものなどの香味剤も使用することが可能である。着色剤を添加して剤形を容易に識別できるようにすることが望ましい場合がある。錠剤は、当技術分野で周知の方法によって被膜されてもよい。
【０１９０】
錠剤は、１又は２以上の副成分と一緒に圧縮又は成形により作製してもよい。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤又は分散剤と混合して、粉末又は顆粒などの流動性の形状の活性薬物を適切な機械で圧縮することにより調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤に浸した粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することにより作製し得る。錠剤は、被膜される又は刻み目を入れてもよいし、活性成分の徐放又は制御放出を提供するように処方されてもよい。
【０１９１】
経口投与に適した他の製剤には、通常はショ糖とアカシア又はトラガントである香り付けされた基剤に活性薬剤を含むトローチ；ゼラチンとグリセリン、又はショ糖とアカシアなどの不活性基剤に活性薬剤を含むパステル剤；及び適切な液体担体に活性薬剤を含む口腔洗浄薬が挙げられる。
【０１９２】
他の投与形態は、静脈内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、皮下に、皮内に、腹腔内に又は筋肉内に注射され得る、及び減菌又は減菌可能溶液から調製される溶液又は乳濁液を含む。注射剤型は典型的には、用量あたり１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２５０ｍｇの活性成分を含有する。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、坐薬、ペッサリー、懸濁液、乳濁液、ローション、軟膏、クリーム、ジェル、スプレー、溶液又は散布剤の形状でもよい。
【０１９４】
経皮投与の代わりの手段は、皮膚パッチの使用による。例えば、活性成分は、ポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性乳濁液からなるクリームに組み込むことが可能である。活性成分は、白蝋又は白色ワセリン基剤と、必要とされ得るような安定化剤及び保存剤とからなる軟膏に、１〜１０重量％の濃度で組み込むことも可能である。
【０１９５】
投与量
当業者であれば、過度の実験なしで対象に投与する即席組成物のうちの１つの適切な用量を容易に決定することができる。典型的には、医者が個々の患者に最も適していることになる実際の投与量を決定することになり、前記投与量は、用いられる特定の作用薬の活性、その作用薬の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄速度、合剤、特定の病状の重症度並びに個々の受けている治療を含む様々な要因によって決まることになる。本明細書に開示される投与量は平均的症例の例である。当然のことながら、もっと高い又はもっと低い投与量のほうがふさわしい個々の例が存在することがあり、そのような例は本発明の範囲内である。
【０１９６】
本発明に従えば、有効量の作用薬がＡｘｌを阻害するために投与され得る。当然のことながら、この投与量は作用薬の投与の種類に応じてさらに修正されることになる。例えば、救急治療のための「有効量」を実現するためには、非経口投与が好ましい。５％ブドウ糖の水又は生理食塩水中の化合物、又は適切な賦形剤を有する類似の製剤の静脈内注射が最も有効であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。典型的には、キナーゼを阻害するのに有効な濃度で血漿中の薬物の濃度を維持するように、非経口投与量は約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇになる。前記作用薬は、約０．４〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日の日総投与量を実現するレベルで毎日１〜４回投与され得る。治療的に有効である活性薬剤の正確な量、及びそのような作用薬が最もうまく投与される経路は、前記作用薬の血液レベルと治療効果があるために必要とされる濃度を比較することにより、当業者により容易に決定される。
【０１９７】
本発明の作用薬は、薬物の濃度が本明細書に開示される治療指標のうちの１又は２以上を達成するのに十分であるような形でも患者に経口投与され得る。典型的には、前記作用薬を含有する医薬組成物は、患者の病状と合致するように約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの経口量で投与される。好ましくは、経口量は約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇになると考えられる。
【０１９８】
本発明の作用薬は、所与の薬理学的効果を有するのに必要とされる作用薬の濃度を決定するためにいくつかの生物学的アッセイのうちの１つにおいて試験され得る。
【０１９９】
パーツのキット
本発明の別の態様は、抗Ａｘｌ抗体を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【０２００】
本発明のさらに別の態様は、Ａｘｌに対する核酸プローブを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【０２０１】
本発明のさらに別の態様は、Ａｘｌに対する少なくとも１つのＱＰＣＲプライマーを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキットに関する。
【０２０２】
本発明の追加の態様は、上記の方法のいずれかにおける上に定義されるキットの使用に関する。
【０２０３】
診断及び予後
本発明は、特にＡｘｌ阻害剤を用いて治療されている個人において、増殖活性により特徴付けられる疾患の診断又は予後におけるバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【０２０４】
本明細書で使用されるように、用語「予後法」は、疾患、特に癌と診断されたヒト又は動物の疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。さらに具体的には、所望の癌には、乳癌、肺癌、胃癌、頭頚部癌、結腸直腸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌及び前立腺癌並びに白血病が挙げられる。
【０２０５】
本明細書で使用される用語「診断法」は、ヒト又は動物の中又は表面における癌の存在又は種類の決定を可能にする方法を意味する。適切には、マーカーがあれば、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療の成功を評価することが可能になる。上で考察したように、適切な診断法は、例えば、ＱＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブその他などの本明細書で同定される遺伝子のいずれかに向けられるプローブを含む。
【０２０６】
本明細書で使用される用語「予後法」は、対象が特定の作用薬／投薬計画を用いた治療に対して感受性である又は応答性である可能性の決定を可能にする方法を意味する。そのような予後法は、特定の治療計画の可能性のある結果、例えば、対象が前記治療に応答する可能性に関する情報、並びに／又は個人が特定の治療計画内でどれほど積極的な治療を受けたらよいのか及び／若しくは個人が放射線／化学療法などの従来の治療法を用いてどれほど積極的な治療を受けたらよいのかに関する情報を提供する。したがって、本明細書に記載される予後法は、個別化医療の分野で重要な適用を有する。
【０２０７】
したがって、好ましい一実施形態は、個別化医療適用における上記のバイオマーカーの使用に関する。
【０２０８】
好ましい一実施形態では、個別化医療適用は、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性である又は応答性であるのかどうかを決定することを目的とする。
【０２０９】
好ましい一実施形態では、個別化医療適用は、対象が特に転移性癌にかかりやすいかどうかを決定することを目的とする。
【０２１０】
本発明の別の態様は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性かどうかを決定するための予後法に関する。
【０２１１】
本発明の別の態様は、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性である又は応答性であるのかどうかを決定するための予後薬剤中のバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用に関する。
【０２１２】
本発明の別の態様は、対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、対象が特に転移性癌にかかりやすいかどうかを決定するための予後法に関する。
【０２１３】
好ましくは、上記の予後法は、
（ｉ）前記対象から試料を得るステップと、
（ii）前記試料におけるＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、対照試料に対するＡｘｌ発現の上方調節が、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対する感受性及び転移性癌に罹る増加した可能性を示すステップと、
を含む。
【０２１４】
明細書全体を通じて、好ましくは本明細書に記載される方法はエクスビボで実施される。
【０２１５】
好ましくは、試料はタンパク質解析により、さらに好ましくは、ＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ、フローサイトメトリー、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ又は２−Ｄ ＰＡＧＥにより解析される。
【０２１６】
本発明は、以下の非限定的実施例により、及び以下の図の参照によりさらに例証される。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】Ａｘｌ発現が乳癌生存率に対する負の予後因子であることを示す図である。（Ａ）免疫化学的に弱い発現（６０％）及び強いＡｘｌ発現。（Ｂ）８年間の臨床的追跡のカプランマイヤー分析。（Ｃ）多変量解析。（Ｄ）原発性及び転移性ヒト乳癌のマッチドペア（ｎ＝１６）におけるＡｘｌ発現：原発性腫瘍は左側（上．Ａｘｌ陰性、下．Ａｘｌ陽性）、転移は右側（上．肝臓、下．骨）。Ａｘｌ発現は、対応する原発性腫瘍と比べた場合転移のほうが強い傾向であった（ｐ＝０．１１、マクニマーの検定）。
【図２】Ａｘｌが乳癌細胞侵襲性に必要であることを示す図である。エピ対立形質ＭＢ−ＭＤＡ−２３１乳癌細胞系列におけるＡｘｌ発現の（Ａ）ＦＡＣＳ及び（Ｂ）ウェスタンブロット解析。（Ｃ）Ａｘｌはリン酸化されている。血清（Ｄ）又はＳＤＦ−１（Ｅ）により誘導されるマトリゲル浸潤アッセイのエピ対立形質解析。ＭＢ−ＭＤＡ−２３１／ｓｈＬｕｃ（上パネル）及びＭＢ−ＭＤＡ−２３１／ｓｈＡｘｌ２（下パネル）の３Ｄマトリゲル解析（Ｆ、Ｇ）。
【図３】乳房上皮細胞においてＡｘｌ活性がＥＭＴ誘導因子により上方調節されていることを示す図である。（Ａ）Ｔｗｉｓｔを安定的に発現するＭＣＦ１０ａ細胞株でのＡｘｌの表面レベルのフローサイトメトリー解析。（Ｂ）対照（ｗｔ）及びＴｗｉｓｔ発現ＭＣＦ１０ａ細胞からの抽出物は、上皮（Ｅ−カドヘリン、β−カテニン）及び間葉（Ｎ−カドヘリン）マーカーの変化について解析された。条件培地は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＧａｓ６に対する抗体を使用するイムノブロッティング法により解析された。（Ｃ）Ｔｗｉｓｔ、Ｚｅｂ２、Ｓｌｕｇ、Ｓｎａｉｌをコードするレトロウイルスベクター又はベクター対照（ＧＦＰ）で形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞は、Ａｘｌ表面発現（左）及び幾何平均蛍光（右）についてフローサイトメトリーにより解析された。（Ｄ）Ｔｗｉｓｔ、Ｚｅｂ２、Ｓｌｕｇ又はＳｎａｉｌレトロウイルスベクターで形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞からの抽出物は、上皮（Ｅ−カドヘリン、β−カテニン）及び間葉（Ｎ−カドヘリン、ビメンチン）マーカーの変化についてイムノブロッティング法により解析された。（Ｅ）播種後７２時間目のＴｗｉｓｔ、Ｚｅｂ２、Ｓｌｕｇ又はＳｎａｉｌレトロウイルスベクターで形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞の形態。
【図４】組織操作された乳腺腫瘍はＡｘｌ発現を必要とすることを示す図である。（Ａ）ＮＯＤＳＣＩＤマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ腫瘍組織操作移植片のインビボ画像。時間的腫瘍増殖は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞からルシフェラーゼ生物発光のインビボ光学画像によりモニターされた（ｉ）。腫瘍細胞数（総光粒子）及び放射状浸潤（シグナル径）測定の程度は対照移植片（実線）からであり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２を発現する細胞移植片（破線）は、ポリ乳酸組織操作スキャフォールド内の腫瘍増殖及びコロニー形成のＡｘｌ依存性を示している（ii）。切除時の両側スキャフォールドの外観（iii）。移植後２８日目の抗ヒトＡｘｌを用いた組織操作腫瘍の免疫組織化学解析（左パネル、ベクター対照；右パネル、ｓｈＡｘｌ２）（iv）。野生型対照（左パネル）及びｓｈＡｘｌ２発現細胞（右パネル）を用いた腫瘍組織操作移植片は、抗ヒトＡｘｌを用いた免疫組織化学により解析された（Ｖ）。黒色四角形はコロニー形成及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞の放射状拡散の境界を画定している。対照と比べて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（ペアードｔ検定）。Ｎ＝６マウス／群。（Ｂ）初代ヒト微小血管細胞（ＥＣ）、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ Ｌｕｃ細胞を含む三細胞移植片の時間的インビボ画像（ｉ）。組織操作脈管構造の存在下で解析された対照（実線）及びｓｈＡｘｌ２発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞移植片（破線）における腫瘍増殖（総光粒子）及び放射状拡散（直径）測定（ii）。切除された腫瘍（２８日目）は操作されたヒト微小血管により高度に血管新生化されている（iii）。免疫組織化学解析は、操作された抗ヒトＣＤ３１染色血管が開存性及び灌流を示す内腔赤血球（挿入図）を含有することを示している（iv：左パネル．ベクター対照；右パネル．ｓｈＡｘｌ−２）。対照と比べて＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５（ペアードｔ検定）。Ｎ＝７マウス／群。スキャフォールド内血管径（左）は影響を受けておらず、微小血管密度（右）はｓｈＡｘｌ２発現により阻害される組織操作ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍においてわずかに増強されている。
【図５】インビボエピ対立形質解析が乳腺腫瘍形成に必要とされる明確なＡｘｌ発現閾値を明らかにしていることを示す図である。（Ａ）無効なＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈＡｘｌ２７９）対照と比べたＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ ｓｈＡｘｌ２７８（ｉ）、ｓｈＡｘｌ２８０（ii）及びｓｈＡｘｌ２（iii）による段階的Ａｘｌ発現を含むＮＯＤ／ＳＣＩＤ ！２ｍｎｕｌｌマウスにおける皮下エピ対立形質ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ異種移植片からの生物発光の時間的インビボ画像。（Ｃ）棒グラフは、腫瘍の光学画像解析に基づく光粒子及び腫瘍径の平均変化を示している。エピ対立形質ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ−Ｌｕｃ腫瘍増殖（総光粒子）及び放射状浸潤（シグナル径）測定はｓｈＡｘｌ２７９（無効なｓｈＲＮＡ）に合わせて正規化されていた（ii）。（Ｄ）Ａｘｌノックダウンに対してプロットされた腫瘍増殖（２８日測定）は治療閾値（８０％減少発現）を明らかにしている。対照と比べた＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５（ペアードｔ検定）。Ｎ＝６マウス／群。
【図６】Ａｘｌが乳癌細胞の転移に必要であることを示す図である。（Ａ）インビボモニターされた原発性腫瘍及び転移、Ｉ、同所性増殖（上パネル）及び時間をかけたリンパ節への転移（下パネル）。II、野生型（実線）及びＡｘｌ ＲＮＡｉ移植片（破線）のインビボ光学画像（GE Explore Optix）によりモニターされた原発性腫瘍増殖。（Ｂ）異なる臓器における転移の検出。（Ｃ）乳癌細胞のエクスビボ検出。Ｉ、切除された臓器の画像が示されている。II、同一組織の組織学的解析は、異なる臓器への転移を確証した（矢印）。（Ｄ）対照（ベクター）とｓｈＡｘｌ２同所的に注射されたマウス間のマンホイットニー（ログランク）検定は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ／ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２坦腫瘍マウスにおける生存の増加を示している（Ｐ＝０．０１３）。
【図７】ＡｘｌがＢＡＬＢ／ｃマウスにおける同系乳癌細胞の免疫後応答再発及び転移に不可欠であることを示す図である。（Ａ）マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＡｘｌ２）又はヒトＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈＡｘｌ２７９）を発現している４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃマウス乳癌細胞は、マウスＡｘｌ表面発現又はアイソタイプ対照についてフローサイトメトリーにより解析された。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−ＬｕｃｓｈｍＡｘｌ２）又は陰性対照ヒト特異的ｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２７９）のどちらかを発現している同所的（乳腺脂肪体）注入４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞からの生物発光の時間的インビボ画像（ｉ）。８週間にわたる対照（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２７９、実線）及びＡｘｌノックダウン（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２、灰色線）注入ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける全身生物発光（総光粒子）の定量化（ii）。＊ｐ＜０．０５（ｔ−検定）、Ｎ＝７マウス／群。（Ｃ）対照又はＡｘｌノックダウン坦腫瘍ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の切除臓器における４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞のエクスビボ生物発光検出によりモニターされた異なる臓器への自然転移（同所的移植８週間後）の調査。
【図８】ベクターＬ３８３ ｐＣＳＩ Ｐｕｒｏ２ＡＧＦＰ２ＡＬｕｃ２の配列を示す図である。
【図９Ａ】ＧＦＰの同時発現を使用して解析された、Ｓｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ（ｐＢＡＢＥ ｐｕｒｏ Ｈ−Ｒａｓ Ｖ１２、Addgene製）構築物で形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。Ｈａ−Ｒａｓ発現は４８時間のピューロマイシン処置により選択された。ＭＣＦ１０ａ細胞におけるＳｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現により、癌幹細胞マーカーＣＤ４４の表面発現が激しく増加した。
【図９Ｂ】Ｌｓｕｇ、ＲａｓをコードするＭＣＦ１０ａ細胞におけるＡｘｌ表面発現を示す図である。Ａｘｌ表面発現は、Ｓｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ誘導ＥＭＴの両方におけるＣＤ４４及び間葉形質の存在と相関している。
【図９Ｃ】ＣＤ４４高（ＣＤ４４＋）及び低（ＣＤ４４−）ＣＤ４４発現亜集団についてＦＡＣＳにより分類される播種７２時間後のＳｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞の間葉形態を示す図である。ＣＤ４４−細胞は、上皮形態を示しており、ＣＤ４４＋ＭＣＦ１０細胞は細長い間葉形態を示している。
【図９Ｄ】Ｓｌｕｇ、Ｒａｓをコードするレトロウイルスベクターで形質導入されたＣＤ４４−及びＣＤ４４＋ＭＣＦ１０ａ細胞のウェスタンブロット解析を示す図である。ＣＤ４４−ＭＣＦ１０ａ細胞は上皮接合部及び細胞骨格タンパク質発現を保持していた。これとは対照的に、ＣＤ４４＋細胞は強い間葉マーカー発現（ビメンチン、Ｎ−カドヘリン）及びＥ−カドヘリンの消失を示しており、ＥＭＴを実証していた。
【図９Ｅ】３−ＤマトリゲルにおけるＣＤ４４＋及びＣＤ４４−Ｓｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞の増殖を示す図である。ＣＤ４４＋、Ａｘｌ発現ＭＣＦ１０ａ細胞は侵襲性であり、間葉表現型と一致している。
【図１０】ＭＣＦ１０ａ細胞が、Ｓｌｕｇ−及びＳｎａｉｌ−誘導Ａｘｌ発現時に細胞関連になる（下、抗Ｇａｓ６、フローサイトメトリー解析）Ｇａｓ６を構成的に発現し（上、ウェスタンブロット、全ライセート）、分泌する（中、ウェスタンブロット、条件培地）ことを示す図である。
【図１１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＡｘｌリガンドのＧａｓ６を構成的に発現することを示す図である（上、ウェスタンブロット、優勢的に細胞関連である全ライセート；中、ウェスタンブロット、条件培地；下、抗Ｇａｓ６フローサイトメトリー解析）。Ａｘｌノックダウンは細胞関連Ｇａｓ６を減少させ、全発現に影響を与えることなく条件培地（Ｇａｓ６＊）においてレベルが増加する。［実施例］
【０２１８】
材料及び方法
プラスミド及び抗体
ｓｈＲＮＡは全て、レトロウイルス感染を介してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を形質転換するために使用されるレトロウイルスベクターＲＲＩ−Ｒｅｄ／Ｌ０８７（Genbank: EU424173）のＬＴＲにおいて改変ヒトＵ６プロモーターから発現された。ＲＲＩ−ＲｅｄはＰｕｒｏ２ＡｍＲｅｄ１も発現し、首尾よく形質転換された細胞においてピューロマイシン耐性及び赤色蛍光を生じる。全てのＡｘｌ ｃＤＮＡヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ： ＢＣ０３２２２９のように付番される。
【０２１９】
以下の配列が使用された：Ａｘｌ２；（ヘアピンは小文字）
GACATCCTCTTTCTCCTGCGAAGCCCATctggtcATGGGCTTCGCAGGAGAAAGAGGATGTC、shAxl278;
ACGGGTCTCCTTCTTTCGCCGttggatccctggtcggatccaaCGGCGAAAGAAGGAGACCCG、shAxl279;
GCTTCAGGCGATTTCCCCGGCGttggatccctggtcggatccaaCGCCGGGGAAATCGCCTGAAGC、shAxl280;
ATGCACGCCCAGCCGCACAGCGttggatccctggtcggatccaaCGCTGTGCGGCTGGGCGTGCAT shLuc;
GATTATGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGctggtcCCGGATTGTTTACATAACCGGACATAATC。
【０２２０】
レトロウイルス発現ベクターＬ３８３ ｐＣＳＩ Ｐｕｒｏ２ＡＧＦＰ２ＡＬｕｃ２（図８参照）は、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ＥＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼのコード配列をＣＲＵ５−レトロウイルス発現ベクターにクローニングすることにより数段階で作製された（Blo et al., 2007）。各オープンリーディングフレームは、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ領域（ＸＸＳＧＬＲＳＧＱＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）をコードするリンカーにより隣から分離された。この配列は同時翻訳的に切断され、およそ化学量論的量の各タンパク質が産生される（Lorens 2004）。ｈＳｎａｉｌ、ｈＳｌｕｇ及びｈＺＥＢ２を発現するプラスミドは、それぞれ構築物ＢＣ０１２９１０、ＢＣ０１５８９５及びＢＣ０６０８１９（Open Biosystems社製）由来の適切な断片をＣＲＵ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰレトロウイルスベクターにクローニングすることにより構築された（Lorens et al 2000）。ヒトＡｘｌに対する２つの抗体；マウスモノクローナル抗ヒトＡｘｌ（MAB154, R&D Systems社製）及びヤギ抗ヒトＡｘｌ（M-20, Santa Cruz社製）が使用された。さらに、以下の抗体；ウサギ抗ヒトｐＡｘｌ（Y779, R&D社製）、ラット抗ヒトＳｎａｉｌ（SN9H2, Cell Signaling社製）、マウス抗ヒトＳｌｕｇ（L40Cb, Cell Signaling社製）、ウサギ抗ヒトＥ−カドヘリン（24E10, Cell Signaling社製）、ウサギ抗ヒトＮ−カドヘリン（ab18203, Abcam社製）、アクチン、マウス抗ヒトｂ−カテニン（L54E2, Cell Signaling社製）、マウス抗ヒトＧａｓ６（R&D Systems社製）、ウサギ抗ヒトＴｗｉｓｔ（Twist2C1a, Abcam社製）が用いられた。
【０２２１】
細胞培養、レトロウイルス形質導入及び細胞増殖アッセイ
全細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養された。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａ細胞（Dr. Gary Nolan, Stanford）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房上皮癌細胞（米国細胞培養保存機関（American Type Culture Collection）, Rockville, MD）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ，human dermal microvascular endothelial cell）及び肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ，pulmonary artery smooth muscle cell）（Cambrex社製, Walkersville, MD, USA）は、既に記載された通りに維持された（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。クローン細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＤＨ３Ｌ２Ｎ（Xenogen Corporation社製, Alameda, CA, USA）は、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン及び１％ピルビン酸ナトリウムを補充されたＥＢＳＳ（アールズ平衡塩溶液）ＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地を有する最小必須培地において培養された。Ｐｈｏｅｎｉｘ Ａ細胞は、リン酸カルシウム法を使用してトランスフェクトされた（Swift, 1999）。トランスフェクションの約３０時間後、培地は細胞が感染されるように、１０％ＦＢＳを補充された増殖培地に変えられた。感染上清はトランスフェクションの約４８時間後に収集された。標的細胞は、一晩５ｍｇ／ｍｌ硫酸プロタミンを含有する上清に曝露された。感染された細胞は、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いて選択された。細胞増殖アッセイは、Promega社製のＭＴＳアッセイを使用して対照細胞株と比べた異なるＡｘｌノックダウン細胞の増殖能を解析するために実施された。細胞は、未処理の又は２０μｌコラーゲン（ラットテイル由来、Roche社製）、フィブロネクチン（Sigma社製）若しくはマトリゲル（BD Biosciences社製）のいずれかで被膜された９６ウェル組織培養プレートに播種された。１００μｌ培地中２０００細胞が９６ウェルプレートに三通り播種され、Promega社製のＭＴＳアッセイを製造業者の使用説明書に従って使用して２４時間ごとにアッセイされた。
【０２２２】
免疫染色、フローサイトメトリー及び細胞選別
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は標準手順を使用してトリプシン処理され、室温で４０分間、最終濃度PBS−０．２％BSA中５ｍｇ／ｍｌの抗Ａｘｌ（#MAB154, R&D Systems社製）で染色する前に、PBS−０．２％BSA中で洗浄された。細胞はPBS−０．２％BSA中で２回洗浄され、暗所中室温で３０分間、最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌの二次抗体（ヤギ抗マウスＡＰＣ（アロフィコシアニン，Allophycocyanin（Allophyocyanin））、架橋されている、Molecular Probes））と一緒にインキュベートされた。細胞はPBS−２％BSAで２回洗浄され、FacsCalibur Flow Cytometer（BD Biosciences社製）上での解析前に３００ｍｌのPBS−０．２％BSA中に再懸濁された。データ解析は、FlowJo software（Tree Star, Inc.社製, Ashland, OR, USA）を使用して実施された。高レベルのＧＦＰ、ＲＦＰ及び低Ａｘｌ（ｓｈＲＮＡ）を発現している細胞は、安定した均一な細胞集団を樹立するためにFACS Aria SORPによりレーザー４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、６３８ｎｍ及び４０７ｎｍを用いて単離された。
【０２２３】
タンパク質抽出物、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティング法及び免疫沈降法
細胞は、プロテアーゼ阻害剤（Complete Mini, EDTA-free, Roche社製 #13457200）及び０．２ｍＭ ＰＭＳＦで補充されたＲＩＰＡ緩衝液（１％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）を有するPBS、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）に溶解された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法は、標準手順に従って実施された。免疫沈降法では、細胞は、プロテアーゼ阻害剤及びＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche社製）で補充されたＮＰ−４０緩衝液（１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ Tris ｐＨ７．４、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に溶解された。抽出物は４０℃で１時間、ｐｒｏｔＡ／Ｇビーズに結合された抗体と一緒にインキュベートされ、前記ビーズは溶出前にＮＰ−４０緩衝液で４回洗浄された。
【０２２４】
浸潤アッセイ及び３Ｄマトリゲルアッセイ
ボイデンチャンバー化学浸潤アッセイ（Albini et al 2004）は、Becton Dickinson（BDFalcon細胞培養インサート（８μｍ））、FalconマルチウェルTM 24ウェルプレート及びＢＤからの増殖因子減少マトリゲルを使用して実施された。インサートは、インサートごとに最終濃度３０μｇマトリゲルまで無血清培地希釈されたマトリゲルを用いて内部に被膜された。マトリゲル作業は、３７℃で３０分間の凝固まで４℃で操作される。５×１０５細胞が０．１％BSAを有する無血清細胞培地に再懸濁され、各インサート上に添加された。ＦＢＳ濃縮細胞培地は走化性因子として機能する。３７℃、５％ＣＯ２での２０時間インキュベーション後、チャンバー内部の細胞は綿棒により取り除かれた。膜の反対側の細胞は固定され、次に、ＤＡＰＩで染色された。写真は蛍光顕微鏡を使用して撮影され、細胞はImageJ（http://rsb.info.nih.gov/nih-imageJ, Wayne Rasband,National）を使用して計数された。
【０２２５】
３ＤアッセイはSandal et al 2007から改変され、３００００細胞がゲル上に播種され、培養物は解析されるまで１０〜１２日間増殖させた。
【０２２６】
臨床試料
一連の本乳癌は、２ビューマンモグラフィーが２４カ月ごとに行われる１９９６年に始まった集団ベースのノルウェー乳癌スクリーニング計画（Norwegian Breast Cancer Screening Program）（Hordaland County）から選択された。手短に言えば、９５浸潤性中間期癌が最初の２回のスクリーニング中間期（１９９６〜２００１）中に発生し、これらは最初の２ラウンド中、総数３１７浸潤性腫瘍由来の９５スクリーニング検出された腫瘍とサイズによりマッチされた（中位径はそれぞれ１５．６及び１５．７ｍｍ）。マッチング後、スクリーニング検出された場合と中間期の場合の平均腫瘍サイズはそれぞれ２５．１と２３．１ｍｍであり、これらの群中の対応する平均年齢は６２歳と５９歳であった。年齢と腫瘍径（病理検査による）に加えて、診断時の乳房密度、組織型、組織学的悪性度、リンパ節転移、及び遠隔転移などの基本的特徴が記録された。最後のマンモグラフから中間期癌の診断までの平均時間は１７．１カ月であった。経過観察の最後の日付は２００４年１１月３１日であり、追跡期間中央値（生存者の）は７２カ月であった。追跡期間中、３１患者が乳癌で亡くなった。
【０２２７】
免疫組織化学
組織マイクロアレイスライドが本研究において使用された。組織マイクロアレイ法は組織保存的であり、いくつかの研究において検証された。免疫組織化学は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織の５μｍ厚切片上で実施された。抗原回復は、電子レンジでＴＲＳ（抗原賦活用溶液，Target Retrieval Solution；DakoCytomation社製, Denmark, AS）緩衝液、ｐＨ６．０中７５０Ｗで１０分間及び３５０Ｗで２０分間煮沸することにより実施された。DakoCytomation Autostainerは染色のために使用された。
【０２２８】
スライドは、Ａｘｌ（Ｈ−１２４；カタログ番号２０７４１）、希釈１対２００（Santa Cruz社製, USA）に対するポリクローナル抗体と一緒に室温で一晩インキュベートされた。免疫ペルオキシダーゼ染色は、メイヤーズヘマトキシリン（DakoCytomation社製, Denmark AS）を用いた対比染色に先立って基質としてジアミノベンジジン四塩化ペルオキシダーゼを用いるDakoCytomation Envision Kit（DakoCytomation社製, Denmark AS）を使用して実施された。
【０２２９】
染色法の評価
染色は大部分が細胞質であるが、細胞質膜において染色のある程度の集中が存在した。染色は、染色の強度及び陽性反応を示す腫瘍細胞の割合を考慮して、半定量的及び主観的類別方式により記録された。各症例からの３つのコア全てが評価された。強度は、０（無染色）〜３（強染色）として記録され；膜染色面積の割合は０（無陽性腫瘍細胞）、１（１０％未満）、２（１０％〜５０％）及び３（５０％を超える腫瘍細胞）として記録された。染色指標（ＳＩ）は、染色強度と面積の積として計算された。免疫組織化学登録は、患者の特徴及び予後について盲検で行われた。
【０２３０】
統計
群の比較はピアソンのカイ二乗検定（Pearson χ２ test）により実施された。全統計的解析では、染色指数（ＳＩ）カテゴリーのカットオフ値は中央値に基づいていた。単変量生存解析（終了点として子宮内膜癌による死亡を使用する；他の原因による死亡は打ち切られた）は、入力日として初回手術の時間を用いる積極限推定値法（カプランマイヤー法）を使用して実施された。
【０２３１】
ログランク（Mantel-Cox）検定を使用して各変数の異なるカテゴリーについて生存曲線を比較した。単変量解析における生存への影響を有する変数（Ｐ≦．１５）はｌｏｇ−ｌｏｇプロットにより試験して、これらの変数をコックスの比例ハザード回帰モデル（Cox' proportional hazards regression model）にどのようにして組み込むことができるかどうかを決定した。
【０２３２】
マウス系統及び動物飼育
本研究では、生後８〜１０週間、体重２０〜２５ｇのＰｒｋｄｃＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌと略記される）重症複合免疫不全マウス（GADES Institute製, Norway）のメスマウスを使用した。マウスは１２時間明／暗サイクルの標準条件下で飼われ、実験の開始に先立って新しい環境条件に順応するのに少なくとも７日間与えられた。この調査は、動物の数と苦痛を最小限にするように設計されているが、ノルウェー動物実験に関する規制（Norwegian Regulation on Animal Experimentation）、科学的目的のために使用される脊椎動物の保護についての欧州協定（European Convention for the Protection of Vertebrate Animals）、及びノルウェー動物研究局（Norwegian Animal Research Authority）の指針に従って実施された。
【０２３３】
生物発光画像（ＢＬＩ）
ＢＬＩは、標本箱に搭載されたeXplore Optix（GE Healtcare社製）カメラを使用して実施された。撮像及びシグナルの定量化は、eXplore Optixソフトウェアを使用して行われた。インビボ撮像では、動物は腹腔内注射（ｉ．ｐ）を介して基質Ｄ−ルシフェリン（Biosynth社製）をPBS（リン酸緩衝食塩水，Phosphate Buffered Saline）中１５０ｍｇ／ｋｇ受け、イソフルランを用いて麻酔された。マウスはカメラボックス内部の温めた台に置かれ、１〜２％イソフルランに連続曝露され、腫瘍モデルに応じて異なるビューについて撮像された。所望の領域が同定され、eXplore Optixソフトウェア（GE eXplore Optix）を使用して全光粒子／秒−１として定量された。インビボ背景生物発光は２〜３×１０光粒子カウントの範囲であった。エクスビボ画像では、１５０ｍｇ／ｋｇ Ｄ−ルシフェリンが部検の直前にマウスに注射された。所望の組織は切除され、プレート内に置かれて撮像された。
【０２３４】
インビボ腫瘍モデル
組織操作
ＧＦＰ−Ｌｕｃバイオマーカー及びＡｘｌ発現を調節する異なるＲＮＡ干渉を発現する１×１０６ ＭＤＡ−ＭＢ ２３１細胞は、Ｆ−１２ Ｋａｉｇｈｎ’ｓ（Invitrogen社製）対マトリゲル（BD Biosciences社製）の１対１混合物に懸濁され、６×６ｍｍポリ乳酸（ＰＬＬＡ）スキャフォールドに播種された。
【０２３５】
メスＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌは、移植手順の間及びその後の撮像の日は１〜２％イソフルラン（Isoba vet.-Schering-Plough社製 A/S）への曝露により麻酔された。２つのスキャフォールドは、Nor et al. Lab Invest.; 81 (4) 453; 2001に従って各マウスにおいて皮下（ｓ．ｃ）に移植された。Ａｘｌを発現する細胞を有するスキャフォールドは各マウスの左側に移植され、Ａｘｌがノックダウンされている細胞を有するスキャフォールドは右側に移植された。外科的処置後、麻酔されたマウスは撮像システムに置かれ、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（Biosynth社製）の腹腔内注射の１０〜１５分後、左側と右側の両方を撮像された。腫瘍発生は４週間、撮像により週１回インビボでモニターされた。
【０２３６】
異種移植片アッセイ
ｓｈＲＮＡベクター及びＧＦＰ−Ｌｕｃを感染させた１×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１００μｌのＦ１２Ｋ培地＋１０％ＦＢＳ／マトリゲル（１対１比、BD Biosciences社製）に懸濁され、２９ゲージインスリン針を用いてメスＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍの両側腹部の皮下に注入された。左側腹部にＡｘｌ発現に関して陽性細胞が注入され、右側腹部にはＡｘｌ発現に陰性の細胞が注入された。
【０２３７】
三細胞移植では、ｓｈＲＮＡベクター及びＧＦＰ−Ｌｕｃを感染させたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）及び肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）と１対２対２の割合で混合された。腫瘍増殖は４連続週間、撮像によりインビボで毎週モニターされた。
【０２３８】
乳腺脂肪体自然転移モデル
ＧＦＰ−Ｌｕｃバイオマーカー及びＡｘｌ発現を調節する異なるＲＮＡ干渉を発現するヒトＭＤＡ−ＭＢ ２３１細胞（ＭＤＡ−ＭＢ ２３１ ＤＨ３Ｌ２Ｎと呼ばれる−Xenogen社製）の亜系統は、マウスの乳腺パッドに注入された。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍｎｕｌｌマウスは、１〜３％イソフルランへの曝露により麻酔にかけられ、ＭＥＭ／ＥＢＳＳ培地／マトリゲル（１対１）に懸濁された５０μｌの２×１０６ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ ＤＨ３Ｌ２Ｎ細胞を腹腔乳腺脂肪体に注入された。Ｄ−ルシフェリン（Biosynth社製）注射の１０〜１５分後、マウスはeXplore Optix撮像システムに置かれ腹側面から撮像された。腫瘍増殖及び転移拡散は、最長９週間生物発光画像により隔週でモニターされた。転移性領域からのシグナルをインビボで観察することができるように原発性腫瘍からの生物発光を最小限にするために再撮像前に各動物の下半身は覆われた。
【０２３９】
組織収集
各実験の終了時、腫瘍組織移植片及び異なる臓器はマウスから回収され、さらに解析するために１０％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich社製）中で保存された。組織は病理組織診断のために調製され（パラフィン包埋、セクショニング及び染色）、顕微鏡評価により解析された。
【０２４０】
モデル動物の結果の統計的解析
平均生物発光（光粒子／秒−１）、腫瘍径及び対応する標準誤差は、実験ごとに決定された。回帰プロットを使用して、生物発光、細胞数と腫瘍径の関係を記述した。統計的解析はペアードｔ−検定に基づいていた。
【０２４１】
結果
Ａｘｌ発現は乳癌患者の全生存に対する強力な予後因子である
乳癌病因におけるＡｘｌの役割を評価するために、年２回の２ビューマンモグラフィーを必要とする１９９６年に始まったノルウェー乳癌スクリーニング計画中に同定された一連の乳癌患者由来の腫瘍におけるＡｘｌ発現を調査した（Wang, H., et al., Mammography screening in Norway: results from the first screening round in four counties and cost-effectiveness of a modeled nationwide screening. Cancer Causes Control, 2001. 12(1): p. 39-45）。手短に言えば、９５浸潤性中間期癌が最初の２つのスクリーニング中間期（１９９６〜２００１）中に発生し、これらは最初の２ラウンド中、総数３１７浸潤性腫瘍由来の９５スクリーニング検出された腫瘍とサイズによりマッチされた（中位径はそれぞれ１５．６及び１５．７ｍｍ（Collett, K., et al., A basal epithelial phenotype is more frequent in interval breast cancers compared with screen detected tumors. Cancer Epidemiol Biomarkers））。マッチング後、スクリーニング検出された場合と中間期の場合の平均腫瘍サイズはそれぞれ２５．１と２３．１ｍｍであり、これらの群中の対応する平均年齢は６２歳と５９歳であった。年齢と腫瘍径（病理検査による）に加えて、診断時の乳房密度、組織型、組織学的悪性度、リンパ節転移、及び遠隔転移などの基本的特徴が記録された。最後のマンモグラフから中間期癌の診断までの平均時間は１７．１カ月であった。臨床パラメータがモニターされ、経過観察の最後の日付は２００４年１１月３１日であり、追跡期間中央値（生存者の）は７２カ月であった。追跡期間中、３１患者が乳癌で亡くなった。
【０２４２】
Ａｘｌ発現（中央値染色指標により２群に分けられた；図１Ａ）と組織学的悪性度、腫瘍径、エストロゲン及びプロゲステロン受容体の発現並びに腋窩リンパ節状態などの重要な臨床病理学的特徴間に顕著な関連性はなかった。その上、Ａｘｌ発現はＨＥＲ２、Ｅ−カドヘリン、基底分化のマーカー（サイトケラチン５／６、Ｐ−カドヘリン）、ＥＺＨ２又はＫｉ−６７発現による腫瘍細胞増殖と関連はなかった。
【０２４３】
しかし、単変量生存解析（カプランマイヤー法、ログランク検定）Ａｘｌ発現は患者生存の減少と顕著な関連があった（ｐ＝０．０３５；図１Ｂ）。Ａｘｌ発現（第一ステップ）に加えて、腫瘍径、組織学的悪性度及びリンパ節状態のような基本的予後因子を含む多変量解析（比例ハザード法）では、Ａｘｌ発現状態は、組織学的悪性度及びリンパ節状態に加えて最終モデルにおける独立した負の予後因子として残った（ｐ＝０．０２１）（図１Ｃ参照）。したがって、Ａｘｌ発現は乳癌患者における臨床転帰不良の強力な予後因子である。
【０２４４】
次に、原発性及び転移乳癌のマッチドペア（ｎ＝１６）の患者生検におけるＡｘｌ発現を調べた。Ａｘｌ発現は、対応する原発性ヒト乳癌と比べた場合、転移においてさらに高められている傾向があり（ｐ＝０．１１、マクニマーの検定；図１ｄ；転移は右側、肝臓（上）及び骨（下））、Ａｘｌ発現は乳癌患者における臨床転帰不良の強力な予後因子であり、転移拡散と関連していることを示唆していた。
【０２４５】
Ａｘｌは乳癌細胞侵襲性に必要とされる
悪い生存率と初期乳癌におけるＡｘｌ発現の強い相関は、全疾患病因におけるＡｘｌの重要な役割を示している。乳癌関連死亡率は常に転移性疾患の合併症の結果であるために、Ａｘｌ発現が悪性乳癌細胞侵襲性に必要とされるかどうかを評価した。Ａｘｌは、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１を含むいくつかの高度に転移性のヒト乳癌細胞株において発現されている。ＡｘｌリガンドのＧａｓ６は同時発現されることが多く、自己分泌活性化をもたらす（Holland S. J., Friera A.M., Franci C, Chan E., Atchison R., McLaughlin J., Swift S. E., Pali E., Yam G., Wong S., Lasaga J., Shen M., Yu S., Xu W., Hitoshi Y., Payan D.G, Nor J. E., Powell M.J, and Lorens J. B. (2005) The Receptor Tyrosine Kinase AxI Regulates Angiogenesis and Tumor Growth. Cancer Research 65:9294-9303）。ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞におけるＡｘｌ発現レベルを特定の細胞挙動と効果的に相関させるために、本発明者らは、最近開発されたＦＡＣＳベースのＲＮＡｉアプローチ、ＣｅｌｌＳｅｌｅｃｔＲＮＡｉを使用して用量依存性の形でＡｘｌ発現を減少させるＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡのエピ対立形質系列を開発した（図２Ａ；Micklem et al.、発表準備中）。このＡｘｌ ｓｈＲＮＡコレクションを使用して、段階的全体（図２Ｂ）及びリン酸化（図２Ｃ）Ａｘｌタンパク質レベルを有するエピ対立形質Ａｘｌ ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞系列を作製した。
【０２４６】
悪性癌細胞は、インビボ転移能と相関する間葉細胞侵襲性を三次元細胞外マトリックスタンパク質ゲル（マトリゲル）において示す（Bissell）。エピ対立形質解析は、血清（図２Ｄ）又は乳癌転移における重要な因子であるＳＤＦ−１ケモカイン（図２Ｅ）に対する応答におけるＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞浸潤のためのＡｘｌ発現の用量依存的必要量を実証した。これとは対照的に、ＡｘｌノックダウンはＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞増殖に対してはまったく効果はなく、二次元（側面上皮創傷治癒）遊走には中程度の効果しかなかった。これは、三次元増殖及び侵襲性におけるＡｘｌの特定の必要量を示した。したがって、本発明者らは、３ＤマトリゲルアッセイにおけるＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞に対するＡｘｌノックダウンの効果を評価した。正常な乳房表皮細胞は３Ｄマトリゲルにおいて極性球状腺房構造体に自己組織化するが、悪性ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞は増殖して高悪性度の腫瘍を反映する浸潤性星状増殖を有する大きな組織の乱れたコロニーを形成する（Bissell）。Ａｘｌ発現のノックダウンは、３Ｄ−マトリゲルにおけるＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞の悪性表現型を強く回復させ、悪性増殖のない小さな丸いコロニーを生み出した（図２Ｆ，Ｇ）。合わせると、これらのデータは、Ａｘｌシグナル伝達は、転移性乳癌細胞の間葉様侵襲性を維持するのに必要とされることを示唆している。
【０２４７】
Ａｘｌは乳房上皮細胞におけるＥＭＴ誘導転写因子により上方調節される
間葉侵襲性、すなわちＥＣＭを遊走し侵入する能力の獲得は、ＥＭＴの機能的特徴である。ＥＭＴ誘導転写因子Ｔｗｉｓｔは乳癌細胞の転移に必要とされる（Yang J, Mani SA, Donaher JL1 Ramaswamy S, Itzykson RA, Come C, Savagner P, Gitelman I, Richardson A, Weinberg RA.Twist, a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis. Cell. 2004 117:927-39）。したがって、Ｔｗｉｓｔ発現が乳房上皮細胞においてＡｘｌを上方調節するかどうかを調べた。正常な乳房上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ）におけるＴｗｉｓｔ発現はＥＭＴを誘導する（図３Ａ；Glackin et al.、発表準備中）。驚くことに、ＡｘｌはＴｗｉｓｔ発現ＭＣＦ１０Ａ細胞においても強く上方調節されている（図３Ａ−Ｂ）。さらに、Ｇａｓ６は正常な乳房上皮細胞により構成的に発現されているので、このＴｗｉｓｔ誘導Ａｘｌ発現は自己分泌活性化ループを確立しており、細胞関連Ｇａｓ６及びチロシンリン酸化Ａｘｌの増加により証拠だてられている（図３Ａ、Ｃ）。他のＥＭＴ誘導転写因子がＡｘｌ発現を同様に上方調節するのかどうかを決定するために、ＺＥＢ２、Ｓｎａｉｌ及びＳｌｕｇを発現しているＭＣＦ１０Ａ細胞を解析した。これらのＥＭＴ転写因子のそれぞれが、ＭＣＦ１０Ａ細胞において間葉転換を誘導し、Ａｘｌ発現を上方調節した。これらの結果は、ＥＭＴ誘導がＡｘｌ発現をもたらし自己分泌シグナル伝達を確立することができることを示唆している。
【０２４８】
Ａｘｌ発現は実験組織操作乳腺腫瘍における腫瘍形成に必要である
インビボでの悪性増殖のためのＡｘｌの必要量を評価するために、効率的なインビボ光学撮像のためのＧＦＰ−ルシフェラーゼ構築物を発現するＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞を含む組織操作アプローチを使用し（ＣＳＩ；Tiron et al.、結果未公表）、ポリ乳酸組織操作スキャフォールドにマトリゲルと一緒に播種し、免疫無防備状態のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。腫瘍細胞はスキャフォールドにコロニー形成するので、操作された腫瘍微小環境内の増殖は腫瘍細胞間葉特徴と関連している（Mooney）。ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞は容易に腫瘍、この生物模倣型の微小環境を形成し、スキャフォールドの侵襲性コロニー形成を示す（図４Ａ）。Ａｘｌノックダウンは、腫瘍形成、側面拡散及び悪性形態を強く阻害した（図４Ａ）。
【０２４９】
Ａｘｌが血管を引き付け吸収する乳癌細胞の能力に影響するかどうかを確かめるために、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞が原発性ヒト微小血管内皮（ＨｕＭＶＥＣ，human microvascular endothelial）及び血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）と一緒に播種されて腫瘍血管構造を作り出すことを含む三細胞移植片アプローチを開発した。ヒトＥＣ−ｖＳＭＣ細胞の移植片は、２週間以内にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて灌流スキャフォールド内ヒト微小血管系を容易に形成する（Hegen et al.、発表準備中）。図４Ｂにおいて示されるように、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞は、この三細胞移植片モデルにおいて侵襲性の高度に血管新生化している腫瘍を形成する。操作されたヒト腫瘍血管構造は、管腔内赤血球と共に均等に分布しており灌流している。これとは対照的に、Ａｘｌノックダウンは、灌流ヒト微小血管系の成長に影響することなく腫瘍形成を妨げた。これは、誘導された血管新生の必要性をおそらく除去する微小血管系の存在下でさえＡｘｌは腫瘍形成に必要とされることを示している。
【０２５０】
明確なＡｘｌ発現閾値は乳腺腫瘍形成に必要とされる
腫瘍を形成するのに必要なＡｘｌ発現のレベルを評価するために、皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍においてＡｘｌのインビボエピ対立形質解析を行った。Ａｘｌエピ対立形質ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系列（図１）は皮下に注射され、生物発光スキャニングにより腫瘍形成について時間的にモニターされた。このアプローチにより、腫瘍増殖に対するＡｘｌ用量応答が明らかにされた（図５）。表面Ａｘｌレベルとの相関は、腫瘍形成に必要とされるＡｘｌ発現の閾値を明らかにした（図５Ｂ、Ｃ）。この用量応答は、侵襲性に対するＡｘｌ阻害の用量依存的効果と一致している（図２）。
【０２５１】
Ａｘｌは乳癌細胞の転移に不可欠である
乳癌転移に対するＡｘｌの必要量を評価するために、急速増殖及び高度に転移性のインビボＭＤＡ−２３１分離株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮを乳腺脂肪体に同所的に注射した。全身生物発光撮像を使用して、９週間にわたり自然転移発症を時間的にモニターした。対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞は、５〜６週間以内に壊死性になる大きな同所性乳腺腫瘍を生じた（図６Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮにおけるＡｘｌノックダウンは、原発性乳腺腫瘍形成の速度を下げたが、実質的な原発性乳腺腫瘍も生じた（図６Ａ）。自然転移は、４週間目に対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ注射マウスの胸部センチネルリンパ節において最初に検出された（図６Ａ）。これとは対照的に、ＭＤＡ−２３１ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ移植マウスにおいて転移は検出されなかった。９週間目に屠殺されると、切除された臓器は、転移細胞の存在による生物発光について個別にスキャンされた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ注射マウスは、リンパ節、肺、卵巣及び腎臓を含む、全てのマウスで広範な自然転移を形成していた。これとは対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ細胞は検出可能な転移を形成しなかった（１匹のマウスの腎臓での単一病変は別として）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ注射マウスの臓器由来の組織生検の組織学的解析により、生物発光総光粒子測定により予想されたように、全ての臓器における複数の微小転移及びマクロ転移の存在が確証された（図６Ｃ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＤＨＬＮ−ＡｘｌｓｈＲＮＡ注射マウス由来の組織生検においては微小転移もマクロ転移も観察されず、観察される生物発光の欠如は、転移形成が阻害されたせいであることを確証した。これらの結果は、Ａｘｌが乳癌転移に不可欠であることを示している。
【０２５２】
同所的に注射されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ／ＧＦＰ−Ｌｕｃ対照又はＡｘｌノックダウン細胞を用いて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの全生存に対するＡｘｌの機能的貢献を評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｄ３Ｈ２ＬＮ／ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２坦腫瘍マウスにおいては、全体生存は著しく増加していた（Ｐ＝０．０１３、ログランク検定；図６ｄ）。これらの結果は本発明者らの臨床観察と合わせて、Ａｘｌが転移性疾患の発生及び全患者生存にとり重要であるという結論を支持している。
【０２５３】
異なる転移モデルにおいて本発明者らの結果を検証するために、ＣＳＩ構築物を用いて高度に転移性のマウス乳癌４Ｔ１細胞株に形質導入し、ＦＡＣＳによりＧＦＰルシフェラーゼ発現について選択した（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ）。４Ｔ１細胞は転移をＴｗｉｓｔ発現に依存しており、高レベルのＡｘｌ発現を示す（図７ａ）。
【０２５４】
４Ｔ１細胞においてマウスＡｘｌ表面レベルを効果的に抑制するマウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＡｘｌ２）を発現するレトロウイルスベクターを開発した（図７ａ）。ミスマッチドヒトＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（ｓｈＡｘｌ２７９）はマウスＡｘｌ発現にはまったく効果はなかった。４Ｔ１細胞におけるＴｗｉｓｔノックダウン及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いた結果に類似して、Ａｘｌノックダウン４Ｔ１細胞の組織培養拡大は著しい影響を受けなかった（データは示されていない）。
【０２５５】
メス正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺に導入されると、同質遺伝子的４Ｔ１腫瘍細胞は、白血球浸潤及び壊死に伴う腫瘍退縮と、それに続く複数の臓器への広範な転移と同時に起こる原発部位での再増殖をもたらす厳密な免疫応答のせいで二相性増殖パターンを示す。４Ｔ１−ＧＦＰＬｕｃ細胞は、免疫無防備状態のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいては単相性増殖のみを示す（データは示されていない）。マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２）又は陰性対照ヒト特異的ｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−ＬｕｃｓｈＡｘｌ２７９）のいずれかを発現している４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞をメスＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪体に注射し、時間的全身インビボ光学画像により腫瘍増殖及び転移を定量化した（図７ｂ）。対照４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２細胞は、急速な原発増殖を示し１週間後に最大に達した。これに続いて、５週間持続される急峻な退縮が起きた（図７ｂ）。６週目、原発部位での再発及び続いて急速に増殖する複数の遠隔転移が観察され、８週目までに全てのマウスが瀕死と致死に至った。マウスＡｘｌターゲティングｓｈＲＮＡ（４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２）を発現している４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ細胞は最初、急速な原発腫瘍増殖、Ａｘｌ抑制によりわずかに減弱し、続いて退縮するという類似の経過をたどった（図７ｂ）。しかし、それに続く原発腫瘍の再発及び急速な増殖遠隔転移の出現はまったくなかった（図７ｂ）。実際、４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２細胞を注射されたマウスは全て、屠殺時（８週目）には健康なままであった。４Ｔ１モデルに特徴的な白血病反応に伴う脾腫も、Ａｘｌノックダウン腫瘍を坦持するマウスにおいては減少していた（データは示されていない）。８週目に屠殺されると、個々の切除された臓器は撮像され全光発光は定量化され、４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈＡｘｌ２７９腫瘍を坦持する全マウスにおける一般的播種部位での転移の存在が確証された（図７ｃ−ｄ）。これとは対照的に、４Ｔ１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ−ｓｈｍＡｘｌ２腫瘍を有するマウス由来の臓器において生物発光腫瘍細胞は検出されなかった（図７ｄ−ｅ）。これらの結果は、Ａｘｌが乳腺腫瘍転移の不可欠な調節因子であるという結論を支持している。
【０２５６】
Ｇａｓ６による自己分泌調節
ＡｘｌリガンドであるＧａｓ６はＡｘｌと同時発現されることが多く、自己分泌活性化と一致している。自己分泌シグナル伝達を示す細胞関連Ｇａｓ６及びリン酸化Ａｘｌレベルは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＡｘｌノックダウンにより減少する（図１１）。ＭＣＦ１０Ａ細胞において、Ｇａｓ６は構成的に発現されており、ＥＭＴ誘導Ａｘｌ発現により細胞関連になった（図１１）。これらの結果は、ＥＭＴプログラム誘導がＡｘｌ発現をもたらし、胸部上皮細胞において自己分泌シグナル伝達を確立することができることを示唆している。Ａｘｌは、Ｇａｓ６と同時発現されることが多いが、多くの転移性癌において検出されるので、自己分泌Ａｘｌシグナル伝達は多くの腫瘍型においてＥＭＴの頻繁な結果であり得る。Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ及びＴｗｉｓなどのＥＭＴ誘導転写因子はＡｘｌ発現を強く誘導し、Ａｘｌが腫瘍細胞の悪性間葉表現型を持続するポジティブフィードバックループに関与する可能性があることを示唆している。この考えは、転移性病変においてＡｘｌ発現が上昇していることを観察したことと一致している。
【０２５７】
ＣＤ４４＋表現型はＡｘｌ発現と関連している
ＭＣＦ１０ａ細胞はＳｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ（ｐＢＡＢＥ ｐｕｒｏ Ｈ−Ｒａｓ Ｖ１２、Addgene製）構築物を用いて形質導入された。Ｓｌｕｇ形質導入された細胞は、ＧＦＰの同時発現を使用するフローサイトメトリーにより解析され、Ｈａ−Ｒａｓ発現は４８時間のピューロマイシン処置により選択された。フローサイトメトリーにより示されるように（図９、パネルＡ）、ＭＣＦ１０ａ細胞におけるＳｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現は、癌幹細胞マーカーＣＤ４４の発現表面発現の強い増加をもたらした。Ｓｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓを用いて形質導入されたＭＣＦ１０ａ細胞のフローサイトメトリー解析により、表面Ａｘｌ発現の強い増加がさらに示された。Ｓｌｕｇ又はＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞は、ＣＤ４４高（ＣＤ４４＋）及び低（ＣＤ４４−）ＣＤ４４発現亜集団についてＦＡＣＳにより識別された。ＣＤ４４−細胞は上皮形態を示し、ＣＤ４４＋ＭＣＦ１０細胞は伸長した間葉形態を示した（図９、パネルＣ）。これらの細胞のウェスタンブロット解析により（図９、パネルＤ）、ＣＤ４４−ＭＣＦ１０ａ細胞が上皮結合部及び細胞骨格タンパク質発現を保持することが実証された。これとは対照的に、ＣＤ４４＋細胞は、強い間葉マーカー発現（ビメンチン、Ｎ−カドヘリン）及びＥ−カドヘリンの消失を示し、ＥＴＭを示していた。Ａｘｌ発現はＳｌｕｇとＨａ−Ｒａｓ誘導ＥＭＴの両方におけるＣＤ４４及び間葉形質の存在と相関していた（図９、パネルＢ、Ｄ）。３ＤマトリゲルにおけるＣＤ４４＋及びＣＤ４４−Ｓｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現ＭＣＦ１０ａ細胞の増殖（図９、パネルＥ）は、ＣＤ４４＋、Ａｘｌ発現ＭＣＦ１０ａ細胞が侵襲性であり、間葉表現型と一致していることを実証した。これらの結果により、ＡｘｌがＭＣＦ１０ａ細胞においてはＳｌｕｇ及びＨａ−Ｒａｓ発現により上方調節されており、間葉及び癌幹細胞形質と相関していることが実証された。
【０２５８】
本発明の記載された態様の様々な修正及び変動は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求の範囲に記載される本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、当業者には明白である本発明を実施する記載されている様式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するためのバイオマーカーとしての、Ａｘｌの使用。
【請求項２】
Ａｘｌが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の誘導を検出するためのバイオマーカーである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ａｘｌの上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示す、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
（ｉ）試料を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、前記対照試料と比べたＡｘｌ発現の上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示すステップと、
を含む、試料中において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための方法。
【請求項５】
対象由来の試料中でＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを決定することを含み、転移性癌のない対象中のレベルと比べて前記ポリペプチドのより高いレベルが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示す、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することにより対象中の転移性癌を診断する方法。
【請求項６】
癌が乳癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬の活性をモニターする際の、Ａｘｌ又はＡｘｌをコードする遺伝子の使用。
【請求項８】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与した後に、Ａｘｌの存在がモニターされる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、及びＡｘｌの活性及び／又は発現をモニターすることを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法。
【請求項１０】
作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、及び未処置の対照試料と比べた場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現の変化を検出することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与するステップと、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中のＡｘｌ発現を測定するステップと、
（iii）上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す能力の指標として、未処置の試料中と比べた場合の処置された試料中のＡｘｌの発現の増加若しくは減少を検出するステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を検出するための方法。
【請求項１２】
（ｉ）Ａｘｌ阻害剤を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中のＡｘｌ発現を測定するステップ、並びに
（iii）Ａｘｌ阻害活性の指標として、前記未処置の試料中と比べた場合の前記処置された試料におけるＡｘｌの発現又は活性の増加若しくは減少を検出するステップ、
により上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤の活性をモニターする方法。
【請求項１３】
試料がタンパク質解析により解析される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質解析がＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ、フローサイトメトリー、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ又は２−Ｄ ＰＡＧＥにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の集団が細胞培養物である、請求項４若しくは９〜１４のいずれかに記載の方法、又は請求項８に記載の使用。
【請求項１６】
細胞が腫瘍細胞、ＰＢＭＣ又はリンパ球である、請求項４若しくは９〜１５のいずれかに記載の方法、又は請求項８に記載の使用。
【請求項１７】
試料が血液である、請求項４〜６又は１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
試料が血清、血漿又は組織培養上清である、請求項４〜６又は１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される前記活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法。
【請求項２０】
測定される活性がＡｘｌ受容体の基質のチロシンリン酸化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
測定される活性がＡｘｌ受容体の自己リン酸化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
接触ステップ（ｉ）における細胞が、既にＡｘｌ遺伝子によりトランスフェクトされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
トランスフェクトされた細胞が、一過的又は安定的にトランスフェクトされている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（iii）における対照条件が、活性Ａｘｌ遺伝子を欠く細胞に作用薬を接触させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
細胞がＡｘｌ遺伝子の変異不活性型を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ａｘｌ受容体が細胞内ドメインの生物学的に活性な部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
Ａｘｌ受容体が固定化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）複数の作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記複数の作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される前記活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
（ｖ）前記複数中に存在するどの作用薬若しくはどの複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すのかを個別に決定するステップと、
を含む、複数の作用薬をスクリーニングすることにより、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法。
【請求項２９】
作用薬が転移性癌を治療するためのものである、請求項９〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
転移性癌の治療のための薬物の調製における、請求項９〜２８のいずれかに記載の方法に従って同定される作用薬の使用。
【請求項３１】
薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合される、請求項９〜２８のいずれかに記載の方法に従って同定される作用薬を含む医薬組成物。
【請求項３２】
（ｉ）請求項９〜２８のいずれかに記載の方法を使用して上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するステップ、及び
（ii）前記作用薬を薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤と混合させるステップ、
を含む、組成物を調製する方法。
【請求項３３】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害するための方法。
【請求項３４】
対象にＡｘｌ阻害剤を投与することにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害することを含む、それを必要とする対象において転移性癌を治療するための方法。
【請求項３５】
Ａｘｌ阻害剤が抗Ａｘｌ抗体又は小分子阻害剤である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象が哺乳動物である、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
対象がヒトである、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項３９】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害することにより転移性癌を治療するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項４０】
抗Ａｘｌ抗体を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキット。
【請求項４１】
Ａｘｌに対する核酸プローブを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキット。
【請求項４２】
Ａｘｌに対する少なくとも１つのＱＰＣＲプライマーを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキット。
【請求項４３】
請求項１又は９〜２８のいずれかにおいて定義される方法における、請求項４０〜４２のいずれかにおいて定義されるキットの使用。
【請求項４４】
（ｉ）細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから試料を単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、前記対照試料と比べたＡｘｌ発現の上方調節が、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に感受性であることを示すステップと、
を含む、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性であるかどうかを決定するための方法。
【請求項４５】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において転移性癌又は末期癌を治療する方法。
【請求項４６】
転移性癌又は末期癌を治療するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項４７】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において転移を阻害する方法。
【請求項４８】
転移を阻害するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項４９】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、癌に罹っている前記対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害する方法。
【請求項５０】
癌に罹っている対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項５１】
実質的に本明細書に記載される方法、使用、医薬組成物又はキット。
【請求項５２】
個別化医療適用における、請求項１に記載のバイオマーカーの使用。
【請求項５３】
個別化医療適用が、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に対象が感受性である又は応答性であるかどうかを決定するためである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
個別化医療適用が、対象が転移性癌に特に罹患している可能性が高いかどうかを決定するためである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に対象が感受性であるかどうかを決定するための予後法。
【請求項５６】
（ｉ）対象から試料を得るステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、前記対照試料と比べたＡｘｌ発現の上方調節が、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に感受性であることを示すステップと、
を含む、請求項５５に記載の予後法。
【請求項５７】
Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に対象が感受性である又は応答性であるかどうかを決定するための予後薬剤におけるバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用。
【請求項１】
対象における上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するためのバイオマーカーとしての、Ａｘｌの使用。
【請求項２】
Ａｘｌが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の誘導を検出するためのバイオマーカーである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ａｘｌの上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示す、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
（ｉ）試料を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、前記対照試料と比べたＡｘｌ発現の上方調節が上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示すステップと、
を含む、試料中において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出するための方法。
【請求項５】
対象由来の試料中でＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを決定することを含み、転移性癌のない対象中のレベルと比べて前記ポリペプチドのより高いレベルが上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を示す、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することにより対象中の転移性癌を診断する方法。
【請求項６】
癌が乳癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬の活性をモニターする際の、Ａｘｌ又はＡｘｌをコードする遺伝子の使用。
【請求項８】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与した後に、Ａｘｌの存在がモニターされる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、及びＡｘｌの活性及び／又は発現をモニターすることを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法。
【請求項１０】
作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与すること、及び未処置の対照試料と比べた場合の処置された試料におけるＡｘｌの発現の変化を検出することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）作用薬を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与するステップと、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中のＡｘｌ発現を測定するステップと、
（iii）上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す能力の指標として、未処置の試料中と比べた場合の処置された試料中のＡｘｌの発現の増加若しくは減少を検出するステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を検出するための方法。
【請求項１２】
（ｉ）Ａｘｌ阻害剤を細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトに投与するステップ、
（ii）処置された及び未処置の細胞、動物又はヒト由来の試料中のＡｘｌ発現を測定するステップ、並びに
（iii）Ａｘｌ阻害活性の指標として、前記未処置の試料中と比べた場合の前記処置された試料におけるＡｘｌの発現又は活性の増加若しくは減少を検出するステップ、
により上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤の活性をモニターする方法。
【請求項１３】
試料がタンパク質解析により解析される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質解析がＥＬＩＳＡ、ＰＥＴ、フローサイトメトリー、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ又は２−Ｄ ＰＡＧＥにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の集団が細胞培養物である、請求項４若しくは９〜１４のいずれかに記載の方法、又は請求項８に記載の使用。
【請求項１６】
細胞が腫瘍細胞、ＰＢＭＣ又はリンパ球である、請求項４若しくは９〜１５のいずれかに記載の方法、又は請求項８に記載の使用。
【請求項１７】
試料が血液である、請求項４〜６又は１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
試料が血清、血漿又は組織培養上清である、請求項４〜６又は１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される前記活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法。
【請求項２０】
測定される活性がＡｘｌ受容体の基質のチロシンリン酸化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
測定される活性がＡｘｌ受容体の自己リン酸化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
接触ステップ（ｉ）における細胞が、既にＡｘｌ遺伝子によりトランスフェクトされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
トランスフェクトされた細胞が、一過的又は安定的にトランスフェクトされている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（iii）における対照条件が、活性Ａｘｌ遺伝子を欠く細胞に作用薬を接触させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
細胞がＡｘｌ遺伝子の変異不活性型を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ａｘｌ受容体が細胞内ドメインの生物学的に活性な部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
Ａｘｌ受容体が固定化されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）複数の作用薬をＡｘｌ受容体又は前記Ａｘｌ受容体を発現している細胞に接触させるステップと、
（ii）前記複数の作用薬の存在下で前記Ａｘｌ受容体活性を測定するステップと、
（iii）ステップ（ii）において測定される前記活性を対照条件下で測定される活性と比較するステップであって、減少によって、前記複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができると同定されるステップと、
（ｖ）前記複数中に存在するどの作用薬若しくはどの複数の作用薬が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すのかを個別に決定するステップと、
を含む、複数の作用薬をスクリーニングすることにより、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するための方法。
【請求項２９】
作用薬が転移性癌を治療するためのものである、請求項９〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
転移性癌の治療のための薬物の調製における、請求項９〜２８のいずれかに記載の方法に従って同定される作用薬の使用。
【請求項３１】
薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体と混合される、請求項９〜２８のいずれかに記載の方法に従って同定される作用薬を含む医薬組成物。
【請求項３２】
（ｉ）請求項９〜２８のいずれかに記載の方法を使用して上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻すことができる作用薬を同定するステップ、及び
（ii）前記作用薬を薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤と混合させるステップ、
を含む、組成物を調製する方法。
【請求項３３】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害するための方法。
【請求項３４】
対象にＡｘｌ阻害剤を投与することにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害することを含む、それを必要とする対象において転移性癌を治療するための方法。
【請求項３５】
Ａｘｌ阻害剤が抗Ａｘｌ抗体又は小分子阻害剤である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象が哺乳動物である、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
対象がヒトである、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項３９】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こした癌細胞の増殖及び拡散を阻害することにより転移性癌を治療するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項４０】
抗Ａｘｌ抗体を含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキット。
【請求項４１】
Ａｘｌに対する核酸プローブを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキット。
【請求項４２】
Ａｘｌに対する少なくとも１つのＱＰＣＲプライマーを含む、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を阻害する又は正常に戻す作用薬の能力を評価するためのキット。
【請求項４３】
請求項１又は９〜２８のいずれかにおいて定義される方法における、請求項４０〜４２のいずれかにおいて定義されるキットの使用。
【請求項４４】
（ｉ）細胞、細胞の集団、モデル動物又はヒトから試料を単離するステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、前記対照試料と比べたＡｘｌ発現の上方調節が、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に感受性であることを示すステップと、
を含む、Ａｘｌ阻害剤を用いる治療に対象が感受性であるかどうかを決定するための方法。
【請求項４５】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において転移性癌又は末期癌を治療する方法。
【請求項４６】
転移性癌又は末期癌を治療するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項４７】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において転移を阻害する方法。
【請求項４８】
転移を阻害するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項４９】
Ａｘｌ阻害剤を対象に投与することを含む、癌に罹っている前記対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害する方法。
【請求項５０】
癌に罹っている対象においてＥＭＴ誘導侵襲性を阻害するための薬物の調製における、Ａｘｌ阻害剤の使用。
【請求項５１】
実質的に本明細書に記載される方法、使用、医薬組成物又はキット。
【請求項５２】
個別化医療適用における、請求項１に記載のバイオマーカーの使用。
【請求項５３】
個別化医療適用が、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に対象が感受性である又は応答性であるかどうかを決定するためである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
個別化医療適用が、対象が転移性癌に特に罹患している可能性が高いかどうかを決定するためである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
対象において上皮間葉転換（ＥＭＴ）の発生を検出することを含む、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に対象が感受性であるかどうかを決定するための予後法。
【請求項５６】
（ｉ）対象から試料を得るステップと、
（ii）前記試料中のＡｘｌの発現を対照試料と比べて決定するステップであって、前記対照試料と比べたＡｘｌ発現の上方調節が、Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に感受性であることを示すステップと、
を含む、請求項５５に記載の予後法。
【請求項５７】
Ａｘｌ阻害剤を用いた治療に対象が感受性である又は応答性であるかどうかを決定するための予後薬剤におけるバイオマーカーとしてのＡｘｌの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ−Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ−Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１３−５２０９５８（Ｐ２０１３−５２０９５８Ａ）
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５３５４７（Ｐ２０１１−５５３５４７）
【出願日】平成２２年３月１日（２０１０．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００５１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０３３８８
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．バブルジェット
【出願人】（５１１２２２１６８）ベルゲン テクノロジオヴェルフォリング エイエス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＲＧＥＮ ＴＥＫＮＯＬＯＧＩＯＶＥＲＦＯＲＩＮＧ ＡＳ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月１０日（２０１３．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１日（２０１０．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００５１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０３３８８
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．バブルジェット
【出願人】（５１１２２２１６８）ベルゲン テクノロジオヴェルフォリング エイエス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＲＧＥＮ ＴＥＫＮＯＬＯＧＩＯＶＥＲＦＯＲＩＮＧ ＡＳ
【Ｆターム（参考）】
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