乳酸菌組成物の製造方法
1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも２ｋｇ（乾燥重量）の乳酸菌組成物を製造する方法であって、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより発酵過程の少なくとも大部分の間、そのpＨを３から８に制御する前記方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも２ｋｇ（乾燥重量）の乳酸菌組成物を製造する方法であって、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより発酵過程の少なくとも大部分の間、そのｐＨを３から８に制御する前記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌はグラム陽性、無芽胞菌属に関する糖類の乳酸発酵を行う。
乳酸菌は、商業的に広く、例えばヨーグルト等のような様々な食品類の製造に使用される。
さらに、多くの乳酸菌は、プロバイオティクス、すなわち適切な量を摂取した場合に宿主（例えばヒト）に健康利益を与える生きた微生物である。
【０００３】
乳酸菌製品は、商業的にしばしば乾燥組成物、例えば凍結乾燥組成物として販売される。乾燥組成物は、例えば乾燥ペレットや錠剤（例えば、粉砕された乾燥ペレットから製造される）であってもよい。
【０００４】
ヒト用または動物用の乳酸菌（例えば乾燥状態）は、抗酸化剤としてアスコルビン酸やアスコルビン酸塩、例えばアスコルビン酸ナトリウムをしばしば処方され、アスコルビン酸ナトリウムは、例えば、乳酸菌製品の貯蔵安定性を改善する。
【０００５】
アスコルビン酸ナトリウムは、アスコルビン酸（ビタミンC）の塩であり通常のE番号、E３０１（欧州連合食品添加物法参照）である。アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸の構造は、本明細書の図１に示される。
L. Kurtmann et al., “Storage stability of freeze-dried Lactobacillus acidophilus（La-5）in relation to water activity and presence of oxygen and ascorbate”; Cryobiology（2009）, doi:10.1016/j.cryobiol.2008.12.001 の論文は２００８年１２月にインターネット上に公開されている。
【０００６】
当該 L−Kurtmannらの論文は、アスコルビン酸ナトリウムが存在した場合は、貯蔵の間、乾燥したラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）の組成物やサンプルの表面に、ピンクまたは赤色が観察されたことを述べる（例えば、当該要旨を参照）。
【０００７】
このようなピンクまたは赤色は所望するものではない。例えば、このようなピンクまたは赤色は、乾燥乳酸菌製品が不健全である見た目を与えるため、多くの消費者は好まない。
【０００８】
発酵の間、乳酸菌は乳酸を生成する。したがって、生成の間、低すぎるｐＨにならないために、当該ｐＨは、塩基を加えることにより発酵の間、制御される。
【０００９】
乳酸菌は一般的に、ｐＨ３未満では適切に生育しないため、一般的に当該ｐＨは、発酵過程の少なくとも大部分の間、３から８を保つために制御される。
【００１０】
L−Kurtmannらの論文において、Chr. Hansen A/SのL．アシドフィラス（L. acidophilus）（La-5（商標））が使用された。当該論文において、ｐＨは発酵の間、制御されたことが、一般的に述べられている（材料および方法を参照）。どのようにしてｐＨ制御が行われたかについては、言及がされていない。
【００１１】
塩基としてのNH3の使用は、工業において乳酸菌製品の、商業的、工業的生産についてかなり普通のことである。事実、「標準」として考慮されているであろう。
【００１２】
上記を論じた当該L. Kurtmannの論文の１７９頁右欄では、菌細胞由来または発酵残渣由来のアミノ基が、所望しないピンク色あるいは赤色の呈色に関与する可能性があることを指摘している。当該論文は、「アスコルビン酸がデヒドロアスコルビン酸に酸化し、そしてアミノ基と反応し当該色素を形成した場合に、赤色化合物が形成される」と示している。
以下にさらに述べるように、事実、L−Kurtmannの論文のこの開示された理論は、本発明（すなわち、NH3を含む塩基を使用していないため）を遠ざける示唆と言ってもよい。
【００１３】
EP-A-1038951（Nestle [CH]）は菌培養のための培地を開示しており、その培地は、抗酸化剤としてアスコルビン酸およびNa2CO3、KH2PO4のような緩衝液（３頁、請求項３および４を参照）を含む。
段落［００２６］において、例えば、アスコルビン酸は、発酵培地に含まれる適切な抗酸化剤の例として、単に供給されることが示されている。
言い換えると、EP-A-1038951は、直接的かつ明確に菌の生産方法を開示しておらず、アスコルビン酸は、回収された菌濃縮物に加えられている。すなわち、以下に述べるように、EP-A-1038951は、明白に、本明細書に述べられた本発明の第一態様（請求項１）の工程（iii）を開示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明によって解決される課題は、抗酸化剤としてアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された乳酸菌組成物（例えば、乾燥状態）を生産するための新たな方法であって、当該組成物が貯蔵の間に著しいピンクまたは赤色に顕色しない前記方法を提供することにある。
【００１５】
本発明者らは、所望しないピンクまたは赤色顕色は、アスコルビン酸ナトリウムを処方された様々な乳酸菌の培地に関連のあること、すなわち、L−Kurtmannの論文で分析されたラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）（La-5（商標））組成物またはサンプルが原因のみでないことを同定した。
【００１６】
本明細書の実施例に示すように、ピンクまたは赤色は、他の市販の培養物、例えば、ラクトバチルス サーモフィラス（LGG（登録商標））、ストレプトコッカス サーモフィラス（TH-4（商標））およびビフィドバクテリウム アニマリス（BB-12（登録商標））培地にも現れた。
【００１７】
これをさらに追求することにより、本発明者らは分析したLa-5（商標）、LGG（登録商標）、TH-4（商標）およびBB-12（登録商標）組成物すべてにおいて、発酵ｐＨを制御するためにNH3が塩基として使用されてきたことを突き止めた。
【００１８】
さらにそれと一緒に作用するために、本発明者は塩基としてNaOHをNH3の代わりに使用することによって、アスコルビン酸ナトリウムを処方された乾燥La-5（商標）、LGG（登録商標）、TH-4（商標）およびBB-12（登録商標）組成物であって、当該組成物の貯蔵の間、著しいピンクまたは赤色に顕色しない組成物を生産することが、驚くべきことに可能となった。さらなる詳細については、本明細書の実施例を参照のこと。
したがって、本発明の本質は、NH3を含む塩基を使用しないことにあると思われる。
【００１９】
理論に制限されることはないが、NH3の使用に関係するピンクまたは赤色の問題は、次の理論的説明ができると信じられる。
【００２０】
アンモニア（NH3）は、アンモニウム（NH4+）と平衡状態にある。当該平衡は９．２５のｐＫａを有し、ｐＨ９．２５未満ではアンモニウム（NH4+）として大多数が存在し、すなわち、培養物が本発明の第一態様の工程（ｉ）で調節されるｐＨで、正に荷電していることを意味する（以下を参照）。
アスコルビン酸の２つのOH基のｐＫａは、それぞれ、４．１７および１１．６である。これは、４．１７のｐＫａのOH基は、脱プロトン化され、そしてアスコルビン酸塩の負電荷（電子過多）点が存在する。本明細書の図１は、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸の構造を示す。
もっともはっきりとしているのは、ｐＨ４より上であることが明白である。しかし、当業者に知られている平衡効果のため、ｐＨ３より上でもまた関連がある。
【００２１】
あまり詳細になりすぎることを避けて、この理論の本質は、正荷電のNH3（すなわち、NH4+）はアスコルビン酸塩分子中の負荷電（電子過多）点を「攻撃」し、そしてこれは、貯蔵の間に、最終的に化合物が所望しないピンクまたは赤色を付与または顕色することをもたらす反応の連鎖を開始する。
【００２２】
当業者に自明なように、NaOHは、正電荷反応基であるNH4+と同類ではなく、そしてこれは、理論によれば、NaOHを塩基として使用した場合に、ピンクまたは赤色が見られないことの本質的な理由である。
【００２３】
上記を論じたL. Kurtmannの論文の１７９頁右欄では、菌細胞由来のまたは発酵残渣由来のアミノ基は所望しないピンク色あるいは赤色の呈色に関与する可能性があることを指摘している。この論文は、「アスコルビン酸がデヒドロアスコルビン酸に酸化し、そしてアミノ基と反応し当該色素を形成した場合に、赤色化合物が形成される」と示している。
事実、L−Kurtmannの論文のこの開示された理論は、本発明（すなわち、NH3を含む塩基を使用していない）を遠ざける示唆と言ってもよい。
【００２４】
要するに、L−Kurtmannの理論は、アミノ基が所望しないピンクあるいは赤色の呈色に関与しうるという先行技術の示唆に、基づくと言ってもよい。
【００２５】
総合的に言えば、先行技術中のアミノ基に基づく理論は、そのアミノ基がデヒドロアスコルビン酸（DHA）のカルボニル炭素を攻撃することを言及している先行技術として要約してもよい。当該カルボニル炭素は、部分的に正荷電（すなわち、σ+帯電）であるため、アミノ基からの孤立電子対は部分的に正荷電された炭素を攻撃することができることを留意することはここで重要である。
先に論じたように、アンモニアは、９．２５のｐＫａを持ち、ｐＨが９．２５未満では、大部分がアンモニウム（NH4+）として存在し、すなわち培養物が、本発明の第一態様の工程（ｉ）において調節され、ｐＨにおいて正に荷電されている。
【００２６】
当業者に自明なように、正のアンモニアは、DHAの部分的に正電荷のカルボニル炭素を攻撃することができず、アンモニアはL−Kurtmannの論文中に述べられた理論の「機序」の使用により所望しないピンクあるいは赤色の呈色に関与できないことを意味する。
言い換えると、アンモニア（すなわち、本明細書のｐＨにおいてNH4+）は「危険」なはずがない（すなわち、NH4+は、所望しないピンクあるいは赤色の呈色に関与するはずがない）ことがこのL−Kurtmann理論または機序から、客観的に導けるかまたは理解するといえるため、L−Kurtmannの論文中に述べられている理論または機序に関係するアミノ基は、本発明を遠ざけるものといってもよい。
【００２７】
当業者に知られているように、NH3（アンモニア）を含まないNaOH以外の塩基、例えばKOH、Na2CO3を、通常同定してもよい。
【００２８】
さらに、当業者に自明なように、上記理論はアスコルビン酸ナトリウムに関連するだけでなく一般的に他のアスコルビン酸塩あるいはアスコルビン酸に関連する。
【００２９】
先に論じたように、ピンクまたは赤色は所望するものではない、なぜなら、例えば、このようなピンクまたは赤色は、乳酸菌製品が不健全である見た目を与えうるため、多くの消費者は好まないからである。
したがって、本発明は、乳酸菌組成物の商業的生産に高度に関連し、そしてそれは、工業的に関連し、大規模で通常生産される。
【００３０】
したがって、本発明の第一態様は、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも２ｋｇ（乾燥重量）の乳酸菌組成物を製造する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ｉ）：少なくとも１００Lの発酵培地を含む発酵槽（バイオリアクター）中で、適切な条件下で乳酸菌を発酵させる工程、ここで、ｐＨが、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより発酵過程の少なくとも大部分の間、そのｐＨを３から８に制御されており；
（ii）：乳酸菌を回収して、乳酸菌濃縮物を得る工程；
（iii）：アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を乳酸菌濃縮物に加える工程；そして
（iv）：アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を含んでいる工程（iii）の濃縮物を適切な方法で処理して、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された乳酸菌組成物を、取得する工程。
【００３１】
当業者に理解されているように、回収工程（ii）で、加えた塩基のすべてを取り除くわけではない。したがって、加えた塩基に関連する量が、菌濃縮物中に存在し、そうして工程（iii）の濃縮物に例えばアスコルビン酸ナトリウムが加えられた場合にも存在する。
【００３２】
上で論じたように、本発明の本質は、NH3（アンモニア）を含む塩基を使用しないこと、すなわち、工程（ｉ）でNH3（アンモニア）を含まない塩基を添加することにあるといえる。
【００３３】
第一態様の方法、他のすべての工程は、本質的に、先行技術よってなされた、ありふれた工程であるとみなしてよい。
ありふれた工程とは、例えば、工程（ｉ）の適切な条件下での発酵のように、当業者が、どのようにそのような先行技術のありふれた工程を行うかを通常知っているため、本明細書でさらに詳細に論じなくてもよいものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸の構造である。
【図２】図２の写真は、発酵の間ｐＨ調節のためにNH3を使用する製法において生産されたBB-12（登録商標）のバッチと、発酵の間ｐＨ調節のためにNaOHを使用するパイロットプラントで生産された２つのバッチとの色の違いを示す。
【図３】図３の写真は、図２と同様あり、La-5（商標）について示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
乳酸菌
上で論じたように、「乳酸菌」という用語は、グラム陽性、無芽胞菌属に関係する糖類の乳酸発酵を行う。
【００３６】
好ましくは、本乳酸菌は、
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、例えばラクトバチルス ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス デルブルエッキー サブスピーシーズ ブルガリカス（Lactobacillus delbruekii subsp. Bulgaricus）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス サリヴァリス（Lactobacillus salivarius）または、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）；
ラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えばラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌、例えばストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）；
リューコノストック（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えば、リューコノストック ラクティス（Leuconostoc lactis）；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌、例えば、ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム アニマリス（bifidobacterium animalis）または、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）；
プロピオニバクテリア（Propioni bacteria）属に属する乳酸菌；
エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、例えば、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecum）；
および、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する乳酸菌から成る群から選択される乳酸菌である。
【００３７】
ビフィドバクテリウムが「真の」乳酸菌かを理論的に論じている文献もある。本文脈においては、ビフィドバクテリウムは、乳酸菌とする。
【００３８】
上の乳酸菌郡の中で、少なくとも１の乳酸菌が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌；
およびラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌から成る群から選択されることが好ましい。
【００３９】
なおさらに好ましくは、本乳酸菌は、
ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）およびビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）から成る群から選択される乳酸菌である。
【００４０】
もっとも好ましくは、本乳酸菌は、受託番号DSM１３２４１であるラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）株；受託番号DMS１５９５４であるビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）株；および受託番号１５９５７であるストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）から成る群から選択される乳酸菌である。
【００４１】
当該DMS１３２４１株は、本明細書ではLa-5（商標）、当該DSM１５９５４株は、本明細書ではBB-12（登録商標）および当該１５９５７株は、本明細書ではTH-4（商標）と名付けられる。
【００４２】
アスコルビン酸またはアスコルビン酸塩
既知の通り、アスコルビン酸塩は、アスコルビン酸の塩である。
本明細書においてアスコルビン酸ナトリウムを適当なアスコルビン酸塩として使用することが好ましいこともある。
アスコルビン酸（アスコルビン酸塩）の他の適当な例として、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸マグネシウムあるいは、アスコルビン酸２リン酸３ナトリウムが挙げられる。
アスコルビン酸の使用に関してもよい。しかしながら、その酸効果のため、ｐＨ調節関連について鑑みる必要がある。
【００４３】
乳酸菌組成物
本乳酸菌組成物は、一つの単一株（例えば、ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus（La-5（商標）））または異なる株の混合物を含んでもよい。また、乳酸菌以外のもの、例えば、酵母を含んでもよい。
【００４４】
組成物の重量は、好ましくは少なくとも５ｋｇ（乾燥重量）、より好ましくは少なくとも１５ｋｇ（乾燥重量）、もっとも好ましくは少なくとも５０ｋｇ（乾燥重量）である。
【００４５】
当業者に知られているように、より多くの重量の組成物は、より大規模の生産に関連し自明の理により有利になるであろう。
【００４６】
商業的に、何度も凍結乾燥が使用されている。したがって、もし第一態様の工程（iv）において乾燥が行われたなら、それは、凍結乾燥乳酸菌組成物を得るための、凍結乾燥であってもよい。
【００４７】
上で論じたように、乳酸菌組成物は１％から５０％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸（乾燥重量比）を処方される。
【００４８】
「乾燥重量比（w/w - dry matter）」という言葉は、当業者によって組成物の乾燥物に基づく重量を意味することが理解されている。
例えば、もし乳酸菌組成物が凍結組成物であれば、例えばアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸の１０％（乾燥重量比）は、例えば、組成物のサンプルを乾燥し、そして組成物の乾燥物として１０％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸が存在することを測定するものとして理解されたい。
【００４９】
乳酸菌組成物は何度も、２％から２４％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸（乾燥重量比）を処方されるかあるいは、５％から１５％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸（乾燥重量比）を処方される。
【００５０】
当業者に自明なように、第一態様の工程（iii）で加えられた、例えば、アスコルビン酸ナトリウムの量は、例えば工程（iv）の乾燥後、乳酸菌組成物中の、例えば、アスコルビン酸ナトリウムの量（乾燥重量比）を決定することになる。
【００５１】
当業者に自明なように、第一態様の工程（iii）で濃縮物に、他の関連する化合物を加えてもよい。
【００５２】
例えば、もし、工程（iv）で凍結乾燥を使用するなら、工程（iii）で、いわゆる凍結保護物質を通常加える。
【００５３】
凍結保護物質は、凍結損傷（氷を形成するための損傷）から生体組織を保護するための物質であり、そして適当な凍結保護物質の例は、例えば、スクロース、マルトデキストリン、トレハロースまたはグリセロールである。
【００５４】
発酵−第一態様の工程（ｉ）
大規模生産を行うには、どれだけ大きな発酵槽であるかに依存する。発酵槽（バイオリアクター）は、少なくとも５００L発酵培地を含むまたは１００００Lの発酵培地を含むことができる。
上で論じたように、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより発酵過程の少なくとも大部分の間、そのｐＨは、３から８に制御されている。
乳酸菌は一般的に、ｐＨ３未満では適切に生育しないため、そのｐＨは、発酵過程の少なくとも大部分の間、３から８を保つために制御される。
乳酸菌の特殊型においては、そのｐＨは、４から７に制御されることもある。
一般的に言って、当業者は、発酵の間、塩基の適切な量の正確な添加によって、ｐＨを制御する方法を知っている。
本文脈で当業者に自明なように、工程（ｉ）の「大部分（majority）」という用語は、ｐＨは、時々、相対的に短い間、例えば、塩基が連続的に添加されていない場合、追加量の塩基が添加される直前に、例えば、３未満になるかもしれないことと理解されるべきである。
【００５５】
NH3（アンモニア）を含まない塩基
上で論じたように、本明細書の実施例では、NaOHは、NH3（アンモニア）を含まない適切な塩基の例として使用されている。
当業者に知られているように、適切な例は、NaOH、KOH、Na2CO3、Na2SおよびNa2Oから成る塩基の群から選択される、少なくとも１以上の塩基であってもよい。
上のリスト中、NaOHまたはKOHは、一般的にもっとも好ましい。
【００５６】
第一態様の工程（ii）から（iv）
上で論じたように、第一態様の方法の工程（ii）から（iv）のすべては、本質的に先行技術に従って作られたありふれた工程と言ってもよい。
例えば、当業者に知られているように、乳酸菌を回収し乳酸菌濃縮物を取得すること（工程（ii））は、遠心分離によって行われるであろう。収菌は、また超遠心分離によって行われてもよい。
例えば、当業者に知られているように、例えば、乾燥アスコルビン酸ナトリウムを濃縮物に添加する前に、水に乾燥アスコルビン酸ナトリウムを溶解することにより、アスコルビン酸ナトリウムを乳酸菌濃縮物に添加してもよい（工程（iii））。また、濃縮物中に「直接的に」乾燥アスコルビン酸ナトリウムを添加することもできる。
工程（iv）に関して、処理の具体的方法は、当然、その適応によるであろう。
例えば、仮に、乾燥乳酸菌組成物を所望するならば、工程（iv）の処理は乾燥である。
仮に、凍結乳酸菌組成物を所望するならば、工程（iv）の処理は凍結である。
あるいは、仮に、液体乳酸菌組成物を所望するならば、工程（iii）後のいかなるそれ以上の処理は、現に必要でない。
【実施例１】
【００５７】
実施例１：色の測定
ピンクまたは赤色の測定は、本明細書で論じられたL−Kurtmannの論文に述べられたように行った。
その論文の２頁の説明のように、色測定は、以下の方法で行った：
乾燥培養物の表面の色は、L*、a*およびb*座標を有するCIELABカラーシステムを使用して測定し、そしておよび三刺激値測色計（Minolta Chroma Meter CR-300, Osaka, Japan）によって測定した。この研究において、色の変化は、黄色味（＋）または青味（−）を測定するb*値、ここで、b*値の増加は、黄色および茶色への色の変化を反映し、並びに赤味（＋）または緑味（−）を測定するa*値によって表現される。その値は、乾燥菌サンプルの表面上の異なる１０の場所の、それぞれ３測定値の平均により決定した。
【００５８】
実施例２：発酵の間のｐＨ調節のためのNH3とNaOHの取替え
Chr. Hansen A/Sの商業的に利用可能な株：
ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）（La-5（商標））
ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）（LGG（登録商標））
ビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）（BB-12（登録商標））
ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）（TH-4（商標））
方法：
３株すべてについて本明細書の第一態様の方法に従って、パイロットスケール生産を行った。
それぞれの株について、発酵（第一態様の工程（ｉ））の間ｐＨを制御するためにNaOHを使用した一つの生産および、対象または参照としてｐＨ制御のためにNH3を使用した他の生産が存在した。他のすべてにおいて、例えば、工程（iii）で添加されたアスコルビン酸ナトリウム量は、これらの生産において１００％同一のものであった。
すべての生産された乳酸菌組成物は、乾燥製品中、抗酸化剤としておよそ１０％アスコルビン酸ナトリウム（乾燥重量比）含んでいた。
凍結乾燥（工程（iv））後、NaOHおよびNH3それぞれによって生産され、そして３０℃、相対湿度３０％で保存し、凍結乾燥乳酸菌組成物の色の変化を追った。
すべての製品の色は、ミノルタ カラリメーター（実施例１参照）で測定し、そして写真も撮った。
【００５９】
結果
図２の写真は、発酵の間ｐＨ調節のためにNH3を使用する製法において生産されたBB-12（登録商標）のバッチと、発酵の間ｐＨ調節のためにNaOHを使用するパイロットプラントで生産された２つのバッチとの色の違いを示す。
図３の写真は、La-5（商標）について同様に示した図である。
その写真から、NH3からNaOHに取り替えたことによる色の大きな改善（より少ない赤またはピンク色）が見られた。
同様の肯定的な結果は、LGG（登録商標）およびTH-4（商標）でも確認した。
【００６０】
結論
本結果は、塩基としてNaOHをNH3の代わりに使用することで、アスコルビン酸ナトリウムを処方された乾燥La-5（商標）、LGG（登録商標）、BB-12（登録商標）および、TH-4（商標）組成物であって、組成物の貯蔵の間、本組成物が、ピンクまたは赤色に著しく呈色しない組成物を生産することができるということを明確に示した。
【００６１】
参考文献
L. Kurtmann et al., “Storage stability of freeze-dried Lactobacillus acidophilus（La-5）in relation to water activity and presence of oxygen and ascorbate”; Cryobiology（2009）, doi:10.1016/j.cryobiol.2008.12.001
は２００８年１２月にインターネット上に公開されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも２ｋｇ（乾燥重量）の乳酸菌組成物を製造する方法であって、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより発酵過程の少なくとも大部分の間、そのｐＨを３から８に制御する前記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌はグラム陽性、無芽胞菌属に関する糖類の乳酸発酵を行う。
乳酸菌は、商業的に広く、例えばヨーグルト等のような様々な食品類の製造に使用される。
さらに、多くの乳酸菌は、プロバイオティクス、すなわち適切な量を摂取した場合に宿主（例えばヒト）に健康利益を与える生きた微生物である。
【０００３】
乳酸菌製品は、商業的にしばしば乾燥組成物、例えば凍結乾燥組成物として販売される。乾燥組成物は、例えば乾燥ペレットや錠剤（例えば、粉砕された乾燥ペレットから製造される）であってもよい。
【０００４】
ヒト用または動物用の乳酸菌（例えば乾燥状態）は、抗酸化剤としてアスコルビン酸やアスコルビン酸塩、例えばアスコルビン酸ナトリウムをしばしば処方され、アスコルビン酸ナトリウムは、例えば、乳酸菌製品の貯蔵安定性を改善する。
【０００５】
アスコルビン酸ナトリウムは、アスコルビン酸（ビタミンC）の塩であり通常のE番号、E３０１（欧州連合食品添加物法参照）である。アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸の構造は、本明細書の図１に示される。
L. Kurtmann et al., “Storage stability of freeze-dried Lactobacillus acidophilus（La-5）in relation to water activity and presence of oxygen and ascorbate”; Cryobiology（2009）, doi:10.1016/j.cryobiol.2008.12.001 の論文は２００８年１２月にインターネット上に公開されている。
【０００６】
当該 L−Kurtmannらの論文は、アスコルビン酸ナトリウムが存在した場合は、貯蔵の間、乾燥したラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）の組成物やサンプルの表面に、ピンクまたは赤色が観察されたことを述べる（例えば、当該要旨を参照）。
【０００７】
このようなピンクまたは赤色は所望するものではない。例えば、このようなピンクまたは赤色は、乾燥乳酸菌製品が不健全である見た目を与えるため、多くの消費者は好まない。
【０００８】
発酵の間、乳酸菌は乳酸を生成する。したがって、生成の間、低すぎるｐＨにならないために、当該ｐＨは、塩基を加えることにより発酵の間、制御される。
【０００９】
乳酸菌は一般的に、ｐＨ３未満では適切に生育しないため、一般的に当該ｐＨは、発酵過程の少なくとも大部分の間、３から８を保つために制御される。
【００１０】
L−Kurtmannらの論文において、Chr. Hansen A/SのL．アシドフィラス（L. acidophilus）（La-5（商標））が使用された。当該論文において、ｐＨは発酵の間、制御されたことが、一般的に述べられている（材料および方法を参照）。どのようにしてｐＨ制御が行われたかについては、言及がされていない。
【００１１】
塩基としてのNH3の使用は、工業において乳酸菌製品の、商業的、工業的生産についてかなり普通のことである。事実、「標準」として考慮されているであろう。
【００１２】
上記を論じた当該L. Kurtmannの論文の１７９頁右欄では、菌細胞由来または発酵残渣由来のアミノ基が、所望しないピンク色あるいは赤色の呈色に関与する可能性があることを指摘している。当該論文は、「アスコルビン酸がデヒドロアスコルビン酸に酸化し、そしてアミノ基と反応し当該色素を形成した場合に、赤色化合物が形成される」と示している。
以下にさらに述べるように、事実、L−Kurtmannの論文のこの開示された理論は、本発明（すなわち、NH3を含む塩基を使用していないため）を遠ざける示唆と言ってもよい。
【００１３】
EP-A-1038951（Nestle [CH]）は菌培養のための培地を開示しており、その培地は、抗酸化剤としてアスコルビン酸およびNa2CO3、KH2PO4のような緩衝液（３頁、請求項３および４を参照）を含む。
段落［００２６］において、例えば、アスコルビン酸は、発酵培地に含まれる適切な抗酸化剤の例として、単に供給されることが示されている。
言い換えると、EP-A-1038951は、直接的かつ明確に菌の生産方法を開示しておらず、アスコルビン酸は、回収された菌濃縮物に加えられている。すなわち、以下に述べるように、EP-A-1038951は、明白に、本明細書に述べられた本発明の第一態様（請求項１）の工程（iii）を開示していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明によって解決される課題は、抗酸化剤としてアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された乳酸菌組成物（例えば、乾燥状態）を生産するための新たな方法であって、当該組成物が貯蔵の間に著しいピンクまたは赤色に顕色しない前記方法を提供することにある。
【００１５】
本発明者らは、所望しないピンクまたは赤色顕色は、アスコルビン酸ナトリウムを処方された様々な乳酸菌の培地に関連のあること、すなわち、L−Kurtmannの論文で分析されたラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）（La-5（商標））組成物またはサンプルが原因のみでないことを同定した。
【００１６】
本明細書の実施例に示すように、ピンクまたは赤色は、他の市販の培養物、例えば、ラクトバチルス サーモフィラス（LGG（登録商標））、ストレプトコッカス サーモフィラス（TH-4（商標））およびビフィドバクテリウム アニマリス（BB-12（登録商標））培地にも現れた。
【００１７】
これをさらに追求することにより、本発明者らは分析したLa-5（商標）、LGG（登録商標）、TH-4（商標）およびBB-12（登録商標）組成物すべてにおいて、発酵ｐＨを制御するためにNH3が塩基として使用されてきたことを突き止めた。
【００１８】
さらにそれと一緒に作用するために、本発明者は塩基としてNaOHをNH3の代わりに使用することによって、アスコルビン酸ナトリウムを処方された乾燥La-5（商標）、LGG（登録商標）、TH-4（商標）およびBB-12（登録商標）組成物であって、当該組成物の貯蔵の間、著しいピンクまたは赤色に顕色しない組成物を生産することが、驚くべきことに可能となった。さらなる詳細については、本明細書の実施例を参照のこと。
したがって、本発明の本質は、NH3を含む塩基を使用しないことにあると思われる。
【００１９】
理論に制限されることはないが、NH3の使用に関係するピンクまたは赤色の問題は、次の理論的説明ができると信じられる。
【００２０】
アンモニア（NH3）は、アンモニウム（NH4+）と平衡状態にある。当該平衡は９．２５のｐＫａを有し、ｐＨ９．２５未満ではアンモニウム（NH4+）として大多数が存在し、すなわち、培養物が本発明の第一態様の工程（ｉ）で調節されるｐＨで、正に荷電していることを意味する（以下を参照）。
アスコルビン酸の２つのOH基のｐＫａは、それぞれ、４．１７および１１．６である。これは、４．１７のｐＫａのOH基は、脱プロトン化され、そしてアスコルビン酸塩の負電荷（電子過多）点が存在する。本明細書の図１は、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸の構造を示す。
もっともはっきりとしているのは、ｐＨ４より上であることが明白である。しかし、当業者に知られている平衡効果のため、ｐＨ３より上でもまた関連がある。
【００２１】
あまり詳細になりすぎることを避けて、この理論の本質は、正荷電のNH3（すなわち、NH4+）はアスコルビン酸塩分子中の負荷電（電子過多）点を「攻撃」し、そしてこれは、貯蔵の間に、最終的に化合物が所望しないピンクまたは赤色を付与または顕色することをもたらす反応の連鎖を開始する。
【００２２】
当業者に自明なように、NaOHは、正電荷反応基であるNH4+と同類ではなく、そしてこれは、理論によれば、NaOHを塩基として使用した場合に、ピンクまたは赤色が見られないことの本質的な理由である。
【００２３】
上記を論じたL. Kurtmannの論文の１７９頁右欄では、菌細胞由来のまたは発酵残渣由来のアミノ基は所望しないピンク色あるいは赤色の呈色に関与する可能性があることを指摘している。この論文は、「アスコルビン酸がデヒドロアスコルビン酸に酸化し、そしてアミノ基と反応し当該色素を形成した場合に、赤色化合物が形成される」と示している。
事実、L−Kurtmannの論文のこの開示された理論は、本発明（すなわち、NH3を含む塩基を使用していない）を遠ざける示唆と言ってもよい。
【００２４】
要するに、L−Kurtmannの理論は、アミノ基が所望しないピンクあるいは赤色の呈色に関与しうるという先行技術の示唆に、基づくと言ってもよい。
【００２５】
総合的に言えば、先行技術中のアミノ基に基づく理論は、そのアミノ基がデヒドロアスコルビン酸（DHA）のカルボニル炭素を攻撃することを言及している先行技術として要約してもよい。当該カルボニル炭素は、部分的に正荷電（すなわち、σ+帯電）であるため、アミノ基からの孤立電子対は部分的に正荷電された炭素を攻撃することができることを留意することはここで重要である。
先に論じたように、アンモニアは、９．２５のｐＫａを持ち、ｐＨが９．２５未満では、大部分がアンモニウム（NH4+）として存在し、すなわち培養物が、本発明の第一態様の工程（ｉ）において調節され、ｐＨにおいて正に荷電されている。
【００２６】
当業者に自明なように、正のアンモニアは、DHAの部分的に正電荷のカルボニル炭素を攻撃することができず、アンモニアはL−Kurtmannの論文中に述べられた理論の「機序」の使用により所望しないピンクあるいは赤色の呈色に関与できないことを意味する。
言い換えると、アンモニア（すなわち、本明細書のｐＨにおいてNH4+）は「危険」なはずがない（すなわち、NH4+は、所望しないピンクあるいは赤色の呈色に関与するはずがない）ことがこのL−Kurtmann理論または機序から、客観的に導けるかまたは理解するといえるため、L−Kurtmannの論文中に述べられている理論または機序に関係するアミノ基は、本発明を遠ざけるものといってもよい。
【００２７】
当業者に知られているように、NH3（アンモニア）を含まないNaOH以外の塩基、例えばKOH、Na2CO3を、通常同定してもよい。
【００２８】
さらに、当業者に自明なように、上記理論はアスコルビン酸ナトリウムに関連するだけでなく一般的に他のアスコルビン酸塩あるいはアスコルビン酸に関連する。
【００２９】
先に論じたように、ピンクまたは赤色は所望するものではない、なぜなら、例えば、このようなピンクまたは赤色は、乳酸菌製品が不健全である見た目を与えうるため、多くの消費者は好まないからである。
したがって、本発明は、乳酸菌組成物の商業的生産に高度に関連し、そしてそれは、工業的に関連し、大規模で通常生産される。
【００３０】
したがって、本発明の第一態様は、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも２ｋｇ（乾燥重量）の乳酸菌組成物を製造する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ｉ）：少なくとも１００Lの発酵培地を含む発酵槽（バイオリアクター）中で、適切な条件下で乳酸菌を発酵させる工程、ここで、ｐＨが、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより発酵過程の少なくとも大部分の間、そのｐＨを３から８に制御されており；
（ii）：乳酸菌を回収して、乳酸菌濃縮物を得る工程；
（iii）：アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を乳酸菌濃縮物に加える工程；そして
（iv）：アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を含んでいる工程（iii）の濃縮物を適切な方法で処理して、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された乳酸菌組成物を、取得する工程。
【００３１】
当業者に理解されているように、回収工程（ii）で、加えた塩基のすべてを取り除くわけではない。したがって、加えた塩基に関連する量が、菌濃縮物中に存在し、そうして工程（iii）の濃縮物に例えばアスコルビン酸ナトリウムが加えられた場合にも存在する。
【００３２】
上で論じたように、本発明の本質は、NH3（アンモニア）を含む塩基を使用しないこと、すなわち、工程（ｉ）でNH3（アンモニア）を含まない塩基を添加することにあるといえる。
【００３３】
第一態様の方法、他のすべての工程は、本質的に、先行技術よってなされた、ありふれた工程であるとみなしてよい。
ありふれた工程とは、例えば、工程（ｉ）の適切な条件下での発酵のように、当業者が、どのようにそのような先行技術のありふれた工程を行うかを通常知っているため、本明細書でさらに詳細に論じなくてもよいものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸の構造である。
【図２】図２の写真は、発酵の間ｐＨ調節のためにNH3を使用する製法において生産されたBB-12（登録商標）のバッチと、発酵の間ｐＨ調節のためにNaOHを使用するパイロットプラントで生産された２つのバッチとの色の違いを示す。
【図３】図３の写真は、図２と同様あり、La-5（商標）について示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
乳酸菌
上で論じたように、「乳酸菌」という用語は、グラム陽性、無芽胞菌属に関係する糖類の乳酸発酵を行う。
【００３６】
好ましくは、本乳酸菌は、
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、例えばラクトバチルス ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス デルブルエッキー サブスピーシーズ ブルガリカス（Lactobacillus delbruekii subsp. Bulgaricus）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス サリヴァリス（Lactobacillus salivarius）または、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）；
ラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えばラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌、例えばストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）；
リューコノストック（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えば、リューコノストック ラクティス（Leuconostoc lactis）；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌、例えば、ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム アニマリス（bifidobacterium animalis）または、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）；
プロピオニバクテリア（Propioni bacteria）属に属する乳酸菌；
エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、例えば、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecum）；
および、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する乳酸菌から成る群から選択される乳酸菌である。
【００３７】
ビフィドバクテリウムが「真の」乳酸菌かを理論的に論じている文献もある。本文脈においては、ビフィドバクテリウムは、乳酸菌とする。
【００３８】
上の乳酸菌郡の中で、少なくとも１の乳酸菌が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌；
およびラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌から成る群から選択されることが好ましい。
【００３９】
なおさらに好ましくは、本乳酸菌は、
ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）およびビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）から成る群から選択される乳酸菌である。
【００４０】
もっとも好ましくは、本乳酸菌は、受託番号DSM１３２４１であるラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）株；受託番号DMS１５９５４であるビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）株；および受託番号１５９５７であるストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）から成る群から選択される乳酸菌である。
【００４１】
当該DMS１３２４１株は、本明細書ではLa-5（商標）、当該DSM１５９５４株は、本明細書ではBB-12（登録商標）および当該１５９５７株は、本明細書ではTH-4（商標）と名付けられる。
【００４２】
アスコルビン酸またはアスコルビン酸塩
既知の通り、アスコルビン酸塩は、アスコルビン酸の塩である。
本明細書においてアスコルビン酸ナトリウムを適当なアスコルビン酸塩として使用することが好ましいこともある。
アスコルビン酸（アスコルビン酸塩）の他の適当な例として、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸マグネシウムあるいは、アスコルビン酸２リン酸３ナトリウムが挙げられる。
アスコルビン酸の使用に関してもよい。しかしながら、その酸効果のため、ｐＨ調節関連について鑑みる必要がある。
【００４３】
乳酸菌組成物
本乳酸菌組成物は、一つの単一株（例えば、ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus（La-5（商標）））または異なる株の混合物を含んでもよい。また、乳酸菌以外のもの、例えば、酵母を含んでもよい。
【００４４】
組成物の重量は、好ましくは少なくとも５ｋｇ（乾燥重量）、より好ましくは少なくとも１５ｋｇ（乾燥重量）、もっとも好ましくは少なくとも５０ｋｇ（乾燥重量）である。
【００４５】
当業者に知られているように、より多くの重量の組成物は、より大規模の生産に関連し自明の理により有利になるであろう。
【００４６】
商業的に、何度も凍結乾燥が使用されている。したがって、もし第一態様の工程（iv）において乾燥が行われたなら、それは、凍結乾燥乳酸菌組成物を得るための、凍結乾燥であってもよい。
【００４７】
上で論じたように、乳酸菌組成物は１％から５０％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸（乾燥重量比）を処方される。
【００４８】
「乾燥重量比（w/w - dry matter）」という言葉は、当業者によって組成物の乾燥物に基づく重量を意味することが理解されている。
例えば、もし乳酸菌組成物が凍結組成物であれば、例えばアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸の１０％（乾燥重量比）は、例えば、組成物のサンプルを乾燥し、そして組成物の乾燥物として１０％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸が存在することを測定するものとして理解されたい。
【００４９】
乳酸菌組成物は何度も、２％から２４％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸（乾燥重量比）を処方されるかあるいは、５％から１５％のアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸（乾燥重量比）を処方される。
【００５０】
当業者に自明なように、第一態様の工程（iii）で加えられた、例えば、アスコルビン酸ナトリウムの量は、例えば工程（iv）の乾燥後、乳酸菌組成物中の、例えば、アスコルビン酸ナトリウムの量（乾燥重量比）を決定することになる。
【００５１】
当業者に自明なように、第一態様の工程（iii）で濃縮物に、他の関連する化合物を加えてもよい。
【００５２】
例えば、もし、工程（iv）で凍結乾燥を使用するなら、工程（iii）で、いわゆる凍結保護物質を通常加える。
【００５３】
凍結保護物質は、凍結損傷（氷を形成するための損傷）から生体組織を保護するための物質であり、そして適当な凍結保護物質の例は、例えば、スクロース、マルトデキストリン、トレハロースまたはグリセロールである。
【００５４】
発酵−第一態様の工程（ｉ）
大規模生産を行うには、どれだけ大きな発酵槽であるかに依存する。発酵槽（バイオリアクター）は、少なくとも５００L発酵培地を含むまたは１００００Lの発酵培地を含むことができる。
上で論じたように、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより発酵過程の少なくとも大部分の間、そのｐＨは、３から８に制御されている。
乳酸菌は一般的に、ｐＨ３未満では適切に生育しないため、そのｐＨは、発酵過程の少なくとも大部分の間、３から８を保つために制御される。
乳酸菌の特殊型においては、そのｐＨは、４から７に制御されることもある。
一般的に言って、当業者は、発酵の間、塩基の適切な量の正確な添加によって、ｐＨを制御する方法を知っている。
本文脈で当業者に自明なように、工程（ｉ）の「大部分（majority）」という用語は、ｐＨは、時々、相対的に短い間、例えば、塩基が連続的に添加されていない場合、追加量の塩基が添加される直前に、例えば、３未満になるかもしれないことと理解されるべきである。
【００５５】
NH3（アンモニア）を含まない塩基
上で論じたように、本明細書の実施例では、NaOHは、NH3（アンモニア）を含まない適切な塩基の例として使用されている。
当業者に知られているように、適切な例は、NaOH、KOH、Na2CO3、Na2SおよびNa2Oから成る塩基の群から選択される、少なくとも１以上の塩基であってもよい。
上のリスト中、NaOHまたはKOHは、一般的にもっとも好ましい。
【００５６】
第一態様の工程（ii）から（iv）
上で論じたように、第一態様の方法の工程（ii）から（iv）のすべては、本質的に先行技術に従って作られたありふれた工程と言ってもよい。
例えば、当業者に知られているように、乳酸菌を回収し乳酸菌濃縮物を取得すること（工程（ii））は、遠心分離によって行われるであろう。収菌は、また超遠心分離によって行われてもよい。
例えば、当業者に知られているように、例えば、乾燥アスコルビン酸ナトリウムを濃縮物に添加する前に、水に乾燥アスコルビン酸ナトリウムを溶解することにより、アスコルビン酸ナトリウムを乳酸菌濃縮物に添加してもよい（工程（iii））。また、濃縮物中に「直接的に」乾燥アスコルビン酸ナトリウムを添加することもできる。
工程（iv）に関して、処理の具体的方法は、当然、その適応によるであろう。
例えば、仮に、乾燥乳酸菌組成物を所望するならば、工程（iv）の処理は乾燥である。
仮に、凍結乳酸菌組成物を所望するならば、工程（iv）の処理は凍結である。
あるいは、仮に、液体乳酸菌組成物を所望するならば、工程（iii）後のいかなるそれ以上の処理は、現に必要でない。
【実施例１】
【００５７】
実施例１：色の測定
ピンクまたは赤色の測定は、本明細書で論じられたL−Kurtmannの論文に述べられたように行った。
その論文の２頁の説明のように、色測定は、以下の方法で行った：
乾燥培養物の表面の色は、L*、a*およびb*座標を有するCIELABカラーシステムを使用して測定し、そしておよび三刺激値測色計（Minolta Chroma Meter CR-300, Osaka, Japan）によって測定した。この研究において、色の変化は、黄色味（＋）または青味（−）を測定するb*値、ここで、b*値の増加は、黄色および茶色への色の変化を反映し、並びに赤味（＋）または緑味（−）を測定するa*値によって表現される。その値は、乾燥菌サンプルの表面上の異なる１０の場所の、それぞれ３測定値の平均により決定した。
【００５８】
実施例２：発酵の間のｐＨ調節のためのNH3とNaOHの取替え
Chr. Hansen A/Sの商業的に利用可能な株：
ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）（La-5（商標））
ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）（LGG（登録商標））
ビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）（BB-12（登録商標））
ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）（TH-4（商標））
方法：
３株すべてについて本明細書の第一態様の方法に従って、パイロットスケール生産を行った。
それぞれの株について、発酵（第一態様の工程（ｉ））の間ｐＨを制御するためにNaOHを使用した一つの生産および、対象または参照としてｐＨ制御のためにNH3を使用した他の生産が存在した。他のすべてにおいて、例えば、工程（iii）で添加されたアスコルビン酸ナトリウム量は、これらの生産において１００％同一のものであった。
すべての生産された乳酸菌組成物は、乾燥製品中、抗酸化剤としておよそ１０％アスコルビン酸ナトリウム（乾燥重量比）含んでいた。
凍結乾燥（工程（iv））後、NaOHおよびNH3それぞれによって生産され、そして３０℃、相対湿度３０％で保存し、凍結乾燥乳酸菌組成物の色の変化を追った。
すべての製品の色は、ミノルタ カラリメーター（実施例１参照）で測定し、そして写真も撮った。
【００５９】
結果
図２の写真は、発酵の間ｐＨ調節のためにNH3を使用する製法において生産されたBB-12（登録商標）のバッチと、発酵の間ｐＨ調節のためにNaOHを使用するパイロットプラントで生産された２つのバッチとの色の違いを示す。
図３の写真は、La-5（商標）について同様に示した図である。
その写真から、NH3からNaOHに取り替えたことによる色の大きな改善（より少ない赤またはピンク色）が見られた。
同様の肯定的な結果は、LGG（登録商標）およびTH-4（商標）でも確認した。
【００６０】
結論
本結果は、塩基としてNaOHをNH3の代わりに使用することで、アスコルビン酸ナトリウムを処方された乾燥La-5（商標）、LGG（登録商標）、BB-12（登録商標）および、TH-4（商標）組成物であって、組成物の貯蔵の間、本組成物が、ピンクまたは赤色に著しく呈色しない組成物を生産することができるということを明確に示した。
【００６１】
参考文献
L. Kurtmann et al., “Storage stability of freeze-dried Lactobacillus acidophilus（La-5）in relation to water activity and presence of oxygen and ascorbate”; Cryobiology（2009）, doi:10.1016/j.cryobiol.2008.12.001
は２００８年１２月にインターネット上に公開されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも２ｋｇ（乾燥重量）の乳酸菌組成物を製造する方法であって、以下の工程：
（ｉ）：少なくとも１００Lの発酵培地を含む発酵槽（バイオリアクター）中で、適切な条件下で当該乳酸菌を発酵させる工程、ここで、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより当該発酵過程の少なくとも大部分の間、pＨを３から８に制御されており；
（ii）：当該乳酸菌を回収して、乳酸菌濃縮物を得る工程；
（iii）：アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を当該乳酸菌濃縮物に加える工程；及び
（iv）：当該アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を含んでいる工程（iii）の濃縮物を適切な方法で処理して、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された当該乳酸菌組成物を取得する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１の工程（iii）においてアスコルビン酸ナトリウムを添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１の工程（iv）の前記処理が乾燥であり、乾燥乳酸菌組成物を得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の工程（iv）の前記処理が凍結であり、凍結乳酸菌組成物を得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記乳酸菌が、以下の：
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、例えばラクトバチルス ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス デルブルエッキー サブスピーシーズ ブルガリカス（Lactobacillus delbruekii subsp. Bulgaricus）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス サリヴァリス（Lactobacillus salivarius）または、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）；
ラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えばラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌、例えばストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）；
リューコノストック（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えば、リューコノストック ラクティス（Leuconostoc lactis）；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌、例えば、ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム アニマリス（bifidobacterium animalis）または、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）；
プロピオニバクテリア（Propioni bacteria）属に属する乳酸菌；
エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、例えば、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecum）；
および、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する乳酸菌から成る群から選択される乳酸菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記乳酸菌が、
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌；
およびラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌から成る群から選択される乳酸菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記乳酸菌が、
ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）およびビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）から成る群から選択される乳酸菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（iv）の乾燥が凍結乾燥であり、凍結乾燥乳酸菌組成物を得る、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記乳酸菌組成物が、５％から１５％（乾燥重量比）アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された乳酸菌組成物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１の工程（iii）で凍結保護物質をさらに添加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の工程（ｉ）の発酵槽（バイオリアクター）が少なくとも５００Lの発酵培地を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１の方法で1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも５ｋｇ（乾燥重量）の乾燥乳酸菌組成物を製造する方法である、請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩基が、NaOH、KOH、Na2CO3、Na2SおよびNa2Oから成る塩基の群から選択される少なくとも１の塩基であり、好ましくは、当該塩基が、NaOHまたはKOHである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩基がNaOHである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１の工程（ｉ）のpＨが、４から７に制御される、請求項１〜１4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも２ｋｇ（乾燥重量）の乳酸菌組成物を製造する方法であって、以下の工程：
（ｉ）：少なくとも１００Lの発酵培地を含む発酵槽（バイオリアクター）中で、適切な条件下で当該乳酸菌を発酵させる工程、ここで、NH3（アンモニア）を含まない塩基を加えることにより当該発酵過程の少なくとも大部分の間、pＨを３から８に制御されており；
（ii）：当該乳酸菌を回収して、乳酸菌濃縮物を得る工程；
（iii）：アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を当該乳酸菌濃縮物に加える工程；及び
（iv）：当該アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を含んでいる工程（iii）の濃縮物を適切な方法で処理して、1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された当該乳酸菌組成物を取得する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１の工程（iii）においてアスコルビン酸ナトリウムを添加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１の工程（iv）の前記処理が乾燥であり、乾燥乳酸菌組成物を得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１の工程（iv）の前記処理が凍結であり、凍結乳酸菌組成物を得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記乳酸菌が、以下の：
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌、例えばラクトバチルス ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス デルブルエッキー サブスピーシーズ ブルガリカス（Lactobacillus delbruekii subsp. Bulgaricus）、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス サリヴァリス（Lactobacillus salivarius）または、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）；
ラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えばラクトコッカス ラクティス（Lactococcus lactis）；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌、例えばストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）；
リューコノストック（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えば、リューコノストック ラクティス（Leuconostoc lactis）；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌、例えば、ビフィドバクテリウム ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム アニマリス（bifidobacterium animalis）または、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Bifidobacterium breve）；
プロピオニバクテリア（Propioni bacteria）属に属する乳酸菌；
エンテロコッカス（Enterococcus）属に属する乳酸菌、例えば、エンテロコッカス フェシウム（Enterococcus faecum）；
および、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属する乳酸菌から成る群から選択される乳酸菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記乳酸菌が、
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌；
ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌；
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌；
およびラクトコッカス（Leuconostoc）属に属する乳酸菌から成る群から選択される乳酸菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記乳酸菌が、
ラクトバチルス アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）およびビフィドバクテリウム アニマリス（Bifidobacterium animalis）から成る群から選択される乳酸菌である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（iv）の乾燥が凍結乾燥であり、凍結乾燥乳酸菌組成物を得る、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記乳酸菌組成物が、５％から１５％（乾燥重量比）アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された乳酸菌組成物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１の工程（iii）で凍結保護物質をさらに添加する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１の工程（ｉ）の発酵槽（バイオリアクター）が少なくとも５００Lの発酵培地を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１の方法で1％から５０％（乾燥重量比）の抗酸化剤としてのアスコルビン酸塩またはアスコルビン酸を処方された、少なくとも５ｋｇ（乾燥重量）の乾燥乳酸菌組成物を製造する方法である、請求項１〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩基が、NaOH、KOH、Na2CO3、Na2SおよびNa2Oから成る塩基の群から選択される少なくとも１の塩基であり、好ましくは、当該塩基が、NaOHまたはKOHである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記塩基がNaOHである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１の工程（ｉ）のpＨが、４から７に制御される、請求項１〜１4のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５１８３９４（Ｐ２０１２−５１８３９４Ａ）
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０５５８（Ｐ２０１１−５５０５５８）
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５２０１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４７２７
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０３２６０３１０）セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ (23)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月１６日（２０１２．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５２０１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４７２７
【国際公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【出願人】（５０３２６０３１０）セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ (23)
【Ｆターム（参考）】
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