修飾ホスファターゼ
本発明は、ホスファターゼに関し、より詳細には、（遺伝的）修飾ホスファターゼ、（遺伝的）修飾ホスファターゼを有する医薬組成物、およびたとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患または腎不全といった処置すなわち治療のための（遺伝的）修飾ホスファターゼの使用、に関する。本発明はさらに、ホスファターゼの生産方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファターゼに関し、より詳細には、（遺伝的）修飾ホスファターゼ、（遺伝的）修飾ホスファターゼを有する医薬組成物、およびたとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患または腎不全などの処置すなわち治療のための（遺伝的）修飾ホスファターゼの使用、に関する。本発明はさらに、ホスファターゼの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファターゼは、その基質を脱リン酸化する、すなわち、リン酸モノエステルを、リン酸イオンおよび遊離ヒドロキシル基を有する分子に加水分解する酵素である。この作用は、ＡＴＰのようなエネルギ分子を用いることによって基質にリン酸基を付着するホスホリラーゼおよびキナーゼの作用とは正反対である。ホスファターゼは、２つの主要カテゴリに分類され得る。すなわちシステイン依存性ホスファターゼ（ＣＤＰ）およびメタロホスファターゼである。後者のホスファターゼは、活性のために、ホスファターゼの活性部位において１またはそれ以上の金属イオンの存在に依存する。
【０００３】
ＣＤＰは、ホスホ−システイン中間体を介してリン酸エステル結合の加水分解を触媒する。遊離システイン求核剤が、リン酸部分のリン原子との結合を形成し、好適に配置された酸性アミノ酸残基または水分子のいずれかによって、リン酸基をチロシンに連結しているＰ−Ｏ結合がプロトン化される。ホスホ−システイン中間体はその後、別の水分子によって加水分解され、別の脱リン酸化反応のための活性部位を再生する。
【０００４】
メタロホスファターゼは、１またはそれ以上の触媒作用に必須の金属イオンをその活性部位内に配位している。現在、これらの金属イオンの識別において幾分の混乱がある。なぜなら、これらの金属イオンを識別しようとする継続的な試みが、異なる回答をもたらすからである。現在、これらの金属は、マグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛またはこれらのあらゆる組合せであり得るという証拠がある。２つの金属イオンをブリッジする水酸化イオンが、リン酸基への求核攻撃に参加すると考えられている。
【０００５】
ホスファターゼは、たんぱくにリン酸基を追加するキナーゼ／ホスホリラーゼとは反対に作用する。リン酸基の追加は、酵素を活性化もしくは非活性化し得（たとえば、キナーゼシグナル経路）、またはたんぱく−たんぱく相互作用を生じさせることができる（たとえば、ＳＨ３ドメイン）。したがって、ホスファターゼは多くのシグナル変換経路に不可欠である。リン酸の追加および除去が、酵素の活性化または阻害に必ずしも対応しないこと、および種々の酵素が、機能調節を活性化または阻害する別個のリン酸化反応部位を有すること、に注意しなければならない。ＣＤＫはたとえば、リン酸化される特定のアミノ酸残基に依存して、活性化または非活性化され得る。リン酸は、リン酸が付着するたんぱくを調節するので、シグナル変換において重要である。調節効果を逆転させるのに、リン酸が除去される。これは、加水分解によって自身で起こるか、たんぱくホスファターゼによって媒介される。
【０００６】
本発明を限定しないが、アルカリホスファターゼが、明細書に記載され、クレームされるホスファターゼの例としてより詳細に議論される。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（ＥＣ ３．１．３．１）は、ヌクレオチド、たんぱくおよびアルカロイドを含む多くの種類の分子からリン酸基を除去するのに関与する加水分解酵素である。リン酸基の除去プロセスは、脱リン酸化と呼ばれる。名前が示すように、アルカリホスファターゼはアルカリ環境において最も効果的である。
【０００７】
アルカリホスファターゼは、分子生物学の実験室において有用なツールとなっている。というのも、ＤＮＡは通常５’末端にリン酸基を有するからである。これらのリン酸の除去が、ＤＮＡをライゲーション（同一または他の分子の３’末端への５’末端の付着）から防止する；また、リン酸基の除去は、プロセスまたは実験におけるさらなるステップを通して標識ＤＮＡの存在を測定するための放射性標識（放射性リン酸基による置換）を可能とする。これらの目的のために、エビ由来のアルカリホスファターゼが最も有用である。というのも、一旦仕事が済むと、不活性化が最も容易であるからである。
【０００８】
アルカリホスファターゼの別の重要な使用は、酵素イムノアッセイの標識としてのものである。
【０００９】
さらに、アルカリホスファターゼは、たとえば敗血症、炎症性腸疾患または腎不全の治療に使用される。
【００１０】
現在利用可能な（アルカリ）ホスファターゼは、診断および疾患の治療の双方において有用であるけれども、たとえば、改変された（たとえば改良された）比活性度、安定性（たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ１／２、または貯蔵に関する安定性（保管寿命））または基質特異性を有する、代わりのホスファターゼが必要である。さらに、異なるｐＨ、温度または塩（非）依存プロフィールを有するホスファターゼも必要である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、代わりの（遺伝的）修飾ホスファターゼを提供する。
第１の実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られる。これらの変異体は、ここではさらに「ドメインスワップ変異体」と呼ぶ。
【００１２】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；IUBMB 酵素命名法に従うＥＣ ３．１．３．１、一般名アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、リン酸モノエステルおよびＨ２Ｏの、アルコールおよびリン酸への反応を触媒する酵素である。ＡＰの他の名前は、アルカリホスホモノエステラーゼ；ホスホモノエステラーゼ；グリセロホスファターゼ；アルカリホスホヒドロラーゼ、アルカリフェニルホスファターゼ、オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ（アルカリ最適）である。ＡＰの系統名は、リン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ（アルカリ最適）である。
【００１３】
ＡＰは、広い特異性の酵素であり、リン酸転移をも触媒する。ヒトおよび他の哺乳類において、少なくとも４つの異なる、関連するアルカリホスファターゼが周知である。ヒトにおいて、これらは、腸、胎盤、胎盤様、および肝臓／骨／腎臓（すなわち組織非特異的）アルカリホスファターゼである。最初の３つは、第２染色体に一緒に座乗し、組織非特異型は第１染色体に座乗する。ＡＰの正確な生理学的機能は知られていないが、ＡＰは、多くの生理学的プロセスに関与するように思われる。
【００１４】
胎盤アルカリホスファターゼは、ここではＡＬＰＰまたはＰＬＡＰと省略する。略称ＡＬＰＩまたはＩＡＰは、腸アルカリホスファターゼを表す。胎盤様２アルカリホスファターゼは、ここではＡＬＰＰ２、ＡＬＰＧまたはＧＣＡＰと省略し、略称ＡＬＰＬ、ＴＮＳＡＬＰ、ＴＮＡＰまたはＢＬＫは、ここでは肝臓／組織非特異的アルカリホスファターゼを表すのに使用される。同一のアルカリホスファターゼについての異なる略称は、ここでは同じように用いられる。
【００１５】
立体配座の観点から、アルカリホスファターゼはおおよそ２つのドメイン、すなわちクラウンドメインおよび活性部位ドメインから成る。活性部位ドメインは、触媒残基および３つの金属イオン部位（Ｚｎ１、Ｚｎ２およびＭｇ３）のように、別個の部分に分けることができる。一次構造の観点から、クラウンドメインは、活性部位ドメインを形成するアミノ酸の横に並ぶ（flank）ことが明らかである。ゆえに、好ましい実施形態において、触媒ドメインは、連続した配列のアミノ酸から構成されるのではなく、クラウンドメインの横に並んでいる。
【００１６】
アルカリホスファターゼのアミノ酸配列、ならびに触媒ドメインおよびクラウンドメインの相対位置は、当業者によって周知である。例として、図１を参照して、これはとりわけ、４つのヒトアルカリホスファターゼのアミノ酸配列を示す。クラウンドメインはこれらの配列において下線が引かれている。本発明のドメインスワップ変異体は好ましくは、（下線が引かれているような）自身のクラウンドメインを、（下線が引かれているような）別のホスファターゼのクラウンドメインと置換することによって、作られた。たとえば、ＡＬＰＰのクラウンドメインは、アミノ酸３６６〜４３０間に位置するので、クラウンドメインに関する好ましい実施形態において、図１のアミノ酸３６６〜４３０に対応する。すなわち、好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、図１のＡＬＰＰのクラウンドメインは、アミノ酸３６６〜４３０間に位置する。
【００１７】
アルカリホスファターゼは、細菌からヒトまで、実質的にすべての生物に存在する。好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼである。他方のホスファターゼは、たとえばＥＣＡＰ（Escherichia coliアルカリホスファターゼ）または７つの周知のＢＩＡＰ（ウシ腸アルカリホスファターゼ）の１つである。好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、異なるアルカリホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。このことは、修飾ホスファターゼがその後、たとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患または腎不全の治療といった、ヒトの治療において用いられる場合に、特に有用である。ヒト起源のそのような（遺伝的）修飾ホスファターゼは、免疫原性がない、または非常に低いと予想される。しかし、当業者にとって、修飾ホスファターゼがたとえば「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」または「ｅｘ ｖｉｖｏ」診断で使用される場合、修飾ホスファターゼは、たとえばヒトおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよいこと、またはウシおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよいことは、明確である。
【００１８】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、前記クラウンドメインは、ＡＬＰＰのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインは、ＡＬＰＩの触媒ドメインである。好ましくは、前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼであり、さらにより好ましい実施形態において、双方の異なるホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。
【００１９】
本発明まで、アルカリホスファターゼの触媒ドメインは、比活性に関して、最も重要であると一般に考えられた。さらに、クラウンドメインは、アルカリホスファターゼの安定性に関与すると考えられた。ゆえに、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメイン（さらに触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰと呼ぶ）を有する組換えアルカリホスファターゼを試験すると、この組換えアルカリホスファターゼの活性は、ＡＬＰＩの活性に匹敵すると予想されていた。しかし、たとえばFreestyle（商標）293発現培地（GIBCO）といった、Ｚｎ２＋のない、または非常に少ない培地における触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの生産が、おおよそ６００Ｕ／ｍｇの比活性度をもたらしたが、同じ細胞系および同じ培地で生産されたＡＬＰＩは、約３０Ｕ／ｍｇの比活性度をもたらした。
【００２０】
さらにより驚いたのは、生産細胞の増殖培地にＺｎ２＋イオンを加える効果であった：このことは、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの比活性度にほとんど効果がないが、ＡＬＰＩの比活性度は、おおよそ７５０Ｕ／ｍｇに増大した。生産後のよく似た濃度のＺｎ２＋の追加が、１６時間後のＡＬＰＩの比活性度においてほんの２倍の増大を誘導しただけであった。
【００２１】
これらの結果の要約が、表１および表２に挙げられる。
理論に制約されるのではないが、ＡＬＰＰのクラウンドメインは、生産された組換え触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰに立体配座変化を与え、この立体配座変化が、より高い比活性度およびＺｎ２＋非依存性酵素をもたらすと思われる。すなわちＡＬＰＰのクラウンドメインの存在は、比較的高い比活性度をもたらし、Ｚｎ２＋非依存性であると考えられる。
【００２２】
さらに、ＡＬＰＩは、酵素の比活性度を増大させるのに、生産中、高いＺｎ２＋濃度を必要とするだけでなく、ＡＬＰＩの比活性度は、Ｚｎ２＋欠乏培地において２４時間以内に減少するが、同じ条件下で、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、その初期の比活性度を維持することが示された。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ活性がＺｎ２＋非依存性であることを暗示している。活性がＺｎ２＋非依存性であるそのような酵素は、Ｚｎ２＋欠乏が病状の一部である病気（たとえば、栄養不良、アルコール依存症および腸完全性障害、敗血症または炎症性疾患を概して含む慢性感染症）において、またはＺｎ２＋の追加が禁忌であるかもしれない病気（たとえば、敗血症の急性期、自己免疫疾患）において、有用であり得る。生産および用途の利点は別として、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、貯蔵中の安定性に関しても利点を有する。
【００２３】
上に述べたように、ＡＬＰＩなどの天然ＡＰは、低いＺｎ２＋濃度の環境においてその酵素活性を失うことが示されてきた。ゆえに、Ｚｎ２＋欠乏が病状の一部である疾患において、前記天然のＡＰは、最も有益であると考えられる部位、たとえば炎症の部位にて、その酵素活性を現すことができない。反対に、たとえば触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰといった、低いＺｎ２＋濃度に感受性でない組換えＡＰは、低いＺｎ２＋濃度の環境において、たとえば炎症部位にて、その活性を維持する。健康な個体で、Ｚｎ２＋血清標準値が１０〜２０μＭである。たとえば、アルコール依存症において、または栄養不良中、そのレベルは１０μＭ未満、または１μＭ未満にさえ減少し得る。ヒトの体内の種々の酵素は、その活性のためにＺｎ２＋に依存しており、たとえば免疫応答は、充分なレベルのＺｎ２＋が存在すれば、より効果的である。免疫システムの先天的部分および特異的部分は、亜鉛によって影響されることが知られており、亜鉛含有たんぱくが炎症部位に蓄積することが立証されてきた。さらに、リウマチ性関節炎、敗血症およびクローン病などの（亜）慢性炎症は、血清亜鉛欠乏を呈する。驚いたことに、本発明はまた、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰが、非修飾（組換え体）アルカリホスファターゼよりもかなり広いｐＨ範囲においてその活性を維持するという見識を与える。炎症および／または虚血などの多くの疾患が、組織のｐＨの攪乱を包含するという事実を踏まえて、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、そのような疾患の治療に特に有用である。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを、好ましくは攪乱された組織のｐＨが付随する疾患の治療における使用のための薬剤として有するホスファターゼの使用を提供し、好ましくは前記疾患が、炎症性疾患および／または虚血が付随する疾患を含む。
【００２４】
本発明は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有する組換えホスファターゼ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）が、局所性または全身性Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療に特に有用であるという見識を与える。したがって別の実施形態において、本発明は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを、好ましくはＺｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療における使用のための薬剤として有するホスファターゼの使用を提供する。好ましくは、前記疾患は、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれる、炎症性疾患を含む。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療のための薬剤の調製における、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有するホスファターゼの使用を提供し、好ましくは、前記疾患は炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれる疾患を含む。
【００２６】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患を治療するための、対象（好ましくはヒト）の治療方法を提供し、前記治療方法は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有する有効量のホスファターゼを、ホスファターゼを必要とする対象に投与することを含み、前記疾患は、好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれる。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、前記クラウンドメインはＡＬＰＩのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインはＡＬＰＰの触媒ドメインである（さらに触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩと呼ぶ）。好ましくは、前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼであり、さらにより好ましい実施形態において、双方の異なるホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。
【００２８】
ヒトアルカリホスファターゼに基づく他の好ましいドメインスワップ変異体は以下のとおりである。
【００２９】
明瞭にする目的で、ＡＬＰＩは腸ＡＰであり、ＡＬＰＰは胎盤ＡＰであり、ＧＣＡＰは胎盤様ＡＰであり、ＴＮＡＰは組織非特異的ＡＰである。
【００３０】
ＥＣＡＰまたはヒト型（ＡＬＰＩ、ＡＬＰＰ、ＧＣＡＰまたはＴＮＡＰ）のいずれかの触媒ドメインと、ＢＩＡＰのクラウンドメインとの組合せもなされ得ることが明らかである。さらに、ＢＩＡＰのクラウンドメインとＥＣＡＰまたはヒト型のいずれかの触媒ドメインとの組合せも生産され得る。
【００３１】
明細書、例および当該技術の文献を通して、他の命名が、アルカリホスファターゼの各アイソフォームを指定するのに使用される。明瞭にする目的で、以下の表において、一般に使用される、または本願において使用される、名前および略称が記載される。
【００３２】
有用な修飾ホスファターゼの別のクラスは、自然条件下では、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカを介して細胞膜に連結するホスファターゼであるが、ホスファターゼはもはや細胞膜に付着しないように今や修飾される。ＧＰＩアンカされるホスファターゼの例は、アルカリホスファターゼおよび5 ’-ヌクレオチダーゼである。すべてのアイソザイムは、細胞膜において機能的にアクティブであり、ＧＰＩアンカ欠損型は、検出可能なレベルで自然に存在しない。血清アルカリホスファターゼ活性が明示されてきたけれども、酵素は、放出膜画分または膜小胞においてなお存在することが通常認められる。乳汁のＡＰ活性は、膜小胞を含む画分にも存在する。ＧＰＩアンカは、トランスアミダーゼを介して付着部位に付着する、前駆体分子として細胞に貯蔵される。ＧＰＩアンカのバックボーンは哺乳類において同一であるが、細胞型依存性修飾が知られている。
【００３３】
アルカリホスファターゼは、原形質膜と関連して、そのＧＰＩアンカを介して、主に見られる。たとえば、好中球が、炎症性微環境内に酵素を放出する代わりに、好中球の負にチャージされた細胞膜のバックグラウンドに対して酵素を提示する。この理由により、ＡＰの最適なｉｎ ｖｉｖｏ活性のために、酵素は、細胞膜または小胞膜に組込まれなければならないことが一般的に認められる。さらに、ポリアニオン性基質が、アルカリ性のｐＨにて通常最適であるホスファターゼ酵素およびその誘導体のホスファターゼ活性、特にアルカリホスファターゼのホスファターゼ活性に好適なアニオン性条件にさらに寄与し得ることが観察されてきた。
【００３４】
ヒト対象者におけるＡＰの医薬的使用について、ほとんどの用途について、ヒト型の酵素を薬剤および治療に適用することが必要条件である。というのも、他種から得られたＡＰ型は、ヒト対象者において免疫原性となり得、治療が免疫学的反応および病理学的副作用を引起し得るからである。いくつかの対象において、致死的な副作用、すなわちアナフィラキシショック（発明者らの動物研究で示された）でさえ起こり得るので、免疫学的副作用の危険は最小化されなければならない。ヒトからのＡＰの単離は、実際的に実現可能ではないので、ＡＰたんぱくのヒト組換え型が、異なる組換え発現プラットフォームにおいて、定められた手順に従って生産され得る。しかし、ＧＰＩ含有の膜アンカたんぱくの発現および精製は、知っての通り困難である。ＧＰＩたんぱくは、膜から分離するのが困難であり、単離および精製するのが困難である。しかし、ＧＰＩアンカおよび膜局在性は、ＡＰの生物学的活性に不可欠であると常にみなされてきた。
【００３５】
本発明のこの部分は、ＧＰＩアンカを欠くヒトＡＰ酵素が、可溶性であり、組換えたんぱく発現システムによって容易に分泌され、肝細胞ベースの生物学的アッセイにおいて、生理学的ｐＨレベルにてかなりのホスファターゼ活性を、生物学的に関連のあるリン酸化基質に向けて提示するという驚くべき発見に基づいている。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は分泌ホスファターゼをもたらす、すなわちホスファターゼは細胞膜に付着しない。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は、生物学的にアクティブである、すなわち生物学的（関連）基質に向けて活性を示す分泌ホスファターゼをもたらす。
【００３８】
ＧＰＩアンカの付着に関与する一般的な配列はないが、明確なコンセンサスはある。
１）Ｃ−末端のアミノ酸の疎水性ストレッチ（少なくとも１１のアミノ酸だが、好ましくは１２以上のアミノ酸）
２）疎水性領域の上流に、親水性アミノ酸のスペーサ（５〜１２のアミノ酸）
３）ＧＰＩが、小さいアミノ酸：グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリンまたはシステイン、に付着している
４）ＧＰＩ付着部位の下流の、２つの続くアミノ酸は、小さいアミノ酸でなければならず、大多数の場合、グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリンまたはシステインから選ばれる。
【００３９】
このコンセンサスに基づいて、当業者はたとえば、１つまたは多数のアミノ酸を挿入し、コンセンサスの一部を乱すことによって、コンセンサスを変異させることができる。しかし、好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は分泌ホスファターゼを提供し、前記修飾は、コンセンサスＧＰＩシグナル配列を包含するアミノ酸配列の変異または欠失を含む。
【００４０】
ヒトの治療における用途について、結果として得られる修飾ホスファターゼは、免疫原性がない、または非常に低いこと、すなわち修飾ホスファターゼは、原則的にヒト起源のものであることが所望される。好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は（好ましくは生物学的に関連のある基質に対する活性を有する）分泌ホスファターゼをもたらし、前記ホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。
【００４１】
ＧＰＩアンカされるホスファターゼの例は、アルカリホスファターゼおよび５’−ヌクレオチダーゼであるので、好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は分泌ホスファターゼをもたらし、前記ホスファターゼは、たとえば、ヒト肝−腎−骨ホスファターゼ、ヒト腸アルカリホスファターゼ、またはヒト胎盤様アルカリホスファターゼなどのヒトアルカリホスファターゼといったアルカリホスファターゼである。
【００４２】
記載されるあらゆる分泌型修飾ホスファターゼは、たとえば、宿主細胞内に、前記分泌型ホスファターゼを調節配列と操作可能に連鎖してコードし、前記宿主細胞が前記分泌型ホスファターゼを発現することを可能にする核酸を導入することによって、および生産されたホスファターゼを、宿主細胞が増殖および／または維持される培地から随意的に単離することによって、生産し得ることが明確である。しかし、前述のＧＰＩ付着配列における変異とは別に、ＧＰＩアンカなしの分泌たんぱくを作る他の方法が存在する。
【００４３】
１）膜アンカたんぱくとしての発現後、ＧＰＩアンカを切除するのにホスホリパーゼが使用されてもよい。ゆえに、本発明はまた、膜アンカホスファターゼを発現することができる宿主を培養することを含む分泌ホスファターゼの生産方法を提供し、前記宿主細胞が、前記ホスファターゼを生産することを可能にし、得られた細胞をホスホリパーゼとインキュベートして、放出されたホスファターゼを随意的に単離する。膜アンカホスファターゼは、たとえば、野生型（または自然もしくは非修飾の）ホスファターゼである。しかし、膜アンカホスファターゼは、その配列の他の部分（たとえばクラウンドメイン）に変異を含むことができる。
【００４４】
２）ＧＰＩアンカの生産への干渉、またはＧＰＩアンカ生産が欠損している細胞（型）の使用が、そうでなければＧＰＩ−アンカされるたんぱくの分泌型を作るのに利用されてもよい。ＧＰＩアンカリング生化学が欠損させられた細胞系の例は、たとえばJur kat、AM-B、C84、BW、S49、CHOおよびRajiである。さらに別の実施形態において、本発明は従って、分泌型（アルカリ）ホスファターゼを発現することができる宿主細胞（たとえば、言及した修飾分泌（アルカリ）ホスファターゼのいずれかをコードする核酸配列を有する宿主細胞）を培養することを含む分泌ホスファターゼの生産方法を提供し、前記宿主が前記分泌型ホスファターゼを生産することを可能にし、生産されたホスファターゼを随意的に単離し、前記宿主細胞は、機能的ＧＰＩアンカたんぱくの生合成が可能ではない。しかし、宿主細胞は、機能的ＧＰＩシグナル配列を有するホスファターゼを生産してもよい。
【００４５】
３）トランスアミダーゼへの干渉、またはトランスアミダーゼが欠損した細胞の使用が、たんぱくへのＧＰＩアンカの付着を阻害するのに使用されてもよく、たんぱくをアンカなしに、かつ分泌可能にする。このような欠損細胞は、CHOにおける変異生成を通して得られた。
【００４６】
クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する修飾ホスファターゼであって、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインが、異なるアルカリホスファターゼから得られる修飾ホスファターゼが、さらに修飾され、分泌可能にされることが可能であることは、当業者に明らかである。ゆえに、好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列に修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾が分泌ホスファターゼをもたらし、前記組換えホスファターゼはさらに、異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインを有する。このような（アルカリ）ホスファターゼ変異体の例が、図１に与えられる。このような結合または「二重」変異体は、たとえば、ある比活性、安定性または基質特異性を有する修飾ホスファターゼをもたらすと同時に、このような生産物の生産は、生産細胞を囲繞する培地から単離することができるという事実によって、大いに改善する。
【００４７】
アルカリホスファターゼの触媒ドメインは、酵素の一次配列において隣接しない様々なアミノ酸配列から構成される。触媒ドメインは、脱リン酸化反応において基質から切除されたリン酸基のアクセプタとして機能する触媒セリン残基（ＡＬＰＰにおけるＳｅｒ９２）を含む。酵素の触媒ドメインはさらに、１またはそれ以上の金属イオンを有する。触媒ドメイン内に含まれる特定のアミノ酸残基が、脱リン酸化反応に関与する金属イオンの結合および配位に関与する。ＡＬＰＰにおいて、金属配位残基は：Ａｓｐ４２、Ｈｉｓ１５３、Ｓｅｒ１５５、Ｇｌｕ３１１、Ａｓｐ３１６、Ｈｉｓ３２０、Ａｓｐ３５７、Ｈｉｓ３５８、Ｈｉｓ３６０およびＨｉｓ４３２である。
【００４８】
さらに別の実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供する。当業者は、触媒残基周り（すなわち、好ましくは立体配座の、触媒残基付近の）、および／または金属イオン配位リン酸ポケット内の、アミノ酸を確実に識別し、変異させることができる。すでに前述されたように、ホスファターゼの配列は周知である。例のように、図１は、とりわけ４つのヒトアルカリホスファターゼのアミノ酸配列を示す。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記ホスファターゼはヒトホスファターゼである。このことは、修飾ホスファターゼがその後、たとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患または腎不全の治療といった、ヒトの治療において用いられる場合に、特に有用である。ヒト起源のそのような（遺伝的）修飾ホスファターゼは、免疫原性がない、または非常に低いと予想される。しかし、当業者にとって、修飾ホスファターゼがたとえば「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」または「ｅｘ ｖｉｖｏ」診断で使用される場合、修飾ホスファターゼは、たとえばヒトおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよく、またはウシおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよいことは、明確である。
【００５０】
さらに別の好ましい実施形態において、前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。
【００５１】
金属イオン配位リン酸結合ポケットは、少なくともヒトアルカリホスファターゼアイソフォームについて、保存されている。このポケットは、２つのＺｎ結合ストレッチおよび１つのＭｇ結合ストレッチから構成され、Ｚｎ１についてアミノ酸Ａｓｐ３１６、Ｈｉｓ３２０およびＨｉｓ４３２を、Ｚｎ２についてＡｓｐ４２、Ａｓｐ３５７およびＡｓｐ３５８を、ならびにＭｇについてＳｅｒ１５５およびＧｌｕ３１をそれぞれ有する（図１のＡＬＰＰが参照される）。
【００５２】
配位アミノ酸残基および／または配位残基付近に配置される残基の変異が、積極的または消極的に、結果として生じる変異体酵素の触媒特性に影響を及ぼしそうである。たとえば、ＡＬＰＰにおいて、アミノ酸残基４４，８７，９３，３２２，３２３および４２９が、配位残基付近に配置される。これらの残基の、ＡＬＰＩの対応する１，２，３または４つのアミノ酸との置換による変異生成が、酵素の触媒特性に影響を及ぼし得る。逆に、ＡＬＰＩのアミノ酸残基４４，８７，９３，３２２，３２３および４２９の、ＡＬＰＰの対応するアミノ酸との置換が、ＡＬＰＩ酵素の触媒特性に影響を及ぼし得る。表４および表５は、置換され得るアミノ酸（の組合せ）を示す。
【００５３】
ゆえに、好ましい実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記変異は、表４、表５または表６に表わされるような変異である。
【００５４】
触媒残基付近および／または金属イオン含有リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼが、たとえばＧＰＩシグナル配列において修飾を有するようにさらに修飾されることが可能であることは、当業者に明らかである。このような変異体は、触媒のドメインおよびクラウンドメインによって、すなわち前記クラウンドメインおよび触媒ドメインが異なるホスファターゼから得られるように、さらに修飾されることさえ可能である。
【００５５】
さらに別の実施形態において、触媒残基付近および／または金属イオン配位含有リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼが、触媒およびクラウンドメインのドメインスワップによってさらに修飾される、すなわち前記クラウンドメインおよび触媒ドメインが異なるホスファターゼから得られるようにすることも可能である。
【００５６】
さらに、さらに別の実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供する。
【００５７】
記載されたあらゆる（遺伝的）修飾ホスファターゼに達するための分子生物学の技術は、当業者にとって周知であり、制限酵素インキュベーション、ライゲーション、ＰＣＲ、変異の導入などの技術を含む。
【００５８】
さらに別の実施形態において、本発明は、たとえば、ドメインスワップ変異体をコードする核酸配列、分泌ホスファターゼをコードする核酸、または分泌ドメインスワップ変異体をコードする核酸配列など、明細書に記載されるホスファターゼをコードする核酸配列を提供する。本発明はさらに、明細書に記載されるホスファターゼをコードする核酸配列を有するベクタを提供する。このようなベクタは好ましくは、ホスファターゼをコードする核酸配列の転写／翻訳に必須の要素（たとえば、プロモータおよび／または終了配列）などの、追加的な核酸配列を含む。前記ベクタは、前記ベクタで形質転換された宿主細胞を選択または維持するための選択マーカ（たとえば抗生物質）をコードする核酸配列を有してもよい。適切なベクタの例は、クローニングベクタまたは発現ベクタである。適切な宿主細胞における発現を仲介するのに適切なあらゆるベクタが、宿主細胞において統合されるか、エピソームとして複製するかのいずれかで、本発明に従って使用されてもよい。ベクタは、プラスミド、（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルスを含む）ウイルス、コスミド、ファージもしくはファージミド、エピゾームベクタまたは人工染色体であってもよい。
【００５９】
さらに、本発明はまた、明細書に記載される核酸配列またはベクタを有する宿主細胞を提供する。細胞は、組換えたんぱくの生産に適している、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、植物細胞または酵母細胞であってもよい。適切な酵母宿主細胞は、Saccharomyces
cerevisiaeおよびPichia pastorisを含む。好ましい宿主細胞は、BHK、HEK293、CHOまたはPerC6（商標）などの、哺乳類（またはより好ましくはヒト）由来細胞である。
【００６０】
明細書に記載されるホスファターゼをコードする核酸配列、前記核酸配列を有するベクタ、前記核酸配列を有する宿主細胞、または前記核酸配列を有するベクタが、修飾ホスファターゼの生産に非常に有用である。ホスファターゼはグリコシル化部位を含むので、ホスファターゼは好ましくは、所望のグリコシル化パターンを提供する細胞において生産される。好ましい実施形態において、使用される生産システムは、哺乳類（たとえばヒト）ｉｎ ｖｉｔｒｏ生産プラットフォームであり、さらにより好ましくは、生産は大規模生産を含む。別の好ましい実施形態において、用いられる生産システムは、人工のヒト様グリコシル化パターンが導入される、植物、酵母または哺乳類（好ましくは非ヒト）プラットフォームである。
【００６１】
異なる生産方法を試験すると、本発明の発明者らは驚いたことに、野生型または変異体（アルカリ）ホスファターゼの生産中のＺｎ２＋イオンの存在が、生産されるホスファターゼの比活性度に影響を及ぼし得ることを見出した。たとえば、ＡＬＰＩの比活性度は、使用される宿主細胞の増殖培地にＺｎ２＋を加えることによって、３０Ｕ／ｍｇから７５０Ｕ／ｍｇに増大し得る。宿主細胞を培養するのに標準的に使用される培地は、０．５〜３ｎＭ Ｚｎ２＋を有する。１ｍＭまでＺｎ２＋を加えると、比活性度が大幅に改善した。したがって、ＡＬＰＩはＺｎ２＋依存性ホスファターゼであると結論される。このことは、Ｚｎ２＋非依存性であるように思われる、すなわち、宿主細胞の培養中のＺｎ２＋の不在が、生産されるホスファターゼの比活性度に有意に影響を及ぼさず、貯蔵中および反応中のＺｎ２＋の不在が、比活性度を低下させない、すでに記載した触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ変異体とは対照的である。
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明はホスファターゼの生産方法を提供し、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能にすることを含む。好ましい実施形態において、前記宿主細胞は哺乳類細胞であり、別の好ましい実施形態において、前記ホスファターゼはヒトホスファターゼである。さらに別の実施形態において、前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。本発明の方法は、野生型（または自然もしくは非遺伝的修飾の）ホスファターゼを生産するのに使用することができ、たとえば明細書に記載されるあらゆるホスファターゼである、遺伝的修飾ホスファターゼを生産するのにも同様に使用することができる。
【００６３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、ホスファターゼの生産方法を提供し、前記方法は、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能とすることを含み、前記方法はさらに、前記ホスファターゼを単離することを含む。本発明はさらに、ホスファターゼの生産方法によって得ることができるホスファターゼを提供し、前記生産方法は、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能とすることを含む。
【００６４】
明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼがある比活性度、ある基質特異性またはある安定性（たとえばｐＨ、温度、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の時間）を有するか否かは、当業者が、市販の基質を用い、アルカリホスファターゼとのインキュベートによる無機リン酸の放出を市販のキットで測定することによって、容易に試験することができる。さらに、修飾ホスファターゼが生物学的に関連のある活性を有するかを判定する、明細書の実験部に記載の試験を用いることも可能である。
【００６５】
すでに言及したように、明細書に記載の（遺伝的）修飾ホスファターゼは、診断および治療に有用である。１つの実施形態において、本発明は、たとえば、
クラウンドメインおよび触媒ドメインを有し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られる、単離もしくは組換えアルカリホスファターゼ、
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列において修飾を有し、前記修飾が分泌ホスファターゼをもたらす、単離もしくは組換えホスファターゼ、
触媒残基付近に変異を含む、単離もしくは組換えホスファターゼ、
またはそれらのあらゆる組合せといった、修飾ホスファターゼを有する医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は随意的に、医薬的に受入れ可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を有する。
【００６６】
医薬組成物は、たとえばタブレットとして、注射可能な液体として、または点滴液としてなど、あらゆる形態で提示されてもよい。さらに、（遺伝的）修飾ホスファターゼは、たとえば静脈、直腸、気管支または経口といった、異なる経路を介して投与することができる。投与のさらに別の適切な経路は、十二指腸点滴の使用である。
【００６７】
好ましい実施形態において、投与の使用経路は静脈内投与である。当業者にとって、好ましくは有効量の（遺伝的）修飾ホスファターゼが供給されることが明らかである。開始点として１〜５，０００Ｕ／ｋｇ／日を使用することができる。静脈経路の投与が用いられる場合、（遺伝的）修飾ホスファターゼが（少なくともある時間）好ましくは持続注入を介して適用される。
【００６８】
組成物は随意的に、医薬的に許容可能な賦形剤、安定剤、活性剤、キャリア、浸透剤、推進剤、消毒剤、希釈剤および防腐剤を有してもよい。適切な賦形剤は、医薬製剤の技術において周知であり、当業者によって容易に獲得および適用され得、たとえば参考文献にRemmington’s Pharmaceutical Sciences（Mace Publishing社、ペンシルベニア州フィラデルフィア、第１７版編、１９８５年）がある。
【００６９】
経口投与について、分泌型ＡＰはたとえば、カプセル、（好ましくは腸溶性コーティングを施した）タブレットおよび粉末などの固形剤形状で、またはエリクサ、シロップおよび懸濁液などの液体剤形状で投与することができる。ＡＰは、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、でんぷん、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどの非活性成分および粉末キャリアとともに、ゼラチンカプセル内に封入することができる。所望の色、味、安定性、緩衝能力、分散または他の周知の所望の特徴を与えるのに追加され得る追加的非活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、可食白色インクなどである。同様の希釈剤は、圧縮タブレットを製造するのに使用することができる。数時間かけた薬剤の継続的放出を提供する持続的放出産物として、タブレットおよびカプセルの双方を製造することができる。圧縮タブレットは、不快なあらゆる味を覆い隠すために、およびタブレットを空気から保護するために、糖衣もしくはフィルムコーティングすることができ、または消化管における選択的分解のために腸溶コーティングすることができる。経口投与のための液体剤形状は、患者の受入れを高めるために色付けおよび香り付けを含むことができる。
【００７０】
好ましい実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼの源を含む組成物は、経口投与に適しており、胃液および低ｐＨの悪影響からＡＰを保護する腸溶コーティングを有する。腸溶コーティングおよび制御放出製剤は、当該技術において周知である。当該技術における腸溶コーティング組成物は、水溶液中に分散し、その後乾燥および／またはペレット化されてもよい、（遺伝的）修飾ホスファターゼおよび他の賦形剤などの活性成分と混合された水溶性腸溶コーティングポリマの溶液から構成されてもよい。形成された腸溶コーティングは、貯蔵中の大気水分および酸素、ならびに摂取後の胃液および低ｐＨによる（遺伝的）修飾ホスファターゼの攻撃に対して抵抗性を示す一方で、より下位の腸管に存在するアルカリ条件下で容易に分解する。
【００７１】
前述の医薬組成物は、たとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全などの治療に非常に有用である。
【００７２】
したがって、別の実施形態において、本発明は、好ましくは敗血症、炎症性腸疾患、腎不全、ならびにリウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から好ましくは選ばれる炎症の治療用の薬剤としての使用のための、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼを提供する。
【００７３】
さらに別の実施形態において、本発明は、敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全の治療用の薬剤の調製における、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼの使用を提供する。
【００７４】
敗血症は、感染が大いに疑われるか証明され、以下の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）基準の２またはそれ以上が満たされる場合、存在すると考えられる：
・毎分＞９０回の心拍数
・＜３６°Ｃ（９６．８°Ｆ）または＞３８°Ｃ（１００．４°Ｆ）の体温
・毎分＞２０回の過呼吸（高い呼吸速度）、または血液ガスについて３２ｍｍＨｇ未満のＰａＣＯ２
・＜４，０００細胞／ｍｍ３もしくは１２，０００細胞／ｍｍ３（＜４×１０９または＞１２×１０９細胞／Ｌ）の白血球数、または１０％を超える帯状体（未熟な白血球）。
【００７５】
しかし、コンセンサスな定義は、臨床的経験を反映するために、敗血症の兆候および症状のリストの最近の拡大とともに展開し続ける。敗血症のより重篤なサブセットは、重症敗血症（深刻な器官不全を伴う敗血症）および敗血性ショック（難治性動脈低血圧症を伴う敗血症）である。そうではなく、２つまたはそれ以上の全身性炎症反応症候群基準が、感染の証拠なしに満たされる場合、患者は単に「ＳＩＲＳ」と診断されるだろう。ＳＩＲＳおよび深刻な器官不全を伴う患者は、「重症ＳＩＲＳ」と呼ばれ得る。患者は、敗血症に加えて、末端器官の機能不全または４ｍｍｏｌ／ｄＬを超える血清乳酸のいずれかの、全身性循環不全の兆候がある場合、「重症敗血症」の状態にあるとして定義される。患者は、敗血症に加えて、適切な流体ボーラス投与（通常２０ｍｌ／ｋｇの晶質）後に低血圧症の状態にある場合、敗血性ショックの状態にあるとして定義される。本発明は、本発明に従う（遺伝的）修飾ホスファターゼが敗血症の治療に特に適しているという見識を与える。敗血症の場合、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼは、好ましくは静脈内投与される。
【００７６】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、大腸、場合によっては小腸の炎症状態の群である。ＩＢＤの主な形態は、クローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。はるかに少ない例を説明すると、他のＩＢＤの形態がある：コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎、不確定大腸炎。クローン病とＵＣとの主な差異は、消化管における炎症性変化の位置および性質である。クローン病は、口から肛門まで消化管のあらゆる部位に影響を及ぼし得るが、大多数の場合は回腸末端に始まる。反対に、潰瘍性大腸炎は、大腸および肛門に制限される。 顕微鏡的に見ると、潰瘍性大腸炎は粘膜（大腸の上皮層）に制限されるが、クローン病は腸壁全体に影響を及ぼす。最後に、クローン病および潰瘍性大腸炎は、（肝臓障害、関節炎、皮膚症状および眼疾患などの）腸外症状を異なった割合で呈する。まれに、患者は、クローン病および潰瘍性大腸炎の双方と診断されてきたが、これは、組合せであるか、単に、一方であるか他方であるかが不確かで識別不能であるか、である。非常に異なる疾患であるが、双方は以下のいずれかの兆候を呈し得る：腹痛、嘔吐、下痢、血便、体重減少および種々の付随する病気または疾患（関節炎、壊疽性膿皮症、原発性硬化性胆管炎）。診断は概して、病理学的病変の生検を伴う大腸内視鏡検査による。ＩＢＤの場合、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼは好ましくは、腸溶性コーティングされたタブレットを介して、または十二指腸点滴を介して投与される。
【００７７】
炎症性腸疾患の群の次に、本発明は、本発明に従うホスファターゼが他の炎症性疾患を治療するのに適しているという見識を与える。炎症性疾患は、肺、関節、肝臓、膵臓、皮膚またはさらに神経組織などの様々な器官に影響を及ぼし得る。表１０は、炎症性の影響を受け得る器官の非限定のリストを与える。幅広い種類の病原物質が、そのような炎症性疾患を引起す、または維持することが、示されてきた。前記病原物質の非限定の例は、微生物（細菌、菌類、ウイルス）、アレルゲン、自己免疫、外傷および虚血／再かん流である。原因物質および病因は非常に多様であり得るが、（亜）慢性炎症は、乱れた免疫反応に由来する。そのような狂った免疫反応は、免疫システムを活性化する炎症誘導組織障害を含む悪循環を通じて維持されると一般に考えられている。とりわけ、ＡＴＰは前述の悪循環において役割を果たすことが示されてきた。本発明は、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼが、ＡＴＰを脱リン酸化することができ、ゆえに前記悪循環を破り、このことが前記炎症性疾患を患う個体に有益であるという見識を与える。そのような炎症性疾患を治療する場合、本発明に従う（遺伝的）修飾ホスファターゼは好ましくは、静脈内投与されるか、局所的に実行可能である場合、たとえば、リウマチ性関節炎の場合は関節内に、（中枢）神経系の炎症の場合はくも膜下に、（アレルギー性）ぜんそくの場合は気管支内に、またはたとえば神経皮膚炎の場合は局所に投与される。さらに、敗血症、クローン病、リウマチ性関節炎などの（亜）慢性炎症反応は、（血清）亜鉛欠乏が付随することが記載されてきた。本発明に従うホスファターゼは、亜鉛欠乏環境に与えられた場合、その酵素活性を失わず、前記炎症性疾患を治療するのに特に適している。本発明は、本発明に従うホスファターゼが、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有し、０．０１μＭという低い準生理学的な（sub-physiological）Ｚｎ２＋濃度にてその活性を維持するという見識を与える。
【００７８】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、１０μＭ未満のＺｎ２＋濃度、好ましくは１μＭ未満のＺｎ２＋濃度、より好ましくは０．１μＭ未満のＺｎ２＋濃度を含む環境における、基質、好ましくはアデノシンリン酸の脱リン酸化のための、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有するホスファターゼの使用を提供する。
【００７９】
急性腎不全（ＡＲＦ）が、血清中クレアチニンレベルの増大をもたらす腎機能の急性損失として定義される。急性腎不全において、糸球体ろ過率が、数日から数週間にわたって減少する。結果として、窒素性廃棄物の排出が減少し、流体および電解質平衡が維持され得ない。急性腎不全の患者はしばしば無症候であり、状態は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）および血清中クレアチニンレベルの上昇が観察されることによって診断される。完全な腎機能停止は、血清中クレアチニンレベルが１日にｄＬあたり少なくとも０．５ｍｇ上昇し、尿排出量が１日に４００ｍＬ未満である（乏尿症）場合に、存在する。明細書に記載の（遺伝的）修飾ホスファターゼは、腎不全の治療において使用することができるだけでなく、特に腎機能が少なくとも部分的に障害がある／低下している場合に、腎機能を改善することもできる。好ましい実施形態において、使用された投与経路は、静脈である。好ましくは、有効量の（遺伝的）修飾ホスファターゼが送達されることが、当業者にとって明らかである。開始点として、１〜５，０００Ｕ／ｋｇ／日を用いることができる。静注ルートの投与が用いられる場合、（遺伝的）修飾ホスファターゼは好ましくは（少なくともある時間の）持続注入を介して適用される。
【００８０】
さらに別の実施形態において、本発明は、敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全を患う対象の治療方法を提供し、前記治療方法は、前記対象に有効量の、本明細書に記載されるあらゆる修飾ホスファターゼを投与することを含む。
【００８１】
本明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼが医薬組成物に組込まれ得るという事実の他に、そのようなホスファターゼは栄養組成物の一部でもあり得る。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼの源は、乳汁、好ましくは牛乳から好ましくは生産または単離される（遺伝的）修飾ホスファターゼである。乳汁は、野生型の動物と比較して、乳汁においてより高いレベルの（遺伝的）修飾ホスファターゼを生産するために育種または遺伝子操作された動物から得られてもよい。乳汁からの（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化画分の調製は、当該技術において周知である。たとえば、乳脂肪球皮膜強化画分または由来画分は、好ましい（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化乳画分であり、生乳の従来のスキミングによって定められた手順に従って得られてもよい。乳汁から単離された（遺伝的）修飾ホスファターゼが、医薬組成物において、および食品組成物または栄養補助食品において処方されてもよい。
【００８３】
好ましい実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼの、本発明に従う消化管の粘膜への経口投与用の（遺伝的）修飾ホスファターゼ含有組成物は、（遺伝的）修飾ホスファターゼが強化された食品または栄養補助食品である。１つの実施形態において、食品は、随意的に、高いレベルの（遺伝的）修飾ホスファターゼを含むように遺伝子操作された植物、果物または野菜であってよい。別の実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼ含有食品または栄養補助食品は、酪農製品である。特に、好ましくは牛乳である、無殺菌乳またはその画分を含有する製剤および組成物は、高いレベルの（遺伝的）修飾ホスファターゼを含み、本発明に従う（遺伝的）修飾ホスファターゼの源として経口投与に特に適している。
【００８４】
本発明はまた、好ましくは乳汁、乳画分または乳製品である、（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化酪農製品の調製方法に関する。この方法は、あまり腐敗しない（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化酪農製品を得るために、好ましくは牛乳である生乳の画分化、（遺伝的）修飾ホスファターゼを含有しないか強化していない画分の低温殺菌、および無殺菌の（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化画分との前記画分の再処方、を含む。無殺菌の（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化画分は、非限定の、紫外線、Ｘ線もしくはガンマ線による照射、ろ過、加圧、浸透圧、化学物質または抗生物質などの他の手段によって滅菌されてもよく、このことが、（遺伝的）修飾ホスファターゼ酵素が実質的にアクティブなままであり、乳画分が実質的に無菌となることを確実にする。この酪農製品は、組成物に使用されてもよく、または進行性敗血症、ＩＢＤもしくは腎不全を患うか、その危険のある対象に直接的に投与されてもよい。しかし、（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化酪農製品は、腸の構造的完全性の保全用の医薬または栄養補助製品として、健康な対象に提供されてもよい。
【００８５】
さらに、本発明の修飾ホスファターゼはまた、（乳汁などの）栄養物において生産される代わりに、前記栄養物に加えられ得る。さらに、後に栄養物に加えられるか、ヒトによって直接的に摂取され得る、タブレットおよび／またはカプセルが調製され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】４つのヒトアルカリホスファターゼアイソザイムの配列である。注意：これらは成熟たんぱくの（すなわち、シグナル配列のない）配列であるが、キメラＡＰを除き、ＧＰＩアンカの追加、およびＣ−末端アミノ酸の付随的処理の前である。
【図２】ＡＴＰだけでは、T84の上清とのインキュベーションでのRAW細胞におけるＩＬ−６の生産を、刺激するのに充分でない。ＡＰを追加しても、ＩＬ−６の生産への影響は見られない。
【図３】ＡＴＰ濃度の増大が、T84の上清とのインキュベーションでのRAW細胞におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−６の生産を増幅する。アルカリホスファターゼは、ＡＴＰの増幅効果を阻害するが、ＬＰＳ誘導ＩＬ−６の生産それ自身を阻害しない。
【図４】触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの比活性度は、Ｚｎ非依存性である。
【図５】ＡＬＰＩの比活性度は、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰと異なり、やがて減少する。
【図６】肝臓スライスによるＬＰＳ誘導ＮＯＸ生産が、ヒトアルカリホスファターゼの異なる分泌型アイソフォームによって阻害される。
【図７】異なるｐＨ値の０．１Ｍバッファにおいて２４時間貯蔵した、異なる分泌型ヒト組換えアルカリホスファターゼおよびウシ腸ホスファターゼ（ＢＩＡＰ）の相対酵素活性度。
【図８】異なる組換えアルカリホスファターゼの生産中に培地へ追加された異なる亜鉛塩の、酵素活性度への影響。
【図９】亜鉛の存在下における、Ａ 室温、Ｃ ３７°ＣおよびＥ ５６°Ｃでの、または亜鉛の不在下における、Ｂ 室温、Ｄ ３７°ＣおよびＦ ５６°Ｃでの貯蔵後に判定した、異なるアルカリホスファターゼの酵素活性度の安定性。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：精製した分泌型ｈＩＡＰおよび分泌型ｈＰＬＡＰのたんぱくプロフィール。レーン１）ＭＷマーカ、レーン４＋５）分泌型ｈＩＡＰの１０倍および２５倍希釈、レーン１２＋１３）分泌型ｈＰＬＡＰの１０倍および２５倍希釈。
【図１１】ＡＰ活性度判定の標準的な化学的基質である、パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）に対する４つのヒトＡＰおよびウシＡＰの酵素比活性度。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
本発明は、以下の非限定の例においてより詳細に説明される。
実験の部
材料および方法
【００８８】
実施例１
異なるホスファターゼによる、生物学的にアクティブな基質ＡＴＰの脱リン酸化
Perkin Elmerから得られるATPlite（商標）Kitは、以下の試薬を含む：哺乳類の溶解溶液、基質バッファ溶液、凍結乾燥基質溶液および凍結乾燥ＡＴＰスタンダード。
【００８９】
凍結乾燥ＡＴＰスタンダードの調製：凍結乾燥ＡＴＰ標準溶液のバイアルをミリＱでもどし、１０ｍＭ ストック溶液を得る。ミリＱの追加後、１分間回転させることによってＡＴＰを完全に溶解する。
【００９０】
ＡＴＰ脱リン化活性の判定：
開始濃度が２０μＭ ＡＴＰの６つの標準曲線を調製し、連続希釈を作製する。最終容積はウェルあたり１００μｌにすべきである。
【００９１】
１Ｕ／ｍｌのホスファターゼ酵素活性を調製する。開始濃度が１Ｕ／ｍｌの３つの標準曲線を用意し、連続希釈を作製する。最終容積は５０μｌにすべきである。
【００９２】
４０μＭ ＡＴＰ溶液を調製する。
５０μｌの１Ｕ／ｍｌ ホスファターゼ酵素溶液標準曲線および５０μｌの４０μＭ ＡＴＰ溶液を、９６ウェルの黒色のOptiplate（商標）（Perkin Elmer）に加えて合わせる。各ウェルの最終容積は１００μｌになる。
【００９３】
プレートを振とうし、３７°Ｃで９０分インキュベートする。
試薬を室温に平衡化させる。
【００９４】
製造者の勧告に従って、適切な量の基質溶液バッファを加えることによって、１つの凍結乾燥基質溶液バイアルをもどす。溶液が均質化するまでやさしく攪拌する。
【００９５】
５０μｌの哺乳類細胞溶解溶液を加え、プレートを５分間７００ｒｐｍで振とうする。
【００９６】
５０μｌの基質溶液をウェルに加え、プレートを５分間７００ｒｐｍで振とうする。
プレート上に７０％ アルコールを噴霧することによって、気泡を除去する。
【００９７】
１０分間プレートを暗順応させ、Viktor3（商標）Multi Label Reader （Perkin Elmer）上で発光を測定する。
【００９８】
実施例２
アルカリホスファターゼの異なるアイソフォームを用いた、肝臓スライスアッセイ
Ｏ２／Ｎ２Ｏ／Forene麻酔下でラットを犠牲にし、肝臓を取出し、スライスの調製までウィスコンシン大学器官保存溶液（ＵＷ）中で貯蔵した。コア（直径５ｍｍ）を肝臓組織の一片から作成し、スライスするまで氷冷ＵＷ溶液中で貯蔵した。スライスは、Krumdieckスライサで行った。グルコースを最終濃度の２５ｍＭまで補充した氷冷ＫＨＢをスライスバッファとして用いた。ラット肝臓スライス（厚さ２００〜２５０μｍ；湿重量±３ｍｇ）を標準の設定（サイクル速度３０；中断モード）で調製した。スライス後、実験開始までラット肝臓スライスをＵＷ溶液中で貯蔵した。
【００９９】
スライスを、１２ウェルプレート（Greiner、オランダ、アルフェンアーンデンレイン）において、Glutamax I（Gibco BRL、スコットランド、ペイズリー）、５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（Gibco BRL）を補充し、９５％ Ｏ２／５％ ＣＯ２で飽和した、１．３ｍｌのWilliams培地Ｅ中で、３７°Ｃにて個々にインキュベートした。スライスを、１０μｇ／ｍｌ ＬＰＳの存在下または不在下で、および異なる濃度のＡＰの異なるアイソフォームの存在下または不在下で、２４時間インキュベートした。スライスの培地は、ＮＯＸ測定まで−８０°Ｃで貯蔵した。
【０１００】
０．２７５μｌの１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２．２μｌの１０Ｕ／ｍｌ 硝酸還元酵素、および０．０５５μｌの１０ｍＭ ＦＡＤの混合物の、水で２倍に希釈した５μｌを、１１０μｌの上清に加えることによって、ＮＯＸ（ＮＯ、ＮＯ２およびＮＯ３の総体）を測定した。３０分３７°Ｃのインキュベーション後、２．２μｌの０．５Ｍ Ｎａ−ピルビン酸塩および０．５５μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＬＤＨを、水で１：０．８２に希釈した、５μｌの第２ミクスチャを加えた。５分３７°Ｃのインキュベーション後、５μｌの３０％ ＺｎＳＯ４を加え、サンプルを２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その後１００μｌの上清を新たなプレートに移し、０．１％ スルファニルアミド、０．０１％ ｎ−ナフチル−エチレン−ジアミンおよび２．５％ リン酸を含む１００μｌのGriess試薬と混合した。最後に、マイクロプレートリーダ上で５５０ｎｍにて吸光度を測定した。吸光度は、硝酸ナトリウムの標準曲線の吸光度に関連する。
【０１０１】
実施例３
細胞外ＡＴＰの脱リン酸化の生物学的効果
マウスマクロファージ細胞系RAW264.7およびヒト上皮細胞系T84（結腸直腸癌）を
American Type Culture Collection（ATCC、米国、メリーランド州、ロックビル）から得、４．５ｇ／ｌ グルコースを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地およびＤＭＥＭ培地においてそれぞれ維持した。両培地とも、Invitrogen社（オランダ、ブレダ）から得、Glutamax Iを含み、１０％ 熱不活性化FBS（Wisent社（カナダ、ケベック州））、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（双方ともIntvitrogen社）を補充した。トリプシン−ＥＤＴＡを用いてT84細胞系をコンフルエントに継代培養し、ラバーポリスマンを用いてRAW264.7細胞を剥がし取った。
【０１０２】
４×１０５のT84細胞を、２ｍｌの培地の入った１２ウェルプレート（Nunc、デンマーク、ロスキレ）内にプレートした。コンフルエントに達するとすぐに培地をリフレッシュし、細胞を、図に表わされるように（格子縞模様）、異なる濃度のＡＴＰおよび／またはＡＰの存在下または不在下において、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳの存在下（図３）または不在下（図２）で２時間インキュベートした。２時間後、上清を集めて、RAW264.7細胞を含む２４ウェルプレート内に移した。これらのRAW264.7細胞は、その前日、１ｍｌの培地中２×１０５の濃度で２４ウェルプレート（Nunc、デンマーク、ロスキレ）内にプレートしていた。T84細胞の１ｍｌの上清を移す前に、RAWの上清を吸引し、廃棄した。
【０１０３】
RAW細胞とT84の上清とを、上清を集めて市販のELISA（Biosource Europe SE、ベルギー、ニベル）を用いてサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦα）含量を調べる前に、２４時間３７°Ｃ、５％ ＣＯ２でインキュベートした。
【０１０４】
実施例４
変異体の調製
ここに記載される変異体、より具体的には、表４、表５および表６に記載される変異体は、標準的な分子生物学的技術を用いて調製した。
【０１０５】
表４〜表６において言及されるアミノ酸位置は、図１に表わされる配列に対応する。変異位置のみを示す。すなわち、野生型配列から外れているもののみを示す。たとえば、表４の変異体１は、野生型配列と比較した場合、位置８７，９３および４２９にて変化していない。すなわち、位置８７はＫ、位置９３はＧ、位置４２９はＥである。
【０１０６】
変異体は、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発法、制限酵素分析および配列分析などの標準的な分子生物学的技術によって調製し、確認する。
【０１０７】
実施例５
ｔ＝０にて、４５０±５０ユニットの異なる組換えアルカリホスファターゼを、異なるＺｎ２＋濃度の希釈バッファ（０．０２５Ｍ グリシン／ＮａＯＨ ｐＨ９．６／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１％ マンニトール／０．０５％ ＢＳＡ）に４，０００倍希釈した。第２の例において、可能性のあるＺｎ２＋源としてのＢＳＡをバッファから除外した。希釈（Ｔ＝０）後１分以内に、サンプルを採取し、以下に記載されるｐＮＰＰアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性について測定した。９０分（Ｔ＝１１/２ｈ）、１８０分（Ｔ＝３ｈ）および２２時間（Ｔ＝２２ｈ）後、各時間でサンプルを摂取し、以下に記載されるｐＮＰＰアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性について直接測定した。市販のＢＣＡキット（Pierce）を用いて以前に得られたたんぱく含量を通して、得られたＵ／ｍｌの結果を割ることによる比活性度（Ｕ／ｍｇ）によって、Ｕ／ｍｌの活性度が逆算された。
【０１０８】
ｐＮＰＰホスファターゼ活性測定：
作業基質：
試薬、基質、サンプルおよびインキュベーションチャンバの温度を２５°Ｃに設定した。分光光度計を４０５ｎｍの波長に設定し、光路は１ｃｍであった。
【０１０９】
使い捨てキュベット内に、５０μｌの被検物質および１，４５０μｌの作業基質をピペットで移して混合し、直ちにキュベットを分光光度計内に置き、４０５ｎｍでの吸光度の増加を３分間記録した。
【０１１０】
容積あたりの活性を、以下の等式：
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ΔＥ４０５／分×１．６×希釈係数
を用いて計算した。
注意：測定範囲は０．０４〜０．４Ｕ／ｍｌでなければならない。
【０１１１】
実施例６
異なるホスファターゼの安定性に及ぼすｐＨの影響
HEK293細胞において一時的に発現するアルカリホスファターゼのｐＨ安定性を調査した。４．０〜９．０のｐＨ範囲を、それらの２５°Ｃでの特異的ｐＨで調整された５つの異なる０．１Ｍ（酢酸ナトリウム、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール）およびグリシン）バッファを用いて試験した。１％ マンニトールで安定化させたＢｉＡＰを参照として用いた。アルカリホスファターゼ溶液を、各バッファにおいておおよそ１００Ｕ／ｍｌに希釈し、２４時間室温で貯蔵し、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について判定した。
【０１１２】
実施例７
異なるホスファターゼの発現に及ぼす亜鉛の影響
異なる亜鉛塩の、HEK293細胞において一時的に発現するアルカリホスファターゼの活性への影響を、１ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．１ｍＭ 亜鉛塩（ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４またはＺｎＡｃ２）を補充した培地における小規模トランスフェクションを用いて調査した。HEK293細胞を、ｓｈＩＡＰ、ｓｈＰＬＡＰ、Ｘｉｎｐｌａｐ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）およびｓＡＬＰＰ−ＡＬＰＩ−ＣＤ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）でトランスフェクトし、ｔ＝１４４ｈにてサンプルを採取し、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について分析した。
【０１１３】
実施例８
異なるホスファターゼの安定性に及ぼす亜鉛の影響
１００μＭのＺｎＣｌ２の存在または不在下において、おおよそ２０Ｕ／ｍｌの異なる（組換え）アイソフォームのアルカリホスファターゼを含む溶液を、温度安定性試験のために調製した。サンプルを室温、３７°Ｃおよび５６°Ｃで貯蔵し、酵素活性（ｐＮＰＰ）を、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いてｔ＝０、２ｈおよび２４ｈにて判定した。
【０１１４】
実施例９
アルカリホスファターゼの融合たんぱくおよび変異体の生成
適切な発現システムを選択するために、ＧＰＩアンカ配列を有する、または欠く、成熟たんぱくをコードするヒト腸（ｈＩＡＰ）およびヒト胎盤（ｈＰＬＡＰ）ｃＤＮＡを、様々なベクタ内にクローニングした。小規模感染の後、用いた発現ベクタは、ＣＭＶドライブされ、シスタチンシグナル配列を含み、精製を促進するためのＮ−末端ＨＩＳタグを付加された。うまく分泌型ｈＩＡＰおよびｈＰＬＡＰの双方を発現した後、２つの融合ヒト分泌型アルカリホスファターゼをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで構築した。１つは胎盤クラウンドメイン（成熟配列のアミノ酸３６０〜４３０）を含む腸ＡＰのバックボーンに基づき、２つ目は腸ＡＰのクラウンドメインを有する胎盤ＡＰのバックボーンに基づく（１つ目をＲｅｃＡＰまたは触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰと呼び、２つ目をｓｈＰＬＡＰ−ｓｈＩＡＰ−ＣＤまたは触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩと呼ぶ）。ヒトシスタチンシグナル配列を有する上記２つの遺伝子を合成し、ＣＭＶプロモータ含有発現ベクタにクローニングした。
【０１１５】
実施例１０
ホスファターゼ比活性度に及ぼすＧＰＩアンカの影響
ＡＰの様々な組換え型を生産し、精製し、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について評価した。さらに、サンプルのたんぱく量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびGelEvalソフトウェアを用いて測定した。活性度（Ｕ／ｍｌ）をたんぱく濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることによって比活性度を計算し、Ｕ／ｍｇで表わした。
【０１１６】
実験の部
結果
実施例１
異なるホスファターゼによる、生物学的にアクティブな基質ＡＴＰの脱リン酸化
２０μＭの最終濃度のＡＴＰを、異なる濃度のＢＩＡＰ、ｓＡＬＰＰ、ｓＡＬＰＩまたはキメラの触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰとインキュベートした。表９から、ｐＮＰＰ化学的活性は、たとえばＡＴＰといった生物学的基質に向けた活性と１：１で関連しないことが明らかである。ＢＩＡＰおよびｓＡＬＰＩはそれぞれ、０．０３１および０．００４のｐＮＰＰのユニット濃度で３７°Ｃの９０分後、ＡＴＰの５０％を超える脱リン酸化を示すが、ＡＬＰＰおよび触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＰはそれぞれ、０．１２５および０．０６２５のｐＮＰＰのユニット濃度でこの量を脱リン酸化することができるだけである。
【０１１７】
実施例２
アルカリホスファターゼの異なるアイソフォームを用いた、肝臓スライスアッセイ
ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）による刺激で、肝臓スライスがＮＯＸを生産する。図６は、異なる濃度での、異なるヒト組換えアルカリホスファターゼ（ｓＡＬＰＩ、ｓＡＬＰＰ、ＧＰＩ−アンカＡＬＰＩ、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）の存在下において、ＮＯＸ生産が有意に阻害されたことを示している。この実験において、ウシ由来ＡＬＰＩをポジティブコントロールとして、溶媒をネガティブコントロールとして用いた。
【０１１８】
ＬＰＳの追加なしでは、肝臓スライスによるＮＯＸ生産は、１０μＭ未満であり、インキュベーション中、異なるホスファターゼの存在によって有意に変化しなかった（不図示）。このことから、試験したすべてのヒトアルカリホスファターゼの組換えアイソフォームは、ＧＰＩアンカの存在に関わらず、ＬＰＳ誘導ＮＯＸ生産に関与する生物学的基質に向けた活性を有すると結論される。
【０１１９】
実施例３
細胞外ＡＴＰの脱リン酸化の生物学的効果
T84の上清とのインキュベーションでのRAW264.7細胞によるＩＬ−６の生産は、ＬＰＳに依存した。ＬＰＳなしでは（図２）、低いレベルのＩＬ−６を生産した。ＡＴＰおよびＡＰは、RAW264.7細胞によって生産されるＩＬ−６のレベルを変えられなかった。反対に、ＬＰＳが存在すると、T84の上清とインキュベートしたRAW264.7によるＩＬ−６の生産は、ＡＴＰの濃度の増大とともに、増大した。ＡＴＰによるサイトカイン生産のこの増大は、０．１Ｕ／ｍｌ以上のＡＰ濃度によって完全に減少し得た（図３）。
【０１２０】
同じプロトコルを用いたＴＮＦαについて、ならびに上皮細胞源としてT84の代わりにHT29を用いたＴＮＦαおよびＩＬ−６について、同様の結果（不図示）を得た。
【０１２１】
ＡＰはＡＴＰを脱リン酸化することによって、ＬＰＳ促進効果を減少させると結論される。ＡＰのＬＰＳに及ぼす影響は見られなかったので、ＡＰはＬＰＳを脱リン酸化することはありそうにない。ＡＴＰおよびＬＰＳの組合せは単にＡＰによってＬＰＳ単独に等しいレベルにまで減少し得た。
【０１２２】
実施例５
異なるホスファターゼのＺｎ２＋依存性の判定
図４および表７に表わされるように、Ｚｎ２＋は、ｓＡＬＰＩの比活性度を有意に安定化させたが、ｓＡＬＰＰおよびキメラの触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、培地におけるＺｎ２＋の存在に依存せず、初期の比活性度を維持した。この実験において、ｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイにおいて定められた手順に従って使用されるＢＳＡは、微量のＺｎ２＋源となり得る。したがって、第２の実験を実行した。表８および図５は、ＢＳＡの不在下およびＺｎ２＋枯渇化キレート剤ＥＤＴＡの存在下において、すべてのアイソフォームが２２時間後に比活性度を緩めることを示している。しかし、貯蔵中および反応中の生理学的（０．５〜１０ｎＭ）濃度のＺｎ２＋の追加が、ｓＡＬＰＰおよび触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの初期の比活性度のそれぞれ６０％および７５％超を保存したが、ｓＡＬＰＩの初期の比活性度の９５％超を失った。非生理学的に高い濃度のＺｎ２＋が、ｓＡＬＰＩの比活性度を保存するのに不可欠であった。
【０１２３】
したがって、キメラの触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、ｓＡＬＰＩと同程度の高い比活性度、およびｓＡＬＰＰと同程度のＺｎ２＋非依存性の比活性度を示すと結論される。Ｚｎ２＋依存性はｓＡＬＰＩクラウンドメインに起因し、一方、高い比活性度はｓＡＬＰＩ触媒ドメインに起因すると結論される。
【０１２４】
実施例６
異なるホスファターゼの安定性に及ぼすｐＨの影響
ＢｉＡＰ、ｓｈＩＡＰ、ｓｈＰＬＡＰ、ＲｅｃＡＰを、ｐＨ値が４．０，５．０，６．０，７．０，８．０および９．０の０．１Ｍ（酢酸ナトリウム、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール）およびグリシン）バッファに希釈し、室温で２４時間貯蔵した。各ｐＨ値について、初期の酵素活性および貯蔵後の酵素活性を、標準的なｐＮＰＰアッセイに従って判定した。その名前によって予想および示唆されるように、アルカリホスファターゼ活性は高いｐＨ範囲（アルカリ環境）において最適である。しかし、図７が示すように、胎盤型は、腸アイソフォームよりも安定している。さらに、この結果は、特に高いｐＨ範囲におけるこの安定性が、触媒ドメインによってではなくクラウンドメインによって決定されることを実証している。というのも、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ（ｒｅｃＡＰ）は、ｓｈＰＬＡＰの安定性プロフィールに追随し、ｐＨ５〜９で安定しているが、ＢＩＡＰおよびｓｈＩＡＰの安定性はｐＨ７〜８に制限されるからである。反対に、触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ（ｓｈＰＬＡＰ−ｈＩＡＰ−ＣＤ）は、ｐＨ９にて、胎盤型ＡＰおよび触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰよりも安定していない。このことは、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰがその活性を、試験した天然ＡＰまたは逆キメラ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）よりもかなり広い範囲のｐＨ値において維持することを実証している。
【０１２５】
実施例７
異なるホスファターゼの発現に及ぼす亜鉛の影響
HEK293細胞における小規模トランスフェクションを用いて、一時的に発現するアルカリホスファターゼの活性への異なる亜鉛塩の影響を調査した。そうするために、ｓｈＩＡＰ、ｓｈＰＬＡＰ、Ｘｉｎｐｌａｐ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）およびｓＡＬＰＰ−ＡＬＰＩ−ＣＤ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）をトランスフェクトし、ｔ＝１４４ｈにてサンプルを採取し、酵素活性について分析した。得られた結果は、酵素活性に関してＺｎ２＋イオン濃度への依存性が存在するが、観察された活性の増大は用いた亜鉛塩の種類に依存しないことを明らかにした。
【０１２６】
図８に示される結果から、得られた酵素活性は亜鉛に依存しているが、どの種類の亜鉛塩が使用されるかについては依存していないと結論される。さらに、亜鉛の追加は、ｓｈＩＡＰの生産について最も好ましく、酵素活性の誘導係数が＞３０であることが示された。ｓＡＬＰＰおよびＸｉｎｐｌａｐについて、活性増強はそれぞれ＜２および＞４であった。逆キメラ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩとも呼ばれるｓＡＬＰＰ−ＡＬＰＩ−ＣＤ）は、亜鉛不在下で生産された場合にごく僅かな活性を示したが、亜鉛存在下ではｓＡＬＰＰと同程度の活性を得た。
【０１２７】
さらに、Ｘｉｎｐｌａｐは、Ｚｎ／Ｍｇイオンの追加なしに、他の試験したＡＰのどれよりもかなり高い酵素活性を示し（係数５）、ｓｈＩＡＰまたは逆キメラ触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩと比較してＺｎ／Ｍｇにあまり依存しない。
【０１２８】
実施例８
異なるホスファターゼの安定性に及ぼす亜鉛の影響
図９は、異なる温度、および１００μＭ ＺｎＣｌ２の存在または不在下での、異なるＡＰの経時的な安定性プロフィールを示す。この結果から、亜鉛の不在下で、アルカリホスファターゼの腸アイソフォーム（ｓＡＬＰＩおよびＢＩＡＰ）は、酵素活性に関してかなり温度感受的であると結論される。３７°Ｃにて、ＢＩＡＰは２時間以内に活性の２０％を失い、２４時間後にはたった２０％の酵素活性しか残っていない。ｓｈＩＡＰは、３７°Ｃでの貯蔵２４時間後、３０％の活性の低下を示す。図９Ｃは、３７°Ｃでの安定性試験中の亜鉛の存在が、酵素を分解から保護することを示している。しかし、５６°Ｃでは、亜鉛はもはや腸アイソフォームを保護せず、双方の腸アイソフォームとも最初の２時間でほぼ完全に酵素活性を失う。反対に、ＲｅｃＡＰ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）およびｓｈＰＬＡＰ（ｓＡＬＰＰ）は、５６°Ｃにてさえ２２時間まで１００μＭの存在または不在下で優れた安定性を示す。
【０１２９】
実施例９
アルカリホスファターゼの融合たんぱくおよび変異体の生成
分泌型ｈＩＡＰおよび分泌型ｈＰＬＡＰは、ＣＭＶプロモータドライブされ、シスタチンシグナル配列を含むベクタを用いてHEK293において発現し、たんぱくのＮ−末端部分にＨＩＳタグを有した。発現たんぱくは、ＨＩＳタグを通じて精製し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した（図１０参照）。分泌型ｈＩＡＰおよびｈＰＬＡＰの懸濁培養の１リットルのたんぱく収量は、それぞれ３８および１６ｍｇであり、＞９５％の純度を示した。ｈＩＡＰおよびｈＰＬＡＰの比活性度は、それぞれ２１および１００Ｕ／ｍｇであった。
【０１３０】
これら２つの分泌型組換えホスファターゼに基づいて、２つのドメインスワップ変異型をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計し、HEK293細胞において発現した。注目すべき結果が、胎盤アルカリホスファターゼのクラウンドメインを有する腸アルカリホスファターゼバックボーンから成るＲｅｃＡＰについて得られた。ＲｅｃＡＰは、従来の培養条件下で、分泌型ｈＩＡＰと比較して５倍高い酵素活性度を示した（１４Ｕ／ｍｌ対２．７Ｕ／ｍｌ）。しかし、細胞培養およびホスファターゼ発現中の１００μＭまでの亜鉛塩の追加は、ＲｅｃＡＰの酵素活性にほんの小さな影響しか与えなかった（１８．８Ｕ／ｍｌ対亜鉛の追加なしで１４．０Ｕ／ｍｌ）が、分泌型ｈＩＡＰの活性度を有意に改善する（３７．９Ｕ／ｍｌ対亜鉛の追加なしで２．７Ｕ／ｍｌ）。一方、腸ＡＰのクラウンドメインを有する胎盤ＡＰのバックボーンに基づくドメインスワップ変異型（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）は、腸型と同程度の亜鉛依存性および分泌型ＰＬＡＰと同程度の最高活性度を示す。ｓｈＩＡＰおよび触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩの活性度において観察された増大は、亜鉛が発現および精製後に酵素に加えられた場合、達成され得ないだろう。したがって、好ましくは腸型のクラウンドメインを有するアルカリホスファターゼの発現中の１００μＭ 亜鉛の追加は、より高いアルカリホスファターゼ活性度をもたらすと結論される。
【０１３１】
実施例１０
ホスファターゼ比活性度に及ぼすＧＰＩアンカの影響
様々なＡＰ組換え型を生産し、酵素活性について評価した。図１１に示される結果は、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＢＩＡＰ）およびｒｅｃＡＰ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）が、分泌型ｈＩＡＰ、分泌型ｈＰＬＡＰおよびＧＰＩアンカｈＩＡＰよりも優れた、類似の比活性度を提示することを実証している。酵素の純度は、酵素の比活性度にとって重要である。したがって、４つのヒト酵素は実験室で精製し、一方、ＢＩＡＰは超高純度ＧＭＰバッチとして得たことに留意すべきである。さらに、分泌型ｈＩＡＰは、ＧＰＩアンカｈＩＡＰよりもおおよそ２倍高い比活性度を有することに留意すべきである。理論に限定されるのではないが、より高い比活性度は、構造または純度のいずれかに関連し得る。というのも、分泌型ＡＰは、ＧＰＩアンカ（膜結合）ＡＰよりも容易に精製されるからである。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
【表３】
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
【表６】
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
【表９】
【０１４１】
【表１０】
【０１４２】
【表１０−１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファターゼに関し、より詳細には、（遺伝的）修飾ホスファターゼ、（遺伝的）修飾ホスファターゼを有する医薬組成物、およびたとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患または腎不全などの処置すなわち治療のための（遺伝的）修飾ホスファターゼの使用、に関する。本発明はさらに、ホスファターゼの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファターゼは、その基質を脱リン酸化する、すなわち、リン酸モノエステルを、リン酸イオンおよび遊離ヒドロキシル基を有する分子に加水分解する酵素である。この作用は、ＡＴＰのようなエネルギ分子を用いることによって基質にリン酸基を付着するホスホリラーゼおよびキナーゼの作用とは正反対である。ホスファターゼは、２つの主要カテゴリに分類され得る。すなわちシステイン依存性ホスファターゼ（ＣＤＰ）およびメタロホスファターゼである。後者のホスファターゼは、活性のために、ホスファターゼの活性部位において１またはそれ以上の金属イオンの存在に依存する。
【０００３】
ＣＤＰは、ホスホ−システイン中間体を介してリン酸エステル結合の加水分解を触媒する。遊離システイン求核剤が、リン酸部分のリン原子との結合を形成し、好適に配置された酸性アミノ酸残基または水分子のいずれかによって、リン酸基をチロシンに連結しているＰ−Ｏ結合がプロトン化される。ホスホ−システイン中間体はその後、別の水分子によって加水分解され、別の脱リン酸化反応のための活性部位を再生する。
【０００４】
メタロホスファターゼは、１またはそれ以上の触媒作用に必須の金属イオンをその活性部位内に配位している。現在、これらの金属イオンの識別において幾分の混乱がある。なぜなら、これらの金属イオンを識別しようとする継続的な試みが、異なる回答をもたらすからである。現在、これらの金属は、マグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛またはこれらのあらゆる組合せであり得るという証拠がある。２つの金属イオンをブリッジする水酸化イオンが、リン酸基への求核攻撃に参加すると考えられている。
【０００５】
ホスファターゼは、たんぱくにリン酸基を追加するキナーゼ／ホスホリラーゼとは反対に作用する。リン酸基の追加は、酵素を活性化もしくは非活性化し得（たとえば、キナーゼシグナル経路）、またはたんぱく−たんぱく相互作用を生じさせることができる（たとえば、ＳＨ３ドメイン）。したがって、ホスファターゼは多くのシグナル変換経路に不可欠である。リン酸の追加および除去が、酵素の活性化または阻害に必ずしも対応しないこと、および種々の酵素が、機能調節を活性化または阻害する別個のリン酸化反応部位を有すること、に注意しなければならない。ＣＤＫはたとえば、リン酸化される特定のアミノ酸残基に依存して、活性化または非活性化され得る。リン酸は、リン酸が付着するたんぱくを調節するので、シグナル変換において重要である。調節効果を逆転させるのに、リン酸が除去される。これは、加水分解によって自身で起こるか、たんぱくホスファターゼによって媒介される。
【０００６】
本発明を限定しないが、アルカリホスファターゼが、明細書に記載され、クレームされるホスファターゼの例としてより詳細に議論される。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（ＥＣ ３．１．３．１）は、ヌクレオチド、たんぱくおよびアルカロイドを含む多くの種類の分子からリン酸基を除去するのに関与する加水分解酵素である。リン酸基の除去プロセスは、脱リン酸化と呼ばれる。名前が示すように、アルカリホスファターゼはアルカリ環境において最も効果的である。
【０００７】
アルカリホスファターゼは、分子生物学の実験室において有用なツールとなっている。というのも、ＤＮＡは通常５’末端にリン酸基を有するからである。これらのリン酸の除去が、ＤＮＡをライゲーション（同一または他の分子の３’末端への５’末端の付着）から防止する；また、リン酸基の除去は、プロセスまたは実験におけるさらなるステップを通して標識ＤＮＡの存在を測定するための放射性標識（放射性リン酸基による置換）を可能とする。これらの目的のために、エビ由来のアルカリホスファターゼが最も有用である。というのも、一旦仕事が済むと、不活性化が最も容易であるからである。
【０００８】
アルカリホスファターゼの別の重要な使用は、酵素イムノアッセイの標識としてのものである。
【０００９】
さらに、アルカリホスファターゼは、たとえば敗血症、炎症性腸疾患または腎不全の治療に使用される。
【００１０】
現在利用可能な（アルカリ）ホスファターゼは、診断および疾患の治療の双方において有用であるけれども、たとえば、改変された（たとえば改良された）比活性度、安定性（たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ１／２、または貯蔵に関する安定性（保管寿命））または基質特異性を有する、代わりのホスファターゼが必要である。さらに、異なるｐＨ、温度または塩（非）依存プロフィールを有するホスファターゼも必要である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、代わりの（遺伝的）修飾ホスファターゼを提供する。
第１の実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られる。これらの変異体は、ここではさらに「ドメインスワップ変異体」と呼ぶ。
【００１２】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）；IUBMB 酵素命名法に従うＥＣ ３．１．３．１、一般名アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、リン酸モノエステルおよびＨ２Ｏの、アルコールおよびリン酸への反応を触媒する酵素である。ＡＰの他の名前は、アルカリホスホモノエステラーゼ；ホスホモノエステラーゼ；グリセロホスファターゼ；アルカリホスホヒドロラーゼ、アルカリフェニルホスファターゼ、オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ（アルカリ最適）である。ＡＰの系統名は、リン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ（アルカリ最適）である。
【００１３】
ＡＰは、広い特異性の酵素であり、リン酸転移をも触媒する。ヒトおよび他の哺乳類において、少なくとも４つの異なる、関連するアルカリホスファターゼが周知である。ヒトにおいて、これらは、腸、胎盤、胎盤様、および肝臓／骨／腎臓（すなわち組織非特異的）アルカリホスファターゼである。最初の３つは、第２染色体に一緒に座乗し、組織非特異型は第１染色体に座乗する。ＡＰの正確な生理学的機能は知られていないが、ＡＰは、多くの生理学的プロセスに関与するように思われる。
【００１４】
胎盤アルカリホスファターゼは、ここではＡＬＰＰまたはＰＬＡＰと省略する。略称ＡＬＰＩまたはＩＡＰは、腸アルカリホスファターゼを表す。胎盤様２アルカリホスファターゼは、ここではＡＬＰＰ２、ＡＬＰＧまたはＧＣＡＰと省略し、略称ＡＬＰＬ、ＴＮＳＡＬＰ、ＴＮＡＰまたはＢＬＫは、ここでは肝臓／組織非特異的アルカリホスファターゼを表すのに使用される。同一のアルカリホスファターゼについての異なる略称は、ここでは同じように用いられる。
【００１５】
立体配座の観点から、アルカリホスファターゼはおおよそ２つのドメイン、すなわちクラウンドメインおよび活性部位ドメインから成る。活性部位ドメインは、触媒残基および３つの金属イオン部位（Ｚｎ１、Ｚｎ２およびＭｇ３）のように、別個の部分に分けることができる。一次構造の観点から、クラウンドメインは、活性部位ドメインを形成するアミノ酸の横に並ぶ（flank）ことが明らかである。ゆえに、好ましい実施形態において、触媒ドメインは、連続した配列のアミノ酸から構成されるのではなく、クラウンドメインの横に並んでいる。
【００１６】
アルカリホスファターゼのアミノ酸配列、ならびに触媒ドメインおよびクラウンドメインの相対位置は、当業者によって周知である。例として、図１を参照して、これはとりわけ、４つのヒトアルカリホスファターゼのアミノ酸配列を示す。クラウンドメインはこれらの配列において下線が引かれている。本発明のドメインスワップ変異体は好ましくは、（下線が引かれているような）自身のクラウンドメインを、（下線が引かれているような）別のホスファターゼのクラウンドメインと置換することによって、作られた。たとえば、ＡＬＰＰのクラウンドメインは、アミノ酸３６６〜４３０間に位置するので、クラウンドメインに関する好ましい実施形態において、図１のアミノ酸３６６〜４３０に対応する。すなわち、好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、図１のＡＬＰＰのクラウンドメインは、アミノ酸３６６〜４３０間に位置する。
【００１７】
アルカリホスファターゼは、細菌からヒトまで、実質的にすべての生物に存在する。好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼである。他方のホスファターゼは、たとえばＥＣＡＰ（Escherichia coliアルカリホスファターゼ）または７つの周知のＢＩＡＰ（ウシ腸アルカリホスファターゼ）の１つである。好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、異なるアルカリホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。このことは、修飾ホスファターゼがその後、たとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患または腎不全の治療といった、ヒトの治療において用いられる場合に、特に有用である。ヒト起源のそのような（遺伝的）修飾ホスファターゼは、免疫原性がない、または非常に低いと予想される。しかし、当業者にとって、修飾ホスファターゼがたとえば「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」または「ｅｘ ｖｉｖｏ」診断で使用される場合、修飾ホスファターゼは、たとえばヒトおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよいこと、またはウシおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよいことは、明確である。
【００１８】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、前記クラウンドメインは、ＡＬＰＰのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインは、ＡＬＰＩの触媒ドメインである。好ましくは、前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼであり、さらにより好ましい実施形態において、双方の異なるホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。
【００１９】
本発明まで、アルカリホスファターゼの触媒ドメインは、比活性に関して、最も重要であると一般に考えられた。さらに、クラウンドメインは、アルカリホスファターゼの安定性に関与すると考えられた。ゆえに、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメイン（さらに触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰと呼ぶ）を有する組換えアルカリホスファターゼを試験すると、この組換えアルカリホスファターゼの活性は、ＡＬＰＩの活性に匹敵すると予想されていた。しかし、たとえばFreestyle（商標）293発現培地（GIBCO）といった、Ｚｎ２＋のない、または非常に少ない培地における触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの生産が、おおよそ６００Ｕ／ｍｇの比活性度をもたらしたが、同じ細胞系および同じ培地で生産されたＡＬＰＩは、約３０Ｕ／ｍｇの比活性度をもたらした。
【００２０】
さらにより驚いたのは、生産細胞の増殖培地にＺｎ２＋イオンを加える効果であった：このことは、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの比活性度にほとんど効果がないが、ＡＬＰＩの比活性度は、おおよそ７５０Ｕ／ｍｇに増大した。生産後のよく似た濃度のＺｎ２＋の追加が、１６時間後のＡＬＰＩの比活性度においてほんの２倍の増大を誘導しただけであった。
【００２１】
これらの結果の要約が、表１および表２に挙げられる。
理論に制約されるのではないが、ＡＬＰＰのクラウンドメインは、生産された組換え触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰに立体配座変化を与え、この立体配座変化が、より高い比活性度およびＺｎ２＋非依存性酵素をもたらすと思われる。すなわちＡＬＰＰのクラウンドメインの存在は、比較的高い比活性度をもたらし、Ｚｎ２＋非依存性であると考えられる。
【００２２】
さらに、ＡＬＰＩは、酵素の比活性度を増大させるのに、生産中、高いＺｎ２＋濃度を必要とするだけでなく、ＡＬＰＩの比活性度は、Ｚｎ２＋欠乏培地において２４時間以内に減少するが、同じ条件下で、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、その初期の比活性度を維持することが示された。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ活性がＺｎ２＋非依存性であることを暗示している。活性がＺｎ２＋非依存性であるそのような酵素は、Ｚｎ２＋欠乏が病状の一部である病気（たとえば、栄養不良、アルコール依存症および腸完全性障害、敗血症または炎症性疾患を概して含む慢性感染症）において、またはＺｎ２＋の追加が禁忌であるかもしれない病気（たとえば、敗血症の急性期、自己免疫疾患）において、有用であり得る。生産および用途の利点は別として、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、貯蔵中の安定性に関しても利点を有する。
【００２３】
上に述べたように、ＡＬＰＩなどの天然ＡＰは、低いＺｎ２＋濃度の環境においてその酵素活性を失うことが示されてきた。ゆえに、Ｚｎ２＋欠乏が病状の一部である疾患において、前記天然のＡＰは、最も有益であると考えられる部位、たとえば炎症の部位にて、その酵素活性を現すことができない。反対に、たとえば触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰといった、低いＺｎ２＋濃度に感受性でない組換えＡＰは、低いＺｎ２＋濃度の環境において、たとえば炎症部位にて、その活性を維持する。健康な個体で、Ｚｎ２＋血清標準値が１０〜２０μＭである。たとえば、アルコール依存症において、または栄養不良中、そのレベルは１０μＭ未満、または１μＭ未満にさえ減少し得る。ヒトの体内の種々の酵素は、その活性のためにＺｎ２＋に依存しており、たとえば免疫応答は、充分なレベルのＺｎ２＋が存在すれば、より効果的である。免疫システムの先天的部分および特異的部分は、亜鉛によって影響されることが知られており、亜鉛含有たんぱくが炎症部位に蓄積することが立証されてきた。さらに、リウマチ性関節炎、敗血症およびクローン病などの（亜）慢性炎症は、血清亜鉛欠乏を呈する。驚いたことに、本発明はまた、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰが、非修飾（組換え体）アルカリホスファターゼよりもかなり広いｐＨ範囲においてその活性を維持するという見識を与える。炎症および／または虚血などの多くの疾患が、組織のｐＨの攪乱を包含するという事実を踏まえて、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、そのような疾患の治療に特に有用である。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを、好ましくは攪乱された組織のｐＨが付随する疾患の治療における使用のための薬剤として有するホスファターゼの使用を提供し、好ましくは前記疾患が、炎症性疾患および／または虚血が付随する疾患を含む。
【００２４】
本発明は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有する組換えホスファターゼ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）が、局所性または全身性Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療に特に有用であるという見識を与える。したがって別の実施形態において、本発明は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを、好ましくはＺｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療における使用のための薬剤として有するホスファターゼの使用を提供する。好ましくは、前記疾患は、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれる、炎症性疾患を含む。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療のための薬剤の調製における、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有するホスファターゼの使用を提供し、好ましくは、前記疾患は炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれる疾患を含む。
【００２６】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患を治療するための、対象（好ましくはヒト）の治療方法を提供し、前記治療方法は、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有する有効量のホスファターゼを、ホスファターゼを必要とする対象に投与することを含み、前記疾患は、好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれる。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する、単離または組換えアルカリホスファターゼを提供し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られ、前記クラウンドメインはＡＬＰＩのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインはＡＬＰＰの触媒ドメインである（さらに触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩと呼ぶ）。好ましくは、前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼであり、さらにより好ましい実施形態において、双方の異なるホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。
【００２８】
ヒトアルカリホスファターゼに基づく他の好ましいドメインスワップ変異体は以下のとおりである。
【００２９】
明瞭にする目的で、ＡＬＰＩは腸ＡＰであり、ＡＬＰＰは胎盤ＡＰであり、ＧＣＡＰは胎盤様ＡＰであり、ＴＮＡＰは組織非特異的ＡＰである。
【００３０】
ＥＣＡＰまたはヒト型（ＡＬＰＩ、ＡＬＰＰ、ＧＣＡＰまたはＴＮＡＰ）のいずれかの触媒ドメインと、ＢＩＡＰのクラウンドメインとの組合せもなされ得ることが明らかである。さらに、ＢＩＡＰのクラウンドメインとＥＣＡＰまたはヒト型のいずれかの触媒ドメインとの組合せも生産され得る。
【００３１】
明細書、例および当該技術の文献を通して、他の命名が、アルカリホスファターゼの各アイソフォームを指定するのに使用される。明瞭にする目的で、以下の表において、一般に使用される、または本願において使用される、名前および略称が記載される。
【００３２】
有用な修飾ホスファターゼの別のクラスは、自然条件下では、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカを介して細胞膜に連結するホスファターゼであるが、ホスファターゼはもはや細胞膜に付着しないように今や修飾される。ＧＰＩアンカされるホスファターゼの例は、アルカリホスファターゼおよび5 ’-ヌクレオチダーゼである。すべてのアイソザイムは、細胞膜において機能的にアクティブであり、ＧＰＩアンカ欠損型は、検出可能なレベルで自然に存在しない。血清アルカリホスファターゼ活性が明示されてきたけれども、酵素は、放出膜画分または膜小胞においてなお存在することが通常認められる。乳汁のＡＰ活性は、膜小胞を含む画分にも存在する。ＧＰＩアンカは、トランスアミダーゼを介して付着部位に付着する、前駆体分子として細胞に貯蔵される。ＧＰＩアンカのバックボーンは哺乳類において同一であるが、細胞型依存性修飾が知られている。
【００３３】
アルカリホスファターゼは、原形質膜と関連して、そのＧＰＩアンカを介して、主に見られる。たとえば、好中球が、炎症性微環境内に酵素を放出する代わりに、好中球の負にチャージされた細胞膜のバックグラウンドに対して酵素を提示する。この理由により、ＡＰの最適なｉｎ ｖｉｖｏ活性のために、酵素は、細胞膜または小胞膜に組込まれなければならないことが一般的に認められる。さらに、ポリアニオン性基質が、アルカリ性のｐＨにて通常最適であるホスファターゼ酵素およびその誘導体のホスファターゼ活性、特にアルカリホスファターゼのホスファターゼ活性に好適なアニオン性条件にさらに寄与し得ることが観察されてきた。
【００３４】
ヒト対象者におけるＡＰの医薬的使用について、ほとんどの用途について、ヒト型の酵素を薬剤および治療に適用することが必要条件である。というのも、他種から得られたＡＰ型は、ヒト対象者において免疫原性となり得、治療が免疫学的反応および病理学的副作用を引起し得るからである。いくつかの対象において、致死的な副作用、すなわちアナフィラキシショック（発明者らの動物研究で示された）でさえ起こり得るので、免疫学的副作用の危険は最小化されなければならない。ヒトからのＡＰの単離は、実際的に実現可能ではないので、ＡＰたんぱくのヒト組換え型が、異なる組換え発現プラットフォームにおいて、定められた手順に従って生産され得る。しかし、ＧＰＩ含有の膜アンカたんぱくの発現および精製は、知っての通り困難である。ＧＰＩたんぱくは、膜から分離するのが困難であり、単離および精製するのが困難である。しかし、ＧＰＩアンカおよび膜局在性は、ＡＰの生物学的活性に不可欠であると常にみなされてきた。
【００３５】
本発明のこの部分は、ＧＰＩアンカを欠くヒトＡＰ酵素が、可溶性であり、組換えたんぱく発現システムによって容易に分泌され、肝細胞ベースの生物学的アッセイにおいて、生理学的ｐＨレベルにてかなりのホスファターゼ活性を、生物学的に関連のあるリン酸化基質に向けて提示するという驚くべき発見に基づいている。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は分泌ホスファターゼをもたらす、すなわちホスファターゼは細胞膜に付着しない。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は、生物学的にアクティブである、すなわち生物学的（関連）基質に向けて活性を示す分泌ホスファターゼをもたらす。
【００３８】
ＧＰＩアンカの付着に関与する一般的な配列はないが、明確なコンセンサスはある。
１）Ｃ−末端のアミノ酸の疎水性ストレッチ（少なくとも１１のアミノ酸だが、好ましくは１２以上のアミノ酸）
２）疎水性領域の上流に、親水性アミノ酸のスペーサ（５〜１２のアミノ酸）
３）ＧＰＩが、小さいアミノ酸：グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリンまたはシステイン、に付着している
４）ＧＰＩ付着部位の下流の、２つの続くアミノ酸は、小さいアミノ酸でなければならず、大多数の場合、グリシン、アスパラギン酸、アスパラギン、アラニン、セリンまたはシステインから選ばれる。
【００３９】
このコンセンサスに基づいて、当業者はたとえば、１つまたは多数のアミノ酸を挿入し、コンセンサスの一部を乱すことによって、コンセンサスを変異させることができる。しかし、好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は分泌ホスファターゼを提供し、前記修飾は、コンセンサスＧＰＩシグナル配列を包含するアミノ酸配列の変異または欠失を含む。
【００４０】
ヒトの治療における用途について、結果として得られる修飾ホスファターゼは、免疫原性がない、または非常に低いこと、すなわち修飾ホスファターゼは、原則的にヒト起源のものであることが所望される。好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は（好ましくは生物学的に関連のある基質に対する活性を有する）分泌ホスファターゼをもたらし、前記ホスファターゼは、ヒトホスファターゼである。
【００４１】
ＧＰＩアンカされるホスファターゼの例は、アルカリホスファターゼおよび５’−ヌクレオチダーゼであるので、好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾は分泌ホスファターゼをもたらし、前記ホスファターゼは、たとえば、ヒト肝−腎−骨ホスファターゼ、ヒト腸アルカリホスファターゼ、またはヒト胎盤様アルカリホスファターゼなどのヒトアルカリホスファターゼといったアルカリホスファターゼである。
【００４２】
記載されるあらゆる分泌型修飾ホスファターゼは、たとえば、宿主細胞内に、前記分泌型ホスファターゼを調節配列と操作可能に連鎖してコードし、前記宿主細胞が前記分泌型ホスファターゼを発現することを可能にする核酸を導入することによって、および生産されたホスファターゼを、宿主細胞が増殖および／または維持される培地から随意的に単離することによって、生産し得ることが明確である。しかし、前述のＧＰＩ付着配列における変異とは別に、ＧＰＩアンカなしの分泌たんぱくを作る他の方法が存在する。
【００４３】
１）膜アンカたんぱくとしての発現後、ＧＰＩアンカを切除するのにホスホリパーゼが使用されてもよい。ゆえに、本発明はまた、膜アンカホスファターゼを発現することができる宿主を培養することを含む分泌ホスファターゼの生産方法を提供し、前記宿主細胞が、前記ホスファターゼを生産することを可能にし、得られた細胞をホスホリパーゼとインキュベートして、放出されたホスファターゼを随意的に単離する。膜アンカホスファターゼは、たとえば、野生型（または自然もしくは非修飾の）ホスファターゼである。しかし、膜アンカホスファターゼは、その配列の他の部分（たとえばクラウンドメイン）に変異を含むことができる。
【００４４】
２）ＧＰＩアンカの生産への干渉、またはＧＰＩアンカ生産が欠損している細胞（型）の使用が、そうでなければＧＰＩ−アンカされるたんぱくの分泌型を作るのに利用されてもよい。ＧＰＩアンカリング生化学が欠損させられた細胞系の例は、たとえばJur kat、AM-B、C84、BW、S49、CHOおよびRajiである。さらに別の実施形態において、本発明は従って、分泌型（アルカリ）ホスファターゼを発現することができる宿主細胞（たとえば、言及した修飾分泌（アルカリ）ホスファターゼのいずれかをコードする核酸配列を有する宿主細胞）を培養することを含む分泌ホスファターゼの生産方法を提供し、前記宿主が前記分泌型ホスファターゼを生産することを可能にし、生産されたホスファターゼを随意的に単離し、前記宿主細胞は、機能的ＧＰＩアンカたんぱくの生合成が可能ではない。しかし、宿主細胞は、機能的ＧＰＩシグナル配列を有するホスファターゼを生産してもよい。
【００４５】
３）トランスアミダーゼへの干渉、またはトランスアミダーゼが欠損した細胞の使用が、たんぱくへのＧＰＩアンカの付着を阻害するのに使用されてもよく、たんぱくをアンカなしに、かつ分泌可能にする。このような欠損細胞は、CHOにおける変異生成を通して得られた。
【００４６】
クラウンドメインおよび触媒ドメインを有する修飾ホスファターゼであって、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインが、異なるアルカリホスファターゼから得られる修飾ホスファターゼが、さらに修飾され、分泌可能にされることが可能であることは、当業者に明らかである。ゆえに、好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列に修飾を含む、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記修飾が分泌ホスファターゼをもたらし、前記組換えホスファターゼはさらに、異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインを有する。このような（アルカリ）ホスファターゼ変異体の例が、図１に与えられる。このような結合または「二重」変異体は、たとえば、ある比活性、安定性または基質特異性を有する修飾ホスファターゼをもたらすと同時に、このような生産物の生産は、生産細胞を囲繞する培地から単離することができるという事実によって、大いに改善する。
【００４７】
アルカリホスファターゼの触媒ドメインは、酵素の一次配列において隣接しない様々なアミノ酸配列から構成される。触媒ドメインは、脱リン酸化反応において基質から切除されたリン酸基のアクセプタとして機能する触媒セリン残基（ＡＬＰＰにおけるＳｅｒ９２）を含む。酵素の触媒ドメインはさらに、１またはそれ以上の金属イオンを有する。触媒ドメイン内に含まれる特定のアミノ酸残基が、脱リン酸化反応に関与する金属イオンの結合および配位に関与する。ＡＬＰＰにおいて、金属配位残基は：Ａｓｐ４２、Ｈｉｓ１５３、Ｓｅｒ１５５、Ｇｌｕ３１１、Ａｓｐ３１６、Ｈｉｓ３２０、Ａｓｐ３５７、Ｈｉｓ３５８、Ｈｉｓ３６０およびＨｉｓ４３２である。
【００４８】
さらに別の実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供する。当業者は、触媒残基周り（すなわち、好ましくは立体配座の、触媒残基付近の）、および／または金属イオン配位リン酸ポケット内の、アミノ酸を確実に識別し、変異させることができる。すでに前述されたように、ホスファターゼの配列は周知である。例のように、図１は、とりわけ４つのヒトアルカリホスファターゼのアミノ酸配列を示す。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記ホスファターゼはヒトホスファターゼである。このことは、修飾ホスファターゼがその後、たとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患または腎不全の治療といった、ヒトの治療において用いられる場合に、特に有用である。ヒト起源のそのような（遺伝的）修飾ホスファターゼは、免疫原性がない、または非常に低いと予想される。しかし、当業者にとって、修飾ホスファターゼがたとえば「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」または「ｅｘ ｖｉｖｏ」診断で使用される場合、修飾ホスファターゼは、たとえばヒトおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよく、またはウシおよびE. coliのアルカリホスファターゼで構成されてもよいことは、明確である。
【００５０】
さらに別の好ましい実施形態において、前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。
【００５１】
金属イオン配位リン酸結合ポケットは、少なくともヒトアルカリホスファターゼアイソフォームについて、保存されている。このポケットは、２つのＺｎ結合ストレッチおよび１つのＭｇ結合ストレッチから構成され、Ｚｎ１についてアミノ酸Ａｓｐ３１６、Ｈｉｓ３２０およびＨｉｓ４３２を、Ｚｎ２についてＡｓｐ４２、Ａｓｐ３５７およびＡｓｐ３５８を、ならびにＭｇについてＳｅｒ１５５およびＧｌｕ３１をそれぞれ有する（図１のＡＬＰＰが参照される）。
【００５２】
配位アミノ酸残基および／または配位残基付近に配置される残基の変異が、積極的または消極的に、結果として生じる変異体酵素の触媒特性に影響を及ぼしそうである。たとえば、ＡＬＰＰにおいて、アミノ酸残基４４，８７，９３，３２２，３２３および４２９が、配位残基付近に配置される。これらの残基の、ＡＬＰＩの対応する１，２，３または４つのアミノ酸との置換による変異生成が、酵素の触媒特性に影響を及ぼし得る。逆に、ＡＬＰＩのアミノ酸残基４４，８７，９３，３２２，３２３および４２９の、ＡＬＰＰの対応するアミノ酸との置換が、ＡＬＰＩ酵素の触媒特性に影響を及ぼし得る。表４および表５は、置換され得るアミノ酸（の組合せ）を示す。
【００５３】
ゆえに、好ましい実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供し、前記変異は、表４、表５または表６に表わされるような変異である。
【００５４】
触媒残基付近および／または金属イオン含有リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼが、たとえばＧＰＩシグナル配列において修飾を有するようにさらに修飾されることが可能であることは、当業者に明らかである。このような変異体は、触媒のドメインおよびクラウンドメインによって、すなわち前記クラウンドメインおよび触媒ドメインが異なるホスファターゼから得られるように、さらに修飾されることさえ可能である。
【００５５】
さらに別の実施形態において、触媒残基付近および／または金属イオン配位含有リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼが、触媒およびクラウンドメインのドメインスワップによってさらに修飾される、すなわち前記クラウンドメインおよび触媒ドメインが異なるホスファターゼから得られるようにすることも可能である。
【００５６】
さらに、さらに別の実施形態において、本発明は、触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有する、単離または組換えホスファターゼを提供する。
【００５７】
記載されたあらゆる（遺伝的）修飾ホスファターゼに達するための分子生物学の技術は、当業者にとって周知であり、制限酵素インキュベーション、ライゲーション、ＰＣＲ、変異の導入などの技術を含む。
【００５８】
さらに別の実施形態において、本発明は、たとえば、ドメインスワップ変異体をコードする核酸配列、分泌ホスファターゼをコードする核酸、または分泌ドメインスワップ変異体をコードする核酸配列など、明細書に記載されるホスファターゼをコードする核酸配列を提供する。本発明はさらに、明細書に記載されるホスファターゼをコードする核酸配列を有するベクタを提供する。このようなベクタは好ましくは、ホスファターゼをコードする核酸配列の転写／翻訳に必須の要素（たとえば、プロモータおよび／または終了配列）などの、追加的な核酸配列を含む。前記ベクタは、前記ベクタで形質転換された宿主細胞を選択または維持するための選択マーカ（たとえば抗生物質）をコードする核酸配列を有してもよい。適切なベクタの例は、クローニングベクタまたは発現ベクタである。適切な宿主細胞における発現を仲介するのに適切なあらゆるベクタが、宿主細胞において統合されるか、エピソームとして複製するかのいずれかで、本発明に従って使用されてもよい。ベクタは、プラスミド、（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルスを含む）ウイルス、コスミド、ファージもしくはファージミド、エピゾームベクタまたは人工染色体であってもよい。
【００５９】
さらに、本発明はまた、明細書に記載される核酸配列またはベクタを有する宿主細胞を提供する。細胞は、組換えたんぱくの生産に適している、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、植物細胞または酵母細胞であってもよい。適切な酵母宿主細胞は、Saccharomyces
cerevisiaeおよびPichia pastorisを含む。好ましい宿主細胞は、BHK、HEK293、CHOまたはPerC6（商標）などの、哺乳類（またはより好ましくはヒト）由来細胞である。
【００６０】
明細書に記載されるホスファターゼをコードする核酸配列、前記核酸配列を有するベクタ、前記核酸配列を有する宿主細胞、または前記核酸配列を有するベクタが、修飾ホスファターゼの生産に非常に有用である。ホスファターゼはグリコシル化部位を含むので、ホスファターゼは好ましくは、所望のグリコシル化パターンを提供する細胞において生産される。好ましい実施形態において、使用される生産システムは、哺乳類（たとえばヒト）ｉｎ ｖｉｔｒｏ生産プラットフォームであり、さらにより好ましくは、生産は大規模生産を含む。別の好ましい実施形態において、用いられる生産システムは、人工のヒト様グリコシル化パターンが導入される、植物、酵母または哺乳類（好ましくは非ヒト）プラットフォームである。
【００６１】
異なる生産方法を試験すると、本発明の発明者らは驚いたことに、野生型または変異体（アルカリ）ホスファターゼの生産中のＺｎ２＋イオンの存在が、生産されるホスファターゼの比活性度に影響を及ぼし得ることを見出した。たとえば、ＡＬＰＩの比活性度は、使用される宿主細胞の増殖培地にＺｎ２＋を加えることによって、３０Ｕ／ｍｇから７５０Ｕ／ｍｇに増大し得る。宿主細胞を培養するのに標準的に使用される培地は、０．５〜３ｎＭ Ｚｎ２＋を有する。１ｍＭまでＺｎ２＋を加えると、比活性度が大幅に改善した。したがって、ＡＬＰＩはＺｎ２＋依存性ホスファターゼであると結論される。このことは、Ｚｎ２＋非依存性であるように思われる、すなわち、宿主細胞の培養中のＺｎ２＋の不在が、生産されるホスファターゼの比活性度に有意に影響を及ぼさず、貯蔵中および反応中のＺｎ２＋の不在が、比活性度を低下させない、すでに記載した触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ変異体とは対照的である。
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明はホスファターゼの生産方法を提供し、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能にすることを含む。好ましい実施形態において、前記宿主細胞は哺乳類細胞であり、別の好ましい実施形態において、前記ホスファターゼはヒトホスファターゼである。さらに別の実施形態において、前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。本発明の方法は、野生型（または自然もしくは非遺伝的修飾の）ホスファターゼを生産するのに使用することができ、たとえば明細書に記載されるあらゆるホスファターゼである、遺伝的修飾ホスファターゼを生産するのにも同様に使用することができる。
【００６３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、ホスファターゼの生産方法を提供し、前記方法は、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能とすることを含み、前記方法はさらに、前記ホスファターゼを単離することを含む。本発明はさらに、ホスファターゼの生産方法によって得ることができるホスファターゼを提供し、前記生産方法は、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能とすることを含む。
【００６４】
明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼがある比活性度、ある基質特異性またはある安定性（たとえばｐＨ、温度、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の時間）を有するか否かは、当業者が、市販の基質を用い、アルカリホスファターゼとのインキュベートによる無機リン酸の放出を市販のキットで測定することによって、容易に試験することができる。さらに、修飾ホスファターゼが生物学的に関連のある活性を有するかを判定する、明細書の実験部に記載の試験を用いることも可能である。
【００６５】
すでに言及したように、明細書に記載の（遺伝的）修飾ホスファターゼは、診断および治療に有用である。１つの実施形態において、本発明は、たとえば、
クラウンドメインおよび触媒ドメインを有し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られる、単離もしくは組換えアルカリホスファターゼ、
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列において修飾を有し、前記修飾が分泌ホスファターゼをもたらす、単離もしくは組換えホスファターゼ、
触媒残基付近に変異を含む、単離もしくは組換えホスファターゼ、
またはそれらのあらゆる組合せといった、修飾ホスファターゼを有する医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は随意的に、医薬的に受入れ可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を有する。
【００６６】
医薬組成物は、たとえばタブレットとして、注射可能な液体として、または点滴液としてなど、あらゆる形態で提示されてもよい。さらに、（遺伝的）修飾ホスファターゼは、たとえば静脈、直腸、気管支または経口といった、異なる経路を介して投与することができる。投与のさらに別の適切な経路は、十二指腸点滴の使用である。
【００６７】
好ましい実施形態において、投与の使用経路は静脈内投与である。当業者にとって、好ましくは有効量の（遺伝的）修飾ホスファターゼが供給されることが明らかである。開始点として１〜５，０００Ｕ／ｋｇ／日を使用することができる。静脈経路の投与が用いられる場合、（遺伝的）修飾ホスファターゼが（少なくともある時間）好ましくは持続注入を介して適用される。
【００６８】
組成物は随意的に、医薬的に許容可能な賦形剤、安定剤、活性剤、キャリア、浸透剤、推進剤、消毒剤、希釈剤および防腐剤を有してもよい。適切な賦形剤は、医薬製剤の技術において周知であり、当業者によって容易に獲得および適用され得、たとえば参考文献にRemmington’s Pharmaceutical Sciences（Mace Publishing社、ペンシルベニア州フィラデルフィア、第１７版編、１９８５年）がある。
【００６９】
経口投与について、分泌型ＡＰはたとえば、カプセル、（好ましくは腸溶性コーティングを施した）タブレットおよび粉末などの固形剤形状で、またはエリクサ、シロップおよび懸濁液などの液体剤形状で投与することができる。ＡＰは、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、でんぷん、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどの非活性成分および粉末キャリアとともに、ゼラチンカプセル内に封入することができる。所望の色、味、安定性、緩衝能力、分散または他の周知の所望の特徴を与えるのに追加され得る追加的非活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、可食白色インクなどである。同様の希釈剤は、圧縮タブレットを製造するのに使用することができる。数時間かけた薬剤の継続的放出を提供する持続的放出産物として、タブレットおよびカプセルの双方を製造することができる。圧縮タブレットは、不快なあらゆる味を覆い隠すために、およびタブレットを空気から保護するために、糖衣もしくはフィルムコーティングすることができ、または消化管における選択的分解のために腸溶コーティングすることができる。経口投与のための液体剤形状は、患者の受入れを高めるために色付けおよび香り付けを含むことができる。
【００７０】
好ましい実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼの源を含む組成物は、経口投与に適しており、胃液および低ｐＨの悪影響からＡＰを保護する腸溶コーティングを有する。腸溶コーティングおよび制御放出製剤は、当該技術において周知である。当該技術における腸溶コーティング組成物は、水溶液中に分散し、その後乾燥および／またはペレット化されてもよい、（遺伝的）修飾ホスファターゼおよび他の賦形剤などの活性成分と混合された水溶性腸溶コーティングポリマの溶液から構成されてもよい。形成された腸溶コーティングは、貯蔵中の大気水分および酸素、ならびに摂取後の胃液および低ｐＨによる（遺伝的）修飾ホスファターゼの攻撃に対して抵抗性を示す一方で、より下位の腸管に存在するアルカリ条件下で容易に分解する。
【００７１】
前述の医薬組成物は、たとえば敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全などの治療に非常に有用である。
【００７２】
したがって、別の実施形態において、本発明は、好ましくは敗血症、炎症性腸疾患、腎不全、ならびにリウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から好ましくは選ばれる炎症の治療用の薬剤としての使用のための、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼを提供する。
【００７３】
さらに別の実施形態において、本発明は、敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全の治療用の薬剤の調製における、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼの使用を提供する。
【００７４】
敗血症は、感染が大いに疑われるか証明され、以下の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）基準の２またはそれ以上が満たされる場合、存在すると考えられる：
・毎分＞９０回の心拍数
・＜３６°Ｃ（９６．８°Ｆ）または＞３８°Ｃ（１００．４°Ｆ）の体温
・毎分＞２０回の過呼吸（高い呼吸速度）、または血液ガスについて３２ｍｍＨｇ未満のＰａＣＯ２
・＜４，０００細胞／ｍｍ３もしくは１２，０００細胞／ｍｍ３（＜４×１０９または＞１２×１０９細胞／Ｌ）の白血球数、または１０％を超える帯状体（未熟な白血球）。
【００７５】
しかし、コンセンサスな定義は、臨床的経験を反映するために、敗血症の兆候および症状のリストの最近の拡大とともに展開し続ける。敗血症のより重篤なサブセットは、重症敗血症（深刻な器官不全を伴う敗血症）および敗血性ショック（難治性動脈低血圧症を伴う敗血症）である。そうではなく、２つまたはそれ以上の全身性炎症反応症候群基準が、感染の証拠なしに満たされる場合、患者は単に「ＳＩＲＳ」と診断されるだろう。ＳＩＲＳおよび深刻な器官不全を伴う患者は、「重症ＳＩＲＳ」と呼ばれ得る。患者は、敗血症に加えて、末端器官の機能不全または４ｍｍｏｌ／ｄＬを超える血清乳酸のいずれかの、全身性循環不全の兆候がある場合、「重症敗血症」の状態にあるとして定義される。患者は、敗血症に加えて、適切な流体ボーラス投与（通常２０ｍｌ／ｋｇの晶質）後に低血圧症の状態にある場合、敗血性ショックの状態にあるとして定義される。本発明は、本発明に従う（遺伝的）修飾ホスファターゼが敗血症の治療に特に適しているという見識を与える。敗血症の場合、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼは、好ましくは静脈内投与される。
【００７６】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、大腸、場合によっては小腸の炎症状態の群である。ＩＢＤの主な形態は、クローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。はるかに少ない例を説明すると、他のＩＢＤの形態がある：コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎、不確定大腸炎。クローン病とＵＣとの主な差異は、消化管における炎症性変化の位置および性質である。クローン病は、口から肛門まで消化管のあらゆる部位に影響を及ぼし得るが、大多数の場合は回腸末端に始まる。反対に、潰瘍性大腸炎は、大腸および肛門に制限される。 顕微鏡的に見ると、潰瘍性大腸炎は粘膜（大腸の上皮層）に制限されるが、クローン病は腸壁全体に影響を及ぼす。最後に、クローン病および潰瘍性大腸炎は、（肝臓障害、関節炎、皮膚症状および眼疾患などの）腸外症状を異なった割合で呈する。まれに、患者は、クローン病および潰瘍性大腸炎の双方と診断されてきたが、これは、組合せであるか、単に、一方であるか他方であるかが不確かで識別不能であるか、である。非常に異なる疾患であるが、双方は以下のいずれかの兆候を呈し得る：腹痛、嘔吐、下痢、血便、体重減少および種々の付随する病気または疾患（関節炎、壊疽性膿皮症、原発性硬化性胆管炎）。診断は概して、病理学的病変の生検を伴う大腸内視鏡検査による。ＩＢＤの場合、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼは好ましくは、腸溶性コーティングされたタブレットを介して、または十二指腸点滴を介して投与される。
【００７７】
炎症性腸疾患の群の次に、本発明は、本発明に従うホスファターゼが他の炎症性疾患を治療するのに適しているという見識を与える。炎症性疾患は、肺、関節、肝臓、膵臓、皮膚またはさらに神経組織などの様々な器官に影響を及ぼし得る。表１０は、炎症性の影響を受け得る器官の非限定のリストを与える。幅広い種類の病原物質が、そのような炎症性疾患を引起す、または維持することが、示されてきた。前記病原物質の非限定の例は、微生物（細菌、菌類、ウイルス）、アレルゲン、自己免疫、外傷および虚血／再かん流である。原因物質および病因は非常に多様であり得るが、（亜）慢性炎症は、乱れた免疫反応に由来する。そのような狂った免疫反応は、免疫システムを活性化する炎症誘導組織障害を含む悪循環を通じて維持されると一般に考えられている。とりわけ、ＡＴＰは前述の悪循環において役割を果たすことが示されてきた。本発明は、明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼが、ＡＴＰを脱リン酸化することができ、ゆえに前記悪循環を破り、このことが前記炎症性疾患を患う個体に有益であるという見識を与える。そのような炎症性疾患を治療する場合、本発明に従う（遺伝的）修飾ホスファターゼは好ましくは、静脈内投与されるか、局所的に実行可能である場合、たとえば、リウマチ性関節炎の場合は関節内に、（中枢）神経系の炎症の場合はくも膜下に、（アレルギー性）ぜんそくの場合は気管支内に、またはたとえば神経皮膚炎の場合は局所に投与される。さらに、敗血症、クローン病、リウマチ性関節炎などの（亜）慢性炎症反応は、（血清）亜鉛欠乏が付随することが記載されてきた。本発明に従うホスファターゼは、亜鉛欠乏環境に与えられた場合、その酵素活性を失わず、前記炎症性疾患を治療するのに特に適している。本発明は、本発明に従うホスファターゼが、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有し、０．０１μＭという低い準生理学的な（sub-physiological）Ｚｎ２＋濃度にてその活性を維持するという見識を与える。
【００７８】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、１０μＭ未満のＺｎ２＋濃度、好ましくは１μＭ未満のＺｎ２＋濃度、より好ましくは０．１μＭ未満のＺｎ２＋濃度を含む環境における、基質、好ましくはアデノシンリン酸の脱リン酸化のための、ＡＬＰＩの触媒ドメインおよびＡＬＰＰのクラウンドメインを有するホスファターゼの使用を提供する。
【００７９】
急性腎不全（ＡＲＦ）が、血清中クレアチニンレベルの増大をもたらす腎機能の急性損失として定義される。急性腎不全において、糸球体ろ過率が、数日から数週間にわたって減少する。結果として、窒素性廃棄物の排出が減少し、流体および電解質平衡が維持され得ない。急性腎不全の患者はしばしば無症候であり、状態は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）および血清中クレアチニンレベルの上昇が観察されることによって診断される。完全な腎機能停止は、血清中クレアチニンレベルが１日にｄＬあたり少なくとも０．５ｍｇ上昇し、尿排出量が１日に４００ｍＬ未満である（乏尿症）場合に、存在する。明細書に記載の（遺伝的）修飾ホスファターゼは、腎不全の治療において使用することができるだけでなく、特に腎機能が少なくとも部分的に障害がある／低下している場合に、腎機能を改善することもできる。好ましい実施形態において、使用された投与経路は、静脈である。好ましくは、有効量の（遺伝的）修飾ホスファターゼが送達されることが、当業者にとって明らかである。開始点として、１〜５，０００Ｕ／ｋｇ／日を用いることができる。静注ルートの投与が用いられる場合、（遺伝的）修飾ホスファターゼは好ましくは（少なくともある時間の）持続注入を介して適用される。
【００８０】
さらに別の実施形態において、本発明は、敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全を患う対象の治療方法を提供し、前記治療方法は、前記対象に有効量の、本明細書に記載されるあらゆる修飾ホスファターゼを投与することを含む。
【００８１】
本明細書に記載される（遺伝的）修飾ホスファターゼが医薬組成物に組込まれ得るという事実の他に、そのようなホスファターゼは栄養組成物の一部でもあり得る。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼの源は、乳汁、好ましくは牛乳から好ましくは生産または単離される（遺伝的）修飾ホスファターゼである。乳汁は、野生型の動物と比較して、乳汁においてより高いレベルの（遺伝的）修飾ホスファターゼを生産するために育種または遺伝子操作された動物から得られてもよい。乳汁からの（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化画分の調製は、当該技術において周知である。たとえば、乳脂肪球皮膜強化画分または由来画分は、好ましい（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化乳画分であり、生乳の従来のスキミングによって定められた手順に従って得られてもよい。乳汁から単離された（遺伝的）修飾ホスファターゼが、医薬組成物において、および食品組成物または栄養補助食品において処方されてもよい。
【００８３】
好ましい実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼの、本発明に従う消化管の粘膜への経口投与用の（遺伝的）修飾ホスファターゼ含有組成物は、（遺伝的）修飾ホスファターゼが強化された食品または栄養補助食品である。１つの実施形態において、食品は、随意的に、高いレベルの（遺伝的）修飾ホスファターゼを含むように遺伝子操作された植物、果物または野菜であってよい。別の実施形態において、（遺伝的）修飾ホスファターゼ含有食品または栄養補助食品は、酪農製品である。特に、好ましくは牛乳である、無殺菌乳またはその画分を含有する製剤および組成物は、高いレベルの（遺伝的）修飾ホスファターゼを含み、本発明に従う（遺伝的）修飾ホスファターゼの源として経口投与に特に適している。
【００８４】
本発明はまた、好ましくは乳汁、乳画分または乳製品である、（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化酪農製品の調製方法に関する。この方法は、あまり腐敗しない（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化酪農製品を得るために、好ましくは牛乳である生乳の画分化、（遺伝的）修飾ホスファターゼを含有しないか強化していない画分の低温殺菌、および無殺菌の（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化画分との前記画分の再処方、を含む。無殺菌の（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化画分は、非限定の、紫外線、Ｘ線もしくはガンマ線による照射、ろ過、加圧、浸透圧、化学物質または抗生物質などの他の手段によって滅菌されてもよく、このことが、（遺伝的）修飾ホスファターゼ酵素が実質的にアクティブなままであり、乳画分が実質的に無菌となることを確実にする。この酪農製品は、組成物に使用されてもよく、または進行性敗血症、ＩＢＤもしくは腎不全を患うか、その危険のある対象に直接的に投与されてもよい。しかし、（遺伝的）修飾ホスファターゼ強化酪農製品は、腸の構造的完全性の保全用の医薬または栄養補助製品として、健康な対象に提供されてもよい。
【００８５】
さらに、本発明の修飾ホスファターゼはまた、（乳汁などの）栄養物において生産される代わりに、前記栄養物に加えられ得る。さらに、後に栄養物に加えられるか、ヒトによって直接的に摂取され得る、タブレットおよび／またはカプセルが調製され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】４つのヒトアルカリホスファターゼアイソザイムの配列である。注意：これらは成熟たんぱくの（すなわち、シグナル配列のない）配列であるが、キメラＡＰを除き、ＧＰＩアンカの追加、およびＣ−末端アミノ酸の付随的処理の前である。
【図２】ＡＴＰだけでは、T84の上清とのインキュベーションでのRAW細胞におけるＩＬ−６の生産を、刺激するのに充分でない。ＡＰを追加しても、ＩＬ−６の生産への影響は見られない。
【図３】ＡＴＰ濃度の増大が、T84の上清とのインキュベーションでのRAW細胞におけるＬＰＳ誘導ＩＬ−６の生産を増幅する。アルカリホスファターゼは、ＡＴＰの増幅効果を阻害するが、ＬＰＳ誘導ＩＬ−６の生産それ自身を阻害しない。
【図４】触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの比活性度は、Ｚｎ非依存性である。
【図５】ＡＬＰＩの比活性度は、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰと異なり、やがて減少する。
【図６】肝臓スライスによるＬＰＳ誘導ＮＯＸ生産が、ヒトアルカリホスファターゼの異なる分泌型アイソフォームによって阻害される。
【図７】異なるｐＨ値の０．１Ｍバッファにおいて２４時間貯蔵した、異なる分泌型ヒト組換えアルカリホスファターゼおよびウシ腸ホスファターゼ（ＢＩＡＰ）の相対酵素活性度。
【図８】異なる組換えアルカリホスファターゼの生産中に培地へ追加された異なる亜鉛塩の、酵素活性度への影響。
【図９】亜鉛の存在下における、Ａ 室温、Ｃ ３７°ＣおよびＥ ５６°Ｃでの、または亜鉛の不在下における、Ｂ 室温、Ｄ ３７°ＣおよびＦ ５６°Ｃでの貯蔵後に判定した、異なるアルカリホスファターゼの酵素活性度の安定性。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：精製した分泌型ｈＩＡＰおよび分泌型ｈＰＬＡＰのたんぱくプロフィール。レーン１）ＭＷマーカ、レーン４＋５）分泌型ｈＩＡＰの１０倍および２５倍希釈、レーン１２＋１３）分泌型ｈＰＬＡＰの１０倍および２５倍希釈。
【図１１】ＡＰ活性度判定の標準的な化学的基質である、パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）に対する４つのヒトＡＰおよびウシＡＰの酵素比活性度。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
本発明は、以下の非限定の例においてより詳細に説明される。
実験の部
材料および方法
【００８８】
実施例１
異なるホスファターゼによる、生物学的にアクティブな基質ＡＴＰの脱リン酸化
Perkin Elmerから得られるATPlite（商標）Kitは、以下の試薬を含む：哺乳類の溶解溶液、基質バッファ溶液、凍結乾燥基質溶液および凍結乾燥ＡＴＰスタンダード。
【００８９】
凍結乾燥ＡＴＰスタンダードの調製：凍結乾燥ＡＴＰ標準溶液のバイアルをミリＱでもどし、１０ｍＭ ストック溶液を得る。ミリＱの追加後、１分間回転させることによってＡＴＰを完全に溶解する。
【００９０】
ＡＴＰ脱リン化活性の判定：
開始濃度が２０μＭ ＡＴＰの６つの標準曲線を調製し、連続希釈を作製する。最終容積はウェルあたり１００μｌにすべきである。
【００９１】
１Ｕ／ｍｌのホスファターゼ酵素活性を調製する。開始濃度が１Ｕ／ｍｌの３つの標準曲線を用意し、連続希釈を作製する。最終容積は５０μｌにすべきである。
【００９２】
４０μＭ ＡＴＰ溶液を調製する。
５０μｌの１Ｕ／ｍｌ ホスファターゼ酵素溶液標準曲線および５０μｌの４０μＭ ＡＴＰ溶液を、９６ウェルの黒色のOptiplate（商標）（Perkin Elmer）に加えて合わせる。各ウェルの最終容積は１００μｌになる。
【００９３】
プレートを振とうし、３７°Ｃで９０分インキュベートする。
試薬を室温に平衡化させる。
【００９４】
製造者の勧告に従って、適切な量の基質溶液バッファを加えることによって、１つの凍結乾燥基質溶液バイアルをもどす。溶液が均質化するまでやさしく攪拌する。
【００９５】
５０μｌの哺乳類細胞溶解溶液を加え、プレートを５分間７００ｒｐｍで振とうする。
【００９６】
５０μｌの基質溶液をウェルに加え、プレートを５分間７００ｒｐｍで振とうする。
プレート上に７０％ アルコールを噴霧することによって、気泡を除去する。
【００９７】
１０分間プレートを暗順応させ、Viktor3（商標）Multi Label Reader （Perkin Elmer）上で発光を測定する。
【００９８】
実施例２
アルカリホスファターゼの異なるアイソフォームを用いた、肝臓スライスアッセイ
Ｏ２／Ｎ２Ｏ／Forene麻酔下でラットを犠牲にし、肝臓を取出し、スライスの調製までウィスコンシン大学器官保存溶液（ＵＷ）中で貯蔵した。コア（直径５ｍｍ）を肝臓組織の一片から作成し、スライスするまで氷冷ＵＷ溶液中で貯蔵した。スライスは、Krumdieckスライサで行った。グルコースを最終濃度の２５ｍＭまで補充した氷冷ＫＨＢをスライスバッファとして用いた。ラット肝臓スライス（厚さ２００〜２５０μｍ；湿重量±３ｍｇ）を標準の設定（サイクル速度３０；中断モード）で調製した。スライス後、実験開始までラット肝臓スライスをＵＷ溶液中で貯蔵した。
【００９９】
スライスを、１２ウェルプレート（Greiner、オランダ、アルフェンアーンデンレイン）において、Glutamax I（Gibco BRL、スコットランド、ペイズリー）、５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（Gibco BRL）を補充し、９５％ Ｏ２／５％ ＣＯ２で飽和した、１．３ｍｌのWilliams培地Ｅ中で、３７°Ｃにて個々にインキュベートした。スライスを、１０μｇ／ｍｌ ＬＰＳの存在下または不在下で、および異なる濃度のＡＰの異なるアイソフォームの存在下または不在下で、２４時間インキュベートした。スライスの培地は、ＮＯＸ測定まで−８０°Ｃで貯蔵した。
【０１００】
０．２７５μｌの１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２．２μｌの１０Ｕ／ｍｌ 硝酸還元酵素、および０．０５５μｌの１０ｍＭ ＦＡＤの混合物の、水で２倍に希釈した５μｌを、１１０μｌの上清に加えることによって、ＮＯＸ（ＮＯ、ＮＯ２およびＮＯ３の総体）を測定した。３０分３７°Ｃのインキュベーション後、２．２μｌの０．５Ｍ Ｎａ−ピルビン酸塩および０．５５μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＬＤＨを、水で１：０．８２に希釈した、５μｌの第２ミクスチャを加えた。５分３７°Ｃのインキュベーション後、５μｌの３０％ ＺｎＳＯ４を加え、サンプルを２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その後１００μｌの上清を新たなプレートに移し、０．１％ スルファニルアミド、０．０１％ ｎ−ナフチル−エチレン−ジアミンおよび２．５％ リン酸を含む１００μｌのGriess試薬と混合した。最後に、マイクロプレートリーダ上で５５０ｎｍにて吸光度を測定した。吸光度は、硝酸ナトリウムの標準曲線の吸光度に関連する。
【０１０１】
実施例３
細胞外ＡＴＰの脱リン酸化の生物学的効果
マウスマクロファージ細胞系RAW264.7およびヒト上皮細胞系T84（結腸直腸癌）を
American Type Culture Collection（ATCC、米国、メリーランド州、ロックビル）から得、４．５ｇ／ｌ グルコースを含む、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地およびＤＭＥＭ培地においてそれぞれ維持した。両培地とも、Invitrogen社（オランダ、ブレダ）から得、Glutamax Iを含み、１０％ 熱不活性化FBS（Wisent社（カナダ、ケベック州））、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（双方ともIntvitrogen社）を補充した。トリプシン−ＥＤＴＡを用いてT84細胞系をコンフルエントに継代培養し、ラバーポリスマンを用いてRAW264.7細胞を剥がし取った。
【０１０２】
４×１０５のT84細胞を、２ｍｌの培地の入った１２ウェルプレート（Nunc、デンマーク、ロスキレ）内にプレートした。コンフルエントに達するとすぐに培地をリフレッシュし、細胞を、図に表わされるように（格子縞模様）、異なる濃度のＡＴＰおよび／またはＡＰの存在下または不在下において、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳの存在下（図３）または不在下（図２）で２時間インキュベートした。２時間後、上清を集めて、RAW264.7細胞を含む２４ウェルプレート内に移した。これらのRAW264.7細胞は、その前日、１ｍｌの培地中２×１０５の濃度で２４ウェルプレート（Nunc、デンマーク、ロスキレ）内にプレートしていた。T84細胞の１ｍｌの上清を移す前に、RAWの上清を吸引し、廃棄した。
【０１０３】
RAW細胞とT84の上清とを、上清を集めて市販のELISA（Biosource Europe SE、ベルギー、ニベル）を用いてサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦα）含量を調べる前に、２４時間３７°Ｃ、５％ ＣＯ２でインキュベートした。
【０１０４】
実施例４
変異体の調製
ここに記載される変異体、より具体的には、表４、表５および表６に記載される変異体は、標準的な分子生物学的技術を用いて調製した。
【０１０５】
表４〜表６において言及されるアミノ酸位置は、図１に表わされる配列に対応する。変異位置のみを示す。すなわち、野生型配列から外れているもののみを示す。たとえば、表４の変異体１は、野生型配列と比較した場合、位置８７，９３および４２９にて変化していない。すなわち、位置８７はＫ、位置９３はＧ、位置４２９はＥである。
【０１０６】
変異体は、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発法、制限酵素分析および配列分析などの標準的な分子生物学的技術によって調製し、確認する。
【０１０７】
実施例５
ｔ＝０にて、４５０±５０ユニットの異なる組換えアルカリホスファターゼを、異なるＺｎ２＋濃度の希釈バッファ（０．０２５Ｍ グリシン／ＮａＯＨ ｐＨ９．６／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１％ マンニトール／０．０５％ ＢＳＡ）に４，０００倍希釈した。第２の例において、可能性のあるＺｎ２＋源としてのＢＳＡをバッファから除外した。希釈（Ｔ＝０）後１分以内に、サンプルを採取し、以下に記載されるｐＮＰＰアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性について測定した。９０分（Ｔ＝１１/２ｈ）、１８０分（Ｔ＝３ｈ）および２２時間（Ｔ＝２２ｈ）後、各時間でサンプルを摂取し、以下に記載されるｐＮＰＰアッセイを用いてアルカリホスファターゼ活性について直接測定した。市販のＢＣＡキット（Pierce）を用いて以前に得られたたんぱく含量を通して、得られたＵ／ｍｌの結果を割ることによる比活性度（Ｕ／ｍｇ）によって、Ｕ／ｍｌの活性度が逆算された。
【０１０８】
ｐＮＰＰホスファターゼ活性測定：
作業基質：
試薬、基質、サンプルおよびインキュベーションチャンバの温度を２５°Ｃに設定した。分光光度計を４０５ｎｍの波長に設定し、光路は１ｃｍであった。
【０１０９】
使い捨てキュベット内に、５０μｌの被検物質および１，４５０μｌの作業基質をピペットで移して混合し、直ちにキュベットを分光光度計内に置き、４０５ｎｍでの吸光度の増加を３分間記録した。
【０１１０】
容積あたりの活性を、以下の等式：
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ΔＥ４０５／分×１．６×希釈係数
を用いて計算した。
注意：測定範囲は０．０４〜０．４Ｕ／ｍｌでなければならない。
【０１１１】
実施例６
異なるホスファターゼの安定性に及ぼすｐＨの影響
HEK293細胞において一時的に発現するアルカリホスファターゼのｐＨ安定性を調査した。４．０〜９．０のｐＨ範囲を、それらの２５°Ｃでの特異的ｐＨで調整された５つの異なる０．１Ｍ（酢酸ナトリウム、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール）およびグリシン）バッファを用いて試験した。１％ マンニトールで安定化させたＢｉＡＰを参照として用いた。アルカリホスファターゼ溶液を、各バッファにおいておおよそ１００Ｕ／ｍｌに希釈し、２４時間室温で貯蔵し、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について判定した。
【０１１２】
実施例７
異なるホスファターゼの発現に及ぼす亜鉛の影響
異なる亜鉛塩の、HEK293細胞において一時的に発現するアルカリホスファターゼの活性への影響を、１ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．１ｍＭ 亜鉛塩（ＺｎＣｌ２、ＺｎＳＯ４またはＺｎＡｃ２）を補充した培地における小規模トランスフェクションを用いて調査した。HEK293細胞を、ｓｈＩＡＰ、ｓｈＰＬＡＰ、Ｘｉｎｐｌａｐ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）およびｓＡＬＰＰ−ＡＬＰＩ−ＣＤ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）でトランスフェクトし、ｔ＝１４４ｈにてサンプルを採取し、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について分析した。
【０１１３】
実施例８
異なるホスファターゼの安定性に及ぼす亜鉛の影響
１００μＭのＺｎＣｌ２の存在または不在下において、おおよそ２０Ｕ／ｍｌの異なる（組換え）アイソフォームのアルカリホスファターゼを含む溶液を、温度安定性試験のために調製した。サンプルを室温、３７°Ｃおよび５６°Ｃで貯蔵し、酵素活性（ｐＮＰＰ）を、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いてｔ＝０、２ｈおよび２４ｈにて判定した。
【０１１４】
実施例９
アルカリホスファターゼの融合たんぱくおよび変異体の生成
適切な発現システムを選択するために、ＧＰＩアンカ配列を有する、または欠く、成熟たんぱくをコードするヒト腸（ｈＩＡＰ）およびヒト胎盤（ｈＰＬＡＰ）ｃＤＮＡを、様々なベクタ内にクローニングした。小規模感染の後、用いた発現ベクタは、ＣＭＶドライブされ、シスタチンシグナル配列を含み、精製を促進するためのＮ−末端ＨＩＳタグを付加された。うまく分泌型ｈＩＡＰおよびｈＰＬＡＰの双方を発現した後、２つの融合ヒト分泌型アルカリホスファターゼをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで構築した。１つは胎盤クラウンドメイン（成熟配列のアミノ酸３６０〜４３０）を含む腸ＡＰのバックボーンに基づき、２つ目は腸ＡＰのクラウンドメインを有する胎盤ＡＰのバックボーンに基づく（１つ目をＲｅｃＡＰまたは触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰと呼び、２つ目をｓｈＰＬＡＰ−ｓｈＩＡＰ−ＣＤまたは触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩと呼ぶ）。ヒトシスタチンシグナル配列を有する上記２つの遺伝子を合成し、ＣＭＶプロモータ含有発現ベクタにクローニングした。
【０１１５】
実施例１０
ホスファターゼ比活性度に及ぼすＧＰＩアンカの影響
ＡＰの様々な組換え型を生産し、精製し、前述のようにｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイを用いて酵素活性について評価した。さらに、サンプルのたんぱく量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびGelEvalソフトウェアを用いて測定した。活性度（Ｕ／ｍｌ）をたんぱく濃度（ｍｇ／ｍｌ）で割ることによって比活性度を計算し、Ｕ／ｍｇで表わした。
【０１１６】
実験の部
結果
実施例１
異なるホスファターゼによる、生物学的にアクティブな基質ＡＴＰの脱リン酸化
２０μＭの最終濃度のＡＴＰを、異なる濃度のＢＩＡＰ、ｓＡＬＰＰ、ｓＡＬＰＩまたはキメラの触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰとインキュベートした。表９から、ｐＮＰＰ化学的活性は、たとえばＡＴＰといった生物学的基質に向けた活性と１：１で関連しないことが明らかである。ＢＩＡＰおよびｓＡＬＰＩはそれぞれ、０．０３１および０．００４のｐＮＰＰのユニット濃度で３７°Ｃの９０分後、ＡＴＰの５０％を超える脱リン酸化を示すが、ＡＬＰＰおよび触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＰはそれぞれ、０．１２５および０．０６２５のｐＮＰＰのユニット濃度でこの量を脱リン酸化することができるだけである。
【０１１７】
実施例２
アルカリホスファターゼの異なるアイソフォームを用いた、肝臓スライスアッセイ
ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）による刺激で、肝臓スライスがＮＯＸを生産する。図６は、異なる濃度での、異なるヒト組換えアルカリホスファターゼ（ｓＡＬＰＩ、ｓＡＬＰＰ、ＧＰＩ−アンカＡＬＰＩ、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）の存在下において、ＮＯＸ生産が有意に阻害されたことを示している。この実験において、ウシ由来ＡＬＰＩをポジティブコントロールとして、溶媒をネガティブコントロールとして用いた。
【０１１８】
ＬＰＳの追加なしでは、肝臓スライスによるＮＯＸ生産は、１０μＭ未満であり、インキュベーション中、異なるホスファターゼの存在によって有意に変化しなかった（不図示）。このことから、試験したすべてのヒトアルカリホスファターゼの組換えアイソフォームは、ＧＰＩアンカの存在に関わらず、ＬＰＳ誘導ＮＯＸ生産に関与する生物学的基質に向けた活性を有すると結論される。
【０１１９】
実施例３
細胞外ＡＴＰの脱リン酸化の生物学的効果
T84の上清とのインキュベーションでのRAW264.7細胞によるＩＬ−６の生産は、ＬＰＳに依存した。ＬＰＳなしでは（図２）、低いレベルのＩＬ−６を生産した。ＡＴＰおよびＡＰは、RAW264.7細胞によって生産されるＩＬ−６のレベルを変えられなかった。反対に、ＬＰＳが存在すると、T84の上清とインキュベートしたRAW264.7によるＩＬ−６の生産は、ＡＴＰの濃度の増大とともに、増大した。ＡＴＰによるサイトカイン生産のこの増大は、０．１Ｕ／ｍｌ以上のＡＰ濃度によって完全に減少し得た（図３）。
【０１２０】
同じプロトコルを用いたＴＮＦαについて、ならびに上皮細胞源としてT84の代わりにHT29を用いたＴＮＦαおよびＩＬ−６について、同様の結果（不図示）を得た。
【０１２１】
ＡＰはＡＴＰを脱リン酸化することによって、ＬＰＳ促進効果を減少させると結論される。ＡＰのＬＰＳに及ぼす影響は見られなかったので、ＡＰはＬＰＳを脱リン酸化することはありそうにない。ＡＴＰおよびＬＰＳの組合せは単にＡＰによってＬＰＳ単独に等しいレベルにまで減少し得た。
【０１２２】
実施例５
異なるホスファターゼのＺｎ２＋依存性の判定
図４および表７に表わされるように、Ｚｎ２＋は、ｓＡＬＰＩの比活性度を有意に安定化させたが、ｓＡＬＰＰおよびキメラの触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、培地におけるＺｎ２＋の存在に依存せず、初期の比活性度を維持した。この実験において、ｐＮＰＰホスファターゼ活性アッセイにおいて定められた手順に従って使用されるＢＳＡは、微量のＺｎ２＋源となり得る。したがって、第２の実験を実行した。表８および図５は、ＢＳＡの不在下およびＺｎ２＋枯渇化キレート剤ＥＤＴＡの存在下において、すべてのアイソフォームが２２時間後に比活性度を緩めることを示している。しかし、貯蔵中および反応中の生理学的（０．５〜１０ｎＭ）濃度のＺｎ２＋の追加が、ｓＡＬＰＰおよび触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰの初期の比活性度のそれぞれ６０％および７５％超を保存したが、ｓＡＬＰＩの初期の比活性度の９５％超を失った。非生理学的に高い濃度のＺｎ２＋が、ｓＡＬＰＩの比活性度を保存するのに不可欠であった。
【０１２３】
したがって、キメラの触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰは、ｓＡＬＰＩと同程度の高い比活性度、およびｓＡＬＰＰと同程度のＺｎ２＋非依存性の比活性度を示すと結論される。Ｚｎ２＋依存性はｓＡＬＰＩクラウンドメインに起因し、一方、高い比活性度はｓＡＬＰＩ触媒ドメインに起因すると結論される。
【０１２４】
実施例６
異なるホスファターゼの安定性に及ぼすｐＨの影響
ＢｉＡＰ、ｓｈＩＡＰ、ｓｈＰＬＡＰ、ＲｅｃＡＰを、ｐＨ値が４．０，５．０，６．０，７．０，８．０および９．０の０．１Ｍ（酢酸ナトリウム、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール）およびグリシン）バッファに希釈し、室温で２４時間貯蔵した。各ｐＨ値について、初期の酵素活性および貯蔵後の酵素活性を、標準的なｐＮＰＰアッセイに従って判定した。その名前によって予想および示唆されるように、アルカリホスファターゼ活性は高いｐＨ範囲（アルカリ環境）において最適である。しかし、図７が示すように、胎盤型は、腸アイソフォームよりも安定している。さらに、この結果は、特に高いｐＨ範囲におけるこの安定性が、触媒ドメインによってではなくクラウンドメインによって決定されることを実証している。というのも、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ（ｒｅｃＡＰ）は、ｓｈＰＬＡＰの安定性プロフィールに追随し、ｐＨ５〜９で安定しているが、ＢＩＡＰおよびｓｈＩＡＰの安定性はｐＨ７〜８に制限されるからである。反対に、触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ（ｓｈＰＬＡＰ−ｈＩＡＰ−ＣＤ）は、ｐＨ９にて、胎盤型ＡＰおよび触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰよりも安定していない。このことは、触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰがその活性を、試験した天然ＡＰまたは逆キメラ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）よりもかなり広い範囲のｐＨ値において維持することを実証している。
【０１２５】
実施例７
異なるホスファターゼの発現に及ぼす亜鉛の影響
HEK293細胞における小規模トランスフェクションを用いて、一時的に発現するアルカリホスファターゼの活性への異なる亜鉛塩の影響を調査した。そうするために、ｓｈＩＡＰ、ｓｈＰＬＡＰ、Ｘｉｎｐｌａｐ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）およびｓＡＬＰＰ−ＡＬＰＩ−ＣＤ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）をトランスフェクトし、ｔ＝１４４ｈにてサンプルを採取し、酵素活性について分析した。得られた結果は、酵素活性に関してＺｎ２＋イオン濃度への依存性が存在するが、観察された活性の増大は用いた亜鉛塩の種類に依存しないことを明らかにした。
【０１２６】
図８に示される結果から、得られた酵素活性は亜鉛に依存しているが、どの種類の亜鉛塩が使用されるかについては依存していないと結論される。さらに、亜鉛の追加は、ｓｈＩＡＰの生産について最も好ましく、酵素活性の誘導係数が＞３０であることが示された。ｓＡＬＰＰおよびＸｉｎｐｌａｐについて、活性増強はそれぞれ＜２および＞４であった。逆キメラ（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩとも呼ばれるｓＡＬＰＰ−ＡＬＰＩ−ＣＤ）は、亜鉛不在下で生産された場合にごく僅かな活性を示したが、亜鉛存在下ではｓＡＬＰＰと同程度の活性を得た。
【０１２７】
さらに、Ｘｉｎｐｌａｐは、Ｚｎ／Ｍｇイオンの追加なしに、他の試験したＡＰのどれよりもかなり高い酵素活性を示し（係数５）、ｓｈＩＡＰまたは逆キメラ触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩと比較してＺｎ／Ｍｇにあまり依存しない。
【０１２８】
実施例８
異なるホスファターゼの安定性に及ぼす亜鉛の影響
図９は、異なる温度、および１００μＭ ＺｎＣｌ２の存在または不在下での、異なるＡＰの経時的な安定性プロフィールを示す。この結果から、亜鉛の不在下で、アルカリホスファターゼの腸アイソフォーム（ｓＡＬＰＩおよびＢＩＡＰ）は、酵素活性に関してかなり温度感受的であると結論される。３７°Ｃにて、ＢＩＡＰは２時間以内に活性の２０％を失い、２４時間後にはたった２０％の酵素活性しか残っていない。ｓｈＩＡＰは、３７°Ｃでの貯蔵２４時間後、３０％の活性の低下を示す。図９Ｃは、３７°Ｃでの安定性試験中の亜鉛の存在が、酵素を分解から保護することを示している。しかし、５６°Ｃでは、亜鉛はもはや腸アイソフォームを保護せず、双方の腸アイソフォームとも最初の２時間でほぼ完全に酵素活性を失う。反対に、ＲｅｃＡＰ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）およびｓｈＰＬＡＰ（ｓＡＬＰＰ）は、５６°Ｃにてさえ２２時間まで１００μＭの存在または不在下で優れた安定性を示す。
【０１２９】
実施例９
アルカリホスファターゼの融合たんぱくおよび変異体の生成
分泌型ｈＩＡＰおよび分泌型ｈＰＬＡＰは、ＣＭＶプロモータドライブされ、シスタチンシグナル配列を含むベクタを用いてHEK293において発現し、たんぱくのＮ−末端部分にＨＩＳタグを有した。発現たんぱくは、ＨＩＳタグを通じて精製し、ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した（図１０参照）。分泌型ｈＩＡＰおよびｈＰＬＡＰの懸濁培養の１リットルのたんぱく収量は、それぞれ３８および１６ｍｇであり、＞９５％の純度を示した。ｈＩＡＰおよびｈＰＬＡＰの比活性度は、それぞれ２１および１００Ｕ／ｍｇであった。
【０１３０】
これら２つの分泌型組換えホスファターゼに基づいて、２つのドメインスワップ変異型をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計し、HEK293細胞において発現した。注目すべき結果が、胎盤アルカリホスファターゼのクラウンドメインを有する腸アルカリホスファターゼバックボーンから成るＲｅｃＡＰについて得られた。ＲｅｃＡＰは、従来の培養条件下で、分泌型ｈＩＡＰと比較して５倍高い酵素活性度を示した（１４Ｕ／ｍｌ対２．７Ｕ／ｍｌ）。しかし、細胞培養およびホスファターゼ発現中の１００μＭまでの亜鉛塩の追加は、ＲｅｃＡＰの酵素活性にほんの小さな影響しか与えなかった（１８．８Ｕ／ｍｌ対亜鉛の追加なしで１４．０Ｕ／ｍｌ）が、分泌型ｈＩＡＰの活性度を有意に改善する（３７．９Ｕ／ｍｌ対亜鉛の追加なしで２．７Ｕ／ｍｌ）。一方、腸ＡＰのクラウンドメインを有する胎盤ＡＰのバックボーンに基づくドメインスワップ変異型（触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩ）は、腸型と同程度の亜鉛依存性および分泌型ＰＬＡＰと同程度の最高活性度を示す。ｓｈＩＡＰおよび触媒ＡＬＰＰ／クラウンＡＬＰＩの活性度において観察された増大は、亜鉛が発現および精製後に酵素に加えられた場合、達成され得ないだろう。したがって、好ましくは腸型のクラウンドメインを有するアルカリホスファターゼの発現中の１００μＭ 亜鉛の追加は、より高いアルカリホスファターゼ活性度をもたらすと結論される。
【０１３１】
実施例１０
ホスファターゼ比活性度に及ぼすＧＰＩアンカの影響
様々なＡＰ組換え型を生産し、酵素活性について評価した。図１１に示される結果は、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＢＩＡＰ）およびｒｅｃＡＰ（触媒ＡＬＰＩ／クラウンＡＬＰＰ）が、分泌型ｈＩＡＰ、分泌型ｈＰＬＡＰおよびＧＰＩアンカｈＩＡＰよりも優れた、類似の比活性度を提示することを実証している。酵素の純度は、酵素の比活性度にとって重要である。したがって、４つのヒト酵素は実験室で精製し、一方、ＢＩＡＰは超高純度ＧＭＰバッチとして得たことに留意すべきである。さらに、分泌型ｈＩＡＰは、ＧＰＩアンカｈＩＡＰよりもおおよそ２倍高い比活性度を有することに留意すべきである。理論に限定されるのではないが、より高い比活性度は、構造または純度のいずれかに関連し得る。というのも、分泌型ＡＰは、ＧＰＩアンカ（膜結合）ＡＰよりも容易に精製されるからである。
【０１３２】
【表１】
【０１３３】
【表２】
【０１３４】
【表３】
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
【表５】
【０１３７】
【表６】
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
【表９】
【０１４１】
【表１０】
【０１４２】
【表１０−１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラウンドメインおよび触媒ドメインを有し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られることを特徴とする単離または組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項２】
前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項１記載のホスファターゼ。
【請求項３】
前記クラウンドメインはＡＬＰＰのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインはＡＬＰＩの触媒ドメインであることを特徴とする請求項１または２記載のホスファターゼ。
【請求項４】
前記クラウンドメインはＡＬＰＩのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインはＡＬＰＰの触媒ドメインであることを特徴とする請求項１または２記載のホスファターゼ。
【請求項５】
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含み、前記修飾は分泌ホスファターゼをもたらすことを特徴とする単離または組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項６】
前記修飾は、コンセンサスＧＰＩシグナル配列を包含するアミノ酸配列の変異または欠失を含むことを特徴とする請求項５記載のホスファターゼ。
【請求項７】
前記ホスファターゼはヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項５または６記載のホスファターゼ。
【請求項８】
前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項９】
前記ホスファターゼは、ヒト肝−腎−骨ホスファターゼ、ヒト腸アルカリホスファターゼ、およびヒト胎盤様アルカリホスファターゼから選ばれることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１０】
異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインをさらに有することを特徴とする請求項５〜９のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１１】
触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有することを特徴とする単離または組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項１２】
前記ホスファターゼはヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項１１記載のホスファターゼ。
【請求項１３】
前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１１または１２記載のホスファターゼ。
【請求項１４】
前記変異は、表４、表５または表６に表わされる変異であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１５】
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列において修飾をさらに有し、前記修飾が非ＧＰＩアンカホスファターゼをもたらすことを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１６】
異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインをさらに有することを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１７】
異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインをさらに有することを特徴とする請求項１５記載のホスファターゼ。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のホスファターゼをコードすることを特徴とする核酸配列。
【請求項１９】
請求項１８記載の核酸を有することを特徴とするベクタ。
【請求項２０】
請求項１８記載の核酸または請求項１９記載のベクタを有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項２１】
ホスファターゼの生産方法であって、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能にすることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞は哺乳類細胞であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ホスファターゼはヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ホスファターゼは、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のホスファターゼであることを特徴とする請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ホスファターゼを単離することをさらに含むことを特徴とする請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法によって得ることができることを特徴とするホスファターゼ。
【請求項２８】
請求項１〜１７および２７のいずれか１項に記載のホスファターゼを有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全の治療用の薬剤の調製における請求項１〜１７および２７のいずれか１項に記載のホスファターゼの使用。
【請求項３０】
敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全を患う対象（好ましくはヒト）の治療方法であって、請求項１〜１７および２７のいずれか１項に記載のホスファターゼの有効量を、前記対象に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
１０μＭ未満のＺｎ２＋濃度、好ましくは１μＭ未満のＺｎ２＋濃度、より好ましくは０．１μＭ未満のＺｎ２＋濃度を含む環境における、基質、好ましくはアデノシンリン酸の脱リン酸化のための請求項３記載のホスファターゼの使用。
【請求項３２】
好ましくは敗血症、炎症性腸疾患および／もしくは他の炎症性疾患ならびに／または腎不全の治療のための薬剤としての使用のための請求項１〜１７または２７のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項３３】
Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療における使用のためのホスファターゼであって、前記疾患は好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれることを特徴とする請求項３記載のホスファターゼ。
【請求項３４】
Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療のための薬剤の調製における請求項３記載のホスファターゼの使用であって、前記疾患は好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれることを特徴とする使用。
【請求項３５】
Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患を患う対象（好ましくはヒト）の治療方法であって、有効量の請求項３記載のホスファターゼを、ホスファターゼを必要とする対象に投与することを含み、前記疾患は好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項１】
クラウンドメインおよび触媒ドメインを有し、前記クラウンドメインおよび前記触媒ドメインは、異なるアルカリホスファターゼから得られることを特徴とする単離または組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項２】
前記異なるホスファターゼの少なくとも１つは、ヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項１記載のホスファターゼ。
【請求項３】
前記クラウンドメインはＡＬＰＰのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインはＡＬＰＩの触媒ドメインであることを特徴とする請求項１または２記載のホスファターゼ。
【請求項４】
前記クラウンドメインはＡＬＰＩのクラウンドメインであり、前記触媒ドメインはＡＬＰＰの触媒ドメインであることを特徴とする請求項１または２記載のホスファターゼ。
【請求項５】
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列における修飾を含み、前記修飾は分泌ホスファターゼをもたらすことを特徴とする単離または組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項６】
前記修飾は、コンセンサスＧＰＩシグナル配列を包含するアミノ酸配列の変異または欠失を含むことを特徴とする請求項５記載のホスファターゼ。
【請求項７】
前記ホスファターゼはヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項５または６記載のホスファターゼ。
【請求項８】
前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項９】
前記ホスファターゼは、ヒト肝−腎−骨ホスファターゼ、ヒト腸アルカリホスファターゼ、およびヒト胎盤様アルカリホスファターゼから選ばれることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１０】
異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインをさらに有することを特徴とする請求項５〜９のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１１】
触媒残基付近および／または金属イオン配位リン酸結合ポケット内に変異を有することを特徴とする単離または組換えアルカリホスファターゼ。
【請求項１２】
前記ホスファターゼはヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項１１記載のホスファターゼ。
【請求項１３】
前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１１または１２記載のホスファターゼ。
【請求項１４】
前記変異は、表４、表５または表６に表わされる変異であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１５】
グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナル配列において修飾をさらに有し、前記修飾が非ＧＰＩアンカホスファターゼをもたらすことを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１６】
異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインをさらに有することを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項１７】
異なるホスファターゼから得られるクラウンドメインおよび触媒ドメインをさらに有することを特徴とする請求項１５記載のホスファターゼ。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のホスファターゼをコードすることを特徴とする核酸配列。
【請求項１９】
請求項１８記載の核酸を有することを特徴とするベクタ。
【請求項２０】
請求項１８記載の核酸または請求項１９記載のベクタを有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項２１】
ホスファターゼの生産方法であって、Ｚｎ２＋を有する培地において前記ホスファターゼを発現することができる宿主細胞を培養し、細胞が前記ホスファターゼを生産することを可能にすることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞は哺乳類細胞であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ホスファターゼはヒトホスファターゼであることを特徴とする請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ホスファターゼはアルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ホスファターゼは、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のホスファターゼであることを特徴とする請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ホスファターゼを単離することをさらに含むことを特徴とする請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法によって得ることができることを特徴とするホスファターゼ。
【請求項２８】
請求項１〜１７および２７のいずれか１項に記載のホスファターゼを有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全の治療用の薬剤の調製における請求項１〜１７および２７のいずれか１項に記載のホスファターゼの使用。
【請求項３０】
敗血症、炎症性腸疾患もしくは他の炎症性疾患および／または腎不全を患う対象（好ましくはヒト）の治療方法であって、請求項１〜１７および２７のいずれか１項に記載のホスファターゼの有効量を、前記対象に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
１０μＭ未満のＺｎ２＋濃度、好ましくは１μＭ未満のＺｎ２＋濃度、より好ましくは０．１μＭ未満のＺｎ２＋濃度を含む環境における、基質、好ましくはアデノシンリン酸の脱リン酸化のための請求項３記載のホスファターゼの使用。
【請求項３２】
好ましくは敗血症、炎症性腸疾患および／もしくは他の炎症性疾患ならびに／または腎不全の治療のための薬剤としての使用のための請求項１〜１７または２７のいずれか１項に記載のホスファターゼ。
【請求項３３】
Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療における使用のためのホスファターゼであって、前記疾患は好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれることを特徴とする請求項３記載のホスファターゼ。
【請求項３４】
Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患の治療のための薬剤の調製における請求項３記載のホスファターゼの使用であって、前記疾患は好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれることを特徴とする使用。
【請求項３５】
Ｚｎ２＋欠乏が付随する疾患を患う対象（好ましくはヒト）の治療方法であって、有効量の請求項３記載のホスファターゼを、ホスファターゼを必要とする対象に投与することを含み、前記疾患は好ましくは炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、敗血症、神経皮膚炎および表１０に表わされる疾患から成る群から選ばれることを特徴とする方法。
【図１】
【図１−１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図９−１】
【図１０】
【図１１】
【図１−１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図９−１】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１０−５２４４９６（Ｐ２０１０−５２４４９６Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６１０２（Ｐ２０１０−５０６１０２）
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０２４９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３３５１１
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（５０９２９６０５２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＭ−Ｐｈａｒｍａ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｕｍｐｓｔｅｒｗｅｇ ６，Ｂｕｎｎｉｋ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２５日（２００８．４．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００８／０５０２４９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３３５１１
【国際公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【出願人】（５０９２９６０５２）
【氏名又は名称原語表記】ＡＭ−Ｐｈａｒｍａ Ｂ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｕｍｐｓｔｅｒｗｅｇ ６，Ｂｕｎｎｉｋ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ
【Ｆターム（参考）】
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