不燃性溶媒によるタンパク質−リポ多糖類複合体からのリポ多糖類の除去
グラム陰性細菌からの組み換えタンパク質産生中に、目的のタンパク質とともにリポ多糖類（ＬＰＳ、エンドトキシン）が放出される。多くの例において、特異的又は非特異的タンパク質−ＩＬＰＳ相互作用により、ＬＰＳは、目的とするタンパク質とともに精製される。発明者らは、アルカンジオールの、本複合体を陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に固定すると同時に、タンパク質−ＬＰＳ複合体からＬＰＳを分離する能力について調べた。アルカンジオールは、毒性がより低く、燃焼性が低いため、アルコール又はアセトニトリルなどの他の有機物の使用に対するより安全な代替物を提供する。さらに、それらは、このような目的で使用されてきた多くの洗剤よりもコスト面で安価である。ＬＰＳ除去効率は、アルカン鎖が長くなるにつれて高くなった。１，２−アルカンジオールは、タンパク質ＬＰＳ複合体からのＬＰＳ分離において末端アルカンジオールよりも効果が高かった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、全体として、タンパク質−リポ多糖類複合体からのリポ多糖類（ＬＰＳ）の除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖類（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の外膜の主要成分である。ＬＰＳのエンドトキシン成分は、リピドＡ部分である。これは、６個以下のアシル鎖で置換されている１，６−結合Ｄ−グルコサミン残基及びさらなる多糖繰り返し単位が結合され得るコア多糖構造を含有する。エンドトキシンは、低用量では生来の免疫系の強力なアクチベーターであるが、同時に、高用量では、エンドトキシンは、敗血性ショックや死亡を含む多くの他の生理反応を誘発する（Ｈｅｉｎｅら、２００１）。
【０００３】
従って、治療薬へのエンドトキシンの混入は、このような製品の製造者にとって最も関心のある事柄である。
【０００４】
グラム陰性細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から多くの組み換えタンパク質が産生される。これらの組み換えタンパク質からのＬＰＳの除去は複雑であるが、特に、そのタンパク質が治療に使用されるものである場合、不可欠な方法であり得る。エンドトキシン分子のユニークな分子特性に基づいてタンパク質からＬＰＳを除去するための多くの様々な方法が開発されてきた。これらの方法には、ＬＰＳアフィニティーレジン、２相抽出、限外濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び膜吸着体（Ｐｅｔｓｃｈ及びＡｎｓｐａｃｈ，２０００により概説されている。）が含まれる。これらの方法では、タンパク質からのＬＰＳの分離の成功の度合いにばらつきがあり、そのばらつきの大部分は、目的とするタンパク質の特性に依存する。
【０００５】
多くの場合、組み換えタンパク質生成中、タンパク質−ＬＰＳ相互作用によりタンパク質からのＬＰＳの分離が困難になる。例えば（これに限定するものではないが）、Ｅ．コリ発現系から産生される組み換えタンパク質において、である。既報の、タンパク質からＬＰＳを分離するための方法のいくつかは、変性疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｗｉｌｓｏｎら、２００１）、そのタンパク質をイオン交換クロマトグラフィー媒体に固定すると同時にエタノール、イソプロパノール（Ｆｒａｎｋｅｎら、２０００）又は洗剤（Ｆｉｓｋｅら、２００１）洗浄を行うことを含め（これに限定される必要はない。）、研究されてきた。
【０００６】
いくつかの実験から、イオン交換クロマトグラフィー中のアルコール及び洗剤洗浄が、ＬＰＳ結合タンパク質レベルの低下に効果的であり、一方、変性ＨＩＣ法ではタンパク質からのＬＰＳの分離度が低いことが示されている。洗剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１２又は３−１４）は、前記アルコールよりも効果的な洗浄剤であることが示された。陰イオン交換レジンとは対照的に、ＬＰＳ−タンパク質複合体が陽イオン交換レジンに結合させた場合も、ＬＰＳのクリアランスが向上したが、ＬＰＳ除去のために使用した洗浄方法は両方のマトリクスに効果的であった。この洗浄法を陽イオン交換体で行った場合、ＬＰＳ−タンパク質相互作用が崩れた時点で、タンパク質を保持しながらそのＬＰＳをそのカラムから洗い去ることになろう。陰イオン交換クロマトグラフィーの場合、ほとんどのｐＨで負に荷電しているＬＰＳは、タンパク質とともにレジンに結合したままである。そのアルコール及び洗剤洗浄がＬＰＳ−タンパク質複合体におけるＬＰＳレベル低下の面で功を奏するものであったとしても、製造環境においてこれらの方法のいずれかを大規模にし、導入することは現実的とは言えない。効率的にＬＰＳ結合タンパク質のＬＰＳレベルを低下させるのに必要なエタノール及びイソプロパノール濃度は、５０％（ｖ／ｖ）を超えるものであった。これらの濃度において、これらの溶液は可燃性液体であり、多くの安全性及び操作上の規制が課せられると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＬＰＳレベル低下に非常に効果的であったとしても、洗剤は比較的高価であり、製造方法に莫大なコストを付加し、目的のタンパク質の生物活性に影響を与え得る。従って、クロマトグラフィーユニット操作中のタンパク質からのＬＰＳの分離のための洗浄剤としてのアルコール及び洗剤に代わり、安全かつ費用効果的に使用できる代替物となる化学物質が必要とされている。理想的には、これらの化学物質は、比較的安価で、明確に化学的で、安全性の問題が最小限であり、方法に導入した場合、目的とするタンパク質の生物活性にできる限り影響を与えないものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、全体として、アルカンジオールの、タンパク質からのリポ多糖類（ＬＰＳ）又は他のエンドトキシン分離能に関する。ある実施形態において、アルカンジオールは、ＬＰＳ−タンパク質複合体からＬＰＳを分離することができる。従って、本発明の実施形態は、全体として、ＬＰＳ−タンパク質複合体からＬＰＳを分離するための、アルカンジオール用いる方法に関する。さらなる実施形態において、本複合体は、レジンに固定化され、そこからＬＰＳが分離される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書中で使用される場合、「アルカンジオール」という用語は、一般式 ＣｎＨ２ｎ（ＯＨ）２を有する非芳香族飽和炭化水素を意味し、指す。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、タンパク質−ＬＰＳ複合体及びＬＰＳ−タンパク質複合体という用語は、同義的である。このタンパク質−ＬＰＳ複合体は、例えば（限定的なものではないが）、分子内力／分子間力によるような緩い会合、又は結合であり得る。
【００１１】
一般に、本発明の実施形態は、タンパク質−リポ多糖類（又は他のエンドトキシン含有物質）複合体からリポ多糖類又はエンドトキシンを分離するための方法に関する。ある実施形態において、タンパク質−リポ多糖類複合体からリポ多糖類を分離する方法には、タンパク質−ＬＰＳ複合体をアルカンジオール含有溶液で洗浄し、それによりそのＬＰＳの少なくとも一部がそのタンパク質から除去及び／又は分離される段階が含まれる。
【００１２】
ある実施形態において、このＬＰＳ−タンパク質複合体（又は他のエンドトキシン複合体）は、組み換えタンパク質などの（これには限定されない。）タンパク質産生中に生成及び／又は形成される。
【００１３】
本発明の実施形態は、あらゆるタンパク質を使用し得る。様々な例には、これらに限定されないが、ウシアルブミン（ＢＳＡ）、ウシホロトランスフェリン、ウシ乳由来のラクトフェリン、ニワトリ卵白由来のリゾチーム、熱ショックタンパク質、熱ショック融合タンパク質などが含まれる。様々なタンパク質は、単純又は複合、小型又は大型であり得る。
【００１４】
組み換えタンパク質産生のために、様々な方法及び／又は発現系が使用され得る。組み換えタンパク質産生のために、あらゆる発現系が使用され得る。ある実施形態において、発現系は細菌性である。このような実施形態において、Ｅ．コリ発現系のようなグラム陰性細菌発現系が使用され得る。しかし、例えば（これらに限定されないが）、カウロバクター・クレセント（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）など、他のタイプの細菌性の系もまた使用され得る。
【００１５】
一般に、エンドトキシンを含有するあらゆる系で、タンパク質からエンドトキシンを分離するために、本発明の実施形態を使用することができる。例えば、ある実施形態において、エンドトキシンは、タンパク質を含有する系の混入物である。いくつかの例において、エンドトキシンが原料中又は加工中の混入物として見出され得ることは、本分野で周知である。このようなエンドトキシンは、本発明の様々な実施形態により除去及び／又は分離することができる。
【００１６】
本発明の様々な実施形態とともに、あらゆるアルカンジオールが使用され得る。適切な非限定例には、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール及び１，７−ヘプタンジオールが含まれる。ある実施形態において、本発明のアルカンジオールは、長鎖アルカンジオールである。アルカンジオールは、全て不燃性化合物であるため、アセトニトリル、エタノール及びメタノールなどの一般的に使用される溶離剤と比較して安全性に優れている。さらに、アルカンジオールは、水溶性であり、多数のプロセスに対して法外な費用がかかることはない。
【００１７】
他の実施形態において、タンパク質−ＬＰＳ複合体の分離を補助及び／又は促進するために、様々な方法が利用される。これらの実施形態の様々な例において、このタンパク質−ＬＰＳ複合体は、基質に接着している。接着の様々な方法には、基質に対する、保持、誘引、結合、塗布、固定及び／又は除去可能な付着が含まれる。タンパク質又はＬＰＳのいずれかが接着され得る。ある実施形態において、ＬＰＳ−タンパク質複合体は、レジンに結合又は固定される。適切なレジンの種類には、これらに限定されないが、ＳＰセファロースファストフローレジン（ＳＰＳＦＦレジン）など、アフィニティーレジン、陰イオン交換レジン、陽イオン交換レジンなどが含まれる。しかし、レジンの選択は、本分野において日常的な技術であり、方法の特定の必要性を満たすように行い得る。
【００１８】
ある実施形態において、ＬＰＳ−タンパク質複合体は、タンパク質がカラムのレジンに結合する条件下で陰イオン交換レジンに結合させられる。次に、アルカンジオール洗浄溶液をカラムに添加し、それによりそのＬＰＳ−タンパク質複合体からそのＬＰＳの少なくとも一部が分離され、そして、アルカンジオールで、又はアルカンジオールについて溶出を行う。ある実施形態において、そのＬＰＳの５０％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。ある代替的実施形態において、そのＬＰＳの７５％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの８０％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。さらに別の実施形態において、そのＬＰＳの８５％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。ある代替的実施形態において、そのＬＰＳの９０％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９５％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９７％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９９％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９９．９％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。ある実施形態において、ＬＰＳを分離及び／又は除去した後、タンパク質をレジンから溶出することができる。本分野で一般的であり、そのレジンに対して適切な方法により、タンパク質が溶出され得る。ある例において、イオン交換体に対して、ｐＨの変化及び／又はコンダクティビティーの上昇を使用してタンパク質を溶出することができる。
【００１９】
ある実施形態において、そのレジンから溶出されるタンパク質の５０％がＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の７５％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の８０％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の８５％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９０％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９５％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９７％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９９％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９９．９％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。
【００２０】
様々な実施形態において、レジンからタンパク質を除去／分離するために別の洗浄法が利用される。代替的な実施形態において、レジンからタンパク質が遅れて溶出されるというだけであるように、タンパク質は洗浄なしで溶出され、それにより、タンパク質からＬＰＳが分離される。分離の度合いは、使用するレジンに依存して様々であり得る。同様に、ＬＰＳ又はタンパク質成分が他方の成分と異なる時間に溶出されるというように、ＬＰＳ−タンパク質複合体の溶出プロファイルを変化させるようにレジンを構築することができる。
【００２１】
従って、本発明の様々な実施形態には、
リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質をイオン交換レジンに固定化する段階と；
前記レジンをアルカンジオールで洗浄し、それにより前記ＬＰＳの少なくとも一部が前記複合体から分離される段階と；
前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法、のような方法が含まれる。
【００２２】
代替的な実施形態において、ＬＰＳはレジンに付着させられ、タンパク質が最初に溶出される。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明は、アルカンジオールでリポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を洗浄することを含む、リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を分解するための方法を含む。
【００２４】
またさらなる実施形態において、本発明は、レジンをアルカンジオールで洗浄する段階を含む、レジンにおけるタンパク質の保持時間を延長させるための方法を含む。そのような実施形態の例において、ＬＰＳを除去するために１，２−ヘキサンジオールなどのヘキサンジオールで洗浄した後、レジンにおける塩濃度を上げることにより、タンパク質が溶出されなくなる。このような実施形態は、高塩濃度環境に対して有用であり、及び、タンパク質に対するレジンの選択性を変更させたいと考え得る場合に有用である。
【００２５】
従って、本発明の実施形態はさらに、
タンパク質−ＬＰＳ複合体をイオン交換レジンに固定する段階と、
該レジンを１，２−ヘキサンジオールで洗浄し、それによりエンドトキシンの少なくとも一部が前記複合体から分離される段階と、
ｐＨを変化させることにより前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、高塩濃度、高コンダクティビティー環境においてタンパク質−ＬＰＳ複合体からＬＰＳを分離する方法を含む。このタイプの好ましい実施形態において、アルカンジオール濃度は、約５％を超える。しかし、あらゆる濃度を使用し得る。
【００２６】
本発明をその具体的な実施形態と関連させて説明してきたが、更なる改変が可能であり、添付の請求項が、一般的に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野の範囲内にある既知の、もしくは慣習的な実施を超えないような、かつ、現存するもの又は後に生じるもののいずれであれ、上文に述べた本質的な特徴に対して適用され得るような、本発明の開示からの逸脱を含む、あらゆる変形、使用又は適用を包含することを意図していることを理解されたい。さらに、本発明の実施形態は、具体的な規格特性及び／又は寸法とともに説明してきたが、本実施形態が、本発明の原則から逸脱することなく、異なる規格特性及び／又は寸法が可能であり、添付の請求項が、このような違いを網羅するものであることを理解されたい。さらに、本明細書中で言及する特許は全て、参考として本明細書中で援用する。
【００２７】
本発明の様々な実施形態のさらなる理解のために、次の実施例を参照されたい。
【００２８】
実施例及び実験
材料
ウシアルブミン（ＢＳＡ）、ウシホロトランスフェリン、ウシ乳由来ラクトフェリン、ニワトリ卵白由来リゾチーム、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ５５：Ｂ５由来のリポ多糖類及びＢＳＴＦＡは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。酢酸、Ｔｒｉｓ（塩基）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、塩酸、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、エタノール、イソプロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びリン酸水素２ナトリウム７水和物は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から購入した。１，６−ヘキサンジオールは、ＢＡＳＦ Ｃｏ．（Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）から購入した。１，２−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４（Ｚｗ３−１４）は、Ｆｌｕｋａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。１，４−ブタンジオール及びエチレングリコールは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１０ｘは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）ＦＬ共役リポ多糖類、血清型Ｏ５５：Ｂ５（ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ）及びＥｎｚＣｈｅｋリゾチームアッセイキットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。Ｐｙｒｏｓｏｌ、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）Ｐｙｒｏｔｅｌｌ−Ｔ、ＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ）及びＥ．コリ Ｏ１１３：Ｈ１０（ＣＳＥ）由来の対照標準エンドトキシンは、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．（Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）から入手した。ＳＰセファロースファストフロー（ＳＰＦＦ）レジン、Ｑセファロースファストフロー（ＱＦＦ）レジン及びＨＲ１０／１０カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）より得た。透明なポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートは、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．（Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）から入手し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレートは、ＮＵＮＣ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から入手した。β−ヒドロキシテトラデカン酸、β−ヒドロキシトリデカン酸、β−ヒドロキシウンデカン酸、β−ヒドロキシトリデカノエート、β−ヒドロキシテトラデカノエート及びβ−ヒドロキシウンデカノエートは、Ｍａｔｒｅｙａ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡ）から購入した。ヘプタンは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）から購入した。
【００２９】
方法
粘性測定
粘性測定のために、ＵＬＡ−Ｙアダプターを備えたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｍｏｄｅｌ １ ＬＶＴ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）を使用した。測定は全て、２０℃にて行った。
【００３０】
ＬＰＳ−タンパク質複合体形成
１０ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、カラム平衡化緩衝液中でタンパク質保存溶液を調製した。１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中でＬＰＳ Ｏ５５：Ｂ５保存溶液を調製し、ＰＢＳ又はカラム平衡化緩衝液中で、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ保存溶液を調製した。これは、１０，０００ＤａのＯ５５：Ｂ５ＬＰＳの分子量に基づくと、およそ１００μＭ 最終濃度である。
【００３１】
１部のＬＰＳ溶液を９部のタンパク質溶液（ｖ／ｖ）に、ポリプロピレン試験管へ添加することにより、ＬＰＳ−タンパク質複合体を形成させた。その試験管をボルテックスにかけ、アルミ箔で包み、次に、ＢＳＡ及びトランスフェリンの場合は室温にて１６時間から７２時間、又は、ラクトフェリンの場合は、３７℃にて少なくとも４時間、インキュベーションを行った。
【００３２】
ＬＡＬ及びＢＯＤＩＰＹ分析
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ蛍光マイクロプレートアッセイのために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳマイクロプレート蛍光分光光度計を使用し、ＬＡＬカイネティック比濁法（ＫＴＡ）のために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレート蛍光分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。標準物質は、３重測定で分析し、試料は、２重又は３重測定で分析した。その結果をプロットし、ＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア バージョン３．１．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で解析した。
【００３３】
Ａ．ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳアッセイ
０．８１μＭから０．０３μＭのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ保存溶液の３段階連続希釈液を調製した。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳアッセイの分析方法は、次のように、Ｙｕ及びＷｒｉｇｈｔ（１９９６）により用いられたアッセイを改変したものであった。黒色のマイクロタイタープレートの各ウェルに、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で調製した１５％ ＳＤＳ ２０μｌ、続いて、試料又は標準物質 １８０μｌを添加した。そのプレートを３７℃にて１０秒間振盪し、蛍光モードですぐに読み取った。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳに対して、最適の励起（４９０ｎｍ）、発光（５２５ｎｍ）及びカットオフ波長（５１５ｎｍ）を測定した。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳに対するアッセイは、０．０１μＭ（１８ｎｇ）未満の／ＬＯＱ値の検出限界及び０．０３μＭ（５４ｎｇ）の定量限界で、０．０３μＭから０．８１μＭ（５４ｎｇから１４５８ｎｇ）の直線的範囲を示した。
【００３４】
Ｂ．ＬＡＬカイネティック比濁法（ＫＴＡ）
必要に応じて、試料のｐＨをＰｙｒｏｓｏｌで６から８に調整した。ＣＳＥ及びＰｙｒｏｔｅｌｌ−ＴをＬＲＷで再構成した。ＣＳＥの直線は、０．０３ＥＵ／ｍｌから１．００ＥＵ／ｍｌであった。ＬＡＬ ＫＴＡの分析方法は次の通りであった。透明なポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウェルに、試料又は標準物質 １００μｌ及びＰｙｒｏｔｅｌｌ−Ｔ １００μｌを添加した。スパイク試料に対して、２．００ＥＵ／ｍｌ ＣＳＥ ５μｌを添加し、０．１０ＥＵ／ｍｌ ＣＳＥレベルにした。そのプレートを１０秒間振盪し、３７℃にて１時間、４０５ｎｍにて、カイネティックモードで、１分ごとにデータを回収した。
【００３５】
Ｃ．ガスクロマトグラフィーによるＬＰＳ分析
ガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣＭＳ）による試料中に存在するＬＰＳの相対的レベルに関する定量的分析は、Ｍｉｅｌｍｃｚｕｌら（１９９２）による方法に基づいており、Ａｇｉｌｅｎｔ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）からの、５９７３質量選択検出器とともに６８９０ガスクロマトグラフを利用した。使用したカラムは、Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）からのＤＢ−５ＭＳカラム（３０ｃｍｘ０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．ｘ０．２５μｍフィルム厚）であった。サロゲート化合物及び標的化合物に対する直線は、１．６ｐｇ／μｌから１００ｐｇ／μｌの範囲であり、内部標準は、５０ｐｇ／μｌで一定に維持した。簡潔に述べると、試料調製及びＧＣＭＳ分析方法は、次のとおりであった。試料及びサロゲート物質であるβ−ヒドロキシトリデカン酸の既知量を５ｍｌの硝子製の反応バイアルに添加した。水性試料を６Ｎ ＨＣｌ中、９０℃から１００℃にて一晩加水分解し、ＬＰＳからβ−ヒドロキシテトラデカン酸を遊離させた。ヘプタンを用いてその脂肪酸を加水分解物から２回抽出し、次に窒素下で乾燥させた。８０℃から９０℃にて、３Ｎ メタノールＨＣｌ中で３０分間インキュベーションすることによりその脂肪酸をメチル化した。水を添加して反応を停止させ、次に、ヘプタンを用いてそのメチルエステルを２回抽出した。次にそのメチルエステルを窒素下で乾燥させた。ＢＳＴＦＡ／ピリジン（２：１、ｖ／ｖ）を添加し、窒素下で最後に乾燥させる前に、１５分から２０分間、８０℃から９０℃にてインキュベーションすることにより、そのメチルエステルを誘導体化した。ヘプタン中で調製した５０ｐｇ／μｌの内部標準、メチル−３−トリメチルシリル−ウンデカン酸中で、試料を再構成した。標準物質及び試料をスプリットレスモードにおいて、１μｌ注入体積で注入した。最初のオーブン温度を９０℃にて４分間保持し、次に、１分あたり２０℃の割合で２５０℃まで変化させ、続いて、１分当たり１０℃の割合で３００℃まで変化させた。マススペクトロメーターは、ＥＭオフセット電圧を５００、溶媒遅延を５．２分に設定した。イオン１７５及び２７３においてメチル−３−ＴＭＳ−ウンデカノエートを、１１．０分及びイオン１７５及び３０１においてメチル−３−ＴＭＳ−トリデカノエートを、１１．７分及びイオン１７５及び３１５でメチル−３−ＴＭＳ−テトラデカノエートをモニターするために選択的イオンモニタリングを使用した。ＭＳＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙソフトウェアに対してＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎを用いてクロマトグラムを作成した。
【００３６】
リゾチームアッセイ
製造者の使用説明書に従い、ＥｎｚＣｈｅｋリゾチームアッセイキットを用いて、リゾチーム活性を測定した。
【００３７】
クロマトグラフィー
クロマトグラフィーは全て、グラディエントポンプ（Ｐ−９００）、５００μｌ又は２０００μｌ注入ループ、可変波長検出器（ＵＶ−９００）及びｐＨならびにコンダクティビティーモニター（ｐＨ／Ｃ−９００）を備えたＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。クロマトグラフィー実験は全て、室温にて、２００ｃｍ／ｈｒから３００ｃｍ／ｈｒの流速で行った。アルカンジオール洗浄中に、アルカンジオール溶液の粘性が高まることによるシステムの背圧上昇を最小限にするために、流速を１５０ｃｍ／ｈｒから２００ｃｍ／ｈｒに減速した。Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア バージョン３．２１又は４．０を用いてクロマトグラムを作成した。レジンは、１ｃｍ直径のカラム中に、７ｃｍから１１ｃｍの層高でパックされていた。各クロマトグラフィーを行う前に、０．５Ｎ ＮａＯＨで６０分から１２０分間、又は０．１Ｎ ＮａＯＨで１６時間超のいずれかで、ＡＫＴＡ及びカラムを浄化した。次に、適切な緩衝液でシステムを平衡化する直前にカラム及びＡＫＴＡをＭｉｌｌｉ−Ｑ水でリンスした。
【００３８】
平衡化緩衝液と同じ化学成分及びｐＨを有するｖ／ｖ溶液として、アルカンジオール、エタノール及びイソプロパノールを調製し、同時に、１，６−ヘキサンジオール及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４をｗ／ｖ溶液として調製した。
【００３９】
Ｄ．陽イオン交換クロマトグラフィー
トランスフェリンに対して、ＳＰセファロースファストフローカラムに１００ｍＭ アセテート、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５を加え、１００ｍＭ アセテート、ｐＨ５で平衡化した。添加後、平衡化緩衝液でレジンを洗浄し、次に、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で溶出した。有機又は洗剤洗浄を行う場合は、最初の洗浄ステップ後に添加し、特に指定のない限り、６ＣＶとした。この洗浄に続いて、有機又は洗剤を除去するために溶出前に平衡化緩衝液で第二の洗浄を行った。
【００４０】
ＢＳＡに対するクロマトグラフィーは、全てのクロマトグラフィー緩衝液のｐＨが４．５であったことを除き、トランスフェリンに対するものと同じであった。１，２−ヘキサンジオールを洗浄剤として用いる場合、溶出は、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に変更した。
【００４１】
ラクトフェリンクロマトグラフィーは、レジンに１Ｍ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を加え、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中で平衡化し、１Ｍ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出したことを除き、トランスフェリンと同様であった。
【００４２】
リゾチームに対するクロマトグラフィーは、レジンに１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中で平衡化し、１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で溶出したことを除き、トランスフェリンの場合と同様であった。
【００４３】
Ｅ．陰イオン交換クロマトグラフィー
ＢＳＡに対して、Ｑセファロースファストフローカラムに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で溶出した。添加後、レジンを平衡化緩衝液で洗浄した。２５ｍＭ アセテート、ｐＨ４．５でＢＳＡを溶出し、ＬＰＳを２５ｍＭ アセテート、１ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５で溶出した。アルカンジオール洗浄を行った場合は、最初の洗浄ステップ後にそれを行い、６ＣＶとした。この洗浄に続き、アルカンジオールを除去するために平衡化緩衝液で第二の洗浄を行った。
【００４４】
結果及び考察
表Ｉは、この研究で使用したタンパク質の分子量及び等電点をまとめたものである。ＢＳＡ、トランスフェリン及びラクトフェリンは全て、ＬＰＳとの結合を示した（Ｄｚａｒｓｋｉ、１９９４；Ｂｅｒｇｅｒ及びＢｅｇｅｒ，１９８７；及びＡｐｐｅｌｍｅｌｋら、１９９４）。酵素活性における洗浄剤の影響を評価するためにリゾチームを使用した。
【００４５】
表Ｉ この研究で使用したタンパク質の分子量及び等電点
【００４６】
【表１】
【００４７】
表ＩＩは、この研究で使用したアルカンジオールのいくつかの生理学的特性をまとめたものである。比較を行うために、他の方法において（Ｆｒａｎｋｅｎら、２０００）ＬＰＳ除去のために用いられてきたエタノール及びイソプロパノールも含まれている。
【００４８】
表ＩＩ この実験で用いたアルカンジオールの生理学的特性
【００４９】
【表２】
【００５０】
有機物及び洗剤によるＬＰＳ−タンパク質複合体の分離
ＬＰＳ及びＬＰＳ−タンパク質複合体のＳＰセファロースファストフロークロマトグラフィー
選択したカラム分画のＬＡＬ−ＫＴＡ分析により、ＳＰセファロースファストフローレジンにおけるＬＰＳ単独及びＬＰＳ−ＢＳＡ複合体のＬＰＳ溶出プロファイルを調べた（表ＩＩＩ）。ＬＰＳをそれのみでクロマトグラフィーに供した場合、予想通り、洗浄−非結合分画において最初にＬＰＳが検出された。ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体のクロマトグラフィーの結果、ＢＳＡ溶出液分画において、ＬＰＳの大部分が検出され、これにより、ＢＳＡのＬＰＳ結合特性（Ｄｚｉａｒｓｋｉ、１９９４）が確認され、ＢＳＡ−ＬＰＳ複合体が、用いた陽イオン交換クロマトグラフィー条件下で安定であることが示された。
【００５１】
表ＩＩＩ ＬＰＳ及びＬＰＳ−ＢＳＡのＳＰＦＦクロマトグラフィー溶出プロファイル
ＳＰセファロースファストフローを用いて、ＬＰＳ及びＬＰＳ−ＢＳＡ複合体をクロマトグラフィーに供した。前記方法で述べたようにしてＬＡＬ ＫＴＡにより、ＬＰＳについてカラム分画を分析した。
【００５２】
【表３】
【００５３】
ＬＡＬ ＫＴＡは、カラム分画におけるＬＰＳの分布を調べるために使用するには困難であり高コストのアッセイである。カラム分画をモニターするために、ＬＰＳに対する蛍光を利用したアッセイが開発された。このアッセイでは、非標識ＬＰＳの代わりに、蛍光性のタグを付加したＬＰＳ、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを用いており、それにより、蛍光分光法を用いてカラム溶出液の分析を迅速に行うことができる。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ共役物におけるＢＯＤＩＰＹマーカーの蛍光は、ＬＰＳがそれ自身又はタンパク質と複合体を形成すると消えることが明らかになっている。試料へＳＤＳを添加すると、ＬＰＳ−ＬＰＳ又はＬＰＳ−タンパク質複合体が解消され、その結果、蛍光が増強する（Ｙｕ及びＷｒｉｇｈｔ、１９９６）。クロマトグラフィー分画におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの迅速かつ定量的な分析を可能にするマイクロタイタープレートを用いたアッセイとして、このアッセイが開発された。
【００５４】
ＢＯＤＩＰＹマーカーがＢＳＡ−ＬＰＳ複合体形成を妨害するか、又は陽イオン交換クロマトグラフィー中に異なる挙動を示すかを調べるために、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質複合体を用いて複合体先行分析を繰り返した。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質複合体の溶出プロファイルは、上記のＬＰＳ及びＬＰＳ−ＢＳＡの溶出プロファイルと同様であった（表ＩＶ）。これにより、ＢＯＤＩＰＹマーカーがＢＳＡ又はトランスフェリンのＬＰＳとの結合能を妨害しないこと、及び、ＢＯＤＩＰＹ基がＬＰＳのクロマトグラフィープロファイルを変化させないことが示された。図１は、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ（Ａ）及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体（Ｂ）に対する典型的なＳＰセファロースファストフロープロファイルを示す。
【００５５】
表ＩＶ ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質のＳＰＦＦクロマトグラフィー溶出プロファイル
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質複合体をＳＰセファロースファストフローを用いてクロマトグラフィーに供した。前記方法で述べたようにして、ＢＯＤＩＰＹアッセイにより、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳについて、カラム分画を分析した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
ＳＰセファロースファストフロークロマトグラフィー中の、アルカンジオールによる、ＬＰＳ−タンパク質複合体からのＬＰＳの減少
最初の実験において、５０％ １，６−ヘキサンジオール洗浄段階が陽イオン交換クロマトグラフィー中にＢＳＡと複合体形成しているＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの量を減少させる可能性について調べた。１，６−ヘキサンジオールを用いた３カラム体積（ＣＶ）洗浄により、ＢＳＡと複合体形成しているＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの量が約２１％減少した。３ＣＶから６ＣＶに１，６−ヘキサンジオール洗浄段階の長さを延長することにより、ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去が約４９％まで促進された。１，６−ヘキサンジオール洗浄段階をさらに３ＣＶ増加させて９ＣＶにすることにより、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去が促進された（５１％）。さらなる実験は全て、６ＣＶ アルカンジオール洗浄段階を用いて行った。
【００５８】
タンパク質がイオン性固形支持体に結合している際の、一連のアルカンジオールの、タンパク質からのＬＰＳ除去効果を、エタノール、イソプロパノール及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４と比較したところ、ＬＰＳ結合タンパク質からのＬＰＳの除去において効果的であることが明らかとなった。ＳＰセファロースファストフローカラムにＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体を添加した。５０％ アルカンジオール溶液 ６カラム体積でそのレジンを洗浄し、次に、溶出した。分画を回収し、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳについて分析した（図２）。アルカンジオールの鎖長が４から６炭素に長くなると、アルカンジオール洗浄分画の蛍光が増強し、一方、溶出分画の蛍光が減弱した。これにより、アルカンジオールがトランスフェリン複合体からＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを除去することが明らかになった。図３及び４は、トランスフェリン及びＢＳＡそれぞれからのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ除去におけるアルカンジオール構造の効果を説明する。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ除去効率は、アルカンジオール鎖長が長くなるにつれて高くなり、１，２−アルカンジオール異性体は、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去において、末端アルカンジオールよりも効果的であった。１，２−ヘキサンジオールは、試験した化合物の中で最も高効率の化合物であり、洗剤及びアルコールよりも優れていた。１，２−ブタンジオール及び１，６−ヘキサンジオールならびに５０％ イソプロパノール及び７５％ エタノールは、トランスフェリンと会合しているＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを同程度のレベルまで減少させた。アルカンジオールによるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去は、トランスフェリン及びＢＳＡ複合体の両方に対して同程度であった。
【００５９】
図２に対する参照は、アルカンジオール洗浄を組み合わせた、ＳＰセファロースファストフローにおける、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ-トランスフェリン複合体のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ溶出プロファイルを示す。
【００６０】
図３は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出液におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少を説明する。クロマトグラフィーは、図２において述べたものと同じである。０％減少は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，６−ヘキサンジオール；４、エチレングリコール；及び５、１，４−ブタンジオール。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体を生成させ、ＳＰセファロースファストフローカラムに添加し、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール又は１，２−ヘキサンジオールの５０％溶液でそのレジンを洗浄した。アルカンジオールを除去するために洗浄した後、上記方法で述べるようにしてトランスフェリンを溶出した。実験間の浄化は、０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて行った。
【００６１】
図４は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少を説明する。クロマトグラフィーは、図２において述べたものと同じである。０％減少は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，２−ブタンジオール；４、１，６−ヘキサンジオール；及び５、５０％ イソプロパノール；６、７５％ エタノール；７、１，４−ブタンジオール；及び８、エチレングリコール。
【００６２】
洗浄に１，２−ヘキサンジオールを用いたトランスフェリンに対する実験中、１Ｍ ＮａＣｌを含み、溶出緩衝液のｐＨがｐＨ５に維持された場合は、トランスフェリンがレジンから溶出されなかったことが認められた。１，２−ヘキサンジオール濃度を１０％に下げると、トランスフェリン保持の延長が観察された。５％の１，２−ヘキサンジオール濃度において、トランスフェリン保持は変化しなかった。ポリエチレングリコール及び他の中性重合体の存在下におけるイオン交換クロマトグラフィー中は、他のタンパク質に対して保持時間の変化が観察されている（Ｍｉｌｂｙら、１９８９及びＧａｇｎｏｎら、１９９６）。タンパク質保持時間の変化は、ポリエチレングリコールの大きさ及び濃度、ならびにタンパク質そのものに依存した。一方、４０％以下の濃度のエチレングリコールはタンパク質保持時間に影響を与えなかった（Ｔａｕｃら、１９９８）。これらの例において、研究対象の化合物がクロマトグラフィー緩衝液全てに含まれていることに留意されたい。１，２−ヘキサンジオールの場合は、洗浄緩衝液のみに含まれており、その後、タンパク質溶出前にさらなる洗浄段階により除去した。
【００６３】
１，２−ヘキサンジオールは、トランスフェリン及びＢＳＡの両方からＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを除去することについて試験したものの中で最も効果的な化合物であったので、この除去に影響を与えるために必要な１，２−ヘキサンジオール洗浄の濃度依存性を調べた。５％、２０％及び５０％ １，２−ヘキサンジオールを含有する１，２−ヘキサンジオール洗浄後に、ＳＰセファロースファストフローＢＳＡ溶出分画におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少を調べた。５％ １，２−ヘキサンジオール洗浄の結果、ＢＳＡ会合ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳが約５５％減少し、一方で、２０％及び５０％ １，２−ヘキサンジオール洗浄によるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少は、同程度であり、約９６％であった。
【００６４】
トランスフェリン及びＢＳＡに加えて、蛍光ＢＯＤＩＰＹアッセイを用いて、１，６−ヘキサンジオールによるラクトフェリン複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ除去もまた調べた。次に、ＧＣ−ＭＳを用いたＬＰＳマーカー化合物 ３−ＯＨ−１４：０脂肪酸に関する試料の分析により、その分析結果を確認した。表Ｖは、そのデータをまとめたものであり、クロマトグラフィーにおいて、アルカンジオール洗浄（この場合は１，６−ヘキサンジオールである。）がラクトフェリン溶出液中のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳレベルを低下させる能力が再び示されている。ＢＯＤＩＰＹ蛍光アッセイによりＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳのおよそ８７％の減少が、ＧＣ−ＭＳアッセイによりＬＰＳマーカーにおいて９１％の減少が観察された。
【００６５】
表Ｖ ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ラクトフェリン複合体のＳＰＦＦクロマトグラフィー溶出プロファイル
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ラクトフェリン複合体を生成させ、ＳＰセファロースファストフローカラムに添加した。上記方法で述べたように、１，６−ヘキサンジオールの５０％溶液を含む実験に対して、ラクトフェリン溶出前に、１，６−ヘキサンジオールを除去するための洗浄を行った。前記方法において述べたように、ＢＯＤＩＰＹ及び３−ＯＨ−１４：０脂肪酸について、カラム分画をアッセイした。
【００６６】
【表５】
【００６７】
クロマトグラフィー実験中に、アルカンジオール洗浄を適用した際、システムの背圧の上昇が認められた。１００ｍＭアセテート、ｐＨ４．５中で調製した各有機溶液及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）溶液の粘性を測定した（図５）。アルカンジオールの粘性は、炭素鎖長とともに上昇し、一方、１，２−アルカンジオール異性体の粘性は、末端アルカンジオール異性体よりもわずかに低かった。アルカンジオール溶液の粘性が上昇することで、規模を大きくする際にいくつかの問題が起こり得る。カラム流速は、使用中の装置に対して適切なシステム圧を維持するように調整しなければならない場合がある。タンパク質−ＬＰＳ複合体からＬＰＳを除去するために低濃度のアルカンジオールを使用できるようにすることで、この問題はある程度解決するであろう。例えば、２０％及び５０％の１，２−ヘキサンジオール洗浄は、上述のように、ＢＳＡ複合体に対してほぼ同レベルでＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを効果的に減少させる。２０％ １，２−ヘキサンジオールの粘性は、５０％ ヘキサンジオールの粘性が７．５Ｃｐであるのに対し、２．６Ｃｐであるというように、５０％ ヘキサンジオールの約３分の１である。
【００６８】
Ｑセファロースファストフロークロマトグラフィー中のアルカンジオールによるＬＰＳ−タンパク質複合体からのＬＰＳの減少
ＬＰＳ−タンパク質複合体からのＬＰＳの除去は、特に塩基性タンパク質に対して、陰イオン交換レジンにおいてより複雑である。陽イオン交換クロマトグラフィー中に、負に荷電しているＬＰＳは、そのレジンの官能基に引き付けられず、アルカンジオール洗浄中にカラムから洗い流されるが、一方、その洗浄条件下でタンパク質は結合したままとなる。陰イオン交換クロマトグラフィー中では、ＬＰＳ及びタンパク質は両方とも、そのレジンの官能基に保持される。従って、その複合体は、分解される必要があり、タンパク質とＬＰＳが別々に溶出されねばならない。
【００６９】
Ｑセファロースファストフローレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー中にＢＳＡ−ＬＰＳ複合体のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳレベルを減少させる１，６−ヘキサンジオール及び１，２−ヘキサンジオールの能力を調べた。ヘキサンジオールの２種類の異性体、１，２−及び１，６−は、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいてタンパク質複合体からＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳレベルを減少させる上で最も効果的な化合物であったので、これらを選択した。
【００７０】
１，２−ヘキサンジオール洗浄を適用した後の陰イオン交換レジンからのＢＳＡの溶出を変化させて、陽イオン交換レジンにおいてトランスフェリンについて観察した。１，２−ヘキサンジオール洗浄後にＢＳＡの溶出に影響を与えるために溶出緩衝液の塩濃度を高くした結果、遊離ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳがＢＳＡとともに溶出された。ｐＨに基づき代替的な溶出スキームを選択した。１，２−ヘキサンジオール洗浄が完了し、１，２−ヘキサンジオールの流出が起こった後、ｐＨ４．５でＢＳＡを溶出した。この後、レジンをストリッピングし、それにより、１Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ４．５緩衝液を用いて残留ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを回収した。表ＶＩは、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去に対する１，２−ヘキサンジオールの効果をまとめたものである。１，２−ヘキサンジオール洗浄を取り入れることで、ＢＳＡ溶出液のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳが約２９％減少し、代わりに、１，２−ヘキサンジオール洗浄分画においてＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳが明らかに溶出された。
【００７１】
表ＶＩ ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体のＱＦＦ溶出プロファイル
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体をＱ−セファロースファストフローを用いたクロマトグラフィーに供した。前記方法において述べたようにして、ＢＯＤＩＰＹアッセイにより、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳについてカラム分画を分析した。
【００７２】
【表６】
【００７３】
酵素活性におけるアルカンジオールの影響
ＳＰセファロースファストフロークロマトグラフィー中の、酵素活性に対する洗浄剤の影響及びそれによる洗浄剤の間接的な変性効果を調べるために、リゾチームを使用した。６ＣＶ ％５０ １，６−ヘキサンジオール洗浄もしくは１，２−ヘキサンジオール洗浄を行い、又は行わずに、リゾチームに対してクロマトグラフィーを行い、蛍光マイクロプレートリゾチーム活性アッセイを用いてリゾチーム活性についてカラム添加液及び溶出液をアッセイした。ヘキサンジオール洗浄は、リゾチーム活性に有害な影響を与えなかった。７５％ エタノール、５０％ イソプロパノール及び１％ Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４洗浄もまたリゾチーム活性に影響を与えなかった。
【００７４】
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１５．Ｔａｕｃ，Ｐ．，Ｃｏｃｈｅｔ，Ｓ．，Ａｌｇｉｍａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌｅｂａｕｔ，Ｉ．，Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｊ．−Ｐ．，Ｂｒｏｃｈｏｎ，Ｊ．Ｃ．，及びＢｅｒｔｒａｎｄ，Ｏ．（１９９８）Ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｔｏ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ ｃｏｒｎ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８２５，１７−２７．
１６．Ｍｉｌｂｙ，Ｋ．Ｈ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｖ．，及びＨｅｎｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．（１９８９）Ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ４８２，１３３−１４４．
［ｉ］Ｔ．Ａ．Ｈａｕｓｅｒ及びＫ．Ｊ．Ｈａｙｅｎｇａ，Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，国際特許ＷＯ０２／０７４７９１ Ａｌ （２００２）．
［ｉｉ］Ｒ．Ｌ．Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｇ．Ｓ．Ｂｌａｎｋ，及びＤ．Ｈ．Ｒｅｉｆｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８３０（１９９９）１２７−１３４．
［ｉｉｉ］Ｒ．Ｌ．Ｆａｈｒｎｅｒ及びＤ．Ｒｅｉｆｓｎｙｄｅｒ 米国特許ＵＳ第６，２６５，５４２ Ｂ１号（２０００）．
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】図１ａは、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳのＳＰ セファロースファストフロー溶出プロファイルの説明図である。破線は、２８０ｎｍのＵＶシグナルであり、実線は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表されたＢＯＤＩＰＹ蛍光に対応する。
【図１ｂ】図１ｂは、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体のＳＰセファロースファストフロー溶出プロファイルの説明図である。破線は、２８０ｎｍのＵＶシグナルであり、実線は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表されたＢＯＤＩＰＹ蛍光に対応する。
【図２】図２は、アルカンジオール洗浄を組み合わせた、ＳＰセファロースファストフローにおけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−溶出プロファイルの説明図である。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体を生成させ、ＳＰセファロースファストフローカラムに添加し、そのカラムを１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール又は１，２−ヘキサンジオールの５０％溶液で洗浄した。
【図３】図３は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少の説明図である。０％減少は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，６−ヘキサンジオール；４、エチレングリコール；及び５、１，４−ブタンジオール。
【図４】図４は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出における、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少の説明図である。０％低下は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，２−ブタンジオール；４、１，６−ヘキサンジオール；及び５、５０％ イソプロパノール；６、７５％ エタノール；７、１，４−ブタンジオール；及び８、エチレングリコール。
【図５】図５は、１００ｍＭ アセテート、ｐＨ４．５中のアルカンジオール、イソプロパノール、エタノール及びＺｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）溶液の粘性の説明図である。溶液は全て、１００ｍＭ アセテート緩衝液、ｐＨ４．５で調製した。１、５０％ １，６−ヘキサンジオール；２、５０％ １，２−ヘキサンジオール；３、５０％ １，４−ブタンジオール；４、５０％ １，２−ブタンジオール；５、５０％ エチレングリコール；６、５０％ イソプロパノール；７、７５％ エタノール；８、１％ Ｚｗ ３−１４；及び９、１００ｍＭ アセテート、ｐＨ４．５
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、全体として、タンパク質−リポ多糖類複合体からのリポ多糖類（ＬＰＳ）の除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖類（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の外膜の主要成分である。ＬＰＳのエンドトキシン成分は、リピドＡ部分である。これは、６個以下のアシル鎖で置換されている１，６−結合Ｄ−グルコサミン残基及びさらなる多糖繰り返し単位が結合され得るコア多糖構造を含有する。エンドトキシンは、低用量では生来の免疫系の強力なアクチベーターであるが、同時に、高用量では、エンドトキシンは、敗血性ショックや死亡を含む多くの他の生理反応を誘発する（Ｈｅｉｎｅら、２００１）。
【０００３】
従って、治療薬へのエンドトキシンの混入は、このような製品の製造者にとって最も関心のある事柄である。
【０００４】
グラム陰性細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から多くの組み換えタンパク質が産生される。これらの組み換えタンパク質からのＬＰＳの除去は複雑であるが、特に、そのタンパク質が治療に使用されるものである場合、不可欠な方法であり得る。エンドトキシン分子のユニークな分子特性に基づいてタンパク質からＬＰＳを除去するための多くの様々な方法が開発されてきた。これらの方法には、ＬＰＳアフィニティーレジン、２相抽出、限外濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び膜吸着体（Ｐｅｔｓｃｈ及びＡｎｓｐａｃｈ，２０００により概説されている。）が含まれる。これらの方法では、タンパク質からのＬＰＳの分離の成功の度合いにばらつきがあり、そのばらつきの大部分は、目的とするタンパク質の特性に依存する。
【０００５】
多くの場合、組み換えタンパク質生成中、タンパク質−ＬＰＳ相互作用によりタンパク質からのＬＰＳの分離が困難になる。例えば（これに限定するものではないが）、Ｅ．コリ発現系から産生される組み換えタンパク質において、である。既報の、タンパク質からＬＰＳを分離するための方法のいくつかは、変性疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｗｉｌｓｏｎら、２００１）、そのタンパク質をイオン交換クロマトグラフィー媒体に固定すると同時にエタノール、イソプロパノール（Ｆｒａｎｋｅｎら、２０００）又は洗剤（Ｆｉｓｋｅら、２００１）洗浄を行うことを含め（これに限定される必要はない。）、研究されてきた。
【０００６】
いくつかの実験から、イオン交換クロマトグラフィー中のアルコール及び洗剤洗浄が、ＬＰＳ結合タンパク質レベルの低下に効果的であり、一方、変性ＨＩＣ法ではタンパク質からのＬＰＳの分離度が低いことが示されている。洗剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１２又は３−１４）は、前記アルコールよりも効果的な洗浄剤であることが示された。陰イオン交換レジンとは対照的に、ＬＰＳ−タンパク質複合体が陽イオン交換レジンに結合させた場合も、ＬＰＳのクリアランスが向上したが、ＬＰＳ除去のために使用した洗浄方法は両方のマトリクスに効果的であった。この洗浄法を陽イオン交換体で行った場合、ＬＰＳ−タンパク質相互作用が崩れた時点で、タンパク質を保持しながらそのＬＰＳをそのカラムから洗い去ることになろう。陰イオン交換クロマトグラフィーの場合、ほとんどのｐＨで負に荷電しているＬＰＳは、タンパク質とともにレジンに結合したままである。そのアルコール及び洗剤洗浄がＬＰＳ−タンパク質複合体におけるＬＰＳレベル低下の面で功を奏するものであったとしても、製造環境においてこれらの方法のいずれかを大規模にし、導入することは現実的とは言えない。効率的にＬＰＳ結合タンパク質のＬＰＳレベルを低下させるのに必要なエタノール及びイソプロパノール濃度は、５０％（ｖ／ｖ）を超えるものであった。これらの濃度において、これらの溶液は可燃性液体であり、多くの安全性及び操作上の規制が課せられると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＬＰＳレベル低下に非常に効果的であったとしても、洗剤は比較的高価であり、製造方法に莫大なコストを付加し、目的のタンパク質の生物活性に影響を与え得る。従って、クロマトグラフィーユニット操作中のタンパク質からのＬＰＳの分離のための洗浄剤としてのアルコール及び洗剤に代わり、安全かつ費用効果的に使用できる代替物となる化学物質が必要とされている。理想的には、これらの化学物質は、比較的安価で、明確に化学的で、安全性の問題が最小限であり、方法に導入した場合、目的とするタンパク質の生物活性にできる限り影響を与えないものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、全体として、アルカンジオールの、タンパク質からのリポ多糖類（ＬＰＳ）又は他のエンドトキシン分離能に関する。ある実施形態において、アルカンジオールは、ＬＰＳ−タンパク質複合体からＬＰＳを分離することができる。従って、本発明の実施形態は、全体として、ＬＰＳ−タンパク質複合体からＬＰＳを分離するための、アルカンジオール用いる方法に関する。さらなる実施形態において、本複合体は、レジンに固定化され、そこからＬＰＳが分離される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書中で使用される場合、「アルカンジオール」という用語は、一般式 ＣｎＨ２ｎ（ＯＨ）２を有する非芳香族飽和炭化水素を意味し、指す。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、タンパク質−ＬＰＳ複合体及びＬＰＳ−タンパク質複合体という用語は、同義的である。このタンパク質−ＬＰＳ複合体は、例えば（限定的なものではないが）、分子内力／分子間力によるような緩い会合、又は結合であり得る。
【００１１】
一般に、本発明の実施形態は、タンパク質−リポ多糖類（又は他のエンドトキシン含有物質）複合体からリポ多糖類又はエンドトキシンを分離するための方法に関する。ある実施形態において、タンパク質−リポ多糖類複合体からリポ多糖類を分離する方法には、タンパク質−ＬＰＳ複合体をアルカンジオール含有溶液で洗浄し、それによりそのＬＰＳの少なくとも一部がそのタンパク質から除去及び／又は分離される段階が含まれる。
【００１２】
ある実施形態において、このＬＰＳ−タンパク質複合体（又は他のエンドトキシン複合体）は、組み換えタンパク質などの（これには限定されない。）タンパク質産生中に生成及び／又は形成される。
【００１３】
本発明の実施形態は、あらゆるタンパク質を使用し得る。様々な例には、これらに限定されないが、ウシアルブミン（ＢＳＡ）、ウシホロトランスフェリン、ウシ乳由来のラクトフェリン、ニワトリ卵白由来のリゾチーム、熱ショックタンパク質、熱ショック融合タンパク質などが含まれる。様々なタンパク質は、単純又は複合、小型又は大型であり得る。
【００１４】
組み換えタンパク質産生のために、様々な方法及び／又は発現系が使用され得る。組み換えタンパク質産生のために、あらゆる発現系が使用され得る。ある実施形態において、発現系は細菌性である。このような実施形態において、Ｅ．コリ発現系のようなグラム陰性細菌発現系が使用され得る。しかし、例えば（これらに限定されないが）、カウロバクター・クレセント（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔ）及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）など、他のタイプの細菌性の系もまた使用され得る。
【００１５】
一般に、エンドトキシンを含有するあらゆる系で、タンパク質からエンドトキシンを分離するために、本発明の実施形態を使用することができる。例えば、ある実施形態において、エンドトキシンは、タンパク質を含有する系の混入物である。いくつかの例において、エンドトキシンが原料中又は加工中の混入物として見出され得ることは、本分野で周知である。このようなエンドトキシンは、本発明の様々な実施形態により除去及び／又は分離することができる。
【００１６】
本発明の様々な実施形態とともに、あらゆるアルカンジオールが使用され得る。適切な非限定例には、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール及び１，７−ヘプタンジオールが含まれる。ある実施形態において、本発明のアルカンジオールは、長鎖アルカンジオールである。アルカンジオールは、全て不燃性化合物であるため、アセトニトリル、エタノール及びメタノールなどの一般的に使用される溶離剤と比較して安全性に優れている。さらに、アルカンジオールは、水溶性であり、多数のプロセスに対して法外な費用がかかることはない。
【００１７】
他の実施形態において、タンパク質−ＬＰＳ複合体の分離を補助及び／又は促進するために、様々な方法が利用される。これらの実施形態の様々な例において、このタンパク質−ＬＰＳ複合体は、基質に接着している。接着の様々な方法には、基質に対する、保持、誘引、結合、塗布、固定及び／又は除去可能な付着が含まれる。タンパク質又はＬＰＳのいずれかが接着され得る。ある実施形態において、ＬＰＳ−タンパク質複合体は、レジンに結合又は固定される。適切なレジンの種類には、これらに限定されないが、ＳＰセファロースファストフローレジン（ＳＰＳＦＦレジン）など、アフィニティーレジン、陰イオン交換レジン、陽イオン交換レジンなどが含まれる。しかし、レジンの選択は、本分野において日常的な技術であり、方法の特定の必要性を満たすように行い得る。
【００１８】
ある実施形態において、ＬＰＳ−タンパク質複合体は、タンパク質がカラムのレジンに結合する条件下で陰イオン交換レジンに結合させられる。次に、アルカンジオール洗浄溶液をカラムに添加し、それによりそのＬＰＳ−タンパク質複合体からそのＬＰＳの少なくとも一部が分離され、そして、アルカンジオールで、又はアルカンジオールについて溶出を行う。ある実施形態において、そのＬＰＳの５０％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。ある代替的実施形態において、そのＬＰＳの７５％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの８０％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。さらに別の実施形態において、そのＬＰＳの８５％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。ある代替的実施形態において、そのＬＰＳの９０％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９５％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９７％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９９％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。別の実施形態において、そのＬＰＳの９９．９％を超える部分がＬＰＳ−タンパク質複合体から分離される。ある実施形態において、ＬＰＳを分離及び／又は除去した後、タンパク質をレジンから溶出することができる。本分野で一般的であり、そのレジンに対して適切な方法により、タンパク質が溶出され得る。ある例において、イオン交換体に対して、ｐＨの変化及び／又はコンダクティビティーの上昇を使用してタンパク質を溶出することができる。
【００１９】
ある実施形態において、そのレジンから溶出されるタンパク質の５０％がＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の７５％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の８０％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の８５％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９０％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９５％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９７％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９９％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。ある代替的実施形態において、レジンから溶出されるタンパク質の９９．９％が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンがない状態である。
【００２０】
様々な実施形態において、レジンからタンパク質を除去／分離するために別の洗浄法が利用される。代替的な実施形態において、レジンからタンパク質が遅れて溶出されるというだけであるように、タンパク質は洗浄なしで溶出され、それにより、タンパク質からＬＰＳが分離される。分離の度合いは、使用するレジンに依存して様々であり得る。同様に、ＬＰＳ又はタンパク質成分が他方の成分と異なる時間に溶出されるというように、ＬＰＳ−タンパク質複合体の溶出プロファイルを変化させるようにレジンを構築することができる。
【００２１】
従って、本発明の様々な実施形態には、
リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質をイオン交換レジンに固定化する段階と；
前記レジンをアルカンジオールで洗浄し、それにより前記ＬＰＳの少なくとも一部が前記複合体から分離される段階と；
前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法、のような方法が含まれる。
【００２２】
代替的な実施形態において、ＬＰＳはレジンに付着させられ、タンパク質が最初に溶出される。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明は、アルカンジオールでリポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を洗浄することを含む、リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を分解するための方法を含む。
【００２４】
またさらなる実施形態において、本発明は、レジンをアルカンジオールで洗浄する段階を含む、レジンにおけるタンパク質の保持時間を延長させるための方法を含む。そのような実施形態の例において、ＬＰＳを除去するために１，２−ヘキサンジオールなどのヘキサンジオールで洗浄した後、レジンにおける塩濃度を上げることにより、タンパク質が溶出されなくなる。このような実施形態は、高塩濃度環境に対して有用であり、及び、タンパク質に対するレジンの選択性を変更させたいと考え得る場合に有用である。
【００２５】
従って、本発明の実施形態はさらに、
タンパク質−ＬＰＳ複合体をイオン交換レジンに固定する段階と、
該レジンを１，２−ヘキサンジオールで洗浄し、それによりエンドトキシンの少なくとも一部が前記複合体から分離される段階と、
ｐＨを変化させることにより前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、高塩濃度、高コンダクティビティー環境においてタンパク質−ＬＰＳ複合体からＬＰＳを分離する方法を含む。このタイプの好ましい実施形態において、アルカンジオール濃度は、約５％を超える。しかし、あらゆる濃度を使用し得る。
【００２６】
本発明をその具体的な実施形態と関連させて説明してきたが、更なる改変が可能であり、添付の請求項が、一般的に、本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野の範囲内にある既知の、もしくは慣習的な実施を超えないような、かつ、現存するもの又は後に生じるもののいずれであれ、上文に述べた本質的な特徴に対して適用され得るような、本発明の開示からの逸脱を含む、あらゆる変形、使用又は適用を包含することを意図していることを理解されたい。さらに、本発明の実施形態は、具体的な規格特性及び／又は寸法とともに説明してきたが、本実施形態が、本発明の原則から逸脱することなく、異なる規格特性及び／又は寸法が可能であり、添付の請求項が、このような違いを網羅するものであることを理解されたい。さらに、本明細書中で言及する特許は全て、参考として本明細書中で援用する。
【００２７】
本発明の様々な実施形態のさらなる理解のために、次の実施例を参照されたい。
【００２８】
実施例及び実験
材料
ウシアルブミン（ＢＳＡ）、ウシホロトランスフェリン、ウシ乳由来ラクトフェリン、ニワトリ卵白由来リゾチーム、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）血清型Ｏ５５：Ｂ５由来のリポ多糖類及びＢＳＴＦＡは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。酢酸、Ｔｒｉｓ（塩基）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、塩酸、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、エタノール、イソプロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びリン酸水素２ナトリウム７水和物は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から購入した。１，６−ヘキサンジオールは、ＢＡＳＦ Ｃｏ．（Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）から購入した。１，２−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４（Ｚｗ３−１４）は、Ｆｌｕｋａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。１，４−ブタンジオール及びエチレングリコールは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１０ｘは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）ＢＯＤＩＰＹ（Ｒ）ＦＬ共役リポ多糖類、血清型Ｏ５５：Ｂ５（ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ）及びＥｎｚＣｈｅｋリゾチームアッセイキットは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。Ｐｙｒｏｓｏｌ、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）Ｐｙｒｏｔｅｌｌ−Ｔ、ＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ）及びＥ．コリ Ｏ１１３：Ｈ１０（ＣＳＥ）由来の対照標準エンドトキシンは、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．（Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）から入手した。ＳＰセファロースファストフロー（ＳＰＦＦ）レジン、Ｑセファロースファストフロー（ＱＦＦ）レジン及びＨＲ１０／１０カラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）より得た。透明なポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレートは、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｉｎｃ．（Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡ）から入手し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレートは、ＮＵＮＣ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から入手した。β−ヒドロキシテトラデカン酸、β−ヒドロキシトリデカン酸、β−ヒドロキシウンデカン酸、β−ヒドロキシトリデカノエート、β−ヒドロキシテトラデカノエート及びβ−ヒドロキシウンデカノエートは、Ｍａｔｒｅｙａ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ，ＰＡ）から購入した。ヘプタンは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）から購入した。
【００２９】
方法
粘性測定
粘性測定のために、ＵＬＡ−Ｙアダプターを備えたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｍｏｄｅｌ １ ＬＶＴ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）を使用した。測定は全て、２０℃にて行った。
【００３０】
ＬＰＳ−タンパク質複合体形成
１０ｍｇ／ｍｌから１１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、カラム平衡化緩衝液中でタンパク質保存溶液を調製した。１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるように、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中でＬＰＳ Ｏ５５：Ｂ５保存溶液を調製し、ＰＢＳ又はカラム平衡化緩衝液中で、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ保存溶液を調製した。これは、１０，０００ＤａのＯ５５：Ｂ５ＬＰＳの分子量に基づくと、およそ１００μＭ 最終濃度である。
【００３１】
１部のＬＰＳ溶液を９部のタンパク質溶液（ｖ／ｖ）に、ポリプロピレン試験管へ添加することにより、ＬＰＳ−タンパク質複合体を形成させた。その試験管をボルテックスにかけ、アルミ箔で包み、次に、ＢＳＡ及びトランスフェリンの場合は室温にて１６時間から７２時間、又は、ラクトフェリンの場合は、３７℃にて少なくとも４時間、インキュベーションを行った。
【００３２】
ＬＡＬ及びＢＯＤＩＰＹ分析
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ蛍光マイクロプレートアッセイのために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳマイクロプレート蛍光分光光度計を使用し、ＬＡＬカイネティック比濁法（ＫＴＡ）のために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレート蛍光分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。標準物質は、３重測定で分析し、試料は、２重又は３重測定で分析した。その結果をプロットし、ＳＯＦＴｍａｘ ＰＲＯソフトウェア バージョン３．１．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で解析した。
【００３３】
Ａ．ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳアッセイ
０．８１μＭから０．０３μＭのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ保存溶液の３段階連続希釈液を調製した。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳアッセイの分析方法は、次のように、Ｙｕ及びＷｒｉｇｈｔ（１９９６）により用いられたアッセイを改変したものであった。黒色のマイクロタイタープレートの各ウェルに、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中で調製した１５％ ＳＤＳ ２０μｌ、続いて、試料又は標準物質 １８０μｌを添加した。そのプレートを３７℃にて１０秒間振盪し、蛍光モードですぐに読み取った。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳに対して、最適の励起（４９０ｎｍ）、発光（５２５ｎｍ）及びカットオフ波長（５１５ｎｍ）を測定した。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳに対するアッセイは、０．０１μＭ（１８ｎｇ）未満の／ＬＯＱ値の検出限界及び０．０３μＭ（５４ｎｇ）の定量限界で、０．０３μＭから０．８１μＭ（５４ｎｇから１４５８ｎｇ）の直線的範囲を示した。
【００３４】
Ｂ．ＬＡＬカイネティック比濁法（ＫＴＡ）
必要に応じて、試料のｐＨをＰｙｒｏｓｏｌで６から８に調整した。ＣＳＥ及びＰｙｒｏｔｅｌｌ−ＴをＬＲＷで再構成した。ＣＳＥの直線は、０．０３ＥＵ／ｍｌから１．００ＥＵ／ｍｌであった。ＬＡＬ ＫＴＡの分析方法は次の通りであった。透明なポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウェルに、試料又は標準物質 １００μｌ及びＰｙｒｏｔｅｌｌ−Ｔ １００μｌを添加した。スパイク試料に対して、２．００ＥＵ／ｍｌ ＣＳＥ ５μｌを添加し、０．１０ＥＵ／ｍｌ ＣＳＥレベルにした。そのプレートを１０秒間振盪し、３７℃にて１時間、４０５ｎｍにて、カイネティックモードで、１分ごとにデータを回収した。
【００３５】
Ｃ．ガスクロマトグラフィーによるＬＰＳ分析
ガスクロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＧＣＭＳ）による試料中に存在するＬＰＳの相対的レベルに関する定量的分析は、Ｍｉｅｌｍｃｚｕｌら（１９９２）による方法に基づいており、Ａｇｉｌｅｎｔ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）からの、５９７３質量選択検出器とともに６８９０ガスクロマトグラフを利用した。使用したカラムは、Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）からのＤＢ−５ＭＳカラム（３０ｃｍｘ０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．ｘ０．２５μｍフィルム厚）であった。サロゲート化合物及び標的化合物に対する直線は、１．６ｐｇ／μｌから１００ｐｇ／μｌの範囲であり、内部標準は、５０ｐｇ／μｌで一定に維持した。簡潔に述べると、試料調製及びＧＣＭＳ分析方法は、次のとおりであった。試料及びサロゲート物質であるβ−ヒドロキシトリデカン酸の既知量を５ｍｌの硝子製の反応バイアルに添加した。水性試料を６Ｎ ＨＣｌ中、９０℃から１００℃にて一晩加水分解し、ＬＰＳからβ−ヒドロキシテトラデカン酸を遊離させた。ヘプタンを用いてその脂肪酸を加水分解物から２回抽出し、次に窒素下で乾燥させた。８０℃から９０℃にて、３Ｎ メタノールＨＣｌ中で３０分間インキュベーションすることによりその脂肪酸をメチル化した。水を添加して反応を停止させ、次に、ヘプタンを用いてそのメチルエステルを２回抽出した。次にそのメチルエステルを窒素下で乾燥させた。ＢＳＴＦＡ／ピリジン（２：１、ｖ／ｖ）を添加し、窒素下で最後に乾燥させる前に、１５分から２０分間、８０℃から９０℃にてインキュベーションすることにより、そのメチルエステルを誘導体化した。ヘプタン中で調製した５０ｐｇ／μｌの内部標準、メチル−３−トリメチルシリル−ウンデカン酸中で、試料を再構成した。標準物質及び試料をスプリットレスモードにおいて、１μｌ注入体積で注入した。最初のオーブン温度を９０℃にて４分間保持し、次に、１分あたり２０℃の割合で２５０℃まで変化させ、続いて、１分当たり１０℃の割合で３００℃まで変化させた。マススペクトロメーターは、ＥＭオフセット電圧を５００、溶媒遅延を５．２分に設定した。イオン１７５及び２７３においてメチル−３−ＴＭＳ−ウンデカノエートを、１１．０分及びイオン１７５及び３０１においてメチル−３−ＴＭＳ−トリデカノエートを、１１．７分及びイオン１７５及び３１５でメチル−３−ＴＭＳ−テトラデカノエートをモニターするために選択的イオンモニタリングを使用した。ＭＳＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙソフトウェアに対してＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎを用いてクロマトグラムを作成した。
【００３６】
リゾチームアッセイ
製造者の使用説明書に従い、ＥｎｚＣｈｅｋリゾチームアッセイキットを用いて、リゾチーム活性を測定した。
【００３７】
クロマトグラフィー
クロマトグラフィーは全て、グラディエントポンプ（Ｐ−９００）、５００μｌ又は２０００μｌ注入ループ、可変波長検出器（ＵＶ−９００）及びｐＨならびにコンダクティビティーモニター（ｐＨ／Ｃ−９００）を備えたＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。クロマトグラフィー実験は全て、室温にて、２００ｃｍ／ｈｒから３００ｃｍ／ｈｒの流速で行った。アルカンジオール洗浄中に、アルカンジオール溶液の粘性が高まることによるシステムの背圧上昇を最小限にするために、流速を１５０ｃｍ／ｈｒから２００ｃｍ／ｈｒに減速した。Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア バージョン３．２１又は４．０を用いてクロマトグラムを作成した。レジンは、１ｃｍ直径のカラム中に、７ｃｍから１１ｃｍの層高でパックされていた。各クロマトグラフィーを行う前に、０．５Ｎ ＮａＯＨで６０分から１２０分間、又は０．１Ｎ ＮａＯＨで１６時間超のいずれかで、ＡＫＴＡ及びカラムを浄化した。次に、適切な緩衝液でシステムを平衡化する直前にカラム及びＡＫＴＡをＭｉｌｌｉ−Ｑ水でリンスした。
【００３８】
平衡化緩衝液と同じ化学成分及びｐＨを有するｖ／ｖ溶液として、アルカンジオール、エタノール及びイソプロパノールを調製し、同時に、１，６−ヘキサンジオール及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４をｗ／ｖ溶液として調製した。
【００３９】
Ｄ．陽イオン交換クロマトグラフィー
トランスフェリンに対して、ＳＰセファロースファストフローカラムに１００ｍＭ アセテート、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５を加え、１００ｍＭ アセテート、ｐＨ５で平衡化した。添加後、平衡化緩衝液でレジンを洗浄し、次に、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で溶出した。有機又は洗剤洗浄を行う場合は、最初の洗浄ステップ後に添加し、特に指定のない限り、６ＣＶとした。この洗浄に続いて、有機又は洗剤を除去するために溶出前に平衡化緩衝液で第二の洗浄を行った。
【００４０】
ＢＳＡに対するクロマトグラフィーは、全てのクロマトグラフィー緩衝液のｐＨが４．５であったことを除き、トランスフェリンに対するものと同じであった。１，２−ヘキサンジオールを洗浄剤として用いる場合、溶出は、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に変更した。
【００４１】
ラクトフェリンクロマトグラフィーは、レジンに１Ｍ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を加え、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中で平衡化し、１Ｍ 塩化ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出したことを除き、トランスフェリンと同様であった。
【００４２】
リゾチームに対するクロマトグラフィーは、レジンに１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中で平衡化し、１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で溶出したことを除き、トランスフェリンの場合と同様であった。
【００４３】
Ｅ．陰イオン交換クロマトグラフィー
ＢＳＡに対して、Ｑセファロースファストフローカラムに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で溶出した。添加後、レジンを平衡化緩衝液で洗浄した。２５ｍＭ アセテート、ｐＨ４．５でＢＳＡを溶出し、ＬＰＳを２５ｍＭ アセテート、１ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．５で溶出した。アルカンジオール洗浄を行った場合は、最初の洗浄ステップ後にそれを行い、６ＣＶとした。この洗浄に続き、アルカンジオールを除去するために平衡化緩衝液で第二の洗浄を行った。
【００４４】
結果及び考察
表Ｉは、この研究で使用したタンパク質の分子量及び等電点をまとめたものである。ＢＳＡ、トランスフェリン及びラクトフェリンは全て、ＬＰＳとの結合を示した（Ｄｚａｒｓｋｉ、１９９４；Ｂｅｒｇｅｒ及びＢｅｇｅｒ，１９８７；及びＡｐｐｅｌｍｅｌｋら、１９９４）。酵素活性における洗浄剤の影響を評価するためにリゾチームを使用した。
【００４５】
表Ｉ この研究で使用したタンパク質の分子量及び等電点
【００４６】
【表１】
【００４７】
表ＩＩは、この研究で使用したアルカンジオールのいくつかの生理学的特性をまとめたものである。比較を行うために、他の方法において（Ｆｒａｎｋｅｎら、２０００）ＬＰＳ除去のために用いられてきたエタノール及びイソプロパノールも含まれている。
【００４８】
表ＩＩ この実験で用いたアルカンジオールの生理学的特性
【００４９】
【表２】
【００５０】
有機物及び洗剤によるＬＰＳ−タンパク質複合体の分離
ＬＰＳ及びＬＰＳ−タンパク質複合体のＳＰセファロースファストフロークロマトグラフィー
選択したカラム分画のＬＡＬ−ＫＴＡ分析により、ＳＰセファロースファストフローレジンにおけるＬＰＳ単独及びＬＰＳ−ＢＳＡ複合体のＬＰＳ溶出プロファイルを調べた（表ＩＩＩ）。ＬＰＳをそれのみでクロマトグラフィーに供した場合、予想通り、洗浄−非結合分画において最初にＬＰＳが検出された。ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体のクロマトグラフィーの結果、ＢＳＡ溶出液分画において、ＬＰＳの大部分が検出され、これにより、ＢＳＡのＬＰＳ結合特性（Ｄｚｉａｒｓｋｉ、１９９４）が確認され、ＢＳＡ−ＬＰＳ複合体が、用いた陽イオン交換クロマトグラフィー条件下で安定であることが示された。
【００５１】
表ＩＩＩ ＬＰＳ及びＬＰＳ−ＢＳＡのＳＰＦＦクロマトグラフィー溶出プロファイル
ＳＰセファロースファストフローを用いて、ＬＰＳ及びＬＰＳ−ＢＳＡ複合体をクロマトグラフィーに供した。前記方法で述べたようにしてＬＡＬ ＫＴＡにより、ＬＰＳについてカラム分画を分析した。
【００５２】
【表３】
【００５３】
ＬＡＬ ＫＴＡは、カラム分画におけるＬＰＳの分布を調べるために使用するには困難であり高コストのアッセイである。カラム分画をモニターするために、ＬＰＳに対する蛍光を利用したアッセイが開発された。このアッセイでは、非標識ＬＰＳの代わりに、蛍光性のタグを付加したＬＰＳ、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを用いており、それにより、蛍光分光法を用いてカラム溶出液の分析を迅速に行うことができる。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ共役物におけるＢＯＤＩＰＹマーカーの蛍光は、ＬＰＳがそれ自身又はタンパク質と複合体を形成すると消えることが明らかになっている。試料へＳＤＳを添加すると、ＬＰＳ−ＬＰＳ又はＬＰＳ−タンパク質複合体が解消され、その結果、蛍光が増強する（Ｙｕ及びＷｒｉｇｈｔ、１９９６）。クロマトグラフィー分画におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの迅速かつ定量的な分析を可能にするマイクロタイタープレートを用いたアッセイとして、このアッセイが開発された。
【００５４】
ＢＯＤＩＰＹマーカーがＢＳＡ−ＬＰＳ複合体形成を妨害するか、又は陽イオン交換クロマトグラフィー中に異なる挙動を示すかを調べるために、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質複合体を用いて複合体先行分析を繰り返した。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質複合体の溶出プロファイルは、上記のＬＰＳ及びＬＰＳ−ＢＳＡの溶出プロファイルと同様であった（表ＩＶ）。これにより、ＢＯＤＩＰＹマーカーがＢＳＡ又はトランスフェリンのＬＰＳとの結合能を妨害しないこと、及び、ＢＯＤＩＰＹ基がＬＰＳのクロマトグラフィープロファイルを変化させないことが示された。図１は、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ（Ａ）及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体（Ｂ）に対する典型的なＳＰセファロースファストフロープロファイルを示す。
【００５５】
表ＩＶ ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質のＳＰＦＦクロマトグラフィー溶出プロファイル
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−タンパク質複合体をＳＰセファロースファストフローを用いてクロマトグラフィーに供した。前記方法で述べたようにして、ＢＯＤＩＰＹアッセイにより、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳについて、カラム分画を分析した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
ＳＰセファロースファストフロークロマトグラフィー中の、アルカンジオールによる、ＬＰＳ−タンパク質複合体からのＬＰＳの減少
最初の実験において、５０％ １，６−ヘキサンジオール洗浄段階が陽イオン交換クロマトグラフィー中にＢＳＡと複合体形成しているＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの量を減少させる可能性について調べた。１，６−ヘキサンジオールを用いた３カラム体積（ＣＶ）洗浄により、ＢＳＡと複合体形成しているＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの量が約２１％減少した。３ＣＶから６ＣＶに１，６−ヘキサンジオール洗浄段階の長さを延長することにより、ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去が約４９％まで促進された。１，６−ヘキサンジオール洗浄段階をさらに３ＣＶ増加させて９ＣＶにすることにより、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去が促進された（５１％）。さらなる実験は全て、６ＣＶ アルカンジオール洗浄段階を用いて行った。
【００５８】
タンパク質がイオン性固形支持体に結合している際の、一連のアルカンジオールの、タンパク質からのＬＰＳ除去効果を、エタノール、イソプロパノール及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４と比較したところ、ＬＰＳ結合タンパク質からのＬＰＳの除去において効果的であることが明らかとなった。ＳＰセファロースファストフローカラムにＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体を添加した。５０％ アルカンジオール溶液 ６カラム体積でそのレジンを洗浄し、次に、溶出した。分画を回収し、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳについて分析した（図２）。アルカンジオールの鎖長が４から６炭素に長くなると、アルカンジオール洗浄分画の蛍光が増強し、一方、溶出分画の蛍光が減弱した。これにより、アルカンジオールがトランスフェリン複合体からＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを除去することが明らかになった。図３及び４は、トランスフェリン及びＢＳＡそれぞれからのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ除去におけるアルカンジオール構造の効果を説明する。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ除去効率は、アルカンジオール鎖長が長くなるにつれて高くなり、１，２−アルカンジオール異性体は、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去において、末端アルカンジオールよりも効果的であった。１，２−ヘキサンジオールは、試験した化合物の中で最も高効率の化合物であり、洗剤及びアルコールよりも優れていた。１，２−ブタンジオール及び１，６−ヘキサンジオールならびに５０％ イソプロパノール及び７５％ エタノールは、トランスフェリンと会合しているＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを同程度のレベルまで減少させた。アルカンジオールによるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去は、トランスフェリン及びＢＳＡ複合体の両方に対して同程度であった。
【００５９】
図２に対する参照は、アルカンジオール洗浄を組み合わせた、ＳＰセファロースファストフローにおける、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ-トランスフェリン複合体のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ溶出プロファイルを示す。
【００６０】
図３は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出液におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少を説明する。クロマトグラフィーは、図２において述べたものと同じである。０％減少は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，６−ヘキサンジオール；４、エチレングリコール；及び５、１，４−ブタンジオール。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体を生成させ、ＳＰセファロースファストフローカラムに添加し、１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール又は１，２−ヘキサンジオールの５０％溶液でそのレジンを洗浄した。アルカンジオールを除去するために洗浄した後、上記方法で述べるようにしてトランスフェリンを溶出した。実験間の浄化は、０．５Ｎ ＮａＯＨを用いて行った。
【００６１】
図４は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少を説明する。クロマトグラフィーは、図２において述べたものと同じである。０％減少は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，２−ブタンジオール；４、１，６−ヘキサンジオール；及び５、５０％ イソプロパノール；６、７５％ エタノール；７、１，４−ブタンジオール；及び８、エチレングリコール。
【００６２】
洗浄に１，２−ヘキサンジオールを用いたトランスフェリンに対する実験中、１Ｍ ＮａＣｌを含み、溶出緩衝液のｐＨがｐＨ５に維持された場合は、トランスフェリンがレジンから溶出されなかったことが認められた。１，２−ヘキサンジオール濃度を１０％に下げると、トランスフェリン保持の延長が観察された。５％の１，２−ヘキサンジオール濃度において、トランスフェリン保持は変化しなかった。ポリエチレングリコール及び他の中性重合体の存在下におけるイオン交換クロマトグラフィー中は、他のタンパク質に対して保持時間の変化が観察されている（Ｍｉｌｂｙら、１９８９及びＧａｇｎｏｎら、１９９６）。タンパク質保持時間の変化は、ポリエチレングリコールの大きさ及び濃度、ならびにタンパク質そのものに依存した。一方、４０％以下の濃度のエチレングリコールはタンパク質保持時間に影響を与えなかった（Ｔａｕｃら、１９９８）。これらの例において、研究対象の化合物がクロマトグラフィー緩衝液全てに含まれていることに留意されたい。１，２−ヘキサンジオールの場合は、洗浄緩衝液のみに含まれており、その後、タンパク質溶出前にさらなる洗浄段階により除去した。
【００６３】
１，２−ヘキサンジオールは、トランスフェリン及びＢＳＡの両方からＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを除去することについて試験したものの中で最も効果的な化合物であったので、この除去に影響を与えるために必要な１，２−ヘキサンジオール洗浄の濃度依存性を調べた。５％、２０％及び５０％ １，２−ヘキサンジオールを含有する１，２−ヘキサンジオール洗浄後に、ＳＰセファロースファストフローＢＳＡ溶出分画におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少を調べた。５％ １，２−ヘキサンジオール洗浄の結果、ＢＳＡ会合ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳが約５５％減少し、一方で、２０％及び５０％ １，２−ヘキサンジオール洗浄によるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少は、同程度であり、約９６％であった。
【００６４】
トランスフェリン及びＢＳＡに加えて、蛍光ＢＯＤＩＰＹアッセイを用いて、１，６−ヘキサンジオールによるラクトフェリン複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ除去もまた調べた。次に、ＧＣ−ＭＳを用いたＬＰＳマーカー化合物 ３−ＯＨ−１４：０脂肪酸に関する試料の分析により、その分析結果を確認した。表Ｖは、そのデータをまとめたものであり、クロマトグラフィーにおいて、アルカンジオール洗浄（この場合は１，６−ヘキサンジオールである。）がラクトフェリン溶出液中のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳレベルを低下させる能力が再び示されている。ＢＯＤＩＰＹ蛍光アッセイによりＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳのおよそ８７％の減少が、ＧＣ−ＭＳアッセイによりＬＰＳマーカーにおいて９１％の減少が観察された。
【００６５】
表Ｖ ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ラクトフェリン複合体のＳＰＦＦクロマトグラフィー溶出プロファイル
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ラクトフェリン複合体を生成させ、ＳＰセファロースファストフローカラムに添加した。上記方法で述べたように、１，６−ヘキサンジオールの５０％溶液を含む実験に対して、ラクトフェリン溶出前に、１，６−ヘキサンジオールを除去するための洗浄を行った。前記方法において述べたように、ＢＯＤＩＰＹ及び３−ＯＨ−１４：０脂肪酸について、カラム分画をアッセイした。
【００６６】
【表５】
【００６７】
クロマトグラフィー実験中に、アルカンジオール洗浄を適用した際、システムの背圧の上昇が認められた。１００ｍＭアセテート、ｐＨ４．５中で調製した各有機溶液及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）溶液の粘性を測定した（図５）。アルカンジオールの粘性は、炭素鎖長とともに上昇し、一方、１，２−アルカンジオール異性体の粘性は、末端アルカンジオール異性体よりもわずかに低かった。アルカンジオール溶液の粘性が上昇することで、規模を大きくする際にいくつかの問題が起こり得る。カラム流速は、使用中の装置に対して適切なシステム圧を維持するように調整しなければならない場合がある。タンパク質−ＬＰＳ複合体からＬＰＳを除去するために低濃度のアルカンジオールを使用できるようにすることで、この問題はある程度解決するであろう。例えば、２０％及び５０％の１，２−ヘキサンジオール洗浄は、上述のように、ＢＳＡ複合体に対してほぼ同レベルでＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを効果的に減少させる。２０％ １，２−ヘキサンジオールの粘性は、５０％ ヘキサンジオールの粘性が７．５Ｃｐであるのに対し、２．６Ｃｐであるというように、５０％ ヘキサンジオールの約３分の１である。
【００６８】
Ｑセファロースファストフロークロマトグラフィー中のアルカンジオールによるＬＰＳ−タンパク質複合体からのＬＰＳの減少
ＬＰＳ−タンパク質複合体からのＬＰＳの除去は、特に塩基性タンパク質に対して、陰イオン交換レジンにおいてより複雑である。陽イオン交換クロマトグラフィー中に、負に荷電しているＬＰＳは、そのレジンの官能基に引き付けられず、アルカンジオール洗浄中にカラムから洗い流されるが、一方、その洗浄条件下でタンパク質は結合したままとなる。陰イオン交換クロマトグラフィー中では、ＬＰＳ及びタンパク質は両方とも、そのレジンの官能基に保持される。従って、その複合体は、分解される必要があり、タンパク質とＬＰＳが別々に溶出されねばならない。
【００６９】
Ｑセファロースファストフローレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー中にＢＳＡ−ＬＰＳ複合体のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳレベルを減少させる１，６−ヘキサンジオール及び１，２−ヘキサンジオールの能力を調べた。ヘキサンジオールの２種類の異性体、１，２−及び１，６−は、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいてタンパク質複合体からＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳレベルを減少させる上で最も効果的な化合物であったので、これらを選択した。
【００７０】
１，２−ヘキサンジオール洗浄を適用した後の陰イオン交換レジンからのＢＳＡの溶出を変化させて、陽イオン交換レジンにおいてトランスフェリンについて観察した。１，２−ヘキサンジオール洗浄後にＢＳＡの溶出に影響を与えるために溶出緩衝液の塩濃度を高くした結果、遊離ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳがＢＳＡとともに溶出された。ｐＨに基づき代替的な溶出スキームを選択した。１，２−ヘキサンジオール洗浄が完了し、１，２−ヘキサンジオールの流出が起こった後、ｐＨ４．５でＢＳＡを溶出した。この後、レジンをストリッピングし、それにより、１Ｍ ＮａＣｌを含有するｐＨ４．５緩衝液を用いて残留ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳを回収した。表ＶＩは、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの除去に対する１，２−ヘキサンジオールの効果をまとめたものである。１，２−ヘキサンジオール洗浄を取り入れることで、ＢＳＡ溶出液のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳが約２９％減少し、代わりに、１，２−ヘキサンジオール洗浄分画においてＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳが明らかに溶出された。
【００７１】
表ＶＩ ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体のＱＦＦ溶出プロファイル
ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ及びＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体をＱ−セファロースファストフローを用いたクロマトグラフィーに供した。前記方法において述べたようにして、ＢＯＤＩＰＹアッセイにより、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳについてカラム分画を分析した。
【００７２】
【表６】
【００７３】
酵素活性におけるアルカンジオールの影響
ＳＰセファロースファストフロークロマトグラフィー中の、酵素活性に対する洗浄剤の影響及びそれによる洗浄剤の間接的な変性効果を調べるために、リゾチームを使用した。６ＣＶ ％５０ １，６−ヘキサンジオール洗浄もしくは１，２−ヘキサンジオール洗浄を行い、又は行わずに、リゾチームに対してクロマトグラフィーを行い、蛍光マイクロプレートリゾチーム活性アッセイを用いてリゾチーム活性についてカラム添加液及び溶出液をアッセイした。ヘキサンジオール洗浄は、リゾチーム活性に有害な影響を与えなかった。７５％ エタノール、５０％ イソプロパノール及び１％ Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４洗浄もまたリゾチーム活性に影響を与えなかった。
【００７４】
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２．Ｐｅｔｓｃｈ，Ｄ．，及びＡｎｓｐａｃｈ，Ｆ．Ｂ．，（２０００）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｒｅｍｏｖａｌ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６，９７−１１９．
３．Ｆｒａｎｋｅｎ，Ｋ．Ｌ．Ｍ．Ｃ．，Ｈｉｅｍｓｔｒａ，Ｈ．Ｓ．，ｖａｎ Ｍｅｉｊｇａａｒｄｅｎ，Ｋ．Ｅ．，Ｓｕｂｒｏｎｔｏ，Ｙ．，ｄｅｎ Ｈａｒｔｉｇｈ，Ｊ．，Ｏｔｔｅｎｈｏｆｆ，Ｔ．Ｈ．Ｍ．，及びＤｒｉｊｆｈｏｕｔ，Ｊ．Ｗ．（２０００）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｔｈｅ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ １８，９５−９９．
４．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｇｇａｒｔ，Ｃ．Ｌ．，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｓ．Ｐ．，及びＷａｌｓｈ，Ｄ．（２００１）Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｔｉｇｈｔｌｙ ｂｏｕｎｄ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８８，６７−７５．
５．Ｆｉｓｋｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｆｒｅｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．Ａ．，ＶａｎＤｅｒＭｅｉｄ，Ｋ．Ｒ．，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ｊ．Ｃ．，及びＡｒｕｍｕｇｈａｍ，Ｒ．（２００１）Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｉｎ Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＵｓｐＡ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ７５３，２６９−２７８．
６．Ｈａｕｓｅｒ，Ｔ．Ａ．，及びＨａｙｅｎｇａ，Ｋ．Ｊ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｂｒａｎｃｈｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｌｋｙｌｄｉｏｌｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 公開番号ＷＯ０２／０７４７９１ Ａｌ。
７．Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｌｅｓｔｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｌａｎｋ，Ｇ．Ｓ．，及びＲｅｉｆｓｎｙｄｅｒ，Ｄ．Ｈ．（１９９９）Ｎｏｎ−ｆｌａｍｍａｂｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−Ｉ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８３０，１２７−１３４．
８．Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｒ．Ｌ．，及びＲｅｉｆｓｎｙｄｅｒ，Ｄ．（２００１）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．米国特許ＵＳ第６，２６５，５４２ Ｂ１号。
９．Ｙｕ，Ｂ．，及びＷｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｄ．（１９９６）Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＬＰＳ ｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ１４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，４１００−４１０５．
１０．Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｂ．，及びＬａｄｄ，Ｄ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｕｎｉｑｕｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｂｙ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ７４３，５１−５５．
１１．Ｍｉｅｌｎｉｃｚｕｋ，Ｚ．，Ａｌｕｇｕｐａｌｌｉ，Ｓ．，Ｍｉｅｌｍｃｚｕｋ，Ｅ．，及びＬａｒｓｓｏｎ，Ｌ．（１９９２）Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ３−ｈｙｄｒｏｘｙ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ及びｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６２３，１１５−１２２．
１２．Ｄｚｉａｒｓｋｉ，Ｒ．（１９９４）Ｃｅｌｌ−ｂｏｕｎｄ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｓ ｔｈｅ ７０−ｋＤａ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ−，ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−，ａｎｄ ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２０４３１−２０４３６．
１３．Ａｐｐｅｌｍｅｌｋ，Ｂ．Ｊ．，Ａｎ，Ｙ．Ｑ．，Ｇｅｅｒｔｓ，Ｍ．，Ｔｈｉｊｓ，Ｂ．Ｇ．，ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｈ．Ａ．，ＭａｃＬａｒｅｎ，Ｄ．Ｍ．，ｄｅ Ｇｒａａｆｆ，Ｊ．及びＮｕｉｊｅｎｓ，Ｊ．Ｈ．（１９９４）Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ ｉｓ ａ ｌｉｐｉｄ Ａ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，６２，２６２８−２６３２．
１４．Ｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．，及びＢｅｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．（１９８７）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｇｃ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １６３，２８９−２９９．
１５．Ｔａｕｃ，Ｐ．，Ｃｏｃｈｅｔ，Ｓ．，Ａｌｇｉｍａｎ，Ｅ．，Ｃａｌｌｅｂａｕｔ，Ｉ．，Ｃａｒｔｒｏｎ，Ｊ．−Ｐ．，Ｂｒｏｃｈｏｎ，Ｊ．Ｃ．，及びＢｅｒｔｒａｎｄ，Ｏ．（１９９８）Ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｔｏ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｆｒｏｍ ｃｏｒｎ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８２５，１７−２７．
１６．Ｍｉｌｂｙ，Ｋ．Ｈ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｖ．，及びＨｅｎｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．（１９８９）Ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ４８２，１３３−１４４．
［ｉ］Ｔ．Ａ．Ｈａｕｓｅｒ及びＫ．Ｊ．Ｈａｙｅｎｇａ，Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，国際特許ＷＯ０２／０７４７９１ Ａｌ （２００２）．
［ｉｉ］Ｒ．Ｌ．Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｐ．Ｍ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｇ．Ｓ．Ｂｌａｎｋ，及びＤ．Ｈ．Ｒｅｉｆｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ８３０（１９９９）１２７−１３４．
［ｉｉｉ］Ｒ．Ｌ．Ｆａｈｒｎｅｒ及びＤ．Ｒｅｉｆｓｎｙｄｅｒ 米国特許ＵＳ第６，２６５，５４２ Ｂ１号（２０００）．
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】図１ａは、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳのＳＰ セファロースファストフロー溶出プロファイルの説明図である。破線は、２８０ｎｍのＵＶシグナルであり、実線は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表されたＢＯＤＩＰＹ蛍光に対応する。
【図１ｂ】図１ｂは、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体のＳＰセファロースファストフロー溶出プロファイルの説明図である。破線は、２８０ｎｍのＵＶシグナルであり、実線は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表されたＢＯＤＩＰＹ蛍光に対応する。
【図２】図２は、アルカンジオール洗浄を組み合わせた、ＳＰセファロースファストフローにおけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体のＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−溶出プロファイルの説明図である。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体を生成させ、ＳＰセファロースファストフローカラムに添加し、そのカラムを１，４−ブタンジオール、１，６−ヘキサンジオール又は１，２−ヘキサンジオールの５０％溶液で洗浄した。
【図３】図３は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出におけるＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−トランスフェリン複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少の説明図である。０％減少は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，６−ヘキサンジオール；４、エチレングリコール；及び５、１，４−ブタンジオール。
【図４】図４は、アルカンジオールによる、ＳＰセファロースファストフロー溶出における、ＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳ−ＢＳＡ複合体からのＢＯＤＩＰＹ−ＬＰＳの減少の説明図である。０％低下は、アルカンジオール洗浄なしで行った対照に対応する。１、１，２−ヘキサンジオール；２、１％ Ｚｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）３−１４；３、１，２−ブタンジオール；４、１，６−ヘキサンジオール；及び５、５０％ イソプロパノール；６、７５％ エタノール；７、１，４−ブタンジオール；及び８、エチレングリコール。
【図５】図５は、１００ｍＭ アセテート、ｐＨ４．５中のアルカンジオール、イソプロパノール、エタノール及びＺｗｉｔｔｔｅｒｇｅｎｔ（両性洗浄剤）溶液の粘性の説明図である。溶液は全て、１００ｍＭ アセテート緩衝液、ｐＨ４．５で調製した。１、５０％ １，６−ヘキサンジオール；２、５０％ １，２−ヘキサンジオール；３、５０％ １，４−ブタンジオール；４、５０％ １，２−ブタンジオール；５、５０％ エチレングリコール；６、５０％ イソプロパノール；７、７５％ エタノール；８、１％ Ｚｗ ３−１４；及び９、１００ｍＭ アセテート、ｐＨ４．５
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法であって、
前記複合体をクロマトグラフィーレジンに固定化する段階と；
前記レジンをアルカンジオールで洗浄し、それにより少なくとも前記ＬＰＳの一部が前記複合体から分離される段階と；および
前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記アルカンジオールが、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール及び１，７−ヘプタンジオールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レジンが、陽イオン交換レジン及び陰イオン交換レジンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、ウシアルブミン（ＢＳＡ）、ウシホロトランスフェリン、ラクトフェリン、リゾチーム及び熱ショックタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、前記レジンに付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＰＳが前記レジンに付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記レジンから溶出されるタンパク質の約９５％超が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンが存在しない状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨ又はコンダクティビティーの変化が、前記レジンから前記タンパク質を溶出するために使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、細菌性発現系から産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌性発現系が、Ｅ．コリ発現系、カウロバクター・クレセント（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔ）発現系及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）発現系からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レジンが、高塩濃度環境にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルカンジオールが、１，２−ヘキサンジオールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、ｐＨの変化により溶出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質をレジンに付加する段階と、該レジンをアルカンジオールで洗浄し、それによりエンドトキシンの少なくとも一部が分離される段階と、を含む、タンパク質からエンドトキシンを分離するための方法。
【請求項１５】
前記エンドトキシンが、前記タンパク質の産生から生成される混入物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記エンドトキシンの９９．９％を超える部分が前記タンパク質から分離される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体のタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーレジンに付着させる段階と；
前記レジンをアルカンジオールで洗浄し、それにより前記ＬＰＳの少なくとも一部が前記複合体から分離される段階と；
ｐＨ又はコンダクティビティーの変化のいずれかにより前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法。
【請求項１８】
前記複合体の前記ＬＰＳが、陰イオン交換クロマトグラフィーレジンに付着させられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法であって、
前記複合体をクロマトグラフィーレジンに固定化する段階と；
前記レジンをアルカンジオールで洗浄し、それにより少なくとも前記ＬＰＳの一部が前記複合体から分離される段階と；および
前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記アルカンジオールが、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール及び１，７−ヘプタンジオールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レジンが、陽イオン交換レジン及び陰イオン交換レジンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、ウシアルブミン（ＢＳＡ）、ウシホロトランスフェリン、ラクトフェリン、リゾチーム及び熱ショックタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、前記レジンに付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＬＰＳが前記レジンに付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記レジンから溶出されるタンパク質の約９５％超が、ＬＰＳ又は他のエンドトキシンが存在しない状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨ又はコンダクティビティーの変化が、前記レジンから前記タンパク質を溶出するために使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、細菌性発現系から産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌性発現系が、Ｅ．コリ発現系、カウロバクター・クレセント（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔ）発現系及びプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）発現系からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レジンが、高塩濃度環境にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルカンジオールが、１，２−ヘキサンジオールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、ｐＨの変化により溶出される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質をレジンに付加する段階と、該レジンをアルカンジオールで洗浄し、それによりエンドトキシンの少なくとも一部が分離される段階と、を含む、タンパク質からエンドトキシンを分離するための方法。
【請求項１５】
前記エンドトキシンが、前記タンパク質の産生から生成される混入物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記エンドトキシンの９９．９％を超える部分が前記タンパク質から分離される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体のタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーレジンに付着させる段階と；
前記レジンをアルカンジオールで洗浄し、それにより前記ＬＰＳの少なくとも一部が前記複合体から分離される段階と；
ｐＨ又はコンダクティビティーの変化のいずれかにより前記レジンから前記タンパク質の少なくとも一部を溶出する段階と、
を含む、リポ多糖類（ＬＰＳ）−タンパク質複合体を含む組み換え産生タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法。
【請求項１８】
前記複合体の前記ＬＰＳが、陰イオン交換クロマトグラフィーレジンに付着させられる、請求項１７に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２６２２５（Ｐ２００７−５２６２２５Ａ）
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７２７５（Ｐ２００６−５１７２７５）
【出願日】平成１６年６月１５日（２００４．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８９９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１５２
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１５日（２００４．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８９９２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１５２
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
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