代謝物濃度を測定する方法及びこれに用いられる電気化学センサ
【課題】皮膚への刺激を抑制しながら、非侵襲による体外侵出液の代謝物濃度測定を高い精度で行うことを可能にする。
【解決手段】電気化学センサの作用電極であって導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する当該作用電極を皮膚に接触させながら、そこにパルス電流又は０．１〜１０μＡｃｍ−２の直流電流を印加することにより体外侵出液を抽出し、抽出された体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、当該作用電極に接触している体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップと、を備える、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法。
【解決手段】電気化学センサの作用電極であって導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する当該作用電極を皮膚に接触させながら、そこにパルス電流又は０．１〜１０μＡｃｍ−２の直流電流を印加することにより体外侵出液を抽出し、抽出された体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、当該作用電極に接触している体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップと、を備える、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法及びこれに用いられる電気化学センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病が進行すると種々の合併症を起こし、失明や壊疽など深刻な症状に発展することもある。また、糖尿病は、癌とともに高い死亡原因である脳梗塞、心筋梗塞などの原因である動脈硬化を引き起こしやすい。これらを予防することは、人間の健康の増進に寄与することは勿論のこと、近年社会問題化している医療費の高騰を回避する上でも重要である。糖尿病の診断や疾病の発見には空腹時血糖値の測定が、治療には血糖値に応じたインスリン注射などの管理が重要である。しかし、受診者は採血時の苦痛を受けなければならない。特に糖尿病患者は一日に数回、採血による侵襲を伴う血糖値測定が必要であり、このことが多くの患者にとって継続的な治療を受ける上で大きな負担となっている。
【０００３】
このような背景のもと、健康診断や治療において、非侵襲によって血糖値（グルコース濃度）の測定を可能にする非侵襲グルコースセンサが望まれている。すでに、血液とグルコース濃度がほぼ対応する皮膚からの体外侵出液中のグルコース濃度を測定する非侵襲グルコースセンサであるＧｌｕｃｏＷａｔｃｈ（商標）が、米シグナス社によって初めて実用化されている。これは電流を皮膚に流すことにより皮膚の細胞外液を体外侵出液として抽出するもので、電流を皮膚に流すことで薬の皮膚への浸透を加速させるイオントフォレーシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の原理の逆を利用したものである。イオントフォレーシスは、皮膚または粘膜に外部から電圧を印加することによって、主に荷電した薬物を電気化学ポテンシャルにより能動的に体内に吸収させる方法であり、非侵襲な投薬方法として知られている。これを逆に利用すると、電気浸透により体内から中性物質を引き抜き、その物質による診断を行うことができる。これを特許文献１ではイオン浸透と呼んでいる。
【０００４】
特許文献１に開示されるバイオセンサでは、白金及びグラファイトのペーストを用いて形成した電極を用いてＳＮ比を高めることで、低いバックグラウンド電流を確保している。
【０００５】
一方、唾液中のグルコース濃度と血糖間に相関があることがＢｅｎ−Ａｒｙｅｈ ｅｔ．ａｌ．により示されている（非特許文献１）。さらに、まだ研究の段階であるが、涙中のグルコース濃度も対象になり得る（非特許文献２）。もし、唾液や涙液中のグルコース濃度に基づいて血糖値を診断できれば、非侵襲グルコースセンサが構成され得る。
【特許文献１】特許第３１５５５２３号公報
【非特許文献１】Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８８年、第２巻、ｐ．９６
【非特許文献２】Ｖｉａｄｉｍｉｒ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ． Ｃｈｅｍｓｔｒｙ、２００４年、第５０巻、ｐ．２３５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の非侵襲による方法では、皮膚表面に生じる分極、電流密度の集中に伴う皮膚刺激やバーニングなどの問題があり、この点で更なる改善が求められていた。
【０００７】
唾液のグルコース濃度を測定する方法によれば、皮膚への刺激の問題は回避されるが、唾液中のグルコース濃度は血液中のそれに比べ約１〜２％程度と極めて低いため、安価な装置を用いて簡易にグルコース濃度を高精度で測定することは困難であり、臨床に普及するには至ってはいない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、皮膚への刺激を抑制しながら、非侵襲による体外侵出液の代謝物濃度測定を高い精度で行うことを可能にする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、電気化学センサの作用電極であって導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する当該作用電極を皮膚に接触させながら、そこにパルス電流又は０．１〜１０μＡｃｍ−２の直流電流を印加することにより体外侵出液を抽出し、抽出された体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、当該作用電極に接触している体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップとを備える、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法である。
【００１０】
上記本発明に係る方法では、パルス電流、又は上記特定範囲の直流電流の印加によって効率的に体外侵出液を抽出することから、皮膚への刺激が十分に抑制される。パルス電流又は比較的弱い直流電流を用いることから、抽出される体外侵出液は微量であるが、ＤＬＣ膜又はダイヤモンド膜を有する作用電極を備える高感度の電気化学センサを用いたことにより、そのような微量の体外侵出液であってもその代謝物濃度を高い精度で測定することが可能である。皮膚への刺激を更に抑制するために、印加するパルス電流は、周波数１〜１００ｋＨｚ、デューティー比５〜３０％若しくは６５〜８５％、パルス電流密度０．０００１〜１０ｍＡｃｍ−２であることが好ましい。
【００１１】
本発明に係る電気化学センサは、導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する作用電極を備え、上記本発明に係る方法によって体外侵出液の代謝物の濃度を測定するためのものである。また、本発明に係る電気化学センサシステムは、本発明に係る電気化学センサと、該電気化学センサにおいて生じる酸化還元電流を検出する制御部とを具備する。
【００１２】
本発明に係る電気化学センサによれば、皮膚への刺激を抑制しながら、非侵襲による体外侵出液の代謝物濃度測定を高い精度で行うことが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、皮膚への刺激を抑制しながら、非侵襲による体外侵出液の代謝物濃度測定を高い精度で行うことが可能である。
【００１４】
また、本発明によれば残余電流の少ないＤＬＣ膜又はダイヤモンド膜を用いることで高いＳＮ比が得られる。そのため、電気浸透のための印加電流を大幅に抑え、また更に皮膚への負担を軽減するためにパルス電流を用いることができる。したがって、非侵襲の測定の際の皮膚刺激やバーニングが十分に抑制される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
本実施形態に係る方法は、作用電極及び対極を有する電気化学センサを用いる非侵襲の測定方法である。具体的には、本実施形態に係る方法は、電気化学センサの作用電極を皮膚に接触させながら、そこに直流電流又はパルス電流を印加することにより皮膚の細胞外液を抽出した体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、当該作用電極に接触している体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップとを備える。
【００１７】
電気化学センサの作用電極が接触している部分の皮膚に対して、直流電流又はパルス電流が印加される。電流の印加は、例えば、作用電極近傍の位置の皮膚に１対の電極を当てる方法によって行われる。
【００１８】
直流電流の場合、０．１〜１０μＡｃｍ−２の電流が印加される。パルス電流の場合、周波数１〜１００ｋＨｚ、デューティー比５〜３０％若しくは６５〜８５％、パルス電流密度０．０００１〜１０ｍＡｃｍ−２であることが好ましい。係る範囲の電流を印加することにより、皮膚への刺激を特に顕著に抑制しながら体外侵出液を皮膚から抽出することができる。皮膚刺激及び測定精度のバランスの観点から、パルス電流の周波数は好ましくは１〜５０ｋＨｚ、更に好ましくは１０〜５０ｋＨｚである。パルス電流のデューティー比は好ましくは５〜２０％若しくは７０〜８５％、更に好ましくは５〜１５％若しくは７０〜８０％である。パルス電流密度は好ましくは０．００１〜５ｍＡｃｍ−２、更に好ましくは０．０１〜２ｍＡｃｍ−２である。
【００１９】
皮膚から抽出された体外侵出液を作用電極に接触させ、そのときに作用電極−対極間に発生する酸化還元電流値を測定する。所定の電位における代謝物濃度と酸化電流値との関係に基づいて、体外侵出液の代謝物濃度が算出される。
【００２０】
本実施形態に係る方法の測定対象物質である代謝物は、生体内の代謝に関連する物質であり、代謝物の全体を一般にメタボロームと称する場合がある。代謝物の具体例としては、糖（グルコース等）、アミノ酸及び蛋白質がある。これらの中には、基本的代謝物のほかに、酸化ストレスマーカー、精神的ストレスマーカーとして扱うことが可能な物質、あるいは体外で生産されるアスコルビン酸などのビタミン類も含まれており、これらの代謝物の濃度を検出することは臨床的意義がある。
【００２１】
酸化ストレスマーカーは、細胞の老化やＤＮＡの損傷、動脈硬化などの指標となる物質である。酸素ストレスマーカーは、例えば、ミトコンドリアから生成されるスーパーオキシドや、一酸化窒素、ペルオキシナイトライド、次亜塩素酸又はそれらのフリーラジカル、金属イオン、リポキシゲナーゼ、及びミエロペルオキニダーゼによって引き起こされる酸化反応により生成する。代表的な酸化ストレスマーカーである８−ヒドロキシ−２’−デオキシシデグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−ｏｘｏｄＧ）、及び８−ニトログアノシンなどのＤＮＡ障害マーカーは、ＤＮＡの酸化ストレス損傷によって生ずる。他の酸化ストレスマーカーとしては、アラキドン酸のフリーラジカル酸化生成物である８−イソプラスタンや、アミノ酸・蛋白質酸化障害マーカーであるヒドロキシロイシン、ヒドロキシバリン、ニトロチロシン、カルボキシメチルリジン、ペントシジン、ニトロチロシン及びチミングリコール、生体内の酸化成分であるα−トコフェノール、バイオピリン、オレイン酸、チレオドキシン、酸化型コエンザイムＱ１０、カルボキシメチルリジン、パーオキシナイトライト、一酸化窒素などの窒素酸化物、ニトロソチオール反応物、ｌｉｐｉｄ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＬＰＯ）、マロンジアルデヒド、酸化ＬＤＬ及び酸化ＬＰ（ａ）、クレアトールＭＤＡ−ＬＤＬなどが挙げられる。
【００２２】
精神的ストレスマーカーとしては、例えば、コルチゾール、ノルエピネフリン、クロモグラニンＡ、ＩｇＡ及びβ−エンドルフィンが挙げられる。
【００２３】
その他の代謝物は、酸化還元反応を生じる化学物質であれば特に限定されないが、例えば、コレステロール、乳酸、クレアチニン、蛋白質、過酸化水素、アルコール、グルタミン酸、アルコールアミノ酸、フルクトサミン、グリセロール、アシル−コエンザイムＡ、チラミン、アミノ酸、グリコレート、ピリドキサール−４−、ソルボース、グロノラクトース、ガラクトース、ピラノース、尿酸、ピルビン酸、アスコルビン酸、アンモニア、トリメチルアミン、アセトン、エタン、ペンタン、水素、酸素、メタン、プロパン、ブタン、イソプレン、メルカプタン類がある。
【００２４】
以上のような方法において好適に用いられる電気化学センサ及び電気化学センサシステムの実施形態に関して、以下に説明する。
【００２５】
図１は、電気化学センサシステムの一実施形態の概略を示すブロック図である。図１に示す電気化学センサシステム１００は、作用電極２、対極３及び参照電極５を有する電気化学センサ１と、電気化学センサ１を検体中の分析対象化学物質の酸化還元電流が検出されるように制御する制御部１０とを備える。作用電極２、対極３及び参照電極５はそれぞれ制御部１０と電気的に接続されている。作用電極２は参照電極５を基準として所定の電位に維持されるように制御部１０によって制御される。そして、作用電極２と対極３との間の電流が制御部１０によって検出される。
【００２６】
本発明に係る電気化学センサシステムは、例えば図２に示す実施形態のように、参照電極を備えていなくてもよい。この場合、作用電極２の電位は対極３を基準として制御される。
【００２７】
図３は、電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。図３に示す電気化学センサ１は、第１の基板２１と、第１の基板２１の一方面において一方の端部近傍に設けられた作用電極２、対極３及び参照電極５と、作用電極２、対極３及び参照電極５にそれぞれ接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線２ａ，３ａ及び５ａと、第１の基板２１に接着された、作用電極２、対極３及び参照電極５が露出するような窓２５が形成されている第２の基板２２とから構成される。第２の基板２２は、リード線２ａ，３ａ及び５ａのうち第１の基板２１の他方の端部近傍以外の部分を覆っている。
【００２８】
作用電極２は、第１の基板２１上に形成された導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜であり、特に好ましくはＤＬＣ膜である。ＤＬＣ膜は、一般にダイヤモンド状炭素膜、ダイヤモンド様炭素膜、ダイヤモンドライクカーボン膜、又はｉ−カーボン膜とも呼ばれる。ＤＬＣ膜は主として炭素及び水素から構成され、ｓｐ３結合及びｓｐ２結合が混在する非晶質炭素膜である。一方、ダイヤモンド膜はダイヤモンド構造を有する結晶を含んだ膜であり、ＤＬＣ膜とはその構造が異なる。ＤＬＣ膜とダイヤモンド膜はラマン分光分析によって明確に区別できることが知られている。ラマンスペクトルにおいて、ダイヤモンド膜の場合１３３３ｃｍ−１に明確なピークが観測されるのに対して、ＤＬＣ膜の場合１３５０ｃｍ−１付近のＤｉｓｏｒｄｅｒｅｄバンドおよび１５５０ｃｍ−１付近のＧｒａｐｈｉｔｉｃバンドにブロードなピークが観測される。
【００２９】
ＤＬＣ膜は、好ましくは、１０〜４０原子％の水素と、３０〜８５原子％の炭素とを含む。ＤＬＣ膜が係る特定範囲の組成を有していることにより、適正な抵抗率を維持しつつ、電気化学センサとしての感度が改善される。また、水素がこの範囲で含まれると、膜中の炭素原子のうち水素終端のダングリングボンドを含むｓｐ３結合を形成するものの割合が高くなって、膜が非晶質化する。非晶質なＤＬＣ膜は、成膜温度が低く、均一な品質の成膜が容易であり、成膜速度も高いので、工業的な生産に有利である。
【００３０】
また、ｓｐ３結合の炭素を主体とするＤＬＣ膜は、電気化学反応によって酸化または還元される化学物質が吸着する過程が極めて少ないので、例えば水に起因する水素や水酸化物やそれらのイオンによる電極への吸着を経る内圏酸化還元反応が極めて起こりににくい。その結果、残余電流と言われるノイズ電流が極端に小さくなるので、検出対象である化学物質の電気化学反応を高ＳＮ比で検出することが可能である。
【００３１】
ＤＬＣ膜は、窒素、リン、ヒ素、アンチモン及びビスマスからなる群から選ばれる少なくとも１種の元素を含んでいてもよい。これらの元素が５〜３０原子％含まれることにより、ＤＬＣ膜がｎ型半導体膜となる。あるいは、ＤＬＣ膜は、ホウ素、ガリウム及びインジウムからなる群から選ばれる元素を更に含むんでいてもよい。これら元素が５〜３０原子％含まれることにより、ＤＬＣ膜がｐ型半導体膜となる。
【００３２】
ＤＬＣ膜は、０．０１〜２０原子％の酸素を更に含むことが好ましい。また、ＤＬＣ膜は０．００２〜１原子％の塩素を更に含むことが好ましい。塩素の割合が０．００２原子％以下であると、絶縁化が起こりにくくなる傾向があり、１原子％を超えると導電性が低下し易くなる傾向がある。
【００３３】
感度向上効果を特に顕著に得るために、ＤＬＣ膜の抵抗率は、好ましくは１０−３〜１０６Ωｃｍ、より好ましくは１０−３〜１０３Ωｃｍ、さらに好ましくは１０−３〜１０２Ωｃｍである。
【００３４】
ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚は、０．０１〜２０μｍが望ましい。ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚が０．０１μｍより薄いと作用電極の抵抗率が大きくなったり、ピンホールが生じやすくなる傾向がある。ピンホールが多く生じるとセンサ用の電極として正常に機能しなくなるおそれがある。また、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚が２０μｍを超えると、下地としての第１の基板２１が反ったりクラックが入ったりし易くなる傾向がある。さらに、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚が大きいと第１の基板２１と溶液の間における電流と抵抗との積に比例して生じる電圧降下が大きくなって、感度が低下し易くなる傾向もある。また、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚はセンサの小型化の観点からも出来るだけ小さいことが望ましい。同様の観点から、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚は、より望ましくは０．０５〜１０μｍ、更に望ましくは０．１〜５μｍである。
【００３５】
導電性のＤＬＣ膜は、例えば、第１の基板２１を加熱しながら、炭化水素ガスを含む原料ガスを用いた気相法により形成することができる。気相法としては、イオン化蒸着法及び高周波プラズマＣＶＤ法が好適である。原料ガスの組成、成膜の際の第１の基板２１の加熱温度、プラズマ条件を調節することにより、上述の特定組成を有するＤＬＣ膜を形成させることができる。具体的には、例えば、第１の基板２１の温度を１５０〜４５０℃に加熱しながら成膜することにより、１０〜４０原子％の水素と、３０〜８５原子％の炭素とを含むＤＬＣ膜が形成される場合が多い。
【００３６】
成膜の際、炭素源としての炭化水素ガスとともに、窒素ガス、アンモニアガス及びピリジン等の含窒素有機物、酸化ホウ素とアルコール類若しくはケト類、又はホウ素アルコキシドのようなガスを併用することにより、窒素、ホウ素等によりドープされたＤＬＣ膜が形成される。例えば、炭化水素ガスと、窒素ガスと、場合により水素、ネオン、ヘリウム、アルゴン及び酸素からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加ガスとを含む混合ガスを真空成膜装置内に原料ガスとして導入しながら、原料ガスに１３．５６ＭＨｚの周波数の電圧を印加してプラズマ化させ、プラズマ化した原料ガスから生成した炭化水素を堆積させる方法により、導電性のＤＬＣ膜を形成することができる。
【００３７】
作用電極２は、上記ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜上に形成された機能膜を有していてもよい。この機能膜は、検体中の代謝物の電気化学反応を選択的に生じさせる酵素を含む。酵素の具体例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、グリセロールオキシダーゼ、アシル−コエンザイムＡオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、グリコレートオキシダーゼ、ピリドキサール−４−オキシダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、グロノラクトースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダ−ゼ、ウリカーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びビリルビンオキシダーゼが挙げられる。
【００３８】
グルコースオキシダーゼの作用により、電極に必要な電位が印加されたときに試料液中のグルコースがグルコン酸に酸化され、過酸化水素が発生する。このときフェリシアン化カリウム、フェロセン、１，１’−ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸及びフェロセンカルボキシアルデヒド等のフェロセン誘導体、ハイドロキノン、クロラニル及びブロマニル等のキノン類、または、フェリシアンイオン、オクタシアノタングステン酸イオン及びオクタシアノモリブデン酸イオン等の金属錯体イオンのようなメディエータを用いると、グルコースの濃度に比例した電流をＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜によって選択的且つ高感度に検知できる。
【００３９】
酵素を含む機能膜は、例えば、酵素及び必要によりメディエータ等の他の成分を含む溶液の膜をＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜上に形成し、これを乾燥する方法により形成することができる。
【００４０】
第１の基板２１は、作用電極２、対極３及び参照電極５を支持する支持体である。第１の基板２１は、電気化学センサとしての使用に耐え得る物理的強度を有していればよい。
【００４１】
ＤＬＣ膜がｎ型半導体膜であるとき、第１の基板２１はｎ型結晶性シリコン基板であることが好ましい。これにより第１の基板２１とＤＬＣ膜との間にショットキー障壁などの界面抵抗が生じにくくなる。電気化学センサの検出電流は通常１ｍＡ以下程度の微小電流であることから、ＩＲドロップの発生が十分に防止される。同様の観点から、ＤＬＣ膜がｐ型半導体膜であるとき、第１の基板２１はｐ型結晶性シリコン基板であることが好ましい。
【００４２】
対極３は、電気化学反応において通常用いられる電極用の導電性材料から構成される。好ましくは、対極３は、白金及び金のような貴金属、または作用電極２と同様の導電性のＤＬＣ膜から構成される。
【００４３】
参照電極５は、典型的には、銀−塩化銀、又は水銀−塩化水銀から構成される。参照電極５はペーストを用いる方法により形成することができる。
【００４４】
リード線２ａ，３ａ，５ａは、銅等の導電性材料から構成され、メタルマスクを用いた通常の方法により形成することができる。
【００４５】
第２の基板２２は、第１の基板２１と同様の基板が用いられる。第１の基板２１と第２の基板２２は作用電極２等を間に挟んで接着剤により接着される。
【００４６】
図４は、参照電極を備えていない電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。図４に示す電気化学センサ１は、参照電極５及びこれに接続されるリード線５ａが形成されていないことの他は、図３の電気化学センサ１と同様の構成を有する。
【００４７】
図５、６は、皮膚に電流を印加するための印加電極を備えた電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。図５に示す電気化学センサ１は、作用電極２、対極３及び参照電極５を間に挟んで対向配置された１対の印加電極５１，５２と、印加電極５１に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５１ａと、印加電極５２に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５２ａとを備える。その他の構成は図２、３の電気化学センサと同様である。印加電極５１，５２により、作用電極２が接触している部分の皮膚に対して電流が印加される。同様に、図６に示す電気化学センサ１は、作用電極２及び対極３を間に挟んで対向配置された１対の印加電極５１，５２と、印加電極５１に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５１ａと、印加電極５２に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５２ａとを備える。
【００４８】
体外侵出液の抽出及びその代謝物濃度の測定は、電気化学センサ１の窓２５内の部分を皮膚に押し当てながら、印加電極５１，５２間に所定の直流電流又はパルス電流を印加して行われる。
【００４９】
電気化学センサシステム１００を構成する制御部１０は、例えば、作用電極２の参照電極５に対する電位を制御するポテンシオスタットと、作用電極２と対極３との間に流れる電流を計測する電流計と、ポテンシオスタット及び電流計を制御するプロセッサと、ポテンシオスタット及び電流計を制御するためのソフトウエアとから構成される。プロセッサ（ＣＰＵ＝中央演算装置）は、上記ソフトウエアを実行することにより、ポテンシオスタット及び電流計を制御する。ポテンシオスタットは、作用電極２の電位を検体中の分析対象化学物質に固有の酸化還元電流が適切に検出されるような所定の電位に維持するように制御される。また、プロセッサは、所定の電位における検体中の分析対象化学物質の濃度と酸化電流値との関係に関する検量線を読み込んでこの検量線に基づいて検体中の分析対象化学物質の濃度を算出する。電気化学センサシステム１００は、算出された結果を表示するモニターを備えていることが好ましい。
【００５０】
図７は、抽出された体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法の一実施形態を示すフロー図である。ステップＳ１では予め作成された検量線データがプロセッサに読み込まれる。ステップＳ２で作用電極を所定の電位Ｅｎに保持し、ステップＳ３で作用電極−対極間の電流値Ｉｎを電圧印加の開始から所定の時間ｔｎ秒後に測定する。ステップＳ４で電流値Ｉｎを読み込み、ステップＳ５で検量線からの内挿に基づいて検体である体外侵出液中の代謝物の濃度Ｃが算出される。ステップＳ６で算出結果の妥当性を判断し、妥当であればステップＳ７で結果が表示される。算出結果が妥当でないと判断された場合、ステップＳ２に戻る。
【００５１】
このような電気化学センサシステムによれば、体外侵出液中の代謝物に固有の酸化還元電位を利用した電位設定により、複数種の代謝物を分離して検出することが可能である。この点で本実施形態に係るシステムは、複数種の代謝物を区別して検出することができない半導体式センサよりも優れる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
ｎ型（１００）面単結晶シリコンウエハを、対向して配置された電極を備える真空成膜装置内に置いた。そして、シリコンウエハを２００℃に加熱しながら、原料ガスとしてエチレン及び窒素を５：５ｓｃｃｍで導入し、１３．５６ＭＨｚの周波数で５００Ｗの電力にて真空装置内をプラズマ化させることにより、シリコンウエハ上に導電性のＤＬＣ膜を形成させた。形成されたＤＬＣ膜の抵抗率は０．３Ωｃｍであり、その組成は水素１０原子％、窒素５原子％、炭素８５原子％であった。ＤＬＣ膜を成膜したシリコンウエハを５ｍｍ角に切り分けて、ｎ型単結晶シリコン基板上にＤＬＣ膜が形成されたチップを得た。
【００５４】
次いで、酵素として２Ｕのグルコースデヒドロゲナーゼ、補酵素として０．０２５ｍｇのフラビンアデニンジヌクレオチド、及びメディエータとして０．０２５ｍｇフェリシアン化カリウムを、ｐＨ７．２の０．０５Ｍリン酸緩衝溶液５μＬに溶解させた。得られた溶液を導電性ＤＬＣ膜上に適下し、更に、ｐＨ７．２の０．０５Ｍリン酸緩衝溶液を用いて調製した１ｗｔ％ウシアルブミン溶液１μＬ、２０ｗｔ％グルタルアルデヒド溶液１μＬを順に適下した。その後、３０℃、湿度１０％の環境で３０分乾燥させて、ＤＬＣ膜上に機能膜を形成させた。
【００５５】
ＤＬＣ膜を作用電極として用い、銀／塩化銀ペーストの印刷により参照電極としての銀−塩化銀電極を形成し、対極としてのＤＬＣ膜を上記と同様の方法で形成して、図１に示すような回路を有する電気化学センサを構成した。
【００５６】
作製した電気化学センサを、駆動用ソフトウェアが読み込まれたプロセッサによって制御される自作ポテンシオスタットに接続し、作用電極−対極間に流れる電流値が計測されるように電気化学センサシステムを構成した。駆動用ソフトウェアは検出電位を参照電極に対して１．２Ｖとなるように設定した。
【００５７】
０．０５Ｍリン酸水素ニナトリウム−リン酸ニ水素カリウムによるｐＨ７．２の緩衝溶液にグルコースを３ｍＭの濃度で溶解したグルコース溶液を準備し、そこに電気化学センサを浸して電流値を測定した。また、ブランクとしてグルコースを溶解していない緩衝液の電流値も測定した。測定結果から算出されたグルコース濃度を、ＳＮ比とともに表１に示す。
【００５８】
実施例２〜５
実施例１と同様の方法で、エチレンと窒素ガスの導入比率を変化させることにより、組成の異なる導電性のＤＬＣ膜をシリコン基板上に形成させた。これ以外は実施例７と同様にして、電気化学センサ及び電気化学センサシステムを準備した。得られた電気化学センサを用いて実施例１と同様にグルコース濃度の測定を行った。結果を表１にまとめて示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
比較例１
作用電極として白金板を用いたことの他は実施例１と同様にして電気化学センサシステムを準備し、グルコース濃度を測定した。グルコース濃度の計算値は２．８ｍＭであり、ＳＮ比は６．７であった。
【００６１】
比較例２
作用電極としてグラシーカーボンを用いたことの他は実施例１と同様にして電気化学センサシステムを準備し、グルコース濃度を測定した。グルコース濃度の計算値は２．７ｍＭであり、ＳＮ比は７．７であった。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例６
印加電極を更に形成したことの他は実施例１と同様にして、図５に示される実施形態と同様の構成を有する電気化学センサを準備した。
【００６４】
得られた電気化学センサを用いて、血液から採取した血漿、涙液、唾液及び皮膚からの体外侵出液中のグルコース濃度を測定した。体外侵出液中のグルコース濃度の測定は、被験者の皮膚に対極及び印加電極を押し当てながら、印加電極間に周波数、デューティー比、パルス電流密度の各パラメータを表３の実施例６−１〜６−５に示す値に設定したパルス電流、又は実施例６−６〜６−８に示す直流電流を印加することにより捕捉した体外侵出液を対象にして、行った。刺激感については、直流３ｍＡ／ｃｍ２の電流印加の際の刺激感を１００として、体外侵出液測定の際の刺激感の大きさを被験者の判断に基づいて相対的に評価した。
【００６５】
比較例３
作用電極として白金板を用いたことの他は実施例６と同様の構成を有する電気化学センサを比較例３として準備し、同様のグルコース濃度測定を行った。
【００６６】
比較例４
実施例６と同様の電気化学センサにて、血液から採取した血漿、涙液、唾液及び皮膚からの体外侵出液中のグルコース濃度を測定した。体外侵出液中のグルコース濃度の測定は、被験者の皮膚に対極及び印加電極を押し当てながら、印加電極間に周波数、デューティー比、パルス電流密度の各パラメータを表３の比較例４−１〜４−２に示す値に設定したパルス電流、又は比較例４−３〜４−５に示す直流電流を印加することにより捕捉した体外侵出液を対象にして、行った。
【００６７】
更に、血液から採取した血漿、涙液、唾液中のグルコース濃度をヘキソナーゼ法により測定し、その値を比較のため表３に示した。
【００６８】
【表３】
【００６９】
表３に示されるように、実施例６はヘキソナーゼ法の結果をよく再現したが、比較例３は測定誤差が大きかった。また、比較例４−１、４−２、４−４、４−５は測定精度は良好であったものの、皮膚への刺激感が大きかった。０．１μＡ／ｃｍ−２を下回る直流電流を印加した比較例４−３は皮膚刺激は小さいものの、体外侵出液の捕捉量が少ないためにグルコース濃度を測定することができなかった。
【００７０】
実施例７
実施例６で用いた電気化学センサを用いて、経皮的抽出可能なデバイス（内容詳細は特許３３２８２９０の２３列２０行〜２４列４行の実施例１、図１Ａ〜Ｃに準じる。）を作成し、センサを皮膚に当て、印加電極に２μＡ／ｃｍ２の直流電流を通して体外侵出液を捕捉し、次いでセンサによって体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７１】
実施例８
周波数１０ｋＨｚ、デューティー比２５％、パルス電流密度２ｍＡｃｍ−２のパルス電流を印加したことの他は実施例７と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７２】
比較例５
０．３２ｍＡ／ｃｍ２の直流電流を印加したことの他は実施例７と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７３】
比較例６
白金電極を作用電極として有する比較例３の電気化学センサを用いたことの他は実施例７と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７４】
比較例７
０．３２ｍＡ／ｃｍ２の直流電流を印加したことの他は比較例６と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７５】
上記実施例及び比較例において、体外侵出液のグルコース濃度測定の際の刺激感を、比較例５（０．３２ｍＡ／ｃｍ２）の場合を１００として、刺激感の大きさを被験者の判断に基づいて相対的に評価した。皮膚から体外侵出液を抽出する速度を示すフラックスの測定も行った。さらに、それぞれの電気化学センサを用いて、別途血液採取しその中の血漿中のグルコース濃度も測定した。
【００７６】
【表４】
【００７７】
表４に示されるように、患者の皮膚への刺激感は、直流２μＡ／ｃｍ２やパルス電流では軽減できた。２μＡ／ｃｍ２のような微弱な直流電流で体外侵出液の採取量が少ない場合であっても、実施例７のように導電性のＤＬＣ膜を用いれば、白金を用いた比較例６に比べグルコース濃度を感度よく検出できる。さらにパルス電流では体外侵出液を抽出する速度を表すフラックスが優れており、患者の刺激感を抑えつつ、高い感度で測定が可能であることがわかった。なお、本発明は、グルコースのみならず、電気化学反応による検出が可能な全ての代謝物に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】電気化学センサシステムの一実施形態を示すブロック図である。
【図２】電気化学センサシステムの一実施形態を示すブロック図である。
【図３】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図４】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図５】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図６】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図７】体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法の一実施形態を示すフロー図である。
【符号の説明】
【００７９】
１…電気化学センサ、２…作用電極、３…対極、５…参照電極、１０…制御部、２１…第１の基板（支持体）、２２…第２の基板、５１，５２…印加電極、１００…電気化学センサシステム。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法及びこれに用いられる電気化学センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病が進行すると種々の合併症を起こし、失明や壊疽など深刻な症状に発展することもある。また、糖尿病は、癌とともに高い死亡原因である脳梗塞、心筋梗塞などの原因である動脈硬化を引き起こしやすい。これらを予防することは、人間の健康の増進に寄与することは勿論のこと、近年社会問題化している医療費の高騰を回避する上でも重要である。糖尿病の診断や疾病の発見には空腹時血糖値の測定が、治療には血糖値に応じたインスリン注射などの管理が重要である。しかし、受診者は採血時の苦痛を受けなければならない。特に糖尿病患者は一日に数回、採血による侵襲を伴う血糖値測定が必要であり、このことが多くの患者にとって継続的な治療を受ける上で大きな負担となっている。
【０００３】
このような背景のもと、健康診断や治療において、非侵襲によって血糖値（グルコース濃度）の測定を可能にする非侵襲グルコースセンサが望まれている。すでに、血液とグルコース濃度がほぼ対応する皮膚からの体外侵出液中のグルコース濃度を測定する非侵襲グルコースセンサであるＧｌｕｃｏＷａｔｃｈ（商標）が、米シグナス社によって初めて実用化されている。これは電流を皮膚に流すことにより皮膚の細胞外液を体外侵出液として抽出するもので、電流を皮膚に流すことで薬の皮膚への浸透を加速させるイオントフォレーシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の原理の逆を利用したものである。イオントフォレーシスは、皮膚または粘膜に外部から電圧を印加することによって、主に荷電した薬物を電気化学ポテンシャルにより能動的に体内に吸収させる方法であり、非侵襲な投薬方法として知られている。これを逆に利用すると、電気浸透により体内から中性物質を引き抜き、その物質による診断を行うことができる。これを特許文献１ではイオン浸透と呼んでいる。
【０００４】
特許文献１に開示されるバイオセンサでは、白金及びグラファイトのペーストを用いて形成した電極を用いてＳＮ比を高めることで、低いバックグラウンド電流を確保している。
【０００５】
一方、唾液中のグルコース濃度と血糖間に相関があることがＢｅｎ−Ａｒｙｅｈ ｅｔ．ａｌ．により示されている（非特許文献１）。さらに、まだ研究の段階であるが、涙中のグルコース濃度も対象になり得る（非特許文献２）。もし、唾液や涙液中のグルコース濃度に基づいて血糖値を診断できれば、非侵襲グルコースセンサが構成され得る。
【特許文献１】特許第３１５５５２３号公報
【非特許文献１】Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８８年、第２巻、ｐ．９６
【非特許文献２】Ｖｉａｄｉｍｉｒ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ． Ｃｈｅｍｓｔｒｙ、２００４年、第５０巻、ｐ．２３５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の非侵襲による方法では、皮膚表面に生じる分極、電流密度の集中に伴う皮膚刺激やバーニングなどの問題があり、この点で更なる改善が求められていた。
【０００７】
唾液のグルコース濃度を測定する方法によれば、皮膚への刺激の問題は回避されるが、唾液中のグルコース濃度は血液中のそれに比べ約１〜２％程度と極めて低いため、安価な装置を用いて簡易にグルコース濃度を高精度で測定することは困難であり、臨床に普及するには至ってはいない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、皮膚への刺激を抑制しながら、非侵襲による体外侵出液の代謝物濃度測定を高い精度で行うことを可能にする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、電気化学センサの作用電極であって導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する当該作用電極を皮膚に接触させながら、そこにパルス電流又は０．１〜１０μＡｃｍ−２の直流電流を印加することにより体外侵出液を抽出し、抽出された体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、当該作用電極に接触している体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップとを備える、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法である。
【００１０】
上記本発明に係る方法では、パルス電流、又は上記特定範囲の直流電流の印加によって効率的に体外侵出液を抽出することから、皮膚への刺激が十分に抑制される。パルス電流又は比較的弱い直流電流を用いることから、抽出される体外侵出液は微量であるが、ＤＬＣ膜又はダイヤモンド膜を有する作用電極を備える高感度の電気化学センサを用いたことにより、そのような微量の体外侵出液であってもその代謝物濃度を高い精度で測定することが可能である。皮膚への刺激を更に抑制するために、印加するパルス電流は、周波数１〜１００ｋＨｚ、デューティー比５〜３０％若しくは６５〜８５％、パルス電流密度０．０００１〜１０ｍＡｃｍ−２であることが好ましい。
【００１１】
本発明に係る電気化学センサは、導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する作用電極を備え、上記本発明に係る方法によって体外侵出液の代謝物の濃度を測定するためのものである。また、本発明に係る電気化学センサシステムは、本発明に係る電気化学センサと、該電気化学センサにおいて生じる酸化還元電流を検出する制御部とを具備する。
【００１２】
本発明に係る電気化学センサによれば、皮膚への刺激を抑制しながら、非侵襲による体外侵出液の代謝物濃度測定を高い精度で行うことが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、皮膚への刺激を抑制しながら、非侵襲による体外侵出液の代謝物濃度測定を高い精度で行うことが可能である。
【００１４】
また、本発明によれば残余電流の少ないＤＬＣ膜又はダイヤモンド膜を用いることで高いＳＮ比が得られる。そのため、電気浸透のための印加電流を大幅に抑え、また更に皮膚への負担を軽減するためにパルス電流を用いることができる。したがって、非侵襲の測定の際の皮膚刺激やバーニングが十分に抑制される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
本実施形態に係る方法は、作用電極及び対極を有する電気化学センサを用いる非侵襲の測定方法である。具体的には、本実施形態に係る方法は、電気化学センサの作用電極を皮膚に接触させながら、そこに直流電流又はパルス電流を印加することにより皮膚の細胞外液を抽出した体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、当該作用電極に接触している体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップとを備える。
【００１７】
電気化学センサの作用電極が接触している部分の皮膚に対して、直流電流又はパルス電流が印加される。電流の印加は、例えば、作用電極近傍の位置の皮膚に１対の電極を当てる方法によって行われる。
【００１８】
直流電流の場合、０．１〜１０μＡｃｍ−２の電流が印加される。パルス電流の場合、周波数１〜１００ｋＨｚ、デューティー比５〜３０％若しくは６５〜８５％、パルス電流密度０．０００１〜１０ｍＡｃｍ−２であることが好ましい。係る範囲の電流を印加することにより、皮膚への刺激を特に顕著に抑制しながら体外侵出液を皮膚から抽出することができる。皮膚刺激及び測定精度のバランスの観点から、パルス電流の周波数は好ましくは１〜５０ｋＨｚ、更に好ましくは１０〜５０ｋＨｚである。パルス電流のデューティー比は好ましくは５〜２０％若しくは７０〜８５％、更に好ましくは５〜１５％若しくは７０〜８０％である。パルス電流密度は好ましくは０．００１〜５ｍＡｃｍ−２、更に好ましくは０．０１〜２ｍＡｃｍ−２である。
【００１９】
皮膚から抽出された体外侵出液を作用電極に接触させ、そのときに作用電極−対極間に発生する酸化還元電流値を測定する。所定の電位における代謝物濃度と酸化電流値との関係に基づいて、体外侵出液の代謝物濃度が算出される。
【００２０】
本実施形態に係る方法の測定対象物質である代謝物は、生体内の代謝に関連する物質であり、代謝物の全体を一般にメタボロームと称する場合がある。代謝物の具体例としては、糖（グルコース等）、アミノ酸及び蛋白質がある。これらの中には、基本的代謝物のほかに、酸化ストレスマーカー、精神的ストレスマーカーとして扱うことが可能な物質、あるいは体外で生産されるアスコルビン酸などのビタミン類も含まれており、これらの代謝物の濃度を検出することは臨床的意義がある。
【００２１】
酸化ストレスマーカーは、細胞の老化やＤＮＡの損傷、動脈硬化などの指標となる物質である。酸素ストレスマーカーは、例えば、ミトコンドリアから生成されるスーパーオキシドや、一酸化窒素、ペルオキシナイトライド、次亜塩素酸又はそれらのフリーラジカル、金属イオン、リポキシゲナーゼ、及びミエロペルオキニダーゼによって引き起こされる酸化反応により生成する。代表的な酸化ストレスマーカーである８−ヒドロキシ−２’−デオキシシデグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）、８−オキソ−７，８−ジヒドロ−２’−デオキシグアノシン（８−ｏｘｏｄＧ）、及び８−ニトログアノシンなどのＤＮＡ障害マーカーは、ＤＮＡの酸化ストレス損傷によって生ずる。他の酸化ストレスマーカーとしては、アラキドン酸のフリーラジカル酸化生成物である８−イソプラスタンや、アミノ酸・蛋白質酸化障害マーカーであるヒドロキシロイシン、ヒドロキシバリン、ニトロチロシン、カルボキシメチルリジン、ペントシジン、ニトロチロシン及びチミングリコール、生体内の酸化成分であるα−トコフェノール、バイオピリン、オレイン酸、チレオドキシン、酸化型コエンザイムＱ１０、カルボキシメチルリジン、パーオキシナイトライト、一酸化窒素などの窒素酸化物、ニトロソチオール反応物、ｌｉｐｉｄ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＬＰＯ）、マロンジアルデヒド、酸化ＬＤＬ及び酸化ＬＰ（ａ）、クレアトールＭＤＡ−ＬＤＬなどが挙げられる。
【００２２】
精神的ストレスマーカーとしては、例えば、コルチゾール、ノルエピネフリン、クロモグラニンＡ、ＩｇＡ及びβ−エンドルフィンが挙げられる。
【００２３】
その他の代謝物は、酸化還元反応を生じる化学物質であれば特に限定されないが、例えば、コレステロール、乳酸、クレアチニン、蛋白質、過酸化水素、アルコール、グルタミン酸、アルコールアミノ酸、フルクトサミン、グリセロール、アシル−コエンザイムＡ、チラミン、アミノ酸、グリコレート、ピリドキサール−４−、ソルボース、グロノラクトース、ガラクトース、ピラノース、尿酸、ピルビン酸、アスコルビン酸、アンモニア、トリメチルアミン、アセトン、エタン、ペンタン、水素、酸素、メタン、プロパン、ブタン、イソプレン、メルカプタン類がある。
【００２４】
以上のような方法において好適に用いられる電気化学センサ及び電気化学センサシステムの実施形態に関して、以下に説明する。
【００２５】
図１は、電気化学センサシステムの一実施形態の概略を示すブロック図である。図１に示す電気化学センサシステム１００は、作用電極２、対極３及び参照電極５を有する電気化学センサ１と、電気化学センサ１を検体中の分析対象化学物質の酸化還元電流が検出されるように制御する制御部１０とを備える。作用電極２、対極３及び参照電極５はそれぞれ制御部１０と電気的に接続されている。作用電極２は参照電極５を基準として所定の電位に維持されるように制御部１０によって制御される。そして、作用電極２と対極３との間の電流が制御部１０によって検出される。
【００２６】
本発明に係る電気化学センサシステムは、例えば図２に示す実施形態のように、参照電極を備えていなくてもよい。この場合、作用電極２の電位は対極３を基準として制御される。
【００２７】
図３は、電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。図３に示す電気化学センサ１は、第１の基板２１と、第１の基板２１の一方面において一方の端部近傍に設けられた作用電極２、対極３及び参照電極５と、作用電極２、対極３及び参照電極５にそれぞれ接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線２ａ，３ａ及び５ａと、第１の基板２１に接着された、作用電極２、対極３及び参照電極５が露出するような窓２５が形成されている第２の基板２２とから構成される。第２の基板２２は、リード線２ａ，３ａ及び５ａのうち第１の基板２１の他方の端部近傍以外の部分を覆っている。
【００２８】
作用電極２は、第１の基板２１上に形成された導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜であり、特に好ましくはＤＬＣ膜である。ＤＬＣ膜は、一般にダイヤモンド状炭素膜、ダイヤモンド様炭素膜、ダイヤモンドライクカーボン膜、又はｉ−カーボン膜とも呼ばれる。ＤＬＣ膜は主として炭素及び水素から構成され、ｓｐ３結合及びｓｐ２結合が混在する非晶質炭素膜である。一方、ダイヤモンド膜はダイヤモンド構造を有する結晶を含んだ膜であり、ＤＬＣ膜とはその構造が異なる。ＤＬＣ膜とダイヤモンド膜はラマン分光分析によって明確に区別できることが知られている。ラマンスペクトルにおいて、ダイヤモンド膜の場合１３３３ｃｍ−１に明確なピークが観測されるのに対して、ＤＬＣ膜の場合１３５０ｃｍ−１付近のＤｉｓｏｒｄｅｒｅｄバンドおよび１５５０ｃｍ−１付近のＧｒａｐｈｉｔｉｃバンドにブロードなピークが観測される。
【００２９】
ＤＬＣ膜は、好ましくは、１０〜４０原子％の水素と、３０〜８５原子％の炭素とを含む。ＤＬＣ膜が係る特定範囲の組成を有していることにより、適正な抵抗率を維持しつつ、電気化学センサとしての感度が改善される。また、水素がこの範囲で含まれると、膜中の炭素原子のうち水素終端のダングリングボンドを含むｓｐ３結合を形成するものの割合が高くなって、膜が非晶質化する。非晶質なＤＬＣ膜は、成膜温度が低く、均一な品質の成膜が容易であり、成膜速度も高いので、工業的な生産に有利である。
【００３０】
また、ｓｐ３結合の炭素を主体とするＤＬＣ膜は、電気化学反応によって酸化または還元される化学物質が吸着する過程が極めて少ないので、例えば水に起因する水素や水酸化物やそれらのイオンによる電極への吸着を経る内圏酸化還元反応が極めて起こりににくい。その結果、残余電流と言われるノイズ電流が極端に小さくなるので、検出対象である化学物質の電気化学反応を高ＳＮ比で検出することが可能である。
【００３１】
ＤＬＣ膜は、窒素、リン、ヒ素、アンチモン及びビスマスからなる群から選ばれる少なくとも１種の元素を含んでいてもよい。これらの元素が５〜３０原子％含まれることにより、ＤＬＣ膜がｎ型半導体膜となる。あるいは、ＤＬＣ膜は、ホウ素、ガリウム及びインジウムからなる群から選ばれる元素を更に含むんでいてもよい。これら元素が５〜３０原子％含まれることにより、ＤＬＣ膜がｐ型半導体膜となる。
【００３２】
ＤＬＣ膜は、０．０１〜２０原子％の酸素を更に含むことが好ましい。また、ＤＬＣ膜は０．００２〜１原子％の塩素を更に含むことが好ましい。塩素の割合が０．００２原子％以下であると、絶縁化が起こりにくくなる傾向があり、１原子％を超えると導電性が低下し易くなる傾向がある。
【００３３】
感度向上効果を特に顕著に得るために、ＤＬＣ膜の抵抗率は、好ましくは１０−３〜１０６Ωｃｍ、より好ましくは１０−３〜１０３Ωｃｍ、さらに好ましくは１０−３〜１０２Ωｃｍである。
【００３４】
ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚は、０．０１〜２０μｍが望ましい。ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚が０．０１μｍより薄いと作用電極の抵抗率が大きくなったり、ピンホールが生じやすくなる傾向がある。ピンホールが多く生じるとセンサ用の電極として正常に機能しなくなるおそれがある。また、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚が２０μｍを超えると、下地としての第１の基板２１が反ったりクラックが入ったりし易くなる傾向がある。さらに、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚が大きいと第１の基板２１と溶液の間における電流と抵抗との積に比例して生じる電圧降下が大きくなって、感度が低下し易くなる傾向もある。また、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚はセンサの小型化の観点からも出来るだけ小さいことが望ましい。同様の観点から、ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜の膜厚は、より望ましくは０．０５〜１０μｍ、更に望ましくは０．１〜５μｍである。
【００３５】
導電性のＤＬＣ膜は、例えば、第１の基板２１を加熱しながら、炭化水素ガスを含む原料ガスを用いた気相法により形成することができる。気相法としては、イオン化蒸着法及び高周波プラズマＣＶＤ法が好適である。原料ガスの組成、成膜の際の第１の基板２１の加熱温度、プラズマ条件を調節することにより、上述の特定組成を有するＤＬＣ膜を形成させることができる。具体的には、例えば、第１の基板２１の温度を１５０〜４５０℃に加熱しながら成膜することにより、１０〜４０原子％の水素と、３０〜８５原子％の炭素とを含むＤＬＣ膜が形成される場合が多い。
【００３６】
成膜の際、炭素源としての炭化水素ガスとともに、窒素ガス、アンモニアガス及びピリジン等の含窒素有機物、酸化ホウ素とアルコール類若しくはケト類、又はホウ素アルコキシドのようなガスを併用することにより、窒素、ホウ素等によりドープされたＤＬＣ膜が形成される。例えば、炭化水素ガスと、窒素ガスと、場合により水素、ネオン、ヘリウム、アルゴン及び酸素からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加ガスとを含む混合ガスを真空成膜装置内に原料ガスとして導入しながら、原料ガスに１３．５６ＭＨｚの周波数の電圧を印加してプラズマ化させ、プラズマ化した原料ガスから生成した炭化水素を堆積させる方法により、導電性のＤＬＣ膜を形成することができる。
【００３７】
作用電極２は、上記ＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜上に形成された機能膜を有していてもよい。この機能膜は、検体中の代謝物の電気化学反応を選択的に生じさせる酵素を含む。酵素の具体例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、グリセロールオキシダーゼ、アシル−コエンザイムＡオキシダーゼ、チラミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、グリコレートオキシダーゼ、ピリドキサール−４−オキシダーゼ、ソルボースオキシダーゼ、グロノラクトースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダ−ゼ、ウリカーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びビリルビンオキシダーゼが挙げられる。
【００３８】
グルコースオキシダーゼの作用により、電極に必要な電位が印加されたときに試料液中のグルコースがグルコン酸に酸化され、過酸化水素が発生する。このときフェリシアン化カリウム、フェロセン、１，１’−ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸及びフェロセンカルボキシアルデヒド等のフェロセン誘導体、ハイドロキノン、クロラニル及びブロマニル等のキノン類、または、フェリシアンイオン、オクタシアノタングステン酸イオン及びオクタシアノモリブデン酸イオン等の金属錯体イオンのようなメディエータを用いると、グルコースの濃度に比例した電流をＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜によって選択的且つ高感度に検知できる。
【００３９】
酵素を含む機能膜は、例えば、酵素及び必要によりメディエータ等の他の成分を含む溶液の膜をＤＬＣ膜またはダイヤモンド膜上に形成し、これを乾燥する方法により形成することができる。
【００４０】
第１の基板２１は、作用電極２、対極３及び参照電極５を支持する支持体である。第１の基板２１は、電気化学センサとしての使用に耐え得る物理的強度を有していればよい。
【００４１】
ＤＬＣ膜がｎ型半導体膜であるとき、第１の基板２１はｎ型結晶性シリコン基板であることが好ましい。これにより第１の基板２１とＤＬＣ膜との間にショットキー障壁などの界面抵抗が生じにくくなる。電気化学センサの検出電流は通常１ｍＡ以下程度の微小電流であることから、ＩＲドロップの発生が十分に防止される。同様の観点から、ＤＬＣ膜がｐ型半導体膜であるとき、第１の基板２１はｐ型結晶性シリコン基板であることが好ましい。
【００４２】
対極３は、電気化学反応において通常用いられる電極用の導電性材料から構成される。好ましくは、対極３は、白金及び金のような貴金属、または作用電極２と同様の導電性のＤＬＣ膜から構成される。
【００４３】
参照電極５は、典型的には、銀−塩化銀、又は水銀−塩化水銀から構成される。参照電極５はペーストを用いる方法により形成することができる。
【００４４】
リード線２ａ，３ａ，５ａは、銅等の導電性材料から構成され、メタルマスクを用いた通常の方法により形成することができる。
【００４５】
第２の基板２２は、第１の基板２１と同様の基板が用いられる。第１の基板２１と第２の基板２２は作用電極２等を間に挟んで接着剤により接着される。
【００４６】
図４は、参照電極を備えていない電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。図４に示す電気化学センサ１は、参照電極５及びこれに接続されるリード線５ａが形成されていないことの他は、図３の電気化学センサ１と同様の構成を有する。
【００４７】
図５、６は、皮膚に電流を印加するための印加電極を備えた電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。図５に示す電気化学センサ１は、作用電極２、対極３及び参照電極５を間に挟んで対向配置された１対の印加電極５１，５２と、印加電極５１に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５１ａと、印加電極５２に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５２ａとを備える。その他の構成は図２、３の電気化学センサと同様である。印加電極５１，５２により、作用電極２が接触している部分の皮膚に対して電流が印加される。同様に、図６に示す電気化学センサ１は、作用電極２及び対極３を間に挟んで対向配置された１対の印加電極５１，５２と、印加電極５１に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５１ａと、印加電極５２に接続されるとともに第１の基板２１の他方の端部まで延在するように第１の基板２１上に形成されたリード線５２ａとを備える。
【００４８】
体外侵出液の抽出及びその代謝物濃度の測定は、電気化学センサ１の窓２５内の部分を皮膚に押し当てながら、印加電極５１，５２間に所定の直流電流又はパルス電流を印加して行われる。
【００４９】
電気化学センサシステム１００を構成する制御部１０は、例えば、作用電極２の参照電極５に対する電位を制御するポテンシオスタットと、作用電極２と対極３との間に流れる電流を計測する電流計と、ポテンシオスタット及び電流計を制御するプロセッサと、ポテンシオスタット及び電流計を制御するためのソフトウエアとから構成される。プロセッサ（ＣＰＵ＝中央演算装置）は、上記ソフトウエアを実行することにより、ポテンシオスタット及び電流計を制御する。ポテンシオスタットは、作用電極２の電位を検体中の分析対象化学物質に固有の酸化還元電流が適切に検出されるような所定の電位に維持するように制御される。また、プロセッサは、所定の電位における検体中の分析対象化学物質の濃度と酸化電流値との関係に関する検量線を読み込んでこの検量線に基づいて検体中の分析対象化学物質の濃度を算出する。電気化学センサシステム１００は、算出された結果を表示するモニターを備えていることが好ましい。
【００５０】
図７は、抽出された体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法の一実施形態を示すフロー図である。ステップＳ１では予め作成された検量線データがプロセッサに読み込まれる。ステップＳ２で作用電極を所定の電位Ｅｎに保持し、ステップＳ３で作用電極−対極間の電流値Ｉｎを電圧印加の開始から所定の時間ｔｎ秒後に測定する。ステップＳ４で電流値Ｉｎを読み込み、ステップＳ５で検量線からの内挿に基づいて検体である体外侵出液中の代謝物の濃度Ｃが算出される。ステップＳ６で算出結果の妥当性を判断し、妥当であればステップＳ７で結果が表示される。算出結果が妥当でないと判断された場合、ステップＳ２に戻る。
【００５１】
このような電気化学センサシステムによれば、体外侵出液中の代謝物に固有の酸化還元電位を利用した電位設定により、複数種の代謝物を分離して検出することが可能である。この点で本実施形態に係るシステムは、複数種の代謝物を区別して検出することができない半導体式センサよりも優れる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１
ｎ型（１００）面単結晶シリコンウエハを、対向して配置された電極を備える真空成膜装置内に置いた。そして、シリコンウエハを２００℃に加熱しながら、原料ガスとしてエチレン及び窒素を５：５ｓｃｃｍで導入し、１３．５６ＭＨｚの周波数で５００Ｗの電力にて真空装置内をプラズマ化させることにより、シリコンウエハ上に導電性のＤＬＣ膜を形成させた。形成されたＤＬＣ膜の抵抗率は０．３Ωｃｍであり、その組成は水素１０原子％、窒素５原子％、炭素８５原子％であった。ＤＬＣ膜を成膜したシリコンウエハを５ｍｍ角に切り分けて、ｎ型単結晶シリコン基板上にＤＬＣ膜が形成されたチップを得た。
【００５４】
次いで、酵素として２Ｕのグルコースデヒドロゲナーゼ、補酵素として０．０２５ｍｇのフラビンアデニンジヌクレオチド、及びメディエータとして０．０２５ｍｇフェリシアン化カリウムを、ｐＨ７．２の０．０５Ｍリン酸緩衝溶液５μＬに溶解させた。得られた溶液を導電性ＤＬＣ膜上に適下し、更に、ｐＨ７．２の０．０５Ｍリン酸緩衝溶液を用いて調製した１ｗｔ％ウシアルブミン溶液１μＬ、２０ｗｔ％グルタルアルデヒド溶液１μＬを順に適下した。その後、３０℃、湿度１０％の環境で３０分乾燥させて、ＤＬＣ膜上に機能膜を形成させた。
【００５５】
ＤＬＣ膜を作用電極として用い、銀／塩化銀ペーストの印刷により参照電極としての銀−塩化銀電極を形成し、対極としてのＤＬＣ膜を上記と同様の方法で形成して、図１に示すような回路を有する電気化学センサを構成した。
【００５６】
作製した電気化学センサを、駆動用ソフトウェアが読み込まれたプロセッサによって制御される自作ポテンシオスタットに接続し、作用電極−対極間に流れる電流値が計測されるように電気化学センサシステムを構成した。駆動用ソフトウェアは検出電位を参照電極に対して１．２Ｖとなるように設定した。
【００５７】
０．０５Ｍリン酸水素ニナトリウム−リン酸ニ水素カリウムによるｐＨ７．２の緩衝溶液にグルコースを３ｍＭの濃度で溶解したグルコース溶液を準備し、そこに電気化学センサを浸して電流値を測定した。また、ブランクとしてグルコースを溶解していない緩衝液の電流値も測定した。測定結果から算出されたグルコース濃度を、ＳＮ比とともに表１に示す。
【００５８】
実施例２〜５
実施例１と同様の方法で、エチレンと窒素ガスの導入比率を変化させることにより、組成の異なる導電性のＤＬＣ膜をシリコン基板上に形成させた。これ以外は実施例７と同様にして、電気化学センサ及び電気化学センサシステムを準備した。得られた電気化学センサを用いて実施例１と同様にグルコース濃度の測定を行った。結果を表１にまとめて示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
比較例１
作用電極として白金板を用いたことの他は実施例１と同様にして電気化学センサシステムを準備し、グルコース濃度を測定した。グルコース濃度の計算値は２．８ｍＭであり、ＳＮ比は６．７であった。
【００６１】
比較例２
作用電極としてグラシーカーボンを用いたことの他は実施例１と同様にして電気化学センサシステムを準備し、グルコース濃度を測定した。グルコース濃度の計算値は２．７ｍＭであり、ＳＮ比は７．７であった。
【００６２】
【表２】
【００６３】
実施例６
印加電極を更に形成したことの他は実施例１と同様にして、図５に示される実施形態と同様の構成を有する電気化学センサを準備した。
【００６４】
得られた電気化学センサを用いて、血液から採取した血漿、涙液、唾液及び皮膚からの体外侵出液中のグルコース濃度を測定した。体外侵出液中のグルコース濃度の測定は、被験者の皮膚に対極及び印加電極を押し当てながら、印加電極間に周波数、デューティー比、パルス電流密度の各パラメータを表３の実施例６−１〜６−５に示す値に設定したパルス電流、又は実施例６−６〜６−８に示す直流電流を印加することにより捕捉した体外侵出液を対象にして、行った。刺激感については、直流３ｍＡ／ｃｍ２の電流印加の際の刺激感を１００として、体外侵出液測定の際の刺激感の大きさを被験者の判断に基づいて相対的に評価した。
【００６５】
比較例３
作用電極として白金板を用いたことの他は実施例６と同様の構成を有する電気化学センサを比較例３として準備し、同様のグルコース濃度測定を行った。
【００６６】
比較例４
実施例６と同様の電気化学センサにて、血液から採取した血漿、涙液、唾液及び皮膚からの体外侵出液中のグルコース濃度を測定した。体外侵出液中のグルコース濃度の測定は、被験者の皮膚に対極及び印加電極を押し当てながら、印加電極間に周波数、デューティー比、パルス電流密度の各パラメータを表３の比較例４−１〜４−２に示す値に設定したパルス電流、又は比較例４−３〜４−５に示す直流電流を印加することにより捕捉した体外侵出液を対象にして、行った。
【００６７】
更に、血液から採取した血漿、涙液、唾液中のグルコース濃度をヘキソナーゼ法により測定し、その値を比較のため表３に示した。
【００６８】
【表３】
【００６９】
表３に示されるように、実施例６はヘキソナーゼ法の結果をよく再現したが、比較例３は測定誤差が大きかった。また、比較例４−１、４−２、４−４、４−５は測定精度は良好であったものの、皮膚への刺激感が大きかった。０．１μＡ／ｃｍ−２を下回る直流電流を印加した比較例４−３は皮膚刺激は小さいものの、体外侵出液の捕捉量が少ないためにグルコース濃度を測定することができなかった。
【００７０】
実施例７
実施例６で用いた電気化学センサを用いて、経皮的抽出可能なデバイス（内容詳細は特許３３２８２９０の２３列２０行〜２４列４行の実施例１、図１Ａ〜Ｃに準じる。）を作成し、センサを皮膚に当て、印加電極に２μＡ／ｃｍ２の直流電流を通して体外侵出液を捕捉し、次いでセンサによって体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７１】
実施例８
周波数１０ｋＨｚ、デューティー比２５％、パルス電流密度２ｍＡｃｍ−２のパルス電流を印加したことの他は実施例７と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７２】
比較例５
０．３２ｍＡ／ｃｍ２の直流電流を印加したことの他は実施例７と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７３】
比較例６
白金電極を作用電極として有する比較例３の電気化学センサを用いたことの他は実施例７と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７４】
比較例７
０．３２ｍＡ／ｃｍ２の直流電流を印加したことの他は比較例６と同様にして、体外侵出液のグルコース濃度を測定した。
【００７５】
上記実施例及び比較例において、体外侵出液のグルコース濃度測定の際の刺激感を、比較例５（０．３２ｍＡ／ｃｍ２）の場合を１００として、刺激感の大きさを被験者の判断に基づいて相対的に評価した。皮膚から体外侵出液を抽出する速度を示すフラックスの測定も行った。さらに、それぞれの電気化学センサを用いて、別途血液採取しその中の血漿中のグルコース濃度も測定した。
【００７６】
【表４】
【００７７】
表４に示されるように、患者の皮膚への刺激感は、直流２μＡ／ｃｍ２やパルス電流では軽減できた。２μＡ／ｃｍ２のような微弱な直流電流で体外侵出液の採取量が少ない場合であっても、実施例７のように導電性のＤＬＣ膜を用いれば、白金を用いた比較例６に比べグルコース濃度を感度よく検出できる。さらにパルス電流では体外侵出液を抽出する速度を表すフラックスが優れており、患者の刺激感を抑えつつ、高い感度で測定が可能であることがわかった。なお、本発明は、グルコースのみならず、電気化学反応による検出が可能な全ての代謝物に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】電気化学センサシステムの一実施形態を示すブロック図である。
【図２】電気化学センサシステムの一実施形態を示すブロック図である。
【図３】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図４】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図５】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図６】電気化学センサの一実施形態を示す平面図である。
【図７】体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法の一実施形態を示すフロー図である。
【符号の説明】
【００７９】
１…電気化学センサ、２…作用電極、３…対極、５…参照電極、１０…制御部、２１…第１の基板（支持体）、２２…第２の基板、５１，５２…印加電極、１００…電気化学センサシステム。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学センサの作用電極であって導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する当該作用電極を皮膚に接触させながら、そこにパルス電流又は０．１〜１０μＡｃｍ−２の直流電流を印加することにより体外侵出液を抽出し、抽出された体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、
当該作用電極に接触している前記体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップと、
を備える、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法。
【請求項２】
前記パルス電流が、周波数１〜１００ｋＨｚ、デューティー比５〜３０％若しくは６５〜８５％、パルス電流密度０．０００１〜１０ｍＡｃｍ−２である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する作用電極を備え、請求項１又は２記載の方法によって体外侵出液の代謝物濃度を測定するための電気化学センサ。
【請求項４】
請求項３記載の電気化学センサと、該電気化学センサにおいて生じる酸化還元電流を検出する制御部と、を具備する電気化学センサシステム。
【請求項１】
電気化学センサの作用電極であって導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する当該作用電極を皮膚に接触させながら、そこにパルス電流又は０．１〜１０μＡｃｍ−２の直流電流を印加することにより体外侵出液を抽出し、抽出された体外侵出液を当該作用電極に接触させるステップと、
当該作用電極に接触している前記体外侵出液の代謝物濃度を当該電気化学センサによって測定するステップと、
を備える、体外侵出液の代謝物濃度を測定する方法。
【請求項２】
前記パルス電流が、周波数１〜１００ｋＨｚ、デューティー比５〜３０％若しくは６５〜８５％、パルス電流密度０．０００１〜１０ｍＡｃｍ−２である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
導電性のＤＬＣ膜又は導電性のダイヤモンド膜を有する作用電極を備え、請求項１又は２記載の方法によって体外侵出液の代謝物濃度を測定するための電気化学センサ。
【請求項４】
請求項３記載の電気化学センサと、該電気化学センサにおいて生じる酸化還元電流を検出する制御部と、を具備する電気化学センサシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−１６８６２２（Ｐ２００９−１６８６２２Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７１３４（Ｐ２００８−７１３４）
【出願日】平成２０年１月１６日（２００８．１．１６）
【出願人】（０００００３０６７）ＴＤＫ株式会社 (7,238)
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１６日（２００８．１．１６）
【出願人】（０００００３０６７）ＴＤＫ株式会社 (7,238)
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