低分子サポート多能性細胞成育およびその方法
本発明は未分化多能性幹細胞培地物を維持する組成物および方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
この出願は米国特許法に基づき2009年4月27日に出願した米国仮出願番号61/172,998の優先権の利益を請求する。その全体の開示は本明細書中に参考として援用する。
【0002】
本発明は低分子神経伝達物質(small molecule neurotransmitters)を少なくとも一部含む多能性幹細胞培地(pluripotent stem cell media)に関する。本発明は、特に、本質的には血清とフィーダを含まない定義された(defined)多能性幹細胞培地であって、少なくともノルエピネフリン、アセチルコリン、およびドーパミンの1つを含み、多分化能ヒト幹細胞の懸濁細胞凝集培養(suspension cell aggregate culture)をサポートする培地に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
多分化能ベース細胞補充療法の最終的な用途は、大量培養を可能にする方法と規制ガイドラインに対応する分化条件の発達を必要とするだろう。
【0004】
アメリカ合衆国では、食品医薬品局(FDA)はレビューワーのためのガイダンス案の形でガイダンスを発行した:ヒト体細胞治療治験新医薬品承認申請(INDs)の化学、製造、およびコントロール(CMC)レビューワーのための指示およびテンプレート;21CFR§1270および§1271の規定。ヨーロッパでは、細胞治療生産物のための要件が人間の胚幹(hES)細胞に適切な、いくつかの指示とガイドラインに概説されている。指示2004/23/EC、指示委員会 2006/17/ECおよび2006/86/E、EU 規定1394/2007、ガイドラインEMEA/CHMP/410869を参照。これらは本明細書に参考として全体を援用する。各国には、人体組織および細胞の寄付、調達、試験、処理、保存、貯蔵および分配を含む品質と安全についての標準規制がある。規制は開発、製造および品質管理、並びに細胞ベースの医薬品の非臨床の、および臨床の開発のためのガイドラインを確立する。C. Unger et al.(2008),Human Molecular Genetics 17(R1):R48-R53を参照されたい。
【0005】
規制ガイドラインは製造規模生産幹細胞とそれの生産物のために多くのハードルを作る。例えば、未分化状態で生体外に多能性細胞を維持するために、調査研究はまだマウス胎児線維芽細胞(MEF)フィーダーやウシ胎仔血清(FBS)などの畜産物を使っている。多分化能を維持するための他の細胞培養条件は、KnockOut(登録商標)Serum Replacer(KSR;Invitrogen)などの血清代用品を含んでいる。Serum Replaceは、より定義されているが、未知化合物や、ウシ血清アルブミン(BSA)、ウシ血清の脂質豊富なアルブミン分画(AlbuMAX)などを含む複雑なクルードの混合物を含む。さらに、血清バッチは彼らの活性、したがって、彼らの多分化能の未分化型細胞培養を維持する能力において異なる。したがって、非動物由来の(「異物性なし(xeno-free)」)定義された成分でのウシ血清の置換は、多能性細胞のGMP生産のために好ましい。
【0006】
出願人は、以前に、IGF1、インシュリン、ERBB2、およびERBB3 受容体の活性化が、増殖性hES細胞の顕著な特徴であることを決定した。IGF1R/IR活性化は、血清中のIGF1または、例えばさまざまな生育条件における血清代用品またはN2/B27細胞培養サプリメント中のマイクログラム/ml濃度のインスリンの結果と考えることができた。これらの活性は強いPI3キナーゼ/AKT信号を提供する、そして、LR3−IGF1、IGF1類似物の低い濃度で同等な活性化が実現できた。McLean et al., 2007 Stem Cells 25, 29-38を参照。ERBB2/3のリン酸化はMEF−CM中のEGFファミリーメンバー、ヘレグリン/ニューレグリンの活性と一致していた。Wang et al., 2007 Blood 110, 4111-9を参照。アクチビンおよびFGFシグナリングの低分子阻害剤のように、hES細胞のIGF1RおよびERBB2の影響を受けた自己再生の阻害が起こる。Robins and Schulz, 2009, “Novel methods of Stem Cell Culture and Maintenance:Media and extra cellular matrix requirements for large scale ESC growth.”を参照。Emerging Technology Platforms for Stem Cells (eds. U. Lakshmipathy J. D. Chesnut and B. Thyagarajan, pp. 251-247) Hoboken.John Wiley & Sons Inc.;and Vallier et al., 2005 J Cell Sci 118, 4495-509)を参照。この定義された培地は開発されDC−HAIFと呼ばれた。これはDMEM/F12、非必須アミノ酸、微量元素、アスコルビン酸、β−メカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシン(任意)からなり、タンパク質はカプリル酸で抽出された脂肪酸のないBSA、鉄結合性グロブリン、組換え型のヘレグリン−1β(H)、アクチビンA(A)、LR3−IGF1(I)、およびFGF2(F)のみである。DC−HAIFは多分化能hES細胞の長期維持、および単独細胞継代、ACCUTASE(登録商標)を使用したスケーリングされたhES細胞のエキスパンションをサポートした。上記のRobins and Schulz (2009) ; 上記のWang et al.,を参照。StemPro(登録商標) hES細胞SFMという商号でLife Technologies社のライセンスの下で販売される、DC−HAIFのバッチ試験用の市販の配合物が利用可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
まだ、代替および/または追加の、例えば、hES、iPS細胞のような、多能性幹細胞における重大な機能を有するシグナリング経路を同定する必要性は残っている。それは治療目的で使用できる。培養組成物は、GMP規格に定義されおよび/または製造される。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は少なくともノルエピネフリンとドーパミンを含み、血清を本質的に含まない、多能性細胞成育のための基本栄養塩溶液を含む組成物に関する。
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】hES細胞における化合物スクリーニングで同定された神経伝達物質/ホルモン受容体の拮抗体/モジュレータを示す。一次的なライブラリスクリーニングのアルカリホスファターゼ(AP)染色は細胞への影響、無し(+++集密的に成長)、中程度の効果(++)、または大きな効果(+)を示す。細胞がまれ(+/−)、細胞無し(−)も示す。一次的なスクリーニングで同定された受容体アンタゴニストも示されている(左のコラム)。スクリーニングは、10マイクロMの化合物を使用して実行された。二次的投与量滴定分析が示される(50−0.1 マイクロMのカラム)、およびそれぞれの化合物と動作により標的にされた受容体のクラスを示す。
【0010】
【図2】hES細胞(例えば、BGO2 細胞)の低密度平板培養アッセイ。10000細胞/ウェルで、StemPro(登録商標) hESC SFM培地(Life Technologies社)中、6−ウエルトレイ内で培養され、7日後にアルカリホスファターゼ(AP+)染色された。Y(Y27632)、ACh(アセチルコリン)、NMDA(N−メチル−D−アスパラギン酸)、NE((−)−ノルエピネフリン)、NE.Bit((+/−)−ノルエピネフリン(+)−酒石酸水素塩)。化合物は示されるように10または50マイクロMで加えられた。
【0011】
【図3】hES細胞の低密度平板培養アッセイ。(A)200−10000細胞/ウエルで、StemPro(登録商標) hESC SFM培地中、またはStemPro(登録商標) hESC SFM+50マイクロM NEもしくは+50マイクロM−ACh中、6−ウエルトレイ内で培養され、8日後にアルカリホスファターゼ(AP+)染色された。比較コロニー計数値を示す。ACh(アセチルコリン)、NE((±)ノルエピネフリン(+)酒石酸水素塩)。(B)平板培養から低細胞濃度で導かれて、NEまたはACh(5日目の)によってサポートされたhES細胞コロニーの未分化型形態。
【0012】
【図4】RT−CESインピーダンスリーダーを使用するNEとAChの滴定。1000 hES細胞/ウェルで、低分子の示した濃度(マイクロM)を含むStemPro hESC SFM内で培養された。そのようなアッセイでは、細胞指標が上昇するタイミングは、低密度で生き残っていて、膨張する細胞の割合に関連する。一般に、NEとAChの濃度の増加が、細胞指数を速く上昇させる。約160時間におけるインピーダンスのスパイクは、人為的事象および誤りである。
【0013】
【図5】低い細胞濃度検定方法における、低分子類化合物の組み合わせの効果。(A)1000hES細胞/ウエルで、50マイクロM(NE、ACh、アデノシン、GABA)または10マイクロM(Y27632)の低分子を含むStemPro hESC SFM中で培養された。アッセイは、5日間RT−CESシステムを使用して行われた。トレースの4つのグループが観測された:最も効果的な化合物/組み合わせは、NE/アデノシンと、NE/AChであった。中間的グループは個別要素としてはNEとAChであり、他のいくつかの組み合わせを含んでいた。低水準グループはアデノシン、GABA単独と、いくつかの有効でなかった要素/組み合わせであった。(B)観察された活性の要約。相対格付け(−から+++)は、低密度の成長におけるサポートの有効性を示し、灰色の欄は相乗作用を示し、黒い欄は拮抗を示す。
【0014】
【図6】hES細胞の低密度生存をサポートする追加の神経伝達物質と関連化合物。1000hES細胞/ウエルで、ヘレグリン(Heregulin)、IGF1、およびアクチビン(HIA)と示された低分子を含むStemPro hESC SFM中でプレートされた。(A)低密度生存をサポートする追加アデノシンとアドレナリン受容体(Adrenoceptor)アゴニストの同定。化合物は10マイクロMでテストされた。DMSOトレースは平均8つのウェルである。(B)同定された化合物の情報について表にした。(C)hES細胞の、ドーパミン、ホモバニリン酸(HVA)、およびセロトニンでサポートされた低密度生存。化合物は示した濃度でテストされた。約160時間におけるインピーダンスのスパイクは、人為的事象および誤りである。
【0015】
【図7】アクチビンの非存在時の改良された低い細胞濃度生存。1000hES細胞/ウエルで、示された増殖因子と低分子の組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)。
【0016】
【図8】低密度生存/コロニー形成へのアクチビンの効果のコロニー計数法アッセイ(A)10000hES細胞が示された増殖因子と低分子の示された組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養された。7日後にアルカリホスファターゼ活性染色された。AP+コロニーが数えられた。明確に、アクチビンが低密度培養に持っているネガティブ効果が示された。(B)それぞれの増殖因子背景における、+NEと+ACh条件の顕微鏡写真。アクチビンがないとき、コロニーは非常に堅固で未分化細胞の原型であった。
【0017】
【図9】増殖因子と神経伝達物質の組み合わせの低密度RT−CES検定方法1000hES細胞/ウエルは示された増殖因子と低分子の示した組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)。低分子は50マイクロMでテストされた。
【0018】
【図10】hES細胞の浮遊培養におけるNEとAChの効果(A)5×106のCyT49細胞が、ローアタッチメント6ウェルのトレーに、50マイクロMで、ヘレグリン、LR3−IGF1、アクチビン、および示した神経伝達物質を含む5mlのStemPro hESC SFM内にシードされて、100rpmで培養された。未分化型懸濁集団は4日目に画像化された。(B)それぞれの条件で、シード後24時間で2つのウェルが収穫され、生存細胞数を測定するために数えられた。(C)培養が4日目に分割されたときのそれぞれの条件の細胞数。(D)(A)におけるイメージは、ImageProソフトウェア計測ツールを使用することで集団直径を決定するのに使用された。それぞれの条件からの50−100集団からの平均直径と標準偏差が示されている。(E)1継代細胞計算データ(A)のp0細胞からの5×106のCyT49 hES細胞が同じ条件でシードされた。Y27632を含む条件における集団はより大きく、最も大きい集団のセンターが壊死性になる前に、シード後3日で継代しなければならなかった。逆に、他の条件は継代の前に6日間培養され、より多い細胞数をもたらした。
【0019】
【図11】懸濁hES細胞がNE、NE/AChまたはNE/AChで培養され、未分化型のままで残っていた。CyT49細胞はNE、NE/AChまたはNE/AChの存在下で懸濁集団として、分化モルホロジーなしで16継代育てられた。p10の後に、いくつかの細胞が、接着培養に再プレートされ、OCT4とTra−1−61について核型分析および免疫けい光染色によって調べられた。すべての培養が未分化型のままで残って、これらの多分化能マーカーが均一に発現した。(SP)StemPro SFM HIA、NE(+50マイクロMにおけるNE)、ACh(+50マイクロMにおけるACh)、NE/ACh(+50マイクロMにおけるNE/ACh)。核型データは右に示されている。SPとSP+NE培養は核型的に正常であった。ACh含有培養物は異数体であった。
【0020】
【図12】標準密度の短期間インピーダンス検定方法でのhES細胞(例えば、BG02)をサポートするNEと成長因子の組み合わせ(A)104BG02細胞/ウエルで50マイクロMのNEと増殖因子の示した組み合わせを含むStemPro hESC SFM含有培地で培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、FGF2(F)。低細胞濃度における結果と対照的に、NEはいくつかの条件ではヘレグリンの非存在下で培養のエキスパンションをサポートした。そのような支持性組み合わせはNE/AIF、NE/IF、NE/IA、およびNE/Iを含む。(B)50〜60時間(Aのライン)の平板培養後の細胞指数の傾斜の測定値が示されている。最小量の増殖だけを示している条件(NE/F)と比べて、他の条件は細胞指数の有効な増大を示した。これは集団のエキスパンションを示している。
【0021】
【図13】標準の密度でhES細胞(例えば、BG01細胞)の連続継代をサポートするノルエピネフリンと増殖因子の組み合わせ。連続培養の間のhES細胞の相対エキスパンション。5×105のhES細胞ウエルが、6ウェルトレーの中で50マイクロM NEと示した増殖因子の組み合わせを含むStemPro hESC SFM培地で、それぞれの継代において培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、FGF2(F)。エキスパンションをサポートした条件について、それぞれの継代の最後の細胞数がプロットされる。二重破線はそれぞれの継代で培養された細胞数を表す。HAIFコントロール培養と比べて、ヘレグリン(AIF)の欠如は多継代で成長を減少させた。コロニー増殖は、ウェルの密にパックされた外側のリングで観測されたが、皿全体に観測されたというわけではない。IFだけに露出された培養物は、2継代の後に有効に維持できなかった。この細胞ラインのアクチビン/ノーダルシグナリングの必要が確認された。NEの存在はAIF条件における増殖へ実質的に肯定的な影響を持ち、HAIF条件に類似する培養増殖と形態も可能にした。NEはアクチビン/ノーダルの要求の代わりをすることができなかった。いくつかの継代にわたってIF/NE条件では分化したからである。
【0022】
【図14】標準の密度でhES細胞の連続継代をサポートするノルエピネフリンと増殖因子の組み合わせ。連続培養の間のhES細胞の相対的エキスパンション。5×105hES細胞/ウエルで、6ウェルトレー中で、50マイクロMのNEと示した増殖因子混合物を含むStemPro hESC SFMにおいてそれぞれの継代において培養された。それぞれの継代の最後の細胞数がプロットされた。二重破線はそれぞれの継代でプレートされた細胞数を表す。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、FGF2(F)。また継代2では、AIF培地がAIまたはAI/NEの余分なウェルをセットするために使用された。HAIFコントロール培地と比べて、ヘレグリン(AIF)の欠如は形態変化をもたらした。細胞は未分化細胞の特性を保有したが、外観では、それらは、より平坦であって、より大きかった。細胞の間には、より大きなギャップがあった。同様の形態はすべてのアクチビン(ヘレグリンの非存在下)含有培地で観測された。IFにおけるコロニーは、非常に堅固でドーム型であり、標準のマウス胚性幹細胞培養物の形態とより類似していた。IF/NEおよびIF/NE/ノギン中の培養物は例外的な形態を示し、堅固な上皮性のコロニーを有し明白な未分化を示さなかった。
【0023】
【図15】NEと単純化された増殖因子の組み合わせを含む定義された培地でのhES細胞連続継代における多分化能マーカーの発現。説明したように(図14)、4つの継代で培養された人間の胚性幹細胞は、スライド上で培養され、エキスパンドされ、示したマーカーについて免疫染色された。IF中、IF/NE中(並びにAIFおよびAIF/NE、図示せず)でエキスパンドした培養物は、OCT4、SOX2、SSEA4およびTRA−1−60をはじめとする、多分化能のマーカーの発現の予想されたプロファイルを保有した。
【0024】
【図16】hES細胞および膵性内胚葉への分化の間における、アドレナリン受容体発現のqPCR分析。遺伝子名は識別子に使用される(例えば、ADRA1Aはalpha1A−アドレナリン受容体を示す)。膵臓の分化のためのhES細胞試料が、1日ごとの分化について示される:d0、未分化 hES細胞;d2/3 内胚葉分化;d5/7 原始腸管;d7/9 後期前腸;d11 膵臓内胚葉。 チャートはd0 hES細胞試料の倍率として示されている。このサンプルのためのしきい値交差ポイントは、異なったアドレナリン受容体の間の相対発現水準を示唆するために示される。BG01、BG02、およびCyT49細胞を含むhES細胞に関する追加サンプルが示される。ADRB1、ADRB2、ADRA2B、およびADRA1Dは、未分化型hES細胞において最も多いアドレナリン受容体を発現し、最も一貫しているように見えた。ADRA2Cは、hES細胞試料中で一貫して発現されるが、低レベルで発現されるのに対し、ADRA1AとADRA1Bは単に低水準であり、または未分化細胞中で一貫性無く検出されただけである。
【0025】
【図17】アドレナリン受容体の阻害は低密度でhES細胞の生存とエキスパンションに影響を与える。2000BG02細胞/ウエルの低密度培養が、ヘレグリン、アクチビン、LR3−IGF1、および50マイクロM NEを含むStemPro hESC SFM内で培養され、7日間インピーダンスリーダー内でモニターされた。それぞれのコントロールの8つのウェルが含まれ、DMSO(ネガティブコントロール)、またはDMSO/50マイクロM NE(NEコントロール)が含まれた。アルファまたはベータアドレナリン受容体の40個の異なった阻害剤が、低密度でhES細胞のNE媒介性生存/エキスパンションへのネガティブ効果をくつがえすことができるかどうか、2回づつテストされた。7つのアドレナリン受容体拮抗薬(Ant.)、5つのβ−アドレナリン受容体拮抗薬、および2つのβアドレナリン受容体遮断薬が、hES細胞に影響を与えたと同定された。それぞれの活性物質の名前、活性、知られている選択性、および説明を示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
低密度でhES細胞内で重要な機能を有する追加シグナリング経路にハイライトを当てるために、公知の生理活性を有する化合物の低分子ライブラリが、培養エキスパンションおよび/または、多分化能に否定的な影響を与えるものを同定するためにスクリーニングされた。主要な系路の阻害がそのようなアッセイにおける遅くされた増殖、細胞障害性、アポプトーシスまたは分化をもたらすと予想されるだろう。重要なことには、このスクリーニングは単純に定義された培地を背景として実行され、血清または準分別されたアルブミンなどの未定義の、または、可変な成分によって典型的に導入される非一貫性を抑制した。単純なアルカリ性ホスファターゼ染色アッセイが、hES細胞成育に影響を与えた約50の化合物を決定するのに使用された。細胞表面神経伝達物質受容体の多数の阻害剤は同定され、これらの受容体について自己再生シグナリングの役割を示唆した。天然由来のリガンドまたは薬品作用関連誘導体を使用して、数種類の低分子神経伝達物質(また、ホルモンまたはモジュレータ(modulator)として機能できる)は、低密度で育てられたhES細胞の生存および/または、エキスパンションをサポートすることがわかった。hES細胞の商業的、そして、臨床の用途に関して開発される先進技術にそのような活性は重要である場合がある。これらの例としては、たとえば信頼できる単独細胞クローニング、完全に定義されて、GMP対応条件下の新しいhES細胞ラインの効率的な導出や、継代時の懸濁培養におけるhES細胞の成長や向上した生育性などがあげられる。
【0027】
定義
特記のない場合、本願発明明細書で使用される用語は、関連技術における当業者によって理解される通常の使用法による。また、以下に提供された用語の定義に加えて、分子生物学の一般的な定義は以下に見られる。Rieger et al., 1991 Glossary of genetics:classical and molecular, 5th Ed., Berlin:Springer-Verlag;Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 補足)。単数形の表記が明細書と特許請求の範囲において使用される場合、それが使用されている文脈に基づいて、1つまたはそれ以上の意味であることが理解されるべきである。したがって、たとえば、「細胞」は少なくとも1つ、2つまたは多数の細胞を意味することができる。
【0028】
また明細書および特許請求の範囲において、特記の無い限り、成分の量、物質の割合または比率、反応条件および他の数値については、すべての場合に“約”という用語によって修飾されるものとして理解される。反する記述のない限り、明細書および特許請求の範囲において記載される数値パラメータは近似値であり、本発明により得られることが求められるものに応じて変化することができる。少なくとも、特許請求の範囲について均等論の適用を制限するものではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも有効数字として報告されており、通常の丸めの技術によっている。
【0029】
「約」という本明細書に使用される用語は、“約”が付された数が、示された数字のプラスマイナス1−10%を含むことを意味する。例えば、約50のヌクレオチドは、45−55のヌクレオチドまたは状況に依存して49−51のヌクレオチドを意味できる。本明細書では、「45−55」などの数値範囲は、範囲内のそれぞれの整数を呼ぶ。例えば、「45−55%」は、割合が45%、46%、などと増え、55%を含むことを意味する。本明細書に記載された範囲内が、たとえば「1.2%から10.5%」のように小数点を含む場合、その範囲は特定の範囲内で示した中で最も小さい増分のそれぞれの少数値について言及する。例えば、「1.2%から10.5%」の場合には、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、であることができ、10.5%を含む。また「1.20%から10.50%」は、1.20%、1.21%、1.22%、1.23%であることができ、10.50%を含む。
【0030】
また、典型的な製造規模の懸濁培養は細胞濃度を最大にしつつ、細胞生存率を維持するための方法として培地の連続かん流(continuous perfusion)を利用する。このような関係においては、培地交換は接着細胞と懸濁集合体に異なった影響の流体せん断を与える。培地流れが細胞表面を横切って流れるとき、不動化された接着細胞は流体せん断応力を受けることがある。対照的に、懸濁集合体は集合体表面を横切るせん断応力をほとんど受けない。集合体が適用されたせん断力に対応して自由に崩れることができるからである。長期間のせん断応力が接着胚性幹細胞に有害であり、懸濁している集合体の形式が最適な生存および機能のために好しいことが予想される。多能性幹細胞、および/または、多能性幹細胞(pluripotent stem cells)から由来されるマルチポーネント前駆細胞(multipotent progenitor cells)の生産のための効率的な製造プロセスと、せん断速度とせん断応力に関連する上記の観測された機構の必要性に基づく必要性が存在している。本発明は、初めて多能性幹細胞の製造方法、および/または、懸濁液形式、特には細胞集合体懸濁液形における多能性幹細胞から誘導されたマルチポーネント前駆細胞の生産のための製造方法を提供する。
【0031】
本明細書において使用される時、「単独細胞懸濁液(single cell suspension)」またはその同等な表現は、すべての機械的、生物学的または化学的手段により調製することができる、流体と細胞の混合物、より典型的には流体と互いに分離された複数の細胞の混合物を意味する。本明細書における単独細胞懸濁液は典型的には、生理学的溶液、たとえば基本塩類溶液、塩水、細胞培地、または同様のものなどの中に懸濁された生育可能なhES細胞またはhES−由来の細胞を含むものをいう。細胞集塊を解離して、第1次組織、培養物中の接着細胞および集合体から、単独細胞懸濁液を形成するためにはいくつかの方法が存在し、例えば、物理的力(細胞スクレーパ、狭口径ピペット、細針吸引、渦離解、および細かいナイロンまたはステンレスメッシュを通した強制濾過などによる摩砕などの機械的な解離)、酵素(トリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ(Acutase)などによる酵素的な解離)、または両者の併用があげられる。さらに、hES細胞の単独細胞への解離を支持するために役立つ方法および培養培地条件は、エキスパンション、細胞選別、マルチウェルプレート検定のための定義されたシーディングのために有用であり、培養手順とクローンエキスパンジョンの自動化を可能にする。したがって、本発明の1つの実施態様は、長期の維持と未分化の多分化能hES細胞または分化型hES細胞の効率的なエキスパンションをサポートすることができる、単独細胞の安定した酵素学的解離hES細胞またはhES−由来細胞培養系を発生させるための方法を提供する。
【0032】
本明細書において使用される時、「接触」という用語(すなわち、細胞、例えば、分化可能な細胞と化合物との接触)は、化合物と細胞を一緒に生体外(例えば、培養物中で化合物を細胞に追加する)でインキュベートすることを含んでいることを意図する。「接触」という用語は、対象中で自然に起こることがある、成分、化合物、成長因子など(たとえば神経伝達物質、ErbB3リガンド、およびTGF−βファミリーのメンバー)を含む定義された細胞媒地への細胞のin vivo暴露(すなわち、天然の生理学的過程の結果、起こることがある暴露)を含めないことを意図する。神経伝達物質、ErbB3リガンド、およびTGF−βファミリーのメンバーを含む定義された細胞培地と細胞が接触するステップは、上記の成分と細胞が接触し暴露されると理解される。例えば、接着培養、または懸濁培養で細胞をインキュベートすることにより細胞を接触させることができる。細胞を安定させるか、または細胞を分化するために、定義された培地と接触された細胞は、さらに細胞分化環境で処理できることが理解される。
【0033】
細胞培養の文脈で本明細書に使用される「サポート」または支持は、培地組成物とそれの具体的成分を示し、細胞培養の所望の成長、生育、多分化能および/または、他の特性に十分なものである。したがって、hES細胞の未分化型エキスパンションをサポートする定義された培地は、hES細胞がそこに追加要素も、化合物も、添加物もまたは同様のものもなしで培養されるとき細胞が分化しないで成長するものである。hES細胞のエキスパンションをサポートする化合物または要素は、説明されたメディア条件に加えられるとhES細胞が成長できるものである。
【0034】
本明細書において使用される時、「定義された細胞培養培地」は「定義された培養培地」、および「定義された培地」は、互換性を持って使用され、実質的に同様の特性で忠実に再生できる無機および有機の成分(生物学的および生活性の成分を含む)の特定の比、量または活性で含む水性の組成物について言及する。定義された培地はタンパク質、望ましくは組換蛋白質を含むことができる。ただし、それらが有意のロット間変動またはバッチ間変動なくそれらを調製するか、または精製できることが条件である。動物の血清は、本来定義できず、可変であるので、定義された培地は血清を含まない。しかしながら、個別の高度に精製された血清または他のタンパク質、要素などは、所定量、または質量、モル当量または活性(例えば、測定できる生物活性)に比例して含むことができる。
【0035】
本明細書において使用される時、「分化」という用語は、それが由来する細胞タイプよりも、より分化された型である細胞タイプの生産について言及する。したがって、用語は部分的にまたは最終的に分化された細胞形を包含する。一般に、hES細胞から得られた分化細胞とは、hES−由来細胞、hES−由来細胞集合体培養物、hES−由来単独細胞懸濁液、またはhES−由来細胞接着培養物、および同様のものをいう。
【0036】
本明細書において使用される時、「実質的に」の用語は、大きい範囲又は程度をいい、たとえば方法において「実質的に同様」の用語が使用される場合には、大きい範囲又は程度において他の方法と類似する方法をいう。本明細書に使用される場合、例えば「実質的に含まない」(たとえば「実質的に汚染物を含まない」、「実質的に血清を含まない」、「インスリンまたはインスリン様増殖因子を実質的に含まない」)、またはそれの同等表現は、溶液、培地、サプリメントおよび賦形剤なとが少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%、血清、汚染物または同等物を含まないことを意味する。1つの実施態様では、血清を含まない、100%血清を含まない、または実質的に血清を含まない定義された培地が提供される。逆に、組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、および同様のものが、「実質的に同様である」またはそれと同等の表現が記載された場合には、組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、および同様のものが、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%が、本明細書で先に記載された組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、または先に記載された方法と、また全体として本明細書に組み込まれた方法と類似することをいう。
【0037】
本発明のある実施態様では、「富化された」という用語は、希望の細胞リネッジ(cell lineage)を約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%以上で含む細胞培養物をいう。
【0038】
本明細書において使用される時、化合物の「有効な量」という用語またはそれと同等の表現は、フィーダー細胞がないときまたは血清もしくは血清代替物がないときに、1カ月以上、2カ月以上、3カ月以上、4カ月以上、5カ月以上、および/または6カ月以上分化可能な細胞培地の安定化のような所望の結果に作用するように、定義された培地の成分中に存在する化合物の十分な量をいう。本発明の他の態様では、化合物の「有効な量」という用語またはそれと同等の表現は、フィーダー細胞の非存在下または血清もしくは血清代替物の非存在下において5、10、15、20、25、30または40継代よりも長く、多能性細胞培養の安定化に有効な成分が残存するに十分な化合物の濃度を示すことができる。同様に、この濃度は当業者によって容易に決定される。
【0039】
本明細書において使用される時、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドの転写および/または細胞の中のポリペプチドの翻訳についていい、分子のレベルは分子を発現する細胞では分子を発現しない細胞よりも測定可能に高くされる。分子の発現を測定する方法は、当業者にとって周知であり、ノーザンブロット法、RT−PCR、in situ ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット法、および免疫染色があげられるが、これらに限定されるものではない。
【0040】
本明細書において使用される時、細胞、細胞ライン、細胞培養または細胞のポピュレーションについて述べる時、「単離された(isolated)」という用語は、細胞の天然源から実質的に分離され、細胞、細胞ライン、細胞培養、または細胞ポピュレーションが生体外で培養できるようにされることをいう。さらに、「単離」という用語は、二個以上の細胞のグループからの1種以上の細胞の物理的分離についていい、細胞は細胞のモルホロジーおよび/または様々なマーカーの発現に基づいて選択される。
【0041】
本発明は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明ならびにそこに含まれる実施例を参照することでさらによく理解され得る。しかしながら、本発明にかかる組成物と方法について説明する前に、本発明は特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、または特定の方法などに限定されないことが理解されるべきである。当業者には当然、種々の改良と変更が明らかである。
Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York. Lastly, を参照されたい。
【0042】
使用される略語と用語体系は、この分野で標準であると考えられて、本明細書に引用されたものなどの専門雑誌で一般的に使用される。本発明は、非常に精製された増殖因子を含む定義された培地組成物(例えば、DC−HAIF培地)は、分化を起こさずに多分化能性幹細胞のエキスパンションをサポートするのに使用できるという本出願人の先の知見に基づいている。本発明は、生育性、成長、多分化能および自己再生に重要なシグナル伝達経路に影響する低分子有機化合物を含んでいる定義された培地を提供する。hES細胞の生育性、成長または潜在活性を減少させる、薬学的に活性な化合物のライブラリのスクリーニングにより、様々な系路がこの点で重要であるとして同定された。知られている活性に従って、これらの化合物は分類された。同定された系路は、神経伝達物質受容体により大きな割合で仲介されることが同定された。具体的には、化合物の多くが、多分化能性幹細胞の成長にマイナスの影響があると同定され、神経伝達物質受容体の拮抗体であるとされた。
【0043】
本明細書において使用される時、「神経伝達物質」または「内因性神経伝達物質」の用語は、励起したときにニューロンの軸索の末端から放出され、シナプス間隙を横切って移動し、標的細胞(例えば、シナプス後ニューロン、樹枝状終点)を励起するかまたは抑制する物質をいう。神経伝達物質は、低分子化合物(すなわち、<=800ダルトン)であり、たとえばモノアミンおよびアミノ酸、並びにより大きな分子、たとえばぺプチドを含む。一般的な低分子神経伝達物質としては以下が挙げられる。
【0044】
【化1】
【0045】
【化2】
【0046】
【化3】
【0047】
【化4】
【0048】
【化5】
【0049】
【化6】
【0050】
【化7】
【0051】
【化8】
【0052】
【化9】
【0053】
神経伝達物質は典型的に7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体(7-transmembrane G-protein-coupled receptors)である標的細胞上の受容体(すなわち、「神経伝達物質受容体」)に結合する。神経伝達物質受容体の例としては:アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、グリシン作動性、グルタミン作動性、GABA作動性、ヒスタミン作動性、コリン作動性、およびセロトニン作動性神経伝達物質受容体があげられる。ある神経伝達物質はシナプスから離れて拡散し、「神経調節(neuromodulation)」として知られているプロセスで複数のニューロンに影響を与え、または他の細胞または受容体に「ホルモン」としての行動する。
大量の薬学的に活性な薬物は、低分子神経伝達物質受容体リガンドであり、たとえばアゴニスト、拮抗体、モジュレータ等である。
【0054】
本明細書において使用される時、「リガンド」は受容体などの生物学的分子に結合する化学的を示す。本明細書において使用される時、「アゴニスト」は細胞の受容体に結合して、細胞による反応の引き金となるリガンドを示し、「拮抗体」は、受容体に結合し、アゴニストの結合をプロックすることにより細胞の反応を抑制するリガンドをいう。
【0055】
多分化能性幹細胞の成長、特に低細胞濃度においてポジティブな効果を持っている化合物を同定するために、低分子薬剤化合物ライブラリのサブセットが、定義された培地DC−HAIF内で低細胞濃度でhESの成長をサポートする能力を持っている化合物についてスクリーニングされた。神経伝達物質拮抗物質がネガティブにhES細胞成育に影響を与える場合、同じ受容体のアゴニストまたは内因性リガンドがポジティブにhES細胞に影響を与えることができると推論された。以下の実施例2と3に記載されるように、低細胞濃度でhES細胞成育をサポートしたさまざまな物質が同定された。特異的に、神経伝達物質ノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、およびアデノシンは、定義された培地に加えられると、多分化能性幹細胞の低密度生存とエキスパンションをサポートする候補として同定された。
【0056】
したがって、本発明は基本栄養塩溶液、増殖因子、並びにノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、およびアデノシンから選択された1種以上の神経伝達物質を含む、定義された培地を提供する。また本発明は、神経伝達物質誘導体、変異体、代謝物、構造類似体、塩、および同様のものを含む、天然由来または人工の低分子の神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗体、リガンド、およびモジュレータを含む定義された培地を提供する。本発明の1つの態様では、媒質はDC−HAIFであり、神経伝達物質はノルエピネフリンである。他の実施態様では、培地は2以上の神経伝達物質の組み合わせを含んでいる。例えば、一定の条件の下で、ノルエピネフリンとアセチルコリンの組み合わせはhES細胞成育を刺激するために相乗効果的に行動するのがわかった。
【0057】
本発明のある実施態様では、ノルエピネフリンと簡易型の増殖因子成分を有する定義された培地組成物を提供する。驚くべきことに、より高い(標準の)細胞濃度と比べて、hES細胞が低細胞濃度で培養されたときには、異なった増殖因子をノルエピネフリンおよび/または、他の小さい有機化合物に取り替えることができる。具体的には、標準細胞濃度では必要であることがわかっていたアクチビンは、低細胞濃度においては必ずしも必要ではなく、より高い細胞濃度でノルエピネフリンに置き換えることができた。
【0058】
本明細書においては「標準細胞濃度」は、培地中で成長可能であって、エキスパンションができるのが典型的に知られている多分化能性幹細胞の濃度領域をいう。たとえば、hES細胞は典型的には、約1×105から約5×105細胞/mlの濃度で培養され、約2.5×106から約5×107細胞/mlの濃度になった時に分割されるか、または継代される。対照的に「低細胞濃度」は、標準細胞濃度よりかなり少ない細胞濃度で培養された多分化能性幹細胞をいう。当該技術分野で、ある閾値濃度より下で培養された細胞は、細胞分裂で立ち遅れを経験したり、または継代を乗り切れないことが周知である。1mlあたり約5×104細胞/mlまたはそれ以下で培養されたhES細胞株は、低細胞濃度のものであると考えられる。
【0059】
ある実施態様では、多能性細胞は細胞外マトリックス蛋白質(ECM)、たとえばMATRIGELの存在下および/または非存在下において、本明細書に記載された定義された培地で培養される。ECMの非存在下で培養された多能性細胞は、約0.5〜10%のヒト血清(hS)を含んでいるか、または300Kおよび/または100Kカットオフスピンカラム(Microcon,Millipore, Billerica, MA))からのhS濃縮画分を含む。直接hSまたはhS濃縮画分を含む培地でhES細胞を直接インキュベートすることによって、hES細胞集合体懸濁液を製造できる。hSまたはhS濃縮画分と培地容器を約30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、または24時間、37℃でインキュベートした後に、hES細胞集合体懸濁液を製造できる。hSまたはhS濃縮画分含有培地におけるhES細胞のための培養効率は、PCT/US2007/062755に記載されている、DC−HAIFで培養されたhES細胞、またはECMとしてMATRIGELを使用してDC−HAIF培地で培養されたhES細胞、または他の類似する培地で培養されたhES細胞において観察されたものと匹敵していた。実質的に血清を含まない定義された培地でhES細胞を培養することが、2009年4月23日に出願された、米国出願番号2009/0104696の、ヒト血清を含むフィーダーを含まない多能性幹細胞培地組成物と方法(METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM)に記載され、これは本明細書の一部として組み込まれる。
【0060】
異なる実施態様では、単層(monolayer)または集合体懸濁液の多能性細胞は実質的に血清を含まない培地で、外因的に付加された繊維芽細胞生長因子(FGF)の非存在下で培養された。これはトムソンらの米国特許番号7,005,252の、血清を含まない培地であるが、FGFをはじめとする外因的に付加された増殖因子を含む培地でhES細胞を培養することを必要とする発明と区別される。
【0061】
本明細書において使用される時、「分化可能な細胞」という用語は、少なくとも部分的に成熟した細胞に分化できる細胞または細胞集合、たとえば他の細胞との融合のような、少なくとも部分的に成熟した細胞へ分化できる細胞の分化に参加できるものを記載するために使用される。本明細書において使用される時、「少なくとも部分的に成熟している細胞(partially mature cells)」は、「前駆細胞(progenitor cells)」、「前駆体細胞(precusor cells)」、「マルチポーネント細胞(multipotent cells)」、「未熟細胞(immature cells)」、および最終分化(terminally differentiated)細胞を含む。少なくとも部分的に熟している細胞は、例えば、最終的な内はい葉細胞、PDXl陰性前腸内胚葉細胞、PDXl陽性プレ膵性内はい葉細胞を含むPDXl陽性膵性内はい葉細胞、PDXl陽性膵性内胚葉端細胞、またはPDX1/NKX6.1コ−ポジティブまたはPDX1/PTF1A コ−ポジティブ膵性内はい葉細胞、NGN3/NKX2.2コ−ポジティブ細胞の陽性のマルチまたはシングル−ホルモン性分泌すい臓細胞を含む。すべてが、同じ臓器または組織からの成熟細胞の、たとえばモルホロジーまたは蛋白質発現などの遺伝表現型の少なくとも1つの特徴を示すが、さらに他の少なくとも1つの細胞タイプに分化できる。
【0062】
さらに、胚様体(EBs)を形成する他の方法を説明する。本明細書において使用される時、「胚様体(embryoid bodies)」、「集合体(aggregate bodies)」との用語またはそれと同等の表現は、ES細胞が単層培地中で過成長した時、または未定義の培地内の懸濁培養で維持されるか、または多発性胚葉組織に向けた非由来性のプロトコールを介して分化された時に現れる分化したおよび未分化の細胞の細胞集合体をいう。すなわち、EBsは、本明細書に記載されるような、多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から形成されない。また、EBsはhES−由来のマルチポーネント細胞の接着培養から形成されない。これらの特徴のみによっても、胚様体と本発明は明確に区別される。
【0063】
胚様体は典型的にはモルホロジー的な評価基準により識別可能な、数個の胚葉である異なる細胞タイプの混合物である。ES細胞の培養で胚様体を形成した時に関する決定は、当技術分野の当業者によって例えば、モルホロジーの目視検査により、ルーチン的に行われる。培養条件に依存して、約20以上の細胞の浮いた塊はEBsであると考えられている。たとえばSchmittら、(1991)Genes Dev.5,728−740;Doetschmanら(1985)J.Embryol.Exp.Morph.87、27−45を参照。また、用語は胚性生殖腺領域から抽出された初期の細胞である、始原生殖細胞から得られたものと等価の構造をも意味する。例えば、Shamblott,ら(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,13726を参照。また当技術分野で時々EG細胞または胚芽細胞と呼ばれる始原生殖細胞は、適切な因子群で処理されると、胚様体を誘導することができる多分化能胚性幹細胞を形成できる。例えば、米国特許番号5,670,372、および上記のShamblottらを参照。
【0064】
EBsを作るための様々な方法が存在している、例えば(2008)ネイチャープロトコル3(5):468−776に記載されたスピン胚様体(spin embryoid bodies)、上記のBauwens他(2008)に記載されているような、マイクロパターンド細胞外マトリックスアイランド上にプレーティングされた単独細胞懸濁液からEBsが形成される。しかしながら、これらの方法はhES細胞およびhESによって由来された細胞の大規模な生産(製造)には、費用的に採算が合わず、それほど効率的でない。スケールアップ生産が実際に始まるまでに、あまりに多くの工程を必要とするからである。たとえば、Bauwens他の方法では、細胞が懸濁培養を始めるために選択される前に、最初に低減した増殖因子MATRIGEL(登録商標)にhES細胞をシードしなければならない。この方法の時間と費用は、カスタム設計されたマイクロ−パターンド組織培養プレートが必要であるので、厄介である。さらに、Ngらの方法は、hES細胞とhES−由来の細胞の大規模な製造には、より均一なEBを作成するために遠心分離機の使用が必要であり、費用効率的でない。最後に、これらのすべての方法論では、本発明のようには、細胞集合体は多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から作られない。
【0065】
胚様体は、3つの胚葉からの多数の細胞タイプで作られた細胞集合体であり、典型的には未分化型胚性幹細胞の集合体を非有向性分化シグナル(non-directed differentiation signals)、たとえば20%のウシ胎仔血清などに暴露することによって作成される細胞集合体である。これは本発明で記載される細胞集合体とは異なる。この非有向性方法論の結果は、生体外で通常の胚成長をまねることを意図する細胞タイプの混合物である。このアプローチは基礎研究レベルで胚成長を調べることの役に立つが、それは細胞収率、集団のアイデンティティ、集団の純粋さ、バッチの一貫性、安全性、細胞機能、および商品原価が主要な関心であるところのすべての大規模な細胞治療製造プロセスには適用できない。そのうえ、胚様体から所定の細胞タイプを精製するのに使われた任意の富化作用戦略にかかわらず、分化プロトコールは単独細胞タイプの大集団を発生させる直接的なアプローチを提供しない。それに続いて、汚染物集団がいつも支配的であり、特定集団を精製するどんな試みも妨げるだろう。
【0066】
多能性細胞の集合体を作成して、分化することへのすべての先行研究は、それらの方法論において以下のコンポーネンツの一個以上を有する:1)ヒト胚性幹細胞ではなくマウスの使用;2)通常の細胞接着過程ではなく、細胞を集合させるために遠心沈殿に依存する強制集合プロトコール;3)静的条件における、細胞塊の集合;4)非単独細胞解離または表面の細胞をこすり落とすことによる集合体の形成;および5)すべての胚様体と胚葉の細胞タイプの形成をもたらす、15−20%の胎児ウシ血清を使用する細胞集合体の非直接分化。我々の知識によれば、胚様体を分化するのに15−20%のFCSを利用しない唯一の研究は、細胞集合体が強制的な集合で形成されて、次に集合体がすぐに、中胚葉に適切な培地を使用して分化されるプロトコールについて説明する(Ngら、Blood.2005 106(5):1601)。しかしながら、この仕事では、10−12日間静的に集合された後、研究者が非集合の接着培養に胚様体を移しているので、本発明とは無関係である。
【0067】
対照的に、本発明は1)ヒト胚性幹細胞を単独細胞に分離し、集合直径および細胞生存のコントロールを改良するために最適化されたせん断速度で回転培養(rotational culture)することによる集合体の形成、2)次に直接、最終的な内胚葉へES細胞集合体を分化させ、前腸内胚葉に分化させ、プレ膵性前腸内胚葉へ分化させ、次いで膵性内胚葉および最終的に膵臓内分泌細胞へ分化させるとの、単独細胞集合体形成のためのアプローチを提供する。この分化プロトコールは高能率と最小量の汚染物集団で、最終的な内胚葉および膵性リネッジ集団を発生させる。そのうえ、他のすべての公開された研究と対照的に、胚性幹細胞集合と分化へのこのアプローチは胚様体を作成しない。
【0068】
1つの特定の実施態様では、未分化の細胞および分化可能な細胞は本発明の細胞培地を使用して、懸濁培養中でエキスパンドする。別の特定の実施態様では、分化可能な細胞が懸濁液内に保持されエキスパンドされる。すなわち、それらは、未分化型のままで残っているか、またはさらに分化するのが阻まれる。当該技術分野において、細胞増殖に関連して「エキスパンド(expand)」、「エキスパンドされた」、「エキスパンジョン」の用語が使用される時、細胞増殖および細胞数の増加、好ましくは生菌細胞数の増加をいう。具体的な実施態様では、細胞は、培養懸濁液中で、約1日、すなわち約24時間以上の間培養することによって、エキスパンドする。より具体的な実施態様では、細胞は懸濁培養中で少なくとも1、2、3、4、5、6、7日間、または少なくとも2、3、4、5、6、7、8週間培養することによりエキスパンドする。
【0069】
本発明は、それらのソースまたはそれらの可塑性(plasticity)にかかわらず、分化可能な細胞に有用な組成物と方法を企図する。本明細書においては、当該技術分野においてそうであるように、細胞の「可塑性」は概略的な意味で使用される。すなわち、細胞の可塑性は、胚、胎児または成長した有機体からの組織または臓器で見い出される特定の細胞タイプに分化する細胞の能力について言及する。細胞が「より可塑性」であればあるほど、細胞が分化できるかもしれない組織はより多くなる。
【0070】
いくつかの実施態様では、「多能性細胞」は、内胚葉リネッジ(endoderm-lineage)、または、特に膵性内胚葉タイプ細胞(pancreatic endoderm type cells)への分化の出発物質として使用される。本明細書において使用される時、「多分化能」、「多能性」、「多能性細胞」、および同等の表現は、細胞培養において増殖および自己再生の両方ができ、例えば多分化能胚性幹細胞は3つの胚性細胞リネッジのそれぞれをもたらすことができるように、マルチポーネント特性を示すものを含むさまざまな細胞集団に分化するものをいう。しかしながら、多能性細胞は胎座の羊膜や、絨毛膜や、他の成分などの胚体外の組織をもたらすことができない。また生体全体の生体を製造できないだろう。すなわち、多能性細胞は「分化全能性(totipotent)」ではない。単独細胞の子孫から3種のすべての胚性胚葉の誘導体を形成して安定した発生能を示す証拠を提供し、注射の後に奇形腫を免疫抑制マウスに発生させることによって、多分化能を示すことができる。多分化能の他の表示は、多能性細胞および、特徴的形態で発現することが知られている遺伝子の発現を含む。当業者に知られている任意の方法を使用して、本発明の多能性細胞を誘導することができる。
【0071】
本明細書に使用される「分化全能性」は、すべてのタイプの細胞、すなわち胚外組織(例えば、胎座)および生体(例えば、マウスまたは人間)の全体をもたらすように成長する細胞の能力をいう。
【0072】
「自己再生」は、分割して親幹細胞と同じ特性を有するより多くの幹細胞を形成し、その結果、幹細胞の集団が無期限に補給されるのを許容する幹細胞の能力をいう。
【0073】
ある実施態様では、出発物質として使用される多能性細胞は、hES細胞、hEG細胞、iPS細胞、単為発生細胞(parthenogenic cell)、および同様のものをはじめとする幹細胞を含んでいる。本明細書において使用される時、「胚性」はただ一つの接合体から、発育済み配偶子細胞以外の多分化能または全能細胞を含まない多細胞性構造までのさまざまな生体の発育時期の範囲を示す。配偶子融合により誘導された胚種に加えて、「胚性」という用語は体細胞核移植により誘導された胚種についてもいう。別の実施態様では、多能性細胞は胚種から誘導されないかまたはただちには誘導されない。たとえば非多能性細胞、たとえばマルチポーネント細胞または最終分化細胞から「退行分化」または「再プログラム化」として知られているプロセスでiPS細胞を得る。本明細書において使用される時、「退行分化(dedifferentiation)」または「再プログラム化」は、分化細胞がそれほど専門化していない先駆、前駆細胞、または幹細胞状態に戻るプロセスをいう。
【0074】
本明細書において使用される時、「マルチポーネント特性(multipotency)」、「マルチポーネント細胞(multipotent cell)」またはそれと同等の表現は、他の特定の細胞タイプの限定された数をもたらすことができる細胞タイプをいう。すなわち、マルチポーネント細胞は1種以上の胚性細胞の運命にゆだねられ、多能性細胞と対照的に、3つの胚性細胞リネッジのそれぞれ、および胚体外の細胞をもたらすことができない。多分化能体細胞は、多能性細胞に対してさらに分化されるが、最終までには分化されない。したがって、多能性細胞(pluripotent cell)には、マルチポーネント細胞より高い潜在能がある。体細胞のプログラムを変えることができるか、またはiPS細胞を発生させるのに使用できる潜在能決定要因としては、Oct−4、Sox2、FoxD3、UTF1、Stella、Rex1、ZNF206、Sox15、Myb12、Lin28、Nanog、DPPA2、ESG1、Otx2またはそれらの組み合わせなどの要素を含むが、これらに限定されない。
【0075】
本発明の1つの態様は、適切な条件の下で培養される時に、選択的に、およびいくつかの態様では可逆的に選択的に異なったセルリネッジを発現できる、多分化能または前駆細胞の集団を含んでいる。本明細書において使用される時、「集団」という用語は同じ識別特性を有する1つ以上の細胞の細胞培養株を示す。「細胞リネッジ」という用語は、細胞タイプの発達のステージのすべてについて言い、最も早い前駆細胞から完全に成熟した細胞(すなわち、特殊化した細胞)までをいう。「前駆細胞(precursor cell)」または「先祖細胞(progenitor cell)」は、より成熟した細胞に分化できる細胞分化経路における任意の細胞であることができる。そういうものとして、前駆細胞は多能性細胞であることができ、またはそれは部分的に分化したマルチポーネント細胞、または可逆的に分化した細胞であることができる。「先駆細胞集団(precursor cell population)」という用語は、より成熟した、または分化した細胞タイプに生育できる細胞群をいう。先駆細胞集団は多分化能である細胞、制限された幹細胞リネッジである細胞(すなわち、すべての外胚葉性リネッジよりも少なく生育できる細胞、またはたとえば神経細胞リネッジにのみ生育できる細胞)、可逆的な制限された幹細胞リネッジである細胞を含むことができる。したがって、「先祖細胞」または「前駆細胞」は、「多能性細胞」または「マルチポーネント細胞」であることができる。
【0076】
本明細書において使用される時、「発育する(develop)」、「分化する」、「成熟する」、または「多能性細胞から生産される」、「多能性細胞から誘導される」、「多能性細胞から分化される」、および同等な表現は、分化された、またはより特殊化した細胞タイプの生産をいい、たとえば生体外の、または、生体内の多能性細胞からの生産をいい、例えば、膵性ホルモンの生産方法のタイトルの国際出願PCT/US2007/015536に記載される、生体内の、移植されたPDX1膵性内はい葉細胞からの成熟した内分泌細胞の生産をいう。この文献は参考として援用される。すべてが、特殊化を経て少なくとも2つの別々の細胞リネッジに分化する可能性を持つステージから、結局最後まで分化する、細胞の発達に関する。本願の目的のために、そのような用語を互換性を持って使用できる。本発明はそのような分化が可逆的であり、多分化能または少なくとも2つ以上の細胞リネッジに分化する能力が選択的に獲得されることを許容する培養条件を企図する。
【0077】
また、本発明は動物の中の任意のソースからの分化可能な細胞を企図する。ただし、細胞が本明細書に定義されるように分化可能であることが条件である。例えば、分化可能な細胞は胚種、その内部の任意の始原生殖層、胎盤または絨毛膜組織、または成人幹細胞などのより成熟している組織、たとえば、それらに限定されるものではないが、脂肪、骨髄、神経組織、乳房組織、肝臓組織、膵臓、上皮、呼吸器、生殖腺および筋肉組織から収穫することができる。具体的実施態様では、分化可能な細胞は胚幹細胞である。他の具体的実施態様では、分化可能な細胞は成人幹細胞である。さらに、他の具体的実施態様では、幹細胞は胎盤の、または絨毛膜から誘導された幹細胞である。
【0078】
本発明は、もちろん分化可能な細胞を発生させることができるすべての動物からの分化可能な細胞も使用することを企図する。分化可能な細胞が得られる動物は、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、非哺乳動物、人間、または非人間であることができる。動物ソースの例としては、霊長動物、齧歯動物、犬科、ネコ科、ウマ科、うし科、およびブタ科の動物を含むが、これらに限定されない。
【0079】
ある実施態様では多能性幹細胞が利用される場合、多能性細胞は正常核型を持っている。調べられた分裂中期の多能性細胞培養物の50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上が正常核型を有する。
【0080】
本発明の組成物と方法は基本栄養塩溶液を含む。本明細書において使用される時、基本栄養塩溶液とは、通常の細胞代謝のために本質的なある種のバルクな無機イオン類と水を細胞に提供する塩の混合物であり、細胞内と細胞外の浸透バランスを維持して、エネルギー源として炭水化物を提供して、生理的pH範囲内の中に媒体を維持するための緩衝化システムを提供する塩の水性溶液をいう。基本栄養塩溶液の例としては、ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(Minimal Essential Medium)(MEM)、基本イーグル培地(Basal Medium Eagle)(BME)、RPMl1640、ハムズ(Ham's)F−10(Ham's F-10)、ハムズF−12(Ham's F-12)、アルファ−最小必須培地(α-Minimal Essential Medium)(αMEM)、グラスゴー最小必須培地(Glasgow's Minimal Essential Medium)(G-MEM)、およびイスコブの改良ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、または多分化能細胞に使用される汎用培地、たとえばX−VIVO(Lonza)造血基本培地およびそれらの混合物があげられるが、これらに限定されるものではない。1つの具体的な実施例では、基本栄養塩溶液はDMEMとハムズF12の約50:50混合物である。
【0081】
本明細書に記載される基本栄養塩溶液は、多能性細胞の成育と生存を維持するのに使われるが、本発明の他の実施態様においては、多分化能または多能性細胞の分化を維持するために、代替の幹細胞培養液も実質的に同様に作用し、たとえばKSR(Invitrogen)、無異物性のKSR(xeno-free KSR)(Invitrogen)、StemPro(登録商標) hESC SFM(Invitrogen)、mTeSR(登録商標)l(StemCell Technologies)、HES cellGRO(ミリポア)、DMEM、およびX Vivo(Lonza)ベース培地などがあげられるが、これらに制限されるものではない。
【0082】
組成物がさらに微量元素を含むことが企図される。商業的に微量元素を購入でき、例えば、Mediatechから購入できる。微量元素の非限定的な例としては、アルミニウム、塩素、硫酸、鉄、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、ホスフェートおよびマグネシウムがあげられるが、これらに制限されるものではない。微量元素を含む化合物の具体的な例としては、AlCl3、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、CdCl2、CdSO4、CoCl2、CrCl3、Cr2(SO4)3、CuSO4、クエン酸第二鉄、GeO2、KI、KBr、LI、モリブデン酸、MnSO4、MnCl2、NaF、Na2SiO3、NaVO3、NH4VO3、(NH4)6Mo7O24、NiSO4、RbCl、セレニウム、Na2SeO3、H2SeO3、亜セレン酸塩−2Na、セレノメチオノン、SnCl2、ZnSO4、ZrOCl2、それらの混合物、およびそれの塩があげられるが、これらに制限されるものではない。セレニウム、亜セレン酸塩またはセレノメチオノンが存在している場合には、約0.002〜約0.02mg/Lの濃度で存在する。また、さらに、ヒドロキシルアパタイトも存在することができる。
【0083】
定義された培地にアミノ酸類を加えることができると企図される。そのようなアミノ酸類の非限定的な例としては、グリシン、L−アラニン、L−アラニル−L−グルタミン、L−グルタミン/グルタマックス、L−塩酸アルギニン、L−アスパラギン−H2O、L−アスパラギン酸、L−システイン ヒドロクロライド H2O、L−シスチン2HCl、L−グルタミン酸、L−ヒスチジン塩酸塩−H2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−塩酸リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−ヒドロキシプロリン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン二ナトリウム塩二水和物、およびL−バリンがあげられる。ある実施態様では、アミノ酸は、L−イソロイシン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−ヒドロキシプロリン、L−バリン、およびそれらの混合物質である。
【0084】
また、定義された培地はアスコルビン酸を含むことができると企図される。望ましくは、アスコルビン酸は約1mg/Lから約1000mg/L、または2mg/Lから約500mg/L、または約5mg/Lから約100mg/L、または約10mg/Lから約100mg/L、または約50mg/Lの初期濃度において存在している。さらに、本発明の組成物と方法は他の成分を含むことができ、たとえば血清アルブミン、鉄結合性グロブリン、L−グルタミン、リピド、抗生物質、βメルカプトエタノール、ビタミン、ミネラル、ATP、および類似物が存在することができる。存在することができるビタミン類の例としてはビタミンA、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、D1、D2、D3、D4、D5、E、トコトリエノール、K1およびK2を含むが、これらに限定されない。当業者はミネラル、ビタミン、ATP、リピド、必須脂肪酸などの、特定の培養における使用のための最適濃度を決定できる。例えば、サプリメントの濃度は約0.001マイクロMから約1mMまたはそれ以上であることができる。サプリメントが提供されることができる濃度の具体的な例は、約0.005マイクロM、0.01マイクロM、0.05マイクロM、0.1マイクロM、0.5マイクロM、1.0マイクロM、2.0マイクロM、2.5マイクロM、3.0マイクロM、4.0マイクロM、5.0マイクロM、10マイクロM、20マイクロM、100マイクロMなどがあげられるが、これらに限定されない。1つの具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンB6とグルタミンを含む。別の具体的な的実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンCと鉄分サプリメントを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンK1とビタミンAを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンD3とATPを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンB12および鉄結合性グロブリンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はトコトリエノールとβメルカプトエタノールを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はグルタミンとATPを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ3−脂肪酸とグルタミンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ6−脂肪酸とビタミンB1を含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、α−リノレン酸、およびB2を含む。
【0085】
本発明の組成物は本質的には血清を含まない。「本質的に」の用語が、組成物、配合物、方法、および同様のものに使用される時、量および品質が基本的にまたは事実上、呼ばれるものであることをいう。ただし少量の不純物および/または重要でない変更は許容される。一般に、本質的にとは、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約99.5%、または100%をいう。「事実上血清を含まない」とは、本発明の溶液における、血清の非存在、または基本的にまたは事実上存在していないことを示す。血清は、本発明の組成物と方法における必須成分ではない。したがって、すべての組成物における血清の存在は単に不純物とされ、たとえば細胞初代培養からの残留結成であるか、または出発物質からのものである。例えば、事実上血清を含まない培地または環境は、5%、4%、3%、2%、1%、または0.5%未満の血清を含むことができ、媒体または環境の改良された生物活性維持能力が依然として観測される。本発明の具体的な実施態様では、事実上血清を含まない組成物は、血清または血清代替物を含んでいないか、または定義された培地に加えられる血清または血清代替物の成分の単離からの血清または血清代替物の痕跡量を含むだけである。
【0086】
本明細書において使用される時、「機能的な断片(functional fragment)」は、完全な長さのポリペプチドと同様の生理的または細胞の効果を生む完全な長さのポリペプチドの断片またはスプライス変異体をいう。機能的な断片の生物学的な効果は、同様の生理的または細胞の効果が見られる限り、完全な長さのポリペプチドと同じ範囲または強度である必要はない。例えば、ErbB2の機能的な断片、HRG−Pは検出可能にErbB2−由来チロシンキナーゼを刺激できる。本明細書において使用される時、「変異体(variant)」という用語はキメラまたは融合ポリペプチド、同族体、類似物、オーソログ(orthologs)、およびパラログ(paralogs)を含む。たとえばさらに、参照される蛋白質またはポリペプチドの変異体は、アミノ酸配列が参照される蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約80%同じであるタンパク質またはポリペプチドである。具体的な実施態様では、変異体は比較蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同じである。
【0087】
本明細書において、たとえば天然の神経伝達物質受容体または人工の神経伝達物質受容体のリガンドのような低分子化合物に関連して使用される時、「類縁体(analog)」という用語は構造的なおよび/または、機能的な類似性を共有する化合物について言う。類縁体は、構造的な類似性を有する「構造類縁体(structural analogs)」と、類似する薬理特性を示す化学的に異なった化合物である「機能的類縁体(functional analogs)」を含む。
【0088】
本明細書において配列アラインメントに関連して用語「対応する」が使用される時には、参照される蛋白質またはポリペプチド内の記載された位置を意味することを意図している。たとえば野生型ヒトまたはマウスのニューレグリン−1と、変成された蛋白質またはポリペプチドにおける参照される蛋白質またはポリペプチドにおける位置をいう。したがって、対象のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、参照される蛋白質またはポリペプチド配列のアミノ酸配列と並べられた時、参照される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列のある記載された位置に対応する配列は、参照される配列の位置と並ぶ配列であり、参照配列と正確な数字の同じ位置にある必要があるわけではない。以下で配列間で対応するアミノ酸を決定するための配列を整列する方法を説明する。
【0089】
たとえばTGF−βである参照されるアミノ酸配列コードとたとえば少なくとも約95%「同じ」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照されるTGF−β、または上記の低分子神経伝達物質、たとえばノルエピレナミン、ドーパミン、またはアセチルコリンをコード化する参照アミノ酸配列の100アミノ酸あたり最大およそ5つの変成を含むことができるのを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同じであることを意味することが理解される。言い換えれば、参照アミノ酸配列と約95%同じアミノ酸配列を持っているペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の約5%までを削除するか、または他のアミノ酸で置換でき、または参照配列に、総アミノ酸類の約5%までのアミノ酸を挿入できる。参照配列のこれらの修飾は参照アミノ酸配列のN末端またはC末端位置において、またはそれらの端末の位置の間のどこでも起こることができ、参照配列のアミノ酸の間に個別に存在するか、または参照配列中に1種以上の隣接するグループとして存在することができる。
【0090】
本明細書において使用される時、「同一性(identity)」の用語は、参照されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比べた、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最も高い順番の一致が得られるように並べられる。「同一性」自体は、当該技術分野で認識された意味を持ち、公知の技術により計算できる。(参照:例えば、コンピュータによる分子生物学(Computational Molecular Biology)、Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York(1988);Biocomputing:インフォーマティクスおよびゲノムプロジェクト(Informatics And Genome Projects),Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993);配列データのコンピュータ分析 パート I(Computer Analysis of Sequence Data,Part I),Griffin,A.M.,and Griffin,H.G,eds.,Humana Press,New Jersey(1994);von Heinje,G,分子生物学における配列分析(Sequence Analysis In Molecular Biology),Academic Press(1987);および 配列分析プライマー(Sequence Analysis Primer),Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York(1991))。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定するいくつかの方法が存在しているが、「同一性」という用語は当業者には公知である(Carillo,H.&Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988))。2つの配列の間の同一性または類似性を決定するのに一般的に使われる方法は、これに限定されるものではないが、大規模コンピュータのガイド(Guide to Huge Computers),Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego(1994)and Carillo,H.& Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988)に開示されている。コンピュータプログラムは同一性と類似性について計算する方法とアルゴリズムを含むことができる。2つの配列の間の同一性と類似性を決定するコンピュータプログラム方法の例は、これに限定されるものではないが、GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i):387 (1984)), BLASTP, ExPASy, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)) およびFASTDBがあげられる。同一性および類似性を決定する方法の例は、Michaels, G. and Garian, R., Current Protocols in Protein Science, Vol 1, John Wiley & Sons, Inc. (2000)に述べられており、これは本出願で参照される。本発明のひとつの実施態様では、2またはそれ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはBLASTPである。
【0091】
本発明の別の実施態様では、二つ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムは、FASTDBである。これはBrutlagらのアルゴリズムによる(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))。これは参照され、本明細書に組み込まれる。FASTDB配列アラインメントでは、対照とされる配列はアミノ配列である。得られる配列アラインメントの同一性はパーセントで示される。同一性のパーセントを計算するためにアミノ酸配列のFASTDBアラインメントに使用されるパラメータ類は、これらに限定されないが、以下の通りである。マトリックス=PAM、k−tuple=2、ミスマッチペナルティ=1、ジョイニングペナルティ=20、ランダマイゼイショングループ長さ=0、カットオフスコア=1、ギャップペナルティ=5、ギャップサイズペナルティ 0.05、ウインドーサイズ=500、または対象とされるアミノ配列の長さの、どちらか短い方。
【0092】
対象の配列がN末端またはC終点の付加または染色体欠失のために対象とされる配列よりも短いかまたは長い場合、内部の付加または染色体欠失のためであるかに関わらず、手作業で矯正をすることができる。なぜなら、パーセントの同一性について計算するとき、FASTDBプログラムが対象の配列のN末端とC末端のトランケーションまたは付加を計算しないからである。対象とされている配列に関し、5’または3’末端においてトランケーションされている配列について、同一性のパーセントは、マッチング/アラインしていない対象配列に対する、N−末端およびC末端である対象配列の塩基の数について計算することによって、対象配列の全塩基のパーセントとして修正される。FASTDB配列アラインメントの結果が、マッチング/アラインメントを決定する。アラインメントの割合は、具体的なパラメータ類を使用して上記のFASTDBプログラムで計算された同一性パーセントから引き算され、最終パーセント同一性スコアが得られる。アラインメントがどのようにお互いに「対応するか」を決定する目的に、同一性パーセントと同様に、この修正されたスコアを使用できる。手動で同一性パーセントスコアを調整する目的のために、参照または対象の配列のNまたはC末端を超えて伸びる質問(対象)の配列の残基を考慮することができる。すなわち、比較配列のNまたはC末端にマッチ/アラインされていない残基は、手動でパーセント同一性スコアまたはアラインメントナンバリングを調整するときに計算できる。
【0093】
例えば、90アミノ酸残基被検配列は、パーセントの同一性を決定するために100残基参照配列と並べられる。染色体欠失は対象の配列のN末端で起こる。したがって、FASTDB配列はN末端で最初の10残基のマッチ/アラインメントを示さない。10の不対残基が配列の10%を示す時(NとC末端における残基数が被検配列における残基の総数と合っていない時)、FASTDBプログラムで計算されたパーセント同一性スコアから10%が引かれる。残っている90の残基が完全に合わせられているなら、最終的な同一性パーセントは90%である。別の例では、90残基の対象配列は100の対象配列と比較される。このとき、染色体欠失は、対象の配列のNまたはC末端には残基が全くない、対象とマッチしないかまたはアラインされていない内部欠損である。この場合、FASTDBによって計算されたパーセントの同一性は、手動で修正されない。
【0094】
また、本発明はキメラまたは融合ポリペプチド(chimeric or fusion polypeptides)を提供する。本明細書において使用される時、「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、少なくとも第二の異なったポリペプチドに有効にリンクされた参照ポリペプチドのメンバーの一部を含む。第二のポリペプチドは、実質的に参照ポリペプチドと同じでないポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有し、該ポリペプチドは同じかまたは異なった有機体から誘導される。融合ポリペプチドに関して、「有効にリンクする」という用語は、参照ポリペプチドと第二のポリペプチドがお互いに融合し、両方の配列が使用される配列に生ずる期待される機能を実現させるようにされることを意図する。参照ポリペプチドのN末端またはC末端に第二のポリペプチドを融合できる。例えば、ある実施態様では、融合ポリペプチドは、IGF−1配列がGST配列のC末端に融合されたGST−IGF−1融合ポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドは組換ポリペプチドの精製を容易にすることができる。別の実施態様では、融合ポリペプチドはN末端におけるヘテロロガスシグナル配列を含むことができる。ある宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)の中では、ポリペプチドの発現および/または分泌はヘテロロガスシグナル配列の使用で増加できる。
【0095】
断片および融合ポリペプチドに加えて、本発明は天然存在ポリペプチドの同族体と類似物を含んでいる。「同族体」は本明細書において類似又は同一のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を持つ2つの核酸またはポリペプチドと定義される。同族体は、以下に定義されるような、対立遺伝子多型、オーソログ、パラログ、アゴニスト、および拮抗体を含んでいる。「同族体」という用語はさらに遺伝コードの縮退のため参照ヌクレオチド配列と異なっていて、その結果参照ヌクレオチド配列によってコード化されたものと同じポリペプチドをコード化する核酸分子を包含する。本明細書において使用される時、「天然存在」は天然に発生する核酸またはアミノ酸配列を示す
【0096】
ポリペプチドのアゴニストは実質的にポリペプチドの生物活動と同じ、またはサブセットを保持できる。ポリペプチドの拮抗物質はポリペプチドから天然に発生する活性の一以上を禁止できる。
【0097】
本発明の組成物および方法においては、分化可能な細胞の中のErbB2チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を含む。本発明の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、少なくとも1つのErbB3リガンドの存在を含む。典型的には、ErbB3リガンドは、ErbB3受容体と結合して、ErbB2受容体と二量化する。ErbB2受容体は、次いで分化可能な細胞の中で細胞内のチロシンキナーゼ活性に応答性となる。
【0098】
本明細書において使用される時、「ErbB3リガンド」はErbB3に結合するリガンドであって、ついでErbB2と二量化し、その結果、ErbB2/ErbB3ヘテロ二量体受容体のErbB2部分のチロシンキナーゼ活性を活性化するものをいう。ErbB3リガンドの非限定的な例としてはニューレグリン−1;ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、ニュー分化因子(Neu Differentiation Factor:NDF)、アセチルコリン受容体由来作用(ARIA)、膠細胞増殖因子2(GGF2)、および知覚性および運動性ニューロン−由来要素(Sensory And Motor Neuron-Derived Factor:SMDF)を含むニューレグリン−1のスプライス変異体とアイソフォーム;ニューレグリン−2;NRG2−βを含むがこれに限定されないニューレグリン−2のスプライス変異体(splice variants)とアイソフォーム;エピレグリン;ビレグリン(Biregulin)があげられる。
【0099】
1つの実施態様では、ErbB2−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段は、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(Heregulin−P:HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、ニュー分化因子(NDF)、アセチルコリンの受容体由来活性体(ARIA)、膠細胞増殖因子2(GGF2)、運動ニューロン由来要素(motor-neuron derived factor:SMDF)、ニューレグリン−2、ニューレグリン−2p(NRG2−P)、エピレグリン(Epiregulin)、ビレグリン、およびそれらの変異体、機能的な断片からなる群から選択された少なくとも1つのErbB3リガンドを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、たとえば二個以上ErbB3リガンドを使用することであるがこれらに限定されない、ErbB2−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する1より多い手段を含む。
【0100】
さらなる具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、ErbB3リガンドは、HRG−P、またはそれらの変異体、機能的な断片である。1つの実施態様では、培地添加タンパク質、ポリペプチド、それらの変異体または由来体の機能的な断片は、培養される細胞種と同じである。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、培養における添加物としてハツカネズミ(mus musculs) HRG−P配列と同じアミノ酸配列を有するHRG−Pを使用でき、「同じ種」であると考えられる。他の実施態様では、生物学的添加物から誘導された種は、培養される細胞と異なっていると考えられる。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、ヒトHRG−P配列と同じアミノ酸配列を有するHRG−Pを使用でき、「異なる種」または「ゼノグラフィック(xenographic)」であると考えられる。
【0101】
本発明の1つの実施態様では、本発明の組成物と方法は外因のインスリンとインスリン代用物を含まない。「外因のインスリンまたはインスリン代用物」を含まないという句は、インスリンまたはインスリン代用物を故意に本発明の組成物または方法に追加されないということを示すのに本明細書に使用される。本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は、したがって、故意に供給されるインスリンまたはインスリン代用物を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性インスリンを含むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性インスリン」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞が自らの作用としてインスリンを製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性インスリンが使用されることもある。具体的例では、本発明の組成物および方法は、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1マイクロg/ml以下のインスリンを含んでいる。
【0102】
本明細書において使用される時、「インスリン」という用語は、正常な生理学的濃度でインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、タンパク質、変異体またはその断片を示す。「インスリン」という用語は、すべての自然なヒトインスリン、他の哺乳動物インスリン、これらの配列の同族体やまたは変異体のポリペプチド配列を有するタンパク質を包含する。さらに、用語インスリンはインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、ポリペプチド断片を包含する。「インスリン代用物」という用語はインスリンとして実質的に同様の結果を与えるためにインスリンに代わって使用されるすべての亜鉛含有化合物をも包含する。インスリン代用物の例としては、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛を含むが、これらに限定されない。
【0103】
はっきり言えば、インスリン様増殖因子は、本発明で企図されるインスリン代用物でなく、またインスリンの同族体でもない。従って、別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は少なくとも1つのインスリン様増殖因子(IGF)、変異体またはそれの機能的な断片の使用を含む。別の実施態様では、本発明の組成物および方法はすべての外因のインスリン様増殖因子(IGFs)も含まない。具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1ng/ml以下のIGF−1を含んでいる。
【0104】
本明細書において使用される時、「IGF−1Rのアクチベータ」という用語は調整された細胞増殖、分化、およびアポプトーシスにおいて極めて重要な役割を果たす有糸分裂促進因子をいう。IGF−1Rのアクチベータの効果は、他の受容体を通して媒介されることもできるが、IGF−1Rを通して通常媒介される。また、IGF−1Rは腫瘍ウイルス蛋白質と癌遺伝子産物によって引き起こされた細胞形質転換を含み、相互作用は特異的結合蛋白質(IGFBPs)のグループによって規制される。さらに、IGFBPプロテアーゼの大きいグループはIGFBPsを加水分解し、IGFs結合を解離し、IGF−1Rと相互作用する能力を再開する。本発明の目的のために、リガンド、受容体、結合蛋白質、およびプロテアーゼはすべてIGF−1Rのアクチベータであると考えられている。ある実施態様では、IGF−1Rのアクチベータは、IGF−1、またはIGF−2である。更なる実施態様では、IGF−1RのアクチベータはIGF−1類似物である。IGF−1類似物の非限定的な例は、LongR3−IGFl,Des(l−3)IGF−1,[Arg3]IGF−l,[Ala31]IFG−1,Des(2,3)[Ala31]IGF−1,[LeU24]IGF−l,Des(2,3)[Leu24]IGF−l,[Leu60]IGF−l,[Ala31][Leu60]IGF−l,[Leu24][Ala31]IGF−l,およびそれらの組み合わせである。更なる実施態様では、IFG−1類似物はLongR3−IGFlである。LongR3−IGFlはヒトインスリン増殖因子−1の組換え型の類似物である。LongR3−IGFlは、約1ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約5ng/mlから約500ng/ml、より望ましくは約50ng/mlから約500ng/ml、より望ましくは約100ng/mlから約300ng/mlまたは約100ng/mlである。
【0105】
ある実施態様では、本発明の組成物および方法は、形質転換増殖因子ベータ(transforming growth factor beta:TGF−β)、またはTGF−βファミリー、変異体またはそれの機能的な断片を含む。本明細書において使用される時、「TGF−βファミリーのメンバー」という用語または増殖因子に関連して使用される同様の語は、TGF−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはTGF−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはTGF−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる。本発明の具体的な実施対態様では、TGF−βファミリーのメンバーが存在する場合には、TGF−βファミリーのメンバー、変異体またはそれの機能的な断片がSMAD2または3を活性化する。ある実施態様では、TGF−βファミリーのメンバーは、ノーダル(Nodal)、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる。1つの実施態様では、TGF−βファミリーのメンバーはアクチビン A、アクチビン B、ノーダル、GDF−8、およびGDFである。
【0106】
ノーダル(Nodal)が存在している場合には、約0.1ng/mlから約2000ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約10ng/mlから約750ng/ml、より望ましくは約25ng/mlから約500ng/mlの初期濃度で存在していることが企図される。使用される場合には、アクチビン Aは約0.01ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約25ng/ml、または望ましくは約10ng/mlの初期濃度において存在していることが企図される。存在する場合には、TGF−βは約0.01ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約50ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約20ng/mlの初期濃度において存在していることが企図される。
【0107】
本発明の追加の実施態様では、本発明の組成物および方法はFGF受容体のアクチベータを含まない。本明細書において使用される時、「FGF受容体のアクチベータ」という用語は、一般に、FGF−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはFGF−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはFGF−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる増殖因子をいう。ある実施態様では、FGF受容体のアクチベータはFGFであり、たとえばαFGFおよびFGF2であるが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、組成物および方法には外因のFGF2を含まない。「外因のFGF2」を含まないとの用語は、故意に本発明の組成物または方法に線維芽細胞増殖因子2、すなわち塩基性FGFが追加されないことを示すものとして本明細書に使用される。したがって、本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は故意に供給されたFGF2を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性のFGF2を含むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性のFGF2」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞それ自身がFGF2を製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性FGF2が使用されることもある。具体例としては、本発明の組成物または方法は、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ng/ml以下のFGF2を含んでいる。
【0108】
しかしながら、本発明の組成物および方法は、FGFポリペプチド、その機能的な断片またはその変異体を包含するFGF受容体の少なくとも1つのアクチベータを含むことができると企図される。FGF2が存在する場合には、約0.1ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.5ng/mlから約50ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約25ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約12ng/ml、また最も望ましくは約8ng/mlの初期濃度において存在することが企図される。別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は、FGF2以外のFGF受容体の少なくとも1つのアクチベータを含むことができる。例えば、本発明の組成物および方法は、FGF−7、FGF10、FGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも1つを含むことができる。具体的実施態様では、FGF−7、FGF−10とFGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも2つが存在している。別の実施態様では、FGF−7、FGF−10、FGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の3つのすべてが存在している。FGF−7、FGF−10、FGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片のいずれかが存在する場合には、それぞれが約0.1ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.5ng/mlから約50ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約25ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約12ng/ml、また最も望ましくは約8ng/mlの初期濃度において存在することが企図される。
【0109】
さらなる実施態様では、本発明の組成物および方法は、血清アルブミン(SA)を含む。具体的実施態様では、SAはウシのSA(BSA)または好ましくはヒトのSA(HAS)のどちらかである。具体的実施態様では、SAの濃度は容積(v/v)で約0.2%以上であるが、約10%v/v以下である。さらなる具体的な実施態様では、SAの濃度は、約0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、 0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%、3.2%、3.4%、3.6%、3.8%、4.0%、4.2%、4.4%、4.6%、4.8%、5.0%、5.2%、5.4%、5.6%、5.8%、6.0%、6.2%、6.4%、6.6%、6.8%、7.0%、7.2%、7.4%、7.6%、7.8%、8.0%、8.2%、8.4%、8.6%、8.8%、9.0%、9.2%、9.4%、9.6% および 9.8%(v/v)よりも高い。
【0110】
従って本発明の細胞培養環境および方法は接着培養に細胞をプレーティングすることを含む。本明細書において使用される時、「プレートされる」、および「プレーティング」という用語は、細胞が接着培養中で成長することを許容する任意のプロセスをいう。本明細書において使用される時、「接着培養」という用語は、細胞が固体表面で培養される培養システムであって、該固体表面は不溶性基体でコーティングされ、ついで以下に例示されるような基体の他の表面被覆でコーティングされるか、または細胞が増殖するか安定することを許容する任意の他の化学物質または生物物質などでコーティングされるものをいう。細胞はしっかりと固体表面、または基体に接着することができるし、またそうでないこともできる。接着培養のための基体は、ポリオルニチン(polyornithine)、ラミニン、ポリリシン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、多糖分解酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、およびポリ乳酸グリコール酸(PLGA)の一つ又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。さらに、接着培養のための基体はフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを含むことができる。本明細書において使用される時、「細胞外マトリックス」という用語は、上で説明した固体基体(ただしこれらに限定されない)を包含し、並びにフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを包含する。1つの実施態様では、細胞はMATRIGEL(登録商標)でコーティングされたプレート上にプレーティングされる。別の実施態様では、細胞はフィブロネクチンコーティングされたプレート上にプレーティングされる。ある実施態様では、細胞がフィブロネクチン上にプレーティングされる場合、プレートは10マイクロg/mlのヒト血漿フィブロネクチン(インビトロゲン、#33016−015)のコーティングで調製され、組織グレード水で希釈され、室温で2〜3時間保持される。別の実施態様では、細胞がプラスチック上にプレーティングされるのを許容するため、24時間までの間、血清を媒体中に置くことができる。細胞の接着を促進するために血清を使用する場合には、次に、培地が移されて、事実上血清を含まない組成物をプレーティングされた細胞に加える。
【0111】
本発明の組成物および方法は、分化可能な細胞が本質的にはフィーダー細胞またはフィーダー層を含まない条件下で培養されることを企図する。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞(feeder cell)」は生体外で成長する細胞である。すなわち、標的細胞と共同培養される。存在する場合には、フィーダー細胞は標的細胞の本質的な細胞密度の要求を満たし、標的細胞についての基体または細胞−細胞相互作用を提供し、細胞培地をコンディショニングし、および/または分化の段階で標的細胞を安定化させる。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞」という用語と「フィーダ細胞層」とは互換性を持って使用できる。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞を本質的に含まない」との用語は、フィーダー細胞を含まないか、または「デ ミニマス(de minimus)」の数のフィーダー細胞を含む組織培養条件を示す。「デ ミニマス」の用語は、分化された細胞がフィーダー細胞上で培養されていた先の培養条件から現在の培養条件へ持ち越された、フィーダー細胞の数を意味する。上記の方法の1つの実施態様では、分化の現状における標的細胞を安定させるフィーダー細胞から、コンディショニングされた培地を得る。別の実施態様では、定義された培地はコンディショニングされていない培地であり、これはフィーダー細胞から得られない培地である。
【0112】
本明細書において使用される時、細胞または細胞培養物の細胞の分化状態に関連して使用される時に「安定」という用語は、細胞が複数の代にわたり培地中で増殖を続け、好ましくは無期限に培地中で増殖を続け、全部ではなくてもほとんどの培地中の細胞が同じ分化状態にあることを意味する。さらに安定した細胞が分裂するとき、分裂は同じ細胞タイプの細胞または同じ分化状態の細胞を通常もたらす。一般に、安定した細胞または細胞集団は、培養条件が変更されない場合には、さらなる分化又は再分化せず、細胞は継代され続け、過成長しない。1つの実施態様では、安定している細胞は、無期限に、または少なくとも2代以上にわたり、安定状態で増殖ができる。より具体的な実施態様では、細胞は3代以上、4代以上、5代以上、6代以上、7代以上、8代以上、9代以上、10代以上、15代以上、20代以上、25代以上、30代以上にわたり、細胞は安定している。1つの実施態様では、細胞は約1カ月以上、2カ月以上、3カ月以上、4カ月以上、5カ月以上、6カ月以上、7カ月以上、8カ月以上、9カ月以上、10カ月、または11カ月の連続した継代において安定である。別の実施態様では、約1年間以上の連続した継代において、細胞は安定している。1つの実施態様では、それらが分化されるのが望ましくなるまで、幹細胞は多分化能状態で定義された培地において通常の継代で維持される。本明細書において使用される時、「増殖」という用語は細胞培養における細胞の数の増大について言う。
【0113】
ある実施態様では、本発明の組成物と方法はBMPシグナリングのイナクチベータを含む。本明細書において使用される時、「BMPシグナリングのイナクチベータ」とは、1種以上のBMPタンパク質の活性、またはそれらの上流または下流シグナルコンポーネンツのいずれかを、可能なシグナリング経路のいずれかを介して拮抗する薬剤をいう。BMPシグナリングのイナクチベートに使用される1つまたは複数の化合物は、当技術分野で知られているもの、または今後発見される任意の化合物であることができる。BMPシグナリングのイナクチベータの非限定的な例としては、ドミナント−陰性 トランケイティド (dominant-negative, truncated)BMP受容体、可溶性のBMP受容体、BMP受容体−Fcキメラ、ノギン(noggin)、ホリスタチン(follistatin)、神経由来因子(chordin)、グレムリン(gremlin)、セルベラス/DANファミリー蛋白質(cerberus/DAN family proteins)、ベントロピン(ventropin)、高ドーズアクチビン(high dose activin)、およびアムニオンレス(amnionless)があげられる。
【0114】
ある実施態様では、本発明の組成物と方法は少なくとも1つのホルモン、シトキン、アディポカイン、成長ホルモン、それらの変異体またはそれらの機能的な断片を含むことができる。ある実施態様では、定義された培地に存在している成長ホルモンは、定義された培地で培養される分化可能な細胞と同じ種のものであると想定される。したがって、例えば、人間細胞が培養されているなら、成長ホルモンは人成長ホルモンである。また、培養細胞と異なった種から来ている成長ホルモンの使用も企図される。望ましくは、ホルモン、シトキン、アディポカイン、および/または成長ホルモンは、約0.001ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約0.001ng/mlから約250ng/ml、または、より望ましくは約0.01ng/mlから約150ng/mlの初期濃度で存在する。
【0115】
本発明の組成物と方法に含むことができるシトキンとアディポカインの例としては、シトキン類の4αヘリックスバンドルファミリー、シトキン類のインターロイキン−1(IL−I)ファミリー、シトキン類のIL−17ファミリー、およびシトキン類のケモカインファミリーを含むが、これらに限定されない。もちろん、本発明はシトキン類のこれらのファミリーのそれぞれのメンバーとサブクラスを企図し、たとえば、CCケモカイン類、CXCケモカイン類、Cケモカイン類およびCX3Cケモカイン類、インターフェロン類、インターロイキン類、リンホトキシン類、c‐kitリガンド、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor:GM-CSF)、単球−マクロファージコロニー刺激因子(monocyte-macrophage colony-stimulating factor;M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−1(PAI−1)、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、腫瘍壊死因子ベータ(TNFβ)、白血病阻止因子、ビスファチン、レチノール結合蛋白4(RBP4)、エリスロポイエチン(EPO)、スロンボポエチン(THPO)があげられるが、これらに限定されるものではない。もちろん、当業者は本発明が上に記載された要素の変異体または機能的な断片を企図していることを理解するだろう。
【0116】
本発明は分化可能な細胞を培養する方法に関し、この方法は、細胞培養表面に分化可能な細胞をプレーティングすることを含み、基本栄養塩溶液を細胞に提供して、細胞にErbB2−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を提供することを含む。
【0117】
1つの実施態様では、血清または血清代替物の非存在下、およびフィーダー細胞層の非存在下で、少なくとも1つの本発明の組成物と分化可能な細胞が接触し、細胞が少なくとも1カ月、未分化状態で維持されるようにされる。多分化能は表面マーカ−、転写性マーカー、核型、3つの胚葉層の細胞に分化する能力に関する細胞のキャラクタリゼーションを介して決定できる。当業者にとって、これらのキャラクタリゼーションは周知である。
【0118】
「懸濁」との用語が細胞培養の文脈で使用される場合、当技術分野で用いられる意味で使用される。すなわち、細胞培養懸濁液は、細胞または細胞集合体が表面に接着しない細胞培養環境である。当業者は懸濁培養技術に詳しく、たとえば、これらに限定されるものではないが、フローフード類(flow hoods)、インキュベータ、および/または、細胞を一定の動きに維持するために使用される装置、例えば、撹拌機プラットホーム、シェーカーなどを必要に応じて備えることができる。本明細書において使用される時、細胞が動いている場合、またはそれらの間の環境が細胞に対して動いている場合には、細胞には「動き」がある。細胞が「動き」の状態に維持されると、1つの実施態様では、動きは細胞をせん断力に暴露することを避けるか、または防ぐように設計されている「優しい動き」または「優しい撹はん」となるだろう。
【0119】
細胞集合体を作るさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、例えば「ハンギングドロップ(hanging drop)」法が知られ、この方法では組織培養液の逆さの滴の中で細胞が滴の底部に沈み、集まり、実験フラスコ中で細胞懸濁液を震動させる。これらのテクニックの種々の変法も使用できる。例えば、N.E.Timminsら,(2004)Angiogenesis 7,97-103;W.Daiら,(1996)Biotechnology and Bioengineering 50,349-356;R.A.Fotyら,(1996)Development 122,1611−1620;G.Forgacsら,(2001)J.Biophys.74,2227-2234(1998);K.S.Fumkawaら,Cell Transplantation 10,441-445;R.Glicklisら,(2004)Biotechnology and Bioengineering 86,672-680;Carpenedoら,(2007)Stem Cells 25,2224-2234;およびT.Korffら,(2001)FASEB J.15,447-457を参照。これらの全体は本明細書に参照され組み込まれる。より最近では、細胞集合体はマイクロパターン化されたコロニーを懸濁液内にこすり落とし、マイクロタイタープレートのコロニーを遠心分離で取り出し懸濁液にするか、またはピペットを使用してパターンドマイクロウェルで成長されたコロニーを取り出し懸濁させる(Ungrin他、(2008)PLoS ONE 3(2)、1-12;Bauwens他、(2008)、Stem Cells Published online June 26,2008)。本明細書に記載された細胞集合体を製造するのにそのような方法を使用できるが、本明細書に製造された細胞集合体は、同期した有向分化(synchronous directed-differentiation)のために上記のd’Amour他2006に記載されているようにして、最適化される。これらの他の方法と異なって、本明細書に記載された懸濁液中における細胞集合体を製造するための方法は大規模製造に影響を受けやすい。
【0120】
一般に、本発明の細胞培地組成は、少なくとも1日に1度リフレッシュされるが、よりしばしばまたは、より少なく懸濁培養物の具体的必要性と事情によって媒体を変えることができる。生体外で、細胞は、通常バッチ・モードにより培養液で育てられて、様々な培地条件に暴露される。本明細書に記載されたように、細胞は接着培養として、または懸濁中における細胞集合体として皿培地中に存在して、取り囲む培地に接触し;および定期的に廃棄物培地が取り替えられる。一般に、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、または24時間毎、またはそれの任意の時間で培養液をリフレッシュできる。追加例では、1.1日、1.2日、1.3日、1.4日、1.5日、1.6日、1.7日、1.8日、1.9日または2日またはそれ以上ごとに、またはそれらの間の任意の期間で培地はリフレッシュされることができるが、これらに限定されるものではない。
【0121】
しかし、本発明の別の実施態様では、増殖因子および頻繁に取り替えられなければならない他の薬剤の分解を防止するために環流方法(perfusion method)が採用され、または一定期間の間に培地からの廃棄物を減耗する手段として環流方法が採用された。例えば、米国特許第5,320,963号は、懸濁細胞の潅流培養のためのバイオリアクタについて説明する。米国特許第5,605,822号は、環流による培養でのHSC細胞の成長のために、増殖因子を提供するのにストロマ細胞を使うバイオリアクタシステムについて説明する。米国特許第5,646,043号は、HSC細胞の成長のための培地組成物を含む連続した周期的環流でのHSC細胞の成長について説明する。米国特許第5,155,035号は、流体培地回転による細胞の懸濁培養のためのバイオリアクタについて説明する。これらは参照され本明細書にそれらの全体が取り入れられる。
【0122】
一般に、本発明の培地組成物中で懸濁培養される細胞は、ほぼ毎週、「スプリット(split)」または「継代(passage)」されるが、細胞は具体的な必要性および懸濁培養の環境に応じて、より頻繁にまたはより少ない頻度で継代されることができる。例えば、細胞は1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日間、またはそれらの間の任意のタイムフレームで継代されることができる。本明細書において使用される時、それが細胞培養の文脈で使用される場合、「スプリット」または「継代」という用語は、当該技術分野における使用されている意味で使用される。すなわち、細胞培養スプリットまたは継代は、前の培養からの細胞の収集と、新しい細胞培養容器への、より少ない数の収集された(収穫された)細胞の移転である。一般に、継代細胞は、健康な細胞培養環境で成長し続けることができる。当業者は細胞培養継代のプロセスおよび方法になじみ深く、これは必ずではないがそれらの成長エキスパンションの間に一緒に集合している細胞を分けるために使用できる酵素的または非酵素的方法の使用を含む。
【0123】
ある場合に、ある程度の細胞死が、継代直後の(懸濁または接着培養の)細胞で起こることがある。1つの実施態様では、分化可能な細胞は、24時間以上細胞媒体のリフレッシュを遅らせることによって継代から「回復できる」。その後、より頻繁に細胞媒体を変えることができる。別の実施態様では、細胞培地は、さらに細胞死の防止剤を含むことができる。例えば最近Wantanabe他は、解離の後にヒト胚性幹細胞を保護するためにRho−関連キナーゼ阻害薬(Rho-associated kinase inhibitor)、Y27632の使用を開示する。Wantanabe,K.,ら,Nat.Biotechnol,25(6):681-686(2007)を参照されたい。これは参照され、本明細書に援用される。追加の実施態様では、細胞培地は、継代直後の細胞死を防ぐか、または減衰させるようにカスパーゼ阻害剤、増殖因子または他の栄養素を含むことができる。使用できる物の具体的例としては、HA1077、ジヒドロクロライド(Dihydrochloride)、ヒドロキシファスジル(Hydroxyfasudil)、Rho キナーゼ 阻害剤、Rho−キナーゼ 阻害剤 II、Rho キナーゼ 阻害剤 III、キナーゼ 阻害剤 IV、およびY27632があげられるが、これらに限定されるわけではない。なお、上記の物質はすべて商業的に利用可能である。さらに別の実施態様では、細胞継代直後またはその間の細胞死を防ぐかまたは減衰させるために使用される物質または要素は、細胞が継代のプロセスから回復した後に、細胞培地から取り除くことができる。追加の実施態様では、未分化型胚性幹細胞は、標準のベース培地中で有効に集合することができ、解離と集合の間、生育性を維持するためにY27632または他の関与を必要としない。
【0124】
また、追加の実施態様では、本発明の組成物および方法は界面活性化合物の存在または使用を含むことができる。1つの特定の実施例では、本発明の組成物と方法は懸濁培養において少なくとも1つの表面活性剤を含む。界面活性化合物は、当技術分野で周知であり、一般的には両親媒性である。具体的実施態様では、本発明はアニオン系、カチオン性、ノニオン性または双性である少なくとも1つの表面活性剤の使用を含む。本発明の組成物および方法に使用される表面活性剤の濃度の決定は、ルーチン的な検査と最適化の問題である。たとえばオーエン他は、ヒーラ細胞とヒト羊膜細胞の細胞培養法における界面活性化合物の使用を報告する。Owenら,J.Cell.Sc,32:363-376(1978)を参照。これは参照して本明細書に組み込まれる。使用できる界面活性化合物の例としては、これらに限定されるわけではないが、以下の物質があげられる;ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、アンモニウムラウリル硫酸、および他のアルキル硫酸塩;ナトリウムラウレススルフェート(SLES)、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、石鹸、または脂肪酸塩、セチルトリメチルアンモニウム臭素(CTAB)(ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム)、および他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム(CPC)、ポリエトキシル化獣脂アミン(POEA)、ベンズアルコニウム塩化物(BAC)、ベンズエトニウム塩化物(BZT)、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、コカミドプロピルベタイン、ヤシアンフォグリシナート、アルキルポリ(エチレンオキシド)、ポリエチレンオキシドとポリプロピレン・オキシドコポリマー、たとえばプルロニック(Pluronic)F68、アルキルポリグリコシド、たとえば、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、コカミド MEA、コカミドDEAおよびコカミドTEA、および/または、ポリオキシエチレン−ソルビタン モノラウレート(トゥイーン)があげられるが、これらに制限されるものではない。
【0125】
本明細書に記載された実施態様は、低せん断環境を維持することにより、システムの細胞濃度を維持して、流体せん断応力を最小にし、hES細胞を増殖させ、および/または分化させる大規模製造のための方法を提供する。特に、本発明は60mmの皿、6ウェルのプレート、回転するボトル、バイオリアクタ(例えば、スピナーフラスコ)、容器、およびクローズドループシステムなどで細胞懸濁液を培養することによる、真核細胞製造スケールアップシステムにおける低せん断環境を維持するための方法を提供する。あるいはまた、細胞を培養する連続かん流システムは、細胞の懸濁、酸化、および新鮮な栄養物の提供のため、すなわち成長および/または分化のために、バイオリアクタまたは容器内における撹拌または動きを必要とする。細胞懸濁液を得るために、バイオリアクタ容器は典型的にはせん断応力の可能なソースである1種以上の可動な機械的撹はん装置を使用する。
【0126】
分化可能な細胞は、酵素学的または非酵素学的方法を使用して、または、本発明の定義された培地との接触の前および接触の後の手動の解離方法により、継代することができる。当技術分野において手動の継代技術についてはよく説明されており、たとえばSchulzら,2004 Stem Cells,22(7):1218−38に記載されている。機械的な継代は追加の物質を含まないが、多能性細胞またはそれらの誘導体を大規模で生産するためには効率的でない。たとえばバイオリアクターまたは大きなフラスコ中での、たとえばGMP−コラゲナーゼのような酵素の使用が企図される。酵素的な解離方法の非限定的な例としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、ACCUTASE(登録商標)などのプロテーアーゼの使用を含む。1つの実施態様では、ACCUTASE(登録商標)は接触された細胞の継代に使用される。酵素的継代方法が使用されるとき、得られた培養物は、シングレット(singlet)、ダブレット(doublet)、トリプレット(triplet)および細胞のクランプ(clumps)を含むことができ、これらは使用された酵素の種類に応じてサイズが異なる。非酵素学的解離方法の非限定的な例は細胞分散バッファ(cell dispersal buffer)である。存在する場合には、細胞外マトリックスの選択により継代方法の選択は影響を及ぼされるが、当業者によって容易に決定されることができる。
【0127】
本発明の方法で使用される離解溶液(disaggregation solution)は、大規模な急性毒性を細胞に引き起こさずに、単独細胞に細胞をばらばらにするか、または離解することができる離解溶液であることができる。離解溶液の例は、トリプシン、ACCUTASE(登録商標)、0.25%のトリプシン/EDTA、TrypLE、またはVERSENE(登録商標)(EDTA)とトリプシンを含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、少なくともいくつかの単独細胞が離解され再培養できることを条件として、集密層または懸濁液中のあらゆる細胞が単独細胞に離解されることを必要とするわけではない。
【0128】
培養の始め、または継代の後に、どんな密度でも分化可能な細胞をシードでき、培養チャンバーにひとつの細胞でもよい。さまざまな要素によって、シードされる細胞の細胞濃度を調整できる。たとえば接着培養、懸濁培養の使用、使用される培養細胞培養液の具体的処方、生育条件、および培養される細胞の企図された使用を含む。細胞培養密度の例としては以下があげられる;0.01×105細胞/ml,0.05×105細胞/ml,0.1×105細胞/ml,0.5×105細胞/ml,1.0×105細胞/ml,1.2×105細胞/ml,1.4×105細胞/ml,1.6×105細胞/ml,1.8×105細胞/ml,2.0×105細胞/ml,3.0×105細胞/ml,4.0×105細胞/ml,5.0×105細胞/ml,6.0×105細胞/ml,7.0×105細胞/ml,8.0×105細胞/ml,9.0×105細胞/ml,または10.0×105細胞/ml、またはそれ以上、たとえば5×107細胞/mlまでが、良好な細胞の生存を示して培養される。これらの値の間の任意の値も採用できる。
【0129】
上記に加えて、本明細書に使用される時には、「細胞濃度操作」という用語、「操作された細胞濃度」またはそれの等価な表現は、製造プロセスまたはシステムでの細胞密度が操作され、増殖性または分化性のhES細胞培養物を生産することをいう。そのような細胞濃度は、システムに供給されるビタミン、ミネラル、アミノ酸、代謝物などの栄養物、または酸素分圧などの環境条件が、細胞生育力を維持するために十分である下でのものをいう。あるいはまた、そのような細胞濃度は、細胞生育力を維持できるような速度でシステムから廃棄物を取り除くことができる下でのものをいう。当業者は容易にそのような細胞濃度を決定できる。
【0130】
維持できる作動細胞濃度は、少なくとも約0.5×106細胞/mlからである。典型的なスケールアップシステム作動式細胞濃度は、約0.5×106細胞/mlから約25×106細胞/mlの間である。例示的な濃度は、約2.5×106細胞/ml、22×106細胞/mlから、最大5×107細胞/mlの間である。本発明の方法では、細胞生存率は少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、および約100%までである。他のスケールアップシステム作動細胞濃度と許容細胞生存率レベルは、当業者によって認められ、当業者にとって周知のテクニックにより決定できる。例えば、バッチ、フェドバッチ(fed-batch)および連続供給される構成では、約0.5×106細胞/mlから15×106細胞/mlの間の細胞濃度であってもよい。
【0131】
ACEA Biosciences,Inc.(www.aceabio.com)からのRT−CES(登録商標)法を使用することで、細胞増殖と生育性を測定することができる、インピーダンスのリアルタイム測定値を提供する96ウェルの培養装置でhESCsを育てることができた。そのようなアプローチは分化可能な細胞における微妙であるか即座の効果のラベルを使用しない識別と定量化を可能にするだろう。また、増殖、アポプトーシスおよびモルホロジー変化のリアルタイム測定も可能にするだろう。
【0132】
さらに、冷凍、冷所保存、および解凍プロセスは、GMP規格により最適に行われる。冷凍保存法および従来のゆっくりとした冷却/急速な暖めの両方が、多能性細胞、少なくともhES細胞の冷所保存に使われた。Hunt C.J., et al., Methods Mol.Biol.(2007)368:261-270。Richards et al.(2004)他は、冷凍防止剤中の主な蛋白源として、胎児ウシ血清ではなくヒト血清アルブミンを使用し、閉鎖密閉ストロー内に冷所保存することを含む、hES細胞のための異物の無い凍結保存実験計画について説明した。Richards M., et al., Stem Cells (2004) 22:779−789を参照。Fujioka et al.(2004)は、ストローの代わりに、冷凍管を使用した冷所保存方法により、霊長類胚性幹細胞を低温保存した。猿胚性幹細胞についての生存率は6.5%、人間の胚性幹細胞についての生存率は12.2%であった。Fujioka T., et al., Int.J.Dev.Biol.(2004)48:1149−1154を参照。従って、本発明の1つの実施態様は、多能性細胞の適切な冷凍、および冷所保存または冷所貯蔵に関する。
【0133】
マルチポーネント細胞または分化細胞の生産のモニター
多能性細胞のマルチポーネント細胞、さらなるマルチポーネント細胞または分化細胞への進行は、ある種の遺伝子マーカーの発現を測定し、定量化することによってモニターすることができる。たとえば、TGF−βシグナル伝達物質のような外因性の要因の添加の前後の異なる時間ポイントで特定の遺伝子マーカーの存在または非存在を検出することができる。あるいはまた、ある種のマーカーの発現は、細胞培養または細胞集団の細胞内のマーカーの存在量を測定することによって、決定できる。例えば、あるプロセスで、多分化能細胞に対するマーカーの発現、およびマルチポーネント細胞または分化細胞に対するマーカーの顕著な発現の不足が決定される。
【0134】
最終的な内胚葉リネッジのタイプの、より低い分化細胞タイプの生産をモニターすることに関する説明として、マーカー発現を測定するのに、プロット移動法や免疫細胞学的方法(ICC)または免疫組織学的方法(IHC)のような、定性的または準定量的技術が使用できる。あるいはまた、Q−PCRなどのテクニックの使用で正確にマーカー発現を定量化することができる。さらに、あるポリペプチド濃度では、膵性の小島ホルモン発現細胞のマーカーの多くが分泌蛋白質である。細胞外マーカーの内容の測定のために、ELISAなどのテクニックを利用できる。
【0135】
本明細書に記載された多能性細胞の発現の進行(例えば上掲のD’Amour他2006で記載されているような、ステージまたは工程1−5の結果として生産された細胞)は、発生経路に沿ってそれぞれの多分化能由来細胞タイプに対するマーカーの発現を決定することによってモニターできる。例えば、いくつかのプロセスでは、多分化能由来の細胞タイプの識別とキャラクタリゼーションは、ある種のマーカーの発現または異なる発現水準、および1以上のマーカーのパターンにより行われる。すなわち、存在または非存在、発現の高低、1種以上のマーカーが、細胞タイプを代表して、同定する。また、ある種のマーカーは一過性発現を持つことができる。それによりマーカーは、1つの発展段階の間非常に発現され、別の発展段階では不十分に発現される。ある特定のマーカーの発現は、標準化されたかまたは正常にされた制御マーカーと比べて、細胞培養または細胞集団中の、細胞内のマーカーの存在量を測定することによって、決定できる。そのようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的であるか、または定量的であることができる。マーカー遺伝子によって生産されるマーカーの発現を定量化する1つの方法が定量的PCR(Q−PCR)の使用である。Q−PCRを実行する方法は当技術分野で周知である。
【0136】
さらに、他の実施態様では、Q−PCRは正確に細胞タイプをキャラクタリゼーションし、同定し、対象細胞タイプ中のそのようなマーカーの量と相対的比率の両方を決定するために、免疫組織化学的方法またはフローサイトメトリー法とともに使用される。1つの実施態様では、Q−PCRは細胞の混合種個体群を含む細胞培養物における、RNA発現のレベルを定量化できる。しかしながら、対象のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞中で共に発現されるか否かどうかは、Q−PCRは、提供できないし、定量化することができない。別の実施態様では、細胞タイプをキャラクタリゼーションし、同定するために、流動細胞計測法方法とともにQ−PCRが使用される。したがって、本明細書に記載した方法の組み合わせを使用して、内胚葉リネッジタイプ細胞を含む様々な細胞タイプの完全なキャラクタリゼーションと同定を実行して、示すことができる。
【0137】
それでも、また、当技術分野で知られている他の方法もマーカー遺伝子発現を定量化するために使用できる。例えば、対象となるマーカー遺伝子生成物に対して特異的な抗体を使用することによって、マーカー遺伝子産物の発現を検出できる(例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー分析、および同様のもの)。あるプロセスでは、多分化能誘導細胞のマーカー遺伝子特性の発現、および多分化能誘導細胞のマーカー遺伝子の欠如を検出できる。多分化能由来細胞タイプのキャラクタリゼーションおよび同定のための更なる方法は、上で示した関連出願に記載されている。本明細書に、関連出願の全体を参考として援用する。増幅分析における使用に適した増幅プローブ/プライマーの組み合わせは以下を含む:インシュリン(INS)(GenBank NM_000207):プライマーAAGAGGCCATCAAGCAGATCA(SEQ ID NO:1);
CAGGAGGCGCATCCACA(SEQ ID NO:2);Nkx6.1(NM_006168):
プライマーCTGGCCTGTACCCCTCATCA(SEQ ID NO:3);
CTTCCCGTCTTTGTCCAACAA(SEQ ID NO:4);Pdx1(NM_000209):
プライマーAAGTCTACCAAAGCTCACGCG(SEQ ID NO:5);
GTAGGCGCCGCCTGC(SEQ ID NO:6);Ngn3(NM_020999):
プライマーGCTCATCGCTCTCTATTCTTTTGC(SEQ ID NO:7);
GGTTGAGGCGTCATCCTTTCT(SEQ ID NO:8);
FOXA2(HNF3B)(NM_021784):
プライマーGGGAGCGGTGAAGATGGA(SEQ ID NO:9);
TCATGTTGCTCACGGAGGAGTA(SEQ ID NO:10);
グルカゴン(GCG)(NM_002054):
プライマーAAGCATTTACTTTGTGGCTGGATT(SEQ ID NO:[[16]]11);
TGATCTGGATTTCTCCTCTGTGTCT(SEQ ID NO:12);
HNF6(NM_030712):
プライマーCGCTCCGCTTAGCAGCAT(SEQ ID NO:13);
GTGTTGCCTCTATCCTTCCCAT(SEQ ID NO:14);
HNF4アルファ(NM_000457):
プライマーGAAGAAGGAAGCCGTCCAGA(SEQ ID NO:15);
GACCTTCGAGTGCTGATCCG(SEQ ID NO:16);
Sox17(NM_022454):プライマーGGCGCAGCAGAATCCAGA(SEQ ID NO:17);HLxB9(NM_005515):
プライマーCACCGCGGGCATGATC(SEQ ID NO:19);
ACTTCCCCAGGAGGTTCGA(SEQ ID NO:20);Nkx2.2(NM_002509):
プライマーGGCCTTCAGTACTCCCTGCA(SEQ ID NO:21);
GGGACTTGGAGCTTGAGTCCT(SEQ ID NO:22);PTF1a(NM_178161):
プライマーGAAGGTCATCATCTGCCATCG(SEQ ID NO:23)
GGCCATAATCAGGGTCGCT(SEQ ID NO:24);SST(NM_001048):
プライマーCCCCAGACTCCGTCAGTTTC(SEQ ID NO:25);
TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(SEQ ID NO:26);
PAX6(NM_000280):
プライマーCCAGAAAGGATGCCTCATAAAGG(SEQ ID NO:27);
TCTGCGCGCCCCTAGTTA(SEQ ID NO:28);
Oct4プライマー:TGGGCTCGAGAAGGATGTG(SEQ ID NO:29)
GCATAGTCGCTGCTTGATCG(SEQ ID NO:30);
MIXL1プライマーCCGAGTCCAGGATCCAGGTA(SEQ ID NO:31)
CTCTGACGCCGAGACTTGG(SEQ ID NO:32);
GATA4プライマーCCTCTTGCAATGCGGAAAG(SEQ ID NO:33)
CGGGAGGAAGGCTCTCACT(SEQ ID NO:34);
GSCプライマーGAGGAGAAAGTGGAGGTCTGGTT(SEQ ID NO:35)
CTCTGATGAGGACCGCTTCTG(SEQ ID NO:36);
CERプライマーACAGTGCCCTTCAGCCAGACT(SEQ ID NO:37)
ACAACTACTTTTTCACAGCCTTCGT(SEQ ID NO:38);
AFPプライマーGAGAAACCCACTGGAGATGAACA(SEQ ID NO:39)
CTCATGGCAAAGTTCTTCCAGAA(SEQ ID NO:40);
SOX1プライマーATGCACCGCTACGACATGG(SEQ ID NO:41)
CTCATGTAGCCCTGCGAGTTG(SEQ ID NO:42);
ZIC1プライマーCTGGCTGTGGCAAGGTCTTC(SEQ ID NO:43)
CAGCCCTCAAACTCGCACTT(SEQ ID NO:44);
NFMプライマーATCGAGGAGCGCCACAAC(SEQ ID NO:45)
TGCTGGATGGTGTCCTGGT(SEQ ID NO:46)。
FGF17(Hs00182599_m1)、VWF(Hs00169795_m1)、CMKOR1(Hs00604567_m1)、CRIP1(Hs00832816_g1)、FOXQ1(Hs00536425_s1)、CALCR(Hs00156229_m1)およびCHGA(Hs00154441_m1)を含む他のプライマーは、ABI Taqmanから利用可能である。
【0138】
多分化能懸濁集合培養を使うスクリーニング法
いくつかの実施態様では、スクリーニング法は、多能性、マルチポーネント細胞および/または分化細胞を含むある細胞集団を得るのに使われる。ついで候補分化因子(candidate differentiation factor)を細胞集団に提供する。候補分化因子を提供する前またはほとんど同時である最初の時間ポイントでは、マーカーの発現が決定される。あるいはまた、候補分化因子を提供した後に、マーカーの発現を決定できる。最初の時間ポイントに引き続く、候補分化因子を細胞集団に提供する工程に引き続く第2の時間ポイントで、同じマーカーの発現が再び決定される。候補分化因子が膵性前駆細胞の分化を促進できるかどうかが、第2の時間ポイントでのマーカーの発現を最初の時間ポイントでのマーカーの発現と比較することによって、決定される。最初の時間ポイントでのマーカーの発現と比べて、第2の時間ポイントでのマーカーの発現が増加するか、または減少しているなら、候補分化因子は膵性先祖細胞の分化を促進できる。
【0139】
本明細書に記載されたスクリーニング法の実施態様では、細胞集団は接触または別の方法で候補(テスト)分化因子が提供される。候補分化因子は上記の細胞のどれかの分化を促進する可能性を持つことができるどんな分子も含むことができる。別の実施態様では、候補分化因子は細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好適な実施例では、候補分化因子は人間の膵性先祖細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。
【0140】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子は低分子を含む。「低分子」の用語は、当該技術分野において使用されている低分子量有機化合物の意味で使用され、ポリマーではないものとして定義される。低分子は天然に存在するもの(内因性神経伝達物質など)、または当技術分野で知られていた合成有機化学方法で調製されたものであることができる。ある実施態様では、低分子は約800ダルトン以下の分子質量を有する分子である。
【0141】
本明細書に記載された他の実施態様では、候補分化因子は大きな分子、例えばポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意のポリペプチドであることができ、たとえば、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外マトリックス蛋白質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキンまたは成長因子であることができるが、これらに限定されるものではない。好ましいポリペプチドは成長因子を含んでいる。
【0142】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子は以下から成る群から選択された1種以上の成長因子を含む:アンフィレグリン、Bリンパ球刺激物質、IL−16、チモポエチン(Thymopoietin)、TRAIL/Apo−2、プレB細胞集落増強因子、内皮分化関連因子1(EDF1)、内皮単核細胞活性化ポリペプチドII、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、ナチュラルキラー細胞増強因子(NKEFA)、骨形成蛋白質2、骨形成蛋白質8(骨形成性タンパク質2)、骨形成タンパク質6、骨形成タンパク質7、結合組織生長因子(CTGF)、CGI−149タンパク質(神経内分泌分化因子)、サイトカイン A3(マクロファージ炎症蛋白1−α)、膠芽腫(Gliablastoma)細胞の分化関連タンパク質(GBDR1)、肝細胞癌(Hepatoma)由来の成長因子、肝細胞癌 U−25先駆体、導管内皮成長因子(VEGF)、導管内皮成長因子 B(VEGF−B)、T細胞特異性RANTES先駆体、胸腺樹状細胞−誘導因子1、トランスフェリン(Transferrin)、インターロイキン−1(IL1)、インターロイキン−2(IL2)、インターロイキン−3(IL3)、インターロイキン−4(IL4)、インターロイキン−5(IL5)、インターロイキン−6(IL6)、インターロイキン−7(IL7)、インターロイキン−8(IL8)、インターロイキン−9(IL9)、インターロイキン−10(IL10)、インターロイキン−11(IL11)、インターロイキン−12(IL12)、インターロイキン−13(IL13)、顆粒白血球(Granulocyte)−コロニー形成活性化因子(G−CSF)、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子(GM CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、エリトロポエチン(Erythropoietin);スロンボポエチン、コレカルシフェロール(ビタミンD3)、表皮(Epidermal)成長因子(EGF)、脳−誘導神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、aFGF FGF−4、FGF−6、FGF−7/ケラチノサイト増殖因子(KGF)、血小板−誘導成長因子(PDGF)、血小板由来成長因子−BB、ベータ神経成長因子、アクチビンA、形質転換成長因子β1(TGFβ1)、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死要素−α、腫瘍壊死要素−β、バースト促進活性(BPA)、赤血球促進活性(EPA)、PGE2、インシュリン成長因子−1(IGF−1)、IGF II、ニューロトロフィン成長因子(NGF)、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン4/5、線毛(Ciliary)神経栄養因子、グリア−誘導ネキシン、デキサメサゾン(Dexamethasone)、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸(Retinoic acid)、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシン(Amphotericin) B、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールリン酸、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン類、TWS119、オキシトシン、ヴァソプレッシン、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン(corticortropin);脂肪刺激ホルモン、甲状せん刺激ホルモン、成長ホルモン、乳腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン抑制因子、生長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状せん刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド1、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作動性小腸ペプチド、サブスタンスP、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン、神経ペプチドチロシン、インシュリン、グルカゴン、胎盤ラクトゲン、弛緩ホルモン、アンジオテンシンII、カルシトリオール(calctriol)、心房性ナトリウム利尿ペプチド、およびメラトニン、サイロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフリン、アンドロステン(androstiene)、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシン B、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールリン酸、ニコチンアミド、DMSO、トリアゾリジンジオン類、およびTWS119。
【0143】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、1以上の濃度で候補分化因子を細胞集団に提供する。いくつかの実施態様では、候補分化因子を細胞集団に提供し、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約0.1ng/mlから約10mg/mlの範囲である。いくつかの実施態様では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約1ng/mlから約1mg/mlの範囲である。細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約10ng/mlから約100マイクロg/mlの範囲である。さらに、他の実施態様では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約100ng/mlから約10マイクロg/mlの範囲である。好適な実施例では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約5ng/mlから約1000マイクロg/mlの範囲である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載されたスクリーニング法の工程は、最初の時間ポイントと2回目の時間ポイントで少なくとも1つのマーカーの発現を決定することを含む。これらの実施態様のいくつかでは、第1の時間ポイントは、候補分化因子を細胞集団に提供する前かまたはほとんど同時であることができる。あるいはまた、いくつかの実施態様では、第1の時間ポイントは候補分化因子を細胞集団に提供した後である。いくつかの実施態様では、複数のマーカーの発現は第1の時間ポイントで決定する。
【0144】
前述の方法は、生存率を上げ、分化状態を安定させ、成長を増加させ、hES細胞の多分化能を維持する低分子および他の化合物のためのスクリーニングに等しく適切である。当業者は本明細書に記載された技術をそのようなスクリーニング法に適合することができるであろう。
【0145】
第1の時間ポイントで少なくとも1つのマーカーの発現を決定することに加えて、本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、第1の時間ポイントの後であり、候補分化因子を細胞集団に提供した後である第2の時間ポイントにおいて少なくとも1つのマーカーの発現を決定することを企図する。そのような実施態様では、同じマーカーの発現を1番目と2番目の時間ポイントの両方で決定する。いくつかの実施態様では、複数のマーカーの発現は1番目と2番目の時間ポイントの両方で決定する。そのような実施態様では、同じ複数のマーカーの発現は1番目と2番目の時間ポイントの両方で決定する。いくつかの実施態様では、マーカー発現は複数の時間ポイントで決定され、それらはそれぞれ第1の時間ポイントの後であり、それらのそれぞれは候補分化因子を細胞集団に提供した後である。ある実施態様では、マーカー発現はQ−PCRで決定する。他の実施態様では、マーカー発現は免疫細胞学的方法で決定する。
【0146】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子を細胞集団に提供してから、第2の時間ポイントでマーカー発現を決定するまでに十分な時間を取ることができる。候補分化因子を細胞集団に提供してから、第2の時間ポイントでマーカー発現を決定するまでに十分な時間は、約1時間から最大約10日間であることができる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのマーカーの発現は、候補分化因子を細胞集団に提供した後の複数の時間で決定される。いくつかの実施態様では、十分な時間は少なくとも約1時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間から数日から数週間である。
【0147】
本明細書に記載された方法のいくつかの実施態様では、第1の時間ポイントでのマーカーの発現と比べて、第2の時間ポイントでのマーカーの発現が増減したかどうかさらに決定される。少なくとも1つのマーカーの発現の増大または減少は、候補分化因子が内分泌性前駆細胞の分化を促進できることを示す。同様に、複数のマーカーの発現が決定されるなら、第1の時間ポイントでの複数のマーカーの発現と比べて、第2の時間ポイントでの複数のマーカーの発現が増減したかどうかがさらに決定される。マーカー発現の増大または減少は、第1と第2の時間ポイントでの細胞集団における、マーカーの量、レベルまたは活性を測定するか、または他の方法で評価することによって決定できる。そのような決定は、他のマーカーとの相対値、例えば、ハウスキーピング遺伝子表現に対して、または絶対値であることができる。ある実施態様では、マーカー発現が第2の時間ポイントで第1の時間ポイントと比べて増加する場合には、増加量は少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、少なくとも約100倍または少なくとも約100倍以上である。いくつかの実施態様では、増加額は2倍より少ない。マーカー発現が第2の時間ポイントで第1の時間ポイントと比べて減少する場合には、減少の量は少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、少なくとも約100倍または少なくとも約100倍以上である。いくつかの実施態様では、減少の量は2倍より少ない。
【0148】
本出願を通じて、種々の文献が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、本発明の技術分野における技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願に参考として援用される。
【0149】
実施例
以下の実施例で使われた単純で定義された培地は、DC−HAIFと呼ばれ、DMEM/F12、非必須アミノ酸、微量元素、アスコルビン酸、β−メカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシン(任意)、カプリル酸抽出された脂肪酸非含有のBSA、鉄結合性グロブリン、組換え型のヘレグリン−1β(H)、アクチビンA(A)、LR3−IGF1(I)、およびFGF2(F)のタンパク質から本質的になる。DC−HAIFは多分化能hES細胞の長期維持をサポートし、またAccutase(登録商標)を使用した単独細胞継代およびhES細胞のスケールドエキスパンション(scaled expansion)をサポートした。上掲のRobins, A. & Schulz, T. 2009を参照。DC−HAIFのバッチテストされた市販製剤は、StemPro(登録商標) hESC SFMという商号でInvitrogenから利用可能である。
【0150】
これらの背景研究の間中、FGF2が定義された培地の必要な成分でなないことが明確になった。高濃度のときにさえ、FGF受容体の貧しいかまたは中程度のリン酸化だけが成長因子刺激の後に観測された。増殖、突発性分化または多分化能の維持について測定可能な影響を培養物に与えることなく、FGF2を定義された培地から省略できた。上掲のRobins, A. & Schulz, T. 2009を参照。したがって、以下の研究では、テキストおよび図の凡例に示すように、加えられたFGF2なしで行われた。さらに、いくつかの検定方法は、成長因子の組み合わせを変えることを要求したので、StemPro(登録商標) hESC SFMの成長因子を含まないバッチがLife Technologiesに特注され、購入され、そのような適応性を提供した。
【0151】
hES細胞培養で重要な機能を有する追加シグナリング経路にハイライトを当てるために、公知の生理活性を有する低分子化合物のライブラリから本質的に成るLOPACライブラリが、低密度hES細胞培養をスクリーニングするのに使われた。目的は、培養エキスパンションおよび/または、多分化能に否定的な影響を与えた低分子を同定することであった。主要な系路の阻害が、遅くされた増殖、細胞障害性、アポプトーシスまたは分化をもたらすと予想されるだろう。重要なことには、これらの一次的および二次的スクリーニングは、本明細書に記載された単純定義された培地を背景として実行され、血清またはセミ分画されたアルブミンなどの未定義の成分によって典型的に導入される変異性を減少させた。活性を決定するために、アルカリホスファターゼ染色検定が行われ、約50の低分子化合物がhES細胞成育と生存を含むhES細胞へのそれらの影響に関していくらかの測定できる活性を示した。これらの化合物の、細胞表面神経伝達物質受容体の多数の阻害剤が同定され、これらの受容体の自己再生におけるシグナリングの役割を少なくとも示唆している。天然由来のリガンドまたは薬品作用関連誘導体を使用して、数種類の低分子神経伝達物質(これらは副腎皮質ホルモンとしても機能する)が同定され、低密度でhES細胞成育のサポートおよび/または、エキスパンションと生存を示した。hES細胞の商業的および臨床用途に関する発展する先進技術に、そのような活性は重要である場合がある。たとえば信頼できる単独細胞クローニング、完全に定義された新規なhES細胞ラインの効率的な導出、GMP対応条件、懸濁液中におけるhES細胞の成長や継代の向上した生存などである。
【0152】
また、上記が本発明の例示の実施態様に関連し、本発明の範囲から逸脱せずに多数の変更を行うことができることが理解されるべきである。本発明は以下の実施例によってさらに説明される。実施例はいかなる方法でも本発明の範囲を制限することは意図されない。一方、手段は多くの他の実施態様、変更および等価手段を有し、本明細書に記載する説明を読んだ後に、本発明の精神および特許請求の範囲の記載から離れることなく明確に理解されるべきである。
【0153】
実施例1:
多能性幹細胞における重要な経路の同定
定義されたメディアDC−HAIF(StemPro(登録商標) hESC SFM、Life Technologies製)での生育の間、この定義された培地中のhES細胞の培養とAccutase(登録商標)による単一細胞継代が小規模培養形式における確固とした平板培養を可能にすることが示された。96−および384ウェルのプレートにこのアプローチを適用して、定量的で統計的に有意に細胞を数え、データは、ERBB2シグナリングの阻害剤であるAG825の自己再生への効果を確認した。
1ウエルあたりおよそ3×104のhES細胞がStemPro(登録商標) hESC SFMのマトリゲル(Matrigel)上で、96ウェルのプレートで約24時間培養された。次に培地を変えた。新しい培地は、LOPAC1280ライブラリ(表1の部分的なリスト)からの化合物の10マイクロMを含んでいて、培地はさらに48時間培養された。培養物はついで固定され、未分化型hES細胞のマーカーである内因性のアルカリホスファターゼ活性のために染色された。このアッセイの形式は影響を受けたウエル(非集密的成長)と、影響を受けないウェル(集密的成長(confluent growth))の明らかな区別を示した。
【0154】
よく特徴付けられた薬理活性を有する小有機分子のライブラリであるLOPAC1280のコレクション(Sigma Cat#LO1280)は、96ウェルプレート(合計16プレート)で上記のアルカリ性ホスファターゼ検出分析を使用することでスクリーニングされた。それぞれの96ウェルのアッセイは80個の化合物(1ウェルあたり1個の化合物)と16ウエルのDMSOキャリアネガティブコントロールで実行された。約50個以上の化合物が一次的なスクリーニングでhES細胞成育とエキスパンションに影響を与えるとして同定された。それらはついで二次スクリーニングにより38分子の群(表1)にされ、通常の知られている細胞傷害性分子類は除かれた(例えば、5アザシチジン)。これらの分子類によって影響を与えられそうな系路(したがってhES細胞において重要な系路)はNFκB、eNOS、RAR(a)、カルシウムチャネル、タヒキニンシグナリング、グアニリルシクラーゼ、SrcおよびJak2によるシグナリングを含む。
【0155】
二次スクリーニングは同じアッセイを使用することで実行されたが、10マイクロMではなく、0.1−50マイクロMの化合物の希釈列が使用された。それぞれの化合物の最小有効濃度を示す(表1)。興味深いことに、38の候補化合物のうち11(28%)は既知の、神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗体、モジュレータまたはリガンドであった(表1、図1)。hES細胞自己再生でのGABAシグナリングの役割は以前に(Ludwig et al., 2006)強調されていたが、他の定義されたメディア条件の下では調べられていない。未分化型多分化能性幹細胞での他の神経伝達物質のための潜在的役割は特徴付けられていない。
【0156】
【表1−1】
【0157】
【表1−2】
【0158】
【表1−3】
【0159】
実施例2:
定義された培地の低細胞濃度における多能性細胞自己再生をサポートする低分子
神経伝達物質受容体を通して作動するのが知られている11の候補化合物の一次的なLOPACスクリーニングでは、6つは拮抗体(アデノシン、ドーパミン、コリン作動性、NMDA、セロトニン、およびヒスタミン受容体)と1つの受容体モジュレータ(コリン作動性(ニコチン様の)の受容体)である(図1)。これらの受容体のブロッキングが増殖を禁止するか、またはアポプトーシスを引き起こすように見えたので、hES細胞の成育と生存に、受容体シグナルは重要であるかもしれない。したがって、リガンド駆動の受容体刺激がhES細胞での自己再生または他の望ましい活性に作用できるということになる。現在のhES細胞培養における主要な制限は低密度での細胞培養のが不能であることである。hES細胞の単独細胞クローニングのいくつかの報告にもかかわらず、完全に定義された培地における、個々のhES細胞の低密度培養とクローニングのための信頼できる条件は開発されていない。Amit et al., 2000 Dev Biol 227, 271-278; Pyle et al., 2006 Nat Biotechnol 24, 344-50; and Watanabe et al., 2007 Nat Biotechnol 25, 681-6を参照。そのような活性を顕在化させる低分子は、高密度、大規模なhES細胞の懸濁培養において、より高い培養/生存、集合または抗アポトーシス活性をサポートし、実質的な改善を提供すると予測されるだろう。上記で特定された受容体に対応する神経伝達物質リガンド、並びに他のさまざまな神経伝達物質リガンドは、hES細胞が低密度で培養された時に、細胞生存と増殖のサポートについてテストされた。
【0160】
コロニー形成アッセイ
約104hES細胞/ウエルでStemPro(登録商標) hESC SFM中、6ウェルのトレー中で、異なった化合物の存在下において約7日間培養された。培養物はついで固定され、アルカリホスファターゼ活性染色され、そして、コロニーが数えられた(図2)。50未満のコロニーがStemPro hESC SFM単独で、定義された培地で7日後に観測され、hES細胞がStemPro hESC SFMの臨界密度閾値以下で生存および/または、有効に増殖しなかったことを示した。
前の実験は、最小で約105の細胞が6ウェルのトレーの中のエキスパンションと連続継代に必要であることを示した。ROCK阻害剤のY27632が、MEFの低密度で育てられたhES細胞成長が報告されていた(Watanabe et al., 上掲)のでコントロールとして含まれていたが、定義された培地におけるコロニー生存/エキスパンションをサポートしなかった(0コロニー)。また、神経伝達物質ヒスタミン、ニコチン、およびNMDAも向上したコロニー形成をサポートしなかった。しかしながら、アデノシン、アセチルコリン(ACh)、およびノルエピネフリン((−)−ノルエピネフリン、または(±)ノルエピネフリン(+)酒石酸水素塩)のすべては、 向上したコロニー形成をサポートした(図2)。すべての3つの分子類が結合し、細胞表面受容体を活性化して、hES細胞で自己再生または反アポプトーシス信号に重要な、新たに認識されるシグナリング経路を示唆した。(±)ノルエピネフリン(+)−酒石酸水素塩は、特記の無い限り、ノルエピネフリン(NE)にかかわるすべての以下の実験に使用された。
【0161】
同様のコロニー計数法実験が、さまざまな細胞濃度(図3)を使用することで行われた。NEまたはAChの存在下において4回以上において、StemPro hESC SFM媒体単独と比べて多くのコロニーが検出され、それぞれ最低で1ウエル当たり1000細胞と500細胞であった。コロニー形成の頻度は異なる始めの密度と比較的一致しており、培養された細胞の2.5−3.5%のオーダーであった。より高い細胞濃度では、細胞移動は最初の約24時間の培養でミクロコロニーの形成につながる。上掲のRobins and Schulz 2009を参照されたい。これらの低密度検定方法でのコロニー形成の一貫した速度は、移動と菌株群形成よりむしろ単独細胞から多くのコロニーを得ることができたと示唆した。低細胞濃度で誘導されたコロニーのイメージは、緊密な、典型的なhES細胞形態を示した(図3)。しかしながら、コロニーの低い頻度は、よりゆるい、細胞のより星状のアレンジメントを示し、部分的な分化またはコロニー内のより不良な細胞−細胞接触を示した。
【0162】
リアルタイムの細胞指数モニタリング
より詳細に個々の神経伝達物質の潜在能力を調べて、相乗作用が異なった要素の間に存在しているかどうかを評価するために、低密度検定方法がリアルタイムのインピーダンスリーダーを使用することで実行された。ACEAバイオサイエンスRT−CESシステムは、細胞指数(cell index)の尺度に翻訳される電気インピーダンスの変化をモニターするために組み込まれたマイクロセンサを含む96−ウエルトレイを使用する。細胞培養中のどんな明白な変調も検出でき、たとえば細胞増殖、移動、細胞拡散、アポプトーシス、分化、および同様のものが検出できるがこれらには限定されない。前の実験は、hES細胞がRT−CESトレー中において、有効に接着しエクスパンドすることを示し、進行性の増加する細胞指数が未分化細胞(Q−PCRで確認される)の増殖を意味した。未分化型培養がいったんコンフリューエントになると、細胞指数は高いままであるが、毎日の給餌の間に上下する(波形:scallop)傾向がある。逆に、分化は典型的にはたとえば細胞指数における山と谷などのような特有のパターンの外観で示される。同様に上皮から間葉への変転(epithelial-to-mesenchymal transition)、平坦化、細胞移動、アポプトーシスまたは同様の分化とまたは成長に関連する変化を暗示する。
【0163】
有効な神経伝達物質濃度の力価測定
RT−CESシステムは、NEとAChが有効である濃度領域を調べるのに使用された。人間の胚性幹細胞は低密度、1000細胞/ウエルで、10日間、RT−CESトレー中で培養された(図4)。細胞はキャリアコントロール(DMSO)、NE、またはAChを含むStemPro hESC SFM中で直接培養された。予想された通り、細胞はDMSO単独では生存もしなかったし、有効に増殖もしなかった。細胞指数の上昇は9日後に観測されただけである。1マイクロMのNEは低密度生存/増殖に影響するように見えなかったが、細胞指数の増大は最初の約6.5日間で5、10、および50マイクロM NEで検出された。70マイクロMおよび100マイクロM NEの両方では、細胞指数は次第に速い上昇を示して、それぞれ約9日と10日の後に明らかにコンフリューエントであった。AChの力価測定は類似パターンをもたらした、また、効果を顕在化させた最も低い濃度は5マイクロMであった。これらのデータはNEとAChの両方のための増加する用量応答を示唆した。これは受容体仲介機構と一致した、NEとAChの両方が次に50マイクロMで使用された。それは、それぞれの神経伝達物質のための中間濃度を表した。
【0164】
神経伝達物質組み合わせ
低分子神経伝達物質の潜在的追加効果を調べるために、hES細胞は、キャリア対照(DMSO)、またはNE、ACh、アデノシン、GABA、Y27632、またはこれらの要素の2つの組み合わせを含むStemPro hESC SFM中で培養された(図5)。DMSO単独、またはY27632の存在下において、細胞は生存も増殖もしなかった。細胞膨張の3つのパターンが検出された。50マイクロM NE、またはAChの、ただ一つの要素としての追加が、有効な生存とエキスパンションを可能にし、細胞指標が約3日後にバックグラウンドを超えて上昇した。2番目のグループの中のエキスパンションでは、50マイクロMのアデノシンまたはGABAを含むものはあまり効果的ではなく、培養の約4.5日後に検出可能であった。最も著しいエキスパンションを示すグループは、3日後に検出可能であり、NE+アデノシンおよびNE+AChを含む培養液から成った。これはこれらのホルモン/神経伝達物質の間の相乗作用を示唆する。相乗作用を示唆した他の唯一の組み合わせが、GABA+アデノシンであった。これは中程度のグループであった。興味深いことには、Y27632の存在はNE、ACh、アデノシンおよびGABAの効果を減少させ、明確に、StemPro hESC SFM培地と神経伝達物質の中でROCK系路を禁止するという好ましくない効果を示した。これらの要素の間の相互作用に関する要約図は図5に提示される。
【0165】
実施例3:
多分化能性幹細胞の低密度生存/エキスパンションをサポートするアゴニスト
合計6つの異なったクラスの神経伝達物質受容体がオリジナルのLOPACスクリーニングに含まれたので、次の目的はhES細胞の低密度生存そして/または、エキスパンションへの影響の大きさを決定するために、同様のリガンドの広い配列(array)を調べることであった。88の神経伝達物質アゴニストのサブライブラリをLOPACコレクションから作成した。これはアデノシン、アドレナリン性、ベンゾジアゼピン系、大麻類のアゴニストおよびコリン作動性レセプタを表す。人間の胚性幹細胞は1000細胞/ウエルで直接、DMSOまたは個々のアゴニスト(10マイクロM)を含むStemPro hESC SFM中に入れられ、RT−CESシステムで約9日間培養された。アデノシンとアドレナリン受容体(図6B)のアゴニストである、(±)ノルエピネフリン(+)酒石酸水素塩(図6A)の効果をまねた追加アゴニストが同定された。ドーパミン、セロトニン、およびホモバニリン酸(HVA)、カテコールアミン代謝物を含む、いくつかの追加神経伝達物質が低密度インピーダンスアッセイでテストされた。DMSOコントロール(図6C)と比べて、これらの化合物は上昇した生存/増殖を示した。これらの研究は、さまざまな神経伝達物質受容体またはシグナリング経路が低密度培養およびエキスパンションをサポートできて、それぞれの系路が多発性リガンドまたはアゴニストを活性化することができそうだと確認した。重要なことには、神経伝達物質系路のすべてがhES細胞成育と多分化能にかかわるわけではない。これは、NMDA、ヒスタミン、およびGABAによって示された確固とした活性の不足、およびアゴニストサブライブラリの10マイクロMの濃度でテストされたのときに有効でなかった83個の化合物によって証明される。
【0166】
実施例4:
低密度多分化能幹細胞培地の定義された培地における、神経伝達物質と増殖因子の組み合わせの効果
上記の研究は、同定された神経伝達物質によって提供されたシグナリングは潜在的にDC−HAIFまたはStemPro hESC SFMに含まれた成長因子蛋白質を補足するかまたは置き換え、したがって、安価な低分子を高価な組換体蛋白質の代わりに用いることによってそのような培地をより費用対効果に優れるようにすることができると示唆した。定義された培地の費用の約半分は特に、アクチビンのためである。それは、製造するのが、難しく、CHO細胞を使用して製造されている。しかし、少なくとも低密度のRT−CES検定方法は、神経伝達物質の候補がStemPro hESC SFMに提供された増殖因子の完全な代理をすることができそうにないことを示した。しかしながら、通常の(高い)細胞濃度では、これらの低分子は潜在的適合性代用物である。
【0167】
したがって、追加検定方法が、ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)およびアクチビン(A)の簡易型の組み合わせについて、神経伝達物質のあるものとないものについて効果を調べるために実行された(図7)。StemPro hESC SFMとHAI(ヘレグリン、アクチビン、およびLR3−IGF1)だけを含むウェルでは、細胞は、予想されるように約9日目までバックグラウンドを超えて検出されなかった。しかしながら、StemPro hESC SFM HI(ヘレグリンおよびLR3−IGF1)は予想外にはるかに確固とした生存/エキスパンションをサポートし、成長は約5.5日目に最初に検出された。おそらく、望ましくないBMP誘導の分化シグナルと競争することによってhES細胞培養で突発性分化を抑圧するように見えたこと、およびアクチビン受容体の阻害が増加する分化を引き起こしたため、アクチビンは元々DC−HAIF媒体に含まれていた。アクチビンの役割は以前に低細胞濃度でテストされていなかったが、これらおよび次の実験は、培養においてこれらの条件での細胞の生存および/またはエキスパンションにおける主要な負の役割を担うことを示した。NE、AChまたはNE/AChの添加は、HAI(ヘレグリン、アクチビン、およびIFG1)またはHI(ヘレグリンとIGF1)バックグラウンドにおいて、改善された生存/エキスパンションを実質的にサポートした。興味深いことには、NEとAChの間の相乗作用はHAIのバックグラウンドにおいて観測されたが(以前に観測されたように)、アクチビンが省略されたとき、それは明白でなかった。したがって、最大生存/エキスパンションはNEを有するStemPro hESC SFM HI(ヘレグリンとIGF1)で観測された。AChの添加はさらなる改善を提供しなかった。
【0168】
コロニー計数アッセイ
異なるアプローチを使用することでこれらの観察が適正であることを示すために、低密度コロニー計数法アッセイが実行された(図8)。約104hES細胞はHAI(ヘレグリン、アクチビン、およびIFG1)またはHI(ヘレグリンとIGF1)を含むStemPro hESC SFMと、それ単独または神経伝達候補物質との組み合わせ、および前の実験からの(NE、NE/セロトニン、NE/ACh、ACh、またはACh/セロトニン)の組み合わせを、6ウェルのトレーの中で培養した。AP+コロニーの計数は、低細胞濃度におけるコロニー形成のときのアクチビンの負の影響を明確に確認し、HI内で神経伝達物質コントロールの無い場合に、>200コロニーであった(図8A)。これらのコロニーは、小さく、大規模に増殖していなかったが、ネガティブコントロールと比べて、明確に存在していた。任意の神経伝達物質リガンドの付加はコロニー形成における顕著な改善を引き起こし、これはRT−CES検定方法と一致した。またNEを有するHI条件はテストされた他の要素の添加で改良されなかった。染色されたコロニーのイメージは、アクチビンの存在下で、生き残っているコロニーが主として不均等であり、分散細胞が小さなコロニーコアの周囲に観察され、一般にはより多くの星状の形態(stellate morphology)を示した(図8B)。これらの特徴は、低い細胞濃度のアクチビンが培養物の部分的な分化、または細胞の遊走の増加を引き起こし、コンパクトなコロニーが形成されないことを示唆する。これらまたは他の効果は細胞生存に非常に影響を与えそうである。逆に、アクチビンの非存在と神経伝達物質の存在下では、タイトでコンパクトなコロニーが典型的に形成された。これは安定してエキスパンドできる未分化型hES細胞の典型である。
【0169】
同様の実験が、神経伝達物質によって提供されたシグナリングが、IGF1またはヘレグリンの代理をすることができるかどうか決定するために行われた。低密度平板培養検定方法は、RT−CESリーダーで、アクチビン(A)、ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、および神経伝達物質候補の異なった組み合わせを有するStemPro hESC SFMを使用して実行された(図9)。前の検定方法と一致して、インピーダンスの上昇はアクチビンの非存在、神経伝達物質NE、NE/ACh、NE/アデノシン、NE/ドーパミン、NE/セロトニンおよびACh/セロトニンが存在する時に非常に早く検出された。ACh/ドーパミンの組み合わせまたは、ACh/HVAの組み合わせは、hES細胞の実質的な生存/エキスパンションを促進するように見えなかった。ヘレグリンだけを含有する培地は、低い細胞濃度生存をサポートしなかったが、上記の神経伝達物質の添加は顕著な改善を引き起こした。しかしながら、ヘレグリン(IGF単独)がないとき、培養は神経伝達物質の存在または非存在のどちらでもエキスパンドしなかった。したがって、アクチビンとIGF1が、これらの短時間分析において不必要であるように見える一方、神経伝達物質によって提供された活性は、低細胞濃度でヘレグリンシグナリングの代理をするように見えなかった。
【0170】
実施例5:
神経伝達物質は多能性細胞の浮遊培養を向上する
低細胞濃度で生存または自己再生をサポートする低分子リガンドが、他の培養形式においても有益な効果を持っていると予想できた。出願人は、以前に、細胞の連続的増殖と培養の効果的なエキスパンションを可能にするhES細胞の浮遊培養システムを開発した。人間の胚性幹細胞(少なくともBG02とCyT49細胞)は、分化なしで10以上の継代で懸濁で維持された。テクニックの基礎は、Accutase(登録商標)、TrypLEまたは細胞散布バッファなどの高い生育性を保持する試薬で培養物を分離して単独細胞にすることであり、次に、回転培養で定義された培地において、細胞の規定された濃度で集合体にした。これらの方法は、2008年11月4日に出願された、PCT/US2008/082356の幹細胞集合体懸濁液組成物、その分化方法、および2007年2月23日に出願された、PCT/US2007/062755の分化細胞の培養方法および培養物に詳細に記載される。これらは本明細書に参考として全体を援用する。hES細胞の自己凝集は、加えられた細胞外マトリックス(ECM)またはECMのようなタンパク質の非存在下に起こり、E−カドヘリンのホモタイプ相互作用によって一部駆動されると推定される。3−4日間のエキスパンドで形成される集団は、回転培養によって発生したせん断力によって互いに離れて保たれる。細胞は、定義された培地によって提供される自己再生シグナリングにより分化が妨げられて、それらの多分化能特性、生体外と奇形腫におけるマーカー発現、正常核型、および分化能を保持する。それぞれの継代で培養のエキスパンションを最大にするために、最小量の実行可能なサイズの均一の集団の最多数を発生させるのは、望ましい。
【0171】
人間の胚性幹細胞はローアタッチメント6ウェルのトレー中に106細胞/mlで、ヘレグリン(H)、IGF1(I)、およびアクチビン(A)を含むStemPro hESC SFMの5ml中、100rpmで培養され、懸濁液中で凝集された。実験変数はY27632、NE、AChまたはNE/AChの添加を含んでいた(図10A)。首尾よく集合体であり、コピーされたウエルの全ての条件で、短期的な細胞生存を決定するために、24時間後に収穫され、分離され、数えられた。StemPro hESC SFM単独では、約50%の細胞だけが最初の24時間生き残ったが、他のすべての処理は約4x106細胞を示した(図10B)。StemPro hESC SFM中の高細胞密度での細胞生存へのY27632のポジテイブな効果は、接着培養における前の観察と一致していて、NE、AChおよびNE/AChの類似の効果とマッチしていた。すべての条件で4日間の回転培養により拡張され、低分子を有する処理で顕在化する細胞数の増大は、細胞計数によって確認された(図10C)。さらに、4日目における集団の直径の測定は培養の期間での観察を確認した(図10D)。StemPro hESC SFM単独では、凝集体サイズは非常に可変であったが、Y27632の添加は細胞の向上した集合を引き起こし、より少ない数の、より大きい集団が見いだされた。対照的に、NE、AChまたはNE/AChの添加は、Y27632で形成されたものよりより小さい集団を可能にし、StemPro hESC SFM単独のものより一貫して均一サイズのものであった。これらのデータは、神経伝達物質がhES細胞の(通常)の、より高い密度浮遊培養のためにいくつかの利点を提供することを示した。第一に、それらは集合段階の間、Y27632で観察されたものと等しいかまたは優れた細胞生存を促進した。第二に、それらはより小さくて一貫して均一なサイズの集合体の形成を促進し、潜在的に凝集体サイズとスプリットの間の時間の長さのより優れた制御を提供し、その結果、それぞれの継代で可能なエキスパンションを最大にする。
【0172】
染色体安定性
これらの可能性を調べるために、これらの培養物はp1に連続的に継代された(図10E)。Y27632によって処理された集団がより大きいサイズのものであったので、それらは、3日後に継代を必要として、その期間におよそ1.2×107の細胞しか発生させなかった。対照的に、NE、AChまたはNE/ACh含有培養液が、6日間培養されて、1ウエルあたり2×107の細胞を発生させた。NE、AChまたはNE/AChを含む浮遊培養液が、12の連続継代のために保持され、平行してHAIFコントロール培養が行われ、すべての条件が、未分化型形態を維持した。懸濁集団は、10継代の後に単独細胞に分離され、分析のために接着培養で再培養された。Oct4およびTra−1−60(図11)、および他の多分化能マーカーの発現は一様に維持され、培養が未分化であったのを示した。再培養物も、それらの核型を決定するためにG−結合された。HAIFコントロールとHAIF/NE培養物の両方が、正倍数体または正常であったが、ACh含有培養物は異数体または異常性であり、第5染色体の三染色体性と他の変調を示した。この実験は、NEの存在下においてhES細胞の長期培養の間ゲノム安定性を維持できて、成長利点を有する異数性細胞の亜細胞が、発生されなかったか、または富化されなかったことを示唆した。しかしながら、このデータが、AChがゲノム一体性に影響することを示唆するので、hES細胞の低密度の生存/成長をサポートするすべての要素が、より高い密度での細胞生育条件で有用性を有するわけではないことは明確である。
【0173】
実施例6:
ノルエピネフリンの存在下において標準の密度での多能性細胞のエキスパンションをサポートする増殖因子の組み合わせ
ノルエピネフリンは細胞が低密度で育てられたとき、ヘレグリンシグナリングの代理をすることができるように見えなかった。これはこれらの要素が異なったシグナリング経路に影響を与えることができることを示唆している。しかしながら、細胞−細胞接触とシグナリングの関係は、標準の播種密度において全く異なっている。そこでは細胞がマイグレートし、最初の24時間の培養でミクロコロニーを形成する。上掲のRobins and Schulz, 2009を参照。したがって、hES細胞をサポートするのに必要な増殖因子の実質的な相違を、低密度および高密度で観測できる。したがって、インピーダンスリーダーを使用して、hES細胞の標準の密度における短期的成長検定が行われた。約104hES細胞/ウエルが、50マイクロMの、NE、ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、またはFGF2(F)の異なった組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養され、3.5日間にわたりモニターした。低細胞濃度における結果と対照的に、NEはある程度の高い密度条件でヘレグリンが存在しない時、培養のエキスパンションをサポートするかもしれない(図12A)。サポートできる組み合わせはNE/AIF、NE/IF、NE/IAおよびNE/Iを含む。ログ相成長の間の細胞指数の傾斜の測定結果が示される(図12B)。これらのデータは、NEが存在する時、組換え型の増殖因子の簡単な組み合わせで、未分化型hES細胞をエキスパンドすることが可能であることを示す。そのような簡単な培地は実質的な利益を持つことができ、特に治療応用のための大規模製造の間のhES細胞の商品原価と関連する。
【0174】
実施例7:
ノルエピネフリンの存在下における多能性細胞の連続継代のための成長因子への要求
NEと増殖因子の簡単な組み合わせ候補を含むメディア中のhES細胞の連続継代の効果は、少なくともBG01(図13)とBG02(図14)細胞についてテストされた。試験条件は10ng/mlのヘレグリン(H)、200ng/mlのLR3−IGF1(I)、10ng/mlのアクチビン(A)、および8ng/mlのFGF2(F)を含むStemPro hESC SFM中で維持された細胞と比較された。ヘレグリン(すなわち、AIF)の非存在下において、ある種のhES細胞培養は有効に維持できなかった。たとえば培養物は、密にパックされた領域があるが、一般に不十分な増殖であった。たとえば増殖はウェルの外側の縁で密であるが、増殖は通常であった。アクチビンが省略された培地(IF)も、不十分に増殖して、4番目の継代で失われた。しかし、NEが含まれていたとき、ヘレグリン(AIF NE)の非存在下において、有効なhES細胞増殖とウェル全体のhES細胞コロニー増殖さえ観測された。それでも、NEは標準細胞ではアクチビンの要件のための代理をするように見えない。IF NE培地がいくつかの継代にわたって分化されるからである。HAIF、AIF、およびAIF NE条件は少なくとも5継代にわたり維持された。AIF NEはAIFだけより好ましかった。なぜなら後者は、不均等な成長を示し続けたからである。
【0175】
また、ある種のhES細胞もヘレグリン(AIF)の非存在に対して形態的応答を示した。細胞がより平坦になり、より広がり、コロニーがタイトな上皮性のパッキングを示さない。同様の形態はすべての(ヘレグリンがない)アクチビン含有細胞培養液で観測された。これらの細胞培養は、別の方法で未分化型特性を表示し続けて、明白に分化しているように見えなかった。ヘレグリンとアクチビンの両方(IF)が存在しないとき、コロニーは、非常に緊密にパックされてドーム型になり、典型的なマウスES細胞培養の形態と、より類似していた。IF/NEおよびIF/NE/ノギンの培地は例外的なES形態を示し、緊密な上皮性のコロニーを示し、明白な分化は示さなかった。したがって、複数の条件が多数の継代にわたってhES細胞の連続性エキスパンションをサポートするかもしれないが、IF NEおよびIF NE ノギンの組み合わせのみが予想された上皮性の特性の維持を促進した。これらの連続的に継代されたhES細胞における多分化能の維持は、Oct4、SSEA4、Tra−1−60およびSox2の免疫蛍光によって示された(図15)。これらの実験は、増殖因子の簡易型の組み合わせが、特にはノルエピネフリン(NE)が培養液に含まれているとき、多能性細胞および連続的増殖をサポートすることを示し、確認した。
【0176】
実施例8:
多能性細胞におけるアドレナリン受容体の発現と機能
多分化能幹細胞増殖におけるそれらの潜在的役割を調べるために、アドレナリン受容体の発現がQ−PCRを使用して調べられた。そして、アドレナリン受容体機能の阻害剤が細胞成育への効果についてテストされた。いくつかのアドレナリン受容体の一定の比較的高い発現はADRB1、ADRB2、ADRA2BおよびADRA1Dを含むhES細胞ラインで検出された(図16)。ADRA2Cは、hES細胞試料で一貫して発現されるが、低レベルでは、ADRA1AとADRA1Bは低水準にあったか、または未分化細胞中で非一貫的に検出されただけである。50マイクロM NEの存在下において、アドレナリン受容体の40個の異なった阻害剤がhES細胞膨張への効果について低細胞濃度でテストされた。未処置のHAIF+NEコントロール、7つのα−アドレナリン作動性受容体拮抗体、5つのβ−アドレナリン受容体拮抗体、および2つのβ−アドレナリン受容体遮断薬の比較により、低細胞濃度でhES細胞生存および/または、エキスパンションに影響を与えかどうかが同定された(図17)。これらの研究は、hES細胞が、さまざまなαおよびβアドレナリン受容体の両方を発現し、受容体機能を禁止して、hES細胞のエキスパンションに影響を与える。その両方がhES細胞におけるNEシグナリングの重要さを確認する。
【0177】
本明細書に記載された、方法、組成物、および装置は、好適な実施例を表わすものであり、例示に過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図しない。例えば、あるhES細胞ラインが使われた;しかしながら、本発明は任意の多分化能幹細胞ラインの使用を意図し、たとえば人間のiPS細胞ラインと他の言及されなかったhESおよびiPS細胞ライン、たとえば以下の表2と3に示されるもの、国立衛生研究所の幹細胞レジストリからのhttp://stemcells.nih.gov/research/registrのワールドワイドウェブに適合しているもの、マサチューセッツ医学大学、ウスター(マサチューセッツ)、米国に位置する、ヒト胚性幹細胞レジストリおよび国際幹細胞レジストリに示されるものを含む。
細胞ラインが利用可能となり、登録が得られると、定期的にこれらのデータベースはアップデートされる。それの細胞ラインのいくつかは、NSCB幹細胞レジストリで利用可能ではない。
それにも関わらず、本発明の出願日現在、少なくとも以下のhES細胞ラインは商業的に利用可能である。
【0178】
【表2−1】
【0179】
【表2−2】
【0180】
【表2−3】
【0181】
【表2−4】
【0182】
【表2−5】
【0183】
【表2−6】
【0184】
【表2−7】
【0185】
【表3−1】
【0186】
【表3−2】
【0187】
【表3−3】
【0188】
【表3−4】
【0189】
【表3−5】
【0190】
【表3−6】
【0191】
【表3−7】
【0192】
本明細書に記載された培地組成物は、iPS細胞ラインなどの他の多能性細胞ラインと共に使うことができる。例えば、少なくともiPS(Foreskin)、およびiPS(IMR90)のクローン、iPS−DF19−9のクローン、これはベクターフリーiPS細胞ラインである、も使用できる。iPS細胞の研究と応用のための京都大学センター(CiRA;山中伸弥)およびウィスコンシン大学(ジェームズ・トムソン)からの細胞ラインも使用できる。それの或るものはWiCeIlから利用可能である。
【0193】
そこでの変化および他の用途は当業者によって考えられるであろうが、それらは本発明の精神の範囲内に包含され、請求の範囲によって定義される。本明細書中で開示された発明に対する種々の置換および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行われうることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【0194】
以下の特許請求の範囲および本出願の開示において使用される、「本質的に成る」との用語は、引き続くリストに記載される任意の要素を含むことを意味し、列記された要素について記載された活性や作用を妨害しないかまたはそれらに貢献する他の要素を含むことができる。すなわち「本質的に成る」との用語は、列記された要素は必要であるかまたは義務的であるが、他の要素は任意であり、それらが記載された要素の活性または機能に影響するかどうかによって、存在できないかまたは存在できる。
【技術分野】
【0001】
関連出願
この出願は米国特許法に基づき2009年4月27日に出願した米国仮出願番号61/172,998の優先権の利益を請求する。その全体の開示は本明細書中に参考として援用する。
【0002】
本発明は低分子神経伝達物質(small molecule neurotransmitters)を少なくとも一部含む多能性幹細胞培地(pluripotent stem cell media)に関する。本発明は、特に、本質的には血清とフィーダを含まない定義された(defined)多能性幹細胞培地であって、少なくともノルエピネフリン、アセチルコリン、およびドーパミンの1つを含み、多分化能ヒト幹細胞の懸濁細胞凝集培養(suspension cell aggregate culture)をサポートする培地に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
多分化能ベース細胞補充療法の最終的な用途は、大量培養を可能にする方法と規制ガイドラインに対応する分化条件の発達を必要とするだろう。
【0004】
アメリカ合衆国では、食品医薬品局(FDA)はレビューワーのためのガイダンス案の形でガイダンスを発行した:ヒト体細胞治療治験新医薬品承認申請(INDs)の化学、製造、およびコントロール(CMC)レビューワーのための指示およびテンプレート;21CFR§1270および§1271の規定。ヨーロッパでは、細胞治療生産物のための要件が人間の胚幹(hES)細胞に適切な、いくつかの指示とガイドラインに概説されている。指示2004/23/EC、指示委員会 2006/17/ECおよび2006/86/E、EU 規定1394/2007、ガイドラインEMEA/CHMP/410869を参照。これらは本明細書に参考として全体を援用する。各国には、人体組織および細胞の寄付、調達、試験、処理、保存、貯蔵および分配を含む品質と安全についての標準規制がある。規制は開発、製造および品質管理、並びに細胞ベースの医薬品の非臨床の、および臨床の開発のためのガイドラインを確立する。C. Unger et al.(2008),Human Molecular Genetics 17(R1):R48-R53を参照されたい。
【0005】
規制ガイドラインは製造規模生産幹細胞とそれの生産物のために多くのハードルを作る。例えば、未分化状態で生体外に多能性細胞を維持するために、調査研究はまだマウス胎児線維芽細胞(MEF)フィーダーやウシ胎仔血清(FBS)などの畜産物を使っている。多分化能を維持するための他の細胞培養条件は、KnockOut(登録商標)Serum Replacer(KSR;Invitrogen)などの血清代用品を含んでいる。Serum Replaceは、より定義されているが、未知化合物や、ウシ血清アルブミン(BSA)、ウシ血清の脂質豊富なアルブミン分画(AlbuMAX)などを含む複雑なクルードの混合物を含む。さらに、血清バッチは彼らの活性、したがって、彼らの多分化能の未分化型細胞培養を維持する能力において異なる。したがって、非動物由来の(「異物性なし(xeno-free)」)定義された成分でのウシ血清の置換は、多能性細胞のGMP生産のために好ましい。
【0006】
出願人は、以前に、IGF1、インシュリン、ERBB2、およびERBB3 受容体の活性化が、増殖性hES細胞の顕著な特徴であることを決定した。IGF1R/IR活性化は、血清中のIGF1または、例えばさまざまな生育条件における血清代用品またはN2/B27細胞培養サプリメント中のマイクログラム/ml濃度のインスリンの結果と考えることができた。これらの活性は強いPI3キナーゼ/AKT信号を提供する、そして、LR3−IGF1、IGF1類似物の低い濃度で同等な活性化が実現できた。McLean et al., 2007 Stem Cells 25, 29-38を参照。ERBB2/3のリン酸化はMEF−CM中のEGFファミリーメンバー、ヘレグリン/ニューレグリンの活性と一致していた。Wang et al., 2007 Blood 110, 4111-9を参照。アクチビンおよびFGFシグナリングの低分子阻害剤のように、hES細胞のIGF1RおよびERBB2の影響を受けた自己再生の阻害が起こる。Robins and Schulz, 2009, “Novel methods of Stem Cell Culture and Maintenance:Media and extra cellular matrix requirements for large scale ESC growth.”を参照。Emerging Technology Platforms for Stem Cells (eds. U. Lakshmipathy J. D. Chesnut and B. Thyagarajan, pp. 251-247) Hoboken.John Wiley & Sons Inc.;and Vallier et al., 2005 J Cell Sci 118, 4495-509)を参照。この定義された培地は開発されDC−HAIFと呼ばれた。これはDMEM/F12、非必須アミノ酸、微量元素、アスコルビン酸、β−メカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシン(任意)からなり、タンパク質はカプリル酸で抽出された脂肪酸のないBSA、鉄結合性グロブリン、組換え型のヘレグリン−1β(H)、アクチビンA(A)、LR3−IGF1(I)、およびFGF2(F)のみである。DC−HAIFは多分化能hES細胞の長期維持、および単独細胞継代、ACCUTASE(登録商標)を使用したスケーリングされたhES細胞のエキスパンションをサポートした。上記のRobins and Schulz (2009) ; 上記のWang et al.,を参照。StemPro(登録商標) hES細胞SFMという商号でLife Technologies社のライセンスの下で販売される、DC−HAIFのバッチ試験用の市販の配合物が利用可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
まだ、代替および/または追加の、例えば、hES、iPS細胞のような、多能性幹細胞における重大な機能を有するシグナリング経路を同定する必要性は残っている。それは治療目的で使用できる。培養組成物は、GMP規格に定義されおよび/または製造される。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は少なくともノルエピネフリンとドーパミンを含み、血清を本質的に含まない、多能性細胞成育のための基本栄養塩溶液を含む組成物に関する。
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】hES細胞における化合物スクリーニングで同定された神経伝達物質/ホルモン受容体の拮抗体/モジュレータを示す。一次的なライブラリスクリーニングのアルカリホスファターゼ(AP)染色は細胞への影響、無し(+++集密的に成長)、中程度の効果(++)、または大きな効果(+)を示す。細胞がまれ(+/−)、細胞無し(−)も示す。一次的なスクリーニングで同定された受容体アンタゴニストも示されている(左のコラム)。スクリーニングは、10マイクロMの化合物を使用して実行された。二次的投与量滴定分析が示される(50−0.1 マイクロMのカラム)、およびそれぞれの化合物と動作により標的にされた受容体のクラスを示す。
【0010】
【図2】hES細胞(例えば、BGO2 細胞)の低密度平板培養アッセイ。10000細胞/ウェルで、StemPro(登録商標) hESC SFM培地(Life Technologies社)中、6−ウエルトレイ内で培養され、7日後にアルカリホスファターゼ(AP+)染色された。Y(Y27632)、ACh(アセチルコリン)、NMDA(N−メチル−D−アスパラギン酸)、NE((−)−ノルエピネフリン)、NE.Bit((+/−)−ノルエピネフリン(+)−酒石酸水素塩)。化合物は示されるように10または50マイクロMで加えられた。
【0011】
【図3】hES細胞の低密度平板培養アッセイ。(A)200−10000細胞/ウエルで、StemPro(登録商標) hESC SFM培地中、またはStemPro(登録商標) hESC SFM+50マイクロM NEもしくは+50マイクロM−ACh中、6−ウエルトレイ内で培養され、8日後にアルカリホスファターゼ(AP+)染色された。比較コロニー計数値を示す。ACh(アセチルコリン)、NE((±)ノルエピネフリン(+)酒石酸水素塩)。(B)平板培養から低細胞濃度で導かれて、NEまたはACh(5日目の)によってサポートされたhES細胞コロニーの未分化型形態。
【0012】
【図4】RT−CESインピーダンスリーダーを使用するNEとAChの滴定。1000 hES細胞/ウェルで、低分子の示した濃度(マイクロM)を含むStemPro hESC SFM内で培養された。そのようなアッセイでは、細胞指標が上昇するタイミングは、低密度で生き残っていて、膨張する細胞の割合に関連する。一般に、NEとAChの濃度の増加が、細胞指数を速く上昇させる。約160時間におけるインピーダンスのスパイクは、人為的事象および誤りである。
【0013】
【図5】低い細胞濃度検定方法における、低分子類化合物の組み合わせの効果。(A)1000hES細胞/ウエルで、50マイクロM(NE、ACh、アデノシン、GABA)または10マイクロM(Y27632)の低分子を含むStemPro hESC SFM中で培養された。アッセイは、5日間RT−CESシステムを使用して行われた。トレースの4つのグループが観測された:最も効果的な化合物/組み合わせは、NE/アデノシンと、NE/AChであった。中間的グループは個別要素としてはNEとAChであり、他のいくつかの組み合わせを含んでいた。低水準グループはアデノシン、GABA単独と、いくつかの有効でなかった要素/組み合わせであった。(B)観察された活性の要約。相対格付け(−から+++)は、低密度の成長におけるサポートの有効性を示し、灰色の欄は相乗作用を示し、黒い欄は拮抗を示す。
【0014】
【図6】hES細胞の低密度生存をサポートする追加の神経伝達物質と関連化合物。1000hES細胞/ウエルで、ヘレグリン(Heregulin)、IGF1、およびアクチビン(HIA)と示された低分子を含むStemPro hESC SFM中でプレートされた。(A)低密度生存をサポートする追加アデノシンとアドレナリン受容体(Adrenoceptor)アゴニストの同定。化合物は10マイクロMでテストされた。DMSOトレースは平均8つのウェルである。(B)同定された化合物の情報について表にした。(C)hES細胞の、ドーパミン、ホモバニリン酸(HVA)、およびセロトニンでサポートされた低密度生存。化合物は示した濃度でテストされた。約160時間におけるインピーダンスのスパイクは、人為的事象および誤りである。
【0015】
【図7】アクチビンの非存在時の改良された低い細胞濃度生存。1000hES細胞/ウエルで、示された増殖因子と低分子の組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)。
【0016】
【図8】低密度生存/コロニー形成へのアクチビンの効果のコロニー計数法アッセイ(A)10000hES細胞が示された増殖因子と低分子の示された組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養された。7日後にアルカリホスファターゼ活性染色された。AP+コロニーが数えられた。明確に、アクチビンが低密度培養に持っているネガティブ効果が示された。(B)それぞれの増殖因子背景における、+NEと+ACh条件の顕微鏡写真。アクチビンがないとき、コロニーは非常に堅固で未分化細胞の原型であった。
【0017】
【図9】増殖因子と神経伝達物質の組み合わせの低密度RT−CES検定方法1000hES細胞/ウエルは示された増殖因子と低分子の示した組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)。低分子は50マイクロMでテストされた。
【0018】
【図10】hES細胞の浮遊培養におけるNEとAChの効果(A)5×106のCyT49細胞が、ローアタッチメント6ウェルのトレーに、50マイクロMで、ヘレグリン、LR3−IGF1、アクチビン、および示した神経伝達物質を含む5mlのStemPro hESC SFM内にシードされて、100rpmで培養された。未分化型懸濁集団は4日目に画像化された。(B)それぞれの条件で、シード後24時間で2つのウェルが収穫され、生存細胞数を測定するために数えられた。(C)培養が4日目に分割されたときのそれぞれの条件の細胞数。(D)(A)におけるイメージは、ImageProソフトウェア計測ツールを使用することで集団直径を決定するのに使用された。それぞれの条件からの50−100集団からの平均直径と標準偏差が示されている。(E)1継代細胞計算データ(A)のp0細胞からの5×106のCyT49 hES細胞が同じ条件でシードされた。Y27632を含む条件における集団はより大きく、最も大きい集団のセンターが壊死性になる前に、シード後3日で継代しなければならなかった。逆に、他の条件は継代の前に6日間培養され、より多い細胞数をもたらした。
【0019】
【図11】懸濁hES細胞がNE、NE/AChまたはNE/AChで培養され、未分化型のままで残っていた。CyT49細胞はNE、NE/AChまたはNE/AChの存在下で懸濁集団として、分化モルホロジーなしで16継代育てられた。p10の後に、いくつかの細胞が、接着培養に再プレートされ、OCT4とTra−1−61について核型分析および免疫けい光染色によって調べられた。すべての培養が未分化型のままで残って、これらの多分化能マーカーが均一に発現した。(SP)StemPro SFM HIA、NE(+50マイクロMにおけるNE)、ACh(+50マイクロMにおけるACh)、NE/ACh(+50マイクロMにおけるNE/ACh)。核型データは右に示されている。SPとSP+NE培養は核型的に正常であった。ACh含有培養物は異数体であった。
【0020】
【図12】標準密度の短期間インピーダンス検定方法でのhES細胞(例えば、BG02)をサポートするNEと成長因子の組み合わせ(A)104BG02細胞/ウエルで50マイクロMのNEと増殖因子の示した組み合わせを含むStemPro hESC SFM含有培地で培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、FGF2(F)。低細胞濃度における結果と対照的に、NEはいくつかの条件ではヘレグリンの非存在下で培養のエキスパンションをサポートした。そのような支持性組み合わせはNE/AIF、NE/IF、NE/IA、およびNE/Iを含む。(B)50〜60時間(Aのライン)の平板培養後の細胞指数の傾斜の測定値が示されている。最小量の増殖だけを示している条件(NE/F)と比べて、他の条件は細胞指数の有効な増大を示した。これは集団のエキスパンションを示している。
【0021】
【図13】標準の密度でhES細胞(例えば、BG01細胞)の連続継代をサポートするノルエピネフリンと増殖因子の組み合わせ。連続培養の間のhES細胞の相対エキスパンション。5×105のhES細胞ウエルが、6ウェルトレーの中で50マイクロM NEと示した増殖因子の組み合わせを含むStemPro hESC SFM培地で、それぞれの継代において培養された。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、FGF2(F)。エキスパンションをサポートした条件について、それぞれの継代の最後の細胞数がプロットされる。二重破線はそれぞれの継代で培養された細胞数を表す。HAIFコントロール培養と比べて、ヘレグリン(AIF)の欠如は多継代で成長を減少させた。コロニー増殖は、ウェルの密にパックされた外側のリングで観測されたが、皿全体に観測されたというわけではない。IFだけに露出された培養物は、2継代の後に有効に維持できなかった。この細胞ラインのアクチビン/ノーダルシグナリングの必要が確認された。NEの存在はAIF条件における増殖へ実質的に肯定的な影響を持ち、HAIF条件に類似する培養増殖と形態も可能にした。NEはアクチビン/ノーダルの要求の代わりをすることができなかった。いくつかの継代にわたってIF/NE条件では分化したからである。
【0022】
【図14】標準の密度でhES細胞の連続継代をサポートするノルエピネフリンと増殖因子の組み合わせ。連続培養の間のhES細胞の相対的エキスパンション。5×105hES細胞/ウエルで、6ウェルトレー中で、50マイクロMのNEと示した増殖因子混合物を含むStemPro hESC SFMにおいてそれぞれの継代において培養された。それぞれの継代の最後の細胞数がプロットされた。二重破線はそれぞれの継代でプレートされた細胞数を表す。ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、FGF2(F)。また継代2では、AIF培地がAIまたはAI/NEの余分なウェルをセットするために使用された。HAIFコントロール培地と比べて、ヘレグリン(AIF)の欠如は形態変化をもたらした。細胞は未分化細胞の特性を保有したが、外観では、それらは、より平坦であって、より大きかった。細胞の間には、より大きなギャップがあった。同様の形態はすべてのアクチビン(ヘレグリンの非存在下)含有培地で観測された。IFにおけるコロニーは、非常に堅固でドーム型であり、標準のマウス胚性幹細胞培養物の形態とより類似していた。IF/NEおよびIF/NE/ノギン中の培養物は例外的な形態を示し、堅固な上皮性のコロニーを有し明白な未分化を示さなかった。
【0023】
【図15】NEと単純化された増殖因子の組み合わせを含む定義された培地でのhES細胞連続継代における多分化能マーカーの発現。説明したように(図14)、4つの継代で培養された人間の胚性幹細胞は、スライド上で培養され、エキスパンドされ、示したマーカーについて免疫染色された。IF中、IF/NE中(並びにAIFおよびAIF/NE、図示せず)でエキスパンドした培養物は、OCT4、SOX2、SSEA4およびTRA−1−60をはじめとする、多分化能のマーカーの発現の予想されたプロファイルを保有した。
【0024】
【図16】hES細胞および膵性内胚葉への分化の間における、アドレナリン受容体発現のqPCR分析。遺伝子名は識別子に使用される(例えば、ADRA1Aはalpha1A−アドレナリン受容体を示す)。膵臓の分化のためのhES細胞試料が、1日ごとの分化について示される:d0、未分化 hES細胞;d2/3 内胚葉分化;d5/7 原始腸管;d7/9 後期前腸;d11 膵臓内胚葉。 チャートはd0 hES細胞試料の倍率として示されている。このサンプルのためのしきい値交差ポイントは、異なったアドレナリン受容体の間の相対発現水準を示唆するために示される。BG01、BG02、およびCyT49細胞を含むhES細胞に関する追加サンプルが示される。ADRB1、ADRB2、ADRA2B、およびADRA1Dは、未分化型hES細胞において最も多いアドレナリン受容体を発現し、最も一貫しているように見えた。ADRA2Cは、hES細胞試料中で一貫して発現されるが、低レベルで発現されるのに対し、ADRA1AとADRA1Bは単に低水準であり、または未分化細胞中で一貫性無く検出されただけである。
【0025】
【図17】アドレナリン受容体の阻害は低密度でhES細胞の生存とエキスパンションに影響を与える。2000BG02細胞/ウエルの低密度培養が、ヘレグリン、アクチビン、LR3−IGF1、および50マイクロM NEを含むStemPro hESC SFM内で培養され、7日間インピーダンスリーダー内でモニターされた。それぞれのコントロールの8つのウェルが含まれ、DMSO(ネガティブコントロール)、またはDMSO/50マイクロM NE(NEコントロール)が含まれた。アルファまたはベータアドレナリン受容体の40個の異なった阻害剤が、低密度でhES細胞のNE媒介性生存/エキスパンションへのネガティブ効果をくつがえすことができるかどうか、2回づつテストされた。7つのアドレナリン受容体拮抗薬(Ant.)、5つのβ−アドレナリン受容体拮抗薬、および2つのβアドレナリン受容体遮断薬が、hES細胞に影響を与えたと同定された。それぞれの活性物質の名前、活性、知られている選択性、および説明を示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
低密度でhES細胞内で重要な機能を有する追加シグナリング経路にハイライトを当てるために、公知の生理活性を有する化合物の低分子ライブラリが、培養エキスパンションおよび/または、多分化能に否定的な影響を与えるものを同定するためにスクリーニングされた。主要な系路の阻害がそのようなアッセイにおける遅くされた増殖、細胞障害性、アポプトーシスまたは分化をもたらすと予想されるだろう。重要なことには、このスクリーニングは単純に定義された培地を背景として実行され、血清または準分別されたアルブミンなどの未定義の、または、可変な成分によって典型的に導入される非一貫性を抑制した。単純なアルカリ性ホスファターゼ染色アッセイが、hES細胞成育に影響を与えた約50の化合物を決定するのに使用された。細胞表面神経伝達物質受容体の多数の阻害剤は同定され、これらの受容体について自己再生シグナリングの役割を示唆した。天然由来のリガンドまたは薬品作用関連誘導体を使用して、数種類の低分子神経伝達物質(また、ホルモンまたはモジュレータ(modulator)として機能できる)は、低密度で育てられたhES細胞の生存および/または、エキスパンションをサポートすることがわかった。hES細胞の商業的、そして、臨床の用途に関して開発される先進技術にそのような活性は重要である場合がある。これらの例としては、たとえば信頼できる単独細胞クローニング、完全に定義されて、GMP対応条件下の新しいhES細胞ラインの効率的な導出や、継代時の懸濁培養におけるhES細胞の成長や向上した生育性などがあげられる。
【0027】
定義
特記のない場合、本願発明明細書で使用される用語は、関連技術における当業者によって理解される通常の使用法による。また、以下に提供された用語の定義に加えて、分子生物学の一般的な定義は以下に見られる。Rieger et al., 1991 Glossary of genetics:classical and molecular, 5th Ed., Berlin:Springer-Verlag;Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 補足)。単数形の表記が明細書と特許請求の範囲において使用される場合、それが使用されている文脈に基づいて、1つまたはそれ以上の意味であることが理解されるべきである。したがって、たとえば、「細胞」は少なくとも1つ、2つまたは多数の細胞を意味することができる。
【0028】
また明細書および特許請求の範囲において、特記の無い限り、成分の量、物質の割合または比率、反応条件および他の数値については、すべての場合に“約”という用語によって修飾されるものとして理解される。反する記述のない限り、明細書および特許請求の範囲において記載される数値パラメータは近似値であり、本発明により得られることが求められるものに応じて変化することができる。少なくとも、特許請求の範囲について均等論の適用を制限するものではなく、それぞれの数値パラメータは少なくとも有効数字として報告されており、通常の丸めの技術によっている。
【0029】
「約」という本明細書に使用される用語は、“約”が付された数が、示された数字のプラスマイナス1−10%を含むことを意味する。例えば、約50のヌクレオチドは、45−55のヌクレオチドまたは状況に依存して49−51のヌクレオチドを意味できる。本明細書では、「45−55」などの数値範囲は、範囲内のそれぞれの整数を呼ぶ。例えば、「45−55%」は、割合が45%、46%、などと増え、55%を含むことを意味する。本明細書に記載された範囲内が、たとえば「1.2%から10.5%」のように小数点を含む場合、その範囲は特定の範囲内で示した中で最も小さい増分のそれぞれの少数値について言及する。例えば、「1.2%から10.5%」の場合には、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、であることができ、10.5%を含む。また「1.20%から10.50%」は、1.20%、1.21%、1.22%、1.23%であることができ、10.50%を含む。
【0030】
また、典型的な製造規模の懸濁培養は細胞濃度を最大にしつつ、細胞生存率を維持するための方法として培地の連続かん流(continuous perfusion)を利用する。このような関係においては、培地交換は接着細胞と懸濁集合体に異なった影響の流体せん断を与える。培地流れが細胞表面を横切って流れるとき、不動化された接着細胞は流体せん断応力を受けることがある。対照的に、懸濁集合体は集合体表面を横切るせん断応力をほとんど受けない。集合体が適用されたせん断力に対応して自由に崩れることができるからである。長期間のせん断応力が接着胚性幹細胞に有害であり、懸濁している集合体の形式が最適な生存および機能のために好しいことが予想される。多能性幹細胞、および/または、多能性幹細胞(pluripotent stem cells)から由来されるマルチポーネント前駆細胞(multipotent progenitor cells)の生産のための効率的な製造プロセスと、せん断速度とせん断応力に関連する上記の観測された機構の必要性に基づく必要性が存在している。本発明は、初めて多能性幹細胞の製造方法、および/または、懸濁液形式、特には細胞集合体懸濁液形における多能性幹細胞から誘導されたマルチポーネント前駆細胞の生産のための製造方法を提供する。
【0031】
本明細書において使用される時、「単独細胞懸濁液(single cell suspension)」またはその同等な表現は、すべての機械的、生物学的または化学的手段により調製することができる、流体と細胞の混合物、より典型的には流体と互いに分離された複数の細胞の混合物を意味する。本明細書における単独細胞懸濁液は典型的には、生理学的溶液、たとえば基本塩類溶液、塩水、細胞培地、または同様のものなどの中に懸濁された生育可能なhES細胞またはhES−由来の細胞を含むものをいう。細胞集塊を解離して、第1次組織、培養物中の接着細胞および集合体から、単独細胞懸濁液を形成するためにはいくつかの方法が存在し、例えば、物理的力(細胞スクレーパ、狭口径ピペット、細針吸引、渦離解、および細かいナイロンまたはステンレスメッシュを通した強制濾過などによる摩砕などの機械的な解離)、酵素(トリプシン、コラゲナーゼ、アキュターゼ(Acutase)などによる酵素的な解離)、または両者の併用があげられる。さらに、hES細胞の単独細胞への解離を支持するために役立つ方法および培養培地条件は、エキスパンション、細胞選別、マルチウェルプレート検定のための定義されたシーディングのために有用であり、培養手順とクローンエキスパンジョンの自動化を可能にする。したがって、本発明の1つの実施態様は、長期の維持と未分化の多分化能hES細胞または分化型hES細胞の効率的なエキスパンションをサポートすることができる、単独細胞の安定した酵素学的解離hES細胞またはhES−由来細胞培養系を発生させるための方法を提供する。
【0032】
本明細書において使用される時、「接触」という用語(すなわち、細胞、例えば、分化可能な細胞と化合物との接触)は、化合物と細胞を一緒に生体外(例えば、培養物中で化合物を細胞に追加する)でインキュベートすることを含んでいることを意図する。「接触」という用語は、対象中で自然に起こることがある、成分、化合物、成長因子など(たとえば神経伝達物質、ErbB3リガンド、およびTGF−βファミリーのメンバー)を含む定義された細胞媒地への細胞のin vivo暴露(すなわち、天然の生理学的過程の結果、起こることがある暴露)を含めないことを意図する。神経伝達物質、ErbB3リガンド、およびTGF−βファミリーのメンバーを含む定義された細胞培地と細胞が接触するステップは、上記の成分と細胞が接触し暴露されると理解される。例えば、接着培養、または懸濁培養で細胞をインキュベートすることにより細胞を接触させることができる。細胞を安定させるか、または細胞を分化するために、定義された培地と接触された細胞は、さらに細胞分化環境で処理できることが理解される。
【0033】
細胞培養の文脈で本明細書に使用される「サポート」または支持は、培地組成物とそれの具体的成分を示し、細胞培養の所望の成長、生育、多分化能および/または、他の特性に十分なものである。したがって、hES細胞の未分化型エキスパンションをサポートする定義された培地は、hES細胞がそこに追加要素も、化合物も、添加物もまたは同様のものもなしで培養されるとき細胞が分化しないで成長するものである。hES細胞のエキスパンションをサポートする化合物または要素は、説明されたメディア条件に加えられるとhES細胞が成長できるものである。
【0034】
本明細書において使用される時、「定義された細胞培養培地」は「定義された培養培地」、および「定義された培地」は、互換性を持って使用され、実質的に同様の特性で忠実に再生できる無機および有機の成分(生物学的および生活性の成分を含む)の特定の比、量または活性で含む水性の組成物について言及する。定義された培地はタンパク質、望ましくは組換蛋白質を含むことができる。ただし、それらが有意のロット間変動またはバッチ間変動なくそれらを調製するか、または精製できることが条件である。動物の血清は、本来定義できず、可変であるので、定義された培地は血清を含まない。しかしながら、個別の高度に精製された血清または他のタンパク質、要素などは、所定量、または質量、モル当量または活性(例えば、測定できる生物活性)に比例して含むことができる。
【0035】
本明細書において使用される時、「分化」という用語は、それが由来する細胞タイプよりも、より分化された型である細胞タイプの生産について言及する。したがって、用語は部分的にまたは最終的に分化された細胞形を包含する。一般に、hES細胞から得られた分化細胞とは、hES−由来細胞、hES−由来細胞集合体培養物、hES−由来単独細胞懸濁液、またはhES−由来細胞接着培養物、および同様のものをいう。
【0036】
本明細書において使用される時、「実質的に」の用語は、大きい範囲又は程度をいい、たとえば方法において「実質的に同様」の用語が使用される場合には、大きい範囲又は程度において他の方法と類似する方法をいう。本明細書に使用される場合、例えば「実質的に含まない」(たとえば「実質的に汚染物を含まない」、「実質的に血清を含まない」、「インスリンまたはインスリン様増殖因子を実質的に含まない」)、またはそれの同等表現は、溶液、培地、サプリメントおよび賦形剤なとが少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%、血清、汚染物または同等物を含まないことを意味する。1つの実施態様では、血清を含まない、100%血清を含まない、または実質的に血清を含まない定義された培地が提供される。逆に、組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、および同様のものが、「実質的に同様である」またはそれと同等の表現が記載された場合には、組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、および同様のものが、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%が、本明細書で先に記載された組成物、プロセス、方法、溶液、培地、サプリメント、賦形剤、または先に記載された方法と、また全体として本明細書に組み込まれた方法と類似することをいう。
【0037】
本発明のある実施態様では、「富化された」という用語は、希望の細胞リネッジ(cell lineage)を約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%以上で含む細胞培養物をいう。
【0038】
本明細書において使用される時、化合物の「有効な量」という用語またはそれと同等の表現は、フィーダー細胞がないときまたは血清もしくは血清代替物がないときに、1カ月以上、2カ月以上、3カ月以上、4カ月以上、5カ月以上、および/または6カ月以上分化可能な細胞培地の安定化のような所望の結果に作用するように、定義された培地の成分中に存在する化合物の十分な量をいう。本発明の他の態様では、化合物の「有効な量」という用語またはそれと同等の表現は、フィーダー細胞の非存在下または血清もしくは血清代替物の非存在下において5、10、15、20、25、30または40継代よりも長く、多能性細胞培養の安定化に有効な成分が残存するに十分な化合物の濃度を示すことができる。同様に、この濃度は当業者によって容易に決定される。
【0039】
本明細書において使用される時、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドの転写および/または細胞の中のポリペプチドの翻訳についていい、分子のレベルは分子を発現する細胞では分子を発現しない細胞よりも測定可能に高くされる。分子の発現を測定する方法は、当業者にとって周知であり、ノーザンブロット法、RT−PCR、in situ ハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット法、および免疫染色があげられるが、これらに限定されるものではない。
【0040】
本明細書において使用される時、細胞、細胞ライン、細胞培養または細胞のポピュレーションについて述べる時、「単離された(isolated)」という用語は、細胞の天然源から実質的に分離され、細胞、細胞ライン、細胞培養、または細胞ポピュレーションが生体外で培養できるようにされることをいう。さらに、「単離」という用語は、二個以上の細胞のグループからの1種以上の細胞の物理的分離についていい、細胞は細胞のモルホロジーおよび/または様々なマーカーの発現に基づいて選択される。
【0041】
本発明は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明ならびにそこに含まれる実施例を参照することでさらによく理解され得る。しかしながら、本発明にかかる組成物と方法について説明する前に、本発明は特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、または特定の方法などに限定されないことが理解されるべきである。当業者には当然、種々の改良と変更が明らかである。
Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth. Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif and Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (Eds.) 1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; and Setlow and Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York. Lastly, を参照されたい。
【0042】
使用される略語と用語体系は、この分野で標準であると考えられて、本明細書に引用されたものなどの専門雑誌で一般的に使用される。本発明は、非常に精製された増殖因子を含む定義された培地組成物(例えば、DC−HAIF培地)は、分化を起こさずに多分化能性幹細胞のエキスパンションをサポートするのに使用できるという本出願人の先の知見に基づいている。本発明は、生育性、成長、多分化能および自己再生に重要なシグナル伝達経路に影響する低分子有機化合物を含んでいる定義された培地を提供する。hES細胞の生育性、成長または潜在活性を減少させる、薬学的に活性な化合物のライブラリのスクリーニングにより、様々な系路がこの点で重要であるとして同定された。知られている活性に従って、これらの化合物は分類された。同定された系路は、神経伝達物質受容体により大きな割合で仲介されることが同定された。具体的には、化合物の多くが、多分化能性幹細胞の成長にマイナスの影響があると同定され、神経伝達物質受容体の拮抗体であるとされた。
【0043】
本明細書において使用される時、「神経伝達物質」または「内因性神経伝達物質」の用語は、励起したときにニューロンの軸索の末端から放出され、シナプス間隙を横切って移動し、標的細胞(例えば、シナプス後ニューロン、樹枝状終点)を励起するかまたは抑制する物質をいう。神経伝達物質は、低分子化合物(すなわち、<=800ダルトン)であり、たとえばモノアミンおよびアミノ酸、並びにより大きな分子、たとえばぺプチドを含む。一般的な低分子神経伝達物質としては以下が挙げられる。
【0044】
【化1】
【0045】
【化2】
【0046】
【化3】
【0047】
【化4】
【0048】
【化5】
【0049】
【化6】
【0050】
【化7】
【0051】
【化8】
【0052】
【化9】
【0053】
神経伝達物質は典型的に7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体(7-transmembrane G-protein-coupled receptors)である標的細胞上の受容体(すなわち、「神経伝達物質受容体」)に結合する。神経伝達物質受容体の例としては:アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、グリシン作動性、グルタミン作動性、GABA作動性、ヒスタミン作動性、コリン作動性、およびセロトニン作動性神経伝達物質受容体があげられる。ある神経伝達物質はシナプスから離れて拡散し、「神経調節(neuromodulation)」として知られているプロセスで複数のニューロンに影響を与え、または他の細胞または受容体に「ホルモン」としての行動する。
大量の薬学的に活性な薬物は、低分子神経伝達物質受容体リガンドであり、たとえばアゴニスト、拮抗体、モジュレータ等である。
【0054】
本明細書において使用される時、「リガンド」は受容体などの生物学的分子に結合する化学的を示す。本明細書において使用される時、「アゴニスト」は細胞の受容体に結合して、細胞による反応の引き金となるリガンドを示し、「拮抗体」は、受容体に結合し、アゴニストの結合をプロックすることにより細胞の反応を抑制するリガンドをいう。
【0055】
多分化能性幹細胞の成長、特に低細胞濃度においてポジティブな効果を持っている化合物を同定するために、低分子薬剤化合物ライブラリのサブセットが、定義された培地DC−HAIF内で低細胞濃度でhESの成長をサポートする能力を持っている化合物についてスクリーニングされた。神経伝達物質拮抗物質がネガティブにhES細胞成育に影響を与える場合、同じ受容体のアゴニストまたは内因性リガンドがポジティブにhES細胞に影響を与えることができると推論された。以下の実施例2と3に記載されるように、低細胞濃度でhES細胞成育をサポートしたさまざまな物質が同定された。特異的に、神経伝達物質ノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、およびアデノシンは、定義された培地に加えられると、多分化能性幹細胞の低密度生存とエキスパンションをサポートする候補として同定された。
【0056】
したがって、本発明は基本栄養塩溶液、増殖因子、並びにノルエピネフリン、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、およびアデノシンから選択された1種以上の神経伝達物質を含む、定義された培地を提供する。また本発明は、神経伝達物質誘導体、変異体、代謝物、構造類似体、塩、および同様のものを含む、天然由来または人工の低分子の神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗体、リガンド、およびモジュレータを含む定義された培地を提供する。本発明の1つの態様では、媒質はDC−HAIFであり、神経伝達物質はノルエピネフリンである。他の実施態様では、培地は2以上の神経伝達物質の組み合わせを含んでいる。例えば、一定の条件の下で、ノルエピネフリンとアセチルコリンの組み合わせはhES細胞成育を刺激するために相乗効果的に行動するのがわかった。
【0057】
本発明のある実施態様では、ノルエピネフリンと簡易型の増殖因子成分を有する定義された培地組成物を提供する。驚くべきことに、より高い(標準の)細胞濃度と比べて、hES細胞が低細胞濃度で培養されたときには、異なった増殖因子をノルエピネフリンおよび/または、他の小さい有機化合物に取り替えることができる。具体的には、標準細胞濃度では必要であることがわかっていたアクチビンは、低細胞濃度においては必ずしも必要ではなく、より高い細胞濃度でノルエピネフリンに置き換えることができた。
【0058】
本明細書においては「標準細胞濃度」は、培地中で成長可能であって、エキスパンションができるのが典型的に知られている多分化能性幹細胞の濃度領域をいう。たとえば、hES細胞は典型的には、約1×105から約5×105細胞/mlの濃度で培養され、約2.5×106から約5×107細胞/mlの濃度になった時に分割されるか、または継代される。対照的に「低細胞濃度」は、標準細胞濃度よりかなり少ない細胞濃度で培養された多分化能性幹細胞をいう。当該技術分野で、ある閾値濃度より下で培養された細胞は、細胞分裂で立ち遅れを経験したり、または継代を乗り切れないことが周知である。1mlあたり約5×104細胞/mlまたはそれ以下で培養されたhES細胞株は、低細胞濃度のものであると考えられる。
【0059】
ある実施態様では、多能性細胞は細胞外マトリックス蛋白質(ECM)、たとえばMATRIGELの存在下および/または非存在下において、本明細書に記載された定義された培地で培養される。ECMの非存在下で培養された多能性細胞は、約0.5〜10%のヒト血清(hS)を含んでいるか、または300Kおよび/または100Kカットオフスピンカラム(Microcon,Millipore, Billerica, MA))からのhS濃縮画分を含む。直接hSまたはhS濃縮画分を含む培地でhES細胞を直接インキュベートすることによって、hES細胞集合体懸濁液を製造できる。hSまたはhS濃縮画分と培地容器を約30分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、12時間、または24時間、37℃でインキュベートした後に、hES細胞集合体懸濁液を製造できる。hSまたはhS濃縮画分含有培地におけるhES細胞のための培養効率は、PCT/US2007/062755に記載されている、DC−HAIFで培養されたhES細胞、またはECMとしてMATRIGELを使用してDC−HAIF培地で培養されたhES細胞、または他の類似する培地で培養されたhES細胞において観察されたものと匹敵していた。実質的に血清を含まない定義された培地でhES細胞を培養することが、2009年4月23日に出願された、米国出願番号2009/0104696の、ヒト血清を含むフィーダーを含まない多能性幹細胞培地組成物と方法(METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER PLURIPOTENT STEM CELL MEDIA CONTAINING HUMAN SERUM)に記載され、これは本明細書の一部として組み込まれる。
【0060】
異なる実施態様では、単層(monolayer)または集合体懸濁液の多能性細胞は実質的に血清を含まない培地で、外因的に付加された繊維芽細胞生長因子(FGF)の非存在下で培養された。これはトムソンらの米国特許番号7,005,252の、血清を含まない培地であるが、FGFをはじめとする外因的に付加された増殖因子を含む培地でhES細胞を培養することを必要とする発明と区別される。
【0061】
本明細書において使用される時、「分化可能な細胞」という用語は、少なくとも部分的に成熟した細胞に分化できる細胞または細胞集合、たとえば他の細胞との融合のような、少なくとも部分的に成熟した細胞へ分化できる細胞の分化に参加できるものを記載するために使用される。本明細書において使用される時、「少なくとも部分的に成熟している細胞(partially mature cells)」は、「前駆細胞(progenitor cells)」、「前駆体細胞(precusor cells)」、「マルチポーネント細胞(multipotent cells)」、「未熟細胞(immature cells)」、および最終分化(terminally differentiated)細胞を含む。少なくとも部分的に熟している細胞は、例えば、最終的な内はい葉細胞、PDXl陰性前腸内胚葉細胞、PDXl陽性プレ膵性内はい葉細胞を含むPDXl陽性膵性内はい葉細胞、PDXl陽性膵性内胚葉端細胞、またはPDX1/NKX6.1コ−ポジティブまたはPDX1/PTF1A コ−ポジティブ膵性内はい葉細胞、NGN3/NKX2.2コ−ポジティブ細胞の陽性のマルチまたはシングル−ホルモン性分泌すい臓細胞を含む。すべてが、同じ臓器または組織からの成熟細胞の、たとえばモルホロジーまたは蛋白質発現などの遺伝表現型の少なくとも1つの特徴を示すが、さらに他の少なくとも1つの細胞タイプに分化できる。
【0062】
さらに、胚様体(EBs)を形成する他の方法を説明する。本明細書において使用される時、「胚様体(embryoid bodies)」、「集合体(aggregate bodies)」との用語またはそれと同等の表現は、ES細胞が単層培地中で過成長した時、または未定義の培地内の懸濁培養で維持されるか、または多発性胚葉組織に向けた非由来性のプロトコールを介して分化された時に現れる分化したおよび未分化の細胞の細胞集合体をいう。すなわち、EBsは、本明細書に記載されるような、多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から形成されない。また、EBsはhES−由来のマルチポーネント細胞の接着培養から形成されない。これらの特徴のみによっても、胚様体と本発明は明確に区別される。
【0063】
胚様体は典型的にはモルホロジー的な評価基準により識別可能な、数個の胚葉である異なる細胞タイプの混合物である。ES細胞の培養で胚様体を形成した時に関する決定は、当技術分野の当業者によって例えば、モルホロジーの目視検査により、ルーチン的に行われる。培養条件に依存して、約20以上の細胞の浮いた塊はEBsであると考えられている。たとえばSchmittら、(1991)Genes Dev.5,728−740;Doetschmanら(1985)J.Embryol.Exp.Morph.87、27−45を参照。また、用語は胚性生殖腺領域から抽出された初期の細胞である、始原生殖細胞から得られたものと等価の構造をも意味する。例えば、Shamblott,ら(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,13726を参照。また当技術分野で時々EG細胞または胚芽細胞と呼ばれる始原生殖細胞は、適切な因子群で処理されると、胚様体を誘導することができる多分化能胚性幹細胞を形成できる。例えば、米国特許番号5,670,372、および上記のShamblottらを参照。
【0064】
EBsを作るための様々な方法が存在している、例えば(2008)ネイチャープロトコル3(5):468−776に記載されたスピン胚様体(spin embryoid bodies)、上記のBauwens他(2008)に記載されているような、マイクロパターンド細胞外マトリックスアイランド上にプレーティングされた単独細胞懸濁液からEBsが形成される。しかしながら、これらの方法はhES細胞およびhESによって由来された細胞の大規模な生産(製造)には、費用的に採算が合わず、それほど効率的でない。スケールアップ生産が実際に始まるまでに、あまりに多くの工程を必要とするからである。たとえば、Bauwens他の方法では、細胞が懸濁培養を始めるために選択される前に、最初に低減した増殖因子MATRIGEL(登録商標)にhES細胞をシードしなければならない。この方法の時間と費用は、カスタム設計されたマイクロ−パターンド組織培養プレートが必要であるので、厄介である。さらに、Ngらの方法は、hES細胞とhES−由来の細胞の大規模な製造には、より均一なEBを作成するために遠心分離機の使用が必要であり、費用効率的でない。最後に、これらのすべての方法論では、本発明のようには、細胞集合体は多分化能性幹細胞の単独細胞懸濁液から作られない。
【0065】
胚様体は、3つの胚葉からの多数の細胞タイプで作られた細胞集合体であり、典型的には未分化型胚性幹細胞の集合体を非有向性分化シグナル(non-directed differentiation signals)、たとえば20%のウシ胎仔血清などに暴露することによって作成される細胞集合体である。これは本発明で記載される細胞集合体とは異なる。この非有向性方法論の結果は、生体外で通常の胚成長をまねることを意図する細胞タイプの混合物である。このアプローチは基礎研究レベルで胚成長を調べることの役に立つが、それは細胞収率、集団のアイデンティティ、集団の純粋さ、バッチの一貫性、安全性、細胞機能、および商品原価が主要な関心であるところのすべての大規模な細胞治療製造プロセスには適用できない。そのうえ、胚様体から所定の細胞タイプを精製するのに使われた任意の富化作用戦略にかかわらず、分化プロトコールは単独細胞タイプの大集団を発生させる直接的なアプローチを提供しない。それに続いて、汚染物集団がいつも支配的であり、特定集団を精製するどんな試みも妨げるだろう。
【0066】
多能性細胞の集合体を作成して、分化することへのすべての先行研究は、それらの方法論において以下のコンポーネンツの一個以上を有する:1)ヒト胚性幹細胞ではなくマウスの使用;2)通常の細胞接着過程ではなく、細胞を集合させるために遠心沈殿に依存する強制集合プロトコール;3)静的条件における、細胞塊の集合;4)非単独細胞解離または表面の細胞をこすり落とすことによる集合体の形成;および5)すべての胚様体と胚葉の細胞タイプの形成をもたらす、15−20%の胎児ウシ血清を使用する細胞集合体の非直接分化。我々の知識によれば、胚様体を分化するのに15−20%のFCSを利用しない唯一の研究は、細胞集合体が強制的な集合で形成されて、次に集合体がすぐに、中胚葉に適切な培地を使用して分化されるプロトコールについて説明する(Ngら、Blood.2005 106(5):1601)。しかしながら、この仕事では、10−12日間静的に集合された後、研究者が非集合の接着培養に胚様体を移しているので、本発明とは無関係である。
【0067】
対照的に、本発明は1)ヒト胚性幹細胞を単独細胞に分離し、集合直径および細胞生存のコントロールを改良するために最適化されたせん断速度で回転培養(rotational culture)することによる集合体の形成、2)次に直接、最終的な内胚葉へES細胞集合体を分化させ、前腸内胚葉に分化させ、プレ膵性前腸内胚葉へ分化させ、次いで膵性内胚葉および最終的に膵臓内分泌細胞へ分化させるとの、単独細胞集合体形成のためのアプローチを提供する。この分化プロトコールは高能率と最小量の汚染物集団で、最終的な内胚葉および膵性リネッジ集団を発生させる。そのうえ、他のすべての公開された研究と対照的に、胚性幹細胞集合と分化へのこのアプローチは胚様体を作成しない。
【0068】
1つの特定の実施態様では、未分化の細胞および分化可能な細胞は本発明の細胞培地を使用して、懸濁培養中でエキスパンドする。別の特定の実施態様では、分化可能な細胞が懸濁液内に保持されエキスパンドされる。すなわち、それらは、未分化型のままで残っているか、またはさらに分化するのが阻まれる。当該技術分野において、細胞増殖に関連して「エキスパンド(expand)」、「エキスパンドされた」、「エキスパンジョン」の用語が使用される時、細胞増殖および細胞数の増加、好ましくは生菌細胞数の増加をいう。具体的な実施態様では、細胞は、培養懸濁液中で、約1日、すなわち約24時間以上の間培養することによって、エキスパンドする。より具体的な実施態様では、細胞は懸濁培養中で少なくとも1、2、3、4、5、6、7日間、または少なくとも2、3、4、5、6、7、8週間培養することによりエキスパンドする。
【0069】
本発明は、それらのソースまたはそれらの可塑性(plasticity)にかかわらず、分化可能な細胞に有用な組成物と方法を企図する。本明細書においては、当該技術分野においてそうであるように、細胞の「可塑性」は概略的な意味で使用される。すなわち、細胞の可塑性は、胚、胎児または成長した有機体からの組織または臓器で見い出される特定の細胞タイプに分化する細胞の能力について言及する。細胞が「より可塑性」であればあるほど、細胞が分化できるかもしれない組織はより多くなる。
【0070】
いくつかの実施態様では、「多能性細胞」は、内胚葉リネッジ(endoderm-lineage)、または、特に膵性内胚葉タイプ細胞(pancreatic endoderm type cells)への分化の出発物質として使用される。本明細書において使用される時、「多分化能」、「多能性」、「多能性細胞」、および同等の表現は、細胞培養において増殖および自己再生の両方ができ、例えば多分化能胚性幹細胞は3つの胚性細胞リネッジのそれぞれをもたらすことができるように、マルチポーネント特性を示すものを含むさまざまな細胞集団に分化するものをいう。しかしながら、多能性細胞は胎座の羊膜や、絨毛膜や、他の成分などの胚体外の組織をもたらすことができない。また生体全体の生体を製造できないだろう。すなわち、多能性細胞は「分化全能性(totipotent)」ではない。単独細胞の子孫から3種のすべての胚性胚葉の誘導体を形成して安定した発生能を示す証拠を提供し、注射の後に奇形腫を免疫抑制マウスに発生させることによって、多分化能を示すことができる。多分化能の他の表示は、多能性細胞および、特徴的形態で発現することが知られている遺伝子の発現を含む。当業者に知られている任意の方法を使用して、本発明の多能性細胞を誘導することができる。
【0071】
本明細書に使用される「分化全能性」は、すべてのタイプの細胞、すなわち胚外組織(例えば、胎座)および生体(例えば、マウスまたは人間)の全体をもたらすように成長する細胞の能力をいう。
【0072】
「自己再生」は、分割して親幹細胞と同じ特性を有するより多くの幹細胞を形成し、その結果、幹細胞の集団が無期限に補給されるのを許容する幹細胞の能力をいう。
【0073】
ある実施態様では、出発物質として使用される多能性細胞は、hES細胞、hEG細胞、iPS細胞、単為発生細胞(parthenogenic cell)、および同様のものをはじめとする幹細胞を含んでいる。本明細書において使用される時、「胚性」はただ一つの接合体から、発育済み配偶子細胞以外の多分化能または全能細胞を含まない多細胞性構造までのさまざまな生体の発育時期の範囲を示す。配偶子融合により誘導された胚種に加えて、「胚性」という用語は体細胞核移植により誘導された胚種についてもいう。別の実施態様では、多能性細胞は胚種から誘導されないかまたはただちには誘導されない。たとえば非多能性細胞、たとえばマルチポーネント細胞または最終分化細胞から「退行分化」または「再プログラム化」として知られているプロセスでiPS細胞を得る。本明細書において使用される時、「退行分化(dedifferentiation)」または「再プログラム化」は、分化細胞がそれほど専門化していない先駆、前駆細胞、または幹細胞状態に戻るプロセスをいう。
【0074】
本明細書において使用される時、「マルチポーネント特性(multipotency)」、「マルチポーネント細胞(multipotent cell)」またはそれと同等の表現は、他の特定の細胞タイプの限定された数をもたらすことができる細胞タイプをいう。すなわち、マルチポーネント細胞は1種以上の胚性細胞の運命にゆだねられ、多能性細胞と対照的に、3つの胚性細胞リネッジのそれぞれ、および胚体外の細胞をもたらすことができない。多分化能体細胞は、多能性細胞に対してさらに分化されるが、最終までには分化されない。したがって、多能性細胞(pluripotent cell)には、マルチポーネント細胞より高い潜在能がある。体細胞のプログラムを変えることができるか、またはiPS細胞を発生させるのに使用できる潜在能決定要因としては、Oct−4、Sox2、FoxD3、UTF1、Stella、Rex1、ZNF206、Sox15、Myb12、Lin28、Nanog、DPPA2、ESG1、Otx2またはそれらの組み合わせなどの要素を含むが、これらに限定されない。
【0075】
本発明の1つの態様は、適切な条件の下で培養される時に、選択的に、およびいくつかの態様では可逆的に選択的に異なったセルリネッジを発現できる、多分化能または前駆細胞の集団を含んでいる。本明細書において使用される時、「集団」という用語は同じ識別特性を有する1つ以上の細胞の細胞培養株を示す。「細胞リネッジ」という用語は、細胞タイプの発達のステージのすべてについて言い、最も早い前駆細胞から完全に成熟した細胞(すなわち、特殊化した細胞)までをいう。「前駆細胞(precursor cell)」または「先祖細胞(progenitor cell)」は、より成熟した細胞に分化できる細胞分化経路における任意の細胞であることができる。そういうものとして、前駆細胞は多能性細胞であることができ、またはそれは部分的に分化したマルチポーネント細胞、または可逆的に分化した細胞であることができる。「先駆細胞集団(precursor cell population)」という用語は、より成熟した、または分化した細胞タイプに生育できる細胞群をいう。先駆細胞集団は多分化能である細胞、制限された幹細胞リネッジである細胞(すなわち、すべての外胚葉性リネッジよりも少なく生育できる細胞、またはたとえば神経細胞リネッジにのみ生育できる細胞)、可逆的な制限された幹細胞リネッジである細胞を含むことができる。したがって、「先祖細胞」または「前駆細胞」は、「多能性細胞」または「マルチポーネント細胞」であることができる。
【0076】
本明細書において使用される時、「発育する(develop)」、「分化する」、「成熟する」、または「多能性細胞から生産される」、「多能性細胞から誘導される」、「多能性細胞から分化される」、および同等な表現は、分化された、またはより特殊化した細胞タイプの生産をいい、たとえば生体外の、または、生体内の多能性細胞からの生産をいい、例えば、膵性ホルモンの生産方法のタイトルの国際出願PCT/US2007/015536に記載される、生体内の、移植されたPDX1膵性内はい葉細胞からの成熟した内分泌細胞の生産をいう。この文献は参考として援用される。すべてが、特殊化を経て少なくとも2つの別々の細胞リネッジに分化する可能性を持つステージから、結局最後まで分化する、細胞の発達に関する。本願の目的のために、そのような用語を互換性を持って使用できる。本発明はそのような分化が可逆的であり、多分化能または少なくとも2つ以上の細胞リネッジに分化する能力が選択的に獲得されることを許容する培養条件を企図する。
【0077】
また、本発明は動物の中の任意のソースからの分化可能な細胞を企図する。ただし、細胞が本明細書に定義されるように分化可能であることが条件である。例えば、分化可能な細胞は胚種、その内部の任意の始原生殖層、胎盤または絨毛膜組織、または成人幹細胞などのより成熟している組織、たとえば、それらに限定されるものではないが、脂肪、骨髄、神経組織、乳房組織、肝臓組織、膵臓、上皮、呼吸器、生殖腺および筋肉組織から収穫することができる。具体的実施態様では、分化可能な細胞は胚幹細胞である。他の具体的実施態様では、分化可能な細胞は成人幹細胞である。さらに、他の具体的実施態様では、幹細胞は胎盤の、または絨毛膜から誘導された幹細胞である。
【0078】
本発明は、もちろん分化可能な細胞を発生させることができるすべての動物からの分化可能な細胞も使用することを企図する。分化可能な細胞が得られる動物は、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、非哺乳動物、人間、または非人間であることができる。動物ソースの例としては、霊長動物、齧歯動物、犬科、ネコ科、ウマ科、うし科、およびブタ科の動物を含むが、これらに限定されない。
【0079】
ある実施態様では多能性幹細胞が利用される場合、多能性細胞は正常核型を持っている。調べられた分裂中期の多能性細胞培養物の50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上または95%以上が正常核型を有する。
【0080】
本発明の組成物と方法は基本栄養塩溶液を含む。本明細書において使用される時、基本栄養塩溶液とは、通常の細胞代謝のために本質的なある種のバルクな無機イオン類と水を細胞に提供する塩の混合物であり、細胞内と細胞外の浸透バランスを維持して、エネルギー源として炭水化物を提供して、生理的pH範囲内の中に媒体を維持するための緩衝化システムを提供する塩の水性溶液をいう。基本栄養塩溶液の例としては、ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)、最小必須培地(Minimal Essential Medium)(MEM)、基本イーグル培地(Basal Medium Eagle)(BME)、RPMl1640、ハムズ(Ham's)F−10(Ham's F-10)、ハムズF−12(Ham's F-12)、アルファ−最小必須培地(α-Minimal Essential Medium)(αMEM)、グラスゴー最小必須培地(Glasgow's Minimal Essential Medium)(G-MEM)、およびイスコブの改良ダルベッコ培地(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、または多分化能細胞に使用される汎用培地、たとえばX−VIVO(Lonza)造血基本培地およびそれらの混合物があげられるが、これらに限定されるものではない。1つの具体的な実施例では、基本栄養塩溶液はDMEMとハムズF12の約50:50混合物である。
【0081】
本明細書に記載される基本栄養塩溶液は、多能性細胞の成育と生存を維持するのに使われるが、本発明の他の実施態様においては、多分化能または多能性細胞の分化を維持するために、代替の幹細胞培養液も実質的に同様に作用し、たとえばKSR(Invitrogen)、無異物性のKSR(xeno-free KSR)(Invitrogen)、StemPro(登録商標) hESC SFM(Invitrogen)、mTeSR(登録商標)l(StemCell Technologies)、HES cellGRO(ミリポア)、DMEM、およびX Vivo(Lonza)ベース培地などがあげられるが、これらに制限されるものではない。
【0082】
組成物がさらに微量元素を含むことが企図される。商業的に微量元素を購入でき、例えば、Mediatechから購入できる。微量元素の非限定的な例としては、アルミニウム、塩素、硫酸、鉄、カドミウム、コバルト、クロム、ゲルマニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、ホスフェートおよびマグネシウムがあげられるが、これらに制限されるものではない。微量元素を含む化合物の具体的な例としては、AlCl3、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、CdCl2、CdSO4、CoCl2、CrCl3、Cr2(SO4)3、CuSO4、クエン酸第二鉄、GeO2、KI、KBr、LI、モリブデン酸、MnSO4、MnCl2、NaF、Na2SiO3、NaVO3、NH4VO3、(NH4)6Mo7O24、NiSO4、RbCl、セレニウム、Na2SeO3、H2SeO3、亜セレン酸塩−2Na、セレノメチオノン、SnCl2、ZnSO4、ZrOCl2、それらの混合物、およびそれの塩があげられるが、これらに制限されるものではない。セレニウム、亜セレン酸塩またはセレノメチオノンが存在している場合には、約0.002〜約0.02mg/Lの濃度で存在する。また、さらに、ヒドロキシルアパタイトも存在することができる。
【0083】
定義された培地にアミノ酸類を加えることができると企図される。そのようなアミノ酸類の非限定的な例としては、グリシン、L−アラニン、L−アラニル−L−グルタミン、L−グルタミン/グルタマックス、L−塩酸アルギニン、L−アスパラギン−H2O、L−アスパラギン酸、L−システイン ヒドロクロライド H2O、L−シスチン2HCl、L−グルタミン酸、L−ヒスチジン塩酸塩−H2O、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−塩酸リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−ヒドロキシプロリン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン二ナトリウム塩二水和物、およびL−バリンがあげられる。ある実施態様では、アミノ酸は、L−イソロイシン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−ヒドロキシプロリン、L−バリン、およびそれらの混合物質である。
【0084】
また、定義された培地はアスコルビン酸を含むことができると企図される。望ましくは、アスコルビン酸は約1mg/Lから約1000mg/L、または2mg/Lから約500mg/L、または約5mg/Lから約100mg/L、または約10mg/Lから約100mg/L、または約50mg/Lの初期濃度において存在している。さらに、本発明の組成物と方法は他の成分を含むことができ、たとえば血清アルブミン、鉄結合性グロブリン、L−グルタミン、リピド、抗生物質、βメルカプトエタノール、ビタミン、ミネラル、ATP、および類似物が存在することができる。存在することができるビタミン類の例としてはビタミンA、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、D1、D2、D3、D4、D5、E、トコトリエノール、K1およびK2を含むが、これらに限定されない。当業者はミネラル、ビタミン、ATP、リピド、必須脂肪酸などの、特定の培養における使用のための最適濃度を決定できる。例えば、サプリメントの濃度は約0.001マイクロMから約1mMまたはそれ以上であることができる。サプリメントが提供されることができる濃度の具体的な例は、約0.005マイクロM、0.01マイクロM、0.05マイクロM、0.1マイクロM、0.5マイクロM、1.0マイクロM、2.0マイクロM、2.5マイクロM、3.0マイクロM、4.0マイクロM、5.0マイクロM、10マイクロM、20マイクロM、100マイクロMなどがあげられるが、これらに限定されない。1つの具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンB6とグルタミンを含む。別の具体的な的実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンCと鉄分サプリメントを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンK1とビタミンAを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、ビタミンD3とATPを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はビタミンB12および鉄結合性グロブリンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はトコトリエノールとβメルカプトエタノールを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はグルタミンとATPを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ3−脂肪酸とグルタミンを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法はオメガ6−脂肪酸とビタミンB1を含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、α−リノレン酸、およびB2を含む。
【0085】
本発明の組成物は本質的には血清を含まない。「本質的に」の用語が、組成物、配合物、方法、および同様のものに使用される時、量および品質が基本的にまたは事実上、呼ばれるものであることをいう。ただし少量の不純物および/または重要でない変更は許容される。一般に、本質的にとは、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約99.5%、または100%をいう。「事実上血清を含まない」とは、本発明の溶液における、血清の非存在、または基本的にまたは事実上存在していないことを示す。血清は、本発明の組成物と方法における必須成分ではない。したがって、すべての組成物における血清の存在は単に不純物とされ、たとえば細胞初代培養からの残留結成であるか、または出発物質からのものである。例えば、事実上血清を含まない培地または環境は、5%、4%、3%、2%、1%、または0.5%未満の血清を含むことができ、媒体または環境の改良された生物活性維持能力が依然として観測される。本発明の具体的な実施態様では、事実上血清を含まない組成物は、血清または血清代替物を含んでいないか、または定義された培地に加えられる血清または血清代替物の成分の単離からの血清または血清代替物の痕跡量を含むだけである。
【0086】
本明細書において使用される時、「機能的な断片(functional fragment)」は、完全な長さのポリペプチドと同様の生理的または細胞の効果を生む完全な長さのポリペプチドの断片またはスプライス変異体をいう。機能的な断片の生物学的な効果は、同様の生理的または細胞の効果が見られる限り、完全な長さのポリペプチドと同じ範囲または強度である必要はない。例えば、ErbB2の機能的な断片、HRG−Pは検出可能にErbB2−由来チロシンキナーゼを刺激できる。本明細書において使用される時、「変異体(variant)」という用語はキメラまたは融合ポリペプチド、同族体、類似物、オーソログ(orthologs)、およびパラログ(paralogs)を含む。たとえばさらに、参照される蛋白質またはポリペプチドの変異体は、アミノ酸配列が参照される蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約80%同じであるタンパク質またはポリペプチドである。具体的な実施態様では、変異体は比較蛋白質またはポリペプチドと少なくとも約85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同じである。
【0087】
本明細書において、たとえば天然の神経伝達物質受容体または人工の神経伝達物質受容体のリガンドのような低分子化合物に関連して使用される時、「類縁体(analog)」という用語は構造的なおよび/または、機能的な類似性を共有する化合物について言う。類縁体は、構造的な類似性を有する「構造類縁体(structural analogs)」と、類似する薬理特性を示す化学的に異なった化合物である「機能的類縁体(functional analogs)」を含む。
【0088】
本明細書において配列アラインメントに関連して用語「対応する」が使用される時には、参照される蛋白質またはポリペプチド内の記載された位置を意味することを意図している。たとえば野生型ヒトまたはマウスのニューレグリン−1と、変成された蛋白質またはポリペプチドにおける参照される蛋白質またはポリペプチドにおける位置をいう。したがって、対象のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列が、参照される蛋白質またはポリペプチド配列のアミノ酸配列と並べられた時、参照される蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列のある記載された位置に対応する配列は、参照される配列の位置と並ぶ配列であり、参照配列と正確な数字の同じ位置にある必要があるわけではない。以下で配列間で対応するアミノ酸を決定するための配列を整列する方法を説明する。
【0089】
たとえばTGF−βである参照されるアミノ酸配列コードとたとえば少なくとも約95%「同じ」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照されるTGF−β、または上記の低分子神経伝達物質、たとえばノルエピレナミン、ドーパミン、またはアセチルコリンをコード化する参照アミノ酸配列の100アミノ酸あたり最大およそ5つの変成を含むことができるのを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同じであることを意味することが理解される。言い換えれば、参照アミノ酸配列と約95%同じアミノ酸配列を持っているペプチドを得るためには、参照配列のアミノ酸残基の約5%までを削除するか、または他のアミノ酸で置換でき、または参照配列に、総アミノ酸類の約5%までのアミノ酸を挿入できる。参照配列のこれらの修飾は参照アミノ酸配列のN末端またはC末端位置において、またはそれらの端末の位置の間のどこでも起こることができ、参照配列のアミノ酸の間に個別に存在するか、または参照配列中に1種以上の隣接するグループとして存在することができる。
【0090】
本明細書において使用される時、「同一性(identity)」の用語は、参照されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比べた、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は最も高い順番の一致が得られるように並べられる。「同一性」自体は、当該技術分野で認識された意味を持ち、公知の技術により計算できる。(参照:例えば、コンピュータによる分子生物学(Computational Molecular Biology)、Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York(1988);Biocomputing:インフォーマティクスおよびゲノムプロジェクト(Informatics And Genome Projects),Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York(1993);配列データのコンピュータ分析 パート I(Computer Analysis of Sequence Data,Part I),Griffin,A.M.,and Griffin,H.G,eds.,Humana Press,New Jersey(1994);von Heinje,G,分子生物学における配列分析(Sequence Analysis In Molecular Biology),Academic Press(1987);および 配列分析プライマー(Sequence Analysis Primer),Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York(1991))。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性を測定するいくつかの方法が存在しているが、「同一性」という用語は当業者には公知である(Carillo,H.&Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988))。2つの配列の間の同一性または類似性を決定するのに一般的に使われる方法は、これに限定されるものではないが、大規模コンピュータのガイド(Guide to Huge Computers),Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San Diego(1994)and Carillo,H.& Lipton,D.,Siam J Applied Math 48:1073(1988)に開示されている。コンピュータプログラムは同一性と類似性について計算する方法とアルゴリズムを含むことができる。2つの配列の間の同一性と類似性を決定するコンピュータプログラム方法の例は、これに限定されるものではないが、GCG program package (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(i):387 (1984)), BLASTP, ExPASy, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)) およびFASTDBがあげられる。同一性および類似性を決定する方法の例は、Michaels, G. and Garian, R., Current Protocols in Protein Science, Vol 1, John Wiley & Sons, Inc. (2000)に述べられており、これは本出願で参照される。本発明のひとつの実施態様では、2またはそれ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムはBLASTPである。
【0091】
本発明の別の実施態様では、二つ以上のポリペプチドの間の同一性を決定するために使用されるアルゴリズムは、FASTDBである。これはBrutlagらのアルゴリズムによる(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))。これは参照され、本明細書に組み込まれる。FASTDB配列アラインメントでは、対照とされる配列はアミノ配列である。得られる配列アラインメントの同一性はパーセントで示される。同一性のパーセントを計算するためにアミノ酸配列のFASTDBアラインメントに使用されるパラメータ類は、これらに限定されないが、以下の通りである。マトリックス=PAM、k−tuple=2、ミスマッチペナルティ=1、ジョイニングペナルティ=20、ランダマイゼイショングループ長さ=0、カットオフスコア=1、ギャップペナルティ=5、ギャップサイズペナルティ 0.05、ウインドーサイズ=500、または対象とされるアミノ配列の長さの、どちらか短い方。
【0092】
対象の配列がN末端またはC終点の付加または染色体欠失のために対象とされる配列よりも短いかまたは長い場合、内部の付加または染色体欠失のためであるかに関わらず、手作業で矯正をすることができる。なぜなら、パーセントの同一性について計算するとき、FASTDBプログラムが対象の配列のN末端とC末端のトランケーションまたは付加を計算しないからである。対象とされている配列に関し、5’または3’末端においてトランケーションされている配列について、同一性のパーセントは、マッチング/アラインしていない対象配列に対する、N−末端およびC末端である対象配列の塩基の数について計算することによって、対象配列の全塩基のパーセントとして修正される。FASTDB配列アラインメントの結果が、マッチング/アラインメントを決定する。アラインメントの割合は、具体的なパラメータ類を使用して上記のFASTDBプログラムで計算された同一性パーセントから引き算され、最終パーセント同一性スコアが得られる。アラインメントがどのようにお互いに「対応するか」を決定する目的に、同一性パーセントと同様に、この修正されたスコアを使用できる。手動で同一性パーセントスコアを調整する目的のために、参照または対象の配列のNまたはC末端を超えて伸びる質問(対象)の配列の残基を考慮することができる。すなわち、比較配列のNまたはC末端にマッチ/アラインされていない残基は、手動でパーセント同一性スコアまたはアラインメントナンバリングを調整するときに計算できる。
【0093】
例えば、90アミノ酸残基被検配列は、パーセントの同一性を決定するために100残基参照配列と並べられる。染色体欠失は対象の配列のN末端で起こる。したがって、FASTDB配列はN末端で最初の10残基のマッチ/アラインメントを示さない。10の不対残基が配列の10%を示す時(NとC末端における残基数が被検配列における残基の総数と合っていない時)、FASTDBプログラムで計算されたパーセント同一性スコアから10%が引かれる。残っている90の残基が完全に合わせられているなら、最終的な同一性パーセントは90%である。別の例では、90残基の対象配列は100の対象配列と比較される。このとき、染色体欠失は、対象の配列のNまたはC末端には残基が全くない、対象とマッチしないかまたはアラインされていない内部欠損である。この場合、FASTDBによって計算されたパーセントの同一性は、手動で修正されない。
【0094】
また、本発明はキメラまたは融合ポリペプチド(chimeric or fusion polypeptides)を提供する。本明細書において使用される時、「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、少なくとも第二の異なったポリペプチドに有効にリンクされた参照ポリペプチドのメンバーの一部を含む。第二のポリペプチドは、実質的に参照ポリペプチドと同じでないポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有し、該ポリペプチドは同じかまたは異なった有機体から誘導される。融合ポリペプチドに関して、「有効にリンクする」という用語は、参照ポリペプチドと第二のポリペプチドがお互いに融合し、両方の配列が使用される配列に生ずる期待される機能を実現させるようにされることを意図する。参照ポリペプチドのN末端またはC末端に第二のポリペプチドを融合できる。例えば、ある実施態様では、融合ポリペプチドは、IGF−1配列がGST配列のC末端に融合されたGST−IGF−1融合ポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドは組換ポリペプチドの精製を容易にすることができる。別の実施態様では、融合ポリペプチドはN末端におけるヘテロロガスシグナル配列を含むことができる。ある宿主細胞(例えば、哺乳動物宿主細胞)の中では、ポリペプチドの発現および/または分泌はヘテロロガスシグナル配列の使用で増加できる。
【0095】
断片および融合ポリペプチドに加えて、本発明は天然存在ポリペプチドの同族体と類似物を含んでいる。「同族体」は本明細書において類似又は同一のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を持つ2つの核酸またはポリペプチドと定義される。同族体は、以下に定義されるような、対立遺伝子多型、オーソログ、パラログ、アゴニスト、および拮抗体を含んでいる。「同族体」という用語はさらに遺伝コードの縮退のため参照ヌクレオチド配列と異なっていて、その結果参照ヌクレオチド配列によってコード化されたものと同じポリペプチドをコード化する核酸分子を包含する。本明細書において使用される時、「天然存在」は天然に発生する核酸またはアミノ酸配列を示す
【0096】
ポリペプチドのアゴニストは実質的にポリペプチドの生物活動と同じ、またはサブセットを保持できる。ポリペプチドの拮抗物質はポリペプチドから天然に発生する活性の一以上を禁止できる。
【0097】
本発明の組成物および方法においては、分化可能な細胞の中のErbB2チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を含む。本発明の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、少なくとも1つのErbB3リガンドの存在を含む。典型的には、ErbB3リガンドは、ErbB3受容体と結合して、ErbB2受容体と二量化する。ErbB2受容体は、次いで分化可能な細胞の中で細胞内のチロシンキナーゼ活性に応答性となる。
【0098】
本明細書において使用される時、「ErbB3リガンド」はErbB3に結合するリガンドであって、ついでErbB2と二量化し、その結果、ErbB2/ErbB3ヘテロ二量体受容体のErbB2部分のチロシンキナーゼ活性を活性化するものをいう。ErbB3リガンドの非限定的な例としてはニューレグリン−1;ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、ニュー分化因子(Neu Differentiation Factor:NDF)、アセチルコリン受容体由来作用(ARIA)、膠細胞増殖因子2(GGF2)、および知覚性および運動性ニューロン−由来要素(Sensory And Motor Neuron-Derived Factor:SMDF)を含むニューレグリン−1のスプライス変異体とアイソフォーム;ニューレグリン−2;NRG2−βを含むがこれに限定されないニューレグリン−2のスプライス変異体(splice variants)とアイソフォーム;エピレグリン;ビレグリン(Biregulin)があげられる。
【0099】
1つの実施態様では、ErbB2−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段は、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(Heregulin−P:HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、ニュー分化因子(NDF)、アセチルコリンの受容体由来活性体(ARIA)、膠細胞増殖因子2(GGF2)、運動ニューロン由来要素(motor-neuron derived factor:SMDF)、ニューレグリン−2、ニューレグリン−2p(NRG2−P)、エピレグリン(Epiregulin)、ビレグリン、およびそれらの変異体、機能的な断片からなる群から選択された少なくとも1つのErbB3リガンドを含む。別の具体的な実施態様では、本発明の組成物および方法は、たとえば二個以上ErbB3リガンドを使用することであるがこれらに限定されない、ErbB2−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する1より多い手段を含む。
【0100】
さらなる具体的な実施態様では、本発明の組成物と方法は、ErbB3リガンドは、HRG−P、またはそれらの変異体、機能的な断片である。1つの実施態様では、培地添加タンパク質、ポリペプチド、それらの変異体または由来体の機能的な断片は、培養される細胞種と同じである。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、培養における添加物としてハツカネズミ(mus musculs) HRG−P配列と同じアミノ酸配列を有するHRG−Pを使用でき、「同じ種」であると考えられる。他の実施態様では、生物学的添加物から誘導された種は、培養される細胞と異なっていると考えられる。例えば、マウス胚性幹細胞が培養されている場合、ヒトHRG−P配列と同じアミノ酸配列を有するHRG−Pを使用でき、「異なる種」または「ゼノグラフィック(xenographic)」であると考えられる。
【0101】
本発明の1つの実施態様では、本発明の組成物と方法は外因のインスリンとインスリン代用物を含まない。「外因のインスリンまたはインスリン代用物」を含まないという句は、インスリンまたはインスリン代用物を故意に本発明の組成物または方法に追加されないということを示すのに本明細書に使用される。本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は、したがって、故意に供給されるインスリンまたはインスリン代用物を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性インスリンを含むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性インスリン」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞が自らの作用としてインスリンを製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性インスリンが使用されることもある。具体的例では、本発明の組成物および方法は、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1マイクロg/ml以下のインスリンを含んでいる。
【0102】
本明細書において使用される時、「インスリン」という用語は、正常な生理学的濃度でインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、タンパク質、変異体またはその断片を示す。「インスリン」という用語は、すべての自然なヒトインスリン、他の哺乳動物インスリン、これらの配列の同族体やまたは変異体のポリペプチド配列を有するタンパク質を包含する。さらに、用語インスリンはインスリン受容体と結合し、インスリン受容体を通してシグナルを引き起こすことができる、ポリペプチド断片を包含する。「インスリン代用物」という用語はインスリンとして実質的に同様の結果を与えるためにインスリンに代わって使用されるすべての亜鉛含有化合物をも包含する。インスリン代用物の例としては、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛を含むが、これらに限定されない。
【0103】
はっきり言えば、インスリン様増殖因子は、本発明で企図されるインスリン代用物でなく、またインスリンの同族体でもない。従って、別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は少なくとも1つのインスリン様増殖因子(IGF)、変異体またはそれの機能的な断片の使用を含む。別の実施態様では、本発明の組成物および方法はすべての外因のインスリン様増殖因子(IGFs)も含まない。具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1ng/ml以下のIGF−1を含んでいる。
【0104】
本明細書において使用される時、「IGF−1Rのアクチベータ」という用語は調整された細胞増殖、分化、およびアポプトーシスにおいて極めて重要な役割を果たす有糸分裂促進因子をいう。IGF−1Rのアクチベータの効果は、他の受容体を通して媒介されることもできるが、IGF−1Rを通して通常媒介される。また、IGF−1Rは腫瘍ウイルス蛋白質と癌遺伝子産物によって引き起こされた細胞形質転換を含み、相互作用は特異的結合蛋白質(IGFBPs)のグループによって規制される。さらに、IGFBPプロテアーゼの大きいグループはIGFBPsを加水分解し、IGFs結合を解離し、IGF−1Rと相互作用する能力を再開する。本発明の目的のために、リガンド、受容体、結合蛋白質、およびプロテアーゼはすべてIGF−1Rのアクチベータであると考えられている。ある実施態様では、IGF−1Rのアクチベータは、IGF−1、またはIGF−2である。更なる実施態様では、IGF−1RのアクチベータはIGF−1類似物である。IGF−1類似物の非限定的な例は、LongR3−IGFl,Des(l−3)IGF−1,[Arg3]IGF−l,[Ala31]IFG−1,Des(2,3)[Ala31]IGF−1,[LeU24]IGF−l,Des(2,3)[Leu24]IGF−l,[Leu60]IGF−l,[Ala31][Leu60]IGF−l,[Leu24][Ala31]IGF−l,およびそれらの組み合わせである。更なる実施態様では、IFG−1類似物はLongR3−IGFlである。LongR3−IGFlはヒトインスリン増殖因子−1の組換え型の類似物である。LongR3−IGFlは、約1ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約5ng/mlから約500ng/ml、より望ましくは約50ng/mlから約500ng/ml、より望ましくは約100ng/mlから約300ng/mlまたは約100ng/mlである。
【0105】
ある実施態様では、本発明の組成物および方法は、形質転換増殖因子ベータ(transforming growth factor beta:TGF−β)、またはTGF−βファミリー、変異体またはそれの機能的な断片を含む。本明細書において使用される時、「TGF−βファミリーのメンバー」という用語または増殖因子に関連して使用される同様の語は、TGF−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはTGF−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはTGF−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる。本発明の具体的な実施対態様では、TGF−βファミリーのメンバーが存在する場合には、TGF−βファミリーのメンバー、変異体またはそれの機能的な断片がSMAD2または3を活性化する。ある実施態様では、TGF−βファミリーのメンバーは、ノーダル(Nodal)、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる。1つの実施態様では、TGF−βファミリーのメンバーはアクチビン A、アクチビン B、ノーダル、GDF−8、およびGDFである。
【0106】
ノーダル(Nodal)が存在している場合には、約0.1ng/mlから約2000ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約10ng/mlから約750ng/ml、より望ましくは約25ng/mlから約500ng/mlの初期濃度で存在していることが企図される。使用される場合には、アクチビン Aは約0.01ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約25ng/ml、または望ましくは約10ng/mlの初期濃度において存在していることが企図される。存在する場合には、TGF−βは約0.01ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約50ng/ml、より望ましくは約0.1ng/mlから約20ng/mlの初期濃度において存在していることが企図される。
【0107】
本発明の追加の実施態様では、本発明の組成物および方法はFGF受容体のアクチベータを含まない。本明細書において使用される時、「FGF受容体のアクチベータ」という用語は、一般に、FGF−βファミリーに関連する当業者に使用される一般的なもの、またはFGF−βファミリーのメンバーに知られた相同性により、またはFGF−βファミリーのメンバーに知られた機能の類似性により特徴付けられる増殖因子をいう。ある実施態様では、FGF受容体のアクチベータはFGFであり、たとえばαFGFおよびFGF2であるが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、組成物および方法には外因のFGF2を含まない。「外因のFGF2」を含まないとの用語は、故意に本発明の組成物または方法に線維芽細胞増殖因子2、すなわち塩基性FGFが追加されないことを示すものとして本明細書に使用される。したがって、本発明のある実施態様では、本発明の方法と組成物は故意に供給されたFGF2を含まない。しかしながら、本発明の組成物または方法が必ずしも内因性のFGF2を含むことができないというわけではない。本明細書において使用される時、「内因性のFGF2」は、本発明の方法により培養された時に、培養細胞それ自身がFGF2を製造できることを示す。細胞初代培養からの不純物、または出発物質からの残留不純物を示すものとして内因性FGF2が使用されることもある。具体例としては、本発明の組成物または方法は、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1ng/ml以下のFGF2を含んでいる。
【0108】
しかしながら、本発明の組成物および方法は、FGFポリペプチド、その機能的な断片またはその変異体を包含するFGF受容体の少なくとも1つのアクチベータを含むことができると企図される。FGF2が存在する場合には、約0.1ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.5ng/mlから約50ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約25ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約12ng/ml、また最も望ましくは約8ng/mlの初期濃度において存在することが企図される。別の具体的実施態様では、本発明の組成物および方法は、FGF2以外のFGF受容体の少なくとも1つのアクチベータを含むことができる。例えば、本発明の組成物および方法は、FGF−7、FGF10、FGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも1つを含むことができる。具体的実施態様では、FGF−7、FGF−10とFGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の少なくとも2つが存在している。別の実施態様では、FGF−7、FGF−10、FGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片の3つのすべてが存在している。FGF−7、FGF−10、FGF−22、それらの変異体またはそれらの機能的な断片のいずれかが存在する場合には、それぞれが約0.1ng/mlから約100ng/ml、より望ましくは約0.5ng/mlから約50ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約25ng/ml、より望ましくは約1ng/mlから約12ng/ml、また最も望ましくは約8ng/mlの初期濃度において存在することが企図される。
【0109】
さらなる実施態様では、本発明の組成物および方法は、血清アルブミン(SA)を含む。具体的実施態様では、SAはウシのSA(BSA)または好ましくはヒトのSA(HAS)のどちらかである。具体的実施態様では、SAの濃度は容積(v/v)で約0.2%以上であるが、約10%v/v以下である。さらなる具体的な実施態様では、SAの濃度は、約0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、 0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%、3.2%、3.4%、3.6%、3.8%、4.0%、4.2%、4.4%、4.6%、4.8%、5.0%、5.2%、5.4%、5.6%、5.8%、6.0%、6.2%、6.4%、6.6%、6.8%、7.0%、7.2%、7.4%、7.6%、7.8%、8.0%、8.2%、8.4%、8.6%、8.8%、9.0%、9.2%、9.4%、9.6% および 9.8%(v/v)よりも高い。
【0110】
従って本発明の細胞培養環境および方法は接着培養に細胞をプレーティングすることを含む。本明細書において使用される時、「プレートされる」、および「プレーティング」という用語は、細胞が接着培養中で成長することを許容する任意のプロセスをいう。本明細書において使用される時、「接着培養」という用語は、細胞が固体表面で培養される培養システムであって、該固体表面は不溶性基体でコーティングされ、ついで以下に例示されるような基体の他の表面被覆でコーティングされるか、または細胞が増殖するか安定することを許容する任意の他の化学物質または生物物質などでコーティングされるものをいう。細胞はしっかりと固体表面、または基体に接着することができるし、またそうでないこともできる。接着培養のための基体は、ポリオルニチン(polyornithine)、ラミニン、ポリリシン、精製コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、エンタクチン、ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン、多糖分解酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、およびポリ乳酸グリコール酸(PLGA)の一つ又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。さらに、接着培養のための基体はフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを含むことができる。本明細書において使用される時、「細胞外マトリックス」という用語は、上で説明した固体基体(ただしこれらに限定されない)を包含し、並びにフィーダー層または多分化能ヒト細胞または細胞培養物を含むマトリックスを包含する。1つの実施態様では、細胞はMATRIGEL(登録商標)でコーティングされたプレート上にプレーティングされる。別の実施態様では、細胞はフィブロネクチンコーティングされたプレート上にプレーティングされる。ある実施態様では、細胞がフィブロネクチン上にプレーティングされる場合、プレートは10マイクロg/mlのヒト血漿フィブロネクチン(インビトロゲン、#33016−015)のコーティングで調製され、組織グレード水で希釈され、室温で2〜3時間保持される。別の実施態様では、細胞がプラスチック上にプレーティングされるのを許容するため、24時間までの間、血清を媒体中に置くことができる。細胞の接着を促進するために血清を使用する場合には、次に、培地が移されて、事実上血清を含まない組成物をプレーティングされた細胞に加える。
【0111】
本発明の組成物および方法は、分化可能な細胞が本質的にはフィーダー細胞またはフィーダー層を含まない条件下で培養されることを企図する。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞(feeder cell)」は生体外で成長する細胞である。すなわち、標的細胞と共同培養される。存在する場合には、フィーダー細胞は標的細胞の本質的な細胞密度の要求を満たし、標的細胞についての基体または細胞−細胞相互作用を提供し、細胞培地をコンディショニングし、および/または分化の段階で標的細胞を安定化させる。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞」という用語と「フィーダ細胞層」とは互換性を持って使用できる。本明細書において使用される時、「フィーダー細胞を本質的に含まない」との用語は、フィーダー細胞を含まないか、または「デ ミニマス(de minimus)」の数のフィーダー細胞を含む組織培養条件を示す。「デ ミニマス」の用語は、分化された細胞がフィーダー細胞上で培養されていた先の培養条件から現在の培養条件へ持ち越された、フィーダー細胞の数を意味する。上記の方法の1つの実施態様では、分化の現状における標的細胞を安定させるフィーダー細胞から、コンディショニングされた培地を得る。別の実施態様では、定義された培地はコンディショニングされていない培地であり、これはフィーダー細胞から得られない培地である。
【0112】
本明細書において使用される時、細胞または細胞培養物の細胞の分化状態に関連して使用される時に「安定」という用語は、細胞が複数の代にわたり培地中で増殖を続け、好ましくは無期限に培地中で増殖を続け、全部ではなくてもほとんどの培地中の細胞が同じ分化状態にあることを意味する。さらに安定した細胞が分裂するとき、分裂は同じ細胞タイプの細胞または同じ分化状態の細胞を通常もたらす。一般に、安定した細胞または細胞集団は、培養条件が変更されない場合には、さらなる分化又は再分化せず、細胞は継代され続け、過成長しない。1つの実施態様では、安定している細胞は、無期限に、または少なくとも2代以上にわたり、安定状態で増殖ができる。より具体的な実施態様では、細胞は3代以上、4代以上、5代以上、6代以上、7代以上、8代以上、9代以上、10代以上、15代以上、20代以上、25代以上、30代以上にわたり、細胞は安定している。1つの実施態様では、細胞は約1カ月以上、2カ月以上、3カ月以上、4カ月以上、5カ月以上、6カ月以上、7カ月以上、8カ月以上、9カ月以上、10カ月、または11カ月の連続した継代において安定である。別の実施態様では、約1年間以上の連続した継代において、細胞は安定している。1つの実施態様では、それらが分化されるのが望ましくなるまで、幹細胞は多分化能状態で定義された培地において通常の継代で維持される。本明細書において使用される時、「増殖」という用語は細胞培養における細胞の数の増大について言う。
【0113】
ある実施態様では、本発明の組成物と方法はBMPシグナリングのイナクチベータを含む。本明細書において使用される時、「BMPシグナリングのイナクチベータ」とは、1種以上のBMPタンパク質の活性、またはそれらの上流または下流シグナルコンポーネンツのいずれかを、可能なシグナリング経路のいずれかを介して拮抗する薬剤をいう。BMPシグナリングのイナクチベートに使用される1つまたは複数の化合物は、当技術分野で知られているもの、または今後発見される任意の化合物であることができる。BMPシグナリングのイナクチベータの非限定的な例としては、ドミナント−陰性 トランケイティド (dominant-negative, truncated)BMP受容体、可溶性のBMP受容体、BMP受容体−Fcキメラ、ノギン(noggin)、ホリスタチン(follistatin)、神経由来因子(chordin)、グレムリン(gremlin)、セルベラス/DANファミリー蛋白質(cerberus/DAN family proteins)、ベントロピン(ventropin)、高ドーズアクチビン(high dose activin)、およびアムニオンレス(amnionless)があげられる。
【0114】
ある実施態様では、本発明の組成物と方法は少なくとも1つのホルモン、シトキン、アディポカイン、成長ホルモン、それらの変異体またはそれらの機能的な断片を含むことができる。ある実施態様では、定義された培地に存在している成長ホルモンは、定義された培地で培養される分化可能な細胞と同じ種のものであると想定される。したがって、例えば、人間細胞が培養されているなら、成長ホルモンは人成長ホルモンである。また、培養細胞と異なった種から来ている成長ホルモンの使用も企図される。望ましくは、ホルモン、シトキン、アディポカイン、および/または成長ホルモンは、約0.001ng/mlから約1000ng/ml、より望ましくは約0.001ng/mlから約250ng/ml、または、より望ましくは約0.01ng/mlから約150ng/mlの初期濃度で存在する。
【0115】
本発明の組成物と方法に含むことができるシトキンとアディポカインの例としては、シトキン類の4αヘリックスバンドルファミリー、シトキン類のインターロイキン−1(IL−I)ファミリー、シトキン類のIL−17ファミリー、およびシトキン類のケモカインファミリーを含むが、これらに限定されない。もちろん、本発明はシトキン類のこれらのファミリーのそれぞれのメンバーとサブクラスを企図し、たとえば、CCケモカイン類、CXCケモカイン類、Cケモカイン類およびCX3Cケモカイン類、インターフェロン類、インターロイキン類、リンホトキシン類、c‐kitリガンド、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor:GM-CSF)、単球−マクロファージコロニー刺激因子(monocyte-macrophage colony-stimulating factor;M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、プラスミノゲンアクチベータインヒビター−1(PAI−1)、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)、腫瘍壊死因子ベータ(TNFβ)、白血病阻止因子、ビスファチン、レチノール結合蛋白4(RBP4)、エリスロポイエチン(EPO)、スロンボポエチン(THPO)があげられるが、これらに限定されるものではない。もちろん、当業者は本発明が上に記載された要素の変異体または機能的な断片を企図していることを理解するだろう。
【0116】
本発明は分化可能な細胞を培養する方法に関し、この方法は、細胞培養表面に分化可能な細胞をプレーティングすることを含み、基本栄養塩溶液を細胞に提供して、細胞にErbB2−由来チロシンキナーゼ活性を刺激する手段を提供することを含む。
【0117】
1つの実施態様では、血清または血清代替物の非存在下、およびフィーダー細胞層の非存在下で、少なくとも1つの本発明の組成物と分化可能な細胞が接触し、細胞が少なくとも1カ月、未分化状態で維持されるようにされる。多分化能は表面マーカ−、転写性マーカー、核型、3つの胚葉層の細胞に分化する能力に関する細胞のキャラクタリゼーションを介して決定できる。当業者にとって、これらのキャラクタリゼーションは周知である。
【0118】
「懸濁」との用語が細胞培養の文脈で使用される場合、当技術分野で用いられる意味で使用される。すなわち、細胞培養懸濁液は、細胞または細胞集合体が表面に接着しない細胞培養環境である。当業者は懸濁培養技術に詳しく、たとえば、これらに限定されるものではないが、フローフード類(flow hoods)、インキュベータ、および/または、細胞を一定の動きに維持するために使用される装置、例えば、撹拌機プラットホーム、シェーカーなどを必要に応じて備えることができる。本明細書において使用される時、細胞が動いている場合、またはそれらの間の環境が細胞に対して動いている場合には、細胞には「動き」がある。細胞が「動き」の状態に維持されると、1つの実施態様では、動きは細胞をせん断力に暴露することを避けるか、または防ぐように設計されている「優しい動き」または「優しい撹はん」となるだろう。
【0119】
細胞集合体を作るさまざまな方法が当該技術分野において公知であり、例えば「ハンギングドロップ(hanging drop)」法が知られ、この方法では組織培養液の逆さの滴の中で細胞が滴の底部に沈み、集まり、実験フラスコ中で細胞懸濁液を震動させる。これらのテクニックの種々の変法も使用できる。例えば、N.E.Timminsら,(2004)Angiogenesis 7,97-103;W.Daiら,(1996)Biotechnology and Bioengineering 50,349-356;R.A.Fotyら,(1996)Development 122,1611−1620;G.Forgacsら,(2001)J.Biophys.74,2227-2234(1998);K.S.Fumkawaら,Cell Transplantation 10,441-445;R.Glicklisら,(2004)Biotechnology and Bioengineering 86,672-680;Carpenedoら,(2007)Stem Cells 25,2224-2234;およびT.Korffら,(2001)FASEB J.15,447-457を参照。これらの全体は本明細書に参照され組み込まれる。より最近では、細胞集合体はマイクロパターン化されたコロニーを懸濁液内にこすり落とし、マイクロタイタープレートのコロニーを遠心分離で取り出し懸濁液にするか、またはピペットを使用してパターンドマイクロウェルで成長されたコロニーを取り出し懸濁させる(Ungrin他、(2008)PLoS ONE 3(2)、1-12;Bauwens他、(2008)、Stem Cells Published online June 26,2008)。本明細書に記載された細胞集合体を製造するのにそのような方法を使用できるが、本明細書に製造された細胞集合体は、同期した有向分化(synchronous directed-differentiation)のために上記のd’Amour他2006に記載されているようにして、最適化される。これらの他の方法と異なって、本明細書に記載された懸濁液中における細胞集合体を製造するための方法は大規模製造に影響を受けやすい。
【0120】
一般に、本発明の細胞培地組成は、少なくとも1日に1度リフレッシュされるが、よりしばしばまたは、より少なく懸濁培養物の具体的必要性と事情によって媒体を変えることができる。生体外で、細胞は、通常バッチ・モードにより培養液で育てられて、様々な培地条件に暴露される。本明細書に記載されたように、細胞は接着培養として、または懸濁中における細胞集合体として皿培地中に存在して、取り囲む培地に接触し;および定期的に廃棄物培地が取り替えられる。一般に、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、または24時間毎、またはそれの任意の時間で培養液をリフレッシュできる。追加例では、1.1日、1.2日、1.3日、1.4日、1.5日、1.6日、1.7日、1.8日、1.9日または2日またはそれ以上ごとに、またはそれらの間の任意の期間で培地はリフレッシュされることができるが、これらに限定されるものではない。
【0121】
しかし、本発明の別の実施態様では、増殖因子および頻繁に取り替えられなければならない他の薬剤の分解を防止するために環流方法(perfusion method)が採用され、または一定期間の間に培地からの廃棄物を減耗する手段として環流方法が採用された。例えば、米国特許第5,320,963号は、懸濁細胞の潅流培養のためのバイオリアクタについて説明する。米国特許第5,605,822号は、環流による培養でのHSC細胞の成長のために、増殖因子を提供するのにストロマ細胞を使うバイオリアクタシステムについて説明する。米国特許第5,646,043号は、HSC細胞の成長のための培地組成物を含む連続した周期的環流でのHSC細胞の成長について説明する。米国特許第5,155,035号は、流体培地回転による細胞の懸濁培養のためのバイオリアクタについて説明する。これらは参照され本明細書にそれらの全体が取り入れられる。
【0122】
一般に、本発明の培地組成物中で懸濁培養される細胞は、ほぼ毎週、「スプリット(split)」または「継代(passage)」されるが、細胞は具体的な必要性および懸濁培養の環境に応じて、より頻繁にまたはより少ない頻度で継代されることができる。例えば、細胞は1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日間、またはそれらの間の任意のタイムフレームで継代されることができる。本明細書において使用される時、それが細胞培養の文脈で使用される場合、「スプリット」または「継代」という用語は、当該技術分野における使用されている意味で使用される。すなわち、細胞培養スプリットまたは継代は、前の培養からの細胞の収集と、新しい細胞培養容器への、より少ない数の収集された(収穫された)細胞の移転である。一般に、継代細胞は、健康な細胞培養環境で成長し続けることができる。当業者は細胞培養継代のプロセスおよび方法になじみ深く、これは必ずではないがそれらの成長エキスパンションの間に一緒に集合している細胞を分けるために使用できる酵素的または非酵素的方法の使用を含む。
【0123】
ある場合に、ある程度の細胞死が、継代直後の(懸濁または接着培養の)細胞で起こることがある。1つの実施態様では、分化可能な細胞は、24時間以上細胞媒体のリフレッシュを遅らせることによって継代から「回復できる」。その後、より頻繁に細胞媒体を変えることができる。別の実施態様では、細胞培地は、さらに細胞死の防止剤を含むことができる。例えば最近Wantanabe他は、解離の後にヒト胚性幹細胞を保護するためにRho−関連キナーゼ阻害薬(Rho-associated kinase inhibitor)、Y27632の使用を開示する。Wantanabe,K.,ら,Nat.Biotechnol,25(6):681-686(2007)を参照されたい。これは参照され、本明細書に援用される。追加の実施態様では、細胞培地は、継代直後の細胞死を防ぐか、または減衰させるようにカスパーゼ阻害剤、増殖因子または他の栄養素を含むことができる。使用できる物の具体的例としては、HA1077、ジヒドロクロライド(Dihydrochloride)、ヒドロキシファスジル(Hydroxyfasudil)、Rho キナーゼ 阻害剤、Rho−キナーゼ 阻害剤 II、Rho キナーゼ 阻害剤 III、キナーゼ 阻害剤 IV、およびY27632があげられるが、これらに限定されるわけではない。なお、上記の物質はすべて商業的に利用可能である。さらに別の実施態様では、細胞継代直後またはその間の細胞死を防ぐかまたは減衰させるために使用される物質または要素は、細胞が継代のプロセスから回復した後に、細胞培地から取り除くことができる。追加の実施態様では、未分化型胚性幹細胞は、標準のベース培地中で有効に集合することができ、解離と集合の間、生育性を維持するためにY27632または他の関与を必要としない。
【0124】
また、追加の実施態様では、本発明の組成物および方法は界面活性化合物の存在または使用を含むことができる。1つの特定の実施例では、本発明の組成物と方法は懸濁培養において少なくとも1つの表面活性剤を含む。界面活性化合物は、当技術分野で周知であり、一般的には両親媒性である。具体的実施態様では、本発明はアニオン系、カチオン性、ノニオン性または双性である少なくとも1つの表面活性剤の使用を含む。本発明の組成物および方法に使用される表面活性剤の濃度の決定は、ルーチン的な検査と最適化の問題である。たとえばオーエン他は、ヒーラ細胞とヒト羊膜細胞の細胞培養法における界面活性化合物の使用を報告する。Owenら,J.Cell.Sc,32:363-376(1978)を参照。これは参照して本明細書に組み込まれる。使用できる界面活性化合物の例としては、これらに限定されるわけではないが、以下の物質があげられる;ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、アンモニウムラウリル硫酸、および他のアルキル硫酸塩;ナトリウムラウレススルフェート(SLES)、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、石鹸、または脂肪酸塩、セチルトリメチルアンモニウム臭素(CTAB)(ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム)、および他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム(CPC)、ポリエトキシル化獣脂アミン(POEA)、ベンズアルコニウム塩化物(BAC)、ベンズエトニウム塩化物(BZT)、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、コカミドプロピルベタイン、ヤシアンフォグリシナート、アルキルポリ(エチレンオキシド)、ポリエチレンオキシドとポリプロピレン・オキシドコポリマー、たとえばプルロニック(Pluronic)F68、アルキルポリグリコシド、たとえば、オクチルグルコシド、デシルマルトシド、脂肪アルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、コカミド MEA、コカミドDEAおよびコカミドTEA、および/または、ポリオキシエチレン−ソルビタン モノラウレート(トゥイーン)があげられるが、これらに制限されるものではない。
【0125】
本明細書に記載された実施態様は、低せん断環境を維持することにより、システムの細胞濃度を維持して、流体せん断応力を最小にし、hES細胞を増殖させ、および/または分化させる大規模製造のための方法を提供する。特に、本発明は60mmの皿、6ウェルのプレート、回転するボトル、バイオリアクタ(例えば、スピナーフラスコ)、容器、およびクローズドループシステムなどで細胞懸濁液を培養することによる、真核細胞製造スケールアップシステムにおける低せん断環境を維持するための方法を提供する。あるいはまた、細胞を培養する連続かん流システムは、細胞の懸濁、酸化、および新鮮な栄養物の提供のため、すなわち成長および/または分化のために、バイオリアクタまたは容器内における撹拌または動きを必要とする。細胞懸濁液を得るために、バイオリアクタ容器は典型的にはせん断応力の可能なソースである1種以上の可動な機械的撹はん装置を使用する。
【0126】
分化可能な細胞は、酵素学的または非酵素学的方法を使用して、または、本発明の定義された培地との接触の前および接触の後の手動の解離方法により、継代することができる。当技術分野において手動の継代技術についてはよく説明されており、たとえばSchulzら,2004 Stem Cells,22(7):1218−38に記載されている。機械的な継代は追加の物質を含まないが、多能性細胞またはそれらの誘導体を大規模で生産するためには効率的でない。たとえばバイオリアクターまたは大きなフラスコ中での、たとえばGMP−コラゲナーゼのような酵素の使用が企図される。酵素的な解離方法の非限定的な例としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、ACCUTASE(登録商標)などのプロテーアーゼの使用を含む。1つの実施態様では、ACCUTASE(登録商標)は接触された細胞の継代に使用される。酵素的継代方法が使用されるとき、得られた培養物は、シングレット(singlet)、ダブレット(doublet)、トリプレット(triplet)および細胞のクランプ(clumps)を含むことができ、これらは使用された酵素の種類に応じてサイズが異なる。非酵素学的解離方法の非限定的な例は細胞分散バッファ(cell dispersal buffer)である。存在する場合には、細胞外マトリックスの選択により継代方法の選択は影響を及ぼされるが、当業者によって容易に決定されることができる。
【0127】
本発明の方法で使用される離解溶液(disaggregation solution)は、大規模な急性毒性を細胞に引き起こさずに、単独細胞に細胞をばらばらにするか、または離解することができる離解溶液であることができる。離解溶液の例は、トリプシン、ACCUTASE(登録商標)、0.25%のトリプシン/EDTA、TrypLE、またはVERSENE(登録商標)(EDTA)とトリプシンを含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、少なくともいくつかの単独細胞が離解され再培養できることを条件として、集密層または懸濁液中のあらゆる細胞が単独細胞に離解されることを必要とするわけではない。
【0128】
培養の始め、または継代の後に、どんな密度でも分化可能な細胞をシードでき、培養チャンバーにひとつの細胞でもよい。さまざまな要素によって、シードされる細胞の細胞濃度を調整できる。たとえば接着培養、懸濁培養の使用、使用される培養細胞培養液の具体的処方、生育条件、および培養される細胞の企図された使用を含む。細胞培養密度の例としては以下があげられる;0.01×105細胞/ml,0.05×105細胞/ml,0.1×105細胞/ml,0.5×105細胞/ml,1.0×105細胞/ml,1.2×105細胞/ml,1.4×105細胞/ml,1.6×105細胞/ml,1.8×105細胞/ml,2.0×105細胞/ml,3.0×105細胞/ml,4.0×105細胞/ml,5.0×105細胞/ml,6.0×105細胞/ml,7.0×105細胞/ml,8.0×105細胞/ml,9.0×105細胞/ml,または10.0×105細胞/ml、またはそれ以上、たとえば5×107細胞/mlまでが、良好な細胞の生存を示して培養される。これらの値の間の任意の値も採用できる。
【0129】
上記に加えて、本明細書に使用される時には、「細胞濃度操作」という用語、「操作された細胞濃度」またはそれの等価な表現は、製造プロセスまたはシステムでの細胞密度が操作され、増殖性または分化性のhES細胞培養物を生産することをいう。そのような細胞濃度は、システムに供給されるビタミン、ミネラル、アミノ酸、代謝物などの栄養物、または酸素分圧などの環境条件が、細胞生育力を維持するために十分である下でのものをいう。あるいはまた、そのような細胞濃度は、細胞生育力を維持できるような速度でシステムから廃棄物を取り除くことができる下でのものをいう。当業者は容易にそのような細胞濃度を決定できる。
【0130】
維持できる作動細胞濃度は、少なくとも約0.5×106細胞/mlからである。典型的なスケールアップシステム作動式細胞濃度は、約0.5×106細胞/mlから約25×106細胞/mlの間である。例示的な濃度は、約2.5×106細胞/ml、22×106細胞/mlから、最大5×107細胞/mlの間である。本発明の方法では、細胞生存率は少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、および約100%までである。他のスケールアップシステム作動細胞濃度と許容細胞生存率レベルは、当業者によって認められ、当業者にとって周知のテクニックにより決定できる。例えば、バッチ、フェドバッチ(fed-batch)および連続供給される構成では、約0.5×106細胞/mlから15×106細胞/mlの間の細胞濃度であってもよい。
【0131】
ACEA Biosciences,Inc.(www.aceabio.com)からのRT−CES(登録商標)法を使用することで、細胞増殖と生育性を測定することができる、インピーダンスのリアルタイム測定値を提供する96ウェルの培養装置でhESCsを育てることができた。そのようなアプローチは分化可能な細胞における微妙であるか即座の効果のラベルを使用しない識別と定量化を可能にするだろう。また、増殖、アポプトーシスおよびモルホロジー変化のリアルタイム測定も可能にするだろう。
【0132】
さらに、冷凍、冷所保存、および解凍プロセスは、GMP規格により最適に行われる。冷凍保存法および従来のゆっくりとした冷却/急速な暖めの両方が、多能性細胞、少なくともhES細胞の冷所保存に使われた。Hunt C.J., et al., Methods Mol.Biol.(2007)368:261-270。Richards et al.(2004)他は、冷凍防止剤中の主な蛋白源として、胎児ウシ血清ではなくヒト血清アルブミンを使用し、閉鎖密閉ストロー内に冷所保存することを含む、hES細胞のための異物の無い凍結保存実験計画について説明した。Richards M., et al., Stem Cells (2004) 22:779−789を参照。Fujioka et al.(2004)は、ストローの代わりに、冷凍管を使用した冷所保存方法により、霊長類胚性幹細胞を低温保存した。猿胚性幹細胞についての生存率は6.5%、人間の胚性幹細胞についての生存率は12.2%であった。Fujioka T., et al., Int.J.Dev.Biol.(2004)48:1149−1154を参照。従って、本発明の1つの実施態様は、多能性細胞の適切な冷凍、および冷所保存または冷所貯蔵に関する。
【0133】
マルチポーネント細胞または分化細胞の生産のモニター
多能性細胞のマルチポーネント細胞、さらなるマルチポーネント細胞または分化細胞への進行は、ある種の遺伝子マーカーの発現を測定し、定量化することによってモニターすることができる。たとえば、TGF−βシグナル伝達物質のような外因性の要因の添加の前後の異なる時間ポイントで特定の遺伝子マーカーの存在または非存在を検出することができる。あるいはまた、ある種のマーカーの発現は、細胞培養または細胞集団の細胞内のマーカーの存在量を測定することによって、決定できる。例えば、あるプロセスで、多分化能細胞に対するマーカーの発現、およびマルチポーネント細胞または分化細胞に対するマーカーの顕著な発現の不足が決定される。
【0134】
最終的な内胚葉リネッジのタイプの、より低い分化細胞タイプの生産をモニターすることに関する説明として、マーカー発現を測定するのに、プロット移動法や免疫細胞学的方法(ICC)または免疫組織学的方法(IHC)のような、定性的または準定量的技術が使用できる。あるいはまた、Q−PCRなどのテクニックの使用で正確にマーカー発現を定量化することができる。さらに、あるポリペプチド濃度では、膵性の小島ホルモン発現細胞のマーカーの多くが分泌蛋白質である。細胞外マーカーの内容の測定のために、ELISAなどのテクニックを利用できる。
【0135】
本明細書に記載された多能性細胞の発現の進行(例えば上掲のD’Amour他2006で記載されているような、ステージまたは工程1−5の結果として生産された細胞)は、発生経路に沿ってそれぞれの多分化能由来細胞タイプに対するマーカーの発現を決定することによってモニターできる。例えば、いくつかのプロセスでは、多分化能由来の細胞タイプの識別とキャラクタリゼーションは、ある種のマーカーの発現または異なる発現水準、および1以上のマーカーのパターンにより行われる。すなわち、存在または非存在、発現の高低、1種以上のマーカーが、細胞タイプを代表して、同定する。また、ある種のマーカーは一過性発現を持つことができる。それによりマーカーは、1つの発展段階の間非常に発現され、別の発展段階では不十分に発現される。ある特定のマーカーの発現は、標準化されたかまたは正常にされた制御マーカーと比べて、細胞培養または細胞集団中の、細胞内のマーカーの存在量を測定することによって、決定できる。そのようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的であるか、または定量的であることができる。マーカー遺伝子によって生産されるマーカーの発現を定量化する1つの方法が定量的PCR(Q−PCR)の使用である。Q−PCRを実行する方法は当技術分野で周知である。
【0136】
さらに、他の実施態様では、Q−PCRは正確に細胞タイプをキャラクタリゼーションし、同定し、対象細胞タイプ中のそのようなマーカーの量と相対的比率の両方を決定するために、免疫組織化学的方法またはフローサイトメトリー法とともに使用される。1つの実施態様では、Q−PCRは細胞の混合種個体群を含む細胞培養物における、RNA発現のレベルを定量化できる。しかしながら、対象のマーカーまたはタンパク質が同じ細胞中で共に発現されるか否かどうかは、Q−PCRは、提供できないし、定量化することができない。別の実施態様では、細胞タイプをキャラクタリゼーションし、同定するために、流動細胞計測法方法とともにQ−PCRが使用される。したがって、本明細書に記載した方法の組み合わせを使用して、内胚葉リネッジタイプ細胞を含む様々な細胞タイプの完全なキャラクタリゼーションと同定を実行して、示すことができる。
【0137】
それでも、また、当技術分野で知られている他の方法もマーカー遺伝子発現を定量化するために使用できる。例えば、対象となるマーカー遺伝子生成物に対して特異的な抗体を使用することによって、マーカー遺伝子産物の発現を検出できる(例えば、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー分析、および同様のもの)。あるプロセスでは、多分化能誘導細胞のマーカー遺伝子特性の発現、および多分化能誘導細胞のマーカー遺伝子の欠如を検出できる。多分化能由来細胞タイプのキャラクタリゼーションおよび同定のための更なる方法は、上で示した関連出願に記載されている。本明細書に、関連出願の全体を参考として援用する。増幅分析における使用に適した増幅プローブ/プライマーの組み合わせは以下を含む:インシュリン(INS)(GenBank NM_000207):プライマーAAGAGGCCATCAAGCAGATCA(SEQ ID NO:1);
CAGGAGGCGCATCCACA(SEQ ID NO:2);Nkx6.1(NM_006168):
プライマーCTGGCCTGTACCCCTCATCA(SEQ ID NO:3);
CTTCCCGTCTTTGTCCAACAA(SEQ ID NO:4);Pdx1(NM_000209):
プライマーAAGTCTACCAAAGCTCACGCG(SEQ ID NO:5);
GTAGGCGCCGCCTGC(SEQ ID NO:6);Ngn3(NM_020999):
プライマーGCTCATCGCTCTCTATTCTTTTGC(SEQ ID NO:7);
GGTTGAGGCGTCATCCTTTCT(SEQ ID NO:8);
FOXA2(HNF3B)(NM_021784):
プライマーGGGAGCGGTGAAGATGGA(SEQ ID NO:9);
TCATGTTGCTCACGGAGGAGTA(SEQ ID NO:10);
グルカゴン(GCG)(NM_002054):
プライマーAAGCATTTACTTTGTGGCTGGATT(SEQ ID NO:[[16]]11);
TGATCTGGATTTCTCCTCTGTGTCT(SEQ ID NO:12);
HNF6(NM_030712):
プライマーCGCTCCGCTTAGCAGCAT(SEQ ID NO:13);
GTGTTGCCTCTATCCTTCCCAT(SEQ ID NO:14);
HNF4アルファ(NM_000457):
プライマーGAAGAAGGAAGCCGTCCAGA(SEQ ID NO:15);
GACCTTCGAGTGCTGATCCG(SEQ ID NO:16);
Sox17(NM_022454):プライマーGGCGCAGCAGAATCCAGA(SEQ ID NO:17);HLxB9(NM_005515):
プライマーCACCGCGGGCATGATC(SEQ ID NO:19);
ACTTCCCCAGGAGGTTCGA(SEQ ID NO:20);Nkx2.2(NM_002509):
プライマーGGCCTTCAGTACTCCCTGCA(SEQ ID NO:21);
GGGACTTGGAGCTTGAGTCCT(SEQ ID NO:22);PTF1a(NM_178161):
プライマーGAAGGTCATCATCTGCCATCG(SEQ ID NO:23)
GGCCATAATCAGGGTCGCT(SEQ ID NO:24);SST(NM_001048):
プライマーCCCCAGACTCCGTCAGTTTC(SEQ ID NO:25);
TCCGTCTGGTTGGGTTCAG(SEQ ID NO:26);
PAX6(NM_000280):
プライマーCCAGAAAGGATGCCTCATAAAGG(SEQ ID NO:27);
TCTGCGCGCCCCTAGTTA(SEQ ID NO:28);
Oct4プライマー:TGGGCTCGAGAAGGATGTG(SEQ ID NO:29)
GCATAGTCGCTGCTTGATCG(SEQ ID NO:30);
MIXL1プライマーCCGAGTCCAGGATCCAGGTA(SEQ ID NO:31)
CTCTGACGCCGAGACTTGG(SEQ ID NO:32);
GATA4プライマーCCTCTTGCAATGCGGAAAG(SEQ ID NO:33)
CGGGAGGAAGGCTCTCACT(SEQ ID NO:34);
GSCプライマーGAGGAGAAAGTGGAGGTCTGGTT(SEQ ID NO:35)
CTCTGATGAGGACCGCTTCTG(SEQ ID NO:36);
CERプライマーACAGTGCCCTTCAGCCAGACT(SEQ ID NO:37)
ACAACTACTTTTTCACAGCCTTCGT(SEQ ID NO:38);
AFPプライマーGAGAAACCCACTGGAGATGAACA(SEQ ID NO:39)
CTCATGGCAAAGTTCTTCCAGAA(SEQ ID NO:40);
SOX1プライマーATGCACCGCTACGACATGG(SEQ ID NO:41)
CTCATGTAGCCCTGCGAGTTG(SEQ ID NO:42);
ZIC1プライマーCTGGCTGTGGCAAGGTCTTC(SEQ ID NO:43)
CAGCCCTCAAACTCGCACTT(SEQ ID NO:44);
NFMプライマーATCGAGGAGCGCCACAAC(SEQ ID NO:45)
TGCTGGATGGTGTCCTGGT(SEQ ID NO:46)。
FGF17(Hs00182599_m1)、VWF(Hs00169795_m1)、CMKOR1(Hs00604567_m1)、CRIP1(Hs00832816_g1)、FOXQ1(Hs00536425_s1)、CALCR(Hs00156229_m1)およびCHGA(Hs00154441_m1)を含む他のプライマーは、ABI Taqmanから利用可能である。
【0138】
多分化能懸濁集合培養を使うスクリーニング法
いくつかの実施態様では、スクリーニング法は、多能性、マルチポーネント細胞および/または分化細胞を含むある細胞集団を得るのに使われる。ついで候補分化因子(candidate differentiation factor)を細胞集団に提供する。候補分化因子を提供する前またはほとんど同時である最初の時間ポイントでは、マーカーの発現が決定される。あるいはまた、候補分化因子を提供した後に、マーカーの発現を決定できる。最初の時間ポイントに引き続く、候補分化因子を細胞集団に提供する工程に引き続く第2の時間ポイントで、同じマーカーの発現が再び決定される。候補分化因子が膵性前駆細胞の分化を促進できるかどうかが、第2の時間ポイントでのマーカーの発現を最初の時間ポイントでのマーカーの発現と比較することによって、決定される。最初の時間ポイントでのマーカーの発現と比べて、第2の時間ポイントでのマーカーの発現が増加するか、または減少しているなら、候補分化因子は膵性先祖細胞の分化を促進できる。
【0139】
本明細書に記載されたスクリーニング法の実施態様では、細胞集団は接触または別の方法で候補(テスト)分化因子が提供される。候補分化因子は上記の細胞のどれかの分化を促進する可能性を持つことができるどんな分子も含むことができる。別の実施態様では、候補分化因子は細胞分化を促進することが知られていない分子を含む。好適な実施例では、候補分化因子は人間の膵性先祖細胞の分化を促進することが知られていない分子を含む。
【0140】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子は低分子を含む。「低分子」の用語は、当該技術分野において使用されている低分子量有機化合物の意味で使用され、ポリマーではないものとして定義される。低分子は天然に存在するもの(内因性神経伝達物質など)、または当技術分野で知られていた合成有機化学方法で調製されたものであることができる。ある実施態様では、低分子は約800ダルトン以下の分子質量を有する分子である。
【0141】
本明細書に記載された他の実施態様では、候補分化因子は大きな分子、例えばポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意のポリペプチドであることができ、たとえば、糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外マトリックス蛋白質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキンまたは成長因子であることができるが、これらに限定されるものではない。好ましいポリペプチドは成長因子を含んでいる。
【0142】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子は以下から成る群から選択された1種以上の成長因子を含む:アンフィレグリン、Bリンパ球刺激物質、IL−16、チモポエチン(Thymopoietin)、TRAIL/Apo−2、プレB細胞集落増強因子、内皮分化関連因子1(EDF1)、内皮単核細胞活性化ポリペプチドII、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、ナチュラルキラー細胞増強因子(NKEFA)、骨形成蛋白質2、骨形成蛋白質8(骨形成性タンパク質2)、骨形成タンパク質6、骨形成タンパク質7、結合組織生長因子(CTGF)、CGI−149タンパク質(神経内分泌分化因子)、サイトカイン A3(マクロファージ炎症蛋白1−α)、膠芽腫(Gliablastoma)細胞の分化関連タンパク質(GBDR1)、肝細胞癌(Hepatoma)由来の成長因子、肝細胞癌 U−25先駆体、導管内皮成長因子(VEGF)、導管内皮成長因子 B(VEGF−B)、T細胞特異性RANTES先駆体、胸腺樹状細胞−誘導因子1、トランスフェリン(Transferrin)、インターロイキン−1(IL1)、インターロイキン−2(IL2)、インターロイキン−3(IL3)、インターロイキン−4(IL4)、インターロイキン−5(IL5)、インターロイキン−6(IL6)、インターロイキン−7(IL7)、インターロイキン−8(IL8)、インターロイキン−9(IL9)、インターロイキン−10(IL10)、インターロイキン−11(IL11)、インターロイキン−12(IL12)、インターロイキン−13(IL13)、顆粒白血球(Granulocyte)−コロニー形成活性化因子(G−CSF)、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子(GM CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、エリトロポエチン(Erythropoietin);スロンボポエチン、コレカルシフェロール(ビタミンD3)、表皮(Epidermal)成長因子(EGF)、脳−誘導神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、aFGF FGF−4、FGF−6、FGF−7/ケラチノサイト増殖因子(KGF)、血小板−誘導成長因子(PDGF)、血小板由来成長因子−BB、ベータ神経成長因子、アクチビンA、形質転換成長因子β1(TGFβ1)、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死要素−α、腫瘍壊死要素−β、バースト促進活性(BPA)、赤血球促進活性(EPA)、PGE2、インシュリン成長因子−1(IGF−1)、IGF II、ニューロトロフィン成長因子(NGF)、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン4/5、線毛(Ciliary)神経栄養因子、グリア−誘導ネキシン、デキサメサゾン(Dexamethasone)、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸(Retinoic acid)、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシン(Amphotericin) B、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールリン酸、ニコチンアミド、DMSO、チアゾリジンジオン類、TWS119、オキシトシン、ヴァソプレッシン、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン(corticortropin);脂肪刺激ホルモン、甲状せん刺激ホルモン、成長ホルモン、乳腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、濾胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン抑制因子、生長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、甲状せん刺激ホルモン放出因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド1、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、モチリン、血管作動性小腸ペプチド、サブスタンスP、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシン、神経ペプチドチロシン、インシュリン、グルカゴン、胎盤ラクトゲン、弛緩ホルモン、アンジオテンシンII、カルシトリオール(calctriol)、心房性ナトリウム利尿ペプチド、およびメラトニン、サイロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフリン、ノルエピネフリン、アンドロステン(androstiene)、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、5−アザシチジン、アンホテリシン B、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールリン酸、ニコチンアミド、DMSO、トリアゾリジンジオン類、およびTWS119。
【0143】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、1以上の濃度で候補分化因子を細胞集団に提供する。いくつかの実施態様では、候補分化因子を細胞集団に提供し、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約0.1ng/mlから約10mg/mlの範囲である。いくつかの実施態様では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約1ng/mlから約1mg/mlの範囲である。細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約10ng/mlから約100マイクロg/mlの範囲である。さらに、他の実施態様では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約100ng/mlから約10マイクロg/mlの範囲である。好適な実施例では、細胞を囲む媒体中の候補分化因子の濃度は、約5ng/mlから約1000マイクロg/mlの範囲である。いくつかの実施態様では、本明細書に記載されたスクリーニング法の工程は、最初の時間ポイントと2回目の時間ポイントで少なくとも1つのマーカーの発現を決定することを含む。これらの実施態様のいくつかでは、第1の時間ポイントは、候補分化因子を細胞集団に提供する前かまたはほとんど同時であることができる。あるいはまた、いくつかの実施態様では、第1の時間ポイントは候補分化因子を細胞集団に提供した後である。いくつかの実施態様では、複数のマーカーの発現は第1の時間ポイントで決定する。
【0144】
前述の方法は、生存率を上げ、分化状態を安定させ、成長を増加させ、hES細胞の多分化能を維持する低分子および他の化合物のためのスクリーニングに等しく適切である。当業者は本明細書に記載された技術をそのようなスクリーニング法に適合することができるであろう。
【0145】
第1の時間ポイントで少なくとも1つのマーカーの発現を決定することに加えて、本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、第1の時間ポイントの後であり、候補分化因子を細胞集団に提供した後である第2の時間ポイントにおいて少なくとも1つのマーカーの発現を決定することを企図する。そのような実施態様では、同じマーカーの発現を1番目と2番目の時間ポイントの両方で決定する。いくつかの実施態様では、複数のマーカーの発現は1番目と2番目の時間ポイントの両方で決定する。そのような実施態様では、同じ複数のマーカーの発現は1番目と2番目の時間ポイントの両方で決定する。いくつかの実施態様では、マーカー発現は複数の時間ポイントで決定され、それらはそれぞれ第1の時間ポイントの後であり、それらのそれぞれは候補分化因子を細胞集団に提供した後である。ある実施態様では、マーカー発現はQ−PCRで決定する。他の実施態様では、マーカー発現は免疫細胞学的方法で決定する。
【0146】
本明細書に記載されたスクリーニング法のいくつかの実施態様では、候補分化因子を細胞集団に提供してから、第2の時間ポイントでマーカー発現を決定するまでに十分な時間を取ることができる。候補分化因子を細胞集団に提供してから、第2の時間ポイントでマーカー発現を決定するまでに十分な時間は、約1時間から最大約10日間であることができる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのマーカーの発現は、候補分化因子を細胞集団に提供した後の複数の時間で決定される。いくつかの実施態様では、十分な時間は少なくとも約1時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間から数日から数週間である。
【0147】
本明細書に記載された方法のいくつかの実施態様では、第1の時間ポイントでのマーカーの発現と比べて、第2の時間ポイントでのマーカーの発現が増減したかどうかさらに決定される。少なくとも1つのマーカーの発現の増大または減少は、候補分化因子が内分泌性前駆細胞の分化を促進できることを示す。同様に、複数のマーカーの発現が決定されるなら、第1の時間ポイントでの複数のマーカーの発現と比べて、第2の時間ポイントでの複数のマーカーの発現が増減したかどうかがさらに決定される。マーカー発現の増大または減少は、第1と第2の時間ポイントでの細胞集団における、マーカーの量、レベルまたは活性を測定するか、または他の方法で評価することによって決定できる。そのような決定は、他のマーカーとの相対値、例えば、ハウスキーピング遺伝子表現に対して、または絶対値であることができる。ある実施態様では、マーカー発現が第2の時間ポイントで第1の時間ポイントと比べて増加する場合には、増加量は少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、少なくとも約100倍または少なくとも約100倍以上である。いくつかの実施態様では、増加額は2倍より少ない。マーカー発現が第2の時間ポイントで第1の時間ポイントと比べて減少する場合には、減少の量は少なくとも約2倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、少なくとも約50倍、少なくとも約60倍、少なくとも約70倍、少なくとも約80倍、少なくとも約90倍、少なくとも約100倍または少なくとも約100倍以上である。いくつかの実施態様では、減少の量は2倍より少ない。
【0148】
本出願を通じて、種々の文献が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、本発明の技術分野における技術水準をより完全に記載するために、その全体が本願に参考として援用される。
【0149】
実施例
以下の実施例で使われた単純で定義された培地は、DC−HAIFと呼ばれ、DMEM/F12、非必須アミノ酸、微量元素、アスコルビン酸、β−メカプトエタノール、ペニシリン/ストレプトマイシン(任意)、カプリル酸抽出された脂肪酸非含有のBSA、鉄結合性グロブリン、組換え型のヘレグリン−1β(H)、アクチビンA(A)、LR3−IGF1(I)、およびFGF2(F)のタンパク質から本質的になる。DC−HAIFは多分化能hES細胞の長期維持をサポートし、またAccutase(登録商標)を使用した単独細胞継代およびhES細胞のスケールドエキスパンション(scaled expansion)をサポートした。上掲のRobins, A. & Schulz, T. 2009を参照。DC−HAIFのバッチテストされた市販製剤は、StemPro(登録商標) hESC SFMという商号でInvitrogenから利用可能である。
【0150】
これらの背景研究の間中、FGF2が定義された培地の必要な成分でなないことが明確になった。高濃度のときにさえ、FGF受容体の貧しいかまたは中程度のリン酸化だけが成長因子刺激の後に観測された。増殖、突発性分化または多分化能の維持について測定可能な影響を培養物に与えることなく、FGF2を定義された培地から省略できた。上掲のRobins, A. & Schulz, T. 2009を参照。したがって、以下の研究では、テキストおよび図の凡例に示すように、加えられたFGF2なしで行われた。さらに、いくつかの検定方法は、成長因子の組み合わせを変えることを要求したので、StemPro(登録商標) hESC SFMの成長因子を含まないバッチがLife Technologiesに特注され、購入され、そのような適応性を提供した。
【0151】
hES細胞培養で重要な機能を有する追加シグナリング経路にハイライトを当てるために、公知の生理活性を有する低分子化合物のライブラリから本質的に成るLOPACライブラリが、低密度hES細胞培養をスクリーニングするのに使われた。目的は、培養エキスパンションおよび/または、多分化能に否定的な影響を与えた低分子を同定することであった。主要な系路の阻害が、遅くされた増殖、細胞障害性、アポプトーシスまたは分化をもたらすと予想されるだろう。重要なことには、これらの一次的および二次的スクリーニングは、本明細書に記載された単純定義された培地を背景として実行され、血清またはセミ分画されたアルブミンなどの未定義の成分によって典型的に導入される変異性を減少させた。活性を決定するために、アルカリホスファターゼ染色検定が行われ、約50の低分子化合物がhES細胞成育と生存を含むhES細胞へのそれらの影響に関していくらかの測定できる活性を示した。これらの化合物の、細胞表面神経伝達物質受容体の多数の阻害剤が同定され、これらの受容体の自己再生におけるシグナリングの役割を少なくとも示唆している。天然由来のリガンドまたは薬品作用関連誘導体を使用して、数種類の低分子神経伝達物質(これらは副腎皮質ホルモンとしても機能する)が同定され、低密度でhES細胞成育のサポートおよび/または、エキスパンションと生存を示した。hES細胞の商業的および臨床用途に関する発展する先進技術に、そのような活性は重要である場合がある。たとえば信頼できる単独細胞クローニング、完全に定義された新規なhES細胞ラインの効率的な導出、GMP対応条件、懸濁液中におけるhES細胞の成長や継代の向上した生存などである。
【0152】
また、上記が本発明の例示の実施態様に関連し、本発明の範囲から逸脱せずに多数の変更を行うことができることが理解されるべきである。本発明は以下の実施例によってさらに説明される。実施例はいかなる方法でも本発明の範囲を制限することは意図されない。一方、手段は多くの他の実施態様、変更および等価手段を有し、本明細書に記載する説明を読んだ後に、本発明の精神および特許請求の範囲の記載から離れることなく明確に理解されるべきである。
【0153】
実施例1:
多能性幹細胞における重要な経路の同定
定義されたメディアDC−HAIF(StemPro(登録商標) hESC SFM、Life Technologies製)での生育の間、この定義された培地中のhES細胞の培養とAccutase(登録商標)による単一細胞継代が小規模培養形式における確固とした平板培養を可能にすることが示された。96−および384ウェルのプレートにこのアプローチを適用して、定量的で統計的に有意に細胞を数え、データは、ERBB2シグナリングの阻害剤であるAG825の自己再生への効果を確認した。
1ウエルあたりおよそ3×104のhES細胞がStemPro(登録商標) hESC SFMのマトリゲル(Matrigel)上で、96ウェルのプレートで約24時間培養された。次に培地を変えた。新しい培地は、LOPAC1280ライブラリ(表1の部分的なリスト)からの化合物の10マイクロMを含んでいて、培地はさらに48時間培養された。培養物はついで固定され、未分化型hES細胞のマーカーである内因性のアルカリホスファターゼ活性のために染色された。このアッセイの形式は影響を受けたウエル(非集密的成長)と、影響を受けないウェル(集密的成長(confluent growth))の明らかな区別を示した。
【0154】
よく特徴付けられた薬理活性を有する小有機分子のライブラリであるLOPAC1280のコレクション(Sigma Cat#LO1280)は、96ウェルプレート(合計16プレート)で上記のアルカリ性ホスファターゼ検出分析を使用することでスクリーニングされた。それぞれの96ウェルのアッセイは80個の化合物(1ウェルあたり1個の化合物)と16ウエルのDMSOキャリアネガティブコントロールで実行された。約50個以上の化合物が一次的なスクリーニングでhES細胞成育とエキスパンションに影響を与えるとして同定された。それらはついで二次スクリーニングにより38分子の群(表1)にされ、通常の知られている細胞傷害性分子類は除かれた(例えば、5アザシチジン)。これらの分子類によって影響を与えられそうな系路(したがってhES細胞において重要な系路)はNFκB、eNOS、RAR(a)、カルシウムチャネル、タヒキニンシグナリング、グアニリルシクラーゼ、SrcおよびJak2によるシグナリングを含む。
【0155】
二次スクリーニングは同じアッセイを使用することで実行されたが、10マイクロMではなく、0.1−50マイクロMの化合物の希釈列が使用された。それぞれの化合物の最小有効濃度を示す(表1)。興味深いことに、38の候補化合物のうち11(28%)は既知の、神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗体、モジュレータまたはリガンドであった(表1、図1)。hES細胞自己再生でのGABAシグナリングの役割は以前に(Ludwig et al., 2006)強調されていたが、他の定義されたメディア条件の下では調べられていない。未分化型多分化能性幹細胞での他の神経伝達物質のための潜在的役割は特徴付けられていない。
【0156】
【表1−1】
【0157】
【表1−2】
【0158】
【表1−3】
【0159】
実施例2:
定義された培地の低細胞濃度における多能性細胞自己再生をサポートする低分子
神経伝達物質受容体を通して作動するのが知られている11の候補化合物の一次的なLOPACスクリーニングでは、6つは拮抗体(アデノシン、ドーパミン、コリン作動性、NMDA、セロトニン、およびヒスタミン受容体)と1つの受容体モジュレータ(コリン作動性(ニコチン様の)の受容体)である(図1)。これらの受容体のブロッキングが増殖を禁止するか、またはアポプトーシスを引き起こすように見えたので、hES細胞の成育と生存に、受容体シグナルは重要であるかもしれない。したがって、リガンド駆動の受容体刺激がhES細胞での自己再生または他の望ましい活性に作用できるということになる。現在のhES細胞培養における主要な制限は低密度での細胞培養のが不能であることである。hES細胞の単独細胞クローニングのいくつかの報告にもかかわらず、完全に定義された培地における、個々のhES細胞の低密度培養とクローニングのための信頼できる条件は開発されていない。Amit et al., 2000 Dev Biol 227, 271-278; Pyle et al., 2006 Nat Biotechnol 24, 344-50; and Watanabe et al., 2007 Nat Biotechnol 25, 681-6を参照。そのような活性を顕在化させる低分子は、高密度、大規模なhES細胞の懸濁培養において、より高い培養/生存、集合または抗アポトーシス活性をサポートし、実質的な改善を提供すると予測されるだろう。上記で特定された受容体に対応する神経伝達物質リガンド、並びに他のさまざまな神経伝達物質リガンドは、hES細胞が低密度で培養された時に、細胞生存と増殖のサポートについてテストされた。
【0160】
コロニー形成アッセイ
約104hES細胞/ウエルでStemPro(登録商標) hESC SFM中、6ウェルのトレー中で、異なった化合物の存在下において約7日間培養された。培養物はついで固定され、アルカリホスファターゼ活性染色され、そして、コロニーが数えられた(図2)。50未満のコロニーがStemPro hESC SFM単独で、定義された培地で7日後に観測され、hES細胞がStemPro hESC SFMの臨界密度閾値以下で生存および/または、有効に増殖しなかったことを示した。
前の実験は、最小で約105の細胞が6ウェルのトレーの中のエキスパンションと連続継代に必要であることを示した。ROCK阻害剤のY27632が、MEFの低密度で育てられたhES細胞成長が報告されていた(Watanabe et al., 上掲)のでコントロールとして含まれていたが、定義された培地におけるコロニー生存/エキスパンションをサポートしなかった(0コロニー)。また、神経伝達物質ヒスタミン、ニコチン、およびNMDAも向上したコロニー形成をサポートしなかった。しかしながら、アデノシン、アセチルコリン(ACh)、およびノルエピネフリン((−)−ノルエピネフリン、または(±)ノルエピネフリン(+)酒石酸水素塩)のすべては、 向上したコロニー形成をサポートした(図2)。すべての3つの分子類が結合し、細胞表面受容体を活性化して、hES細胞で自己再生または反アポプトーシス信号に重要な、新たに認識されるシグナリング経路を示唆した。(±)ノルエピネフリン(+)−酒石酸水素塩は、特記の無い限り、ノルエピネフリン(NE)にかかわるすべての以下の実験に使用された。
【0161】
同様のコロニー計数法実験が、さまざまな細胞濃度(図3)を使用することで行われた。NEまたはAChの存在下において4回以上において、StemPro hESC SFM媒体単独と比べて多くのコロニーが検出され、それぞれ最低で1ウエル当たり1000細胞と500細胞であった。コロニー形成の頻度は異なる始めの密度と比較的一致しており、培養された細胞の2.5−3.5%のオーダーであった。より高い細胞濃度では、細胞移動は最初の約24時間の培養でミクロコロニーの形成につながる。上掲のRobins and Schulz 2009を参照されたい。これらの低密度検定方法でのコロニー形成の一貫した速度は、移動と菌株群形成よりむしろ単独細胞から多くのコロニーを得ることができたと示唆した。低細胞濃度で誘導されたコロニーのイメージは、緊密な、典型的なhES細胞形態を示した(図3)。しかしながら、コロニーの低い頻度は、よりゆるい、細胞のより星状のアレンジメントを示し、部分的な分化またはコロニー内のより不良な細胞−細胞接触を示した。
【0162】
リアルタイムの細胞指数モニタリング
より詳細に個々の神経伝達物質の潜在能力を調べて、相乗作用が異なった要素の間に存在しているかどうかを評価するために、低密度検定方法がリアルタイムのインピーダンスリーダーを使用することで実行された。ACEAバイオサイエンスRT−CESシステムは、細胞指数(cell index)の尺度に翻訳される電気インピーダンスの変化をモニターするために組み込まれたマイクロセンサを含む96−ウエルトレイを使用する。細胞培養中のどんな明白な変調も検出でき、たとえば細胞増殖、移動、細胞拡散、アポプトーシス、分化、および同様のものが検出できるがこれらには限定されない。前の実験は、hES細胞がRT−CESトレー中において、有効に接着しエクスパンドすることを示し、進行性の増加する細胞指数が未分化細胞(Q−PCRで確認される)の増殖を意味した。未分化型培養がいったんコンフリューエントになると、細胞指数は高いままであるが、毎日の給餌の間に上下する(波形:scallop)傾向がある。逆に、分化は典型的にはたとえば細胞指数における山と谷などのような特有のパターンの外観で示される。同様に上皮から間葉への変転(epithelial-to-mesenchymal transition)、平坦化、細胞移動、アポプトーシスまたは同様の分化とまたは成長に関連する変化を暗示する。
【0163】
有効な神経伝達物質濃度の力価測定
RT−CESシステムは、NEとAChが有効である濃度領域を調べるのに使用された。人間の胚性幹細胞は低密度、1000細胞/ウエルで、10日間、RT−CESトレー中で培養された(図4)。細胞はキャリアコントロール(DMSO)、NE、またはAChを含むStemPro hESC SFM中で直接培養された。予想された通り、細胞はDMSO単独では生存もしなかったし、有効に増殖もしなかった。細胞指数の上昇は9日後に観測されただけである。1マイクロMのNEは低密度生存/増殖に影響するように見えなかったが、細胞指数の増大は最初の約6.5日間で5、10、および50マイクロM NEで検出された。70マイクロMおよび100マイクロM NEの両方では、細胞指数は次第に速い上昇を示して、それぞれ約9日と10日の後に明らかにコンフリューエントであった。AChの力価測定は類似パターンをもたらした、また、効果を顕在化させた最も低い濃度は5マイクロMであった。これらのデータはNEとAChの両方のための増加する用量応答を示唆した。これは受容体仲介機構と一致した、NEとAChの両方が次に50マイクロMで使用された。それは、それぞれの神経伝達物質のための中間濃度を表した。
【0164】
神経伝達物質組み合わせ
低分子神経伝達物質の潜在的追加効果を調べるために、hES細胞は、キャリア対照(DMSO)、またはNE、ACh、アデノシン、GABA、Y27632、またはこれらの要素の2つの組み合わせを含むStemPro hESC SFM中で培養された(図5)。DMSO単独、またはY27632の存在下において、細胞は生存も増殖もしなかった。細胞膨張の3つのパターンが検出された。50マイクロM NE、またはAChの、ただ一つの要素としての追加が、有効な生存とエキスパンションを可能にし、細胞指標が約3日後にバックグラウンドを超えて上昇した。2番目のグループの中のエキスパンションでは、50マイクロMのアデノシンまたはGABAを含むものはあまり効果的ではなく、培養の約4.5日後に検出可能であった。最も著しいエキスパンションを示すグループは、3日後に検出可能であり、NE+アデノシンおよびNE+AChを含む培養液から成った。これはこれらのホルモン/神経伝達物質の間の相乗作用を示唆する。相乗作用を示唆した他の唯一の組み合わせが、GABA+アデノシンであった。これは中程度のグループであった。興味深いことには、Y27632の存在はNE、ACh、アデノシンおよびGABAの効果を減少させ、明確に、StemPro hESC SFM培地と神経伝達物質の中でROCK系路を禁止するという好ましくない効果を示した。これらの要素の間の相互作用に関する要約図は図5に提示される。
【0165】
実施例3:
多分化能性幹細胞の低密度生存/エキスパンションをサポートするアゴニスト
合計6つの異なったクラスの神経伝達物質受容体がオリジナルのLOPACスクリーニングに含まれたので、次の目的はhES細胞の低密度生存そして/または、エキスパンションへの影響の大きさを決定するために、同様のリガンドの広い配列(array)を調べることであった。88の神経伝達物質アゴニストのサブライブラリをLOPACコレクションから作成した。これはアデノシン、アドレナリン性、ベンゾジアゼピン系、大麻類のアゴニストおよびコリン作動性レセプタを表す。人間の胚性幹細胞は1000細胞/ウエルで直接、DMSOまたは個々のアゴニスト(10マイクロM)を含むStemPro hESC SFM中に入れられ、RT−CESシステムで約9日間培養された。アデノシンとアドレナリン受容体(図6B)のアゴニストである、(±)ノルエピネフリン(+)酒石酸水素塩(図6A)の効果をまねた追加アゴニストが同定された。ドーパミン、セロトニン、およびホモバニリン酸(HVA)、カテコールアミン代謝物を含む、いくつかの追加神経伝達物質が低密度インピーダンスアッセイでテストされた。DMSOコントロール(図6C)と比べて、これらの化合物は上昇した生存/増殖を示した。これらの研究は、さまざまな神経伝達物質受容体またはシグナリング経路が低密度培養およびエキスパンションをサポートできて、それぞれの系路が多発性リガンドまたはアゴニストを活性化することができそうだと確認した。重要なことには、神経伝達物質系路のすべてがhES細胞成育と多分化能にかかわるわけではない。これは、NMDA、ヒスタミン、およびGABAによって示された確固とした活性の不足、およびアゴニストサブライブラリの10マイクロMの濃度でテストされたのときに有効でなかった83個の化合物によって証明される。
【0166】
実施例4:
低密度多分化能幹細胞培地の定義された培地における、神経伝達物質と増殖因子の組み合わせの効果
上記の研究は、同定された神経伝達物質によって提供されたシグナリングは潜在的にDC−HAIFまたはStemPro hESC SFMに含まれた成長因子蛋白質を補足するかまたは置き換え、したがって、安価な低分子を高価な組換体蛋白質の代わりに用いることによってそのような培地をより費用対効果に優れるようにすることができると示唆した。定義された培地の費用の約半分は特に、アクチビンのためである。それは、製造するのが、難しく、CHO細胞を使用して製造されている。しかし、少なくとも低密度のRT−CES検定方法は、神経伝達物質の候補がStemPro hESC SFMに提供された増殖因子の完全な代理をすることができそうにないことを示した。しかしながら、通常の(高い)細胞濃度では、これらの低分子は潜在的適合性代用物である。
【0167】
したがって、追加検定方法が、ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)およびアクチビン(A)の簡易型の組み合わせについて、神経伝達物質のあるものとないものについて効果を調べるために実行された(図7)。StemPro hESC SFMとHAI(ヘレグリン、アクチビン、およびLR3−IGF1)だけを含むウェルでは、細胞は、予想されるように約9日目までバックグラウンドを超えて検出されなかった。しかしながら、StemPro hESC SFM HI(ヘレグリンおよびLR3−IGF1)は予想外にはるかに確固とした生存/エキスパンションをサポートし、成長は約5.5日目に最初に検出された。おそらく、望ましくないBMP誘導の分化シグナルと競争することによってhES細胞培養で突発性分化を抑圧するように見えたこと、およびアクチビン受容体の阻害が増加する分化を引き起こしたため、アクチビンは元々DC−HAIF媒体に含まれていた。アクチビンの役割は以前に低細胞濃度でテストされていなかったが、これらおよび次の実験は、培養においてこれらの条件での細胞の生存および/またはエキスパンションにおける主要な負の役割を担うことを示した。NE、AChまたはNE/AChの添加は、HAI(ヘレグリン、アクチビン、およびIFG1)またはHI(ヘレグリンとIGF1)バックグラウンドにおいて、改善された生存/エキスパンションを実質的にサポートした。興味深いことには、NEとAChの間の相乗作用はHAIのバックグラウンドにおいて観測されたが(以前に観測されたように)、アクチビンが省略されたとき、それは明白でなかった。したがって、最大生存/エキスパンションはNEを有するStemPro hESC SFM HI(ヘレグリンとIGF1)で観測された。AChの添加はさらなる改善を提供しなかった。
【0168】
コロニー計数アッセイ
異なるアプローチを使用することでこれらの観察が適正であることを示すために、低密度コロニー計数法アッセイが実行された(図8)。約104hES細胞はHAI(ヘレグリン、アクチビン、およびIFG1)またはHI(ヘレグリンとIGF1)を含むStemPro hESC SFMと、それ単独または神経伝達候補物質との組み合わせ、および前の実験からの(NE、NE/セロトニン、NE/ACh、ACh、またはACh/セロトニン)の組み合わせを、6ウェルのトレーの中で培養した。AP+コロニーの計数は、低細胞濃度におけるコロニー形成のときのアクチビンの負の影響を明確に確認し、HI内で神経伝達物質コントロールの無い場合に、>200コロニーであった(図8A)。これらのコロニーは、小さく、大規模に増殖していなかったが、ネガティブコントロールと比べて、明確に存在していた。任意の神経伝達物質リガンドの付加はコロニー形成における顕著な改善を引き起こし、これはRT−CES検定方法と一致した。またNEを有するHI条件はテストされた他の要素の添加で改良されなかった。染色されたコロニーのイメージは、アクチビンの存在下で、生き残っているコロニーが主として不均等であり、分散細胞が小さなコロニーコアの周囲に観察され、一般にはより多くの星状の形態(stellate morphology)を示した(図8B)。これらの特徴は、低い細胞濃度のアクチビンが培養物の部分的な分化、または細胞の遊走の増加を引き起こし、コンパクトなコロニーが形成されないことを示唆する。これらまたは他の効果は細胞生存に非常に影響を与えそうである。逆に、アクチビンの非存在と神経伝達物質の存在下では、タイトでコンパクトなコロニーが典型的に形成された。これは安定してエキスパンドできる未分化型hES細胞の典型である。
【0169】
同様の実験が、神経伝達物質によって提供されたシグナリングが、IGF1またはヘレグリンの代理をすることができるかどうか決定するために行われた。低密度平板培養検定方法は、RT−CESリーダーで、アクチビン(A)、ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、および神経伝達物質候補の異なった組み合わせを有するStemPro hESC SFMを使用して実行された(図9)。前の検定方法と一致して、インピーダンスの上昇はアクチビンの非存在、神経伝達物質NE、NE/ACh、NE/アデノシン、NE/ドーパミン、NE/セロトニンおよびACh/セロトニンが存在する時に非常に早く検出された。ACh/ドーパミンの組み合わせまたは、ACh/HVAの組み合わせは、hES細胞の実質的な生存/エキスパンションを促進するように見えなかった。ヘレグリンだけを含有する培地は、低い細胞濃度生存をサポートしなかったが、上記の神経伝達物質の添加は顕著な改善を引き起こした。しかしながら、ヘレグリン(IGF単独)がないとき、培養は神経伝達物質の存在または非存在のどちらでもエキスパンドしなかった。したがって、アクチビンとIGF1が、これらの短時間分析において不必要であるように見える一方、神経伝達物質によって提供された活性は、低細胞濃度でヘレグリンシグナリングの代理をするように見えなかった。
【0170】
実施例5:
神経伝達物質は多能性細胞の浮遊培養を向上する
低細胞濃度で生存または自己再生をサポートする低分子リガンドが、他の培養形式においても有益な効果を持っていると予想できた。出願人は、以前に、細胞の連続的増殖と培養の効果的なエキスパンションを可能にするhES細胞の浮遊培養システムを開発した。人間の胚性幹細胞(少なくともBG02とCyT49細胞)は、分化なしで10以上の継代で懸濁で維持された。テクニックの基礎は、Accutase(登録商標)、TrypLEまたは細胞散布バッファなどの高い生育性を保持する試薬で培養物を分離して単独細胞にすることであり、次に、回転培養で定義された培地において、細胞の規定された濃度で集合体にした。これらの方法は、2008年11月4日に出願された、PCT/US2008/082356の幹細胞集合体懸濁液組成物、その分化方法、および2007年2月23日に出願された、PCT/US2007/062755の分化細胞の培養方法および培養物に詳細に記載される。これらは本明細書に参考として全体を援用する。hES細胞の自己凝集は、加えられた細胞外マトリックス(ECM)またはECMのようなタンパク質の非存在下に起こり、E−カドヘリンのホモタイプ相互作用によって一部駆動されると推定される。3−4日間のエキスパンドで形成される集団は、回転培養によって発生したせん断力によって互いに離れて保たれる。細胞は、定義された培地によって提供される自己再生シグナリングにより分化が妨げられて、それらの多分化能特性、生体外と奇形腫におけるマーカー発現、正常核型、および分化能を保持する。それぞれの継代で培養のエキスパンションを最大にするために、最小量の実行可能なサイズの均一の集団の最多数を発生させるのは、望ましい。
【0171】
人間の胚性幹細胞はローアタッチメント6ウェルのトレー中に106細胞/mlで、ヘレグリン(H)、IGF1(I)、およびアクチビン(A)を含むStemPro hESC SFMの5ml中、100rpmで培養され、懸濁液中で凝集された。実験変数はY27632、NE、AChまたはNE/AChの添加を含んでいた(図10A)。首尾よく集合体であり、コピーされたウエルの全ての条件で、短期的な細胞生存を決定するために、24時間後に収穫され、分離され、数えられた。StemPro hESC SFM単独では、約50%の細胞だけが最初の24時間生き残ったが、他のすべての処理は約4x106細胞を示した(図10B)。StemPro hESC SFM中の高細胞密度での細胞生存へのY27632のポジテイブな効果は、接着培養における前の観察と一致していて、NE、AChおよびNE/AChの類似の効果とマッチしていた。すべての条件で4日間の回転培養により拡張され、低分子を有する処理で顕在化する細胞数の増大は、細胞計数によって確認された(図10C)。さらに、4日目における集団の直径の測定は培養の期間での観察を確認した(図10D)。StemPro hESC SFM単独では、凝集体サイズは非常に可変であったが、Y27632の添加は細胞の向上した集合を引き起こし、より少ない数の、より大きい集団が見いだされた。対照的に、NE、AChまたはNE/AChの添加は、Y27632で形成されたものよりより小さい集団を可能にし、StemPro hESC SFM単独のものより一貫して均一サイズのものであった。これらのデータは、神経伝達物質がhES細胞の(通常)の、より高い密度浮遊培養のためにいくつかの利点を提供することを示した。第一に、それらは集合段階の間、Y27632で観察されたものと等しいかまたは優れた細胞生存を促進した。第二に、それらはより小さくて一貫して均一なサイズの集合体の形成を促進し、潜在的に凝集体サイズとスプリットの間の時間の長さのより優れた制御を提供し、その結果、それぞれの継代で可能なエキスパンションを最大にする。
【0172】
染色体安定性
これらの可能性を調べるために、これらの培養物はp1に連続的に継代された(図10E)。Y27632によって処理された集団がより大きいサイズのものであったので、それらは、3日後に継代を必要として、その期間におよそ1.2×107の細胞しか発生させなかった。対照的に、NE、AChまたはNE/ACh含有培養液が、6日間培養されて、1ウエルあたり2×107の細胞を発生させた。NE、AChまたはNE/AChを含む浮遊培養液が、12の連続継代のために保持され、平行してHAIFコントロール培養が行われ、すべての条件が、未分化型形態を維持した。懸濁集団は、10継代の後に単独細胞に分離され、分析のために接着培養で再培養された。Oct4およびTra−1−60(図11)、および他の多分化能マーカーの発現は一様に維持され、培養が未分化であったのを示した。再培養物も、それらの核型を決定するためにG−結合された。HAIFコントロールとHAIF/NE培養物の両方が、正倍数体または正常であったが、ACh含有培養物は異数体または異常性であり、第5染色体の三染色体性と他の変調を示した。この実験は、NEの存在下においてhES細胞の長期培養の間ゲノム安定性を維持できて、成長利点を有する異数性細胞の亜細胞が、発生されなかったか、または富化されなかったことを示唆した。しかしながら、このデータが、AChがゲノム一体性に影響することを示唆するので、hES細胞の低密度の生存/成長をサポートするすべての要素が、より高い密度での細胞生育条件で有用性を有するわけではないことは明確である。
【0173】
実施例6:
ノルエピネフリンの存在下において標準の密度での多能性細胞のエキスパンションをサポートする増殖因子の組み合わせ
ノルエピネフリンは細胞が低密度で育てられたとき、ヘレグリンシグナリングの代理をすることができるように見えなかった。これはこれらの要素が異なったシグナリング経路に影響を与えることができることを示唆している。しかしながら、細胞−細胞接触とシグナリングの関係は、標準の播種密度において全く異なっている。そこでは細胞がマイグレートし、最初の24時間の培養でミクロコロニーを形成する。上掲のRobins and Schulz, 2009を参照。したがって、hES細胞をサポートするのに必要な増殖因子の実質的な相違を、低密度および高密度で観測できる。したがって、インピーダンスリーダーを使用して、hES細胞の標準の密度における短期的成長検定が行われた。約104hES細胞/ウエルが、50マイクロMの、NE、ヘレグリン(H)、LR3−IGF1(I)、アクチビン(A)、またはFGF2(F)の異なった組み合わせを含むStemPro hESC SFMで培養され、3.5日間にわたりモニターした。低細胞濃度における結果と対照的に、NEはある程度の高い密度条件でヘレグリンが存在しない時、培養のエキスパンションをサポートするかもしれない(図12A)。サポートできる組み合わせはNE/AIF、NE/IF、NE/IAおよびNE/Iを含む。ログ相成長の間の細胞指数の傾斜の測定結果が示される(図12B)。これらのデータは、NEが存在する時、組換え型の増殖因子の簡単な組み合わせで、未分化型hES細胞をエキスパンドすることが可能であることを示す。そのような簡単な培地は実質的な利益を持つことができ、特に治療応用のための大規模製造の間のhES細胞の商品原価と関連する。
【0174】
実施例7:
ノルエピネフリンの存在下における多能性細胞の連続継代のための成長因子への要求
NEと増殖因子の簡単な組み合わせ候補を含むメディア中のhES細胞の連続継代の効果は、少なくともBG01(図13)とBG02(図14)細胞についてテストされた。試験条件は10ng/mlのヘレグリン(H)、200ng/mlのLR3−IGF1(I)、10ng/mlのアクチビン(A)、および8ng/mlのFGF2(F)を含むStemPro hESC SFM中で維持された細胞と比較された。ヘレグリン(すなわち、AIF)の非存在下において、ある種のhES細胞培養は有効に維持できなかった。たとえば培養物は、密にパックされた領域があるが、一般に不十分な増殖であった。たとえば増殖はウェルの外側の縁で密であるが、増殖は通常であった。アクチビンが省略された培地(IF)も、不十分に増殖して、4番目の継代で失われた。しかし、NEが含まれていたとき、ヘレグリン(AIF NE)の非存在下において、有効なhES細胞増殖とウェル全体のhES細胞コロニー増殖さえ観測された。それでも、NEは標準細胞ではアクチビンの要件のための代理をするように見えない。IF NE培地がいくつかの継代にわたって分化されるからである。HAIF、AIF、およびAIF NE条件は少なくとも5継代にわたり維持された。AIF NEはAIFだけより好ましかった。なぜなら後者は、不均等な成長を示し続けたからである。
【0175】
また、ある種のhES細胞もヘレグリン(AIF)の非存在に対して形態的応答を示した。細胞がより平坦になり、より広がり、コロニーがタイトな上皮性のパッキングを示さない。同様の形態はすべての(ヘレグリンがない)アクチビン含有細胞培養液で観測された。これらの細胞培養は、別の方法で未分化型特性を表示し続けて、明白に分化しているように見えなかった。ヘレグリンとアクチビンの両方(IF)が存在しないとき、コロニーは、非常に緊密にパックされてドーム型になり、典型的なマウスES細胞培養の形態と、より類似していた。IF/NEおよびIF/NE/ノギンの培地は例外的なES形態を示し、緊密な上皮性のコロニーを示し、明白な分化は示さなかった。したがって、複数の条件が多数の継代にわたってhES細胞の連続性エキスパンションをサポートするかもしれないが、IF NEおよびIF NE ノギンの組み合わせのみが予想された上皮性の特性の維持を促進した。これらの連続的に継代されたhES細胞における多分化能の維持は、Oct4、SSEA4、Tra−1−60およびSox2の免疫蛍光によって示された(図15)。これらの実験は、増殖因子の簡易型の組み合わせが、特にはノルエピネフリン(NE)が培養液に含まれているとき、多能性細胞および連続的増殖をサポートすることを示し、確認した。
【0176】
実施例8:
多能性細胞におけるアドレナリン受容体の発現と機能
多分化能幹細胞増殖におけるそれらの潜在的役割を調べるために、アドレナリン受容体の発現がQ−PCRを使用して調べられた。そして、アドレナリン受容体機能の阻害剤が細胞成育への効果についてテストされた。いくつかのアドレナリン受容体の一定の比較的高い発現はADRB1、ADRB2、ADRA2BおよびADRA1Dを含むhES細胞ラインで検出された(図16)。ADRA2Cは、hES細胞試料で一貫して発現されるが、低レベルでは、ADRA1AとADRA1Bは低水準にあったか、または未分化細胞中で非一貫的に検出されただけである。50マイクロM NEの存在下において、アドレナリン受容体の40個の異なった阻害剤がhES細胞膨張への効果について低細胞濃度でテストされた。未処置のHAIF+NEコントロール、7つのα−アドレナリン作動性受容体拮抗体、5つのβ−アドレナリン受容体拮抗体、および2つのβ−アドレナリン受容体遮断薬の比較により、低細胞濃度でhES細胞生存および/または、エキスパンションに影響を与えかどうかが同定された(図17)。これらの研究は、hES細胞が、さまざまなαおよびβアドレナリン受容体の両方を発現し、受容体機能を禁止して、hES細胞のエキスパンションに影響を与える。その両方がhES細胞におけるNEシグナリングの重要さを確認する。
【0177】
本明細書に記載された、方法、組成物、および装置は、好適な実施例を表わすものであり、例示に過ぎず、本発明の範囲を制限することを意図しない。例えば、あるhES細胞ラインが使われた;しかしながら、本発明は任意の多分化能幹細胞ラインの使用を意図し、たとえば人間のiPS細胞ラインと他の言及されなかったhESおよびiPS細胞ライン、たとえば以下の表2と3に示されるもの、国立衛生研究所の幹細胞レジストリからのhttp://stemcells.nih.gov/research/registrのワールドワイドウェブに適合しているもの、マサチューセッツ医学大学、ウスター(マサチューセッツ)、米国に位置する、ヒト胚性幹細胞レジストリおよび国際幹細胞レジストリに示されるものを含む。
細胞ラインが利用可能となり、登録が得られると、定期的にこれらのデータベースはアップデートされる。それの細胞ラインのいくつかは、NSCB幹細胞レジストリで利用可能ではない。
それにも関わらず、本発明の出願日現在、少なくとも以下のhES細胞ラインは商業的に利用可能である。
【0178】
【表2−1】
【0179】
【表2−2】
【0180】
【表2−3】
【0181】
【表2−4】
【0182】
【表2−5】
【0183】
【表2−6】
【0184】
【表2−7】
【0185】
【表3−1】
【0186】
【表3−2】
【0187】
【表3−3】
【0188】
【表3−4】
【0189】
【表3−5】
【0190】
【表3−6】
【0191】
【表3−7】
【0192】
本明細書に記載された培地組成物は、iPS細胞ラインなどの他の多能性細胞ラインと共に使うことができる。例えば、少なくともiPS(Foreskin)、およびiPS(IMR90)のクローン、iPS−DF19−9のクローン、これはベクターフリーiPS細胞ラインである、も使用できる。iPS細胞の研究と応用のための京都大学センター(CiRA;山中伸弥)およびウィスコンシン大学(ジェームズ・トムソン)からの細胞ラインも使用できる。それの或るものはWiCeIlから利用可能である。
【0193】
そこでの変化および他の用途は当業者によって考えられるであろうが、それらは本発明の精神の範囲内に包含され、請求の範囲によって定義される。本明細書中で開示された発明に対する種々の置換および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行われうることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【0194】
以下の特許請求の範囲および本出願の開示において使用される、「本質的に成る」との用語は、引き続くリストに記載される任意の要素を含むことを意味し、列記された要素について記載された活性や作用を妨害しないかまたはそれらに貢献する他の要素を含むことができる。すなわち「本質的に成る」との用語は、列記された要素は必要であるかまたは義務的であるが、他の要素は任意であり、それらが記載された要素の活性または機能に影響するかどうかによって、存在できないかまたは存在できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗物質、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物を含む定義された細胞培地であって、
該培地内で培養された人間の多分化能性幹細胞のエキスパンションを分化することなくサポートする、定義された細胞培地。
【請求項2】
該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、コリン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン酸作動性、セロトニン作動性またはアデノシン受容体である、請求項1記載の定義された細胞培地。
【請求項3】
該神経伝達物質受容体がアドレナリン受容体である、請求項2記載の定義された細胞培地。
【請求項4】
該化合物が神経伝達物質受容体のアゴニストである、請求項2記載の定義された細胞培地。
【請求項5】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、ドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、およびそれらの生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項6】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、およびそれらの生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項5記載の定義された細胞培地。
【請求項7】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項6記載の定義された細胞培地。
【請求項8】
アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項7記載の定義された細胞培地。
【請求項9】
該化合物は、アセチルコリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項6記載の定義された細胞培地。
【請求項10】
該化合物は、アデノシン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項6記載の定義された細胞培地。
【請求項11】
さらにGABA、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩をさらに含む、請求項10記載の定義された細胞培地。
【請求項12】
該人間の多分化能性幹細胞が低い初期細胞濃度で培養される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項13】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項12記載の定義された細胞培地。
【請求項14】
該化合物がパラ−アミノクロニジンヒドロクロリド、イソタリンメシラート、塩酸イソプロテレノール、および5’−N−メチル カルボキサミドアデノシンから成る群から選択される、請求項12記載の定義された細胞培地。
【請求項15】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項13記載の定義された細胞培地。
【請求項16】
該増殖因子が以下から成る群から選択される、請求項15記載の定義された細胞培地:
ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片。
【請求項17】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項18】
該ErbB3リガンドは、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性剤(ARIA)、膠細胞成長因子2(GGF2)、感覚および運動神経由来の因子(SMDF)、ニューレグリン−2;エピレグリン、ビレグリン、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項19】
該TGF−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11、および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項20】
該IGF−1RのアクチベータがIGF−1、IGF−2、longR3−IGF1、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項21】
該FGF受容体のアクチベータがFGF−2、FGF−7、FGF−10、FGF−22、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項22】
該培地がFGF受容体の外因のアクチベータまたはそれらの機能的な断片を含まない、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項23】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンド;インシュリン様成長因子、それらの機能的な断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項24】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータ、TGF−βファミリーメンバー、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項23記載の定義された細胞培地。
【請求項25】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項24記載の定義された細胞培地。
【請求項26】
アデノシン、セロトニン、およびドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項25記載の定義された細胞培地。
【請求項27】
単独細胞集合体の懸濁液として、該多分化能性幹細胞が培養される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項28】
該組成物が実質的に倍数性状態の多分化能性幹細胞のエキスパンションをサポートする、請求項27記載の定義された細胞培地。
【請求項29】
該化合物は、ノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項28記載の定義された細胞培地。
【請求項30】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項29記載の定義された細胞培地。
【請求項31】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項30記載の定義された細胞培地。
【請求項32】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項30記載の定義された細胞培地。
【請求項33】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含み、人間の多分化能性幹細胞は標準の初期細胞濃度で培養される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項34】
少なくとも1つの増殖因子を含む請求項33の定義された細胞培地。
【請求項35】
該増殖因子がErbB3リガンド;TGF−βファミリーメンバー;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータ;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータ;それらの機能的な断片およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項34記載の定義された細胞培地。
【請求項36】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータとそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項37】
該培地が外因のTGF−βファミリーメンバーとそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項38】
該培地が外因のErbB3リガンドとそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項39】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項40】
該少なくとも1つの増殖因子が、インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および任意の、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片の組み合わせから成る、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項41】
ノギンをさらに含む、請求項41記載の定義された細胞培地。
【請求項42】
以下を含む組成物:
a)神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗物質、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物を含む定義された細胞培地、並びに
b)人間の多分化能性幹細胞;
該定義された培地は、培地内で培養された人間の多分化能性幹細胞のエキスパンションを分化することなくサポートする。
【請求項43】
該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、コリン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン酸作動性、セロトニン作動性またはアデノシン受容体である、請求項42記載の組成物。
【請求項44】
該神経伝達物質受容体がアドレナリン受容体である、請求項43記載の組成物。
【請求項45】
該化合物が神経伝達物質受容体のアゴニストである、請求項43記載の組成物。
【請求項46】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、ドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項45記載の組成物。
【請求項47】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項46記載の組成物。
【請求項48】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項47記載の組成物。
【請求項49】
アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項48記載の組成物。
【請求項50】
それらの化合物は、アセチルコリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項45記載の組成物。
【請求項51】
該化合物は、アデノシン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項45記載の組成物。
【請求項52】
さらにGABA、それらの構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含む、請求項51記載の組成物。
【請求項53】
該人間の多分化能性幹細胞が低い初期細胞濃度で培養される、請求項43記載の組成物。
【請求項54】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項53記載の組成物。
【請求項55】
該化合物がパラ−アミノクロニジンヒドロクロリド、イソタリンメシラート、塩酸イソプロテレノール、および5’−N−メチル カルボキサミドアデノシンから成る群から選択される、請求項53記載の組成物。
【請求項56】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項54記載の組成物。
【請求項57】
該増殖因子が以下から成る群から選択される、請求項56記載の組成物:
ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片。
【請求項58】
該定義された培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項57記載の組成物。
【請求項59】
該ErbB3リガンドは、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性剤(ARIA)、膠細胞成長因子2(GGF2)、感覚および運動神経由来の因子(SMDF)、ニューレグリン−2;エピレグリン、ビレグリン、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項60】
該TGF−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11、および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる、請求項57記載の組成物。
【請求項61】
該IGF−1RのアクチベータがIGF−1、IGF−2、longR3−IGF1、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項62】
該FGF受容体のアクチベータがFGF−2、FGF−7、FGF−10、FGF−22、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項63】
該定義された培地がFGF受容体の外因のアクチベータまたはそれらの機能的な断片を含まない、請求項57記載の組成物。
【請求項64】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンド;インシュリン様成長因子、それらの機能的な断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項65】
該定義された培地が外因のFGF受容体のアクチベータ、TGF−βファミリーメンバー、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項64記載の組成物。
【請求項66】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項65記載の組成物。
【請求項67】
アデノシン、セロトニン、およびドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項65記載の組成物。
【請求項68】
単独細胞集合体の懸濁液として、該人間の多分化能性幹細胞が培養される、請求項45記載の組成物。
【請求項69】
該人間の多能性幹細胞が、実質的に正倍数体である、請求項68記載の組成物。
【請求項70】
該化合物は、ノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項69記載の組成物。
【請求項71】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項70記載の組成物。
【請求項72】
該少なくとも1つの増殖因子が、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項71記載の組成物。
【請求項73】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項71記載の組成物。
【請求項74】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含み、人間の多分化能性幹細胞は標準の初期細胞濃度で培養される、請求項45記載の組成物。
【請求項75】
少なくとも1つの増殖因子を含む請求項74記載の定義された細胞培地。
【請求項76】
該増殖因子が、ErbB3リガンド;TGF−βファミリーメンバー;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータ;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータ;それらの機能的な断片およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項75記載の組成物。
【請求項77】
該定義された培地が外因のFGF受容体のアクチベータとそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項78】
該定義された培地が外因のTGF−βファミリーメンバーとそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項79】
該定義された培地が外因のErbB3リガンドとそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項80】
該定義された培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項81】
該少なくとも1つの増殖因子が、インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および任意の、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片の組み合わせから成る、請求項76記載の組成物。
【請求項82】
ノギンをさらに含む、請求項81記載の組成物。
【請求項83】
人間の多分化能性幹細胞をエキスパンドさせるための方法であって、
神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗物質、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物を含む定義された細胞培地内で人間の多分化能性幹細胞を培養することを含み、該細胞が培養中に分割するが、分化しない方法。
【請求項84】
該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、コリン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン酸作動性、セロトニン作動性またはアデノシン受容体である、請求項83記載の方法。
【請求項85】
該神経伝達物質受容体がアドレナリン受容体である、請求項84記載の方法。
【請求項86】
該化合物が神経伝達物質受容体のアゴニストである、請求項84記載の方法。
【請求項87】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、ドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項86記載の方法。
【請求項88】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項87記載の方法。
【請求項89】
該化合物がノルエピネフリン、それらの構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項88記載の方法。
【請求項90】
該培地がアセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項89記載の方法。
【請求項91】
該化合物は、アセチルコリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項88記載の方法。
【請求項92】
該化合物は、アデノシン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項88記載の方法。
【請求項93】
該培地がさらにGABA、それらの構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含む、請求項92記載の方法。
【請求項94】
該人間の多分化能性幹細胞が低い初期細胞濃度で培養される、請求項86記載の方法。
【請求項95】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項94記載の方法。
【請求項96】
該化合物がパラーアミノクロニジンヒドロクロリド、イソタリンメシラート、塩酸イソプロテレノール、および5’−N−メチル カルボキサミドアデノシンから成る群から選択される、請求項94記載の方法。
【請求項97】
該培地が少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項95記載の方法。
【請求項98】
該増殖因子が以下から成る群から選択される、請求項97記載の方法:
ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片。
【請求項99】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項98記載の方法。
【請求項100】
該ErbB3リガンドは、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性剤(ARIA)、膠細胞成長因子2(GGF2)、感覚および運動神経由来の因子(SMDF)、ニューレグリン−2;エピレグリン、ビレグリン、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項101】
該TGF−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11、および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる、請求項98記載の方法。
【請求項102】
該IGF−1RのアクチベータがIGF−1、IGF−2、longR3−IGF1、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項103】
該FGF受容体のアクチベータがFGF−2、FGF−7、FGF−10、FGF−22、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項104】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片を含まない、請求項98記載の方法。
【請求項105】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンド、インシュリン様成長因子、それらの機能的な断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項106】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータ、TGF−βファミリーメンバー、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項105記載の方法。
【請求項107】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項106記載の方法。
【請求項108】
該培地がアデノシン、セロトニン、およびドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項107記載の方法。
【請求項109】
単独細胞集合体の懸濁液として、該人間の多分化能性幹細胞が培養される、請求項86記載の方法。
【請求項110】
該人間の多能性幹細胞が、実質的に正倍数体である、請求項109記載の方法。
【請求項111】
該化合物は、ノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項110記載の方法。
【請求項112】
該培地が少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項111記載の方法。
【請求項113】
該少なくとも1つの増殖因子が、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項112記載の方法。
【請求項114】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項112記載の方法。
【請求項115】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含み、人間の多分化能性幹細胞は標準の初期細胞濃度で培養される、請求項86記載の方法。
【請求項116】
該培地が少なくとも1つの増殖因子を含む請求項115記載の方法。
【請求項117】
該増殖因子がErbB3リガンド;TGF−βファミリーメンバー;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータ;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータ;それらの機能的な断片とそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項116記載の方法。
【請求項118】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータとそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項119】
該培地が外因のTGF−βファミリーメンバーとそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項120】
該培地が外因のErbB3リガンドとそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項121】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項122】
該少なくとも1つの増殖因子が、インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および任意の、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片の組み合わせから成る、請求項117記載の方法。
【請求項123】
該培地がノギンをさらに含む、請求項122記載の方法。
【請求項1】
神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗物質、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物を含む定義された細胞培地であって、
該培地内で培養された人間の多分化能性幹細胞のエキスパンションを分化することなくサポートする、定義された細胞培地。
【請求項2】
該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、コリン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン酸作動性、セロトニン作動性またはアデノシン受容体である、請求項1記載の定義された細胞培地。
【請求項3】
該神経伝達物質受容体がアドレナリン受容体である、請求項2記載の定義された細胞培地。
【請求項4】
該化合物が神経伝達物質受容体のアゴニストである、請求項2記載の定義された細胞培地。
【請求項5】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、ドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、およびそれらの生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項6】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、およびそれらの生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項5記載の定義された細胞培地。
【請求項7】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項6記載の定義された細胞培地。
【請求項8】
アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項7記載の定義された細胞培地。
【請求項9】
該化合物は、アセチルコリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項6記載の定義された細胞培地。
【請求項10】
該化合物は、アデノシン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項6記載の定義された細胞培地。
【請求項11】
さらにGABA、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩をさらに含む、請求項10記載の定義された細胞培地。
【請求項12】
該人間の多分化能性幹細胞が低い初期細胞濃度で培養される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項13】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項12記載の定義された細胞培地。
【請求項14】
該化合物がパラ−アミノクロニジンヒドロクロリド、イソタリンメシラート、塩酸イソプロテレノール、および5’−N−メチル カルボキサミドアデノシンから成る群から選択される、請求項12記載の定義された細胞培地。
【請求項15】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項13記載の定義された細胞培地。
【請求項16】
該増殖因子が以下から成る群から選択される、請求項15記載の定義された細胞培地:
ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片。
【請求項17】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項18】
該ErbB3リガンドは、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性剤(ARIA)、膠細胞成長因子2(GGF2)、感覚および運動神経由来の因子(SMDF)、ニューレグリン−2;エピレグリン、ビレグリン、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項19】
該TGF−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11、および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項20】
該IGF−1RのアクチベータがIGF−1、IGF−2、longR3−IGF1、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項21】
該FGF受容体のアクチベータがFGF−2、FGF−7、FGF−10、FGF−22、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項22】
該培地がFGF受容体の外因のアクチベータまたはそれらの機能的な断片を含まない、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項23】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンド;インシュリン様成長因子、それらの機能的な断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項16記載の定義された細胞培地。
【請求項24】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータ、TGF−βファミリーメンバー、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項23記載の定義された細胞培地。
【請求項25】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項24記載の定義された細胞培地。
【請求項26】
アデノシン、セロトニン、およびドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項25記載の定義された細胞培地。
【請求項27】
単独細胞集合体の懸濁液として、該多分化能性幹細胞が培養される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項28】
該組成物が実質的に倍数性状態の多分化能性幹細胞のエキスパンションをサポートする、請求項27記載の定義された細胞培地。
【請求項29】
該化合物は、ノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項28記載の定義された細胞培地。
【請求項30】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項29記載の定義された細胞培地。
【請求項31】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項30記載の定義された細胞培地。
【請求項32】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項30記載の定義された細胞培地。
【請求項33】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含み、人間の多分化能性幹細胞は標準の初期細胞濃度で培養される、請求項4記載の定義された細胞培地。
【請求項34】
少なくとも1つの増殖因子を含む請求項33の定義された細胞培地。
【請求項35】
該増殖因子がErbB3リガンド;TGF−βファミリーメンバー;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータ;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータ;それらの機能的な断片およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項34記載の定義された細胞培地。
【請求項36】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータとそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項37】
該培地が外因のTGF−βファミリーメンバーとそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項38】
該培地が外因のErbB3リガンドとそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項39】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項40】
該少なくとも1つの増殖因子が、インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および任意の、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片の組み合わせから成る、請求項35記載の定義された細胞培地。
【請求項41】
ノギンをさらに含む、請求項41記載の定義された細胞培地。
【請求項42】
以下を含む組成物:
a)神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗物質、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物を含む定義された細胞培地、並びに
b)人間の多分化能性幹細胞;
該定義された培地は、培地内で培養された人間の多分化能性幹細胞のエキスパンションを分化することなくサポートする。
【請求項43】
該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、コリン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン酸作動性、セロトニン作動性またはアデノシン受容体である、請求項42記載の組成物。
【請求項44】
該神経伝達物質受容体がアドレナリン受容体である、請求項43記載の組成物。
【請求項45】
該化合物が神経伝達物質受容体のアゴニストである、請求項43記載の組成物。
【請求項46】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、ドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項45記載の組成物。
【請求項47】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項46記載の組成物。
【請求項48】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項47記載の組成物。
【請求項49】
アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項48記載の組成物。
【請求項50】
それらの化合物は、アセチルコリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項45記載の組成物。
【請求項51】
該化合物は、アデノシン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項45記載の組成物。
【請求項52】
さらにGABA、それらの構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含む、請求項51記載の組成物。
【請求項53】
該人間の多分化能性幹細胞が低い初期細胞濃度で培養される、請求項43記載の組成物。
【請求項54】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項53記載の組成物。
【請求項55】
該化合物がパラ−アミノクロニジンヒドロクロリド、イソタリンメシラート、塩酸イソプロテレノール、および5’−N−メチル カルボキサミドアデノシンから成る群から選択される、請求項53記載の組成物。
【請求項56】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項54記載の組成物。
【請求項57】
該増殖因子が以下から成る群から選択される、請求項56記載の組成物:
ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片。
【請求項58】
該定義された培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項57記載の組成物。
【請求項59】
該ErbB3リガンドは、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性剤(ARIA)、膠細胞成長因子2(GGF2)、感覚および運動神経由来の因子(SMDF)、ニューレグリン−2;エピレグリン、ビレグリン、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項60】
該TGF−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11、および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる、請求項57記載の組成物。
【請求項61】
該IGF−1RのアクチベータがIGF−1、IGF−2、longR3−IGF1、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項62】
該FGF受容体のアクチベータがFGF−2、FGF−7、FGF−10、FGF−22、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項63】
該定義された培地がFGF受容体の外因のアクチベータまたはそれらの機能的な断片を含まない、請求項57記載の組成物。
【請求項64】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンド;インシュリン様成長因子、それらの機能的な断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項57記載の組成物。
【請求項65】
該定義された培地が外因のFGF受容体のアクチベータ、TGF−βファミリーメンバー、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項64記載の組成物。
【請求項66】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項65記載の組成物。
【請求項67】
アデノシン、セロトニン、およびドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項65記載の組成物。
【請求項68】
単独細胞集合体の懸濁液として、該人間の多分化能性幹細胞が培養される、請求項45記載の組成物。
【請求項69】
該人間の多能性幹細胞が、実質的に正倍数体である、請求項68記載の組成物。
【請求項70】
該化合物は、ノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項69記載の組成物。
【請求項71】
少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項70記載の組成物。
【請求項72】
該少なくとも1つの増殖因子が、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項71記載の組成物。
【請求項73】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項71記載の組成物。
【請求項74】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含み、人間の多分化能性幹細胞は標準の初期細胞濃度で培養される、請求項45記載の組成物。
【請求項75】
少なくとも1つの増殖因子を含む請求項74記載の定義された細胞培地。
【請求項76】
該増殖因子が、ErbB3リガンド;TGF−βファミリーメンバー;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータ;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータ;それらの機能的な断片およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項75記載の組成物。
【請求項77】
該定義された培地が外因のFGF受容体のアクチベータとそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項78】
該定義された培地が外因のTGF−βファミリーメンバーとそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項79】
該定義された培地が外因のErbB3リガンドとそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項80】
該定義された培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項76記載の組成物。
【請求項81】
該少なくとも1つの増殖因子が、インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および任意の、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片の組み合わせから成る、請求項76記載の組成物。
【請求項82】
ノギンをさらに含む、請求項81記載の組成物。
【請求項83】
人間の多分化能性幹細胞をエキスパンドさせるための方法であって、
神経伝達物質受容体のアゴニスト、拮抗物質、リガンド、およびモジュレータから成る群から選択された化合物を含む定義された細胞培地内で人間の多分化能性幹細胞を培養することを含み、該細胞が培養中に分割するが、分化しない方法。
【請求項84】
該神経伝達物質受容体は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、コリン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン酸作動性、セロトニン作動性またはアデノシン受容体である、請求項83記載の方法。
【請求項85】
該神経伝達物質受容体がアドレナリン受容体である、請求項84記載の方法。
【請求項86】
該化合物が神経伝達物質受容体のアゴニストである、請求項84記載の方法。
【請求項87】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、ドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項86記載の方法。
【請求項88】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、および生理的に許容できる塩から成る群から選択される、請求項87記載の方法。
【請求項89】
該化合物がノルエピネフリン、それらの構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項88記載の方法。
【請求項90】
該培地がアセチルコリン、アデノシン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項89記載の方法。
【請求項91】
該化合物は、アセチルコリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項88記載の方法。
【請求項92】
該化合物は、アデノシン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項88記載の方法。
【請求項93】
該培地がさらにGABA、それらの構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含む、請求項92記載の方法。
【請求項94】
該人間の多分化能性幹細胞が低い初期細胞濃度で培養される、請求項86記載の方法。
【請求項95】
該化合物がノルエピネフリン、アセチルコリン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項94記載の方法。
【請求項96】
該化合物がパラーアミノクロニジンヒドロクロリド、イソタリンメシラート、塩酸イソプロテレノール、および5’−N−メチル カルボキサミドアデノシンから成る群から選択される、請求項94記載の方法。
【請求項97】
該培地が少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項95記載の方法。
【請求項98】
該増殖因子が以下から成る群から選択される、請求項97記載の方法:
ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片。
【請求項99】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項98記載の方法。
【請求項100】
該ErbB3リガンドは、ニューレグリン−1、ヘレグリン−P(HRG−P)、ヘレグリン−a(HRG−a)、Neu分化因子(NDF)、アセチルコリン受容体誘導活性剤(ARIA)、膠細胞成長因子2(GGF2)、感覚および運動神経由来の因子(SMDF)、ニューレグリン−2;エピレグリン、ビレグリン、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項101】
該TGF−βファミリーメンバーが、ノーダル、アクチビン A、アクチビン B、TGF−β、骨形成タンパク質−2(BMP2)、GDF−8、GDF−11、および骨形成タンパク質−4(BMP4)から成る群から選ばれる、請求項98記載の方法。
【請求項102】
該IGF−1RのアクチベータがIGF−1、IGF−2、longR3−IGF1、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項103】
該FGF受容体のアクチベータがFGF−2、FGF−7、FGF−10、FGF−22、およびそれらの機能的な断片から成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項104】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片を含まない、請求項98記載の方法。
【請求項105】
該少なくとも1つの増殖因子がErbB3リガンド、インシュリン様成長因子、それらの機能的な断片、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項98記載の方法。
【請求項106】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータ、TGF−βファミリーメンバー、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項105記載の方法。
【請求項107】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項106記載の方法。
【請求項108】
該培地がアデノシン、セロトニン、およびドーパミン、それらの構造類似体、誘導体、生理的に許容できる塩、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される化合物をさらに含む、請求項107記載の方法。
【請求項109】
単独細胞集合体の懸濁液として、該人間の多分化能性幹細胞が培養される、請求項86記載の方法。
【請求項110】
該人間の多能性幹細胞が、実質的に正倍数体である、請求項109記載の方法。
【請求項111】
該化合物は、ノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩である、請求項110記載の方法。
【請求項112】
該培地が少なくとも1つの増殖因子を含む、請求項111記載の方法。
【請求項113】
該少なくとも1つの増殖因子が、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片;TGF−βファミリーメンバーまたはそれらの機能的な断片;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;それらの組み合わせから成る群から選択される、請求項112記載の方法。
【請求項114】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項112記載の方法。
【請求項115】
該化合物がノルエピネフリン、その構造類似体、誘導体、または生理的に許容できる塩を含み、人間の多分化能性幹細胞は標準の初期細胞濃度で培養される、請求項86記載の方法。
【請求項116】
該培地が少なくとも1つの増殖因子を含む請求項115記載の方法。
【請求項117】
該増殖因子がErbB3リガンド;TGF−βファミリーメンバー;インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータ;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータ;それらの機能的な断片とそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項116記載の方法。
【請求項118】
該培地が外因のFGF受容体のアクチベータとそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項119】
該培地が外因のTGF−βファミリーメンバーとそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項120】
該培地が外因のErbB3リガンドとそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項121】
該培地が外因のインシュリン、インシュリン代用物、インスリン様活性剤、およびそれらの機能的な断片を含まない、請求項117記載の方法。
【請求項122】
該少なくとも1つの増殖因子が、インスリン様成長因子受容体(IGF−1R)のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;繊維芽細胞生長因子(FGF)受容体のアクチベータまたはそれらの機能的な断片;および任意の、ErbB3リガンドまたはそれらの機能的な断片の組み合わせから成る、請求項117記載の方法。
【請求項123】
該培地がノギンをさらに含む、請求項122記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【公表番号】特表2012−525148(P2012−525148A)
【公表日】平成24年10月22日(2012.10.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−508599(P2012−508599)
【出願日】平成22年4月27日(2010.4.27)
【国際出願番号】PCT/US2010/032601
【国際公開番号】WO2010/129294
【国際公開日】平成22年11月11日(2010.11.11)
【出願人】(511109799)バイアサイト インク (2)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成24年10月22日(2012.10.22)
【国際特許分類】
【出願日】平成22年4月27日(2010.4.27)
【国際出願番号】PCT/US2010/032601
【国際公開番号】WO2010/129294
【国際公開日】平成22年11月11日(2010.11.11)
【出願人】(511109799)バイアサイト インク (2)
【Fターム(参考)】
[ Back to top ]