光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法
【課題】医農薬原料として重要な光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを製造するための操作性に優れた工業的に実施可能な方法を提供する。
【解決手段】ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させた後、該生体触媒反応液の溶媒を水系から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを晶析析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液が酢酸根を含むと共に、貧溶媒系に置換する際、貧溶媒としてアルコール類を用いる。
【解決手段】ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させた後、該生体触媒反応液の溶媒を水系から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを晶析析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液が酢酸根を含むと共に、貧溶媒系に置換する際、貧溶媒としてアルコール類を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医農薬中間体として重要な光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの、操作性に優れた工業的に実施可能な製造方法に関する。詳しくは、原料のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択性を有する生体触媒を用いて加水分解した後、貧溶媒に置換して光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の方法によって得られる光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、ＨＩＶやＨＣＶのプロテアーゼ阻害剤等の医薬品原料として重要な中間体である（例えば、特許文献１、２参照）。従来、立体選択性を有する生体触媒、即ち、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させてＬ体またはＤ体選択的加水分解を行うことにより、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを生成させた後、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより未反応のＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを有機溶媒に溶解させ、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる方法が知られている（例えば、特許文献３，４，５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９９／０３６４０４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０３５０６０号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−１１０３４号公報
【特許文献４】特開２００１−３２８９７０号公報
【特許文献５】特開２００２−２５３２９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、生体触媒反応の際、生体触媒の至適ｐＨにおいて行われることが望ましい。ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適したｐＨは、使用する生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、例えばＬ体選択的加水分解活性を有する遺伝子組換菌株であるｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）由来の酵素を用いた場合はｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ６〜８において好適に反応が進行する。遊離のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの水溶液のｐＨは１０．５程度となるため、立体選択的加水分解を至適ｐＨ条件で実施するためには酸を添加してｐＨを調整しなければならない。至適ｐＨに合わせるために塩酸などの無機酸を加えるのが一般的であるが、加えられた酸は未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用して有機溶媒に対して溶解性の低い酸塩を形成してしまうため、有機溶媒中に析出した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを分離取得する際に、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンにその対掌体であるＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩が混入してしまう。光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンがその対掌体のｔｅｒｔ−ロイシンアミドまたはその塩を含有する場合、ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度が高いにもかかわらずｔｅｒｔ−ロイシンアミドがｔｅｒｔ−ロイシンと類似の反応性を示すことによりｔｅｒｔ−ロイシン誘導体の光学純度を低下させる場合がある。従って、Ｄ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩の混入を防ぐ必要があり、生体触媒反応後にｔｅｒｔ−ロイシンアミドより強い塩基を加えてアミドを遊離化する操作が必要になる。
【０００５】
ところが、酵素反応後に塩基を加えてアミドを遊離化した後、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる操作を行うと、有機溶媒のゲル化が生じ、流動性が失われてしまう問題が発生した。
【０００６】
その際、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、溶媒の流動性が失われたことにより回収することが困難であった。また、流動性が失われたことによりｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離することができなくなり、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの純度を著しく低下させる問題が生じた。反応液のゲル化には塩の存在が関係しており、ゲル化を回避するために有効と考えられる脱塩操作を行った場合には、工程数の増加に伴い収率の低下を免れない。さらに、流動性を回復するために大量の有機溶媒を添加した場合には、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドは除去することができるが、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの回収率の低下を招く結果となった。工業的な面からも大量の有機溶媒の使用は好ましくない。文献にはゲル化については記載されていないが、文献記載の方法ではこのように、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法として工業的に実施することが困難であることが判明した。
【０００７】
生体触媒反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することによりｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる操作を行うと、有機溶媒のゲル化が生じる理由の詳細は明らかではないが、例えば、ｔｅｒｔ−ロイシンの構造異性体であるイソロイシンなどの誘導体では、水素結合の分子間相互作用により低分子でありながらゲルを生成する性質が知られている（英謙二, 高分子論文集, ５２７７３,１９９５年、英謙二, 高分子論文集, ５５,５８５,１９９８年）。ｔｅｒｔ−ロイシンにおいても同様の現象が起こっていると考えられ、ゆえに、有機溶媒のゲル化が生じていると考えられるが、本課題の解決法を示した報告は認められない。
【０００８】
本発明の目的は、従来技術における上記した課題を解決し、医農薬原料として重要な光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを製造するための操作性に優れた工業的に実施可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの工業的に実施可能な製造方法に関して鋭意検討した。
【００１０】
一般的な酸、たとえば塩酸、硫酸等の存在下で、アミドを遊離化しないまま反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒に晶析させると、未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩が光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンと共に析出し、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの純度を低下させた。そのため、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換する操作の前に塩基を添加してアミドの遊離化を行う必要がある。この場合、アミドの遊離化で生成する塩により、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換する操作中に反応混合物がゲル化してしまい、工業的操作が困難となるうえ、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンに未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドが混入して純度を低下させるという問題点がある。反応液のゲル化という現象は、塩酸、硫酸をはじめとする鉱酸および蟻酸、プロピオン酸をはじめとする有機酸など多くの酸でｐＨ調整して生体触媒反応を行い、アミドを遊離化して反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換した場合に観察された。
【００１１】
酸の添加量、添加温度などの条件を変えながら広く検討したところ、意外にも、添加する酸として酢酸を選択すると、特異的に、アミドを遊離化するための塩基性物質の添加を行わなくても光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩を光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンと分離することが可能であり、ゲル化を回避しながらｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩を含まない高純度の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを取得できることを見出した。さらに貧溶媒として相応しい溶媒の種類について検討したところ、酢酸添加下でゲル化を起こさないこと、水と共沸し沸点も比較的低いこと、析出する光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンに対する溶解性が低く、しかもｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩の溶解性が高いこと、その他溶媒としての安全性や経済性の面から、アルコール類、特に２−メチル−１−プロパノールが好適に使用できることを見出した。
【００１２】
このように、溶媒置換前の反応液に酢酸根を存在させ、塩基性物質によるｔｅｒｔ−ロイシンアミドの遊離化を行うことなく反応液の溶媒を水からアルコール類へ置換すれば、反応混合物をゲル化させることなく、かつ光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ高純度で分離取得することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを得るための（１）から（７）に示す製造方法に関する。
（１）ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させる生体触媒反応を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得た後、該反応液の溶媒を水から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液が酢酸根を含むと共に、貧溶媒系に置換する際、貧溶媒としてアルコール類を用いることを特徴とする、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからの光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（２）生体触媒反応を行う際に反応液が酢酸根を含むように反応液を調製することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（３）ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒がキサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属もしくはミコプラナ属に属する微生物、またはこれら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換法により誘導される組換株より調製された、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物である、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（４）ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの生体触媒反応時に該反応液に酢酸を添加することを特徴とする、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造法。
（５）アルコール類が２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノールから選ばれる一種以上である、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（６）アルコール類が２−メチル−１−プロパノールである、（５）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（７）光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンがＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンである、（１）〜（６）の何れか一項に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに立体選択的加水分解活性を有する生体触媒を作用させ、続いて反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒に析出せしめる際に反応混合物をゲル化させることなくＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを高純度かつ高収率に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】反応の進行状況。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態はｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させる生体触媒反応を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得、その後、反応液中に酢酸根が存在する状態で、溶媒を水系からｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒に置換することにより、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させるものである。
【００１７】
［生体触媒反応］
まず、生体触媒反応により、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解を行う。すなわち、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させて、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得る。
【００１８】
本発明のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に使用される生体触媒は、Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対応するＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒であればよく、このような生体触媒を有する微生物として例えば、キサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属またはミコプラナ属等に属する微生物、具体的にはキサントバクター フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ）ＮＣＩＢ １００７１Ｔ、プロタミノバクター アルボフラバス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ８４５８、ミコバクテリウム メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＢＴ−８４（ＦＥＲＭ Ｐ８８２３）、ミコバクテリウム メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）Ｐ−２３（ＦＥＲＭ Ｐ８８２５）、ミコプラナ ラモサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｒａｍｏｓａ）ＮＣＩＢ９４４０Ｔ、ミコプラナ ディモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｄｉｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、バリオボラックス パラドクサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＤＳＭ１４４６８が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換法等の遺伝学的手法により誘導される組換株、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）等の何れの菌株であっても上記能力を有するものであれば本発明に使用できる。また、これら微生物は、菌体または菌体処理物、例えば菌体濃縮液、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物もしくは精製酵素、またはこれらの担体固定物等の形態で使用することができる。
【００１９】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適したｔｅｒｔ−ロイシンアミド初期濃度は０．０１ｗｔ％〜飽和濃度、好ましくは１〜２０ｗｔ％、より好ましくは５〜２０ｗｔ％である。低濃度域では反応液体積当りの生産性が非常に低くなり、高濃度域では酵素の失活を招きやすい。の使用量はその比活性または活性量によって決定され、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の場合にはｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して乾燥重量として重量比０．０００５〜３とするのが好ましく、０．０００５〜０．０５がより好ましい。
【００２０】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適した反応温度は生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、一般的には１０〜７０℃の範囲が好ましい。
【００２１】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適したｐＨは使用する生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の場合にはｐＨ６〜１０において好適に進行する。遊離ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを原料とする場合、原料水溶液のｐＨは１０．５程度となるため、立体選択的加水分解を至適ｐＨ条件で実施するためには酸を添加してｐＨを調整する必要がある。添加する酸の量は、使用する酵素により異なり一概に規定することはできないが、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の場合には、ｐＨ調整に効果を有する範囲としてｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して０．００５〜１ｍｏｌ倍量、好ましくは０．００５〜０．５ｍｏｌ倍量である。
【００２２】
生体触媒を用いた反応系にさらに、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋などの各種金属イオンを反応溶液中に１〜５０ｐｐｍ添加することにより、立体選択的加水分解速度を向上させることができる。この際、添加する金属イオンは反応液内において非常に低濃度で添加するため、ゲル化の要因としては無視し得る。ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液への添加順序は特に限定されないが、より高い反応速度を得るために酸、金属イオン、生体触媒の順であることが好ましい。
【００２３】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解の反応様式は、回分でも連続でも良い。反応装置は、撹拌機を備えた槽でも、固定化触媒を充填した塔でも、それらの組み合わせでも良い。
【００２４】
Ｌ体またはＤ体選択的加水分解反応は、Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの９５％以上がＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されるまで、好ましくはＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドが検出されなくなるまで行うと、収率上のみならず品質上も好適である。
【００２５】
［生体触媒の除去］
生体触媒反応終了後、反応液中に存在する生体触媒は、例えば遠心分離、濾過膜あるいは吸着分離などの通常の分離手段により除くことが望ましい。さらに限外濾過し、または活性炭等の吸着剤を用いて微生物由来の有機物の大部分を除去するとより好適である。また、生体触媒反応に使用した生体触媒は、反応に使用した後も、遠心分離もしくはろ過操作などにより回収し、生体触媒反応の容器に戻すことにより再利用することができる。
【００２６】
［アミドの遊離化］
生体触媒反応終了後または生体触媒除去後の反応液はｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその塩を含有している。塩酸や硫酸等の無機酸とｔｅｒｔ−ロイシンアミドの塩はアルコールへの溶解挙動がｔｅｒｔ−ロイシンと類似しているため、後工程で光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとその対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離する目的から、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドと塩を形成しているアニオン成分と当量の塩基を添加してアミドの遊離化を行いｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドの溶解性を大幅に異なる状態とすることが一般的である。この場合には得られるｔｅｒｔ−ロイシンは遊離処理によって生じた無機塩を含有することになる。本発明でも同様の遊離処理を行うことは可能であるが、本発明においてはｔｅｒｔ−ロイシンアミドは主にアルコールへの溶解度が高い酢酸塩として存在していることから、塩基添加による遊離化を行わなくともｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離できる。そのため、酢酸のみをアニオン成分として含有する場合には遊離化を行わないほうが、塩を含まない高純度のｔｅｒｔ−ロイシンが得られるために好適である。
【００２７】
［溶媒置換］
続いて、溶媒置換を行う。すなわち、反応液の溶媒を水からｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系へと置換し、未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドは溶解させ、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させる。溶媒置換の方法は、減圧または常圧で濃縮した後にｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒（以下単に貧溶媒とする）を加える方法、貧溶媒を加えて水と共沸させる方法など、通常の溶媒置換方法を用いることができる。
【００２８】
反応液の溶媒を水から貧溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを貧溶媒に析出せしめる際に、予め塩基の添加によるアミドの遊離化を行わなくても未反応のＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩の析出を防ぐことができ、かつゲル化を引き起こさないという観点から、溶媒置換を行う反応液、すなわち溶媒置換に供する液に酢酸根を含ませなければならない。好ましくは、生体触媒反応を行う際に反応液が酢酸根を含むように反応液を調製することである。これにより、生体触媒反応終了後に酢酸等を加えずとも、溶媒置換に供する液に酢酸根を含ませることができる。
【００２９】
溶媒置換に供する液に含まれるアニオン成分の９５％以上を酢酸根とすることが好ましく、酢酸根のみとすることが最も好ましい。なお、溶媒置換に供する液において生体触媒および生体触媒反応の添加剤として使用する金属塩に由来するアニオン成分は微量であるため無視することができる。よって、溶媒置換に供する液のアニオン成分とは、上記以外のもの、すなわちｐＨ調整および酢酸根を含ませる目的等で加える酸および塩に由来するものならびに原料にＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの塩を使用する場合にこれに由来するものとする。
【００３０】
溶媒置換に供する液に酢酸根を含ませるには、酢酸、酢酸塩等を溶媒置換の前までに反応液に添加すればよい。すなわち、生体触媒反応の前もしくは進行中または反応終了後の生体触媒除去の前もしくは後に添加すればよい。操作の簡便さと最終的に得られる光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの品質の観点から、好適には生体触媒反応時のｐＨ調整のために、生体触媒反応時の前および／または進行中に酢酸を添加すればよい。さらに好適には遊離のアミドを生体触媒反応の出発物質として用い、ｐＨ調整を酢酸のみを用いて行い生体触媒反応を行った後、特に酸や塩基の添加をすることなく溶媒置換を行うことである。なお、酢酸を用いることに代えて、生体触媒反応の原料としてｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酢酸塩を用いることも可能である。その場合には、ｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩と遊離のｔｅｒｔ−ロイシンアミドを適当な割合で併用することにより、ｐＨを望む範囲に調整することが可能である。
【００３１】
貧溶媒は、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその塩の溶解度が高く、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの溶解度が低い溶媒としてアルコール類が好適である。より好適には、２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノール等の炭素数３〜７のアルコール類が使用される。さらには水と共沸し、水への溶解性が低い性質を有する有機溶媒は、溶媒の置換操作が容易になることから、特に好適である。貧溶媒として他の有機溶媒、例えばトルエンを用いた場合には、ｔｅｒｔ−ロイシンとともにｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩が析出し、ｔｅｒｔ−ロイシン純度が著しく低下するため好ましくない。水から貧溶媒へ置換する方法は、生体触媒を除去した反応液または該反応液を濃縮した液に貧溶媒を添加し、常圧または減圧下にて共沸させながら水を留去させ、溶媒を貧溶媒へ置換していく方法を用いることができる。特に好ましい貧溶媒は、２−メチル−１−プロパノールである。貧溶媒中の水分量は少ないほど光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの収率が高い。貧溶媒中の水分量は、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満である。さらに、貧溶媒への置換を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させたのちに回収する操作の温度は、特に限定されず、常用の温度域である。
【００３２】
［光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの取得］
析出した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、遠心分離や濾過などの通常の固液分離手段により容易に回収することできる。回収された光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは残留するｔｅｒｔ−ロイシンアミドを抽出する溶媒で洗浄した後、通風乾燥や真空乾燥などにより乾燥させ、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドまたはその酸塩を含まない光学純度の高い光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンが得られる。
【実施例】
【００３３】
次に、本発明を実施例および比較例をもってより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの例にのみ制限されるものではない。なお、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびｔｅｒｔ−ロイシンの定量には以下に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析条件を用いた。
〔ＨＰＬＣ分析条件１〕
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ−１８（４．６φ×２５０ｍｍ）
溶離液：過塩素酸５０ｍＭ水溶液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
〔ＨＰＬＣ分析条件２〕
カラム：スミキラルＯＡ−５０００（４．６φ×５０ｍｍ）
溶離液：硫酸銅１ｍＭ水溶液
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
【００３４】
実施例１
［生体触媒の培養］
生体触媒としては、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド立体選択的加水分解酵素を有する形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の菌体を用いた。該株を下記の培地にて回分培養を行い、さらに遠心分離濃縮によって培養濃縮液を得た。
培地組成（ｐＨ７．０）
グリセリン ６０ｇ
ポリペプトン ４８ｇ
チアミン塩酸塩 ４．８ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ４．８ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．８ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １２ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ７２ｍｇ
Ｈ２Ｏ １２００ｍＬ
【００３５】
［光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造］
１００ｍＬのフラスコに６．０３ｇ（０．０４６３ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドと水５３．８ｇを加えて溶解した後、酢酸０．３１ｇ（０．００５２ｍｏｌ）を添加して溶液ｐＨを１０．５から８．６に調整した。さらに、塩化マンガン四水和物２．２ｍｇを添加し、上記の培養濃縮液０．７５ｇ（乾燥菌体の重量として０．０６ｇを含有）を接種し、４０℃において２０時間撹拌により生体触媒反応を行った。
【００３６】
反応の進行は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件１で確認した。結果を図１に示す。図１でいう反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。
【００３７】
反応後、反応液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体を除去した濾液を取得した。濾液に２−メチル−１−プロパノール７５ｍＬを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出した光学活性Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過により濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール２０ｍＬで洗浄し、さらに２０℃のアセトン５０ｍＬで洗浄した後、４０℃で真空乾燥を行った。白色粉末として光学活性Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを２．９２ｇ（０．０２２２ｍｏｌ）取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で、光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、化学純度、光学純度はともに９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は９６．１ｍｏｌ％であった。
【００３８】
比較例１
生体触媒反応時に酢酸を添加しない以外は実施例１と同様に反応を行った。ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液の段階でｐＨは１０．６であった。反応の進行結果を図１に示す。
【００３９】
比較例２
生体触媒反応時に酢酸に換えて３５％塩酸０．５４ｇ（０．００５２ｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様に反応を行った。塩酸添加後の反応液のｐＨは８．５であった。反応の進行結果を図１に示す。
【００４０】
得られた反応液を実施例１と同様に菌体除去、溶媒置換した。濾過により、白色結晶３．４６ｇを取得した。この結晶中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度は７６．８ｗｔ％で、他にＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド塩酸塩が含まれていた。原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は８７．６ｍｏｌ％であった。
【００４１】
比較例３〜９
生体触媒反応時に酢酸に換えて表１の酸（０．００５２ｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様に反応を行った。
【００４２】
得られた反応液を実施例１と同様に菌体除去し、水酸化ナトリウム０．２１ｇ（０．００５２ｍｏｌ）を加えてアミドを遊離化した後、実施例１と同様に共沸脱水した。しかし、比較例３〜９については溶媒置換中に反応液のゲル化が起こり流動性が失われたため、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収することができなかった。
【００４３】
【表１】
【００４４】
比較例１０
溶媒置換に使用する貧溶媒として２−メチル−１−プロパノールに代えてトルエンを使用する以外は実施例１と同様に操作を行った。溶媒置換の際、ゲル化は発生しなかった。白色粉末６．０９ｇを取得した。この粉末中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度は４７．８％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンのほかにＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩が含まれていた。
【００４５】
比較例１１
生体触媒反応時に酢酸に代えて３５％塩酸０．５２ｇ（０．００５０ｍｏｌ）を使用するとともに、菌体除去後に水酸化ナトリウム０．２０ｇ（０．００５０ｍｏｌ）を加えてｔｅｒｔ−ロイシンアミドを遊離化し、溶媒置換に使用する貧溶媒として２−メチル−１−プロパノールに代えてトルエンを使用する以外は実施例１と同様に操作を行った。Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンが塩化ナトリウムとともに溶媒置換に使用した容器壁面にこびりついたため回収が困難であり、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対するＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率は２３．６％であった。
【００４６】
比較例１２
実施例１と同様に生体触媒反応および菌体除去操作を行った後、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度２０％となるまで反応液を減圧濃縮し、アセトン１００ｇを添加した。析出したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを濾取し、アセトン１００ｇで洗浄、４０℃で減圧乾燥した。その結果、白色粉末１．８２ｇを取得した。この粉末中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン化学純度、光学純度はともに９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は５９．８ｍｏｌ％であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医農薬中間体として重要な光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの、操作性に優れた工業的に実施可能な製造方法に関する。詳しくは、原料のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択性を有する生体触媒を用いて加水分解した後、貧溶媒に置換して光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の方法によって得られる光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、ＨＩＶやＨＣＶのプロテアーゼ阻害剤等の医薬品原料として重要な中間体である（例えば、特許文献１、２参照）。従来、立体選択性を有する生体触媒、即ち、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させてＬ体またはＤ体選択的加水分解を行うことにより、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを生成させた後、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより未反応のＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを有機溶媒に溶解させ、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる方法が知られている（例えば、特許文献３，４，５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第９９／０３６４０４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０３５０６０号パンフレット
【特許文献３】特開２００１−１１０３４号公報
【特許文献４】特開２００１−３２８９７０号公報
【特許文献５】特開２００２−２５３２９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般に、生体触媒反応の際、生体触媒の至適ｐＨにおいて行われることが望ましい。ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適したｐＨは、使用する生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、例えばＬ体選択的加水分解活性を有する遺伝子組換菌株であるｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）由来の酵素を用いた場合はｐＨ６〜１０、より好ましくはｐＨ６〜８において好適に反応が進行する。遊離のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの水溶液のｐＨは１０．５程度となるため、立体選択的加水分解を至適ｐＨ条件で実施するためには酸を添加してｐＨを調整しなければならない。至適ｐＨに合わせるために塩酸などの無機酸を加えるのが一般的であるが、加えられた酸は未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用して有機溶媒に対して溶解性の低い酸塩を形成してしまうため、有機溶媒中に析出した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを分離取得する際に、光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンにその対掌体であるＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩が混入してしまう。光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンがその対掌体のｔｅｒｔ−ロイシンアミドまたはその塩を含有する場合、ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度が高いにもかかわらずｔｅｒｔ−ロイシンアミドがｔｅｒｔ−ロイシンと類似の反応性を示すことによりｔｅｒｔ−ロイシン誘導体の光学純度を低下させる場合がある。従って、Ｄ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩の混入を防ぐ必要があり、生体触媒反応後にｔｅｒｔ−ロイシンアミドより強い塩基を加えてアミドを遊離化する操作が必要になる。
【０００５】
ところが、酵素反応後に塩基を加えてアミドを遊離化した後、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる操作を行うと、有機溶媒のゲル化が生じ、流動性が失われてしまう問題が発生した。
【０００６】
その際、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、溶媒の流動性が失われたことにより回収することが困難であった。また、流動性が失われたことによりｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離することができなくなり、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの純度を著しく低下させる問題が生じた。反応液のゲル化には塩の存在が関係しており、ゲル化を回避するために有効と考えられる脱塩操作を行った場合には、工程数の増加に伴い収率の低下を免れない。さらに、流動性を回復するために大量の有機溶媒を添加した場合には、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドは除去することができるが、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの回収率の低下を招く結果となった。工業的な面からも大量の有機溶媒の使用は好ましくない。文献にはゲル化については記載されていないが、文献記載の方法ではこのように、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法として工業的に実施することが困難であることが判明した。
【０００７】
生体触媒反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することによりｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒から析出させる操作を行うと、有機溶媒のゲル化が生じる理由の詳細は明らかではないが、例えば、ｔｅｒｔ−ロイシンの構造異性体であるイソロイシンなどの誘導体では、水素結合の分子間相互作用により低分子でありながらゲルを生成する性質が知られている（英謙二, 高分子論文集, ５２７７３,１９９５年、英謙二, 高分子論文集, ５５,５８５,１９９８年）。ｔｅｒｔ−ロイシンにおいても同様の現象が起こっていると考えられ、ゆえに、有機溶媒のゲル化が生じていると考えられるが、本課題の解決法を示した報告は認められない。
【０００８】
本発明の目的は、従来技術における上記した課題を解決し、医農薬原料として重要な光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを製造するための操作性に優れた工業的に実施可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの工業的に実施可能な製造方法に関して鋭意検討した。
【００１０】
一般的な酸、たとえば塩酸、硫酸等の存在下で、アミドを遊離化しないまま反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒に晶析させると、未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩が光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンと共に析出し、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの純度を低下させた。そのため、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換する操作の前に塩基を添加してアミドの遊離化を行う必要がある。この場合、アミドの遊離化で生成する塩により、反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換する操作中に反応混合物がゲル化してしまい、工業的操作が困難となるうえ、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンに未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドが混入して純度を低下させるという問題点がある。反応液のゲル化という現象は、塩酸、硫酸をはじめとする鉱酸および蟻酸、プロピオン酸をはじめとする有機酸など多くの酸でｐＨ調整して生体触媒反応を行い、アミドを遊離化して反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換した場合に観察された。
【００１１】
酸の添加量、添加温度などの条件を変えながら広く検討したところ、意外にも、添加する酸として酢酸を選択すると、特異的に、アミドを遊離化するための塩基性物質の添加を行わなくても光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩を光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンと分離することが可能であり、ゲル化を回避しながらｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩を含まない高純度の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを取得できることを見出した。さらに貧溶媒として相応しい溶媒の種類について検討したところ、酢酸添加下でゲル化を起こさないこと、水と共沸し沸点も比較的低いこと、析出する光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンに対する溶解性が低く、しかもｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩の溶解性が高いこと、その他溶媒としての安全性や経済性の面から、アルコール類、特に２−メチル−１−プロパノールが好適に使用できることを見出した。
【００１２】
このように、溶媒置換前の反応液に酢酸根を存在させ、塩基性物質によるｔｅｒｔ−ロイシンアミドの遊離化を行うことなく反応液の溶媒を水からアルコール類へ置換すれば、反応混合物をゲル化させることなく、かつ光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ高純度で分離取得することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを得るための（１）から（７）に示す製造方法に関する。
（１）ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させる生体触媒反応を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得た後、該反応液の溶媒を水から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液が酢酸根を含むと共に、貧溶媒系に置換する際、貧溶媒としてアルコール類を用いることを特徴とする、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからの光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（２）生体触媒反応を行う際に反応液が酢酸根を含むように反応液を調製することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（３）ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒がキサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属もしくはミコプラナ属に属する微生物、またはこれら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換法により誘導される組換株より調製された、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物である、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（４）ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの生体触媒反応時に該反応液に酢酸を添加することを特徴とする、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造法。
（５）アルコール類が２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノールから選ばれる一種以上である、（１）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（６）アルコール類が２−メチル−１−プロパノールである、（５）に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
（７）光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンがＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンである、（１）〜（６）の何れか一項に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに立体選択的加水分解活性を有する生体触媒を作用させ、続いて反応液の溶媒を水から有機溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを有機溶媒に析出せしめる際に反応混合物をゲル化させることなくＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを高純度かつ高収率に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】反応の進行状況。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態はｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させる生体触媒反応を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得、その後、反応液中に酢酸根が存在する状態で、溶媒を水系からｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒に置換することにより、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させるものである。
【００１７】
［生体触媒反応］
まず、生体触媒反応により、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解を行う。すなわち、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒をｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させて、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得る。
【００１８】
本発明のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に使用される生体触媒は、Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対応するＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒であればよく、このような生体触媒を有する微生物として例えば、キサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属またはミコプラナ属等に属する微生物、具体的にはキサントバクター フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｌａｖｕｓ）ＮＣＩＢ １００７１Ｔ、プロタミノバクター アルボフラバス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ８４５８、ミコバクテリウム メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＢＴ−８４（ＦＥＲＭ Ｐ８８２３）、ミコバクテリウム メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）Ｐ−２３（ＦＥＲＭ Ｐ８８２５）、ミコプラナ ラモサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｒａｍｏｓａ）ＮＣＩＢ９４４０Ｔ、ミコプラナ ディモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｄｉｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、バリオボラックス パラドクサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＤＳＭ１４４６８が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換法等の遺伝学的手法により誘導される組換株、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）等の何れの菌株であっても上記能力を有するものであれば本発明に使用できる。また、これら微生物は、菌体または菌体処理物、例えば菌体濃縮液、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物もしくは精製酵素、またはこれらの担体固定物等の形態で使用することができる。
【００１９】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適したｔｅｒｔ−ロイシンアミド初期濃度は０．０１ｗｔ％〜飽和濃度、好ましくは１〜２０ｗｔ％、より好ましくは５〜２０ｗｔ％である。低濃度域では反応液体積当りの生産性が非常に低くなり、高濃度域では酵素の失活を招きやすい。の使用量はその比活性または活性量によって決定され、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の場合にはｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して乾燥重量として重量比０．０００５〜３とするのが好ましく、０．０００５〜０．０５がより好ましい。
【００２０】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適した反応温度は生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、一般的には１０〜７０℃の範囲が好ましい。
【００２１】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解に適したｐＨは使用する生体触媒により異なり一概に規定することはできないが、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の場合にはｐＨ６〜１０において好適に進行する。遊離ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを原料とする場合、原料水溶液のｐＨは１０．５程度となるため、立体選択的加水分解を至適ｐＨ条件で実施するためには酸を添加してｐＨを調整する必要がある。添加する酸の量は、使用する酵素により異なり一概に規定することはできないが、例えばｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の場合には、ｐＨ調整に効果を有する範囲としてｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して０．００５〜１ｍｏｌ倍量、好ましくは０．００５〜０．５ｍｏｌ倍量である。
【００２２】
生体触媒を用いた反応系にさらに、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋などの各種金属イオンを反応溶液中に１〜５０ｐｐｍ添加することにより、立体選択的加水分解速度を向上させることができる。この際、添加する金属イオンは反応液内において非常に低濃度で添加するため、ゲル化の要因としては無視し得る。ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液への添加順序は特に限定されないが、より高い反応速度を得るために酸、金属イオン、生体触媒の順であることが好ましい。
【００２３】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解の反応様式は、回分でも連続でも良い。反応装置は、撹拌機を備えた槽でも、固定化触媒を充填した塔でも、それらの組み合わせでも良い。
【００２４】
Ｌ体またはＤ体選択的加水分解反応は、Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの９５％以上がＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されるまで、好ましくはＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドが検出されなくなるまで行うと、収率上のみならず品質上も好適である。
【００２５】
［生体触媒の除去］
生体触媒反応終了後、反応液中に存在する生体触媒は、例えば遠心分離、濾過膜あるいは吸着分離などの通常の分離手段により除くことが望ましい。さらに限外濾過し、または活性炭等の吸着剤を用いて微生物由来の有機物の大部分を除去するとより好適である。また、生体触媒反応に使用した生体触媒は、反応に使用した後も、遠心分離もしくはろ過操作などにより回収し、生体触媒反応の容器に戻すことにより再利用することができる。
【００２６】
［アミドの遊離化］
生体触媒反応終了後または生体触媒除去後の反応液はｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその塩を含有している。塩酸や硫酸等の無機酸とｔｅｒｔ−ロイシンアミドの塩はアルコールへの溶解挙動がｔｅｒｔ−ロイシンと類似しているため、後工程で光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンとその対掌体であるｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離する目的から、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドと塩を形成しているアニオン成分と当量の塩基を添加してアミドの遊離化を行いｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドの溶解性を大幅に異なる状態とすることが一般的である。この場合には得られるｔｅｒｔ−ロイシンは遊離処理によって生じた無機塩を含有することになる。本発明でも同様の遊離処理を行うことは可能であるが、本発明においてはｔｅｒｔ−ロイシンアミドは主にアルコールへの溶解度が高い酢酸塩として存在していることから、塩基添加による遊離化を行わなくともｔｅｒｔ−ロイシンとｔｅｒｔ−ロイシンアミドを分離できる。そのため、酢酸のみをアニオン成分として含有する場合には遊離化を行わないほうが、塩を含まない高純度のｔｅｒｔ−ロイシンが得られるために好適である。
【００２７】
［溶媒置換］
続いて、溶媒置換を行う。すなわち、反応液の溶媒を水からｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系へと置換し、未反応のｔｅｒｔ−ロイシンアミドは溶解させ、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させる。溶媒置換の方法は、減圧または常圧で濃縮した後にｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒（以下単に貧溶媒とする）を加える方法、貧溶媒を加えて水と共沸させる方法など、通常の溶媒置換方法を用いることができる。
【００２８】
反応液の溶媒を水から貧溶媒へ置換することにより光学活性Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンを貧溶媒に析出せしめる際に、予め塩基の添加によるアミドの遊離化を行わなくても未反応のＤ−またはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酸塩の析出を防ぐことができ、かつゲル化を引き起こさないという観点から、溶媒置換を行う反応液、すなわち溶媒置換に供する液に酢酸根を含ませなければならない。好ましくは、生体触媒反応を行う際に反応液が酢酸根を含むように反応液を調製することである。これにより、生体触媒反応終了後に酢酸等を加えずとも、溶媒置換に供する液に酢酸根を含ませることができる。
【００２９】
溶媒置換に供する液に含まれるアニオン成分の９５％以上を酢酸根とすることが好ましく、酢酸根のみとすることが最も好ましい。なお、溶媒置換に供する液において生体触媒および生体触媒反応の添加剤として使用する金属塩に由来するアニオン成分は微量であるため無視することができる。よって、溶媒置換に供する液のアニオン成分とは、上記以外のもの、すなわちｐＨ調整および酢酸根を含ませる目的等で加える酸および塩に由来するものならびに原料にＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの塩を使用する場合にこれに由来するものとする。
【００３０】
溶媒置換に供する液に酢酸根を含ませるには、酢酸、酢酸塩等を溶媒置換の前までに反応液に添加すればよい。すなわち、生体触媒反応の前もしくは進行中または反応終了後の生体触媒除去の前もしくは後に添加すればよい。操作の簡便さと最終的に得られる光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの品質の観点から、好適には生体触媒反応時のｐＨ調整のために、生体触媒反応時の前および／または進行中に酢酸を添加すればよい。さらに好適には遊離のアミドを生体触媒反応の出発物質として用い、ｐＨ調整を酢酸のみを用いて行い生体触媒反応を行った後、特に酸や塩基の添加をすることなく溶媒置換を行うことである。なお、酢酸を用いることに代えて、生体触媒反応の原料としてｔｅｒｔ−ロイシンアミドの酢酸塩を用いることも可能である。その場合には、ｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩と遊離のｔｅｒｔ−ロイシンアミドを適当な割合で併用することにより、ｐＨを望む範囲に調整することが可能である。
【００３１】
貧溶媒は、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびその塩の溶解度が高く、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの溶解度が低い溶媒としてアルコール類が好適である。より好適には、２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノール等の炭素数３〜７のアルコール類が使用される。さらには水と共沸し、水への溶解性が低い性質を有する有機溶媒は、溶媒の置換操作が容易になることから、特に好適である。貧溶媒として他の有機溶媒、例えばトルエンを用いた場合には、ｔｅｒｔ−ロイシンとともにｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩が析出し、ｔｅｒｔ−ロイシン純度が著しく低下するため好ましくない。水から貧溶媒へ置換する方法は、生体触媒を除去した反応液または該反応液を濃縮した液に貧溶媒を添加し、常圧または減圧下にて共沸させながら水を留去させ、溶媒を貧溶媒へ置換していく方法を用いることができる。特に好ましい貧溶媒は、２−メチル−１−プロパノールである。貧溶媒中の水分量は少ないほど光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの収率が高い。貧溶媒中の水分量は、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満である。さらに、貧溶媒への置換を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させたのちに回収する操作の温度は、特に限定されず、常用の温度域である。
【００３２】
［光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの取得］
析出した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは、遠心分離や濾過などの通常の固液分離手段により容易に回収することできる。回収された光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンは残留するｔｅｒｔ−ロイシンアミドを抽出する溶媒で洗浄した後、通風乾燥や真空乾燥などにより乾燥させ、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドまたはその酸塩を含まない光学純度の高い光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンが得られる。
【実施例】
【００３３】
次に、本発明を実施例および比較例をもってより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの例にのみ制限されるものではない。なお、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドおよびｔｅｒｔ−ロイシンの定量には以下に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析条件を用いた。
〔ＨＰＬＣ分析条件１〕
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ−１８（４．６φ×２５０ｍｍ）
溶離液：過塩素酸５０ｍＭ水溶液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
〔ＨＰＬＣ分析条件２〕
カラム：スミキラルＯＡ−５０００（４．６φ×５０ｍｍ）
溶離液：硫酸銅１ｍＭ水溶液
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
【００３４】
実施例１
［生体触媒の培養］
生体触媒としては、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド立体選択的加水分解酵素を有する形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ ＡＰ−２００５６）の菌体を用いた。該株を下記の培地にて回分培養を行い、さらに遠心分離濃縮によって培養濃縮液を得た。
培地組成（ｐＨ７．０）
グリセリン ６０ｇ
ポリペプトン ４８ｇ
チアミン塩酸塩 ４．８ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ４．８ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．８ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １２ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ７２ｍｇ
Ｈ２Ｏ １２００ｍＬ
【００３５】
［光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造］
１００ｍＬのフラスコに６．０３ｇ（０．０４６３ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドと水５３．８ｇを加えて溶解した後、酢酸０．３１ｇ（０．００５２ｍｏｌ）を添加して溶液ｐＨを１０．５から８．６に調整した。さらに、塩化マンガン四水和物２．２ｍｇを添加し、上記の培養濃縮液０．７５ｇ（乾燥菌体の重量として０．０６ｇを含有）を接種し、４０℃において２０時間撹拌により生体触媒反応を行った。
【００３６】
反応の進行は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件１で確認した。結果を図１に示す。図１でいう反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。
【００３７】
反応後、反応液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体を除去した濾液を取得した。濾液に２−メチル−１−プロパノール７５ｍＬを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出した光学活性Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過により濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール２０ｍＬで洗浄し、さらに２０℃のアセトン５０ｍＬで洗浄した後、４０℃で真空乾燥を行った。白色粉末として光学活性Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを２．９２ｇ（０．０２２２ｍｏｌ）取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で、光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、化学純度、光学純度はともに９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は９６．１ｍｏｌ％であった。
【００３８】
比較例１
生体触媒反応時に酢酸を添加しない以外は実施例１と同様に反応を行った。ｔｅｒｔ−ロイシンアミド水溶液の段階でｐＨは１０．６であった。反応の進行結果を図１に示す。
【００３９】
比較例２
生体触媒反応時に酢酸に換えて３５％塩酸０．５４ｇ（０．００５２ｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様に反応を行った。塩酸添加後の反応液のｐＨは８．５であった。反応の進行結果を図１に示す。
【００４０】
得られた反応液を実施例１と同様に菌体除去、溶媒置換した。濾過により、白色結晶３．４６ｇを取得した。この結晶中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度は７６．８ｗｔ％で、他にＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド塩酸塩が含まれていた。原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は８７．６ｍｏｌ％であった。
【００４１】
比較例３〜９
生体触媒反応時に酢酸に換えて表１の酸（０．００５２ｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様に反応を行った。
【００４２】
得られた反応液を実施例１と同様に菌体除去し、水酸化ナトリウム０．２１ｇ（０．００５２ｍｏｌ）を加えてアミドを遊離化した後、実施例１と同様に共沸脱水した。しかし、比較例３〜９については溶媒置換中に反応液のゲル化が起こり流動性が失われたため、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンを回収することができなかった。
【００４３】
【表１】
【００４４】
比較例１０
溶媒置換に使用する貧溶媒として２−メチル−１−プロパノールに代えてトルエンを使用する以外は実施例１と同様に操作を行った。溶媒置換の際、ゲル化は発生しなかった。白色粉末６．０９ｇを取得した。この粉末中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度は４７．８％であり、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンのほかにＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド酢酸塩が含まれていた。
【００４５】
比較例１１
生体触媒反応時に酢酸に代えて３５％塩酸０．５２ｇ（０．００５０ｍｏｌ）を使用するとともに、菌体除去後に水酸化ナトリウム０．２０ｇ（０．００５０ｍｏｌ）を加えてｔｅｒｔ−ロイシンアミドを遊離化し、溶媒置換に使用する貧溶媒として２−メチル−１−プロパノールに代えてトルエンを使用する以外は実施例１と同様に操作を行った。Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンが塩化ナトリウムとともに溶媒置換に使用した容器壁面にこびりついたため回収が困難であり、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対するＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの収率は２３．６％であった。
【００４６】
比較例１２
実施例１と同様に生体触媒反応および菌体除去操作を行った後、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン濃度２０％となるまで反応液を減圧濃縮し、アセトン１００ｇを添加した。析出したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを濾取し、アセトン１００ｇで洗浄、４０℃で減圧乾燥した。その結果、白色粉末１．８２ｇを取得した。この粉末中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシン化学純度、光学純度はともに９９％以上であった。また、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対する収率は５９．８ｍｏｌ％であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させる生体触媒反応を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得た後、該反応液の溶媒を水から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液が酢酸根を含むと共に、貧溶媒系に置換する際、貧溶媒としてアルコール類を用いることを特徴とする、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからの光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項２】
生体触媒反応を行う際に反応液が酢酸根を含むように反応液を調製することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項３】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒がキサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属もしくはミコプラナ属に属する微生物、またはこれら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換法により誘導される組換株より調製された、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物である、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項４】
生体触媒反応の前および／または進行中に該反応液に酢酸を添加することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造法。
【請求項５】
アルコール類が２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノールから選ばれる一種以上である、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項６】
アルコール類が２−メチル−１−プロパノールである、請求項５に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項７】
光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンがＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンである、請求項１〜６の何れか一項に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項１】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒を、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに作用させる生体触媒反応を行い、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンおよびｔｅｒｔ−ロイシンアミドを含む反応液を得た後、該反応液の溶媒を水から光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの貧溶媒系に置換することにより、生成した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出させ分取する方法において、溶媒置換に供する液が酢酸根を含むと共に、貧溶媒系に置換する際、貧溶媒としてアルコール類を用いることを特徴とする、ｔｅｒｔ−ロイシンアミドからの光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項２】
生体触媒反応を行う際に反応液が酢酸根を含むように反応液を調製することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項３】
ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する生体触媒がキサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属もしくはミコプラナ属に属する微生物、またはこれら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換法により誘導される組換株より調製された、酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物である、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項４】
生体触媒反応の前および／または進行中に該反応液に酢酸を添加することを特徴とする、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造法。
【請求項５】
アルコール類が２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、１−ブタノールおよび２−ブタノールから選ばれる一種以上である、請求項１に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項６】
アルコール類が２−メチル−１−プロパノールである、請求項５に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【請求項７】
光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンがＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンである、請求項１〜６の何れか一項に記載の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２８４１０９（Ｐ２０１０−２８４１０９Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４０１９５（Ｐ２００９−１４０１９５）
【出願日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（０００００４４６６）三菱瓦斯化学株式会社 (1,281)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【出願人】（０００００４４６６）三菱瓦斯化学株式会社 (1,281)
【Ｆターム（参考）】
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