免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドおよびその使用
本明細書は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を惹起する組成物および方法を提供する。より詳細には、組成物および方法は、ＰｃｐＡのフラグメントおよびその変異体を含む免疫原性ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドをコードするかまたは発現する核酸、ベクターおよびトランスフェクト細胞に関する。免疫原性ポリペプチドを製造および使用する方法についても記載する。該組成物および方法を用いれば、肺炎球菌感染症を軽減または防止するように設計された現在入手可能な組成物および方法と比べ、有効性および効率が向上し、費用が削減される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００６年８月１７日に出願された米国特許出願第６０／８２２，７１５号、２００６年９月２８日に出願された同第６０／８２７，３４８号、および２００７年５月１０日に出願された同第６０／９１７，１７８号に対する優先権を主張し、米国特許出願第６０／８２２，７１５号、同第６０／８２７，３４８号、および同第６０／９１７，１７８号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府により助成された研究に関する申告）
本発明は、国立衛生研究所からの助成金第Ｒ０１ ＡＩ０５３７４９号、同第Ｒ０１ ＡＩ２１５４８号、および同第Ｔ３２ ＨＬ ０７５５３号のもと政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはかなり広範囲に存在するヒト病原体であり、肺、中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）、中耳および鼻道（ｎａｓａｌ ｔｒａｃｔ）などのいくつかの器官に感染する場合がある。感染すると、気管支炎、肺炎、髄膜炎、副鼻腔感染症および敗血症など様々な症状を引き起こす。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒトの細菌性髄膜炎の主な原因であり、抗生物質による処置を行っても死亡率および罹患率が高いことと関係がある（非特許文献１）。
【０００４】
現在、２種類の肺炎球菌ワクチンが利用できる。１つは２３種の莢膜多糖類からなる成人用ワクチンで、この２３種を合わせると、肺炎球菌感染症の原因となる菌の約９０％の莢膜型を占める。しかしながら、このワクチンは、小児、すなわち、肺炎球菌感染症に対する感受性が高い年齢群には免疫原性がない。成人にあっては、このワクチンは、菌血症性の肺炎に対して有効性が約６０％であるがことが明らかになってはいるものの、年齢または基礎的な医学的状態が原因で肺炎球菌感染症の危険性が高まると、成人でも有効性が低下する（非特許文献２；非特許文献３）。このワクチンは、最も一般的な感染形態である非菌血症性の肺炎球菌性肺炎に対して効果的であることが明らかにされていない。
【０００５】
利用可能なもう１つのワクチンは、２歳未満の小児の菌血症性肺炎球菌感染症に対して有効な７価コンジュゲートワクチンである。このワクチンは、肺炎に対する有効性も証明されている（非特許文献４；非特許文献５）。このワクチンは、７種のコンジュゲートを製造する必要があるため製造が複雑であることから、高価なものになっている（小児１人当たり約＄２００）。さらに、非ワクチン型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが非常に多い発展途上国世界の感染症をカバーするのにあまり役に立たない（非特許文献６；非特許文献７）。このワクチンは、中耳炎および定着に対しては侵襲性疾患に対してほど効かない。また、７価コンジュゲートワクチンを使用すると定着が促進され、ワクチンに含まれる７多糖類でない莢膜型の菌による疾患が増加することも明らかになっている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。故に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの効果的な処置剤が依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｑｕａｇｌｉａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：８６４−８７２
【非特許文献２】Ｆｅｄｓｏｎ，ａｎｄ Ｍｕｓｈｅｒ．２００４．「Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ，」ｐｐ．５２９−５８８．Ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｓ．Ａ．Ｐｌｏｔｋｉｎ ａｎｄ Ｗ．Ａ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ（ｅｄｓ．），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
【非特許文献３】Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ，Ｍｅｄ．３２５：１４５３−１４６０（１９９１）
【非特許文献４】Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１：８１０−５（２００２）
【非特許文献５】Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐｅｄｉａｔｒ．ｌｌ（７）：８４３−５３（２００４）
【非特許文献６】Ｄｉ Ｆａｂｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．２０：９５９−９６７（２００１）
【非特許文献７】Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄ，Ｔｒａｐ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ １０：４９７−５００（２００５）
【非特許文献８】Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４：１４４−１５４（２００４）
【非特許文献９】Ｅｓｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：４０３−４０９（２００１）
【非特許文献１０】Ｍｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１８０：１１７１−１１７６（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を惹起する組成物および方法について説明する。より詳細には、本開示は、ＰｃｐＡのフラグメントおよびその変異体ならびにポリペプチドをコードする核酸など、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドに関する。本開示はさらに、免疫原性ポリペプチドの製造および使用の方法にも関する。こうした組成物および方法を用いれば、肺炎球菌感染症を軽減または防止するように設計された現在入手可能な組成物および方法と比べ、有効性および効率が向上し、費用が削減される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＰＣＲによるｐｃｐＡの確認を示す。様々なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株のゲノムＤＮＡをＰＣＲ解析した。プライマー対（ＢＧＰ１（配列番号５０）およびＢＧＰ２（配列番号５１））を用いてＰｃｐＡのＮ末端部分（ＬＲＲ領域を含む）をコードする核酸を増幅した。レーン１は、ＴＩＧＲ４；レーン２は、Ｌ８２０１３；レーン３は、Ｄ１０９１Ｂ；レーン４は、ＢＧ１２７３０；レーン５は、ＴＪ０８９３；レーン６は、Ｒ６；レーン７は、ＢＧ１０７５２；レーン８は、Ｖ１７５；レーン９は、ＥＦ３０３０；レーン１０は、陰性対照（鋳型ＤＮＡなし）である。
【図２】図２は、低Ｍｎ２＋条件下でのＰｃｐＡの存在に関するウエスタンブロット解析を示す。バクテリアを中間対数期まで低Ｍｎ２＋培地で培養し、全細胞タンパク質サンプルを調製した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースにトランスファーして、ｒＰｃｐＡポリクローナル抗血清でプローブした。レーン１は、ＪＥＮ１１（ｐｃｐＡ−ミュータント）；レーン２は、ＪＥＮ７（ｐｃｐＡの構成的ミュータント）；レーン３は、Ｄ１０９１Ｂ；レーン４は、ＥＦ５６６８；レーン５は、ＢＧ１０７５２；レーン６は、Ｖ１７５；レーン７は、Ｌ８２０１３；レーン８は、ＢＧ１２７３０；レーン９は、ＴＪ０８９３である。
【図３Ａ】図３は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡの免疫により得られる保護作用がアジュバント単独の場合と比べて統計学的に有意であることを示す。ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに吸着したｒＰｃｐＡまたは水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫した。軽麻酔下でマウスにＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、肺ホモジネート（図３Ａ）および鼻洗浄液（図３Ｂ）の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．００１９、マンホイットニー）。
【図３Ｂ】図３は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡの免疫により得られる保護作用がアジュバント単独の場合と比べて統計学的に有意であることを示す。ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに吸着したｒＰｃｐＡまたは水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫した。軽麻酔下でマウスにＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、肺ホモジネート（図３Ａ）および鼻洗浄液（図３Ｂ）の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．００１９、マンホイットニー）。
【図４Ａ】図４は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる他のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜血清型に対する保護作用が、アジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。マウスに、ＴＪ０８９３株、血清型１４株（図４Ａ）（＊＊：ｐ＝０．０２０９）；Ｌ８２０１６株、血清型６Ｂ（図４Ｂ）（＊＊：ｐ＝０．０１９３）；またはＥＦ９３０３株、血清型２３Ｆ（図４Ｃ）（＊＊：ｐ＝０．０３８８、マンホイットニー）をチャレンジした。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。
【図４Ｂ】図４は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる他のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜血清型に対する保護作用が、アジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。マウスに、ＴＪ０８９３株、血清型１４株（図４Ａ）（＊＊：ｐ＝０．０２０９）；Ｌ８２０１６株、血清型６Ｂ（図４Ｂ）（＊＊：ｐ＝０．０１９３）；またはＥＦ９３０３株、血清型２３Ｆ（図４Ｃ）（＊＊：ｐ＝０．０３８８、マンホイットニー）をチャレンジした。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。
【図４Ｃ】図４は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる他のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜血清型に対する保護作用が、アジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。マウスに、ＴＪ０８９３株、血清型１４株（図４Ａ）（＊＊：ｐ＝０．０２０９）；Ｌ８２０１６株、血清型６Ｂ（図４Ｂ）（＊＊：ｐ＝０．０１９３）；またはＥＦ９３０３株、血清型２３Ｆ（図４Ｃ）（＊＊：ｐ＝０．０３８８、マンホイットニー）をチャレンジした。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。
【図５】図５は、ｐｃｐＡ不活性化がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの鼻腔内定着に与える作用を示す。マウスにＥＦ３０３０またはその誘導体ＪＥＮ１８を１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、鼻洗浄液の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／Ｎｏｓｅの中央値を示す。
【図６】図６は、致死性の敗血症のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる保護作用がアジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに吸着したｒＰｃｐＡまたは水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫した。マウスにＴＩＧＲ４を３００ＣＦＵ静脈内チャレンジし、生存時間を２１日間モニターした。水平線は、生存時間の中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．００６７、マンホイットニー）。生存しているマウスを安楽死させ、検査したが、その血液中にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出できなかった。
【図７】図７は、敗血症のマウスモデルにおけるＴＩＧＲ４およびそのｐｃｐＡ不活化誘導体ＪＥＮ１１のビルレンスを示す。マウスにＴＩＧＲ４またはＪＥＮ１１を３００ＣＦＵ静脈内チャレンジし、生存時間を２１日間モニターした。水平線は、生存時間の中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．０２９９、マンホイットニー）。
【図８】図８は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡの粘膜免疫によりアジュバント単独の場合と比較して保護作用が得られることを示す。ＣＢＡ／ＮマウスにｒＰｃｐＡとコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、またはＣＴＢを単独で鼻腔内免疫した。軽麻酔下で、マウスにＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、ホモジナイズした肺中の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。（＊：ｐ＝０．０００１、マンホイットニー）。
【図９】図９は、ヒト肺上皮細胞へのｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株（それぞれＴＩＧＲ４およびＪＥＮ１１）の付着を示す。Ａ５４９ヒト肺上皮細胞の単層を、高マンガン（高Ｍｎ２＋）または低マンガン（低Ｍｎ２＋）の増殖条件下で増幅させておいたｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。この上皮細胞を洗浄し、溶解させた。各ライセート中の付着肺炎球菌の数を血液寒天プレートの定量プレーティングで判定した。回収Ｌｏｇ１０ＣＦＵとは、実験の終了時に肺上皮細胞に関連した肺炎球菌の数をいう。（＊＊：ｐ＝０．００２２、マンホイットニー）。
【図１０】図１０は、ｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株がヒト鼻上皮細胞に付着しなかったことを示す。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト鼻上皮細胞の単層を、高マンガン（高Ｍｎ２＋）または低マンガン（低Ｍｎ２＋）増殖条件下で増幅させておいたｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。次に、この細胞を洗浄し、溶解させた。ライセート中の肺炎球菌の数を血液寒天プレートの定量プレーティングで判定した。回収Ｌｏｇ１０ＣＦＵとは、実験の終了時の肺炎球菌の数をいう。
【図１１】図１１は、Ａ５４９細胞への肺炎球菌の付着が、ＰｃｐＡに対する抗体により阻害されることを示す。Ａ５４９ヒト肺上皮細胞の単層を、抗体なし、１／１００に希釈したＰｃｐＡ抗体または１／５０に希釈したＰｃｐＡ抗体を用いて高マンガン（高Ｍｎ２＋）または低マンガン（低Ｍｎ２＋）で増幅させたｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、溶解させた。ライセート中の肺炎球菌の数を血液寒天プレートの定量プレーティングで判定した。
【図１２】図１２は、ＰｃｐＡに対するウサギ血清による敗血症に対する保護作用を示す。完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡでウサギを免疫して、続いて２週後および４週後に完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡでウサギを免疫してウサギ血清を調製した。最終ブーストから２週間後に血清を採取し、ドットブロットアッセイを行ったところＰｃｐＡに対する抗体を含むことが示された。免疫の開始前に免疫前血清も採取しておいた。２つの群を用いてウサギ抗血清の希釈液が致死性の肺炎球菌感染症を防止できるかどうかマウスを検査した。ＴＩＧＲ４の静脈内チャレンジの１時間前にマウスの３つの群に１／１０、１／１００または１／１０００に希釈した免疫血清を０．１ｍＬ腹腔内投与した。２匹のマウスに１／１０免疫前（非免疫）ウサギ血清を投与し、２匹のマウスに希釈液（ＰＢＳ）のみを投与した。マウスを５００時間または死亡時まで観察した。１／１０免疫血清を投与したマウス２匹は、実験を通して生存した。他のマウスはすべて、チャレンジ後４０〜６０時間後に死亡した。
【図１３】図１３は、ＰｃｐＡおよびニューモリシン（Ｐｌｙ）による肺感染に対する保護作用を示す。マウスに５μｇのｒＰｃｐＡ、５μｇのニューモリシン（Ｐｌｙ）または５μｇのｒＰｃｐＡと５μｇのＰｌｙを３回免疫した。最初に２回の注射ではａｌｕｍを用い、３回目の注射はタンパク質単独で行った。使用したＰｌｙは、野生型Ｐｌｙであった。マウスをイソフルラン（ミンラド，バッファロー，ニューヨーク州）で麻酔（ａｎｅｔｈｅｓｉｚｅｄ）し、４０μＬ容量に加えた莢膜型１９Ｆ株ＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。この手順の結果、肺感染症および鼻腔定着が起きる。７日後、マウスを屠殺し、ホモジナイズした肺をプレーティングした。ＣＦＵを観察したところ、ＰｃｐＡまたはＰｌｙのどちらかを免疫しても保護作用のレベルは同等であった。ＰｃｐＡとＰｌｙで免疫したマウスにおいては、保護作用が対照マウスよりも１００倍超、ＰｌｙまたはＰｃｐＡ単独の場合よりも１０倍高まった。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＪＭＳ８７の構築を示す模式図である。このプラスミドは、プラスミドｐＥＴ３０ａおよびＰｃｐＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｂ６由来のΔＳＰΔＣＢＤ ＰｃｐＡ）のフラグメントをコードする核酸のライゲーションにより形成される。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、マウスの敗血症モデルにおいて、マウスに実施例８（１０〜０．６２５μｇ／用量）の組換えＰｃｐＡ（ｒＰｃｐＡ）を免疫して得られる保護作用をグラフ化したものである。マウスにＷＵＢＭ３株を３００ＣＦＵ腹腔内チャレンジした。図１５Ａは、一定期間にわたり、ｒＰｃｐＡを免疫したマウスがアジュバント対照群（ＰＢＳ）と比較して各用量で有意な保護作用を受けたことを示す（フィッシャーの正確確率検定）。図１５Ｂは、チャレンジから７日後の各群における保護作用のレベルを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、マウスの敗血症モデルにおいて、マウスに実施例８（１０〜０．６２５μｇ／用量）の組換えＰｃｐＡ（ｒＰｃｐＡ）を免疫して得られる保護作用をグラフ化したものである。マウスにＷＵＢＭ３株を３００ＣＦＵ腹腔内チャレンジした。図１５Ａは、一定期間にわたり、ｒＰｃｐＡを免疫したマウスがアジュバント対照群（ＰＢＳ）と比較して各用量で有意な保護作用を受けたことを示す（フィッシャーの正確確率検定）。図１５Ｂは、チャレンジから７日後の各群における保護作用のレベルを示す。
【図１６】図１６は、マウスの肺炎モデルにおいて、実施例８のｒＰｃｐＡの免疫により得られる保護作用をグラフ化したものである。群１〜６にプラセボ（群１）、ＰｓｐＡ（群２）またはｒＰｃｐＡ（群３〜６）を免疫した。０日目に１群当たり約１４匹のＣＢＡ／Ｎマウスに初回用量の免疫原を皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。２１日目に２回目の免疫、４３日目に３回目の免疫を行った。６３日目にマウスにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＥＦ３０３０を５．６×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から５日後、ホモジナイズした肺組織のＣＦＵを判定した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書は、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントおよび変異体、さらにはそのフラグメントおよび変異体の製造方法および使用方法について記載する。ＰｃｐＡは、当初Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコリン結合タンパク質（ＣＢＰ：ｃｈｏｌｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）として同定されたが、ＣＢＰタンパク質であるＰｓｐＡおよびＰｓｐＣとは異なり（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｂｅａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６４：２０７−２１４（１９９８））、ＰｃｐＡの突然変異は、（１）変異株と野生株を競合させる競合モデルでマウスの肺、菌血症および鼻咽頭においてビルレンスを低下させる（Ｈａｖａ ａｎｄ Ｃａｍｉｌｌｉ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１３８９−１４０６（２００２））；（２）肺での定着に関する非競合的な比較においてビルレンスおよび細菌負荷を低下させる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：１１７１−１１８０（２００６））；（３）ＣＢＡ／ＣａＨＮ−Ｂｔｋｘｉｄ／Ｊマウスにおいて敗血症の原因となるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの侵襲性株ＴＩＧＲ４（莢膜型４）の能力を低下させる；および（４）野生株と競合して肺での定着を低下させることが明らかになっている。本開示は、ＰｃｐＡに免疫原性があること、特にＰｃｐＡのフラグメントおよび変異体に免疫原性があるという最初の証拠を提供する。
【００１０】
免疫原性ポリペプチドは、（シグナル配列の存在下または存在下での）全長ＰｃｐＡアミノ酸配列、そのフラグメントおよびその変異体を含む。全長ＰｃｐＡには、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｂ６由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＢ０４７５８、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＴＩＧＲ４由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿３４６５５４およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒ６由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿３５９５３６がある。
【００１１】
任意に、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、１つまたは複数のロイシンに富んだ領域（ＬＲＲ：ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。こうしたＬＬＲは、天然型ＰｃｐＡに存在し、あるいは、このＬＬＲの天然型ＬＲＲに対する配列同一性は、たとえば、８０％、８５％、９０％または９５％など、約６０〜約９９％である。成熟ＰｃｐＡタンパク質（すなわち、シグナルペプチドが存在しないタンパク質）のＬＲＲは、配列番号１、２、４１または４５内で確認できる。
【００１２】
ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは任意に、天然型成熟ＰｃｐＡタンパク質に一般に存在するコリン結合性のアンカー配列が認められない。天然型のコリン結合性アンカー配列は、成熟ＰｃｐＡタンパク質の配列番号５２である。より詳細には、免疫原性ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸置換を持ち、かつ天然型ＰｃｐＡに対して配列同一性が約６０〜約９９％、すなわち任意の同一性が８０、８５、９０および９５％などである、天然型ＰｃｐＡのＮ末端領域を含む。Ｎ末端領域は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換の存在下または非存在下およびシグナル配列の存在下または存在下で配列番号１、２、３、４、４１または４５のアミノ酸配列を含んでもよい。Ｎ末端領域は、配列番号１、２、３、４、４１または４５に対する配列同一性が約６０〜約９９％（あるいは任意の同一性が８０〜９９％）のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１３】
配列番号１、２、３、４、４１または４５の免疫原性フラグメントは、配列番号１、２、３、４、４１または４５のアミノ酸残基を５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０および１９１個、すなわち５〜１９１個の任意の数のアミノ酸残基を含む。こうしたフラグメントの例として、たとえば、ＬＥＫＩＥＤＲＡＦＤ（配列番号５）、ＦＳＥＬＥＥＩＥＬＰ（配列番号６）、ＡＳＬＥＹＩＧＴＳＡ（配列番号７）、ＦＳＦＳＱＫＬＫＫＬ（配列番号８）、ＴＦＳＳＳＳＫＬＥＬ（配列番号９）、ＩＳＨＥＡＦＡＮＬＳ（配列番号１０）、ＮＬＥＫＬＴＬＰＫＳ（配列番号１１）、ＶＫＴＬＧＳＮＬＦＲ（配列番号１２）、ＬＴＴＳＬＮＭＬＭＬ（配列番号１３）、ＬＴＴＳＬＫＨＶＤＶ（配列番号１４）、ＲＧＭＩＶＡＳＶＤＧ（配列番号１５）、ＥＥＧＮＥＳＦＡＳＶＤＧ（配列番号１６）、ＶＳＦＱＳＫＴＱＬＩ（配列番号１７）、ＶＬＦＳＫＤＫＴＱＬＩ（配列番号１８）、ＹＹＰＳＱＫＮＤＥＳ（配列番号１９）、ＹＫＴＰＫＥＴＫＥＬ（配列番号２０）、ＡＳＹＳＦＮＫＮＳＹ（配列番号２１）、ＬＫＫＬＥＬＮＥＧＬ（配列番号２２）、ＱＫＩＧＴＦＡＦＡＤ（配列番号２３）、ＥＫＩＧＴＦＡＦＡＤ（配列番号２４）、ＡＴＫＬＥＥＩＳＬＰ（配列番号２５）、ＡＩＫＬＥＥＩＳＬＰ（配列番号２６）、ＮＳＬＥＴＩＥＲＬＡ（配列番号２７）、ＦＹＧＮＬＥＬＫＥＬＩＬ（配列番号２８）を含むアミノ酸が挙げられる。
【００１４】
任意に、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、ＬＲＲがない。ＬＲＲが認められない免疫原性ポリペプチドとして、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１または５個以上のアミノ酸残基を含む配列番号２９、３０または３１のいずれかの任意の免疫原性フラグメントがある。配列番号３０および３１は、ＰｃｐＡのロイシンに富んだ領域のＣ末端側に残基を含む。
【００１５】
本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの変異体は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含んでもよい。免疫原性ポリペプチドの変異体は、配列番号１〜３１、４１および４５またはこれらの任意のフラグメントに対する配列同一性が約６０〜約９９％（すなわち、任意の同一性が６０〜９９％）のアミノ酸配列を含む。変異体の選択については、本明細書に教示する方法を用いてその免疫原性能の観点から行う。
【００１６】
本明細書に記載のＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、ＰｃｐＡのフラグメントおよびそのフラグメントの変異体を含む。ＰｃｐＡフラグメントの変異体は、アミノ酸配列の改変を含んでもよい。たとえば、アミノ酸配列の改変としては、置換、挿入または欠失による変化がある。変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせを単一の変異体内で組み合わせても構わない。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合のほか、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は一般に、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入よりも、たとえば、１〜４残基程度の小さな挿入になる。欠失は、１つまたは複数のアミノ酸残基をタンパク質配列から除去するものである。タンパク質分子内の任意の１部位で約２〜６残基以下を欠失させるのが一般的である。こうした変異体については通常、タンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により作成して、それにより変異体をコードするＤＮＡを製造し、その後、組換え細胞培養でＤＮＡを発現させる。既知の配列を持つＤＮＡの所定の部位で置換突然変異を製造する技法はよく知られており、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発があるが、これに限定されるものではない。アミノ酸置換は一般に単一残基であるが、いくつかの異なる位置で同時に行ってもよい。置換変異体は、少なくとも１つの残基を除去し、その代わりに別の残基を挿入する変異体である。こうした置換は通常、以下の表１に準じて製造され、保存的置換と呼ばれる。一方、これ以外のものも当業者にはよく知られている。
【００１７】
【表１】
本明細書で使用する場合、変異体は、ｐｃｐＡ相同遺伝子内の１つまたは複数の部位で多型性を示す、別の株に由来する天然型ｐｃｐＡの対立遺伝子を含んでもよい。変異体は、従来の分子生物学的技法により製造することができる。本明細書では、変異体について天然型ｐｃｐＡと比較した配列同一性との関連で記載する。当業者であれば、２つのポリペプチドまたは核酸の配列同一性の判定方法を容易に理解できる。たとえば、同一性が最高レベルになるように２つの配列を整列させた後、配列同一性を算出してもよい。アライメントについては、使用するアライメントプログラムの個々のアルゴリズムによってある程度異なる。これには、たとえば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｍｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法による、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）による、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０；Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９ ａｎｄ Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に記載のアルゴリズムが挙げられる。これらの各参考文献については、少なくともアライメントに関連する材料および同一性の計算に関して参照によって援用する。一般に、これらの方法のどれを用いもよいが、場合によってこうした様々な方法による結果が異なる可能性があることが理解されるであろう。配列同一性を、たとえば、９５％とする場合、その同一性は、受け入れられた計算方法の少なくとも１つで検出可能なものでなければならない。
【００１８】
本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドは、１種または複数種のアミノ酸アナログまたは非天然型立体異性体を含んでもよい。こうしたアミノ酸アナログおよび立体異性体については、ｔＲＮＡ分子に目的のアミノ酸を組み込み、たとえば、アンバーコドンを利用してそのアナログアミノ酸を部位特異的にペプチド鎖に挿入する遺伝子コンストラクトを設計することで容易にポリペプチド鎖に導入することができる（少なくともアミノ酸アナログに関する材料について参照によってすべて本明細書に援用するＴｈｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ ７７：４３− ７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；Ｉｂｂａ ａｎｄ Ｈｅｒｍｅｃｋｅ，Ｂｉｏｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）を参照）。ペプチドには似ているものの天然のペプチド結合を介して連結されていない免疫原性フラグメントを製造してもよい。たとえば、アミノ酸またはアミノ酸アナログの結合は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスとトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨＨ２ＳＯ−−（これらおよび他のものについては、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ， ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ， ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｐ．２６７−３５７．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，１（２）：４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−，ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ １ ｐｐ．３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−，ｃｉｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；欧州特許第００４５６６５号 ｔｏ Ｓｚｅｌｋｅ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）で確認することができ、少なくとも結合に関する材料について、これらの各々を参照によって本明細書に援用する）を含んでもよい。
【００１９】
アミノ酸アナログおよび立体異性体は、多くの場合、製造がより経済的であること、化学的安定性の強化、薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）の改良、特異性（広範な生物活性など）の変化およびその他など、特性を改良できるか、望ましい特性を持っている。たとえば、Ｄアミノ酸は天然ペプチダーゼにより認識されないため、Ｄ−アミノ酸を用いてより安定なペプチドを得ることができる。コンセンサス配列の１種または複数種のアミノ酸と同じタイプのＤ−アミノ酸との網羅的な置換（Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジンなど）を用いてより安定なペプチドを得ることができる。システイン残基を用いて２つ以上のペプチドを一緒に環化または結合させてもよい。これは、ペプチドを特定のコンフォメーションに限定するのに有益な場合がある。（参照によって本明細書に援用するＲｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）を参照）。
【００２０】
本明細書は、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドおよび薬学的に許容されるキャリアを含む組成物について記載する。任意に、この組成物は、アジュバントをさらに含む。免疫原性ポリペプチドを含む組成物は、たとえば、免疫原性ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドもしくはＰｓｐＡ、ニューモリシンの免疫原性フラグメントまたはこれらの組み合わせなど、他の免疫原性ポリペプチドの組み合わせを含んでもよい。
【００２１】
任意に、本明細書に記載の組成物は、粘膜表面への投与に好適である。この組成物は、たとえば、点鼻薬、ネブライザー溶液またはエアロゾル吸入剤であってもよい。したがって、組成物は、容器内にあってもよく、容器は、鼻噴霧器、ネブライザーまたは吸入器であってもよい。
【００２２】
薬学的に許容されるキャリアとは、生物学的またはその他の点で望ましい、すなわち、任意の好ましからぬ生物学的作用を引き起こしたり、それを含む医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な相互作用を起こしたりせずに、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントと一緒に被検体に投与できる材料をいう。当業者によく知られているように、キャリアについては当然ながら、被検体において活性成分の任意の分解および任意の有害な副作用を最小限にとどめるように選択することになる。
【００２３】
好適なキャリアおよびその製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。一般に、製剤に適切な量の薬学的に許容される塩を用いて製剤を等張にする。薬学的に許容されるキャリアの例として、滅菌水、生理食塩液、リンゲル溶液のような緩衝液およびデキストロース溶液があるが、これに限定されるものではない。溶液のｐＨは通常、約５〜約８または約７〜約７．５である。他のキャリアとして、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤がある。マトリックスは、たとえば、薄膜、リポソームまたは微小粒子のような形状製品の形をとる。たとえば、投与される組成物の投与経路および濃度に応じて、ある種のキャリアがより好ましくなる場合があることが当業者には明らかであろう。キャリアは、ヒトまたは他の被検体へのＰｃｐＡ免疫原性フラグメントの投与に好適なものである。
【００２４】
医薬組成物は、免疫原性ポリペプチドの他にキャリア、増粘剤、希釈薬、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、アジュバント、免疫賦活薬を含んでもよい。さらに、医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤および麻酔薬など１種または複数種の活性成分を含んでもよい。
【００２５】
アジュバントは、アルミニウム塩などの金属塩を含み、アジュバント活性を持つ安全な賦形剤を与えるものとして当該技術分野において周知である。こうしたアジュバントの作用機序には、投与から最大３週間注射部位にとどまることができるような抗原デポーの形成、さらに抗原提示細胞に取り込まれやすい抗原／金属塩複合体の形成があると考えられる。抗原の吸着には、アルミニウムばかりでなく、亜鉛、カルシウム、セリウム、クロム、鉄およびベリリウム（ｂｅｒｉｌｉｕｍ）の塩など他の金属塩も用いられている。アルミニウムの水酸化物およびリン酸塩が、最も一般的である。アルミニウム塩、抗原および他の免疫賦活薬を含む製剤または組成物は、当該技術分野において公知である。免疫賦活薬の例として、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。
【００２６】
アジュバントおよび／または免疫賦活薬を、ポリペプチド組成物と同時に、組成物の投与の直前に、あるいは投与後に投与してもよい。任意に、組成物は、アジュバントをさらに含む。アジュバント製剤は、たとえば、粘膜誘導部位を標的にする薬を含む。アジュバントは任意に、以下に限定されるものではないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、血管形成因子、アポトーシス阻害剤およびこれらの組み合わせなどの群から選択されてもよい。サイトカインをアジュバントとして選択する場合、サイトカインは、以下に限定されるものではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８などのインターロイキン；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）；インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ）；またはアジュバント活性を持つ他の任意のサイトカインなどの群から選択されてもよい。また、本発明の組成物および方法にアジュバント活性または他の生物活性を持つサイトカインの一部またはサイトカインのミュータントもしくは模倣体（またはこれらの組み合わせ）を用いてもよい。
【００２７】
ケモカインをアジュバントとして用いる場合、ケモカインは任意に、以下に限定されるものではないが、リンホタクチン、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ＬＡＲＣ（ｌｉｖｅｒａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＰＡＲＣ（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＴＡＲ Ｃ（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＳＬＣ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）およびＦＫＮ（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）などの群から選択してもよい。アポトーシス阻害剤をアジュバントとして選択した場合、アポトーシス阻害剤は任意に、以下に限定されるものではないが、カスパーゼ８の阻害剤およびその組み合わせなどの群から選択してもよい。血管形成因子をアジュバントとして選択した場合、血管形成因子は任意に、以下に限定されるものではないが、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヒアルロナン（ＨＡ：ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）フラグメントおよびこれらの組み合わせなどの群から選択してもよい。
【００２８】
実質的に無毒の生物活性アジュバントの他の例としては、ホルモン、酵素、成長因子またはこれらの生物活性部分が挙げられる。そうしたホルモン、酵素、成長因子またはこれらの生物活性部分は、たとえば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、イヌ、ネコ、ウマまたはトリ由来であってもよく、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、プロラクチン、上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−１）、ソマトトロピン（成長ホルモン）もしくはインスリン、またはその受容体が免疫系の細胞に発現する他の任意のホルモンもしくは成長因子であってもよい。
【００２９】
さらに、アジュバントは、たとえば、コレラ毒素（ＣＴ：ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素（ＬＴ：ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡおよび百日咳毒素（ＰＴ：ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）またはこれらの組み合わせ、サブユニット、トキソイド、キメラまたはミュータントのような細菌毒素も含む。たとえば、天然のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ：ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ）の精製調製物を用いても構わない。フラグメント、ホモログ、誘導体およびこうしたトキシンのいずれかの融合物も好適なものであるが、アジュバント活性を保持していることが条件となる。アジュバントの好適なミュータントまたは変異体は、たとえば、国際特許第９５／１７２１１号（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ ＣＴミュータント）、国際特許第９６／６６２７号（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ ＬＴミュータント）および国際特許第９５／３４３２３号（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ ＰＴミュータント）に記載されている。本方法および組成物で使用できるさらなるＬＴミュータントには、たとえば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓミュータント、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙミュータント、Ｇｌｕ−１１０−ＡｓｐミュータントおよびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐミュータントがある。さらに他のアジュバントとして、ＲＨ３リガンド；ＣｐＧモチーフオリゴヌクレオチド；たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｈｉｇｅｌｌａ ｅｘｓｅｒｉなどの細菌性モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ：ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）；サポニン（ＱＳ２１など）またはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ：ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ミクロスフェアなどを用いてもよい。他に考えられるアジュバントとして、デフェンシンおよびＣｐＧモチーフがある。
【００３０】
本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの製造方法および使用方法とそうした方法に有用な組成物とを提供する。このポリペプチドについては、標準的な分子生物学的技法および発現系を用いて作製することができる。（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１を参照）。たとえば、免疫原性ポリペプチドをコードするｐｃｐＡ遺伝子のフラグメントを単離してもよく、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、市販されている任意の発現ベクター（ｐＢＲ３２２ベクターおよびｐＵＣベクター（ニューイングランドバイオラボインク（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ），マサチューセッツ州）など）または発現／精製ベクター（ＧＳＴ融合ベクター（ファイザーインク（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．），ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ），ニュージャージー州）など）にクローニングしてから、好適な原核生物、ウイルスまたは真核生物の宿主に発現させてもよい。その後、従来の手段により、あるいは、市販の発現／精製系の場合は製造者の指示に従って精製を行えばよい。
【００３１】
本明細書は、配列番号１〜３１、４１および４５のいずれか１つをコードする配列を含む核酸を提供する。本明細書は、全長ＰｃｐＡタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列番号３２、３３および４７を含む核酸を提供する。また、配列番号３２、３３および４７の縮重変異体およびこうした縮重変異体のフラグメントも提供する。
【００３２】
配列番号１および２またはそのフラグメントをコードする核酸であって、それぞれ配列番号３４および配列番号３５またはその縮重変異体もしくはフラグメントを含む、核酸について記載する。
【００３３】
配列番号３および４またはそのフラグメントをコードする核酸は、それぞれ配列番号３６および３７またはその縮重変異体もしくはフラグメントを含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
配列番号４２またはその縮重変異体もしくはフラグメントを含む、配列番号４１またはそのフラグメントをコードする核酸について記載する。
【００３５】
配列番号４６またはその縮重変異体またはフラグメントを含む、配列番号４５またはそのフラグメントをコードする核酸について記載する。
【００３６】
配列番号２９またはそのフラグメントをコードする例示的核酸は、配列番号３８またはその縮重変異体もしくフラグメントを含む。
【００３７】
さらに詳しくは、本明細書は、配列番号３２〜３８、４２、４６および４７またはこれらの縮重変異体として示される配列のいずれか１つを含む核酸を提供する。
【００３８】
さらに、配列番号３２〜３８、４２、４６および４７または配列番号３２〜３８、４２、４６および４７の相補体またはその配列もしくは相補体の任意のフラグメントを含むヌクレオチド配列を持つハイブリダイゼーションプローブの全部または任意の部分とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離された核酸も提供する。ハイブリダイズしている核酸のハイブリダイズしている部分の長さは一般に、少なくとも１５（１５、２０、２５、３０、４０またはそれ以上など）ヌクレオチドである。ハイブリダイズしている部分は、ハイブリダイズする配列部分と少なくとも８０％（８５％、９０％または９５％など）同一である。ハイブリダイズしている核酸は、たとえば、クローニングプローブ、プライマー（ＰＣＲプライマーなど）または診断プローブとして有用である。核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性については、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である融解温度すなわちＴｍで表す。この融解温度を用いて必要なストリンジェント条件を決める。プローブと同一ではないが、プローブと関連があり実質的に同一である配列を同定する場合、まず特定の塩濃度（ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）またはＳＳＰＥ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＥＤＴＡ）など）を用いて相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度を確立することが有用である。１％のミスマッチでＴｍが１℃低下すると想定する場合、それに合わせてハイブリダイゼーション反応の最終の洗浄温度を下げる（たとえば、同一性が９５％を超える配列を探索する場合、最終洗浄温度を５℃下げる）。実際のミスマッチ１％当たりのＴｍの変化は、０．５〜１．５℃である可能性がある。ハイストリンジェントな条件では、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳにおいて６８℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで室温にて洗浄を行う。中ストリンジェントな条件では、３×ＳＳＣで４２℃にて洗浄する。塩濃度および温度を変動させてプローブと標的核酸との同一性の最適レベルを達成してもよい。こうした条件に関するさらなるガイダンスは、当該技術分野において容易に入手することができ、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載されている。
【００３９】
したがって、前述のペプチド配列、その変異体およびフラグメントをコードできる核酸を開示することが理解されよう。この核酸には、個々のタンパク質配列に関係するすべての縮重配列、すなわち、特定のタンパク質配列をコードする配列を持つすべての核酸ばかりでなく、本開示のタンパク質配列の変異体および誘導体をコードする縮重核酸など、すべての核酸が含まれることになる。したがって、本明細書には１つ１つの核酸配列をすべて書き出していない場合もあるが、実際には、本開示のタンパク質配列により、ありとあらゆる配列が開示および記載されていることが理解されよう。
【００４０】
また、本明細書に記載の核酸を含むベクターも開示する。したがって、免疫原性ポリペプチド（配列番号１〜３１、４１もしくは４５またはそのフラグメントもしくは変異体など）をコードする核酸を含むベクターを提供する。このベクターは、配列番号３２〜３８、４２および４７またはその縮重変異体またはフラグメントの核酸配列のうちどれを含んでもよい。任意に、ベクターの核酸は、発現調節配列（プロモーターまたはエンハンサーまたはその両方など）に作動的に連結されている。好適な発現ベクターは、当業者によく知られており、ノバゲンインク（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．），マディソン，ウィスコンシン州；インビトロジェンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），カールズバッド，カリフォルニア州；およびプロメガコーポレーション，マディソン，ウィスコンシン州など様々な供給源で市販されている。
【００４１】
さらに、ベクターを含む培養細胞も提供する。培養細胞は、ベクターをトランスフェクトした培養細胞でも細胞の子孫でもよく、その細胞に免疫原性ポリペプチドが発現する。好適な細胞株は当業者に公知であり、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から市販されている。
【００４２】
トランスフェクト細胞を、免疫原性ポリペプチドを作製する方法に用いてもよい。この方法では、任意に発現配列の制御下、免疫原性ポリペプチドが発現する条件下でベクターを含む細胞を培養する。標準的なタンパク質精製法を用いて細胞または培地から免疫原性ポリペプチドを単離することができる。
【００４３】
免疫原性ポリペプチドについては、比較的大きなポリペプチドまたはタンパク質を普通に酵素的に切断して作製してもよいし、タンパク質化学的技法で２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを連結して作製してもよい。たとえば、ペプチドまたはポリペプチドをＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学反応あるいはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）化学反応。（アプライドバイオシステムズインク（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），フォスターシティー，カリフォルニア州）のどちらかにより、現在利用できる実験機器を用いて化学的に合成することができる。ペプチド縮合反応、ネイティブ化学ライゲーション、固相化学反応または酵素的ライゲーションにより、２つのフラグメントをそのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合により共有結合で結合させて、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドを形成してもよい。（その中に記載されている方法についてすべてを参照によって本明細書に援用するＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ，，Ｇｒａｎｔ，ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．，Ｂｏｄａｎｓｋｙ ａｎｄ Ｔｒｏｓｔ，ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１）；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４）；Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，（１９８４）を参照）。
【００４４】
１種または複数種のポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドおよび組成物を用いて抗体を作製してもよい。したがって、被検体のＰｃｐＡに特異的な抗体を作製する方法は、本明細書に記載の免疫原性ＰｃｐＡフラグメントを被検体に投与することを含む。さらに、本明細書は、ＰｃｐＡポリペプチドに結合する抗体およびＰｃｐＡポリペプチドに結合する抗体フラグメントも提供する。
【００４５】
抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、完全ヒト抗体またはヒト化抗体でもよく、天然抗体および一本鎖抗体を含む。抗体は、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドを被検体に投与してインビボで作製してもよい。抗体の作製には、ハイブリドーマ法を用いたモノクローナル抗体の製造が含まれる。ハイブリドーマ法については、当該技術分野において周知であり、その中に記載されている方法について参照によってその全体を援用するＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５） ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）に記載されている。
【００４６】
一本鎖抗体の製造方法は、当業者によく知られている。たとえば、米国特許第５，３５９，０４６号（その方法に関して参照によってその全体を本明細書に援用する）を参照されたい。一本鎖抗体を作製するには、短いペプチドリンカーを用いて重鎖と軽鎖の可変ドメインを一緒に融合し、それにより単一分子上に抗原結合部位を再構成する。抗原結合性または結合の特異性を大きく阻害することなく、一方の可変ドメインのＣ末端が他方の可変ドメインのＮ末端に１５〜２５アミノ酸ペプチドまたはリンカーにより連結される一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が開発されている。重鎖と軽鎖が適切な立体配座配向で一緒に結合できるようにリンカーを選択する。たとえば、リンカーに関する材料について参照によって本明細書に援用するＨｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．２０３：４６−１２１（１９９１）を参照されたい。
【００４７】
ＰｃｐＡポリペプチドに対する完全ヒト抗体およびヒト化抗体を本明細書に記載の方法に用いてもよい。ヒト化抗体は、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を持つマウス、ラットまたはウサギなど非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換されている場合もある。免疫によりヒト抗体の完全なレパートリー（すなわち、完全ヒト抗体）を産生することができるトランスジェニックアニマル（マウスなど）を用いてもよい。生殖系列変異のキメラマウスにおいて抗体重鎖の結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子を同系接合的に欠損させると、内因性抗体の産生が完全に阻害される。そうした生殖系列ミュータントマウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを転移すれば、抗原チャレンジによりヒト抗体が産生される（たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照）。また、ファージディスプレイライブラリーでヒト抗体を作製してもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｔｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技法には、ヒトモノクローナル抗体の調製方法について記載されている（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．」 Ｉｎ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２７，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１））。こうした参考文献については、その中に記載されている方法のため参照によってその全体を援用する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、抗体フラグメントは、ハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦａｂフラグメントを含む。こうした抗体フラグメントは、特定のＰｃｐＡポリペプチドに対する結合能を保持している。各方法を用いて（ａｂ）発現ライブラリーを構築（たとえば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）すれば、ＰｃｐＡポリペプチドに対する所望の特異性を持つモノクローナルＦ（ａｂ）フラグメントを迅速かつ効果的に同定することができる。ポリペプチドのイディオタイプを含む抗体フラグメントについては、当該技術分野において公知の技法で作製することができ、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により作製されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により作製されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理して作製されるＦ（ａｂ）フラグメントおよび（ｉｖ）Ｆ（ｖ）フラグメントがあるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
本明細書は、被検体において肺炎球菌感染症の危険性を低下させる方法であって、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントまたはその組成物を被検体に投与することを含む、方法を記載する。肺炎球菌感染症には、たとえば、髄膜炎、中耳炎、肺炎、敗血症または溶血性尿毒症がある。したがって、本明細書に記載の方法より、こうした感染症の任意の１つまたは複数の危険性が低下する。この方法は、第２の免疫原性フラグメントを投与するステップをさらに含んでもよい。第２の免疫原性フラグメントは、ＰｓｐＡ由来でも、ニューモリシン由来でも、これらの組み合わせ由来でもよい。第２の免疫原性フラグメントについては、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントと同時、その前、あるいはその後に投与してもよい。
【００５０】
ＰｃｐＡポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物は、経口投与、非経口投与（静脈内など）、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、または鼻腔投与もしくは呼吸器系の任意の部分への投与などの局所投与することができる。本明細書で使用する場合、呼吸器系への投与とは、エアロゾル化または挿管を介した噴霧機構または飛沫機構による送達など、外鼻孔の一方もしくは両方あるいは口を介して組成物を鼻部および鼻道に送達することをいう。
【００５１】
組成物およびＰｃｐＡポリペプチドまたはフラグメントの正確な必要量は、被検体の種、年齢、体重および全身状態、使用するポリペプチドおよびその投与モードによって被検体ごとに異なるであろう。したがって、組成物の正確な量をすべて明らかにすることができるとは限らない。しかしながら、当業者であれば、本明細書の記載を考慮して適切な量を決定できる。さらに、たとえば、プライムブーストレジメンにおいて、ＰｃｐＡポリペプチドまたはフラグメントの反復投与を用いてもよい。
【００５２】
肺炎および敗血症に対する防御免疫を惹起する際、ＰｓｐＡとニューモリシンを組み合わせると、どちらかのタンパク質単独の場合であり有効性が高まる（Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，１８８：３３９−４８（２００３）；Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：３０２８−３３（２０００））。したがって、ＰｃｐＡまたは免疫原性フラグメントを含む組成物は任意に、ＰｃｐＡ、ＰｓｐＡまたはニューモリシンの第２の免疫原性フラグメントまたはその組み合わせを含んでもよい。これらの参考文献については、その中に教示されているタンパク質の組み合わせ方法および投与方法のため参照によってその全体を本明細書に援用する。
【００５３】
本明細書に記載の組成物を組み合わせる際は、前述の処理のどれを用いてもよい。組み合わせる場合は、同時に（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）（混合剤などとして）、分離されているが同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）（同じ被検体に異なる静脈ラインなどを介して）あるいは連続的に（化合物または薬の１つを最初に投与してから第２の化合物または薬を投与するなど）投与してもよい。したがって、組み合わせという語は、２種以上の薬を同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）投与、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）投与または連続投与することをいう。
【００５４】
単数形ａ、ａｎおよびｔｈｅは、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する場合、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の対象を含むという点に留意しなければならない。したがって、たとえば、抗原性フラグメントという場合、抗原性フラグメントの混合物を含み、薬学的キャリアまたはアジュバントという場合、そうしたキャリアまたはアジュバントの２種以上の混合物を含む。
【００５５】
本明細書で使用する場合、被検体とは、個体をいう。したがって、被検体は、ネコおよびイヌなどの飼い慣らされた動物、家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）およびヤギなど）、実験動物（マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）およびトリを含んでもよい。一態様では、被検体は、霊長類またはヒトなどの哺乳動物である。
【００５６】
任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）または任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）とは、その後に記載した事象または状況が起こることもあるが、起こらないこともあり、そう記載することで、その事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合が含まれることを意味する。たとえば、任意に組成物は組み合わせを含んでもよいといった場合、組み合わせとは、組成物が異なる分子の組み合わせを含んでもよいし、組み合わせを含まなくてもよいため、こう記載することで、組み合わせが存在する場合と組み合わせが存在しない場合（すなわち、組み合わせの個々の構成物）とが含まれる。
【００５７】
本明細書では、範囲を、約を前置した１つの特定の値からおよび／または約を前置したもう１つの特定の値までと表すことができる。このように範囲を表す場合、１つの特定の値からおよび／またはもう１つの特定の値までは別の態様である。同様に、先行詞約を用いて値を近似値として表す場合、特定の値は別の態様を形成することを理解されたい。さらに、各範囲の端点はもう一方の端点との関連でも他の端点と切り離しても意味があることを理解されたい。
【００５８】
本明細書では、ある症候に対する一定の処置（肺炎球菌感染症の防止など）との関連で防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）、防止している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、および防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）という語を用いる場合、処置した患者がその症候を臨床的に観察できるレベルでまったく発症しないか、処置を受けない場合と比べて発症が遅くなる、および／またはその程度が軽くなることをいう。こうした語は、患者がその症候をまったく経験しない状況のみに限定されるものではない。たとえば、一定の症候を発現させると予想された刺激を患者に曝露しているさなかに処置を施して、その結果、本来予想されるよりも患者の症候の症状が減少および／または緩和する場合、その処置は症候を防止したと言えよう。処置の結果、患者が感染症の軽い症状しか明確に示さずに、その感染症が防止される場合があっても、これは、感染している微生物が細胞にまったく侵入しなかったことを意味するものではない。
【００５９】
同様に、感染症の危険性との関連で本明細書において使用する場合、所定の処置により軽減する、軽減している（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、および軽減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）（肺炎球菌感染症の危険性の軽減など）とは、処置（免疫原性ポリペプチドの投与など）を行わない感染症発症の対照レベルまたは基準レベルと比較して被検体の感染症の発症が遅くなる、またはその程度が軽くなることをいう。感染症の危険性が軽減された結果、患者が感染の軽い症状しか明確に示さずに、感染症の症状が遅延する場合があっても、これは、感染している微生物が細胞にまったく侵入しなかったことを意味するものではない。
【００６０】
当然のことながら、開示されている方法および組成物は、他に記載がない限り、特定の合成方法、特定の解析技法または特定の試薬に限定されるものではなく、したがって、異なってもよい。また、本明細書に使用する用語は、特定の実施形態を記載するためのものにすぎず、限定的であることを意図するのではないことは言うまでもない。
【００６１】
本発明の多くの実施形態について記載してきた。しかしながら、様々な改変が可能であることが理解されるであろう。さらに、ある特徴またはステップについて記載する場合、組み合わせについて明示的に記載していなくても、本明細書の他の任意の特徴またはステップと組み合わせてもよい。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内にある。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
ＰｃｐＡは、肺感染症および致死性の敗血症に対する保護作用を惹起する。
【００６３】
材料および方法。
【００６４】
菌種、培地および増殖条件。本研究では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０ならびにその誘導体を用いた。他に記載がない限り、０．５％酵母エキスを含むトッドヒューイット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）ブロス（ＴＨＹ）または血液寒天プレートで肺炎球菌を３７℃で増殖させた。適切な場合、エリスロマイシンを濃度０．３μｇ／ｍｌで培地に加えた。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（表２）の臨床分離株および主要なクローン群の分離株（表３）を用いた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
これらの研究に使用した臨床菌株は、過去２５年以内に単離されたものである。あり得べきＰｃｐＡの多様性を調べるため、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａゲノム多様性プロジェクト（Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ｓｔｒｅｐ／ｉｎｆｏ）で用いた菌株の群から分離株を選択した。
【００６７】
菌株の構築の間、１．５％寒天を含むルリア−ベルターニ（ＬＢ：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロスまたはＬＢプレートで増殖させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）内でプラスミドを維持した。増殖培地に、ｐＣＲ２．１系、ｐＣＲ４系およびｐＥＴ−２０ｂ系プラスミドにはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を、ｐＪＹ４１６４系プラスミドにはエリスロマイシン（４００μｇ／ｍｌ）を加えた。
【００６８】
高マンガン培地でのバクテリアの増殖にはＴＨＹ培地を用いた。低マンガン条件での増殖では、マンガンを除去したＴＨＹを調製した。製造者の指示に従ってオートクレーブ処理の前にＣｈｅｌｅｘ−１００（２％ｗ／ｖ）（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ），セントルイス，ミズーリ州）を加えてＴＨＹ培地を調製した。オートクレーブ処理後、このＴＨＹ／Ｃｈｅｌｅｘ混合物を室温で一晩撹拌し、続いて濾過滅菌した。使用前にＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＦｅＳＣ４をそれぞれ１ｍＭの濃度まで加え、ＭｎＳＯ４を０．１μＭの濃度まで加えた。増殖を６００ｎｍにおける光学密度でモニターした。
【００６９】
菌株の構築。本研究に用いたＥ．ｃｏｌｉ株、プラスミドおよびプライマーを示す（表４）。突然変異誘発を用いて親株ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０のｐｃｐＡを不活化した。変異株の構築については、以前に行われて記載されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：１１７１−８０（２００６））。
【００７０】
【表４】
組換えＰｃｐＡの発現および精製。本研究に使用した菌株、プラスミドおよびプライマーを表２に示す。プライマーＤＴＧ−１６（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＴＧＡＡＣＣ−３’（配列番号３９））およびＤＴＧ−１２（５’−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号４０））を、菌株ＴＩＧＲ４におけるｐｃｐＡの１１２６ｂｐフラグメントを増幅するように設計した。このプライマーはそれぞれ、操作された制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを含む。３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１２５μＭのｄＮＴＰ、各プライマー５０ピコモルおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットを含むカクテル（総容量５０μｌ）において反応を３０サイクル繰り返した。１サイクルは、９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、５分であった。最初に、この増幅させた遺伝子フラグメントをＴ−テイルド（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）法でｐＴＯＰＯ４（インビトロジェンインク，カールズバッド，カリフォルニア州）にクローニングし、プラスミドｐＬＭＧを形成した。
【００７１】
このフラグメントを、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）を用いてｐＣＲ４にクローニングした。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州）を用いてエンドヌクレアーゼ消化により、精製したプラスミドをスクリーニングした。得られたプラスミドｐＤＧ−１にｐｃｐＡフラグメントが挿入されていることをアガロースゲル電気泳動、ＰＣＲ解析およびＤＮＡシークエンシングをすべて用いて確認した。ｐＤＧ−１のインサートをｐＥＴ−２０ｂ発現ベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ），マディソン，ウィスコンシン州）にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＪＭ−１をタンパク質製造のためＥ．ｃｏｌｉ株ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバゲン，マディソン，ウィスコンシン州）に形質転換した。この株は、誘導性ＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７プロモーターの染色体コピーを含む。ＩＰＴＧの誘導により、アミノ酸１９〜３９１を含む切断タンパク質を発現させる。この過剰発現した切断タンパク質を、精製しやすくするためＣ−カルボキシ末端ヒスチジンタグを用いてノバゲンＨＩＳ−ＢＩＮＤ（登録商標）精製キット（ノバゲン，マディソン，ウィスコンシン州）で精製を行った。その後クーマシーブルー（Ｃｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ったところ、約４１ｋＤａの単一バンドが見られた。
【００７２】
以下は、クローニングし発現させたｒＰｃｐＡタンパク質の完全な配列である。下線を引いた部分はクローニングベクター由来である。
【００７３】
【化１】
【００７４】
【化２】
抗ＰｃｐＡポリクローナル抗体の作製。精製したｒＰｃｐＡを用いてニュージーランドホワイトウサギ（マートルズラビティー（Ｍｙｒｔｌｅ’ｓ Ｒａｂｂｉｔｙ），トンプソンステーション（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ），テネシー州）に皮下免疫し、抗ＰｃｐＡポリクローナル血清を得た。このウサギに１ｍｌの完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡを総容量２ｍｌ皮下注射した。２週間後、完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡで第２のブーストを行い、第２のブーストから２週間後、不完全フロイントアジュバントに加えた１００μｇのＰｃｐＡで第３のブーストを行った。最終ブーストから２週間後、麻酔下でウサギを心臓穿刺により脱血した。その血液を凝固させ、遠心分離により血清を得て−８０℃で保存した。
【００７５】
ＰＣＲによるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株におけるｐｃｐＡの確認。ＰＣＲプライマー対ＢＧＰ−１とＢＧＰ−２を用い種々のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株におけるｐｃｐＡの有無を点検した。プライマー対を、ＴＩＧＲ４株におけるｐｃｐＡの１４１６ｂｐのＮ末端フラグメントを増幅するように設計した。その後、ＰＣＲ産物をＴ．Ａ．Ｅ．（Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ）アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色して増幅したバンドの正確なサイズを調べた。
【００７６】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の分画。ＹｏｔｈｅｒおよびＷｈｉｔｅが記載した方法（Ｙｏｔｈｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ １７６：２９７６−８５（１９９４））をわずかに変更してプロトプラストを作製した。ＭＴＨＹで増殖させた対数期細胞をペレットにし、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。次いで、この細胞を０．５ｍｌの２％塩化コリンに再懸濁し、そのチューブを数回反転させた。次いで、細胞をペレットにし、上清を取り除き、−２０℃で保存した（コリン溶出画分）。細胞をペレットにし、３００μｌのプロトプラスト緩衝液（２０％スクロース、５ｍＭのトリス［ｐＨ７．４］、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４）で１回洗浄した。次いで、このペレットを１ｍｌのプロトプラスト緩衝液に再懸濁してから、培養ペレット１ｍｌ当たり５Ｕのムタノリシン（シグマアルドリッチ，セントルイス，ミズーリ州）を加えた。この懸濁液を室温で一晩インキュベートした。細胞を６０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレットにし、上清を−２０℃で保存する（細胞壁画分）。次いで、このプロトプラストを１ｍｌのプロトプラスト緩衝液で洗浄した。顕微鏡検査によりプロトプラストの形成を確認した。このプロトプラストをペレットにし、０．３〜１ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解して、これを−２０℃で保存する（細胞膜／細胞質画分）。ＰｃｐＡが存在するかどうかウエスタンブロット解析により各画分のサンプルを調べる。
【００７７】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗体染色。高または低マンガン培地で増殖させた中間対数期細胞（ＯＤ６０００．６）をペレットにし、ＰＢＳで洗浄して、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳＢ）に再懸濁し、室温で２０分インキュベートした。細胞をペレットにし、ＰＢＳＢまたはＰＢＳＢで１：１００になるように希釈した抗ＰｃｐＡ血清に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いてＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、ＰＢＳＢで希釈したヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（重鎖と軽鎖）−フルオレセインイソチオシアナート（サザンバイオテクノロジーアソシエーツインク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．），バーミングハム，アラバマ州）と４℃で３０分間インキュベートした。次に、この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０１ｍＭの親油性膜色素ＴＭＡ−ＤＰＨ（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）を含む４％ホルムアルデヒドＰＢＳ溶液に再懸濁した。その後、細菌細胞をＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ ７０顕微鏡を用いて落射蛍光観察で検査した。
【００７８】
ウエスタンブロット。細菌培養をＴＨＹおよびＭＴＨＹで中間対数期ＯＤ６０００．６まで増殖させた。同量の菌株をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプル緩衝液を含むＰＢＳで再懸濁して、５分間煮沸した。サンプルおよび着色タンパク質標準物質（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）を製造者の指示に従いＮｕＰＡＧＥ１０％ビス−トリスゲル（インビトルゲン，カールズバッド，カリフォルニア州）に流し、モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ：ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−ＳＤＳ泳動用緩衝液（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）で電気泳動により分離した。次に、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ ｓｅｍｉｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｌｌ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ），カリフォルニア州）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーした。このブロットを、ＰＢＳＢで１：１０００に希釈した抗ＰｃｐＡポリクローナル抗体でプローブした。ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（重鎖と軽鎖）−アルカリホスファターゼおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（サザンバイオテクノロジーアソシエーツインク，バーミングハム，アラバマ州）を二次抗体として用いた。Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ）錠剤（シグマアルドリッチ，スイス）を用いて比色検出を行った。
【００７９】
マウスの全身免疫。最初に、６〜８週齢のＣＢＡ／ＣａＨＮＢｔｋｘｉｄ／Ｊ（ＣＢＡ／Ｎ）マウス（ジャクソンラブズ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ），バーハーバー，メイン州）に、２μｇの水酸化アルミニウムをアジュバントとして１０μｇのｒＰｃｐＡを総容量２００μｌ皮下注射した。２週間後、水酸化アルミニウムを用いて１０μｇのｒＰｃｐＡで第２のブーストを行った。２週間後、水酸化アルミニウムを用いずに１０μｇのｒＰｃｐＡを含む第３のブーストを行った。次に、このマウスを２週間放置しておき、その後Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅをチャレンジした。感染の２４時間前にマウスを脱血した。
【００８０】
敗血症のマウスモデル。前述の感染症の全身モデルを用いて肺炎球菌のビルレンスを調べた（Ｃｏａｔｓ，ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：４２５７−６２（２００５）；Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：７５−８５（２００３））。６〜８週齢のＣＢＡ／Ｎマウスに、乳酸加リンゲルで希釈したバクテリアを３００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）静脈内注射した。マウスを２１間モニターした。触っても反応しなくなり、体温が正常未満まで低下したときマウスを瀕死状態としてスコア化し、その日時を記録した。瀕死状態のマウスをすべてＣＯ２麻酔で安楽死させた。
【００８１】
肺炎のマウスモデル。以前に記載されているように肺に感染させた（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：２５２６−３４（２００２）；Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：３３９−４８（２００３）；Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２５７−２６０（１９９７））。６〜８週齢のＣＢＡ／Ｎマウスをイソフルラン（ミンラド（ＭｉｎＲＡＤ），バッファロー，ニューヨーク州）で麻酔し、５×１０６個のバクテリアを含む４０μｌの乳酸加リンゲル溶液の懸濁液をマウスの外鼻孔に導入し、誤嚥性肺炎を誘発した。７日後、マウスを屠殺した。屠殺したマウスの鼻腔を、以前に記載されているように５０μｌの乳酸加リンゲルで洗浄した（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：８３９−４６（１９９７））。鼻洗浄液を連続希釈し、ゲンタマイシン（４μｇ／ｍｌ）を含む血液寒天培地に蒔いた。肺を摘出し、２ｍｌの乳酸加リンゲルが入ったストマッカーバッグに入れ、ホモジナイズし、連続希釈して、３倍連続希釈液に加えたゲンタマイシンを含む血液寒天培地に蒔いた。
【００８２】
鼻咽頭定着のマウスモデル：以前に記載されているように鼻腔内接種を行った（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：２５２６−３４（２００２）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：８３９−４６（１９９７））。６〜８週齢のＣＢＡ／Ｎマウスに、麻酔なしで１０μｌの乳酸加リンゲル液に加えた１０６個のバクテリアを鼻腔内感染させた。次に、感染マウスを屠殺し、その鼻腔を５０μｌのリンゲル溶液で洗浄した。この鼻洗浄液を連続希釈し、ゲンタマイシンを含む血液寒天培地に蒔いた。キャンドルジャーで３７℃にて一晩インキュベーションした後、血液寒天プレートから目視可能な数を判定した。
【００８３】
統計解析。インスタット（Ｉｎｓｔａｔ）（グラフパッドソフトウェアインク（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．），サンディエゴ，カリフォルニア州）を用いて統計解析を行った。マンホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）の２標本順位検定を用いて、対照と実験群との瀕死状態になるまでの時間またはＣＦＵの回収数を比較した。ｐ値が０．０５未満の場合に統計学的に有意と判定した。
【００８４】
結果
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床的に重要な菌株にはｐｃｐＡが存在する。ｐｃｐＡのＬＲＲ領域をはさんだプライマー（ＢＧＰ１とＢＧＰ２）を用いてＰＣＲにより、ｐｃｐＡの存在を調べた。調査対象の２３株（表２および表３）それぞれで約１５００ｂｐフラグメントが得られた。これら菌株のうち８つは、過去２５年以内に単離されている臨床菌株で、７価コンジュゲートワクチンがカバーする７種のよく見られる莢膜型の代表的な菌株である（図１）。残りの１２株は、ゲノム多様性プロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｍｉｃｒｏｂｉｏ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ｓｔｒｅｐ／ｉｎｆｏ／）の一環として構築された一連の菌株から選択されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのセットである。このプロジェクトは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの幅広い多様性をカバーするため一連の菌株を選択している。これら１２株については、ＭＬＳＴデータに基づき広く多岐にわたるように選択した。４株は重篤な侵襲性疾患の患者由来、５株は無症候性保菌者由来で、２株については疾患／定着が不明であり、１株は世界的な抗生物質耐性クローン由来であった。これらの菌株は、世界の様々な領域における１２種の莢膜型の典型である。
【００８５】
すべての菌株でＰｃｐＡの発現を検査するため、低（≦０．１μＭ）マンガンで菌株を増殖させた。全細胞タンパク質サンプルを、低マンガン培地で培養した中間対数期細胞から調製した。（表２および表３）に示したすべての菌株を検査したが、７価ワクチンに含まれる莢膜型に相当する菌株のみを示してある（図２）。全細胞タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにトランスファーした。このブロットを抗ＰｃｐＡポリクローナル抗血清でプローブすると、これら莢膜（ｃａｐｓｕｌａｒｅ）血清型４、６、９、１４、１８、１９、２３の野生株それぞれで約６２ｋＤａのバンドが検出された（図２）。この６２ｋＤａバンドは、ｐｃｐＡ不活化ミュータントＪＥＮ１１では存在しなかった一方、７種の典型的な菌株では存在した。また、全細胞タンパク質サンプルについては、同じ菌株を高マンガン培地で増殖させた菌株からも調製したが、抗ＰｃｐＡ抗血清によりバンドは検出されなかった。ＰＣＲ解析とウエスタンブロットデータの組み合わせから、表２および表３に示すＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株すべてでｐｃｐＡが存在することが明らかになった。
【００８６】
ＰｃｐＡは、低マンガン条件下でＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの表面に露出している。マンガンは、レギュレーターＰｓａＲの作用を介してｐｃｐＡ遺伝子の転写をコントロールしていることが研究で明らかになっている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：１１７１−８０（２００６））。本明細書に記載のとおり、マンガン依存性制御は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ表面上のＰｃｐＡの存在に直接影響を与え、表面ＰｃｐＡは、莢膜を持つ肺炎球菌上でも抗体に接触できる。
【００８７】
細胞分画を行って、ＰｃｐＡがＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａの細胞壁または細胞膜／サイトゾルと関係があるどうか判定した。これら細胞画分のウエスタンブロット解析から、ＰｃｐＡは大部分が低マンガン培地で増殖させたバクテリアのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞壁に存在することが明らかになった。ＰｃｐＡの小さな画分は、細胞膜／サイトゾルとの関連性が認められたが、これは、おそらくＰｃｐＡがまだバクテリアの表面に運ばれていないのであろう。
【００８８】
細胞分画ばかりでなく、野生型Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＴＩＧＲ４由来の対数期細胞を、高または低マンガン培地で増殖させ、抗ＰｃｐＡポリクローナル抗血清、続いてフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）コンジュゲート抗ウサギ免疫グロブリンで染色した。具体的には、ＴＩＧＲ４を中間対数期まで高または低Ｍｎ２＋培地で培養した。バクテリアを、抗ＰｃｐＡウサギ血清とインキュベートし、続いてＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギＩｇ抗体とインキュベートした。次に、細胞を、膜色素ＴＭＡ−ＤＰＨを含む４％ホルムアルデヒドで固定した。その後、この標識バクテリアを免疫蛍光顕微鏡により調べた。ＰｃｐＡに対する抗体は、低マンガンで増幅させたバクテリアの染色に関与できるが、高マンガンで増幅させたバクテリアには関与できない。
【００８９】
こうした結果から、ＰｃｐＡは、インビトロでの低マンガン条件下で培養した野生型Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの表面に露出していることが明らかになる。これは、ＰｃｐＡが宿主内の肺および血液などの低マンガン部位に感染しているバクテリアに発現し、表面に露出していることを示唆している。ＰｃｐＡがこのように露出していることで感染において細菌と宿主上皮との間のＰｃｐＡ−リガンド相互作用が亢進される。こうした結果からは、マンガン濃度によるＰｃｐＡ産生の制御を大部分の肺炎球菌に一般化できることも示唆される。
【００９０】
ｒＰｃｐＡを免疫すると、抗体が惹起され、肺および全身性感染症に対して保護作用が与えられるが、鼻咽頭定着には大きな作用を及ぼさない。感染症研究に使用する前、マウスを、水酸化アルミニウムを含むｒＰｃｐＡで免疫するか、水酸化アルミニウムを単独投与した。マウスの２つの群についてＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）により全Ｉｇ（Ｈ＋Ｌ）を定量した。免疫マウスの血清中の抗体特異的ＰｃｐＡの幾何平均レベルは、０．４６５（±０．１１９）μｇ／ｍｌ、これに対してアジュバントを単独投与したマウスでは平均０．００２（±０．００２）μｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）であった。これは、免疫経路が、ｒＰｃｐＡに対する免疫反応を惹起させるのに有効であったことを示唆している。
【００９１】
免疫によりマウスが肺炎から保護されるかどうかを調べるため、免疫マウスおよびａｌｕｍのみのマウスを軽麻酔し、外鼻孔にＥＦ３０３０株を５×１０６ＣＦＵ接種した。この手順では、限局性肺炎が認められたが、菌血症は認められなかった。したがって、このモデルにおける保護作用は肺炎自体とは関係があるものの、敗血症全般には無関係である可能性がある。感染から７日後、マウスをすべて屠殺した。ホモジナイズした肺組織および鼻洗浄液の細菌数を判定した。回収したＣＦＵの中央値によれば、ｒＰｃｐＡで免疫したマウスの肺ホモジネートから回収した肺炎球菌数は、アジュバントを単独投与した場合に比べて１／１００未満であった（図３Ａ）（Ｐ＝０．００２）。こうした結果から、ｒＰｃｐＡの免疫により、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺感染症に対する保護作用を惹起できることが示唆される。マウスの鼻洗浄液から回収した細菌数については、ｒＰｃｐＡで免疫した場合とアジュバントを単独投与した場合とで有意な差はなかった（図３Ｂ）。以下に詳述するように、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株血清型６由来の組換えＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ（ｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ）も肺感染を防止するが、肺炎のマウスモデルの定着については防止しなかった。
【００９２】
次に、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの他の菌株（ＴＪ０８９３、血清型１４；ＥＦ９３０３、血清型２３Ｆ；およびＬ８２０１６、血清型６Ｂ）による限局性肺感染に対して皮下免疫が保護作用を与えるかどうかを判定した。ｒＰｃｐＡを皮下免疫すると、アジュバントを単独免疫したマウスと比較して、各菌株に対して有意な保護作用が惹起された（図５）。
【００９３】
最適な鼻腔定着にはＰｃｐＡの発現は必要ない。免疫を行っても肺炎モデルに使用したマウスの鼻洗浄液から回収したバクテリア数に影響がなかったため、鼻咽頭保菌のモデルを用いてｐｃｐＡ不活性化の作用を調べた。このモデルでは、肺炎モデルのマウスの鼻洗浄液から収集した間接的な観察結果とは異なり、鼻腔保菌に対するＰｃｐＡの任意の作用を直接観察できる。マウスに、事前に麻酔せずにＥＦ３０３０株またはそのｐｃｐＡ不活化ミュータントＪＥＮ１８株のどちらかを１０６ＣＦＵ接種した。感染から７日後、このマウスを屠殺し、鼻洗浄液を採取して、肺炎球菌を検出するためプレーティングした。ＥＦ３０３０またはＪＥＮ１８を接種したマウスの鼻洗浄液から回収したバクテリア数には、どちらも有意な差はなかった（図５）。
【００９４】
インタクトなｐｃｐＡの遺伝子が存在しても、あるいは、ｒＰｃｐＡの皮下免疫を行っても、マウスの鼻洗浄液に回収された肺炎球菌数に影響がないということは、鼻咽頭のマンガン濃度（≧３６μＭ）がｐｃｐＡ転写を抑制するほど十分に高いことと整合する。こうした条件下では、鼻咽頭におけるｐｓａＲによりｐｃｐＡ転写が阻止されると考えられる。したがって、この宿主部位ではＰｃｐＡに対する免疫がバクテリアにほとんど作用しないことが予想されよう。
【００９５】
ＰｃｐＡおよびＰｃｐＡに対する免疫は、全身性感染症のマウスモデルにおけるビルレンスに作用する。敗血症を防止するＰｃｐＡに対する免疫能を評価するため、ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに加えたＰｃｐＡを、または対照として水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫し、静脈内に莢膜型４、ＴＩＧＲ４Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅをチャレンジした。マウスに菌血症および敗血症を発症させやすくするため、ＥＦ３０３０でなはなくこの菌株を用いた。免疫した動物に、ＴＩＧＲ４株Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを３００ＣＦＵ静脈内（ＩＶ）注射した。生存状況を２１日間モニターした。ｒＰｃｐＡ免疫を受けたマウスが瀕死状態になるまでの経過時間中央値は、アジュバントを単独投与したマウスと比べて４３．５時間伸びた（図６）。ｒＰｃｐＡで免疫したマウスの２６パーセントが生存した一方、水酸化アルミニウム単独で免疫マウスはすべて死亡した。この生存の差は統計学的に有意であった（Ｐ＝０．００７）。
【００９６】
静脈内接種後にマウスを瀕死状態にさせる肺炎球菌の能力に対するｐｃｐＡの不活性化の作用。ｐｃｐＡを不活性化すると、肺炎マウスモデルおよび肺−敗血症モデルのビルレンスが低下した。本明細書に記載のように、未感染のマウスにＴＩＧＲ４またはそのｐｃｐＡ不活化ミュータントＪＥＮ１１を３００ＣＦＵ感染させて、静脈内チャレンジ後の全身性感染症に対するｐｃｐＡ不活性化の作用を調べた。ｐｃｐＡ−ミュータントに感染したマウスが瀕死状態になるまでの経過時間中央値は、野生型バクテリアで感染させた場合と比べて３１．５時間の伸びた（Ｐ＝０．０２９９）（図７）。これは、全身性疾患を発症させるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの能力にはＰｃｐＡが関与していることを示唆している。
【００９７】
（実施例２）
ＰｃｐＡの粘膜免疫は肺感染を防止する。
【００９８】
図８に示すように、ＰｃｐＡの粘膜免疫は、菌株ＥＦ３０３０による肺感染症を防止する。ＣＢＡ／Ｎマウスに５μｇのＰｃｐＡおよびアジュバントとしてコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を鼻腔内免疫した。免疫後マウスを脱血し、次に、菌株ＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。図８は、感染から７日後の肺ホモジネートにおけるバクテリアのｌｏｇＣＦＵを示す。
【００９９】
粘膜免疫による保護作用は、皮下免疫の場合よりも若干高まることが観察された。こうしたデータと実施例１から、少なくとも粘膜経路または皮下経路の投与を用いれば、肺炎および敗血症に対する保護作用が得られることが示唆される。ＰｃｐＡを粘膜免疫しても、この菌株による鼻腔定着を防止できない。ＰｃｐＡは定着の過程で発現しないため、鼻腔定着を防止できないことが予想される。
【０１００】
（実施例３）
ＰｃｐＡの皮下または鼻腔内免疫により惹起される抗体。
【０１０１】
ＰｃｐＡで免疫したマウスから得られた血清について、ＰｃｐＡに対する抗体のレベルを調べた。ＣＢＡ／Ｎマウスに、０日目および１４日目にアジュバントとして水酸化アルミニウムまたはコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）のどちらかを皮下（ＳＣ）免疫し、２１日目にＰｃｐＡを単独で皮下（ＳＣ）免疫した。３５日目にマウスを脱血し、血清中の抗体レベルを判定した。判定には、ＰｓｐＡでコートしたマイクロ滴定プレートと反応する既知濃度のＰｓｐＡ抗体で観察される光学密度（ＯＤ）を標準として用いた。対照として、別のマウス群を希釈液およびアジュバントのみで免疫した。ＩｇＧ抗体反応は、鼻腔内（ＩＮ）免疫よりもＳＣ免疫で観察された方が１．３倍大きかった（表５）。
【０１０２】
【表５】
このタイプのアッセイにはつきものであるが、サブクラスの量の合計が全Ｉｇの量にならなかった。これは、抗ＩｇＧ血清がＩｇＧサブクラスのすべてを等しく認識するとは限らないことを示唆している。
【０１０３】
（実施例４）
肺細胞への付着にはＰｃｐＡが必要である。
【０１０４】
ＰｃｐＡは、形質転換肺上皮細胞Ａ５４９細胞株（図９）への付着には必要であるが、形質転換ヒト鼻上皮細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２系（図１０）への付着には必要ない。Ａ５４９肺上皮細胞への付着には、ＰｃｐＡを産生するように肺炎球菌が低Ｍｎ２＋において増幅する必要があることも観察された。こうした研究のため肺炎球菌を、トッドヒューイットおよび酵素培地（高Ｍｎ２＋）、あるいはＣｈｅｌｅｘ−１００（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に通して０．１μｍのＭｎＳＯ４および１ｍＭのＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＦｅＳＯ４で再構成したトッドヒューイットおよび酵素培地（低Ｍｎ２＋）で増殖させた。（Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ，１８８：３３９−４８（２００３））。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２またはＡ５４９細胞の単層を、ＴＩＧＲ４（ｐｃｐＡ＋）またはＪＥＮ１１（ｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株）１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。この付着バクテリアを含む上皮細胞を洗浄し、０．５％ツイーン２０で溶解した。血液寒天プレートの定量プレーティングでライセート中の肺炎球菌の数を判定した。
【０１０５】
肺炎球菌のＡ５４９細胞への付着は、ＰｃｐＡに対する抗体で阻害される（図１１）。こうしたデータは、肺炎球菌の肺上皮細胞への付着がＰｃｐＡ依存性であることを示唆している。
【０１０６】
（実施例５）
受動防御モデル。
【０１０７】
ＰｃｐＡによる能動免疫が肺感染に対する保護作用を惹起できることから、ＰｃｐＡに対する抗体がマウスを肺感染から受動的に保護できるかどうかを判定した。しかしながら、肺炎モデルでは受動防御はまだ観察されていない。第２の受動免疫研究では、ＰｃｐＡに対するウサギ免疫血清を用いて、ＴＩＧＲ４株による静脈内（ＩＶ）敗血症に対する受動防御を判定した。検査対象の最高濃度（１／１０）の血清ではマウス２匹の死を予防できることが観察された（図１２）。非免疫血清では、同じ濃度でも防止することができなかった。こうしたデータから、受動免疫は、予防が困難な場合がある菌株、ＴＩＧＲ４株を予防することができると考えられる（Ｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ，７１：４４９８−５０５（２００３））。
【０１０８】
（実施例６）
ＰｃｐＡおよびニューモリシンによる保護作用
ニューモリシン（Ｐｌｙ）は、肺感染に対してある程度の保護作用を惹起し得るもう１つのタンパク質である（Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：３３９−４８（２００３））。ニューモリシンおよびＰｃｐＡはともに、タンパク質ベースの肺炎球菌ワクチンの候補物質であるため、この２つのタンパク質について、免疫源として併用した場合、どちらかを単独で使用するよりも肺感染に対する保護作用が高まるかどうかを判定した。マウスにＰｃｐＡ５μｇ、ニューモリシン５μｇまたはＰｃｐＡ５μｇとニューモリシン５μｇを３回免疫した。最初の２回の注射ではａｌｕｍを用い、３回目の注射ではタンパク質単独で行った。今回使用したニューモリシンは、野生型ニューモリシンであった。図１３は、ニューモリシンが肺感染に対して、ＰｃｐＡが惹起するのと類似の保護作用を惹起することを示す。ＰｃｐＡとニューモリシンを組み合わせると、ニューモリシン単独の場合よりも保護作用が著しく高まった。こうしたデータから、ＰｃｐＡおよびニューモリシンを併用することで保護作用が得られることが示唆される。
【０１０９】
（実施例７）
他の肺炎球菌に対する交差防御。
【０１１０】
ＰｃｐＡが交差防御を惹起するかどうかを判定するため、上述の方法を用いて実施例１〜２に記載した以外の菌株を検査してもよい。敗血症の研究の場合、ＴＩＧＲ４の他にＷＵ２、Ａ６６、ＢＧ７３２２、ＥＦ６７９６、Ｄ３９などの菌株が検査対象となる。これらの菌株の莢膜型は、３、３、６Ｂ、６Ａおよび２である。肺感染を調べるには、限局性肺感染のマウスモデルでうまく行く菌株を用いる。こうした菌株として、ＥＦ９３０９、ＴＧ０８９３、Ｌ８２０１６、ＢＧ７３２２およびＥＦ６７９６が挙げられる。これらの莢膜型は、２３Ｆ、１４、６Ｂ、６Ｂおよび６Ａである。
【０１１１】
（実施例８）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６由来の組換えＰｃｐＡのクローニングおよび発現。
【０１１２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６株、１４４５３、アメリカンタイプカルチャーコレクション指定番号５５９８７由来のｐｃｐＡ遺伝子のフラグメントを以下のとおりクローニングした。このｐｃｐＡ遺伝子は、ＰｃｐＡ Ｃ末端コリン結合ドメイン（ＣＢＤ）のリピートをコードする部分と天然のシグナルペプチド（ＳＰ）配列をコードする部分とを欠損している。この遺伝子を、図１４に示すようにＮｄｅＩとＸｈｏＩのクローニング部位の間のｐＥＴ−３０ａ（ノバゲンインク，マディソン，ウィスコンシン州）にクローニングした。内部ｐｃｐＡ遺伝子（ΔＳＰΔＣＢＤ１３３５ｂｐ）の遺伝子フラグメントを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６株染色体（ｃｈｏｒｏｍｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーとして
５’−ＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＡＧ−３’（配列番号４３）および
５’−ＣＴＡＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＡＧＴＴＣＧＧＡＡＧＴＡＡＴＣ−３’（配列番号４４）
を用いた。実施例１に記載されているようにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプライマーに制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを導入した。ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤをコードする得られた１３３５塩基対フラグメントは、どちらかの末端にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を含んでいた。増幅したフラグメントをゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化してから、このｐｃｐＡ遺伝子フラグメントを、強力なＴ７プロモーターおよび翻訳シグナルを用いてｐＥＴ−３０ａベクター（ノバゲンインク，マディソン，ウィスコンシン州）のＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位の間にライゲートした（図１４）。ＤＮＡシーケンシングの結果、組換えプラスミドｐＪＭＳ８７は、ｐｃｐＡ遺伝子フラグメントΔＳＰΔＣＢＤ１３３５ｂｐを含むことが確認された。プラスミドｐＪＭＳ８７をタンパク質製造のためＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。ＩＰＴＧで誘導して、このＥ．ｃｏｌｉ株に天然のシグナルペプチド（ΔＳＰ）およびＣ末端コリン結合ドメイン（ΔＣＢＤ）を欠損しているＰｃｐＡタンパク質を発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析でこの発現タンパク質を確認した。
【０１１３】
ｒＰｃｐＡタンパク質（ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤとも呼ぶ）の配列は、以下のとおりである。下線で示す残基（Ｍ）は、クローニングベクター由来である。
【０１１４】
【化３】
（実施例９）
ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤの免疫は、敗血症モデルの肺炎に対して保護作用を惹起する。
【０１１５】
ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤがマウスの敗血症モデルにおいて感染症を防止するかどうかを判定するため、マウスに、精製した組換えＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ（ｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ）を１用量当たり１０、５、２．５、１．２５および０．６２５μｇ免疫し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＷＵＢＭ３を１匹当たり約３００ＣＦＵチャレンジした。このｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤについては、リン酸アルミニウムアジュバントで製剤化した。
【０１１６】
簡単に説明すると、マウスに、対照のＰＢＳアジュバント、３０μｇの３価組換えＰｓｐＡタンパク質を含むＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＰｓｐＡタンパク質、あるいは１用量当たり１０、５、２．５、１．２５または０．６２５μｇのｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤを免疫した。健康なＢＡＬＢ／ｃ Ｋ−７２雌マウス（チャールスリバーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ウィルミントン，マサチューセッツ州）（各群およそ１４匹）を０日目に皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。２１日目に２回目の免疫および４３日目に３回目の免疫を行った。６３日目に、このマウスにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＷＵ２ＢＭ３バクテリア約３００ＣＦＵを０．４ｍｌ用量腹腔内（ＩＰ）チャレンジした。生存率を時間（日数）に対してプロットして図１５Ａに示す。チャレンジから７日目の生存率を図１５Ｂに示す。
【０１１７】
これらの結果は、ｒＰｃｐＡが１用量当たり少なくとも約０．６２５μｇから少なくとも約１０μｇで保護作用を持つことを示す。ｒＰｃｐＡではアジュバント対照群と比較して統計学的に有意な保護作用が得られた（片側または両側のフィッシャーの正確確率検定）。
【０１１８】
【表６】
（実施例１０）
ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤの免疫は、肺炎に対する保護作用を惹起する。
【０１１９】
マウス肺炎モデルにおいて実施例５のｒＰｃｐＡタンパク質を用いて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＥＦ３０３０のチャレンジに対するこのタンパク質の保護作用の有効性も検査した。ＣＢＡ／Ｎマウス１０匹群に、表７に示すような免疫原製剤２００μｌを３週間おきに３回（０日目、２１日目および４２日目）皮下免疫した。３回目の免疫から３週間後（６３日目）、このマウスに麻酔下でＥＦ３０３０株を鼻腔内に５．６×１０６ＣＦＵチャレンジした。チャレンジから５日後（６８日目）、マウスを屠殺し、肺組織および血液を摘出してＣＦＵを回収するためプレーティングした。この免疫群をリン酸アルミニウムアジュバント３ｍｇ／ｍｌで製剤化した。
【０１２０】
【表７】
３価ＰｓｐＡ免疫原は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＰｓｐＡ Ｒｘ１−Ｍ１、ＥＦ３２９６およびＥＦ５６６８で構成した。
【０１２１】
結果を図１６に示す。ｒＰｃｐＡタンパク質は、対照群（アジュバント単独は群１）と比較して保護作用が顕著であり（群３〜６）、陽性対照（群２がＰｓｐＡ）に対しては同等レベルであった。マンホイットニー検定によるｐ値を表８に示す。
【０１２２】
【表８】
本明細書に引用する刊行物および刊行物に記載の材料については、その全体を参照によって本明細書に明確に援用する。
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への相互参照）
本願は、２００６年８月１７日に出願された米国特許出願第６０／８２２，７１５号、２００６年９月２８日に出願された同第６０／８２７，３４８号、および２００７年５月１０日に出願された同第６０／９１７，１７８号に対する優先権を主張し、米国特許出願第６０／８２２，７１５号、同第６０／８２７，３４８号、および同第６０／９１７，１７８号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（連邦政府により助成された研究に関する申告）
本発明は、国立衛生研究所からの助成金第Ｒ０１ ＡＩ０５３７４９号、同第Ｒ０１ ＡＩ２１５４８号、および同第Ｔ３２ ＨＬ ０７５５３号のもと政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはかなり広範囲に存在するヒト病原体であり、肺、中枢神経系（ＣＮＳ：ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）、中耳および鼻道（ｎａｓａｌ ｔｒａｃｔ）などのいくつかの器官に感染する場合がある。感染すると、気管支炎、肺炎、髄膜炎、副鼻腔感染症および敗血症など様々な症状を引き起こす。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒトの細菌性髄膜炎の主な原因であり、抗生物質による処置を行っても死亡率および罹患率が高いことと関係がある（非特許文献１）。
【０００４】
現在、２種類の肺炎球菌ワクチンが利用できる。１つは２３種の莢膜多糖類からなる成人用ワクチンで、この２３種を合わせると、肺炎球菌感染症の原因となる菌の約９０％の莢膜型を占める。しかしながら、このワクチンは、小児、すなわち、肺炎球菌感染症に対する感受性が高い年齢群には免疫原性がない。成人にあっては、このワクチンは、菌血症性の肺炎に対して有効性が約６０％であるがことが明らかになってはいるものの、年齢または基礎的な医学的状態が原因で肺炎球菌感染症の危険性が高まると、成人でも有効性が低下する（非特許文献２；非特許文献３）。このワクチンは、最も一般的な感染形態である非菌血症性の肺炎球菌性肺炎に対して効果的であることが明らかにされていない。
【０００５】
利用可能なもう１つのワクチンは、２歳未満の小児の菌血症性肺炎球菌感染症に対して有効な７価コンジュゲートワクチンである。このワクチンは、肺炎に対する有効性も証明されている（非特許文献４；非特許文献５）。このワクチンは、７種のコンジュゲートを製造する必要があるため製造が複雑であることから、高価なものになっている（小児１人当たり約＄２００）。さらに、非ワクチン型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが非常に多い発展途上国世界の感染症をカバーするのにあまり役に立たない（非特許文献６；非特許文献７）。このワクチンは、中耳炎および定着に対しては侵襲性疾患に対してほど効かない。また、７価コンジュゲートワクチンを使用すると定着が促進され、ワクチンに含まれる７多糖類でない莢膜型の菌による疾患が増加することも明らかになっている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。故に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの効果的な処置剤が依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｑｕａｇｌｉａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：８６４−８７２
【非特許文献２】Ｆｅｄｓｏｎ，ａｎｄ Ｍｕｓｈｅｒ．２００４．「Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ，」ｐｐ．５２９−５８８．Ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｓ．Ａ．Ｐｌｏｔｋｉｎ ａｎｄ Ｗ．Ａ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ（ｅｄｓ．），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
【非特許文献３】Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ，Ｍｅｄ．３２５：１４５３−１４６０（１９９１）
【非特許文献４】Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１：８１０−５（２００２）
【非特許文献５】Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐｅｄｉａｔｒ．ｌｌ（７）：８４３−５３（２００４）
【非特許文献６】Ｄｉ Ｆａｂｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．２０：９５９−９６７（２００１）
【非特許文献７】Ｍｕｌｈｏｌｌａｎｄ，Ｔｒａｐ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ １０：４９７−５００（２００５）
【非特許文献８】Ｂｏｇａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．４：１４４−１５４（２００４）
【非特許文献９】Ｅｓｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：４０３−４０９（２００１）
【非特許文献１０】Ｍｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．１８０：１１７１−１１７６（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を惹起する組成物および方法について説明する。より詳細には、本開示は、ＰｃｐＡのフラグメントおよびその変異体ならびにポリペプチドをコードする核酸など、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドに関する。本開示はさらに、免疫原性ポリペプチドの製造および使用の方法にも関する。こうした組成物および方法を用いれば、肺炎球菌感染症を軽減または防止するように設計された現在入手可能な組成物および方法と比べ、有効性および効率が向上し、費用が削減される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＰＣＲによるｐｃｐＡの確認を示す。様々なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株のゲノムＤＮＡをＰＣＲ解析した。プライマー対（ＢＧＰ１（配列番号５０）およびＢＧＰ２（配列番号５１））を用いてＰｃｐＡのＮ末端部分（ＬＲＲ領域を含む）をコードする核酸を増幅した。レーン１は、ＴＩＧＲ４；レーン２は、Ｌ８２０１３；レーン３は、Ｄ１０９１Ｂ；レーン４は、ＢＧ１２７３０；レーン５は、ＴＪ０８９３；レーン６は、Ｒ６；レーン７は、ＢＧ１０７５２；レーン８は、Ｖ１７５；レーン９は、ＥＦ３０３０；レーン１０は、陰性対照（鋳型ＤＮＡなし）である。
【図２】図２は、低Ｍｎ２＋条件下でのＰｃｐＡの存在に関するウエスタンブロット解析を示す。バクテリアを中間対数期まで低Ｍｎ２＋培地で培養し、全細胞タンパク質サンプルを調製した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースにトランスファーして、ｒＰｃｐＡポリクローナル抗血清でプローブした。レーン１は、ＪＥＮ１１（ｐｃｐＡ−ミュータント）；レーン２は、ＪＥＮ７（ｐｃｐＡの構成的ミュータント）；レーン３は、Ｄ１０９１Ｂ；レーン４は、ＥＦ５６６８；レーン５は、ＢＧ１０７５２；レーン６は、Ｖ１７５；レーン７は、Ｌ８２０１３；レーン８は、ＢＧ１２７３０；レーン９は、ＴＪ０８９３である。
【図３Ａ】図３は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡの免疫により得られる保護作用がアジュバント単独の場合と比べて統計学的に有意であることを示す。ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに吸着したｒＰｃｐＡまたは水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫した。軽麻酔下でマウスにＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、肺ホモジネート（図３Ａ）および鼻洗浄液（図３Ｂ）の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．００１９、マンホイットニー）。
【図３Ｂ】図３は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡの免疫により得られる保護作用がアジュバント単独の場合と比べて統計学的に有意であることを示す。ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに吸着したｒＰｃｐＡまたは水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫した。軽麻酔下でマウスにＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、肺ホモジネート（図３Ａ）および鼻洗浄液（図３Ｂ）の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．００１９、マンホイットニー）。
【図４Ａ】図４は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる他のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜血清型に対する保護作用が、アジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。マウスに、ＴＪ０８９３株、血清型１４株（図４Ａ）（＊＊：ｐ＝０．０２０９）；Ｌ８２０１６株、血清型６Ｂ（図４Ｂ）（＊＊：ｐ＝０．０１９３）；またはＥＦ９３０３株、血清型２３Ｆ（図４Ｃ）（＊＊：ｐ＝０．０３８８、マンホイットニー）をチャレンジした。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。
【図４Ｂ】図４は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる他のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜血清型に対する保護作用が、アジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。マウスに、ＴＪ０８９３株、血清型１４株（図４Ａ）（＊＊：ｐ＝０．０２０９）；Ｌ８２０１６株、血清型６Ｂ（図４Ｂ）（＊＊：ｐ＝０．０１９３）；またはＥＦ９３０３株、血清型２３Ｆ（図４Ｃ）（＊＊：ｐ＝０．０３８８、マンホイットニー）をチャレンジした。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。
【図４Ｃ】図４は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる他のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜血清型に対する保護作用が、アジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。マウスに、ＴＪ０８９３株、血清型１４株（図４Ａ）（＊＊：ｐ＝０．０２０９）；Ｌ８２０１６株、血清型６Ｂ（図４Ｂ）（＊＊：ｐ＝０．０１９３）；またはＥＦ９３０３株、血清型２３Ｆ（図４Ｃ）（＊＊：ｐ＝０．０３８８、マンホイットニー）をチャレンジした。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。
【図５】図５は、ｐｃｐＡ不活性化がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの鼻腔内定着に与える作用を示す。マウスにＥＦ３０３０またはその誘導体ＪＥＮ１８を１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、鼻洗浄液の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／Ｎｏｓｅの中央値を示す。
【図６】図６は、致死性の敗血症のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡ免疫により得られる保護作用がアジュバント単独の場合に対して統計学的に有意であることを示す。ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに吸着したｒＰｃｐＡまたは水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫した。マウスにＴＩＧＲ４を３００ＣＦＵ静脈内チャレンジし、生存時間を２１日間モニターした。水平線は、生存時間の中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．００６７、マンホイットニー）。生存しているマウスを安楽死させ、検査したが、その血液中にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出できなかった。
【図７】図７は、敗血症のマウスモデルにおけるＴＩＧＲ４およびそのｐｃｐＡ不活化誘導体ＪＥＮ１１のビルレンスを示す。マウスにＴＩＧＲ４またはＪＥＮ１１を３００ＣＦＵ静脈内チャレンジし、生存時間を２１日間モニターした。水平線は、生存時間の中央値を示す。（＊＊：ｐ＝０．０２９９、マンホイットニー）。
【図８】図８は、肺炎のマウスモデルにおいて、ｒＰｃｐＡの粘膜免疫によりアジュバント単独の場合と比較して保護作用が得られることを示す。ＣＢＡ／ＮマウスにｒＰｃｐＡとコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、またはＣＴＢを単独で鼻腔内免疫した。軽麻酔下で、マウスにＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から７日後、マウスを屠殺し、ホモジナイズした肺中の細菌数を判定した。水平線は、Ｌｏｇ１０ＣＦＵの中央値を示す。（＊：ｐ＝０．０００１、マンホイットニー）。
【図９】図９は、ヒト肺上皮細胞へのｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株（それぞれＴＩＧＲ４およびＪＥＮ１１）の付着を示す。Ａ５４９ヒト肺上皮細胞の単層を、高マンガン（高Ｍｎ２＋）または低マンガン（低Ｍｎ２＋）の増殖条件下で増幅させておいたｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。この上皮細胞を洗浄し、溶解させた。各ライセート中の付着肺炎球菌の数を血液寒天プレートの定量プレーティングで判定した。回収Ｌｏｇ１０ＣＦＵとは、実験の終了時に肺上皮細胞に関連した肺炎球菌の数をいう。（＊＊：ｐ＝０．００２２、マンホイットニー）。
【図１０】図１０は、ｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株がヒト鼻上皮細胞に付着しなかったことを示す。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２ヒト鼻上皮細胞の単層を、高マンガン（高Ｍｎ２＋）または低マンガン（低Ｍｎ２＋）増殖条件下で増幅させておいたｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。次に、この細胞を洗浄し、溶解させた。ライセート中の肺炎球菌の数を血液寒天プレートの定量プレーティングで判定した。回収Ｌｏｇ１０ＣＦＵとは、実験の終了時の肺炎球菌の数をいう。
【図１１】図１１は、Ａ５４９細胞への肺炎球菌の付着が、ＰｃｐＡに対する抗体により阻害されることを示す。Ａ５４９ヒト肺上皮細胞の単層を、抗体なし、１／１００に希釈したＰｃｐＡ抗体または１／５０に希釈したＰｃｐＡ抗体を用いて高マンガン（高Ｍｎ２＋）または低マンガン（低Ｍｎ２＋）で増幅させたｐｃｐＡ＋ＴＩＧＲ４株およびｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、溶解させた。ライセート中の肺炎球菌の数を血液寒天プレートの定量プレーティングで判定した。
【図１２】図１２は、ＰｃｐＡに対するウサギ血清による敗血症に対する保護作用を示す。完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡでウサギを免疫して、続いて２週後および４週後に完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡでウサギを免疫してウサギ血清を調製した。最終ブーストから２週間後に血清を採取し、ドットブロットアッセイを行ったところＰｃｐＡに対する抗体を含むことが示された。免疫の開始前に免疫前血清も採取しておいた。２つの群を用いてウサギ抗血清の希釈液が致死性の肺炎球菌感染症を防止できるかどうかマウスを検査した。ＴＩＧＲ４の静脈内チャレンジの１時間前にマウスの３つの群に１／１０、１／１００または１／１０００に希釈した免疫血清を０．１ｍＬ腹腔内投与した。２匹のマウスに１／１０免疫前（非免疫）ウサギ血清を投与し、２匹のマウスに希釈液（ＰＢＳ）のみを投与した。マウスを５００時間または死亡時まで観察した。１／１０免疫血清を投与したマウス２匹は、実験を通して生存した。他のマウスはすべて、チャレンジ後４０〜６０時間後に死亡した。
【図１３】図１３は、ＰｃｐＡおよびニューモリシン（Ｐｌｙ）による肺感染に対する保護作用を示す。マウスに５μｇのｒＰｃｐＡ、５μｇのニューモリシン（Ｐｌｙ）または５μｇのｒＰｃｐＡと５μｇのＰｌｙを３回免疫した。最初に２回の注射ではａｌｕｍを用い、３回目の注射はタンパク質単独で行った。使用したＰｌｙは、野生型Ｐｌｙであった。マウスをイソフルラン（ミンラド，バッファロー，ニューヨーク州）で麻酔（ａｎｅｔｈｅｓｉｚｅｄ）し、４０μＬ容量に加えた莢膜型１９Ｆ株ＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。この手順の結果、肺感染症および鼻腔定着が起きる。７日後、マウスを屠殺し、ホモジナイズした肺をプレーティングした。ＣＦＵを観察したところ、ＰｃｐＡまたはＰｌｙのどちらかを免疫しても保護作用のレベルは同等であった。ＰｃｐＡとＰｌｙで免疫したマウスにおいては、保護作用が対照マウスよりも１００倍超、ＰｌｙまたはＰｃｐＡ単独の場合よりも１０倍高まった。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＪＭＳ８７の構築を示す模式図である。このプラスミドは、プラスミドｐＥＴ３０ａおよびＰｃｐＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｂ６由来のΔＳＰΔＣＢＤ ＰｃｐＡ）のフラグメントをコードする核酸のライゲーションにより形成される。
【図１５Ａ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、マウスの敗血症モデルにおいて、マウスに実施例８（１０〜０．６２５μｇ／用量）の組換えＰｃｐＡ（ｒＰｃｐＡ）を免疫して得られる保護作用をグラフ化したものである。マウスにＷＵＢＭ３株を３００ＣＦＵ腹腔内チャレンジした。図１５Ａは、一定期間にわたり、ｒＰｃｐＡを免疫したマウスがアジュバント対照群（ＰＢＳ）と比較して各用量で有意な保護作用を受けたことを示す（フィッシャーの正確確率検定）。図１５Ｂは、チャレンジから７日後の各群における保護作用のレベルを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび図１５Ｂは、マウスの敗血症モデルにおいて、マウスに実施例８（１０〜０．６２５μｇ／用量）の組換えＰｃｐＡ（ｒＰｃｐＡ）を免疫して得られる保護作用をグラフ化したものである。マウスにＷＵＢＭ３株を３００ＣＦＵ腹腔内チャレンジした。図１５Ａは、一定期間にわたり、ｒＰｃｐＡを免疫したマウスがアジュバント対照群（ＰＢＳ）と比較して各用量で有意な保護作用を受けたことを示す（フィッシャーの正確確率検定）。図１５Ｂは、チャレンジから７日後の各群における保護作用のレベルを示す。
【図１６】図１６は、マウスの肺炎モデルにおいて、実施例８のｒＰｃｐＡの免疫により得られる保護作用をグラフ化したものである。群１〜６にプラセボ（群１）、ＰｓｐＡ（群２）またはｒＰｃｐＡ（群３〜６）を免疫した。０日目に１群当たり約１４匹のＣＢＡ／Ｎマウスに初回用量の免疫原を皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。２１日目に２回目の免疫、４３日目に３回目の免疫を行った。６３日目にマウスにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＥＦ３０３０を５．６×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。感染から５日後、ホモジナイズした肺組織のＣＦＵを判定した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書は、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントおよび変異体、さらにはそのフラグメントおよび変異体の製造方法および使用方法について記載する。ＰｃｐＡは、当初Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコリン結合タンパク質（ＣＢＰ：ｃｈｏｌｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）として同定されたが、ＣＢＰタンパク質であるＰｓｐＡおよびＰｓｐＣとは異なり（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｂｅａｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６４：２０７−２１４（１９９８））、ＰｃｐＡの突然変異は、（１）変異株と野生株を競合させる競合モデルでマウスの肺、菌血症および鼻咽頭においてビルレンスを低下させる（Ｈａｖａ ａｎｄ Ｃａｍｉｌｌｉ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１３８９−１４０６（２００２））；（２）肺での定着に関する非競合的な比較においてビルレンスおよび細菌負荷を低下させる（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：１１７１−１１８０（２００６））；（３）ＣＢＡ／ＣａＨＮ−Ｂｔｋｘｉｄ／Ｊマウスにおいて敗血症の原因となるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの侵襲性株ＴＩＧＲ４（莢膜型４）の能力を低下させる；および（４）野生株と競合して肺での定着を低下させることが明らかになっている。本開示は、ＰｃｐＡに免疫原性があること、特にＰｃｐＡのフラグメントおよび変異体に免疫原性があるという最初の証拠を提供する。
【００１０】
免疫原性ポリペプチドは、（シグナル配列の存在下または存在下での）全長ＰｃｐＡアミノ酸配列、そのフラグメントおよびその変異体を含む。全長ＰｃｐＡには、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｂ６由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＢ０４７５８、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＴＩＧＲ４由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿３４６５５４およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｒ６由来のＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿３５９５３６がある。
【００１１】
任意に、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、１つまたは複数のロイシンに富んだ領域（ＬＲＲ：ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。こうしたＬＬＲは、天然型ＰｃｐＡに存在し、あるいは、このＬＬＲの天然型ＬＲＲに対する配列同一性は、たとえば、８０％、８５％、９０％または９５％など、約６０〜約９９％である。成熟ＰｃｐＡタンパク質（すなわち、シグナルペプチドが存在しないタンパク質）のＬＲＲは、配列番号１、２、４１または４５内で確認できる。
【００１２】
ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは任意に、天然型成熟ＰｃｐＡタンパク質に一般に存在するコリン結合性のアンカー配列が認められない。天然型のコリン結合性アンカー配列は、成熟ＰｃｐＡタンパク質の配列番号５２である。より詳細には、免疫原性ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸置換を持ち、かつ天然型ＰｃｐＡに対して配列同一性が約６０〜約９９％、すなわち任意の同一性が８０、８５、９０および９５％などである、天然型ＰｃｐＡのＮ末端領域を含む。Ｎ末端領域は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換の存在下または非存在下およびシグナル配列の存在下または存在下で配列番号１、２、３、４、４１または４５のアミノ酸配列を含んでもよい。Ｎ末端領域は、配列番号１、２、３、４、４１または４５に対する配列同一性が約６０〜約９９％（あるいは任意の同一性が８０〜９９％）のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１３】
配列番号１、２、３、４、４１または４５の免疫原性フラグメントは、配列番号１、２、３、４、４１または４５のアミノ酸残基を５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０および１９１個、すなわち５〜１９１個の任意の数のアミノ酸残基を含む。こうしたフラグメントの例として、たとえば、ＬＥＫＩＥＤＲＡＦＤ（配列番号５）、ＦＳＥＬＥＥＩＥＬＰ（配列番号６）、ＡＳＬＥＹＩＧＴＳＡ（配列番号７）、ＦＳＦＳＱＫＬＫＫＬ（配列番号８）、ＴＦＳＳＳＳＫＬＥＬ（配列番号９）、ＩＳＨＥＡＦＡＮＬＳ（配列番号１０）、ＮＬＥＫＬＴＬＰＫＳ（配列番号１１）、ＶＫＴＬＧＳＮＬＦＲ（配列番号１２）、ＬＴＴＳＬＮＭＬＭＬ（配列番号１３）、ＬＴＴＳＬＫＨＶＤＶ（配列番号１４）、ＲＧＭＩＶＡＳＶＤＧ（配列番号１５）、ＥＥＧＮＥＳＦＡＳＶＤＧ（配列番号１６）、ＶＳＦＱＳＫＴＱＬＩ（配列番号１７）、ＶＬＦＳＫＤＫＴＱＬＩ（配列番号１８）、ＹＹＰＳＱＫＮＤＥＳ（配列番号１９）、ＹＫＴＰＫＥＴＫＥＬ（配列番号２０）、ＡＳＹＳＦＮＫＮＳＹ（配列番号２１）、ＬＫＫＬＥＬＮＥＧＬ（配列番号２２）、ＱＫＩＧＴＦＡＦＡＤ（配列番号２３）、ＥＫＩＧＴＦＡＦＡＤ（配列番号２４）、ＡＴＫＬＥＥＩＳＬＰ（配列番号２５）、ＡＩＫＬＥＥＩＳＬＰ（配列番号２６）、ＮＳＬＥＴＩＥＲＬＡ（配列番号２７）、ＦＹＧＮＬＥＬＫＥＬＩＬ（配列番号２８）を含むアミノ酸が挙げられる。
【００１４】
任意に、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、ＬＲＲがない。ＬＲＲが認められない免疫原性ポリペプチドとして、配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１または５個以上のアミノ酸残基を含む配列番号２９、３０または３１のいずれかの任意の免疫原性フラグメントがある。配列番号３０および３１は、ＰｃｐＡのロイシンに富んだ領域のＣ末端側に残基を含む。
【００１５】
本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの変異体は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含んでもよい。免疫原性ポリペプチドの変異体は、配列番号１〜３１、４１および４５またはこれらの任意のフラグメントに対する配列同一性が約６０〜約９９％（すなわち、任意の同一性が６０〜９９％）のアミノ酸配列を含む。変異体の選択については、本明細書に教示する方法を用いてその免疫原性能の観点から行う。
【００１６】
本明細書に記載のＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドは、ＰｃｐＡのフラグメントおよびそのフラグメントの変異体を含む。ＰｃｐＡフラグメントの変異体は、アミノ酸配列の改変を含んでもよい。たとえば、アミノ酸配列の改変としては、置換、挿入または欠失による変化がある。変異体が免疫原性ポリペプチドである限り、置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせを単一の変異体内で組み合わせても構わない。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合のほか、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は一般に、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入よりも、たとえば、１〜４残基程度の小さな挿入になる。欠失は、１つまたは複数のアミノ酸残基をタンパク質配列から除去するものである。タンパク質分子内の任意の１部位で約２〜６残基以下を欠失させるのが一般的である。こうした変異体については通常、タンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により作成して、それにより変異体をコードするＤＮＡを製造し、その後、組換え細胞培養でＤＮＡを発現させる。既知の配列を持つＤＮＡの所定の部位で置換突然変異を製造する技法はよく知られており、Ｍ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発があるが、これに限定されるものではない。アミノ酸置換は一般に単一残基であるが、いくつかの異なる位置で同時に行ってもよい。置換変異体は、少なくとも１つの残基を除去し、その代わりに別の残基を挿入する変異体である。こうした置換は通常、以下の表１に準じて製造され、保存的置換と呼ばれる。一方、これ以外のものも当業者にはよく知られている。
【００１７】
【表１】
本明細書で使用する場合、変異体は、ｐｃｐＡ相同遺伝子内の１つまたは複数の部位で多型性を示す、別の株に由来する天然型ｐｃｐＡの対立遺伝子を含んでもよい。変異体は、従来の分子生物学的技法により製造することができる。本明細書では、変異体について天然型ｐｃｐＡと比較した配列同一性との関連で記載する。当業者であれば、２つのポリペプチドまたは核酸の配列同一性の判定方法を容易に理解できる。たとえば、同一性が最高レベルになるように２つの配列を整列させた後、配列同一性を算出してもよい。アライメントについては、使用するアライメントプログラムの個々のアルゴリズムによってある程度異なる。これには、たとえば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｍｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法による、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）による、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０ならびにＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０；Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９ ａｎｄ Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に記載のアルゴリズムが挙げられる。これらの各参考文献については、少なくともアライメントに関連する材料および同一性の計算に関して参照によって援用する。一般に、これらの方法のどれを用いもよいが、場合によってこうした様々な方法による結果が異なる可能性があることが理解されるであろう。配列同一性を、たとえば、９５％とする場合、その同一性は、受け入れられた計算方法の少なくとも１つで検出可能なものでなければならない。
【００１８】
本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドは、１種または複数種のアミノ酸アナログまたは非天然型立体異性体を含んでもよい。こうしたアミノ酸アナログおよび立体異性体については、ｔＲＮＡ分子に目的のアミノ酸を組み込み、たとえば、アンバーコドンを利用してそのアナログアミノ酸を部位特異的にペプチド鎖に挿入する遺伝子コンストラクトを設計することで容易にポリペプチド鎖に導入することができる（少なくともアミノ酸アナログに関する材料について参照によってすべて本明細書に援用するＴｈｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ ７７：４３− ７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；Ｉｂｂａ ａｎｄ Ｈｅｒｍｅｃｋｅ，Ｂｉｏｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）を参照）。ペプチドには似ているものの天然のペプチド結合を介して連結されていない免疫原性フラグメントを製造してもよい。たとえば、アミノ酸またはアミノ酸アナログの結合は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスとトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨＨ２ＳＯ−−（これらおよび他のものについては、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．「Ｐｅｐｔｉｄｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ， ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ， ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｐ．２６７−３５７．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．ｅｄｉｔｏｒ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，１（２）：４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−，ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ １ ｐｐ．３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−，ｃｉｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；欧州特許第００４５６６５号 ｔｏ Ｓｚｅｌｋｅ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）で確認することができ、少なくとも結合に関する材料について、これらの各々を参照によって本明細書に援用する）を含んでもよい。
【００１９】
アミノ酸アナログおよび立体異性体は、多くの場合、製造がより経済的であること、化学的安定性の強化、薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）の改良、特異性（広範な生物活性など）の変化およびその他など、特性を改良できるか、望ましい特性を持っている。たとえば、Ｄアミノ酸は天然ペプチダーゼにより認識されないため、Ｄ−アミノ酸を用いてより安定なペプチドを得ることができる。コンセンサス配列の１種または複数種のアミノ酸と同じタイプのＤ−アミノ酸との網羅的な置換（Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジンなど）を用いてより安定なペプチドを得ることができる。システイン残基を用いて２つ以上のペプチドを一緒に環化または結合させてもよい。これは、ペプチドを特定のコンフォメーションに限定するのに有益な場合がある。（参照によって本明細書に援用するＲｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）を参照）。
【００２０】
本明細書は、ＰｃｐＡの免疫原性ポリペプチドおよび薬学的に許容されるキャリアを含む組成物について記載する。任意に、この組成物は、アジュバントをさらに含む。免疫原性ポリペプチドを含む組成物は、たとえば、免疫原性ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドもしくはＰｓｐＡ、ニューモリシンの免疫原性フラグメントまたはこれらの組み合わせなど、他の免疫原性ポリペプチドの組み合わせを含んでもよい。
【００２１】
任意に、本明細書に記載の組成物は、粘膜表面への投与に好適である。この組成物は、たとえば、点鼻薬、ネブライザー溶液またはエアロゾル吸入剤であってもよい。したがって、組成物は、容器内にあってもよく、容器は、鼻噴霧器、ネブライザーまたは吸入器であってもよい。
【００２２】
薬学的に許容されるキャリアとは、生物学的またはその他の点で望ましい、すなわち、任意の好ましからぬ生物学的作用を引き起こしたり、それを含む医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な相互作用を起こしたりせずに、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントと一緒に被検体に投与できる材料をいう。当業者によく知られているように、キャリアについては当然ながら、被検体において活性成分の任意の分解および任意の有害な副作用を最小限にとどめるように選択することになる。
【００２３】
好適なキャリアおよびその製剤については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。一般に、製剤に適切な量の薬学的に許容される塩を用いて製剤を等張にする。薬学的に許容されるキャリアの例として、滅菌水、生理食塩液、リンゲル溶液のような緩衝液およびデキストロース溶液があるが、これに限定されるものではない。溶液のｐＨは通常、約５〜約８または約７〜約７．５である。他のキャリアとして、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性製剤がある。マトリックスは、たとえば、薄膜、リポソームまたは微小粒子のような形状製品の形をとる。たとえば、投与される組成物の投与経路および濃度に応じて、ある種のキャリアがより好ましくなる場合があることが当業者には明らかであろう。キャリアは、ヒトまたは他の被検体へのＰｃｐＡ免疫原性フラグメントの投与に好適なものである。
【００２４】
医薬組成物は、免疫原性ポリペプチドの他にキャリア、増粘剤、希釈薬、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、アジュバント、免疫賦活薬を含んでもよい。さらに、医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤および麻酔薬など１種または複数種の活性成分を含んでもよい。
【００２５】
アジュバントは、アルミニウム塩などの金属塩を含み、アジュバント活性を持つ安全な賦形剤を与えるものとして当該技術分野において周知である。こうしたアジュバントの作用機序には、投与から最大３週間注射部位にとどまることができるような抗原デポーの形成、さらに抗原提示細胞に取り込まれやすい抗原／金属塩複合体の形成があると考えられる。抗原の吸着には、アルミニウムばかりでなく、亜鉛、カルシウム、セリウム、クロム、鉄およびベリリウム（ｂｅｒｉｌｉｕｍ）の塩など他の金属塩も用いられている。アルミニウムの水酸化物およびリン酸塩が、最も一般的である。アルミニウム塩、抗原および他の免疫賦活薬を含む製剤または組成物は、当該技術分野において公知である。免疫賦活薬の例として、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。
【００２６】
アジュバントおよび／または免疫賦活薬を、ポリペプチド組成物と同時に、組成物の投与の直前に、あるいは投与後に投与してもよい。任意に、組成物は、アジュバントをさらに含む。アジュバント製剤は、たとえば、粘膜誘導部位を標的にする薬を含む。アジュバントは任意に、以下に限定されるものではないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、血管形成因子、アポトーシス阻害剤およびこれらの組み合わせなどの群から選択されてもよい。サイトカインをアジュバントとして選択する場合、サイトカインは、以下に限定されるものではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８などのインターロイキン；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）；インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ）；またはアジュバント活性を持つ他の任意のサイトカインなどの群から選択されてもよい。また、本発明の組成物および方法にアジュバント活性または他の生物活性を持つサイトカインの一部またはサイトカインのミュータントもしくは模倣体（またはこれらの組み合わせ）を用いてもよい。
【００２７】
ケモカインをアジュバントとして用いる場合、ケモカインは任意に、以下に限定されるものではないが、リンホタクチン、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ＬＡＲＣ（ｌｉｖｅｒａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＰＡＲＣ（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＭＤＣ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＴＡＲ Ｃ（ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、ＳＬＣ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）およびＦＫＮ（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）などの群から選択してもよい。アポトーシス阻害剤をアジュバントとして選択した場合、アポトーシス阻害剤は任意に、以下に限定されるものではないが、カスパーゼ８の阻害剤およびその組み合わせなどの群から選択してもよい。血管形成因子をアジュバントとして選択した場合、血管形成因子は任意に、以下に限定されるものではないが、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヒアルロナン（ＨＡ：ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）フラグメントおよびこれらの組み合わせなどの群から選択してもよい。
【００２８】
実質的に無毒の生物活性アジュバントの他の例としては、ホルモン、酵素、成長因子またはこれらの生物活性部分が挙げられる。そうしたホルモン、酵素、成長因子またはこれらの生物活性部分は、たとえば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、イヌ、ネコ、ウマまたはトリ由来であってもよく、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、プロラクチン、上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−１）、ソマトトロピン（成長ホルモン）もしくはインスリン、またはその受容体が免疫系の細胞に発現する他の任意のホルモンもしくは成長因子であってもよい。
【００２９】
さらに、アジュバントは、たとえば、コレラ毒素（ＣＴ：ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ）、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素（ＬＴ：ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅトキシンＡおよび百日咳毒素（ＰＴ：ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）またはこれらの組み合わせ、サブユニット、トキソイド、キメラまたはミュータントのような細菌毒素も含む。たとえば、天然のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ：ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ）の精製調製物を用いても構わない。フラグメント、ホモログ、誘導体およびこうしたトキシンのいずれかの融合物も好適なものであるが、アジュバント活性を保持していることが条件となる。アジュバントの好適なミュータントまたは変異体は、たとえば、国際特許第９５／１７２１１号（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ ＣＴミュータント）、国際特許第９６／６６２７号（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ ＬＴミュータント）および国際特許第９５／３４３２３号（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ ＰＴミュータント）に記載されている。本方法および組成物で使用できるさらなるＬＴミュータントには、たとえば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓミュータント、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙミュータント、Ｇｌｕ−１１０−ＡｓｐミュータントおよびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐミュータントがある。さらに他のアジュバントとして、ＲＨ３リガンド；ＣｐＧモチーフオリゴヌクレオチド；たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｈｉｇｅｌｌａ ｅｘｓｅｒｉなどの細菌性モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ：ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）；サポニン（ＱＳ２１など）またはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ：ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）ミクロスフェアなどを用いてもよい。他に考えられるアジュバントとして、デフェンシンおよびＣｐＧモチーフがある。
【００３０】
本明細書に記載の免疫原性ポリペプチドの製造方法および使用方法とそうした方法に有用な組成物とを提供する。このポリペプチドについては、標準的な分子生物学的技法および発現系を用いて作製することができる。（たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１を参照）。たとえば、免疫原性ポリペプチドをコードするｐｃｐＡ遺伝子のフラグメントを単離してもよく、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、市販されている任意の発現ベクター（ｐＢＲ３２２ベクターおよびｐＵＣベクター（ニューイングランドバイオラボインク（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ），マサチューセッツ州）など）または発現／精製ベクター（ＧＳＴ融合ベクター（ファイザーインク（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．），ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ），ニュージャージー州）など）にクローニングしてから、好適な原核生物、ウイルスまたは真核生物の宿主に発現させてもよい。その後、従来の手段により、あるいは、市販の発現／精製系の場合は製造者の指示に従って精製を行えばよい。
【００３１】
本明細書は、配列番号１〜３１、４１および４５のいずれか１つをコードする配列を含む核酸を提供する。本明細書は、全長ＰｃｐＡタンパク質またはそのフラグメントをコードする配列番号３２、３３および４７を含む核酸を提供する。また、配列番号３２、３３および４７の縮重変異体およびこうした縮重変異体のフラグメントも提供する。
【００３２】
配列番号１および２またはそのフラグメントをコードする核酸であって、それぞれ配列番号３４および配列番号３５またはその縮重変異体もしくはフラグメントを含む、核酸について記載する。
【００３３】
配列番号３および４またはそのフラグメントをコードする核酸は、それぞれ配列番号３６および３７またはその縮重変異体もしくはフラグメントを含むが、これに限定されるものではない。
【００３４】
配列番号４２またはその縮重変異体もしくはフラグメントを含む、配列番号４１またはそのフラグメントをコードする核酸について記載する。
【００３５】
配列番号４６またはその縮重変異体またはフラグメントを含む、配列番号４５またはそのフラグメントをコードする核酸について記載する。
【００３６】
配列番号２９またはそのフラグメントをコードする例示的核酸は、配列番号３８またはその縮重変異体もしくフラグメントを含む。
【００３７】
さらに詳しくは、本明細書は、配列番号３２〜３８、４２、４６および４７またはこれらの縮重変異体として示される配列のいずれか１つを含む核酸を提供する。
【００３８】
さらに、配列番号３２〜３８、４２、４６および４７または配列番号３２〜３８、４２、４６および４７の相補体またはその配列もしくは相補体の任意のフラグメントを含むヌクレオチド配列を持つハイブリダイゼーションプローブの全部または任意の部分とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離された核酸も提供する。ハイブリダイズしている核酸のハイブリダイズしている部分の長さは一般に、少なくとも１５（１５、２０、２５、３０、４０またはそれ以上など）ヌクレオチドである。ハイブリダイズしている部分は、ハイブリダイズする配列部分と少なくとも８０％（８５％、９０％または９５％など）同一である。ハイブリダイズしている核酸は、たとえば、クローニングプローブ、プライマー（ＰＣＲプライマーなど）または診断プローブとして有用である。核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性については、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である融解温度すなわちＴｍで表す。この融解温度を用いて必要なストリンジェント条件を決める。プローブと同一ではないが、プローブと関連があり実質的に同一である配列を同定する場合、まず特定の塩濃度（ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）またはＳＳＰＥ（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＥＤＴＡ）など）を用いて相同ハイブリダイゼーションのみが起こる最低温度を確立することが有用である。１％のミスマッチでＴｍが１℃低下すると想定する場合、それに合わせてハイブリダイゼーション反応の最終の洗浄温度を下げる（たとえば、同一性が９５％を超える配列を探索する場合、最終洗浄温度を５℃下げる）。実際のミスマッチ１％当たりのＴｍの変化は、０．５〜１．５℃である可能性がある。ハイストリンジェントな条件では、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳにおいて６８℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで室温にて洗浄を行う。中ストリンジェントな条件では、３×ＳＳＣで４２℃にて洗浄する。塩濃度および温度を変動させてプローブと標的核酸との同一性の最適レベルを達成してもよい。こうした条件に関するさらなるガイダンスは、当該技術分野において容易に入手することができ、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載されている。
【００３９】
したがって、前述のペプチド配列、その変異体およびフラグメントをコードできる核酸を開示することが理解されよう。この核酸には、個々のタンパク質配列に関係するすべての縮重配列、すなわち、特定のタンパク質配列をコードする配列を持つすべての核酸ばかりでなく、本開示のタンパク質配列の変異体および誘導体をコードする縮重核酸など、すべての核酸が含まれることになる。したがって、本明細書には１つ１つの核酸配列をすべて書き出していない場合もあるが、実際には、本開示のタンパク質配列により、ありとあらゆる配列が開示および記載されていることが理解されよう。
【００４０】
また、本明細書に記載の核酸を含むベクターも開示する。したがって、免疫原性ポリペプチド（配列番号１〜３１、４１もしくは４５またはそのフラグメントもしくは変異体など）をコードする核酸を含むベクターを提供する。このベクターは、配列番号３２〜３８、４２および４７またはその縮重変異体またはフラグメントの核酸配列のうちどれを含んでもよい。任意に、ベクターの核酸は、発現調節配列（プロモーターまたはエンハンサーまたはその両方など）に作動的に連結されている。好適な発現ベクターは、当業者によく知られており、ノバゲンインク（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．），マディソン，ウィスコンシン州；インビトロジェンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），カールズバッド，カリフォルニア州；およびプロメガコーポレーション，マディソン，ウィスコンシン州など様々な供給源で市販されている。
【００４１】
さらに、ベクターを含む培養細胞も提供する。培養細胞は、ベクターをトランスフェクトした培養細胞でも細胞の子孫でもよく、その細胞に免疫原性ポリペプチドが発現する。好適な細胞株は当業者に公知であり、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から市販されている。
【００４２】
トランスフェクト細胞を、免疫原性ポリペプチドを作製する方法に用いてもよい。この方法では、任意に発現配列の制御下、免疫原性ポリペプチドが発現する条件下でベクターを含む細胞を培養する。標準的なタンパク質精製法を用いて細胞または培地から免疫原性ポリペプチドを単離することができる。
【００４３】
免疫原性ポリペプチドについては、比較的大きなポリペプチドまたはタンパク質を普通に酵素的に切断して作製してもよいし、タンパク質化学的技法で２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを連結して作製してもよい。たとえば、ペプチドまたはポリペプチドをＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学反応あるいはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボノイル）化学反応。（アプライドバイオシステムズインク（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），フォスターシティー，カリフォルニア州）のどちらかにより、現在利用できる実験機器を用いて化学的に合成することができる。ペプチド縮合反応、ネイティブ化学ライゲーション、固相化学反応または酵素的ライゲーションにより、２つのフラグメントをそのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合により共有結合で結合させて、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドを形成してもよい。（その中に記載されている方法についてすべてを参照によって本明細書に援用するＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ，，Ｇｒａｎｔ，ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．，Ｂｏｄａｎｓｋｙ ａｎｄ Ｔｒｏｓｔ，ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１）；Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４）；Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，（１９８４）を参照）。
【００４４】
１種または複数種のポリペプチドを含む免疫原性ポリペプチドおよび組成物を用いて抗体を作製してもよい。したがって、被検体のＰｃｐＡに特異的な抗体を作製する方法は、本明細書に記載の免疫原性ＰｃｐＡフラグメントを被検体に投与することを含む。さらに、本明細書は、ＰｃｐＡポリペプチドに結合する抗体およびＰｃｐＡポリペプチドに結合する抗体フラグメントも提供する。
【００４５】
抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、完全ヒト抗体またはヒト化抗体でもよく、天然抗体および一本鎖抗体を含む。抗体は、免疫原性ＰｃｐＡポリペプチドを被検体に投与してインビボで作製してもよい。抗体の作製には、ハイブリドーマ法を用いたモノクローナル抗体の製造が含まれる。ハイブリドーマ法については、当該技術分野において周知であり、その中に記載されている方法について参照によってその全体を援用するＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５） ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）に記載されている。
【００４６】
一本鎖抗体の製造方法は、当業者によく知られている。たとえば、米国特許第５，３５９，０４６号（その方法に関して参照によってその全体を本明細書に援用する）を参照されたい。一本鎖抗体を作製するには、短いペプチドリンカーを用いて重鎖と軽鎖の可変ドメインを一緒に融合し、それにより単一分子上に抗原結合部位を再構成する。抗原結合性または結合の特異性を大きく阻害することなく、一方の可変ドメインのＣ末端が他方の可変ドメインのＮ末端に１５〜２５アミノ酸ペプチドまたはリンカーにより連結される一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が開発されている。重鎖と軽鎖が適切な立体配座配向で一緒に結合できるようにリンカーを選択する。たとえば、リンカーに関する材料について参照によって本明細書に援用するＨｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．２０３：４６−１２１（１９９１）を参照されたい。
【００４７】
ＰｃｐＡポリペプチドに対する完全ヒト抗体およびヒト化抗体を本明細書に記載の方法に用いてもよい。ヒト化抗体は、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を持つマウス、ラットまたはウサギなど非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換されている場合もある。免疫によりヒト抗体の完全なレパートリー（すなわち、完全ヒト抗体）を産生することができるトランスジェニックアニマル（マウスなど）を用いてもよい。生殖系列変異のキメラマウスにおいて抗体重鎖の結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子を同系接合的に欠損させると、内因性抗体の産生が完全に阻害される。そうした生殖系列ミュータントマウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを転移すれば、抗原チャレンジによりヒト抗体が産生される（たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｒｍ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）を参照）。また、ファージディスプレイライブラリーでヒト抗体を作製してもよい（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１（１９９１））。ＣｏｔｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技法には、ヒトモノクローナル抗体の調製方法について記載されている（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．」 Ｉｎ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２７，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ａｎｄ Ｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１））。こうした参考文献については、その中に記載されている方法のため参照によってその全体を援用する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、抗体フラグメントは、ハイブリッドフラグメントを含むＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦａｂフラグメントを含む。こうした抗体フラグメントは、特定のＰｃｐＡポリペプチドに対する結合能を保持している。各方法を用いて（ａｂ）発現ライブラリーを構築（たとえば、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）すれば、ＰｃｐＡポリペプチドに対する所望の特異性を持つモノクローナルＦ（ａｂ）フラグメントを迅速かつ効果的に同定することができる。ポリペプチドのイディオタイプを含む抗体フラグメントについては、当該技術分野において公知の技法で作製することができ、（ｉ）抗体分子のペプシン消化により作製されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により作製されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理して作製されるＦ（ａｂ）フラグメントおよび（ｉｖ）Ｆ（ｖ）フラグメントがあるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
本明細書は、被検体において肺炎球菌感染症の危険性を低下させる方法であって、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントまたはその組成物を被検体に投与することを含む、方法を記載する。肺炎球菌感染症には、たとえば、髄膜炎、中耳炎、肺炎、敗血症または溶血性尿毒症がある。したがって、本明細書に記載の方法より、こうした感染症の任意の１つまたは複数の危険性が低下する。この方法は、第２の免疫原性フラグメントを投与するステップをさらに含んでもよい。第２の免疫原性フラグメントは、ＰｓｐＡ由来でも、ニューモリシン由来でも、これらの組み合わせ由来でもよい。第２の免疫原性フラグメントについては、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメントと同時、その前、あるいはその後に投与してもよい。
【００５０】
ＰｃｐＡポリペプチドまたはそのフラグメントを含む組成物は、経口投与、非経口投与（静脈内など）、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、または鼻腔投与もしくは呼吸器系の任意の部分への投与などの局所投与することができる。本明細書で使用する場合、呼吸器系への投与とは、エアロゾル化または挿管を介した噴霧機構または飛沫機構による送達など、外鼻孔の一方もしくは両方あるいは口を介して組成物を鼻部および鼻道に送達することをいう。
【００５１】
組成物およびＰｃｐＡポリペプチドまたはフラグメントの正確な必要量は、被検体の種、年齢、体重および全身状態、使用するポリペプチドおよびその投与モードによって被検体ごとに異なるであろう。したがって、組成物の正確な量をすべて明らかにすることができるとは限らない。しかしながら、当業者であれば、本明細書の記載を考慮して適切な量を決定できる。さらに、たとえば、プライムブーストレジメンにおいて、ＰｃｐＡポリペプチドまたはフラグメントの反復投与を用いてもよい。
【００５２】
肺炎および敗血症に対する防御免疫を惹起する際、ＰｓｐＡとニューモリシンを組み合わせると、どちらかのタンパク質単独の場合であり有効性が高まる（Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ，１８８：３３９−４８（２００３）；Ｏｇｕｎｎｉｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：３０２８−３３（２０００））。したがって、ＰｃｐＡまたは免疫原性フラグメントを含む組成物は任意に、ＰｃｐＡ、ＰｓｐＡまたはニューモリシンの第２の免疫原性フラグメントまたはその組み合わせを含んでもよい。これらの参考文献については、その中に教示されているタンパク質の組み合わせ方法および投与方法のため参照によってその全体を本明細書に援用する。
【００５３】
本明細書に記載の組成物を組み合わせる際は、前述の処理のどれを用いてもよい。組み合わせる場合は、同時に（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）（混合剤などとして）、分離されているが同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）（同じ被検体に異なる静脈ラインなどを介して）あるいは連続的に（化合物または薬の１つを最初に投与してから第２の化合物または薬を投与するなど）投与してもよい。したがって、組み合わせという語は、２種以上の薬を同時（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）投与、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）投与または連続投与することをいう。
【００５４】
単数形ａ、ａｎおよびｔｈｅは、本明細書および添付の特許請求の範囲に使用する場合、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の対象を含むという点に留意しなければならない。したがって、たとえば、抗原性フラグメントという場合、抗原性フラグメントの混合物を含み、薬学的キャリアまたはアジュバントという場合、そうしたキャリアまたはアジュバントの２種以上の混合物を含む。
【００５５】
本明細書で使用する場合、被検体とは、個体をいう。したがって、被検体は、ネコおよびイヌなどの飼い慣らされた動物、家畜（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）およびヤギなど）、実験動物（マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）およびトリを含んでもよい。一態様では、被検体は、霊長類またはヒトなどの哺乳動物である。
【００５６】
任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）または任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）とは、その後に記載した事象または状況が起こることもあるが、起こらないこともあり、そう記載することで、その事象または状況が起こる場合と、それが起こらない場合が含まれることを意味する。たとえば、任意に組成物は組み合わせを含んでもよいといった場合、組み合わせとは、組成物が異なる分子の組み合わせを含んでもよいし、組み合わせを含まなくてもよいため、こう記載することで、組み合わせが存在する場合と組み合わせが存在しない場合（すなわち、組み合わせの個々の構成物）とが含まれる。
【００５７】
本明細書では、範囲を、約を前置した１つの特定の値からおよび／または約を前置したもう１つの特定の値までと表すことができる。このように範囲を表す場合、１つの特定の値からおよび／またはもう１つの特定の値までは別の態様である。同様に、先行詞約を用いて値を近似値として表す場合、特定の値は別の態様を形成することを理解されたい。さらに、各範囲の端点はもう一方の端点との関連でも他の端点と切り離しても意味があることを理解されたい。
【００５８】
本明細書では、ある症候に対する一定の処置（肺炎球菌感染症の防止など）との関連で防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）、防止している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、および防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）という語を用いる場合、処置した患者がその症候を臨床的に観察できるレベルでまったく発症しないか、処置を受けない場合と比べて発症が遅くなる、および／またはその程度が軽くなることをいう。こうした語は、患者がその症候をまったく経験しない状況のみに限定されるものではない。たとえば、一定の症候を発現させると予想された刺激を患者に曝露しているさなかに処置を施して、その結果、本来予想されるよりも患者の症候の症状が減少および／または緩和する場合、その処置は症候を防止したと言えよう。処置の結果、患者が感染症の軽い症状しか明確に示さずに、その感染症が防止される場合があっても、これは、感染している微生物が細胞にまったく侵入しなかったことを意味するものではない。
【００５９】
同様に、感染症の危険性との関連で本明細書において使用する場合、所定の処置により軽減する、軽減している（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、および軽減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）（肺炎球菌感染症の危険性の軽減など）とは、処置（免疫原性ポリペプチドの投与など）を行わない感染症発症の対照レベルまたは基準レベルと比較して被検体の感染症の発症が遅くなる、またはその程度が軽くなることをいう。感染症の危険性が軽減された結果、患者が感染の軽い症状しか明確に示さずに、感染症の症状が遅延する場合があっても、これは、感染している微生物が細胞にまったく侵入しなかったことを意味するものではない。
【００６０】
当然のことながら、開示されている方法および組成物は、他に記載がない限り、特定の合成方法、特定の解析技法または特定の試薬に限定されるものではなく、したがって、異なってもよい。また、本明細書に使用する用語は、特定の実施形態を記載するためのものにすぎず、限定的であることを意図するのではないことは言うまでもない。
【００６１】
本発明の多くの実施形態について記載してきた。しかしながら、様々な改変が可能であることが理解されるであろう。さらに、ある特徴またはステップについて記載する場合、組み合わせについて明示的に記載していなくても、本明細書の他の任意の特徴またはステップと組み合わせてもよい。したがって、他の実施形態も、特許請求の範囲内にある。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
ＰｃｐＡは、肺感染症および致死性の敗血症に対する保護作用を惹起する。
【００６３】
材料および方法。
【００６４】
菌種、培地および増殖条件。本研究では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０ならびにその誘導体を用いた。他に記載がない限り、０．５％酵母エキスを含むトッドヒューイット（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ）ブロス（ＴＨＹ）または血液寒天プレートで肺炎球菌を３７℃で増殖させた。適切な場合、エリスロマイシンを濃度０．３μｇ／ｍｌで培地に加えた。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（表２）の臨床分離株および主要なクローン群の分離株（表３）を用いた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
これらの研究に使用した臨床菌株は、過去２５年以内に単離されたものである。あり得べきＰｃｐＡの多様性を調べるため、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａゲノム多様性プロジェクト（Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ｓｔｒｅｐ／ｉｎｆｏ）で用いた菌株の群から分離株を選択した。
【００６７】
菌株の構築の間、１．５％寒天を含むルリア−ベルターニ（ＬＢ：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロスまたはＬＢプレートで増殖させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）内でプラスミドを維持した。増殖培地に、ｐＣＲ２．１系、ｐＣＲ４系およびｐＥＴ−２０ｂ系プラスミドにはアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を、ｐＪＹ４１６４系プラスミドにはエリスロマイシン（４００μｇ／ｍｌ）を加えた。
【００６８】
高マンガン培地でのバクテリアの増殖にはＴＨＹ培地を用いた。低マンガン条件での増殖では、マンガンを除去したＴＨＹを調製した。製造者の指示に従ってオートクレーブ処理の前にＣｈｅｌｅｘ−１００（２％ｗ／ｖ）（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ），セントルイス，ミズーリ州）を加えてＴＨＹ培地を調製した。オートクレーブ処理後、このＴＨＹ／Ｃｈｅｌｅｘ混合物を室温で一晩撹拌し、続いて濾過滅菌した。使用前にＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＦｅＳＣ４をそれぞれ１ｍＭの濃度まで加え、ＭｎＳＯ４を０．１μＭの濃度まで加えた。増殖を６００ｎｍにおける光学密度でモニターした。
【００６９】
菌株の構築。本研究に用いたＥ．ｃｏｌｉ株、プラスミドおよびプライマーを示す（表４）。突然変異誘発を用いて親株ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０のｐｃｐＡを不活化した。変異株の構築については、以前に行われて記載されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：１１７１−８０（２００６））。
【００７０】
【表４】
組換えＰｃｐＡの発現および精製。本研究に使用した菌株、プラスミドおよびプライマーを表２に示す。プライマーＤＴＧ−１６（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＣＴＡＡＴＧＡＡＣＣ−３’（配列番号３９））およびＤＴＧ−１２（５’−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号４０））を、菌株ＴＩＧＲ４におけるｐｃｐＡの１１２６ｂｐフラグメントを増幅するように設計した。このプライマーはそれぞれ、操作された制限エンドヌクレアーゼ部位ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを含む。３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１２５μＭのｄＮＴＰ、各プライマー５０ピコモルおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニットを含むカクテル（総容量５０μｌ）において反応を３０サイクル繰り返した。１サイクルは、９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、５分であった。最初に、この増幅させた遺伝子フラグメントをＴ−テイルド（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）法でｐＴＯＰＯ４（インビトロジェンインク，カールズバッド，カリフォルニア州）にクローニングし、プラスミドｐＬＭＧを形成した。
【００７１】
このフラグメントを、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）を用いてｐＣＲ４にクローニングした。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ），マディソン，ウィスコンシン州）を用いてエンドヌクレアーゼ消化により、精製したプラスミドをスクリーニングした。得られたプラスミドｐＤＧ−１にｐｃｐＡフラグメントが挿入されていることをアガロースゲル電気泳動、ＰＣＲ解析およびＤＮＡシークエンシングをすべて用いて確認した。ｐＤＧ−１のインサートをｐＥＴ−２０ｂ発現ベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ），マディソン，ウィスコンシン州）にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＪＭ−１をタンパク質製造のためＥ．ｃｏｌｉ株ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバゲン，マディソン，ウィスコンシン州）に形質転換した。この株は、誘導性ＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７プロモーターの染色体コピーを含む。ＩＰＴＧの誘導により、アミノ酸１９〜３９１を含む切断タンパク質を発現させる。この過剰発現した切断タンパク質を、精製しやすくするためＣ−カルボキシ末端ヒスチジンタグを用いてノバゲンＨＩＳ−ＢＩＮＤ（登録商標）精製キット（ノバゲン，マディソン，ウィスコンシン州）で精製を行った。その後クーマシーブルー（Ｃｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行ったところ、約４１ｋＤａの単一バンドが見られた。
【００７２】
以下は、クローニングし発現させたｒＰｃｐＡタンパク質の完全な配列である。下線を引いた部分はクローニングベクター由来である。
【００７３】
【化１】
【００７４】
【化２】
抗ＰｃｐＡポリクローナル抗体の作製。精製したｒＰｃｐＡを用いてニュージーランドホワイトウサギ（マートルズラビティー（Ｍｙｒｔｌｅ’ｓ Ｒａｂｂｉｔｙ），トンプソンステーション（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ），テネシー州）に皮下免疫し、抗ＰｃｐＡポリクローナル血清を得た。このウサギに１ｍｌの完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡを総容量２ｍｌ皮下注射した。２週間後、完全フロインドアジュバントに加えた１００μｇのｒＰｃｐＡで第２のブーストを行い、第２のブーストから２週間後、不完全フロイントアジュバントに加えた１００μｇのＰｃｐＡで第３のブーストを行った。最終ブーストから２週間後、麻酔下でウサギを心臓穿刺により脱血した。その血液を凝固させ、遠心分離により血清を得て−８０℃で保存した。
【００７５】
ＰＣＲによるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株におけるｐｃｐＡの確認。ＰＣＲプライマー対ＢＧＰ−１とＢＧＰ−２を用い種々のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株におけるｐｃｐＡの有無を点検した。プライマー対を、ＴＩＧＲ４株におけるｐｃｐＡの１４１６ｂｐのＮ末端フラグメントを増幅するように設計した。その後、ＰＣＲ産物をＴ．Ａ．Ｅ．（Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ）アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムで染色して増幅したバンドの正確なサイズを調べた。
【００７６】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の分画。ＹｏｔｈｅｒおよびＷｈｉｔｅが記載した方法（Ｙｏｔｈｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ １７６：２９７６−８５（１９９４））をわずかに変更してプロトプラストを作製した。ＭＴＨＹで増殖させた対数期細胞をペレットにし、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。次いで、この細胞を０．５ｍｌの２％塩化コリンに再懸濁し、そのチューブを数回反転させた。次いで、細胞をペレットにし、上清を取り除き、−２０℃で保存した（コリン溶出画分）。細胞をペレットにし、３００μｌのプロトプラスト緩衝液（２０％スクロース、５ｍＭのトリス［ｐＨ７．４］、２．５ｍＭのＭｇＳＯ４）で１回洗浄した。次いで、このペレットを１ｍｌのプロトプラスト緩衝液に再懸濁してから、培養ペレット１ｍｌ当たり５Ｕのムタノリシン（シグマアルドリッチ，セントルイス，ミズーリ州）を加えた。この懸濁液を室温で一晩インキュベートした。細胞を６０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレットにし、上清を−２０℃で保存する（細胞壁画分）。次いで、このプロトプラストを１ｍｌのプロトプラスト緩衝液で洗浄した。顕微鏡検査によりプロトプラストの形成を確認した。このプロトプラストをペレットにし、０．３〜１ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解して、これを−２０℃で保存する（細胞膜／細胞質画分）。ＰｃｐＡが存在するかどうかウエスタンブロット解析により各画分のサンプルを調べる。
【００７７】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗体染色。高または低マンガン培地で増殖させた中間対数期細胞（ＯＤ６０００．６）をペレットにし、ＰＢＳで洗浄して、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳＢ）に再懸濁し、室温で２０分インキュベートした。細胞をペレットにし、ＰＢＳＢまたはＰＢＳＢで１：１００になるように希釈した抗ＰｃｐＡ血清に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いてＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を、ＰＢＳＢで希釈したヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（重鎖と軽鎖）−フルオレセインイソチオシアナート（サザンバイオテクノロジーアソシエーツインク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．），バーミングハム，アラバマ州）と４℃で３０分間インキュベートした。次に、この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．０１ｍＭの親油性膜色素ＴＭＡ−ＤＰＨ（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）を含む４％ホルムアルデヒドＰＢＳ溶液に再懸濁した。その後、細菌細胞をＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ ７０顕微鏡を用いて落射蛍光観察で検査した。
【００７８】
ウエスタンブロット。細菌培養をＴＨＹおよびＭＴＨＹで中間対数期ＯＤ６０００．６まで増殖させた。同量の菌株をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプル緩衝液を含むＰＢＳで再懸濁して、５分間煮沸した。サンプルおよび着色タンパク質標準物質（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）を製造者の指示に従いＮｕＰＡＧＥ１０％ビス−トリスゲル（インビトルゲン，カールズバッド，カリフォルニア州）に流し、モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ：ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）−ＳＤＳ泳動用緩衝液（インビトロジェン，カールズバッド，カリフォルニア州）で電気泳動により分離した。次に、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ ｓｅｍｉｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｌｌ（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ），カリフォルニア州）を用いてタンパク質をニトロセルロース膜にトランスファーした。このブロットを、ＰＢＳＢで１：１０００に希釈した抗ＰｃｐＡポリクローナル抗体でプローブした。ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（重鎖と軽鎖）−アルカリホスファターゼおよびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（サザンバイオテクノロジーアソシエーツインク，バーミングハム，アラバマ州）を二次抗体として用いた。Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＮＢＴ−ＢＣＩＰ）錠剤（シグマアルドリッチ，スイス）を用いて比色検出を行った。
【００７９】
マウスの全身免疫。最初に、６〜８週齢のＣＢＡ／ＣａＨＮＢｔｋｘｉｄ／Ｊ（ＣＢＡ／Ｎ）マウス（ジャクソンラブズ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ），バーハーバー，メイン州）に、２μｇの水酸化アルミニウムをアジュバントとして１０μｇのｒＰｃｐＡを総容量２００μｌ皮下注射した。２週間後、水酸化アルミニウムを用いて１０μｇのｒＰｃｐＡで第２のブーストを行った。２週間後、水酸化アルミニウムを用いずに１０μｇのｒＰｃｐＡを含む第３のブーストを行った。次に、このマウスを２週間放置しておき、その後Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅをチャレンジした。感染の２４時間前にマウスを脱血した。
【００８０】
敗血症のマウスモデル。前述の感染症の全身モデルを用いて肺炎球菌のビルレンスを調べた（Ｃｏａｔｓ，ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２３：４２５７−６２（２００５）；Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：７５−８５（２００３））。６〜８週齢のＣＢＡ／Ｎマウスに、乳酸加リンゲルで希釈したバクテリアを３００ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）静脈内注射した。マウスを２１間モニターした。触っても反応しなくなり、体温が正常未満まで低下したときマウスを瀕死状態としてスコア化し、その日時を記録した。瀕死状態のマウスをすべてＣＯ２麻酔で安楽死させた。
【００８１】
肺炎のマウスモデル。以前に記載されているように肺に感染させた（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：２５２６−３４（２００２）；Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：３３９−４８（２００３）；Ｔａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２５７−２６０（１９９７））。６〜８週齢のＣＢＡ／Ｎマウスをイソフルラン（ミンラド（ＭｉｎＲＡＤ），バッファロー，ニューヨーク州）で麻酔し、５×１０６個のバクテリアを含む４０μｌの乳酸加リンゲル溶液の懸濁液をマウスの外鼻孔に導入し、誤嚥性肺炎を誘発した。７日後、マウスを屠殺した。屠殺したマウスの鼻腔を、以前に記載されているように５０μｌの乳酸加リンゲルで洗浄した（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：８３９−４６（１９９７））。鼻洗浄液を連続希釈し、ゲンタマイシン（４μｇ／ｍｌ）を含む血液寒天培地に蒔いた。肺を摘出し、２ｍｌの乳酸加リンゲルが入ったストマッカーバッグに入れ、ホモジナイズし、連続希釈して、３倍連続希釈液に加えたゲンタマイシンを含む血液寒天培地に蒔いた。
【００８２】
鼻咽頭定着のマウスモデル：以前に記載されているように鼻腔内接種を行った（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：２５２６−３４（２００２）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：８３９−４６（１９９７））。６〜８週齢のＣＢＡ／Ｎマウスに、麻酔なしで１０μｌの乳酸加リンゲル液に加えた１０６個のバクテリアを鼻腔内感染させた。次に、感染マウスを屠殺し、その鼻腔を５０μｌのリンゲル溶液で洗浄した。この鼻洗浄液を連続希釈し、ゲンタマイシンを含む血液寒天培地に蒔いた。キャンドルジャーで３７℃にて一晩インキュベーションした後、血液寒天プレートから目視可能な数を判定した。
【００８３】
統計解析。インスタット（Ｉｎｓｔａｔ）（グラフパッドソフトウェアインク（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．），サンディエゴ，カリフォルニア州）を用いて統計解析を行った。マンホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）の２標本順位検定を用いて、対照と実験群との瀕死状態になるまでの時間またはＣＦＵの回収数を比較した。ｐ値が０．０５未満の場合に統計学的に有意と判定した。
【００８４】
結果
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床的に重要な菌株にはｐｃｐＡが存在する。ｐｃｐＡのＬＲＲ領域をはさんだプライマー（ＢＧＰ１とＢＧＰ２）を用いてＰＣＲにより、ｐｃｐＡの存在を調べた。調査対象の２３株（表２および表３）それぞれで約１５００ｂｐフラグメントが得られた。これら菌株のうち８つは、過去２５年以内に単離されている臨床菌株で、７価コンジュゲートワクチンがカバーする７種のよく見られる莢膜型の代表的な菌株である（図１）。残りの１２株は、ゲノム多様性プロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｍｉｃｒｏｂｉｏ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ｓｔｒｅｐ／ｉｎｆｏ／）の一環として構築された一連の菌株から選択されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのセットである。このプロジェクトは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの幅広い多様性をカバーするため一連の菌株を選択している。これら１２株については、ＭＬＳＴデータに基づき広く多岐にわたるように選択した。４株は重篤な侵襲性疾患の患者由来、５株は無症候性保菌者由来で、２株については疾患／定着が不明であり、１株は世界的な抗生物質耐性クローン由来であった。これらの菌株は、世界の様々な領域における１２種の莢膜型の典型である。
【００８５】
すべての菌株でＰｃｐＡの発現を検査するため、低（≦０．１μＭ）マンガンで菌株を増殖させた。全細胞タンパク質サンプルを、低マンガン培地で培養した中間対数期細胞から調製した。（表２および表３）に示したすべての菌株を検査したが、７価ワクチンに含まれる莢膜型に相当する菌株のみを示してある（図２）。全細胞タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにトランスファーした。このブロットを抗ＰｃｐＡポリクローナル抗血清でプローブすると、これら莢膜（ｃａｐｓｕｌａｒｅ）血清型４、６、９、１４、１８、１９、２３の野生株それぞれで約６２ｋＤａのバンドが検出された（図２）。この６２ｋＤａバンドは、ｐｃｐＡ不活化ミュータントＪＥＮ１１では存在しなかった一方、７種の典型的な菌株では存在した。また、全細胞タンパク質サンプルについては、同じ菌株を高マンガン培地で増殖させた菌株からも調製したが、抗ＰｃｐＡ抗血清によりバンドは検出されなかった。ＰＣＲ解析とウエスタンブロットデータの組み合わせから、表２および表３に示すＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株すべてでｐｃｐＡが存在することが明らかになった。
【００８６】
ＰｃｐＡは、低マンガン条件下でＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの表面に露出している。マンガンは、レギュレーターＰｓａＲの作用を介してｐｃｐＡ遺伝子の転写をコントロールしていることが研究で明らかになっている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：１１７１−８０（２００６））。本明細書に記載のとおり、マンガン依存性制御は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ表面上のＰｃｐＡの存在に直接影響を与え、表面ＰｃｐＡは、莢膜を持つ肺炎球菌上でも抗体に接触できる。
【００８７】
細胞分画を行って、ＰｃｐＡがＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａの細胞壁または細胞膜／サイトゾルと関係があるどうか判定した。これら細胞画分のウエスタンブロット解析から、ＰｃｐＡは大部分が低マンガン培地で増殖させたバクテリアのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞壁に存在することが明らかになった。ＰｃｐＡの小さな画分は、細胞膜／サイトゾルとの関連性が認められたが、これは、おそらくＰｃｐＡがまだバクテリアの表面に運ばれていないのであろう。
【００８８】
細胞分画ばかりでなく、野生型Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＴＩＧＲ４由来の対数期細胞を、高または低マンガン培地で増殖させ、抗ＰｃｐＡポリクローナル抗血清、続いてフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）コンジュゲート抗ウサギ免疫グロブリンで染色した。具体的には、ＴＩＧＲ４を中間対数期まで高または低Ｍｎ２＋培地で培養した。バクテリアを、抗ＰｃｐＡウサギ血清とインキュベートし、続いてＦＩＴＣコンジュゲート抗ウサギＩｇ抗体とインキュベートした。次に、細胞を、膜色素ＴＭＡ−ＤＰＨを含む４％ホルムアルデヒドで固定した。その後、この標識バクテリアを免疫蛍光顕微鏡により調べた。ＰｃｐＡに対する抗体は、低マンガンで増幅させたバクテリアの染色に関与できるが、高マンガンで増幅させたバクテリアには関与できない。
【００８９】
こうした結果から、ＰｃｐＡは、インビトロでの低マンガン条件下で培養した野生型Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの表面に露出していることが明らかになる。これは、ＰｃｐＡが宿主内の肺および血液などの低マンガン部位に感染しているバクテリアに発現し、表面に露出していることを示唆している。ＰｃｐＡがこのように露出していることで感染において細菌と宿主上皮との間のＰｃｐＡ−リガンド相互作用が亢進される。こうした結果からは、マンガン濃度によるＰｃｐＡ産生の制御を大部分の肺炎球菌に一般化できることも示唆される。
【００９０】
ｒＰｃｐＡを免疫すると、抗体が惹起され、肺および全身性感染症に対して保護作用が与えられるが、鼻咽頭定着には大きな作用を及ぼさない。感染症研究に使用する前、マウスを、水酸化アルミニウムを含むｒＰｃｐＡで免疫するか、水酸化アルミニウムを単独投与した。マウスの２つの群についてＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）により全Ｉｇ（Ｈ＋Ｌ）を定量した。免疫マウスの血清中の抗体特異的ＰｃｐＡの幾何平均レベルは、０．４６５（±０．１１９）μｇ／ｍｌ、これに対してアジュバントを単独投与したマウスでは平均０．００２（±０．００２）μｇ／ｍｌ（±ＳＥＭ）であった。これは、免疫経路が、ｒＰｃｐＡに対する免疫反応を惹起させるのに有効であったことを示唆している。
【００９１】
免疫によりマウスが肺炎から保護されるかどうかを調べるため、免疫マウスおよびａｌｕｍのみのマウスを軽麻酔し、外鼻孔にＥＦ３０３０株を５×１０６ＣＦＵ接種した。この手順では、限局性肺炎が認められたが、菌血症は認められなかった。したがって、このモデルにおける保護作用は肺炎自体とは関係があるものの、敗血症全般には無関係である可能性がある。感染から７日後、マウスをすべて屠殺した。ホモジナイズした肺組織および鼻洗浄液の細菌数を判定した。回収したＣＦＵの中央値によれば、ｒＰｃｐＡで免疫したマウスの肺ホモジネートから回収した肺炎球菌数は、アジュバントを単独投与した場合に比べて１／１００未満であった（図３Ａ）（Ｐ＝０．００２）。こうした結果から、ｒＰｃｐＡの免疫により、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる肺感染症に対する保護作用を惹起できることが示唆される。マウスの鼻洗浄液から回収した細菌数については、ｒＰｃｐＡで免疫した場合とアジュバントを単独投与した場合とで有意な差はなかった（図３Ｂ）。以下に詳述するように、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株血清型６由来の組換えＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ（ｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ）も肺感染を防止するが、肺炎のマウスモデルの定着については防止しなかった。
【００９２】
次に、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの他の菌株（ＴＪ０８９３、血清型１４；ＥＦ９３０３、血清型２３Ｆ；およびＬ８２０１６、血清型６Ｂ）による限局性肺感染に対して皮下免疫が保護作用を与えるかどうかを判定した。ｒＰｃｐＡを皮下免疫すると、アジュバントを単独免疫したマウスと比較して、各菌株に対して有意な保護作用が惹起された（図５）。
【００９３】
最適な鼻腔定着にはＰｃｐＡの発現は必要ない。免疫を行っても肺炎モデルに使用したマウスの鼻洗浄液から回収したバクテリア数に影響がなかったため、鼻咽頭保菌のモデルを用いてｐｃｐＡ不活性化の作用を調べた。このモデルでは、肺炎モデルのマウスの鼻洗浄液から収集した間接的な観察結果とは異なり、鼻腔保菌に対するＰｃｐＡの任意の作用を直接観察できる。マウスに、事前に麻酔せずにＥＦ３０３０株またはそのｐｃｐＡ不活化ミュータントＪＥＮ１８株のどちらかを１０６ＣＦＵ接種した。感染から７日後、このマウスを屠殺し、鼻洗浄液を採取して、肺炎球菌を検出するためプレーティングした。ＥＦ３０３０またはＪＥＮ１８を接種したマウスの鼻洗浄液から回収したバクテリア数には、どちらも有意な差はなかった（図５）。
【００９４】
インタクトなｐｃｐＡの遺伝子が存在しても、あるいは、ｒＰｃｐＡの皮下免疫を行っても、マウスの鼻洗浄液に回収された肺炎球菌数に影響がないということは、鼻咽頭のマンガン濃度（≧３６μＭ）がｐｃｐＡ転写を抑制するほど十分に高いことと整合する。こうした条件下では、鼻咽頭におけるｐｓａＲによりｐｃｐＡ転写が阻止されると考えられる。したがって、この宿主部位ではＰｃｐＡに対する免疫がバクテリアにほとんど作用しないことが予想されよう。
【００９５】
ＰｃｐＡおよびＰｃｐＡに対する免疫は、全身性感染症のマウスモデルにおけるビルレンスに作用する。敗血症を防止するＰｃｐＡに対する免疫能を評価するため、ＣＢＡ／Ｎマウスに、水酸化アルミニウムに加えたＰｃｐＡを、または対照として水酸化アルミニウムを単独で皮下免疫し、静脈内に莢膜型４、ＴＩＧＲ４Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅをチャレンジした。マウスに菌血症および敗血症を発症させやすくするため、ＥＦ３０３０でなはなくこの菌株を用いた。免疫した動物に、ＴＩＧＲ４株Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを３００ＣＦＵ静脈内（ＩＶ）注射した。生存状況を２１日間モニターした。ｒＰｃｐＡ免疫を受けたマウスが瀕死状態になるまでの経過時間中央値は、アジュバントを単独投与したマウスと比べて４３．５時間伸びた（図６）。ｒＰｃｐＡで免疫したマウスの２６パーセントが生存した一方、水酸化アルミニウム単独で免疫マウスはすべて死亡した。この生存の差は統計学的に有意であった（Ｐ＝０．００７）。
【００９６】
静脈内接種後にマウスを瀕死状態にさせる肺炎球菌の能力に対するｐｃｐＡの不活性化の作用。ｐｃｐＡを不活性化すると、肺炎マウスモデルおよび肺−敗血症モデルのビルレンスが低下した。本明細書に記載のように、未感染のマウスにＴＩＧＲ４またはそのｐｃｐＡ不活化ミュータントＪＥＮ１１を３００ＣＦＵ感染させて、静脈内チャレンジ後の全身性感染症に対するｐｃｐＡ不活性化の作用を調べた。ｐｃｐＡ−ミュータントに感染したマウスが瀕死状態になるまでの経過時間中央値は、野生型バクテリアで感染させた場合と比べて３１．５時間の伸びた（Ｐ＝０．０２９９）（図７）。これは、全身性疾患を発症させるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの能力にはＰｃｐＡが関与していることを示唆している。
【００９７】
（実施例２）
ＰｃｐＡの粘膜免疫は肺感染を防止する。
【００９８】
図８に示すように、ＰｃｐＡの粘膜免疫は、菌株ＥＦ３０３０による肺感染症を防止する。ＣＢＡ／Ｎマウスに５μｇのＰｃｐＡおよびアジュバントとしてコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）を鼻腔内免疫した。免疫後マウスを脱血し、次に、菌株ＥＦ３０３０を５×１０６ＣＦＵ鼻腔内チャレンジした。図８は、感染から７日後の肺ホモジネートにおけるバクテリアのｌｏｇＣＦＵを示す。
【００９９】
粘膜免疫による保護作用は、皮下免疫の場合よりも若干高まることが観察された。こうしたデータと実施例１から、少なくとも粘膜経路または皮下経路の投与を用いれば、肺炎および敗血症に対する保護作用が得られることが示唆される。ＰｃｐＡを粘膜免疫しても、この菌株による鼻腔定着を防止できない。ＰｃｐＡは定着の過程で発現しないため、鼻腔定着を防止できないことが予想される。
【０１００】
（実施例３）
ＰｃｐＡの皮下または鼻腔内免疫により惹起される抗体。
【０１０１】
ＰｃｐＡで免疫したマウスから得られた血清について、ＰｃｐＡに対する抗体のレベルを調べた。ＣＢＡ／Ｎマウスに、０日目および１４日目にアジュバントとして水酸化アルミニウムまたはコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）のどちらかを皮下（ＳＣ）免疫し、２１日目にＰｃｐＡを単独で皮下（ＳＣ）免疫した。３５日目にマウスを脱血し、血清中の抗体レベルを判定した。判定には、ＰｓｐＡでコートしたマイクロ滴定プレートと反応する既知濃度のＰｓｐＡ抗体で観察される光学密度（ＯＤ）を標準として用いた。対照として、別のマウス群を希釈液およびアジュバントのみで免疫した。ＩｇＧ抗体反応は、鼻腔内（ＩＮ）免疫よりもＳＣ免疫で観察された方が１．３倍大きかった（表５）。
【０１０２】
【表５】
このタイプのアッセイにはつきものであるが、サブクラスの量の合計が全Ｉｇの量にならなかった。これは、抗ＩｇＧ血清がＩｇＧサブクラスのすべてを等しく認識するとは限らないことを示唆している。
【０１０３】
（実施例４）
肺細胞への付着にはＰｃｐＡが必要である。
【０１０４】
ＰｃｐＡは、形質転換肺上皮細胞Ａ５４９細胞株（図９）への付着には必要であるが、形質転換ヒト鼻上皮細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２系（図１０）への付着には必要ない。Ａ５４９肺上皮細胞への付着には、ＰｃｐＡを産生するように肺炎球菌が低Ｍｎ２＋において増幅する必要があることも観察された。こうした研究のため肺炎球菌を、トッドヒューイットおよび酵素培地（高Ｍｎ２＋）、あるいはＣｈｅｌｅｘ−１００（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に通して０．１μｍのＭｎＳＯ４および１ｍＭのＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＦｅＳＯ４で再構成したトッドヒューイットおよび酵素培地（低Ｍｎ２＋）で増殖させた。（Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ，１８８：３３９−４８（２００３））。Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２またはＡ５４９細胞の単層を、ＴＩＧＲ４（ｐｃｐＡ＋）またはＪＥＮ１１（ｐｃｐＡ−ＴＩＧＲ４株）１０６ＣＦＵと１５０分間インキュベートした。この付着バクテリアを含む上皮細胞を洗浄し、０．５％ツイーン２０で溶解した。血液寒天プレートの定量プレーティングでライセート中の肺炎球菌の数を判定した。
【０１０５】
肺炎球菌のＡ５４９細胞への付着は、ＰｃｐＡに対する抗体で阻害される（図１１）。こうしたデータは、肺炎球菌の肺上皮細胞への付着がＰｃｐＡ依存性であることを示唆している。
【０１０６】
（実施例５）
受動防御モデル。
【０１０７】
ＰｃｐＡによる能動免疫が肺感染に対する保護作用を惹起できることから、ＰｃｐＡに対する抗体がマウスを肺感染から受動的に保護できるかどうかを判定した。しかしながら、肺炎モデルでは受動防御はまだ観察されていない。第２の受動免疫研究では、ＰｃｐＡに対するウサギ免疫血清を用いて、ＴＩＧＲ４株による静脈内（ＩＶ）敗血症に対する受動防御を判定した。検査対象の最高濃度（１／１０）の血清ではマウス２匹の死を予防できることが観察された（図１２）。非免疫血清では、同じ濃度でも防止することができなかった。こうしたデータから、受動免疫は、予防が困難な場合がある菌株、ＴＩＧＲ４株を予防することができると考えられる（Ｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ，７１：４４９８−５０５（２００３））。
【０１０８】
（実施例６）
ＰｃｐＡおよびニューモリシンによる保護作用
ニューモリシン（Ｐｌｙ）は、肺感染に対してある程度の保護作用を惹起し得るもう１つのタンパク質である（Ｂｒｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：３３９−４８（２００３））。ニューモリシンおよびＰｃｐＡはともに、タンパク質ベースの肺炎球菌ワクチンの候補物質であるため、この２つのタンパク質について、免疫源として併用した場合、どちらかを単独で使用するよりも肺感染に対する保護作用が高まるかどうかを判定した。マウスにＰｃｐＡ５μｇ、ニューモリシン５μｇまたはＰｃｐＡ５μｇとニューモリシン５μｇを３回免疫した。最初の２回の注射ではａｌｕｍを用い、３回目の注射ではタンパク質単独で行った。今回使用したニューモリシンは、野生型ニューモリシンであった。図１３は、ニューモリシンが肺感染に対して、ＰｃｐＡが惹起するのと類似の保護作用を惹起することを示す。ＰｃｐＡとニューモリシンを組み合わせると、ニューモリシン単独の場合よりも保護作用が著しく高まった。こうしたデータから、ＰｃｐＡおよびニューモリシンを併用することで保護作用が得られることが示唆される。
【０１０９】
（実施例７）
他の肺炎球菌に対する交差防御。
【０１１０】
ＰｃｐＡが交差防御を惹起するかどうかを判定するため、上述の方法を用いて実施例１〜２に記載した以外の菌株を検査してもよい。敗血症の研究の場合、ＴＩＧＲ４の他にＷＵ２、Ａ６６、ＢＧ７３２２、ＥＦ６７９６、Ｄ３９などの菌株が検査対象となる。これらの菌株の莢膜型は、３、３、６Ｂ、６Ａおよび２である。肺感染を調べるには、限局性肺感染のマウスモデルでうまく行く菌株を用いる。こうした菌株として、ＥＦ９３０９、ＴＧ０８９３、Ｌ８２０１６、ＢＧ７３２２およびＥＦ６７９６が挙げられる。これらの莢膜型は、２３Ｆ、１４、６Ｂ、６Ｂおよび６Ａである。
【０１１１】
（実施例８）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６由来の組換えＰｃｐＡのクローニングおよび発現。
【０１１２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６株、１４４５３、アメリカンタイプカルチャーコレクション指定番号５５９８７由来のｐｃｐＡ遺伝子のフラグメントを以下のとおりクローニングした。このｐｃｐＡ遺伝子は、ＰｃｐＡ Ｃ末端コリン結合ドメイン（ＣＢＤ）のリピートをコードする部分と天然のシグナルペプチド（ＳＰ）配列をコードする部分とを欠損している。この遺伝子を、図１４に示すようにＮｄｅＩとＸｈｏＩのクローニング部位の間のｐＥＴ−３０ａ（ノバゲンインク，マディソン，ウィスコンシン州）にクローニングした。内部ｐｃｐＡ遺伝子（ΔＳＰΔＣＢＤ１３３５ｂｐ）の遺伝子フラグメントを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６株染色体（ｃｈｏｒｏｍｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーとして
５’−ＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＴＴＡＧ−３’（配列番号４３）および
５’−ＣＴＡＡＴＧＡＡＣＣＡＣＡＴＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＡＧＴＴＣＧＧＡＡＧＴＡＡＴＣ−３’（配列番号４４）
を用いた。実施例１に記載されているようにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプライマーに制限エンドヌクレアーゼ部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを導入した。ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤをコードする得られた１３３５塩基対フラグメントは、どちらかの末端にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位を含んでいた。増幅したフラグメントをゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化してから、このｐｃｐＡ遺伝子フラグメントを、強力なＴ７プロモーターおよび翻訳シグナルを用いてｐＥＴ−３０ａベクター（ノバゲンインク，マディソン，ウィスコンシン州）のＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位の間にライゲートした（図１４）。ＤＮＡシーケンシングの結果、組換えプラスミドｐＪＭＳ８７は、ｐｃｐＡ遺伝子フラグメントΔＳＰΔＣＢＤ１３３５ｂｐを含むことが確認された。プラスミドｐＪＭＳ８７をタンパク質製造のためＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。ＩＰＴＧで誘導して、このＥ．ｃｏｌｉ株に天然のシグナルペプチド（ΔＳＰ）およびＣ末端コリン結合ドメイン（ΔＣＢＤ）を欠損しているＰｃｐＡタンパク質を発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析でこの発現タンパク質を確認した。
【０１１３】
ｒＰｃｐＡタンパク質（ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤとも呼ぶ）の配列は、以下のとおりである。下線で示す残基（Ｍ）は、クローニングベクター由来である。
【０１１４】
【化３】
（実施例９）
ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤの免疫は、敗血症モデルの肺炎に対して保護作用を惹起する。
【０１１５】
ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤがマウスの敗血症モデルにおいて感染症を防止するかどうかを判定するため、マウスに、精製した組換えＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ（ｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤ）を１用量当たり１０、５、２．５、１．２５および０．６２５μｇ免疫し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＷＵＢＭ３を１匹当たり約３００ＣＦＵチャレンジした。このｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤについては、リン酸アルミニウムアジュバントで製剤化した。
【０１１６】
簡単に説明すると、マウスに、対照のＰＢＳアジュバント、３０μｇの３価組換えＰｓｐＡタンパク質を含むＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＰｓｐＡタンパク質、あるいは１用量当たり１０、５、２．５、１．２５または０．６２５μｇのｒＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤを免疫した。健康なＢＡＬＢ／ｃ Ｋ−７２雌マウス（チャールスリバーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ウィルミントン，マサチューセッツ州）（各群およそ１４匹）を０日目に皮下（ｓ．ｃ．）免疫した。２１日目に２回目の免疫および４３日目に３回目の免疫を行った。６３日目に、このマウスにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＷＵ２ＢＭ３バクテリア約３００ＣＦＵを０．４ｍｌ用量腹腔内（ＩＰ）チャレンジした。生存率を時間（日数）に対してプロットして図１５Ａに示す。チャレンジから７日目の生存率を図１５Ｂに示す。
【０１１７】
これらの結果は、ｒＰｃｐＡが１用量当たり少なくとも約０．６２５μｇから少なくとも約１０μｇで保護作用を持つことを示す。ｒＰｃｐＡではアジュバント対照群と比較して統計学的に有意な保護作用が得られた（片側または両側のフィッシャーの正確確率検定）。
【０１１８】
【表６】
（実施例１０）
ＰｃｐＡΔＳＰΔＣＢＤの免疫は、肺炎に対する保護作用を惹起する。
【０１１９】
マウス肺炎モデルにおいて実施例５のｒＰｃｐＡタンパク質を用いて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＥＦ３０３０のチャレンジに対するこのタンパク質の保護作用の有効性も検査した。ＣＢＡ／Ｎマウス１０匹群に、表７に示すような免疫原製剤２００μｌを３週間おきに３回（０日目、２１日目および４２日目）皮下免疫した。３回目の免疫から３週間後（６３日目）、このマウスに麻酔下でＥＦ３０３０株を鼻腔内に５．６×１０６ＣＦＵチャレンジした。チャレンジから５日後（６８日目）、マウスを屠殺し、肺組織および血液を摘出してＣＦＵを回収するためプレーティングした。この免疫群をリン酸アルミニウムアジュバント３ｍｇ／ｍｌで製剤化した。
【０１２０】
【表７】
３価ＰｓｐＡ免疫原は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＰｓｐＡ Ｒｘ１−Ｍ１、ＥＦ３２９６およびＥＦ５６６８で構成した。
【０１２１】
結果を図１６に示す。ｒＰｃｐＡタンパク質は、対照群（アジュバント単独は群１）と比較して保護作用が顕著であり（群３〜６）、陽性対照（群２がＰｓｐＡ）に対しては同等レベルであった。マンホイットニー検定によるｐ値を表８に示す。
【０１２２】
【表８】
本明細書に引用する刊行物および刊行物に記載の材料については、その全体を参照によって本明細書に明確に援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６由来の天然型ＰｃｐＡの１つまたは複数のロイシンに富んだ領域を含む、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメント。
【請求項２】
前記フラグメントが配列番号４５を含む、請求項１に記載の免疫原性フラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の免疫原性フラグメントおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
免疫原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ＰｓｐＡの免疫原性フラグメント、ニューモリシンまたはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、粘膜表面への投与に好適である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、点鼻薬である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、ネブライザー溶液である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、エアロゾル吸入剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項３に記載の組成物を含む、容器。
【請求項１２】
前記容器は、鼻噴霧器である、請求項１１に記載の容器。
【請求項１３】
前記容器は、ネブライザーである、請求項１１に記載の容器。
【請求項１４】
前記容器は、吸入器である、請求項１１に記載の容器。
【請求項１５】
被検体においてＰｃｐＡに対する抗体を産生する方法であって、請求項２に記載の免疫原性フラグメントを前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
被検体において肺炎球菌の鼻腔保菌を防止または抑制する方法であって、請求項２に記載の免疫原性フラグメントを前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
被検体において肺炎球菌感染症の危険性を低下させる方法であって、２に記載の免疫原性フラグメントを前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、髄膜炎である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、中耳炎である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、肺炎である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、溶血性尿毒症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫原性フラグメントを投与しても、肺炎球菌（ｐｅｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）の鼻腔保菌が皆無にならない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６由来の天然型ＰｃｐＡの１つまたは複数のロイシンに富んだ領域を含む、ＰｃｐＡの免疫原性フラグメント。
【請求項２】
前記フラグメントが配列番号４５を含む、請求項１に記載の免疫原性フラグメント。
【請求項３】
請求項２に記載の免疫原性フラグメントおよび薬学的に許容されるキャリアを含む、組成物。
【請求項４】
アジュバントをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
免疫原性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ＰｓｐＡの免疫原性フラグメント、ニューモリシンまたはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、粘膜表面への投与に好適である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、点鼻薬である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、ネブライザー溶液である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、エアロゾル吸入剤である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項３に記載の組成物を含む、容器。
【請求項１２】
前記容器は、鼻噴霧器である、請求項１１に記載の容器。
【請求項１３】
前記容器は、ネブライザーである、請求項１１に記載の容器。
【請求項１４】
前記容器は、吸入器である、請求項１１に記載の容器。
【請求項１５】
被検体においてＰｃｐＡに対する抗体を産生する方法であって、請求項２に記載の免疫原性フラグメントを前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
被検体において肺炎球菌の鼻腔保菌を防止または抑制する方法であって、請求項２に記載の免疫原性フラグメントを前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
被検体において肺炎球菌感染症の危険性を低下させる方法であって、２に記載の免疫原性フラグメントを前記被検体に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、髄膜炎である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、中耳炎である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、肺炎である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記肺炎球菌（ｐｎｅｕｃｏｃｏｃｃａｌ）感染症は、溶血性尿毒症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫原性フラグメントを投与しても、肺炎球菌（ｐｅｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）の鼻腔保菌が皆無にならない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５０１０１２（Ｐ２０１０−５０１０１２Ａ）
【公表日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２４８１４（Ｐ２００９−５２４８１４）
【出願日】平成１９年８月１７日（２００７．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２２３０２
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０６３８５３３５）ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション (10)
【出願人】（５０９０４４６７１）サノフィ パステュール リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１７日（２００７．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６１８０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０２２３０２
【国際公開日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【出願人】（５０６３８５３３５）ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション (10)
【出願人】（５０９０４４６７１）サノフィ パステュール リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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