免疫反応を増加させるための方法
本発明は免疫系の細胞のＣｂｌ−ｂ機能を減少させるか、または阻害して、それにより抗原に対する細胞の免疫反応を増加させることを含む、抗原と接触した免疫系の細胞の免疫反応を増加させるインビトロまたはエキソビボにおける方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の免疫応答を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
能動免疫はとても危うい感染症に対する総合的な戦いを初めて可能にさせ、いくつかの場合において、安価な非常に効率的な内因性防御メカニズムを使用して世界的な根絶を達成さえさせた。したがって、努力が種々の適応症に対する予防的および治療的ワクチン接種アプローチを開発するために費やされ、これからも費やされるであろう。しかしながら、効率的な免疫は免疫応答の誘導を必要とし、そしてそれは防御免疫を引き起こす。しかしながら、免疫抗原の免疫原性の欠如は起こるべき所望の効果の機能不全を引き起こす。非常に興味があり特異的な抗原製剤は、マラリア、ＨＩＶ、インフルエンザまたは腫瘍疾患（わずかな著名な例を挙げる）の予防および処置に対して、すでに開発されている。しかしながら、これらの処置は、例えば、免疫抗原の免疫原性の欠如により成功していない。さらに、広く使用されているワクチン、例えば、処置されたものの約８０％に対してのみ保護的な免疫応答力価を実際に構築するＢ型肝炎ワクチンでさえ、免疫原性の欠如の問題を引き起こす。免疫系の反応性の欠如に関する主な理由はこれらの抗原が“異物”として認識されないことである。哺乳動物において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される構造が内因性として認識されるか、または異物として認識されるかどうかを決定するものは主にＴ細胞である。免疫応答を誘導するため、本質的に２つの別々のシグナルが、互いに独立して、必要である。このメカニズムは免疫系のオーバーシュートを防止する。第１の必須条件は、Ｔ細胞受容体に関してＡＰＣにより提供される抗原を認識することである。これが起こらない場合、次にさらなる反応が起こらない。さらに、免疫応答の誘導のため、Ｔ細胞表面におけるＣＤ２８受容体と危険として抗原構造を分類したときのみＡＰＣにおいて発現されるＢ７の相互作用を有することは絶対的に必須である。最低限の免疫原性のみを有するワクチン接種抗原でのワクチン接種の場合、Ｂ７とＣＤ２８の間の連絡の相互作用を介する共刺激が起こらず、次に免疫応答を引き起こさないが、代わりにＴ細胞レベルにおいて耐性の発生を引き起こす。しかしながら、共刺激の必要性は酵素Ｅ３−ユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂをオフにすることにより迂回することができることが証明されている。この酵素が免疫反応のコントロールにおける決定的なスイッチである（Chiang et al., J Clin Invest (2007) doi:10.1172/JCI29472）。しかしながら、Ｃｂｌ−ｂの非存在下において、高い免疫原性である投与される物質は強い免疫応答の誘導を引き起こし得る。さらに、Ｃｂｌ−ｂ−欠損マウス（ホモ接合型遺伝子ノックアウト）は生存可能であり、それらの免疫系は効率的に自己誘発腫瘍を認識し、主にＣＤ８＋Ｔ細胞に基づく溶解免疫応答を構築することができる（Loeser et al., JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699）。しかしながら、記載されている酵素の完全な除去はスーパー抗原の免疫後の自己免疫の増加も引き起こす。したがって、Loeser et al.は、負の調節因子としてＣｂｌ−ｂがＴ細胞の“免疫反応”に関与することを示すことができている。
【０００３】
特定の遺伝子発現の減衰のためのＳｉＲＮＡ技術は、また、すでに低い効率を有するＣｂｌ−ｂに関して記載している。ＵＳ２００７／００８７９８８はＨＰＫ１を調節するための方法、この発現をＣｂｌ−ｂ発現を増加させることにより増加させることができる（逆もまた同様（例えば、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡの阻害により））ことに関する。
【０００４】
ＵＳ２００７／００５４３３５５はＣｂｌ−ｂペプチドおよびＣｂｌ−ｂ−関連タンパク質、特にＰＯＳＨならびにＣｂｌ−ｂ−関連疾患の処置のためのそれらの使用を記載している。
【０００５】
ＷＯ２００４／０７８１３０Ａ２はＰＯＳＨ−関連疾患、例えば、ウイルス性疾患、癌および神経障害の処置のための組成物に関する。ＰＯＳＨはＣｂｌ−ｂを含む複数のＰＯＳＨ−関連タンパク質と共に利用することができる。
【０００６】
ＵＳ２００６／０２９２１１９Ａ１は細胞における負の免疫調節因子の阻害により免疫細胞の免疫応答を増加させる方法に関する。このような負の免疫調節因子は、例えば、ユビキチン化、脱ユビキチン化およびスモイル化による分子安定性と関連するタンパク質ならびにＮＦｋＢ阻害因子の発現を阻害する転写因子またはＮＦｋＢ標的遺伝子の転写の抑制因子から選択される。
【０００７】
しかしながら、臨床的適用のためのＣｂｌ−ｂメディエーターの使用は記載されていない。したがって、本発明の１つの目的は、免疫反応を調節するための方法を利用できるようにし、実用化することである。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明は免疫系の細胞のＣｂｌ−ｂ機能を減少させるか、または阻害して、それにより抗原に対する細胞の免疫反応を増加させることを含む、抗原と接触した免疫系の細胞の免疫反応を増加させるインビトロまたはエキソビボにおける方法に関する。
【０００９】
Ｃｂｌ−ｂ遺伝子およびその遺伝子産物は関連分野において詳細に記載されている（UniGene Id. Hs.3144 and Hs. 381921）。Ｃｂｌ−ｂ配列は、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿００８２７９およびＮＰ＿００９１１２の下に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公開されている。抗−Ｃｂｌ−ｂ抗体、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス阻害因子は市販されている。特定のｓｉＲＮＡはＣｂｌ−ｂ発現、したがってＣｂｌ−ｂ機能をも減少させるか、または阻害するために適当であり、混合ＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチドと共にＵＳ２１００７／００５４３５５に記載されており、例えば、約２０塩基長である。
【００１０】
自己免疫反応の誘導を引き起こすことができる免疫系の過剰反応の危険性を中和するために、例えば、Ｔ細胞におけるＣｂｌ−ｂ機能の阻害／ノックアウトを正確に定義された期間においてのみ実施することができる。したがって、与えられた免疫抗原に対して特異的な免疫応答の発生をサポートするための限定された期間のみ、制御されている方法においてＣｂｌ−ｂを軽減するが、即座に“正常”の免疫学的状態に回復させることにより自己免疫性疾患を防止することが、アジュバント治療的ワクチン接種アプローチのために必須である。したがって、本発明にしたがって、免疫系の単離された細胞の特定の選択物のみをインビトロまたはエキソビボにて処理し、次に患者に戻す。したがって、インビトロまたはエキソビボにおける効率的なＣｂｌ−ｂ減衰のための１つのアプローチは、免疫反応を増加させるための必須条件である。
【００１１】
Ｃｂｌ−ｂ機能をＣｂｌ−ｂの発現を減少させるか、または阻害することにより、好ましくは減少させるか、または阻害する。減少または阻害なる用語は、機能の完全な阻害までの、変化していない天然機能と比較してＣｂｌ−ｂの機能（および／または発現）における減少に関する。機能（および／または発現）を好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少させる。
【００１２】
好ましい態様において、Ｃｂｌ−ｂの機能を好ましくは一時的に減少させるか、または阻害する。言い換えれば、該機能を上記のとおり一時的にのみ減少させ、次に、例えば、阻害因子、例えば、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡの消費もしくは崩壊または非−Ｃｂｌ−ｂ−異常細胞の新生（インビボ）により回復することができる。免疫細胞におけるＣｂｌ−ｂの一時的な減少も、例えば、治療的成功が達成されるまで、繰り返し達成することができる。
【００１３】
Ｃｂｌ−ｂの発現を好ましくはＣｂｌ−ｂアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用することにより減少させるか、または阻害する。この目的のため、それら同士がハイブリダイズし、それによりそれらを不活性化できるように、標的（Ｃｂｌ−ｂ）ｍＲＮＡ配列の部分に相補的である短鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列を使用する。これらの配列の長さは好ましくは少なくとも１５、１８、２０、２２、２５、２８、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０または２００塩基、最大で完全な標的配列、好ましくは最大で２５０２、２０００、１５００、１０００、５００または３００塩基である。配列番号１、２、３、４、５、６、７および／または８の配列を好ましくは使用する。
【００１４】
同様に、Ｃｂｌ−ｂの機能を複数の他の既知の因子により、例えば、Ｃｂｌ−ｂアンタゴニスト因子、阻害因子、特にアプタマーまたはイントラマーを使用することにより、減少させるか、または阻害することができる。Ｃｂｌ−ｂの効果および／または機能を抑制するすべてのアンタゴニスト因子または阻害因子が、また、細胞の免疫反応を増加させるために本発明にしたがって使用され得る。アンタゴニスト因子または阻害因子は、好ましくはインビトロ、エキソビボ、または、さらにインビボにて免疫系の細胞の免疫反応性を増加させるための医薬品を製造するために使用される。これは、抑制された、または非効率的な免疫系を有する疾患、特に癌の処置、ならびにインビボまたはエキソビボにて免疫系の細胞と接触させることができる（ワクチン接種）抗原に対する免疫応答の増加を可能にする。
【００１５】
本発明は、また、特にｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用することにより、好ましくは一時的な減少または阻害により、細胞のｃ−Ｃｂｌ機能を減少させるか、または阻害して、抗原に対する細胞の免疫反応を減少させることを含む、免疫系の細胞の免疫反応を減少させる方法に関する。免疫反応を増加させるために、Ｃｂｌ−ｂと一緒にｃ−Ｃｂｌを軽減することは絶対的に必要ではない。実施例に示されているとおり、代わりにｃ−Ｃｂｌの減衰はＣｂｌ−ｂの阻害により達成される効果の逆転を引き起こす。したがって、Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌはアンタゴニスト機能を有する。Ｃ−Ｃｂｌは、また、その減衰が免疫寛容の増加を引き起こすという、Ｔ細胞反応性の微調節においてこれまでに未知の機能を果たす。したがって、ｃ−Ｃｂｌ機能の減少または阻害は免疫抑制に対して適当であり、したがって、例えば、炎症またはアレルギーにおいてその使用を可能にする。減衰の程度および方向がＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌ（本明細書に記載されているＣｂｌ−ｂと類似）の減少または阻害において用量に依存するため、両方の因子を一緒にこれらの機能において減少させ得る。免疫反応を増加させるために、Ｃｂｌ−ｂの減少はｃ−Ｃｂｌの減少より重要である（逆もまた同様）。Ｃ−ＣｂｌアンチセンスまたはｓｉＲＮＡはＣｂｌ−ｂに対する上記のものと同じ配列系を有し得る。配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および／または１６の配列を好ましくは使用する。
【００１６】
特別な態様において、抗原を取り込み、好ましくは抗原フラグメントを提示するか、または、より良くは、ＨＬＡに関連する抗原フラグメントを認識し、それにより活性化される細胞を特に使用する。
【００１７】
好ましい態様において、本発明において使用される細胞は、抗原提示細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージおよび／または樹状細胞、特にＴ−リンパ球、ＣＤ８＋Ｔ−リンパ球、ＣＤ４＋Ｔ−リンパ球、特にＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇｓ（制御性Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞毒性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。同様に、一般的にＣＤ３／ＣＤ１９−陰性リンパ球も使用することができる。ＮＫ細胞はとりわけそれらの好ましいグループを形成する。抗原は好ましくは細胞に取り込まれ、そして細胞は抗原、好ましくは抗原フラグメントを提示する。ＰＢＭＣおよびＴ細胞は、とりわけ強い抗原−特異的反応を誘導するために処置に対する組合せにおいてとりわけ好ましい。他の態様において、特に免疫反応を全体的に増加するために（例えば、免疫不全を処置するために）、種々のＴ細胞は単独にて広範な効果を達成するために十分である。本発明の免疫反応の増加は好ましくはこれらの細胞、特にＣＤ８またはＣＤ４細胞ならびにＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞が介在する。
【００１８】
エレクトロポレーションは好ましくは細胞、特にＴ細胞またはＮＫ細胞のＣｂｌ−ｂ阻害因子、例えば、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡまたはノックアウトＣｂｌ−ｂ構築物とのトランスフェクションのために使用される。トランスフェクション、すなわち、Ｃｂｌ−ｂの阻害を引き起こすあらゆる培地がこの目的のために適当である。Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ、＃３１９８５−０４７）はこのような培地の１つの例である。
【００１９】
加えて、細胞を、また、免疫刺激物質、例えば、免疫刺激サイトカインまたは他の免疫刺激受容体（例えば、ＴＬＲ、トール様受容体）のリガンドまたは表面分子、好ましくはＣＤ３および／またはＣＤ２８に対する抗体にて処理、すなわち、刺激し、細胞による免疫応答を促進し得る。
【００２０】
Ｃｂｌ−ｂの阻害は、また、樹状細胞ワクチン接種、好ましくは抗腫瘍ワクチン接種の一部として使用され得る。
【００２１】
あるいは、および／または、加えて、Ｃｂｌ−ｂ−阻害細胞と好ましくは腫瘍（細胞）抗原にて負荷された、患者から得られる樹状細胞のインビトロ共培養を阻害する細胞も本発明の目的のための共培養に使用することが可能である。
【００２２】
本明細書において使用される“ワクチン接種”は、絶対的な感覚にて−すなわち、免疫系により絶対的な保護を引き起こす免疫原の投与−ではなく、むしろ免疫学的投与として免疫系による保護を増加させる、および／またはワクチン抗原に対する免疫系、特にそれらの細胞を活性化するとして理解するべきである。
【００２３】
１つの特定の局面において、本発明は、患者の免疫系の細胞を単離し、Ｃｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子を使用することによりインビトロまたはエキソビボにおける免疫反応を増加させ、そして患者に細胞を再移植することを含む、患者における抗原に対する免疫反応を増加させる、および／または免疫反応それ自体を増加させるための医薬組成物の製造のためのＣｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子の使用であって、免疫反応は細胞のＣｂｌ−ｂ機能の減少または阻害により増加される使用に関する。
【００２４】
ワクチン接種、抗原の投与と同時に、好ましくは限定された期間の免疫反応の増加の実行は、循環Ｔ細胞のごく一部においてＣｂｌ−ｂ発現を減少させることにより誘導することができる。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は患者の骨髄からの全血および／または血液細胞および腫瘍組織それ自体（ＴＩＬ）から得られ、理想的にはあらかじめ数日間、例えば、５日間免疫化され、インビトロまたはエキソビボにてＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ減衰バッチで処理されている。この方法は非常に迅速に実施される。理想的な場合において、この細胞製造物は取り出されたほんの数分後に再び患者に投与され得る。細胞は所望により細胞が再移植される前にそれぞれの細胞に対して適当であるエキソ−ビボ−刺激プロトコールにより増殖または拡大され得る。ほんの数パーセントの患者のＴ細胞集団を示すインビトロにて活性化されたＴ細胞は、受容者で循環している間にリンパ節において抗原提示細胞と出会うと、これらの抗原提示細胞はすでに起こっている免疫により抗原を取り込み、そこに移動する。インビトロにて処理されたＴ細胞は共刺激シグナルを必要としないため、それらは免疫抗原の認識後に即座に急増し、細胞レベルおよび体液レベルの両方における免疫応答の誘導に全身的に寄与するサイトカインを分泌する。このバッチによって、弱い免疫原性抗原でさえ長期免疫保護の確立を引き起こす。同様に、癌患者における自己腫瘍の拒絶反応はこの方法において誘導することができる。受動免疫法、例えば、腫瘍−抗原−特異的抗体と組み合わせた化学療法／放射線治療の一つおよび／または同時のいずれかにて使用され、Ｃｂｌ−ｂアンタゴニスト因子は免疫反応を増加させる。
【００２５】
したがって、この方法を、所望により疾患特異的抗原の選択と共に先天性または後天性免疫不全、特にＡＩＤＳ、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、薬物誘導免疫抑制または癌を処置するために使用する。固形腫瘍を含む癌の処置が特に好ましい。
【００２６】
処置の成功のチャンスを増加させるため、癌の処置は好ましくは別の抗腫瘍治療、特に化学療法、放射線治療、治療的生体細胞または樹状細胞（腫瘍）ワクチン接種の投与と組み合わせて投与される。Ｃｂｌ−ｂの阻害を樹状細胞ワクチン接種、好ましくは抗腫瘍ワクチン接種の一部として使用することができる。あるいは、および／または加えて、Ｃｂｌ−ｂ−阻害細胞と好ましくは腫瘍（細胞）抗原にて負荷された、患者から得られる樹状細胞のインビトロ共培養ならびに本発明の目的のための共培養の使用も可能である。
【００２７】
インビトロまたはエキソビボにおける免疫反応の増加は上記のとおりの治療方法において実施され得、細胞は細胞の除去前または後に所望により抗原に暴露される。
【００２８】
免疫抗原の提示、抗原提示細胞によるそれらの摂取およびさらに取り込まれた物質を活性化Ｔ細胞に提示する局所リンパ節へのこれらの細胞の移動の時間的順序も、治療的実施において重要である。したがって、患者は、より好ましくは細胞の単離前、特に好ましくは細胞の単離の少なくとも１、２、３、４または５日および／または最大２０、１６、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１週間前に好ましくは抗原を接種する。あるいは、インビトロまたはエキソビボにおける抗原を有する細胞の次のワクチン接種または処理も可能にする。
【００２９】
加えて、好ましくは患者由来であり、対応する抗原と接触し、次にＣｂｌ−ｂ−阻害免疫細胞、好ましくはＴ細胞の投与と一緒または投与のすぐ前もしくは後のいずれかにて特異的な免疫反応の増加に寄与することができる、抗原提示細胞も使用することができる。
【００３０】
該細胞は好ましくは特定の抗原または特定の抗原を含む細胞に対して特異的であり、抗原の特異性または存在に対して選択され、選択された細胞の免疫反応を増加させる。免疫を増加させる特異性を有する特定の抗原および／または細胞の選択を介して、免疫応答は標的方法で患者における特定の標的に対して指向させることができる。このような標的は特に腫瘍（少なくとも１個以上の腫瘍抗原の選択を介する）または病原体である。
【００３１】
細胞の分離と平行して、トランスフェクションバッチにおける対応するｓｉＲＮＡが同じ滅菌使い捨てチューブ中に置かれていることが考えられる。したがって、他の局面において、本発明は、特に抗原に対する免疫系の細胞の免疫反応を増加させるためのＣｂｌ−ｂ阻害因子を含む、好ましくは滅菌容器、例えば、使い捨てチューブに関する。
【００３２】
同様に、本発明は、特に本発明の方法により抗原に対する免疫系の細胞の免疫反応を増加させるための、免疫系の細胞を保持するための容器、特に使い捨てチューブ、ならびにＣｂｌ−ｂ阻害因子、例えば、ｓｉＲＮＡを含むキットを提供する。
【００３３】
容器および／またはキットは、また、さらに刺激を増加させるための、免疫刺激物質、好ましくはサイトカインまたは他の受容体（例えば、ＴＬＲ）のリガンドまたは表面分子、好ましくはＣＤ３および／またはＣＤ２８に対する抗体を含み得る。同様に、キットまたは容器は、また、安定化成分、培地またはバッファー（細胞の安定化のため）、トランスフェクションまたはヌクレオフェクション(nucleofection)溶液、好ましくは細胞培地、例えば、ＲＰＭＩまたはＯｐｔｉｍｅｍを含み得る。
【００３４】
本発明は下記図および実施例（それらに限定されない）により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は共刺激による（ａ）、Ｃｂｌ−ｂ発現の減衰の場合において、Ｔ細胞受容体の単独刺激による（ｃ）、通常、活性化を引き起こさない（ｂ）Ｔ細胞活性化の簡略化された概略図を示す；
【００３６】
【図２】図２はＣｂｌ−ｂ発現のウエスタンブロット分析を示す。ＣＤ８＋細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、Ｃｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトし、培地に維持し、そして抗−ＣＤ３刺激または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８刺激後に刺激なしの対照グループと比較した。Ｆｙｎをローディング対照として使用した；
【００３７】
【図３】図３はｓｉＲＮＡ処理２日後のヒトＣＤ８＋細胞のＩＦＮ−γ分泌を示す。ＩＦＮ−γ濃度を刺激（培地）なし（左）、ＣＤ３−特異的共刺激（中央）後またはＣＤ３およびＣＤ２８−特異的共刺激（右）後のＣＤ８＋Ｔ細胞の上清において測定した。非特異的ｓｉＲＮＡ（１つ目の棒）、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ（２つ目の棒）、ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（３つ目の棒）ならびにＣｂｌ−ｂ−特異的およびｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（４つ目の棒）の手段によりトランスフェクトされた２日齢細胞集団を比較した；
【００３８】
【図４】図４はｓｉＲＮＡ処理２０日後のヒトＣＤ８＋細胞のＩＬ−２分泌を示す。ＩＬ−２濃度を刺激（培地）なし（左）、ＣＤ３−特異的刺激（中央）後またはＣＤ３およびＣＤ２８−特異的共刺激（右）後のＣＤ８＋Ｔ細胞の上清において測定した。非特異的ｓｉＲＮＡ（１つ目の棒）、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ（２つ目の棒）、ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（３つ目の棒）ならびにＣｂｌ−ｂ−特異的およびｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（４つ目の棒）の手段によりトランスフェクトされた２日齢細胞集団を比較した；
【００３９】
【図５】図５は免疫反応を増加させるためのインビトロＣｂｌ−ｂ減衰バッチの時間的順序を示す；
【００４０】
【図６】図６はＰＢＭＣから単離されたヒトＴ細胞によるｓｉＲＮＡ摂取（Ａ）およびＣＤ８−細胞−枯渇ＰＢＭＣによるｓｉＲＮＡ摂取（Ｂ）を示す；
【００４１】
【図７】図７はＲＮＡｉ後のＣｂｌ−ｂ ｍＲＮＡ発現（Ａ）およびウエスタンブロットにおけるＲＮＡｉ後の生産されたＣｂｌ−ｂ タンパク質の量（Ｂ）を示す；
【００４２】
【図８】図８はＣｂｌ−ｂ阻害後のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２生産を示す；
【００４３】
【図９】図９は時間プロフィールとしてＣｂｌ−ｂ阻害後のＩＦＮ−γ生産を示す；
【００４４】
【図１０】図１０はＣＤ１０７ａ＋ＣＤ６９（Ａ）、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ３、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＡＭ（Ｂ）マーカー発現により測定されるＴ細胞反応性の増加を示す。
【００４５】
【図１１】図１１Ａは治療用ＣＤ８細胞におけるＣｂｌ−ｂ抑制有り／無しの処理後のマウスにおける腫瘍成長；Ｂは処理後のＥＧ７ｏｖａ腫瘍を有するマウスの死亡率を示す。
【実施例】
【００４６】
実施例：
実施例１：配列
以下のｓｉＲＮＡ配列を、単独または組み合わせて、Ｃｂｌ−ｂを阻害するために使用した：
１． センス配列：
Ｇ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号２）
２． センス配列：
Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号３）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号４）
３． センス配列：
Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号５）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号６）
４． センス配列：
Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号７）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号８）
以下のｓｉＲＮＡ配列を、単独または組み合わせて、ｃ−Ｃｂｌを阻害するために使用した：
１． センス配列
Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号９）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｕ（配列番号１０）
２． センス配列
Ｇ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ （配列番号１１）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号１２）
３． センス配列
Ｕ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１３）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１４）
４． センス配列
Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１５）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号１６）
【００４７】
実施例２：Ｃｂｌ−ｂ発現における一時的な減少
この実施例において、Ｔ細胞の免疫反応がエキソビボにて影響され得ることを示す。
全血をＣＰＴチューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）を使用することによりドナーから取り出し、ＰＢＭＣを遠心分離により分離した。別の工程において、この製造物からＣＤ８＋細胞を濃縮した。これらをＡｍａｘａトランスフェクション装置（実施例３に詳細なプロトコール）を使用するＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡの手段によりトランスフェクトし、さらに培養した。非特異的ｓｉＲＮＡを有する同一のバッチをＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡの手段により同一のプロトコールを使用してトランスフェクトし、対照としてさらに培養した。Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌの機能の可能性のある重複を推測するため、他の２つのバッチをｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡならびにｃ−Ｃｂｌ−特異的およびＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡの組合せにより処理した。すべてのバッチを２日間培養した。トランスフェクションがＣｂｌ−ｂ発現の所望の減衰を引き起こした事実は、後のウエスタンブロット分析により証明した。Ｃｂｌ−ｂ発現を誘導するために、培養物をＣＤ３にて、別のバッチにおいてＣＤ３−特異的およびＣＤ２８−特異的抗体にて刺激した。すべての実験において、トランスフェクトされた製造物におけるＣｂｌ−ｂ発現は、図２に示されるとおり、対照トランスフェクションの強度の５％未満にさせた。ｓｉＲＮＡの安定性および結果としての発現の効率的な抑制は限定期間であり、他の細胞に伝達されないため、選択されるバッチはＣｂｌ−ｂ発現の一時的な減衰であり、これはＣｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡの存在に正確に拘束されている。
【００４８】
実施例３：トランスフェクションプロトコール
ヒトＴ細胞におけるｓｉＲＮＡのヌクレオフェクション
ヌクレオフェクションを別のラボアシスタントと共に行うことにより実施する。一人がｓｉＲＮＡオリゴのピペッティングを行い、もう一人が試料を培養培地に移す。これは該処理を有意に加速させる。
１． 細胞のための培地を製造する、ＲＰＭＩ（＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、＋Ｌ−ｇｌｕｔ、＋１０％ＦＣＳ）。
２． 培養培地を少なくとも２つの５０ｍＬＦａｌｃｏｎチューブ／構造物に（ヌクレオフェクトされた細胞を回収するために１つ、および細胞洗浄培地のために１つ）ピペットで取り、そして１ｍＬ／Ｌのヌクレオフェクション試料をそれぞれのチューブにピペットで取る。チューブを３７℃にさらす。
３． それぞれのヌクレオフェクション試料に対してＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに印を付ける。
４． ７分間ヌクレオフェクト細胞を遠心し（４１０ｇ）、上清を取り除く。Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ、＃３１９８５−０４７）を加える。
５． 細胞密度が４０×１０６／ｍＬとなる。それぞれのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに１００μＬ（＝４×１０６細胞）をピペットで取る。
６． ヌクレオフェクション直前に１．５−２．５μＭのｓｉＲＮＡ−オリゴを細胞を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに加える。ピペッティングにより混合し、溶液を細胞に移す（気泡を発生させない）。テーブルに細胞を軽くたたき、気泡を取り除く。
７． ふたを閉め、細胞をＡｍａｘａトランスフェクションデバイス（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）に置く。（Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を使用して最良の選択としてＰｒｏｇｒａｍ Ｕ−１４を行い、Ｖ−２４は行わない）。ｘ−ボタンを押し、ＯＫシグナル後に細胞を取り出す。（次のエレクトロポレーション前に再びｘ−ボタンを押す）。
８． 即座に５００μＬのＲＰＭＩ（３７℃）をヌクレオフェクション細胞に加え、パスツールピペットを使用してピペッティングすることにより注意深く混合する。細胞を回収するＦａｌｃｏｎチューブに移す。細胞を５００μＬのあらかじめ加熱したＲＰＭＩにて１回洗浄し、細胞の残りを回収するＦａｌｃｏｎチューブに移す。
９． それぞれのサンプルにおいて工程５−７を繰り返す。
１０． すべての試料がヌクレオフェクトされるまでＦａｌｃｏｎチューブをインキュベーターに置く。
１１． ４ｍＬの細胞懸濁液を６−ウェルプレートウェル（＝２試料）にピペットで取り、プレートをインキュベーターに置く。
１２． 次の日、細胞を回収し、それらをカウントし、上記のとおりに実施されたヌクレオフェクション後２４時間の培養を開始する。ＲＮＡの単離のために一定量の細胞を取り、標的遺伝子が活性化の時点で下方調節されているかどうかをチェックする。タンパク質試料をタンパク質発現動力学に基づいて取る。
【００４９】
実施例４：ヌクレオフェクション効率
ＣＤ８＋を上記のとおりヒト末梢血から単離した。ネガティブ選択をビーズを使用して実施した。
結果（Ａｍａｘａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）：
集団の純度：ＣＤ８＋ ９７％（ＦＡＣＳ）
【表１】
Ｏｐｔｉｍｅｍでの実験：
【表２】
したがって、確かにＣｂｌ−ｂの発現の減少をタンパク質化学において検出した。
【００５０】
実施例５：Ｔ細胞反応性の一時的な増加−ＩＦＮ−γの測定
したがって、ヒトＣＤ８＋細胞におけるＣｂｌ−ｂ発現を効率において少なくとも９５％抑制することができることを証明した。別の結果として、今回、Ｔ細胞集団の反応性も増加させることができることを証明した。所望の効果がもっぱらＣｂｌ−ｂ−特異的であり、所望の効果をｃ−ＣｂｌによるＣｂｌ−ｂ発現の減衰の場合には迂回することができないことを確認するため、別のアプローチにおいてｃ−Ｃｂｌを軽減させ、そして第３のバッチにおいてｃ−ＣｂｌおよびＣｂｌ−ｂを軽減させた。すべてのこれらのＣＤ８＋細胞培養物を２日間培養し、ＣＤ３、また、ＣＤ３およびＣＤ２８により刺激し、非刺激グループと比較した。通常、Ｔ細胞は急増するためにＣＤ３およびＣＤ２８の共刺激が必要であり、これは培養物の上清における炎症性サイトカインの分泌により容易に検出することができる。このＴ細胞活性化を検出するために、上清におけるＩＦＮ−γ力価を測定した。Ｔ細胞反応性におけるｓｉＲＮＡ処理による発現の減衰の影響の図を図３に示す。トランスフェクション２日後、すべてのＣＤ８＋細胞培養物をＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトし、記載されているとおりに刺激し、非特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトした対照グループと比較した。非刺激細胞は本質的にＩＦＮ−γ発現をしなかった。ＣＤ３のみ刺激後、すべての培養物は、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを上清において検出できるように、高められた反応性を有した。ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡおよび非特異的にトランスフェクトされた細胞に対するシグナルは非常に類似する（低い）ものであった。Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトされた細胞のみが、約３ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ力価と関連する非常に高い反応性を有した。しかしながら、ｃ−Ｃｂｌ−およびＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにより共トランスフェクトされた細胞製造物の反応性は、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ処理後のものより低く、わずか１．２ｎｇ／ｍＬであった。すべての場合において、ＣＤ３−およびＣＤ２８−特異的共刺激は、予想通り、ＣＤ３−特異的刺激のみよりも確かに高いシグナルを生じた。非特異的ｓｉＲＮＡにて処理された対照製造物は１．２ｎｇ／ｍＬの量のＩＦＮ−γ力価を生じたが、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにて処理された培養物は３．８ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ濃度を有した。Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌ−特異的に共軽減された培養物は、Ｃｂｌ−ｂ−軽減されたグループのものよりもさらに低い１．７ｎｇ／ｍＬの力価を有したことは、注目すべきものであった。ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡにて処理された細胞集団が有意に低い反応性を有し、わずか５００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γが上清において測定されたことも予期しないことであった。この濃度は非特異的に処理された共刺激された対照グループのものより有意に低く、抗−ＣＤ３のみにて刺激された対照グループの値に相当する。したがって、マウス系と対照的に、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌの冗長は実験的に排除され、Ｃｂｌ−ｂ（および、その上流調節因子）を介するが、Ｃｂｌ−ｂ／ｃ−Ｃｂｌ組合せを介さない治療的アプローチが免疫反応を増加させるために適当である。しかしながら、ｃ−Ｃｂｌの阻害は他の適用のための免疫−抑制、例えば、炎症またはアレルギーの処置を可能にする。
【００５１】
単剤治療またはワクチン接種との組合せのいずれかとして設計されるこの同時治療的アプローチは、また、末梢にて播種性腫瘍細胞を認識し、免疫応答を構築することにより結局はそれらと闘うことができる。癌を診断された後即座に使用するとき、原発性腫瘍の転移もそれにより防止される。
【００５２】
実施例６：Ｔ細胞反応性の一時的な増加−ＩＬ−２の測定
図４から見られるとおり、非常に類似した結果が同じ上清におけるＩＬ−２濃度を測定することにより得られた。刺激なしで測定できる応答はないが、抗−ＣＤ３−特異的処理はすべてのグループにおいて確かに測定できるシグナルを誘導した。したがって、＞２００ｐｇ／ｍＬがＣｂｌ−ｂ−軽減されたグループにおいて測定された。Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌ−共軽減された集団におけるＩＬ−２濃度は再び低く、＜１００ｐｇ／ｍＬであった。抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８−特異的共刺激は同様に高いシグナルを生じた。＞８００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２濃度をｓｉＲＮＡ処理にかかわらずすべてのグループにおいて測定した。対照グループは１．３および１．４ｎｇ／ｍＬのＣｂｌ−ｂ−軽減された力価と非常に類似した力価を生じた。このアプローチにおいてｃ−Ｃｂｌのみを一つだけで使用するか、またはｃ−ＣｂｌをＣｂｌ−ｂと共に使用するかどうかにかかわらず、ｃ−Ｃｂｌ−特異的減衰後のＩＬ−２濃度が非常に低く、ほんの８００ｐｇ／ｍＬであったことは興味深い。
【００５３】
実施例７：免疫反応の一時的な増加
インビトロまたはエキソビボ処理により、Ｔ細胞反応性を効率的に増加させ、Ｔ細胞受容体のみの刺激を介して、Ｔ細胞の増殖を誘導することを可能にする。これは本明細書に記載されている治療的アプローチのための必須条件である。この減衰はＲＮＡｉ技術の使用による一時的な性質である。
これらの修飾された細胞の適用は、ワクチンの免疫原性を増加させ、そして、一般的に免疫系の反応性を増加させるために役立つ。基礎免疫の５日後、全血をＣＰＴチューブにおいて患者から取る。約２０分後、ＰＢＭＣを遠心分離により単離する。細胞製造物をＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトし、その後即座に患者に再移植する。１０日目、再び全血を取り、血清を抽出した。炎症前サイトカイン力価をこの血清において測定し、対照グループと比較した。誘導された免疫応答の性質は、また、Ｔｈ１−制御された免疫応答の細胞配向（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ１２力価の増加）またはＴｈ２−指向免疫応答における液性傾向（ＩＬ４、ＩＬ５およびＩＬ１０力価の増加）に関して分析される。必要なとき、ＰＢＭＣ治療を有するか、または有さない他の追加免疫を１４日間隔にて実施する（図５）。
【００５４】
実施例８：ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ１９Ｂ−細胞のヌクレオフェクション
ＰＢＭＣを上記のとおりに単離し、実施例３（Ｕ１４）と同じ条件下においてトランスフェクトした。トランスフェクションに対して使用されるオリゴ（ｓｉＧＬＯ ｒｅｄ）を２μＭの濃度において使用し、そして特定の摂取をＦＡＣＳにより検出した；ＣＤ４およびＣＤ８細胞の区別をＣＤ８−ＴＩＦＣおよびＣＤ３−ＡＰＣにて同時二重染色により実施した（図６Ａ）。
ＰＢＭＣを上記のとおりに製造し、それらのＣＤ８細胞を単離した。次に残りのＣＤ８−ネガティブ細胞を（３．３μＭのオリゴ濃度を有するが）上記のとおりにｓｉＧＬＯ ｒｅｄにて再びトランスフェクトした。特定の摂取をＣＤ３−ＦＩＴＣおよびＣＤ１９−ＡＰＣにて同時二重染色によりＦＡＣＳにより検出した（図６Ｂ）。使用されるオリゴの効率的な摂取が、また、主にＮＫ細胞からなるＣＤ３／ＣＤ１９−ネガティブリンパ球の画分において起こったことを、この実験において観察されたことは興味があることである。
したがって、この実施例は、他の免疫細胞を、また、ＣＤ８細胞と同じトランスフェクション条件下において非常に効率的にトランスフェクトすることができることを示す。
【００５５】
実施例９：ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおけるヒトＣＤ４細胞におけるＣｂｌ−ｂ発現の一時的な減少
ＣＤ４細胞をＣＤ８細胞の枯渇によりＰＢＭＣから単離し、ＰＨＡ／抗−ＣＤ３／２８刺激により培養した。２週間後、これらのＣＤ４細胞にＡｍａｘａトランスフェクションプロトコールを使用してＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした（実施例３および８、参照）。同一のバッチに対照バッチとして同一のプロトコールを使用して非特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を１日以上、ＩＬ−２（５ｎｇ／ｍＬ）と培養し、次の日、抗−ＣＤ３／２８にて刺激した。
トランスフェクトされた製造物におけるＣｂｌ−ｂ ｍＲＮＡ発現は刺激されたＣＤ４細胞における対照トランスフェクションと比較して、２４時間にて約８５％減少した（図７Ａ）。Ｃｂｌ−ｂ ｍＲＮＡにおける急激な減少は、ウエスタンブロットにおいて検出されるＣｂｌ−ｂのタンパク質の量において比較的強い減少と相関した（図７Ｂ）。
【００５６】
実施例１０：ＣＤ４Ｔ細胞反応性の増加−抗腫瘍活性を有するサイトカインの測定
Ｔ細胞−介在免疫応答におけるＣＤ４−細胞の主な役割の１つは炎症性サイトカインの生産である。本明細書では特にサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを挙げられている。
したがって、これらの３つのサイトカインの発現をＥＬＩＳＡにより同定した。抗−ＣＤ２／２８刺激の２４時間後、これら３つのサイトカインはヒトＣｂｌ−ｂ−サイレンスＣＤ４Ｔ細胞において有意に増加した（図８）。
【００５７】
実施例１１：抗腫瘍活性を有するサイトカインの生産の増加を介するＣＤ４Ｔ細胞反応性における増加の一時的な進行
Ｃｂｌ−ｂ−サイレンスＴ細胞の効率的な抗腫瘍活性を達成するために、Ｔ細胞刺激後の特定の期間にわたって維持することもサイトカイン生産の増加のために重要である。しかしながら、この期間は、また、患者の非悪性組織に対して望ましくない自己免疫を永久に確立する危険性を最小化するために限定すべきである。
【００５８】
したがって、ＩＦＮ−γの生産も種々の時間点においてＦＡＣＳにおける細胞内染色により分析した。図９の線図は、ＩＦＮ−γの著しい増加が少なくとも４８時間維持され、刺激６日後にそれが対照のレベルに相当するところまで戻ったことを明白に示す。
【００５９】
実施例１２：Ｔ細胞反応性の増加−機能特性および／または刺激マーカー機能を有する表面分子の発現の増加
ヒトＴ細胞におけるＣｂｌ−ｂの機能的に成功したサイレンシングに対するマーカーとしてのサイトカイン生産のそれぞれの測定は技術的にかなり複雑であり、したがって、それは時間的に近いため、実行不可能な傾向にある。したがって、ＦＡＣＳによる機能的に重要な表面マーカーの発現も測定した。
【００６０】
ＣＤ１０７ａは細胞毒性Ｔ細胞の分泌活性に対する表面マーカーとして本明細書において定義され、したがってＣＤ１０７ａを抗−ＣＤ３／２８刺激の２４時間後にＣｂｌ−ｂ−抑制されたＣＤ８Ｔ細胞において測定した。したがって、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトされたＴ細胞は非常に増加した分泌活性を現した（図１０Ａ）。
【００６１】
ＣＤ１０７ａ分子がＴ細胞における小胞輸送と関連しているため、それはＣＤ４Ｔ細胞の分泌活性に対する主マーカーとしても使用され得る。図１０Ｂは、Ｃｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡ−トランスフェクト細胞におけるＣＤ１０７ａの発現が、また、それ以外は同じように処理された対照細胞と比較して有意であったことを示す。
【００６２】
ＣＤ４０ＬおよびＩＣＡＭは、Ｔ細胞刺激により誘導され得る２つの他の表面分子である。これらの２つの分子（特に抗原提示細胞とＢ−細胞の刺激／増殖の相互作用に関するＣＤ４０Ｌ、抗原提示細胞と血管系から（悪性）組織への移動の相互作用に関するＩＣＡＭ）は機能的関連性の分子である。図１０Ｂはこれらの２つの表面分子の発現がＣｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡ−トランスフェクトされたヒトＣＤ４Ｔ細胞において有意に増加したことを示す。
【００６３】
Ｔ細胞反応性の増加に関与するここに記載されているメカニズムの１つは、細胞表面におけるＣＤ３−受容体のあまり顕著でない減衰である。図１０Ｂはさらに細胞表面におけるＣＤ３受容体の量がＣｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡ−トランスフェクトされたヒトＣＤ４Ｔ細胞において確かに増加したことを示す。
【００６４】
従来のＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の細胞表面発現が、また、確かに増加したが、ＣＤ２５の発現は変化していないままであることは興味深い。これは、ＣＤ２５が、また、刺激マーカーとして定義されるが、その機能はとりわけいわゆるＴ−制御性細胞の存在および生存と関連するため、特定の機能的関連性であるかもしれない。
【００６５】
全体的に、図１０は、したがって、さらに機能的に重要な分子または表面マーカーとして働く分子をＣｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡトランスフェクションにより細胞表面において明白に多量に検出することができることを示す。
【００６６】
実施例１３：Ｃｂｌ−ｂ−欠損Ｔ細胞および樹状細胞の関節移植はインビボ腫瘍モデルにおける有効な治療的方法である。
腫瘍を０．１ミリオンのＥＧ７ｏｖａ細胞の皮下注射により野生型マウスにおいて誘導させた。次にＣＤ８Ｔ細胞および樹状細胞を５および６日目に注入し、この養子細胞治療の効果を腫瘍の成長を測定することにより連続的に追跡した。図１１Ａは、腫瘍成長をＣｂｌ−ｂ−欠損Ｔ細胞の移植により野生型Ｔ細胞よりも非常に強く長期間にわたって抑制することができることを示す。
【００６７】
図１１Ｂは、また、Ｃｂｌ−ｂ−欠損Ｔ細胞における処理が８０日間の観察の終わりまで処理された大部分のマウスの長期生存を保証したことを示す。それとは対照的に、野生型Ｔ細胞における処理は、対照グループと比較して、平均寿命をほんのわずかに長く誘導した。したがって、図１１Ｂは、Ｃｂｌ−ｂ−欠損または抑制Ｔ細胞における処理が正常Ｔ細胞における処理と比較して顕著な利点を有することを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞の免疫応答を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
能動免疫はとても危うい感染症に対する総合的な戦いを初めて可能にさせ、いくつかの場合において、安価な非常に効率的な内因性防御メカニズムを使用して世界的な根絶を達成さえさせた。したがって、努力が種々の適応症に対する予防的および治療的ワクチン接種アプローチを開発するために費やされ、これからも費やされるであろう。しかしながら、効率的な免疫は免疫応答の誘導を必要とし、そしてそれは防御免疫を引き起こす。しかしながら、免疫抗原の免疫原性の欠如は起こるべき所望の効果の機能不全を引き起こす。非常に興味があり特異的な抗原製剤は、マラリア、ＨＩＶ、インフルエンザまたは腫瘍疾患（わずかな著名な例を挙げる）の予防および処置に対して、すでに開発されている。しかしながら、これらの処置は、例えば、免疫抗原の免疫原性の欠如により成功していない。さらに、広く使用されているワクチン、例えば、処置されたものの約８０％に対してのみ保護的な免疫応答力価を実際に構築するＢ型肝炎ワクチンでさえ、免疫原性の欠如の問題を引き起こす。免疫系の反応性の欠如に関する主な理由はこれらの抗原が“異物”として認識されないことである。哺乳動物において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される構造が内因性として認識されるか、または異物として認識されるかどうかを決定するものは主にＴ細胞である。免疫応答を誘導するため、本質的に２つの別々のシグナルが、互いに独立して、必要である。このメカニズムは免疫系のオーバーシュートを防止する。第１の必須条件は、Ｔ細胞受容体に関してＡＰＣにより提供される抗原を認識することである。これが起こらない場合、次にさらなる反応が起こらない。さらに、免疫応答の誘導のため、Ｔ細胞表面におけるＣＤ２８受容体と危険として抗原構造を分類したときのみＡＰＣにおいて発現されるＢ７の相互作用を有することは絶対的に必須である。最低限の免疫原性のみを有するワクチン接種抗原でのワクチン接種の場合、Ｂ７とＣＤ２８の間の連絡の相互作用を介する共刺激が起こらず、次に免疫応答を引き起こさないが、代わりにＴ細胞レベルにおいて耐性の発生を引き起こす。しかしながら、共刺激の必要性は酵素Ｅ３−ユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂをオフにすることにより迂回することができることが証明されている。この酵素が免疫反応のコントロールにおける決定的なスイッチである（Chiang et al., J Clin Invest (2007) doi:10.1172/JCI29472）。しかしながら、Ｃｂｌ−ｂの非存在下において、高い免疫原性である投与される物質は強い免疫応答の誘導を引き起こし得る。さらに、Ｃｂｌ−ｂ−欠損マウス（ホモ接合型遺伝子ノックアウト）は生存可能であり、それらの免疫系は効率的に自己誘発腫瘍を認識し、主にＣＤ８＋Ｔ細胞に基づく溶解免疫応答を構築することができる（Loeser et al., JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699）。しかしながら、記載されている酵素の完全な除去はスーパー抗原の免疫後の自己免疫の増加も引き起こす。したがって、Loeser et al.は、負の調節因子としてＣｂｌ−ｂがＴ細胞の“免疫反応”に関与することを示すことができている。
【０００３】
特定の遺伝子発現の減衰のためのＳｉＲＮＡ技術は、また、すでに低い効率を有するＣｂｌ−ｂに関して記載している。ＵＳ２００７／００８７９８８はＨＰＫ１を調節するための方法、この発現をＣｂｌ−ｂ発現を増加させることにより増加させることができる（逆もまた同様（例えば、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡの阻害により））ことに関する。
【０００４】
ＵＳ２００７／００５４３３５５はＣｂｌ−ｂペプチドおよびＣｂｌ−ｂ−関連タンパク質、特にＰＯＳＨならびにＣｂｌ−ｂ−関連疾患の処置のためのそれらの使用を記載している。
【０００５】
ＷＯ２００４／０７８１３０Ａ２はＰＯＳＨ−関連疾患、例えば、ウイルス性疾患、癌および神経障害の処置のための組成物に関する。ＰＯＳＨはＣｂｌ−ｂを含む複数のＰＯＳＨ−関連タンパク質と共に利用することができる。
【０００６】
ＵＳ２００６／０２９２１１９Ａ１は細胞における負の免疫調節因子の阻害により免疫細胞の免疫応答を増加させる方法に関する。このような負の免疫調節因子は、例えば、ユビキチン化、脱ユビキチン化およびスモイル化による分子安定性と関連するタンパク質ならびにＮＦｋＢ阻害因子の発現を阻害する転写因子またはＮＦｋＢ標的遺伝子の転写の抑制因子から選択される。
【０００７】
しかしながら、臨床的適用のためのＣｂｌ−ｂメディエーターの使用は記載されていない。したがって、本発明の１つの目的は、免疫反応を調節するための方法を利用できるようにし、実用化することである。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明は免疫系の細胞のＣｂｌ−ｂ機能を減少させるか、または阻害して、それにより抗原に対する細胞の免疫反応を増加させることを含む、抗原と接触した免疫系の細胞の免疫反応を増加させるインビトロまたはエキソビボにおける方法に関する。
【０００９】
Ｃｂｌ−ｂ遺伝子およびその遺伝子産物は関連分野において詳細に記載されている（UniGene Id. Hs.3144 and Hs. 381921）。Ｃｂｌ−ｂ配列は、例えば、アクセッション番号ＮＭ＿００８２７９およびＮＰ＿００９１１２の下に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公開されている。抗−Ｃｂｌ−ｂ抗体、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス阻害因子は市販されている。特定のｓｉＲＮＡはＣｂｌ−ｂ発現、したがってＣｂｌ−ｂ機能をも減少させるか、または阻害するために適当であり、混合ＲＮＡ／ＤＮＡヌクレオチドと共にＵＳ２１００７／００５４３５５に記載されており、例えば、約２０塩基長である。
【００１０】
自己免疫反応の誘導を引き起こすことができる免疫系の過剰反応の危険性を中和するために、例えば、Ｔ細胞におけるＣｂｌ−ｂ機能の阻害／ノックアウトを正確に定義された期間においてのみ実施することができる。したがって、与えられた免疫抗原に対して特異的な免疫応答の発生をサポートするための限定された期間のみ、制御されている方法においてＣｂｌ−ｂを軽減するが、即座に“正常”の免疫学的状態に回復させることにより自己免疫性疾患を防止することが、アジュバント治療的ワクチン接種アプローチのために必須である。したがって、本発明にしたがって、免疫系の単離された細胞の特定の選択物のみをインビトロまたはエキソビボにて処理し、次に患者に戻す。したがって、インビトロまたはエキソビボにおける効率的なＣｂｌ−ｂ減衰のための１つのアプローチは、免疫反応を増加させるための必須条件である。
【００１１】
Ｃｂｌ−ｂ機能をＣｂｌ−ｂの発現を減少させるか、または阻害することにより、好ましくは減少させるか、または阻害する。減少または阻害なる用語は、機能の完全な阻害までの、変化していない天然機能と比較してＣｂｌ−ｂの機能（および／または発現）における減少に関する。機能（および／または発現）を好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少させる。
【００１２】
好ましい態様において、Ｃｂｌ−ｂの機能を好ましくは一時的に減少させるか、または阻害する。言い換えれば、該機能を上記のとおり一時的にのみ減少させ、次に、例えば、阻害因子、例えば、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡの消費もしくは崩壊または非−Ｃｂｌ−ｂ−異常細胞の新生（インビボ）により回復することができる。免疫細胞におけるＣｂｌ−ｂの一時的な減少も、例えば、治療的成功が達成されるまで、繰り返し達成することができる。
【００１３】
Ｃｂｌ−ｂの発現を好ましくはＣｂｌ−ｂアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用することにより減少させるか、または阻害する。この目的のため、それら同士がハイブリダイズし、それによりそれらを不活性化できるように、標的（Ｃｂｌ−ｂ）ｍＲＮＡ配列の部分に相補的である短鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列を使用する。これらの配列の長さは好ましくは少なくとも１５、１８、２０、２２、２５、２８、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０または２００塩基、最大で完全な標的配列、好ましくは最大で２５０２、２０００、１５００、１０００、５００または３００塩基である。配列番号１、２、３、４、５、６、７および／または８の配列を好ましくは使用する。
【００１４】
同様に、Ｃｂｌ−ｂの機能を複数の他の既知の因子により、例えば、Ｃｂｌ−ｂアンタゴニスト因子、阻害因子、特にアプタマーまたはイントラマーを使用することにより、減少させるか、または阻害することができる。Ｃｂｌ−ｂの効果および／または機能を抑制するすべてのアンタゴニスト因子または阻害因子が、また、細胞の免疫反応を増加させるために本発明にしたがって使用され得る。アンタゴニスト因子または阻害因子は、好ましくはインビトロ、エキソビボ、または、さらにインビボにて免疫系の細胞の免疫反応性を増加させるための医薬品を製造するために使用される。これは、抑制された、または非効率的な免疫系を有する疾患、特に癌の処置、ならびにインビボまたはエキソビボにて免疫系の細胞と接触させることができる（ワクチン接種）抗原に対する免疫応答の増加を可能にする。
【００１５】
本発明は、また、特にｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用することにより、好ましくは一時的な減少または阻害により、細胞のｃ−Ｃｂｌ機能を減少させるか、または阻害して、抗原に対する細胞の免疫反応を減少させることを含む、免疫系の細胞の免疫反応を減少させる方法に関する。免疫反応を増加させるために、Ｃｂｌ−ｂと一緒にｃ−Ｃｂｌを軽減することは絶対的に必要ではない。実施例に示されているとおり、代わりにｃ−Ｃｂｌの減衰はＣｂｌ−ｂの阻害により達成される効果の逆転を引き起こす。したがって、Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌはアンタゴニスト機能を有する。Ｃ−Ｃｂｌは、また、その減衰が免疫寛容の増加を引き起こすという、Ｔ細胞反応性の微調節においてこれまでに未知の機能を果たす。したがって、ｃ−Ｃｂｌ機能の減少または阻害は免疫抑制に対して適当であり、したがって、例えば、炎症またはアレルギーにおいてその使用を可能にする。減衰の程度および方向がＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌ（本明細書に記載されているＣｂｌ−ｂと類似）の減少または阻害において用量に依存するため、両方の因子を一緒にこれらの機能において減少させ得る。免疫反応を増加させるために、Ｃｂｌ−ｂの減少はｃ−Ｃｂｌの減少より重要である（逆もまた同様）。Ｃ−ＣｂｌアンチセンスまたはｓｉＲＮＡはＣｂｌ−ｂに対する上記のものと同じ配列系を有し得る。配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および／または１６の配列を好ましくは使用する。
【００１６】
特別な態様において、抗原を取り込み、好ましくは抗原フラグメントを提示するか、または、より良くは、ＨＬＡに関連する抗原フラグメントを認識し、それにより活性化される細胞を特に使用する。
【００１７】
好ましい態様において、本発明において使用される細胞は、抗原提示細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージおよび／または樹状細胞、特にＴ−リンパ球、ＣＤ８＋Ｔ−リンパ球、ＣＤ４＋Ｔ−リンパ球、特にＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇｓ（制御性Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞毒性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。同様に、一般的にＣＤ３／ＣＤ１９−陰性リンパ球も使用することができる。ＮＫ細胞はとりわけそれらの好ましいグループを形成する。抗原は好ましくは細胞に取り込まれ、そして細胞は抗原、好ましくは抗原フラグメントを提示する。ＰＢＭＣおよびＴ細胞は、とりわけ強い抗原−特異的反応を誘導するために処置に対する組合せにおいてとりわけ好ましい。他の態様において、特に免疫反応を全体的に増加するために（例えば、免疫不全を処置するために）、種々のＴ細胞は単独にて広範な効果を達成するために十分である。本発明の免疫反応の増加は好ましくはこれらの細胞、特にＣＤ８またはＣＤ４細胞ならびにＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞が介在する。
【００１８】
エレクトロポレーションは好ましくは細胞、特にＴ細胞またはＮＫ細胞のＣｂｌ−ｂ阻害因子、例えば、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡまたはノックアウトＣｂｌ−ｂ構築物とのトランスフェクションのために使用される。トランスフェクション、すなわち、Ｃｂｌ−ｂの阻害を引き起こすあらゆる培地がこの目的のために適当である。Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ、＃３１９８５−０４７）はこのような培地の１つの例である。
【００１９】
加えて、細胞を、また、免疫刺激物質、例えば、免疫刺激サイトカインまたは他の免疫刺激受容体（例えば、ＴＬＲ、トール様受容体）のリガンドまたは表面分子、好ましくはＣＤ３および／またはＣＤ２８に対する抗体にて処理、すなわち、刺激し、細胞による免疫応答を促進し得る。
【００２０】
Ｃｂｌ−ｂの阻害は、また、樹状細胞ワクチン接種、好ましくは抗腫瘍ワクチン接種の一部として使用され得る。
【００２１】
あるいは、および／または、加えて、Ｃｂｌ−ｂ−阻害細胞と好ましくは腫瘍（細胞）抗原にて負荷された、患者から得られる樹状細胞のインビトロ共培養を阻害する細胞も本発明の目的のための共培養に使用することが可能である。
【００２２】
本明細書において使用される“ワクチン接種”は、絶対的な感覚にて−すなわち、免疫系により絶対的な保護を引き起こす免疫原の投与−ではなく、むしろ免疫学的投与として免疫系による保護を増加させる、および／またはワクチン抗原に対する免疫系、特にそれらの細胞を活性化するとして理解するべきである。
【００２３】
１つの特定の局面において、本発明は、患者の免疫系の細胞を単離し、Ｃｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子を使用することによりインビトロまたはエキソビボにおける免疫反応を増加させ、そして患者に細胞を再移植することを含む、患者における抗原に対する免疫反応を増加させる、および／または免疫反応それ自体を増加させるための医薬組成物の製造のためのＣｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子の使用であって、免疫反応は細胞のＣｂｌ−ｂ機能の減少または阻害により増加される使用に関する。
【００２４】
ワクチン接種、抗原の投与と同時に、好ましくは限定された期間の免疫反応の増加の実行は、循環Ｔ細胞のごく一部においてＣｂｌ−ｂ発現を減少させることにより誘導することができる。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）は患者の骨髄からの全血および／または血液細胞および腫瘍組織それ自体（ＴＩＬ）から得られ、理想的にはあらかじめ数日間、例えば、５日間免疫化され、インビトロまたはエキソビボにてＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ減衰バッチで処理されている。この方法は非常に迅速に実施される。理想的な場合において、この細胞製造物は取り出されたほんの数分後に再び患者に投与され得る。細胞は所望により細胞が再移植される前にそれぞれの細胞に対して適当であるエキソ−ビボ−刺激プロトコールにより増殖または拡大され得る。ほんの数パーセントの患者のＴ細胞集団を示すインビトロにて活性化されたＴ細胞は、受容者で循環している間にリンパ節において抗原提示細胞と出会うと、これらの抗原提示細胞はすでに起こっている免疫により抗原を取り込み、そこに移動する。インビトロにて処理されたＴ細胞は共刺激シグナルを必要としないため、それらは免疫抗原の認識後に即座に急増し、細胞レベルおよび体液レベルの両方における免疫応答の誘導に全身的に寄与するサイトカインを分泌する。このバッチによって、弱い免疫原性抗原でさえ長期免疫保護の確立を引き起こす。同様に、癌患者における自己腫瘍の拒絶反応はこの方法において誘導することができる。受動免疫法、例えば、腫瘍−抗原−特異的抗体と組み合わせた化学療法／放射線治療の一つおよび／または同時のいずれかにて使用され、Ｃｂｌ−ｂアンタゴニスト因子は免疫反応を増加させる。
【００２５】
したがって、この方法を、所望により疾患特異的抗原の選択と共に先天性または後天性免疫不全、特にＡＩＤＳ、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、薬物誘導免疫抑制または癌を処置するために使用する。固形腫瘍を含む癌の処置が特に好ましい。
【００２６】
処置の成功のチャンスを増加させるため、癌の処置は好ましくは別の抗腫瘍治療、特に化学療法、放射線治療、治療的生体細胞または樹状細胞（腫瘍）ワクチン接種の投与と組み合わせて投与される。Ｃｂｌ−ｂの阻害を樹状細胞ワクチン接種、好ましくは抗腫瘍ワクチン接種の一部として使用することができる。あるいは、および／または加えて、Ｃｂｌ−ｂ−阻害細胞と好ましくは腫瘍（細胞）抗原にて負荷された、患者から得られる樹状細胞のインビトロ共培養ならびに本発明の目的のための共培養の使用も可能である。
【００２７】
インビトロまたはエキソビボにおける免疫反応の増加は上記のとおりの治療方法において実施され得、細胞は細胞の除去前または後に所望により抗原に暴露される。
【００２８】
免疫抗原の提示、抗原提示細胞によるそれらの摂取およびさらに取り込まれた物質を活性化Ｔ細胞に提示する局所リンパ節へのこれらの細胞の移動の時間的順序も、治療的実施において重要である。したがって、患者は、より好ましくは細胞の単離前、特に好ましくは細胞の単離の少なくとも１、２、３、４または５日および／または最大２０、１６、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１週間前に好ましくは抗原を接種する。あるいは、インビトロまたはエキソビボにおける抗原を有する細胞の次のワクチン接種または処理も可能にする。
【００２９】
加えて、好ましくは患者由来であり、対応する抗原と接触し、次にＣｂｌ−ｂ−阻害免疫細胞、好ましくはＴ細胞の投与と一緒または投与のすぐ前もしくは後のいずれかにて特異的な免疫反応の増加に寄与することができる、抗原提示細胞も使用することができる。
【００３０】
該細胞は好ましくは特定の抗原または特定の抗原を含む細胞に対して特異的であり、抗原の特異性または存在に対して選択され、選択された細胞の免疫反応を増加させる。免疫を増加させる特異性を有する特定の抗原および／または細胞の選択を介して、免疫応答は標的方法で患者における特定の標的に対して指向させることができる。このような標的は特に腫瘍（少なくとも１個以上の腫瘍抗原の選択を介する）または病原体である。
【００３１】
細胞の分離と平行して、トランスフェクションバッチにおける対応するｓｉＲＮＡが同じ滅菌使い捨てチューブ中に置かれていることが考えられる。したがって、他の局面において、本発明は、特に抗原に対する免疫系の細胞の免疫反応を増加させるためのＣｂｌ−ｂ阻害因子を含む、好ましくは滅菌容器、例えば、使い捨てチューブに関する。
【００３２】
同様に、本発明は、特に本発明の方法により抗原に対する免疫系の細胞の免疫反応を増加させるための、免疫系の細胞を保持するための容器、特に使い捨てチューブ、ならびにＣｂｌ−ｂ阻害因子、例えば、ｓｉＲＮＡを含むキットを提供する。
【００３３】
容器および／またはキットは、また、さらに刺激を増加させるための、免疫刺激物質、好ましくはサイトカインまたは他の受容体（例えば、ＴＬＲ）のリガンドまたは表面分子、好ましくはＣＤ３および／またはＣＤ２８に対する抗体を含み得る。同様に、キットまたは容器は、また、安定化成分、培地またはバッファー（細胞の安定化のため）、トランスフェクションまたはヌクレオフェクション(nucleofection)溶液、好ましくは細胞培地、例えば、ＲＰＭＩまたはＯｐｔｉｍｅｍを含み得る。
【００３４】
本発明は下記図および実施例（それらに限定されない）により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は共刺激による（ａ）、Ｃｂｌ−ｂ発現の減衰の場合において、Ｔ細胞受容体の単独刺激による（ｃ）、通常、活性化を引き起こさない（ｂ）Ｔ細胞活性化の簡略化された概略図を示す；
【００３６】
【図２】図２はＣｂｌ−ｂ発現のウエスタンブロット分析を示す。ＣＤ８＋細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、Ｃｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトし、培地に維持し、そして抗−ＣＤ３刺激または抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８刺激後に刺激なしの対照グループと比較した。Ｆｙｎをローディング対照として使用した；
【００３７】
【図３】図３はｓｉＲＮＡ処理２日後のヒトＣＤ８＋細胞のＩＦＮ−γ分泌を示す。ＩＦＮ−γ濃度を刺激（培地）なし（左）、ＣＤ３−特異的共刺激（中央）後またはＣＤ３およびＣＤ２８−特異的共刺激（右）後のＣＤ８＋Ｔ細胞の上清において測定した。非特異的ｓｉＲＮＡ（１つ目の棒）、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ（２つ目の棒）、ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（３つ目の棒）ならびにＣｂｌ−ｂ−特異的およびｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（４つ目の棒）の手段によりトランスフェクトされた２日齢細胞集団を比較した；
【００３８】
【図４】図４はｓｉＲＮＡ処理２０日後のヒトＣＤ８＋細胞のＩＬ−２分泌を示す。ＩＬ−２濃度を刺激（培地）なし（左）、ＣＤ３−特異的刺激（中央）後またはＣＤ３およびＣＤ２８−特異的共刺激（右）後のＣＤ８＋Ｔ細胞の上清において測定した。非特異的ｓｉＲＮＡ（１つ目の棒）、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ（２つ目の棒）、ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（３つ目の棒）ならびにＣｂｌ−ｂ−特異的およびｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡ（４つ目の棒）の手段によりトランスフェクトされた２日齢細胞集団を比較した；
【００３９】
【図５】図５は免疫反応を増加させるためのインビトロＣｂｌ−ｂ減衰バッチの時間的順序を示す；
【００４０】
【図６】図６はＰＢＭＣから単離されたヒトＴ細胞によるｓｉＲＮＡ摂取（Ａ）およびＣＤ８−細胞−枯渇ＰＢＭＣによるｓｉＲＮＡ摂取（Ｂ）を示す；
【００４１】
【図７】図７はＲＮＡｉ後のＣｂｌ−ｂ ｍＲＮＡ発現（Ａ）およびウエスタンブロットにおけるＲＮＡｉ後の生産されたＣｂｌ−ｂ タンパク質の量（Ｂ）を示す；
【００４２】
【図８】図８はＣｂｌ−ｂ阻害後のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２生産を示す；
【００４３】
【図９】図９は時間プロフィールとしてＣｂｌ−ｂ阻害後のＩＦＮ−γ生産を示す；
【００４４】
【図１０】図１０はＣＤ１０７ａ＋ＣＤ６９（Ａ）、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ３、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＡＭ（Ｂ）マーカー発現により測定されるＴ細胞反応性の増加を示す。
【００４５】
【図１１】図１１Ａは治療用ＣＤ８細胞におけるＣｂｌ−ｂ抑制有り／無しの処理後のマウスにおける腫瘍成長；Ｂは処理後のＥＧ７ｏｖａ腫瘍を有するマウスの死亡率を示す。
【実施例】
【００４６】
実施例：
実施例１：配列
以下のｓｉＲＮＡ配列を、単独または組み合わせて、Ｃｂｌ−ｂを阻害するために使用した：
１． センス配列：
Ｇ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号２）
２． センス配列：
Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号３）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号４）
３． センス配列：
Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号５）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号６）
４． センス配列：
Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号７）
アンチセンス配列：
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号８）
以下のｓｉＲＮＡ配列を、単独または組み合わせて、ｃ−Ｃｂｌを阻害するために使用した：
１． センス配列
Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号９）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ｇ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｕ（配列番号１０）
２． センス配列
Ｇ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｕ （配列番号１１）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号１２）
３． センス配列
Ｕ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｃ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１３）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｇ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｇ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１４）
４． センス配列
Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｇ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ａ．Ｕ．Ｕ（配列番号１５）
アンチセンス配列
５’−Ｐ．Ｕ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｃ．Ｕ．Ｃ．Ｃ．Ｕ．Ｕ（配列番号１６）
【００４７】
実施例２：Ｃｂｌ−ｂ発現における一時的な減少
この実施例において、Ｔ細胞の免疫反応がエキソビボにて影響され得ることを示す。
全血をＣＰＴチューブ（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）を使用することによりドナーから取り出し、ＰＢＭＣを遠心分離により分離した。別の工程において、この製造物からＣＤ８＋細胞を濃縮した。これらをＡｍａｘａトランスフェクション装置（実施例３に詳細なプロトコール）を使用するＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡの手段によりトランスフェクトし、さらに培養した。非特異的ｓｉＲＮＡを有する同一のバッチをＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡの手段により同一のプロトコールを使用してトランスフェクトし、対照としてさらに培養した。Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌの機能の可能性のある重複を推測するため、他の２つのバッチをｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡならびにｃ−Ｃｂｌ−特異的およびＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡの組合せにより処理した。すべてのバッチを２日間培養した。トランスフェクションがＣｂｌ−ｂ発現の所望の減衰を引き起こした事実は、後のウエスタンブロット分析により証明した。Ｃｂｌ−ｂ発現を誘導するために、培養物をＣＤ３にて、別のバッチにおいてＣＤ３−特異的およびＣＤ２８−特異的抗体にて刺激した。すべての実験において、トランスフェクトされた製造物におけるＣｂｌ−ｂ発現は、図２に示されるとおり、対照トランスフェクションの強度の５％未満にさせた。ｓｉＲＮＡの安定性および結果としての発現の効率的な抑制は限定期間であり、他の細胞に伝達されないため、選択されるバッチはＣｂｌ−ｂ発現の一時的な減衰であり、これはＣｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡの存在に正確に拘束されている。
【００４８】
実施例３：トランスフェクションプロトコール
ヒトＴ細胞におけるｓｉＲＮＡのヌクレオフェクション
ヌクレオフェクションを別のラボアシスタントと共に行うことにより実施する。一人がｓｉＲＮＡオリゴのピペッティングを行い、もう一人が試料を培養培地に移す。これは該処理を有意に加速させる。
１． 細胞のための培地を製造する、ＲＰＭＩ（＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、＋Ｌ−ｇｌｕｔ、＋１０％ＦＣＳ）。
２． 培養培地を少なくとも２つの５０ｍＬＦａｌｃｏｎチューブ／構造物に（ヌクレオフェクトされた細胞を回収するために１つ、および細胞洗浄培地のために１つ）ピペットで取り、そして１ｍＬ／Ｌのヌクレオフェクション試料をそれぞれのチューブにピペットで取る。チューブを３７℃にさらす。
３． それぞれのヌクレオフェクション試料に対してＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに印を付ける。
４． ７分間ヌクレオフェクト細胞を遠心し（４１０ｇ）、上清を取り除く。Ｏｐｔｉｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ、＃３１９８５−０４７）を加える。
５． 細胞密度が４０×１０６／ｍＬとなる。それぞれのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに１００μＬ（＝４×１０６細胞）をピペットで取る。
６． ヌクレオフェクション直前に１．５−２．５μＭのｓｉＲＮＡ−オリゴを細胞を含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに加える。ピペッティングにより混合し、溶液を細胞に移す（気泡を発生させない）。テーブルに細胞を軽くたたき、気泡を取り除く。
７． ふたを閉め、細胞をＡｍａｘａトランスフェクションデバイス（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）に置く。（Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を使用して最良の選択としてＰｒｏｇｒａｍ Ｕ−１４を行い、Ｖ−２４は行わない）。ｘ−ボタンを押し、ＯＫシグナル後に細胞を取り出す。（次のエレクトロポレーション前に再びｘ−ボタンを押す）。
８． 即座に５００μＬのＲＰＭＩ（３７℃）をヌクレオフェクション細胞に加え、パスツールピペットを使用してピペッティングすることにより注意深く混合する。細胞を回収するＦａｌｃｏｎチューブに移す。細胞を５００μＬのあらかじめ加熱したＲＰＭＩにて１回洗浄し、細胞の残りを回収するＦａｌｃｏｎチューブに移す。
９． それぞれのサンプルにおいて工程５−７を繰り返す。
１０． すべての試料がヌクレオフェクトされるまでＦａｌｃｏｎチューブをインキュベーターに置く。
１１． ４ｍＬの細胞懸濁液を６−ウェルプレートウェル（＝２試料）にピペットで取り、プレートをインキュベーターに置く。
１２． 次の日、細胞を回収し、それらをカウントし、上記のとおりに実施されたヌクレオフェクション後２４時間の培養を開始する。ＲＮＡの単離のために一定量の細胞を取り、標的遺伝子が活性化の時点で下方調節されているかどうかをチェックする。タンパク質試料をタンパク質発現動力学に基づいて取る。
【００４９】
実施例４：ヌクレオフェクション効率
ＣＤ８＋を上記のとおりヒト末梢血から単離した。ネガティブ選択をビーズを使用して実施した。
結果（Ａｍａｘａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）：
集団の純度：ＣＤ８＋ ９７％（ＦＡＣＳ）
【表１】
Ｏｐｔｉｍｅｍでの実験：
【表２】
したがって、確かにＣｂｌ−ｂの発現の減少をタンパク質化学において検出した。
【００５０】
実施例５：Ｔ細胞反応性の一時的な増加−ＩＦＮ−γの測定
したがって、ヒトＣＤ８＋細胞におけるＣｂｌ−ｂ発現を効率において少なくとも９５％抑制することができることを証明した。別の結果として、今回、Ｔ細胞集団の反応性も増加させることができることを証明した。所望の効果がもっぱらＣｂｌ−ｂ−特異的であり、所望の効果をｃ−ＣｂｌによるＣｂｌ−ｂ発現の減衰の場合には迂回することができないことを確認するため、別のアプローチにおいてｃ−Ｃｂｌを軽減させ、そして第３のバッチにおいてｃ−ＣｂｌおよびＣｂｌ−ｂを軽減させた。すべてのこれらのＣＤ８＋細胞培養物を２日間培養し、ＣＤ３、また、ＣＤ３およびＣＤ２８により刺激し、非刺激グループと比較した。通常、Ｔ細胞は急増するためにＣＤ３およびＣＤ２８の共刺激が必要であり、これは培養物の上清における炎症性サイトカインの分泌により容易に検出することができる。このＴ細胞活性化を検出するために、上清におけるＩＦＮ−γ力価を測定した。Ｔ細胞反応性におけるｓｉＲＮＡ処理による発現の減衰の影響の図を図３に示す。トランスフェクション２日後、すべてのＣＤ８＋細胞培養物をＣｂｌ−ｂおよび／またはｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトし、記載されているとおりに刺激し、非特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトした対照グループと比較した。非刺激細胞は本質的にＩＦＮ−γ発現をしなかった。ＣＤ３のみ刺激後、すべての培養物は、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを上清において検出できるように、高められた反応性を有した。ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡおよび非特異的にトランスフェクトされた細胞に対するシグナルは非常に類似する（低い）ものであった。Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトされた細胞のみが、約３ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ力価と関連する非常に高い反応性を有した。しかしながら、ｃ−Ｃｂｌ−およびＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにより共トランスフェクトされた細胞製造物の反応性は、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡ処理後のものより低く、わずか１．２ｎｇ／ｍＬであった。すべての場合において、ＣＤ３−およびＣＤ２８−特異的共刺激は、予想通り、ＣＤ３−特異的刺激のみよりも確かに高いシグナルを生じた。非特異的ｓｉＲＮＡにて処理された対照製造物は１．２ｎｇ／ｍＬの量のＩＦＮ−γ力価を生じたが、Ｃｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにて処理された培養物は３．８ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ濃度を有した。Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌ−特異的に共軽減された培養物は、Ｃｂｌ−ｂ−軽減されたグループのものよりもさらに低い１．７ｎｇ／ｍＬの力価を有したことは、注目すべきものであった。ｃ−Ｃｂｌ−特異的ｓｉＲＮＡにて処理された細胞集団が有意に低い反応性を有し、わずか５００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γが上清において測定されたことも予期しないことであった。この濃度は非特異的に処理された共刺激された対照グループのものより有意に低く、抗−ＣＤ３のみにて刺激された対照グループの値に相当する。したがって、マウス系と対照的に、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌの冗長は実験的に排除され、Ｃｂｌ−ｂ（および、その上流調節因子）を介するが、Ｃｂｌ−ｂ／ｃ−Ｃｂｌ組合せを介さない治療的アプローチが免疫反応を増加させるために適当である。しかしながら、ｃ−Ｃｂｌの阻害は他の適用のための免疫−抑制、例えば、炎症またはアレルギーの処置を可能にする。
【００５１】
単剤治療またはワクチン接種との組合せのいずれかとして設計されるこの同時治療的アプローチは、また、末梢にて播種性腫瘍細胞を認識し、免疫応答を構築することにより結局はそれらと闘うことができる。癌を診断された後即座に使用するとき、原発性腫瘍の転移もそれにより防止される。
【００５２】
実施例６：Ｔ細胞反応性の一時的な増加−ＩＬ−２の測定
図４から見られるとおり、非常に類似した結果が同じ上清におけるＩＬ−２濃度を測定することにより得られた。刺激なしで測定できる応答はないが、抗−ＣＤ３−特異的処理はすべてのグループにおいて確かに測定できるシグナルを誘導した。したがって、＞２００ｐｇ／ｍＬがＣｂｌ−ｂ−軽減されたグループにおいて測定された。Ｃｂｌ−ｂおよびｃ−Ｃｂｌ−共軽減された集団におけるＩＬ−２濃度は再び低く、＜１００ｐｇ／ｍＬであった。抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８−特異的共刺激は同様に高いシグナルを生じた。＞８００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−２濃度をｓｉＲＮＡ処理にかかわらずすべてのグループにおいて測定した。対照グループは１．３および１．４ｎｇ／ｍＬのＣｂｌ−ｂ−軽減された力価と非常に類似した力価を生じた。このアプローチにおいてｃ−Ｃｂｌのみを一つだけで使用するか、またはｃ−ＣｂｌをＣｂｌ−ｂと共に使用するかどうかにかかわらず、ｃ−Ｃｂｌ−特異的減衰後のＩＬ−２濃度が非常に低く、ほんの８００ｐｇ／ｍＬであったことは興味深い。
【００５３】
実施例７：免疫反応の一時的な増加
インビトロまたはエキソビボ処理により、Ｔ細胞反応性を効率的に増加させ、Ｔ細胞受容体のみの刺激を介して、Ｔ細胞の増殖を誘導することを可能にする。これは本明細書に記載されている治療的アプローチのための必須条件である。この減衰はＲＮＡｉ技術の使用による一時的な性質である。
これらの修飾された細胞の適用は、ワクチンの免疫原性を増加させ、そして、一般的に免疫系の反応性を増加させるために役立つ。基礎免疫の５日後、全血をＣＰＴチューブにおいて患者から取る。約２０分後、ＰＢＭＣを遠心分離により単離する。細胞製造物をＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトし、その後即座に患者に再移植する。１０日目、再び全血を取り、血清を抽出した。炎症前サイトカイン力価をこの血清において測定し、対照グループと比較した。誘導された免疫応答の性質は、また、Ｔｈ１−制御された免疫応答の細胞配向（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ１２力価の増加）またはＴｈ２−指向免疫応答における液性傾向（ＩＬ４、ＩＬ５およびＩＬ１０力価の増加）に関して分析される。必要なとき、ＰＢＭＣ治療を有するか、または有さない他の追加免疫を１４日間隔にて実施する（図５）。
【００５４】
実施例８：ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ１９Ｂ−細胞のヌクレオフェクション
ＰＢＭＣを上記のとおりに単離し、実施例３（Ｕ１４）と同じ条件下においてトランスフェクトした。トランスフェクションに対して使用されるオリゴ（ｓｉＧＬＯ ｒｅｄ）を２μＭの濃度において使用し、そして特定の摂取をＦＡＣＳにより検出した；ＣＤ４およびＣＤ８細胞の区別をＣＤ８−ＴＩＦＣおよびＣＤ３−ＡＰＣにて同時二重染色により実施した（図６Ａ）。
ＰＢＭＣを上記のとおりに製造し、それらのＣＤ８細胞を単離した。次に残りのＣＤ８−ネガティブ細胞を（３．３μＭのオリゴ濃度を有するが）上記のとおりにｓｉＧＬＯ ｒｅｄにて再びトランスフェクトした。特定の摂取をＣＤ３−ＦＩＴＣおよびＣＤ１９−ＡＰＣにて同時二重染色によりＦＡＣＳにより検出した（図６Ｂ）。使用されるオリゴの効率的な摂取が、また、主にＮＫ細胞からなるＣＤ３／ＣＤ１９−ネガティブリンパ球の画分において起こったことを、この実験において観察されたことは興味があることである。
したがって、この実施例は、他の免疫細胞を、また、ＣＤ８細胞と同じトランスフェクション条件下において非常に効率的にトランスフェクトすることができることを示す。
【００５５】
実施例９：ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおけるヒトＣＤ４細胞におけるＣｂｌ−ｂ発現の一時的な減少
ＣＤ４細胞をＣＤ８細胞の枯渇によりＰＢＭＣから単離し、ＰＨＡ／抗−ＣＤ３／２８刺激により培養した。２週間後、これらのＣＤ４細胞にＡｍａｘａトランスフェクションプロトコールを使用してＣｂｌ−ｂ−特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした（実施例３および８、参照）。同一のバッチに対照バッチとして同一のプロトコールを使用して非特異的ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を１日以上、ＩＬ−２（５ｎｇ／ｍＬ）と培養し、次の日、抗−ＣＤ３／２８にて刺激した。
トランスフェクトされた製造物におけるＣｂｌ−ｂ ｍＲＮＡ発現は刺激されたＣＤ４細胞における対照トランスフェクションと比較して、２４時間にて約８５％減少した（図７Ａ）。Ｃｂｌ−ｂ ｍＲＮＡにおける急激な減少は、ウエスタンブロットにおいて検出されるＣｂｌ−ｂのタンパク質の量において比較的強い減少と相関した（図７Ｂ）。
【００５６】
実施例１０：ＣＤ４Ｔ細胞反応性の増加−抗腫瘍活性を有するサイトカインの測定
Ｔ細胞−介在免疫応答におけるＣＤ４−細胞の主な役割の１つは炎症性サイトカインの生産である。本明細書では特にサイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを挙げられている。
したがって、これらの３つのサイトカインの発現をＥＬＩＳＡにより同定した。抗−ＣＤ２／２８刺激の２４時間後、これら３つのサイトカインはヒトＣｂｌ−ｂ−サイレンスＣＤ４Ｔ細胞において有意に増加した（図８）。
【００５７】
実施例１１：抗腫瘍活性を有するサイトカインの生産の増加を介するＣＤ４Ｔ細胞反応性における増加の一時的な進行
Ｃｂｌ−ｂ−サイレンスＴ細胞の効率的な抗腫瘍活性を達成するために、Ｔ細胞刺激後の特定の期間にわたって維持することもサイトカイン生産の増加のために重要である。しかしながら、この期間は、また、患者の非悪性組織に対して望ましくない自己免疫を永久に確立する危険性を最小化するために限定すべきである。
【００５８】
したがって、ＩＦＮ−γの生産も種々の時間点においてＦＡＣＳにおける細胞内染色により分析した。図９の線図は、ＩＦＮ−γの著しい増加が少なくとも４８時間維持され、刺激６日後にそれが対照のレベルに相当するところまで戻ったことを明白に示す。
【００５９】
実施例１２：Ｔ細胞反応性の増加−機能特性および／または刺激マーカー機能を有する表面分子の発現の増加
ヒトＴ細胞におけるＣｂｌ−ｂの機能的に成功したサイレンシングに対するマーカーとしてのサイトカイン生産のそれぞれの測定は技術的にかなり複雑であり、したがって、それは時間的に近いため、実行不可能な傾向にある。したがって、ＦＡＣＳによる機能的に重要な表面マーカーの発現も測定した。
【００６０】
ＣＤ１０７ａは細胞毒性Ｔ細胞の分泌活性に対する表面マーカーとして本明細書において定義され、したがってＣＤ１０７ａを抗−ＣＤ３／２８刺激の２４時間後にＣｂｌ−ｂ−抑制されたＣＤ８Ｔ細胞において測定した。したがって、Ｃｂｌ−ｂ ｓｉＲＮＡにてトランスフェクトされたＴ細胞は非常に増加した分泌活性を現した（図１０Ａ）。
【００６１】
ＣＤ１０７ａ分子がＴ細胞における小胞輸送と関連しているため、それはＣＤ４Ｔ細胞の分泌活性に対する主マーカーとしても使用され得る。図１０Ｂは、Ｃｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡ−トランスフェクト細胞におけるＣＤ１０７ａの発現が、また、それ以外は同じように処理された対照細胞と比較して有意であったことを示す。
【００６２】
ＣＤ４０ＬおよびＩＣＡＭは、Ｔ細胞刺激により誘導され得る２つの他の表面分子である。これらの２つの分子（特に抗原提示細胞とＢ−細胞の刺激／増殖の相互作用に関するＣＤ４０Ｌ、抗原提示細胞と血管系から（悪性）組織への移動の相互作用に関するＩＣＡＭ）は機能的関連性の分子である。図１０Ｂはこれらの２つの表面分子の発現がＣｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡ−トランスフェクトされたヒトＣＤ４Ｔ細胞において有意に増加したことを示す。
【００６３】
Ｔ細胞反応性の増加に関与するここに記載されているメカニズムの１つは、細胞表面におけるＣＤ３−受容体のあまり顕著でない減衰である。図１０Ｂはさらに細胞表面におけるＣＤ３受容体の量がＣｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡ−トランスフェクトされたヒトＣＤ４Ｔ細胞において確かに増加したことを示す。
【００６４】
従来のＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の細胞表面発現が、また、確かに増加したが、ＣＤ２５の発現は変化していないままであることは興味深い。これは、ＣＤ２５が、また、刺激マーカーとして定義されるが、その機能はとりわけいわゆるＴ−制御性細胞の存在および生存と関連するため、特定の機能的関連性であるかもしれない。
【００６５】
全体的に、図１０は、したがって、さらに機能的に重要な分子または表面マーカーとして働く分子をＣｂｌ−ｂ−ｓｉＲＮＡトランスフェクションにより細胞表面において明白に多量に検出することができることを示す。
【００６６】
実施例１３：Ｃｂｌ−ｂ−欠損Ｔ細胞および樹状細胞の関節移植はインビボ腫瘍モデルにおける有効な治療的方法である。
腫瘍を０．１ミリオンのＥＧ７ｏｖａ細胞の皮下注射により野生型マウスにおいて誘導させた。次にＣＤ８Ｔ細胞および樹状細胞を５および６日目に注入し、この養子細胞治療の効果を腫瘍の成長を測定することにより連続的に追跡した。図１１Ａは、腫瘍成長をＣｂｌ−ｂ−欠損Ｔ細胞の移植により野生型Ｔ細胞よりも非常に強く長期間にわたって抑制することができることを示す。
【００６７】
図１１Ｂは、また、Ｃｂｌ−ｂ−欠損Ｔ細胞における処理が８０日間の観察の終わりまで処理された大部分のマウスの長期生存を保証したことを示す。それとは対照的に、野生型Ｔ細胞における処理は、対照グループと比較して、平均寿命をほんのわずかに長く誘導した。したがって、図１１Ｂは、Ｃｂｌ−ｂ−欠損または抑制Ｔ細胞における処理が正常Ｔ細胞における処理と比較して顕著な利点を有することを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系の細胞のＣｂｌ−ｂ機能を減少させるか、または阻害して、抗原に対する細胞の免疫反応を増加させることを含む、抗原と接触した免疫系の細胞の免疫反応を増加させるインビトロまたはエキソビボにおける方法。
【請求項２】
Ｃｂｌ−ｂの発現を減少させるか、または阻害することにより、Ｃｂｌ−ｂ機能を減少させるか、または阻害することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃｂｌ−ｂの機能の減少または阻害が一時的であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃｂｌ−ｂの発現をＣｂｌ−ｂアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用することにより減少させるか、または阻害することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｃｂｌ−ｂの機能をＣｂｌ−ｂアンタゴニスト因子、阻害因子、アプタマーまたはイントラマーを使用することにより減少させるか、または阻害することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
特にｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用により、好ましくは一時的な減少または阻害により、細胞のｃ−Ｃｂｌ機能を減少させるか、または阻害して、抗原に対する細胞の免疫反応を減少させることを含む、免疫系の細胞の免疫反応を減少させる方法。
【請求項７】
細胞が抗原を取り込み、好ましくは抗原フラグメントを提示するか、または、より良くは、ＨＬＡに関連する抗原フラグメントを認識し、それにより活性化されることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞が、抗原提示細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／または樹状細胞、特にＴ−リンパ球、好ましくはＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ−リンパ球を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞を免疫刺激物質、好ましくはサイトカイン、特にＣＤ３および／またはＣＤ２８にて処理することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
患者の免疫系の細胞を単離し、Ｃｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子を使用することによりインビトロまたはエキソビボにおける細胞の免疫反応を増加させ、そして患者に細胞を再移植することにより患者における抗原に対する免疫反応を増加させるための医薬組成物の製造のためのＣｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子の使用であって、ここで、免疫反応は細胞のＣｂｌ−ｂ機能の減少または阻害により増加される使用。
【請求項１１】
先天性または後天性免疫不全、特にＡＩＤＳ、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、薬物誘導免疫抑制または癌の処置のための請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
癌が固形腫瘍を形成することを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
別の抗腫瘍処置、好ましくは化学療法、放射線治療、生体細胞または樹状細胞ワクチン接種、特に腫瘍ワクチン接種の投与と組み合わせた、癌の処置のための請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
患者が、好ましくは細胞の単離前、特に好ましくは細胞の単離の少なくとも２日および／または最大８週前に抗原をワクチン接種することを特徴とする、請求項１０から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
細胞をインビトロまたはエキソビボにおいて抗原と接触させることを特徴とする、請求項１０から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
インビトロまたはエキソビボにおける免疫反応における増加または細胞が請求項１から５および７から９に定義されていることを特徴とする、請求項１０から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
特定の抗原に特異的である細胞または特定の抗原を含む細胞を抗原の特異性または存在に対して選択し、選択された細胞の免疫反応を増加させることを特徴とする、請求項１０から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
細胞を再移植前に増殖させることを特徴とする、請求項１から１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
好ましくは請求項１から９のいずれかに定義されているか、または請求項１０から１９のいずれかに記載の使用のための、特に抗原に対する免疫系の細胞の免疫反応を増加させるためのＣｂｌ−ｂ阻害因子を含む、容器、好ましくは使い捨てチューブ。
【請求項２１】
細胞を保持するための容器、好ましくは使い捨てチューブ、Ｃｂｌ−ｂ阻害因子および好ましくは細胞培地および／またはトランスフェクションバッファーを含む、請求項１から９に記載の方法を実施するためのまたは請求項１０から１９に記載の使用のためのキット。
【請求項２２】
免疫刺激物質、好ましくはサイトカイン、特にＣＤ３および／またはＣＤ２８を含む、請求項２０に記載の容器または請求項２１に記載のキット。
【請求項１】
免疫系の細胞のＣｂｌ−ｂ機能を減少させるか、または阻害して、抗原に対する細胞の免疫反応を増加させることを含む、抗原と接触した免疫系の細胞の免疫反応を増加させるインビトロまたはエキソビボにおける方法。
【請求項２】
Ｃｂｌ−ｂの発現を減少させるか、または阻害することにより、Ｃｂｌ−ｂ機能を減少させるか、または阻害することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃｂｌ−ｂの機能の減少または阻害が一時的であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃｂｌ−ｂの発現をＣｂｌ−ｂアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用することにより減少させるか、または阻害することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
Ｃｂｌ−ｂの機能をＣｂｌ−ｂアンタゴニスト因子、阻害因子、アプタマーまたはイントラマーを使用することにより減少させるか、または阻害することを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
特にｃ−ＣｂｌアンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用により、好ましくは一時的な減少または阻害により、細胞のｃ−Ｃｂｌ機能を減少させるか、または阻害して、抗原に対する細胞の免疫反応を減少させることを含む、免疫系の細胞の免疫反応を減少させる方法。
【請求項７】
細胞が抗原を取り込み、好ましくは抗原フラグメントを提示するか、または、より良くは、ＨＬＡに関連する抗原フラグメントを認識し、それにより活性化されることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞が、抗原提示細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および／または樹状細胞、特にＴ−リンパ球、好ましくはＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ−リンパ球を含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
細胞を免疫刺激物質、好ましくはサイトカイン、特にＣＤ３および／またはＣＤ２８にて処理することを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
患者の免疫系の細胞を単離し、Ｃｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子を使用することによりインビトロまたはエキソビボにおける細胞の免疫反応を増加させ、そして患者に細胞を再移植することにより患者における抗原に対する免疫反応を増加させるための医薬組成物の製造のためのＣｂｌ−ｂ阻害因子またはアンタゴニスト因子の使用であって、ここで、免疫反応は細胞のＣｂｌ−ｂ機能の減少または阻害により増加される使用。
【請求項１１】
先天性または後天性免疫不全、特にＡＩＤＳ、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、薬物誘導免疫抑制または癌の処置のための請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
癌が固形腫瘍を形成することを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
別の抗腫瘍処置、好ましくは化学療法、放射線治療、生体細胞または樹状細胞ワクチン接種、特に腫瘍ワクチン接種の投与と組み合わせた、癌の処置のための請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
患者が、好ましくは細胞の単離前、特に好ましくは細胞の単離の少なくとも２日および／または最大８週前に抗原をワクチン接種することを特徴とする、請求項１０から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
細胞をインビトロまたはエキソビボにおいて抗原と接触させることを特徴とする、請求項１０から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
インビトロまたはエキソビボにおける免疫反応における増加または細胞が請求項１から５および７から９に定義されていることを特徴とする、請求項１０から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
特定の抗原に特異的である細胞または特定の抗原を含む細胞を抗原の特異性または存在に対して選択し、選択された細胞の免疫反応を増加させることを特徴とする、請求項１０から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
抗原が腫瘍抗原であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
細胞を再移植前に増殖させることを特徴とする、請求項１から１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】
好ましくは請求項１から９のいずれかに定義されているか、または請求項１０から１９のいずれかに記載の使用のための、特に抗原に対する免疫系の細胞の免疫反応を増加させるためのＣｂｌ−ｂ阻害因子を含む、容器、好ましくは使い捨てチューブ。
【請求項２１】
細胞を保持するための容器、好ましくは使い捨てチューブ、Ｃｂｌ−ｂ阻害因子および好ましくは細胞培地および／またはトランスフェクションバッファーを含む、請求項１から９に記載の方法を実施するためのまたは請求項１０から１９に記載の使用のためのキット。
【請求項２２】
免疫刺激物質、好ましくはサイトカイン、特にＣＤ３および／またはＣＤ２８を含む、請求項２０に記載の容器または請求項２１に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０７８０６（Ｐ２０１１−５０７８０６Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３７２０７（Ｐ２０１０−５３７２０７）
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００８／０００４４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７３９０５
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５１００１９０５９）メディツィーニシェ・ウニヴェルジテート・インスブルック (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＺＩＮＩＳＣＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＩＮＮＳＢＲＵＣＫ
【出願人】（５０９３４３１１６）アペイロン・バイオロジックス・アクチェンゲゼルシャフト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＥＩＲＯＮ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００８／０００４４３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７３９０５
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５１００１９０５９）メディツィーニシェ・ウニヴェルジテート・インスブルック (2)
【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＺＩＮＩＳＣＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＩＮＮＳＢＲＵＣＫ
【出願人】（５０９３４３１１６）アペイロン・バイオロジックス・アクチェンゲゼルシャフト (2)
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＥＩＲＯＮ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]