修飾シクロスポリンの使用
肝臓疾患の予防または処置に有用な特性を有する、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非免疫抑制性シクロスポリンの新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロスポリンは、構造的に特徴的な、環状の、ポリ−Ｎメチル化ウンデカペプチドのクラスを含み、一般に、薬理学的活性、とりわけ免疫抑制性または抗炎症性活性を有する。シクロフィリンと強力に結合するが、免疫抑制性でないシクロスポリンが同定されている。WO2005021028 A1は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する阻害効果を有する非免疫抑制性シクロスポリンの使用を開示している。
【０００３】
シクロスポリンは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてシクロスポリンＡの活性の５％以下、好ましくは２％以下の活性を有するとき、非免疫抑制性であると考えられる。混合リンパ球反応は、T. Meoによって“Immunological Methods”, L. Lefkovits and B. Peris, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227 - 239 (1979)に記載されている。Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、８−１０週齢）の脾臓細胞（０．５×１０６個）を５日間、ＣＢＡマウス（メス、８−１０週齢）の放射線照射（２０００ｒｅｄｓ）またはマイトマイシンＣ処理脾臓細胞０．５×１０５個と共にインキュベートする。放射線照射同種細胞はＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞の増殖性反応を誘導し、これはＤＮＡへの標識化前駆体取り込みによって測定することができる。刺激細胞は放射線照射（またはマイトマイシンＣ処理）されているので、Ｂａｌｂ／ｃ細胞に増殖的反応をせず、抗原性を保持する。ＭＬＲにおいて試験化合物について測定したＩＣ５０を、並行試験においてシクロスポリンＡについて測定したものと比較する。さらに、非免疫抑制性シクロスポリンはＣＮおよび下流ＮＦ−ＡＴ経路の阻害能を欠く。
【０００４】
繊維症は、修復または反応プロセスとしての、臓器または組織における過剰な繊維性結合性組織の形成または発達である。繊維症の１つの形態である肝硬変は、繊維性瘢痕（scar）組織および再生性結節（nodule）による肝臓組織の置換によって特徴付けられる慢性肝臓疾患の結果であり、肝機能の進行的喪失を導く。肝星細胞（ＨＳＣ）は、特徴的な星状形態を有し、Disse類洞周囲腔に存在する肝臓非実質細胞である。肝臓傷害後、ＨＳＣは活性化筋繊維芽表現型に分化転換を起こして、α平滑筋アクチンを発現する。次に活性化ＨＳＣは増殖し、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質を生産する。シクロスポリンＡ（cyclosporine）およびタクロリムスのような免疫抑制剤の、ＨＳＣにおける細胞増殖およびコラーゲン生産に対するこれまでの評価は、シクロスポリンは細胞増殖およびコラーゲン生産を抑制するが、タクロリムスはかかる効果を有さないというものであり、これはシクロスポリンが潜在的に抗繊維形成効果を有することを示している。
【０００５】
現在利用可能な抗繊維治療は、繊維形成を制圧するよりもむしろ、肝炎の抑制に向けられている。治療的介入の要点は、傷害性刺激を除去し、肝炎を抑制し、星状細胞活性化を下方制御し、マトリックス分解を促進する努力を含む必要がある。
【０００６】
したがって、本発明は、グラフト−肝硬変、慢性肝炎、肝硬変、肝臓がん、例えば肝細胞癌腫のような肝臓疾患またはその進行の予防または処置における、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンの使用を提供する。さらに、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンは、例えば先天性肝繊維症を有する新生児または移植レシピエント、例えば臓器もしくは組織移植、例えば肝臓移植レシピエントの予防的処置として、使用することもできる。
【０００７】
シクロスポリンは、Quesniaux in Eur. J. Immunol. 1987 17 1359 1365に記載の競合ＥＬＩＳＡ試験において、シクロスポリンＡの少なくとも５分の１ヒト組換えシクロフィリンと結合すれば、シクロフィリン結合性であると考えられる。この試験において、試験するシクロスポリンをシクロフィリンと被覆ＢＳＡ−シクロスポリンＡのインキュベーション中に加え、そして競合剤なしでの対照反応の５０％阻害を与える濃度（ＩＣ５０）を計算する。この結果を、試験化合物のＩＣ５０とシクロスポリンＡそれ自体の刺激試験におけるＩＣ５０の比の、１０を底とした対数である結合比（ＢＲ）として表現する。したがって、ＢＲ １．０は、試験化合物がヒトシクロフィリンと、シクロスポリンＡの１０倍低い倍率で結合することを示し、負の値はシクロスポリンＡのものよりも強く結合することを示している。ＨＣＶに対して活性なシクロスポリンは、０．７未満、好ましくは０以下のＢＲを有する。
【０００８】
免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンの例は、例えば式Ｉ
【化１】
〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔまたはＯ−アセチル−ＭｅＢｍｔ１であり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；
ＲはＰｒｏ、Ｓａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａまたは（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；
ＹはＭｅＬｅｕ、チオＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり；
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｔ１は（Ｄ）ＡｌａまたはＬｙｓであり；
Ｔ２はＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；そして
Ｔ３はＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである〕
の化合物を含む。
【０００９】
好ましい式Ｉの化合物は、例えば式Ｉａ
【化２】
〔式中、
Ｗ’はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；
Ｒ’はＳａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａまたは（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；
Ｙ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、Ｍｅｌｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり；
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そして
Ｑ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである〕
の化合物である。
【００１０】
基Ｗ’、Ｘ、Ｙ’、Ｚ、Ｑ’およびＲ’は独立して、下記の好ましい意味を有する：
Ｗ’は好ましくはＷ”であり、ここでＷ”はＭｅＢｍｔまたはジヒドロ−ＭｅＢｍｔである；
Ｘは好ましくはＸ’であり、ここでＸ’はαＡｂｕまたはＮｖａであり、より好ましくはＸ”であり、ここでＸ”はαＡｂｕである；
Ｒ’は好ましくはＲ”であり、ここでＲ”はＳａｒである；
Ｙ’は好ましくはＹ”であり、ここでＹ”はγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＩｌｅ、Ｎ−エチルＩｌｅまたはＮ−エチルＶａｌである；
Ｚは好ましくはＺ’であり、ここでＺ’はＶａｌまたはＭｅＶａｌである；そして
Ｑ’は好ましくはＱ”であり、ここでＱ”はＭｅＬｅｕである。
【００１１】
式Ｉａの化合物の好ましい群は、Ｗ’がＷ”であり、ＸがＸ’であり、Ｙ’がＹ”であり、ＺがＺ’であり、Ｑ’がＱ”であり、そしてＲ’がＲ”であるものである。
【００１２】
式Ｉａの化合物の好ましい例は、例えば：
ａ）［ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ］１−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン； BR＊ = 0.1; IR<1%
ｂ）［ＭｅＶａｌ］４−シクロスポリン； BR = 0.1; IR<1%
ｃ）［ＭｅＩｌｅ］４−シクロスポリン； BR = -0.2; IR<1%
ｄ）［ＭｅＴｈｒ］４−シクロスポリン
ｅ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン； BR =0.4; IR<1%
ｆ）［エチル−Ｉｌｅ］４−シクロスポリン； BR = 0.1; IR<2%
ｇ）［エチル−Ｖａｌ］４−シクロスポリン； BR = 0; IR<2%
ｈ）［Ｎｖａ］２−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン；
ｉ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］６−シクロスポリン；
ｊ）［ＭｅＶａｌ］５−シクロスポリン； BR = 0.4; IR = 5.3%
ｋ）［ＭｅＯＴｈｒ］２−［（Ｄ）ＭｅＡｌａ］３−［ＭｅＶａｌ］５−シクロスポリン；
ｊ）［８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔ］１−シクロスポリン、BR = 0.35; IR=1.8%
ｋ）［ＭｅＡｌａ］６−シクロスポリン； BR = -0.4; IR= 3.2
Ｉ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］９−シクロスポリン； BR = 0.15; IR = 2.9
である。
ＩＲ＝免疫抑制比、シクロスポリンＡに対する活性の割合として表現される。
【００１３】
非免疫抑制性シクロスポリンのさらなる例は、WO 98/28330、WO 98/28329およびWO 98/28328（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）に記載の化合物、例えば式ＩＩ
【化３】
〔式中、Ｗａは
【化４】
｛式中、Ｒａは式ＩｃまたはＩｄ
【化５】
（式中、Ｒ４はＣ１−４アルキルチオ、アミノＣ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルアミノＣ１−４アルキルチオ、ジＣ１−４アルキルアミノ−Ｃ１−４アルキルチオ、ピリミジニルチオ、チアゾリルチオ、Ｎ−Ｃ１−４アルキルイミダゾリルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェニルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェノキシ、ニトロフェニルアミノまたは２−オキソピリミジン−１−イルであり、そしてＲ’４はＣ１−４アルキルである）
の基である｝
であり；
ＸａはＡｂｕであり；
【００１４】
Ｒａは−ＮＭｅ−ＣＨ（Ｒｂ）−ＣＯ−｛ここで、ＲｂはＨまたは−Ｓ−Ａｌｋ−Ｒ０であり、ここでＡｌｋ−Ｒ０はメチルであるか；またはＡｌｋは直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２−６アルキレンまたはＣ３−６シクロアルキレンであり、Ｒ０はＨ；ＯＨ；ＣＯＯＨ；Ｃ２−５アルコキシカルボニル；ＮＲ１Ｒ２であり、ここでＲ１およびＲ２は各々独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキルおよびフェニル（各々所望によりハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ２−５アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノおよび／またはジＣ１−４アルキル−アミノで置換されていてもよい）、ならびにベンジルおよびヘテロ環式基（当該ベンジルおよびヘテロ環式基は飽和または不飽和であり、５〜６個の環員と１〜３個のヘテロ原子を含む）から選択されるか、またはＲ１とＲ２はそれらが結合している窒素原子と一体となって、４−６員ヘテロ環（これは窒素、酸素および硫黄から選択される他のヘテロ原子を含んでいてもよく、そして所望によりＣ１−４アルキル、フェニルまたはベンジルで置換されている）を形成するか；またはＲ１およびＲ２は各々独立して、式Ｉｂ
【化６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記定義のとおりであり、Ｒ３はＨまたはＣ１−４アルキルであり、ｎは２〜４の整数である）の基である｝
であり、
ＹａはＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；
ＺａはＶａｌであり；そして
ＱａはＭｅＬｅｕである、ただし、ＹａがＭｅＬｅｕであるとき、ＲｂはＨではない〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００１５】
式ＩＩにおいて、Ｒ１および／またはＲ２がヘテロ環式基であるとき、これはピリジル、テトラヒドロ−ピリジル、ピペリジル、イミダゾリル、オキサゾリルまたはチアゾリルであり得る。Ｒ１とＲ２がそれらが結合している窒素原子と共にヘテロ環式基を形成するとき、一例として、該ヘテロ環式基はアゼチジニル、ピペリジル、ピペラジニル、Ｎ−メチル−ピペラジニル、Ｎ−フェニルピペラジニル、Ｎ−ベンジルピペラジニル、ピリジル、イミダゾリル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロピリジル、メチルテトラヒドロピリジル（例えば４−メチル−テトラヒドロピリジル）またはフェニルテトラヒドロピリジル（例えば４フェニルテトラヒドロピリジル）から選択され得る。
【００１６】
式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を、以下のとおり分類され得る多様な方法で得ることができる：
１）発酵
２）生体内変化
３）誘導体化
４）部分合成
５）全合成
（例えばEP 0 484 281 A1、WO 00/01715、WO 98/28330、WO 98/28329またはWO 98/28328に記載されている。それらの内容を、出典明示により本明細書の一部とする）。
【００１７】
一連のさらなる具体的なまたは別の態様において、本発明はまた、以下のものを提供する：
１．１ それを必要とする対象における肝臓疾患に関連した状態を予防または処置する方法であって、当該対象に治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を投与することを含む方法。
【００１８】
本発明によって、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンは、肝臓疾患に関連した兆候、症状または状態の１つ以上を緩解するか、または消失させるのに有効な量、例えば対象の生検サンプルにおいて測定したコラーゲン生産を抑制するのに有効な量で、投与することができる。
【００１９】
１．２ 培地におけるＨＳＣ増殖を抑制する方法であって、この培地に有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を適用することを含む方法。
【００２０】
１．３ それを必要とする対象における肝臓疾患に関連した状態を抑制する方法であって、当該対象に治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を投与することを含む方法。
【００２１】
１．４ それを必要とする移植レシピエントにおける肝臓疾患に関連した状態の再発を予防または処置する方法であって、当該レシピエントに治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を投与することを含む方法。
【００２２】
２． 上記定義の何れかの方法に使用する医薬組成物の製造における、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物の使用。
【００２３】
３． 上記定義の何れかの方法に使用するための医薬組成物であって、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物と、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【００２４】
上記疾患および状態の処置における非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン（以下、「本発明のシクロスポリン」）の有用性を、標準的な動物試験または臨床試験で、例えば下記方法によって示すことができる。
【００２５】
Ａ．インビトロ細胞培養：
ＨＳＣは、オスWistarラットの肝臓から、Kato, et al, J. Hepatol (1999) 31:91-99に記載に従い、インサイチュコラゲナーゼ灌流、プロナーゼ消化、次いで２層化（１７％／１１．５％）したメトリザミド溶液（Sigma Chemical, St. Louis, MO）中での遠心分離を行う一連の操作で単離する。ＨＳＣは、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むDulbecco修飾Eagle培地（ＤＭＥＭ）中で培養する。実験は、第３と第４連続継代間の細胞で行う。マウスマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−１）およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を測定するため、Shibata, et al, Cell Transplant (2003) 12:499-507に従って作成したＨＳＣ由来のヒト細胞系であるＴＷＮＴ−４細胞を、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１に対するＦａｓｕｄｉｌの効果を評価するために用いる。ＴＷＮＴ−４細胞を前出（Ｉｄ）のとおり、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養する。ＮＩＭ８１１（Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland）をＤＭＥＭに溶解させ、培養物に加える。ＨＳＣの細胞生存率は、無血清条件下、２４時間、２μＭ ＮＩＭ８１１の存在下で、９０％を超える。
【００２６】
タイプ１コラーゲンアッセイ： 培養したＨＳＣを、無血清培地中、ＮＩＭ８１１の存在下または非存在下で２４時間インキュベートする。培養培地中のタイプＩコラーゲンを、Iwamoto, et al, J. Hepatol (2000) 32:762-770に記載のとおり、ＥＬＩＳＡによって測定する。抗ラットタイプＩコラーゲン抗体（LSL, Tokyo, Japan）を１次抗体として使用することができる。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Organon Teknika Corporation, Durham, NC）を２次抗体として用いる。ラット尾腱コラーゲンタイプＩ（Advance Biofactures Corporation, Lymbrook, NY）を標準的な対照として用いる。
【００２７】
ＭＭＰ−１、ＴＩＭＰ−１およびコラゲナーゼアッセイ： 培養したＴＷＮＴ−４細胞を、無血清培地中、ＮＩＭ８１１の存在下または非存在下で２４時間インキュベートする。培養培地中のＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１生産を、Fukushima, et al, Liver Int (2005) 25:829-838に記載の方法に従って、ヒトＭＭＰ−１のためのBiotrak ＥＬＩＳＡシステム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）およびｈＴＩＭＰ−１キット（Daiichi Fine Chemical Co. Ltd., Toyama, Japan）によるＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定する。培養培地中の活性ＭＭＰ−１およびプロ−ＭＭＰ−１を、ＭＭＰ−１ Biotrak Activity Assay System （Amersham）で測定する。
【００２８】
実時間ＲＴ−ＰＣＲを使用した遺伝子発現分析： 全ＲＮＡをＴＷＮＴ−４細胞から、Trizol剤（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で製造し、これをＮＩＭ８１１の存在下または非存在下、１０％ＦＣＳ中で２４時間維持する。ｃＤＮＡを１．０ｍｇ ＲＮＡから、GeneAmp（商標）ＲＮＡ ＰＣＲ（Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA）で、ランダムヘキサマーを用いて合成する。実時間ＰＣＲをLightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1 （Roche, Tokyo, Japan）を用いて、Nakamuta, et al, Int J. Mol Med (2005) 16(4):631-635に記載のとおりに行う。LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μＭの上流および下流ＰＣＲプライマー、ならびにテンプレートとして２ｍｌの第１ストランドｃＤＮＡを含む反応混合物（２０μｌ）を用いる。反応の変化を制御するため、すべてのＰＣＲを、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現に対して正規化する。使用できるプライマーは下記のとおりである：ヒトタイプＩコラーゲンａ１鎖について、５’−ＡＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＡＡＣＡＧ−３’（フォワードプライマー）（配列番号１）および５’−ＣＴＣＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡ−３’（リバースプライマー）（配列番号２）（GenBank（商標）受託番号NM-000088）（２１）；ヒトａ−ＳＭＡについて、５’−ＡＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＣ−３’（フォワードプライマー）（配列番号３）および５’−ＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡ−３’（リバースプライマー）（GenBank（商標）受託番号NM-000088）；ＭＭＰ−１について、５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＴＣＣＴ−３’（フォワードプライマー）および５’−ＴＣＣＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＧＴＧ−３’（リバースプライマー）（GenBank（商標）受託番号NM002421）；ＴＩＭＰ−１について、５’−ＴＴＣＴＧＣＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＴ−３’（フォワードプライマー）および５’−ＴＣＣＧＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＧＡＧＴ−３’（リバースプライマー）（配列番号４）（GenBank（商標）受託番号NM003254）；Ｓｍａｄ７について、５’−ＧＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣＧＧ−３’（フォワードプライマー）（配列番号５）および５’−ＣＡＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＣＡ−３’（リバースプライマー）（配列番号６）（Quan, et al, J Biol Chem (2005) 80:8079-8085）；形質転換増殖因子β受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）について、５’−ＧＧＣＣＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＣ−３’（フォワードプライマー）（配列番号７）および５’−ＧＧＧＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＣＣ−３’（リバースプライマー）（配列番号８）（Woszcyk et al, Med Sci Monit (2004) 10:C33C37)）。
【００２９】
ＢｒｄＵ取り込み分析： ＢｒｄＵのＨＳＣ取り込みを、Higashi, et al, J. Lab Clin Med (2005) 145(6):316-322に記載のとおり、細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて測定する。簡単に言うと、亜コンフルエントのＨＳＣを、２４時間血清欠乏にする。次にこれをＤＭＥＭで洗浄して、ＢｒｄＵと共に、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、ＮＩＭ８１１の存在下または非存在下で２４時間インキュベートする。細胞をＢｒｄＵで標識化した後、細胞ＤＮＡを消化し、ペルオキシダーゼと結合した抗ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベートする。ＢｒｄＵ取り込みを、上清の蛍光強度を４５０ｎｍ（励起）および６９０ｎｍ（放出）で測定して評価する。
【００３０】
アポトーシス分析： ＨＳＣをＮＩＭ８１１の存在下または非存在下、無血清条件で２４時間維持する。細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中、室温で３０分間固定し、０．２％Triton X-100を含むＰＢＳ中、４℃で５分間透過処理する。細胞をHoechst 33342で染色し、In Situ Cell Death Detection Kit（Roche）を用い、製造業者の指示に従って、ＴＵＮＥＬ法によって分析する。サンプルを、LSM 510共焦点レーザー走査顕微鏡（Zeiss）で可視化する。３つの独立した実験、そして３つの異なる細胞調製物から、少なくとも１００個の細胞が、各条件について測定される。
【００３１】
リン酸化および非リン酸化−ＭＡＰＫについてのウェスタンブロット分析： ウェスタンブロット分析を、Uchimura, et al, Hepatology (2001) 33:91099に記載のとおりに行う。ＨＳＣを２４時間飢餓状態にし、次にＮＩＭ８１１を用いまたは用いることなく、２時間処理する。１×１０７個のＴＷＮＴ−４細胞を含む全細胞溶解物を、１００μｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで調製する。タンパク質溶解物を１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、二フッ化ポリビニリデン膜（Millipore, Bedford, MA）に移し、そしてＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、リン酸化−ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＪＮＫ、リン酸化−ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、ｐ３８ ＭＡＰＫ、またはリン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）（New England Biolabs, Beverly, MA）について、１次抗体で探索する。結合抗体を、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を２次抗体として用いて検出する。ブロットをＥＣＬ−プラス（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて検出して、抗体を可視化する。ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、リン酸化−ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、リン酸化−ＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびリン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫのレベルを、光学走査系を用いたデンシトメトリーによって定量する。比較のために、リン酸化ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫの非リン酸化ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫに対する比それぞれを、濃度測定データから計算する。
【００３２】
リン酸化および非リン酸化−Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３についてのウェスタンブロット分析： ウェスタンブロット分析を、ＭＡＰＫ分析について上記のとおりに行い、Ｓｍａｄ２、リン酸化−Ｓｍａｄ２（Ｔｈｒ／Ｔｙｒ）、Ｓｍａｄ３またはリン酸化Ｓｍａｄ３（Ｔｈｒ／Ｔｙｒ）について１次抗体で探索する（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）。比較として、リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の非リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３に対する比それぞれを、濃度測定データから計算する。
【００３３】
統計的分析： 全ての結果を、平均±ＳＥＭとして示す。片側ＡＮＯＶＡ、続いてＳｃｈｅｆｆ検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて、比較を行う。
【００３４】
実施例１ タイプＩコラーゲン蓄積、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１生産、ならびにコラゲナーゼ活性化に対するＮＩＭ８１１の効果
ＨＳＣによるＥＣＭ生産に対するＮＩＭ８１１の効果を評価するため、上記のとおり多くのラットＨＳＣを調節した後、培養培地中のタイプＩコラーゲン濃度を測定する。高濃度のＮＩＭ８１１、およびシクロスポリンＡ（cyclosporine）での細胞の処理は、コラーゲン蓄積の濃度依存的抑制を導く；０．５μＭ ＮＩＭ８１１は、コラーゲン蓄積を約５０％減少させる。この抑制は、ＮＩＭ８１１での処置によってコラーゲン発現が抑制されるので、少なくとも転写よりも上流で制御される。Nakamuta, et al, Transplant Proc (2005) 37:4598-4602において既に報告されたとおり、シクロスポリンは０．１２５μＭ（１５０ｎｇ／ｍｌ）の臨床的に妥当な（clinically relevant）濃度で、コラーゲン濃度を約５０％減少させるが、タクロリムスは１２．５ｎＭ（１０ｎｇ／ｍｌ）の臨床的に妥当な濃度でコラーゲン生産を顕著に低減させない。コラーゲン生産の速度によって決定されることに加えて、コラーゲン蓄積は、コラゲナーゼ活性によって、すなわちＭＭＰ１とＴＭＩＰ−１間のバランスによって制御される。ＮＩＭ８１１は、コラゲナーゼ活性（活性ＭＭＰ−１）およびプロ−ＭＭＰ−１レベルの濃度依存的増加を導き；０．５μＭ ＮＩＭ８１１の存在下で、コラゲナーゼ活性はおよそ２倍増加する。しかし、ＮＩＭ８１１は２．０μＭの濃度ですら、ＴＩＭＰ−１生産を顕著に低減させない。
【００３５】
実施例２ タイプ１コラーゲン、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１遺伝子発現に対するＮＩＭ８１１の効果
タイプＩコラーゲン、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１のｍＲＮＡレベルに対するＮＩＭ８１１またはシクロスポリンの効果を評価するため、本明細書に記載のとおりＲＴ−ＰＣＲを行う。タイプＩコラーゲンの発現は、０．５μＭ ＮＩＭ８１１の存在下でおよそ３０％減少する。対照的に、０．５μＭ ＮＩＭ８１１によって、ＭＭＰ−１の発現がほぼ２倍増進するが、ＴＩＭＰ−１のそれは変化しなかった。これらの結果は、遺伝子発現に対するＮＩＭ８１１の効果は、そのタンパク質生産に対する効果と同様であることを示している。
【００３６】
実施例３ 細胞増殖およびアポトーシスに対するファスジルの効果
前の研究によって、コラーゲン生産の刺激に加えて、活性化ＨＳＣはＭＭＰ−１のような間質性コラゲナーゼによる間質性コラーゲンの分解を阻害することが示されており、このことはマトリックス分解が繊維症の進行中に阻害されることを示している（Benyon, et al, Gastroenterology (1996) 110:821-831、Iredale, et al, Hepatology (1996) 24:17-184、Iredale, et al, J. Clin Invest (1992) 90:282287参照）。ＴＩＭＰ−１は、マトリックス分解の阻害とは独立して、細胞増殖およびアポトーシスを制御することが報告されている（Murphy, et al, J. Biol Chem (2002) 277:1106911076参照）。ＮＩＭ８１１は濃度依存的様式で、アポトーシスなしにＨＳＣの細胞増殖を抑制する。
【００３７】
細胞増殖に対するＮＩＭ８１１の効果を試験するため、ＢｒｄＵ取り込みを本明細書に記載のとおり測定する。定量的分析によって、２．０μＭ ＮＩＭ８１１処理によって新規ＤＮＡ合成がおよそ３０％減少するが、より低い濃度ではそうでないことが示される。さらに、２μＭ ＮＩＭ８１１の存在下で、アポトーシスは観察されない。本発明者らの結果は、ＮＩＭが、コラーゲン生産の抑制およびコラゲナーゼ活性の増加のために、肝臓繊維症についての治療能を有することを示している。
【００３８】
実施例４ ＭＡＰＫシグナル伝達に対するＮＩＭ８１１の効果
ＮＩＭ８１１によってコラーゲン生産および細胞増殖が抑制され、コラゲナーゼ活性が増加する機構を調査するため、ＨＳＣにおいてコラーゲン生産および細胞増殖に重要な役割を果たすＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８を含むＭＡＰＫのような細胞間シグナル伝達カスケード（Marr, et al, Hepatology (2000) 1:428-434）に対するＮＩＭ８１１の効果を、上記のとおり評価する。ＮＩＭ８１１は濃度０．５μＭでＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を、それぞれ３．６倍および２．３倍増加させる。ＮＩＭ８１１での処置は、濃度上昇的にＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を顕著に増加させるが、ＥＲＫ１／２を抑制しない。シクロスポリンがその免疫抑制効果を、ＪＮＫおよびｐ３８についてカルシニューリン依存性ＮＦＡＴ経路とカルシニューリン非依存性活性化経路の両方によって示すことは、既に示されている（Mastuda, et al, EMPO Reports (2000) 1:428-434）。シクロスポリンＡ（cyclosporine）アナログであるＮＩＭ８１１は、シクロフィリンＡと結合しないため、ＮＦＡＴ経路を活性化しない（Waldmeier, et al, Mol Pharmacol, (2002) 62(1):22-29）。ＮＩＭ８１１とシクロスポリンＡ（cyclosporine）間のＪＮＫおよびｐ３８に対する効果の差は、ＮＩＭ８１１においてＮＦＡＴ経路が存在しないことに由来するかも知れない。
【００３９】
実施例５ ＴＧＦβシグナル伝達経路に対するＮＩＭ８１１の効果
ＭＡＰＫに加えて、ＴＧＦ−βシグナル伝達カスケードは、ＨＳＣのコラーゲン生産を強力に刺激する（Friedman, et al, J Biol Chem (1994) 269:10551-10558）。ＴＧＦ−βは細胞膜でＴＧＦβＲＩＩと結合し、次にＴＧＦβＲＩＩはグリシン／セリンリッチドメインに位置するセリンおよびスレオニン残基でＴＧＦβＲＩをリン酸化する（Wrana, et al, サイトカイン Growth Factor Rev (2000) 11:5-13）。リン酸化されたＴＧＦβＲＩは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３をＣ末端ＳＳＸＳモチーフでリン酸化し、これは共通のパートナーであるＳｍａｄ４と複合体を形成する。これらのＳｍａｄタンパク質は、核に移行し、コラーゲン（Ｉｄ）のような標的遺伝子の転写を活性化する。Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介するＴＧＦβシグナル伝達カスケードは、Friedman, et al , J Biol Chem (1994) 269:10551-10558に記載されたタイプＩコラーゲン遺伝子の発現を強く制御するので、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化に対するＮＩＭ８１１の効果が評価される。ＮＩＭ８１１での処理によって、濃縮様式でＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化が顕著に抑制され；０．５μＭ ＮＩＭ８１１はＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化を、それぞれおよそ７０％および６０％抑制する。Ｓｍａｄ７の発現は、ＴＧＦβＲＩＩリン酸化の阻害によってＴＧＦβシグナル伝達経路を負に制御する（Hayashi, et al, Cell (1997) 1165-1173）。０．５μＭ ＮＩＭ８１１によって、Ｓｍａｄ７の発現がおよそ２倍に増加し、ＴＧＦβＲＩをおよそ５０％抑制する。これらの結果は、ＮＩＭ８１１がＴＧＦβＲＩＩおよび／またはＴＧＦβＲ１キナーゼ活性を阻害し得ることを示唆している。Ｓｍａｄ７（Ｉｄ）、イムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）１２（４０）およびＳＡＲＡ（受容体活性化のためのＳｍａｄアンカー）（４１）は、ＴＧＦβＲに関連しており、ＴＧＦβシグナル伝達を制御する。ＮＩＭ８１１はＳｍａｄ７の発現を増進し、そしてＴＧＦＲＩのそれを抑制し、このことはＮＩＭ８１１がＴＧＦβシグナル伝達経路を、受容体レベルでの阻害によって少なくとも部分的に阻害することを示している。シクロスポリンＡ（cyclosporine）も、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ７およびＴＧＦβＲＩに対する同様の効果を有する（データは公開せず）。
【００４０】
上記のとおり、ＮＩＭ８１１はＪＮＫおよびｐ３８に対してシクロスポリンＡとは反対の効果を有するが、いずれもがコラーゲン生産および細胞増殖に対して同様の効果を示し、このことはＮＩＭおよびシクロスポリンＡが抗繊維形成効果、主としてＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害を示すことを示唆している。
【００４１】
シクロフィリンは、ペプチド結合アミノ末端のプロリンへのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ相互変換を触媒してタンパク質コンホメーションの変化を促進する、ＰＰＩアーゼファミリーである（Waldmeier, supra）。１０個以上のシクロフィリンサブタイプが存在しており、それらは、転写制御、免疫応答、タンパク質分泌およびミトコンドリア機能を含む多様な細胞プロセスに関与している（Waldmeier supra, Duina, et al, Science (1996) 274:1713-1715）。Watashi et al., Hepatology (2003) 38:1282-1288は、近年、ＮＩＭ８１１がインビトロでのＨＣＶ複製を抑制するが、一方タクロリムスはこの効果を示さないことを報告した。ＮＩＭ８１１はシクロフィリンＡ（１４）との結合能を欠くため、ＮＩＭ８１１はシクロフィリンＢまたはＤのような他のシクロフィリンとの結合によって薬理学的効果を示すと考えられる。特に、ＮＩＭ８１１は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの機能的レギュレーターであるシクロフィリンＢとの結合を介して、抗ウイルス効果を示す（Watashi, et al, Mol Cell (2005) 19:111-122）。ＮＩＭ８１１は、ミトコンドリア透過性転移を制御するシクロフィリンＤとの相互作用の阻害に基づいて、細胞保護作用を有することも報告されている（Waldmeier, et al, Mol Pharmacol (2002) 62:22-29）。Kon et al, Hepatology (2004) 40:1170-1179は、ＮＩＭ８１１がアセトアミノフェン誘導性壊死および培養マウス肝細胞のアポトーシスを阻止すると報告した。
【００４２】
Ｂ．臨床試験
肝繊維症／肝硬変を有する計１５患者を、２週間の試験に組み込む。核患者に本発明のシクロスポリン、例えば［Ｍｅｌｌｅ］４−シクロスポリンを７〜１５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与する。Ｃ型肝炎抗原の血清レベルを各患者において０日目〜１４日目に測定する。
【００４３】
肝繊維症／肝硬変、とりわけ肝傷害を有する患者は、下記兆候または症状の１種以上を示し得る：（ａ）ＡＬＴの上昇、（ｂ）抗ＨＣＶ抗体試験で陽性、（ｃ）ＨＣＶ−ＲＮＡについての陽性試験によって示されるＨＣＶの存在、（ｄ）慢性肝疾患の臨床的兆候、（ｅ）肝細胞損傷。かかる基準は肝炎性肝繊維症／肝硬変の診断に使用できるのみならず、薬剤処置に対する患者の応答を評価するために使用することもできる。
【００４４】
血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇は、非制御Ｃ型肝炎において生じることが知られており、処置に対する完全応答は、一般に、これらの血清酵素、とりわけＡＬＴの正常化として定義される（Davis et al., 1989, New Eng. J. Med. 321:1501 - 1506）。ＡＬＴは、肝細胞が破壊されると放出される酵素であり、ＨＣＶ感染の兆候である。
【００４５】
薬剤処置に応答する対象におけるＨＣＶ複製の経過を追跡するために、血清サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡを、例えばＨＣＶゲノムのＮ５３およびＮ５４非構造的遺伝子領域由来の２セットのプライマーを用いる重複（nested）ポリメラーゼ連鎖反応アッセイによって測定することができる。Farci et al., 1991, New Eng. J. Med. 325:98 - 104。Ulrich et al., 1990, J. Clin. Invest., 86:1609-1614。
【００４６】
肝臓生検サンプルの組織学的試験は、評価の第２の基準として使用することができる。例えば、Knodell et al., 1981, Hepatology 1:431-435参照、この組織学的活性指標（門脈炎症、ピースミール壊死もしくは架橋壊死、小葉傷害および繊維症）は、疾患活性のスコア方法を提供する。
【００４７】
本発明の方法を実施するのに必要な１日用量は、例えば使用する非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、宿主、投与形態、処置する状態の重症度に依存して変化する。好ましい１日用量範囲は、単回用量または複数回用量として、約１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００４８】
患者にとって好適な１日用量は、例えば経口または静脈内で１〜２０ｍｇ／ｋｇのオーダーである。経口投与に好適な単位投与形態は、約０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇの有効成分、例えば［ＭｅＩｌｅ］４−シクロスポリンと、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。
【００４９】
本発明のシクロスポリンを、何れかの常套の経路、とりわけ経腸的に、例えば経口的に、例えば飲用液、錠剤もしくはカプセル剤の形態で、または非経腸的に、例えば注射液または懸濁液の形態で、投与することができる。好ましい医薬組成物は、例えばUK 2,222,770 Aに記載のミクロエマルジョンを利用したものであってもよい。
【００５０】
本発明のシクロスポリンは、単独の有効成分として、または他の薬剤、例えば下記のものと組み合わせて投与することができる：抗ＨＣＶ活性を有する薬剤、例えばインターフェロン、例えばインターフェロン−α２ａまたはインターフェロン−α２ｂ、例えばＩｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａ、Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）もしくはＢｅｔａｆｅｒｏｎ（登録商標）、または水溶性ポリマーもしくはヒトアルブミンと結合したインターフェロン、例えばアルブフェロン、抗ウイルス剤、例えばリボビリン、ラミブジン、ＮＶ０８もしくはＮＭ２８３、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ヘリカーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼのようなＨＣＶコード化因子の阻害剤、もしくはかかる阻害剤のプロドラッグ、抗繊維剤、例えばＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えばイマチニブ、免疫調節剤、例えばミコフェノール酸、その塩もしくはプロドラッグ、例えばミコフェノール酸ナトリウムもしくはミコフェノール酸モフェチル、またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０または所望によりリン酸化されたそのアナログ、例えばEP627406A1、EP778263A1、EP1002792A1、WO02/18395、W002/76995、WO 02/06268、JP2002316985、WO03/29184、W003/29205、W003/62252 および W003/62248に記載のもの。
【００５１】
インターフェロンと水溶性ポリマーの複合体は、とりわけポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレンポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーとの複合体を含むことを意味する。ポリアルキレンオキシドに基づくポリマーとは別のものとして、実質的に非抗原性物質、例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物に基づくポリマー等を用いることができる。かかるインターフェロン−ポリマー複合体は、米国特許第4,766,106号、第4,917,888号、欧州特許出願第0 236987号、欧州特許出願第0 510 356号および国際公開公報第WO 95/13090号に記載されている。ポリマー性修飾によって抗原性応答が十分に減少するので、外来インターフェロンは完全に自己である必要はない。ポリマー複合体を製造するために使用するインターフェロンを、哺乳類抽出物、例えばヒト、反すう動物またはウシインターフェロンから製造するか、または組換え的に製造することができる。好ましいのは、ペグ化インターフェロンとしても知られているインターフェロンとポリエチレングリコールの複合体である。
【００５２】
とりわけ好ましいインターフェロンの複合体は、ペグ化アルファ−インターフェロン、例えばペグ化インターフェロン−α−２ａ、ペグ化インターフェロン−α−２ｂ；ペグ化コンセンサスインターフェロンまたはペグ化精製インターフェロン−α製品である。ペグ化インターフェロン−α−２ａは、例えば欧州特許第593868号に記載されており、例えばＰＥＧＡＳＵＳ（Hoffmann-La Roche）の商品名で商業的に入手可能である。ペグ化インターフェロン−α−２ｂは、例えば欧州特許第975,369号に記載されており、例えばＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ Ａｎ（Schering Plough）の商品名で商業的に入手可能である。ペグ化コンセンサスインターフェロンはWO 96/11953に記載されている。好ましいペグ化α−インターフェロンは、ペグ化インターフェロン−α２ａおよびペグ化インターフェロン−α−２ｂである。ペグ化コンセンサスインターフェロンも好ましい。
【００５３】
使用する共薬剤についての１日用量は、例えば使用する化合物、宿主、投与形態、および処置する状態の重症度に依存して変化する。例えば、ラミブジンは、１日用量１００ｍｇで投与することができる。
【００５４】
ペグ化インターフェロンを非経腸的に、１〜３回／週、好ましくは週１回、合計週間用量２，０００，０００〜１０，０００，０００ＩＵ、より好ましくは５，０００，０００〜１０，０００，０００ＩＵ、最も好ましくは８，０００，０００〜１０，０００，０００ＩＵの範囲で投与することができる。
【００５５】
上記に従って、本発明はさらにさらなる局面において、下記のものを提供する：
４．例えば上記定義の何れかの方法に使用するための医薬組合せ剤であって、ａ）非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物である第１の薬剤と、ｂ）共薬剤、例えば上記定義の第２の薬剤を含む、組合せ剤。
【００５６】
５．治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物と、共薬剤、例えば上記定義の第２の薬剤の、例えば同時的または逐次的共投与を含む、上記定義の方法。
【００５７】
「共投与」または「組合せ投与」等の用語は、本明細書において使用するとき、選択した治療薬剤を１人の患者に投与することを含み、そして該薬剤を必ずしも同じ投与経路または同時に投与する必要がない処置レジメンを含むことを意図する。
【００５８】
本発明の医薬組合せ剤の投与によって、薬学的有効成分を１種のみ適用する単独療法と比較して、有利な効果、例えば相乗的治療効果が得られる。好ましい相乗的組合せは、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンと、所望によりポリマーと複合化したインターフェロンとの組合せである。
【００５９】
さらに好ましい組合せは、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンとミコフェノール酸、その塩もしくはプロドラッグとの、またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０との組合せである。
【００６０】
［ＭｅＩｌｅ］４−シクロスポリンまたは［ＭｅＶａｌ］４−シクロスポリンが、本発明において使用するのに好ましい非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非免疫抑制性シクロスポリンの新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロスポリンは、構造的に特徴的な、環状の、ポリ−Ｎメチル化ウンデカペプチドのクラスを含み、一般に、薬理学的活性、とりわけ免疫抑制性または抗炎症性活性を有する。シクロフィリンと強力に結合するが、免疫抑制性でないシクロスポリンが同定されている。WO2005021028 A1は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する阻害効果を有する非免疫抑制性シクロスポリンの使用を開示している。
【０００３】
シクロスポリンは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）においてシクロスポリンＡの活性の５％以下、好ましくは２％以下の活性を有するとき、非免疫抑制性であると考えられる。混合リンパ球反応は、T. Meoによって“Immunological Methods”, L. Lefkovits and B. Peris, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227 - 239 (1979)に記載されている。Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、８−１０週齢）の脾臓細胞（０．５×１０６個）を５日間、ＣＢＡマウス（メス、８−１０週齢）の放射線照射（２０００ｒｅｄｓ）またはマイトマイシンＣ処理脾臓細胞０．５×１０５個と共にインキュベートする。放射線照射同種細胞はＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞の増殖性反応を誘導し、これはＤＮＡへの標識化前駆体取り込みによって測定することができる。刺激細胞は放射線照射（またはマイトマイシンＣ処理）されているので、Ｂａｌｂ／ｃ細胞に増殖的反応をせず、抗原性を保持する。ＭＬＲにおいて試験化合物について測定したＩＣ５０を、並行試験においてシクロスポリンＡについて測定したものと比較する。さらに、非免疫抑制性シクロスポリンはＣＮおよび下流ＮＦ−ＡＴ経路の阻害能を欠く。
【０００４】
繊維症は、修復または反応プロセスとしての、臓器または組織における過剰な繊維性結合性組織の形成または発達である。繊維症の１つの形態である肝硬変は、繊維性瘢痕（scar）組織および再生性結節（nodule）による肝臓組織の置換によって特徴付けられる慢性肝臓疾患の結果であり、肝機能の進行的喪失を導く。肝星細胞（ＨＳＣ）は、特徴的な星状形態を有し、Disse類洞周囲腔に存在する肝臓非実質細胞である。肝臓傷害後、ＨＳＣは活性化筋繊維芽表現型に分化転換を起こして、α平滑筋アクチンを発現する。次に活性化ＨＳＣは増殖し、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質を生産する。シクロスポリンＡ（cyclosporine）およびタクロリムスのような免疫抑制剤の、ＨＳＣにおける細胞増殖およびコラーゲン生産に対するこれまでの評価は、シクロスポリンは細胞増殖およびコラーゲン生産を抑制するが、タクロリムスはかかる効果を有さないというものであり、これはシクロスポリンが潜在的に抗繊維形成効果を有することを示している。
【０００５】
現在利用可能な抗繊維治療は、繊維形成を制圧するよりもむしろ、肝炎の抑制に向けられている。治療的介入の要点は、傷害性刺激を除去し、肝炎を抑制し、星状細胞活性化を下方制御し、マトリックス分解を促進する努力を含む必要がある。
【０００６】
したがって、本発明は、グラフト−肝硬変、慢性肝炎、肝硬変、肝臓がん、例えば肝細胞癌腫のような肝臓疾患またはその進行の予防または処置における、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンの使用を提供する。さらに、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンは、例えば先天性肝繊維症を有する新生児または移植レシピエント、例えば臓器もしくは組織移植、例えば肝臓移植レシピエントの予防的処置として、使用することもできる。
【０００７】
シクロスポリンは、Quesniaux in Eur. J. Immunol. 1987 17 1359 1365に記載の競合ＥＬＩＳＡ試験において、シクロスポリンＡの少なくとも５分の１ヒト組換えシクロフィリンと結合すれば、シクロフィリン結合性であると考えられる。この試験において、試験するシクロスポリンをシクロフィリンと被覆ＢＳＡ−シクロスポリンＡのインキュベーション中に加え、そして競合剤なしでの対照反応の５０％阻害を与える濃度（ＩＣ５０）を計算する。この結果を、試験化合物のＩＣ５０とシクロスポリンＡそれ自体の刺激試験におけるＩＣ５０の比の、１０を底とした対数である結合比（ＢＲ）として表現する。したがって、ＢＲ １．０は、試験化合物がヒトシクロフィリンと、シクロスポリンＡの１０倍低い倍率で結合することを示し、負の値はシクロスポリンＡのものよりも強く結合することを示している。ＨＣＶに対して活性なシクロスポリンは、０．７未満、好ましくは０以下のＢＲを有する。
【０００８】
免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンの例は、例えば式Ｉ
【化１】
〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔまたはＯ−アセチル−ＭｅＢｍｔ１であり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；
ＲはＰｒｏ、Ｓａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａまたは（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；
ＹはＭｅＬｅｕ、チオＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり；
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；
ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＡｌａまたはＰｒｏであり；
Ｔ１は（Ｄ）ＡｌａまたはＬｙｓであり；
Ｔ２はＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；そして
Ｔ３はＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである〕
の化合物を含む。
【０００９】
好ましい式Ｉの化合物は、例えば式Ｉａ
【化２】
〔式中、
Ｗ’はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；
Ｒ’はＳａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａまたは（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；
Ｙ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、Ｍｅｌｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａＩｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルＩｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり；
ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そして
Ｑ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである〕
の化合物である。
【００１０】
基Ｗ’、Ｘ、Ｙ’、Ｚ、Ｑ’およびＲ’は独立して、下記の好ましい意味を有する：
Ｗ’は好ましくはＷ”であり、ここでＷ”はＭｅＢｍｔまたはジヒドロ−ＭｅＢｍｔである；
Ｘは好ましくはＸ’であり、ここでＸ’はαＡｂｕまたはＮｖａであり、より好ましくはＸ”であり、ここでＸ”はαＡｂｕである；
Ｒ’は好ましくはＲ”であり、ここでＲ”はＳａｒである；
Ｙ’は好ましくはＹ”であり、ここでＹ”はγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＩｌｅ、Ｎ−エチルＩｌｅまたはＮ−エチルＶａｌである；
Ｚは好ましくはＺ’であり、ここでＺ’はＶａｌまたはＭｅＶａｌである；そして
Ｑ’は好ましくはＱ”であり、ここでＱ”はＭｅＬｅｕである。
【００１１】
式Ｉａの化合物の好ましい群は、Ｗ’がＷ”であり、ＸがＸ’であり、Ｙ’がＹ”であり、ＺがＺ’であり、Ｑ’がＱ”であり、そしてＲ’がＲ”であるものである。
【００１２】
式Ｉａの化合物の好ましい例は、例えば：
ａ）［ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ］１−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン； BR＊ = 0.1; IR<1%
ｂ）［ＭｅＶａｌ］４−シクロスポリン； BR = 0.1; IR<1%
ｃ）［ＭｅＩｌｅ］４−シクロスポリン； BR = -0.2; IR<1%
ｄ）［ＭｅＴｈｒ］４−シクロスポリン
ｅ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン； BR =0.4; IR<1%
ｆ）［エチル−Ｉｌｅ］４−シクロスポリン； BR = 0.1; IR<2%
ｇ）［エチル−Ｖａｌ］４−シクロスポリン； BR = 0; IR<2%
ｈ）［Ｎｖａ］２−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−シクロスポリン；
ｉ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］４−［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］６−シクロスポリン；
ｊ）［ＭｅＶａｌ］５−シクロスポリン； BR = 0.4; IR = 5.3%
ｋ）［ＭｅＯＴｈｒ］２−［（Ｄ）ＭｅＡｌａ］３−［ＭｅＶａｌ］５−シクロスポリン；
ｊ）［８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔ］１−シクロスポリン、BR = 0.35; IR=1.8%
ｋ）［ＭｅＡｌａ］６−シクロスポリン； BR = -0.4; IR= 3.2
Ｉ）［γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ］９−シクロスポリン； BR = 0.15; IR = 2.9
である。
ＩＲ＝免疫抑制比、シクロスポリンＡに対する活性の割合として表現される。
【００１３】
非免疫抑制性シクロスポリンのさらなる例は、WO 98/28330、WO 98/28329およびWO 98/28328（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）に記載の化合物、例えば式ＩＩ
【化３】
〔式中、Ｗａは
【化４】
｛式中、Ｒａは式ＩｃまたはＩｄ
【化５】
（式中、Ｒ４はＣ１−４アルキルチオ、アミノＣ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキルアミノＣ１−４アルキルチオ、ジＣ１−４アルキルアミノ−Ｃ１−４アルキルチオ、ピリミジニルチオ、チアゾリルチオ、Ｎ−Ｃ１−４アルキルイミダゾリルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェニルチオ、ヒドロキシＣ１−４アルキルフェノキシ、ニトロフェニルアミノまたは２−オキソピリミジン−１−イルであり、そしてＲ’４はＣ１−４アルキルである）
の基である｝
であり；
ＸａはＡｂｕであり；
【００１４】
Ｒａは−ＮＭｅ−ＣＨ（Ｒｂ）−ＣＯ−｛ここで、ＲｂはＨまたは−Ｓ−Ａｌｋ−Ｒ０であり、ここでＡｌｋ−Ｒ０はメチルであるか；またはＡｌｋは直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２−６アルキレンまたはＣ３−６シクロアルキレンであり、Ｒ０はＨ；ＯＨ；ＣＯＯＨ；Ｃ２−５アルコキシカルボニル；ＮＲ１Ｒ２であり、ここでＲ１およびＲ２は各々独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキルおよびフェニル（各々所望によりハロゲン、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ２−５アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノおよび／またはジＣ１−４アルキル−アミノで置換されていてもよい）、ならびにベンジルおよびヘテロ環式基（当該ベンジルおよびヘテロ環式基は飽和または不飽和であり、５〜６個の環員と１〜３個のヘテロ原子を含む）から選択されるか、またはＲ１とＲ２はそれらが結合している窒素原子と一体となって、４−６員ヘテロ環（これは窒素、酸素および硫黄から選択される他のヘテロ原子を含んでいてもよく、そして所望によりＣ１−４アルキル、フェニルまたはベンジルで置換されている）を形成するか；またはＲ１およびＲ２は各々独立して、式Ｉｂ
【化６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は上記定義のとおりであり、Ｒ３はＨまたはＣ１−４アルキルであり、ｎは２〜４の整数である）の基である｝
であり、
ＹａはＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；
ＺａはＶａｌであり；そして
ＱａはＭｅＬｅｕである、ただし、ＹａがＭｅＬｅｕであるとき、ＲｂはＨではない〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【００１５】
式ＩＩにおいて、Ｒ１および／またはＲ２がヘテロ環式基であるとき、これはピリジル、テトラヒドロ−ピリジル、ピペリジル、イミダゾリル、オキサゾリルまたはチアゾリルであり得る。Ｒ１とＲ２がそれらが結合している窒素原子と共にヘテロ環式基を形成するとき、一例として、該ヘテロ環式基はアゼチジニル、ピペリジル、ピペラジニル、Ｎ−メチル−ピペラジニル、Ｎ−フェニルピペラジニル、Ｎ−ベンジルピペラジニル、ピリジル、イミダゾリル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロピリジル、メチルテトラヒドロピリジル（例えば４−メチル−テトラヒドロピリジル）またはフェニルテトラヒドロピリジル（例えば４フェニルテトラヒドロピリジル）から選択され得る。
【００１６】
式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を、以下のとおり分類され得る多様な方法で得ることができる：
１）発酵
２）生体内変化
３）誘導体化
４）部分合成
５）全合成
（例えばEP 0 484 281 A1、WO 00/01715、WO 98/28330、WO 98/28329またはWO 98/28328に記載されている。それらの内容を、出典明示により本明細書の一部とする）。
【００１７】
一連のさらなる具体的なまたは別の態様において、本発明はまた、以下のものを提供する：
１．１ それを必要とする対象における肝臓疾患に関連した状態を予防または処置する方法であって、当該対象に治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を投与することを含む方法。
【００１８】
本発明によって、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンは、肝臓疾患に関連した兆候、症状または状態の１つ以上を緩解するか、または消失させるのに有効な量、例えば対象の生検サンプルにおいて測定したコラーゲン生産を抑制するのに有効な量で、投与することができる。
【００１９】
１．２ 培地におけるＨＳＣ増殖を抑制する方法であって、この培地に有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を適用することを含む方法。
【００２０】
１．３ それを必要とする対象における肝臓疾患に関連した状態を抑制する方法であって、当該対象に治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を投与することを含む方法。
【００２１】
１．４ それを必要とする移植レシピエントにおける肝臓疾患に関連した状態の再発を予防または処置する方法であって、当該レシピエントに治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物を投与することを含む方法。
【００２２】
２． 上記定義の何れかの方法に使用する医薬組成物の製造における、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物の使用。
【００２３】
３． 上記定義の何れかの方法に使用するための医薬組成物であって、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物と、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【００２４】
上記疾患および状態の処置における非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン（以下、「本発明のシクロスポリン」）の有用性を、標準的な動物試験または臨床試験で、例えば下記方法によって示すことができる。
【００２５】
Ａ．インビトロ細胞培養：
ＨＳＣは、オスWistarラットの肝臓から、Kato, et al, J. Hepatol (1999) 31:91-99に記載に従い、インサイチュコラゲナーゼ灌流、プロナーゼ消化、次いで２層化（１７％／１１．５％）したメトリザミド溶液（Sigma Chemical, St. Louis, MO）中での遠心分離を行う一連の操作で単離する。ＨＳＣは、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むDulbecco修飾Eagle培地（ＤＭＥＭ）中で培養する。実験は、第３と第４連続継代間の細胞で行う。マウスマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−１）およびマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１）を測定するため、Shibata, et al, Cell Transplant (2003) 12:499-507に従って作成したＨＳＣ由来のヒト細胞系であるＴＷＮＴ−４細胞を、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１に対するＦａｓｕｄｉｌの効果を評価するために用いる。ＴＷＮＴ−４細胞を前出（Ｉｄ）のとおり、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養する。ＮＩＭ８１１（Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland）をＤＭＥＭに溶解させ、培養物に加える。ＨＳＣの細胞生存率は、無血清条件下、２４時間、２μＭ ＮＩＭ８１１の存在下で、９０％を超える。
【００２６】
タイプ１コラーゲンアッセイ： 培養したＨＳＣを、無血清培地中、ＮＩＭ８１１の存在下または非存在下で２４時間インキュベートする。培養培地中のタイプＩコラーゲンを、Iwamoto, et al, J. Hepatol (2000) 32:762-770に記載のとおり、ＥＬＩＳＡによって測定する。抗ラットタイプＩコラーゲン抗体（LSL, Tokyo, Japan）を１次抗体として使用することができる。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Organon Teknika Corporation, Durham, NC）を２次抗体として用いる。ラット尾腱コラーゲンタイプＩ（Advance Biofactures Corporation, Lymbrook, NY）を標準的な対照として用いる。
【００２７】
ＭＭＰ−１、ＴＩＭＰ−１およびコラゲナーゼアッセイ： 培養したＴＷＮＴ−４細胞を、無血清培地中、ＮＩＭ８１１の存在下または非存在下で２４時間インキュベートする。培養培地中のＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１生産を、Fukushima, et al, Liver Int (2005) 25:829-838に記載の方法に従って、ヒトＭＭＰ−１のためのBiotrak ＥＬＩＳＡシステム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）およびｈＴＩＭＰ−１キット（Daiichi Fine Chemical Co. Ltd., Toyama, Japan）によるＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定する。培養培地中の活性ＭＭＰ−１およびプロ−ＭＭＰ−１を、ＭＭＰ−１ Biotrak Activity Assay System （Amersham）で測定する。
【００２８】
実時間ＲＴ−ＰＣＲを使用した遺伝子発現分析： 全ＲＮＡをＴＷＮＴ−４細胞から、Trizol剤（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）で製造し、これをＮＩＭ８１１の存在下または非存在下、１０％ＦＣＳ中で２４時間維持する。ｃＤＮＡを１．０ｍｇ ＲＮＡから、GeneAmp（商標）ＲＮＡ ＰＣＲ（Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA）で、ランダムヘキサマーを用いて合成する。実時間ＰＣＲをLightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1 （Roche, Tokyo, Japan）を用いて、Nakamuta, et al, Int J. Mol Med (2005) 16(4):631-635に記載のとおりに行う。LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５μＭの上流および下流ＰＣＲプライマー、ならびにテンプレートとして２ｍｌの第１ストランドｃＤＮＡを含む反応混合物（２０μｌ）を用いる。反応の変化を制御するため、すべてのＰＣＲを、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現に対して正規化する。使用できるプライマーは下記のとおりである：ヒトタイプＩコラーゲンａ１鎖について、５’−ＡＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＡＡＣＡＧ−３’（フォワードプライマー）（配列番号１）および５’−ＣＴＣＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡ−３’（リバースプライマー）（配列番号２）（GenBank（商標）受託番号NM-000088）（２１）；ヒトａ−ＳＭＡについて、５’−ＡＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＣ−３’（フォワードプライマー）（配列番号３）および５’−ＣＡＧＡＧＴＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣＣＧＧＡ−３’（リバースプライマー）（GenBank（商標）受託番号NM-000088）；ＭＭＰ−１について、５’−ＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＴＣＣＴ−３’（フォワードプライマー）および５’−ＴＣＣＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＧＴＧ−３’（リバースプライマー）（GenBank（商標）受託番号NM002421）；ＴＩＭＰ−１について、５’−ＴＴＣＴＧＣＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＴＣＧＴ−３’（フォワードプライマー）および５’−ＴＣＣＧＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＧＡＧＴ−３’（リバースプライマー）（配列番号４）（GenBank（商標）受託番号NM003254）；Ｓｍａｄ７について、５’−ＧＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＣＴＣＧＧ−３’（フォワードプライマー）（配列番号５）および５’−ＣＡＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＣＡ−３’（リバースプライマー）（配列番号６）（Quan, et al, J Biol Chem (2005) 80:8079-8085）；形質転換増殖因子β受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）について、５’−ＧＧＣＣＧＴＴＴＧＴＡＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＣ−３’（フォワードプライマー）（配列番号７）および５’−ＧＧＧＣＧＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＣＣ−３’（リバースプライマー）（配列番号８）（Woszcyk et al, Med Sci Monit (2004) 10:C33C37)）。
【００２９】
ＢｒｄＵ取り込み分析： ＢｒｄＵのＨＳＣ取り込みを、Higashi, et al, J. Lab Clin Med (2005) 145(6):316-322に記載のとおり、細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いて測定する。簡単に言うと、亜コンフルエントのＨＳＣを、２４時間血清欠乏にする。次にこれをＤＭＥＭで洗浄して、ＢｒｄＵと共に、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中、ＮＩＭ８１１の存在下または非存在下で２４時間インキュベートする。細胞をＢｒｄＵで標識化した後、細胞ＤＮＡを消化し、ペルオキシダーゼと結合した抗ＢｒｄＵ抗体と共にインキュベートする。ＢｒｄＵ取り込みを、上清の蛍光強度を４５０ｎｍ（励起）および６９０ｎｍ（放出）で測定して評価する。
【００３０】
アポトーシス分析： ＨＳＣをＮＩＭ８１１の存在下または非存在下、無血清条件で２４時間維持する。細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中、室温で３０分間固定し、０．２％Triton X-100を含むＰＢＳ中、４℃で５分間透過処理する。細胞をHoechst 33342で染色し、In Situ Cell Death Detection Kit（Roche）を用い、製造業者の指示に従って、ＴＵＮＥＬ法によって分析する。サンプルを、LSM 510共焦点レーザー走査顕微鏡（Zeiss）で可視化する。３つの独立した実験、そして３つの異なる細胞調製物から、少なくとも１００個の細胞が、各条件について測定される。
【００３１】
リン酸化および非リン酸化−ＭＡＰＫについてのウェスタンブロット分析： ウェスタンブロット分析を、Uchimura, et al, Hepatology (2001) 33:91099に記載のとおりに行う。ＨＳＣを２４時間飢餓状態にし、次にＮＩＭ８１１を用いまたは用いることなく、２時間処理する。１×１０７個のＴＷＮＴ−４細胞を含む全細胞溶解物を、１００μｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで調製する。タンパク質溶解物を１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、二フッ化ポリビニリデン膜（Millipore, Bedford, MA）に移し、そしてＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、リン酸化−ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＪＮＫ、リン酸化−ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、ｐ３８ ＭＡＰＫ、またはリン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）（New England Biolabs, Beverly, MA）について、１次抗体で探索する。結合抗体を、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を２次抗体として用いて検出する。ブロットをＥＣＬ−プラス（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて検出して、抗体を可視化する。ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、リン酸化−ＥＲＫ１／２ ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、リン酸化−ＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびリン酸化−ｐ３８ ＭＡＰＫのレベルを、光学走査系を用いたデンシトメトリーによって定量する。比較のために、リン酸化ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫの非リン酸化ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫに対する比それぞれを、濃度測定データから計算する。
【００３２】
リン酸化および非リン酸化−Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３についてのウェスタンブロット分析： ウェスタンブロット分析を、ＭＡＰＫ分析について上記のとおりに行い、Ｓｍａｄ２、リン酸化−Ｓｍａｄ２（Ｔｈｒ／Ｔｙｒ）、Ｓｍａｄ３またはリン酸化Ｓｍａｄ３（Ｔｈｒ／Ｔｙｒ）について１次抗体で探索する（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）。比較として、リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の非リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３に対する比それぞれを、濃度測定データから計算する。
【００３３】
統計的分析： 全ての結果を、平均±ＳＥＭとして示す。片側ＡＮＯＶＡ、続いてＳｃｈｅｆｆ検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて、比較を行う。
【００３４】
実施例１ タイプＩコラーゲン蓄積、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１生産、ならびにコラゲナーゼ活性化に対するＮＩＭ８１１の効果
ＨＳＣによるＥＣＭ生産に対するＮＩＭ８１１の効果を評価するため、上記のとおり多くのラットＨＳＣを調節した後、培養培地中のタイプＩコラーゲン濃度を測定する。高濃度のＮＩＭ８１１、およびシクロスポリンＡ（cyclosporine）での細胞の処理は、コラーゲン蓄積の濃度依存的抑制を導く；０．５μＭ ＮＩＭ８１１は、コラーゲン蓄積を約５０％減少させる。この抑制は、ＮＩＭ８１１での処置によってコラーゲン発現が抑制されるので、少なくとも転写よりも上流で制御される。Nakamuta, et al, Transplant Proc (2005) 37:4598-4602において既に報告されたとおり、シクロスポリンは０．１２５μＭ（１５０ｎｇ／ｍｌ）の臨床的に妥当な（clinically relevant）濃度で、コラーゲン濃度を約５０％減少させるが、タクロリムスは１２．５ｎＭ（１０ｎｇ／ｍｌ）の臨床的に妥当な濃度でコラーゲン生産を顕著に低減させない。コラーゲン生産の速度によって決定されることに加えて、コラーゲン蓄積は、コラゲナーゼ活性によって、すなわちＭＭＰ１とＴＭＩＰ−１間のバランスによって制御される。ＮＩＭ８１１は、コラゲナーゼ活性（活性ＭＭＰ−１）およびプロ−ＭＭＰ−１レベルの濃度依存的増加を導き；０．５μＭ ＮＩＭ８１１の存在下で、コラゲナーゼ活性はおよそ２倍増加する。しかし、ＮＩＭ８１１は２．０μＭの濃度ですら、ＴＩＭＰ−１生産を顕著に低減させない。
【００３５】
実施例２ タイプ１コラーゲン、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１遺伝子発現に対するＮＩＭ８１１の効果
タイプＩコラーゲン、ＭＭＰ−１およびＴＩＭＰ−１のｍＲＮＡレベルに対するＮＩＭ８１１またはシクロスポリンの効果を評価するため、本明細書に記載のとおりＲＴ−ＰＣＲを行う。タイプＩコラーゲンの発現は、０．５μＭ ＮＩＭ８１１の存在下でおよそ３０％減少する。対照的に、０．５μＭ ＮＩＭ８１１によって、ＭＭＰ−１の発現がほぼ２倍増進するが、ＴＩＭＰ−１のそれは変化しなかった。これらの結果は、遺伝子発現に対するＮＩＭ８１１の効果は、そのタンパク質生産に対する効果と同様であることを示している。
【００３６】
実施例３ 細胞増殖およびアポトーシスに対するファスジルの効果
前の研究によって、コラーゲン生産の刺激に加えて、活性化ＨＳＣはＭＭＰ−１のような間質性コラゲナーゼによる間質性コラーゲンの分解を阻害することが示されており、このことはマトリックス分解が繊維症の進行中に阻害されることを示している（Benyon, et al, Gastroenterology (1996) 110:821-831、Iredale, et al, Hepatology (1996) 24:17-184、Iredale, et al, J. Clin Invest (1992) 90:282287参照）。ＴＩＭＰ−１は、マトリックス分解の阻害とは独立して、細胞増殖およびアポトーシスを制御することが報告されている（Murphy, et al, J. Biol Chem (2002) 277:1106911076参照）。ＮＩＭ８１１は濃度依存的様式で、アポトーシスなしにＨＳＣの細胞増殖を抑制する。
【００３７】
細胞増殖に対するＮＩＭ８１１の効果を試験するため、ＢｒｄＵ取り込みを本明細書に記載のとおり測定する。定量的分析によって、２．０μＭ ＮＩＭ８１１処理によって新規ＤＮＡ合成がおよそ３０％減少するが、より低い濃度ではそうでないことが示される。さらに、２μＭ ＮＩＭ８１１の存在下で、アポトーシスは観察されない。本発明者らの結果は、ＮＩＭが、コラーゲン生産の抑制およびコラゲナーゼ活性の増加のために、肝臓繊維症についての治療能を有することを示している。
【００３８】
実施例４ ＭＡＰＫシグナル伝達に対するＮＩＭ８１１の効果
ＮＩＭ８１１によってコラーゲン生産および細胞増殖が抑制され、コラゲナーゼ活性が増加する機構を調査するため、ＨＳＣにおいてコラーゲン生産および細胞増殖に重要な役割を果たすＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８を含むＭＡＰＫのような細胞間シグナル伝達カスケード（Marr, et al, Hepatology (2000) 1:428-434）に対するＮＩＭ８１１の効果を、上記のとおり評価する。ＮＩＭ８１１は濃度０．５μＭでＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を、それぞれ３．６倍および２．３倍増加させる。ＮＩＭ８１１での処置は、濃度上昇的にＪＮＫおよびｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を顕著に増加させるが、ＥＲＫ１／２を抑制しない。シクロスポリンがその免疫抑制効果を、ＪＮＫおよびｐ３８についてカルシニューリン依存性ＮＦＡＴ経路とカルシニューリン非依存性活性化経路の両方によって示すことは、既に示されている（Mastuda, et al, EMPO Reports (2000) 1:428-434）。シクロスポリンＡ（cyclosporine）アナログであるＮＩＭ８１１は、シクロフィリンＡと結合しないため、ＮＦＡＴ経路を活性化しない（Waldmeier, et al, Mol Pharmacol, (2002) 62(1):22-29）。ＮＩＭ８１１とシクロスポリンＡ（cyclosporine）間のＪＮＫおよびｐ３８に対する効果の差は、ＮＩＭ８１１においてＮＦＡＴ経路が存在しないことに由来するかも知れない。
【００３９】
実施例５ ＴＧＦβシグナル伝達経路に対するＮＩＭ８１１の効果
ＭＡＰＫに加えて、ＴＧＦ−βシグナル伝達カスケードは、ＨＳＣのコラーゲン生産を強力に刺激する（Friedman, et al, J Biol Chem (1994) 269:10551-10558）。ＴＧＦ−βは細胞膜でＴＧＦβＲＩＩと結合し、次にＴＧＦβＲＩＩはグリシン／セリンリッチドメインに位置するセリンおよびスレオニン残基でＴＧＦβＲＩをリン酸化する（Wrana, et al, サイトカイン Growth Factor Rev (2000) 11:5-13）。リン酸化されたＴＧＦβＲＩは、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３をＣ末端ＳＳＸＳモチーフでリン酸化し、これは共通のパートナーであるＳｍａｄ４と複合体を形成する。これらのＳｍａｄタンパク質は、核に移行し、コラーゲン（Ｉｄ）のような標的遺伝子の転写を活性化する。Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３を介するＴＧＦβシグナル伝達カスケードは、Friedman, et al , J Biol Chem (1994) 269:10551-10558に記載されたタイプＩコラーゲン遺伝子の発現を強く制御するので、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化に対するＮＩＭ８１１の効果が評価される。ＮＩＭ８１１での処理によって、濃縮様式でＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化が顕著に抑制され；０．５μＭ ＮＩＭ８１１はＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化を、それぞれおよそ７０％および６０％抑制する。Ｓｍａｄ７の発現は、ＴＧＦβＲＩＩリン酸化の阻害によってＴＧＦβシグナル伝達経路を負に制御する（Hayashi, et al, Cell (1997) 1165-1173）。０．５μＭ ＮＩＭ８１１によって、Ｓｍａｄ７の発現がおよそ２倍に増加し、ＴＧＦβＲＩをおよそ５０％抑制する。これらの結果は、ＮＩＭ８１１がＴＧＦβＲＩＩおよび／またはＴＧＦβＲ１キナーゼ活性を阻害し得ることを示唆している。Ｓｍａｄ７（Ｉｄ）、イムノフィリンＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）１２（４０）およびＳＡＲＡ（受容体活性化のためのＳｍａｄアンカー）（４１）は、ＴＧＦβＲに関連しており、ＴＧＦβシグナル伝達を制御する。ＮＩＭ８１１はＳｍａｄ７の発現を増進し、そしてＴＧＦＲＩのそれを抑制し、このことはＮＩＭ８１１がＴＧＦβシグナル伝達経路を、受容体レベルでの阻害によって少なくとも部分的に阻害することを示している。シクロスポリンＡ（cyclosporine）も、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ７およびＴＧＦβＲＩに対する同様の効果を有する（データは公開せず）。
【００４０】
上記のとおり、ＮＩＭ８１１はＪＮＫおよびｐ３８に対してシクロスポリンＡとは反対の効果を有するが、いずれもがコラーゲン生産および細胞増殖に対して同様の効果を示し、このことはＮＩＭおよびシクロスポリンＡが抗繊維形成効果、主としてＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害を示すことを示唆している。
【００４１】
シクロフィリンは、ペプチド結合アミノ末端のプロリンへのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ相互変換を触媒してタンパク質コンホメーションの変化を促進する、ＰＰＩアーゼファミリーである（Waldmeier, supra）。１０個以上のシクロフィリンサブタイプが存在しており、それらは、転写制御、免疫応答、タンパク質分泌およびミトコンドリア機能を含む多様な細胞プロセスに関与している（Waldmeier supra, Duina, et al, Science (1996) 274:1713-1715）。Watashi et al., Hepatology (2003) 38:1282-1288は、近年、ＮＩＭ８１１がインビトロでのＨＣＶ複製を抑制するが、一方タクロリムスはこの効果を示さないことを報告した。ＮＩＭ８１１はシクロフィリンＡ（１４）との結合能を欠くため、ＮＩＭ８１１はシクロフィリンＢまたはＤのような他のシクロフィリンとの結合によって薬理学的効果を示すと考えられる。特に、ＮＩＭ８１１は、ＨＣＶ ＲＮＡポリメラーゼの機能的レギュレーターであるシクロフィリンＢとの結合を介して、抗ウイルス効果を示す（Watashi, et al, Mol Cell (2005) 19:111-122）。ＮＩＭ８１１は、ミトコンドリア透過性転移を制御するシクロフィリンＤとの相互作用の阻害に基づいて、細胞保護作用を有することも報告されている（Waldmeier, et al, Mol Pharmacol (2002) 62:22-29）。Kon et al, Hepatology (2004) 40:1170-1179は、ＮＩＭ８１１がアセトアミノフェン誘導性壊死および培養マウス肝細胞のアポトーシスを阻止すると報告した。
【００４２】
Ｂ．臨床試験
肝繊維症／肝硬変を有する計１５患者を、２週間の試験に組み込む。核患者に本発明のシクロスポリン、例えば［Ｍｅｌｌｅ］４−シクロスポリンを７〜１５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与する。Ｃ型肝炎抗原の血清レベルを各患者において０日目〜１４日目に測定する。
【００４３】
肝繊維症／肝硬変、とりわけ肝傷害を有する患者は、下記兆候または症状の１種以上を示し得る：（ａ）ＡＬＴの上昇、（ｂ）抗ＨＣＶ抗体試験で陽性、（ｃ）ＨＣＶ−ＲＮＡについての陽性試験によって示されるＨＣＶの存在、（ｄ）慢性肝疾患の臨床的兆候、（ｅ）肝細胞損傷。かかる基準は肝炎性肝繊維症／肝硬変の診断に使用できるのみならず、薬剤処置に対する患者の応答を評価するために使用することもできる。
【００４４】
血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇は、非制御Ｃ型肝炎において生じることが知られており、処置に対する完全応答は、一般に、これらの血清酵素、とりわけＡＬＴの正常化として定義される（Davis et al., 1989, New Eng. J. Med. 321:1501 - 1506）。ＡＬＴは、肝細胞が破壊されると放出される酵素であり、ＨＣＶ感染の兆候である。
【００４５】
薬剤処置に応答する対象におけるＨＣＶ複製の経過を追跡するために、血清サンプル中のＨＣＶ ＲＮＡを、例えばＨＣＶゲノムのＮ５３およびＮ５４非構造的遺伝子領域由来の２セットのプライマーを用いる重複（nested）ポリメラーゼ連鎖反応アッセイによって測定することができる。Farci et al., 1991, New Eng. J. Med. 325:98 - 104。Ulrich et al., 1990, J. Clin. Invest., 86:1609-1614。
【００４６】
肝臓生検サンプルの組織学的試験は、評価の第２の基準として使用することができる。例えば、Knodell et al., 1981, Hepatology 1:431-435参照、この組織学的活性指標（門脈炎症、ピースミール壊死もしくは架橋壊死、小葉傷害および繊維症）は、疾患活性のスコア方法を提供する。
【００４７】
本発明の方法を実施するのに必要な１日用量は、例えば使用する非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、宿主、投与形態、処置する状態の重症度に依存して変化する。好ましい１日用量範囲は、単回用量または複数回用量として、約１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００４８】
患者にとって好適な１日用量は、例えば経口または静脈内で１〜２０ｍｇ／ｋｇのオーダーである。経口投与に好適な単位投与形態は、約０．２５〜１０ｍｇ／ｋｇの有効成分、例えば［ＭｅＩｌｅ］４−シクロスポリンと、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む。
【００４９】
本発明のシクロスポリンを、何れかの常套の経路、とりわけ経腸的に、例えば経口的に、例えば飲用液、錠剤もしくはカプセル剤の形態で、または非経腸的に、例えば注射液または懸濁液の形態で、投与することができる。好ましい医薬組成物は、例えばUK 2,222,770 Aに記載のミクロエマルジョンを利用したものであってもよい。
【００５０】
本発明のシクロスポリンは、単独の有効成分として、または他の薬剤、例えば下記のものと組み合わせて投与することができる：抗ＨＣＶ活性を有する薬剤、例えばインターフェロン、例えばインターフェロン−α２ａまたはインターフェロン−α２ｂ、例えばＩｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａ、Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）もしくはＢｅｔａｆｅｒｏｎ（登録商標）、または水溶性ポリマーもしくはヒトアルブミンと結合したインターフェロン、例えばアルブフェロン、抗ウイルス剤、例えばリボビリン、ラミブジン、ＮＶ０８もしくはＮＭ２８３、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ、ヘリカーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼのようなＨＣＶコード化因子の阻害剤、もしくはかかる阻害剤のプロドラッグ、抗繊維剤、例えばＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えばイマチニブ、免疫調節剤、例えばミコフェノール酸、その塩もしくはプロドラッグ、例えばミコフェノール酸ナトリウムもしくはミコフェノール酸モフェチル、またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０または所望によりリン酸化されたそのアナログ、例えばEP627406A1、EP778263A1、EP1002792A1、WO02/18395、W002/76995、WO 02/06268、JP2002316985、WO03/29184、W003/29205、W003/62252 および W003/62248に記載のもの。
【００５１】
インターフェロンと水溶性ポリマーの複合体は、とりわけポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレンポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーとの複合体を含むことを意味する。ポリアルキレンオキシドに基づくポリマーとは別のものとして、実質的に非抗原性物質、例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物に基づくポリマー等を用いることができる。かかるインターフェロン−ポリマー複合体は、米国特許第4,766,106号、第4,917,888号、欧州特許出願第0 236987号、欧州特許出願第0 510 356号および国際公開公報第WO 95/13090号に記載されている。ポリマー性修飾によって抗原性応答が十分に減少するので、外来インターフェロンは完全に自己である必要はない。ポリマー複合体を製造するために使用するインターフェロンを、哺乳類抽出物、例えばヒト、反すう動物またはウシインターフェロンから製造するか、または組換え的に製造することができる。好ましいのは、ペグ化インターフェロンとしても知られているインターフェロンとポリエチレングリコールの複合体である。
【００５２】
とりわけ好ましいインターフェロンの複合体は、ペグ化アルファ−インターフェロン、例えばペグ化インターフェロン−α−２ａ、ペグ化インターフェロン−α−２ｂ；ペグ化コンセンサスインターフェロンまたはペグ化精製インターフェロン−α製品である。ペグ化インターフェロン−α−２ａは、例えば欧州特許第593868号に記載されており、例えばＰＥＧＡＳＵＳ（Hoffmann-La Roche）の商品名で商業的に入手可能である。ペグ化インターフェロン−α−２ｂは、例えば欧州特許第975,369号に記載されており、例えばＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ Ａｎ（Schering Plough）の商品名で商業的に入手可能である。ペグ化コンセンサスインターフェロンはWO 96/11953に記載されている。好ましいペグ化α−インターフェロンは、ペグ化インターフェロン−α２ａおよびペグ化インターフェロン−α−２ｂである。ペグ化コンセンサスインターフェロンも好ましい。
【００５３】
使用する共薬剤についての１日用量は、例えば使用する化合物、宿主、投与形態、および処置する状態の重症度に依存して変化する。例えば、ラミブジンは、１日用量１００ｍｇで投与することができる。
【００５４】
ペグ化インターフェロンを非経腸的に、１〜３回／週、好ましくは週１回、合計週間用量２，０００，０００〜１０，０００，０００ＩＵ、より好ましくは５，０００，０００〜１０，０００，０００ＩＵ、最も好ましくは８，０００，０００〜１０，０００，０００ＩＵの範囲で投与することができる。
【００５５】
上記に従って、本発明はさらにさらなる局面において、下記のものを提供する：
４．例えば上記定義の何れかの方法に使用するための医薬組合せ剤であって、ａ）非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物である第１の薬剤と、ｂ）共薬剤、例えば上記定義の第２の薬剤を含む、組合せ剤。
【００５６】
５．治療上有効量の非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリン、例えば式Ｉ、ＩａまたはＩＩの化合物と、共薬剤、例えば上記定義の第２の薬剤の、例えば同時的または逐次的共投与を含む、上記定義の方法。
【００５７】
「共投与」または「組合せ投与」等の用語は、本明細書において使用するとき、選択した治療薬剤を１人の患者に投与することを含み、そして該薬剤を必ずしも同じ投与経路または同時に投与する必要がない処置レジメンを含むことを意図する。
【００５８】
本発明の医薬組合せ剤の投与によって、薬学的有効成分を１種のみ適用する単独療法と比較して、有利な効果、例えば相乗的治療効果が得られる。好ましい相乗的組合せは、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンと、所望によりポリマーと複合化したインターフェロンとの組合せである。
【００５９】
さらに好ましい組合せは、非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンとミコフェノール酸、その塩もしくはプロドラッグとの、またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０との組合せである。
【００６０】
［ＭｅＩｌｅ］４−シクロスポリンまたは［ＭｅＶａｌ］４−シクロスポリンが、本発明において使用するのに好ましい非免疫抑制性シクロフィリン結合性シクロスポリンである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓疾患に関連した状態の予防または処置用医薬組成物の製造におけるシクロスポリンの使用であって、当該シクロスポリンが、
（ｉ）ヒト組換えシクロフィリンと結合比（ＢＲ）０．７未満で結合し、ここでＢＲは競合ＥＬＩＳＡ試験で測定した刺激試験におけるシクロスポリンＡのＩＣ５０に対する当該シクロスポリンのＩＣ５０の比の、１０を底とした対数であり；そして
（ｉｉ）混合リンパ球反応において、シクロスポリンＡの活性の５％以下の活性を有する
使用。
【請求項２】
肝臓疾患の抑制用医薬組成物の製造における、請求項１に記載のシクロスポリンの使用。
【請求項３】
移植レシピエントにおける肝臓疾患の再発の予防用医薬組成物の製造における、請求項１に記載のシクロスポリンの使用。
【請求項４】
シクロスポリンが式Ｉ
〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔまたはＯ−アセチル−ＭｅＢｍｔ４であり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；ＲはＰｒｏ、Ｓａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａまたは（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；ＹはＭｅＬｅｕ、チオＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、Ｍｅｌｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａｌｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルｉｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり、ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり、ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＡｌａまたはＰｒｏであり、Ｔ１は（Ｄ）ＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｔ２はＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり、そしてＴ３はＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである〕
化合物；式Ｉａ
−１５Ｗ’−ＸＲ’Ｙ’Ｚ−Ｑ’−Ａｌａ−（Ｄ）Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ Ｉａ
〔式中、Ｗ’はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；Ｒ’はＳａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａ、または（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；Ｙ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、Ｍｅｌｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａｌｌｅまたはＭｅａＴｈｒであり；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルｉｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり、ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そしてＱ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｉａである〕
の化合物、または式ＩＩ
ＷＸａ Ｒａ Ｙａ Ｚａ Ｑａ Ａｌａ−（Ｄ）Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ− １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ ＩＩ
〔式中、ＷａはＲａ ＨＯ／，，，，，ＣＨ ＣＨ Ｉ Ｉ ＣＨ３ ＯＨ２であり
ここでＲａは式ＩｃまたはＩｄ
ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ ＣＨ２ Ｒ４ ＩｃまたはＣＨ２ Ｓｌ Ｉ Ｒ’４ Ｉｄ
（ここで、Ｒ４はＣ’４アルキルチオ、アミノＣ４アルキルチオ、Ｃ４アルキルアミノＣ’４アルキルチオ、ジＣ’４アルキルアミノ−Ｃ４アルキルチオ、ピリミジニルチオ、チアゾリルチオ、Ｎ−Ｃ４アルキルイミダゾリルチオ、ヒドロキシＣ４アルキルフェニルチオ、ヒドロキシＣ’４アルキルフェノキシ、ニトロフェニルアミノまたは２−オキソピリミジン−１−イルであり、そしてＲ’４はＣ’４アルキルである）
の基であり、
ＸａはＡｂｕであり；−１６Ｒａは−ＮＭｅ−ＣＨ（Ｒｂ）−ＣＯ−｛ここで、ＲｂはＨまたは−Ｓ−Ａｌｋ−Ｒ０であり、ここでＡｌｋ−Ｒｏはメチルであるか；またはＡｌｋは直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２ ６アルキレンまたはＣａｌシクロアルキレンであり、ＲｏはＨ；ＯＨ；ＣＯＯＨ；Ｃ２ ５アルコキシ−カルボニル；ＮＲＲ２であり、ここでＲおよびＲ２は各々独立して、Ｈ、Ｃ’−アルキル、Ｃ２アルケニル、Ｃ３ ６シクロアルキルおよびフェニル（各々所望によりハロゲン、Ｃ、アルコキシ、Ｃ２５アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ−アルキルアミノおよび／またはジＣ’−アルキル−アミノで置換されていてもよい）、ならびにベンジルおよびヘテロ環式基（当該ベンジルおよびヘテロ環式基は飽和または不飽和であり、５〜６個の環員および１〜３個のヘテロ原子を含む）から選択されるか、またはＲとＲ２はそれらが結合している窒素原子と一体となって、４−６員ヘテロ環（これは窒素、酸素および硫黄から選択される他のヘテロ原子を含んでいてもよく、そして所望によりＣ−アルキル、フェニルまたはベンジルで置換されている）を形成するか；またはＲおよびＲ２は各々独立して、式ｌｂ i:’) /.t （ここで、ＲおよびＲ２は上記定義のとおりであり、Ｒ３はＨまたはＣ’アルキルであり、ｎは２〜４の整数である）の基である｝
であり；ＹａはＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；ＺａはＶａｌであり；そしてＱａはＭｅＬｅｕである、ただし、ＹａがＭｅＬｅｕであるとき、ＲｂはＨではない〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項１、２または３に記載の使用。
【請求項５】
肝臓疾患の予防または処置用医薬組成物であって、請求項１に記載のシクロスポリンと、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載のシクロスポリンである第１の薬剤と、ｂ）抗繊維形成特性を有する共薬剤を含む、医薬組合せ剤。
【請求項７】
肝硬変の予防または処置に使用するための医薬組合せ剤であって、ａ）請求項１に記載のシクロスポリンである第１の薬剤と、ｂ）抗ＨＣＶ特性を有する薬剤、抗繊維形成剤、免疫調節剤またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト−１７から選択される共薬剤を含む、医薬組合せ剤。
【請求項８】
それを必要とする対象における肝臓疾患を予防または処置する方法であって、当該対象に治療上有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを投与することを含む方法。
【請求項９】
培地中のＨＳＣ増殖を抑制する方法であって、この培地に有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを適用することを含む方法。
【請求項１０】
それを必要とする患者における肝臓疾患を抑制する方法であって、この対象に治療上有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを投与することを含む方法。
【請求項１１】
それを必要とする移植レシピエントにおける肝臓疾患の再発を予防する方法であって、当該レシピエントに治療上有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを投与することを含む方法。
【請求項１２】
治療上有効量の請求項１に定義のシクロスポリンと、抗ＨＣＶ特性を有する薬剤、抗繊維形成剤、免疫調節剤またはＳ１Ｐ受容体アゴニストから選択される共薬剤を同時的または逐次的に共投与することを含む、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
肝臓疾患に関連した状態の予防または処置用医薬組成物の製造におけるシクロスポリンの使用であって、当該シクロスポリンが、
（ｉ）ヒト組換えシクロフィリンと結合比（ＢＲ）０．７未満で結合し、ここでＢＲは競合ＥＬＩＳＡ試験で測定した刺激試験におけるシクロスポリンＡのＩＣ５０に対する当該シクロスポリンのＩＣ５０の比の、１０を底とした対数であり；そして
（ｉｉ）混合リンパ球反応において、シクロスポリンＡの活性の５％以下の活性を有する
使用。
【請求項２】
肝臓疾患の抑制用医薬組成物の製造における、請求項１に記載のシクロスポリンの使用。
【請求項３】
移植レシピエントにおける肝臓疾患の再発の予防用医薬組成物の製造における、請求項１に記載のシクロスポリンの使用。
【請求項４】
シクロスポリンが式Ｉ
〔式中、
ＷはＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔ、８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔまたはＯ−アセチル−ＭｅＢｍｔ４であり；
ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；ＲはＰｒｏ、Ｓａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａまたは（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；ＹはＭｅＬｅｕ、チオＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、Ｍｅｌｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａｌｌｅまたはＭｅａＴｈｒ；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルｉｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり、ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり、ＱはＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、ＭｅＡｌａまたはＰｒｏであり、Ｔ１は（Ｄ）ＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｔ２はＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり、そしてＴ３はＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｌａである〕
化合物；式Ｉａ
−１５Ｗ’−ＸＲ’Ｙ’Ｚ−Ｑ’−Ａｌａ−（Ｄ）Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ Ｉａ
〔式中、Ｗ’はＭｅＢｍｔ、ジヒドロ−ＭｅＢｍｔまたは８’−ヒドロキシ−ＭｅＢｍｔであり；ＸはαＡｂｕ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｎｖａまたは０−メチルスレオニン（ＭｅＯＴｈｒ）であり；Ｒ’はＳａｒ、（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ、（Ｄ）−ＭｅＡｌａ、または（Ｄ）−ＭｅＳｅｒ（Ｏアセチル）であり；Ｙ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕ、Ｍｅｌｌｅ、ＭｅＶａｌ、ＭｅＴｈｒ、ＭｅＡｌａ、ＭｅａｌｌｅまたはＭｅａＴｈｒであり；Ｎ−エチルＶａｌ、Ｎ−エチルｉｌｅ、Ｎ−エチルＴｈｒ、Ｎ−エチルＰｈｅ、Ｎ−エチルＴｙｒまたはＮ−エチルＴｈｒ（Ｏアセチル）であり、ＺはＶａｌ、Ｌｅｕ、ＭｅＶａｌまたはＭｅＬｅｕであり；そしてＱ’はＭｅＬｅｕ、γ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕまたはＭｅＡｉａである〕
の化合物、または式ＩＩ
ＷＸａ Ｒａ Ｙａ Ｚａ Ｑａ Ａｌａ−（Ｄ）Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ− １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ ＩＩ
〔式中、ＷａはＲａ ＨＯ／，，，，，ＣＨ ＣＨ Ｉ Ｉ ＣＨ３ ＯＨ２であり
ここでＲａは式ＩｃまたはＩｄ
ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ ＣＨ２ Ｒ４ ＩｃまたはＣＨ２ Ｓｌ Ｉ Ｒ’４ Ｉｄ
（ここで、Ｒ４はＣ’４アルキルチオ、アミノＣ４アルキルチオ、Ｃ４アルキルアミノＣ’４アルキルチオ、ジＣ’４アルキルアミノ−Ｃ４アルキルチオ、ピリミジニルチオ、チアゾリルチオ、Ｎ−Ｃ４アルキルイミダゾリルチオ、ヒドロキシＣ４アルキルフェニルチオ、ヒドロキシＣ’４アルキルフェノキシ、ニトロフェニルアミノまたは２−オキソピリミジン−１−イルであり、そしてＲ’４はＣ’４アルキルである）
の基であり、
ＸａはＡｂｕであり；−１６Ｒａは−ＮＭｅ−ＣＨ（Ｒｂ）−ＣＯ−｛ここで、ＲｂはＨまたは−Ｓ−Ａｌｋ−Ｒ０であり、ここでＡｌｋ−Ｒｏはメチルであるか；またはＡｌｋは直鎖もしくは分枝鎖Ｃ２ ６アルキレンまたはＣａｌシクロアルキレンであり、ＲｏはＨ；ＯＨ；ＣＯＯＨ；Ｃ２ ５アルコキシ−カルボニル；ＮＲＲ２であり、ここでＲおよびＲ２は各々独立して、Ｈ、Ｃ’−アルキル、Ｃ２アルケニル、Ｃ３ ６シクロアルキルおよびフェニル（各々所望によりハロゲン、Ｃ、アルコキシ、Ｃ２５アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ−アルキルアミノおよび／またはジＣ’−アルキル−アミノで置換されていてもよい）、ならびにベンジルおよびヘテロ環式基（当該ベンジルおよびヘテロ環式基は飽和または不飽和であり、５〜６個の環員および１〜３個のヘテロ原子を含む）から選択されるか、またはＲとＲ２はそれらが結合している窒素原子と一体となって、４−６員ヘテロ環（これは窒素、酸素および硫黄から選択される他のヘテロ原子を含んでいてもよく、そして所望によりＣ−アルキル、フェニルまたはベンジルで置換されている）を形成するか；またはＲおよびＲ２は各々独立して、式ｌｂ i:’) /.t （ここで、ＲおよびＲ２は上記定義のとおりであり、Ｒ３はＨまたはＣ’アルキルであり、ｎは２〜４の整数である）の基である｝
であり；ＹａはＭｅＬｅｕまたはγ−ヒドロキシ−ＭｅＬｅｕであり；ＺａはＶａｌであり；そしてＱａはＭｅＬｅｕである、ただし、ＹａがＭｅＬｅｕであるとき、ＲｂはＨではない〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項１、２または３に記載の使用。
【請求項５】
肝臓疾患の予防または処置用医薬組成物であって、請求項１に記載のシクロスポリンと、１種以上の薬学的に許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載のシクロスポリンである第１の薬剤と、ｂ）抗繊維形成特性を有する共薬剤を含む、医薬組合せ剤。
【請求項７】
肝硬変の予防または処置に使用するための医薬組合せ剤であって、ａ）請求項１に記載のシクロスポリンである第１の薬剤と、ｂ）抗ＨＣＶ特性を有する薬剤、抗繊維形成剤、免疫調節剤またはＳ１Ｐ受容体アゴニスト−１７から選択される共薬剤を含む、医薬組合せ剤。
【請求項８】
それを必要とする対象における肝臓疾患を予防または処置する方法であって、当該対象に治療上有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを投与することを含む方法。
【請求項９】
培地中のＨＳＣ増殖を抑制する方法であって、この培地に有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを適用することを含む方法。
【請求項１０】
それを必要とする患者における肝臓疾患を抑制する方法であって、この対象に治療上有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを投与することを含む方法。
【請求項１１】
それを必要とする移植レシピエントにおける肝臓疾患の再発を予防する方法であって、当該レシピエントに治療上有効量の請求項１に記載のシクロスポリンを投与することを含む方法。
【請求項１２】
治療上有効量の請求項１に定義のシクロスポリンと、抗ＨＣＶ特性を有する薬剤、抗繊維形成剤、免疫調節剤またはＳ１Ｐ受容体アゴニストから選択される共薬剤を同時的または逐次的に共投与することを含む、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【公表番号】特表２０１０−５０５９１２（Ｐ２０１０−５０５９１２Ａ）
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３１８４１（Ｐ２００９−５３１８４１）
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４３７９７
【国際公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１０日（２００７．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０７９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４３７９７
【国際公開日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
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