代替的な核酸配列決定法
核酸セグメントの平行配列決定を提供する実施形態が提供される。いくつかの実施形態では、１つの配列が少なくとも２種類の異なる配列決定技術によって配列決定され、結果が比較され、それにより、１つの技術の欠陥や長所を第２の技術によって補うことが可能となる。一実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチドの配列決定のための方法を提供し、この方法は：核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程を含み、ここで、該核酸配列決定試薬の第１のセットは該核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／９６８，８３４号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、核酸配列決定のための方法と組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
導入
核酸を配列決定するための多種多様な技術が存在している。しかし、多くの場合、これらの様々な技術には、得られる配列の不確定性につながり得るという問題点がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本発明の技術は、特に、より正確な核酸配列決定および／またはより大きな読み取り長などによって、さらに効率的な配列決定を手助けする方法と装置を提供する。
【０００５】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および核酸配列決定試薬の第２のセットを使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程。ここで、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる。
【０００６】
本発明の教示の１つの方法の様々な実施形態には以下が含まれる：目的のポリヌクレオチドに由来するクローンライブラリーについて第１の核酸配列決定化学反応を行う工程；核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および核酸配列決定試薬の第２のセットを使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程が含まれる。ここで、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる。
【０００７】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：第１の核酸配列決定化学反応を使用して目的のポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および第２の核酸配列決定化学反応を使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程。いくつかの実施形態では、第１の領域の配列決定と第２の領域の配列決定の全てまたは一部を同時に行うことができる。
【０００８】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程であって、それにより、第１の核酸配列が生成される工程；核酸配列決定試薬の第２のセットを使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程であって、ここで、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なり、それにより、第２の核酸配列が生成され、ここで、第１の領域と第２の領域は、共通している少なくとも１ヌクレオチド塩基位置を有する、工程；および第１の核酸配列と第２の核酸を比較する工程。いくつかの実施形態では、第１の領域の配列決定と第２の領域の配列決定の全てまたは一部を同時に行うことができる。
【０００９】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：分析用ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチド断片に断片化する工程；ポリヌクレオチド断片の少なくとも一部をクローン増幅させ、それによって断片クローンのセットが生成される、工程；断片クローンのセットの第１の部分を、核酸配列決定試薬の第１のセットを用いて配列決定し、それによって、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される、工程；第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；断片クローンのセットの第２の部分を、核酸配列決定試薬の第２のセットを用いて配列決定し、それによって、第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される、工程；第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリを第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリと比較する工程；および他の塩基配列アセンブリ中の塩基の塩基識別（ｂａｓｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）と比較した、対応しているヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、第１の塩基配列アセンブリと第２の塩基配列アセンブリとの間での少なくとも１つの塩基識別を選択する工程。
【００１０】
様々な実施形態において、第１の領域と第２の領域は重複しており、一方、他の実施形態では、重複していない。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域はポリヌクレオチドの異なる鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域は少なくとも５ヌクレオチド重複している。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域は少なくとも１０ヌクレオチド重複している。いくつかの実施形態では、第１の領域は第２の領域に隣接し得る。
【００１１】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは固体支持体上に固定される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズまたは他の粒子であり得る。様々な実施形態において、増幅させられたクローンはアレイ上に存在する。
【００１２】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは単一分子であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは増幅させられたクローンであり得る。いくつかの実施形態では、増幅させられたクローンはＰＣＲによって生成される。いくつかの実施形態では、ＰＣＲはエマルジョンＰＣＲである。いくつかの実施形態では、増幅は半固体支持体の中で行われる。いくつかの実施形態では、増幅は固体支持体上で行われる。
【００１３】
様々な実施形態において、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、ピロシーケンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応である。
【００１４】
様々な実施形態において、クローンライブラリーには目的の生物のゲノムが含まれる。いくつかの実施形態では、目的の生物は原核生物である。いくつかの実施形態では、目的の生物は真核生物である。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーには、目的のゲノムに由来するアンプリコン由来のクローンが含まれる。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーは核酸ライブラリーに由来する。
【００１５】
本発明の教示のなおさらなる態様は、ポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムに関する。
【００１６】
様々な実施形態において、目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムには、以下が含まれる：分析用ポリヌクレオチドのアレイ；上記アレイを含み、少なくとも１つの入力ポートを有しているフローセル；核酸配列決定試薬の第１のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートとつながれている）；核酸配列決定試薬の第２のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートと流体連結されている）；核酸配列決定試薬の第１のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第１の光学シグナルコレクター；および核酸配列決定試薬の第２のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第２の光学シグナルコレクター。いくつかの実施形態では、配列決定試薬の２つ以上のセットによる反応の画像化を同時に行うことができる。
【００１７】
様々な実施形態において、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは同じ構成要素である。いくつかの実施形態では、光学シグナルコレクターのうちの少なくとも一方にＣＣＤが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のシステムにはさらに、ポリヌクレオチドのアレイ上に存在する蛍光シグナルの励起を誘導するように構成されたレーザーが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ポリヌクレオチドの配列を分析するための１つの実施形態を示しているフローチャートを示す。２種類の配列決定化学反応が、配列を決定するために使用される。
【図２】図２は、ポリヌクレオチド配列を分析するための別の実施形態を示しているフローチャートを示す。核酸配列決定試薬の２つのセットが、配列を決定するために使用される。
【図３】図３は、ポリヌクレオチド配列を分析するための別の実施形態を示しているフローチャートを示す。連結反応による配列決定とピロシーケンスが、配列を決定するために使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
当業者はこれらの図面が説明の目的だけのために提供されることを理解するであろう。これらの図面は、本発明の教示の範囲を限定するようには決して意図されない。
【００２０】
多くの高度に多重化された平行配列決定技術には、膨大な量の作業が、配列決定自体ではなくむしろ、配列決定用の試料の調製工程において発生する。本明細書中に記載されるような様々な技術によるポリヌクレオチドの配列決定により、実質的な効果を得ることができる。配列決定反応を並行して行うことができる。このように、１つの技術に特異的であるエラーを、最少量の付加的な作業（同じ量の不可欠な調製作業が、使用される実際の配列決定技術の数とは無関係に行われる）によって排除または減らすことができる。分析用ポリヌクレオチドの様々な領域が、様々な配列決定技術によって利用され得る。
【００２１】
一般的には、本発明の教示により、特に、より正確な核酸配列決定および／またはより大きな読み取り長などによって、さらに効率的な配列決定を手助けする方法と装置が提供される。様々な実施形態において、本発明の教示により、核酸の高度に多重化された平行配列決定のための方法と装置が提供される。
【００２２】
様々な実施形態において、配列は、少なくとも２種類の配列決定化学反応によって分析され得る。この多重配列決定化学反応の使用により、個々のクローンの配列の正確性、および複数のクローンから導かれた最終的なコンパイルされた配列の正確性を高めることができる。異なる配列決定化学反応は、異なるエラーを生じる傾向がある。２種類の化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置に最終的な塩基を示す際に考慮され得る。様々な化学反応での塩基のバリエーションと配列の偏りもまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮され得る。様々な実施形態において、３種類以上の配列決定化学反応が使用される。いくつかの実施形態では、様々な化学反応を使用した配列決定工程の全てまたは一部を同時に行うことができる。
【００２３】
本発明の教示により、さらに、特に、配列決定反応を検出するためのシステム、方法、キット、および装置が提供される。
【００２４】
定義
他に明記されない限り、本明細書中に記載される本発明に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、状況によって必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。一般的には、本明細書中に記載される細胞と組織の培養、分子生物学、およびタンパク質、ならびにオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、ならびに技術は、当該分野で周知であり、一般的に使用されているものである。例えば、化学合成、化学分析、組み換え核酸、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養、ならびに形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）についての標準的な技術が使用される。酵素反応と精製技術は、製造者の使用説明書に従って行われるか、または当該分野で一般的に行われているように行われるか、または本明細書中に記載されるように行われる。先行技術と手法は、一般的に、当技術分野で周知の従来法に従い、本明細書をとおして引用され考察される、様々な一般的であり、より具体的な参考文献に記載されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０００）を参照のこと。組み合わせて利用される命名法、ならびに本明細書中に記載される実験手法および技術は、当該分野で周知であり、そして一般的に使用されているものである。
【００２５】
本明細書中に提供される実施形態にしたがって利用される場合は、以下の用語は、他に明記されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００２６】
用語「核酸配列決定化学反応」は、本明細書中で使用される場合、配列決定結果を得るためにポリヌクレオチドを配列決定するために使用される化学反応のタイプとそれに伴う方法をいう。多種多様な配列決定化学反応が当該分野で公知である。本明細書中で開示される様々な実施形態に有用な様々なタイプの配列決定化学反応の例としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、鎖終結法、色素標識ターミネーター法、可逆的ターミネーターを使用する配列決定、リン酸塩の検出による核酸の配列決定（「ピロリン酸シーケンス」または「ピロシーケンス」）、および連結による配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。そのような配列決定化学反応および対応する配列決定試薬は、例えば、米国特許第７，０５７，０２６号、同第５，７６３，５９４号、同第５，８０８，０４５号、同第６，２３２，４６５号、同第５，９９０，３００号、同第５，８７２，２４４号、同第６，６１３，５２３号、同第６，６６４，０７９号、同第５，３０２，５０９号、同第６，２５５，４７５号、同第６，３０９，８３６号、同第６，６１３，５１３号、同第６，８４１，１２８号、同第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号、同第５，７５０，３４１号、同第６，３０６，５９７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６７８Ａ１、同ＷＯ９３／０５１８３Ａ１、同ＷＯ６０７４３５１Ａ２、同ＷＯ０３０５４１４２Ａ２、同ＷＯ０３００４６９０Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０６０８４１３２Ａ２、および同ＷＯ０６０７３５０４Ａ２（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００２７】
用語「配列決定試薬」は、本明細書中で使用される場合、核酸の配列決定に使用される試薬をいう。配列決定化学反応のタイプに応じて、様々な配列決定試薬を使用することができる。「配列決定試薬」としては、適切なプライマー、ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ、核酸重合剤（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）、ＲＮＡ重合剤（例えば、Ｑβレプリカーゼ）、検出標識、切断可能なリンカー、マグネシウム、連結試薬、切断試薬、ユニバーサル塩基などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、４種類のジデオキシヌクレオチドが、（例えば、自動核酸配列分析のための）様々な蛍光色素で標識される。当業者は、適切な試薬を選択することができる。例示的な配列決定化学反応のタイプは上に列挙されており、いくつかは以下にさらに詳細に記載される。
【００２８】
表現「異なるポリヌクレオチド鎖」は、本明細書中で使用される場合、２本鎖であるポリヌクレオチドの同じ鎖には由来しない核酸鎖をいう。異なる鎖は相補的である場合も、また相補的ではない場合もあり、また、重複している相補性領域を共有している場合もある。重複しているヌクレオチドの数は、１ヌクレオチドから領域全体の完全な重複まで様々であり得る。いくつかの実施形態では、異なるポリヌクレオチド鎖は、少なくとも５ヌクレオチドの重複している相補性領域を共有する。他の実施形態では、異なるポリヌクレオチド鎖は、少なくとも１０ヌクレオチドの重複している相補性領域を共有する。
【００２９】
表現「ポリヌクレオチドの第１の領域」は、本明細書中で使用される場合、それについての配列情報が望まれるポリヌクレオチドの第１のセグメントをいう。第１の領域は、任意の長さまたは配列の領域であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域には、より大きなポリヌクレオチドの断片が含まれ得る。
【００３０】
表現「ポリヌクレオチドの第２の領域」は、本明細書中で使用される場合、それについての配列情報が望まれるポリヌクレオチドのセグメントをいう。ポリヌクレオチドの第２の領域は、任意の長さまたは配列の領域であり得る。ポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの第１の領域と重複している場合があり、また重複していない場合もある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、少なくとも５ヌクレオチド重複している。他の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、少なくとも１０ヌクレオチド重複している。ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は異なるポリヌクレオチド鎖上に存在する場合があり、また、同じポリヌクレオチド鎖上に存在する場合もある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域には、ポリヌクレオチドの断片が含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの第１の領域とは異なるポリヌクレオチド断片上にある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの第１の領域と同じポリヌクレオチド断片上にある。様々な実施形態において、第３の領域またはさらなる領域が検討される。
【００３１】
表現「核酸配列決定試薬の第１のセット」は、本明細書中で使用される場合、核酸配列決定試薬の１つ以上の他のセットを使用して得られた配列決定結果と比較される配列決定結果をもたらす、配列決定に使用される試薬の１つのセットをいう。
【００３２】
表現「核酸配列決定試薬の第２のセット」は、本明細書中で使用される場合、核酸配列決定試薬の１つ以上の他のセットの配列決定結果と比較される配列決定結果をもたらす、配列決定に使用される試薬の１つのセットをいう。配列決定試薬は、配列決定法のタイプに応じて様々であり得る。核酸配列決定試薬の第２のセットは、核酸配列決定試薬の第１のセットと同じである場合も、また異なる場合もある。様々な実施形態において、第３のセットまたはさらなるセットが使用され得る。
【００３３】
表現「核酸配列決定試薬の第１のセットは核酸の第２のセットとは異なる」は、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは第２のセットのいずれかに、他方のセットの中には存在しない少なくとも１種類の成分が含まれることを意味する。核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、異なるタイプの配列決定化学反応を行うために、ただし、少なくとも１種類の異なる試薬を用いて、使用され得る。あるいは、核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じタイプの配列決定化学反応を行うために、ただし、少なくとも１種類の異なる試薬を用いて使用され得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、ヌクレオチド単量体（核酸）の一本鎖および二本鎖のポリマーを意味する。これには、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連結（例えば、３’−５’および２’−５’）、逆結合（例えば、３’−３’および５’−５’分岐構造）によって連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（核酸）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはアナログ核酸が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、関連する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）を有する。ポリヌクレオチドは、全てがデオキシリボヌクレオチドからなる場合、全てがリボヌクレオチドからなる場合、また、それらのキメラ混合物からなる場合もある。ポリヌクレオチドは、ヌクレオ塩基と糖アナログからなり得る。ポリヌクレオチドは、通常、これらが当該分野でオリゴヌクレオチドとより一般的に頻繁に呼ばれる場合の、少ない数の単量体単位（例えば、５〜４０）から、数千個の単量体ヌクレオチド単位までの大きさの範囲である。他に明記されない限り、ポリヌクレオチド配列が示されているか否かにかかわらず、ヌクレオチドは、左から右に向かって５’から３’の順序であり、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」がチミジンを示すことが理解されるであろう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸配列」または「ヌクレオ塩基配列」は、ヌクレオ塩基含有サブユニットを含むポリマーの任意の区分である。適切なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的な例として、オリゴヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸、ならびにそれらのアナログおよびキメラが挙げられる。
【００３６】
用語「固定された」は当該分野で理解されており、核酸に関して使用される場合、表面の使用が意図される環境に存在している、その種に対して働く引力よりも強い引力で表面に対して核酸が付着させられている状態をいう。
【００３７】
用語「生物」は、複製させることができ、配列決定の目的である核酸を含む、任意の生存または生存していないものを示すために本明細書中で使用される。これには、プラスミド、ウイルス、原核生物、古細菌、および真核生物の細胞、細胞株、真菌、原生動物、植物、動物などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
表現「閉鎖複合体単一分子配列決定」は、本明細書中で使用される場合、固定されたプライマー／鋳型上に１つのヌクレオチドを捕捉するための、ＤＮＡポリメラーゼの通常の触媒サイクルを含むピロシーケンスをベースとする配列決定化学反応をいう。閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応および対応する配列決定試薬は、例えば、米国特許第７，２６４，９３４号に記載されている。
【００３９】
表現「ナノサイズ流体配列決定」は、本明細書中で使用される場合、個々の塩基を特定するであろう、個々のＤＮＡ分子からの電流を測定するためのナノ細孔を用いる配列決定化学反応をいう。
【００４０】
例示的な実施形態
図１は、様々な方法または手法を行うために使用できる工程を示しているフローチャートを示す。以下により十分に記載されるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列は、第１の配列決定化学反応１０を使用して決定される。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域の配列は、第２の配列決定化学反応２０を使用して決定される。２つの配列が、その後、比較される（３０）。それにより、２つの配列の間でのあらゆる差異が同定され、したがって、さらに正確な配列決定結果が得られる。
【００４１】
図２は、いくつかの実施形態で使用できる工程を示しているフローチャートを示す。第１の核酸配列は、核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域について決定され得る（４０）。第２の核酸配列は、核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して、ポリヌクレオチドの第２の領域について決定され得る（５０）。示される実施形態では、核酸配列決定試薬の第２のセットは、核酸配列決定試薬の第１のセットとは異なる。第１の領域と第２の領域は、共通している少なくとも１つのヌクレオチド塩基位置を有し得る。その後、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に対して比較され得る（６０）。さらなる配列を、核酸配列決定試薬のさらなるセットを使用して決定し、第１の核酸配列および第２の核酸配列に対して比較することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域または第２の領域中にある塩基のうちの少なくとも１つについての少なくとも１つのエラー値が、公知の方法を使用して生じ得る。いくつかの実施形態では、複数のエラー値が、例えば、２００２年１０月２３日に提出された米国特許出願公開番号２００４００５３２４６（その全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に開示されている方法にしたがって計算される。エラー値は、複数の核酸配列を比較した際に不一致が存在する場合、塩基識別を選択するための基準として使用され得る。いくつかの実施形態では、塩基識別は、他の核酸配列中の塩基の塩基識別と比較された、対応する核酸配列中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間で選択される。いくつかの実施形態では、１つの配列決定化学反応に伴う公知の問題に基づくエラーを含む可能性がある領域が同定される。この領域の配列は、同じエラーの問題がない配列決定化学反応を使用して得られた配列に対して比較される。例えば、１つの領域（例えば、ＧＣ含量が高い場所）の配列決定についてのエラー率が、第２の配列決定化学反応に対して第１の配列決定化学反応について高いことが公知である場合には、塩基識別を、第２の配列決定化学反応を使用して決定された配列から選択することができる。
【００４３】
ポリヌクレオチドの配列は、配列決定化学反応を使用して決定することができる。多種多様な配列決定化学反応が当該分野で公知である。上記で議論されたように、本明細書中に開示される様々な実施形態に有用な様々なタイプの配列決定化学反応の例としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、鎖ターミネーター法、色素ターミネーター法、可逆的ターミネーターを使用する配列決定、リン酸塩の検出による核酸の配列決定（「ピロリン酸シーケンス」または「ピロシーケンス」）、連結による配列決定、閉鎖複合体単一分子配列決定、ナノサイズ流体配列決定、および力分光法プラットフォーム配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。そのような配列決定化学反応および対応する配列決定試薬は、例えば、米国特許第７，０５７，０２６号、同第５，７６３，５９４号、同第５，８０８，０４５号、同第６，２３２，４６５号、同第５，９９０，３００号、同第５，８７２，２４４号、同第６，６１３，５２３号、同第６，６６４，０７９号、同第５，３０２，５０９号、同第６，２５５，４７５号、同第６，３０９，８３６号、同第６，６１３，５１３号、同第６，８４１，１２８号、同第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号、同第５，７５０，３４１号、同第６，３０６，５９７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６７８Ａ１、同ＷＯ９３／０５１８３Ａ１、同ＷＯ６０７４３５１Ａ２、同ＷＯ０３０５４１４２Ａ２、同ＷＯ０３００４６９０Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０６０８４１３２Ａ２、および同ＷＯ０６０７３５０４Ａ２（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００４４】
可逆的ターミネーターを使用する核酸の配列決定に有用な様々な可逆的ターミネーターが、当該分野で公知である。可逆的ターミネーター法は、１回に１つのヌクレオチドを付加し、その位置に対応する標識を検出し、その後、別のヌクレオチドを重合させるためにブロッキング基を除去する、標識されたターミネーターの可逆的なバージョンを使用する。可逆的ターミネーターのブロッキング基は、３’位置または５’位置のいずれかに存在し得る。あるいは、可逆的ターミネーターは、ヌクレオチド塩基上または２’位置に取り除くことができるブロッキング基を有し得、これは、可逆的ターミネーターが取り込まれた後、ブロッキング基が取り除かれるまで、ポリヌクレオチドの伸張を妨げるように作用する。可逆的ターミネーターを使用する配列決定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第７，０５７，０２６号および同第６，６６４，０７９号に記載されているような、切断可能なリンカー基を介して検出可能な標識に連結させられたヌクレオシドおよびヌクレオチドを使用する配列決定；米国特許第５，７６３，５９４号、同第５，８０８，０４５号、同第５，９９０，３００号、同第６，２３２，４６５号、および同第５，８７２，２４４号に記載されているような、保護されたヌクレオチドを使用する配列決定；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６７８および同ＷＯ２００６／０７４３５１に記載されているような、可逆的にブロックされたヌクレオチドを使用する配列決定；ＰＣＴ公開番号９３／０５１８３に開示されているような、塩基付加配列決定スキームによる配列決定；米国特許第６，６１３，５１３号に記載されているような、取り込みによる配列決定；米国特許第６，３０９，８３６に記載されているような、ヒドロカルビルジチオメチル修飾化合物を使用する配列決定；米国特許第６，２５５，４７５号に記載されているような、鎖ターミネーターを使用する配列決定；ならびに、米国特許第５，３０２，５０９号に記載されているような、蛍光標識された３’−ブロックヌクレオチド三リン酸を使用する配列決定。
【００４５】
ピロシーケンスは、相補的な配列が鋳型としての未知の配列（決定される配列）を使用して重合させられる技術である。毎回、１つの新しいヌクレオチドが、成長しつつある相補的な鎖に重合させられ、ピロリン酸（ＰＰｉ）分子が放出される。その後、このピロリン酸の放出が検出される。４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）またはそれらのアナログ（例えば、α−チオ−ｄＡＴＰ）の反復的付加には、ピロリン酸の放出時間と放出程度のモニタリングが伴い、それにより、成長しつつある相補的な鎖に取り込まれたヌクレオチドが同定される。ピロシーケンスの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣＴ公開番号０３／０５４１４２に開示されているような、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を使用する配列決定；米国特許第６，８４１，１２８号に記載されているようなシステムを使用する配列決定；米国特許第６，２１０，８９１号に記載されているような、ピロリン酸の放出の酵素的検出を使用する配列決定；米国特許第６，２５８，５６８号に記載されているような、ピロリン酸の放出による塩基の取り込みと、それと同時の酵素によるヌクレオチドの分解を使用する配列決定；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／００４６９０に記載されているような、実質的な二次元アレイの中で平行して行われる高密度に詰め込まれた無関係な化学反応を使用する配列決定；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／００２２０４に記載されているような、３’−Ｏ−修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を使用する配列決定。
【００４６】
段階的な連結と切断による配列決定は、標的ポリヌクレオチドの末端への連結と、そこでのプローブの切断のサイクルの繰り返しに基づく。例えば、個々のそのようなサイクルでは、１つ以上の末端ヌクレオチドが同定され、連結と切断のさらなるサイクルを行うことができるように、１つ以上のヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの末端から取り除かれる。個々のサイクルでは、標的配列は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで、１個以上のヌクレオチドずつ短くなる。連結による配列決定法の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８４１３２に記載されているような、オリゴヌクレオチドの連結と切断のサイクルによる配列決定；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１０１４５に記載されているような、フローサイトメトリーによって蛍光標識された粒子をカウントすることによる配列決定；米国特許第６，３０６，５９７号に記載されているような、一本鎖の鋳型に沿った二本鎖の伸張サイクルの繰り返しに基づく配列決定；米国特許第５，４０３，７０８号に記載されているような、鋳型核酸にハイブリダイズした連結産物を生成させることによる配列決定；ならびに、米国特許第５，５５２，２７８号に記載されているような、段階的な連結と切断による配列決定。
【００４７】
様々な実施形態において、配列は、少なくとも２種類の配列決定化学反応によって分析され得る。様々な実施形態において、３種類以上の異なる配列決定化学反応が使用される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列は、第１の配列決定化学反応を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域は、同じ鎖または相補的な鎖の異なる領域であり、これらは重複していない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域の配列は、第２の配列決定化学反応を使用して決定され得る。第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は同じであってよく、また、これらは異なっていてもよい。第１の領域と第２の領域は同じであってよく、また、これらは異なっていてもよい。他の実施形態では、第３の配列決定化学反応が、ポリヌクレオチドの第３の領域の配列を決定するために使用される。第３の領域は、第１の領域および／または第２の領域と同じであってよく、また、これは異なっていてもよい。第３の配列決定化学反応は、第１の配列決定化学反応および／または第２の配列決定化学反応と同じであってよく、また、これは異なっていてもよい。第１の領域、第２の領域、およびさらなる領域の配列決定は、いくつかの実施形態では同時に行うことができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、ピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、ナノサイズ流体配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、力分光法プラットフォーム配列決定法であり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、ピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、ナノサイズ流体配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、力分光法プラットフォーム配列決定法であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は連結化学反応による配列決定であり得、第２の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得、第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得、第２の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得、第２の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は連結化学反応による配列決定であり得、第２の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得、第２の配列決定化学反応は連結化学反応による配列決定であり得る。
【００５２】
本明細書中に開示される様々な実施形態において、配列決定は、アレイ形式で行われ得る。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチド断片について、第１の配列決定化学反応が行われ得る。続いて、アレイ上のポリヌクレオチド断片について、第２の配列決定化学反応が行われ得る。他の実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチド断片について、第３の、またはそれ以上の配列決定化学反応が行われ得る。
【００５３】
特定のタイプの配列決定化学反応は、核酸配列決定試薬の様々な異なるセットを使用して行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の１つのセットにはアピラーゼが含まれ得る。ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の別のセットにはアピラーゼは含まれず、ポリメラーゼの基質として作用することができるが、ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用できないｄＡＴＰアナログが含まれる場合がある。
【００５４】
可逆的ターミネーターを用いる配列決定のための核酸配列決定試薬の様々なセットには、当該分野で公知の多種多様な可逆的ターミネーターが含まれ得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、適切なプライマー、核酸ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ、および核酸重合剤（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）が含まれ得る。他の実施形態では、段階的な連結と切断による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ＲＮＡ重合剤（例えば、Ｑβレプリカーゼ）、検出標識、切断可能なリンカー、マグネシウム、連結試薬、切断試薬、ユニバーサル塩基が含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、適切なプライマー、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）、およびＡｇＮＯ３が含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、４倍縮重塩基を持つオクタヌクレオチドプローブとＤＮＡリガーゼが含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第５，７５０，３４１号に記載されているもの）が含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０８４１３２に記載されているような、ＳＯＬｉＤ法のための任意の試薬が含まれ得る。他の実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、アピラーゼ、ルシフェリンおよびルシフェラーゼが含まれ得る。他の実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬のセットには、例えば、標的位置がプライマーの３’末端にすぐ隣接するように試料核酸にハイブリダイズする特異的プライマー、ポリメラーゼ、ピロリン酸の放出を同定するための酵素検出手段、ポリメラーゼの基質として作用することができるが、ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用できないｄＡＰＴアナログを含むデオキシヌクレオチド、そして状況に応じて、ジデオキシヌクレオチドが含まれ得る。他の実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、鋳型核酸、プライマー、修飾されたＴ７核酸ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、およびアピラーゼが含まれ得る。他の実施形態では、可逆的ターミネーターを使用する配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、切断可能なリンカー基を介して検出可能な標識に連結させられたヌクレオシドおよびヌクレオチドが含まれ得る。他の実施形態では、可逆的ターミネーターを使用する配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ヒドロカルビルジチオメチル修飾化合物が含まれ得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列は、核酸配列決定試薬の第１のセットを使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域の配列は、核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットが、核酸配列決定試薬の第２のセットと同じタイプの配列決定化学反応を使用するために使用される。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なり；核酸配列決定試薬の第１のセットが、核酸配列決定試薬の第２のセットと同じタイプの配列決定化学反応を行うために使用される。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットが、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なるタイプの配列決定化学反応を行うために使用される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ナノサイズ流体配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、力分光法プラットフォーム配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は重複していてよい。ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、またはそれ以上重複していてよい。重複している領域は同じ鎖の上に存在する場合があり、また、相補鎖から決定される場合もある。ここで、異なる配列決定化学反応が異なる鎖について行われる。重複している領域中の核酸塩基配列の判定は、重複している領域の中でより高い正確性を得るために互いに比較することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は完全に重複していてよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は重複していない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は互いに隣接し得る。例えば、第１の領域は１〜１０塩基であり得、第２の領域は１１〜２０塩基であり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、異なるポリヌクレオチド鎖の上に存在し得る。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、異なるポリヌクレオチド鎖の上に存在し得、相補的であり得る。他の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの同じ鎖の上に存在し得る。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの同じ鎖の上に存在し得、そして重複し得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じポリヌクレオチド断片を配列決定または再配列決定するために使用され得る。他の実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じクローンの異なる領域を配列決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、第１の化学反応と第２の化学反応は、同じポリヌクレオチド鎖または相補的な鎖の、異なる重複していない領域について行われ得る。他の実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じクローンの部分的に重複している領域を配列決定するために使用され得る。例えば、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じ鎖について異なる方向から配列決定するために使用され得る。あるいは、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、相補的な鎖について異なる方向から配列決定するために使用され得る。他の実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、読み取り長を伸張させるために同じ鎖に沿って連続して行われ得る。例えば、ポリヌクレオチド鎖は、連結による配列決定によって最初に、続いて、最終的な連結産物を伸張させるためにピロシーケンスによって、配列決定され得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチド鎖は、連結による配列決定によって最初に、続いて、最終的な連結産物を伸張させるために可逆的ターミネーターの化学反応によって配列決定され得る。
【００６３】
配列決定用のポリヌクレオチドは、高度に多重化された平行配列決定の多数の従来法での配列分析のための試料と、原則として同じ様式で調製することができる。そのような方法により、使用される配列決定化学反応および検出システムのための十分な多量の標的ＤＮＡが提供される、単一ＤＮＡ分子のクローン増幅が生じる。クローン増幅産物は、固体支持体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、複数のクローンが１つの固体支持体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、それぞれが個々のクローンを含む複数の固体支持体が、複数のクローンを分けて維持するために第２の固体支持体上に固定され得る。固体支持体上でのエマルジョンＰＣＲは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／１０３０１１Ａ２、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０１０１４５Ａ２、およびＤｉｅｈｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３巻、Ｎｏ：７、ｐｐ５５１−５５９（２００６）に記載されている。単一分子から個々のポロニー（またはコロニー）を形成させるためのクローン増幅は、特に、米国特許第６，００１，５６８号に記載されている。ＰＣＲを使用して固体支持体上にクローンを形成させるためのクローン増幅もまた、特に、米国特許第５，６４１，６５８号、同第６０６０２８８号、同第６０９０５９２号、およびＰＣＴ出願ＷＯ０７／０６０４５６Ａ１に見出せる。いくつかの実施形態では、配列決定されるポリヌクレオチドは単一分子であり得る。ポリヌクレオチドは、多数のヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１ヌクレオチドから約２０，０００ヌクレオチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチドから約２，０００ヌクレオチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１００ヌクレオチドから５００ヌクレオチドから構成され得る。
【００６４】
様々な実施形態において、配列決定用のポリヌクレオチドは断片化され得る。ポリヌクレオチドの断片化は、当該分野で公知の多数の様々な方法のうちのいずれかによって行われ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡｓｅＩのようなヌクレアーゼで消化され得る。他の実施形態では、核酸は、例えば、超音波処理によって、または小さい孔を有しているチューブを通過させることによって、無作為に剪断され得る。核酸を１種類以上の制限酵素で部分的に消化することができることもまた意図され、その結果、特定の重なり部分が統計的に保たれ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のポリヌクレオチド断片になるように断片化され得る。配列決定されるポリヌクレオチドには、１つ以上のユニバーサルな感作部位、または公知であるかもしくは予め決定された配列が含まれ得る。ユニバーサルな感作部位は、例えば、連結、増幅プライマー、およびクローニングベクターを含む様々な方法で導入することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドアダプターを、ポリヌクレオチド断片の一方の末端または両端に連結させることができる。オリゴヌクレオチドアダプターは、ポリヌクレオチド断片の増幅に有用であり得る。例えば、連結されたアダプターの配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく増幅のための結合部位となり得る。
【００６６】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチド断片の少なくとも一部のクローン増幅により、断片クローンのセットが生成される。ポリヌクレオチドは、例えば、エマルジョンＰＣＲおよび架橋ＰＣＲのようなＰＣＲ、またはポロニー形成のような技術によってクローン増幅させることができる。これらは例えば、米国特許第５，６１６，４７８号、同第５，９５８，６９８号、同第６，００１，５６８号、同第５，６４１，６５８号、同第６，０６０，２８８号、同第６，０９０，５９２号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０１０１４５Ａ２、同ＷＯ０５０７３４１０Ａ２、同ＷＯ０４０６９８４９Ａ２、同ＷＯ０５０８２０９８Ａ２、同ＷＯ２００７／０６０４５６、同ＷＯ９８４４１５１Ａ１、および同ＷＯ００１８９５７Ａ１に記載されている。これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。様々な実施形態において、増幅は固相増幅であり得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、エマルジョンＰＣＲを、ポリヌクレオチドを増幅させるために使用することができる。エマルジョンを形成させるための方法は当該分野で公知である。例えば、エマルジョンは、水相を油相と混合することによって形成させることができる。いくつかの実施形態では、増幅は、例えば、バルクの油相の中にＰＣＲ反応混合物の多数の液滴を含む、油中水を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ法は、２工程の熱サイクルからなり得る。第１の工程は、油中水エマルジョンを使用して行うことができる。この工程の間に、鋳型ＤＮＡを、油中水エマルジョン中の液滴の限られた容積の中で増幅させることができる。油中水エマルジョンは、その後、崩壊させられ、第２のＰＣＲ工程が行われ得る。
【００６８】
様々な実施形態において、架橋ＰＣＲを、ポリヌクレオチドを増幅させるために使用することができる。架橋ＰＣＲは、特に、米国特許第５，６４１，６５２号およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ／０８００２５０２Ａ２に記載されている。架橋ＰＣＲは、クローン増幅を行うために使用することができる。架橋増幅は、固相に結合させられたプライマーを、溶液相の標的核酸配列の伸張および増幅のために使用する技術である。アニーリング工程の間に、１つの結合したプライマーによって伸張した産物は、他の結合したプライマーと架橋を形成する。全ての増幅産物が表面に共有結合されると、これらを、電気泳動を行わずに検出し、定量することができる。例えば、５’−アミンを持つプライマーは、例えば、シリカ、ポリメチルメタクリレート、またはポリスチレンビーズ支持体に共有結合させることができ、標準的なＰＣＲ反応条件下で溶液相プライマーの代わりに使用することができる。増幅反応は、支持体に結合した形態への３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みによってモニターすることができる。
【００６９】
様々な実施形態において、ポロニーの形成を、ポリヌクレオチドを増幅させるために使用することができる。ポロニー技術は、反応が、例えば、顕微鏡スライドに貼り付けられた薄いポリアクリルアミドゲルの中に固定されるＰＣＲの１つの形態である。ＰＣＲが進行するに伴い、ＰＣＲ産物は、その固定された鋳型（例えば、ポリヌクレオチド）からゲルの中に放射状に拡散し、それによって、環状のＰＣＲ産物またはポリメラーゼコロニーを生じる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、クローン、例えば、遺伝子操作技術によって、１つの生物から別の生物へと移動させられ、複製させられた遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、クローンを増幅させることができる。いくつかの実施形態では、核酸配列決定化学反応を、目的のポリヌクレオチドに由来するクローンライブラリーについて行うことができる。クローンライブラリーには、目的の生物のゲノムが含まれ得る。いくつかの実施形態では、目的の生物は原核生物である。他の実施形態では、目的の生物は真核生物である。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーには、目的のゲノムに由来するアンプリコン由来のクローンが含まれ得る。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーは核酸ライブラリーに由来し得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片は固体支持体上に固定することができる。分析用のポリヌクレオチド断片の単一クローンを、単一の固体支持体（例えば、単一ビーズ上の単一クローン）上に存在させることができる。他の実施形態では、複数のクローンを、単一の固体支持体上に存在させることができ、これらは互いに間隔をあけることができる。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドもしくは断片の増幅および／または配列決定は、固体支持体上で行うことができる。固体支持体は、その上でポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する、付着させる、または固定することができる任意の固相材料であり得る。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトのような、有機ポリマーから作られ得る。固体支持体はまた、無機でもあり得、例えば、ガラス、ケイ素、細孔性ガラス（ＣＰＧ）、または逆相ケイ素であり得る。固体支持体の立体構造は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、表面の形態、またはそれらの組み合わせであり得る。表面は平坦、実質的に平坦であり得るか、または平坦ではない場合もある。固体支持体は多孔性であっても、非孔性であってもよく、また、膨張性があっても、また膨張性がなくてもよい。固体支持体は、ウェル、くぼみの形態、または他の容器、器、特徴、または配置もしくは位置の中に構成することができる。
【００７２】
有用な固体支持体は当該分野で周知であり、これには、核酸を共有結合するものまたは核酸を非共有結合するもののいずれかが含まれる。水素結合を含むと一般的に理解される非共有支持体には、自然界に存在しているポリマー、および合成のポリマー材料（例えば、ニトロセルロース、誘導型ナイロン、およびフッ化ポリヒドロカーボン）が、フィルターまたは固体シートのような様々な形態で含まれる。共有結合支持体もまた有用であり、これには、化学反応基または基を有している材料（例えば、ジクロロトリアジン、ジアゾベンジルオキシメチルなど）が含まれる。これらは、ポリヌクレオチドへの結合のために活性化させることができる。
【００７３】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドの増幅は、半固体支持体の中で行われ得る。「半固体」は、本明細書中で使用される場合、固体成分と液体成分を両方持つ圧縮可能なマトリックスをいう。ここで、液体が、孔、空間、または複数の固体マトリックス成分間の他の隙間をふさいでいる。例示的な半固体マトリックスとしては、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリアミド（ナイロン）、および架橋されたアガロース、デキストラン、およびポリエチレングリコール製のマトリックスが含まれる。半固体支持体が、例えば、実質的な平面、固定支柱である半固体支持体を支える、基質とも言われる第２の支持体上に設けられる場合がある。
【００７４】
いくつかの実施形態では、増幅させたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片をアレイ上に存在させることができる。いくつかの実施形態では、アレイには、クローン以外の個々の分子が含まれ得る。本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドのアレイには、固体支持体上または器の配置の中に存在するポリヌクレオチドの配置が含まれる。アレイには、本明細書中で使用される場合は、ランダムアレイ（例えば、ビーズアレイ）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ジップコード（すなわち、配列タグ）を、アレイ上に分類するために使用することができる。特定のアレイ形式は、「チップ」または「バイオチップ」と呼ばれる（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．（２０００））。アレイには、低密度数（例えば、１個から約１２個）、中密度（例えば、約１００個以上の位置）、または高密度数（例えば、１０００個以上）のアドレス可能位置が含まれ得る。通常、アレイ形式は、製造、取り扱い、配置、積み重ね、試薬を投入、検出、および保存できるように幾何学的に一定の形状であり得る。アレイは、横列および縦列形式で構成され得、それぞれの位置の間に一定の間隔が設けられる。あるいは、位置は、均一な処理および／またはサンプリングのために束ねることができ、混合することができ、また、均一に混ぜることもできる。アレイには、高スループットの取り扱い、ロボット送達、マスキング、および／または試薬のサンプリングのために、ならびに／あるいは、レーザー照射、共焦点および／または偏向集光による散乱を含む検出手段によって個々の位置が空間的にアドレス可能であるように構成されたアドレス可能な複数の位置を含めることができる。アレイには、１つ以上の「アドレス可能配置」、例えば、「アドレス可能位置、すなわち、１つの公知のタイプの分子を含む物理的配置が含まれ得る。
【００７５】
１つ以上のタイプの基準が、画像解析またはアラインメントを補助するために分析される試料の中で散乱させられ得る。様々な実施形態において、試料にはさらに、少なくとも１つの基準が含まれる。「基準」または「マーカー」または「登録点」は、本明細書中で、アレイの連続するデータ画像の正確な比較を可能にする物理的参照特徴または特性を意味する。基準の使用は様々な理由から有用である。一般的には、配列決定方法には、経時的に撮影された、いくつかのデータ画像のうちの空間的に異なる複数の位置（特徴）に配置された目的物（すなわち、核酸）をモニタリングすることが含まれ得る。１つのフレームから次のフレームまでで起こった何らかのシフトは、物質の分析を複雑にする。アッセイ構造の中に永久的な基準を取り込ませることにより、それぞれのデータ画像を、手作業または自動のいずれかで整列させることができ、それにより画像の正確な比較、並進の制御（すなわち、Ｘ−Ｙ方向でのシフト）、および／または回転、ならびに、画像の縮小または拡大が可能となる。加えて、蛍光に基づくアッセイが使用される場合（崩壊または分析のアッセイのいずれかについて、あるいは両方について）には、任意の所定の画像において、特定の領域または特徴は、標識の特徴、および調べられる波長、または分析物もしくはＤＢＬの有無などに応じて、蛍光を発する場合も、また発しない場合もある。いくつかの実施形態では、画像解析は、試薬の２つ以上のセットによって生じた同時に検出可能なシグナルによって行われ得る。
【００７６】
アレイ上のポリヌクレオチドを配列決定するための様々なシステムは、例えば、米国特許第６，４０６，８４８号、同第６，６５４，５０５号、同第６，８０６，０５２号、および同第６，８３１，９９４号に記載されている。これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。通常、配列決定化学反応により、特異的なヌクレオチド塩基の存在の指標である検出可能なシグナルが生じる。例えば、蛍光、比色、化学発光、放射活性、または質量タグ（例えば、質量分析法とともに使用される）シグナルのような光学シグナルが生じ得る。したがって、目的のそれぞれのタイプのシグナルを検出するために複数のタイプの検出システムを有しているシステムを持つことが望ましい。
【００７７】
目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムのいくつかの実施形態の特徴が、本発明の様々な実施形態にしたがって開示される。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムには、以下が含まれ得る：少なくとも１つの入力ポートを有している分析用ポリヌクレオチドを含むフローセル；核酸配列決定試薬の第１のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートとつながれている）；核酸配列決定試薬の第２のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートと流体連結されている）；核酸配列決定試薬の第１のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成された第１の光学シグナルコレクター；および核酸配列決定試薬の第２のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成された第２の光学シグナルコレクター。いくつかの実施形態では、分析用ポリヌクレオチドは、フローセルの中に含まれるアレイ上に存在する。いくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは同じ構成要素である。他の実施形態では、これらは異なる。いくつかの実施形態では、配列決定試薬の第１のセットによって生じた光学シグナルと、配列決定試薬の第２のセットによって生じた光学シグナルは、同時に回収される。このシステムは、配列決定試薬のさらなるセットを加えるために容易に拡大することができる。
【００７８】
このシステムのいくつかの実施形態についての重要な特徴はフローセルである。様々な実施形態において、フローセルの本体には、少なくとも１つの入力ポートと、少なくとも１つのリザーバーセットが含まれ得る。様々な実施形態において、フローセルには２つのリザーバーセットが含まれ得る。入力ポートとリザーバーセットは、標準的なマイクロマシニング技術（例えば、Ｅｋｓｔｒｏｍら、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ９１／００３２７；Ｂｒｏｗｎ、米国特許第４，９１１，７８２号；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：１９２−１９３２（１９９２）など）によって形成され得る。フローセルは、ガラス、シリコン、ポリエチレン、ポリエステル、テフロン（登録商標）、他のプラスチックなどを含む任意の様々な材料から組み立てられ得る。様々な実施形態において、フローセルの重要な機能としては、以下が挙げられる：ｉ）一連の処理工程の間、実質的に固定された平坦なアレイまたは単層の中にポリヌクレオチドの集団を保持すること、ｉｉ）処理のそれぞれの工程の間に、核酸配列決定試薬が個々のポリヌクレオチドに接近できることを確実にすること、およびｉｉｉ）処理試薬の使用を最小限にすること。必要とされる固定の程度は、それぞれの実施形態の間で変化し得る。
【００７９】
様々な実施形態において、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは同じ構成要素である。様々な実施形態において、光学シグナルコレクターのうちの１つにはＣＣＤが含まれる。様々な実施形態において、このシステムにはさらに、ポリヌクレオチドのアレイ上に存在する蛍光シグナルの励起を誘導するように構成されたレーザーが含まれる。
【００８０】
このシステムのいくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターまたは第２の光学シグナルコレクターは、蛍光シグナルを検出する。このシステムのいくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは蛍光シグナルを検出する。このシステムのいくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターまたは第２の光学シグナルコレクターが、化学発光シグナルを検出する。他の実施形態では、このシステムは、比色シグナルと化学発光シグナルの両方を検出するための検出システムを有することができる。他の実施形態では、このシステムは、蛍光シグナルと化学発光シグナルの両方を検出するための検出システムを有することができる。他の実施形態では、このシステムは、蛍光、比色シグナル、および化学発光シグナルを検出するための検出システムを有することができる。
【００８１】
核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じであっても、異なっていてもよい。核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じタイプの配列決定化学反応、または異なる配列決定化学反応を行うために使用することができる。核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じタイプの配列決定化学反応を行うために使用され得、そしてこれらは、両方のセットの間で異なる少なくとも１つの試薬を有する。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ナノサイズ流体配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、力分光法プラットフォーム配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００８２】
このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、ナノサイズ流体配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、力分光法プラットフォーム配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００８３】
このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る
いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術を、完全にまたは一部、同時に行うことができる。例えば、２種類以上の配列決定技術の少なくとも一部を同時に実行することができる。したがって、いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術のうちの１つ以上の工程を同時に行うことができる。１つ以上の工程は同じ工程であっても、対応する工程であってもよく、また、異なる工程であってもよい。他の実施形態では、２種類以上の配列決定技術を、完全に同時に行うことができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術または配列決定試薬のセットが、同時に、平行して、または時間的に重複して使用される。すなわち、いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定法方が同じ時間の間に行われる（しかし、これらは、全ての実施形態において同じタイミングで開始され、停止される必要はない）。いくつかの実施形態では、２種類の技術が同じ室内で行われる。いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術（例えば、配列決定試薬の使用）が、別のタイミングで行われ得、そして最初の出発材料（例えば、増幅された産物）は同じ増幅させられた試料に由来し得る。したがって、いくつかの実施形態では、試料の増幅後に、様々な配列決定方法でのその後の使用のために試料を分けることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、複数の配列決定プロセスのためのキットが提供される。これらのキットには、出発標的核酸配列の増幅のための試薬、出発標的核酸配列の配列決定のための試薬の第１のセット、出発標的核酸配列の配列決定のための試薬の第２のセット（ここでは、２つのセットは互いに異なる）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、増幅試薬は含まれない。加えて、説明書とエラーの同定の指針の１つのセットが含まれ得る。そのような構成要素は、例えば、印刷物であっても、また、デジタル形態であってもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術を使用して核酸を配列決定することができる配列決定機器が提供される。いくつかの実施形態では、この機器は、２つ以上の核酸を、２種類の配列決定技術を使用して、一部または完全に、同時に配列決定するために使用することができる。この機器には、例えば、１つ以上のリザーバーが含まれている１つ以上のフローセルと、１つ以上の光学シグナルコレクターが含まれ得る。いくつかの実施形態では、配列決定機器は、２つのさらなる配列決定化学反応によるシグナルを処理することができる。例えば、そのような機器には、例えば、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定法、鎖終結法、色素終結法、可逆的ターミネーターを使用する配列決定法、リン酸塩の検出による核酸の配列決定法、連結による配列決定法、閉鎖複合体単一分子配列決定法、ナノサイズ流体配列決定法、および力分光法プラットフォーム配列決定法（これらに限定されない）のような配列決定化学反応のうちの２種類以上のタイプによるシグナルを処理する能力が含まれ得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、複数の配列決定技術の結果を比較し、他の配列決定技術と比較して１つの配列決定技術でのエラーの可能性（すなわち、エラー率）に基づいて個々の同定された配列から最適な配列（例えば、最もエラーを起こしにくい）を選択するデータ処理能力を含む機器が提供される。いくつかの実施形態では、機器は、２種類以上の配列決定化学反応についての配列決定シグナル処理能力とデータ処理能力の両方を有し得る。複数の配列決定化学反応によるシグナルを処理するため、および／または結果を比較するためにデータを処理するための機器には、例えば、生の、または制限されていない配列決定データを受け取るための手段、少なくとも１つの処理装置、および／または標準的な配列決定データを記憶させるための記憶装置が含まれ得る。いくつかの実施態様では、機器には、ビデオディスプレーが含まれるか、または、機器がビデオディスプレーにつながれるか、あるいは別の装置（例えば、コンピューター）に通信接続させられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、複数の配列決定技術の結果を比較し、そして他の配列決定技術と比較した１つの配列決定技術におけるエラーの可能性（すなわち、エラー率）に基づいて個々の同定された配列から最適な配列（最もエラーを起こしにくい）を選択する、コンピュータープログラムが含まれる（または、別々に提供され得る）。いくつかの実施形態では、このプログラムは、配列を得、そして複数の配列を組み合わせるために使用される特異的技術についてのエラーの可能性に基づいて、得られた個々の配列についてもっとも正確な配列を選択する（または、最も正確でない配列を除外する）。この様式で、１つの完全な、精度の高い配列が、このプログラムによって提供され得る。いくつかの実施形態では、このプログラムは、本明細書中に記載される複数の方法のうちの任意のものを実行する。いくつかの実施形態では、このコンピュータープログラムは、複数の配列決定技術によるデータを処理するための機器と組み合わせて使用することができる。他の実施形態では、このコンピュータープログラムは、パーソナルコンピューターおよびミニコンピューターと一般的に呼ばれているものを含む、任意の多目的コンピューターを使用して実行され得る。
【実施例】
【００８９】
本発明の教示の複数の態様は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得る。以下の実施例は、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００９０】
（実施例１）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９１】
配列決定用のポリヌクレオチドは、以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、以下に記載するように連結による配列決定を使用して配列決定を行い、第１の配列を決定する（図３、７０）。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について、以下に記載するようにピロシーケンスを行って、第２の配列を決定する（図３、８０）。第１の配列を第２の配列に対して比較する（図３、９０）。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９２】
（実施例２）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９３】
配列決定用ポリヌクレオチドは以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、以下に記載するように連結による配列決定を使用して配列決定を行い、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について可逆的ターミネーターを使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９４】
（実施例３）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９５】
配列決定用ポリヌクレオチドは以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、可逆的ターミネーターを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について以下に記載するようにピロシーケンスを行って第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９６】
（実施例４）
本実施例は、ヌクレオチド配列決定試薬の第１のセットとヌクレオチド配列決定試薬の第２のセットを使用するポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９７】
配列決定用ポリヌクレオチドは、以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、例えば、ポロニー増幅によってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について配列決定試薬の第１のセットを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。配列決定試薬の第１のセットには、ＲＮＡ重合剤（例えば、Ｑβレプリカーゼ）、検出標識、切断可能なリンカー、マグネシウム、連結試薬、切断試薬、およびユニバーサル塩基が含まれる。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について配列決定試薬の第２のセットを使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。配列決定試薬の第２のセットには、プライマー、修飾されたＴ７核酸ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、およびアピラーゼが含まれる。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９８】
（実施例５）
本実施例は、第１の配列決定化学反応によってポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定し、第２の配列決定化学反応によってポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９９】
ポリヌクレオチドの第１の領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域に隣接している異なるポリヌクレオチド鎖（すなわち、相補鎖）上にある第２の領域について連結による配列決定を使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１００】
（実施例６）
本実施例は、ポリヌクレオチドの１つの鎖に沿って読むための、配列決定試薬の２つの異なるセットを使用することにより、読み取り長を伸張させるための可能な方法を説明する。
【０１０１】
本実施例では、ポリヌクレオチドの第１の領域について、連結による配列決定のための配列決定試薬の１つのセットを使用する配列決定を行う。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域と同じ鎖にあるポリヌクレオチドの第２の領域について、配列決定試薬の第１のセットとは異なる、配列決定試薬の第２のセットを使用する配列決定を行って、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列決定による最終的な連結産物を伸張させる。
【０１０２】
（実施例７）
本実施例は、可逆的ターミネーターを用いる配列決定と連結による配列決定によって、重複しているポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０３】
ポリヌクレオチドの第１の領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域と１０ヌクレオチド重複している、ポリヌクレオチドの同じ鎖上にある第２の領域について、連結による配列決定を使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１０４】
（実施例８）
本実施例は、２種類の配列決定化学反応を使用して同じポリヌクレオチドを配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０５】
ポリヌクレオチドの１つの領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の核酸配列を得る。次に、ポリヌクレオチドの同じ領域について、連結による配列決定が行って、第２の核酸配列を得る。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１０６】
（実施例９）
本実施例は、異なる鎖の上にあり、完全に重複している２つの領域である、ポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０７】
ポリヌクレオチドの第１の領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域と完全に重複しているポリヌクレオチドの異なる鎖上にある第２の領域（すなわち、ポリヌクレオチドの第１の領域の相補物）についてピロシーケンスを行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１０８】
（実施例１０）
本実施例は、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットを使用した配列決定によって得られたエラー値を使用するポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０９】
本実施例では、断片クローンの１つのセットの第１の部分を酸配列決定試薬の第１のセットを使用して配列決定する。この配列決定により、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリが得られる。第１のヌクレオチド塩基配列中の核酸配列中の塩基のうちの少なくとも一部についてのエラー値が得られる。
【０１１０】
次に、断片クローンの上記セットの第２の部分を、核酸配列決定試薬の第２のセットを用いて配列決定する。この配列決定により、第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリが得られる。第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてのエラー値が得られる。
【０１１１】
次に、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリを第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリと比較する。他の塩基配列アセンブリ中の塩基の塩基識別と比較した、対応しているヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、第１の塩基配列アセンブリと第２の塩基配列アセンブリとの間での少なくとも１つの塩基識別を選択する。例えば、第１のヌクレオチド配列アセンブリ中の塩基識別のエラー値がＸであり、第２のヌクレオチド配列中の塩基識別のエラー値が＜Ｘである場合には、その位置の塩基についての識別は、第２のヌクレオチド配列中の塩基識別として選択される。
【０１１２】
（実施例１１）
本実施例は、エマルジョンＰＣＲによるポリヌクレオチド配列の増幅のための可能な方法を説明する。他の方法と改変は当業者に明らかであろう。
【０１１３】
ＰＣＲ用のマイクロエマルジョンは、以前に記載された方法のわずかな変更によって調製することができる。ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０１０１４５、同ＷＯ０５０７３４１０、および同ＷＯ０４０６９８４９；Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．（１９９８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６，６５２−６５６；Ｇｈａｄｅｓｓｙ，Ｆ．Ｊ．、Ｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，４５５２−４５５７（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる）。油相は、鉱油（Ｓｉｇｍａ Ｍ−３５１６）中の４．５％のＳｐａｎ ８０（Ｓ６７６０、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．４０％のＴｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｓ−８０７４）、および０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｔ−９２８４）からなり得る。油相は、毎日新しく調製することができる。いくつかの実施形態では、水相は、３００μｌの全量中の、６７ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭのＮＨ４ＳＯ４、６．７ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（３−メルカプトエタノール、１ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、１ｍＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、０．０５μＭの正方向プライマー、２５μＭの逆方向プライマー、４５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０９６６−０３４）、様々な量の鋳型核酸、および約１０８オリゴヌクレオチドが結合させられたビーズからなり得る。いくつかの実施形態では、正方向プライマーは、その配列が目的のポリヌクレオチドの３’の２０〜２２ｎｔと同一であるオリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、正方向プライマーのうちの少量は、増幅反応を最大化させるためにビオチンで修飾されない。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、油中水型マイクロエマルジョンは、２ｍｌの丸底凍結保存用バイアル（４３０６６１，Ｃｏｍｉｎｇ，Ｃｏｍｉｎｇ，ＮＹ）の中に予め入れた４００マイクロリットルの油相に対する２００マイクロリットルの水相の滴下によって調製することができる。滴下は、例えば、ＶＷＲモデル５６５磁気攪拌装置上で磁気マイクロ撹拌棒（５８９４８−３５３，ＶＷＲ，Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）により１４００ＲＰＭで混合物を攪拌しながら、１分かけて行われ得る。水相の添加後、混合物は全部で約３０分間、持続的に攪拌される。
【０１１５】
２つのエマルジョンを、磁気攪拌装置の中心に置いた棚の中に２つのチューブを置くことによって一度に作製することができる。
【０１１６】
エマルジョンを９６ウェルＰＣＲプレートのウェルにアリコートし、それぞれ約１００μｌを含める。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、以下のサイクル条件下で行われ得る：９４℃で２分間、その後に：９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、そして７０℃で３０秒間を４０サイクル。いくつかの実施形態では、分析されるＰＣＲ産物は、約１８０ｂｐから２５０ｂｐまでの範囲であり得る。
【０１１７】
ＰＣＲサイクルの後、ＰＣＲプレートのウェル由来のマイクロエマルジョンをプールし、１．５ｍｌのチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４３０９０９）中への８００μｌのＮＸ緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのＮａＣｌ）の添加によって崩壊させることができる。２０秒間のボルテックス後、ビーズを、８０００ｒｐｍ（５０００ｇ）で９０秒間のマイクロ遠心分離機での遠心分離によってペレット化することができる。最上部の油相と、３００マイクロリットルの水相を除くほぼ全てをチューブから取り出し、６００μｌのＮＸ緩衝液を添加することができる。２０秒間のボルテックスと９０秒間の遠心分離の後、最上部の油相と、３００μｌの水相を除くほぼ全てを取り出す。６００μｌのＮＸ緩衝液の添加、ボルテックス、および遠心分離をもう一度繰り返し、最上部の油部分と、３００μｌの水相を除くほぼ全てを取り出す。その後、チューブを磁石（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓ）の上に置き、上清の残りを注意しながらピペットで取り除いた。ビーズを、遠心分離ではなく磁力による分離を使用して１×ＰＣＲ緩衝液でさらに３回洗浄し、最後に１００μｌの１×ＰＣＲ緩衝液中に再度懸濁した。
【０１１８】
（実施例１２）
本実施例は、ポロニー増幅によるポリヌクレオチドの増幅のための可能な方法を説明する。ポロニー増幅は、例えば、米国特許第５，６１６，４７８号、同第５，９５８，６９８号、および同第６，００１，５６８号；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０８２０９８Ａ２にさらに記載されており、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１１９】
ポリヌクレオチドの増幅は、培地を染み込ませた、多孔性、繊維性、網目状、コイル状、毛細管状、薄板状、または折り畳まれた構造を有しており、核酸の指数増幅のための細胞を含まない酵素システムの構成要素を含む、有機および／または無機固体マトリックスを使用することにより、培地の中で行うことができる。この培地中では、個々の分子の子孫（クローン）は、マトリックス分子が最初に入れられた反応容積の同じ区画に留まる。この方法では、インビトロでの核酸のクローニング、ならびに、研究される試料中での核酸分子の単独の検出が可能である。
【０１２０】
緩衝液、熱安定性核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ核酸ポリメラーゼ）、核酸試料、プライマー、および基質を含む全ての反応成分は、脱気されたアクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド溶液、およびアクリルアミド重合の触媒［過硫酸アンモニウムおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）］と混合される。０．２〜０．４ｍｍ厚のゲル層が、その後、一方のガラスはシラン結合剤で、他方のガラスはシラン除去剤で処理されている２枚のガラスプレートの間に成型される。重合の完了後、シラン除去剤で処理されたプレートが取り除かれ、ゲルに、反応緩衝液で湿らされたナイロンブロッティング膜が重ねられ、熱安定性フィルムで包まれ、そしてガラスプレートに向かい合わせになるように取り付けられた恒温プレート上に置かれる。恒温プレートとの適正な熱交換を確実にするために、鉱油の薄層が、プレート表面とゲルを包むフィルムの間に設けられる。増幅反応は、恒温プレートの温度が循環（少なくとも２０サイクル行われる）させられると起こる。これは、送水管を通じて恒温プレートと接続された温度制御デバイスを使用することによって行われ、これは、様々な温度の３つまたは２つの水浴を使用する。Ｔｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｈ．ら（１９８９）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６，３３−３５］Ｗｅｉｅｒ，Ｈ．Ｕ．およびＧｒａｙ，Ｊ．Ｗ．（１９８８）ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ７，４４−４７。市販されているＰＣＲ温度循環装置もまた、加熱ブロックがゲルプレートに適合するように改良された後に使用することができる。反応成分、それらの濃度、およびＰＣＲ条件は、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４８７−４９１に記載されているとおりである。
【０１２１】
（実施例１３）
本実施例は、固相増幅によるポリヌクレオチドの増幅のための可能な方法を説明する。固相合成は、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号、同第６，０６０，２８８号、および同第６，０９０，５９２号；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０６０４５６、同ＷＯ９８４４１５１Ａ１、および同ＷＯ００１８９５７Ａ１にさらに記載されており、これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１２２】
本実施例では、ポリヌクレオチドは、およそ１ｋｂの長さを有しているポリヌクレオチド断片が生じるように超音波処理される。標的配列を含むアダプターが、ポリヌクレオチド断片の少なくとも一方の末端に対してアニーリングさせられる。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド断片の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を用いて合成され、そしてこのオリゴヌクレオチドはエポキシシラン誘導固体支持体に対して、５’アミノ基によって固定される。ヘキサエチレン−グリコールのスペーサー基が、ハイブリダイゼーション反応の際の立体障害を排除するためにオリゴヌクレオチドの合成の間に含められる。スペーサー領域は、アミノ基の付加の前に合成されたオリゴヌクレオチドに導入され、それにより、計算された２５Åのスペーサー領域が生じる。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドは、熱安定性ポリメラーゼ、酵素緩衝液、３２Ｐ標識ｄＮＴＰおよび未標識ｄＮＴＰの存在下でポリヌクレオチド断片の標的核酸配列とハイブリダイズさせて、反応混合物を形成させることができる。反応混合物は、変性のために９４℃で１分間加熱され、１分間５５℃に冷却され、そして５分間７５℃に温められて、固定されたオリゴヌクレオチドから伸張する、ポリヌクレオチド断片に相補的な増幅産物が形成させられる。
【０１２４】
（実施例１４）
本実施例は、ピロシーケンスによるポリヌクレオチドの増幅のための可能な方法を説明する。
【０１２５】
ピロシーケンスは、例えば、米国特許第６，８４１，１２８号、同第６，２１０，８９１号、および同第６，２５８，５６８号にさらに詳細に記載されており、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１２６】
本実施例では、増幅された目的のポリヌクレオチドは、リアルタイム核酸配列決定のための鋳型として使用される。ポリヌクレオチドは、ストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性体ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ２８０−ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎまたはＭ４５０−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）上に固定され、プライマーがこの固定された鋳型に対してハイブリダイズさせられる。固定されたポリヌクレオチドは、修飾されたＴ７核酸ポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０；Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）、クレノウ核酸ポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、またはエキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ−）クレノウ核酸ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）のいずれかとともにインキュベートされる。配列決定手順は、様々なデオキシヌクレオシド三リン酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が連続的に付加される際のプライマー鎖の段階的伸張によって行われる。それぞれのヌクレオチド付加の間の固定されたポリヌクレオチドの洗浄は、２工程で行われる：最初に、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液で、その後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．５）で行われる。ヌクレオチドの取り込みが原因で放出されたＰＰｉは、ＥＬＩＤＡによって検出される（Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７、２３５−２３８）。発光は、電位差記録計に接続されたＬＫＢ１２５０照度計を使用して測定される。照度計は、内部光標準について１０ｍＶの反応を生じるように較正される。照度の出力は、既知の量のＡＴＰまたはＰＰｉの添加によって較正される。標準的なアッセイ容量は０．２ｍｌであり、これには以下の成分が含まれ得る：０．１μＭのＡＴＰについて２００ｍＶの反応を生じる量の、０．１ＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．７５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、５μＭのアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、４μｇ／ｍｌのＬ−ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、０．３Ｕ／ｍｌのＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．７．７．４）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）、精製されたルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）。１ｐｍｏｌの固定された核酸断片と３ｐｍｏｌの核酸ポリメラーゼが、上記の溶液に添加される。配列決定反応は４０ｐｍｏｌの１種類のヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の添加によって開始される。この反応は室温で行うことができる。ｄＡＴＰとｄＡＴＰαＳのルシフェラーゼ反応に対する影響が実験される場合は、ＡＰＳとＡＴＰスルフリラーゼの両方をアッセイから省くことができる。
【０１２７】
（実施例１５）
本実施例は、連結による配列決定によるポリヌクレオチド配列の決定のための可能な方法を説明する。
【０１２８】
本実施例では、鋳型核酸は、磁気ビーズに対して目的のポリヌクレオチドを５’末端で結合させることによって調製される。蛍光標識されたプライマーが１×クレノウ緩衝液と予め混合される。この溶液は、緩衝液の除去後、鋳型が付着させられた磁気ビーズのアリコート（１０６／μＬ）に添加され、得られる溶液が、ハイブリダイゼーションに適している条件下で十分に混合される。鋳型／プライマーハイブリダイゼーションを起こさせた後、プライマー／緩衝液が除去され、ビーズは洗浄緩衝液を使用して洗浄され、その後、連結緩衝液中に再度懸濁させられる。標識プライマーがハイブリダイズした鋳型ビーズは、その後、第１の配列決定プローブ、リガーゼ、および緩衝液を含む混合物中で、プローブの連結に適している条件下でインキュベートされる。プローブの連結後、ビーズが、酢酸ナトリウムを含む緩衝液中で洗浄される。ＡｇＮＯ３がこの溶液に添加され、得られた混合物が、切断を可能にする条件下でインキュベートされる。ＡｇＮＯ３が除去され、ビーズは、酢酸ナトリウム中で１回洗浄される。その後、ビーズは中性緩衝液中で洗浄され、アリコートが取り出され、分析用に保存される。緩衝液が除去され、その後、ビーズがＨ２Ｏ５中に再懸濁され、第２の配列決定プローブ、リガーゼ、および緩衝液を含む混合物とともに、連結に適している条件でインキュベートされる。第２の配列決定プローブの連結後、ビーズが、酢酸ナトリウムを含む緩衝液中で洗浄される。ＡｇＮＯ３がこの溶液に添加され、そして得られる混合液が、切断を可能にする条件下でインキュベートされる。ＡｇＮＯ３が除去され、ビーズは、酢酸ナトリウム中で１回洗浄される。その後、ビーズが中性緩衝液中で洗浄され、アリコートが取り出され、分析用に保存される。
【０１２９】
第１の配列決定プローブと第２の配列決定プローブは、内部ホスホロチオレート化チミジン塩基（ｓＴ）を含むように合成される。第１の切断可能プローブが、Ｔ４核酸リガーゼを使用してプライマーの伸張可能な末端に連結され、その後、硝酸銀を使用して切断される。切断により、伸張プローブの末端にある５個のヌクレオチドが除去され、プライマーに連結させられたままのプローブの部分上に伸張可能な末端が生じる。その後、第２の切断可能プローブが伸張可能な末端に連結され、その後、同様に切断される。
【０１３０】
蛍光キャピラリー電気泳動ゲルシフトアッセイを使用して、連結と切断の工程をモニターすることができる。このアッセイでは、プライマーが、５’リン酸がオリゴヌクレオチドプローブとなるための連結基質として作用できるよう（リンが移動度に基づくキャピラリーゲル電気泳動のレポーターとなる）に、鋳型鎖にハイブリダイズさせられる。各工程の後、ビーズのアリコートが分析のために取り出される。オリゴヌクレオチドプローブの連結後、磁気ビーズが磁石を使用して回収され、プライマーとそれに連結させられたプローブ（単数または複数）からなる連結種が、熱変性によって鋳型ビーズから解離させられ、標識されたサイズ標準物とともに自動核酸配列決定機器を使用する蛍光キャピラリー電気泳動に供される。典型的なゲルシフトにおいては、ピーク電位には、ｉ）プライマーピーク（伸張が起こらなかったかまたはプライマーの伸張が起こらなかったことが原因である）、ｉｉ）アデニル化ピーク（核酸リガーゼの作用による非生産性の連結点の５’末端でのアデノシン残基の付着が原因である−Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８６：７９０−７９７、１９７４を参照のこと）、およびｉｉｉ）完了ピーク（オリゴプローブの付着が原因である）が含まれる。
【０１３１】
連結が完全に進行することが望ましいが、これは必須ではない。例えば、上記に記載した連結工程後に５’ホスファターゼで処理することにより、任意の連結されていない５’末端を効率よく「キャップ」することが可能である。しかし、そのような場合は、行うことができる連続的な連結の数が、連結可能な分子の減少が原因で制限されるであろう。所定の数の連続的な連結を用いる場合は、読み取り長は、それぞれの連結／切断サイクル後に残っているプローブ長と、連続的な反応の回数に依存し、それぞれの後に、プライマーの除去と、プライマー結合部位の異なる部分に結合するプライマーのハイブリダイゼーションが続き、これらは、所定の鋳型について行うことができ、「リセット」の数とも呼ばれる。これは、プローブの５’末端に向かって配置された切断可能な連結を持つより長いプローブを使用する根拠を示している。本発明者らの実験では、ヘキサマープローブは、オクタマーおよびさらに長いプローブよりも多量の連結不可能なアデニル化産物を生じた。したがって、オクタマーおよびさらに長いプローブは、完成するまで実質的に連結するであろう（下記を参照のこと）。加えて、ヘキサマープローブの５’末端に蛍光部分を付加することによって、連結の効率が下がると見られ、一方、オクタマープローブに蛍光部分を付加することはほとんど影響がないか、または全く影響はない。これらの理由から、オクタマーまたはさらに長いプローブの使用が特定の実施形態において好ましいと考えられる。
【０１３２】
（実施例１６）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１３３】
配列決定用ポリヌクレオチドは以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、以下に記載するように連結による配列決定を使用して配列決定を行い、第１の配列を決定する。ポリヌクレオチドの第２の領域について、以下に記載するようにピロシーケンスを行って、第２の配列を決定する。少なくとも第１の領域と第２の領域の一部を同時に配列決定することができる。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の間での塩基のバリエーションと配列の偏りもまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮され得る。
【０１３４】
上記の一般的な記載と詳細な記載はいずれも例であり、説明にすぎず、請求される本発明を限定するものではないと理解される。本明細書中では、単数形の使用には、他に具体的に示されない限り、複数形が含まれる。本明細書中では用語「ａ」または「ａｎ」は、他に具体的に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書中では、「または」の使用は、他に具体的に示されない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定されない。また、「要素」または「成分」のような用語には、他に具体的に示されない限り、１単位の要素または成分と、複数の要素または複数の成分の両方が含まれる。
【０１３５】
本明細書中で使用された見出しのセクションは、構成の目的のためだけのものであり、いかなる方法においても記載される本発明の事項を限定するとは解釈されない。
【０１３６】
本発明の教示の中で議論される温度、濃度、時間などの前には「約」を含蓄し得ることが理解されるであろう。結果として、わずかな、実質的ではない偏差が本明細書中の本発明の教示の範囲に含まれる。例えば、「プライマー（ａ ｐｒｉｍｅｒ）」は、２つ以上のプライマーが存在する可能性があるが、必ずしもそうである必要はないことを意味する；例えば、限定ではないが、特定のプライマー種の１つ以上のコピー、ならびに、特定のプライマーのタイプの１つ以上のバージョン、例えば、限定ではないが、様々な正方向プライマーの多重度。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定するようには意図されない。上記一般的記載と詳細な記載はいずれも例であり、説明に過ぎず、本発明を限定するものではないことが理解される。
【０１３７】
引用による組み込み
本明細書中で引用された全ての参考文献（特許、特許出願、論文、テキストなどを含む）とその中で引用されている参考文献は、それらが前々からそうではなかったという程度に、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。組み込まれた文献と同様の材料のうちの１つ以上（定義される用語、用語の使用、記載される技術などを含むがこれらに限定されない）が本出願とは異なるか、または矛盾する場合には、本出願が支配する。
【０１３８】
等価物
上記記載と実施例は本発明の特定の好ましい実施形態詳細に説明しており、本発明によって意図される最良の態様を記載している。しかし、どんなに詳細であろうとも、上記は文章であり、本発明は多くの方法で実施することができ、本発明が添付の特許請求の範囲とその任意の等価物にしたがって解釈されなければならないことが理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
優先権
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００７年８月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／９６８，８３４号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、核酸配列決定のための方法と組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
導入
核酸を配列決定するための多種多様な技術が存在している。しかし、多くの場合、これらの様々な技術には、得られる配列の不確定性につながり得るという問題点がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
本発明の技術は、特に、より正確な核酸配列決定および／またはより大きな読み取り長などによって、さらに効率的な配列決定を手助けする方法と装置を提供する。
【０００５】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および核酸配列決定試薬の第２のセットを使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程。ここで、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる。
【０００６】
本発明の教示の１つの方法の様々な実施形態には以下が含まれる：目的のポリヌクレオチドに由来するクローンライブラリーについて第１の核酸配列決定化学反応を行う工程；核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および核酸配列決定試薬の第２のセットを使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程が含まれる。ここで、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる。
【０００７】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：第１の核酸配列決定化学反応を使用して目的のポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および第２の核酸配列決定化学反応を使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程。いくつかの実施形態では、第１の領域の配列決定と第２の領域の配列決定の全てまたは一部を同時に行うことができる。
【０００８】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程であって、それにより、第１の核酸配列が生成される工程；核酸配列決定試薬の第２のセットを使用してポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程であって、ここで、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なり、それにより、第２の核酸配列が生成され、ここで、第１の領域と第２の領域は、共通している少なくとも１ヌクレオチド塩基位置を有する、工程；および第１の核酸配列と第２の核酸を比較する工程。いくつかの実施形態では、第１の領域の配列決定と第２の領域の配列決定の全てまたは一部を同時に行うことができる。
【０００９】
本発明の教示の方法の様々な実施形態には以下が含まれる：分析用ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチド断片に断片化する工程；ポリヌクレオチド断片の少なくとも一部をクローン増幅させ、それによって断片クローンのセットが生成される、工程；断片クローンのセットの第１の部分を、核酸配列決定試薬の第１のセットを用いて配列決定し、それによって、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される、工程；第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；断片クローンのセットの第２の部分を、核酸配列決定試薬の第２のセットを用いて配列決定し、それによって、第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される、工程；第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリを第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリと比較する工程；および他の塩基配列アセンブリ中の塩基の塩基識別（ｂａｓｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）と比較した、対応しているヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、第１の塩基配列アセンブリと第２の塩基配列アセンブリとの間での少なくとも１つの塩基識別を選択する工程。
【００１０】
様々な実施形態において、第１の領域と第２の領域は重複しており、一方、他の実施形態では、重複していない。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域はポリヌクレオチドの異なる鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域は少なくとも５ヌクレオチド重複している。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域は少なくとも１０ヌクレオチド重複している。いくつかの実施形態では、第１の領域は第２の領域に隣接し得る。
【００１１】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは固体支持体上に固定される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズまたは他の粒子であり得る。様々な実施形態において、増幅させられたクローンはアレイ上に存在する。
【００１２】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは単一分子であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは増幅させられたクローンであり得る。いくつかの実施形態では、増幅させられたクローンはＰＣＲによって生成される。いくつかの実施形態では、ＰＣＲはエマルジョンＰＣＲである。いくつかの実施形態では、増幅は半固体支持体の中で行われる。いくつかの実施形態では、増幅は固体支持体上で行われる。
【００１３】
様々な実施形態において、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、ピロシーケンス（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応である。
【００１４】
様々な実施形態において、クローンライブラリーには目的の生物のゲノムが含まれる。いくつかの実施形態では、目的の生物は原核生物である。いくつかの実施形態では、目的の生物は真核生物である。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーには、目的のゲノムに由来するアンプリコン由来のクローンが含まれる。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーは核酸ライブラリーに由来する。
【００１５】
本発明の教示のなおさらなる態様は、ポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムに関する。
【００１６】
様々な実施形態において、目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムには、以下が含まれる：分析用ポリヌクレオチドのアレイ；上記アレイを含み、少なくとも１つの入力ポートを有しているフローセル；核酸配列決定試薬の第１のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートとつながれている）；核酸配列決定試薬の第２のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートと流体連結されている）；核酸配列決定試薬の第１のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第１の光学シグナルコレクター；および核酸配列決定試薬の第２のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第２の光学シグナルコレクター。いくつかの実施形態では、配列決定試薬の２つ以上のセットによる反応の画像化を同時に行うことができる。
【００１７】
様々な実施形態において、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは同じ構成要素である。いくつかの実施形態では、光学シグナルコレクターのうちの少なくとも一方にＣＣＤが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のシステムにはさらに、ポリヌクレオチドのアレイ上に存在する蛍光シグナルの励起を誘導するように構成されたレーザーが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ポリヌクレオチドの配列を分析するための１つの実施形態を示しているフローチャートを示す。２種類の配列決定化学反応が、配列を決定するために使用される。
【図２】図２は、ポリヌクレオチド配列を分析するための別の実施形態を示しているフローチャートを示す。核酸配列決定試薬の２つのセットが、配列を決定するために使用される。
【図３】図３は、ポリヌクレオチド配列を分析するための別の実施形態を示しているフローチャートを示す。連結反応による配列決定とピロシーケンスが、配列を決定するために使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
当業者はこれらの図面が説明の目的だけのために提供されることを理解するであろう。これらの図面は、本発明の教示の範囲を限定するようには決して意図されない。
【００２０】
多くの高度に多重化された平行配列決定技術には、膨大な量の作業が、配列決定自体ではなくむしろ、配列決定用の試料の調製工程において発生する。本明細書中に記載されるような様々な技術によるポリヌクレオチドの配列決定により、実質的な効果を得ることができる。配列決定反応を並行して行うことができる。このように、１つの技術に特異的であるエラーを、最少量の付加的な作業（同じ量の不可欠な調製作業が、使用される実際の配列決定技術の数とは無関係に行われる）によって排除または減らすことができる。分析用ポリヌクレオチドの様々な領域が、様々な配列決定技術によって利用され得る。
【００２１】
一般的には、本発明の教示により、特に、より正確な核酸配列決定および／またはより大きな読み取り長などによって、さらに効率的な配列決定を手助けする方法と装置が提供される。様々な実施形態において、本発明の教示により、核酸の高度に多重化された平行配列決定のための方法と装置が提供される。
【００２２】
様々な実施形態において、配列は、少なくとも２種類の配列決定化学反応によって分析され得る。この多重配列決定化学反応の使用により、個々のクローンの配列の正確性、および複数のクローンから導かれた最終的なコンパイルされた配列の正確性を高めることができる。異なる配列決定化学反応は、異なるエラーを生じる傾向がある。２種類の化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置に最終的な塩基を示す際に考慮され得る。様々な化学反応での塩基のバリエーションと配列の偏りもまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮され得る。様々な実施形態において、３種類以上の配列決定化学反応が使用される。いくつかの実施形態では、様々な化学反応を使用した配列決定工程の全てまたは一部を同時に行うことができる。
【００２３】
本発明の教示により、さらに、特に、配列決定反応を検出するためのシステム、方法、キット、および装置が提供される。
【００２４】
定義
他に明記されない限り、本明細書中に記載される本発明に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、状況によって必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。一般的には、本明細書中に記載される細胞と組織の培養、分子生物学、およびタンパク質、ならびにオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、ならびに技術は、当該分野で周知であり、一般的に使用されているものである。例えば、化学合成、化学分析、組み換え核酸、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養、ならびに形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）についての標準的な技術が使用される。酵素反応と精製技術は、製造者の使用説明書に従って行われるか、または当該分野で一般的に行われているように行われるか、または本明細書中に記載されるように行われる。先行技術と手法は、一般的に、当技術分野で周知の従来法に従い、本明細書をとおして引用され考察される、様々な一般的であり、より具体的な参考文献に記載されているように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０００）を参照のこと。組み合わせて利用される命名法、ならびに本明細書中に記載される実験手法および技術は、当該分野で周知であり、そして一般的に使用されているものである。
【００２５】
本明細書中に提供される実施形態にしたがって利用される場合は、以下の用語は、他に明記されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００２６】
用語「核酸配列決定化学反応」は、本明細書中で使用される場合、配列決定結果を得るためにポリヌクレオチドを配列決定するために使用される化学反応のタイプとそれに伴う方法をいう。多種多様な配列決定化学反応が当該分野で公知である。本明細書中で開示される様々な実施形態に有用な様々なタイプの配列決定化学反応の例としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、鎖終結法、色素標識ターミネーター法、可逆的ターミネーターを使用する配列決定、リン酸塩の検出による核酸の配列決定（「ピロリン酸シーケンス」または「ピロシーケンス」）、および連結による配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。そのような配列決定化学反応および対応する配列決定試薬は、例えば、米国特許第７，０５７，０２６号、同第５，７６３，５９４号、同第５，８０８，０４５号、同第６，２３２，４６５号、同第５，９９０，３００号、同第５，８７２，２４４号、同第６，６１３，５２３号、同第６，６６４，０７９号、同第５，３０２，５０９号、同第６，２５５，４７５号、同第６，３０９，８３６号、同第６，６１３，５１３号、同第６，８４１，１２８号、同第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号、同第５，７５０，３４１号、同第６，３０６，５９７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６７８Ａ１、同ＷＯ９３／０５１８３Ａ１、同ＷＯ６０７４３５１Ａ２、同ＷＯ０３０５４１４２Ａ２、同ＷＯ０３００４６９０Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０６０８４１３２Ａ２、および同ＷＯ０６０７３５０４Ａ２（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００２７】
用語「配列決定試薬」は、本明細書中で使用される場合、核酸の配列決定に使用される試薬をいう。配列決定化学反応のタイプに応じて、様々な配列決定試薬を使用することができる。「配列決定試薬」としては、適切なプライマー、ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ、核酸重合剤（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）、ＲＮＡ重合剤（例えば、Ｑβレプリカーゼ）、検出標識、切断可能なリンカー、マグネシウム、連結試薬、切断試薬、ユニバーサル塩基などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、４種類のジデオキシヌクレオチドが、（例えば、自動核酸配列分析のための）様々な蛍光色素で標識される。当業者は、適切な試薬を選択することができる。例示的な配列決定化学反応のタイプは上に列挙されており、いくつかは以下にさらに詳細に記載される。
【００２８】
表現「異なるポリヌクレオチド鎖」は、本明細書中で使用される場合、２本鎖であるポリヌクレオチドの同じ鎖には由来しない核酸鎖をいう。異なる鎖は相補的である場合も、また相補的ではない場合もあり、また、重複している相補性領域を共有している場合もある。重複しているヌクレオチドの数は、１ヌクレオチドから領域全体の完全な重複まで様々であり得る。いくつかの実施形態では、異なるポリヌクレオチド鎖は、少なくとも５ヌクレオチドの重複している相補性領域を共有する。他の実施形態では、異なるポリヌクレオチド鎖は、少なくとも１０ヌクレオチドの重複している相補性領域を共有する。
【００２９】
表現「ポリヌクレオチドの第１の領域」は、本明細書中で使用される場合、それについての配列情報が望まれるポリヌクレオチドの第１のセグメントをいう。第１の領域は、任意の長さまたは配列の領域であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域には、より大きなポリヌクレオチドの断片が含まれ得る。
【００３０】
表現「ポリヌクレオチドの第２の領域」は、本明細書中で使用される場合、それについての配列情報が望まれるポリヌクレオチドのセグメントをいう。ポリヌクレオチドの第２の領域は、任意の長さまたは配列の領域であり得る。ポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの第１の領域と重複している場合があり、また重複していない場合もある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、少なくとも５ヌクレオチド重複している。他の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、少なくとも１０ヌクレオチド重複している。ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は異なるポリヌクレオチド鎖上に存在する場合があり、また、同じポリヌクレオチド鎖上に存在する場合もある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域には、ポリヌクレオチドの断片が含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの第１の領域とは異なるポリヌクレオチド断片上にある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの第１の領域と同じポリヌクレオチド断片上にある。様々な実施形態において、第３の領域またはさらなる領域が検討される。
【００３１】
表現「核酸配列決定試薬の第１のセット」は、本明細書中で使用される場合、核酸配列決定試薬の１つ以上の他のセットを使用して得られた配列決定結果と比較される配列決定結果をもたらす、配列決定に使用される試薬の１つのセットをいう。
【００３２】
表現「核酸配列決定試薬の第２のセット」は、本明細書中で使用される場合、核酸配列決定試薬の１つ以上の他のセットの配列決定結果と比較される配列決定結果をもたらす、配列決定に使用される試薬の１つのセットをいう。配列決定試薬は、配列決定法のタイプに応じて様々であり得る。核酸配列決定試薬の第２のセットは、核酸配列決定試薬の第１のセットと同じである場合も、また異なる場合もある。様々な実施形態において、第３のセットまたはさらなるセットが使用され得る。
【００３３】
表現「核酸配列決定試薬の第１のセットは核酸の第２のセットとは異なる」は、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは第２のセットのいずれかに、他方のセットの中には存在しない少なくとも１種類の成分が含まれることを意味する。核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、異なるタイプの配列決定化学反応を行うために、ただし、少なくとも１種類の異なる試薬を用いて、使用され得る。あるいは、核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じタイプの配列決定化学反応を行うために、ただし、少なくとも１種類の異なる試薬を用いて使用され得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、ヌクレオチド単量体（核酸）の一本鎖および二本鎖のポリマーを意味する。これには、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合連結（例えば、３’−５’および２’−５’）、逆結合（例えば、３’−３’および５’−５’分岐構造）によって連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（核酸）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、またはアナログ核酸が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、関連する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）を有する。ポリヌクレオチドは、全てがデオキシリボヌクレオチドからなる場合、全てがリボヌクレオチドからなる場合、また、それらのキメラ混合物からなる場合もある。ポリヌクレオチドは、ヌクレオ塩基と糖アナログからなり得る。ポリヌクレオチドは、通常、これらが当該分野でオリゴヌクレオチドとより一般的に頻繁に呼ばれる場合の、少ない数の単量体単位（例えば、５〜４０）から、数千個の単量体ヌクレオチド単位までの大きさの範囲である。他に明記されない限り、ポリヌクレオチド配列が示されているか否かにかかわらず、ヌクレオチドは、左から右に向かって５’から３’の順序であり、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」がチミジンを示すことが理解されるであろう。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸配列」または「ヌクレオ塩基配列」は、ヌクレオ塩基含有サブユニットを含むポリマーの任意の区分である。適切なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的な例として、オリゴヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸、ならびにそれらのアナログおよびキメラが挙げられる。
【００３６】
用語「固定された」は当該分野で理解されており、核酸に関して使用される場合、表面の使用が意図される環境に存在している、その種に対して働く引力よりも強い引力で表面に対して核酸が付着させられている状態をいう。
【００３７】
用語「生物」は、複製させることができ、配列決定の目的である核酸を含む、任意の生存または生存していないものを示すために本明細書中で使用される。これには、プラスミド、ウイルス、原核生物、古細菌、および真核生物の細胞、細胞株、真菌、原生動物、植物、動物などが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
表現「閉鎖複合体単一分子配列決定」は、本明細書中で使用される場合、固定されたプライマー／鋳型上に１つのヌクレオチドを捕捉するための、ＤＮＡポリメラーゼの通常の触媒サイクルを含むピロシーケンスをベースとする配列決定化学反応をいう。閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応および対応する配列決定試薬は、例えば、米国特許第７，２６４，９３４号に記載されている。
【００３９】
表現「ナノサイズ流体配列決定」は、本明細書中で使用される場合、個々の塩基を特定するであろう、個々のＤＮＡ分子からの電流を測定するためのナノ細孔を用いる配列決定化学反応をいう。
【００４０】
例示的な実施形態
図１は、様々な方法または手法を行うために使用できる工程を示しているフローチャートを示す。以下により十分に記載されるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列は、第１の配列決定化学反応１０を使用して決定される。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域の配列は、第２の配列決定化学反応２０を使用して決定される。２つの配列が、その後、比較される（３０）。それにより、２つの配列の間でのあらゆる差異が同定され、したがって、さらに正確な配列決定結果が得られる。
【００４１】
図２は、いくつかの実施形態で使用できる工程を示しているフローチャートを示す。第１の核酸配列は、核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域について決定され得る（４０）。第２の核酸配列は、核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して、ポリヌクレオチドの第２の領域について決定され得る（５０）。示される実施形態では、核酸配列決定試薬の第２のセットは、核酸配列決定試薬の第１のセットとは異なる。第１の領域と第２の領域は、共通している少なくとも１つのヌクレオチド塩基位置を有し得る。その後、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に対して比較され得る（６０）。さらなる配列を、核酸配列決定試薬のさらなるセットを使用して決定し、第１の核酸配列および第２の核酸配列に対して比較することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域または第２の領域中にある塩基のうちの少なくとも１つについての少なくとも１つのエラー値が、公知の方法を使用して生じ得る。いくつかの実施形態では、複数のエラー値が、例えば、２００２年１０月２３日に提出された米国特許出願公開番号２００４００５３２４６（その全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に開示されている方法にしたがって計算される。エラー値は、複数の核酸配列を比較した際に不一致が存在する場合、塩基識別を選択するための基準として使用され得る。いくつかの実施形態では、塩基識別は、他の核酸配列中の塩基の塩基識別と比較された、対応する核酸配列中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間で選択される。いくつかの実施形態では、１つの配列決定化学反応に伴う公知の問題に基づくエラーを含む可能性がある領域が同定される。この領域の配列は、同じエラーの問題がない配列決定化学反応を使用して得られた配列に対して比較される。例えば、１つの領域（例えば、ＧＣ含量が高い場所）の配列決定についてのエラー率が、第２の配列決定化学反応に対して第１の配列決定化学反応について高いことが公知である場合には、塩基識別を、第２の配列決定化学反応を使用して決定された配列から選択することができる。
【００４３】
ポリヌクレオチドの配列は、配列決定化学反応を使用して決定することができる。多種多様な配列決定化学反応が当該分野で公知である。上記で議論されたように、本明細書中に開示される様々な実施形態に有用な様々なタイプの配列決定化学反応の例としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、鎖ターミネーター法、色素ターミネーター法、可逆的ターミネーターを使用する配列決定、リン酸塩の検出による核酸の配列決定（「ピロリン酸シーケンス」または「ピロシーケンス」）、連結による配列決定、閉鎖複合体単一分子配列決定、ナノサイズ流体配列決定、および力分光法プラットフォーム配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。そのような配列決定化学反応および対応する配列決定試薬は、例えば、米国特許第７，０５７，０２６号、同第５，７６３，５９４号、同第５，８０８，０４５号、同第６，２３２，４６５号、同第５，９９０，３００号、同第５，８７２，２４４号、同第６，６１３，５２３号、同第６，６６４，０７９号、同第５，３０２，５０９号、同第６，２５５，４７５号、同第６，３０９，８３６号、同第６，６１３，５１３号、同第６，８４１，１２８号、同第６，２１０，８９１号、同第６，２５８，５６８号、同第５，７５０，３４１号、同第６，３０６，５９７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６７８Ａ１、同ＷＯ９３／０５１８３Ａ１、同ＷＯ６０７４３５１Ａ２、同ＷＯ０３０５４１４２Ａ２、同ＷＯ０３００４６９０Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０７００２２０４Ａ２、同ＷＯ０６０８４１３２Ａ２、および同ＷＯ０６０７３５０４Ａ２（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００４４】
可逆的ターミネーターを使用する核酸の配列決定に有用な様々な可逆的ターミネーターが、当該分野で公知である。可逆的ターミネーター法は、１回に１つのヌクレオチドを付加し、その位置に対応する標識を検出し、その後、別のヌクレオチドを重合させるためにブロッキング基を除去する、標識されたターミネーターの可逆的なバージョンを使用する。可逆的ターミネーターのブロッキング基は、３’位置または５’位置のいずれかに存在し得る。あるいは、可逆的ターミネーターは、ヌクレオチド塩基上または２’位置に取り除くことができるブロッキング基を有し得、これは、可逆的ターミネーターが取り込まれた後、ブロッキング基が取り除かれるまで、ポリヌクレオチドの伸張を妨げるように作用する。可逆的ターミネーターを使用する配列決定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第７，０５７，０２６号および同第６，６６４，０７９号に記載されているような、切断可能なリンカー基を介して検出可能な標識に連結させられたヌクレオシドおよびヌクレオチドを使用する配列決定；米国特許第５，７６３，５９４号、同第５，８０８，０４５号、同第５，９９０，３００号、同第６，２３２，４６５号、および同第５，８７２，２４４号に記載されているような、保護されたヌクレオチドを使用する配列決定；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０６６７８および同ＷＯ２００６／０７４３５１に記載されているような、可逆的にブロックされたヌクレオチドを使用する配列決定；ＰＣＴ公開番号９３／０５１８３に開示されているような、塩基付加配列決定スキームによる配列決定；米国特許第６，６１３，５１３号に記載されているような、取り込みによる配列決定；米国特許第６，３０９，８３６に記載されているような、ヒドロカルビルジチオメチル修飾化合物を使用する配列決定；米国特許第６，２５５，４７５号に記載されているような、鎖ターミネーターを使用する配列決定；ならびに、米国特許第５，３０２，５０９号に記載されているような、蛍光標識された３’−ブロックヌクレオチド三リン酸を使用する配列決定。
【００４５】
ピロシーケンスは、相補的な配列が鋳型としての未知の配列（決定される配列）を使用して重合させられる技術である。毎回、１つの新しいヌクレオチドが、成長しつつある相補的な鎖に重合させられ、ピロリン酸（ＰＰｉ）分子が放出される。その後、このピロリン酸の放出が検出される。４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）またはそれらのアナログ（例えば、α−チオ−ｄＡＴＰ）の反復的付加には、ピロリン酸の放出時間と放出程度のモニタリングが伴い、それにより、成長しつつある相補的な鎖に取り込まれたヌクレオチドが同定される。ピロシーケンスの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣＴ公開番号０３／０５４１４２に開示されているような、スルフリラーゼ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を使用する配列決定；米国特許第６，８４１，１２８号に記載されているようなシステムを使用する配列決定；米国特許第６，２１０，８９１号に記載されているような、ピロリン酸の放出の酵素的検出を使用する配列決定；米国特許第６，２５８，５６８号に記載されているような、ピロリン酸の放出による塩基の取り込みと、それと同時の酵素によるヌクレオチドの分解を使用する配列決定；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０３／００４６９０に記載されているような、実質的な二次元アレイの中で平行して行われる高密度に詰め込まれた無関係な化学反応を使用する配列決定；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／００２２０４に記載されているような、３’−Ｏ−修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を使用する配列決定。
【００４６】
段階的な連結と切断による配列決定は、標的ポリヌクレオチドの末端への連結と、そこでのプローブの切断のサイクルの繰り返しに基づく。例えば、個々のそのようなサイクルでは、１つ以上の末端ヌクレオチドが同定され、連結と切断のさらなるサイクルを行うことができるように、１つ以上のヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの末端から取り除かれる。個々のサイクルでは、標的配列は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されるまで、１個以上のヌクレオチドずつ短くなる。連結による配列決定法の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８４１３２に記載されているような、オリゴヌクレオチドの連結と切断のサイクルによる配列決定；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／０１０１４５に記載されているような、フローサイトメトリーによって蛍光標識された粒子をカウントすることによる配列決定；米国特許第６，３０６，５９７号に記載されているような、一本鎖の鋳型に沿った二本鎖の伸張サイクルの繰り返しに基づく配列決定；米国特許第５，４０３，７０８号に記載されているような、鋳型核酸にハイブリダイズした連結産物を生成させることによる配列決定；ならびに、米国特許第５，５５２，２７８号に記載されているような、段階的な連結と切断による配列決定。
【００４７】
様々な実施形態において、配列は、少なくとも２種類の配列決定化学反応によって分析され得る。様々な実施形態において、３種類以上の異なる配列決定化学反応が使用される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列は、第１の配列決定化学反応を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、第１の領域と第２の領域は、同じ鎖または相補的な鎖の異なる領域であり、これらは重複していない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域の配列は、第２の配列決定化学反応を使用して決定され得る。第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は同じであってよく、また、これらは異なっていてもよい。第１の領域と第２の領域は同じであってよく、また、これらは異なっていてもよい。他の実施形態では、第３の配列決定化学反応が、ポリヌクレオチドの第３の領域の配列を決定するために使用される。第３の領域は、第１の領域および／または第２の領域と同じであってよく、また、これは異なっていてもよい。第３の配列決定化学反応は、第１の配列決定化学反応および／または第２の配列決定化学反応と同じであってよく、また、これは異なっていてもよい。第１の領域、第２の領域、およびさらなる領域の配列決定は、いくつかの実施形態では同時に行うことができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、ピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、ナノサイズ流体配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応または第２の配列決定化学反応は、力分光法プラットフォーム配列決定法であり得る。
【００５０】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、ピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、ナノサイズ流体配列決定化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、力分光法プラットフォーム配列決定法であり得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は連結化学反応による配列決定であり得、第２の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得、第２の配列決定化学反応は、連結化学反応による配列決定であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得、第２の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得、第２の配列決定化学反応は可逆的ターミネーターの化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応は連結化学反応による配列決定であり得、第２の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得る。いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応はピロシーケンス化学反応であり得、第２の配列決定化学反応は連結化学反応による配列決定であり得る。
【００５２】
本明細書中に開示される様々な実施形態において、配列決定は、アレイ形式で行われ得る。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチド断片について、第１の配列決定化学反応が行われ得る。続いて、アレイ上のポリヌクレオチド断片について、第２の配列決定化学反応が行われ得る。他の実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチド断片について、第３の、またはそれ以上の配列決定化学反応が行われ得る。
【００５３】
特定のタイプの配列決定化学反応は、核酸配列決定試薬の様々な異なるセットを使用して行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の１つのセットにはアピラーゼが含まれ得る。ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の別のセットにはアピラーゼは含まれず、ポリメラーゼの基質として作用することができるが、ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用できないｄＡＴＰアナログが含まれる場合がある。
【００５４】
可逆的ターミネーターを用いる配列決定のための核酸配列決定試薬の様々なセットには、当該分野で公知の多種多様な可逆的ターミネーターが含まれ得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、適切なプライマー、核酸ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ、および核酸重合剤（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）が含まれ得る。他の実施形態では、段階的な連結と切断による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ＲＮＡ重合剤（例えば、Ｑβレプリカーゼ）、検出標識、切断可能なリンカー、マグネシウム、連結試薬、切断試薬、ユニバーサル塩基が含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、適切なプライマー、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）、およびＡｇＮＯ３が含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、４倍縮重塩基を持つオクタヌクレオチドプローブとＤＮＡリガーゼが含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第５，７５０，３４１号に記載されているもの）が含まれ得る。他の実施形態では、連結による配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０６／０８４１３２に記載されているような、ＳＯＬｉＤ法のための任意の試薬が含まれ得る。他の実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ＡＴＰスルフリラーゼ、アピラーゼ、ルシフェリンおよびルシフェラーゼが含まれ得る。他の実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬のセットには、例えば、標的位置がプライマーの３’末端にすぐ隣接するように試料核酸にハイブリダイズする特異的プライマー、ポリメラーゼ、ピロリン酸の放出を同定するための酵素検出手段、ポリメラーゼの基質として作用することができるが、ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用できないｄＡＰＴアナログを含むデオキシヌクレオチド、そして状況に応じて、ジデオキシヌクレオチドが含まれ得る。他の実施形態では、ピロシーケンスのための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、鋳型核酸、プライマー、修飾されたＴ７核酸ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、およびアピラーゼが含まれ得る。他の実施形態では、可逆的ターミネーターを使用する配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、切断可能なリンカー基を介して検出可能な標識に連結させられたヌクレオシドおよびヌクレオチドが含まれ得る。他の実施形態では、可逆的ターミネーターを使用する配列決定のための核酸配列決定試薬の１つのセットには、例えば、ヒドロカルビルジチオメチル修飾化合物が含まれ得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列は、核酸配列決定試薬の第１のセットを使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第２の領域の配列は、核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットが、核酸配列決定試薬の第２のセットと同じタイプの配列決定化学反応を使用するために使用される。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なり；核酸配列決定試薬の第１のセットが、核酸配列決定試薬の第２のセットと同じタイプの配列決定化学反応を行うために使用される。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットが、核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なるタイプの配列決定化学反応を行うために使用される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ナノサイズ流体配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、力分光法プラットフォーム配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は重複していてよい。ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、またはそれ以上重複していてよい。重複している領域は同じ鎖の上に存在する場合があり、また、相補鎖から決定される場合もある。ここで、異なる配列決定化学反応が異なる鎖について行われる。重複している領域中の核酸塩基配列の判定は、重複している領域の中でより高い正確性を得るために互いに比較することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は完全に重複していてよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は重複していない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域と第２の領域は互いに隣接し得る。例えば、第１の領域は１〜１０塩基であり得、第２の領域は１１〜２０塩基であり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、異なるポリヌクレオチド鎖の上に存在し得る。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、異なるポリヌクレオチド鎖の上に存在し得、相補的であり得る。他の実施形態では、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの同じ鎖の上に存在し得る。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドの第１の領域とポリヌクレオチドの第２の領域は、ポリヌクレオチドの同じ鎖の上に存在し得、そして重複し得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じポリヌクレオチド断片を配列決定または再配列決定するために使用され得る。他の実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じクローンの異なる領域を配列決定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、第１の化学反応と第２の化学反応は、同じポリヌクレオチド鎖または相補的な鎖の、異なる重複していない領域について行われ得る。他の実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じクローンの部分的に重複している領域を配列決定するために使用され得る。例えば、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、同じ鎖について異なる方向から配列決定するために使用され得る。あるいは、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、相補的な鎖について異なる方向から配列決定するために使用され得る。他の実施形態では、第１の配列決定化学反応と第２の配列決定化学反応は、読み取り長を伸張させるために同じ鎖に沿って連続して行われ得る。例えば、ポリヌクレオチド鎖は、連結による配列決定によって最初に、続いて、最終的な連結産物を伸張させるためにピロシーケンスによって、配列決定され得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチド鎖は、連結による配列決定によって最初に、続いて、最終的な連結産物を伸張させるために可逆的ターミネーターの化学反応によって配列決定され得る。
【００６３】
配列決定用のポリヌクレオチドは、高度に多重化された平行配列決定の多数の従来法での配列分析のための試料と、原則として同じ様式で調製することができる。そのような方法により、使用される配列決定化学反応および検出システムのための十分な多量の標的ＤＮＡが提供される、単一ＤＮＡ分子のクローン増幅が生じる。クローン増幅産物は、固体支持体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、複数のクローンが１つの固体支持体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、それぞれが個々のクローンを含む複数の固体支持体が、複数のクローンを分けて維持するために第２の固体支持体上に固定され得る。固体支持体上でのエマルジョンＰＣＲは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／１０３０１１Ａ２、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０１０１４５Ａ２、およびＤｉｅｈｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第３巻、Ｎｏ：７、ｐｐ５５１−５５９（２００６）に記載されている。単一分子から個々のポロニー（またはコロニー）を形成させるためのクローン増幅は、特に、米国特許第６，００１，５６８号に記載されている。ＰＣＲを使用して固体支持体上にクローンを形成させるためのクローン増幅もまた、特に、米国特許第５，６４１，６５８号、同第６０６０２８８号、同第６０９０５９２号、およびＰＣＴ出願ＷＯ０７／０６０４５６Ａ１に見出せる。いくつかの実施形態では、配列決定されるポリヌクレオチドは単一分子であり得る。ポリヌクレオチドは、多数のヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１ヌクレオチドから約２０，０００ヌクレオチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチドから約２，０００ヌクレオチドから構成され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１００ヌクレオチドから５００ヌクレオチドから構成され得る。
【００６４】
様々な実施形態において、配列決定用のポリヌクレオチドは断片化され得る。ポリヌクレオチドの断片化は、当該分野で公知の多数の様々な方法のうちのいずれかによって行われ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡｓｅＩのようなヌクレアーゼで消化され得る。他の実施形態では、核酸は、例えば、超音波処理によって、または小さい孔を有しているチューブを通過させることによって、無作為に剪断され得る。核酸を１種類以上の制限酵素で部分的に消化することができることもまた意図され、その結果、特定の重なり部分が統計的に保たれ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のポリヌクレオチド断片になるように断片化され得る。配列決定されるポリヌクレオチドには、１つ以上のユニバーサルな感作部位、または公知であるかもしくは予め決定された配列が含まれ得る。ユニバーサルな感作部位は、例えば、連結、増幅プライマー、およびクローニングベクターを含む様々な方法で導入することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドアダプターを、ポリヌクレオチド断片の一方の末端または両端に連結させることができる。オリゴヌクレオチドアダプターは、ポリヌクレオチド断片の増幅に有用であり得る。例えば、連結されたアダプターの配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく増幅のための結合部位となり得る。
【００６６】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチド断片の少なくとも一部のクローン増幅により、断片クローンのセットが生成される。ポリヌクレオチドは、例えば、エマルジョンＰＣＲおよび架橋ＰＣＲのようなＰＣＲ、またはポロニー形成のような技術によってクローン増幅させることができる。これらは例えば、米国特許第５，６１６，４７８号、同第５，９５８，６９８号、同第６，００１，５６８号、同第５，６４１，６５８号、同第６，０６０，２８８号、同第６，０９０，５９２号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０１０１４５Ａ２、同ＷＯ０５０７３４１０Ａ２、同ＷＯ０４０６９８４９Ａ２、同ＷＯ０５０８２０９８Ａ２、同ＷＯ２００７／０６０４５６、同ＷＯ９８４４１５１Ａ１、および同ＷＯ００１８９５７Ａ１に記載されている。これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。様々な実施形態において、増幅は固相増幅であり得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、エマルジョンＰＣＲを、ポリヌクレオチドを増幅させるために使用することができる。エマルジョンを形成させるための方法は当該分野で公知である。例えば、エマルジョンは、水相を油相と混合することによって形成させることができる。いくつかの実施形態では、増幅は、例えば、バルクの油相の中にＰＣＲ反応混合物の多数の液滴を含む、油中水を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ法は、２工程の熱サイクルからなり得る。第１の工程は、油中水エマルジョンを使用して行うことができる。この工程の間に、鋳型ＤＮＡを、油中水エマルジョン中の液滴の限られた容積の中で増幅させることができる。油中水エマルジョンは、その後、崩壊させられ、第２のＰＣＲ工程が行われ得る。
【００６８】
様々な実施形態において、架橋ＰＣＲを、ポリヌクレオチドを増幅させるために使用することができる。架橋ＰＣＲは、特に、米国特許第５，６４１，６５２号およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ／０８００２５０２Ａ２に記載されている。架橋ＰＣＲは、クローン増幅を行うために使用することができる。架橋増幅は、固相に結合させられたプライマーを、溶液相の標的核酸配列の伸張および増幅のために使用する技術である。アニーリング工程の間に、１つの結合したプライマーによって伸張した産物は、他の結合したプライマーと架橋を形成する。全ての増幅産物が表面に共有結合されると、これらを、電気泳動を行わずに検出し、定量することができる。例えば、５’−アミンを持つプライマーは、例えば、シリカ、ポリメチルメタクリレート、またはポリスチレンビーズ支持体に共有結合させることができ、標準的なＰＣＲ反応条件下で溶液相プライマーの代わりに使用することができる。増幅反応は、支持体に結合した形態への３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みによってモニターすることができる。
【００６９】
様々な実施形態において、ポロニーの形成を、ポリヌクレオチドを増幅させるために使用することができる。ポロニー技術は、反応が、例えば、顕微鏡スライドに貼り付けられた薄いポリアクリルアミドゲルの中に固定されるＰＣＲの１つの形態である。ＰＣＲが進行するに伴い、ＰＣＲ産物は、その固定された鋳型（例えば、ポリヌクレオチド）からゲルの中に放射状に拡散し、それによって、環状のＰＣＲ産物またはポリメラーゼコロニーを生じる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、クローン、例えば、遺伝子操作技術によって、１つの生物から別の生物へと移動させられ、複製させられた遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、クローンを増幅させることができる。いくつかの実施形態では、核酸配列決定化学反応を、目的のポリヌクレオチドに由来するクローンライブラリーについて行うことができる。クローンライブラリーには、目的の生物のゲノムが含まれ得る。いくつかの実施形態では、目的の生物は原核生物である。他の実施形態では、目的の生物は真核生物である。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーには、目的のゲノムに由来するアンプリコン由来のクローンが含まれ得る。いくつかの実施形態では、クローンライブラリーは核酸ライブラリーに由来し得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片は固体支持体上に固定することができる。分析用のポリヌクレオチド断片の単一クローンを、単一の固体支持体（例えば、単一ビーズ上の単一クローン）上に存在させることができる。他の実施形態では、複数のクローンを、単一の固体支持体上に存在させることができ、これらは互いに間隔をあけることができる。様々な実施形態において、ポリヌクレオチドもしくは断片の増幅および／または配列決定は、固体支持体上で行うことができる。固体支持体は、その上でポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する、付着させる、または固定することができる任意の固相材料であり得る。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトのような、有機ポリマーから作られ得る。固体支持体はまた、無機でもあり得、例えば、ガラス、ケイ素、細孔性ガラス（ＣＰＧ）、または逆相ケイ素であり得る。固体支持体の立体構造は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、表面の形態、またはそれらの組み合わせであり得る。表面は平坦、実質的に平坦であり得るか、または平坦ではない場合もある。固体支持体は多孔性であっても、非孔性であってもよく、また、膨張性があっても、また膨張性がなくてもよい。固体支持体は、ウェル、くぼみの形態、または他の容器、器、特徴、または配置もしくは位置の中に構成することができる。
【００７２】
有用な固体支持体は当該分野で周知であり、これには、核酸を共有結合するものまたは核酸を非共有結合するもののいずれかが含まれる。水素結合を含むと一般的に理解される非共有支持体には、自然界に存在しているポリマー、および合成のポリマー材料（例えば、ニトロセルロース、誘導型ナイロン、およびフッ化ポリヒドロカーボン）が、フィルターまたは固体シートのような様々な形態で含まれる。共有結合支持体もまた有用であり、これには、化学反応基または基を有している材料（例えば、ジクロロトリアジン、ジアゾベンジルオキシメチルなど）が含まれる。これらは、ポリヌクレオチドへの結合のために活性化させることができる。
【００７３】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドの増幅は、半固体支持体の中で行われ得る。「半固体」は、本明細書中で使用される場合、固体成分と液体成分を両方持つ圧縮可能なマトリックスをいう。ここで、液体が、孔、空間、または複数の固体マトリックス成分間の他の隙間をふさいでいる。例示的な半固体マトリックスとしては、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリアミド（ナイロン）、および架橋されたアガロース、デキストラン、およびポリエチレングリコール製のマトリックスが含まれる。半固体支持体が、例えば、実質的な平面、固定支柱である半固体支持体を支える、基質とも言われる第２の支持体上に設けられる場合がある。
【００７４】
いくつかの実施形態では、増幅させたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片をアレイ上に存在させることができる。いくつかの実施形態では、アレイには、クローン以外の個々の分子が含まれ得る。本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドのアレイには、固体支持体上または器の配置の中に存在するポリヌクレオチドの配置が含まれる。アレイには、本明細書中で使用される場合は、ランダムアレイ（例えば、ビーズアレイ）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ジップコード（すなわち、配列タグ）を、アレイ上に分類するために使用することができる。特定のアレイ形式は、「チップ」または「バイオチップ」と呼ばれる（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．（２０００））。アレイには、低密度数（例えば、１個から約１２個）、中密度（例えば、約１００個以上の位置）、または高密度数（例えば、１０００個以上）のアドレス可能位置が含まれ得る。通常、アレイ形式は、製造、取り扱い、配置、積み重ね、試薬を投入、検出、および保存できるように幾何学的に一定の形状であり得る。アレイは、横列および縦列形式で構成され得、それぞれの位置の間に一定の間隔が設けられる。あるいは、位置は、均一な処理および／またはサンプリングのために束ねることができ、混合することができ、また、均一に混ぜることもできる。アレイには、高スループットの取り扱い、ロボット送達、マスキング、および／または試薬のサンプリングのために、ならびに／あるいは、レーザー照射、共焦点および／または偏向集光による散乱を含む検出手段によって個々の位置が空間的にアドレス可能であるように構成されたアドレス可能な複数の位置を含めることができる。アレイには、１つ以上の「アドレス可能配置」、例えば、「アドレス可能位置、すなわち、１つの公知のタイプの分子を含む物理的配置が含まれ得る。
【００７５】
１つ以上のタイプの基準が、画像解析またはアラインメントを補助するために分析される試料の中で散乱させられ得る。様々な実施形態において、試料にはさらに、少なくとも１つの基準が含まれる。「基準」または「マーカー」または「登録点」は、本明細書中で、アレイの連続するデータ画像の正確な比較を可能にする物理的参照特徴または特性を意味する。基準の使用は様々な理由から有用である。一般的には、配列決定方法には、経時的に撮影された、いくつかのデータ画像のうちの空間的に異なる複数の位置（特徴）に配置された目的物（すなわち、核酸）をモニタリングすることが含まれ得る。１つのフレームから次のフレームまでで起こった何らかのシフトは、物質の分析を複雑にする。アッセイ構造の中に永久的な基準を取り込ませることにより、それぞれのデータ画像を、手作業または自動のいずれかで整列させることができ、それにより画像の正確な比較、並進の制御（すなわち、Ｘ−Ｙ方向でのシフト）、および／または回転、ならびに、画像の縮小または拡大が可能となる。加えて、蛍光に基づくアッセイが使用される場合（崩壊または分析のアッセイのいずれかについて、あるいは両方について）には、任意の所定の画像において、特定の領域または特徴は、標識の特徴、および調べられる波長、または分析物もしくはＤＢＬの有無などに応じて、蛍光を発する場合も、また発しない場合もある。いくつかの実施形態では、画像解析は、試薬の２つ以上のセットによって生じた同時に検出可能なシグナルによって行われ得る。
【００７６】
アレイ上のポリヌクレオチドを配列決定するための様々なシステムは、例えば、米国特許第６，４０６，８４８号、同第６，６５４，５０５号、同第６，８０６，０５２号、および同第６，８３１，９９４号に記載されている。これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。通常、配列決定化学反応により、特異的なヌクレオチド塩基の存在の指標である検出可能なシグナルが生じる。例えば、蛍光、比色、化学発光、放射活性、または質量タグ（例えば、質量分析法とともに使用される）シグナルのような光学シグナルが生じ得る。したがって、目的のそれぞれのタイプのシグナルを検出するために複数のタイプの検出システムを有しているシステムを持つことが望ましい。
【００７７】
目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムのいくつかの実施形態の特徴が、本発明の様々な実施形態にしたがって開示される。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムには、以下が含まれ得る：少なくとも１つの入力ポートを有している分析用ポリヌクレオチドを含むフローセル；核酸配列決定試薬の第１のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートとつながれている）；核酸配列決定試薬の第２のセットを含むリザーバーセット（ここで、リザーバーセットは入力ポートと流体連結されている）；核酸配列決定試薬の第１のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成された第１の光学シグナルコレクター；および核酸配列決定試薬の第２のセットと分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成された第２の光学シグナルコレクター。いくつかの実施形態では、分析用ポリヌクレオチドは、フローセルの中に含まれるアレイ上に存在する。いくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは同じ構成要素である。他の実施形態では、これらは異なる。いくつかの実施形態では、配列決定試薬の第１のセットによって生じた光学シグナルと、配列決定試薬の第２のセットによって生じた光学シグナルは、同時に回収される。このシステムは、配列決定試薬のさらなるセットを加えるために容易に拡大することができる。
【００７８】
このシステムのいくつかの実施形態についての重要な特徴はフローセルである。様々な実施形態において、フローセルの本体には、少なくとも１つの入力ポートと、少なくとも１つのリザーバーセットが含まれ得る。様々な実施形態において、フローセルには２つのリザーバーセットが含まれ得る。入力ポートとリザーバーセットは、標準的なマイクロマシニング技術（例えば、Ｅｋｓｔｒｏｍら、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ９１／００３２７；Ｂｒｏｗｎ、米国特許第４，９１１，７８２号；Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４：１９２−１９３２（１９９２）など）によって形成され得る。フローセルは、ガラス、シリコン、ポリエチレン、ポリエステル、テフロン（登録商標）、他のプラスチックなどを含む任意の様々な材料から組み立てられ得る。様々な実施形態において、フローセルの重要な機能としては、以下が挙げられる：ｉ）一連の処理工程の間、実質的に固定された平坦なアレイまたは単層の中にポリヌクレオチドの集団を保持すること、ｉｉ）処理のそれぞれの工程の間に、核酸配列決定試薬が個々のポリヌクレオチドに接近できることを確実にすること、およびｉｉｉ）処理試薬の使用を最小限にすること。必要とされる固定の程度は、それぞれの実施形態の間で変化し得る。
【００７９】
様々な実施形態において、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは同じ構成要素である。様々な実施形態において、光学シグナルコレクターのうちの１つにはＣＣＤが含まれる。様々な実施形態において、このシステムにはさらに、ポリヌクレオチドのアレイ上に存在する蛍光シグナルの励起を誘導するように構成されたレーザーが含まれる。
【００８０】
このシステムのいくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターまたは第２の光学シグナルコレクターは、蛍光シグナルを検出する。このシステムのいくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターと第２の光学シグナルコレクターは蛍光シグナルを検出する。このシステムのいくつかの実施形態では、第１の光学シグナルコレクターまたは第２の光学シグナルコレクターが、化学発光シグナルを検出する。他の実施形態では、このシステムは、比色シグナルと化学発光シグナルの両方を検出するための検出システムを有することができる。他の実施形態では、このシステムは、蛍光シグナルと化学発光シグナルの両方を検出するための検出システムを有することができる。他の実施形態では、このシステムは、蛍光、比色シグナル、および化学発光シグナルを検出するための検出システムを有することができる。
【００８１】
核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じであっても、異なっていてもよい。核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じタイプの配列決定化学反応、または異なる配列決定化学反応を行うために使用することができる。核酸配列決定試薬の第１のセットと第２のセットは、同じタイプの配列決定化学反応を行うために使用され得、そしてこれらは、両方のセットの間で異なる少なくとも１つの試薬を有する。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、ナノサイズ流体配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットまたは核酸配列決定試薬の第２のセットは、力分光法プラットフォーム配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００８２】
このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、閉鎖複合体単一分子配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、ナノサイズ流体配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットは、力分光法プラットフォーム配列決定化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。
【００８３】
このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは、ピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは可逆的ターミネーターの化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得る。このシステムのいくつかの実施形態では、核酸配列決定試薬の第１のセットはピロシーケンス化学反応のための試薬の１つのセットであり得、核酸配列決定試薬の第２のセットは連結化学反応による配列決定のための試薬の１つのセットであり得る
いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術を、完全にまたは一部、同時に行うことができる。例えば、２種類以上の配列決定技術の少なくとも一部を同時に実行することができる。したがって、いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術のうちの１つ以上の工程を同時に行うことができる。１つ以上の工程は同じ工程であっても、対応する工程であってもよく、また、異なる工程であってもよい。他の実施形態では、２種類以上の配列決定技術を、完全に同時に行うことができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術または配列決定試薬のセットが、同時に、平行して、または時間的に重複して使用される。すなわち、いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定法方が同じ時間の間に行われる（しかし、これらは、全ての実施形態において同じタイミングで開始され、停止される必要はない）。いくつかの実施形態では、２種類の技術が同じ室内で行われる。いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術（例えば、配列決定試薬の使用）が、別のタイミングで行われ得、そして最初の出発材料（例えば、増幅された産物）は同じ増幅させられた試料に由来し得る。したがって、いくつかの実施形態では、試料の増幅後に、様々な配列決定方法でのその後の使用のために試料を分けることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、複数の配列決定プロセスのためのキットが提供される。これらのキットには、出発標的核酸配列の増幅のための試薬、出発標的核酸配列の配列決定のための試薬の第１のセット、出発標的核酸配列の配列決定のための試薬の第２のセット（ここでは、２つのセットは互いに異なる）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、増幅試薬は含まれない。加えて、説明書とエラーの同定の指針の１つのセットが含まれ得る。そのような構成要素は、例えば、印刷物であっても、また、デジタル形態であってもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態では、２種類以上の配列決定技術を使用して核酸を配列決定することができる配列決定機器が提供される。いくつかの実施形態では、この機器は、２つ以上の核酸を、２種類の配列決定技術を使用して、一部または完全に、同時に配列決定するために使用することができる。この機器には、例えば、１つ以上のリザーバーが含まれている１つ以上のフローセルと、１つ以上の光学シグナルコレクターが含まれ得る。いくつかの実施形態では、配列決定機器は、２つのさらなる配列決定化学反応によるシグナルを処理することができる。例えば、そのような機器には、例えば、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定法、鎖終結法、色素終結法、可逆的ターミネーターを使用する配列決定法、リン酸塩の検出による核酸の配列決定法、連結による配列決定法、閉鎖複合体単一分子配列決定法、ナノサイズ流体配列決定法、および力分光法プラットフォーム配列決定法（これらに限定されない）のような配列決定化学反応のうちの２種類以上のタイプによるシグナルを処理する能力が含まれ得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、複数の配列決定技術の結果を比較し、他の配列決定技術と比較して１つの配列決定技術でのエラーの可能性（すなわち、エラー率）に基づいて個々の同定された配列から最適な配列（例えば、最もエラーを起こしにくい）を選択するデータ処理能力を含む機器が提供される。いくつかの実施形態では、機器は、２種類以上の配列決定化学反応についての配列決定シグナル処理能力とデータ処理能力の両方を有し得る。複数の配列決定化学反応によるシグナルを処理するため、および／または結果を比較するためにデータを処理するための機器には、例えば、生の、または制限されていない配列決定データを受け取るための手段、少なくとも１つの処理装置、および／または標準的な配列決定データを記憶させるための記憶装置が含まれ得る。いくつかの実施態様では、機器には、ビデオディスプレーが含まれるか、または、機器がビデオディスプレーにつながれるか、あるいは別の装置（例えば、コンピューター）に通信接続させられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、複数の配列決定技術の結果を比較し、そして他の配列決定技術と比較した１つの配列決定技術におけるエラーの可能性（すなわち、エラー率）に基づいて個々の同定された配列から最適な配列（最もエラーを起こしにくい）を選択する、コンピュータープログラムが含まれる（または、別々に提供され得る）。いくつかの実施形態では、このプログラムは、配列を得、そして複数の配列を組み合わせるために使用される特異的技術についてのエラーの可能性に基づいて、得られた個々の配列についてもっとも正確な配列を選択する（または、最も正確でない配列を除外する）。この様式で、１つの完全な、精度の高い配列が、このプログラムによって提供され得る。いくつかの実施形態では、このプログラムは、本明細書中に記載される複数の方法のうちの任意のものを実行する。いくつかの実施形態では、このコンピュータープログラムは、複数の配列決定技術によるデータを処理するための機器と組み合わせて使用することができる。他の実施形態では、このコンピュータープログラムは、パーソナルコンピューターおよびミニコンピューターと一般的に呼ばれているものを含む、任意の多目的コンピューターを使用して実行され得る。
【実施例】
【００８９】
本発明の教示の複数の態様は、以下の実施例を考慮してさらに理解され得る。以下の実施例は、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００９０】
（実施例１）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９１】
配列決定用のポリヌクレオチドは、以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、以下に記載するように連結による配列決定を使用して配列決定を行い、第１の配列を決定する（図３、７０）。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について、以下に記載するようにピロシーケンスを行って、第２の配列を決定する（図３、８０）。第１の配列を第２の配列に対して比較する（図３、９０）。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９２】
（実施例２）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９３】
配列決定用ポリヌクレオチドは以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、以下に記載するように連結による配列決定を使用して配列決定を行い、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について可逆的ターミネーターを使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９４】
（実施例３）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９５】
配列決定用ポリヌクレオチドは以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、可逆的ターミネーターを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について以下に記載するようにピロシーケンスを行って第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９６】
（実施例４）
本実施例は、ヌクレオチド配列決定試薬の第１のセットとヌクレオチド配列決定試薬の第２のセットを使用するポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９７】
配列決定用ポリヌクレオチドは、以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、例えば、ポロニー増幅によってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について配列決定試薬の第１のセットを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。配列決定試薬の第１のセットには、ＲＮＡ重合剤（例えば、Ｑβレプリカーゼ）、検出標識、切断可能なリンカー、マグネシウム、連結試薬、切断試薬、およびユニバーサル塩基が含まれる。次に、ポリヌクレオチドの第２の領域について配列決定試薬の第２のセットを使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。配列決定試薬の第２のセットには、プライマー、修飾されたＴ７核酸ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ核酸ポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、およびアピラーゼが含まれる。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【００９８】
（実施例５）
本実施例は、第１の配列決定化学反応によってポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定し、第２の配列決定化学反応によってポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【００９９】
ポリヌクレオチドの第１の領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域に隣接している異なるポリヌクレオチド鎖（すなわち、相補鎖）上にある第２の領域について連結による配列決定を使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１００】
（実施例６）
本実施例は、ポリヌクレオチドの１つの鎖に沿って読むための、配列決定試薬の２つの異なるセットを使用することにより、読み取り長を伸張させるための可能な方法を説明する。
【０１０１】
本実施例では、ポリヌクレオチドの第１の領域について、連結による配列決定のための配列決定試薬の１つのセットを使用する配列決定を行う。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域と同じ鎖にあるポリヌクレオチドの第２の領域について、配列決定試薬の第１のセットとは異なる、配列決定試薬の第２のセットを使用する配列決定を行って、ポリヌクレオチドの第１の領域の配列決定による最終的な連結産物を伸張させる。
【０１０２】
（実施例７）
本実施例は、可逆的ターミネーターを用いる配列決定と連結による配列決定によって、重複しているポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０３】
ポリヌクレオチドの第１の領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域と１０ヌクレオチド重複している、ポリヌクレオチドの同じ鎖上にある第２の領域について、連結による配列決定を使用する配列決定を行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１０４】
（実施例８）
本実施例は、２種類の配列決定化学反応を使用して同じポリヌクレオチドを配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０５】
ポリヌクレオチドの１つの領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の核酸配列を得る。次に、ポリヌクレオチドの同じ領域について、連結による配列決定が行って、第２の核酸配列を得る。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１０６】
（実施例９）
本実施例は、異なる鎖の上にあり、完全に重複している２つの領域である、ポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０７】
ポリヌクレオチドの第１の領域についてピロシーケンスを使用する配列決定を行って、第１の配列を決定する。次に、ポリヌクレオチドの第１の領域と完全に重複しているポリヌクレオチドの異なる鎖上にある第２の領域（すなわち、ポリヌクレオチドの第１の領域の相補物）についてピロシーケンスを行って、第２の配列を決定する。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の塩基のバリエーションおよび配列の偏向もまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮することができる。
【０１０８】
（実施例１０）
本実施例は、核酸配列決定試薬の第１のセットと核酸配列決定試薬の第２のセットを使用した配列決定によって得られたエラー値を使用するポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１０９】
本実施例では、断片クローンの１つのセットの第１の部分を酸配列決定試薬の第１のセットを使用して配列決定する。この配列決定により、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリが得られる。第１のヌクレオチド塩基配列中の核酸配列中の塩基のうちの少なくとも一部についてのエラー値が得られる。
【０１１０】
次に、断片クローンの上記セットの第２の部分を、核酸配列決定試薬の第２のセットを用いて配列決定する。この配列決定により、第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリが得られる。第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてのエラー値が得られる。
【０１１１】
次に、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリを第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリと比較する。他の塩基配列アセンブリ中の塩基の塩基識別と比較した、対応しているヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、第１の塩基配列アセンブリと第２の塩基配列アセンブリとの間での少なくとも１つの塩基識別を選択する。例えば、第１のヌクレオチド配列アセンブリ中の塩基識別のエラー値がＸであり、第２のヌクレオチド配列中の塩基識別のエラー値が＜Ｘである場合には、その位置の塩基についての識別は、第２のヌクレオチド配列中の塩基識別として選択される。
【０１１２】
（実施例１１）
本実施例は、エマルジョンＰＣＲによるポリヌクレオチド配列の増幅のための可能な方法を説明する。他の方法と改変は当業者に明らかであろう。
【０１１３】
ＰＣＲ用のマイクロエマルジョンは、以前に記載された方法のわずかな変更によって調製することができる。ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０１０１４５、同ＷＯ０５０７３４１０、および同ＷＯ０４０６９８４９；Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．（１９９８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６，６５２−６５６；Ｇｈａｄｅｓｓｙ，Ｆ．Ｊ．、Ｏｎｇ，Ｊ．Ｌ．およびＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８，４５５２−４５５７（これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる）。油相は、鉱油（Ｓｉｇｍａ Ｍ−３５１６）中の４．５％のＳｐａｎ ８０（Ｓ６７６０、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．４０％のＴｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ Ｓ−８０７４）、および０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ｔ−９２８４）からなり得る。油相は、毎日新しく調製することができる。いくつかの実施形態では、水相は、３００μｌの全量中の、６７ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１６．６ｍＭのＮＨ４ＳＯ４、６．７ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの（３−メルカプトエタノール、１ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、１ｍＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、０．０５μＭの正方向プライマー、２５μＭの逆方向プライマー、４５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０９６６−０３４）、様々な量の鋳型核酸、および約１０８オリゴヌクレオチドが結合させられたビーズからなり得る。いくつかの実施形態では、正方向プライマーは、その配列が目的のポリヌクレオチドの３’の２０〜２２ｎｔと同一であるオリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、正方向プライマーのうちの少量は、増幅反応を最大化させるためにビオチンで修飾されない。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、油中水型マイクロエマルジョンは、２ｍｌの丸底凍結保存用バイアル（４３０６６１，Ｃｏｍｉｎｇ，Ｃｏｍｉｎｇ，ＮＹ）の中に予め入れた４００マイクロリットルの油相に対する２００マイクロリットルの水相の滴下によって調製することができる。滴下は、例えば、ＶＷＲモデル５６５磁気攪拌装置上で磁気マイクロ撹拌棒（５８９４８−３５３，ＶＷＲ，Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）により１４００ＲＰＭで混合物を攪拌しながら、１分かけて行われ得る。水相の添加後、混合物は全部で約３０分間、持続的に攪拌される。
【０１１５】
２つのエマルジョンを、磁気攪拌装置の中心に置いた棚の中に２つのチューブを置くことによって一度に作製することができる。
【０１１６】
エマルジョンを９６ウェルＰＣＲプレートのウェルにアリコートし、それぞれ約１００μｌを含める。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、以下のサイクル条件下で行われ得る：９４℃で２分間、その後に：９４℃で１５秒間、５７℃で３０秒間、そして７０℃で３０秒間を４０サイクル。いくつかの実施形態では、分析されるＰＣＲ産物は、約１８０ｂｐから２５０ｂｐまでの範囲であり得る。
【０１１７】
ＰＣＲサイクルの後、ＰＣＲプレートのウェル由来のマイクロエマルジョンをプールし、１．５ｍｌのチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４３０９０９）中への８００μｌのＮＸ緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭのＮａＣｌ）の添加によって崩壊させることができる。２０秒間のボルテックス後、ビーズを、８０００ｒｐｍ（５０００ｇ）で９０秒間のマイクロ遠心分離機での遠心分離によってペレット化することができる。最上部の油相と、３００マイクロリットルの水相を除くほぼ全てをチューブから取り出し、６００μｌのＮＸ緩衝液を添加することができる。２０秒間のボルテックスと９０秒間の遠心分離の後、最上部の油相と、３００μｌの水相を除くほぼ全てを取り出す。６００μｌのＮＸ緩衝液の添加、ボルテックス、および遠心分離をもう一度繰り返し、最上部の油部分と、３００μｌの水相を除くほぼ全てを取り出す。その後、チューブを磁石（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−Ｓ）の上に置き、上清の残りを注意しながらピペットで取り除いた。ビーズを、遠心分離ではなく磁力による分離を使用して１×ＰＣＲ緩衝液でさらに３回洗浄し、最後に１００μｌの１×ＰＣＲ緩衝液中に再度懸濁した。
【０１１８】
（実施例１２）
本実施例は、ポロニー増幅によるポリヌクレオチドの増幅のための可能な方法を説明する。ポロニー増幅は、例えば、米国特許第５，６１６，４７８号、同第５，９５８，６９８号、および同第６，００１，５６８号；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０５０８２０９８Ａ２にさらに記載されており、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１１９】
ポリヌクレオチドの増幅は、培地を染み込ませた、多孔性、繊維性、網目状、コイル状、毛細管状、薄板状、または折り畳まれた構造を有しており、核酸の指数増幅のための細胞を含まない酵素システムの構成要素を含む、有機および／または無機固体マトリックスを使用することにより、培地の中で行うことができる。この培地中では、個々の分子の子孫（クローン）は、マトリックス分子が最初に入れられた反応容積の同じ区画に留まる。この方法では、インビトロでの核酸のクローニング、ならびに、研究される試料中での核酸分子の単独の検出が可能である。
【０１２０】
緩衝液、熱安定性核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ核酸ポリメラーゼ）、核酸試料、プライマー、および基質を含む全ての反応成分は、脱気されたアクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド溶液、およびアクリルアミド重合の触媒［過硫酸アンモニウムおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）］と混合される。０．２〜０．４ｍｍ厚のゲル層が、その後、一方のガラスはシラン結合剤で、他方のガラスはシラン除去剤で処理されている２枚のガラスプレートの間に成型される。重合の完了後、シラン除去剤で処理されたプレートが取り除かれ、ゲルに、反応緩衝液で湿らされたナイロンブロッティング膜が重ねられ、熱安定性フィルムで包まれ、そしてガラスプレートに向かい合わせになるように取り付けられた恒温プレート上に置かれる。恒温プレートとの適正な熱交換を確実にするために、鉱油の薄層が、プレート表面とゲルを包むフィルムの間に設けられる。増幅反応は、恒温プレートの温度が循環（少なくとも２０サイクル行われる）させられると起こる。これは、送水管を通じて恒温プレートと接続された温度制御デバイスを使用することによって行われ、これは、様々な温度の３つまたは２つの水浴を使用する。Ｔｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｈ．ら（１９８９）Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６，３３−３５］Ｗｅｉｅｒ，Ｈ．Ｕ．およびＧｒａｙ，Ｊ．Ｗ．（１９８８）ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ７，４４−４７。市販されているＰＣＲ温度循環装置もまた、加熱ブロックがゲルプレートに適合するように改良された後に使用することができる。反応成分、それらの濃度、およびＰＣＲ条件は、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、４８７−４９１に記載されているとおりである。
【０１２１】
（実施例１３）
本実施例は、固相増幅によるポリヌクレオチドの増幅のための可能な方法を説明する。固相合成は、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号、同第６，０６０，２８８号、および同第６，０９０，５９２号；ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０６０４５６、同ＷＯ９８４４１５１Ａ１、および同ＷＯ００１８９５７Ａ１にさらに記載されており、これらは、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１２２】
本実施例では、ポリヌクレオチドは、およそ１ｋｂの長さを有しているポリヌクレオチド断片が生じるように超音波処理される。標的配列を含むアダプターが、ポリヌクレオチド断片の少なくとも一方の末端に対してアニーリングさせられる。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチド断片の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を用いて合成され、そしてこのオリゴヌクレオチドはエポキシシラン誘導固体支持体に対して、５’アミノ基によって固定される。ヘキサエチレン−グリコールのスペーサー基が、ハイブリダイゼーション反応の際の立体障害を排除するためにオリゴヌクレオチドの合成の間に含められる。スペーサー領域は、アミノ基の付加の前に合成されたオリゴヌクレオチドに導入され、それにより、計算された２５Åのスペーサー領域が生じる。
【０１２３】
オリゴヌクレオチドは、熱安定性ポリメラーゼ、酵素緩衝液、３２Ｐ標識ｄＮＴＰおよび未標識ｄＮＴＰの存在下でポリヌクレオチド断片の標的核酸配列とハイブリダイズさせて、反応混合物を形成させることができる。反応混合物は、変性のために９４℃で１分間加熱され、１分間５５℃に冷却され、そして５分間７５℃に温められて、固定されたオリゴヌクレオチドから伸張する、ポリヌクレオチド断片に相補的な増幅産物が形成させられる。
【０１２４】
（実施例１４）
本実施例は、ピロシーケンスによるポリヌクレオチドの増幅のための可能な方法を説明する。
【０１２５】
ピロシーケンスは、例えば、米国特許第６，８４１，１２８号、同第６，２１０，８９１号、および同第６，２５８，５６８号にさらに詳細に記載されており、これらはそれらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０１２６】
本実施例では、増幅された目的のポリヌクレオチドは、リアルタイム核酸配列決定のための鋳型として使用される。ポリヌクレオチドは、ストレプトアビジンでコーティングされた超常磁性体ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ２８０−ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎまたはＭ４５０−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）上に固定され、プライマーがこの固定された鋳型に対してハイブリダイズさせられる。固定されたポリヌクレオチドは、修飾されたＴ７核酸ポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０；Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）、クレノウ核酸ポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、またはエキソヌクレアーゼ欠損（ｅｘｏ−）クレノウ核酸ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）のいずれかとともにインキュベートされる。配列決定手順は、様々なデオキシヌクレオシド三リン酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が連続的に付加される際のプライマー鎖の段階的伸張によって行われる。それぞれのヌクレオチド付加の間の固定されたポリヌクレオチドの洗浄は、２工程で行われる：最初に、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液で、その後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．５）で行われる。ヌクレオチドの取り込みが原因で放出されたＰＰｉは、ＥＬＩＤＡによって検出される（Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７、２３５−２３８）。発光は、電位差記録計に接続されたＬＫＢ１２５０照度計を使用して測定される。照度計は、内部光標準について１０ｍＶの反応を生じるように較正される。照度の出力は、既知の量のＡＴＰまたはＰＰｉの添加によって較正される。標準的なアッセイ容量は０．２ｍｌであり、これには以下の成分が含まれ得る：０．１μＭのＡＴＰについて２００ｍＶの反応を生じる量の、０．１ＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．７５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１％のウシ血清アルブミン、１ｍＭのジチオスレイトール、５μＭのアデノシン５’−ホスホ硫酸（ＡＰＳ）、０．４ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（３６０ ０００）、１００μｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、４μｇ／ｍｌのＬ−ルシフェリン（ＢｉｏＯｒｂｉｔ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、０．３Ｕ／ｍｌのＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ：硫酸アデニルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．７．７．４）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）、精製されたルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）。１ｐｍｏｌの固定された核酸断片と３ｐｍｏｌの核酸ポリメラーゼが、上記の溶液に添加される。配列決定反応は４０ｐｍｏｌの１種類のヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の添加によって開始される。この反応は室温で行うことができる。ｄＡＴＰとｄＡＴＰαＳのルシフェラーゼ反応に対する影響が実験される場合は、ＡＰＳとＡＴＰスルフリラーゼの両方をアッセイから省くことができる。
【０１２７】
（実施例１５）
本実施例は、連結による配列決定によるポリヌクレオチド配列の決定のための可能な方法を説明する。
【０１２８】
本実施例では、鋳型核酸は、磁気ビーズに対して目的のポリヌクレオチドを５’末端で結合させることによって調製される。蛍光標識されたプライマーが１×クレノウ緩衝液と予め混合される。この溶液は、緩衝液の除去後、鋳型が付着させられた磁気ビーズのアリコート（１０６／μＬ）に添加され、得られる溶液が、ハイブリダイゼーションに適している条件下で十分に混合される。鋳型／プライマーハイブリダイゼーションを起こさせた後、プライマー／緩衝液が除去され、ビーズは洗浄緩衝液を使用して洗浄され、その後、連結緩衝液中に再度懸濁させられる。標識プライマーがハイブリダイズした鋳型ビーズは、その後、第１の配列決定プローブ、リガーゼ、および緩衝液を含む混合物中で、プローブの連結に適している条件下でインキュベートされる。プローブの連結後、ビーズが、酢酸ナトリウムを含む緩衝液中で洗浄される。ＡｇＮＯ３がこの溶液に添加され、得られた混合物が、切断を可能にする条件下でインキュベートされる。ＡｇＮＯ３が除去され、ビーズは、酢酸ナトリウム中で１回洗浄される。その後、ビーズは中性緩衝液中で洗浄され、アリコートが取り出され、分析用に保存される。緩衝液が除去され、その後、ビーズがＨ２Ｏ５中に再懸濁され、第２の配列決定プローブ、リガーゼ、および緩衝液を含む混合物とともに、連結に適している条件でインキュベートされる。第２の配列決定プローブの連結後、ビーズが、酢酸ナトリウムを含む緩衝液中で洗浄される。ＡｇＮＯ３がこの溶液に添加され、そして得られる混合液が、切断を可能にする条件下でインキュベートされる。ＡｇＮＯ３が除去され、ビーズは、酢酸ナトリウム中で１回洗浄される。その後、ビーズが中性緩衝液中で洗浄され、アリコートが取り出され、分析用に保存される。
【０１２９】
第１の配列決定プローブと第２の配列決定プローブは、内部ホスホロチオレート化チミジン塩基（ｓＴ）を含むように合成される。第１の切断可能プローブが、Ｔ４核酸リガーゼを使用してプライマーの伸張可能な末端に連結され、その後、硝酸銀を使用して切断される。切断により、伸張プローブの末端にある５個のヌクレオチドが除去され、プライマーに連結させられたままのプローブの部分上に伸張可能な末端が生じる。その後、第２の切断可能プローブが伸張可能な末端に連結され、その後、同様に切断される。
【０１３０】
蛍光キャピラリー電気泳動ゲルシフトアッセイを使用して、連結と切断の工程をモニターすることができる。このアッセイでは、プライマーが、５’リン酸がオリゴヌクレオチドプローブとなるための連結基質として作用できるよう（リンが移動度に基づくキャピラリーゲル電気泳動のレポーターとなる）に、鋳型鎖にハイブリダイズさせられる。各工程の後、ビーズのアリコートが分析のために取り出される。オリゴヌクレオチドプローブの連結後、磁気ビーズが磁石を使用して回収され、プライマーとそれに連結させられたプローブ（単数または複数）からなる連結種が、熱変性によって鋳型ビーズから解離させられ、標識されたサイズ標準物とともに自動核酸配列決定機器を使用する蛍光キャピラリー電気泳動に供される。典型的なゲルシフトにおいては、ピーク電位には、ｉ）プライマーピーク（伸張が起こらなかったかまたはプライマーの伸張が起こらなかったことが原因である）、ｉｉ）アデニル化ピーク（核酸リガーゼの作用による非生産性の連結点の５’末端でのアデノシン残基の付着が原因である−Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８６：７９０−７９７、１９７４を参照のこと）、およびｉｉｉ）完了ピーク（オリゴプローブの付着が原因である）が含まれる。
【０１３１】
連結が完全に進行することが望ましいが、これは必須ではない。例えば、上記に記載した連結工程後に５’ホスファターゼで処理することにより、任意の連結されていない５’末端を効率よく「キャップ」することが可能である。しかし、そのような場合は、行うことができる連続的な連結の数が、連結可能な分子の減少が原因で制限されるであろう。所定の数の連続的な連結を用いる場合は、読み取り長は、それぞれの連結／切断サイクル後に残っているプローブ長と、連続的な反応の回数に依存し、それぞれの後に、プライマーの除去と、プライマー結合部位の異なる部分に結合するプライマーのハイブリダイゼーションが続き、これらは、所定の鋳型について行うことができ、「リセット」の数とも呼ばれる。これは、プローブの５’末端に向かって配置された切断可能な連結を持つより長いプローブを使用する根拠を示している。本発明者らの実験では、ヘキサマープローブは、オクタマーおよびさらに長いプローブよりも多量の連結不可能なアデニル化産物を生じた。したがって、オクタマーおよびさらに長いプローブは、完成するまで実質的に連結するであろう（下記を参照のこと）。加えて、ヘキサマープローブの５’末端に蛍光部分を付加することによって、連結の効率が下がると見られ、一方、オクタマープローブに蛍光部分を付加することはほとんど影響がないか、または全く影響はない。これらの理由から、オクタマーまたはさらに長いプローブの使用が特定の実施形態において好ましいと考えられる。
【０１３２】
（実施例１６）
本実施例は、連結による配列決定とピロシーケンスを使用してポリヌクレオチドの２つの領域を配列決定することによる、ポリヌクレオチド配列の分析のための可能な方法を説明する。
【０１３３】
配列決定用ポリヌクレオチドは以下に記載するように、ポリヌクレオチドを断片化させ、エマルジョンＰＣＲによってこれらの断片をクローン増幅させることによって調製する。増幅後、ポリヌクレオチドの第１の領域について、以下に記載するように連結による配列決定を使用して配列決定を行い、第１の配列を決定する。ポリヌクレオチドの第２の領域について、以下に記載するようにピロシーケンスを行って、第２の配列を決定する。少なくとも第１の領域と第２の領域の一部を同時に配列決定することができる。第１の配列を第２の配列に対して比較する。２つの異なる化学反応によるデータ間での一致または不一致は、所定の位置についての最終的な塩基の決定を行う際に考慮することができる。様々な化学反応の間での塩基のバリエーションと配列の偏りもまた、最終的な配列の決定を行う際に考慮され得る。
【０１３４】
上記の一般的な記載と詳細な記載はいずれも例であり、説明にすぎず、請求される本発明を限定するものではないと理解される。本明細書中では、単数形の使用には、他に具体的に示されない限り、複数形が含まれる。本明細書中では用語「ａ」または「ａｎ」は、他に具体的に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書中では、「または」の使用は、他に具体的に示されない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定されない。また、「要素」または「成分」のような用語には、他に具体的に示されない限り、１単位の要素または成分と、複数の要素または複数の成分の両方が含まれる。
【０１３５】
本明細書中で使用された見出しのセクションは、構成の目的のためだけのものであり、いかなる方法においても記載される本発明の事項を限定するとは解釈されない。
【０１３６】
本発明の教示の中で議論される温度、濃度、時間などの前には「約」を含蓄し得ることが理解されるであろう。結果として、わずかな、実質的ではない偏差が本明細書中の本発明の教示の範囲に含まれる。例えば、「プライマー（ａ ｐｒｉｍｅｒ）」は、２つ以上のプライマーが存在する可能性があるが、必ずしもそうである必要はないことを意味する；例えば、限定ではないが、特定のプライマー種の１つ以上のコピー、ならびに、特定のプライマーのタイプの１つ以上のバージョン、例えば、限定ではないが、様々な正方向プライマーの多重度。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定するようには意図されない。上記一般的記載と詳細な記載はいずれも例であり、説明に過ぎず、本発明を限定するものではないことが理解される。
【０１３７】
引用による組み込み
本明細書中で引用された全ての参考文献（特許、特許出願、論文、テキストなどを含む）とその中で引用されている参考文献は、それらが前々からそうではなかったという程度に、それらの全体が引用により本明細書中に組み込まれる。組み込まれた文献と同様の材料のうちの１つ以上（定義される用語、用語の使用、記載される技術などを含むがこれらに限定されない）が本出願とは異なるか、または矛盾する場合には、本出願が支配する。
【０１３８】
等価物
上記記載と実施例は本発明の特定の好ましい実施形態詳細に説明しており、本発明によって意図される最良の態様を記載している。しかし、どんなに詳細であろうとも、上記は文章であり、本発明は多くの方法で実施することができ、本発明が添付の特許請求の範囲とその任意の等価物にしたがって解釈されなければならないことが理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドの配列決定のための方法であって、該方法は：
核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および
核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程
を含み、ここで、該核酸配列決定試薬の第１のセットは該核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる、方法。
【請求項２】
前記第１の領域と前記第２の領域とが重複している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の領域と前記第２の領域とが前記ポリヌクレオチドの異なる鎖上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の領域と前記第２の領域とが少なくとも５ヌクレオチド重複している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の領域と前記第２の領域とが少なくとも１０ヌクレオチド重複している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の領域が前記第２の領域に隣接し得る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが固体支持体上に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固体支持体がビーズであり得る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが単一分子であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが増幅させられたクローンであり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅させられたクローンがＰＣＲによって生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＣＲがエマルジョンＰＣＲである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が半固体支持体の中で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅が固体支持体上で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅させられたクローンがアレイ上に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の配列決定化学反応または前記第２の配列決定化学反応が、連結化学反応による配列決定であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の配列決定化学反応または前記第２の配列決定化学反応が可逆的ターミネーターの化学反応であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の配列決定化学反応または前記第２の配列決定化学反応がピロシーケンス化学反応であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の配列決定化学反応と前記第２の配列決定化学反応が連結化学反応による配列決定であり得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の配列決定化学反応と前記第２の配列決定化学反応が可逆的ターミネーターの化学反応である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
目的のポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法は：
目的のポリヌクレオチドに由来するクローンライブラリーについて第１の核酸配列決定化学反応を行う工程；
核酸配列決定試薬の第１のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および
核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程
を含み、ここで、該核酸配列決定試薬の第１のセットは、該核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる、方法。
【請求項２２】
前記クローンライブラリーが目的の生物のゲノムからなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的の生物が原核生物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的の生物が真核生物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記クローンライブラリーに、目的のゲノム由来のアンプリコンに由来するクローンが含まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記クローンライブラリーが核酸ライブラリーに由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法は：
核酸配列決定試薬の第１のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程であって、それにより、第１の核酸配列が生成される工程；
核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程であって、ここで、該核酸配列決定試薬の第１のセットは、該核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なり、それにより、第２の核酸配列が生成され、ここで、該第１の領域と該第２の領域は、共通している少なくとも１ヌクレオチド塩基位置を有する、工程；および、
該第１の核酸配列と該第２の核酸を比較する工程を含む、方法。
【請求項２８】
目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムであって、該システムは：
分析用ポリヌクレオチドのアレイ；
該アレイを含み、少なくとも１つの入力ポートを有しているフローセル；
核酸配列決定試薬の第１のセットを含むリザーバーセットであって、入力ポートとつながれているリザーバーセット；
核酸配列決定試薬の第２のセットを含むリザーバーセットであって、入力ポートと流体連結されている、リザーバーセット；
該核酸配列決定試薬の第１のセットと該分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第１の光学シグナルコレクター；および、
該核酸配列決定試薬の第２のセットと該分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第２の光学シグナルコレクター
を含む、システム。
【請求項２９】
前記第１の光学シグナルコレクターと前記第２の光学シグナルコレクターが同じ構成要素である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記光学シグナルコレクターのうちの少なくとも一方にＣＣＤが含まれる、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
前記システムに、前記ポリヌクレオチドのアレイ上に存在する蛍光シグナルの励起を誘導するように構成されたレーザーがさらに含まれる、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドの配列決定のための方法であって、該方法は：
分析用ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチド断片に断片化する工程；
該ポリヌクレオチド断片の少なくとも一部をクローン増幅させ、それによって断片クローンのセットが生成される工程；
該断片クローンのセットの第１の部分を核酸配列決定試薬の第１のセットを用いて配列決定し、それによって、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される工程；
該第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；
該断片クローンのセットの第２の部分を核酸配列決定試薬の第２のセットを用いて配列決定し、それによって、第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される工程；
該第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；
該第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリを該第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリと比較する工程；および、
他の塩基配列アセンブリ中の塩基の塩基識別と比較した、対応しているヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、該第１の塩基配列アセンブリと該第２の塩基配列アセンブリとの間での少なくとも１つの塩基識別を選択する工程
を含む、方法。
【請求項１】
ポリヌクレオチドの配列決定のための方法であって、該方法は：
核酸配列決定試薬の第１のセットを使用してポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および
核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程
を含み、ここで、該核酸配列決定試薬の第１のセットは該核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる、方法。
【請求項２】
前記第１の領域と前記第２の領域とが重複している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の領域と前記第２の領域とが前記ポリヌクレオチドの異なる鎖上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の領域と前記第２の領域とが少なくとも５ヌクレオチド重複している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の領域と前記第２の領域とが少なくとも１０ヌクレオチド重複している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の領域が前記第２の領域に隣接し得る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが固体支持体上に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記固体支持体がビーズであり得る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが単一分子であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが増幅させられたクローンであり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅させられたクローンがＰＣＲによって生成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＣＲがエマルジョンＰＣＲである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が半固体支持体の中で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅が固体支持体上で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅させられたクローンがアレイ上に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の配列決定化学反応または前記第２の配列決定化学反応が、連結化学反応による配列決定であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の配列決定化学反応または前記第２の配列決定化学反応が可逆的ターミネーターの化学反応であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の配列決定化学反応または前記第２の配列決定化学反応がピロシーケンス化学反応であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の配列決定化学反応と前記第２の配列決定化学反応が連結化学反応による配列決定であり得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の配列決定化学反応と前記第２の配列決定化学反応が可逆的ターミネーターの化学反応である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
目的のポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法は：
目的のポリヌクレオチドに由来するクローンライブラリーについて第１の核酸配列決定化学反応を行う工程；
核酸配列決定試薬の第１のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程；および
核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程
を含み、ここで、該核酸配列決定試薬の第１のセットは、該核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なる、方法。
【請求項２２】
前記クローンライブラリーが目的の生物のゲノムからなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的の生物が原核生物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的の生物が真核生物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記クローンライブラリーに、目的のゲノム由来のアンプリコンに由来するクローンが含まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記クローンライブラリーが核酸ライブラリーに由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法は：
核酸配列決定試薬の第１のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第１の領域の配列を決定する工程であって、それにより、第１の核酸配列が生成される工程；
核酸配列決定試薬の第２のセットを使用して該ポリヌクレオチドの第２の領域の配列を決定する工程であって、ここで、該核酸配列決定試薬の第１のセットは、該核酸配列決定試薬の第２のセットとは異なり、それにより、第２の核酸配列が生成され、ここで、該第１の領域と該第２の領域は、共通している少なくとも１ヌクレオチド塩基位置を有する、工程；および、
該第１の核酸配列と該第２の核酸を比較する工程を含む、方法。
【請求項２８】
目的のポリヌクレオチドの塩基配列を決定するためのシステムであって、該システムは：
分析用ポリヌクレオチドのアレイ；
該アレイを含み、少なくとも１つの入力ポートを有しているフローセル；
核酸配列決定試薬の第１のセットを含むリザーバーセットであって、入力ポートとつながれているリザーバーセット；
核酸配列決定試薬の第２のセットを含むリザーバーセットであって、入力ポートと流体連結されている、リザーバーセット；
該核酸配列決定試薬の第１のセットと該分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第１の光学シグナルコレクター；および、
該核酸配列決定試薬の第２のセットと該分析用ポリヌクレオチドとの間での反応によって生じた光学シグナルを検出するように構成されている第２の光学シグナルコレクター
を含む、システム。
【請求項２９】
前記第１の光学シグナルコレクターと前記第２の光学シグナルコレクターが同じ構成要素である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記光学シグナルコレクターのうちの少なくとも一方にＣＣＤが含まれる、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３１】
前記システムに、前記ポリヌクレオチドのアレイ上に存在する蛍光シグナルの励起を誘導するように構成されたレーザーがさらに含まれる、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドの配列決定のための方法であって、該方法は：
分析用ポリヌクレオチドを複数のポリヌクレオチド断片に断片化する工程；
該ポリヌクレオチド断片の少なくとも一部をクローン増幅させ、それによって断片クローンのセットが生成される工程；
該断片クローンのセットの第１の部分を核酸配列決定試薬の第１のセットを用いて配列決定し、それによって、第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される工程；
該第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；
該断片クローンのセットの第２の部分を核酸配列決定試薬の第２のセットを用いて配列決定し、それによって、第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリが生成される工程；
該第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基のうちの少なくとも一部についてエラー値を得る工程；
該第１のヌクレオチド塩基配列アセンブリを該第２のヌクレオチド塩基配列アセンブリと比較する工程；および、
他の塩基配列アセンブリ中の塩基の塩基識別と比較した、対応しているヌクレオチド塩基配列アセンブリ中の塩基識別についてのより低いエラー値に基づいて、該第１の塩基配列アセンブリと該第２の塩基配列アセンブリとの間での少なくとも１つの塩基識別を選択する工程
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３７６４３（Ｐ２０１０−５３７６４３Ａ）
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２３１４１（Ｐ２０１０−５２３１４１）
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４６７８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９７２８
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４６７８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９７２８
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
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