免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法
本発明は、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法、改善された治療効果を有する免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体、および薬剤として、特に免疫療法のための薬剤としてのその使用に関する。具体的には、本発明は、突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を提供することを含み、この突然変異が、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法、ならびに本発明の方法によって得られる抗体および薬剤としてそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法、改善された治療効果を有する免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体、および薬剤として、特に免疫療法のための薬剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳児は、自身の適応抗体を介した免疫を獲得するまで、母体から子に能動的に移行されるＩｇＧクラスの母体抗体によって保護されている。ヒトにおいて、胎盤を介したこの子宮内ＩｇＧ移行、または（たとえばげっ歯動物において）出生後の腸上皮を介した母乳からの移行は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって媒介される。
【０００３】
ＦｃＲｎは、β２Ｍと結合した、特異なＨＬＡクラスＩ様α鎖から成るヘテロ二量体である。ＦｃＲｎは、酸性ｐＨ（約６．５）において高い親和性でＩｇＧに結合するが、生理的ｐＨ（約７．４）では結合がほぼ完全に排除される。
【０００４】
インビボでは、結合は、ＩｇＧを含有する血漿の飲作用後に初期エンドソームにおいて起こると推測される。ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体が形成され、おそらくＦｃＲｎの細胞質側末端における様々なソーティングシグナルによって、リソソーム経路から離れる経路を辿る。
【０００５】
これらの複合体は細胞表面に再循環されるかまたは細胞の反対側に輸送され、そこでＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体を含む小胞が一度にまたは一連の「キス・アンド・ラン」事象において細胞膜と融合する。これらの事象の間に、ｐＨは生理的レベル（約７．４）に戻り、ＩｇＧに対するＦｃＲｎの親和性を大きく低下させる。これは複合体の解離を生じさせ、ＩｇＧは放出されるが、ＦｃＲｎは再循環されてＩｇＧと再結合すると推測される。
【０００６】
ＩｇＧ輸送の他にも、ＦｃＲｎは様々な他の機能を媒介する。たとえば、ＦｃＲｎはアルブミンをリソソーム分解から救済し、食作用において役割を果たすことが示された。
【０００７】
ＩｇＧについてのサルベージ受容体として、ＦｃＲｎは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の高い血漿濃度（総ＩｇＧについて約１０ｍｇ／ｍｌ）に関与すると考えられる。しかし、ＩｇＧ３の血清半減期は他のＩｇＧサブクラスの数分の一に過ぎず、他の血清タンパク質と同等であるので（ＩｇＧ３は約７日間であるのに対し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は約２１日間）、ＦｃＲｎが同じような方法でＩｇＧ３に結合し、輸送し、救済するか否かは明らかでない。ＩｇＧ３について認められる血清半減期に関して少なくとも２つの可能な理論が存在する。
【０００８】
第一に、ＩｇＧ３の比較的長いヒンジ領域は、ＩｇＧ３を、パパイン、プラスミン、トリプシンおよび／またはペプシンのようなタンパク質分解酵素の活性に対してよりアクセスしやすくする。
【０００９】
第二に、ＦｃＲｎによるＩｇＧ３の再循環は、存在するとすれば、他のＩｇＧサブクラスの場合ほど効率的ではないと考えられる。
【００１０】
免疫療法のために一般的に使用されるＩｇＧ１抗体と比較して、ＩｇＧ３抗体は、中でも特に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、および／またはＩｇＧ３を抗体ベースの治療のためのより適切な候補物質とする補体の活性化に関して、改善された治療効果を提供する。
【００１１】
しかし、ＩｇＧ１抗体と比較して、ＩｇＧ３抗体の比較的短い半減期は、それらの治療上の有利な性質にもかかわらず、それらの治療適用を大きく制限してきた。
【発明の概要】
【００１２】
従って、高い治療効果を有するＩｇＧ３抗体、特にＩｇＧ１抗体の血清半減期に匹敵する高い血清半減期を有するＩｇＧ３抗体を提供することが本発明の１つの目的である。
【００１３】
この目的は、いくつかある目的の中でも特に、付属の請求項１に概説される方法によって達成される。
【００１４】
具体的には、この目的は、突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を提供することを含み、この突然変異が、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法によって達成される。そのような突然変異はまた、抗体工学の技術分野においてＲ４３５Ｈ突然変異とも称される。
【００１５】
本明細書で交換可能に使用される、「突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体」または「突然変異ＩｇＧ３」という用語は、天然では認められない、またはポリクローナルもしくはハイブリドーマ技術などの従来の抗体惹起および単離手法を使用して誘導し得るＩｇＧ３抗体を指示する。
【００１６】
本発明の「突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体」または「突然変異ＩｇＧ３」は、たとえば、従来の抗体惹起および単離手法を通して得られる、本明細書では「親」という用語によって指定される抗体を起源とする核酸物質に対して一般的な組換えＤＮＡ技術を使用して誘導される。しかし、本発明の抗体は、その治療効果、特にその血清半減期において、これらの「親」抗体と異なる。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の突然変異ＩｇＧ３は、（本発明の突然変異ＩｇＧ３を提供するために突然変異させる核酸物質のソースを提供する）親ＩｇＧ３と比較して、親ＩｇＧ３の、親和性および特異性などのすべての特徴的な性質を有し、治療効果、特に血清半減期が高いという点においてのみ異なる。
【００１８】
驚くべきことに、本発明者は、ＩｇＧ３重鎖の４３５位のヒスチジン（Ｈ）残基の存在が、ＩｇＧ３抗体のインビボ血清半減期をＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体のインビボ半減期に匹敵するレベル、すなわち約２１日間に上昇させることを発見した。
【００１９】
これまでの試験は、本発明の実施例のように、４３５位にヒスチジン残基を有するＩｇＧ１も、４３５位にアルギニン残基を有するＩｇＧ３も、いずれもＦｃＲｎ受容体による個別の輸送効率が同等であることを示していたので、この作用は意外である。
【００２０】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のＩｇＧ３抗体、すなわちＩｇＧ３（Ｒ４３５Ｈ）の基礎となる高い血清半減期は、ＦｃＲｎ受容体に対するＩｇＧ１とＩｇＧ３の競合を排除することによって提供されると推測される。インビボで、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方が血清中に存在するが、ＦｃＲｎ受容体に関して競合すること、およびＩｇＧ１に有利なその後のリソソーム分解の細胞救済により、ＩｇＧ１は約２１日間循環中にとどまるが、ＩｇＧ３は他の血清タンパク質と同様の速度、すなわち約７日間で速やかに分解される。
【００２１】
ＩｇＧ３の４３５位のアルギニン（Ｒ）残基のヒスチジン（Ｈ）残基への変換は、ＩｇＧ３と比較したＩｇＧ１のこの競合優位性を排除し、それによってＩｇＧ３の血清半減期をＩｇＧ１、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４に匹敵する半減期まで上昇させる。
【００２２】
本発明によれば、ＩｇＧ３抗体のアミノ酸位置４３５は、Ｋａｂａｔのアミノ酸残基位置定義によるＩｇＧ３抗体の重鎖ＣＨ３ドメインのアミノ酸位置４３５である。
【００２３】
しかし、本発明はまた、Ｋａｂａｔの定義によるＩｇＧ３抗体の重鎖ＣＨ３ドメインの４３５位に対応するまたは等価の位置における他のアルギニン（Ｒ）のヒスチジン（Ｈ）への置換を包含する。
【００２４】
本発明のＩｇＧ３抗体は、親ＩｇＧ３抗体と比較して突然変異している。一般に、本発明の親ＩｇＧ抗体は約７日間の血清半減期を示し、４３５位にアルギニンを含む。本発明のＩｇＧ３抗体は、好ましくは、Ｒ４３５Ｈ突然変異のためにその半減期が約７日間から約２１日間に上昇していることを除き、親ＩｇＧ３抗体と類似の親和性および特異性を示す。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明のＩｇＧ３抗体は、Ｒ４３５Ｈ突然変異を除き、親ＩｇＧ３抗体と実質的に類似のアミノ酸配列を有し、より好ましくは実質的に同一のアミノ酸配列、最も好ましくは同一のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
上記の最も好ましい実施形態のために、本発明はまた、突然変異したＩｇＧ３抗体を提供するための方法に関し、この突然変異は、親ＩｇＧ３抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換から成る。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明の方法によるＩｇＧ３抗体はヒトＩｇＧ３抗体である。本発明の記述中、ヒト抗体は、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体などの、少なくともヒト由来の定常部分を含む抗体である。
【００２８】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明の方法によるＩｇＧ３抗体は、高いインビボ血清半減期、好ましくは約２１日間、たとえば１９、２０、２１、２２または２３日間の血清半減期を含む高い治療効果を有するＩｇＧ３抗体である。
【００２９】
本発明によれば、本発明のＩｇＧ３抗体は、好ましくは、
（ａ）免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離するステップと、
（ｂ）アミノ酸位置４３５をコードするコドンを、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）をコードするように突然変異させ、突然変異した核酸配列を提供するステップと、
（ｃ）前記突然変異核酸配列を作動可能な発現エレメントとともに提供するステップと、
（ｄ）前記突然変異核酸および免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の軽鎖をコードする核酸配列を適切な宿主において発現させ、それによって突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を提供するステップと、場合により
（ｅ）前記突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を単離するステップと
によって提供される。
【００３０】
ステップ（ｂ）は、アミノ酸位置４３５をコードするコドンを、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）をコードするように突然変異させ、突然変異した核酸配列を提供するステップを含む。
【００３１】
ステップ（ｄ）による適切な宿主の好ましいコドン使用頻度に依存して、当業者は、ヒスチジンをコードする４３５位の適切なコドンを容易に選択することができる。一般に、大部分の高等真核生物種またはメタノール資化酵母（ピキア・パストリス、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような一部の酵母種に関しては、ステップ（ｂ）は、アミノ酸位置４３５をコードするコドンをＣＡＣまたはＣＡＴに突然変異させ、突然変異した核酸配列を提供することを含む。
【００３２】
もう１つの態様によれば、本発明は、突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体、好ましくはヒト抗体に関し、この突然変異は、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む。
【００３３】
この態様の好ましい実施形態によれば、本発明は、突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体、好ましくはヒト抗体に関し、この突然変異は、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換からなる。
【００３４】
本発明のＩｇＧ３抗体の改善された治療効果、特にそれらの改善された血清半減期を考慮して、本発明は、第三の態様によれば、薬剤としての使用のため、好ましくは、免疫療法、たとえば、好ましくは関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、ならびに非ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、頭頸部がんおよび乳がんを含む多くの形態のがん、および免疫不全症などの免疫療法のための薬剤として使用のための、上記で定義した、突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体に関する。
【００３５】
Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症や低ガンマグロブリン血症などの一部の免疫不全症は、部分的または完全な抗体の欠如を生じさせる。これらの疾患はしばしば、受動免疫と呼ばれる短期的な形態の免疫を誘導することによって治療される。受動免疫は、ヒトまたは動物の血清、プールされた免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体の形態で既製抗体を罹患個体に移入することを介して達成される。本発明の高い血清半減期はこれらの疾患の治療に特に適する。
【００３６】
本発明を、付属の図面を参照し、以下の実施例を使用してさらに詳述し、説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＪＡＲおよびＡ３７５におけるＩＶＩｇのＦｃＲｎを介した輸送が、ＩｇＧ１についてはＺドメインによって阻害されるが、ＩｇＧ３に関しては阻害されないことを示す。 図１Ａ：ＦｃＲｎ陰性Ａ３７５−ＷＴ細胞は特異的ＩｇＧトランスサイトーシス（ＩＶＩｇ）を示さず、ＨＲＰ輸送によって測定した受動漏出と同等であった。ＦｃＲｎのα鎖でのトランスフェクション後、Ａ３７５−ＦｃＲｎはＩｇＧを頂端から側底側画分へと極めて効率的に輸送する。ＩＶＩｇを、輸送の前に２：１のモル比（Ｚドメイン：ＩｇＧ）でＺドメイン（プロテインＡの最小ＩｇＧ結合ドメイン）と混合した場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎ細胞によるＩｇＧ１輸送は有意に低下したが、一方ＩｇＧ３輸送は増強された。 図１Ｂ：天然にＦｃＲｎを発現するＪＡＲ細胞は、ＩＶＩｇからＩｇＧ１とＩｇＧ３を等しく良好に輸送した。輸送の前に２：１のモル比でＩＶＩｇをＺドメインと共にインキュベートすると、ＩｇＧ１の輸送は阻害されたが、ＩｇＧ３の輸送は増大した。 Ａ）およびＢ）の両方において１００μｇ／ｍｌのＩＶＩｇを使用した。ＩｇＧ１を白いバーで示し、ＩｇＧ３は斜線を付けたバーで、そしてＨＲＰは黒いバーで示した。Ｙ軸は、頂端画分から側底側画分に輸送されたＩｇＧのパーセンテージを示す。統計比較は、一方向ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定によって実施し、有意性のレベルを「実験材料および方法」の章で定義するように示している。
【図２】ＩｇＧ３の輸送が非飽和条件下でＩｇＧ１によって阻害されることを示す。 図２Ａ：ＩｇＧ３とＩｇＧ１は、頂端から側底側画分に別々に輸送された場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎ細胞において等しく良好にトランスサイトーシスされ、注入量を倍加した場合、どちらもそれら自体の輸送を阻害しなかった。しかし１：１混合物では、ＩｇＧ１の存在下でＩｇＧ３の輸送が低下した。 図２Ｂ：ＪＡＲ細胞では、ＩｇＧ３は、単独で提供された場合、頂端から側底側画分へと効率的に輸送された。輸送されるＩｇＧ１またはＩｇＧ３の量も、頂端濃度を倍加することによって影響を受けなかったが、ＩｇＧ３輸送は、等しい量のＩｇＧ１の存在によって阻害された。 図２Ｃ：１つのサブクラスだけが存在する場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎは一定のパーセンテージのＩｇＧを頂端から側底膜側へと輸送した。ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方について、このパーセンテージは試験した範囲にわたって安定なままであった。 ミエローマＩｇＧ１およびＩＭＩｇ由来のＩｇＧ３をすべての実験のために使用した。データは、各々３つのウェルの３回の独立した実験の平均および標準偏差である。ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方が存在する場合は、両方を同じ試料において独立して測定した。ＩｇＧ１の存在下でのＩｇＧ３の輸送を、角括弧で示すように両側ｔ検定によってＩｇＧ３単独の輸送と比較した。
【図３】ＩｇＧ１によるＩｇＧ３輸送の濃度依存的阻害を示す。 図３Ａ：漸増量のＩｇＧ１の不在下または存在下での組換えＩｇＧ３（１０μｇ／ｍｌ）の頂端から側底側への輸送。ＩｇＧ３輸送は、１ｎｇ／ｍｌ超のＩｇＧが存在する場合、プラトーまで阻害された。すべてのデータポイントを、一方向ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定によってＩｇＧ１なしの試料と比較した。 図３Ｂ：組換えＩｇＧ３単独（点線）または１：１のモル比で漸増濃度のＩｇＧ１と混合したＩｇＧ３（実線）を頂端画分に添加し、側底側画分においてＩｇＧ３を測定した。１μｇ／ｍｌより低い濃度では、ＩｇＧ３の輸送は、ＩｇＧ３を単独で輸送した場合に認められたのと同様のレベルまで上昇した。 ＩｇＧ１とＩｇＧ３の混合輸送からのすべてのデータポイントを、ｔ検定によってＩｇＧ１不在下での対応するＩｇＧ３輸送と比較した。
【図４】Ｆｃと４３５位にモデリングしたアルギニンを伴うラットＦｃＲｎの結晶構造を示す。 図４Ａ：ＩｇＧの結合アミノ酸位置４３５の配向を黄色で示す、ＩｇＧ分子のＦｃ部分を伴うＦｃＲｎの結晶構造。 図４Ｂ：ＦｃＲｎにおける結合ポケットへのＩｇＧのアミノ酸４３５の側鎖（ヒスチジン、緑色で示す）の結合を示す、結合ポケットの拡大図。アルギニンをこの位置にモデリングした場合（黄色で示す）、ＦｃＲｎ表面領域へと突出し、おそらく立体障害を引き起こす。１７から得た結晶学的配位およびモデリングはＶＭＤ１．８．４を使用して実施した。
【図５】４３５位にアルギニンを有するＩｇＧの頂端から側底側への輸送が４３５位にヒスチジンを有するＩｇＧによって阻害されるが、側底側から頂端への輸送は影響されないことを示す。 図５Ａ：ＩｇＧ１（Ｈ４３５）およびＩｇＧ３（Ｒ４３５）における４３５位のアミノ酸をアラニンに突然変異させることは輸送を低下させるが、互いの骨格上のＩｇＧ１にネイティブなヒスチジンとＩｇＧ３にネイティブなアルギニンを交換すると、ＦｃＲｎでトランスフェクトしたＡ３７５細胞に別々に提供した場合、それらの輸送率に影響を及ぼさなかった。 図５Ｂ：ＩｇＧ３−ＷＴの輸送はＩｇＧ１−ＷＴによって阻害されたが、４３５位にアラニンまたはアルギニンを担持するＩｇＧ１はＩｇＧ３の輸送に影響を及ぼさなかった。 図５Ｃ：４３５位にヒスチジンを有するＩｇＧ３の輸送はＷＴのＩｇＧ１によって阻害されなかった。ＩｇＧ１とＩｇＧ３の４３５位に認められるアミノ酸を交換した場合、ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒの輸送はＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈによって阻害された。 図５Ｄ：ＩｇＧ１とＩｇＧ３は、側底側から頂端方向に輸送される場合、両方が単独で輸送される場合、および１：１の比率で混合して輸送される場合は、等しいレベルで輸送された。 ＋／−（ＩｇＧ／ＩｇＧなし）によって示すように、組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ３を、Ａ）およびＤ）の最も左側の２つのバーでは別々に使用し、またはＢ）、Ｃ）およびＤ）の最も右側の２つのバーでは等しい濃度で（１０μｇ／ｍｌ／サブクラス）混合して使用した。突然変異体（４３５Ｈ、４３５Ａ、４３５Ｒ）の存在は対応する文字で示している。ＷＴ ＩｇＧの輸送を、一方向ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定によって突然変異ＩｇＧの輸送と比較し、有意性を「実験材料および方法」の章で述べるように示している。
【図６】インビボおよびインビトロでのＩｇＧ３の異化作用増強がＲ４３５によるものであることを示す。 図６Ａ：集密的なＡ３７５−ＦｃＲｎ単層の頂端画分に添加した総ＩｇＧの約９５％が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３を個別に（１０μｇ／ｍｌ）に添加した場合、２４時間後に頂端画分と側底側画分の両方から回収された。しかし、ＩｇＧ１とＩｇＧ３を等しい量で混合した場合、初期ＩｇＧ３の約６５％が検出でき、ＩｇＧ３がＩｇＧ１の存在下で分解されたことを示唆した。ＩｇＧ１の回収は、ＩｇＧ３が存在しない場合に認められたのと同様であった。ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈは、ＩｇＧ３単独と同様に、２４時間後に約９５％が検出できたので、ＩｇＧ１の存在下でも分解されなかった。 図６Ｂ：ＩＶＩｇによる最後の治療から４週間後の無ガンマグロブリン血症患者からの血清中のＩｇＧサブクラスおよびヒスチジン−４３５を含有するＩｇＧ３アロタイプＧ３ｍ（ｓ、ｔ）を、対応するＩＶＩｇ製剤中で認められるＩｇＧサブクラスおよびＧ３ｍ（ｓ、ｔ）レベルと比較した相対的濃度。 データは、３名の患者からの血清において実施した測定から計算した平均プラス標準偏差を示す。統計比較は、一方向ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定によって実施し、有意性のレベルは「実験材料および方法」の章で定義するように示している。簡潔さのために、有意差は、すべてのサブクラスと比較したＩｇＧ１について、および総ＩｇＧ３とＧ３ｍ（ｓ、ｔ）レベルの間でのみ提示している。
【実施例】
【００３８】
＜序論＞
この実施例では、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のＦｃＲｎを介した輸送における相違を明らかにする。完全なヒトインビトロおよびインビボモデルを使用して、予想外に、ＩｇＧ１とＩｇＧ３がＦｃＲｎを介した輸送および再循環に関して競合することが認められた。本発明のデータは、ＩｇＧ３における４３５位のアルギニンの存在が、インビボで認められたその高い割合の異化作用を説明するのに十分であることを明らかにする。
【００３９】
＜実験材料および方法＞
細胞培養
ヒト絨毛癌細胞（ＪＡＲ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）をＩＭＤＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）において、および黒色腫細胞（Ａ３７５、ＦｃＲｎ−β２ｍ＋、Ｃ．Ｓａｕｔｅｓ−ＦｒｉｄｍａｎおよびＬ．Ｃａｓｓａｒｄの好意により提供された）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において、どちらの培地にもＬ−グルタミン（３００ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ、ＰＡＡ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｂｏｄｉｎｃｏ，Ａｌｋｍａａｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を添加して増殖させた。すべての培養は、飽和湿度および空気中５％ＣＯ２において３７℃で実施した。
【００４０】
Ａ３７５−ＦｃＲｎ
ヒトＦｃＲｎのｃＤＮＡを、正プライマー５’ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＴＣ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＣＴ ＣＡＧ Ｃ ３’および逆プライマー５’ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＣＡＣ ３’を使用してＰＣＲによって増幅した。生成物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、ＦｃＲｎ配列を自動ＤＮＡシークエンシング（ＡＢＩ ３７３ Ｓｔｒｅｔｃｈ自動配列決定装置、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって確認した。
【００４１】
完全なＦｃＲｎコード領域を含有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター（ＤＮＡＸ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングし、パッケージングベクターと共に２９３Ｔ細胞４２にトランスフェクトした。上清を使用してＡ３７５細胞をトランスフェクトした。ＦｃＲｎの発現をＭＡｂ−１Ｇ３結合および定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
【００４２】
ＩｇＧ
市販の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ、Ｓａｎｑｕｉｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を購入した。ミエローマＩｇＧ１は、多発性骨髄腫を有する３名の患者から血清タンパク質沈殿によって入手し、プールした。
【００４３】
簡単に述べると、タンパク質をＤＥＡＥサイズクロマトグラフィーによって分離し、その後セファデックス結合抗サブクラスＩｇＧのカラムを通すことによってＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を除去した。セファロースマトリックス上に固定化したプロテインＡを使用して他のサブクラスを除去することにより、筋肉内Ｉｇ（ＩＭＩｇ、Ｓａｎｑｕｉｎ）からＩｇＧ３を得た。
【００４４】
野生型と突然変異型（ＩｇＧ１−Ｈ４５３Ａ、ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ａ、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ）の両方の組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ３を、製造者の指示に従って２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において生産した。
【００４５】
ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ａは記述されているように作製した。ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ、ＩｇＧ３−Ｒ４３５ＡおよびＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈは、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）および以下のオリゴヌクレオチドプライマーをそれらの相補的な逆プライマーと共に使用して作製した。
ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ：ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ
ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ａ：ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ
ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ：ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＡＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ
すべての突然変異を発現の前に配列決定によって確認した。
【００４６】
Ｚドメイン
Ｚドメインをコードする遺伝子を、同時に制限部位（ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ）を導入する、プライマーＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＡＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＡＣ（正）およびＣＴＧ ＣＡＧ ＴＴＡ ＴＴＴ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＴＣ（逆）を使用してｐＴｈｉｏ−Ｈｉｓ−ＺＺ２４ベクターからＰＣＲによって増幅し、その後ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）にクローニングした。
【００４７】
ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して、遺伝子をｐＧＥＸ６．２発現ベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現の前に結果を配列決定によって確認した。
【００４８】
ＰｒｅＳｃｉｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製の間にＧＳＴタグを除去し、その後Ｚドメインを重力流によってグルタチオンセファロース４Ｂカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ）から溶出させた。最後に、溶出液をＰＢＳに対して透析した。
【００４９】
ＩｇＧトランスサイトーシス
ＩｇＧ輸送実験のために、１２ｍｍのトランスウェルフィルター（細孔径０．４ｍｍ、Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に５×１０５細胞を接種した。細胞を一晩集密まで増殖させ、ＰＢＳで洗浄して、新たな１２ウェルプレートにおいて側底側画分に培地１．５ｍｌおよび頂端画分に培地０．５ｍｌを入れた。充填画分中の培地は、輸送されるＩｇＧおよび受容体を介さない輸送または漏出を評価するための１２５ｐｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓａｎｑｕｉｎ）を含んだ。
【００５０】
１００ｍｌの試料を適切な画分から採取し、ＩｇＧを定量した。頂端から側底側への輸送を、（［ＩｇＧ］側底側×１．５ｍｌ）／（［ＩｇＧ］注入量×０．５ｍｌ）×１００％に従って計算し、側底側から頂端への輸送を（［ＩｇＧ］頂端×０．５ｍｌ）／（［ＩｇＧ］注入量×１．５ｍｌ）×１００％として計算した。すべての実験を３回ずつ実施した。
【００５１】
無ガンマグロブリン血症患者
４週間の間隔を置いてＩＶＩｇで定期的に治療されている、無ガンマグロブリン血症に罹患している３名の患者からの血清試料を、ＩＶＩｇを摂取した４週間後に採取し、以下で述べるようにＩｇＧレベルを測定した。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。
【００５２】
ＩｇＧの定量
血清試料中のＩｇＧサブクラス濃度を、製造者のプロトコールに従って比濁法（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ ＩＩ、Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）によって定量した。他のすべての場合に、ＩｇＧ濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。
【００５３】
Ｇ３ｍ（ｓ）とＧ３ｍ（ｔ）の両方がほとんど独占的に一緒に生じ、Ｇ３ｍ（ｔ）がＧ３ｍ（ｓ）を伴わずに認められることはまれであるため、サブクラス特異的マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１：ＭＨ１６１−１；ＩｇＧ３：ＭＨ１６３−１、Ｓａｎｑｕｉｎ）またはアロタイプ特異的モノクローナル抗Ｇ３ｍ（ｔ）（１５Ａ１０、Ｓａｎｑｕｉｎ）を使用してＧ３ｍ（ｓ，ｔ）ＩｇＧ３を捕捉した。マウスモノクローナル抗ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を、Ｇ３ｍ（ｓ，ｔ）ＥＬＩＳＡを除くすべてのアッセイにおいて検出のために使用し、Ｇ３ｍ（ｓ，ｔ）ＥＬＩＳＡでは、マウスモノクローナル抗ＩｇＧ３−ＨＲＰ（ＭＨ１６３−１、Ｓａｎｑｕｉｎ）を使用した。
【００５４】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の変換を使用してＨＲＰ活性を定量し、４５０ｎｍのＧｅｎｉｏｓ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して吸収を読み取った。輸送のためまたは患者を治療するために使用したのと同じＩｇＧ製剤を用いて標準曲線を作成した。
【００５５】
統計解析およびデータセット
提示するすべてのデータは、各々３回の反復から成る少なくとも３つの独立した実験の平均および標準偏差を示す。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，ＵＳＡ）をすべての統計解析のために使用した。有意性はｐ＝０．０５に設定し、有意性のレベルをすべての数字上に＊：ｐ＝０．０５；＊＊：ｐ＝０．０１；＊＊＊：ｐ＝０．００１として示している。
【００５６】
＜結果＞
ＦｃＲｎを介したＩｇＧ輸送
ＦｃＲｎ陰性ヒト細胞株Ａ３７５は、有意の量のＩｇＧを頂端から側底側画分に輸送することができなかった（図１Ａ）。ＦｃＲｎのα鎖遺伝子での形質導入後（Ａ３７５−ＦｃＲｎ）、これらの細胞は単層を越えてＩｇＧを活発に輸送した。加えて、内因性ＦｃＲｎを発現する、胎盤合胞体栄養細胞層由来のＪＡＲ細胞を横切るＩｇＧ輸送を検討した（図１Ｂ）。
【００５７】
これらの試験のために、すべてのヒトＩｇＧサブタイプの生理的比率（約６０％のＩｇＧ１、３３％のＩｇＧ２、３％のＩｇＧ３、３％のＩｇＧ４）でのポリクローナル混合物、ＩＶＩｇを使用した。すべてのサブクラスの輸送が認められたが、Ａ３７５−ＦｃＲｎはＩｇＧ３より３〜４倍多いＩｇＧ１を輸送し、一方ＪＡＲは両者の等しい量を輸送した。
【００５８】
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡは、ＦｃＲｎと同じ部位でＩｇＧ３を除くすべてのＩｇＧサブクラスに結合する。ＦｃＲｎへの結合に関するＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の競合的阻害剤を、プロテインＡの最小結合ドメイン（Ｚドメイン、５９アミノ酸の三重αらせん構造）を使用して作製した。
【００５９】
輸送実験の前にＩＶＩｇをこのＺドメインと共にインキュベートした場合、理論的最小値である２：１（Ｚ：ＩｇＧ）という低いモル比を使用して、Ａ３７５−ＦｃＲｎ細胞によるＩｇＧ１の輸送がＡ３７５−ＷＴに近いレベルまで低下することが認められた（図１Ａ）。
【００６０】
同様に、Ｚドメインの存在下で、ＪＡＲ細胞によるＩｇＧ１輸送が非特異的輸送に関して認められたレベルまで低下し（図１Ｂ）、両方の細胞型においてＩｇＧ１輸送がＦｃＲｎ依存性であることを明らかにした。
【００６１】
注目すべきことに、Ｚドメインを使用して他のサブクラスのＦｃＲｎを介した輸送を阻害した場合、ＩｇＧ３輸送はＪＡＲ細胞およびＡ３７５−ＦｃＲｎ細胞の両方において有意に上昇し（図１Ａおよび１Ｂ）、その他のＩｇＧサブクラスの活発な輸送がＩｇＧ３輸送を妨げることを指示しした。
【００６２】
ＩｇＧ１はＩｇＧ３の輸送を妨げる
この所見と一致して、骨髄腫ＩｇＧ１またはＩｇＧ３を別々にＡ３７５−ＦｃＲｎに提供した場合、ＩｇＧ１とＩｇＧ３は等しい量で輸送されることが認められた（図２Ａ）。ＪＡＲ細胞は、さらに、個別に提供した場合、ＩｇＧ１よりも最大で５０％多いＩｇＧ３を輸送した（図２Ｂ）。しかし、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の等モル混合物を提供した場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎおよびＪＡＲによるＩｇＧ３輸送は、ＩＶＩｇ輸送実験で見られたように同等のレベルまで低下した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００６３】
これがＦｃＲｎの飽和によるものであるかどうかを試験したが、精製ＩｇＧ１またはＩｇＧ３の濃度を広い範囲にわたって（１μｇ／ｍｌ〜３５０μｇ／ｍｌ）低下または上昇させても、相対的輸送効率には影響を及ぼさなかったので、これについての証拠は見出せなかった（図２Ｃ）。
【００６４】
ＩｇＧ１によるＩｇＧ３輸送の濃度依存的阻害
Ｖ遺伝子を一致させた組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ３を使用して同じ結果を得た。ＩｇＧ３濃度を１０μｇ／ｍｌで一定に保持した場合、１ｎｇ／ｍｌという低いＩｇＧ１濃度で頂端から側底側へのＩｇＧ３輸送が有意に（ｐ＜０．０５）低下した（図３Ａ）。ＩｇＧ１とＩｇＧ３を等モル比で混合した場合、相対的ＩｇＧ３輸送はＩｇＧ３単独の輸送と比較して有意に低下した。ＩｇＧ３輸送の阻害は濃度依存的であり、１０ｎｇ／ｍｌ／サブクラスのＩｇＧ濃度で失われた（図３Ｂ）。注目すべきことに、同じ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）のＩｇＧ１は、１０００倍過剰のＩｇＧ３（１０μｇ／ｍｌ、図３Ａ）を有意に阻害した。
【００６５】
これらのデータは、頂端から側底側へのトランスサイトーシスの間にＩｇＧ１によってＩｇＧ３に及ぼされる阻害が濃度依存的であることを明らかにし、これら２つのサブクラスがＦｃＲｎを介した輸送に関して競合することを示唆した。
【００６６】
ＩｇＧ１によるＩｇＧ３輸送の阻害はＲ４３５によるものである
ＩｇＧ３は、４３５位に、その他のＩｇＧサブクラスで認められるヒスチジンの代わりにアルギニンを含む。これらの相違を既存の結晶構造にモデリングした場合、アルギニンのより長い側鎖がＦｃＲｎ結合ポケットへのＩｇＧの密接な適合を潜在的に破壊することは明らかであったが（図４）、同時に理論的には、ヒスチジンは中性であるがアルギニンが正に荷電するｐＨ７．５でより有利な電荷を伝達し得る。
【００６７】
４３５位のアミノ酸をアラニンに突然変異させた場合、ほとんどすべてのＦｃＲｎ依存性輸送が排除され（図５Ａ）、また３１０位のヒスチジンをアラニンに突然変異させた場合も、特異的ＩｇＧ輸送は見られなかった（データは示していない）。
【００６８】
ＩｇＧ１も、ＩｇＧ３由来のアルギニン残基を含むように、およびその逆にも突然変異させた（それぞれＩｇＧ１−Ｈ４３５ＲおよびＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ）。これらの突然変異は、個別に輸送した場合、いずれのサブクラスの輸送効率にも有意の影響を及ぼさなかった（図５Ａ）。
【００６９】
ＩｇＧ１−ＷＴの存在はＩｇＧ３−ＷＴの輸送効率の低下を生じさせたので、４３５位に突然変異を担持する様々なＩｇＧ１およびＩｇＧ３変異体を１：１の比率で混合した。
【００７０】
ＦｃＲｎに非効率的に結合するＩｇＧ１−Ｈ４３５Ａは、ＦｃＲｎによってほとんどトランスサイトーシスされず（図５Ａ）、ＩｇＧ３の輸送を阻害することもできなかった（図５Ｂ）。重要な点として、輸送コンピテントであるＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ（図５Ａ）がＩｇＧ３の輸送を阻害することができず（図５Ｂ）、ＩｇＧ３とＩｇＧ１の間でのアルギニン／ヒスチジンの相違がＩｇＧ３輸送のＩｇＧ１を介した阻害のために重要であることを指示した。
【００７１】
同様に、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ輸送のレベルは、等しい量のＩｇＧ１変異体（ＩｇＧ１−ＷＴ、ＩｇＧ１−Ｈ４３５ＡまたはＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ）のいずれの存在によっても影響されなかった（図５Ｃ）。
【００７２】
注目すべきことに、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈは、ＩｇＧ１−ＷＴがＩｇＧ３−ＷＴの輸送を阻害した（図５Ｂ）のと同程度にＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒの輸送を阻害し（図５Ｃ）、Ｒ４３５はＦｃＲｎを介した結合と効率的な輸送を可能にするが、Ｈ４３５を含有するＩｇＧが存在する場合はこれに当てはまらないことを明らかにした。
【００７３】
側底側から頂端方向では、しかしながら、ＩｇＧ１はＩｇＧ３輸送に影響を及ぼさなかった（図５Ｄ）。従って、ＩｇＧ１は、頂端から側底側へのＦｃＲｎを介したＩｇＧ３輸送だけを阻害した（図１〜５）。
【００７４】
インビトロでの分解
ＦｃＲｎはリソソーム分解からＩｇＧを救済する責任を担うので、ＩｇＧ１の存在下でのＩｇＧ３の輸送低下が、頂端から側底側への輸送の間にその分解増強を生じさせるか否かを試験した。２４時間後、頂端画分と側底側画分からの種々のＩｇＧ変異体の回収率に大きな差が認められた（図６）。
【００７５】
単独で輸送された場合、最大で９５％までのＩｇＧ１−ＷＴまたはＩｇＧ３−ＷＴが回収できたが、等モル量（１０μｇ／ｍｌ／サブクラス）で混合した場合は、すべてのＩｇＧ１が回収されたが、ＩｇＧ３の初期量の６０％だけしか検出できなかった。
【００７６】
しかし、ＩｇＧ１−ＷＴとＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈを等しい濃度で提供した場合、ＩｇＧ１−ＷＴとＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈの両方の回収率は約９５％であり（図６）、ＩｇＧ１の存在下でのＩｇＧ３の輸送低下および損失増加はもっぱら４３５位のアルギニンによるものであることを指示した。
【００７７】
低濃度のＩｇＧ１によるＩｇＧ３の輸送阻害の低下（図３）と一致して、ＩｇＧ３を低濃度（１０ｎｇ／ｍｌ／サブクラス、データは示していない）のＩｇＧ１と共に輸送した場合、ＩｇＧ３の分解の濃度依存的低下が認められた。輸送効率の低下は、従って、おそらくＦｃＲｎを介した救済の喪失に起因する、より速やかな分解に関連する。
【００７８】
ヒスチジン４３５を含有するＩｇＧ３のインビボでの半減期上昇
ＩｇＧ３内に存在するＲ４３５が、同時にインビボでのＩｇＧ３の低い半減期の原因であるのかどうかを調べるため、種々のＩＶＩｇ由来のＩｇＧ３アロタイプの血清中での持続性をＸ連鎖無ガンマグロブリン血症患者の血清において比較した。
【００７９】
ＩＶＩｇの最後の注射の４週間後に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の相対的量は、これらの患者において、ＩＶＩｇ製剤自体において認められる量と比較して不変であった（図６Ｂ）。予想されたように、総ＩｇＧ３レベルは有意に低下したが、Ｇ３ｍ（ｓ，ｔ）アロタイプのＩｇＧ３の残存する相対的量は有意に増加した。従って、４３５位にヒスチジンまたはアルギニンを含有するＩｇＧ３の天然変異体は、それぞれ低いまたは高い割合の異化作用を示す。
【００８０】
これらのデータを合わせると、より一般的に認められるアロタイプ形態（Ｇ３ｍ（ｂ）、Ｇ３ｍ（ｇ））において存在するＲ４３５は、インビボでのそれらの高い割合の異化作用を説明するのに十分であることを指示する。
【００８１】
＜考察＞
ＩｇＧはヒト胎盤を越えて効率的に輸送され、ＩｇＧの半減期は、ＦｃＲｎという１つの受容体のおかげで、同程度の大きさの血清タンパク質と比較して長い。これに対する唯一の例外は、非ＦｃＲｎ結合タンパク質に匹敵する半減期を有すると記述されている、ヒトＩｇＧ３である。逆に、母体レベルに比べ、ＩｇＧ１よりかなり低いレベルであるが、母体由来のＩｇＧ３が新生児において認められる。
【００８２】
両方の現象を観察して、以下で論じるように、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の間の微妙な相違に説明を求めたが、明確な実験上の証拠は得られなかった。この実施例において、精製ＩｇＧ３のＦｃＲｎを介した輸送は正常であることが認められたが、他のＩｇＧサブクラスの存在下でＩｇＧ３輸送の予想外の阻害が認められた。この阻害は、ＩｇＧ３とその他のＩｇＧサブクラスとの間の１個のアミノ酸の相違によるものであることが判明し、それはインビトロでのＩｇＧ３の分解およびインビボでの異化作用増強と直接相関した。
【００８３】
本実施例では、天然にＦｃＲｎを発現するヒト胎盤由来のＪＡＲ細胞、ＦｃＲｎ発現を欠くヒトＡ３７５細胞、およびヒトＦｃＲｎでトランスフェクトしたＡ３７５細胞を使用して、完全なヒト系において、従っていかなる種間不適合性も排除して、ヒトＩｇＧ輸送を検討した。
【００８４】
特に、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のＦｃＲｎを介した輸送の相違、および４３５位のアミノ酸の相違の影響を検討した。様々なソースのＩｇＧを使用した。ＩＶＩｇ、ミエローマＩｇＧ、ならびにＶ遺伝子がマッチする組換え野生型ＩｇＧ１とＩｇＧ３および４３５位においてのみ異なるそれらの突然変異体。
【００８５】
精製ＩｇＧ１とＩｇＧ３の輸送率は、ＪＡＲ細胞においてＩｇＧ３輸送が比較的高かったことを除き、両方の細胞株ですべてのＩｇＧソースについて同様であり、輸送のためにはＦｃＲｎが必要であるが、別のＦｃＲが関与している可能性があることを示唆した。しかし、ＩｇＧ１とＩｇＧ３を同時に輸送した場合、両方の細胞型においてＩｇＧ３の輸送がＩｇＧ１によって阻害されることが認められた。
【００８６】
この阻害は、ＩＭＩｇから精製したＩｇＧ３と組み合わせたミエローマＩｇＧ１、Ｖ遺伝子適合ＩｇＧ、ならびに阻害が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に特異的なＦｃＲｎ−ＩｇＧ結合のプロテインＡに基づく阻害剤（Ｚドメイン）によって軽減され得るＩＶＩｇに関して認められた。
【００８７】
十分に定義された組換え抗体を使用することにより、認められた阻害が、可変領域、軽鎖アイソタイプにおける相違によって、または他のサブクラスの抗体製剤への混入によって引き起こされた人為的影響に関連する可能性が排除された。
【００８８】
ＦｃＲｎ飽和は、輸送されたＩｇＧの相対的量が、検討した両細胞型について精製ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両方の広い範囲の注入濃度にわたって一定であったため、認められた阻害についての可能性のある説明としては除外された。
【００８９】
ＩｇＧ３の存在または不在も、ＩｇＧ１輸送に影響を及ぼさなかった。ＩｇＧ３輸送のＩｇＧ１誘導性阻害は用量依存的であり、Ｓ字型曲線に沿って上昇し、比較的低い量のＩｇＧ１を必要とした。
【００９０】
４３５位のアミノ酸を、ＩｇＧ１においてヒスチジンからアルギニンまたはアラニンに突然変異させること、またはＩｇＧ３においてアルギニンからヒスチジンに突然変異させることは、ＩｇＧ１によるＦｃＲｎを介したＩｇＧ３輸送の阻害を無効にした。この阻害は、さらに、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３の間で４３５位のアミノ酸（ヒスチジン／アルギニン）を交換することによって（ＩｇＧ１−Ｈ４３５ＲおよびＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈを生じさせる）完全に逆転することができた。４３５位をアラニンに突然変異させると、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方について輸送をほとんどバックグラウンドレベルにまで低下させた。
【００９１】
＜結論＞
ＩｇＧ３は、ＩｇＧ１（免疫療法のために最も一般的に使用されるアイソタイプ）と比較して同等またはより優れたエフェクター機能で知られるが、同時にその短いインビボ半減期でも知られる。
【００９２】
後者の部分に関して、本発明のデータは、Ｒ４３５を含有するＩｇＧ３が、ＦｃＲｎ結合に関する競合に敗れて、リソソーム経路から離れることを示し、インビボでの高い異化作用および胎盤を越えるＩｇＧ３の相対的に低い輸送を説明する。
【００９３】
本発明のデータは、両方のＦｃＲｎを介する作用がＲ４３５をヒスチジンで置換することによって軽減され得ることを明らかにする。これは、最大のエフェクター機能を目指す現在および将来の抗体ベースの治療のために重要な意味を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法、改善された治療効果を有する免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体、および薬剤として、特に免疫療法のための薬剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳児は、自身の適応抗体を介した免疫を獲得するまで、母体から子に能動的に移行されるＩｇＧクラスの母体抗体によって保護されている。ヒトにおいて、胎盤を介したこの子宮内ＩｇＧ移行、または（たとえばげっ歯動物において）出生後の腸上皮を介した母乳からの移行は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって媒介される。
【０００３】
ＦｃＲｎは、β２Ｍと結合した、特異なＨＬＡクラスＩ様α鎖から成るヘテロ二量体である。ＦｃＲｎは、酸性ｐＨ（約６．５）において高い親和性でＩｇＧに結合するが、生理的ｐＨ（約７．４）では結合がほぼ完全に排除される。
【０００４】
インビボでは、結合は、ＩｇＧを含有する血漿の飲作用後に初期エンドソームにおいて起こると推測される。ＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体が形成され、おそらくＦｃＲｎの細胞質側末端における様々なソーティングシグナルによって、リソソーム経路から離れる経路を辿る。
【０００５】
これらの複合体は細胞表面に再循環されるかまたは細胞の反対側に輸送され、そこでＦｃＲｎ−ＩｇＧ複合体を含む小胞が一度にまたは一連の「キス・アンド・ラン」事象において細胞膜と融合する。これらの事象の間に、ｐＨは生理的レベル（約７．４）に戻り、ＩｇＧに対するＦｃＲｎの親和性を大きく低下させる。これは複合体の解離を生じさせ、ＩｇＧは放出されるが、ＦｃＲｎは再循環されてＩｇＧと再結合すると推測される。
【０００６】
ＩｇＧ輸送の他にも、ＦｃＲｎは様々な他の機能を媒介する。たとえば、ＦｃＲｎはアルブミンをリソソーム分解から救済し、食作用において役割を果たすことが示された。
【０００７】
ＩｇＧについてのサルベージ受容体として、ＦｃＲｎは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の高い血漿濃度（総ＩｇＧについて約１０ｍｇ／ｍｌ）に関与すると考えられる。しかし、ＩｇＧ３の血清半減期は他のＩｇＧサブクラスの数分の一に過ぎず、他の血清タンパク質と同等であるので（ＩｇＧ３は約７日間であるのに対し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は約２１日間）、ＦｃＲｎが同じような方法でＩｇＧ３に結合し、輸送し、救済するか否かは明らかでない。ＩｇＧ３について認められる血清半減期に関して少なくとも２つの可能な理論が存在する。
【０００８】
第一に、ＩｇＧ３の比較的長いヒンジ領域は、ＩｇＧ３を、パパイン、プラスミン、トリプシンおよび／またはペプシンのようなタンパク質分解酵素の活性に対してよりアクセスしやすくする。
【０００９】
第二に、ＦｃＲｎによるＩｇＧ３の再循環は、存在するとすれば、他のＩｇＧサブクラスの場合ほど効率的ではないと考えられる。
【００１０】
免疫療法のために一般的に使用されるＩｇＧ１抗体と比較して、ＩｇＧ３抗体は、中でも特に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、および／またはＩｇＧ３を抗体ベースの治療のためのより適切な候補物質とする補体の活性化に関して、改善された治療効果を提供する。
【００１１】
しかし、ＩｇＧ１抗体と比較して、ＩｇＧ３抗体の比較的短い半減期は、それらの治療上の有利な性質にもかかわらず、それらの治療適用を大きく制限してきた。
【発明の概要】
【００１２】
従って、高い治療効果を有するＩｇＧ３抗体、特にＩｇＧ１抗体の血清半減期に匹敵する高い血清半減期を有するＩｇＧ３抗体を提供することが本発明の１つの目的である。
【００１３】
この目的は、いくつかある目的の中でも特に、付属の請求項１に概説される方法によって達成される。
【００１４】
具体的には、この目的は、突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を提供することを含み、この突然変異が、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法によって達成される。そのような突然変異はまた、抗体工学の技術分野においてＲ４３５Ｈ突然変異とも称される。
【００１５】
本明細書で交換可能に使用される、「突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体」または「突然変異ＩｇＧ３」という用語は、天然では認められない、またはポリクローナルもしくはハイブリドーマ技術などの従来の抗体惹起および単離手法を使用して誘導し得るＩｇＧ３抗体を指示する。
【００１６】
本発明の「突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体」または「突然変異ＩｇＧ３」は、たとえば、従来の抗体惹起および単離手法を通して得られる、本明細書では「親」という用語によって指定される抗体を起源とする核酸物質に対して一般的な組換えＤＮＡ技術を使用して誘導される。しかし、本発明の抗体は、その治療効果、特にその血清半減期において、これらの「親」抗体と異なる。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の突然変異ＩｇＧ３は、（本発明の突然変異ＩｇＧ３を提供するために突然変異させる核酸物質のソースを提供する）親ＩｇＧ３と比較して、親ＩｇＧ３の、親和性および特異性などのすべての特徴的な性質を有し、治療効果、特に血清半減期が高いという点においてのみ異なる。
【００１８】
驚くべきことに、本発明者は、ＩｇＧ３重鎖の４３５位のヒスチジン（Ｈ）残基の存在が、ＩｇＧ３抗体のインビボ血清半減期をＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体のインビボ半減期に匹敵するレベル、すなわち約２１日間に上昇させることを発見した。
【００１９】
これまでの試験は、本発明の実施例のように、４３５位にヒスチジン残基を有するＩｇＧ１も、４３５位にアルギニン残基を有するＩｇＧ３も、いずれもＦｃＲｎ受容体による個別の輸送効率が同等であることを示していたので、この作用は意外である。
【００２０】
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のＩｇＧ３抗体、すなわちＩｇＧ３（Ｒ４３５Ｈ）の基礎となる高い血清半減期は、ＦｃＲｎ受容体に対するＩｇＧ１とＩｇＧ３の競合を排除することによって提供されると推測される。インビボで、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方が血清中に存在するが、ＦｃＲｎ受容体に関して競合すること、およびＩｇＧ１に有利なその後のリソソーム分解の細胞救済により、ＩｇＧ１は約２１日間循環中にとどまるが、ＩｇＧ３は他の血清タンパク質と同様の速度、すなわち約７日間で速やかに分解される。
【００２１】
ＩｇＧ３の４３５位のアルギニン（Ｒ）残基のヒスチジン（Ｈ）残基への変換は、ＩｇＧ３と比較したＩｇＧ１のこの競合優位性を排除し、それによってＩｇＧ３の血清半減期をＩｇＧ１、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４に匹敵する半減期まで上昇させる。
【００２２】
本発明によれば、ＩｇＧ３抗体のアミノ酸位置４３５は、Ｋａｂａｔのアミノ酸残基位置定義によるＩｇＧ３抗体の重鎖ＣＨ３ドメインのアミノ酸位置４３５である。
【００２３】
しかし、本発明はまた、Ｋａｂａｔの定義によるＩｇＧ３抗体の重鎖ＣＨ３ドメインの４３５位に対応するまたは等価の位置における他のアルギニン（Ｒ）のヒスチジン（Ｈ）への置換を包含する。
【００２４】
本発明のＩｇＧ３抗体は、親ＩｇＧ３抗体と比較して突然変異している。一般に、本発明の親ＩｇＧ抗体は約７日間の血清半減期を示し、４３５位にアルギニンを含む。本発明のＩｇＧ３抗体は、好ましくは、Ｒ４３５Ｈ突然変異のためにその半減期が約７日間から約２１日間に上昇していることを除き、親ＩｇＧ３抗体と類似の親和性および特異性を示す。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明のＩｇＧ３抗体は、Ｒ４３５Ｈ突然変異を除き、親ＩｇＧ３抗体と実質的に類似のアミノ酸配列を有し、より好ましくは実質的に同一のアミノ酸配列、最も好ましくは同一のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
上記の最も好ましい実施形態のために、本発明はまた、突然変異したＩｇＧ３抗体を提供するための方法に関し、この突然変異は、親ＩｇＧ３抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換から成る。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明の方法によるＩｇＧ３抗体はヒトＩｇＧ３抗体である。本発明の記述中、ヒト抗体は、完全ヒト抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体などの、少なくともヒト由来の定常部分を含む抗体である。
【００２８】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明の方法によるＩｇＧ３抗体は、高いインビボ血清半減期、好ましくは約２１日間、たとえば１９、２０、２１、２２または２３日間の血清半減期を含む高い治療効果を有するＩｇＧ３抗体である。
【００２９】
本発明によれば、本発明のＩｇＧ３抗体は、好ましくは、
（ａ）免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離するステップと、
（ｂ）アミノ酸位置４３５をコードするコドンを、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）をコードするように突然変異させ、突然変異した核酸配列を提供するステップと、
（ｃ）前記突然変異核酸配列を作動可能な発現エレメントとともに提供するステップと、
（ｄ）前記突然変異核酸および免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の軽鎖をコードする核酸配列を適切な宿主において発現させ、それによって突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を提供するステップと、場合により
（ｅ）前記突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を単離するステップと
によって提供される。
【００３０】
ステップ（ｂ）は、アミノ酸位置４３５をコードするコドンを、アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）をコードするように突然変異させ、突然変異した核酸配列を提供するステップを含む。
【００３１】
ステップ（ｄ）による適切な宿主の好ましいコドン使用頻度に依存して、当業者は、ヒスチジンをコードする４３５位の適切なコドンを容易に選択することができる。一般に、大部分の高等真核生物種またはメタノール資化酵母（ピキア・パストリス、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような一部の酵母種に関しては、ステップ（ｂ）は、アミノ酸位置４３５をコードするコドンをＣＡＣまたはＣＡＴに突然変異させ、突然変異した核酸配列を提供することを含む。
【００３２】
もう１つの態様によれば、本発明は、突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体、好ましくはヒト抗体に関し、この突然変異は、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む。
【００３３】
この態様の好ましい実施形態によれば、本発明は、突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体、好ましくはヒト抗体に関し、この突然変異は、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換からなる。
【００３４】
本発明のＩｇＧ３抗体の改善された治療効果、特にそれらの改善された血清半減期を考慮して、本発明は、第三の態様によれば、薬剤としての使用のため、好ましくは、免疫療法、たとえば、好ましくは関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、ならびに非ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、頭頸部がんおよび乳がんを含む多くの形態のがん、および免疫不全症などの免疫療法のための薬剤として使用のための、上記で定義した、突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体に関する。
【００３５】
Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症や低ガンマグロブリン血症などの一部の免疫不全症は、部分的または完全な抗体の欠如を生じさせる。これらの疾患はしばしば、受動免疫と呼ばれる短期的な形態の免疫を誘導することによって治療される。受動免疫は、ヒトまたは動物の血清、プールされた免疫グロブリンまたはモノクローナル抗体の形態で既製抗体を罹患個体に移入することを介して達成される。本発明の高い血清半減期はこれらの疾患の治療に特に適する。
【００３６】
本発明を、付属の図面を参照し、以下の実施例を使用してさらに詳述し、説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＪＡＲおよびＡ３７５におけるＩＶＩｇのＦｃＲｎを介した輸送が、ＩｇＧ１についてはＺドメインによって阻害されるが、ＩｇＧ３に関しては阻害されないことを示す。 図１Ａ：ＦｃＲｎ陰性Ａ３７５−ＷＴ細胞は特異的ＩｇＧトランスサイトーシス（ＩＶＩｇ）を示さず、ＨＲＰ輸送によって測定した受動漏出と同等であった。ＦｃＲｎのα鎖でのトランスフェクション後、Ａ３７５−ＦｃＲｎはＩｇＧを頂端から側底側画分へと極めて効率的に輸送する。ＩＶＩｇを、輸送の前に２：１のモル比（Ｚドメイン：ＩｇＧ）でＺドメイン（プロテインＡの最小ＩｇＧ結合ドメイン）と混合した場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎ細胞によるＩｇＧ１輸送は有意に低下したが、一方ＩｇＧ３輸送は増強された。 図１Ｂ：天然にＦｃＲｎを発現するＪＡＲ細胞は、ＩＶＩｇからＩｇＧ１とＩｇＧ３を等しく良好に輸送した。輸送の前に２：１のモル比でＩＶＩｇをＺドメインと共にインキュベートすると、ＩｇＧ１の輸送は阻害されたが、ＩｇＧ３の輸送は増大した。 Ａ）およびＢ）の両方において１００μｇ／ｍｌのＩＶＩｇを使用した。ＩｇＧ１を白いバーで示し、ＩｇＧ３は斜線を付けたバーで、そしてＨＲＰは黒いバーで示した。Ｙ軸は、頂端画分から側底側画分に輸送されたＩｇＧのパーセンテージを示す。統計比較は、一方向ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定によって実施し、有意性のレベルを「実験材料および方法」の章で定義するように示している。
【図２】ＩｇＧ３の輸送が非飽和条件下でＩｇＧ１によって阻害されることを示す。 図２Ａ：ＩｇＧ３とＩｇＧ１は、頂端から側底側画分に別々に輸送された場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎ細胞において等しく良好にトランスサイトーシスされ、注入量を倍加した場合、どちらもそれら自体の輸送を阻害しなかった。しかし１：１混合物では、ＩｇＧ１の存在下でＩｇＧ３の輸送が低下した。 図２Ｂ：ＪＡＲ細胞では、ＩｇＧ３は、単独で提供された場合、頂端から側底側画分へと効率的に輸送された。輸送されるＩｇＧ１またはＩｇＧ３の量も、頂端濃度を倍加することによって影響を受けなかったが、ＩｇＧ３輸送は、等しい量のＩｇＧ１の存在によって阻害された。 図２Ｃ：１つのサブクラスだけが存在する場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎは一定のパーセンテージのＩｇＧを頂端から側底膜側へと輸送した。ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方について、このパーセンテージは試験した範囲にわたって安定なままであった。 ミエローマＩｇＧ１およびＩＭＩｇ由来のＩｇＧ３をすべての実験のために使用した。データは、各々３つのウェルの３回の独立した実験の平均および標準偏差である。ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方が存在する場合は、両方を同じ試料において独立して測定した。ＩｇＧ１の存在下でのＩｇＧ３の輸送を、角括弧で示すように両側ｔ検定によってＩｇＧ３単独の輸送と比較した。
【図３】ＩｇＧ１によるＩｇＧ３輸送の濃度依存的阻害を示す。 図３Ａ：漸増量のＩｇＧ１の不在下または存在下での組換えＩｇＧ３（１０μｇ／ｍｌ）の頂端から側底側への輸送。ＩｇＧ３輸送は、１ｎｇ／ｍｌ超のＩｇＧが存在する場合、プラトーまで阻害された。すべてのデータポイントを、一方向ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定によってＩｇＧ１なしの試料と比較した。 図３Ｂ：組換えＩｇＧ３単独（点線）または１：１のモル比で漸増濃度のＩｇＧ１と混合したＩｇＧ３（実線）を頂端画分に添加し、側底側画分においてＩｇＧ３を測定した。１μｇ／ｍｌより低い濃度では、ＩｇＧ３の輸送は、ＩｇＧ３を単独で輸送した場合に認められたのと同様のレベルまで上昇した。 ＩｇＧ１とＩｇＧ３の混合輸送からのすべてのデータポイントを、ｔ検定によってＩｇＧ１不在下での対応するＩｇＧ３輸送と比較した。
【図４】Ｆｃと４３５位にモデリングしたアルギニンを伴うラットＦｃＲｎの結晶構造を示す。 図４Ａ：ＩｇＧの結合アミノ酸位置４３５の配向を黄色で示す、ＩｇＧ分子のＦｃ部分を伴うＦｃＲｎの結晶構造。 図４Ｂ：ＦｃＲｎにおける結合ポケットへのＩｇＧのアミノ酸４３５の側鎖（ヒスチジン、緑色で示す）の結合を示す、結合ポケットの拡大図。アルギニンをこの位置にモデリングした場合（黄色で示す）、ＦｃＲｎ表面領域へと突出し、おそらく立体障害を引き起こす。１７から得た結晶学的配位およびモデリングはＶＭＤ１．８．４を使用して実施した。
【図５】４３５位にアルギニンを有するＩｇＧの頂端から側底側への輸送が４３５位にヒスチジンを有するＩｇＧによって阻害されるが、側底側から頂端への輸送は影響されないことを示す。 図５Ａ：ＩｇＧ１（Ｈ４３５）およびＩｇＧ３（Ｒ４３５）における４３５位のアミノ酸をアラニンに突然変異させることは輸送を低下させるが、互いの骨格上のＩｇＧ１にネイティブなヒスチジンとＩｇＧ３にネイティブなアルギニンを交換すると、ＦｃＲｎでトランスフェクトしたＡ３７５細胞に別々に提供した場合、それらの輸送率に影響を及ぼさなかった。 図５Ｂ：ＩｇＧ３−ＷＴの輸送はＩｇＧ１−ＷＴによって阻害されたが、４３５位にアラニンまたはアルギニンを担持するＩｇＧ１はＩｇＧ３の輸送に影響を及ぼさなかった。 図５Ｃ：４３５位にヒスチジンを有するＩｇＧ３の輸送はＷＴのＩｇＧ１によって阻害されなかった。ＩｇＧ１とＩｇＧ３の４３５位に認められるアミノ酸を交換した場合、ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒの輸送はＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈによって阻害された。 図５Ｄ：ＩｇＧ１とＩｇＧ３は、側底側から頂端方向に輸送される場合、両方が単独で輸送される場合、および１：１の比率で混合して輸送される場合は、等しいレベルで輸送された。 ＋／−（ＩｇＧ／ＩｇＧなし）によって示すように、組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ３を、Ａ）およびＤ）の最も左側の２つのバーでは別々に使用し、またはＢ）、Ｃ）およびＤ）の最も右側の２つのバーでは等しい濃度で（１０μｇ／ｍｌ／サブクラス）混合して使用した。突然変異体（４３５Ｈ、４３５Ａ、４３５Ｒ）の存在は対応する文字で示している。ＷＴ ＩｇＧの輸送を、一方向ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定によって突然変異ＩｇＧの輸送と比較し、有意性を「実験材料および方法」の章で述べるように示している。
【図６】インビボおよびインビトロでのＩｇＧ３の異化作用増強がＲ４３５によるものであることを示す。 図６Ａ：集密的なＡ３７５−ＦｃＲｎ単層の頂端画分に添加した総ＩｇＧの約９５％が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３を個別に（１０μｇ／ｍｌ）に添加した場合、２４時間後に頂端画分と側底側画分の両方から回収された。しかし、ＩｇＧ１とＩｇＧ３を等しい量で混合した場合、初期ＩｇＧ３の約６５％が検出でき、ＩｇＧ３がＩｇＧ１の存在下で分解されたことを示唆した。ＩｇＧ１の回収は、ＩｇＧ３が存在しない場合に認められたのと同様であった。ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈは、ＩｇＧ３単独と同様に、２４時間後に約９５％が検出できたので、ＩｇＧ１の存在下でも分解されなかった。 図６Ｂ：ＩＶＩｇによる最後の治療から４週間後の無ガンマグロブリン血症患者からの血清中のＩｇＧサブクラスおよびヒスチジン−４３５を含有するＩｇＧ３アロタイプＧ３ｍ（ｓ、ｔ）を、対応するＩＶＩｇ製剤中で認められるＩｇＧサブクラスおよびＧ３ｍ（ｓ、ｔ）レベルと比較した相対的濃度。 データは、３名の患者からの血清において実施した測定から計算した平均プラス標準偏差を示す。統計比較は、一方向ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定によって実施し、有意性のレベルは「実験材料および方法」の章で定義するように示している。簡潔さのために、有意差は、すべてのサブクラスと比較したＩｇＧ１について、および総ＩｇＧ３とＧ３ｍ（ｓ、ｔ）レベルの間でのみ提示している。
【実施例】
【００３８】
＜序論＞
この実施例では、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のＦｃＲｎを介した輸送における相違を明らかにする。完全なヒトインビトロおよびインビボモデルを使用して、予想外に、ＩｇＧ１とＩｇＧ３がＦｃＲｎを介した輸送および再循環に関して競合することが認められた。本発明のデータは、ＩｇＧ３における４３５位のアルギニンの存在が、インビボで認められたその高い割合の異化作用を説明するのに十分であることを明らかにする。
【００３９】
＜実験材料および方法＞
細胞培養
ヒト絨毛癌細胞（ＪＡＲ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）をＩＭＤＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）において、および黒色腫細胞（Ａ３７５、ＦｃＲｎ−β２ｍ＋、Ｃ．Ｓａｕｔｅｓ−ＦｒｉｄｍａｎおよびＬ．Ｃａｓｓａｒｄの好意により提供された）をＲＰＭＩ １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）において、どちらの培地にもＬ−グルタミン（３００ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ，Ｐａｓｃｈｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ、ＰＡＡ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｂｏｄｉｎｃｏ，Ａｌｋｍａａｒ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を添加して増殖させた。すべての培養は、飽和湿度および空気中５％ＣＯ２において３７℃で実施した。
【００４０】
Ａ３７５−ＦｃＲｎ
ヒトＦｃＲｎのｃＤＮＡを、正プライマー５’ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＴＣ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＣＴ ＣＡＧ Ｃ ３’および逆プライマー５’ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＣＡＣ ３’を使用してＰＣＲによって増幅した。生成物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、ＦｃＲｎ配列を自動ＤＮＡシークエンシング（ＡＢＩ ３７３ Ｓｔｒｅｔｃｈ自動配列決定装置、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって確認した。
【００４１】
完全なＦｃＲｎコード領域を含有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＭＸ−ｐｕｒｏベクター（ＤＮＡＸ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）にサブクローニングし、パッケージングベクターと共に２９３Ｔ細胞４２にトランスフェクトした。上清を使用してＡ３７５細胞をトランスフェクトした。ＦｃＲｎの発現をＭＡｂ−１Ｇ３結合および定量的ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。
【００４２】
ＩｇＧ
市販の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ、Ｓａｎｑｕｉｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を購入した。ミエローマＩｇＧ１は、多発性骨髄腫を有する３名の患者から血清タンパク質沈殿によって入手し、プールした。
【００４３】
簡単に述べると、タンパク質をＤＥＡＥサイズクロマトグラフィーによって分離し、その後セファデックス結合抗サブクラスＩｇＧのカラムを通すことによってＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を除去した。セファロースマトリックス上に固定化したプロテインＡを使用して他のサブクラスを除去することにより、筋肉内Ｉｇ（ＩＭＩｇ、Ｓａｎｑｕｉｎ）からＩｇＧ３を得た。
【００４４】
野生型と突然変異型（ＩｇＧ１−Ｈ４５３Ａ、ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ａ、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ）の両方の組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ３を、製造者の指示に従って２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において生産した。
【００４５】
ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ａは記述されているように作製した。ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ、ＩｇＧ３−Ｒ４３５ＡおよびＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈは、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）および以下のオリゴヌクレオチドプライマーをそれらの相補的な逆プライマーと共に使用して作製した。
ＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ：ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ
ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ａ：ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ
ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ：ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＡＣ ＴＡＣ ＡＣＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ Ｃ
すべての突然変異を発現の前に配列決定によって確認した。
【００４６】
Ｚドメイン
Ｚドメインをコードする遺伝子を、同時に制限部位（ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ）を導入する、プライマーＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＡＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＡＣ（正）およびＣＴＧ ＣＡＧ ＴＴＡ ＴＴＴ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＴＣ（逆）を使用してｐＴｈｉｏ−Ｈｉｓ−ＺＺ２４ベクターからＰＣＲによって増幅し、その後ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）にクローニングした。
【００４７】
ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位を使用して、遺伝子をｐＧＥＸ６．２発現ベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現の前に結果を配列決定によって確認した。
【００４８】
ＰｒｅＳｃｉｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製の間にＧＳＴタグを除去し、その後Ｚドメインを重力流によってグルタチオンセファロース４Ｂカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ，ＵＫ）から溶出させた。最後に、溶出液をＰＢＳに対して透析した。
【００４９】
ＩｇＧトランスサイトーシス
ＩｇＧ輸送実験のために、１２ｍｍのトランスウェルフィルター（細孔径０．４ｍｍ、Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に５×１０５細胞を接種した。細胞を一晩集密まで増殖させ、ＰＢＳで洗浄して、新たな１２ウェルプレートにおいて側底側画分に培地１．５ｍｌおよび頂端画分に培地０．５ｍｌを入れた。充填画分中の培地は、輸送されるＩｇＧおよび受容体を介さない輸送または漏出を評価するための１２５ｐｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓａｎｑｕｉｎ）を含んだ。
【００５０】
１００ｍｌの試料を適切な画分から採取し、ＩｇＧを定量した。頂端から側底側への輸送を、（［ＩｇＧ］側底側×１．５ｍｌ）／（［ＩｇＧ］注入量×０．５ｍｌ）×１００％に従って計算し、側底側から頂端への輸送を（［ＩｇＧ］頂端×０．５ｍｌ）／（［ＩｇＧ］注入量×１．５ｍｌ）×１００％として計算した。すべての実験を３回ずつ実施した。
【００５１】
無ガンマグロブリン血症患者
４週間の間隔を置いてＩＶＩｇで定期的に治療されている、無ガンマグロブリン血症に罹患している３名の患者からの血清試料を、ＩＶＩｇを摂取した４週間後に採取し、以下で述べるようにＩｇＧレベルを測定した。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。
【００５２】
ＩｇＧの定量
血清試料中のＩｇＧサブクラス濃度を、製造者のプロトコールに従って比濁法（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｅｒ ＩＩ、Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）によって定量した。他のすべての場合に、ＩｇＧ濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。
【００５３】
Ｇ３ｍ（ｓ）とＧ３ｍ（ｔ）の両方がほとんど独占的に一緒に生じ、Ｇ３ｍ（ｔ）がＧ３ｍ（ｓ）を伴わずに認められることはまれであるため、サブクラス特異的マウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１：ＭＨ１６１−１；ＩｇＧ３：ＭＨ１６３−１、Ｓａｎｑｕｉｎ）またはアロタイプ特異的モノクローナル抗Ｇ３ｍ（ｔ）（１５Ａ１０、Ｓａｎｑｕｉｎ）を使用してＧ３ｍ（ｓ，ｔ）ＩｇＧ３を捕捉した。マウスモノクローナル抗ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を、Ｇ３ｍ（ｓ，ｔ）ＥＬＩＳＡを除くすべてのアッセイにおいて検出のために使用し、Ｇ３ｍ（ｓ，ｔ）ＥＬＩＳＡでは、マウスモノクローナル抗ＩｇＧ３−ＨＲＰ（ＭＨ１６３−１、Ｓａｎｑｕｉｎ）を使用した。
【００５４】
３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の変換を使用してＨＲＰ活性を定量し、４５０ｎｍのＧｅｎｉｏｓ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して吸収を読み取った。輸送のためまたは患者を治療するために使用したのと同じＩｇＧ製剤を用いて標準曲線を作成した。
【００５５】
統計解析およびデータセット
提示するすべてのデータは、各々３回の反復から成る少なくとも３つの独立した実験の平均および標準偏差を示す。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，ＵＳＡ）をすべての統計解析のために使用した。有意性はｐ＝０．０５に設定し、有意性のレベルをすべての数字上に＊：ｐ＝０．０５；＊＊：ｐ＝０．０１；＊＊＊：ｐ＝０．００１として示している。
【００５６】
＜結果＞
ＦｃＲｎを介したＩｇＧ輸送
ＦｃＲｎ陰性ヒト細胞株Ａ３７５は、有意の量のＩｇＧを頂端から側底側画分に輸送することができなかった（図１Ａ）。ＦｃＲｎのα鎖遺伝子での形質導入後（Ａ３７５−ＦｃＲｎ）、これらの細胞は単層を越えてＩｇＧを活発に輸送した。加えて、内因性ＦｃＲｎを発現する、胎盤合胞体栄養細胞層由来のＪＡＲ細胞を横切るＩｇＧ輸送を検討した（図１Ｂ）。
【００５７】
これらの試験のために、すべてのヒトＩｇＧサブタイプの生理的比率（約６０％のＩｇＧ１、３３％のＩｇＧ２、３％のＩｇＧ３、３％のＩｇＧ４）でのポリクローナル混合物、ＩＶＩｇを使用した。すべてのサブクラスの輸送が認められたが、Ａ３７５−ＦｃＲｎはＩｇＧ３より３〜４倍多いＩｇＧ１を輸送し、一方ＪＡＲは両者の等しい量を輸送した。
【００５８】
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡは、ＦｃＲｎと同じ部位でＩｇＧ３を除くすべてのＩｇＧサブクラスに結合する。ＦｃＲｎへの結合に関するＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の競合的阻害剤を、プロテインＡの最小結合ドメイン（Ｚドメイン、５９アミノ酸の三重αらせん構造）を使用して作製した。
【００５９】
輸送実験の前にＩＶＩｇをこのＺドメインと共にインキュベートした場合、理論的最小値である２：１（Ｚ：ＩｇＧ）という低いモル比を使用して、Ａ３７５−ＦｃＲｎ細胞によるＩｇＧ１の輸送がＡ３７５−ＷＴに近いレベルまで低下することが認められた（図１Ａ）。
【００６０】
同様に、Ｚドメインの存在下で、ＪＡＲ細胞によるＩｇＧ１輸送が非特異的輸送に関して認められたレベルまで低下し（図１Ｂ）、両方の細胞型においてＩｇＧ１輸送がＦｃＲｎ依存性であることを明らかにした。
【００６１】
注目すべきことに、Ｚドメインを使用して他のサブクラスのＦｃＲｎを介した輸送を阻害した場合、ＩｇＧ３輸送はＪＡＲ細胞およびＡ３７５−ＦｃＲｎ細胞の両方において有意に上昇し（図１Ａおよび１Ｂ）、その他のＩｇＧサブクラスの活発な輸送がＩｇＧ３輸送を妨げることを指示しした。
【００６２】
ＩｇＧ１はＩｇＧ３の輸送を妨げる
この所見と一致して、骨髄腫ＩｇＧ１またはＩｇＧ３を別々にＡ３７５−ＦｃＲｎに提供した場合、ＩｇＧ１とＩｇＧ３は等しい量で輸送されることが認められた（図２Ａ）。ＪＡＲ細胞は、さらに、個別に提供した場合、ＩｇＧ１よりも最大で５０％多いＩｇＧ３を輸送した（図２Ｂ）。しかし、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の等モル混合物を提供した場合、Ａ３７５−ＦｃＲｎおよびＪＡＲによるＩｇＧ３輸送は、ＩＶＩｇ輸送実験で見られたように同等のレベルまで低下した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００６３】
これがＦｃＲｎの飽和によるものであるかどうかを試験したが、精製ＩｇＧ１またはＩｇＧ３の濃度を広い範囲にわたって（１μｇ／ｍｌ〜３５０μｇ／ｍｌ）低下または上昇させても、相対的輸送効率には影響を及ぼさなかったので、これについての証拠は見出せなかった（図２Ｃ）。
【００６４】
ＩｇＧ１によるＩｇＧ３輸送の濃度依存的阻害
Ｖ遺伝子を一致させた組換えＩｇＧ１およびＩｇＧ３を使用して同じ結果を得た。ＩｇＧ３濃度を１０μｇ／ｍｌで一定に保持した場合、１ｎｇ／ｍｌという低いＩｇＧ１濃度で頂端から側底側へのＩｇＧ３輸送が有意に（ｐ＜０．０５）低下した（図３Ａ）。ＩｇＧ１とＩｇＧ３を等モル比で混合した場合、相対的ＩｇＧ３輸送はＩｇＧ３単独の輸送と比較して有意に低下した。ＩｇＧ３輸送の阻害は濃度依存的であり、１０ｎｇ／ｍｌ／サブクラスのＩｇＧ濃度で失われた（図３Ｂ）。注目すべきことに、同じ濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）のＩｇＧ１は、１０００倍過剰のＩｇＧ３（１０μｇ／ｍｌ、図３Ａ）を有意に阻害した。
【００６５】
これらのデータは、頂端から側底側へのトランスサイトーシスの間にＩｇＧ１によってＩｇＧ３に及ぼされる阻害が濃度依存的であることを明らかにし、これら２つのサブクラスがＦｃＲｎを介した輸送に関して競合することを示唆した。
【００６６】
ＩｇＧ１によるＩｇＧ３輸送の阻害はＲ４３５によるものである
ＩｇＧ３は、４３５位に、その他のＩｇＧサブクラスで認められるヒスチジンの代わりにアルギニンを含む。これらの相違を既存の結晶構造にモデリングした場合、アルギニンのより長い側鎖がＦｃＲｎ結合ポケットへのＩｇＧの密接な適合を潜在的に破壊することは明らかであったが（図４）、同時に理論的には、ヒスチジンは中性であるがアルギニンが正に荷電するｐＨ７．５でより有利な電荷を伝達し得る。
【００６７】
４３５位のアミノ酸をアラニンに突然変異させた場合、ほとんどすべてのＦｃＲｎ依存性輸送が排除され（図５Ａ）、また３１０位のヒスチジンをアラニンに突然変異させた場合も、特異的ＩｇＧ輸送は見られなかった（データは示していない）。
【００６８】
ＩｇＧ１も、ＩｇＧ３由来のアルギニン残基を含むように、およびその逆にも突然変異させた（それぞれＩｇＧ１−Ｈ４３５ＲおよびＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ）。これらの突然変異は、個別に輸送した場合、いずれのサブクラスの輸送効率にも有意の影響を及ぼさなかった（図５Ａ）。
【００６９】
ＩｇＧ１−ＷＴの存在はＩｇＧ３−ＷＴの輸送効率の低下を生じさせたので、４３５位に突然変異を担持する様々なＩｇＧ１およびＩｇＧ３変異体を１：１の比率で混合した。
【００７０】
ＦｃＲｎに非効率的に結合するＩｇＧ１−Ｈ４３５Ａは、ＦｃＲｎによってほとんどトランスサイトーシスされず（図５Ａ）、ＩｇＧ３の輸送を阻害することもできなかった（図５Ｂ）。重要な点として、輸送コンピテントであるＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ（図５Ａ）がＩｇＧ３の輸送を阻害することができず（図５Ｂ）、ＩｇＧ３とＩｇＧ１の間でのアルギニン／ヒスチジンの相違がＩｇＧ３輸送のＩｇＧ１を介した阻害のために重要であることを指示した。
【００７１】
同様に、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈ輸送のレベルは、等しい量のＩｇＧ１変異体（ＩｇＧ１−ＷＴ、ＩｇＧ１−Ｈ４３５ＡまたはＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒ）のいずれの存在によっても影響されなかった（図５Ｃ）。
【００７２】
注目すべきことに、ＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈは、ＩｇＧ１−ＷＴがＩｇＧ３−ＷＴの輸送を阻害した（図５Ｂ）のと同程度にＩｇＧ１−Ｈ４３５Ｒの輸送を阻害し（図５Ｃ）、Ｒ４３５はＦｃＲｎを介した結合と効率的な輸送を可能にするが、Ｈ４３５を含有するＩｇＧが存在する場合はこれに当てはまらないことを明らかにした。
【００７３】
側底側から頂端方向では、しかしながら、ＩｇＧ１はＩｇＧ３輸送に影響を及ぼさなかった（図５Ｄ）。従って、ＩｇＧ１は、頂端から側底側へのＦｃＲｎを介したＩｇＧ３輸送だけを阻害した（図１〜５）。
【００７４】
インビトロでの分解
ＦｃＲｎはリソソーム分解からＩｇＧを救済する責任を担うので、ＩｇＧ１の存在下でのＩｇＧ３の輸送低下が、頂端から側底側への輸送の間にその分解増強を生じさせるか否かを試験した。２４時間後、頂端画分と側底側画分からの種々のＩｇＧ変異体の回収率に大きな差が認められた（図６）。
【００７５】
単独で輸送された場合、最大で９５％までのＩｇＧ１−ＷＴまたはＩｇＧ３−ＷＴが回収できたが、等モル量（１０μｇ／ｍｌ／サブクラス）で混合した場合は、すべてのＩｇＧ１が回収されたが、ＩｇＧ３の初期量の６０％だけしか検出できなかった。
【００７６】
しかし、ＩｇＧ１−ＷＴとＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈを等しい濃度で提供した場合、ＩｇＧ１−ＷＴとＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈの両方の回収率は約９５％であり（図６）、ＩｇＧ１の存在下でのＩｇＧ３の輸送低下および損失増加はもっぱら４３５位のアルギニンによるものであることを指示した。
【００７７】
低濃度のＩｇＧ１によるＩｇＧ３の輸送阻害の低下（図３）と一致して、ＩｇＧ３を低濃度（１０ｎｇ／ｍｌ／サブクラス、データは示していない）のＩｇＧ１と共に輸送した場合、ＩｇＧ３の分解の濃度依存的低下が認められた。輸送効率の低下は、従って、おそらくＦｃＲｎを介した救済の喪失に起因する、より速やかな分解に関連する。
【００７８】
ヒスチジン４３５を含有するＩｇＧ３のインビボでの半減期上昇
ＩｇＧ３内に存在するＲ４３５が、同時にインビボでのＩｇＧ３の低い半減期の原因であるのかどうかを調べるため、種々のＩＶＩｇ由来のＩｇＧ３アロタイプの血清中での持続性をＸ連鎖無ガンマグロブリン血症患者の血清において比較した。
【００７９】
ＩＶＩｇの最後の注射の４週間後に、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の相対的量は、これらの患者において、ＩＶＩｇ製剤自体において認められる量と比較して不変であった（図６Ｂ）。予想されたように、総ＩｇＧ３レベルは有意に低下したが、Ｇ３ｍ（ｓ，ｔ）アロタイプのＩｇＧ３の残存する相対的量は有意に増加した。従って、４３５位にヒスチジンまたはアルギニンを含有するＩｇＧ３の天然変異体は、それぞれ低いまたは高い割合の異化作用を示す。
【００８０】
これらのデータを合わせると、より一般的に認められるアロタイプ形態（Ｇ３ｍ（ｂ）、Ｇ３ｍ（ｇ））において存在するＲ４３５は、インビボでのそれらの高い割合の異化作用を説明するのに十分であることを指示する。
【００８１】
＜考察＞
ＩｇＧはヒト胎盤を越えて効率的に輸送され、ＩｇＧの半減期は、ＦｃＲｎという１つの受容体のおかげで、同程度の大きさの血清タンパク質と比較して長い。これに対する唯一の例外は、非ＦｃＲｎ結合タンパク質に匹敵する半減期を有すると記述されている、ヒトＩｇＧ３である。逆に、母体レベルに比べ、ＩｇＧ１よりかなり低いレベルであるが、母体由来のＩｇＧ３が新生児において認められる。
【００８２】
両方の現象を観察して、以下で論じるように、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の間の微妙な相違に説明を求めたが、明確な実験上の証拠は得られなかった。この実施例において、精製ＩｇＧ３のＦｃＲｎを介した輸送は正常であることが認められたが、他のＩｇＧサブクラスの存在下でＩｇＧ３輸送の予想外の阻害が認められた。この阻害は、ＩｇＧ３とその他のＩｇＧサブクラスとの間の１個のアミノ酸の相違によるものであることが判明し、それはインビトロでのＩｇＧ３の分解およびインビボでの異化作用増強と直接相関した。
【００８３】
本実施例では、天然にＦｃＲｎを発現するヒト胎盤由来のＪＡＲ細胞、ＦｃＲｎ発現を欠くヒトＡ３７５細胞、およびヒトＦｃＲｎでトランスフェクトしたＡ３７５細胞を使用して、完全なヒト系において、従っていかなる種間不適合性も排除して、ヒトＩｇＧ輸送を検討した。
【００８４】
特に、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のＦｃＲｎを介した輸送の相違、および４３５位のアミノ酸の相違の影響を検討した。様々なソースのＩｇＧを使用した。ＩＶＩｇ、ミエローマＩｇＧ、ならびにＶ遺伝子がマッチする組換え野生型ＩｇＧ１とＩｇＧ３および４３５位においてのみ異なるそれらの突然変異体。
【００８５】
精製ＩｇＧ１とＩｇＧ３の輸送率は、ＪＡＲ細胞においてＩｇＧ３輸送が比較的高かったことを除き、両方の細胞株ですべてのＩｇＧソースについて同様であり、輸送のためにはＦｃＲｎが必要であるが、別のＦｃＲが関与している可能性があることを示唆した。しかし、ＩｇＧ１とＩｇＧ３を同時に輸送した場合、両方の細胞型においてＩｇＧ３の輸送がＩｇＧ１によって阻害されることが認められた。
【００８６】
この阻害は、ＩＭＩｇから精製したＩｇＧ３と組み合わせたミエローマＩｇＧ１、Ｖ遺伝子適合ＩｇＧ、ならびに阻害が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４に特異的なＦｃＲｎ−ＩｇＧ結合のプロテインＡに基づく阻害剤（Ｚドメイン）によって軽減され得るＩＶＩｇに関して認められた。
【００８７】
十分に定義された組換え抗体を使用することにより、認められた阻害が、可変領域、軽鎖アイソタイプにおける相違によって、または他のサブクラスの抗体製剤への混入によって引き起こされた人為的影響に関連する可能性が排除された。
【００８８】
ＦｃＲｎ飽和は、輸送されたＩｇＧの相対的量が、検討した両細胞型について精製ＩｇＧ１およびＩｇＧ３の両方の広い範囲の注入濃度にわたって一定であったため、認められた阻害についての可能性のある説明としては除外された。
【００８９】
ＩｇＧ３の存在または不在も、ＩｇＧ１輸送に影響を及ぼさなかった。ＩｇＧ３輸送のＩｇＧ１誘導性阻害は用量依存的であり、Ｓ字型曲線に沿って上昇し、比較的低い量のＩｇＧ１を必要とした。
【００９０】
４３５位のアミノ酸を、ＩｇＧ１においてヒスチジンからアルギニンまたはアラニンに突然変異させること、またはＩｇＧ３においてアルギニンからヒスチジンに突然変異させることは、ＩｇＧ１によるＦｃＲｎを介したＩｇＧ３輸送の阻害を無効にした。この阻害は、さらに、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３の間で４３５位のアミノ酸（ヒスチジン／アルギニン）を交換することによって（ＩｇＧ１−Ｈ４３５ＲおよびＩｇＧ３−Ｒ４３５Ｈを生じさせる）完全に逆転することができた。４３５位をアラニンに突然変異させると、ＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方について輸送をほとんどバックグラウンドレベルにまで低下させた。
【００９１】
＜結論＞
ＩｇＧ３は、ＩｇＧ１（免疫療法のために最も一般的に使用されるアイソタイプ）と比較して同等またはより優れたエフェクター機能で知られるが、同時にその短いインビボ半減期でも知られる。
【００９２】
後者の部分に関して、本発明のデータは、Ｒ４３５を含有するＩｇＧ３が、ＦｃＲｎ結合に関する競合に敗れて、リソソーム経路から離れることを示し、インビボでの高い異化作用および胎盤を越えるＩｇＧ３の相対的に低い輸送を説明する。
【００９３】
本発明のデータは、両方のＦｃＲｎを介する作用がＲ４３５をヒスチジンで置換することによって軽減され得ることを明らかにする。これは、最大のエフェクター機能を目指す現在および将来の抗体ベースの治療のために重要な意味を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を準備するステップを含み、前記突然変異が、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法。
【請求項２】
前記突然変異が、前記親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、前記ＣＨ３ドメイン内の４３５位の前記アミノ酸アルギニン（Ｒ）の前記アミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体がヒト免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療効果を高めることが、インビボでの半減期を高めることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を準備するステップが、
ａ）免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離するステップと、
ｂ）突然変異した核酸配列を提供するために、アミノ酸位置４３５をコードするコドンを、前記アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）をコードするように突然変異させるステップと、
ｃ）前記突然変異核酸配列を作動可能な発現エレメントとともに提供するステップと、
ｄ）前記突然変異核酸と免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の軽鎖をコードする核酸配列とを適切な宿主において発現させ、それによって突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を提供するステップと、
任意選択的に、
ｅ）前記突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を単離するステップと
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体であって、前記突然変異が、前記親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、前記ＣＨ３ドメイン内の４３５位の前記アミノ酸アルギニン（Ｒ）の前記アミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む、突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項７】
前記突然変異が、前記親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位の前記アミノ酸アルギニン（Ｒ）の前記アミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換から成る、請求項６に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体がヒト免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体である、請求項６または請求項７に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって得られる突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項１０】
薬剤としての使用のための、請求項６〜９のいずれか一項に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項１１】
免疫療法のための、請求項６〜９のいずれか一項に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項１】
突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を準備するステップを含み、前記突然変異が、親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）のアミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む、免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の治療効果を高めるための方法。
【請求項２】
前記突然変異が、前記親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、前記ＣＨ３ドメイン内の４３５位の前記アミノ酸アルギニン（Ｒ）の前記アミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体がヒト免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療効果を高めることが、インビボでの半減期を高めることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を準備するステップが、
ａ）免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離するステップと、
ｂ）突然変異した核酸配列を提供するために、アミノ酸位置４３５をコードするコドンを、前記アミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）をコードするように突然変異させるステップと、
ｃ）前記突然変異核酸配列を作動可能な発現エレメントとともに提供するステップと、
ｄ）前記突然変異核酸と免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体の軽鎖をコードする核酸配列とを適切な宿主において発現させ、それによって突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を提供するステップと、
任意選択的に、
ｅ）前記突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体を単離するステップと
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
突然変異した免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体であって、前記突然変異が、前記親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、前記ＣＨ３ドメイン内の４３５位の前記アミノ酸アルギニン（Ｒ）の前記アミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換を含む、突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項７】
前記突然変異が、前記親免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体と比較して、ＣＨ３ドメイン内の４３５位の前記アミノ酸アルギニン（Ｒ）の前記アミノ酸ヒスチジン（Ｈ）による置換から成る、請求項６に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体がヒト免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体である、請求項６または請求項７に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって得られる突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項１０】
薬剤としての使用のための、請求項６〜９のいずれか一項に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【請求項１１】
免疫療法のための、請求項６〜９のいずれか一項に記載の突然変異免疫グロブリンＧクラス３（ＩｇＧ３）抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５０９９５１（Ｐ２０１１−５０９９５１Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４２５１６（Ｐ２０１０−５４２５１６）
【出願日】平成２０年１月１８日（２００８．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０００３７３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８９８４６
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５１０１９７１３９）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１８日（２００８．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０００３７３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８９８４６
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５１０１９７１３９）
【Ｆターム（参考）】
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