光を発光反応から消失させる二重酵素アッセイの方法及びキット
本発明は、光学反応、例えば酵素媒介発光反応を消失させる試薬を利用した一重及び二重リポーター発光アッセイに関するものである。本発明の一実施形態では、以降の異なる酵素媒介発光反応に影響を及ぼすことなく第１の酵素媒介発光反応を選択的に消光する試薬をアッセイに加える。１つ又は複数の選択的消光試薬を含むアッセイキット、及びこのような消光試薬を含む組成物も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００３年２月１２日に出願の米国特許出願第６０／４４７０６５号の出願日の権益を主張し、その開示内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、酵素媒介一重及び二重光学リポーターアッセイ、並びに１つ又は複数の光学反応を消失させる試薬に関する。例えば、本発明は少なくとも１つの酵素を利用する発光アッセイ及び１つ又は複数の消光試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
発光は、ある種の生物ではルシフェラーゼ媒介酸化反応の結果として起こる。多種多様な非常に異なる生物種からのルシフェラーゼ遺伝子、特にＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（北アメリカに多い蛍）、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ（ジャマイカのコメツキムシ）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）及びいくつかの細菌、例えばキセノラブドゥスルミネセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種のルシフェラーゼ遺伝子は、極めて有名な発光リポーター遺伝子である。蛍ルシフェラーゼはまたＡＴＰ濃度の一般的なリポーターであり、その役割で、バイオマスを検出するために広く使われている。発光はまた、他の酵素とある種の合成基質、例えばアルカリホスファターゼとアダマンチルジオキセタン、又はワサビペルオキシダーゼとルミノールとが混合されたときにも起こる。
【０００４】
ルシフェラーゼ遺伝子は、非放射性で、感度が高く、極めて広い直線的な発光アッセイ範囲を有するため、遺伝子リポーターとして広く使われている。例えば、わずか１０−２０モルの蛍ルシフェラーゼを検出することができる。その結果、遺伝子活性のルシフェラーゼアッセイは、原核及び真核の細胞培養、トランスジェニック動植物及び無細胞発現系を含む実質的にあらゆる実験生物系で使われる。同様に、ＡＴＰのルシフェラーゼアッセイは感度が高く、１０−１６モル以下の検出が可能である。
【０００５】
ルシフェラーゼはルシフェリンと呼ばれている酵素特異的基質の酸化を介して光を発生する。蛍ルシフェラーゼ及び他の全ての甲虫ルシフェラーゼでは、発光はマグネシウムイオン、酸素及びＡＴＰの存在下で起こる。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを含む花虫綱のルシフェラーゼでは、ルシフェリンと共に酸素のみが必要である。通常、遺伝的活性の発光アッセイにおいては、反応基質及び他の発光活性化剤が、リポーター酵素の発現が疑われる生物系に導入される。その結果、もし発光が生じれば、その発光はルミノメーター又は任意の適当な放射エネルギー測定器を使って測定される。このアッセイは非常に迅速で感度が高く、迅速且つ容易に遺伝子発現データを提供し、放射性試薬を必要としない。遺伝的活性以外のためのリポーターアッセイは、同様に実施される。
【０００６】
蛍ルシフェラーゼを使う従来の遺伝活性アッセイは、アッセイ用試薬にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）を含ませて酵素ターンオーバーを大きくし、それにより発光強度を高めることにより更に改善されている（米国特許第５２８３１７９号）。この試薬を使うと、ルシフェラーゼ活性はルミノメーター又はシンチレーションカウンターで容易に測定することができる。コエンザイムＡを追加して持続発光を起こすように改変されたルシフェラーゼ反応は、遺伝子組み換え細胞又は組織におけるルシフェラーゼ発現を定量化するための極めて感度が高く迅速なアッセイを提供する。
【０００７】
１つの発光サンプルからの屈折光は、透明マルチウェルの連続したウェル中の発光サンプルからのシグナルを後に測定するときに妨害となるかもしれない。更に、単一の透明なプラスティックプレート内の複数の発光サンプルから発散している屈折光の蓄積特性の点で、第１のサンプルウェルの発光シグナルは正確に測定することができるが、後続のウェルにおける発光反応の連続的活性化は、前の全てのサンプルからプラスチックを通過してくる屈折光子の蓄積的発光のために、だんだん不正確な測定をもたらす。この屈折光又は「屈折性クロストーク」の問題は、明るく発光するウェルが発光のない陰性対照ウェルに隣接する場合、或いは、明るく照らされたウェルが比較的薄暗いウェルの近くにあるときには更に悪化する。このことは、透明なマルチウェルプレートでの絶対値及びベースライン発光の測定を非常に困難にする。
【０００８】
白いプラスチック製の不透明なプレートは透明なプレートよりも高い発光感度を生じさせることができるが、光子は隣接ウェルから容易に拡散し、同じくウェル間のクロストーク干渉をもたらす。ここでのクロストークは「反射クロストーク」と称される。更に、当初蛍光用を目的とした黒色９６穴プレートは、そのプラスチックの非反射特性のためにサンプルからの信号が非常に減殺されるので発光用には理想的でない。更に、不透明なプレートはそれを通して培養細胞を観察又は撮影することができず、またこのようなプレートは細胞の接着及び増殖特性に未知の影響を及ぼすので、培養細胞には不向きである。
【０００９】
ルシフェラーゼは、蛍ルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）並びに様々なホスファターゼ、例えば分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びウテロフェリン（Ｕｆ；酸性ホスファターゼ）などのいくつかのリポーターの１つであり、これらは、組み合わせられ、遺伝活性のコリポーターとして使われる。二重酵素リポーター系は、１つの系における個々の２つのリポーター酵素の同時使用、発現及び測定に関するものである。遺伝子リポーティングにおいては、二重リポーターアッセイは特に２つの異なるリポーター遺伝子を同時に発現するように遺伝子操作された個々の細胞又は細胞集団（例えば、培養内に分散した細胞、分離した組織又は動物全体）でのアッセイに役立つ。ほとんどの場合、１つの遺伝子の活性は特異的な実験条件の影響を報告するが、第２のリポーター遺伝子の活性は全てのセットの実験値が正規化されるような内部標準を提供する。二重酵素リポーター技術は、実験用及び対照リポーター酵素をコードしている独立した遺伝材料の無細胞再構成系、例えば同時翻訳又は共役転写及び翻訳のために導入された細胞溶解物でも使用することができる。イムノアッセイは、同様に単一のサンプルからの実験値と対照値の両方の二重リポーティングのために設計することもできる。
【００１０】
いかなる二重酵素リポーターアッセイのパフォーマンスも、構成酵素の化学的特性及び得られたそれぞれのデータセットを相関させる能力によって制限される。様々なリポーター酵素の酵素反応速度論、アッセイ化学及びインキュベーション要件は異なるので、２つのリポーター酵素を、単一の試験管又はウェルで統合した二重リポーターアッセイ形式で組み合わせることを困難にする。二重リポーターアッセイの統合のための１つの方法が米国特許第５７４４３２０号に記載されており、そこでは甲虫若しくはＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼアッセイのための詳細な一般的若しくは特異的な消光剤が開示され、また蛍ルシフェラーゼ、次いでＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼからの発光を連続して測定するための好的な二重リポーターアッセイが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、酵素媒介発光反応又は一連の酵素媒介発光反応をアッセイする方法で用いる更なる発光消失剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、第一の発光リポーターによって発生した光を消失（ｑｕｅｎｃｈ）（減少、抑制、又は除去）させて、その後に第２の発光リポーターシグナルを測定できるようにする組成物及び方法を対象とする。そのような方法は、発光反応の特性や反応が測定される順番に関係なく、発光反応の様々な組合せを非常に柔軟に多重化することを可能にする。従って、本発明は、第１の酵素媒介発光反応を迅速且つ効率的に（例えば選択的に）消失させる１つ又は複数の試薬を用いる、発光アッセイのための組成物及び方法を含む。本発明の方法及び組成物で用いられる好ましい選択的消光試薬としては、それらに限定されないが、第１の酵素の基質類似阻害剤、例えば、その酵素の本来の基質（即ち、その酵素の天然基質）と構造的に類似してその酵素を阻害するもの、及び／又は酵素の活性部位をめぐって発光基質と競合するもの（競合阻害剤）；隔離剤、例えば、第１の酵素の基質を第１の酵素から物理的に分離する物質（このような物質は例えば、第１の基質若しくは第１の酵素をミセルに入れて物理的に分離するか、又は第１の基質若しくは第１の酵素の溶解性を変化させることにより発光をもたらす第１の基質と第１の酵素間の相互作用を抑制するが、第２の異なる酵素とその対応する基質との間の反応を実質上変化させない）；全ての酵素媒介反応ではないが少なくとも１つの酵素媒介発光反応によって発される光の色を消す着色化合物（実質的に１つの酵素媒介発光反応を消失させるが全ての酵素媒介発光反応を同程度に消失させない他の適当な有機化合物を含む）、或いはこれらの任意の組合せが含まれる。かくしてそのような試薬は、有効量では少なくとも１つの酵素媒介発光反応を消失させ、その一方で、少なくとも１つの他の異なった酵素媒介発光反応からの光の効率的な生成及び記録を可能にする点で選択的である。一の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応のための選択的消光試薬は、甲虫ルシフェラーゼ媒介反応からの発光を選択的に消失させる試薬ではない。好ましくは、第１の酵素媒介発光反応のための１つ又は複数の選択的消光試薬は、花虫類ルシフェラーゼ媒介反応からの発光を選択的に消失させる試薬である。
【００１３】
光の「実質的」消失とは、基準、例えば第１の酵素媒介発光反応の、消失と同等以上の消失である。例えば、選択的消光試薬は第１の酵素媒介発光反応を実質的に３５倍消失させるが、第２の異なる酵素媒介発光反応を消失しないか又は３５倍未満で消失させる場合、この試薬は第２の反応と比較して第１の反応に対して選択的な消光試薬である。対照的に、ある消光試薬が第１の酵素媒介発光反応を３５倍消失させ、第２の異なった酵素媒介発光反応を３５倍以上消失させるならば、この試薬は第２の反応と比較して第１の反応に対して選択的な消光試薬ではない。
【００１４】
選択的な消光試薬は、異なる発光反応と比較してある発光反応からの発光を少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更により好ましくは少なくとも１００倍以上、例えば２００倍、３００倍、４００倍又は９００倍消失させる。
【００１５】
発光リポーターは、発光反応を媒介することにより化学系又は生化学系の状態についての情報をもたらす分子である。その例としては、遺伝子リポーター（Ｗｏｏｄ、１９９５）、イムノアッセイリポーター（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ他、１９９１）、ＡＴＰリポーター（Ｓｃｈｒａｍ、１９９１）、並びに他の細胞分子のリポーター、例えば酵素又はコファクターがある。酵素は化学変換を触媒するタンパク質であり、したがってその化学変換による変更を受けない。酵素は化学変換の最後に再生するので、他の化学変換の過程で繰り返し利用できる。酵素はこのように基質ターンオーバーの能力を有する。この性質により、酵素媒介発光反応で連続発光が可能になる。酵素媒介発光反応は、その反応の結果として光子を発生する酵素によって媒介される化学反応である。酵素媒介発光反応の酵素は、その反応で発生した発光の大部分がその酵素の作用の結果として生じる場合はその反応を効率的に実施可能にする。
【００１６】
本発明は、光子の存在が一過性であるので、理想的に発光反応に適している。したがって、光子を発生する酵素反応の消失により、直ちにサンプル中に存在する生成光子が減少する。このように一旦発光計測がされて酵素反応が消失すると、サンプル中には生成光子の蓄積が起こらない。本質的に、サンプル中に実験対象又は対照のシグナル（即ち光子）を蓄積させることなく、発光反応を「停止」することができる。安定した化学生成物の蓄積を測定したり、蓄積した化学生成物の遅い崩壊を測定する類似の酵素反応では、同じことが言えるとは限らない。これらの反応では、化学生成物をもたらす酵素反応を消失させてもまだサンプル中に大量の化学生成物が蓄積するので、同時に又は連続して行われる他のサンプルアッセイに干渉するおそれがある。
【００１７】
発光反応の媒介となる酵素の例としては、それらには限定されないが、全て甲虫ルシフェリンのＡＴＰ媒介酸化を触媒する甲虫ルシフェラーゼ；全てコエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）の酸化を触媒する花虫綱のルシフェラーゼ（Ｗａｒｄ、１９８５）；ルミノールに関わる反応を触媒するワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ（Ｔｈｏｒｐ他、１９８６）；及び、アダマンチル１，２−ジオキセタンリン酸塩との反応を触媒するアルカリホスファターゼなどのホスファターゼ（Ｓｃｈａａｐ他、１９８９）並びにジオキセタン基質、例えば、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリロキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン、二ナトリウム塩、又は二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロル）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル］フェニルホスフェート、又は二ナトリウム２−クロル−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）−トリシクロ｛３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル｝−１−フェニルホスフェート、二ナトリウム２−クロル−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（それぞれＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＡＤＰ−Ｓｔａｒ（商標））、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−ｌ，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）トリシクロ［３．３．１．１３，７］−デカン］−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ（登録商標））、５−クロル−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ（登録商標）、２−クロル−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロル）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（登録商標）、及び、ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロナート（Ｇｌｕｃｕｒｏｎ（商標））との反応を触媒する他の酵素；或いはそのような酵素の機能上の同等物がある。特定された酵素の機能上の同等物としては、対応する非組換えの野生型酵素と同じ発光反応を触媒する能力を維持する組換え酵素があり、これらは同じ酵素グループに含まれるが、対応する野生型酵素と比較して変化した構造を有する。ある酵素の機能同等物の例としては、ある酵素が他のペプチド又はタンパク質と遺伝的に融合して二機能性ハイブリッドタンパク質を生じる例がある（Ｋｏｂａｔａｋｅ他、１９９３）。
【００１８】
ルシフェラーゼは様々な発光生物から単離又は取得することができ、例えばＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの蛍ルシフェラーゼ又はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼがある。本明細書で使う「ルシフェラーゼ」とは、任意の天然、合成又は遺伝子組換えの供給源に由来するいかなる種類のルシフェラーゼをも意味し、このような例としては、それらには限定されないが、蛍Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓから単離されたルシフェラーゼ又は他の甲虫ルシフェラーゼ（例えば、コメツキムシ（例えばＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）若しくはツチボタル類（Ｐｈｅｏｇｏｄｉｄａｅ種）から得られたルシフェラーゼ）、ウミシイタケＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｖａｒｇｕｌａ種、例えばＶ．ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ、Ｇａｕｓｓｉａ種、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ種、ツタノハガイＬａｔｉａ ｎｅｒｉｔｏｉｄｅｓ由来のもの、キセノラブドゥスルミネセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）及びビブリオフィッシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｈｅｒｉｉ）などの微生物から単離された細菌性のルシフェラーゼ；並びに、その機能上の同等物がある。
【００１９】
一の実施形態では、本発明は酵素媒介発光反応を消失させる１つ又は複数の試薬を使用する発光アッセイに関する。一の実施形態では、前記１つ又は複数の消光試薬は、前記試薬がない場合の発光と比較して発光を少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更により好ましくは少なくとも１００倍以上、例えば２００倍、３００倍、４００倍又は９００倍消失させるのに有効な量で添加される。好ましくは、消光試薬は本明細書で記載されているような選択的な消光試薬である。
【００２０】
例えば、本発明は酵素媒介発光反応をアッセイする方法を含む。この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定し、前記発光反応に少なくとも１つの選択的な消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させることを含む。他の実施形態においては、この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定し、前記発光反応に少なくとも２つの選択的な消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させることを含む。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は第２の異なる連続する酵素媒介発光反応から発生する光を実質的に消失させずに、第１の酵素媒介発光反応を選択的に消失させる１つ又は複数の試薬を使用する発光アッセイに関する。一の実施形態では、前記第２の異なる酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの試薬が、前記第１の酵素媒介発光反応に存在する。
【００２２】
本発明の一実施形態では、酵素媒介発光反応は、先ず適当な反応開始剤又は試薬をサンプルに添加して反応混合物を生成することから開始する。前記反応混合物中で発生した発光シグナルは、次に、例えばサンプル中の１つ又は複数の分子の存在又は量を検出するために測定される。１つ又は複数の選択的な消光試薬を次に加えて、前記選択的な消光試薬の導入後の比較的短い時間内で前記発光シグナルを消失させる。一の実施形態では、前記１つ又は複数の選択的消光試薬は、前記試薬がない場合の発光と比較して発光を少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更により好ましくは少なくとも１００倍以上、例えば２００倍、３００倍、４００倍又は９００倍消失させるのに有効な量で添加される。サンプル中の酵素からの発光シグナルを消失させることから、選択的な消光試薬を添加するとその前に活性化されたサンプルからの光がその後に活性化されたサンプルの、例えば複数サンプルアッセイ形式での光の測定に干渉するのが防止される。発生した第２の発光シグナルを次に測定する。好ましくは、２つ以上の分子の存在又は量を単一反応で検出する。例えば全ての反応は単一の容器、例えばウェルで行われる。
【００２３】
本発明の方法で使用されるサンプルは、細胞溶解物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応生成物、細胞培養の上清、生理学的液体サンプル、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、涙又は尿サンプルであっても、無傷細胞を含んでもよい。細胞、細胞溶解物又は上清は、原核細胞又は真核細胞から得ることができ、また生理学的液体はいかなる鳥類、爬虫類、両生類又は哺乳類から得ることができる。反応開始剤又は試薬は、このように無傷細胞、細胞溶解物又は上清若しくは生理学的液体に加えることができる。消光試薬も、無傷細胞若しくは細胞溶解物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応生成物又は生理学的液体サンプル若しくは上清サンプルに加えることができる。
【００２４】
従って、本発明は、別の異なる酵素媒介発光反応を消失させずに、ある酵素媒介発光反応、例えばルシフェラーゼ媒介発光反応又は非ルシフェラーゼ媒介発光反応を選択的に消失させる１つ又は複数の試薬を使用する二重リポーター発光アッセイを含む。即ち、２つの異なる酵素は各種試薬に対し異なる反応を示し、それによって、酵素媒介発光反応の１つを選択的に消失させる。一の実施形態では両方の反応はルシフェラーゼ媒介反応であり、例えば、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介発光反応であり、この反応は、選択的に消失させられると同時に、第２の異なるルシフェラーゼ媒介発光反応、例えば蛍ルシフェラーゼ媒介発光反応が、この第２の反応からの蛍光を実質的に消失することなく進行できるようにする。例えば、花虫綱のルシフェラーゼに選択的で、サンプル中に存在する他のリポーター又はそこで起こる反応に対して影響しない試薬を使って、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを選択的に消失させることができる。花虫綱ルシフェラーゼ媒介発光反応を選択的に消失させる試薬の例としては、それらには限定されないが、構造的にセレンテラジンに類縁の基質類似体阻害剤、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、例えば、ミセル内に花虫綱ルシフェラーゼ基質を隔離するが花虫綱ルシフェラーゼ酵素は隔離しない界面活性剤、第１の反応から発する色を選択的に消失させる着色化合物（例えば青色光では選択的な消失試薬は黄色の着色化合物である）又はそのような試薬の組合せなどがある。
【００２５】
第１の反応のための消光試薬及び第２の反応のための活性化試薬は、同時に又は順番に加えることができる。消光試薬が第２の酵素媒介発光反応の同時開始を可能にするように製剤化される場合は、このような試薬は“消光及び活性化”試薬と称される。それ故に、消光及び活性化試薬は同時に第１の酵素反応を消失させて第２の酵素反応を開始するので、そのようなアッセイは１つのサンプルにおいて２つの別個の異なる発光リポーターの連続測定を可能にする。その結果、発光リポーターの１つは内部標準として使うことができ、他は実験変数（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｒｉａｂｌｅｓ）の影響を報告するのに用いられる。或いは、各リポーターはサンプル中の２つの異なる変数、例えば特定のプロテアーゼ及びＡＴＰの濃度の存在を報告することができる。この方法は、大いに多重化を促進し、標準のマルチウェルプレート及び装置を使って、迅速で、自動化可能で、正確な再現性のある結果を提供する。
【００２６】
例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼの発光化学物質を、異なる発光酵素と共に二重リポーター発光アッセイで利用することができる。一の実施形態では、２つの発光酵素の１つは内部標準として働き、他は酵素媒介反応の遺伝子活性、又は酵素、基質若しくはコファクターの存在若しくは量の実験マーカーとして機能する。更に、本発明は特に従来の透明又は不透明なマルチウェルプレートを用いた、酵素媒介発光リポーター系に基づく高スループットの自動化アッセイに役立つ。
【００２７】
一実施形態では、本発明は酵素媒介発光反応をアッセイする方法を含む。この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定し、前記発光反応に少なくとも１つの消光試薬を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させ、且つ／又は前記第１の酵素媒介発光反応を消失させることを含む。一の実施形態では、前記消光試薬は花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、着色化合物、隔離剤又はその組合せである。例えば、一の実施形態では、花虫綱ルシフェラーゼ媒介発光反応をプロテアーゼなどの分子の存在又は量を検出するために使用することができ、この反応は、例えばＡＴＰ濃度を検出する、甲虫ルシフェラーゼ媒介発光反応の開始前に消失される。したがって、本発明は１つ若しくは複数の酵素、１つ若しくは複数の基質及び／又は１つ若しくは複数のコファクター、或いはそのいかなる組合せのための酵素媒介アッセイの多重化を可能にする。
【００２８】
本発明は、このようにサンプル内の少なくとも１つの分子の活性又は存在を測定するための方法を提供する。この方法は、酵素媒介反応のための少なくとも１つの分子を含み得るサンプル（このサンプルは例えば、前記の酵素を含んでもよい）を用意し、前記サンプルと前記分子を欠く前記酵素媒介反応のための反応混合物（この反応混合物は例えば検出する前記酵素の基質を含む）とを接触させることを含み、前記分子の存在又は量を酵素媒介発光反応によって検出することができる。一の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応の後に又はそれと並行して、反応混合物を第２の酵素媒介発光反応によって検出することができる分子を検出するための試薬と接触させる。
【００２９】
本発明の方法は、サンプル内の複数の酵素、基質又はコファクターの検出を可能にし、サンプルとしては例えば真核細胞（例えば酵母、鳥類、植物、昆虫又は哺乳類細胞があり、哺乳類細胞としては、それらには限定されないが、ヒト、サル、ネズミ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、羊、ヤギ又はブタの細胞が含まれる）或いは原核細胞、或いは２つ以上の異なる生物からの細胞、或いは細胞溶解物又はその上清などがある。このような細胞は、組換え手法によって遺伝子組換えされたものでなくてもよく（非遺伝子組換細胞）、或いは一時的に組換えＤＮＡでトランスフェクションされ、且つ／又はそのゲノムが組換えＤＮＡで安定的に増強されているか、若しくはそのゲノムが修飾されて遺伝子が破壊されている、（例えばプロモーター、イントロン若しくは読取り枠が破壊されている）か１つのＤＮＡ断片が他のものと置換されている組換え細胞であってもよい。組換えＤＮＡ又は置換ＤＮＡ断片は、本発明の方法によって検出される分子、検出する分子の濃度若しくは活性を変化させる成分、及び／又は前記分子や成分に無関係な前記分子の濃度若しくは活性を変化させる遺伝子産物をコードするものであってよい。
【００３０】
一の実施形態では、本発明は１アリコートの細胞又はその溶解物中の複数の酵素の存在又は量を測定する方法に関する。細胞の異なる位置に存在する酵素、例えば分泌酵素及び細胞内酵素では、１つの酵素の基質を無傷細胞と共にウェルに加えることができる。このように、一の実施形態では、例えば細胞内酵素の検出を分泌酵素と同じ容器、例えば同じウェル内で行う場合、分泌酵素の存在又は量を酵素媒介発光反応用試薬及び前記分泌酵素の基質（この基質は切断されると前記発光反応用の基質を生じる）を無傷細胞と接触させることによって検出し、次に選択的な消光試薬を細胞溶解と並行して、又はその前後に加え、次に、細胞内酵素の存在又は量を検出する。第１の酵素の検出は細胞溶解の前でも後でもよいが、消光の前にする。このように、本方法は酵素媒介反応のいかなる分子、例えばいかなる酵素、基質又はコファクター或いはそのいかなるセットでも検出するために使用することができる。これらの方法で使用される酵素は、検出するための酵素であっても基質又はコファクターの検出に有用な酵素であってもよく、それらは、組換え及び内因性（天然）の酵素を含む酵素の任意の組合せから選択することができる。
【００３１】
本発明は、酵素媒介発光反応を利用してサンプルを分析するための消光試薬、組成物及びアッセイキットも含む。例えば、本発明はアッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；少なくとも１つの選択的な消光試薬を含み、この選択的な消光試薬の少なくとも１つが前記酵素の基質類似体阻害剤、着色化合物、隔離剤又は他の有機化合物を含む組成物；前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器；並びに取扱説明書を含む酵素媒介発光反応アッセイキットを含む。機能的酵素基質は生物から得ることも（「天然」基質）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することもできる（「合成」基質）。他の実施形態では、酵素媒介発光反応アッセイキットはアッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；花虫綱のルシフェラーゼに対する少なくとも１つの選択的な消光試薬を含む組成物；前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器；及び取扱説明書を含む。キットには対照試薬、例えば機能的酵素が含まれてもよい。
【００３２】
他の実施形態では、本発明はアッセイする第１の酵素媒介発光反応に対応する第１の機能的酵素基質；前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；花虫綱のルシフェラーゼに対する少なくとも１つの選択的な消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質を含む消光及び活性化組成物；前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器；並びに取扱説明書を含む二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキットを含む。他の実施形態では、前記二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキットは、アッセイする第１の酵素媒介発光反応と対応する第１の機能的酵素基質；前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；少なくとも２つの選択的な消光試薬と第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質とを含む消光及び活性化組成物；前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器；並びに取扱説明書を含む。
【００３３】
また、酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制する方法も提供される。本明細書で使用されるとき、「アナライト」はリン光を生じる発光反応混合物内に存在する物質である。「非アナライト」の例は、例えば容器又は入れ物（例えば白いルミノメータープレートの発光反応混合物に存在せず、アナライトがない場合にリン光を生じる物質である。「リン光」は、それに向けられた高エネルギー電子を吸収したリン光体からの、可視帯エネルギーの長時間に渡る段階的な放出である。対照的に、蛍光は異なる周波数の高エネルギー電子を吸収した粒子からの、１周波数のエネルギーの放射である。この方法は発光反応を媒介する酵素を含むサンプルを前記酵素の反応混合物と接触させることを含み、前記混合物は着色化合物を含むが前記発光反応のための酵素を含まない。前記化合物の色は発光反応によって発生する光と実質的に同じであり、即ち約７５ｎｍ以内、好ましくは約５０ｎｍ以内、より好ましくは２５ｎｍ、１０ｎｍ又はそれ以下、例えば５ｎｍ以内である。その後、発光を検出するか測定する。また、酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制するのに役立つ化合物を特定する方法も提供される。この方法は、１つ又は複数の化合物を発光反応を媒介する酵素を含む反応混合物と接触させ、酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制する化合物を特定することを含む。
【００３４】
一の実施形態では、本発明はアッセイする酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；少なくとも１つの着色化合物；前記少なくとも１つの着色化合物がその中に入っている適当な第２の容器；及び取扱説明書を含み、前記少なくとも１つの化合物の色は前記酵素媒介発光反応によって発生する光と実質的に同じである酵素媒介発光反応アッセイキットを含む。一の実施形態では、アナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制する酵素媒介発光反応アッセイキットが提供される。このキットは、少なくとも１つの着色化合物；前記少なくとも１つの着色化合物のための適当な第１の容器；アッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第２の容器；及び取扱説明書を含む。他の実施形態では、このキットは少なくとも１つの着色化合物及びアッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質、前記着色化合物のための適当な容器、少なくとも１つの機能的酵素基質並びに使用説明書を含む。キット内の化合物の色は、発光反応の酵素によって発生する光と実質的に同じである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は酵素媒介発光反応をアッセイする方法を含む。一の実施形態では、この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応を開始し、前記発光反応によって発生した発光エネルギーを定量し、前記発光反応に少なくとも１つの消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させることを含む。好ましくは、前記消光試薬は選択的な消光試薬である。即ち、前記消光試薬は全ての発光反応を消失させる訳ではなく、それで第２の連続する酵素媒介発光反応を行うことができる。このように、本発明は第１の酵素媒介発光反応を消失するのみならず、選択的に消失させるのに役立つ組成物及び方法を提供する。
【００３６】
本発明は、第１の酵素媒介発光反応が開始されて前記第１の反応の発光エネルギーが検出又は測定される、酵素媒介発光反応の二重リポーターアッセイ方法も含む。この方法では、次に、少なくとも１つの選択的消光試薬、即ち、全てではないが少なくとも１つの発光反応を消失させる消光試薬を含む組成物を導入し、次いで第２の酵素媒介発光反応を活性化するか開始することができる混合物を含む組成物が導入されるか、又は第１の酵素媒介発光反応を選択的に消失させ、同時に第１の酵素媒介発光反応とは異なる第２の酵素媒介発光反応を開始することができる消光及び活性化組成物が導入される。第２の酵素媒介発光反応によって発生する発光エネルギーを次に検出又は測定する。任意選択に、第２の酵素媒介発光反応はその後第２の消光試薬の添加により消失させることができ、この第２の消光試薬は第２の酵素媒介発光反応に選択的で、好ましくは第３の酵素媒介発光反応を消失又は実質的に消失させない。
【００３７】
選択的消光試薬は、自動注入器及び従来の９６穴プレートなどのマイクロタイタープレート（不透明及び透明）での使用に理想的である。選択的消光試薬はサンプル内からの発光シグナルを効果的に消失させるので、透明なマルチウェルプレート内でもサンプル間の屈折光クロストークなしで複数の発光アッセイを実施することができる。更に、選択的消光試薬は、許容レベルを超えたバックグラウンド反射光を消去する。
【００３８】
好ましい一の実施形態では、酵素媒介発光反応の少なくとも１つは、ルシフェラーゼ媒介反応である。ルシフェラーゼの中では、本発明の方法は特にＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼなどの花虫綱ルシフェラーゼ、並びに甲虫ルシフェラーゼ、例えばＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ及びＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓルシフェラーゼによって媒介される発光反応のアッセイに使用することができる。例えば、第１の酵素媒介発光反応は、花虫綱ルシフェラーゼ媒介反応でよい。他の実施形態において、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応は、甲虫ルシフェラーゼ、例えば蛍ルシフェラーゼによって媒介されない。一の実施形態では、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによって媒介され、第２の酵素媒介反応は異なる酵素、例えば甲虫ルシフェラーゼ、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼによって媒介される。他の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応は、ペルオキシダーゼやホスファターゼなどのルシフェラーゼではない酵素によって媒介されてもよい。この実施形態において、第２の酵素媒介反応は、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼなどの酵素によって媒介されてもよい。
【００３９】
本明細書で記載されているように、酵素媒介発光反応はいくつかの異なる試薬、例えばそれらには限定されないが、以下のクラスの化合物から選択される１つ又は複数の消光試薬で消失、好ましくは選択的に消失させることができる：発光反応のための基質類似体阻害剤、隔離剤（例えば界面活性剤などの酵素をその基質から物理的に切り離すことができる化合物、又はさもなければ酵素若しくはその基質の溶解性を変化させる化合物）色素などの着色化合物、並びに他の有機化合物（即ち、１つ又は複数の炭素原子を含む化合物）。一実施形態では、隔離剤は基質をミセル内に隔離することによって酵素をその基質から物理的に切り離す。「ミセル」は、特定の濃度（臨界ミセル濃度）で見られる両親媒性分子のコロイド状集合体である。ミセル内の集合分子の数は、一般的に５０から１００である。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、溶液内の界面活性剤モノマーの最大可能濃度に対応する、界面活性剤の総濃度である（図５を参照）。
【００４０】
特定の酵素の消光試薬は同じクラスの酵素を不活化し易い。このように、通常、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの消光試薬は他の花虫綱ルシフェラーゼを不活化する傾向にあり、蛍ルシフェラーゼの消光試薬は他の甲虫ルシフェラーゼを不活化し易い。同様に、通常、特定の反応を触媒する酵素、例えばペルオキシダーゼ又はホスファターゼの消光試薬は、その反応を触媒する他の酵素、即ちそれぞれ他のペルオキシダーゼ及び他のホスファターゼを不活化し易い。
【００４１】
本発明の組成物及びキットのため並びに方法で使用するための好ましい基質類似体阻害剤としては、それらには限定されないが、発光反応を抑制する基質類似体阻害剤、例えば天然基質と構造的に類縁であるが、異なる酵素の基質を含むように改変されたもの（「プロ基質」）がある。好ましい基質類似体阻害剤としては、それらには限定されないが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼなど花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテル及びその類似体、並びにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの他の基質類似体阻害剤、例えばその酵素と結合するがエノール酸素が活性部位内の酸化反応に関係しないようにするもの、例えばセレンテラジンエチルエーテルなど；ペルオキシダーゼ、例えばワサビペルオキシダーゼ；更に、ホスファターゼ、例えば蛍光と結合しない安定化ジオキセタン、即ち酵素と結合するが発光しない類似体などのアルカリホスファターゼがある。例えば、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体としては、下記式を有する化合物に関連したものが含まれる。
【化１】
［式中、Ｒ７はＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又は−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１４であり；
Ｒ８はＨ、アルキル、ヘテロアルキル又はアリールであり；
Ｒ９は、Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又は−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１５であり；
Ｒ１０は−Ｈ、−ＣＨ３又は−ＣＨ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１１は、酵素脱離が可能な基ではなく；
Ｒ１４及びＲ１５は独立して酵素脱離が可能な基であり；
但し、Ｒ１４及びＲ１５は全てがアセチル基ではない。］
【００４２】
「アリール」には芳香環、例えばアリール環又はヘテロアリール環、例えばフェニル基若しくはナフチル基が含まれる。
【００４３】
具体的な一実施形態では、Ｒ１１はＣ１〜Ｃ１０アルキルエーテルである。
【００４４】
具体的な一実施形態では、Ｒ１１はメチルエーテルである。
【００４５】
具体的な一実施形態では、基質類似体は下記式（ＩＩ）を有する２，８−ジベンジル−３−メトキシ−６−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（セレンテラジンｈｈメチルエーテル）である：
【化２】
【００４６】
式（ＩＩ）の化合物の合成では、アルゴン下の周囲温度で乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中で撹拌した２，８−ジベンジル−６−フェニル−７Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（０．２５ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ）を一斉に加え、次にヨウ化メチル（０．４ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ）を滴下する。１時間の撹拌後、ＴＬＣ分析によると反応は終了していた。反応混合物をジクロロメタン（７５ｍｌ）で希釈し、水で２回洗浄した。有機抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過・蒸発して褐色油を得た。この粗抽出油はシリカゲル（３０ｇ）のフラッシュクロマトグラフィにより移動層としてジクロロメタンを使って精製した。該当する画分をプールして蒸発させ、所望の化合物を２００ｍｇ（７７％）得た。
【００４７】
他の酵素の基質を含むように改変されたルシフェラーゼの基質類似体（「プロ基質」）は、それが前記他の酵素が存在しなくルシフェラーゼ及び適当な試薬が存在する場合には発光を起こさないが、前記他の酵素とルシフェラーゼ及び適当な試薬が存在する場合には発光を起こす場合は、本発明のキット及び方法で使用することができ、即ち、プロ基質は基質類似体阻害剤となりうる。したがって、そのような基質類似体は、プロ基質を認識する酵素を欠く反応において選択的消光試薬として、又はその酵素を含む反応における発光プロ基質として使用することができる。例えば、これらの類似体としては、アミノルシフェリン、ジヒドロルシフェリン、ルシフェリン６’メチルエーテル、ルシフェリン６’クロロエチルエーテル、又はセレンテラジンの誘導体、例えばセレンテラジンｎ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｃ、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｅ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｆｃｐ、セレンテラジンｉ、セレンテラジンｉｃｐ若しくはセレンテラジン２−メチルのような他の酵素の基質を含むように変更されたセレンテラジンの誘導体があり、例えば国際出願ＡＪＳ０３／０２９３６を参照されたい。
【００４８】
通常、セレンテラジンに関しては、この誘導体化は、フェノール（−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）、カルボニル（＞Ｃ＝Ｏ）及びアニリン（−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２）などの官能基のその環境への反応性が低い基への変換を含む。官能基の通常の反応性は酵素脱離が可能な基が存在すると抑制されるので、酵素脱離が可能な基は保護基と称することができる。可能な保護基としては、エステラーゼとの相互作用によって脱離するエステルがある。可能な保護基としては、ホスホジエステラーゼ及びアルカリホスファターゼなどのホスファターゼとの相互作用によって脱離するホスホリルもある。可能な保護基としては、グリコシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−フルクトフラノシド及びβ−Ｄ−グルコシドウロネートとの相互作用によって脱離するグルコシルもある。当業者ならば、本発明で使用することができるであろう他の酵素脱離が可能な保護基を認めることができよう。酵素と酵素脱離が可能な基との相互作用の例は、米国特許第５８３１１０２号、並びにＴｓｉｅｎ（１９８１）；Ｒｅｄｄｅｎ他（１９９９）；及びＡｎｎａｅｒｔ他（１９９７）に記載されている。
【００４９】
酵素脱離が可能な基は、特異的な酵素の作用によってのみ脱離するように設計してもよい。例えば、ある種の脂肪酸を酵素脱離可能な基として使用することができ、特異的なエステラーゼだけがこれらの保護されたセレンテラジンをセレンテラジンに変える。立体障害の高い保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチル基を使用してもよい。そのような保護基は、大きな、立体障害エステルに作用することができる新規エステラーゼのスクリーニングに役立つ。アミノ酸も保護基として使用することができる。保護されたセレンテラジンは、更にエノール酸素原子を保護基と結合した窒素原子で置換することによって変更してもよい。この種の保護基は次にプロテアーゼによって取り除くことができ、その後、保護されたセレンテラジンをエノール／カルボニルへ加水分解することによりセレンテラジンが生じる。
【００５０】
これらの酵素脱離が可能な基は、好ましくはアルコール官能基の誘導体である。セレンテラジンのカルボニル官能基の場合、誘導体化にはカルボニルのエノール基（−Ｃ＝Ｃ−ＯＨ）への変換が含まれてもよい。セレンテラジンのカルボニル及びエノール型は、エノール型の基質が常にある割合で存在するように溶液内で動的平衡状態にあってもよい。エノール基のヒドロキシル（−ＯＨ）部分は誘導体化することができる。アシル化剤を使ったエステル形成を経た誘導体化を、以下に図式的に示す。構造ＩＩＩを有するセレンテラジンは２つのフェノール基及び１つのカルボニル基を含み、これらの基はいかなる組合せで保護してもよい。
【化３】
【００５１】
エーテル保護基による誘導体化は、例えばセレンテラジンをアセトキシメチルブロマイドなどのアルキル化剤で処理して実施することができる。エステル保護基による誘導体化は、例えばセレンテラジンをア無水酢酸又は塩化酢酸などのアシル化剤で処理して実施することができる。これらの誘導体化は塩基条件下、即ちｐＨ７から１４の間で実施される。これらの条件下では、フェノールのヒドロキシルとイミダゾロン酸素は共に反応して、対応するエステル又はエーテルを形成することができる。イミダゾロン酸素はエノール型のときに反応すると思われている。保護／脱保護プロセス並びに様々な保護基の例は、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｇｒｅｅｎｅ、Ｗｕｔｓ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１に記載されている。
【００５２】
誘導体化プロセスの１例は、保護されたセレンテラジンＩＶのセレンテラジンＩＩＩからの合成である。保護されたセレンテラジンＩＶは３つのアセチル保護基が存在するので、トリアセチル−セレンテラジンとしても知られている。
【化４】
【００５３】
化合物ＩＶの構造を有する化合物が天然のセレンテラジンＩＩＩの構造を確立する研究において中間体として使われたことが報告されている（Ｉｎｏｕｅ他、１９７７）。保護されたセレンテラジンＩＶは、アセチル誘導体化されたエノール基の反応活性度を考えると、他の保護されたセレンテラジンと比較して安定性がかなり低いことが予想される。
【００５４】
与えられた保護基に関しては、誘導体化されたエノールは同じように誘導体化されたフェノールよりも不安定である。エノール誘導体の反応性が増すことから、エノール誘導体が選択的に加水分解されて再びイミダゾロンカルボニルが得られるようになる。この種の化合物は、官能基の一部が保護され他は保護されないことから部分的保護化学種と呼ばれる。これらの部分的保護化学種は生物アッセイで使用することができ、又は異なるアシル化剤若しくはアルキル化剤と更に反応を起こさせて非対称化合物、つまり複数種類の保護基を有し同じくアッセイで使用することができる化合物を形成することができる。適当な保護基の選択は、検討中の細胞型及び所望の加水分解速度によって決めることができる。選択的な加水分解は、例えばＩｎｏｕｅ他（１９７７）で記載されているように実施することができる。このことは、トリアセチル−セレンテラジン（ＩＶ）のジアセチル−セレンテラジン（Ｖ）への選択的加水分解及び以降の保護された非対称セレンテラジン（ＶＩ）の形成のための以下の反応スキームに図示する。
【化５】
【００５５】
構造ＶＩＩ〜ＩＸは、カルボニル上に保護基を有している保護されたセレンテラジンを例示する。
【化６】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は独立してＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又はその組合せでよい。Ｒ１２及びＲ１３は、独立して−ＯＲ１６、Ｈ、ＯＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又はその組合せでよい。構造ＶＩＩＩでは、ｎは０、１、又は２、好ましくは１でよい。
好ましくは、Ｒ７はＲ１の記載通りであるか、又は−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１４である。
好ましくは、Ｒ８はＲ２の記載通りであり、Ｒ１０はＲ４の記載通りである。
好ましくは、Ｒ９はＲ３の記載通りであるか、又は−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１５である。
Ｒｐとして一緒に識別されるＲ１１、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は保護基であり、独立して様々な保護基のいずれかでよい。好ましくは、これらの種はそれらの対応するＯ原子と共にエーテル、エステル又はその組合せである。例えば、保護基はアセチル（Ｒｐ＝−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３）、ブチリル（Ｒｐ＝−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ３Ｈ７）、アセトキシメチル（Ｒｐ＝−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３）、プロパノイロキシメチル（Ｒｐ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２Ｈ５）、ブチリロキシメチル（Ｒｐ＝−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ３Ｈ７）、ピバロイロキシメチル（Ｒｐ＝−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ３）３）又はｔ−ブチリル（Ｒｐ＝−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ３）３）でよい。
【００５６】
保護されたセレンテラジンの具体例としては、トリアセチル−セレンテラジン（ＩＶ）、トリブチリル−セレンテラジン（Ｘ）、ジアセチル−セレンテラジン−ｈ（ＸＩ）、アセトキシメチルジアセチル−セレンテラジン（ＸＩＩ）、アセトキシメチルアセチル−セレンテラジン−ｈ（ＸＩＩＩ）、ピバロイルオキシメチル−セレンテラジン−ｈ（ＸＩＶ）及びアセトキシメチル−ジデオキシセレンテラジン（ＸＶ）がある。
【化７】
【００５７】
保護されたセレンテラジンが適当な脱保護酵素と相互作用すると、保護基が取り除かれ、元の官能基を回復することができる。適当な脱保護酵素が存在しない場合は保護基は脱離せず、一部の実施形態においては保護されたセレンテラジンはルシフェラーゼの阻害剤として使用することもできる。エステル及びエーテル保護基に関しては、脱保護酵素は、例えばエステラーゼを含めいかなるヒドロラーゼでもよい。セレンテラジンに関しては、その脱保護形態（即ちカルボニル）内にカルボニル官能基を有することは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ及びエクオリンなどの発光タンパク質との発光相互作用を可能にする。保護されたセレンテラジンをセレンテラジンに変換するには、カルボニル部位を脱保護するだけでよい。それでもフェノールのヒドロキシル上の保護基は、発光相互作用を妨害又は阻止することができる。
【００５８】
ジオキセタン基質を使用する酵素に関しては、反応のための基質としては下記式を有するジオキセタン含有基質があり、また反応の基質類似体阻害剤はこのような基質と構造的に関係していてもよく、
【化８】
［式中、Ｔは置換されている（即ち、１つ若しくは複数のＣ１〜Ｃ７アルキル基又はヘテロ原子基、例えばハロゲン原子を含む）か非置換のシクロアルキル環（環に６〜１２個の炭素原子を含んでいる）又は多環式アルキル基（２つ以上の縮合環を有し、各環は独立に５〜１２個の炭素原子を含む）であり、これらはジオキセタン４員環とスピロ結合により結合し、例としてはクロロアダマンチル基若しくはアダマンチル基があり、最も好ましくはクロロアダマンチルであり；
Ｙは蛍光発色団であり（即ち、Ｙはエネルギーを吸収して励起した、即ちより高いエネルギーの状態を形成することができる基であり、その状態から光を放出して元のエネルギー状態に戻る）；
Ｘは水素、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル又はヘテロアルキル基（１〜７個の炭素原子を含み、例えばメトキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシエチル、トリフルオロエトキシ又はヒドロキシプロピル）、アリール基（少なくとも１つの環を有し、例えばフェニル）、ヘテロアリール基（少なくとも１つの環を有し、例えばピロリル又はピラゾリル）、ヘテロアルキル基（環に２〜７個の炭素原子を含み、例えばジオキサン）、アラルキル基（少なくとも１つの環を有し、例えばベンジル）、アルカリル基（少なくとも１つの環を有し、例えばトリル）、或いは酵素切断が可能な基、即ち、酵素によって切断されてジオキセタンに結合した電子に富む基、例えばリン酸を生成することができる部分を有する基であり、リン−酸素結合は酵素、例えば酸性ホスファターゼ又はアルカリホスファターゼによって切断されてジオキセタン又はＯＲに結合した負荷電の酸素を生成することができ；
Ｚは水素、ヒドロキシル又は酵素切断可能な基であり、但しＸ又はＺの少なくとも１つは酵素切断可能な基で、酵素は前記酵素切断可能な基を切断してジオキセタンに結合した負荷電の基（例えば酸素アニオン）を形成し、前記負荷電の基はジオキセタンが分解して基Ｙを含む発光物質（即ち、光の形のエネルギーを発する物質）を形成するようにする］
発光シグナルは、酵素活性の指標として検出される。発光の強度を測定することにより酵素活性を測定することができる。
【００５９】
化学発光反応のための活性基質は式ＸＶＩのＸがＯＲのとき生成され、基Ｒは炭素原子数１〜２０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル、アリール、シクロアルキル又はアリールアルキルである。Ｒは１つ又は２つのヘテロ原子を含んでもよく、これらはＰ、Ｎ、Ｓ又はＯでよい。置換基Ｒはハロゲン化される。ハロゲン化の程度は、アダマンチル基、アリール基上の選択された置換基、及び想定されている特定の用途の所望の酵素反応速度論によって異なる。最も好ましくはＲはトリハロアルキル基である。好ましい基としてはトリハロ低級アルキルがあり、これにはトリフルオロエチル、トリフルオロプロピル、ヘプタフルオロブチロール、ヘキサフルオロ−２−プロピル、ａ−トリフルオロメチルベンジル、ａ−トリフルオロメチルエチル及びジフルオロクロロブチル基が含まれる。置換基Ｒの炭素原子は、ハロゲンで部分的又は完全に置換されてもよい。Ｒがアリールである場合、好ましい基としては１つ若しくは複数のクロロ、フルオロ又はトリフルオロメチル基で置換されたフェニル環、例えば２，５−ジクロロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，３，５−トリフルオロフェニル、２−クロロ−４−フルオロフェニル又は３−トリフルオロメチルフェニルを挙げることができる。フッ素及び塩素は特に好ましい置換基であるが、臭素及びヨウ素は特別な状況で使用することができる。
【００６０】
基Ｙは酵素切断が可能な基Ｚに結合した蛍光発色団又は蛍光団である。Ｙはジオキセタンが分解すると発光性となるが、それはリポーター酵素が基Ｚを切断し、それによりジオキセタンを不安定にする電子に富む部分が生成してジオキセタン分解の原因となる場合である。分解により２つの個々のカルボニル化合物が生成し、その１つは基Ｔを含み、他は基Ｘ及び基Ｙを含む。ジオキセタン分解から遊離するエネルギーは、Ｘ及びＹ基を含む化合物に発光を起こさせる（基Ｘが水素の場合、アルデヒドが生じる）。Ｙは好ましくはフェニル又はアリールである。アリール部分は式ＸＶＩのように基Ｚを有し、更に米国特許第５５８２９８０号に記載されているように１〜３個の電子活性基、例えば塩素又はメトキシを有する。
【００６１】
いかなる発色団でもＹとして使用することができる。一般に、感度を向上させるために量子収率を最大にする発色団を使うことが望ましい。したがって、Ｙは通常芳香族の基を含む。適当な発色団の例は、米国特許第４９７８６１４号で更に詳述されている。
【００６２】
発色団Ｙに結合した基Ｚは、酵素切断が可能な基である。酵素と接触すると、酵素切断が可能な基は切断されて発色団Ｙに結合した電子に富む基を生じる；この基は、２つの個々のカルボニル含有化合物、例えばケトン又はエステル、また基Ｘが水素の場合はアルデヒドへのジオキセタンの分解を開始する。電子に富む基の例としては、酸素、硫黄及びアミン又はアミノアニオンがある。最も好ましい基は、酸素アニオンである。適当なＺ基及びこれらの基に特異的な酵素の例は、米国特許第４９７８６１４号の表１に記載されている。そのような酵素としては、アルカリ及び酸のホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フラクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ並びにトリプシンが含まれる。
【００６３】
ジオキセタン類似体は、Ｔ、Ｙ及びＸのいずれかと結合した１つ又は複数の可溶化置換基、即ち、水溶液中で類似体の溶解性を強化する置換基を含むことができる。可溶化置換基の例としてはカルボン酸、例えば酢酸；スルホン酸、例えばメタンスルホン酸；及び、第４級アミノ塩、例えば臭化アンモニウムが含まれ；最も好ましい可溶化置換基は、メタン又はエタンスルホン酸である。それから本発明の実施に役立つジオキセタン類似体を調製することができる他のジオキセタンは、米国特許第５０８９６３０号；米国特許第５１１２９６０号；米国特許第５５３８８４７号及び米国特許第５５８２９８０号に記載されている。
【００６４】
一の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応のための基質類似体は甲虫ルシフェラーゼのための基質類似体ではなく、例えば、この基質類似体はデヒドロルシフェリン、ＡＴＰ、ベンゾチアゾール、１−（４−アミノフェニル）−６−メチルベンゾチアゾール、２−フェニルベンゾチアゾール及び２（Ｏ−ヒドロキシフェニル）ベンゾチアゾールではない。
【００６５】
一の実施形態では、好ましい基質類似体は天然基質の不可逆的競合阻害剤である。
【００６６】
好ましい隔離剤としては、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、例えば有効量では基質をその対応する酵素から物理的に分離して、好ましくは酵素反応が起こらないようにするもの、並びに基質又は酵素の抗体又は他のリガンドが含まれる。好ましい隔離剤としては、第１の酵素の基質の少なくとも一部、例えば３５％以上、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上を例えばミセル内に隔離するが、異なる第２の酵素及びその対応する基質は隔離しない剤、又は第２の異なる基質及びその対応する酵素の溶解性は変化させないが第１の基質若しくは第１の酵素の溶解性を変化させて発光をもたらす第１の基質と第１の酵素間の相互作用を、例えば少なくとも３５％以上、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上抑制する剤が含まれる。好ましい隔離剤としては、それらには限定されないが、アニオン性、非イオン性、両性又はカチオン性界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｏｒ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、例えば図５に示したものがある。一実施形態では、好ましい隔離剤としては、それらには限定されないが、クラウンエーテル、エトキシル化Ｔｏｍａｈ、例えばＴｏｍａｈ Ｅ（登録商標）、アザクラウンエーテル、シクロデキストラン、トゥイーン（登録商標）２０（ポリ（オキシエチレン）ｘ−ソルビタン−モノラウレート）、トゥイーン８０、Ｂｉｇ Ｃｈａｐｓ、ＣＨＡＰＳ、ＤＴＡＢ、トリトン（登録商標）Ｘ−１００（アルキルポリエーテルアルコール；［Ｃ１６Ｈ２６Ｏ２］ｎ）、並びにＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）Ｎｐ−９、ポリビニルピロリドン及びグリコール、例えばポリエチレングリコール、例えば４００又は６００が含まれる。このように、例えば、基質、例えば大部分の基質を対応する酵素から物理的に分離する剤を添加すると、前記基質（例えばセレンテラジン）をミセル内に隔離し、前記酵素、例えばＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを溶液の水性部分に残すことができる。より詳細には、第１の発光反応の好ましい隔離剤は、発光反応を媒介する第１の酵素の基質の少なくとも大部分を酵素から物理的に分離し、第２の異なる酵素媒介発光反応からの光を実質的には消光しない剤である。一実施形態では、第１の花虫綱ルシフェラーゼ媒介反応の隔離剤は、例えば第２の酵素媒介発光反応がＰｐｅ２などの蛍ルシフェラーゼによって媒介される場合は、荷電界面活性剤、例えば約０．０５％、０．１％、１．０％、２％（ｖ／ｖ）以上のＣＨＡＰＳでよい（国際出願第０１／２０００２号）。他の実施形態では、第１の花虫綱ルシフェラーゼ媒介反応の隔離剤は、例えば第２の酵素媒介発光反応がＬｕｃ＋によって媒介される場合は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、例えば０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１．０％、２％以上のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９でよい（米国特許第５６７０３５６号）。
【００６７】
一実施形態では、好ましい着色化合物は青、緑又は赤の光を消光する化合物である。化合物は目視又は吸収スペクトルによりスクリーニングして青、緑又は赤の光を消光する化合物候補を識別することができる（特別に参照により本明細書に組み込まれた「染色剤、色素及び指示薬のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈハンドブック（Ｔｈｅ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔａｉｎｓ，Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｉｎｄｉｃａｔｅｒｓ）」、Ｇｒｅｅｎ編、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ミルウォーキー、ＷＩ、１９９０を参照）。
【００６８】
本明細書で使用される赤色光には、約５９０ｎｍより長く約７３０ｎｍ未満の波長、例えば６１０ｎｍから６５０ｎｍの波長の光が含まれる。本明細書で使用される黄緑色の光には、約４９０ｎｍから約５９０ｎｍ、好ましくは約５２０ｎｍから約５７０ｎｍの波長の光が含まれる。本明細書で使用される黄色光には、５６０ｎｍより長く約５９０ｎｍまでの波長の光が含まれる。本明細書で使用される緑色光には、４９０ｎｍより長く約５６０ｎｍまでの波長の光が含まれる。本明細書で使用される青色光には、４００ｎｍより長く約４９０ｎｍまでの波長の光が含まれる。
【００６９】
例えば、赤色光は４．２９×１０１４Ｈｚの周波数又は１．７７ｅＶである７００ｎｍの波長、並びに４．６２×１０１４Ｈｚの周波数又は１．９１ｅＶである６５０ｎｍの波長と一致してもよい。黄色光は５．１６×１０１４Ｈｚの周波数又は２．１４ｅＶのエネルギーである５８０ｎｍの波長と一致してもよい。緑色光は５．４５×１０１４Ｈｚの周波数又は２．２５ｅＶのエネルギーである５５０ｎｍの波長と一致してもよい。青色光は６．６６×１０１４Ｈｚの周波数又は２．７５ｅＶのエネルギーである４５０ｎｍの波長と一致し、紫色光は７．５０×１０１４Ｈｚの周波数又は３．１０ｅＶのエネルギーである４００ｎｍの波長と一致してもよい。
【００７０】
例えば、黄色の化合物は青色光、例えばＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びワサビペルオキシダーゼの媒介による反応から発生する光を消光するのに役立つ。更に、黄色の化合物は一部の甲虫ルシフェラーゼによって発生する黄緑光を消光しないので、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ／蛍ルシフェラーゼアッセイなどの二重アッセイで消光するために用いることができる。好ましい黄色化合物としては、それらには限定されないが、水溶液で溶解すると５６０〜５９０ｎｍから７５ｎｍ以内にピーク吸光度を有する化合物、例えばジピリダモール及びベルベリンヘミサルフェートがある。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによって発生する光を消光するために好ましい化合物としては、それらには限定されないが、青色光を吸収し、一実施形態では黄緑色光を透過させる化合物、例えば、それらには限定されないが、アクリジンオレンジ、塩基オレンジ２１号、塩酸４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンアルソン酸（ｂｅｎｚｅｎｅｎｅａｒｓｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、５−アミノフルオロセイン、ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオレセイン、２，４−ジアミノ−５−（２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニルアゾ）ベンゼンスルホン酸、ヌビアンイエローＴＢ、アシッドオレンジ１０号、アウリン、及び溶媒黄色１４号がある。
【００７１】
他の実施形態において、好ましい化合物としては、赤色光を消光する化合物、例えば溶液ではシアン又は青色を呈する化合物、例えばアズールＢテトラフルオロホウ酸塩、アシッドブルー９３、５，５’，７−インジゴトリスルフィン酸三カリウム塩、クレジルバイオレットアセテート、トリプタンブルー、トウォート染色剤及びリサミングリーンＢがある。好ましい青色化合物としては、水溶液で溶解すると４００〜４９０ｎｍから７５ｎｍ以内にピーク吸光度を有する化合物がある。
【００７２】
赤色光又は黄色光を消光するが青色光は消光しない青色の化合物としては、それらには限定されないが、青色クロム酸塩色素、イソスルファンブルー、メチレンブルー、クーマシーブルー、アシッドブルー、オルセイン、ペルシャンブルー、インジゴトリスルホン酸カリウム、α−ナフトフタレイン、アズールＩＩ、オイルブルーＮ、パテントブルーＶＦ、パラローアニリン塩基（ｐａｒａｒｏａｎｉｌｉｎｅ）、ロダニルブルー、テトラブロモフェノールブルー、トルイジンブルーＯ、ビクトリアピュアブルーＢＯ、ビクトリアブルーＢ、アルカリブルー６Ｂ、アルファアズリンＡ及びシアニン染料などがある。
【００７３】
他の実施形態において、好ましい化合物としては、緑色光を消光する化合物、例えば溶液ではマゼンタ又は赤色を呈し、一実施形態では赤色光を透過させる化合物、例えばそれらには限定されないが、アシッドブルー、アシッドバイオレット１９、アミドナフトールレッド６Ｂ、及び塩基レッド９がある。好ましい一実施形態において、緑色光を消光して青色光を透過させる化合物としては、アシッドバイオレット１７、インディゴブルー、塩化ピナシアノール、ローダミン６Ｇ過塩素酸塩、ロダニルブルー、パラローザニリン塩基、ローズベンガルビス（トリエチルアンモニウム）塩及び３，３’−ジメチルフェノールフタレインがある。好ましい化合物は、水溶液で溶解すると５９０〜７３０ｎｍから７５ｎｍ以内にピーク吸光度を有する化合物である。
【００７４】
一の実施形態では、化学発光反応の消光試薬として有効な適当な化合物としては有機化合物（即ち１つ又は複数の炭素原子を含む化合物）があり、例えば参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第０９／５９０８８４号に開示されているものなどがある。適当な有機化合物は炭素−硫黄結合又は炭素−セレニウム結合を含むことができ、例えば、適当な有機化合物は炭素−硫黄二重結合（Ｃ＝Ｓ）、炭素セレニウム二重結合（Ｃ＝Ｓｅ）、炭素−硫黄単結合（Ｃ−Ｓ）又は炭素−セレニウム単結合（Ｃ−Ｓｅ）を含むことができる。適当な有機化合物は、炭素と結合したメルカプト基（Ｃ−ＳＨ）又は２つの炭素原子と結合した硫黄原子（Ｃ−Ｓ−Ｃ）も含むことができる。好ましい化合物は親油性である。
【００７５】
炭素硫黄二重結合又は炭素セレニウム二重結合を含む適当な化合物としては、例えば式（ＸＶＩＩ）の化合物：
【化９】
［式中、ＸはＳ又はＳｅであり；Ｒ１及びＲ２は、各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲａＲｂであり；或いはそれらが結合する炭素と共にＲ１及びＲ２は炭素及び任意選択にオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）又は窒素（−ＮＲｃ）−から選択される１つ、２つ又は３つのヘテロ原子を含む５、６、７又は８員環の飽和又は不飽和の環を形成し、前記環は任意選択に１つ、２つ又は３つのハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールで置換され；Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃのいずれかの（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、１つ又は複数（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される］
又はその塩が含まれる。
【００７６】
本明細書で使われる用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを意味する。
【００７７】
用語「アルキル」、「アルコキシ」、「アルケニル」、「アルキニル」などは、本明細書で使われるように、分岐及び非分岐の基を意味する；しかし、「プロピル」のような個々の基に言及する場合は、直鎖で非分岐鎖の基のみを含み、「イソプロピル」のような分枝鎖異性体は特別に呼ばれる。
【００７８】
本明細書で使われるように、用語「アリール」は６〜３０個の原子を含み少なくとも１つの環が芳香環である、単環式又は多環式炭化水素基を意味する。好ましくは、アリールはフェニル基又は約９〜１０個の環原子を有し少なくとも１つの環が芳香環であるオルト縮合二環式炭素環基を意味する。「ヘテロアリール」は、炭素と非ペルオキシド酸素、硫黄及びＮ（Ｘ）からなる群からそれぞれ選択される１〜４個のヘテロ原子からなる５個又は６個の環原子を含む単環式芳香環の基を含み、Ｘは無であるか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニル又はベンジルであり、並びにそこから誘導される８〜３０個の原子を含む多環式環の基を含む。好ましくは、ヘテロアリールは、炭素と非ペルオキシド酸素、硫黄及びＮ（Ｘ）からなる群からそれぞれ選択される１〜４個のヘテロ原子からなる５個又は６個の環原子を含む単環式芳香環の環炭素を介して結合した基を含み、Ｘは無であるか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニル又はベンジルであり、並びにそこから誘導された約８〜１０個の環原子のオルト縮合二環式複素環の基、特にベンズ誘導体又はプロピレン、トリメチレン若しくはテトラメチレンジ基をそこへ縮合することによって誘導したものを含む。
【００７９】
メルカプト基を含む適当な化合物としては、例えば式Ｒ３ＳＨの化合物又はその塩が含まれ、但し、式中：Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ３の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つ又は複数（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｄＲｅで任意選択に置換され；Ｒｄ及びＲｅは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）、アルキニル（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールであり；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８０】
他の適当な化合物としては、例えば式Ｒ４ＮＣＳの化合物又はその塩が含まれ、但し、式中、Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ３の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｆＲｇで任意選択に置換され；Ｒｆ及びＲｇは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールであり；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８１】
炭素−セレン単結合又は炭素硫黄単結合を含む他の適当な化合物としては、式Ｒ５−Ｘ−Ｒ６の化合物
［式中：
Ｘは−Ｓ−又は−Ｓｅ−であり；
Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ６は水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；
又は、Ｒ５及びＲ６はＸと共にヘテロアリールを形成し；
Ｒ５又はＲ６の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つ又は複数（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｋＲｍで任意選択に置換され；
Ｒｋ及びＲｍは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールであり；
アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される］
又はその塩が含まれる。
【００８２】
下記に示す基、置換基及び範囲の具体的な好ましい値は説明のためだけにすぎず、それらは、基及び置換基についての他の定義値や定義範囲の他の値を排除するものではない。
【００８３】
具体的には、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル又はヘキシルでよく；（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルでよく；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ又はヘキシルオキシでよく；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルは、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル又は５−ヘキセニルでよく；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル又は５−ヘキシニルでよく；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルは、アセチル、プロパノイル又はブタノイルでよく；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル又はヘキシロキシカルボニルでよく；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイロキシは、アセトキシ、プロパノイロキシ、ブタノイロキシ、イソブタノイロキシ、ペンタノイロキシ又はヘキサノイロキシでよく；アリールは、フェニル、インデニル又はナフチルでよく；ヘテロアリールはフリル、イミダゾリル、トリアゾリル、トリアジニル、オキサゾイル、イソオキサゾイル、チアゾリル、イソチアゾイル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、テトラゾリル、ピリジル（又はそのＮ−オキシド）、チエニル、ピリミジニル（又はそのＮ−オキシド）、インドリル、イソキノリル（又はそのＮ−オキシド）或いはキノリル（又はそのＮ−オキシド）でよい。
【００８４】
具体的には、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲａＲｂであり；Ｒａ及びＲｂは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ及びＲｂの（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つか２つのハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８５】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリール又はＮＲａＲｂでよい。
【００８６】
具体的には、それらが結合する炭素と共にＲ１及びＲ２は炭素及び任意選択にオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）又は窒素（−ＮＲｃ）−から選択される１つ又は２つのヘテロ原子を含む５又は６員環の飽和又は不飽和の環を形成することができ、前記環は任意選択に１つ、２つ又は３つのハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールで置換され；Ｒｃは水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールであり；Ｒ１、Ｒ２、及びＲｃのいずれかの（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８７】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立してＮＲａＲｂでよく；Ｒａ及びＲｂは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールであり；（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８８】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立してアミノ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノ又は４−チアゾイルアミノでよい。
【００８９】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立してアミノ、メチル、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノ又は４−チアゾイルアミノでよい。
【００９０】
Ｒ３の具体的な値は、１つ又は複数のハロゲン、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｄＲｅで任意選択に置換された（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルである。
【００９１】
Ｒ３の具体的な値は、２−アミノエチル、２−アミノ−２−カルボキシエチル又は２−アシルアミノ−２−カルボキシエチルである。
【００９２】
Ｒ４の具体的な値は、１つ又は複数のハロゲン、メルカプトヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ、又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換されたアリールである。
【００９３】
具体的には、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ６は水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールである。
【００９４】
具体的には、Ｒ５及びＲ６はＸと共にヘテロアリールを形成する。
【００９５】
好ましい有機化合物からは、１つ又は複数のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含むポリペプチド及びタンパク質は排除される。
【００９６】
好ましい有機化合物からは、１つ又は複数のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含む化合物は除外される。
【００９７】
一実施形態では、好ましくは消光試薬はヨウ化物、ヨウ素、硫酸塩、硝酸塩、イソプロパノール、２−（４−アミノフェニル）−６−メチルベンゾチアゾール（ＡＰＢＮＨ）、酸化ジメチルデシルホスフィン、ピロリン酸、ベンゾチアゾール、２−フェニルベンゾチアゾール、ｎ−ブタノール、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）、（２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−チアゾール−４−カルボン酸、エチレンジアミンテトラエチレンジアミン四酢酸、２（ｏ−ヒドロキシフェニル）ベンゾチアゾール、アデノシン５’−三リン酸、酸化２’，３−非環式ジアルコール過ヨウ素酸塩、還元ホウ化水素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、クエン酸、トゥイーン（登録商標）２０及びトリトン（登録商標）Ｘ−１００ではない。他の実施形態において、消光試薬を含む組成物は、クエン酸、ｎ−ブタノール、イソプロパノール、エチルアルコール、ヨウ化物、ヨウ素、トゥイーン（登録商標）２０、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド及びそのいかなる組合せも含まない。他の実施形態では、消光試薬はチオールではない。他の実施形態では、消光試薬は甲虫ルシフェラーゼの選択的消光試薬ではない。
【００９８】
本発明は、１つ又は複数の選択的消光試薬を含む、単一リポーター及び二重リポーターのアッセイキットも含む。単一リポーターキットは、酵素媒介発光反応からの光子発光を消光することができる少なくとも１つの選択的消光試薬組成物を含む。前記少なくとも１つの選択的消光試薬組成物は、適当な第１の容器内に入れられる。酵素媒介発光反応の少なくとも１つの機能的酵素基質が、前記少なくとも１つの機能的酵素基質が置かれる適当な第２の容器と共に任意選択にキットに含まれる。キットは、使用説明書も含む。
【００９９】
一実施形態では、２つ以上の選択的消光試薬が本発明の方法、組成物及びキットで使用され、好ましくは、消光に及ぼすその複合効果は相加作用以上である。
【０１００】
二重リポーターキットは、少なくとも１つの酵素媒介発光反応からの光子発光を消光させることができるが、少なくとも１つの第２の異なる酵素媒介発光反応を実質的に消光させることのできない少なくとも１つの選択的消光試薬を含む。或いは、又は少なくとも１つの選択的消光試薬に加えて、キットは、少なくとも１つの酵素媒介発光反応からの光子発光を選択的に消光させることができるが、第２の異なる酵素媒介発光反応からの光子発光を実質的に消光させることのできない少なくとも１つの第１の消光試薬を含む消光及び活性化組成物を含む。前記少なくとも１つの選択的消光試薬組成物、又は消光及び活性化組成物は、適当な第１の容器内に置かれる。第１の酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの機能的酵素基質が、適当な第２の容器内に置かれる。任意選択に、二重リポーターキットは、適当な第３の容器内に置かれた第２の酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの機能的酵素基質を含む。この二重リポーターキットは、使用説明書も含む。また、任意選択に、この二重リポーターキットは適当な第３の容器内に置かれた、前記第１の選択的消光試薬とは異なる少なくとも１つの第２の消光試薬も含むことができる。選択的な消光試薬であってもよい第２の消光試薬は、第２の異なる酵素媒介発光反応を消光させることができる。
【０１０１】
本発明は、本発明の方法を実施するためのアッセイキットも含む。そのようなキットは、１つ又は複数の容器内に、通常アッセイでの使用を容易にするように便利に梱包されて、前記方法を実施するための様々な組成物を大量に含む。このように、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ基質又はＡＴＰのアッセイキットには、以下の１つ又は複数或いはそのいかなる組合せも含むことができる組成物が含まれる：マグネシウムイオン、ＡＴＰ、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェリン及び／又はチオール試薬。一実施形態では、そのような組成物は、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含んでもよく、他の成分、例えばタンパク質のルシフェラーゼ活性エンハンサー（例えば、精製酵素製剤中のウシ血清アルブミン又はグリコール）、ＥＤＴＡ若しくはＣＤＴＡ、リン酸塩若しくは２−アミノエタノール、或いは甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が適当な速度で進行するｐＨ及びイオン強度の溶液を提供するための緩衝を含んでもよい。
【０１０２】
そのようなキット及び組成物の１成分は、カチオン、例えばマグネシウム、カルシウム、マンガンなどでよい。
【０１０３】
本発明の方法及び組成物で使用されるチオール試薬は、ＣｏＡ又はＣｏＡ以外のチオール試薬である。ＣｏＡ以外のチオール試薬は、反応が起こる温度、ｐＨ、イオン強度、化学組成などの条件下で空気飽和した水溶液内で還元剤として有効な遊離のスルフヒドリル基を有する試薬である。これらの試薬の中で好ましいものはＤＴＴである。使用することができる他のものとしては、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトプロパノール（いずれかがエナンチオマーであるか両方共いかなる組合せのエナンチオマーである）、３−メルカプトプロパノール、２，３−ジチオプロパノール及びグルタチオンがある。
【０１０４】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼなどの花虫綱ルシフェラーゼの反応をアッセイするためのキットでは、組成物は例えばｐＨ５の試薬緩衝、約０．５Ｍ ＫＣｌ又はＮａＣｌなどの高濃度塩、セレンテラジン又はセレンテラジンｈｈなどの基質を含み、また他の成分を含んでもよい。
【０１０５】
アッセイキットは、１つ又は複数の基質、例えば第１の反応のための基質及び第２の反応のための基質、例えば発光反応の基質である生成物を生成する酵素の基質を含んでもよい。基質は、合成により調製してもよい。例えば、セレンテラジン又は他のルシフェリンの修飾された形態、「保護された」形態は、本明細書で記載するように本発明のキット及び方法で使用してもよい。保護されたセレンテラジンのような保護されたルシフェリンとしては、もはやルシフェラーゼと相互作用して発光を起こすことはないルシフェリンの修飾形態がある。一実施形態では、この修飾はルシフェリンへのいかなる酵素脱離可能な基の付加であり、この保護されたルシフェリンと適当な酵素との相互作用により発光が可能な活性ルシフェリンが生成する。保護されたルシフェリンを活性ルシフェリンに変換する酵素は、好ましくは非発光性の酵素である。参照によって本明細書に組み込まれている国際出願第０３／０４０１００号に開示されているセレンテラジンの全ては、保護されたセレンテラジンに変換することができる。
【０１０６】
上述の様々な成分は、例えば溶液又は凍結乾燥混合物中で、単一の容器又は複数の容器で様々な組合せ（個々も含む）で組み合わせることができる。酵素、コファクター又は基質が存在してもよい細胞内で酵素媒介発光反応により酵素、基質又はコファクターをアッセイするための好ましいキットには、細胞内に活性型又は活性化することができる形態で存在するかもしれない酵素、基質又はコファクターを（細胞溶解の間に放出される様々な酵素の作用に対して）保存しつつ、細胞を溶解するのに役立つ溶液（又は溶液を調製するための成分）が含まれる。
【０１０７】
当業者は、本明細書で記載されているものなど、及び本明細書で記載されているもの以外の組成物が、いかなるアッセイ反応混合物、したがって本発明のキットに、例えば酵素活性を維持又は強化するために、或いはアッセイ対象のサンプルの一定量を得るために使用される処置の結果として存在してもよいことは周知である。このように、一般には緩衝剤、例えばトリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、トリス、グリシルグリシン、リン酸塩のようなものがｐＨ及びイオン強度を維持するために存在する；酵素活性を高めるタンパク質物質、例えば哺乳類の血清アルブミン（好ましくはウシ血清アルブミン）又はラクトアルブミン又はオバルブミンが存在してもよい；ＥＤＴＡ又はＣＤＴＡ（シクロヘキシレンジアミン四酢酸）のようなものは、アッセイするリポーターが抽出される系（例えば細胞）に存在するかもしれなく、また、リポーター又は他の反応成分に悪影響を与えるかもしれない含金属プロテアーゼ又はホスファターゼの活性を抑えるために存在してもよい。酵素を安定させるグリセリン又はエチレングリコールが存在してもよい。
【０１０８】
例えば、マグネシウムなどのカチオンへの対イオンが存在してもよい。当業者が理解するように、これらの対イオンの化学同一性及び濃度は、マグネシウムイオンを供給するために使用されるマグネシウム塩、使用する緩衝、溶液のｐＨ、ｐＨ調節物質（酸又は塩基）並びにマグネシウム塩、緩衝及びｐＨ調節用酸若しくは塩基以外のソースに由来する溶液中アニオンによって大きく異なる。一実施形態では、マグネシウムイオンは、所望のマグネシウムイオン濃度を提供するために、用いる緩衝（例えばトリシン）を含む溶液に溶かした炭酸塩として供給することができ、次に緩衝溶液のｐＨは硫酸などの強酸の添加によって調節することができ、その結果大部分の炭酸塩（及び重炭酸塩）は二酸化炭素として消失し、またこれらのアニオンは硫酸イオン、重硫酸イオン、トリシンアニオン及び恐らく他の種類のアニオン（アニオンを供給し溶液に存在するかもしれない他の物質（例えばリン酸塩）に依存する）によって置換される。アッセイ法が実施される溶液の空気からの酸素飽和は、ルシフェラーゼ反応で必要な分子状酸素を供給するのに十分である。いずれにせよ、アッセイ反応混合物中のルシフェラーゼの活性に有効な様々な成分、例えばこの方法に関する上の説明で具体的に列挙した成分の濃度を確かめることは、当業者には容易である。
【０１０９】
当業者に周知のように、キットを使用して実施するアッセイの信頼性及び精度を確保するため、またキットのアナライト（例えば酵素、基質、コファクターなど）についてのサンプルの定量分析を可能にするために、本発明の検査キットは様々な対照及び標準、例えば既知の酵素、基質又はコファクター、例えばＡＴＰ、濃度の溶液、例えば酵素なし、基質なし、若しくはコファクターなし（例えば、蛍ルシフェラーゼ陰性対照のためのＡＴＰがない）の溶液を含むこともできる。
【０１１０】
本発明の方法に従ってアッセイすることができるサンプルの種類としては、とりわけ遺伝子リポーターとしての発光リポーター、細胞分子のリポーター又はその分子のモジュレーターとしての発光リポーター、イムノアッセイにおけるリポーター或いは核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイにおけるリポーターを含むサンプルがある。イムノアッセイ及び核酸プローブ技術で理解されているように、本発明に従ってアッセイされる酵素は、それらの技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、イムノアッセイ又は核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイでアナライトを検出する際に使用されるそれぞれ抗体若しくはその断片、又は核酸プローブと物理的、例えば化学的に又は組換えにより結合する。その後、同様に公知の方法に従い、リポーター標識抗体又は核酸プローブは分析するサンプルと合わされて検出対象の、サンプルに存在するかもしれない分子（例えば、イムノアッセイの場合は抗原若しくは抗抗原抗体、又は核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイの場合は標的核酸）と結合し、次にアナライトと結合しなかったリポーター標識抗体又は核酸プローブは、もしあるとすれば結合したものから分離される。リポーターは本発明に従ってリポーターのアッセイの間、物理的に標識抗体又はプローブと結合を維持することができるか、或いは再び公知の方法により、本発明に従ってリポーターのアッセイの前に抗体又は核酸プローブから分離することができる。発光反応の媒介となる酵素をリポーター又は標識として使用することができるイムノアッセイ及び核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイは、生物学、バイオテクノロジー及び医学の分野で多くの実用上の、また研究上の用途、例えば病原体の検出、遺伝子欠損の検出、疾患診断などを有する。
【０１１１】
本発明の方法に従ってリポーターの存在につきアッセイすることができる他の種類のサンプルは、リポーターの発現がプロモーター、又はリポーターをコードするＤＮＡセグメントと結合した他の転写調節因子による転写の活性化に応じて、或いはリポーターをコードしているＲＮＡの翻訳の結果として起こる細胞の抽出物である。そのような細胞において、発光リポーターは、他の酵素、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが転写又は転写の調節などの遺伝的事象をモニターするために用いられる方法と同様に使用される。そのような発光リポーターの使用は分子生物学及び生物医学で有益なものであり、例えば特定のプロモーター又は他の転写調節因子における転写活性化又は転写抑制活性に基づく治療活性について化合物をスクリーニングする際に使用することができる。
【０１１２】
例えば、二重アッセイでは、２つの異なる酵素、例えば蛍ルシフェラーゼ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを含むサンプル、又は異なる酵素媒介発光反応によって検出することができる異なる分子のいかなる組合せ、例えばプロテアーゼとＡＴＰを含むサンプルがアッセイされる。サンプルとしては、非細胞性サンプル、例えば精製酵素を有するサンプル、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応、細胞性（無傷の）サンプル、原核又は真核サンプル、或いは細胞溶解物がある。第１に、前記２つの酵素媒介反応の１つのための活性化（開始）剤をマルチウェルプレートウェルのウェルなどの容器に入ったサンプルに加え、得られた発光を測定する。特定の消光及び活性化試薬を次にウェルに加えて第１の酵素媒介反応を選択的に消光し、同時に第２の酵素媒介反応を活性化する。代わりに、選択的な消光試薬及び第２の酵素媒介発光反応に特異的な第２の光活性化試薬を、サンプルに順番に加えることができる。第２の反応からの発光を次に第１のものと同様にして測定する。任意選択に、サンプルからの発光は次に第２の消光試薬、例えば非選択的消光試薬又は第２の酵素媒介反応のための選択的消光試薬を加えることによって消光してもよい。このように、本発明は単一のサンプル内で２つの異なるパラメータを測定することができる多重発光アッセイを提供する。上記の如く、酵素媒介反応の１つは内部標準の働きをし、他の酵素媒介反応は遺伝マーカー又は他の実験変数として機能することができ、或いは、各々の反応では異なる実験変数を測定することができる。更に、当業者が理解するように、アッセイ法である本発明の方法は、通常適当な対照又は標準を用いて実施され（例えば、分析するサンプルは酵素を含まない溶液及び既知の濃度の酵素を含む溶液と並行して分析される）、適当な標準を使用した場合、この方法は測定用サンプル（即ち、分析サンプル）内の検出対象の分子の濃度を定量するように調整することができる。
【０１１３】
例えば、甲虫（Ｗｏｏｄ、１９９１）及びＲｅｎｉｌｌａ（Ｍａｔｈｅｗｓ他、１９７７）のルシフェラーゼの活性を定量化するために従来使用されているアッセイ化学は不適合であった。本発明はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイと蛍又はコメツキムシルシフェラーゼ反応のそれとを混合した革新的な化学処方を具現化することにより、新規二重ルシフェラーゼリポーターアッセイを作出する。
【０１１４】
水溶液である本発明の組成物、例えば本発明の方法で使用される組成物では、基質は一般的に約０．０１μＭから約２ｍＭの濃度で存在する。蛍ルシフェラーゼでは、ルシフェリンは最大の光アウトプットのために最適化された試薬中では約０．４７ｍＭで、また安定したシグナルのために最適化された試薬中では約１ｍＭで飽和する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼでは、セレンテラジンは最大の光アウトプットのために最適化された試薬中では約２μＭで、また安定したシグナルのために最適化された試薬中では約６０から１００μＭで飽和する。ＡＴＰが存在する組成物中では、ＡＴＰ濃度は約０．０１ｍＭから約５ｍＭまで変動し、好ましくは約０．５ｍＭである。そのような水溶液組成物中にＣｏＡが存在する場合は、ＣｏＡの濃度は約０．００１ｍＭから約５ｍＭまで変動し、好ましくは約０．２ｍＭから１ｍＭである。同様に、存在するＤＴＴの濃度は約２０ｍＭから約２００ｍＭであり、好ましくは約２０から４０ｍＭである。
【０１１５】
連続的なＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及び甲虫ルシフェラーゼアッセイでは、リポーターＮｏ．１、つまりＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介発光反応の１００％制御値は、消光試薬の添加前の反応からの発光を定量化することによって測定される。リポーターＮｏ．２、例えば蛍ルシフェラーゼ媒介発光反応の１００％制御値は、消光試薬及びリポーターＮｏ．１の基質を含まない反応からの発光を定量化することによって測定される。
【０１１６】
表１〜２及び図４は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介反応又はワサビペルオキシダーゼ媒介反応（リポーターＮｏ．１）を定量化し、次に試薬の添加によって消光する状況に適用した本発明を示す。より詳細には、表１は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介反応（リポーターＮｏ．１）が定量化され、次に基質類似体、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテル、隔離剤、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、黄色化合物、例えばベルベリンヘミサルフェート、又はその組合せを含む組成物の添加によって選択的に消光する状況に適用された本発明を示す。それらの同じ試薬は、蛍ルシフェラーゼ（リポーターＮｏ．２、図１〜３を参照）の発光反応に影響を及ぼさない。これらの例は、二重発光リポーターアッセイのユニークな、統合した性質を納得させるものである。両方の発光リポーター酵素の活性は、同じ機器を使用して単一の試験管に入った同じサンプル内から迅速に定量化することができる（表１）。このように、二重アッセイの統合された化学により、個々の発光シグナルを単一のサンプル内で発現した２つの異なる発光リポーター酵素の反応と区別する能力が提供される。
【０１１７】
本明細書で同じく記載されているように、白いルミノメータープレート及び発光酵素を含まない発光反応混合物に存在する１つ又は複数のアナライトはバックグラウンドリン光をもたらす。このリン光を消光するために、その存在下で発光反応によって生じた光が透過し、即ち検出され、しかし、リン光によって生じた光は透過しないように着色化合物が選択される。このように、赤色コメツキムシルシフェラーゼによって生じた赤色光のためには、少なくとも１つの赤色化合物が使用される。緑色コメツキムシルシフェラーゼによって生じた緑色光のためには、少なくとも１つの緑色化合物が、またＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによって生じた青色光のためには少なくとも１つの青色化合物が使用される。前記１つ又は複数の着色化合物は、発光反応を媒介する酵素を有するかそのことが疑われるサンプルの添加の前に反応混合物に加えてもよく、反応混合物へのサンプルの添加の前にサンプルに加えてもよく、又は反応混合物とサンプルを合わせるときに加えてもよい。
【０１１８】
本発明を、以下の非限定的な実施例により更に説明する。
【実施例１】
【０１１９】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの選択的消光
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応を、選択的に消光されるその能力に関して評価した。３つのクラスの化合物、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質類似体、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテル、隔離剤、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９などの界面活性剤、及び／又は黄色い着色化合物、例えばベルベリンヘミサルフェートを試験した。
【０１２０】
物質及び方法
ホタルルシフェラーゼ発光反応に対する、セレンテラジンｈｈメチルエーテルの影響を試験するために、ルシフェラーゼ試薬（２７０μＭの補酵素Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５３０μＭのＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、２０ｍＭのトリシンｐＨ７．８（Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭの炭酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭのＥＴＤＡ（Ｓｉｇｍａ）、２．７ｍＭの硫酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ）、及び３３ｍＭのジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ））を、さまざまな濃度の甲虫ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、シフェラーゼ飽和に必要とされる濃度（９４０μＭ、４７０μＭ、２３５μＭ及び１１７．５μＭ、飽和は約４７０μＭで起こる）より上及び下で調製した。セレンテラジンｈｈメチルエーテル（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＭＳＯに溶かし、０μＭ、２０μＭ、５０μＭ及び１００μＭで、異なるルシフェラーゼ試薬に加えた。ホタルルシフェラーゼからの発光を、２０μｌのホタルルシフェラーゼ（５×１０−１４モル／反応）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１×細胞培養物溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に溶かしたものを、１００μｌのルシフェラーゼ試薬に加えることによって測定した。セレンテラジンｈｈメチルエーテルの不在下で統一した値に、発光を標準化した。
【０１２１】
ホタルルシフェラーゼ発光反応に対する、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９の影響を試験するために、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９（Ｓｉｇｍａ）を試薬に滴定した。２０μｌのホタルルシフェラーゼ（２．５×１０−１４モル／反応）を、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４及び１ｍｇ／ｍｌゼラチンに溶かしたものを、１００μｌの試薬に加えた後に、発光を統一した。界面活性剤なしで統一した値に、発光を標準化した。
【０１２２】
ホタルルシフェラーゼ発光反応に対する、ベルベリンヘミサルフェートの影響を試験するために、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。ベルベリンヘミサルフェートをＤＭＳＯに溶かし、さまざまな濃度の試薬に滴定した。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、約２．２×１０−１５モル／反応に、ホタルルシフェラーゼを希釈した。１００μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬と１００μｌの希釈酵素を組み合わせることによって、発光反応を開始させた。界面活性剤なしで統一した値に、発光を標準化した。
【０１２３】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応に対する、セレンテラジンｈｈメチルエーテル、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９及び／又はベルベリンヘミサルフェートの影響を試験するために、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。ルシフェラーゼアッセイバッファー（ｐｔ．Ｅ１５２、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９、２００μＭのセレンテラジンｈｈメチルエーテル、１ｍＭのベルベリンヘミサルフェート、又はこの３つの組合せと組み合わせた。それぞれのバッファーを、ルシフェラーゼアッセイ基質（ｐｔ．Ｅ１５１、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のバイアルに加えて、ルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）及び消光剤を作製した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（５×１０−１４モル／反応）を、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４７１）及び１ｍｇ／ｍｌゼラチン中で調製した。２０μｌの酵素溶液を１００μｌのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬に加えることによって、発光を開始させ、測定した。１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を後に加えることによって、Ｒｅｎｉｌｌａ発光を停止させ、残りの発光を測定することができた。残りのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光で最初のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光を割った商として、消光の倍数を計算した。
【０１２４】
結果
それぞれの試験した選択的消光試薬は、ホタルルシフェラーゼ発光反応に対して、ほとんど有害な影響が無いことが示された（図１〜図３）。これらの同じ試薬を、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ仲介型発光を停止させるそれらの能力に関して、次いで試験した（表１）。高濃度のセレンテラジンｈｈメチルエーテルに関しては、いくつかの物質、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９（Ｓｉｇｍａ）などの隔離剤を加えることが、溶解度を維持し且つ／或いは増大させるために必要であった。さらに、セレンテラジンｈｈメチルエーテルによる消光は、隔離剤の存在によって増大した。
【０１２５】
黄色い色素を、ホタル反応からの光の生成に影響を与えずに、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応からの青い光を吸収する、それらの傾向に関して調べた。試験した黄色い色素の中で、ジピリダモール（データ示さず）及びベルベリンヘミサルフェートは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応の、選択的消光試薬であることが示された（例えば、表１及び図３を参照）。例えば、１ｍＭにおいてジピリダモールは、約３５倍Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応を停止させることが見出され、１ｍＭにおいてベルベリンヘミサルフェートは、約４６倍〜８９倍反応を停止させることが見出された。
【０１２６】
選択的消光物質が、ホタルルシフェラーゼ発光反応に有害に影響を与えることはなかったが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応に対する、これらの個別の影響又は組合せの影響は劇的であった。
【表１】
【実施例２】
【０１２７】
連続的なルシフェラーゼ測定用の、選択的消光試薬の使用
物質及び方法
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。ルシフェラーゼアッセイバッファー（ｐｔ．Ｅ１５２、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９、２００μＭのセレンテラジンｈｈメチルエーテル、及び１ｍＭのベルベリンヘミサルフェートと組み合わせた。ルシフェラーゼアッセイバッファーを、ルシフェラーゼアッセイ基質（ｐｔ．Ｅ１５１、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に加えて、ルシフェラーゼアッセイ試薬及び消光剤を作製した。アッセイ用の酵素ストックを、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４７１）及び１ｍｇ／ｍｌゼラチン中で調製した（酵素安定化用）。それぞれ約５×１０−１２及び５×１０−１４モル／反応の最終濃度で、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼのストック、並びに前述のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼのストックの５０：５０混合物を調製した。２０μｌのそれぞれの酵素ストックを１００μｌのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬に加え、発光を統一することによって、発光を生成させた。１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を後に加えることによって、Ｒｅｎｉｌｌａ発光を停止させ、ホタル発光を測定することができた。次いでホタルルシフェラーゼ発光又は残りのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光を、それぞれの酵素サンプルに関して測定した。ホタルルシフェラーゼとＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの５０：５０混合物を含む酵素サンプルについての発光値を２倍にして、酵素濃度を標準化した。
【表２】
【０１２８】
結果
表２中のデータから、第二の酵素、ホタルルシフェラーゼが、３つの消光試薬の組合せを使用して、第一の酵素反応、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ反応の後に、確実に測定することができることが示される。したがって、改変型ルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、Ｒｅｎｉｌｌａ発光反応を停止させることによって、Ｒｅｎｉｌｌａ及びホタル酵素を同じサンプルから正確に測定することができる。
【実施例３】
【０１２９】
着色化合物とホースラディシュペルオキシダーゼの発光反応からの光の消光
物質及び方法
ＫＰＯ４、ｐＨ６．５中で調製した、０．０４４ｍｇ／ｍｌホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の２０μｌを、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、２μＭのＨ２Ｏ２＋／−１００μＭのベルベリンヘミサルフェートの１００μｌに加えた。対照反応物は、ベルベリンヘミサルフェートを含んでいなかった。１００μｌの１０ｍＭのＬｕｍｉｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を５５ｍＭのＮａＯＨに溶かしたものを次いで加えて、化学発光反応を開始させ、発光はルミノメーターで測定した。反応開始後のさまざまな時間で、発光を捉えた。
【０１３０】
結果
表１において明らかであるように、ベルベリンヘミサルフェート（黄色い化合物）を使用して、（青い発光を放射する）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼからの、光の発生を停止させることができる。ＨＲＰ仲介型反応も、青い光を発生させることができる。図４は、黄色い化合物を使用して、ＨＲＰ系のレポーター系からの光を停止させることができることを示す。例えば、ベルベリンヘミサルフェートは、５００倍を超えてホースラディシュペルオキシダーゼ依存性の化学発光を停止させた。したがって、多数のレポータータンパク質の一連の発光の測定値は、レポーターの１つがＨＲＰである同じウェルから測定することができる。
【実施例４】
【０１３１】
プレート又はアナライトからのリン光の停止
発光反応用の白色ルミノメータープレートを使用すると、バックグラウンドリン光が生じることが多い。リン光では、原子又は分子によって放射される光が、励起源を除去した後で持続する。リン光は蛍光と類似しているが、種がそこから初期状態に移行することはできない準安定状態へと励起される。熱エネルギーにより電子がそこから下方遷移することができる状態になると、放射が起こり、目に見えるバンドにおいて経時的なそのエネルギーの段階的放出がもたらされる。したがって、リン光は温度依存性である。このリン光を停止させ、そうすることによりシグナル／バックグラウンド比を増大させるために、特定のルシフェラーゼによって生成する光が効果的に伝播するが、リン光からの光は伝播しないように、着色化合物を選択した。
【０１３２】
物質及び方法
アマランス及びベンゾプルプリン４Ｂは赤い化合物であり、赤いコメツキムシのルシフェラーゼは赤い光を放射する。蛍光増白剤２８は黄色い化合物であり、ホタルルシフェラーゼは黄緑色の光を放射する。
【０１３３】
アマランス（Ａｌｄｒｉｃｈ、１２０５６１）、ベンゾプルプリン４Ｂ（Ａｌｄｒｉｃｈ番号２２８８２）、及び蛍光増白剤２８（Ａｌｄｒｉｃｈ４７５３００）のストックを、１００μＭでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中において調製した。ルミノメータープレート（９６ウェル）は、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した１種のルミノメーターチューブ（直径１２ｍｍ）に適合するように、ルミノメータープレートを粉々にした。正常な蛍光下において研究室内で、すべての実験を行った。
【０１３４】
この実験は、着色化合物又はＤＭＳＯを加える前後に、シグナル／バックグラウンド比を測定した。発光の測定値を、それぞれの実験で空の発光チューブから得て、バックグラウンド比を定量化した。白色ルミノメータープレートの破片、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の指示書に従い調製した１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）試薬、及び１００μｌのＧｌｏ溶解バッファー（Ｐｒｏｒｎｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を発光チューブ中に置き、発光を再度測定した。この測定によって、市販のホタルルシフェラーゼ試薬中において、ルミノメータープレートから放射されたリン光を捉えた。２μｌのＤＭＳＯ、又はＤＭＳＯ中の色素の１つを次いでチューブに加え、サンプルを混合し、発光を３回測定した。この測定は、現時点で着色されていた試薬又はＤＭＳＯ担体を含む試薬によって、放射された発光の量を捉えた。最後に、２μｌのルシフェラーゼをチューブに加え、サンプルを混合し、発光を最後に測定した。すべての発光測定値は、２秒の遅延後の１０秒間の統一値であった。
【０１３５】
ホタルルシフェラーゼは、１ｍｇ／ｍｌのブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むＧｌｏ溶解バッファー中に１．４×１０−５ｍｇ／ｍｌの濃度の、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）ルシフェラーゼであった。赤いコメツキムシのルシフェラーゼは、Ｇｌｏ溶解バッファーを用いて作製した細胞溶解物から、赤いコメツキムシのルシフェラーゼで一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から得た。このサンプル中の絶対的なルシフェラーゼ濃度は知られていないが、シグナル／バックグラウンドの改善は、バックグラウンドを超える発光を発生する任意の量のルシフェラーゼで評価することができる。
【０１３６】
ルシフェラーゼサンプルからのバックグラウンドを引いた発光を、試薬＋プレート破片サンプルのバックグラウンドを引いた発光で割って、リン光のシグナル／バックグラウンド比を計算した。ルシフェラーゼサンプルからのバックグラウンドを引いた発光を、ＤＭＳＯ−又は色素を加えたサンプルのバックグラウンドを引いた発光で割って、ＤＭＳＯ又は色素サンプルのシグナル／バックグラウンド比を計算した。したがってシグナル／バックグラウンドの改善値は、リン光の比で割ったＤＭＳＯ又は色素の存在下での比であり、次いで１を引き、パーセントとして表す。
【表３】
【０１３７】
結果
表３中に示すように、赤いコメツキムシのルシフェラーゼ仲介反応の赤い化合物、及びホタルルシフェラーゼ仲介反応の黄色い化合物などの、着色化合物は、それぞれの反応に加えると、シグナル／バックグラウンド比を改善した。
【０１３８】
表３中の負の数は、色素を含むサンプルが、チューブ単独で測定したバックグラウンドより、低い発光を有することを示す。したがって、シグナル／バックグラウンドの改善は、これらのサンプルに関しては計算することができない。何故なら、その値は無限だからである。
【０１３９】
したがって着色化合物は、均質な系中では、発光を測定する前に、細胞に加える試薬中に存在する可能性がある。不均質な系に関しては、着色化合物は、細胞に加える溶解試薬中に存在する可能性があり、その後反応用の試薬を加え、次いで発光を測定する。或いは、溶解試薬を細胞に加えることができ、その後、着色化合物を含む反応用の試薬を加え、次いで発光を測定する。
【０１４０】
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【０１４１】
すべての刊行物、特許及び特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。前述の本明細書中において、そのいくつかの好ましい実施形態に関して本発明を説明し、多くの詳細を例示の目的で述べてきたが、本発明には他の実施形態が可能であり、本発明の基本原則から逸脱せずに、本明細書に記載した詳細のいくつかを相当に変えることができることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】蛍ルシフェラーゼ発光がＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質類似体、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテルに影響を受けないことを示す図である。
【図２】蛍ルシフェラーゼ発光が本発明の隔離剤の存在下で増加することを示す図である。
【図３】蛍ルシフェラーゼ発光が黄色化合物、例えばベルベリンヘミサルフェートに影響を受けないことを示す図である。
【図４】黄色化合物、色素ベルベリンヘミサルフェートがワサビペルオキシダーゼの化学発光を消失させることを示す図である。
【図５Ａ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｂ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｃ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｄ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｅ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｆ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００３年２月１２日に出願の米国特許出願第６０／４４７０６５号の出願日の権益を主張し、その開示内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、酵素媒介一重及び二重光学リポーターアッセイ、並びに１つ又は複数の光学反応を消失させる試薬に関する。例えば、本発明は少なくとも１つの酵素を利用する発光アッセイ及び１つ又は複数の消光試薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
発光は、ある種の生物ではルシフェラーゼ媒介酸化反応の結果として起こる。多種多様な非常に異なる生物種からのルシフェラーゼ遺伝子、特にＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（北アメリカに多い蛍）、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ（ジャマイカのコメツキムシ）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）及びいくつかの細菌、例えばキセノラブドゥスルミネセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種のルシフェラーゼ遺伝子は、極めて有名な発光リポーター遺伝子である。蛍ルシフェラーゼはまたＡＴＰ濃度の一般的なリポーターであり、その役割で、バイオマスを検出するために広く使われている。発光はまた、他の酵素とある種の合成基質、例えばアルカリホスファターゼとアダマンチルジオキセタン、又はワサビペルオキシダーゼとルミノールとが混合されたときにも起こる。
【０００４】
ルシフェラーゼ遺伝子は、非放射性で、感度が高く、極めて広い直線的な発光アッセイ範囲を有するため、遺伝子リポーターとして広く使われている。例えば、わずか１０−２０モルの蛍ルシフェラーゼを検出することができる。その結果、遺伝子活性のルシフェラーゼアッセイは、原核及び真核の細胞培養、トランスジェニック動植物及び無細胞発現系を含む実質的にあらゆる実験生物系で使われる。同様に、ＡＴＰのルシフェラーゼアッセイは感度が高く、１０−１６モル以下の検出が可能である。
【０００５】
ルシフェラーゼはルシフェリンと呼ばれている酵素特異的基質の酸化を介して光を発生する。蛍ルシフェラーゼ及び他の全ての甲虫ルシフェラーゼでは、発光はマグネシウムイオン、酸素及びＡＴＰの存在下で起こる。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを含む花虫綱のルシフェラーゼでは、ルシフェリンと共に酸素のみが必要である。通常、遺伝的活性の発光アッセイにおいては、反応基質及び他の発光活性化剤が、リポーター酵素の発現が疑われる生物系に導入される。その結果、もし発光が生じれば、その発光はルミノメーター又は任意の適当な放射エネルギー測定器を使って測定される。このアッセイは非常に迅速で感度が高く、迅速且つ容易に遺伝子発現データを提供し、放射性試薬を必要としない。遺伝的活性以外のためのリポーターアッセイは、同様に実施される。
【０００６】
蛍ルシフェラーゼを使う従来の遺伝活性アッセイは、アッセイ用試薬にコエンザイムＡ（ＣｏＡ）を含ませて酵素ターンオーバーを大きくし、それにより発光強度を高めることにより更に改善されている（米国特許第５２８３１７９号）。この試薬を使うと、ルシフェラーゼ活性はルミノメーター又はシンチレーションカウンターで容易に測定することができる。コエンザイムＡを追加して持続発光を起こすように改変されたルシフェラーゼ反応は、遺伝子組み換え細胞又は組織におけるルシフェラーゼ発現を定量化するための極めて感度が高く迅速なアッセイを提供する。
【０００７】
１つの発光サンプルからの屈折光は、透明マルチウェルの連続したウェル中の発光サンプルからのシグナルを後に測定するときに妨害となるかもしれない。更に、単一の透明なプラスティックプレート内の複数の発光サンプルから発散している屈折光の蓄積特性の点で、第１のサンプルウェルの発光シグナルは正確に測定することができるが、後続のウェルにおける発光反応の連続的活性化は、前の全てのサンプルからプラスチックを通過してくる屈折光子の蓄積的発光のために、だんだん不正確な測定をもたらす。この屈折光又は「屈折性クロストーク」の問題は、明るく発光するウェルが発光のない陰性対照ウェルに隣接する場合、或いは、明るく照らされたウェルが比較的薄暗いウェルの近くにあるときには更に悪化する。このことは、透明なマルチウェルプレートでの絶対値及びベースライン発光の測定を非常に困難にする。
【０００８】
白いプラスチック製の不透明なプレートは透明なプレートよりも高い発光感度を生じさせることができるが、光子は隣接ウェルから容易に拡散し、同じくウェル間のクロストーク干渉をもたらす。ここでのクロストークは「反射クロストーク」と称される。更に、当初蛍光用を目的とした黒色９６穴プレートは、そのプラスチックの非反射特性のためにサンプルからの信号が非常に減殺されるので発光用には理想的でない。更に、不透明なプレートはそれを通して培養細胞を観察又は撮影することができず、またこのようなプレートは細胞の接着及び増殖特性に未知の影響を及ぼすので、培養細胞には不向きである。
【０００９】
ルシフェラーゼは、蛍ルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）並びに様々なホスファターゼ、例えば分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）及びウテロフェリン（Ｕｆ；酸性ホスファターゼ）などのいくつかのリポーターの１つであり、これらは、組み合わせられ、遺伝活性のコリポーターとして使われる。二重酵素リポーター系は、１つの系における個々の２つのリポーター酵素の同時使用、発現及び測定に関するものである。遺伝子リポーティングにおいては、二重リポーターアッセイは特に２つの異なるリポーター遺伝子を同時に発現するように遺伝子操作された個々の細胞又は細胞集団（例えば、培養内に分散した細胞、分離した組織又は動物全体）でのアッセイに役立つ。ほとんどの場合、１つの遺伝子の活性は特異的な実験条件の影響を報告するが、第２のリポーター遺伝子の活性は全てのセットの実験値が正規化されるような内部標準を提供する。二重酵素リポーター技術は、実験用及び対照リポーター酵素をコードしている独立した遺伝材料の無細胞再構成系、例えば同時翻訳又は共役転写及び翻訳のために導入された細胞溶解物でも使用することができる。イムノアッセイは、同様に単一のサンプルからの実験値と対照値の両方の二重リポーティングのために設計することもできる。
【００１０】
いかなる二重酵素リポーターアッセイのパフォーマンスも、構成酵素の化学的特性及び得られたそれぞれのデータセットを相関させる能力によって制限される。様々なリポーター酵素の酵素反応速度論、アッセイ化学及びインキュベーション要件は異なるので、２つのリポーター酵素を、単一の試験管又はウェルで統合した二重リポーターアッセイ形式で組み合わせることを困難にする。二重リポーターアッセイの統合のための１つの方法が米国特許第５７４４３２０号に記載されており、そこでは甲虫若しくはＲｅｎｉｌｌａのルシフェラーゼアッセイのための詳細な一般的若しくは特異的な消光剤が開示され、また蛍ルシフェラーゼ、次いでＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼからの発光を連続して測定するための好的な二重リポーターアッセイが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、酵素媒介発光反応又は一連の酵素媒介発光反応をアッセイする方法で用いる更なる発光消失剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、第一の発光リポーターによって発生した光を消失（ｑｕｅｎｃｈ）（減少、抑制、又は除去）させて、その後に第２の発光リポーターシグナルを測定できるようにする組成物及び方法を対象とする。そのような方法は、発光反応の特性や反応が測定される順番に関係なく、発光反応の様々な組合せを非常に柔軟に多重化することを可能にする。従って、本発明は、第１の酵素媒介発光反応を迅速且つ効率的に（例えば選択的に）消失させる１つ又は複数の試薬を用いる、発光アッセイのための組成物及び方法を含む。本発明の方法及び組成物で用いられる好ましい選択的消光試薬としては、それらに限定されないが、第１の酵素の基質類似阻害剤、例えば、その酵素の本来の基質（即ち、その酵素の天然基質）と構造的に類似してその酵素を阻害するもの、及び／又は酵素の活性部位をめぐって発光基質と競合するもの（競合阻害剤）；隔離剤、例えば、第１の酵素の基質を第１の酵素から物理的に分離する物質（このような物質は例えば、第１の基質若しくは第１の酵素をミセルに入れて物理的に分離するか、又は第１の基質若しくは第１の酵素の溶解性を変化させることにより発光をもたらす第１の基質と第１の酵素間の相互作用を抑制するが、第２の異なる酵素とその対応する基質との間の反応を実質上変化させない）；全ての酵素媒介反応ではないが少なくとも１つの酵素媒介発光反応によって発される光の色を消す着色化合物（実質的に１つの酵素媒介発光反応を消失させるが全ての酵素媒介発光反応を同程度に消失させない他の適当な有機化合物を含む）、或いはこれらの任意の組合せが含まれる。かくしてそのような試薬は、有効量では少なくとも１つの酵素媒介発光反応を消失させ、その一方で、少なくとも１つの他の異なった酵素媒介発光反応からの光の効率的な生成及び記録を可能にする点で選択的である。一の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応のための選択的消光試薬は、甲虫ルシフェラーゼ媒介反応からの発光を選択的に消失させる試薬ではない。好ましくは、第１の酵素媒介発光反応のための１つ又は複数の選択的消光試薬は、花虫類ルシフェラーゼ媒介反応からの発光を選択的に消失させる試薬である。
【００１３】
光の「実質的」消失とは、基準、例えば第１の酵素媒介発光反応の、消失と同等以上の消失である。例えば、選択的消光試薬は第１の酵素媒介発光反応を実質的に３５倍消失させるが、第２の異なる酵素媒介発光反応を消失しないか又は３５倍未満で消失させる場合、この試薬は第２の反応と比較して第１の反応に対して選択的な消光試薬である。対照的に、ある消光試薬が第１の酵素媒介発光反応を３５倍消失させ、第２の異なった酵素媒介発光反応を３５倍以上消失させるならば、この試薬は第２の反応と比較して第１の反応に対して選択的な消光試薬ではない。
【００１４】
選択的な消光試薬は、異なる発光反応と比較してある発光反応からの発光を少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更により好ましくは少なくとも１００倍以上、例えば２００倍、３００倍、４００倍又は９００倍消失させる。
【００１５】
発光リポーターは、発光反応を媒介することにより化学系又は生化学系の状態についての情報をもたらす分子である。その例としては、遺伝子リポーター（Ｗｏｏｄ、１９９５）、イムノアッセイリポーター（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ他、１９９１）、ＡＴＰリポーター（Ｓｃｈｒａｍ、１９９１）、並びに他の細胞分子のリポーター、例えば酵素又はコファクターがある。酵素は化学変換を触媒するタンパク質であり、したがってその化学変換による変更を受けない。酵素は化学変換の最後に再生するので、他の化学変換の過程で繰り返し利用できる。酵素はこのように基質ターンオーバーの能力を有する。この性質により、酵素媒介発光反応で連続発光が可能になる。酵素媒介発光反応は、その反応の結果として光子を発生する酵素によって媒介される化学反応である。酵素媒介発光反応の酵素は、その反応で発生した発光の大部分がその酵素の作用の結果として生じる場合はその反応を効率的に実施可能にする。
【００１６】
本発明は、光子の存在が一過性であるので、理想的に発光反応に適している。したがって、光子を発生する酵素反応の消失により、直ちにサンプル中に存在する生成光子が減少する。このように一旦発光計測がされて酵素反応が消失すると、サンプル中には生成光子の蓄積が起こらない。本質的に、サンプル中に実験対象又は対照のシグナル（即ち光子）を蓄積させることなく、発光反応を「停止」することができる。安定した化学生成物の蓄積を測定したり、蓄積した化学生成物の遅い崩壊を測定する類似の酵素反応では、同じことが言えるとは限らない。これらの反応では、化学生成物をもたらす酵素反応を消失させてもまだサンプル中に大量の化学生成物が蓄積するので、同時に又は連続して行われる他のサンプルアッセイに干渉するおそれがある。
【００１７】
発光反応の媒介となる酵素の例としては、それらには限定されないが、全て甲虫ルシフェリンのＡＴＰ媒介酸化を触媒する甲虫ルシフェラーゼ；全てコエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）の酸化を触媒する花虫綱のルシフェラーゼ（Ｗａｒｄ、１９８５）；ルミノールに関わる反応を触媒するワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ（Ｔｈｏｒｐ他、１９８６）；及び、アダマンチル１，２−ジオキセタンリン酸塩との反応を触媒するアルカリホスファターゼなどのホスファターゼ（Ｓｃｈａａｐ他、１９８９）並びにジオキセタン基質、例えば、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリロキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン、二ナトリウム塩、又は二ナトリウム３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロル）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル］フェニルホスフェート、又は二ナトリウム２−クロル−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）−トリシクロ｛３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル｝−１−フェニルホスフェート、二ナトリウム２−クロル−５−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）−１−フェニルホスフェート（それぞれＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）及びＡＤＰ−Ｓｔａｒ（商標））、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）フェニル−ｌ，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）トリシクロ［３．３．１．１３，７］−デカン］−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ（登録商標））、５−クロル−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−４−イル−フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ（登録商標）、２−クロル−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’（５’−クロル）−トリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ（登録商標）、及び、ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロル）−トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロナート（Ｇｌｕｃｕｒｏｎ（商標））との反応を触媒する他の酵素；或いはそのような酵素の機能上の同等物がある。特定された酵素の機能上の同等物としては、対応する非組換えの野生型酵素と同じ発光反応を触媒する能力を維持する組換え酵素があり、これらは同じ酵素グループに含まれるが、対応する野生型酵素と比較して変化した構造を有する。ある酵素の機能同等物の例としては、ある酵素が他のペプチド又はタンパク質と遺伝的に融合して二機能性ハイブリッドタンパク質を生じる例がある（Ｋｏｂａｔａｋｅ他、１９９３）。
【００１８】
ルシフェラーゼは様々な発光生物から単離又は取得することができ、例えばＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの蛍ルシフェラーゼ又はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼがある。本明細書で使う「ルシフェラーゼ」とは、任意の天然、合成又は遺伝子組換えの供給源に由来するいかなる種類のルシフェラーゼをも意味し、このような例としては、それらには限定されないが、蛍Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓから単離されたルシフェラーゼ又は他の甲虫ルシフェラーゼ（例えば、コメツキムシ（例えばＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）若しくはツチボタル類（Ｐｈｅｏｇｏｄｉｄａｅ種）から得られたルシフェラーゼ）、ウミシイタケＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｖａｒｇｕｌａ種、例えばＶ．ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ、Ｇａｕｓｓｉａ種、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ種、ツタノハガイＬａｔｉａ ｎｅｒｉｔｏｉｄｅｓ由来のもの、キセノラブドゥスルミネセンス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）及びビブリオフィッシャリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｈｅｒｉｉ）などの微生物から単離された細菌性のルシフェラーゼ；並びに、その機能上の同等物がある。
【００１９】
一の実施形態では、本発明は酵素媒介発光反応を消失させる１つ又は複数の試薬を使用する発光アッセイに関する。一の実施形態では、前記１つ又は複数の消光試薬は、前記試薬がない場合の発光と比較して発光を少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更により好ましくは少なくとも１００倍以上、例えば２００倍、３００倍、４００倍又は９００倍消失させるのに有効な量で添加される。好ましくは、消光試薬は本明細書で記載されているような選択的な消光試薬である。
【００２０】
例えば、本発明は酵素媒介発光反応をアッセイする方法を含む。この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定し、前記発光反応に少なくとも１つの選択的な消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させることを含む。他の実施形態においては、この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定し、前記発光反応に少なくとも２つの選択的な消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させることを含む。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は第２の異なる連続する酵素媒介発光反応から発生する光を実質的に消失させずに、第１の酵素媒介発光反応を選択的に消失させる１つ又は複数の試薬を使用する発光アッセイに関する。一の実施形態では、前記第２の異なる酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの試薬が、前記第１の酵素媒介発光反応に存在する。
【００２２】
本発明の一実施形態では、酵素媒介発光反応は、先ず適当な反応開始剤又は試薬をサンプルに添加して反応混合物を生成することから開始する。前記反応混合物中で発生した発光シグナルは、次に、例えばサンプル中の１つ又は複数の分子の存在又は量を検出するために測定される。１つ又は複数の選択的な消光試薬を次に加えて、前記選択的な消光試薬の導入後の比較的短い時間内で前記発光シグナルを消失させる。一の実施形態では、前記１つ又は複数の選択的消光試薬は、前記試薬がない場合の発光と比較して発光を少なくとも１５倍、好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも３５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更により好ましくは少なくとも１００倍以上、例えば２００倍、３００倍、４００倍又は９００倍消失させるのに有効な量で添加される。サンプル中の酵素からの発光シグナルを消失させることから、選択的な消光試薬を添加するとその前に活性化されたサンプルからの光がその後に活性化されたサンプルの、例えば複数サンプルアッセイ形式での光の測定に干渉するのが防止される。発生した第２の発光シグナルを次に測定する。好ましくは、２つ以上の分子の存在又は量を単一反応で検出する。例えば全ての反応は単一の容器、例えばウェルで行われる。
【００２３】
本発明の方法で使用されるサンプルは、細胞溶解物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応生成物、細胞培養の上清、生理学的液体サンプル、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、涙又は尿サンプルであっても、無傷細胞を含んでもよい。細胞、細胞溶解物又は上清は、原核細胞又は真核細胞から得ることができ、また生理学的液体はいかなる鳥類、爬虫類、両生類又は哺乳類から得ることができる。反応開始剤又は試薬は、このように無傷細胞、細胞溶解物又は上清若しくは生理学的液体に加えることができる。消光試薬も、無傷細胞若しくは細胞溶解物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応生成物又は生理学的液体サンプル若しくは上清サンプルに加えることができる。
【００２４】
従って、本発明は、別の異なる酵素媒介発光反応を消失させずに、ある酵素媒介発光反応、例えばルシフェラーゼ媒介発光反応又は非ルシフェラーゼ媒介発光反応を選択的に消失させる１つ又は複数の試薬を使用する二重リポーター発光アッセイを含む。即ち、２つの異なる酵素は各種試薬に対し異なる反応を示し、それによって、酵素媒介発光反応の１つを選択的に消失させる。一の実施形態では両方の反応はルシフェラーゼ媒介反応であり、例えば、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介発光反応であり、この反応は、選択的に消失させられると同時に、第２の異なるルシフェラーゼ媒介発光反応、例えば蛍ルシフェラーゼ媒介発光反応が、この第２の反応からの蛍光を実質的に消失することなく進行できるようにする。例えば、花虫綱のルシフェラーゼに選択的で、サンプル中に存在する他のリポーター又はそこで起こる反応に対して影響しない試薬を使って、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを選択的に消失させることができる。花虫綱ルシフェラーゼ媒介発光反応を選択的に消失させる試薬の例としては、それらには限定されないが、構造的にセレンテラジンに類縁の基質類似体阻害剤、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、例えば、ミセル内に花虫綱ルシフェラーゼ基質を隔離するが花虫綱ルシフェラーゼ酵素は隔離しない界面活性剤、第１の反応から発する色を選択的に消失させる着色化合物（例えば青色光では選択的な消失試薬は黄色の着色化合物である）又はそのような試薬の組合せなどがある。
【００２５】
第１の反応のための消光試薬及び第２の反応のための活性化試薬は、同時に又は順番に加えることができる。消光試薬が第２の酵素媒介発光反応の同時開始を可能にするように製剤化される場合は、このような試薬は“消光及び活性化”試薬と称される。それ故に、消光及び活性化試薬は同時に第１の酵素反応を消失させて第２の酵素反応を開始するので、そのようなアッセイは１つのサンプルにおいて２つの別個の異なる発光リポーターの連続測定を可能にする。その結果、発光リポーターの１つは内部標準として使うことができ、他は実験変数（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｒｉａｂｌｅｓ）の影響を報告するのに用いられる。或いは、各リポーターはサンプル中の２つの異なる変数、例えば特定のプロテアーゼ及びＡＴＰの濃度の存在を報告することができる。この方法は、大いに多重化を促進し、標準のマルチウェルプレート及び装置を使って、迅速で、自動化可能で、正確な再現性のある結果を提供する。
【００２６】
例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼの発光化学物質を、異なる発光酵素と共に二重リポーター発光アッセイで利用することができる。一の実施形態では、２つの発光酵素の１つは内部標準として働き、他は酵素媒介反応の遺伝子活性、又は酵素、基質若しくはコファクターの存在若しくは量の実験マーカーとして機能する。更に、本発明は特に従来の透明又は不透明なマルチウェルプレートを用いた、酵素媒介発光リポーター系に基づく高スループットの自動化アッセイに役立つ。
【００２７】
一実施形態では、本発明は酵素媒介発光反応をアッセイする方法を含む。この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定し、前記発光反応に少なくとも１つの消光試薬を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させ、且つ／又は前記第１の酵素媒介発光反応を消失させることを含む。一の実施形態では、前記消光試薬は花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、着色化合物、隔離剤又はその組合せである。例えば、一の実施形態では、花虫綱ルシフェラーゼ媒介発光反応をプロテアーゼなどの分子の存在又は量を検出するために使用することができ、この反応は、例えばＡＴＰ濃度を検出する、甲虫ルシフェラーゼ媒介発光反応の開始前に消失される。したがって、本発明は１つ若しくは複数の酵素、１つ若しくは複数の基質及び／又は１つ若しくは複数のコファクター、或いはそのいかなる組合せのための酵素媒介アッセイの多重化を可能にする。
【００２８】
本発明は、このようにサンプル内の少なくとも１つの分子の活性又は存在を測定するための方法を提供する。この方法は、酵素媒介反応のための少なくとも１つの分子を含み得るサンプル（このサンプルは例えば、前記の酵素を含んでもよい）を用意し、前記サンプルと前記分子を欠く前記酵素媒介反応のための反応混合物（この反応混合物は例えば検出する前記酵素の基質を含む）とを接触させることを含み、前記分子の存在又は量を酵素媒介発光反応によって検出することができる。一の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応の後に又はそれと並行して、反応混合物を第２の酵素媒介発光反応によって検出することができる分子を検出するための試薬と接触させる。
【００２９】
本発明の方法は、サンプル内の複数の酵素、基質又はコファクターの検出を可能にし、サンプルとしては例えば真核細胞（例えば酵母、鳥類、植物、昆虫又は哺乳類細胞があり、哺乳類細胞としては、それらには限定されないが、ヒト、サル、ネズミ、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、羊、ヤギ又はブタの細胞が含まれる）或いは原核細胞、或いは２つ以上の異なる生物からの細胞、或いは細胞溶解物又はその上清などがある。このような細胞は、組換え手法によって遺伝子組換えされたものでなくてもよく（非遺伝子組換細胞）、或いは一時的に組換えＤＮＡでトランスフェクションされ、且つ／又はそのゲノムが組換えＤＮＡで安定的に増強されているか、若しくはそのゲノムが修飾されて遺伝子が破壊されている、（例えばプロモーター、イントロン若しくは読取り枠が破壊されている）か１つのＤＮＡ断片が他のものと置換されている組換え細胞であってもよい。組換えＤＮＡ又は置換ＤＮＡ断片は、本発明の方法によって検出される分子、検出する分子の濃度若しくは活性を変化させる成分、及び／又は前記分子や成分に無関係な前記分子の濃度若しくは活性を変化させる遺伝子産物をコードするものであってよい。
【００３０】
一の実施形態では、本発明は１アリコートの細胞又はその溶解物中の複数の酵素の存在又は量を測定する方法に関する。細胞の異なる位置に存在する酵素、例えば分泌酵素及び細胞内酵素では、１つの酵素の基質を無傷細胞と共にウェルに加えることができる。このように、一の実施形態では、例えば細胞内酵素の検出を分泌酵素と同じ容器、例えば同じウェル内で行う場合、分泌酵素の存在又は量を酵素媒介発光反応用試薬及び前記分泌酵素の基質（この基質は切断されると前記発光反応用の基質を生じる）を無傷細胞と接触させることによって検出し、次に選択的な消光試薬を細胞溶解と並行して、又はその前後に加え、次に、細胞内酵素の存在又は量を検出する。第１の酵素の検出は細胞溶解の前でも後でもよいが、消光の前にする。このように、本方法は酵素媒介反応のいかなる分子、例えばいかなる酵素、基質又はコファクター或いはそのいかなるセットでも検出するために使用することができる。これらの方法で使用される酵素は、検出するための酵素であっても基質又はコファクターの検出に有用な酵素であってもよく、それらは、組換え及び内因性（天然）の酵素を含む酵素の任意の組合せから選択することができる。
【００３１】
本発明は、酵素媒介発光反応を利用してサンプルを分析するための消光試薬、組成物及びアッセイキットも含む。例えば、本発明はアッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；少なくとも１つの選択的な消光試薬を含み、この選択的な消光試薬の少なくとも１つが前記酵素の基質類似体阻害剤、着色化合物、隔離剤又は他の有機化合物を含む組成物；前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器；並びに取扱説明書を含む酵素媒介発光反応アッセイキットを含む。機能的酵素基質は生物から得ることも（「天然」基質）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することもできる（「合成」基質）。他の実施形態では、酵素媒介発光反応アッセイキットはアッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；花虫綱のルシフェラーゼに対する少なくとも１つの選択的な消光試薬を含む組成物；前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器；及び取扱説明書を含む。キットには対照試薬、例えば機能的酵素が含まれてもよい。
【００３２】
他の実施形態では、本発明はアッセイする第１の酵素媒介発光反応に対応する第１の機能的酵素基質；前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；花虫綱のルシフェラーゼに対する少なくとも１つの選択的な消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質を含む消光及び活性化組成物；前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器；並びに取扱説明書を含む二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキットを含む。他の実施形態では、前記二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキットは、アッセイする第１の酵素媒介発光反応と対応する第１の機能的酵素基質；前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；少なくとも２つの選択的な消光試薬と第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質とを含む消光及び活性化組成物；前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器；並びに取扱説明書を含む。
【００３３】
また、酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制する方法も提供される。本明細書で使用されるとき、「アナライト」はリン光を生じる発光反応混合物内に存在する物質である。「非アナライト」の例は、例えば容器又は入れ物（例えば白いルミノメータープレートの発光反応混合物に存在せず、アナライトがない場合にリン光を生じる物質である。「リン光」は、それに向けられた高エネルギー電子を吸収したリン光体からの、可視帯エネルギーの長時間に渡る段階的な放出である。対照的に、蛍光は異なる周波数の高エネルギー電子を吸収した粒子からの、１周波数のエネルギーの放射である。この方法は発光反応を媒介する酵素を含むサンプルを前記酵素の反応混合物と接触させることを含み、前記混合物は着色化合物を含むが前記発光反応のための酵素を含まない。前記化合物の色は発光反応によって発生する光と実質的に同じであり、即ち約７５ｎｍ以内、好ましくは約５０ｎｍ以内、より好ましくは２５ｎｍ、１０ｎｍ又はそれ以下、例えば５ｎｍ以内である。その後、発光を検出するか測定する。また、酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制するのに役立つ化合物を特定する方法も提供される。この方法は、１つ又は複数の化合物を発光反応を媒介する酵素を含む反応混合物と接触させ、酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制する化合物を特定することを含む。
【００３４】
一の実施形態では、本発明はアッセイする酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器；少なくとも１つの着色化合物；前記少なくとも１つの着色化合物がその中に入っている適当な第２の容器；及び取扱説明書を含み、前記少なくとも１つの化合物の色は前記酵素媒介発光反応によって発生する光と実質的に同じである酵素媒介発光反応アッセイキットを含む。一の実施形態では、アナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減らすか抑制する酵素媒介発光反応アッセイキットが提供される。このキットは、少なくとも１つの着色化合物；前記少なくとも１つの着色化合物のための適当な第１の容器；アッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質；前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第２の容器；及び取扱説明書を含む。他の実施形態では、このキットは少なくとも１つの着色化合物及びアッセイする酵素媒介発光反応に対応する少なくとも１つの機能的酵素基質、前記着色化合物のための適当な容器、少なくとも１つの機能的酵素基質並びに使用説明書を含む。キット内の化合物の色は、発光反応の酵素によって発生する光と実質的に同じである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は酵素媒介発光反応をアッセイする方法を含む。一の実施形態では、この方法は、少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応を開始し、前記発光反応によって発生した発光エネルギーを定量し、前記発光反応に少なくとも１つの消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させることを含む。好ましくは、前記消光試薬は選択的な消光試薬である。即ち、前記消光試薬は全ての発光反応を消失させる訳ではなく、それで第２の連続する酵素媒介発光反応を行うことができる。このように、本発明は第１の酵素媒介発光反応を消失するのみならず、選択的に消失させるのに役立つ組成物及び方法を提供する。
【００３６】
本発明は、第１の酵素媒介発光反応が開始されて前記第１の反応の発光エネルギーが検出又は測定される、酵素媒介発光反応の二重リポーターアッセイ方法も含む。この方法では、次に、少なくとも１つの選択的消光試薬、即ち、全てではないが少なくとも１つの発光反応を消失させる消光試薬を含む組成物を導入し、次いで第２の酵素媒介発光反応を活性化するか開始することができる混合物を含む組成物が導入されるか、又は第１の酵素媒介発光反応を選択的に消失させ、同時に第１の酵素媒介発光反応とは異なる第２の酵素媒介発光反応を開始することができる消光及び活性化組成物が導入される。第２の酵素媒介発光反応によって発生する発光エネルギーを次に検出又は測定する。任意選択に、第２の酵素媒介発光反応はその後第２の消光試薬の添加により消失させることができ、この第２の消光試薬は第２の酵素媒介発光反応に選択的で、好ましくは第３の酵素媒介発光反応を消失又は実質的に消失させない。
【００３７】
選択的消光試薬は、自動注入器及び従来の９６穴プレートなどのマイクロタイタープレート（不透明及び透明）での使用に理想的である。選択的消光試薬はサンプル内からの発光シグナルを効果的に消失させるので、透明なマルチウェルプレート内でもサンプル間の屈折光クロストークなしで複数の発光アッセイを実施することができる。更に、選択的消光試薬は、許容レベルを超えたバックグラウンド反射光を消去する。
【００３８】
好ましい一の実施形態では、酵素媒介発光反応の少なくとも１つは、ルシフェラーゼ媒介反応である。ルシフェラーゼの中では、本発明の方法は特にＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼなどの花虫綱ルシフェラーゼ、並びに甲虫ルシフェラーゼ、例えばＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ及びＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓルシフェラーゼによって媒介される発光反応のアッセイに使用することができる。例えば、第１の酵素媒介発光反応は、花虫綱ルシフェラーゼ媒介反応でよい。他の実施形態において、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応は、甲虫ルシフェラーゼ、例えば蛍ルシフェラーゼによって媒介されない。一の実施形態では、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによって媒介され、第２の酵素媒介反応は異なる酵素、例えば甲虫ルシフェラーゼ、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼによって媒介される。他の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応は、ペルオキシダーゼやホスファターゼなどのルシフェラーゼではない酵素によって媒介されてもよい。この実施形態において、第２の酵素媒介反応は、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼなどの酵素によって媒介されてもよい。
【００３９】
本明細書で記載されているように、酵素媒介発光反応はいくつかの異なる試薬、例えばそれらには限定されないが、以下のクラスの化合物から選択される１つ又は複数の消光試薬で消失、好ましくは選択的に消失させることができる：発光反応のための基質類似体阻害剤、隔離剤（例えば界面活性剤などの酵素をその基質から物理的に切り離すことができる化合物、又はさもなければ酵素若しくはその基質の溶解性を変化させる化合物）色素などの着色化合物、並びに他の有機化合物（即ち、１つ又は複数の炭素原子を含む化合物）。一実施形態では、隔離剤は基質をミセル内に隔離することによって酵素をその基質から物理的に切り離す。「ミセル」は、特定の濃度（臨界ミセル濃度）で見られる両親媒性分子のコロイド状集合体である。ミセル内の集合分子の数は、一般的に５０から１００である。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、溶液内の界面活性剤モノマーの最大可能濃度に対応する、界面活性剤の総濃度である（図５を参照）。
【００４０】
特定の酵素の消光試薬は同じクラスの酵素を不活化し易い。このように、通常、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの消光試薬は他の花虫綱ルシフェラーゼを不活化する傾向にあり、蛍ルシフェラーゼの消光試薬は他の甲虫ルシフェラーゼを不活化し易い。同様に、通常、特定の反応を触媒する酵素、例えばペルオキシダーゼ又はホスファターゼの消光試薬は、その反応を触媒する他の酵素、即ちそれぞれ他のペルオキシダーゼ及び他のホスファターゼを不活化し易い。
【００４１】
本発明の組成物及びキットのため並びに方法で使用するための好ましい基質類似体阻害剤としては、それらには限定されないが、発光反応を抑制する基質類似体阻害剤、例えば天然基質と構造的に類縁であるが、異なる酵素の基質を含むように改変されたもの（「プロ基質」）がある。好ましい基質類似体阻害剤としては、それらには限定されないが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼなど花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテル及びその類似体、並びにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの他の基質類似体阻害剤、例えばその酵素と結合するがエノール酸素が活性部位内の酸化反応に関係しないようにするもの、例えばセレンテラジンエチルエーテルなど；ペルオキシダーゼ、例えばワサビペルオキシダーゼ；更に、ホスファターゼ、例えば蛍光と結合しない安定化ジオキセタン、即ち酵素と結合するが発光しない類似体などのアルカリホスファターゼがある。例えば、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体としては、下記式を有する化合物に関連したものが含まれる。
【化１】
［式中、Ｒ７はＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又は−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１４であり；
Ｒ８はＨ、アルキル、ヘテロアルキル又はアリールであり；
Ｒ９は、Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又は−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１５であり；
Ｒ１０は−Ｈ、−ＣＨ３又は−ＣＨ（ＣＨ３）２であり；
Ｒ１１は、酵素脱離が可能な基ではなく；
Ｒ１４及びＲ１５は独立して酵素脱離が可能な基であり；
但し、Ｒ１４及びＲ１５は全てがアセチル基ではない。］
【００４２】
「アリール」には芳香環、例えばアリール環又はヘテロアリール環、例えばフェニル基若しくはナフチル基が含まれる。
【００４３】
具体的な一実施形態では、Ｒ１１はＣ１〜Ｃ１０アルキルエーテルである。
【００４４】
具体的な一実施形態では、Ｒ１１はメチルエーテルである。
【００４５】
具体的な一実施形態では、基質類似体は下記式（ＩＩ）を有する２，８−ジベンジル−３−メトキシ−６−フェニル−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン（セレンテラジンｈｈメチルエーテル）である：
【化２】
【００４６】
式（ＩＩ）の化合物の合成では、アルゴン下の周囲温度で乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中で撹拌した２，８−ジベンジル−６−フェニル−７Ｈ−イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（０．２５ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１．１ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ）を一斉に加え、次にヨウ化メチル（０．４ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ）を滴下する。１時間の撹拌後、ＴＬＣ分析によると反応は終了していた。反応混合物をジクロロメタン（７５ｍｌ）で希釈し、水で２回洗浄した。有機抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過・蒸発して褐色油を得た。この粗抽出油はシリカゲル（３０ｇ）のフラッシュクロマトグラフィにより移動層としてジクロロメタンを使って精製した。該当する画分をプールして蒸発させ、所望の化合物を２００ｍｇ（７７％）得た。
【００４７】
他の酵素の基質を含むように改変されたルシフェラーゼの基質類似体（「プロ基質」）は、それが前記他の酵素が存在しなくルシフェラーゼ及び適当な試薬が存在する場合には発光を起こさないが、前記他の酵素とルシフェラーゼ及び適当な試薬が存在する場合には発光を起こす場合は、本発明のキット及び方法で使用することができ、即ち、プロ基質は基質類似体阻害剤となりうる。したがって、そのような基質類似体は、プロ基質を認識する酵素を欠く反応において選択的消光試薬として、又はその酵素を含む反応における発光プロ基質として使用することができる。例えば、これらの類似体としては、アミノルシフェリン、ジヒドロルシフェリン、ルシフェリン６’メチルエーテル、ルシフェリン６’クロロエチルエーテル、又はセレンテラジンの誘導体、例えばセレンテラジンｎ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｃ、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｅ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｆｃｐ、セレンテラジンｉ、セレンテラジンｉｃｐ若しくはセレンテラジン２−メチルのような他の酵素の基質を含むように変更されたセレンテラジンの誘導体があり、例えば国際出願ＡＪＳ０３／０２９３６を参照されたい。
【００４８】
通常、セレンテラジンに関しては、この誘導体化は、フェノール（−Ｃ６Ｈ４−ＯＨ）、カルボニル（＞Ｃ＝Ｏ）及びアニリン（−Ｃ６Ｈ４−ＮＨ２）などの官能基のその環境への反応性が低い基への変換を含む。官能基の通常の反応性は酵素脱離が可能な基が存在すると抑制されるので、酵素脱離が可能な基は保護基と称することができる。可能な保護基としては、エステラーゼとの相互作用によって脱離するエステルがある。可能な保護基としては、ホスホジエステラーゼ及びアルカリホスファターゼなどのホスファターゼとの相互作用によって脱離するホスホリルもある。可能な保護基としては、グリコシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−ガラクトシド、α−Ｄ−グルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−マンノシド、β−Ｄ−フルクトフラノシド及びβ−Ｄ−グルコシドウロネートとの相互作用によって脱離するグルコシルもある。当業者ならば、本発明で使用することができるであろう他の酵素脱離が可能な保護基を認めることができよう。酵素と酵素脱離が可能な基との相互作用の例は、米国特許第５８３１１０２号、並びにＴｓｉｅｎ（１９８１）；Ｒｅｄｄｅｎ他（１９９９）；及びＡｎｎａｅｒｔ他（１９９７）に記載されている。
【００４９】
酵素脱離が可能な基は、特異的な酵素の作用によってのみ脱離するように設計してもよい。例えば、ある種の脂肪酸を酵素脱離可能な基として使用することができ、特異的なエステラーゼだけがこれらの保護されたセレンテラジンをセレンテラジンに変える。立体障害の高い保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチル基を使用してもよい。そのような保護基は、大きな、立体障害エステルに作用することができる新規エステラーゼのスクリーニングに役立つ。アミノ酸も保護基として使用することができる。保護されたセレンテラジンは、更にエノール酸素原子を保護基と結合した窒素原子で置換することによって変更してもよい。この種の保護基は次にプロテアーゼによって取り除くことができ、その後、保護されたセレンテラジンをエノール／カルボニルへ加水分解することによりセレンテラジンが生じる。
【００５０】
これらの酵素脱離が可能な基は、好ましくはアルコール官能基の誘導体である。セレンテラジンのカルボニル官能基の場合、誘導体化にはカルボニルのエノール基（−Ｃ＝Ｃ−ＯＨ）への変換が含まれてもよい。セレンテラジンのカルボニル及びエノール型は、エノール型の基質が常にある割合で存在するように溶液内で動的平衡状態にあってもよい。エノール基のヒドロキシル（−ＯＨ）部分は誘導体化することができる。アシル化剤を使ったエステル形成を経た誘導体化を、以下に図式的に示す。構造ＩＩＩを有するセレンテラジンは２つのフェノール基及び１つのカルボニル基を含み、これらの基はいかなる組合せで保護してもよい。
【化３】
【００５１】
エーテル保護基による誘導体化は、例えばセレンテラジンをアセトキシメチルブロマイドなどのアルキル化剤で処理して実施することができる。エステル保護基による誘導体化は、例えばセレンテラジンをア無水酢酸又は塩化酢酸などのアシル化剤で処理して実施することができる。これらの誘導体化は塩基条件下、即ちｐＨ７から１４の間で実施される。これらの条件下では、フェノールのヒドロキシルとイミダゾロン酸素は共に反応して、対応するエステル又はエーテルを形成することができる。イミダゾロン酸素はエノール型のときに反応すると思われている。保護／脱保護プロセス並びに様々な保護基の例は、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｇｒｅｅｎｅ、Ｗｕｔｓ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１に記載されている。
【００５２】
誘導体化プロセスの１例は、保護されたセレンテラジンＩＶのセレンテラジンＩＩＩからの合成である。保護されたセレンテラジンＩＶは３つのアセチル保護基が存在するので、トリアセチル−セレンテラジンとしても知られている。
【化４】
【００５３】
化合物ＩＶの構造を有する化合物が天然のセレンテラジンＩＩＩの構造を確立する研究において中間体として使われたことが報告されている（Ｉｎｏｕｅ他、１９７７）。保護されたセレンテラジンＩＶは、アセチル誘導体化されたエノール基の反応活性度を考えると、他の保護されたセレンテラジンと比較して安定性がかなり低いことが予想される。
【００５４】
与えられた保護基に関しては、誘導体化されたエノールは同じように誘導体化されたフェノールよりも不安定である。エノール誘導体の反応性が増すことから、エノール誘導体が選択的に加水分解されて再びイミダゾロンカルボニルが得られるようになる。この種の化合物は、官能基の一部が保護され他は保護されないことから部分的保護化学種と呼ばれる。これらの部分的保護化学種は生物アッセイで使用することができ、又は異なるアシル化剤若しくはアルキル化剤と更に反応を起こさせて非対称化合物、つまり複数種類の保護基を有し同じくアッセイで使用することができる化合物を形成することができる。適当な保護基の選択は、検討中の細胞型及び所望の加水分解速度によって決めることができる。選択的な加水分解は、例えばＩｎｏｕｅ他（１９７７）で記載されているように実施することができる。このことは、トリアセチル−セレンテラジン（ＩＶ）のジアセチル−セレンテラジン（Ｖ）への選択的加水分解及び以降の保護された非対称セレンテラジン（ＶＩ）の形成のための以下の反応スキームに図示する。
【化５】
【００５５】
構造ＶＩＩ〜ＩＸは、カルボニル上に保護基を有している保護されたセレンテラジンを例示する。
【化６】
Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は独立してＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又はその組合せでよい。Ｒ１２及びＲ１３は、独立して−ＯＲ１６、Ｈ、ＯＨ、アルキル、ヘテロアルキル、アリール又はその組合せでよい。構造ＶＩＩＩでは、ｎは０、１、又は２、好ましくは１でよい。
好ましくは、Ｒ７はＲ１の記載通りであるか、又は−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１４である。
好ましくは、Ｒ８はＲ２の記載通りであり、Ｒ１０はＲ４の記載通りである。
好ましくは、Ｒ９はＲ３の記載通りであるか、又は−Ｃ６Ｈ４ＯＲ１５である。
Ｒｐとして一緒に識別されるＲ１１、Ｒ１４、Ｒ１５及びＲ１６は保護基であり、独立して様々な保護基のいずれかでよい。好ましくは、これらの種はそれらの対応するＯ原子と共にエーテル、エステル又はその組合せである。例えば、保護基はアセチル（Ｒｐ＝−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３）、ブチリル（Ｒｐ＝−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ３Ｈ７）、アセトキシメチル（Ｒｐ＝−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３）、プロパノイロキシメチル（Ｒｐ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２Ｈ５）、ブチリロキシメチル（Ｒｐ＝−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ３Ｈ７）、ピバロイロキシメチル（Ｒｐ＝−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ３）３）又はｔ−ブチリル（Ｒｐ＝−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ（ＣＨ３）３）でよい。
【００５６】
保護されたセレンテラジンの具体例としては、トリアセチル−セレンテラジン（ＩＶ）、トリブチリル−セレンテラジン（Ｘ）、ジアセチル−セレンテラジン−ｈ（ＸＩ）、アセトキシメチルジアセチル−セレンテラジン（ＸＩＩ）、アセトキシメチルアセチル−セレンテラジン−ｈ（ＸＩＩＩ）、ピバロイルオキシメチル−セレンテラジン−ｈ（ＸＩＶ）及びアセトキシメチル−ジデオキシセレンテラジン（ＸＶ）がある。
【化７】
【００５７】
保護されたセレンテラジンが適当な脱保護酵素と相互作用すると、保護基が取り除かれ、元の官能基を回復することができる。適当な脱保護酵素が存在しない場合は保護基は脱離せず、一部の実施形態においては保護されたセレンテラジンはルシフェラーゼの阻害剤として使用することもできる。エステル及びエーテル保護基に関しては、脱保護酵素は、例えばエステラーゼを含めいかなるヒドロラーゼでもよい。セレンテラジンに関しては、その脱保護形態（即ちカルボニル）内にカルボニル官能基を有することは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェラーゼ及びエクオリンなどの発光タンパク質との発光相互作用を可能にする。保護されたセレンテラジンをセレンテラジンに変換するには、カルボニル部位を脱保護するだけでよい。それでもフェノールのヒドロキシル上の保護基は、発光相互作用を妨害又は阻止することができる。
【００５８】
ジオキセタン基質を使用する酵素に関しては、反応のための基質としては下記式を有するジオキセタン含有基質があり、また反応の基質類似体阻害剤はこのような基質と構造的に関係していてもよく、
【化８】
［式中、Ｔは置換されている（即ち、１つ若しくは複数のＣ１〜Ｃ７アルキル基又はヘテロ原子基、例えばハロゲン原子を含む）か非置換のシクロアルキル環（環に６〜１２個の炭素原子を含んでいる）又は多環式アルキル基（２つ以上の縮合環を有し、各環は独立に５〜１２個の炭素原子を含む）であり、これらはジオキセタン４員環とスピロ結合により結合し、例としてはクロロアダマンチル基若しくはアダマンチル基があり、最も好ましくはクロロアダマンチルであり；
Ｙは蛍光発色団であり（即ち、Ｙはエネルギーを吸収して励起した、即ちより高いエネルギーの状態を形成することができる基であり、その状態から光を放出して元のエネルギー状態に戻る）；
Ｘは水素、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル又はヘテロアルキル基（１〜７個の炭素原子を含み、例えばメトキシ、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシエチル、トリフルオロエトキシ又はヒドロキシプロピル）、アリール基（少なくとも１つの環を有し、例えばフェニル）、ヘテロアリール基（少なくとも１つの環を有し、例えばピロリル又はピラゾリル）、ヘテロアルキル基（環に２〜７個の炭素原子を含み、例えばジオキサン）、アラルキル基（少なくとも１つの環を有し、例えばベンジル）、アルカリル基（少なくとも１つの環を有し、例えばトリル）、或いは酵素切断が可能な基、即ち、酵素によって切断されてジオキセタンに結合した電子に富む基、例えばリン酸を生成することができる部分を有する基であり、リン−酸素結合は酵素、例えば酸性ホスファターゼ又はアルカリホスファターゼによって切断されてジオキセタン又はＯＲに結合した負荷電の酸素を生成することができ；
Ｚは水素、ヒドロキシル又は酵素切断可能な基であり、但しＸ又はＺの少なくとも１つは酵素切断可能な基で、酵素は前記酵素切断可能な基を切断してジオキセタンに結合した負荷電の基（例えば酸素アニオン）を形成し、前記負荷電の基はジオキセタンが分解して基Ｙを含む発光物質（即ち、光の形のエネルギーを発する物質）を形成するようにする］
発光シグナルは、酵素活性の指標として検出される。発光の強度を測定することにより酵素活性を測定することができる。
【００５９】
化学発光反応のための活性基質は式ＸＶＩのＸがＯＲのとき生成され、基Ｒは炭素原子数１〜２０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル、アリール、シクロアルキル又はアリールアルキルである。Ｒは１つ又は２つのヘテロ原子を含んでもよく、これらはＰ、Ｎ、Ｓ又はＯでよい。置換基Ｒはハロゲン化される。ハロゲン化の程度は、アダマンチル基、アリール基上の選択された置換基、及び想定されている特定の用途の所望の酵素反応速度論によって異なる。最も好ましくはＲはトリハロアルキル基である。好ましい基としてはトリハロ低級アルキルがあり、これにはトリフルオロエチル、トリフルオロプロピル、ヘプタフルオロブチロール、ヘキサフルオロ−２−プロピル、ａ−トリフルオロメチルベンジル、ａ−トリフルオロメチルエチル及びジフルオロクロロブチル基が含まれる。置換基Ｒの炭素原子は、ハロゲンで部分的又は完全に置換されてもよい。Ｒがアリールである場合、好ましい基としては１つ若しくは複数のクロロ、フルオロ又はトリフルオロメチル基で置換されたフェニル環、例えば２，５−ジクロロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，３，５−トリフルオロフェニル、２−クロロ−４−フルオロフェニル又は３−トリフルオロメチルフェニルを挙げることができる。フッ素及び塩素は特に好ましい置換基であるが、臭素及びヨウ素は特別な状況で使用することができる。
【００６０】
基Ｙは酵素切断が可能な基Ｚに結合した蛍光発色団又は蛍光団である。Ｙはジオキセタンが分解すると発光性となるが、それはリポーター酵素が基Ｚを切断し、それによりジオキセタンを不安定にする電子に富む部分が生成してジオキセタン分解の原因となる場合である。分解により２つの個々のカルボニル化合物が生成し、その１つは基Ｔを含み、他は基Ｘ及び基Ｙを含む。ジオキセタン分解から遊離するエネルギーは、Ｘ及びＹ基を含む化合物に発光を起こさせる（基Ｘが水素の場合、アルデヒドが生じる）。Ｙは好ましくはフェニル又はアリールである。アリール部分は式ＸＶＩのように基Ｚを有し、更に米国特許第５５８２９８０号に記載されているように１〜３個の電子活性基、例えば塩素又はメトキシを有する。
【００６１】
いかなる発色団でもＹとして使用することができる。一般に、感度を向上させるために量子収率を最大にする発色団を使うことが望ましい。したがって、Ｙは通常芳香族の基を含む。適当な発色団の例は、米国特許第４９７８６１４号で更に詳述されている。
【００６２】
発色団Ｙに結合した基Ｚは、酵素切断が可能な基である。酵素と接触すると、酵素切断が可能な基は切断されて発色団Ｙに結合した電子に富む基を生じる；この基は、２つの個々のカルボニル含有化合物、例えばケトン又はエステル、また基Ｘが水素の場合はアルデヒドへのジオキセタンの分解を開始する。電子に富む基の例としては、酸素、硫黄及びアミン又はアミノアニオンがある。最も好ましい基は、酸素アニオンである。適当なＺ基及びこれらの基に特異的な酵素の例は、米国特許第４９７８６１４号の表１に記載されている。そのような酵素としては、アルカリ及び酸のホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、β−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フラクトフラノシダーゼ、β−Ｄ−グルコシドウロナーゼ並びにトリプシンが含まれる。
【００６３】
ジオキセタン類似体は、Ｔ、Ｙ及びＸのいずれかと結合した１つ又は複数の可溶化置換基、即ち、水溶液中で類似体の溶解性を強化する置換基を含むことができる。可溶化置換基の例としてはカルボン酸、例えば酢酸；スルホン酸、例えばメタンスルホン酸；及び、第４級アミノ塩、例えば臭化アンモニウムが含まれ；最も好ましい可溶化置換基は、メタン又はエタンスルホン酸である。それから本発明の実施に役立つジオキセタン類似体を調製することができる他のジオキセタンは、米国特許第５０８９６３０号；米国特許第５１１２９６０号；米国特許第５５３８８４７号及び米国特許第５５８２９８０号に記載されている。
【００６４】
一の実施形態では、第１の酵素媒介発光反応のための基質類似体は甲虫ルシフェラーゼのための基質類似体ではなく、例えば、この基質類似体はデヒドロルシフェリン、ＡＴＰ、ベンゾチアゾール、１−（４−アミノフェニル）−６−メチルベンゾチアゾール、２−フェニルベンゾチアゾール及び２（Ｏ−ヒドロキシフェニル）ベンゾチアゾールではない。
【００６５】
一の実施形態では、好ましい基質類似体は天然基質の不可逆的競合阻害剤である。
【００６６】
好ましい隔離剤としては、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、例えば有効量では基質をその対応する酵素から物理的に分離して、好ましくは酵素反応が起こらないようにするもの、並びに基質又は酵素の抗体又は他のリガンドが含まれる。好ましい隔離剤としては、第１の酵素の基質の少なくとも一部、例えば３５％以上、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上を例えばミセル内に隔離するが、異なる第２の酵素及びその対応する基質は隔離しない剤、又は第２の異なる基質及びその対応する酵素の溶解性は変化させないが第１の基質若しくは第１の酵素の溶解性を変化させて発光をもたらす第１の基質と第１の酵素間の相互作用を、例えば少なくとも３５％以上、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上抑制する剤が含まれる。好ましい隔離剤としては、それらには限定されないが、アニオン性、非イオン性、両性又はカチオン性界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｏｒ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、例えば図５に示したものがある。一実施形態では、好ましい隔離剤としては、それらには限定されないが、クラウンエーテル、エトキシル化Ｔｏｍａｈ、例えばＴｏｍａｈ Ｅ（登録商標）、アザクラウンエーテル、シクロデキストラン、トゥイーン（登録商標）２０（ポリ（オキシエチレン）ｘ−ソルビタン−モノラウレート）、トゥイーン８０、Ｂｉｇ Ｃｈａｐｓ、ＣＨＡＰＳ、ＤＴＡＢ、トリトン（登録商標）Ｘ−１００（アルキルポリエーテルアルコール；［Ｃ１６Ｈ２６Ｏ２］ｎ）、並びにＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）Ｎｐ−９、ポリビニルピロリドン及びグリコール、例えばポリエチレングリコール、例えば４００又は６００が含まれる。このように、例えば、基質、例えば大部分の基質を対応する酵素から物理的に分離する剤を添加すると、前記基質（例えばセレンテラジン）をミセル内に隔離し、前記酵素、例えばＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを溶液の水性部分に残すことができる。より詳細には、第１の発光反応の好ましい隔離剤は、発光反応を媒介する第１の酵素の基質の少なくとも大部分を酵素から物理的に分離し、第２の異なる酵素媒介発光反応からの光を実質的には消光しない剤である。一実施形態では、第１の花虫綱ルシフェラーゼ媒介反応の隔離剤は、例えば第２の酵素媒介発光反応がＰｐｅ２などの蛍ルシフェラーゼによって媒介される場合は、荷電界面活性剤、例えば約０．０５％、０．１％、１．０％、２％（ｖ／ｖ）以上のＣＨＡＰＳでよい（国際出願第０１／２０００２号）。他の実施形態では、第１の花虫綱ルシフェラーゼ媒介反応の隔離剤は、例えば第２の酵素媒介発光反応がＬｕｃ＋によって媒介される場合は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９、例えば０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１．０％、２％以上のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００又はＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９でよい（米国特許第５６７０３５６号）。
【００６７】
一実施形態では、好ましい着色化合物は青、緑又は赤の光を消光する化合物である。化合物は目視又は吸収スペクトルによりスクリーニングして青、緑又は赤の光を消光する化合物候補を識別することができる（特別に参照により本明細書に組み込まれた「染色剤、色素及び指示薬のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈハンドブック（Ｔｈｅ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔａｉｎｓ，Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｉｎｄｉｃａｔｅｒｓ）」、Ｇｒｅｅｎ編、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ミルウォーキー、ＷＩ、１９９０を参照）。
【００６８】
本明細書で使用される赤色光には、約５９０ｎｍより長く約７３０ｎｍ未満の波長、例えば６１０ｎｍから６５０ｎｍの波長の光が含まれる。本明細書で使用される黄緑色の光には、約４９０ｎｍから約５９０ｎｍ、好ましくは約５２０ｎｍから約５７０ｎｍの波長の光が含まれる。本明細書で使用される黄色光には、５６０ｎｍより長く約５９０ｎｍまでの波長の光が含まれる。本明細書で使用される緑色光には、４９０ｎｍより長く約５６０ｎｍまでの波長の光が含まれる。本明細書で使用される青色光には、４００ｎｍより長く約４９０ｎｍまでの波長の光が含まれる。
【００６９】
例えば、赤色光は４．２９×１０１４Ｈｚの周波数又は１．７７ｅＶである７００ｎｍの波長、並びに４．６２×１０１４Ｈｚの周波数又は１．９１ｅＶである６５０ｎｍの波長と一致してもよい。黄色光は５．１６×１０１４Ｈｚの周波数又は２．１４ｅＶのエネルギーである５８０ｎｍの波長と一致してもよい。緑色光は５．４５×１０１４Ｈｚの周波数又は２．２５ｅＶのエネルギーである５５０ｎｍの波長と一致してもよい。青色光は６．６６×１０１４Ｈｚの周波数又は２．７５ｅＶのエネルギーである４５０ｎｍの波長と一致し、紫色光は７．５０×１０１４Ｈｚの周波数又は３．１０ｅＶのエネルギーである４００ｎｍの波長と一致してもよい。
【００７０】
例えば、黄色の化合物は青色光、例えばＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びワサビペルオキシダーゼの媒介による反応から発生する光を消光するのに役立つ。更に、黄色の化合物は一部の甲虫ルシフェラーゼによって発生する黄緑光を消光しないので、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ／蛍ルシフェラーゼアッセイなどの二重アッセイで消光するために用いることができる。好ましい黄色化合物としては、それらには限定されないが、水溶液で溶解すると５６０〜５９０ｎｍから７５ｎｍ以内にピーク吸光度を有する化合物、例えばジピリダモール及びベルベリンヘミサルフェートがある。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによって発生する光を消光するために好ましい化合物としては、それらには限定されないが、青色光を吸収し、一実施形態では黄緑色光を透過させる化合物、例えば、それらには限定されないが、アクリジンオレンジ、塩基オレンジ２１号、塩酸４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）ベンゼンアルソン酸（ｂｅｎｚｅｎｅｎｅａｒｓｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、５−アミノフルオロセイン、ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオレセイン、２，４−ジアミノ−５−（２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニルアゾ）ベンゼンスルホン酸、ヌビアンイエローＴＢ、アシッドオレンジ１０号、アウリン、及び溶媒黄色１４号がある。
【００７１】
他の実施形態において、好ましい化合物としては、赤色光を消光する化合物、例えば溶液ではシアン又は青色を呈する化合物、例えばアズールＢテトラフルオロホウ酸塩、アシッドブルー９３、５，５’，７−インジゴトリスルフィン酸三カリウム塩、クレジルバイオレットアセテート、トリプタンブルー、トウォート染色剤及びリサミングリーンＢがある。好ましい青色化合物としては、水溶液で溶解すると４００〜４９０ｎｍから７５ｎｍ以内にピーク吸光度を有する化合物がある。
【００７２】
赤色光又は黄色光を消光するが青色光は消光しない青色の化合物としては、それらには限定されないが、青色クロム酸塩色素、イソスルファンブルー、メチレンブルー、クーマシーブルー、アシッドブルー、オルセイン、ペルシャンブルー、インジゴトリスルホン酸カリウム、α−ナフトフタレイン、アズールＩＩ、オイルブルーＮ、パテントブルーＶＦ、パラローアニリン塩基（ｐａｒａｒｏａｎｉｌｉｎｅ）、ロダニルブルー、テトラブロモフェノールブルー、トルイジンブルーＯ、ビクトリアピュアブルーＢＯ、ビクトリアブルーＢ、アルカリブルー６Ｂ、アルファアズリンＡ及びシアニン染料などがある。
【００７３】
他の実施形態において、好ましい化合物としては、緑色光を消光する化合物、例えば溶液ではマゼンタ又は赤色を呈し、一実施形態では赤色光を透過させる化合物、例えばそれらには限定されないが、アシッドブルー、アシッドバイオレット１９、アミドナフトールレッド６Ｂ、及び塩基レッド９がある。好ましい一実施形態において、緑色光を消光して青色光を透過させる化合物としては、アシッドバイオレット１７、インディゴブルー、塩化ピナシアノール、ローダミン６Ｇ過塩素酸塩、ロダニルブルー、パラローザニリン塩基、ローズベンガルビス（トリエチルアンモニウム）塩及び３，３’−ジメチルフェノールフタレインがある。好ましい化合物は、水溶液で溶解すると５９０〜７３０ｎｍから７５ｎｍ以内にピーク吸光度を有する化合物である。
【００７４】
一の実施形態では、化学発光反応の消光試薬として有効な適当な化合物としては有機化合物（即ち１つ又は複数の炭素原子を含む化合物）があり、例えば参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第０９／５９０８８４号に開示されているものなどがある。適当な有機化合物は炭素−硫黄結合又は炭素−セレニウム結合を含むことができ、例えば、適当な有機化合物は炭素−硫黄二重結合（Ｃ＝Ｓ）、炭素セレニウム二重結合（Ｃ＝Ｓｅ）、炭素−硫黄単結合（Ｃ−Ｓ）又は炭素−セレニウム単結合（Ｃ−Ｓｅ）を含むことができる。適当な有機化合物は、炭素と結合したメルカプト基（Ｃ−ＳＨ）又は２つの炭素原子と結合した硫黄原子（Ｃ−Ｓ−Ｃ）も含むことができる。好ましい化合物は親油性である。
【００７５】
炭素硫黄二重結合又は炭素セレニウム二重結合を含む適当な化合物としては、例えば式（ＸＶＩＩ）の化合物：
【化９】
［式中、ＸはＳ又はＳｅであり；Ｒ１及びＲ２は、各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲａＲｂであり；或いはそれらが結合する炭素と共にＲ１及びＲ２は炭素及び任意選択にオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）又は窒素（−ＮＲｃ）−から選択される１つ、２つ又は３つのヘテロ原子を含む５、６、７又は８員環の飽和又は不飽和の環を形成し、前記環は任意選択に１つ、２つ又は３つのハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールで置換され；Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃのいずれかの（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、１つ又は複数（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される］
又はその塩が含まれる。
【００７６】
本明細書で使われる用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを意味する。
【００７７】
用語「アルキル」、「アルコキシ」、「アルケニル」、「アルキニル」などは、本明細書で使われるように、分岐及び非分岐の基を意味する；しかし、「プロピル」のような個々の基に言及する場合は、直鎖で非分岐鎖の基のみを含み、「イソプロピル」のような分枝鎖異性体は特別に呼ばれる。
【００７８】
本明細書で使われるように、用語「アリール」は６〜３０個の原子を含み少なくとも１つの環が芳香環である、単環式又は多環式炭化水素基を意味する。好ましくは、アリールはフェニル基又は約９〜１０個の環原子を有し少なくとも１つの環が芳香環であるオルト縮合二環式炭素環基を意味する。「ヘテロアリール」は、炭素と非ペルオキシド酸素、硫黄及びＮ（Ｘ）からなる群からそれぞれ選択される１〜４個のヘテロ原子からなる５個又は６個の環原子を含む単環式芳香環の基を含み、Ｘは無であるか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニル又はベンジルであり、並びにそこから誘導される８〜３０個の原子を含む多環式環の基を含む。好ましくは、ヘテロアリールは、炭素と非ペルオキシド酸素、硫黄及びＮ（Ｘ）からなる群からそれぞれ選択される１〜４個のヘテロ原子からなる５個又は６個の環原子を含む単環式芳香環の環炭素を介して結合した基を含み、Ｘは無であるか、Ｈ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、フェニル又はベンジルであり、並びにそこから誘導された約８〜１０個の環原子のオルト縮合二環式複素環の基、特にベンズ誘導体又はプロピレン、トリメチレン若しくはテトラメチレンジ基をそこへ縮合することによって誘導したものを含む。
【００７９】
メルカプト基を含む適当な化合物としては、例えば式Ｒ３ＳＨの化合物又はその塩が含まれ、但し、式中：Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ３の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つ又は複数（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｄＲｅで任意選択に置換され；Ｒｄ及びＲｅは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）、アルキニル（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールであり；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８０】
他の適当な化合物としては、例えば式Ｒ４ＮＣＳの化合物又はその塩が含まれ、但し、式中、Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ３の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｆＲｇで任意選択に置換され；Ｒｆ及びＲｇは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールであり；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８１】
炭素−セレン単結合又は炭素硫黄単結合を含む他の適当な化合物としては、式Ｒ５−Ｘ−Ｒ６の化合物
［式中：
Ｘは−Ｓ−又は−Ｓｅ−であり；
Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ６は水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；
又は、Ｒ５及びＲ６はＸと共にヘテロアリールを形成し；
Ｒ５又はＲ６の（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つ又は複数（例えば１つ、２つ、３つ又は４つ）のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｋＲｍで任意選択に置換され；
Ｒｋ及びＲｍは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールであり；
アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数（１つ、２つ、３つ、又は４つ）のハロゲン、メルカプト、ヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される］
又はその塩が含まれる。
【００８２】
下記に示す基、置換基及び範囲の具体的な好ましい値は説明のためだけにすぎず、それらは、基及び置換基についての他の定義値や定義範囲の他の値を排除するものではない。
【００８３】
具体的には、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル又はヘキシルでよく；（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシルでよく；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ又はヘキシルオキシでよく；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニルは、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル又は５−ヘキセニルでよく；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル又は５−ヘキシニルでよく；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイルは、アセチル、プロパノイル又はブタノイルでよく；（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ペントキシカルボニル又はヘキシロキシカルボニルでよく；（Ｃ２〜Ｃ２０）アルカノイロキシは、アセトキシ、プロパノイロキシ、ブタノイロキシ、イソブタノイロキシ、ペンタノイロキシ又はヘキサノイロキシでよく；アリールは、フェニル、インデニル又はナフチルでよく；ヘテロアリールはフリル、イミダゾリル、トリアゾリル、トリアジニル、オキサゾイル、イソオキサゾイル、チアゾリル、イソチアゾイル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、テトラゾリル、ピリジル（又はそのＮ−オキシド）、チエニル、ピリミジニル（又はそのＮ−オキシド）、インドリル、イソキノリル（又はそのＮ−オキシド）或いはキノリル（又はそのＮ−オキシド）でよい。
【００８４】
具体的には、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲａＲｂであり；Ｒａ及びＲｂは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、又はヘテロアリールであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒａ及びＲｂの（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つか２つのハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８５】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリール又はＮＲａＲｂでよい。
【００８６】
具体的には、それらが結合する炭素と共にＲ１及びＲ２は炭素及び任意選択にオキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）又は窒素（−ＮＲｃ）−から選択される１つ又は２つのヘテロ原子を含む５又は６員環の飽和又は不飽和の環を形成することができ、前記環は任意選択に１つ、２つ又は３つのハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールで置換され；Ｒｃは水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールであり；Ｒ１、Ｒ２、及びＲｃのいずれかの（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルは、１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８７】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立してＮＲａＲｂでよく；Ｒａ及びＲｂは各々独立して水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、アリール、ヘテロアリールであり；（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、又は（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニルのいずれかは、１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、アリール又はヘテロアリールで任意選択に置換され；アリール又はヘテロアリールのいずれかは１つ又は複数のハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換される。
【００８８】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立してアミノ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノ又は４−チアゾイルアミノでよい。
【００８９】
具体的には、Ｒ１及びＲ２は各々独立してアミノ、メチル、アリルアミノ、２−ヒドロキシエチルアミノ、フェニルアミノ又は４−チアゾイルアミノでよい。
【００９０】
Ｒ３の具体的な値は、１つ又は複数のハロゲン、メルカプト、オキソ、チオキソ、カルボキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はＮＲｄＲｅで任意選択に置換された（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルである。
【００９１】
Ｒ３の具体的な値は、２−アミノエチル、２−アミノ−２−カルボキシエチル又は２−アシルアミノ−２−カルボキシエチルである。
【００９２】
Ｒ４の具体的な値は、１つ又は複数のハロゲン、メルカプトヒドロキシ、オキソ、カルボキシ、シアノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイロキシ、スルホ、又は（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシカルボニルで任意選択に置換されたアリールである。
【００９３】
具体的には、Ｒ５は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールであり；Ｒ６は水素、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ１０）アルキニル、アリール又はヘテロアリールである。
【００９４】
具体的には、Ｒ５及びＲ６はＸと共にヘテロアリールを形成する。
【００９５】
好ましい有機化合物からは、１つ又は複数のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含むポリペプチド及びタンパク質は排除される。
【００９６】
好ましい有機化合物からは、１つ又は複数のメルカプト（Ｃ−ＳＨ）基を含む化合物は除外される。
【００９７】
一実施形態では、好ましくは消光試薬はヨウ化物、ヨウ素、硫酸塩、硝酸塩、イソプロパノール、２−（４−アミノフェニル）−６−メチルベンゾチアゾール（ＡＰＢＮＨ）、酸化ジメチルデシルホスフィン、ピロリン酸、ベンゾチアゾール、２−フェニルベンゾチアゾール、ｎ−ブタノール、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）、（２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−チアゾール−４−カルボン酸、エチレンジアミンテトラエチレンジアミン四酢酸、２（ｏ−ヒドロキシフェニル）ベンゾチアゾール、アデノシン５’−三リン酸、酸化２’，３−非環式ジアルコール過ヨウ素酸塩、還元ホウ化水素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、クエン酸、トゥイーン（登録商標）２０及びトリトン（登録商標）Ｘ−１００ではない。他の実施形態において、消光試薬を含む組成物は、クエン酸、ｎ−ブタノール、イソプロパノール、エチルアルコール、ヨウ化物、ヨウ素、トゥイーン（登録商標）２０、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド及びそのいかなる組合せも含まない。他の実施形態では、消光試薬はチオールではない。他の実施形態では、消光試薬は甲虫ルシフェラーゼの選択的消光試薬ではない。
【００９８】
本発明は、１つ又は複数の選択的消光試薬を含む、単一リポーター及び二重リポーターのアッセイキットも含む。単一リポーターキットは、酵素媒介発光反応からの光子発光を消光することができる少なくとも１つの選択的消光試薬組成物を含む。前記少なくとも１つの選択的消光試薬組成物は、適当な第１の容器内に入れられる。酵素媒介発光反応の少なくとも１つの機能的酵素基質が、前記少なくとも１つの機能的酵素基質が置かれる適当な第２の容器と共に任意選択にキットに含まれる。キットは、使用説明書も含む。
【００９９】
一実施形態では、２つ以上の選択的消光試薬が本発明の方法、組成物及びキットで使用され、好ましくは、消光に及ぼすその複合効果は相加作用以上である。
【０１００】
二重リポーターキットは、少なくとも１つの酵素媒介発光反応からの光子発光を消光させることができるが、少なくとも１つの第２の異なる酵素媒介発光反応を実質的に消光させることのできない少なくとも１つの選択的消光試薬を含む。或いは、又は少なくとも１つの選択的消光試薬に加えて、キットは、少なくとも１つの酵素媒介発光反応からの光子発光を選択的に消光させることができるが、第２の異なる酵素媒介発光反応からの光子発光を実質的に消光させることのできない少なくとも１つの第１の消光試薬を含む消光及び活性化組成物を含む。前記少なくとも１つの選択的消光試薬組成物、又は消光及び活性化組成物は、適当な第１の容器内に置かれる。第１の酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの機能的酵素基質が、適当な第２の容器内に置かれる。任意選択に、二重リポーターキットは、適当な第３の容器内に置かれた第２の酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの機能的酵素基質を含む。この二重リポーターキットは、使用説明書も含む。また、任意選択に、この二重リポーターキットは適当な第３の容器内に置かれた、前記第１の選択的消光試薬とは異なる少なくとも１つの第２の消光試薬も含むことができる。選択的な消光試薬であってもよい第２の消光試薬は、第２の異なる酵素媒介発光反応を消光させることができる。
【０１０１】
本発明は、本発明の方法を実施するためのアッセイキットも含む。そのようなキットは、１つ又は複数の容器内に、通常アッセイでの使用を容易にするように便利に梱包されて、前記方法を実施するための様々な組成物を大量に含む。このように、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ基質又はＡＴＰのアッセイキットには、以下の１つ又は複数或いはそのいかなる組合せも含むことができる組成物が含まれる：マグネシウムイオン、ＡＴＰ、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェリン及び／又はチオール試薬。一実施形態では、そのような組成物は、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含んでもよく、他の成分、例えばタンパク質のルシフェラーゼ活性エンハンサー（例えば、精製酵素製剤中のウシ血清アルブミン又はグリコール）、ＥＤＴＡ若しくはＣＤＴＡ、リン酸塩若しくは２−アミノエタノール、或いは甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が適当な速度で進行するｐＨ及びイオン強度の溶液を提供するための緩衝を含んでもよい。
【０１０２】
そのようなキット及び組成物の１成分は、カチオン、例えばマグネシウム、カルシウム、マンガンなどでよい。
【０１０３】
本発明の方法及び組成物で使用されるチオール試薬は、ＣｏＡ又はＣｏＡ以外のチオール試薬である。ＣｏＡ以外のチオール試薬は、反応が起こる温度、ｐＨ、イオン強度、化学組成などの条件下で空気飽和した水溶液内で還元剤として有効な遊離のスルフヒドリル基を有する試薬である。これらの試薬の中で好ましいものはＤＴＴである。使用することができる他のものとしては、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトプロパノール（いずれかがエナンチオマーであるか両方共いかなる組合せのエナンチオマーである）、３−メルカプトプロパノール、２，３−ジチオプロパノール及びグルタチオンがある。
【０１０４】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼなどの花虫綱ルシフェラーゼの反応をアッセイするためのキットでは、組成物は例えばｐＨ５の試薬緩衝、約０．５Ｍ ＫＣｌ又はＮａＣｌなどの高濃度塩、セレンテラジン又はセレンテラジンｈｈなどの基質を含み、また他の成分を含んでもよい。
【０１０５】
アッセイキットは、１つ又は複数の基質、例えば第１の反応のための基質及び第２の反応のための基質、例えば発光反応の基質である生成物を生成する酵素の基質を含んでもよい。基質は、合成により調製してもよい。例えば、セレンテラジン又は他のルシフェリンの修飾された形態、「保護された」形態は、本明細書で記載するように本発明のキット及び方法で使用してもよい。保護されたセレンテラジンのような保護されたルシフェリンとしては、もはやルシフェラーゼと相互作用して発光を起こすことはないルシフェリンの修飾形態がある。一実施形態では、この修飾はルシフェリンへのいかなる酵素脱離可能な基の付加であり、この保護されたルシフェリンと適当な酵素との相互作用により発光が可能な活性ルシフェリンが生成する。保護されたルシフェリンを活性ルシフェリンに変換する酵素は、好ましくは非発光性の酵素である。参照によって本明細書に組み込まれている国際出願第０３／０４０１００号に開示されているセレンテラジンの全ては、保護されたセレンテラジンに変換することができる。
【０１０６】
上述の様々な成分は、例えば溶液又は凍結乾燥混合物中で、単一の容器又は複数の容器で様々な組合せ（個々も含む）で組み合わせることができる。酵素、コファクター又は基質が存在してもよい細胞内で酵素媒介発光反応により酵素、基質又はコファクターをアッセイするための好ましいキットには、細胞内に活性型又は活性化することができる形態で存在するかもしれない酵素、基質又はコファクターを（細胞溶解の間に放出される様々な酵素の作用に対して）保存しつつ、細胞を溶解するのに役立つ溶液（又は溶液を調製するための成分）が含まれる。
【０１０７】
当業者は、本明細書で記載されているものなど、及び本明細書で記載されているもの以外の組成物が、いかなるアッセイ反応混合物、したがって本発明のキットに、例えば酵素活性を維持又は強化するために、或いはアッセイ対象のサンプルの一定量を得るために使用される処置の結果として存在してもよいことは周知である。このように、一般には緩衝剤、例えばトリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、トリス、グリシルグリシン、リン酸塩のようなものがｐＨ及びイオン強度を維持するために存在する；酵素活性を高めるタンパク質物質、例えば哺乳類の血清アルブミン（好ましくはウシ血清アルブミン）又はラクトアルブミン又はオバルブミンが存在してもよい；ＥＤＴＡ又はＣＤＴＡ（シクロヘキシレンジアミン四酢酸）のようなものは、アッセイするリポーターが抽出される系（例えば細胞）に存在するかもしれなく、また、リポーター又は他の反応成分に悪影響を与えるかもしれない含金属プロテアーゼ又はホスファターゼの活性を抑えるために存在してもよい。酵素を安定させるグリセリン又はエチレングリコールが存在してもよい。
【０１０８】
例えば、マグネシウムなどのカチオンへの対イオンが存在してもよい。当業者が理解するように、これらの対イオンの化学同一性及び濃度は、マグネシウムイオンを供給するために使用されるマグネシウム塩、使用する緩衝、溶液のｐＨ、ｐＨ調節物質（酸又は塩基）並びにマグネシウム塩、緩衝及びｐＨ調節用酸若しくは塩基以外のソースに由来する溶液中アニオンによって大きく異なる。一実施形態では、マグネシウムイオンは、所望のマグネシウムイオン濃度を提供するために、用いる緩衝（例えばトリシン）を含む溶液に溶かした炭酸塩として供給することができ、次に緩衝溶液のｐＨは硫酸などの強酸の添加によって調節することができ、その結果大部分の炭酸塩（及び重炭酸塩）は二酸化炭素として消失し、またこれらのアニオンは硫酸イオン、重硫酸イオン、トリシンアニオン及び恐らく他の種類のアニオン（アニオンを供給し溶液に存在するかもしれない他の物質（例えばリン酸塩）に依存する）によって置換される。アッセイ法が実施される溶液の空気からの酸素飽和は、ルシフェラーゼ反応で必要な分子状酸素を供給するのに十分である。いずれにせよ、アッセイ反応混合物中のルシフェラーゼの活性に有効な様々な成分、例えばこの方法に関する上の説明で具体的に列挙した成分の濃度を確かめることは、当業者には容易である。
【０１０９】
当業者に周知のように、キットを使用して実施するアッセイの信頼性及び精度を確保するため、またキットのアナライト（例えば酵素、基質、コファクターなど）についてのサンプルの定量分析を可能にするために、本発明の検査キットは様々な対照及び標準、例えば既知の酵素、基質又はコファクター、例えばＡＴＰ、濃度の溶液、例えば酵素なし、基質なし、若しくはコファクターなし（例えば、蛍ルシフェラーゼ陰性対照のためのＡＴＰがない）の溶液を含むこともできる。
【０１１０】
本発明の方法に従ってアッセイすることができるサンプルの種類としては、とりわけ遺伝子リポーターとしての発光リポーター、細胞分子のリポーター又はその分子のモジュレーターとしての発光リポーター、イムノアッセイにおけるリポーター或いは核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイにおけるリポーターを含むサンプルがある。イムノアッセイ及び核酸プローブ技術で理解されているように、本発明に従ってアッセイされる酵素は、それらの技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、イムノアッセイ又は核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイでアナライトを検出する際に使用されるそれぞれ抗体若しくはその断片、又は核酸プローブと物理的、例えば化学的に又は組換えにより結合する。その後、同様に公知の方法に従い、リポーター標識抗体又は核酸プローブは分析するサンプルと合わされて検出対象の、サンプルに存在するかもしれない分子（例えば、イムノアッセイの場合は抗原若しくは抗抗原抗体、又は核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイの場合は標的核酸）と結合し、次にアナライトと結合しなかったリポーター標識抗体又は核酸プローブは、もしあるとすれば結合したものから分離される。リポーターは本発明に従ってリポーターのアッセイの間、物理的に標識抗体又はプローブと結合を維持することができるか、或いは再び公知の方法により、本発明に従ってリポーターのアッセイの前に抗体又は核酸プローブから分離することができる。発光反応の媒介となる酵素をリポーター又は標識として使用することができるイムノアッセイ及び核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイは、生物学、バイオテクノロジー及び医学の分野で多くの実用上の、また研究上の用途、例えば病原体の検出、遺伝子欠損の検出、疾患診断などを有する。
【０１１１】
本発明の方法に従ってリポーターの存在につきアッセイすることができる他の種類のサンプルは、リポーターの発現がプロモーター、又はリポーターをコードするＤＮＡセグメントと結合した他の転写調節因子による転写の活性化に応じて、或いはリポーターをコードしているＲＮＡの翻訳の結果として起こる細胞の抽出物である。そのような細胞において、発光リポーターは、他の酵素、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが転写又は転写の調節などの遺伝的事象をモニターするために用いられる方法と同様に使用される。そのような発光リポーターの使用は分子生物学及び生物医学で有益なものであり、例えば特定のプロモーター又は他の転写調節因子における転写活性化又は転写抑制活性に基づく治療活性について化合物をスクリーニングする際に使用することができる。
【０１１２】
例えば、二重アッセイでは、２つの異なる酵素、例えば蛍ルシフェラーゼ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを含むサンプル、又は異なる酵素媒介発光反応によって検出することができる異なる分子のいかなる組合せ、例えばプロテアーゼとＡＴＰを含むサンプルがアッセイされる。サンプルとしては、非細胞性サンプル、例えば精製酵素を有するサンプル、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳反応又はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応、細胞性（無傷の）サンプル、原核又は真核サンプル、或いは細胞溶解物がある。第１に、前記２つの酵素媒介反応の１つのための活性化（開始）剤をマルチウェルプレートウェルのウェルなどの容器に入ったサンプルに加え、得られた発光を測定する。特定の消光及び活性化試薬を次にウェルに加えて第１の酵素媒介反応を選択的に消光し、同時に第２の酵素媒介反応を活性化する。代わりに、選択的な消光試薬及び第２の酵素媒介発光反応に特異的な第２の光活性化試薬を、サンプルに順番に加えることができる。第２の反応からの発光を次に第１のものと同様にして測定する。任意選択に、サンプルからの発光は次に第２の消光試薬、例えば非選択的消光試薬又は第２の酵素媒介反応のための選択的消光試薬を加えることによって消光してもよい。このように、本発明は単一のサンプル内で２つの異なるパラメータを測定することができる多重発光アッセイを提供する。上記の如く、酵素媒介反応の１つは内部標準の働きをし、他の酵素媒介反応は遺伝マーカー又は他の実験変数として機能することができ、或いは、各々の反応では異なる実験変数を測定することができる。更に、当業者が理解するように、アッセイ法である本発明の方法は、通常適当な対照又は標準を用いて実施され（例えば、分析するサンプルは酵素を含まない溶液及び既知の濃度の酵素を含む溶液と並行して分析される）、適当な標準を使用した場合、この方法は測定用サンプル（即ち、分析サンプル）内の検出対象の分子の濃度を定量するように調整することができる。
【０１１３】
例えば、甲虫（Ｗｏｏｄ、１９９１）及びＲｅｎｉｌｌａ（Ｍａｔｈｅｗｓ他、１９７７）のルシフェラーゼの活性を定量化するために従来使用されているアッセイ化学は不適合であった。本発明はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイと蛍又はコメツキムシルシフェラーゼ反応のそれとを混合した革新的な化学処方を具現化することにより、新規二重ルシフェラーゼリポーターアッセイを作出する。
【０１１４】
水溶液である本発明の組成物、例えば本発明の方法で使用される組成物では、基質は一般的に約０．０１μＭから約２ｍＭの濃度で存在する。蛍ルシフェラーゼでは、ルシフェリンは最大の光アウトプットのために最適化された試薬中では約０．４７ｍＭで、また安定したシグナルのために最適化された試薬中では約１ｍＭで飽和する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼでは、セレンテラジンは最大の光アウトプットのために最適化された試薬中では約２μＭで、また安定したシグナルのために最適化された試薬中では約６０から１００μＭで飽和する。ＡＴＰが存在する組成物中では、ＡＴＰ濃度は約０．０１ｍＭから約５ｍＭまで変動し、好ましくは約０．５ｍＭである。そのような水溶液組成物中にＣｏＡが存在する場合は、ＣｏＡの濃度は約０．００１ｍＭから約５ｍＭまで変動し、好ましくは約０．２ｍＭから１ｍＭである。同様に、存在するＤＴＴの濃度は約２０ｍＭから約２００ｍＭであり、好ましくは約２０から４０ｍＭである。
【０１１５】
連続的なＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及び甲虫ルシフェラーゼアッセイでは、リポーターＮｏ．１、つまりＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介発光反応の１００％制御値は、消光試薬の添加前の反応からの発光を定量化することによって測定される。リポーターＮｏ．２、例えば蛍ルシフェラーゼ媒介発光反応の１００％制御値は、消光試薬及びリポーターＮｏ．１の基質を含まない反応からの発光を定量化することによって測定される。
【０１１６】
表１〜２及び図４は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介反応又はワサビペルオキシダーゼ媒介反応（リポーターＮｏ．１）を定量化し、次に試薬の添加によって消光する状況に適用した本発明を示す。より詳細には、表１は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ媒介反応（リポーターＮｏ．１）が定量化され、次に基質類似体、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテル、隔離剤、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）、黄色化合物、例えばベルベリンヘミサルフェート、又はその組合せを含む組成物の添加によって選択的に消光する状況に適用された本発明を示す。それらの同じ試薬は、蛍ルシフェラーゼ（リポーターＮｏ．２、図１〜３を参照）の発光反応に影響を及ぼさない。これらの例は、二重発光リポーターアッセイのユニークな、統合した性質を納得させるものである。両方の発光リポーター酵素の活性は、同じ機器を使用して単一の試験管に入った同じサンプル内から迅速に定量化することができる（表１）。このように、二重アッセイの統合された化学により、個々の発光シグナルを単一のサンプル内で発現した２つの異なる発光リポーター酵素の反応と区別する能力が提供される。
【０１１７】
本明細書で同じく記載されているように、白いルミノメータープレート及び発光酵素を含まない発光反応混合物に存在する１つ又は複数のアナライトはバックグラウンドリン光をもたらす。このリン光を消光するために、その存在下で発光反応によって生じた光が透過し、即ち検出され、しかし、リン光によって生じた光は透過しないように着色化合物が選択される。このように、赤色コメツキムシルシフェラーゼによって生じた赤色光のためには、少なくとも１つの赤色化合物が使用される。緑色コメツキムシルシフェラーゼによって生じた緑色光のためには、少なくとも１つの緑色化合物が、またＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによって生じた青色光のためには少なくとも１つの青色化合物が使用される。前記１つ又は複数の着色化合物は、発光反応を媒介する酵素を有するかそのことが疑われるサンプルの添加の前に反応混合物に加えてもよく、反応混合物へのサンプルの添加の前にサンプルに加えてもよく、又は反応混合物とサンプルを合わせるときに加えてもよい。
【０１１８】
本発明を、以下の非限定的な実施例により更に説明する。
【実施例１】
【０１１９】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの選択的消光
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応を、選択的に消光されるその能力に関して評価した。３つのクラスの化合物、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質類似体、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテル、隔離剤、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９などの界面活性剤、及び／又は黄色い着色化合物、例えばベルベリンヘミサルフェートを試験した。
【０１２０】
物質及び方法
ホタルルシフェラーゼ発光反応に対する、セレンテラジンｈｈメチルエーテルの影響を試験するために、ルシフェラーゼ試薬（２７０μＭの補酵素Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５３０μＭのＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、２０ｍＭのトリシンｐＨ７．８（Ｆｉｓｈｅｒ）、１ｍＭの炭酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭのＥＴＤＡ（Ｓｉｇｍａ）、２．７ｍＭの硫酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ）、及び３３ｍＭのジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ））を、さまざまな濃度の甲虫ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、シフェラーゼ飽和に必要とされる濃度（９４０μＭ、４７０μＭ、２３５μＭ及び１１７．５μＭ、飽和は約４７０μＭで起こる）より上及び下で調製した。セレンテラジンｈｈメチルエーテル（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＭＳＯに溶かし、０μＭ、２０μＭ、５０μＭ及び１００μＭで、異なるルシフェラーゼ試薬に加えた。ホタルルシフェラーゼからの発光を、２０μｌのホタルルシフェラーゼ（５×１０−１４モル／反応）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１×細胞培養物溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に溶かしたものを、１００μｌのルシフェラーゼ試薬に加えることによって測定した。セレンテラジンｈｈメチルエーテルの不在下で統一した値に、発光を標準化した。
【０１２１】
ホタルルシフェラーゼ発光反応に対する、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９の影響を試験するために、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９（Ｓｉｇｍａ）を試薬に滴定した。２０μｌのホタルルシフェラーゼ（２．５×１０−１４モル／反応）を、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４及び１ｍｇ／ｍｌゼラチンに溶かしたものを、１００μｌの試薬に加えた後に、発光を統一した。界面活性剤なしで統一した値に、発光を標準化した。
【０１２２】
ホタルルシフェラーゼ発光反応に対する、ベルベリンヘミサルフェートの影響を試験するために、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。ベルベリンヘミサルフェートをＤＭＳＯに溶かし、さまざまな濃度の試薬に滴定した。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、約２．２×１０−１５モル／反応に、ホタルルシフェラーゼを希釈した。１００μｌのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬と１００μｌの希釈酵素を組み合わせることによって、発光反応を開始させた。界面活性剤なしで統一した値に、発光を標準化した。
【０１２３】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応に対する、セレンテラジンｈｈメチルエーテル、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９及び／又はベルベリンヘミサルフェートの影響を試験するために、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。ルシフェラーゼアッセイバッファー（ｐｔ．Ｅ１５２、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９、２００μＭのセレンテラジンｈｈメチルエーテル、１ｍＭのベルベリンヘミサルフェート、又はこの３つの組合せと組み合わせた。それぞれのバッファーを、ルシフェラーゼアッセイ基質（ｐｔ．Ｅ１５１、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のバイアルに加えて、ルシフェラーゼアッセイ試薬（ＬＡＲ）及び消光剤を作製した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（５×１０−１４モル／反応）を、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４７１）及び１ｍｇ／ｍｌゼラチン中で調製した。２０μｌの酵素溶液を１００μｌのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬に加えることによって、発光を開始させ、測定した。１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を後に加えることによって、Ｒｅｎｉｌｌａ発光を停止させ、残りの発光を測定することができた。残りのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光で最初のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光を割った商として、消光の倍数を計算した。
【０１２４】
結果
それぞれの試験した選択的消光試薬は、ホタルルシフェラーゼ発光反応に対して、ほとんど有害な影響が無いことが示された（図１〜図３）。これらの同じ試薬を、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ仲介型発光を停止させるそれらの能力に関して、次いで試験した（表１）。高濃度のセレンテラジンｈｈメチルエーテルに関しては、いくつかの物質、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９（Ｓｉｇｍａ）などの隔離剤を加えることが、溶解度を維持し且つ／或いは増大させるために必要であった。さらに、セレンテラジンｈｈメチルエーテルによる消光は、隔離剤の存在によって増大した。
【０１２５】
黄色い色素を、ホタル反応からの光の生成に影響を与えずに、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応からの青い光を吸収する、それらの傾向に関して調べた。試験した黄色い色素の中で、ジピリダモール（データ示さず）及びベルベリンヘミサルフェートは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応の、選択的消光試薬であることが示された（例えば、表１及び図３を参照）。例えば、１ｍＭにおいてジピリダモールは、約３５倍Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応を停止させることが見出され、１ｍＭにおいてベルベリンヘミサルフェートは、約４６倍〜８９倍反応を停止させることが見出された。
【０１２６】
選択的消光物質が、ホタルルシフェラーゼ発光反応に有害に影響を与えることはなかったが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光反応に対する、これらの個別の影響又は組合せの影響は劇的であった。
【表１】
【実施例２】
【０１２７】
連続的なルシフェラーゼ測定用の、選択的消光試薬の使用
物質及び方法
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、製造者の指示書に従い調製した。ルシフェラーゼアッセイバッファー（ｐｔ．Ｅ１５２、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、１％のＴｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９、２００μＭのセレンテラジンｈｈメチルエーテル、及び１ｍＭのベルベリンヘミサルフェートと組み合わせた。ルシフェラーゼアッセイバッファーを、ルシフェラーゼアッセイ基質（ｐｔ．Ｅ１５１、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に加えて、ルシフェラーゼアッセイ試薬及び消光剤を作製した。アッセイ用の酵素ストックを、１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４７１）及び１ｍｇ／ｍｌゼラチン中で調製した（酵素安定化用）。それぞれ約５×１０−１２及び５×１０−１４モル／反応の最終濃度で、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼのストック、並びに前述のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとホタルルシフェラーゼのストックの５０：５０混合物を調製した。２０μｌのそれぞれの酵素ストックを１００μｌのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼアッセイ試薬に加え、発光を統一することによって、発光を生成させた。１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を後に加えることによって、Ｒｅｎｉｌｌａ発光を停止させ、ホタル発光を測定することができた。次いでホタルルシフェラーゼ発光又は残りのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発光を、それぞれの酵素サンプルに関して測定した。ホタルルシフェラーゼとＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの５０：５０混合物を含む酵素サンプルについての発光値を２倍にして、酵素濃度を標準化した。
【表２】
【０１２８】
結果
表２中のデータから、第二の酵素、ホタルルシフェラーゼが、３つの消光試薬の組合せを使用して、第一の酵素反応、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ反応の後に、確実に測定することができることが示される。したがって、改変型ルシフェラーゼアッセイ試薬を使用して、Ｒｅｎｉｌｌａ発光反応を停止させることによって、Ｒｅｎｉｌｌａ及びホタル酵素を同じサンプルから正確に測定することができる。
【実施例３】
【０１２９】
着色化合物とホースラディシュペルオキシダーゼの発光反応からの光の消光
物質及び方法
ＫＰＯ４、ｐＨ６．５中で調製した、０．０４４ｍｇ／ｍｌホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の２０μｌを、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３、２μＭのＨ２Ｏ２＋／−１００μＭのベルベリンヘミサルフェートの１００μｌに加えた。対照反応物は、ベルベリンヘミサルフェートを含んでいなかった。１００μｌの１０ｍＭのＬｕｍｉｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を５５ｍＭのＮａＯＨに溶かしたものを次いで加えて、化学発光反応を開始させ、発光はルミノメーターで測定した。反応開始後のさまざまな時間で、発光を捉えた。
【０１３０】
結果
表１において明らかであるように、ベルベリンヘミサルフェート（黄色い化合物）を使用して、（青い発光を放射する）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼからの、光の発生を停止させることができる。ＨＲＰ仲介型反応も、青い光を発生させることができる。図４は、黄色い化合物を使用して、ＨＲＰ系のレポーター系からの光を停止させることができることを示す。例えば、ベルベリンヘミサルフェートは、５００倍を超えてホースラディシュペルオキシダーゼ依存性の化学発光を停止させた。したがって、多数のレポータータンパク質の一連の発光の測定値は、レポーターの１つがＨＲＰである同じウェルから測定することができる。
【実施例４】
【０１３１】
プレート又はアナライトからのリン光の停止
発光反応用の白色ルミノメータープレートを使用すると、バックグラウンドリン光が生じることが多い。リン光では、原子又は分子によって放射される光が、励起源を除去した後で持続する。リン光は蛍光と類似しているが、種がそこから初期状態に移行することはできない準安定状態へと励起される。熱エネルギーにより電子がそこから下方遷移することができる状態になると、放射が起こり、目に見えるバンドにおいて経時的なそのエネルギーの段階的放出がもたらされる。したがって、リン光は温度依存性である。このリン光を停止させ、そうすることによりシグナル／バックグラウンド比を増大させるために、特定のルシフェラーゼによって生成する光が効果的に伝播するが、リン光からの光は伝播しないように、着色化合物を選択した。
【０１３２】
物質及び方法
アマランス及びベンゾプルプリン４Ｂは赤い化合物であり、赤いコメツキムシのルシフェラーゼは赤い光を放射する。蛍光増白剤２８は黄色い化合物であり、ホタルルシフェラーゼは黄緑色の光を放射する。
【０１３３】
アマランス（Ａｌｄｒｉｃｈ、１２０５６１）、ベンゾプルプリン４Ｂ（Ａｌｄｒｉｃｈ番号２２８８２）、及び蛍光増白剤２８（Ａｌｄｒｉｃｈ４７５３００）のストックを、１００μＭでＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中において調製した。ルミノメータープレート（９６ウェル）は、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した１種のルミノメーターチューブ（直径１２ｍｍ）に適合するように、ルミノメータープレートを粉々にした。正常な蛍光下において研究室内で、すべての実験を行った。
【０１３４】
この実験は、着色化合物又はＤＭＳＯを加える前後に、シグナル／バックグラウンド比を測定した。発光の測定値を、それぞれの実験で空の発光チューブから得て、バックグラウンド比を定量化した。白色ルミノメータープレートの破片、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の指示書に従い調製した１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）試薬、及び１００μｌのＧｌｏ溶解バッファー（Ｐｒｏｒｎｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を発光チューブ中に置き、発光を再度測定した。この測定によって、市販のホタルルシフェラーゼ試薬中において、ルミノメータープレートから放射されたリン光を捉えた。２μｌのＤＭＳＯ、又はＤＭＳＯ中の色素の１つを次いでチューブに加え、サンプルを混合し、発光を３回測定した。この測定は、現時点で着色されていた試薬又はＤＭＳＯ担体を含む試薬によって、放射された発光の量を捉えた。最後に、２μｌのルシフェラーゼをチューブに加え、サンプルを混合し、発光を最後に測定した。すべての発光測定値は、２秒の遅延後の１０秒間の統一値であった。
【０１３５】
ホタルルシフェラーゼは、１ｍｇ／ｍｌのブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含むＧｌｏ溶解バッファー中に１．４×１０−５ｍｇ／ｍｌの濃度の、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）ルシフェラーゼであった。赤いコメツキムシのルシフェラーゼは、Ｇｌｏ溶解バッファーを用いて作製した細胞溶解物から、赤いコメツキムシのルシフェラーゼで一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞から得た。このサンプル中の絶対的なルシフェラーゼ濃度は知られていないが、シグナル／バックグラウンドの改善は、バックグラウンドを超える発光を発生する任意の量のルシフェラーゼで評価することができる。
【０１３６】
ルシフェラーゼサンプルからのバックグラウンドを引いた発光を、試薬＋プレート破片サンプルのバックグラウンドを引いた発光で割って、リン光のシグナル／バックグラウンド比を計算した。ルシフェラーゼサンプルからのバックグラウンドを引いた発光を、ＤＭＳＯ−又は色素を加えたサンプルのバックグラウンドを引いた発光で割って、ＤＭＳＯ又は色素サンプルのシグナル／バックグラウンド比を計算した。したがってシグナル／バックグラウンドの改善値は、リン光の比で割ったＤＭＳＯ又は色素の存在下での比であり、次いで１を引き、パーセントとして表す。
【表３】
【０１３７】
結果
表３中に示すように、赤いコメツキムシのルシフェラーゼ仲介反応の赤い化合物、及びホタルルシフェラーゼ仲介反応の黄色い化合物などの、着色化合物は、それぞれの反応に加えると、シグナル／バックグラウンド比を改善した。
【０１３８】
表３中の負の数は、色素を含むサンプルが、チューブ単独で測定したバックグラウンドより、低い発光を有することを示す。したがって、シグナル／バックグラウンドの改善は、これらのサンプルに関しては計算することができない。何故なら、その値は無限だからである。
【０１３９】
したがって着色化合物は、均質な系中では、発光を測定する前に、細胞に加える試薬中に存在する可能性がある。不均質な系に関しては、着色化合物は、細胞に加える溶解試薬中に存在する可能性があり、その後反応用の試薬を加え、次いで発光を測定する。或いは、溶解試薬を細胞に加えることができ、その後、着色化合物を含む反応用の試薬を加え、次いで発光を測定する。
【０１４０】
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【０１４１】
すべての刊行物、特許及び特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。前述の本明細書中において、そのいくつかの好ましい実施形態に関して本発明を説明し、多くの詳細を例示の目的で述べてきたが、本発明には他の実施形態が可能であり、本発明の基本原則から逸脱せずに、本明細書に記載した詳細のいくつかを相当に変えることができることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】蛍ルシフェラーゼ発光がＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの基質類似体、例えばセレンテラジンｈｈメチルエーテルに影響を受けないことを示す図である。
【図２】蛍ルシフェラーゼ発光が本発明の隔離剤の存在下で増加することを示す図である。
【図３】蛍ルシフェラーゼ発光が黄色化合物、例えばベルベリンヘミサルフェートに影響を受けないことを示す図である。
【図４】黄色化合物、色素ベルベリンヘミサルフェートがワサビペルオキシダーゼの化学発光を消失させることを示す図である。
【図５Ａ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｂ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｃ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｄ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｅ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【図５Ｆ】選択した界面活性剤の性質を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの甲虫ルシフェラーゼ媒介反応以外の第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記第１の酵素媒介発光反応を選択的に消光し、前記第１の酵素媒介発光反応とは別の第２の酵素媒介発光反応を開始することができる組成物であって、前記第１の酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの選択的消光試薬を含む組成物を導入するステップと、
（ｃ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項２】
（ａ）少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に選択的消光試薬である着色化合物を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させるステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項３】
（ａ）少なくとも１つの甲虫ルシフェラーゼ媒介反応以外の第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に少なくとも１つの選択的消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させるステップと、
（ｃ）前記第１の酵素媒介発光反応とは異なる第２の酵素媒介発光反応を開始することができる組成物を導入するステップと、
（ｄ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項４】
前記組成物が前記第１の酵素媒介発光反応とは異なる第２の酵素媒介発光反応を開始することができる試薬を更に含み、
（ｃ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生する発光エネルギーを検出又は測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの選択的消光試薬が前記第１の酵素の基質類似体阻害剤である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの選択的消光試薬が隔離剤である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記隔離剤は、第１の酵素の基質を隔離し、第２の酵素の基質を隔離しない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記隔離剤は非イオン性界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記隔離剤はクラウンエーテル、グリコール又はシクロデキストランである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの選択的消光試薬は着色化合物である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１１】
前記着色化合物は、青色光、緑色光又は赤色光を消光する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）において、ルシフェラーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１３】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）において、前記第１の酵素媒介反応は、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、保護されたセレンテラジンである基質類似体阻害剤、黄色の化合物又はその組合せにより消光する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記着色化合物は、青色光、緑色光又は赤色光を消光する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）においてルシフェラーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項２又は４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の酵素媒介発光反応は花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の酵素媒介発光反応は、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の酵素媒介発光反応はルシフェラーゼによって媒介される、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の酵素媒介発光反応はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（北米の蛍）ルシフェラーゼ、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｏｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓルシフェラーゼ又はそれらの機能同等物によって媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素媒介発光反応の１つは、基質、酵素又はコファクターの存在又は量を検出する、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）において、ペルオキシダーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項２６】
ワサビペルオキシダーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）においてホスファターゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項２８】
アルカリホスファターゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の酵素媒介発光反応はペルオキシダーゼ媒介発光反応である、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の酵素媒介発光反応はワサビペルオキシダーゼ媒介発光反応である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の酵素媒介発光反応はホスファターゼ媒介発光反応である、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の酵素媒介発光反応はアルカリホスファターゼ媒介発光反応である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）において、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応が検出又は測定され、前記第２の酵素媒介発光反応は第２の異なるルシフェラーゼ媒介発光反応である、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）において、前記第１の酵素媒介発光反応は花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介され、前記第２の酵素媒介発光反応は甲虫ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の酵素媒介発光反応はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ又はＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓのルシフェラーゼによって媒介される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）において、前記第１の酵素媒介発光反応はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼによって媒介される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応は、基質、酵素又はコファクターの存在又は量を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項３８】
更に、
前記第２の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定した後に、前記第２の酵素媒介発光反応を消光させることができる少なくとも１つの第２の消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第２の酵素媒介発光反応を消光させるステップを含む、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの第２の消光試薬は前記第２の酵素媒介反応を選択的に消光させることができる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記選択的消光試薬は前記第１の酵素媒介発光反応を少なくとも３５倍消光する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物に２つ以上の選択的消光試薬が存在する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項４２】
前記選択的消光試薬は、前記第１の酵素媒介発光反応を少なくとも１００倍消光する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質であって、甲虫ルシフェラーゼの基質以外の基質と、
前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
前記発光反応の媒介となる酵素の基質類似体阻害剤である少なくとも１つの選択的な消光試薬、着色化合物、又はトリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤を含む組成物と、
前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
を含む酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項４４】
酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質と、
前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
花虫綱ルシフェラーゼに対する少なくとも１つの選択的消光試薬を含む組成物と、
前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
を含む酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項４５】
前記選択的消光試薬は保護されたセレンテラジンである基質類似体阻害剤である、請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記選択的消光試薬はクラウンエーテル、グリコール又はシクロデキストランである、請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４７】
前記選択的消光試薬はトリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４８】
前記選択的消光試薬は黄色化合物である、請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４９】
第１の酵素媒介発光反応で検出する分子のための第１の機能的酵素基質と、
前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
前記第１の発光反応を媒介する酵素の少なくとも１つの選択的消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質を含み、前記第１の発光反応を媒介する酵素は甲虫ルシフェラーゼではない消光及び活性化組成物と、
前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
含む二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項５０】
第１の酵素媒介発光反応で検出する分子のための第１の機能的酵素基質であって、甲虫ルシフェラーゼの基質以外の基質と、
前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
少なくとも１つの選択的消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質を含む消光及び活性化組成物と、
前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
を含む二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項５１】
前記第１の機能的酵素基質及び前記第２の異なる機能的酵素基質はルシフェラーゼ基質である、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記第１の酵素媒介反応は、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、保護されたセレンテラジンである基質類似体阻害剤、黄色の化合物又はその組合せを含む、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記隔離剤はクラウンエーテル、グリコール又はシクロデキストランである、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５４】
更に：
前記第２の異なる酵素媒介反応からの光子放出を消光させることができる第２の消光試薬；及び
前記第２の消光試薬がその中に入っている適当な第３の容器を含む、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５５】
（ａ）少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、黄色の化合物又はその組合せを含む、少なくとも１つの消光試薬を導入することにより、前記第１の酵素媒介反応からの光子放出を消光するステップと、
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項５６】
（ａ）少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、着色化合物又はその組合せを含む少なくとも１つの消光試薬を含む組成物を導入することにより、前記第１の酵素媒介発光反応を消光するステップとステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項５７】
酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減少抑制するための方法において、
（ａ）発光反応を媒介する酵素を含むサンプルと、着色化合物を含む前記酵素のための反応混合物であって、前記酵素を含まず前記化合物の色が前記発光反応で発生する光と実質的に同じ反応である混合物とを接触させるステップと、
（ｂ）発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、方法。
【請求項５８】
酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減少若しくは抑制するための方法において、
（ａ）発光反応を媒介する酵素及びその化合物の色が前記発光反応で発生する光と実質的に同じ着色化合物を含むサンプルを、前記酵素の反応混合物と接触させるステップと、
（ｂ）発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、方法。
【請求項５９】
前記反応混合物の発光エネルギーを前記サンプルと前記混合物を接触させる前に検出又は測定するステップを更に含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物は赤色、黄色、青色又は緑色の化合物である、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記酵素は花虫綱ルシフェラーゼである、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記酵素は甲虫ルシフェラーゼである、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６３】
酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質と、
前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
少なくとも１つの着色化合物と、
前記少なくとも１つの着色化合物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書とを含み、
前記少なくとも１つの化合物の色が前記酵素媒介発光反応によって発生する光と実質的に同じである
酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項６４】
少なくとも１つの着色化合物及び酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質と、
前記少なくとも１つの着色化合物及び前記少なくとも１つの機能的酵素基質が入っている適当な第１の容器と、
取扱説明書とを含み、
前記少なくとも１つの化合物の色は前記酵素媒介発光反応によって発生する光と実質的に同じである
酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項６５】
発光反応を媒介する酵素の少なくとも１つの選択的消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応により検出する分子のための機能的酵素基質を含み、前記第１の発光反応を媒介する酵素は甲虫ルシフェラーゼではない消光及び活性化組成物と、
前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な容器と、
取扱説明書と
を含む酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項６６】
前記第２の酵素媒介発光反応は甲虫ルシフェラーゼ媒介発光反応である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記第１の酵素媒介発光反応は花虫綱ルシフェラーゼ媒介発光反応である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６８】
前記選択的消光試薬は、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、着色化合物又はその組合せである、請求項６５に記載のキット。
【請求項６９】
（ａ）少なくとも１つの甲虫ルシフェラーゼ媒介反応以外の第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記第１の酵素媒介発光反応を選択的に消光し、前記第１の酵素媒介発光反応とは別の第２の酵素媒介発光反応を開始することができる組成物であって、前記第１の酵素のための基質類似体阻害剤である少なくとも１つの選択的消光試薬、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、又は着色化合物を含む組成物を導入するステップと、
（ｃ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生する発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの甲虫ルシフェラーゼ媒介反応以外の第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記第１の酵素媒介発光反応を選択的に消光し、前記第１の酵素媒介発光反応とは別の第２の酵素媒介発光反応を開始することができる組成物であって、前記第１の酵素媒介発光反応のための少なくとも１つの選択的消光試薬を含む組成物を導入するステップと、
（ｃ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項２】
（ａ）少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に選択的消光試薬である着色化合物を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させるステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項３】
（ａ）少なくとも１つの甲虫ルシフェラーゼ媒介反応以外の第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に少なくとも１つの選択的消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第１の酵素媒介発光反応からの光子放出を消失させるステップと、
（ｃ）前記第１の酵素媒介発光反応とは異なる第２の酵素媒介発光反応を開始することができる組成物を導入するステップと、
（ｄ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項４】
前記組成物が前記第１の酵素媒介発光反応とは異なる第２の酵素媒介発光反応を開始することができる試薬を更に含み、
（ｃ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生する発光エネルギーを検出又は測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの選択的消光試薬が前記第１の酵素の基質類似体阻害剤である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの選択的消光試薬が隔離剤である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記隔離剤は、第１の酵素の基質を隔離し、第２の酵素の基質を隔離しない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記隔離剤は非イオン性界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記隔離剤はクラウンエーテル、グリコール又はシクロデキストランである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの選択的消光試薬は着色化合物である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１１】
前記着色化合物は、青色光、緑色光又は赤色光を消光する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）において、ルシフェラーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１３】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）において、前記第１の酵素媒介反応は、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、保護されたセレンテラジンである基質類似体阻害剤、黄色の化合物又はその組合せにより消光する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記着色化合物は、青色光、緑色光又は赤色光を消光する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）においてルシフェラーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項２又は４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ルシフェラーゼ媒介発光反応は、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の酵素媒介発光反応は花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の酵素媒介発光反応は、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ウミシイタケ）ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の酵素媒介発光反応はルシフェラーゼによって媒介される、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の酵素媒介発光反応はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（北米の蛍）ルシフェラーゼ、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｏｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓルシフェラーゼ又はそれらの機能同等物によって媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記酵素媒介発光反応の１つは、基質、酵素又はコファクターの存在又は量を検出する、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）において、ペルオキシダーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項２６】
ワサビペルオキシダーゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）においてホスファターゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項１、２、３又は４に記載の方法。
【請求項２８】
アルカリホスファターゼ媒介発光反応が検出又は測定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の酵素媒介発光反応はペルオキシダーゼ媒介発光反応である、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の酵素媒介発光反応はワサビペルオキシダーゼ媒介発光反応である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の酵素媒介発光反応はホスファターゼ媒介発光反応である、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の酵素媒介発光反応はアルカリホスファターゼ媒介発光反応である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）において、第１のルシフェラーゼ媒介発光反応が検出又は測定され、前記第２の酵素媒介発光反応は第２の異なるルシフェラーゼ媒介発光反応である、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）において、前記第１の酵素媒介発光反応は花虫綱ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介され、前記第２の酵素媒介発光反応は甲虫ルシフェラーゼ又はその機能同等物によって媒介される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の酵素媒介発光反応はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ又はＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓのルシフェラーゼによって媒介される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）において、前記第１の酵素媒介発光反応はＲｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼによって媒介される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応は、基質、酵素又はコファクターの存在又は量を検出する、請求項２に記載の方法。
【請求項３８】
更に、
前記第２の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定した後に、前記第２の酵素媒介発光反応を消光させることができる少なくとも１つの第２の消光試薬を含む組成物を導入することによって前記第２の酵素媒介発光反応を消光させるステップを含む、請求項１、３又は４に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの第２の消光試薬は前記第２の酵素媒介反応を選択的に消光させることができる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記選択的消光試薬は前記第１の酵素媒介発光反応を少なくとも３５倍消光する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物に２つ以上の選択的消光試薬が存在する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項４２】
前記選択的消光試薬は、前記第１の酵素媒介発光反応を少なくとも１００倍消光する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質であって、甲虫ルシフェラーゼの基質以外の基質と、
前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
前記発光反応の媒介となる酵素の基質類似体阻害剤である少なくとも１つの選択的な消光試薬、着色化合物、又はトリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤を含む組成物と、
前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
を含む酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項４４】
酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質と、
前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
花虫綱ルシフェラーゼに対する少なくとも１つの選択的消光試薬を含む組成物と、
前記組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
を含む酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項４５】
前記選択的消光試薬は保護されたセレンテラジンである基質類似体阻害剤である、請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記選択的消光試薬はクラウンエーテル、グリコール又はシクロデキストランである、請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４７】
前記選択的消光試薬はトリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４８】
前記選択的消光試薬は黄色化合物である、請求項４３又は４４に記載のキット。
【請求項４９】
第１の酵素媒介発光反応で検出する分子のための第１の機能的酵素基質と、
前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
前記第１の発光反応を媒介する酵素の少なくとも１つの選択的消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質を含み、前記第１の発光反応を媒介する酵素は甲虫ルシフェラーゼではない消光及び活性化組成物と、
前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
含む二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項５０】
第１の酵素媒介発光反応で検出する分子のための第１の機能的酵素基質であって、甲虫ルシフェラーゼの基質以外の基質と、
前記第１の機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
少なくとも１つの選択的消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応に対応する第２の異なる機能的酵素基質を含む消光及び活性化組成物と、
前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書と
を含む二重リポーター酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項５１】
前記第１の機能的酵素基質及び前記第２の異なる機能的酵素基質はルシフェラーゼ基質である、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記第１の酵素媒介反応は、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、保護されたセレンテラジンである基質類似体阻害剤、黄色の化合物又はその組合せを含む、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記隔離剤はクラウンエーテル、グリコール又はシクロデキストランである、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５４】
更に：
前記第２の異なる酵素媒介反応からの光子放出を消光させることができる第２の消光試薬；及び
前記第２の消光試薬がその中に入っている適当な第３の容器を含む、請求項４９又は５０に記載のキット。
【請求項５５】
（ａ）少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、黄色の化合物又はその組合せを含む、少なくとも１つの消光試薬を導入することにより、前記第１の酵素媒介反応からの光子放出を消光するステップと、
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項５６】
（ａ）少なくとも１つの第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記発光反応に、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、着色化合物又はその組合せを含む少なくとも１つの消光試薬を含む組成物を導入することにより、前記第１の酵素媒介発光反応を消光するステップとステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【請求項５７】
酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減少抑制するための方法において、
（ａ）発光反応を媒介する酵素を含むサンプルと、着色化合物を含む前記酵素のための反応混合物であって、前記酵素を含まず前記化合物の色が前記発光反応で発生する光と実質的に同じ反応である混合物とを接触させるステップと、
（ｂ）発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、方法。
【請求項５８】
酵素媒介発光反応でのアナライト非依存性又はアナライト依存性のリン光を減少若しくは抑制するための方法において、
（ａ）発光反応を媒介する酵素及びその化合物の色が前記発光反応で発生する光と実質的に同じ着色化合物を含むサンプルを、前記酵素の反応混合物と接触させるステップと、
（ｂ）発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、方法。
【請求項５９】
前記反応混合物の発光エネルギーを前記サンプルと前記混合物を接触させる前に検出又は測定するステップを更に含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記化合物は赤色、黄色、青色又は緑色の化合物である、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記酵素は花虫綱ルシフェラーゼである、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記酵素は甲虫ルシフェラーゼである、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項６３】
酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質と、
前記少なくとも１つの機能的酵素基質がその中に入っている適当な第１の容器と、
少なくとも１つの着色化合物と、
前記少なくとも１つの着色化合物がその中に入っている適当な第２の容器と、
取扱説明書とを含み、
前記少なくとも１つの化合物の色が前記酵素媒介発光反応によって発生する光と実質的に同じである
酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項６４】
少なくとも１つの着色化合物及び酵素媒介発光反応で検出する分子のための少なくとも１つの機能的酵素基質と、
前記少なくとも１つの着色化合物及び前記少なくとも１つの機能的酵素基質が入っている適当な第１の容器と、
取扱説明書とを含み、
前記少なくとも１つの化合物の色は前記酵素媒介発光反応によって発生する光と実質的に同じである
酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項６５】
発光反応を媒介する酵素の少なくとも１つの選択的消光試薬及び第２の異なる酵素媒介発光反応により検出する分子のための機能的酵素基質を含み、前記第１の発光反応を媒介する酵素は甲虫ルシフェラーゼではない消光及び活性化組成物と、
前記消光及び活性化組成物がその中に入っている適当な容器と、
取扱説明書と
を含む酵素媒介発光反応アッセイキット。
【請求項６６】
前記第２の酵素媒介発光反応は甲虫ルシフェラーゼ媒介発光反応である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記第１の酵素媒介発光反応は花虫綱ルシフェラーゼ媒介発光反応である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６８】
前記選択的消光試薬は、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、花虫綱ルシフェラーゼの基質類似体阻害剤、着色化合物又はその組合せである、請求項６５に記載のキット。
【請求項６９】
（ａ）少なくとも１つの甲虫ルシフェラーゼ媒介反応以外の第１の酵素媒介発光反応によって発生した発光エネルギーを検出又は測定するステップと、
（ｂ）前記第１の酵素媒介発光反応を選択的に消光し、前記第１の酵素媒介発光反応とは別の第２の酵素媒介発光反応を開始することができる組成物であって、前記第１の酵素のための基質類似体阻害剤である少なくとも１つの選択的消光試薬、トリトン（登録商標）Ｘ−１００及びトゥイーン（登録商標）２０以外の非イオン性界面活性剤、又は着色化合物を含む組成物を導入するステップと、
（ｃ）前記第２の酵素媒介発光反応によって発生する発光エネルギーを検出又は測定するステップと
を含む、酵素媒介発光反応のアッセイ方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【公表番号】特表２００６−５１７４１３（Ｐ２００６−５１７４１３Ａ）
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０３５１３（Ｐ２００６−５０３５１３）
【出願日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００４０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２２９９
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５９３０８９１４９）プロメガ コーポレイション (57)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００４０７５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７２２９９
【国際公開日】平成１６年８月２６日（２００４．８．２６）
【出願人】（５９３０８９１４９）プロメガ コーポレイション (57)
【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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