乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法
【課題】乳酸菌を含有する冷菓中に混在する乳酸菌以外の生菌数を、簡便かつ迅速に測定する。
【解決手段】乳酸菌を含有する冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する。測定試料は、ブロムクレゾールパープルが添加された標準寒天培地で培養する。ブロムクレゾールパープルは、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇ添加する。培養に際しては混釈法を用いる。希釈による栄養制限等によって乳酸菌の生育が抑制されるため、実用上、十分な検出精度でもって、簡便かつ迅速に生菌数を測定することができる。
【解決手段】乳酸菌を含有する冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する。測定試料は、ブロムクレゾールパープルが添加された標準寒天培地で培養する。ブロムクレゾールパープルは、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇ添加する。培養に際しては混釈法を用いる。希釈による栄養制限等によって乳酸菌の生育が抑制されるため、実用上、十分な検出精度でもって、簡便かつ迅速に生菌数を測定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた乳酸菌を含有する冷菓中に混在する、乳酸菌以外の細菌の生菌数の測定方法に関し、とくに乳酸菌を添加したアイスクリーム類に好適な生菌数の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた乳酸菌を含む冷菓といえば、たとえばフローズンヨーグルトがある。乳酸菌には、整腸作用等、様々な健康促進効果が認められることから、近年再び注目を集めている。
【０００３】
一方、冷たい菓子（冷菓）の代表格としてアイスクリームがある。アイスクリームは、関連法令によれば、乳固形分や乳脂肪分の違いによって、アイスクリームとアイスミルクとラクトアイスとに分類されており、これらを含めてアイスクリーム類として定義されている。最近では、このアイスクリーム類に乳酸菌を添加した新しい冷菓も提案されている。この乳酸菌入りのアイスクリーム類は、単にアイスクリーム類に乳酸菌の機能性が付与されているだけでなく、発酵乳の爽やかな後味が加わることで、従来のアイスクリームにはなかった口当たりのよい新たな風味が実現されている。
【０００４】
ところで、これら冷菓は、関連法令によって成分規格が規定されているため、冷菓を製造するメーカーは、その基準が満たされていることを常時測定して検査する必要がある。その基準の一つに細菌数（生菌数、生きている細菌数）の規格項目がある。
【０００５】
しかし、この細菌数は細菌汚染の指標であるため、検査対象に乳酸菌が含まれる場合には、乳酸菌を除いた細菌数をもって細菌数とする必要がある。検査対象に乳酸菌が含まれる場合の生菌数の測定方法としては、たとえば、非特許文献１，２がある。
【０００６】
【非特許文献１】「食品衛生検査指針 微生物編 ２００４」、社団法人 日本食品衛生協会、２００４年６月３０日、ｐ．５７９−５８０
【非特許文献２】「Ｂｕｔｔｅｒ，ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍｉｌｋｓ ａｎｄ ｆｒｅｓｈ ｃｈｅｅｓｅ −Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ−Ｃｏｌｏｎｙ‐ｃｏｕｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｔ ３０℃」、ＩＳＯ１３５５９：２００２（Ｅ）（ＩＤＦ１５３：２００２（Ｅ））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、フローズンヨーグルト等、検査対象が多量に乳酸菌を含む場合、その乳酸菌だけを除いて一般細菌の生菌数を測定することは難しく、十分な測定方法が確立されていないのが実情である。
【０００８】
たとえば、標準寒天培地を用いた定法に従って一般細菌数を測定し、コロニーの形状等から乳酸菌と一般細菌とを選別することが考えられるが、検査対象が多量に乳酸菌を含む場合、乳酸菌が一般細菌よりも圧倒的に多くなってしまい、それらの判別に経験を要するうえ、精度に欠け実用的でない。また、この標準寒天培地に乳酸菌測定用の培地を併用する方法も考えられる。つまり、乳酸菌を含む総菌数と乳酸菌数とをそれぞれ測定して、総菌数から乳酸菌数を減算することによって算出するのであるが、測定に手間がかかり過ぎて、これもまた実用性に欠ける。
【０００９】
そこで、本発明者らは、先の非特許文献１の「乳酸菌を加えた粉末清涼飲料の細菌数（生菌数、ただし乳酸菌を除く）の測定方法」に示されているペニシリンＧカリウム添加ブドウ糖加寒天培地や、４％塩化ナトリウム含有ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地などの適用を試みたが、検査対象によっては、乳酸菌のコロニー形成が認められ、一般細菌のみを選択的に検出することができなかった。
【００１０】
また、先の非特許文献２には、国際規格として「発酵乳等の汚染細菌の計測法」（以下、単にＩＤＦ１５３法という）が示されているが、作業負担の大きい塗抹法によるものであるうえ、培養条件が３０℃、７２時間と期間を要するため、正確かつ迅速を要する品質管理の現場においては扱い難い。また、この方法の場合、培地への選択剤の添加が不可欠であり、選択剤の選定や培地調製という煩雑な作業を要し、汎用性に欠けるという不利もある。
【００１１】
そこで、本発明は前記問題点に鑑み、フローズンヨーグルトや乳酸菌入りのアイスクリームなどの、生きた乳酸菌を多量に含む冷菓中に混在する乳酸菌以外の生菌数を、簡便でありながら、迅速に測定できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
請求項１に記載の本発明は、乳酸菌を含有する冷菓中に混在する乳酸菌以外の細菌数を測定する乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法である。そして、上記課題を解決するため、前記冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する工程と、前記測定試料を、ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）が添加された標準寒天培地で培養する工程と、培養後に検出されるコロニー数を計数する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１３】
請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、ブロムクレゾールパープルが、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇ添加されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項３に記載の本発明は、請求項１または請求項２に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、混釈法を用いて培養することを特徴とする。
【００１５】
請求項４に記載の本発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、前記冷菓が、乳酸菌が添加されたアイスクリーム類を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
生きた乳酸菌を多量に含む冷菓の生菌数を、実用上、十分な検出精度でもって、簡便かつ迅速に測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、乳酸菌を含む冷菓中に混在する乳酸菌以外の細菌数（生菌数）を測定する測定方法である。そして、その測定の工程に、測定対象の冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する工程と、測定試料を標準寒天培地で培養する工程と、培養後に検出されるコロニー数を計数する工程と、を含むことに特徴がある。以下、図面を参照しつつ、本発明の最良の実施の形態について説明する。
【００１８】
本発明において、乳酸菌とは、たとえばヨーグルトに代表される発酵乳中に含まれる細菌であって、乳酸を多量につくる細菌群の総称である。細菌学的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属や、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属などの分類に属している。乳酸菌には多くの種類が存在するが、本発明では、乳酸菌の種類については、とくに限定しない。しかしながら、その中でも、発酵乳を製造する際に使用されるスターターとしての乳酸菌、たとえば、乳酸球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）や乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などを含む場合に好適である。とくに乳酸球菌は、乳酸菌の中でも一般細菌とともに検出され易いが、これの生育を効果的に抑制することができる。
【００１９】
本発明が測定対象とするのは、たとえば、フローズンヨーグルトなどの生きた乳酸菌を多量に含む冷菓である。乳酸菌を別途添加したアイスクリーム類も測定対象に含む。すなわち、本発明では、生きた乳酸菌が多量に含まれる菓子であって、流通時あるいは保管時には冷凍状態で取り扱われる冷たい菓子（冷菓）を測定対象とする。
【００２０】
冷菓は、冷凍下で流通されることから、製造後は温度条件により一般細菌は増殖できない。したがって、製造後に生菌数を検査して規格内にあることを確認すれば、以後、菌数の増加を心配する必要が無い。そして、たとえば、先のアイスクリーム類の細菌数の規格をみると、アイスクリームは、１ｇあたり１００，０００（１×１０５）ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）以下、アイスミルクおよびラクトアイスは、１ｇあたり５０，０００（５×１０４）ｃｆｕ以下となっており、検出下限菌数が比較的高くても規格を満たすか否かの判断ができ、測定条件的には有利だからである。
【００２１】
しかしながら、ヨーグルト等の発酵乳には、通常、１ｇあたり約１０７ｃｆｕの乳酸菌が含まれている。そのため、この中に混在する一般細菌だけを選択的に測定するのは容易でない。
【００２２】
ところが、乳酸菌は、他の一般細菌と比べると栄養要求性が高い傾向がある。そこで、本発明者らは、冷菓の特質を考慮すれば、測定時の希釈率を十分に高めて、冷菓由来の栄養源、つまり、乳酸菌の生育にとって有効と思われる栄養源の培地への持込量を少なくすれば、一般細菌だけを選択的に測定できると考えた。そして、実験により検証した結果、実用的な測定方法を得るに至ったのである。
【００２３】
すなわち、本発明では、測定する冷菓を、まず５００倍〜１００００倍、規格や検査精度を考慮すれば、好ましくは５００倍〜５０００倍に希釈して測定試料を調製する。１０倍希釈の単純な繰り返しで対処できるため、より好ましくは、１０００倍に希釈する。そうすることで、まず、栄養制限によって乳酸菌の生育を効果的に抑制することができ、多量の乳酸菌が含まれていても、そこに混在している一般細菌だけを選択して測定することが可能となる。しかし、培地に黄変等が認められず、一般細菌を測定できる場合もあり、その場合には、必ずしも希釈倍率には限定されない。なお、希釈倍率は、厳密な精度を求めるものではない。これら数値は、実用上、許容できる程度の前後幅を含む。
【００２４】
図１に、本発明の測定方法の概要を示す。図１の（ａ）に示すように、クリーンベンチ等の無菌環境下で、たとえば、測定対象である乳酸菌を含む冷菓から１ｇを採取し、生理食塩水（塩分濃度０．８５％）の入った滅菌済み試験管で希釈を繰り返して、１０００倍まで段階的に希釈する。そして、冷菓を１０００倍に希釈調製した溶液を測定試料Ｓとする。
【００２５】
培養には、一般細菌の培養に適した培地、すなわち、常用されている一般細菌測定用の標準寒天培地を用いて培養する。
【００２６】
標準寒天培地には、ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）を添加するのが好ましい。詳しくは、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇのＢＣＰを添加する。好ましくは、０．０２〜０．０３ｇのＢＣＰを添加する。ＢＣＰは、青系色素からなるＰＨ指示薬である。培地では、たとえば、乳酸菌測定用の公定培地であるＢＣＰ加プレート寒天培地に用いられている。なお、この実施の形態では、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０２５ｇのＢＣＰを添加している。
【００２７】
ここで、上記各培地の組成を図２に示す。図２には、標準寒天培地と、ＢＣＰ加プレート寒天培地と、標準寒天培地にＢＣＰを添加した培地（以下、単にＢｌｕｅ−ＳＭＡという）とを対比して示してある。いずれの培地も、基本組成であるペプトン、酵母エキス、ブドウ糖および寒天の含量は同じである。標準寒天培地に対して相違するのは、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡは、ＢＣＰを含み、ＢＣＰ加プレート寒天培地は、さらにｔｗｅｅｎ８０（登録商標）とＬ−システインを含む点である。
【００２８】
ｔｗｅｅｎ８０およびＬ−システインは、乳酸菌の栄養要求性にあわせて添加される栄養源である。したがって、これを含まない標準寒天培地やＢｌｕｅ−ＳＭＡは、それだけ乳酸菌の増殖を抑制することができる。
【００２９】
ＢＣＰは、ＢＣＰ加プレート寒天培地においては、乳酸菌が生成する乳酸によってコロニーの周辺が黄変するのを利用して、目視による乳酸菌の検出を容易にするために用いられている。一方、本発明では、何らかの酸を生成する一般細菌のコロニーの周辺が黄変することを利用して、目視による一般細菌の検出を容易にすることや、コントラストを高めて検出されるコロニーの判別を容易にすることのために用いる。
【００３０】
さらに、実験の過程で標準寒天培地にＢＣＰを添加することで、乳酸菌の生育を抑制する効果が認められており、本発明におけるＢＣＰは、乳酸菌の生育抑制効果にも寄与し得ることがわかっている。その実験結果を図３に示す。図３は、乳酸菌を含むある冷菓を試料に生菌数の測定を行った結果を示している。そこでは、同じ所定条件の下、試料（Ｓ）の希釈率を変えて標準寒天培地（ＭＥＲＣＫ社製）と、その標準寒天培地にＢＣＰを添加して調製したＢｌｕｅ−ＳＭＡとで比較実験を行った（Ｎ＝２、それぞれの試料に対して２回測定）。
【００３１】
図３に示すように、ＢＣＰを添加していない標準寒天培地においては、１０倍希釈は判別不可であり、１００倍希釈ではコロニーが多過ぎて計数できず（ＴＮＴＣ；Ｔｏｏ Ｎｕｍｅｒｏｕｓ Ｔｏ Ｃｏｕｎｔ）、１０００倍希釈でも菌の生育が認められた（たとえば、２．９×１０５ｃｆｕ／ｇ）。それに対して、ＢＣＰを添加したＢｌｕｅ−ＳＭＡでは、１００倍希釈までは黄変が認められたものの、１０００倍希釈ではコロニーの形成が認められなかった。すなわち、希釈による栄養制限とＢＣＰ添加の相乗効果とで乳酸菌の生育が効果的に抑制できたものと考えられる。
【００３２】
次に、培養の操作について説明する。操作に先立って、培地は予め十分量つくって小分けして滅菌しておく。そして、操作時に培地の必要量を加温して液状にする。そうすることで、まとめて作業ができ、効率よく作業できる。液状の培地（滅菌後に加温して溶解した培地）は、そのまま菌に影響を与えない温度、たとえば４０℃前後に保持する。
【００３３】
そして、図１の（ｂ）に示すように、準備した測定試料Ｓの１ｍｌを適量の培地（Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ）とともに滅菌済みのシャーレＰに流し入れ、混ぜ合わせながら直ちに固化させる。培地が固化したシャーレＰは、図１の（ｃ）に示すように、下を向けた状態で、恒温器Ｔに保管して所定条件の下で培養する（混釈法）。操作は単に培地と測定試料とを混ぜ合わせるだけであるため、多数の検査が必要であっても簡便かつ迅速に処理できる。
【００３４】
なお、予めシャーレＰに培地を固化させて培地平板を作製した後、その上に測定試料を滴下してコンラジ棒等で平板上に拡げて培養する方法（塗抹法）もあるが、塗抹法で検出下限菌数を低くしようとすると、シャーレの枚数を多くしなければならなくなるなどのため、準備や操作に手間を要し、実用面で混釈法に劣る。
【００３５】
培養条件は、一部の低温細菌や中温細菌を対象とする場合には、３０℃、４８時間相当の条件で培養する。中温細菌を対象とする場合には、３５℃、４８時間相当の条件で培養する。もっとも、培養条件は、必要に応じて適宜調製することができる。また、ここで示す培養条件の数値は、至適条件であって、厳密な精度を求めるものではない。これら数値は、実用上、許容できる程度の前後幅を含む。
【００３６】
所定条件の下で培養した後、固化した培地に形成されたコロニーを目視により計数する。そして、得られた計数値を基に、希釈倍率から冷菓の単位量あたりの生菌数を算出するのである。乳酸菌は、生育が抑制されてコロニーを形成しないため、安心して計測できる。
【００３７】
そして、このとき、ＢＣＰが所定量添加してあると、コントラストが高まるため、コロニーの判別が容易である。つまり、混釈法の場合、培地の内部でコロニーが形成されるため、コロニーが微小になる傾向があるが、その場合であっても、コントラストによってコロニーがくっきりと見えるからである。
【００３８】
以上のように、本発明の測定方法によれば、従来用いられている培地を工夫して冷菓を所定倍希釈するだけで、これまで手間と時間を要していた、乳酸菌を多量に含む冷菓の細菌検査を簡単かつ迅速に行うことが可能となるのである。
【００３９】
もっとも、希釈する分、検出下限菌数は高くなるが、冷菓を対象としているため、その規格基準を考慮すれば、規格を満たすか否かの判断には十分である。たとえば、アイスクリームであれば、規格基準が１００，０００（１×１０５）ｃｆｕ／ｍｌ以下なので、１００００倍に希釈しても、シャーレ中に１０個のコロニーが検出されるか否かで規格基準を満たすか否かの判断を行うことができ、ラクトアイスやアイスミルクであれば、規格基準が５０，０００（５×１０４）ｃｆｕ／ｍｌ以下なので、５０００倍に希釈しても、シャーレ中に１０個のコロニーが検出されるか否かで規格基準を満たすか否かの判断を行うことができる。
【００４０】
｛第１実施例｝
第１実施例として、本発明の測定方法（以下、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法という）を、先に説明したＩＤＦ１５３法による測定方法と比較した実験を示す。
【００４１】
測定対象には、発酵乳が４０％使用された乳酸菌入りのアイスクリームを用いた。これには、無脂乳固形分１２．５％、乳脂肪分１３．５％が含まれるとともに、乳酸菌が約１０７ｃｆｕ／ｇ含まれている。含まれる乳酸菌は、発酵乳製造時に用いられたスターターの乳酸菌である。具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＯＬＳ３２９０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４１）の２種である。この乳酸菌入りアイスクリームのロット別の計１７サンプルについて測定を行った。
【００４２】
培地には、先に説明した、標準寒天培地にＢＣＰを添加した培地（Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ、ＭＥＲＣＫ社製）を用いた。培養温度は３０℃と３５℃、培養期間はいずれも４８時間とした。
【００４３】
測定試料には、測定対象である乳酸菌入りアイスクリームを、滅菌済み生理食塩水（塩分濃度０．８５％）で１０倍（１０−１）、１００倍（１０−２）、１０００倍（１０−３）に希釈したものを用いた。３５℃では、それに加えて１００００倍（１０−４）、１０００００倍（１０−５）に希釈して、それぞれを測定試料とした。
【００４４】
得られた各測定試料１ｍｌは、適量のＢｌｕｅ−ＳＭＡと滅菌シャーレに混釈して固化させた後、それぞれ各温度で４８時間培養し、検出されたコロニー数を目視により計数した。
【００４５】
比較対象として、上記の測定と同時に上記各１７サンプル対して、ＩＤＦ１５３法に従い測定を行った。具体的には、同法所定の培地で滅菌シャーレに培地平板を作製した。そして、先の１００倍〜１００００倍に希釈した各測定試料０．１ｍｌを培地平板上に塗抹した後、３０℃、７２時間培養し、検出したコロニー数を目視により計数した。
【００４６】
そのほか、各サンプルに含まれる乳酸菌数についても、乳等省令に従って測定した。
【００４７】
Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法において、１０倍希釈では、いずれも培地全体にわたる黄変が認められた。また、１００倍希釈でも培地の変色が認められた。そのため、これらについては、乳酸菌の影響があると判断し、測定対象から除外した。一方、１０００倍希釈以上では、培地に変色は認められなかった。そこで、１０００倍希釈以上の測定試料を採用し、各測定試料の培地に形成されたコロニー数を計数した。その計数結果を図４に示す。図４に示すように、測定を行った乳酸菌入りアイスクリーム１７サンプルのいずれにも、約１０６〜１０８ｃｆｕ／ｇの乳酸菌が含まれていた。そして、１０００倍希釈相当の計数結果に基づき、希釈倍率から冷菓１ｇあたりの生菌数を算出した。その算出結果は、図５の表、および図６、図７のグラフに示す。なお、その場合の検出限界は、１０００ｃｆｕ／ｇである（＜１０００）。
【００４８】
図４および図５に示すように、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法では、検出無しから最大３７０００ｃｆｕ／ｇの生菌数が測定された。なお、図４において、サンプルＮｏ．１１の１０００００倍（１０−５）など、希釈倍率からすれば本来検出されないはずの一部に検出が認められているが、これは、細菌検査に伴う操作上の誤差と考える。したがって、数個程度の計数値では、定性的にみても精度が低いため、規格に対して検出の有無を判断するのは難しい。そこで、本実施例では、ある程度まとまった数の検出値でもって対比できる１０００倍希釈について評価を行うこととした。そして、図５に示すように、１０００倍希釈の測定試料における結果をみると、３０℃では、検出無しは９サンプル、１０００ｃｆｕ／ｇレベルは６サンプル、１００００ｃｆｕ／ｇレベルは２サンプルであった。同様に、３５℃では、検出無しは７サンプル、１０００ｃｆｕ／ｇレベルは４サンプル、１００００ｃｆｕ／ｇレベルは６サンプルであった。
【００４９】
対して、ＩＤＦ１５３法では、検出無しから最大２７０００ｃｆｕ／ｇの生菌数が測定された。そして、１０００倍希釈に相当する測定試料（１０−２）における結果をみると、検出無しは８サンプル、１０００ｃｆｕ／ｇレベルは６サンプル、１００００ｃｆｕ／ｇレベルは３サンプルであった。
【００５０】
図６、図７は、図５に示す結果から、冷菓の１０００倍希釈相当の測定試料における、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法とＩＤＦ１５３法での各サンプルの生菌数の測定結果を対比して示したグラフである。図６は培養温度が３０℃の結果であり、図７は培養温度が３５℃の結果である。各グラフに示されるように、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法は、３０℃、３５℃のいずれの場合も、ＩＤＦ１５３法とほぼ同じ検出傾向が認められた。とくに、生菌数が少なくて誤差が大きいレベルでは多少の相違は認められるものの、生菌数が多くなると、よりその傾向が認められた。
【００５１】
したがって、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法は、ＩＤＦ１５３法と同程度の検出精度を有していることがわかる。
【００５２】
｛第２実施例｝
第２実施例として、ＢＣＰの添加量の影響を確認した実験を示す。本実験では、乳酸菌を含むある冷菓を試料に、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡのＢＣＰの添加量だけを変えて、生菌数の測定を行った。
【００５３】
標準寒天培地１０００ｍｌあたりのＢＣＰの添加量を０．０２０ｇ、０．０２５ｇ、０．０３０ｇとしたＢｌｕｅ−ＳＭＡを調製した。そして、希釈率の異なる各試料（１０倍〜１０００倍）に対し、調製したＢｌｕｅ−ＳＭＡを用いて生菌数の測定を行った（Ｎ＝２、それぞれの試料に対して２回測定）。なお、培養条件は、いずれも温度３５℃、４８時間培養であり、操作等、その他も同じ条件の下で行った。各サンプルに含まれる乳酸菌数についても、乳等省令に従って測定した。
【００５４】
その結果を図８に示す。図８に示すように、いずれのＢＣＰの添加量でも、１０倍および１００倍希釈では黄変が認められ、乳酸菌の影響が認められたが、５００倍希釈および１０００倍希釈では黄変は認められず、コロニーの発生も認められなかった。図示はしないが、測定を行った各サンプルにおいて、約１０７〜１０８ｃｆｕ／ｇの乳酸菌が認められた。したがって、少なくとも上記のＢＣＰの添加量であれば、乳酸菌生育の抑制効果に違いはなく、確実かつ安定して測定できることがわかった。
【００５５】
以上説明したとおり、本発明によれば、ＩＤＦ１５３法等、これまで時間と手間をかけなければ測定できなかった、生きた乳酸菌が多量に含まれる冷菓の生菌数を、実用上十分な検出精度でもって、簡便かつ迅速に測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の測定方法の概略を説明する図である。
【図２】各種培地の組成を示す図である。
【図３】ＢＣＰ添加による乳酸菌の生育抑制効果を示す実験結果を表した図である。
【図４】第１実施例の実験結果を示す図である。
【図５】第１実施例の実験結果を示す図である。
【図６】第１実施例の実験結果を示すグラフである。
【図７】第１実施例の実験結果を示すグラフである。
【図８】第２実施例の実験結果を示す図である。
【符号の説明】
【００５７】
Ｓ 測定試料
Ｐ シャーレ
Ｔ 恒温器
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた乳酸菌を含有する冷菓中に混在する、乳酸菌以外の細菌の生菌数の測定方法に関し、とくに乳酸菌を添加したアイスクリーム類に好適な生菌数の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた乳酸菌を含む冷菓といえば、たとえばフローズンヨーグルトがある。乳酸菌には、整腸作用等、様々な健康促進効果が認められることから、近年再び注目を集めている。
【０００３】
一方、冷たい菓子（冷菓）の代表格としてアイスクリームがある。アイスクリームは、関連法令によれば、乳固形分や乳脂肪分の違いによって、アイスクリームとアイスミルクとラクトアイスとに分類されており、これらを含めてアイスクリーム類として定義されている。最近では、このアイスクリーム類に乳酸菌を添加した新しい冷菓も提案されている。この乳酸菌入りのアイスクリーム類は、単にアイスクリーム類に乳酸菌の機能性が付与されているだけでなく、発酵乳の爽やかな後味が加わることで、従来のアイスクリームにはなかった口当たりのよい新たな風味が実現されている。
【０００４】
ところで、これら冷菓は、関連法令によって成分規格が規定されているため、冷菓を製造するメーカーは、その基準が満たされていることを常時測定して検査する必要がある。その基準の一つに細菌数（生菌数、生きている細菌数）の規格項目がある。
【０００５】
しかし、この細菌数は細菌汚染の指標であるため、検査対象に乳酸菌が含まれる場合には、乳酸菌を除いた細菌数をもって細菌数とする必要がある。検査対象に乳酸菌が含まれる場合の生菌数の測定方法としては、たとえば、非特許文献１，２がある。
【０００６】
【非特許文献１】「食品衛生検査指針 微生物編 ２００４」、社団法人 日本食品衛生協会、２００４年６月３０日、ｐ．５７９−５８０
【非特許文献２】「Ｂｕｔｔｅｒ，ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍｉｌｋｓ ａｎｄ ｆｒｅｓｈ ｃｈｅｅｓｅ −Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ−Ｃｏｌｏｎｙ‐ｃｏｕｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｔ ３０℃」、ＩＳＯ１３５５９：２００２（Ｅ）（ＩＤＦ１５３：２００２（Ｅ））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、フローズンヨーグルト等、検査対象が多量に乳酸菌を含む場合、その乳酸菌だけを除いて一般細菌の生菌数を測定することは難しく、十分な測定方法が確立されていないのが実情である。
【０００８】
たとえば、標準寒天培地を用いた定法に従って一般細菌数を測定し、コロニーの形状等から乳酸菌と一般細菌とを選別することが考えられるが、検査対象が多量に乳酸菌を含む場合、乳酸菌が一般細菌よりも圧倒的に多くなってしまい、それらの判別に経験を要するうえ、精度に欠け実用的でない。また、この標準寒天培地に乳酸菌測定用の培地を併用する方法も考えられる。つまり、乳酸菌を含む総菌数と乳酸菌数とをそれぞれ測定して、総菌数から乳酸菌数を減算することによって算出するのであるが、測定に手間がかかり過ぎて、これもまた実用性に欠ける。
【０００９】
そこで、本発明者らは、先の非特許文献１の「乳酸菌を加えた粉末清涼飲料の細菌数（生菌数、ただし乳酸菌を除く）の測定方法」に示されているペニシリンＧカリウム添加ブドウ糖加寒天培地や、４％塩化ナトリウム含有ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地などの適用を試みたが、検査対象によっては、乳酸菌のコロニー形成が認められ、一般細菌のみを選択的に検出することができなかった。
【００１０】
また、先の非特許文献２には、国際規格として「発酵乳等の汚染細菌の計測法」（以下、単にＩＤＦ１５３法という）が示されているが、作業負担の大きい塗抹法によるものであるうえ、培養条件が３０℃、７２時間と期間を要するため、正確かつ迅速を要する品質管理の現場においては扱い難い。また、この方法の場合、培地への選択剤の添加が不可欠であり、選択剤の選定や培地調製という煩雑な作業を要し、汎用性に欠けるという不利もある。
【００１１】
そこで、本発明は前記問題点に鑑み、フローズンヨーグルトや乳酸菌入りのアイスクリームなどの、生きた乳酸菌を多量に含む冷菓中に混在する乳酸菌以外の生菌数を、簡便でありながら、迅速に測定できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
請求項１に記載の本発明は、乳酸菌を含有する冷菓中に混在する乳酸菌以外の細菌数を測定する乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法である。そして、上記課題を解決するため、前記冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する工程と、前記測定試料を、ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）が添加された標準寒天培地で培養する工程と、培養後に検出されるコロニー数を計数する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１３】
請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、ブロムクレゾールパープルが、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇ添加されていることを特徴とする。
【００１４】
請求項３に記載の本発明は、請求項１または請求項２に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、混釈法を用いて培養することを特徴とする。
【００１５】
請求項４に記載の本発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、前記冷菓が、乳酸菌が添加されたアイスクリーム類を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
生きた乳酸菌を多量に含む冷菓の生菌数を、実用上、十分な検出精度でもって、簡便かつ迅速に測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、乳酸菌を含む冷菓中に混在する乳酸菌以外の細菌数（生菌数）を測定する測定方法である。そして、その測定の工程に、測定対象の冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する工程と、測定試料を標準寒天培地で培養する工程と、培養後に検出されるコロニー数を計数する工程と、を含むことに特徴がある。以下、図面を参照しつつ、本発明の最良の実施の形態について説明する。
【００１８】
本発明において、乳酸菌とは、たとえばヨーグルトに代表される発酵乳中に含まれる細菌であって、乳酸を多量につくる細菌群の総称である。細菌学的には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属や、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属などの分類に属している。乳酸菌には多くの種類が存在するが、本発明では、乳酸菌の種類については、とくに限定しない。しかしながら、その中でも、発酵乳を製造する際に使用されるスターターとしての乳酸菌、たとえば、乳酸球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）や乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などを含む場合に好適である。とくに乳酸球菌は、乳酸菌の中でも一般細菌とともに検出され易いが、これの生育を効果的に抑制することができる。
【００１９】
本発明が測定対象とするのは、たとえば、フローズンヨーグルトなどの生きた乳酸菌を多量に含む冷菓である。乳酸菌を別途添加したアイスクリーム類も測定対象に含む。すなわち、本発明では、生きた乳酸菌が多量に含まれる菓子であって、流通時あるいは保管時には冷凍状態で取り扱われる冷たい菓子（冷菓）を測定対象とする。
【００２０】
冷菓は、冷凍下で流通されることから、製造後は温度条件により一般細菌は増殖できない。したがって、製造後に生菌数を検査して規格内にあることを確認すれば、以後、菌数の増加を心配する必要が無い。そして、たとえば、先のアイスクリーム類の細菌数の規格をみると、アイスクリームは、１ｇあたり１００，０００（１×１０５）ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）以下、アイスミルクおよびラクトアイスは、１ｇあたり５０，０００（５×１０４）ｃｆｕ以下となっており、検出下限菌数が比較的高くても規格を満たすか否かの判断ができ、測定条件的には有利だからである。
【００２１】
しかしながら、ヨーグルト等の発酵乳には、通常、１ｇあたり約１０７ｃｆｕの乳酸菌が含まれている。そのため、この中に混在する一般細菌だけを選択的に測定するのは容易でない。
【００２２】
ところが、乳酸菌は、他の一般細菌と比べると栄養要求性が高い傾向がある。そこで、本発明者らは、冷菓の特質を考慮すれば、測定時の希釈率を十分に高めて、冷菓由来の栄養源、つまり、乳酸菌の生育にとって有効と思われる栄養源の培地への持込量を少なくすれば、一般細菌だけを選択的に測定できると考えた。そして、実験により検証した結果、実用的な測定方法を得るに至ったのである。
【００２３】
すなわち、本発明では、測定する冷菓を、まず５００倍〜１００００倍、規格や検査精度を考慮すれば、好ましくは５００倍〜５０００倍に希釈して測定試料を調製する。１０倍希釈の単純な繰り返しで対処できるため、より好ましくは、１０００倍に希釈する。そうすることで、まず、栄養制限によって乳酸菌の生育を効果的に抑制することができ、多量の乳酸菌が含まれていても、そこに混在している一般細菌だけを選択して測定することが可能となる。しかし、培地に黄変等が認められず、一般細菌を測定できる場合もあり、その場合には、必ずしも希釈倍率には限定されない。なお、希釈倍率は、厳密な精度を求めるものではない。これら数値は、実用上、許容できる程度の前後幅を含む。
【００２４】
図１に、本発明の測定方法の概要を示す。図１の（ａ）に示すように、クリーンベンチ等の無菌環境下で、たとえば、測定対象である乳酸菌を含む冷菓から１ｇを採取し、生理食塩水（塩分濃度０．８５％）の入った滅菌済み試験管で希釈を繰り返して、１０００倍まで段階的に希釈する。そして、冷菓を１０００倍に希釈調製した溶液を測定試料Ｓとする。
【００２５】
培養には、一般細菌の培養に適した培地、すなわち、常用されている一般細菌測定用の標準寒天培地を用いて培養する。
【００２６】
標準寒天培地には、ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）を添加するのが好ましい。詳しくは、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇのＢＣＰを添加する。好ましくは、０．０２〜０．０３ｇのＢＣＰを添加する。ＢＣＰは、青系色素からなるＰＨ指示薬である。培地では、たとえば、乳酸菌測定用の公定培地であるＢＣＰ加プレート寒天培地に用いられている。なお、この実施の形態では、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０２５ｇのＢＣＰを添加している。
【００２７】
ここで、上記各培地の組成を図２に示す。図２には、標準寒天培地と、ＢＣＰ加プレート寒天培地と、標準寒天培地にＢＣＰを添加した培地（以下、単にＢｌｕｅ−ＳＭＡという）とを対比して示してある。いずれの培地も、基本組成であるペプトン、酵母エキス、ブドウ糖および寒天の含量は同じである。標準寒天培地に対して相違するのは、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡは、ＢＣＰを含み、ＢＣＰ加プレート寒天培地は、さらにｔｗｅｅｎ８０（登録商標）とＬ−システインを含む点である。
【００２８】
ｔｗｅｅｎ８０およびＬ−システインは、乳酸菌の栄養要求性にあわせて添加される栄養源である。したがって、これを含まない標準寒天培地やＢｌｕｅ−ＳＭＡは、それだけ乳酸菌の増殖を抑制することができる。
【００２９】
ＢＣＰは、ＢＣＰ加プレート寒天培地においては、乳酸菌が生成する乳酸によってコロニーの周辺が黄変するのを利用して、目視による乳酸菌の検出を容易にするために用いられている。一方、本発明では、何らかの酸を生成する一般細菌のコロニーの周辺が黄変することを利用して、目視による一般細菌の検出を容易にすることや、コントラストを高めて検出されるコロニーの判別を容易にすることのために用いる。
【００３０】
さらに、実験の過程で標準寒天培地にＢＣＰを添加することで、乳酸菌の生育を抑制する効果が認められており、本発明におけるＢＣＰは、乳酸菌の生育抑制効果にも寄与し得ることがわかっている。その実験結果を図３に示す。図３は、乳酸菌を含むある冷菓を試料に生菌数の測定を行った結果を示している。そこでは、同じ所定条件の下、試料（Ｓ）の希釈率を変えて標準寒天培地（ＭＥＲＣＫ社製）と、その標準寒天培地にＢＣＰを添加して調製したＢｌｕｅ−ＳＭＡとで比較実験を行った（Ｎ＝２、それぞれの試料に対して２回測定）。
【００３１】
図３に示すように、ＢＣＰを添加していない標準寒天培地においては、１０倍希釈は判別不可であり、１００倍希釈ではコロニーが多過ぎて計数できず（ＴＮＴＣ；Ｔｏｏ Ｎｕｍｅｒｏｕｓ Ｔｏ Ｃｏｕｎｔ）、１０００倍希釈でも菌の生育が認められた（たとえば、２．９×１０５ｃｆｕ／ｇ）。それに対して、ＢＣＰを添加したＢｌｕｅ−ＳＭＡでは、１００倍希釈までは黄変が認められたものの、１０００倍希釈ではコロニーの形成が認められなかった。すなわち、希釈による栄養制限とＢＣＰ添加の相乗効果とで乳酸菌の生育が効果的に抑制できたものと考えられる。
【００３２】
次に、培養の操作について説明する。操作に先立って、培地は予め十分量つくって小分けして滅菌しておく。そして、操作時に培地の必要量を加温して液状にする。そうすることで、まとめて作業ができ、効率よく作業できる。液状の培地（滅菌後に加温して溶解した培地）は、そのまま菌に影響を与えない温度、たとえば４０℃前後に保持する。
【００３３】
そして、図１の（ｂ）に示すように、準備した測定試料Ｓの１ｍｌを適量の培地（Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ）とともに滅菌済みのシャーレＰに流し入れ、混ぜ合わせながら直ちに固化させる。培地が固化したシャーレＰは、図１の（ｃ）に示すように、下を向けた状態で、恒温器Ｔに保管して所定条件の下で培養する（混釈法）。操作は単に培地と測定試料とを混ぜ合わせるだけであるため、多数の検査が必要であっても簡便かつ迅速に処理できる。
【００３４】
なお、予めシャーレＰに培地を固化させて培地平板を作製した後、その上に測定試料を滴下してコンラジ棒等で平板上に拡げて培養する方法（塗抹法）もあるが、塗抹法で検出下限菌数を低くしようとすると、シャーレの枚数を多くしなければならなくなるなどのため、準備や操作に手間を要し、実用面で混釈法に劣る。
【００３５】
培養条件は、一部の低温細菌や中温細菌を対象とする場合には、３０℃、４８時間相当の条件で培養する。中温細菌を対象とする場合には、３５℃、４８時間相当の条件で培養する。もっとも、培養条件は、必要に応じて適宜調製することができる。また、ここで示す培養条件の数値は、至適条件であって、厳密な精度を求めるものではない。これら数値は、実用上、許容できる程度の前後幅を含む。
【００３６】
所定条件の下で培養した後、固化した培地に形成されたコロニーを目視により計数する。そして、得られた計数値を基に、希釈倍率から冷菓の単位量あたりの生菌数を算出するのである。乳酸菌は、生育が抑制されてコロニーを形成しないため、安心して計測できる。
【００３７】
そして、このとき、ＢＣＰが所定量添加してあると、コントラストが高まるため、コロニーの判別が容易である。つまり、混釈法の場合、培地の内部でコロニーが形成されるため、コロニーが微小になる傾向があるが、その場合であっても、コントラストによってコロニーがくっきりと見えるからである。
【００３８】
以上のように、本発明の測定方法によれば、従来用いられている培地を工夫して冷菓を所定倍希釈するだけで、これまで手間と時間を要していた、乳酸菌を多量に含む冷菓の細菌検査を簡単かつ迅速に行うことが可能となるのである。
【００３９】
もっとも、希釈する分、検出下限菌数は高くなるが、冷菓を対象としているため、その規格基準を考慮すれば、規格を満たすか否かの判断には十分である。たとえば、アイスクリームであれば、規格基準が１００，０００（１×１０５）ｃｆｕ／ｍｌ以下なので、１００００倍に希釈しても、シャーレ中に１０個のコロニーが検出されるか否かで規格基準を満たすか否かの判断を行うことができ、ラクトアイスやアイスミルクであれば、規格基準が５０，０００（５×１０４）ｃｆｕ／ｍｌ以下なので、５０００倍に希釈しても、シャーレ中に１０個のコロニーが検出されるか否かで規格基準を満たすか否かの判断を行うことができる。
【００４０】
｛第１実施例｝
第１実施例として、本発明の測定方法（以下、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法という）を、先に説明したＩＤＦ１５３法による測定方法と比較した実験を示す。
【００４１】
測定対象には、発酵乳が４０％使用された乳酸菌入りのアイスクリームを用いた。これには、無脂乳固形分１２．５％、乳脂肪分１３．５％が含まれるとともに、乳酸菌が約１０７ｃｆｕ／ｇ含まれている。含まれる乳酸菌は、発酵乳製造時に用いられたスターターの乳酸菌である。具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＯＬＳ３２９０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＯＬＬ１０７３Ｒ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４１）の２種である。この乳酸菌入りアイスクリームのロット別の計１７サンプルについて測定を行った。
【００４２】
培地には、先に説明した、標準寒天培地にＢＣＰを添加した培地（Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ、ＭＥＲＣＫ社製）を用いた。培養温度は３０℃と３５℃、培養期間はいずれも４８時間とした。
【００４３】
測定試料には、測定対象である乳酸菌入りアイスクリームを、滅菌済み生理食塩水（塩分濃度０．８５％）で１０倍（１０−１）、１００倍（１０−２）、１０００倍（１０−３）に希釈したものを用いた。３５℃では、それに加えて１００００倍（１０−４）、１０００００倍（１０−５）に希釈して、それぞれを測定試料とした。
【００４４】
得られた各測定試料１ｍｌは、適量のＢｌｕｅ−ＳＭＡと滅菌シャーレに混釈して固化させた後、それぞれ各温度で４８時間培養し、検出されたコロニー数を目視により計数した。
【００４５】
比較対象として、上記の測定と同時に上記各１７サンプル対して、ＩＤＦ１５３法に従い測定を行った。具体的には、同法所定の培地で滅菌シャーレに培地平板を作製した。そして、先の１００倍〜１００００倍に希釈した各測定試料０．１ｍｌを培地平板上に塗抹した後、３０℃、７２時間培養し、検出したコロニー数を目視により計数した。
【００４６】
そのほか、各サンプルに含まれる乳酸菌数についても、乳等省令に従って測定した。
【００４７】
Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法において、１０倍希釈では、いずれも培地全体にわたる黄変が認められた。また、１００倍希釈でも培地の変色が認められた。そのため、これらについては、乳酸菌の影響があると判断し、測定対象から除外した。一方、１０００倍希釈以上では、培地に変色は認められなかった。そこで、１０００倍希釈以上の測定試料を採用し、各測定試料の培地に形成されたコロニー数を計数した。その計数結果を図４に示す。図４に示すように、測定を行った乳酸菌入りアイスクリーム１７サンプルのいずれにも、約１０６〜１０８ｃｆｕ／ｇの乳酸菌が含まれていた。そして、１０００倍希釈相当の計数結果に基づき、希釈倍率から冷菓１ｇあたりの生菌数を算出した。その算出結果は、図５の表、および図６、図７のグラフに示す。なお、その場合の検出限界は、１０００ｃｆｕ／ｇである（＜１０００）。
【００４８】
図４および図５に示すように、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法では、検出無しから最大３７０００ｃｆｕ／ｇの生菌数が測定された。なお、図４において、サンプルＮｏ．１１の１０００００倍（１０−５）など、希釈倍率からすれば本来検出されないはずの一部に検出が認められているが、これは、細菌検査に伴う操作上の誤差と考える。したがって、数個程度の計数値では、定性的にみても精度が低いため、規格に対して検出の有無を判断するのは難しい。そこで、本実施例では、ある程度まとまった数の検出値でもって対比できる１０００倍希釈について評価を行うこととした。そして、図５に示すように、１０００倍希釈の測定試料における結果をみると、３０℃では、検出無しは９サンプル、１０００ｃｆｕ／ｇレベルは６サンプル、１００００ｃｆｕ／ｇレベルは２サンプルであった。同様に、３５℃では、検出無しは７サンプル、１０００ｃｆｕ／ｇレベルは４サンプル、１００００ｃｆｕ／ｇレベルは６サンプルであった。
【００４９】
対して、ＩＤＦ１５３法では、検出無しから最大２７０００ｃｆｕ／ｇの生菌数が測定された。そして、１０００倍希釈に相当する測定試料（１０−２）における結果をみると、検出無しは８サンプル、１０００ｃｆｕ／ｇレベルは６サンプル、１００００ｃｆｕ／ｇレベルは３サンプルであった。
【００５０】
図６、図７は、図５に示す結果から、冷菓の１０００倍希釈相当の測定試料における、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法とＩＤＦ１５３法での各サンプルの生菌数の測定結果を対比して示したグラフである。図６は培養温度が３０℃の結果であり、図７は培養温度が３５℃の結果である。各グラフに示されるように、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法は、３０℃、３５℃のいずれの場合も、ＩＤＦ１５３法とほぼ同じ検出傾向が認められた。とくに、生菌数が少なくて誤差が大きいレベルでは多少の相違は認められるものの、生菌数が多くなると、よりその傾向が認められた。
【００５１】
したがって、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡ法は、ＩＤＦ１５３法と同程度の検出精度を有していることがわかる。
【００５２】
｛第２実施例｝
第２実施例として、ＢＣＰの添加量の影響を確認した実験を示す。本実験では、乳酸菌を含むある冷菓を試料に、Ｂｌｕｅ−ＳＭＡのＢＣＰの添加量だけを変えて、生菌数の測定を行った。
【００５３】
標準寒天培地１０００ｍｌあたりのＢＣＰの添加量を０．０２０ｇ、０．０２５ｇ、０．０３０ｇとしたＢｌｕｅ−ＳＭＡを調製した。そして、希釈率の異なる各試料（１０倍〜１０００倍）に対し、調製したＢｌｕｅ−ＳＭＡを用いて生菌数の測定を行った（Ｎ＝２、それぞれの試料に対して２回測定）。なお、培養条件は、いずれも温度３５℃、４８時間培養であり、操作等、その他も同じ条件の下で行った。各サンプルに含まれる乳酸菌数についても、乳等省令に従って測定した。
【００５４】
その結果を図８に示す。図８に示すように、いずれのＢＣＰの添加量でも、１０倍および１００倍希釈では黄変が認められ、乳酸菌の影響が認められたが、５００倍希釈および１０００倍希釈では黄変は認められず、コロニーの発生も認められなかった。図示はしないが、測定を行った各サンプルにおいて、約１０７〜１０８ｃｆｕ／ｇの乳酸菌が認められた。したがって、少なくとも上記のＢＣＰの添加量であれば、乳酸菌生育の抑制効果に違いはなく、確実かつ安定して測定できることがわかった。
【００５５】
以上説明したとおり、本発明によれば、ＩＤＦ１５３法等、これまで時間と手間をかけなければ測定できなかった、生きた乳酸菌が多量に含まれる冷菓の生菌数を、実用上十分な検出精度でもって、簡便かつ迅速に測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の測定方法の概略を説明する図である。
【図２】各種培地の組成を示す図である。
【図３】ＢＣＰ添加による乳酸菌の生育抑制効果を示す実験結果を表した図である。
【図４】第１実施例の実験結果を示す図である。
【図５】第１実施例の実験結果を示す図である。
【図６】第１実施例の実験結果を示すグラフである。
【図７】第１実施例の実験結果を示すグラフである。
【図８】第２実施例の実験結果を示す図である。
【符号の説明】
【００５７】
Ｓ 測定試料
Ｐ シャーレ
Ｔ 恒温器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を含有する冷菓中に混在する乳酸菌以外の細菌数を測定する乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
前記冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する工程と、
前記測定試料を、ブロムクレゾールパープルが添加された標準寒天培地で培養する工程と、
培養後に検出されるコロニー数を計数する工程と、
を含むことを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
ブロムクレゾールパープルが、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇ添加されていることを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
混釈法を用いて培養することを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
前記冷菓が、乳酸菌が添加されたアイスクリーム類を含むことを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【請求項１】
乳酸菌を含有する冷菓中に混在する乳酸菌以外の細菌数を測定する乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
前記冷菓を５００倍〜１００００倍に希釈して測定試料を調製する工程と、
前記測定試料を、ブロムクレゾールパープルが添加された標準寒天培地で培養する工程と、
培養後に検出されるコロニー数を計数する工程と、
を含むことを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
ブロムクレゾールパープルが、標準寒天培地１０００ｍｌあたり０．０１〜０．０４ｇ添加されていることを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
混釈法を用いて培養することを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法であって、
前記冷菓が、乳酸菌が添加されたアイスクリーム類を含むことを特徴とする乳酸菌入り冷菓の生菌数の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−１８７９７２（Ｐ２００８−１８７９７２Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７０２７（Ｐ２００７−２７０２７）
【出願日】平成１９年２月６日（２００７．２．６）
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月６日（２００７．２．６）
【出願人】（０００００６１３８）明治乳業株式会社 (265)
【Ｆターム（参考）】
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