免疫学的検定法および免疫学的検定法に使用する検査ディスク
【課題】測定操作の容易性、高精度および安価な費用という免疫学的検定法の利点を活かしつつ、測定時間の大幅な短縮、さらには従来法より１桁以上高感度の免疫学的検定法およびそれに使用できる検査ディスクを提供する。
【解決手段】抗原をマイクロビーズに固定化し、反応場であるマイクロチャンバーのサイズ（容積）と、該マイクロチャンバーに保持される前記マイクロビーズの総体積を一定の範囲にする競合的免疫学的検定法、およびその方法に使用する検査ディスクを提供する。
【解決手段】抗原をマイクロビーズに固定化し、反応場であるマイクロチャンバーのサイズ（容積）と、該マイクロチャンバーに保持される前記マイクロビーズの総体積を一定の範囲にする競合的免疫学的検定法、およびその方法に使用する検査ディスクを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原抗体反応による生物学的試料の定量分析に関し、抗原を正確に定量する免疫学的検定法（イムノアッセイ）、および該免疫学的検定法に使用する検査ディスクに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的検定法（イムノアッセイ）とは、免疫学的測定法とも称され、特定の抗体（抗原）は特定の抗原（抗体）と特異的に結合反応をすることを応用した、生物学的試料の定量的検出法であり、感染症または癌の発症若しくはその予後観察等、様々な場面に有用な測定方法である。
【０００３】
免疫学的検定法は、測定感度が良好で、一般的に測定精度が高く、また測定操作が比較的簡単であり低コストで分析可能という利点があるので、様々な方法が開発されている。これらの中で、標識試薬が放射性同位元素であるもの（ラジオイムノアッセイ）または酵素であるもの（エンザイムイムノアッセイ）、および測定原理が競合的原理または非競合的原理（サンドイッチ結合原理）によるものが代表的な検定法である。
【０００４】
上記の酵素を標識とした免疫学的検定法において、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）では、マイクロタイタープレートを用いた測定（検定）が広く行われている。本方法は、多検体を同時に測定できるという利点を有するが、抗原抗体反応時間のみならず、マイクロタイタープレートのウェル中への抗原または抗体の固定化（吸着）および該反応後の測定前処理に、各々１時間以上を必要とし、測定に必要な総時間が数時間を要するという問題を有している。
【０００５】
マイクロタイタープレートを使用する場合の、測定時間に長時間を要するという問題を解決するため、マイクロ流路と称される、断面積が微小で細長い流路中で抗原抗体反応を行う測定方法も提案されている（非特許文献１）。しかし、非特許文献１の方法では、一度に多数の検体を同時に測定できないという別の問題を有していた。
【０００６】
マイクロ流路を使用することによる上記問題の解決のため、本願発明者は、ＥＬＩＳＡにおいて、多数のマイクロ流路および抗体を固定化したマイクロビーズを備える検査ディスクを開発し、非競合的結合原理による測定法（サンドイッチ法）に適用した（非特許文献２）。これにより、測定時間が３０分間〜１時間程度にまで短縮された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｔｏ Ｋ．、Ｋｉｍｕｒａ Ｈ．、Ｋｉｔａｍｏｒｉ Ｔ．、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒａ ｂｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｂｅａｄ−Ｂｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｉｎ ａ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．、２００１年、７３、ｐ．１２１３−１２１８
【非特許文献２】Ｎ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ、Ｓ．Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｉ．Ｋｕｂｏ、「ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＡＬ ＦＬＯＷ ＤＥＶＩＣＥ ＦＯＲ ＨＩＧＨ−ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＭＡＲＫＥＲ ＣＥＡ」、ＥＣＳ Ｔｒａｎｓｓａｃｔｉｏｎｓ、２００８年、１６（１１）、ｐ．１２３−１２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、非特許文献２の検定法では、２段階の抗原抗体反応が必要であるため測定時間短縮がいまだ十分なものではなかった。また、測定時間を短縮するためには、抗原抗体反応の反応場の表面積を大きくすることが考えられるが、固定化する抗体濃度の点で、反応場であるマイクロチャンバー（検出部）を、好適なサイズ（容積）とすることが非特許文献２では困難であった。一方、生体内の極わずかな変化をいち早く捉えて、早期に有効な診断または治療等を可能とするために、これまで以上に高感度および高精度の測定（検定）へのニーズが高まってきている。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、測定操作の容易性、高精度および安価な費用という免疫学的検定法の利点を活かしつつ、測定時間の大幅な短縮、さらには従来法より１桁以上高感度の免疫学的検定法およびそれに使用できる検査ディスクを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、測定原理を競合的結合法（以降、競合法と称する）に変えて、以下のような方法およびその方法を実施する検査ディスクを開発した。具体的には、抗体の代わりに抗原をマイクロビーズに固定化し、好適には反応場であるマイクロチャンバー（検出部）のサイズ（容積）と、該マイクロチャンバーに保持（充填）される前記マイクロビーズの総体積を一定の範囲にすることにより、前記課題を解決し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の第１の発明によれば、２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されている、ディスク状検査容器を使用して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出する免疫学的検定法が提供される。なお、本出願において、「マイクロ流路」と称した場合は、原則供給部、検出部および排出部を含んだ基本構成全体を示すものとし、供給部、検出部および排出部を含まない場合は単に「流路」と称する。
【００１２】
第２の発明によれば、前記マイクロビーズに固定化される抗原は腫瘍マーカーであることが好適である。
【００１３】
第３の発明によれば、１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ濃度の前記腫瘍マーカーの水溶液により、前記マイクロビーズに前記腫瘍マーカーを固定化して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出することが好適である。
【００１４】
第４の発明によれば、前記検出部の１個の容積は０．００１〜０．１ｍｍ３であることが好適である。
【００１５】
第５の発明によれば、前記抗原抗体反応の反応時間は１〜５分間である免疫学的検定法が提供される。
【００１６】
第６の発明によれば、２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されている、免疫学的検定法に使用する検査ディスクが提供される。
【００１７】
第７の発明によれば、前記検査ディスクの前記マイクロビーズに固定化される抗原は、腫瘍マーカーであることが好適である。
【００１８】
第８の発明によれば、前記検出部の１個の容積は、０．００１〜０．１ｍｍ３であることが好適である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の免疫学的検定法および検査ディスクによれば、当該免疫学的検定の測定時間を大幅に短縮できるという効果を奏する。さらには、従来法より１桁以上高感度で高精度に生物学的試料の定量ができるという効果も奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の免疫学的検定法の測定フローを概略的に示す工程図である。
【図２】（ａ）は本発明の検査ディスクの一例を上面視にて模式的に示す図である。（ｂ）は１本のマイクロ流路を概念的に示す模式図である。
【図３】１本のマイクロ流路において、抗原が固定されたマイクロビーズが検出部（マイクロチャンバー）に保持され、抗原抗体反応が行われる状態を模式的に表す、該１本のマイクロ流路の断面図である。
【図４】（ａ）は一つの検出部（マイクロチャンバー）近傍を、側面から見た断面図を概略的に表した図である。（ｂ）は検出部の容積Ｖ３部分を示すために、（ａ）のＩＶｂ−ＩＶｂ線の矢視方向の断面図を概略的に示した図である。
【図５】複数の検出部につながっている第２の供給部を有する、本発明の検査ディスクの別の例を上面視にて模式的に示す図である。
【図６】実施形態１での、測定対象の抗原（腫瘍マーカー）濃度と化学発光強度（ＣＬ強度；Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の関係を表すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照しながら、課題解決のために重要な点および従来技術と異なる特徴等について説明する。
【００２２】
本発明の免疫学的検定法は、抗原をマイクロビーズに固定し、反応場であり検出部であるマイクロチャンバーに保持して抗原抗体反応を行わせる。抗体をビーズなどの担体（固相）等に固定化する場合は、抗体の分子形態（構造）がＹ字型ヘテロテトラマーいう共通の構造を有していることから、基本的な固定化方法が確立されており特に困難性を有しない。しかし、抗原を固定化する場合は、抗原には様々な構造および性質の分子があるため、担体への固定化には、対象抗原毎にその方法に工夫を要するという困難性がある。
【００２３】
したがって、抗体を担体等に固定化し、抗原を標識して競合法で免疫学的検定を行う方法も考え得るが、例えば抗原を酵素で標識する場合は、酵素との反応効率が低いという問題がある。さらには、腫瘍マーカー等の抗原を標識抗原として試薬化すると費用が高いという不利益点もある。そこで、高精度および安価という本検定法の利点を活かすため、抗原固定化による競合法を完成させた。
【００２４】
しかしながら、上記した困難性以上に、抗原を固定化した場合は、分子量の比較的大きな抗体が立体的障害を受けることなくマイクロビーズの表面に接近して、固定化抗原と反応しなければならないという困難性を克服する必要があった。これらの困難性を解決するための方法および装置について、その実施の形態の詳細を以下に説明する。
【００２５】
すなわち、本発明においては、図２に一例として示すような検査ディスク１を使用し、図１に示すフローに従って、抗原固定化での競合法による免疫学的検定を行う。好ましくは、検出部であるマイクロチャンバー３のサイズを所定の範囲とすることにより、短時間で高精度の測定を行うことができる。
【００２６】
抗原には、細菌やウイルスなど、生体内へ外部から侵入してくるもの、および癌などの腫瘍を起因として血液中に遊離してくる腫瘍マーカーなど種々のものがある。本発明のマイクロビーズ７への固定化能、および術後の予後観察等における極微量分析の意義において、抗原としては腫瘍マーカーが好ましい。
【００２７】
腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ＴＰＡ（組織ポリペプチド抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）およびｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２タンパクのコード遺伝子）等，種々のものを挙げることができる。マイクロビーズ７上での抗体との反応の好適性の点で、ＣＥＡ、ＡＦＰおよびＰＳＡ等の糖タンパク質系が好ましい。
【００２８】
本発明の免疫学的検定法の測定手順を、図１に示す測定フローの工程図に従って説明する。まず、複数のマイクロビーズ７に抗原をカルボジイミド法等により固定化（Ｓ１）する。固定化する抗原（固定化抗原８）は上記の理由により腫瘍マーカーであることが好ましい。
【００２９】
本発明のマイクロビーズ７は、球体、多面体、卵状、ラグビーボール状、またはゴルフボールのように表面に多数のディンプルを有する球体等の形状であってよく、供給部２から検出部３までの流動性およびマイクロビーズ７の表面上での効率的な抗原抗体反応の進行の点で、球体（真球だけでなく略球体も含む）が好ましい。なお、マイクロビーズ７が球体である場合には、その直径は１μｍ以上、１００μｍ以下であり、検出部３に効果的に保持させる点で５μｍ以上が好ましい。また、抗原抗体反応に好適な表面密度となるように抗原８を固定化する点において、前記直径は５０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下がより好ましい。マイクロビーズ７が球体以外の形状である場合においても、上記のサイズとほぼ同程度であることが好ましい。
【００３０】
また、マイクロビーズ７の材質としては、抗原が固定化されれば特に制限はなく、ガラス、ポリスチレンまたはポリカーボネート等の樹脂、金または銀等の金属、およびステンレス等の金属化合物を使用することができる。安価で軽量である点で樹脂製のマイクロビーズが好ましい。
【００３１】
抗原固定化に使用するマイクロビーズ７の数は、検査ディスク１の一つの検出部当たり数千〜数万個になるように決定する。一つの検出部当たりの具体的な個数は、マイクロビーズ７の体積と検出部３のサイズ（容積）の相対的関係によって決められる。反応速度向上と高感度の両立の点で、マイクロビーズの総体積が、検出部３の容積の５％以上が好ましく、より好ましくは１０％、さらに好ましくは２５％以上である。一方、後述するように抗原抗体反応においてはインキュベーションすることが好ましいので、インキュベーション時の試料液とマイクロビーズの接触効率の点で、前記マイクロビーズの総体積は、前記検出部容積の７０％以下が好ましく、より好ましくは５０％、さらに好ましくは４０％以下である。
【００３２】
なお、一つの検出部３の容積は、流路５、６とつながり、幅が流路５、６より大きくなっている部分の面積と当該部分の高さ（深さ）を掛けた値とする。図４（ａ）に一つの検出部３の近傍を検査ディスクの側面から見た断面図で表し、同図のＩＶｂ−ＩＶｂ線の矢視方向の断面図（前記一つの検出部３の近傍を検査ディスクの上面から見た断面図）を図４（ｂ）に示す。一つの検出部３の容積を図４（ｂ）のＶ３で指し示している。なお、検出部３は流路５および６と開口してつながっているが、容積Ｖ３は、検出部３と両流路５および６の境界部までの容積である。
【００３３】
以上のことから、本発明の検出部３は、抗原抗体反応に好適な数量のマイクロビーズを保持する点で、その容積は０．００１〜０．１ｍｍ３であることが好ましい。この容積を確保するため、検出部３の幅は流路５または６の幅の２〜１０倍程度となり、検出部３の長さは１００〜３０００μｍ程度となる。また、その深さは、マイクロビーズ表面で抗原抗体反応が効率よく行われる点で、供給部２から検出部３までの流路５の１〜２倍が好ましい。該検出部３の形状は、前記容積を確保できれば特に制限がなく、例えば、略直方体または図４（ｂ）に示したように上面視、略楕円状等様々な形状を取ることができる。
【００３４】
検出部３に保持されるマイクロビーズの総体積と検出部３の容積が、上記した相対的関係になるようにマイクロビーズ数を決定し、血球計算盤により濃度計測した懸濁液から、適切な濃度のマイクロビーズ懸濁液を調製する。該懸濁液に抗原を添加し、インキュベーションしながら固定化させる（Ｓ１）。操作の具定例については後述の実施形態１において詳述する。
【００３５】
このようにして調製した、抗原固定化マイクロビーズ懸濁液を検査ディスク１のマイクロ流路の供給部２から、マイクロピペット等でマイクロ流路中に注入し、抗原固定化マイクロビーズを、例えば遠心力によって検出部３に充填する（Ｓ３）。図２（ａ）のような複数のマイクロ流路を有する検査ディスクを使用するときは、各供給部２に前記懸濁液を注入して各検出部３に充填する。このとき、各マイクロ流路の抗原抗体反応が均一に進行するようにするため、各検出部３に保持されるマイクロビーズの総体積の検出部３の容積に対する割合は、上記に示した範囲内で、すべての検出部３においてほぼ同程度であることが望ましい。
【００３６】
検査ディスクの一例を図２に示すが、検査ディスク１には多数のマイクロ流路（供給部２、検出部３および排出部４も含む）が存在することが、多検体同時検定の点で好ましい。前記マイクロ流路の数は、多検体同時検定の実効を挙げる上において、一つの検査ディスクには２０本以上のマイクロ流路が存在することが好ましく、４０本以上であればより好ましい。一方、検査ディスクの実用的なサイズと検定操作に支障をきたさない点で、１００本以下が好ましく、８０本以下がより好ましい。
【００３７】
また、検定（測定）試料等を遠心力により検出部３に送液充填しうる利便性の点で、検査ディスクに形成される複数のマイクロ流路は、対称的あるいは均等的な位置関係で該検査ディスク中に形成されるのが好ましい。例えば、図２（ａ）に示したように検査ディスク１の中心を対称点とした略点対称の形で配置されるのが好ましい。
【００３８】
図２（ａ）は検査ディスクを上から見た場合の模式図であり、多数のマイクロ流路が簡略的に記載されている。図２（ｂ）は一つのマイクロ流路を模式的に示しており、供給部２および排出部４は大気に解放されているが、検出部３並びに流路５および６は検査ディスクの内部に形成されている。これらそれぞれの部分は、マイクロビーズ懸濁液および試料液が流動したり保持されたりできるように、一定の空間（容積）を有している。なお、供給部２および排出部４は、試料液等の供給および排出のし易さの点で、その開口部の上面部の面積は０．５〜３ｍｍ２が好ましい。この場合、供給部及び排出部の容積は、各々０．５ｍｍ３〜５ｍｍ３程度となる。なお、各マイクロ流路とも、上記した通り、試料供給部２及び排出部４のみで大気へ開放されており、流路５、６及び検出部３は検査ディスク１の本体内部に形成されている。
【００３９】
本発明の検査ディスクにおいて、供給部２から検出部３までの流路５の幅は、５０〜２００μｍであり、深さは３０〜１５０μｍである。または、該流路５の断面が円形である場合は、その直径が３０〜２００μｍである。あるいは、前記流路５の断面は、その断面積が同程度の楕円形状であってもよい。ただし、マイクロビーズ７が通過できる必要があるため、マイクロビーズ７の直径との兼ね合いで、前記流路５の幅、深さまたは直径をこれらの範囲内で決定する。
【００４０】
一方、検出部３から排出部４までの流路６の幅は、５０〜２００μｍであり、深さは２〜１０μｍである。ただし、マイクロビーズ７が検出部３で止まり排出部４方向へ流出しない必要があるため、マイクロビーズ７の直径との兼ね合いで、検出部３から排出部４までの前記流路６の幅はこれらの範囲内で決定する。
【００４１】
図２（ａ）では、各マイクロ流路には、各々、供給部２、検出部３および排出部４が一つずつの場合が示されているが、一つのマイクロ流路に２〜４個の供給部を有していても良い。具体的には、図２の供給部２と検出部３を結ぶ流路５から枝分かれする形で流路が形成され、その流路の端に第２、第３または第４の供給部が形成されていても良い。あるいは、第２、第３および第４の供給部が直接検出部３とつながるように複数の流路が形成されていても良い。
【００４２】
また、検査ディスクの別の形態として、図５に模式的に示すように、図２の供給部２に相当する供給部２（ａ）とは別に、複数の検出部３に同時に試料液等を供給できる供給部２（ｂ）を備えていても良い。図１の洗浄Ｓ７および発光基質注入Ｓ８をすばやく実行できる点においては、図５に示す検査ディスクの形態が好ましい。供給部２（ｂ）から試料液等を同時に供給できる検出部３の数としては、試料液、洗浄液または発光基質等を均質に供給できる点で、２〜２０個が好ましく、効率性の点では４個以上がより好ましい。８個以上であればさらに好ましい。
【００４３】
抗原固定化マイクロビーズを調製する一方で、抗体を酵素で標識する（Ｓ２）とともに測定対象の抗原を混合して測定試料液を調製する（Ｓ４）。抗原固定化マイクロビーズを検出部３に充填後、該測定試料液を供給部２から注入し、同様に遠心力で検出部３に送液して前記抗原固定化マイクロビーズが充填されている検出部３を前記測定試料液で満たす（Ｓ５）。このようにして前記抗原固定化マイクロビーズと前記測定試料液とを接触させた後、所定時間インキュベートして抗原抗体反応を行う（Ｓ６）。
【００４４】
本発明に使用できる抗体の種類としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥいずれも使用できるが、具体的に測定に使用する抗体は、当然のことながら、測定対象抗原と反応する抗体が選択される。
【００４５】
抗原抗体反応がおこなわれる検出部３の内部の様子を図３に概念的に表す。表面に抗原が固定化（固定化抗原８）されたマイクロビーズ７が保持されている。検出部３から排出部４につながる流路６は、その深さがマイクロビーズ７の直径より小さいため、マイクロビーズ７は流路６の方へ流出せずに検出部３で止まっている。この検出部３に、酵素で標識された抗体１０と測定対象抗原９を含有する前記測定試料液が、上記したように送液されて、酵素標識抗体１０と固定化抗原８または測定対象抗原９との間で競合的に抗原抗体反応が行われる（図３）。
【００４６】
本実施の形態において、酵素標識抗体１０の量は、測定対象抗原９とマイクロビーズ７上の固定化抗原８の全てと結合（反応）する量より少ないため、測定対象抗原９と固定化抗原８とで酵素標識抗体１０を取り合う形で競合的結合が起きる。そして、固定化抗原８と結合する酵素標識抗体１０の量は、試料中の測定対象抗原９の量（濃度）によって規則性を持って変化するため、固定化抗原８と結合した酵素標識抗体１０の量を発光強度分析等により検出すれば、試料中の測定対象抗原量を定量することができる。
【００４７】
固定化抗原８と結合した酵素標識抗体１０の量を測定するに当たり、インキュベートによる抗原抗体反応後に、緩衝液を供給部２より注入して流路５、６内及び検出部３を洗浄する（Ｓ７）。洗浄の目的は、測定対象抗原９と酵素標識抗体１０との結合物質、未反応の測定対象抗原９およびその他の検出時に障害となる物質の排出除去である。これらの排出物はマイクロ流路の排出部４より排出する。
【００４８】
前記洗浄後、発光試薬として、ｐ−ヨードフェノール、ルミノールおよび過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含む水溶液を供給部２より注入し、固定化抗原８と結合した酵素標識抗体１０を発光させ（Ｓ８）、該発光の発光強度をイメージングアナライザーで測定する（Ｓ９）。以上の測定（検定）操作を測定対象抗原９の濃度を変化させて行い、抗原濃度と発光強度の関係についての検量線を作成する。該検量線の作成にあたり、測定対象抗原９の濃度毎に検査ディスクを変えてもよく、複数のマイクロ流路を有する検査ディスクを使用してマイクロ流路毎に測定対象抗原濃度を変化させて、１枚の検査ディスクで測定を行っても良い。時間短縮、効率性の点で１枚の検査ディスクで検量線を作成できる測定を行うことが好ましい。
【００４９】
抗原濃度が未知である実際の測定対象試料を、上記と同様の測定フローで測定し、得られた発光強度を前記検量線上にプロットして抗原濃度を読み取ることによって、未知試料中の抗原濃度を決定することができる。
【００５０】
上記の抗原抗体反応に関しては、数分間、具体的には１０分間以内の２分間以上で十分である。１枚の検査ディスクの複数のマイクロ流路で同時測定することによるタイムラグを考慮すれば、３分間以上が好ましい。
【００５１】
本発明の一例として、抗原として腫瘍マーカーであるＣＥＡ（癌胎児性抗原）、酵素標識抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）で標識したゴートポリクローナル抗体を使用して免疫学的検定を行った。この例において、抗原抗体反応を５分間で行ったときの検量線を図６に示す。なお、該抗原抗体反応が１０分間および１５分間であってもほぼ同じプロットとなる検量線が描かれた。
【００５２】
図６から明らかなように、測定対象抗原濃度が０．９ｐｇ／ｍＬと９ｐｇ／ｍＬとで発光強度に明らかな差があり、このことは、試料中の測定対象抗原濃度がこの範囲であっても測定できることを示している。以上述べたとおり、本発明により非常に高感度の測定が短時間でかつ高精度に実施可能となった。
【００５３】
上記の本発明の免疫学的検定法に使用する検査ディスクの素材としては、熱可塑性樹脂若しくは熱硬化性樹脂等の高分子材料、セラミックス、ガラス、シリコンまたは金属等の任意の素材が使用できる。密閉性、微細加工性の点でガラス、シリコン、高分子材料、またはこれらの組み合わせが好ましい。高分子材料としては、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシロキサン類を使用することができる。なお、これらの素材は、マイクロ流路およびマイクロチャンバー（検出部）の状況を、肉眼的または光学的に観察するために透明であるのが好ましい。
【００５４】
前記検査ディスクの製造方法として、次のような方法を挙げることができる。例えば、流路とマイクロチャンバーのパターンを有する前記材質のシートまたはプレートと、試料液の供給部及び排出部を有する平坦なシートまたはプレートとを貼り合わせることにより製造することができる。また、該供給部および排出部は、流路とマイクロチャンバーのパターンを有するシートまたはプレートに形成されていてもよい。あるいは、流路、マイクロチャンバー、供給部、および排出部のパターンが、２枚のシートまたはプレートに分割して作成されたもの（例えば略面対称の形）を、貼り合わせて前記検査ディスクを製造してもよい。光学的な観察及び解析に適する点で、前記検査ディスクの厚さは１ｍｍ〜３ｍｍが好ましい。
【００５５】
これらの流路とマイクロチャンバー等のパターンを有するシートは、金型でプレスしたり、金型に熱可塑性樹脂等の流動性の素材を流し込むことで形成してもよく、厚膜のリソグラフィーにより凸型のパターンを形成し、該パターン上に熱可塑性樹脂等の流動性の素材を流し込んで形成してもよく、シートまたはプレートに直接、機械加工やフォトリソグラフィーを用いたエッチングにより形成してもよい。
【００５６】
＜実施形態１＞
以下、好適な実施形態について図面に基づきさらに詳しく説明する。
【００５７】
検査ディスクの作製
まず、直径４インチのシリコンウェハーを用いてマイクロ流路の鋳型を作製した。シリコンウェハー上に、薄膜フォトレジスト（ＳＵ−８ ２００５）を２０００ｒｐｍ、３０秒間スピンコートし、塗り広げた。これをホットプレートで、６５℃で１分間および９５℃で２分間加熱後、デザインされたフォトマスクと共にマスクアライナーにセットしてＵＶ（３５０ｎｍ）照射を９０秒間し、薄膜フォトレジストを光硬化させた。次に上記シリコンウェハーを６５℃で１分間および９５℃で１分間加熱した。
【００５８】
前記シリコンウェハーに厚膜フォトレジスト（ＳＵ−８ ５０）を滴下し、スピンコーターで２０００ｒｐｍ、３０秒間回転させて均一な厚さ（５０μｍ）に広げた。さらに、ホットプレートで、６５℃で６分間および９５℃で２０分間加熱後、デザインされたフォトマスクと共にマスクアライナーにセットしてＵＶ（３５０ｎｍ）照射を９０秒間し、６５℃で１分間および９５℃で５分間加熱した。その後、ＳＵ−８の現像液に浸して未重合の余分なレジストを除去し、ドライ窒素ガスで乾燥させて鋳型を完成させた。
【００５９】
この鋳型に対し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のプレポリマー（ダウコーニング製シルガード１８４）を流し込み、熱硬化させた。硬化したＰＤＭＳシートを鋳型から取り出して供給部および排出部が大気に開放するように成形した後、凹部が形成されたシート表面に対して当該シートと同じ形の平滑なガラスを張り合わせて、図２に示す６４本のマイクロ流路を備えた検査ディスク（直径１００ｍｍ、厚さ１．８ｍｍ）を作製した。
【００６０】
本実施形態で作製した前記検査ディスクの供給部２および排出部４の開口部の上面部面積は約１ｍｍ２である。また、流路５の「幅×深さ」は「１００μｍ×５６μｍ」、検出部３の容積は０．０２０ｍｍ３（平均幅×長さ×深さ＝３５０μｍ×１０００μｍ×５６μｍ）、流路６の「幅×深さ」は「１００μｍ×５μｍ」である。
【００６１】
抗原固定化マイクロビーズの調製
抗原として腫瘍マーカー「癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）」を使用した。ＣＥＡを直径１０μｍの球体状ポリスチレンマイクロビーズに、カルボジイミド法によって次のように固定化した。該ポリスチレンマイクロビーズの懸濁液０．２ｍＬ、ＥＤＣ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）０．７５ｍＬ、および超純水０．０５ｍＬを混合し、１時間室温でゆっくり攪拌した後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心後に上澄み溶液を取り除いた。さらに、ＣＥＡ溶液（９μｇ／ｍＬ）を２００μＬ混合し、低温室（４℃）で一晩ゆっくり攪拌して反応させた。この反応懸濁液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心後に上澄み溶液を取り除き、ブロッキング剤溶液（４００ｎｇ／ｍＬ）を１ｍＬ添加し、インキュベーター（３７℃）で１．５時間ゆっくり攪拌した。このビーズ懸濁液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心後、上澄み液を取り除き、ビーズを回収した。沈殿したビーズにＴＢＳTバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ；ｐＨ７．６）１ｍＬを加え再懸濁した。その後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心してマイクロビーズを回収する洗浄操作を３回、０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ；ｐＨ７．０）で前記と同様の洗浄操作を２回行い、回収したＣＥＡ固定化マイクロビーズにＰＢを加え懸濁液０．１ｍＬを調製した。前記ＣＥＡ固定化マイクロビーズ懸濁液は、免疫学的検定法を実施するまでは冷蔵庫に保管した。
【００６２】
ＣＥＡの本発明による免疫学検定（検量線の作成と検証）
前記ＣＥＡ固定化マイクロビーズ懸濁液の１．５μＬを、上記の方法により作製した検査ディスク１の供給部２から注入し、遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）で検出部３に送液して該検出部３に保持させた。本実施形態において、検出部３の容積に対する抗原固定化マイクロビーズの総体積の割合は、各検出部とも２６±０．５％となるように充填して保持した。
【００６３】
測定対象ＣＥＡを含む試料溶液と、１０００倍希釈ＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体を１：１で混合し、その混合溶液である測定試料液１μＬを供給部２から注入して遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）で検出部３に送液した。送液後、室温でインキュベートしながら抗原抗体反応を行った。なお、測定対象ＣＥＡ濃度は、０．９、９、９０、９００、および９０００（ｐｇ／ｍＬ）の５種類とし、加えてＣＥＡもＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体も入っていないＰＢについても測定した。なお、この測定は一つの検査ディスク上で、１種類の濃度について３〜５流路を使用して（ｎ数：３〜５）行った。また、インキュベート時間は５、１０、または１５分間の３種類を実施して比較した。
【００６４】
インキュベート後、ＴＢＳＴバッファーで５回、ＰＢで２回、各２μＬずつ供給部２より注入し、遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）により流路５、６内、検出部３、およびマイクロビーズ７を洗浄した（洗浄液は排出部４から排出）。この操作を２回繰り返し、測定試料液中のＣＥＡとＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体との結合物質、未反応のＣＥＡおよびその他の検出時に障害となる物質を除去した。
【００６５】
洗浄後、供給部２から発光基質水溶液（ｐ−ヨードフェノール０．４ｍＭ、ルミノール０．３７５ｍＭおよびＨ２Ｏ２０．７５ｍＭ）を１μＬ注入し遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）により検出部に発行基質溶液を送液し、マイクロビーズ７に固定化されたＣＥＡと反応したＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体の標識酵素と反応させた。これにより、マイクロビーズ７上に存在する標識酵素が発光するので、その化学発光強度（ＣＬ強度）をイメージングアナライザーで５分間測定した。上記の測定対象ＣＥＡ濃度の各条件下で抗原抗体反応を行った場合、マイクロビーズ７の表面上に固定化されたＣＥＡと抗体との結合量が異なり、その化学発光強度に差があらわれる。
【００６６】
測定対象ＣＥＡが少なければ、マイクロビーズ表面に固定化されたＣＥＡと反応する酵素標識抗体が多く、反対に、測定対象ＣＥＡが多ければ、該測定対象ＣＥＡと反応する酵素標識抗体が多くなるので、固定化ＣＥＡと反応する酵素標識抗体は少なくなる。したがって、測定対象ＣＥＡが少ないほど、検出部３（マイクロビーズ保持部分）の発光強度が強く、測定対象ＣＥＡが多いほど発光強度が弱い。
【００６７】
試料中のＣＥＡ濃度と発光強度の関係について、その測定結果を図６に示す。抗原抗体反応時間を５分間とした場合の測定結果であるが、該反応時間を１０分間または１５分間とした場合も、ほぼ同じプロットおよび線が得られ、本実施形態において抗原抗体反応時間は５分間であれば十分であることが示された。なお、図６で９０００ｐｇ／ｍｌにおける発光強度は、ＣＥＡもＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体も入っていないＰＢを検出部３に送液した後、発光基質水溶液を送液した際のバックグラウンドの発光強度とほとんど差がないことが示された。また、ＣＥＡ固定化マイクロビーズの検査ディスクへの注入から発光強度測定までの測定時間については、約１５分間であり、非特許文献２による方法の１／２〜１／４にまで時間が短縮された。
【００６８】
また、試料中のＣＥＡ濃度が０．９ｐｇ／ｍＬと９ｐｇ／ｍＬとで発光強度に明らかな差があり、このことは、試料中の測定対象ＣＥＡ濃度がこの範囲であっても測定できることを示している。この点に関し、ＣＥＡ濃度を変化させた既知試料を数回測定し、全て図６の検量線上にプロットされることを確認した。以上のことから、本発明によって非常に高感度の測定が短時間でかつ高精度に実施可能であることを実証することができた。
【００６９】
このように短時間で高精度に測定できる理由については、明確ではないが、マイクロビーズの体積と検出部であるマイクロチャンバーの容積の比率を特定のものとしたこと、非常に小さなマイクロビーズを使用して反応場である表面積を大きくしたことが一因と考えられる。さらに、これらのことにより、マイクロビーズ表面上での抗原抗体反応の濃度を非特許文献２の方法の１／１０以下とすることができたことによるものと考えられる。すなわち、マイクロビーズ表面上の抗原および抗体の濃度が低くなったことにより、分子量の比較的大きな抗体が立体的障害を受けることなく、固定化抗原と反応がスムーズに進行できるようになったことによるものと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
高感度かつ迅速な免疫学検定が実施可能となることにより、癌あるいは感染症等様々な疾病の早期かつ的確な診断、および予後の追跡による、例えば癌転移の早期発見への応用が可能である。
【符号の説明】
【００７１】
１ 検査ディスク
２、２ａ、２ｂ 供給部
３ 検出部（マイクロチャンバー）
４ 排出部
５、６ 流路
７ マイクロビーズ
８ 固定化抗原
９ 測定対象抗原
１０ 酵素標識抗体
１１ 別形態の検査ディスク
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原抗体反応による生物学的試料の定量分析に関し、抗原を正確に定量する免疫学的検定法（イムノアッセイ）、および該免疫学的検定法に使用する検査ディスクに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的検定法（イムノアッセイ）とは、免疫学的測定法とも称され、特定の抗体（抗原）は特定の抗原（抗体）と特異的に結合反応をすることを応用した、生物学的試料の定量的検出法であり、感染症または癌の発症若しくはその予後観察等、様々な場面に有用な測定方法である。
【０００３】
免疫学的検定法は、測定感度が良好で、一般的に測定精度が高く、また測定操作が比較的簡単であり低コストで分析可能という利点があるので、様々な方法が開発されている。これらの中で、標識試薬が放射性同位元素であるもの（ラジオイムノアッセイ）または酵素であるもの（エンザイムイムノアッセイ）、および測定原理が競合的原理または非競合的原理（サンドイッチ結合原理）によるものが代表的な検定法である。
【０００４】
上記の酵素を標識とした免疫学的検定法において、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）では、マイクロタイタープレートを用いた測定（検定）が広く行われている。本方法は、多検体を同時に測定できるという利点を有するが、抗原抗体反応時間のみならず、マイクロタイタープレートのウェル中への抗原または抗体の固定化（吸着）および該反応後の測定前処理に、各々１時間以上を必要とし、測定に必要な総時間が数時間を要するという問題を有している。
【０００５】
マイクロタイタープレートを使用する場合の、測定時間に長時間を要するという問題を解決するため、マイクロ流路と称される、断面積が微小で細長い流路中で抗原抗体反応を行う測定方法も提案されている（非特許文献１）。しかし、非特許文献１の方法では、一度に多数の検体を同時に測定できないという別の問題を有していた。
【０００６】
マイクロ流路を使用することによる上記問題の解決のため、本願発明者は、ＥＬＩＳＡにおいて、多数のマイクロ流路および抗体を固定化したマイクロビーズを備える検査ディスクを開発し、非競合的結合原理による測定法（サンドイッチ法）に適用した（非特許文献２）。これにより、測定時間が３０分間〜１時間程度にまで短縮された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｔｏ Ｋ．、Ｋｉｍｕｒａ Ｈ．、Ｋｉｔａｍｏｒｉ Ｔ．、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒａ ｂｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｂｅａｄ−Ｂｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｉｎ ａ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．、２００１年、７３、ｐ．１２１３−１２１８
【非特許文献２】Ｎ．Ｍａｔｓｕｎａｇａ、Ｓ．Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｉ．Ｋｕｂｏ、「ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＡＬ ＦＬＯＷ ＤＥＶＩＣＥ ＦＯＲ ＨＩＧＨ−ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＭＡＲＫＥＲ ＣＥＡ」、ＥＣＳ Ｔｒａｎｓｓａｃｔｉｏｎｓ、２００８年、１６（１１）、ｐ．１２３−１２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、非特許文献２の検定法では、２段階の抗原抗体反応が必要であるため測定時間短縮がいまだ十分なものではなかった。また、測定時間を短縮するためには、抗原抗体反応の反応場の表面積を大きくすることが考えられるが、固定化する抗体濃度の点で、反応場であるマイクロチャンバー（検出部）を、好適なサイズ（容積）とすることが非特許文献２では困難であった。一方、生体内の極わずかな変化をいち早く捉えて、早期に有効な診断または治療等を可能とするために、これまで以上に高感度および高精度の測定（検定）へのニーズが高まってきている。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、測定操作の容易性、高精度および安価な費用という免疫学的検定法の利点を活かしつつ、測定時間の大幅な短縮、さらには従来法より１桁以上高感度の免疫学的検定法およびそれに使用できる検査ディスクを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、測定原理を競合的結合法（以降、競合法と称する）に変えて、以下のような方法およびその方法を実施する検査ディスクを開発した。具体的には、抗体の代わりに抗原をマイクロビーズに固定化し、好適には反応場であるマイクロチャンバー（検出部）のサイズ（容積）と、該マイクロチャンバーに保持（充填）される前記マイクロビーズの総体積を一定の範囲にすることにより、前記課題を解決し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の第１の発明によれば、２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されている、ディスク状検査容器を使用して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出する免疫学的検定法が提供される。なお、本出願において、「マイクロ流路」と称した場合は、原則供給部、検出部および排出部を含んだ基本構成全体を示すものとし、供給部、検出部および排出部を含まない場合は単に「流路」と称する。
【００１２】
第２の発明によれば、前記マイクロビーズに固定化される抗原は腫瘍マーカーであることが好適である。
【００１３】
第３の発明によれば、１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ濃度の前記腫瘍マーカーの水溶液により、前記マイクロビーズに前記腫瘍マーカーを固定化して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出することが好適である。
【００１４】
第４の発明によれば、前記検出部の１個の容積は０．００１〜０．１ｍｍ３であることが好適である。
【００１５】
第５の発明によれば、前記抗原抗体反応の反応時間は１〜５分間である免疫学的検定法が提供される。
【００１６】
第６の発明によれば、２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されている、免疫学的検定法に使用する検査ディスクが提供される。
【００１７】
第７の発明によれば、前記検査ディスクの前記マイクロビーズに固定化される抗原は、腫瘍マーカーであることが好適である。
【００１８】
第８の発明によれば、前記検出部の１個の容積は、０．００１〜０．１ｍｍ３であることが好適である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の免疫学的検定法および検査ディスクによれば、当該免疫学的検定の測定時間を大幅に短縮できるという効果を奏する。さらには、従来法より１桁以上高感度で高精度に生物学的試料の定量ができるという効果も奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の免疫学的検定法の測定フローを概略的に示す工程図である。
【図２】（ａ）は本発明の検査ディスクの一例を上面視にて模式的に示す図である。（ｂ）は１本のマイクロ流路を概念的に示す模式図である。
【図３】１本のマイクロ流路において、抗原が固定されたマイクロビーズが検出部（マイクロチャンバー）に保持され、抗原抗体反応が行われる状態を模式的に表す、該１本のマイクロ流路の断面図である。
【図４】（ａ）は一つの検出部（マイクロチャンバー）近傍を、側面から見た断面図を概略的に表した図である。（ｂ）は検出部の容積Ｖ３部分を示すために、（ａ）のＩＶｂ−ＩＶｂ線の矢視方向の断面図を概略的に示した図である。
【図５】複数の検出部につながっている第２の供給部を有する、本発明の検査ディスクの別の例を上面視にて模式的に示す図である。
【図６】実施形態１での、測定対象の抗原（腫瘍マーカー）濃度と化学発光強度（ＣＬ強度；Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の関係を表すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照しながら、課題解決のために重要な点および従来技術と異なる特徴等について説明する。
【００２２】
本発明の免疫学的検定法は、抗原をマイクロビーズに固定し、反応場であり検出部であるマイクロチャンバーに保持して抗原抗体反応を行わせる。抗体をビーズなどの担体（固相）等に固定化する場合は、抗体の分子形態（構造）がＹ字型ヘテロテトラマーいう共通の構造を有していることから、基本的な固定化方法が確立されており特に困難性を有しない。しかし、抗原を固定化する場合は、抗原には様々な構造および性質の分子があるため、担体への固定化には、対象抗原毎にその方法に工夫を要するという困難性がある。
【００２３】
したがって、抗体を担体等に固定化し、抗原を標識して競合法で免疫学的検定を行う方法も考え得るが、例えば抗原を酵素で標識する場合は、酵素との反応効率が低いという問題がある。さらには、腫瘍マーカー等の抗原を標識抗原として試薬化すると費用が高いという不利益点もある。そこで、高精度および安価という本検定法の利点を活かすため、抗原固定化による競合法を完成させた。
【００２４】
しかしながら、上記した困難性以上に、抗原を固定化した場合は、分子量の比較的大きな抗体が立体的障害を受けることなくマイクロビーズの表面に接近して、固定化抗原と反応しなければならないという困難性を克服する必要があった。これらの困難性を解決するための方法および装置について、その実施の形態の詳細を以下に説明する。
【００２５】
すなわち、本発明においては、図２に一例として示すような検査ディスク１を使用し、図１に示すフローに従って、抗原固定化での競合法による免疫学的検定を行う。好ましくは、検出部であるマイクロチャンバー３のサイズを所定の範囲とすることにより、短時間で高精度の測定を行うことができる。
【００２６】
抗原には、細菌やウイルスなど、生体内へ外部から侵入してくるもの、および癌などの腫瘍を起因として血液中に遊離してくる腫瘍マーカーなど種々のものがある。本発明のマイクロビーズ７への固定化能、および術後の予後観察等における極微量分析の意義において、抗原としては腫瘍マーカーが好ましい。
【００２７】
腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ＴＰＡ（組織ポリペプチド抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）およびｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２タンパクのコード遺伝子）等，種々のものを挙げることができる。マイクロビーズ７上での抗体との反応の好適性の点で、ＣＥＡ、ＡＦＰおよびＰＳＡ等の糖タンパク質系が好ましい。
【００２８】
本発明の免疫学的検定法の測定手順を、図１に示す測定フローの工程図に従って説明する。まず、複数のマイクロビーズ７に抗原をカルボジイミド法等により固定化（Ｓ１）する。固定化する抗原（固定化抗原８）は上記の理由により腫瘍マーカーであることが好ましい。
【００２９】
本発明のマイクロビーズ７は、球体、多面体、卵状、ラグビーボール状、またはゴルフボールのように表面に多数のディンプルを有する球体等の形状であってよく、供給部２から検出部３までの流動性およびマイクロビーズ７の表面上での効率的な抗原抗体反応の進行の点で、球体（真球だけでなく略球体も含む）が好ましい。なお、マイクロビーズ７が球体である場合には、その直径は１μｍ以上、１００μｍ以下であり、検出部３に効果的に保持させる点で５μｍ以上が好ましい。また、抗原抗体反応に好適な表面密度となるように抗原８を固定化する点において、前記直径は５０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下がより好ましい。マイクロビーズ７が球体以外の形状である場合においても、上記のサイズとほぼ同程度であることが好ましい。
【００３０】
また、マイクロビーズ７の材質としては、抗原が固定化されれば特に制限はなく、ガラス、ポリスチレンまたはポリカーボネート等の樹脂、金または銀等の金属、およびステンレス等の金属化合物を使用することができる。安価で軽量である点で樹脂製のマイクロビーズが好ましい。
【００３１】
抗原固定化に使用するマイクロビーズ７の数は、検査ディスク１の一つの検出部当たり数千〜数万個になるように決定する。一つの検出部当たりの具体的な個数は、マイクロビーズ７の体積と検出部３のサイズ（容積）の相対的関係によって決められる。反応速度向上と高感度の両立の点で、マイクロビーズの総体積が、検出部３の容積の５％以上が好ましく、より好ましくは１０％、さらに好ましくは２５％以上である。一方、後述するように抗原抗体反応においてはインキュベーションすることが好ましいので、インキュベーション時の試料液とマイクロビーズの接触効率の点で、前記マイクロビーズの総体積は、前記検出部容積の７０％以下が好ましく、より好ましくは５０％、さらに好ましくは４０％以下である。
【００３２】
なお、一つの検出部３の容積は、流路５、６とつながり、幅が流路５、６より大きくなっている部分の面積と当該部分の高さ（深さ）を掛けた値とする。図４（ａ）に一つの検出部３の近傍を検査ディスクの側面から見た断面図で表し、同図のＩＶｂ−ＩＶｂ線の矢視方向の断面図（前記一つの検出部３の近傍を検査ディスクの上面から見た断面図）を図４（ｂ）に示す。一つの検出部３の容積を図４（ｂ）のＶ３で指し示している。なお、検出部３は流路５および６と開口してつながっているが、容積Ｖ３は、検出部３と両流路５および６の境界部までの容積である。
【００３３】
以上のことから、本発明の検出部３は、抗原抗体反応に好適な数量のマイクロビーズを保持する点で、その容積は０．００１〜０．１ｍｍ３であることが好ましい。この容積を確保するため、検出部３の幅は流路５または６の幅の２〜１０倍程度となり、検出部３の長さは１００〜３０００μｍ程度となる。また、その深さは、マイクロビーズ表面で抗原抗体反応が効率よく行われる点で、供給部２から検出部３までの流路５の１〜２倍が好ましい。該検出部３の形状は、前記容積を確保できれば特に制限がなく、例えば、略直方体または図４（ｂ）に示したように上面視、略楕円状等様々な形状を取ることができる。
【００３４】
検出部３に保持されるマイクロビーズの総体積と検出部３の容積が、上記した相対的関係になるようにマイクロビーズ数を決定し、血球計算盤により濃度計測した懸濁液から、適切な濃度のマイクロビーズ懸濁液を調製する。該懸濁液に抗原を添加し、インキュベーションしながら固定化させる（Ｓ１）。操作の具定例については後述の実施形態１において詳述する。
【００３５】
このようにして調製した、抗原固定化マイクロビーズ懸濁液を検査ディスク１のマイクロ流路の供給部２から、マイクロピペット等でマイクロ流路中に注入し、抗原固定化マイクロビーズを、例えば遠心力によって検出部３に充填する（Ｓ３）。図２（ａ）のような複数のマイクロ流路を有する検査ディスクを使用するときは、各供給部２に前記懸濁液を注入して各検出部３に充填する。このとき、各マイクロ流路の抗原抗体反応が均一に進行するようにするため、各検出部３に保持されるマイクロビーズの総体積の検出部３の容積に対する割合は、上記に示した範囲内で、すべての検出部３においてほぼ同程度であることが望ましい。
【００３６】
検査ディスクの一例を図２に示すが、検査ディスク１には多数のマイクロ流路（供給部２、検出部３および排出部４も含む）が存在することが、多検体同時検定の点で好ましい。前記マイクロ流路の数は、多検体同時検定の実効を挙げる上において、一つの検査ディスクには２０本以上のマイクロ流路が存在することが好ましく、４０本以上であればより好ましい。一方、検査ディスクの実用的なサイズと検定操作に支障をきたさない点で、１００本以下が好ましく、８０本以下がより好ましい。
【００３７】
また、検定（測定）試料等を遠心力により検出部３に送液充填しうる利便性の点で、検査ディスクに形成される複数のマイクロ流路は、対称的あるいは均等的な位置関係で該検査ディスク中に形成されるのが好ましい。例えば、図２（ａ）に示したように検査ディスク１の中心を対称点とした略点対称の形で配置されるのが好ましい。
【００３８】
図２（ａ）は検査ディスクを上から見た場合の模式図であり、多数のマイクロ流路が簡略的に記載されている。図２（ｂ）は一つのマイクロ流路を模式的に示しており、供給部２および排出部４は大気に解放されているが、検出部３並びに流路５および６は検査ディスクの内部に形成されている。これらそれぞれの部分は、マイクロビーズ懸濁液および試料液が流動したり保持されたりできるように、一定の空間（容積）を有している。なお、供給部２および排出部４は、試料液等の供給および排出のし易さの点で、その開口部の上面部の面積は０．５〜３ｍｍ２が好ましい。この場合、供給部及び排出部の容積は、各々０．５ｍｍ３〜５ｍｍ３程度となる。なお、各マイクロ流路とも、上記した通り、試料供給部２及び排出部４のみで大気へ開放されており、流路５、６及び検出部３は検査ディスク１の本体内部に形成されている。
【００３９】
本発明の検査ディスクにおいて、供給部２から検出部３までの流路５の幅は、５０〜２００μｍであり、深さは３０〜１５０μｍである。または、該流路５の断面が円形である場合は、その直径が３０〜２００μｍである。あるいは、前記流路５の断面は、その断面積が同程度の楕円形状であってもよい。ただし、マイクロビーズ７が通過できる必要があるため、マイクロビーズ７の直径との兼ね合いで、前記流路５の幅、深さまたは直径をこれらの範囲内で決定する。
【００４０】
一方、検出部３から排出部４までの流路６の幅は、５０〜２００μｍであり、深さは２〜１０μｍである。ただし、マイクロビーズ７が検出部３で止まり排出部４方向へ流出しない必要があるため、マイクロビーズ７の直径との兼ね合いで、検出部３から排出部４までの前記流路６の幅はこれらの範囲内で決定する。
【００４１】
図２（ａ）では、各マイクロ流路には、各々、供給部２、検出部３および排出部４が一つずつの場合が示されているが、一つのマイクロ流路に２〜４個の供給部を有していても良い。具体的には、図２の供給部２と検出部３を結ぶ流路５から枝分かれする形で流路が形成され、その流路の端に第２、第３または第４の供給部が形成されていても良い。あるいは、第２、第３および第４の供給部が直接検出部３とつながるように複数の流路が形成されていても良い。
【００４２】
また、検査ディスクの別の形態として、図５に模式的に示すように、図２の供給部２に相当する供給部２（ａ）とは別に、複数の検出部３に同時に試料液等を供給できる供給部２（ｂ）を備えていても良い。図１の洗浄Ｓ７および発光基質注入Ｓ８をすばやく実行できる点においては、図５に示す検査ディスクの形態が好ましい。供給部２（ｂ）から試料液等を同時に供給できる検出部３の数としては、試料液、洗浄液または発光基質等を均質に供給できる点で、２〜２０個が好ましく、効率性の点では４個以上がより好ましい。８個以上であればさらに好ましい。
【００４３】
抗原固定化マイクロビーズを調製する一方で、抗体を酵素で標識する（Ｓ２）とともに測定対象の抗原を混合して測定試料液を調製する（Ｓ４）。抗原固定化マイクロビーズを検出部３に充填後、該測定試料液を供給部２から注入し、同様に遠心力で検出部３に送液して前記抗原固定化マイクロビーズが充填されている検出部３を前記測定試料液で満たす（Ｓ５）。このようにして前記抗原固定化マイクロビーズと前記測定試料液とを接触させた後、所定時間インキュベートして抗原抗体反応を行う（Ｓ６）。
【００４４】
本発明に使用できる抗体の種類としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥいずれも使用できるが、具体的に測定に使用する抗体は、当然のことながら、測定対象抗原と反応する抗体が選択される。
【００４５】
抗原抗体反応がおこなわれる検出部３の内部の様子を図３に概念的に表す。表面に抗原が固定化（固定化抗原８）されたマイクロビーズ７が保持されている。検出部３から排出部４につながる流路６は、その深さがマイクロビーズ７の直径より小さいため、マイクロビーズ７は流路６の方へ流出せずに検出部３で止まっている。この検出部３に、酵素で標識された抗体１０と測定対象抗原９を含有する前記測定試料液が、上記したように送液されて、酵素標識抗体１０と固定化抗原８または測定対象抗原９との間で競合的に抗原抗体反応が行われる（図３）。
【００４６】
本実施の形態において、酵素標識抗体１０の量は、測定対象抗原９とマイクロビーズ７上の固定化抗原８の全てと結合（反応）する量より少ないため、測定対象抗原９と固定化抗原８とで酵素標識抗体１０を取り合う形で競合的結合が起きる。そして、固定化抗原８と結合する酵素標識抗体１０の量は、試料中の測定対象抗原９の量（濃度）によって規則性を持って変化するため、固定化抗原８と結合した酵素標識抗体１０の量を発光強度分析等により検出すれば、試料中の測定対象抗原量を定量することができる。
【００４７】
固定化抗原８と結合した酵素標識抗体１０の量を測定するに当たり、インキュベートによる抗原抗体反応後に、緩衝液を供給部２より注入して流路５、６内及び検出部３を洗浄する（Ｓ７）。洗浄の目的は、測定対象抗原９と酵素標識抗体１０との結合物質、未反応の測定対象抗原９およびその他の検出時に障害となる物質の排出除去である。これらの排出物はマイクロ流路の排出部４より排出する。
【００４８】
前記洗浄後、発光試薬として、ｐ−ヨードフェノール、ルミノールおよび過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含む水溶液を供給部２より注入し、固定化抗原８と結合した酵素標識抗体１０を発光させ（Ｓ８）、該発光の発光強度をイメージングアナライザーで測定する（Ｓ９）。以上の測定（検定）操作を測定対象抗原９の濃度を変化させて行い、抗原濃度と発光強度の関係についての検量線を作成する。該検量線の作成にあたり、測定対象抗原９の濃度毎に検査ディスクを変えてもよく、複数のマイクロ流路を有する検査ディスクを使用してマイクロ流路毎に測定対象抗原濃度を変化させて、１枚の検査ディスクで測定を行っても良い。時間短縮、効率性の点で１枚の検査ディスクで検量線を作成できる測定を行うことが好ましい。
【００４９】
抗原濃度が未知である実際の測定対象試料を、上記と同様の測定フローで測定し、得られた発光強度を前記検量線上にプロットして抗原濃度を読み取ることによって、未知試料中の抗原濃度を決定することができる。
【００５０】
上記の抗原抗体反応に関しては、数分間、具体的には１０分間以内の２分間以上で十分である。１枚の検査ディスクの複数のマイクロ流路で同時測定することによるタイムラグを考慮すれば、３分間以上が好ましい。
【００５１】
本発明の一例として、抗原として腫瘍マーカーであるＣＥＡ（癌胎児性抗原）、酵素標識抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）で標識したゴートポリクローナル抗体を使用して免疫学的検定を行った。この例において、抗原抗体反応を５分間で行ったときの検量線を図６に示す。なお、該抗原抗体反応が１０分間および１５分間であってもほぼ同じプロットとなる検量線が描かれた。
【００５２】
図６から明らかなように、測定対象抗原濃度が０．９ｐｇ／ｍＬと９ｐｇ／ｍＬとで発光強度に明らかな差があり、このことは、試料中の測定対象抗原濃度がこの範囲であっても測定できることを示している。以上述べたとおり、本発明により非常に高感度の測定が短時間でかつ高精度に実施可能となった。
【００５３】
上記の本発明の免疫学的検定法に使用する検査ディスクの素材としては、熱可塑性樹脂若しくは熱硬化性樹脂等の高分子材料、セラミックス、ガラス、シリコンまたは金属等の任意の素材が使用できる。密閉性、微細加工性の点でガラス、シリコン、高分子材料、またはこれらの組み合わせが好ましい。高分子材料としては、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシロキサン類を使用することができる。なお、これらの素材は、マイクロ流路およびマイクロチャンバー（検出部）の状況を、肉眼的または光学的に観察するために透明であるのが好ましい。
【００５４】
前記検査ディスクの製造方法として、次のような方法を挙げることができる。例えば、流路とマイクロチャンバーのパターンを有する前記材質のシートまたはプレートと、試料液の供給部及び排出部を有する平坦なシートまたはプレートとを貼り合わせることにより製造することができる。また、該供給部および排出部は、流路とマイクロチャンバーのパターンを有するシートまたはプレートに形成されていてもよい。あるいは、流路、マイクロチャンバー、供給部、および排出部のパターンが、２枚のシートまたはプレートに分割して作成されたもの（例えば略面対称の形）を、貼り合わせて前記検査ディスクを製造してもよい。光学的な観察及び解析に適する点で、前記検査ディスクの厚さは１ｍｍ〜３ｍｍが好ましい。
【００５５】
これらの流路とマイクロチャンバー等のパターンを有するシートは、金型でプレスしたり、金型に熱可塑性樹脂等の流動性の素材を流し込むことで形成してもよく、厚膜のリソグラフィーにより凸型のパターンを形成し、該パターン上に熱可塑性樹脂等の流動性の素材を流し込んで形成してもよく、シートまたはプレートに直接、機械加工やフォトリソグラフィーを用いたエッチングにより形成してもよい。
【００５６】
＜実施形態１＞
以下、好適な実施形態について図面に基づきさらに詳しく説明する。
【００５７】
検査ディスクの作製
まず、直径４インチのシリコンウェハーを用いてマイクロ流路の鋳型を作製した。シリコンウェハー上に、薄膜フォトレジスト（ＳＵ−８ ２００５）を２０００ｒｐｍ、３０秒間スピンコートし、塗り広げた。これをホットプレートで、６５℃で１分間および９５℃で２分間加熱後、デザインされたフォトマスクと共にマスクアライナーにセットしてＵＶ（３５０ｎｍ）照射を９０秒間し、薄膜フォトレジストを光硬化させた。次に上記シリコンウェハーを６５℃で１分間および９５℃で１分間加熱した。
【００５８】
前記シリコンウェハーに厚膜フォトレジスト（ＳＵ−８ ５０）を滴下し、スピンコーターで２０００ｒｐｍ、３０秒間回転させて均一な厚さ（５０μｍ）に広げた。さらに、ホットプレートで、６５℃で６分間および９５℃で２０分間加熱後、デザインされたフォトマスクと共にマスクアライナーにセットしてＵＶ（３５０ｎｍ）照射を９０秒間し、６５℃で１分間および９５℃で５分間加熱した。その後、ＳＵ−８の現像液に浸して未重合の余分なレジストを除去し、ドライ窒素ガスで乾燥させて鋳型を完成させた。
【００５９】
この鋳型に対し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のプレポリマー（ダウコーニング製シルガード１８４）を流し込み、熱硬化させた。硬化したＰＤＭＳシートを鋳型から取り出して供給部および排出部が大気に開放するように成形した後、凹部が形成されたシート表面に対して当該シートと同じ形の平滑なガラスを張り合わせて、図２に示す６４本のマイクロ流路を備えた検査ディスク（直径１００ｍｍ、厚さ１．８ｍｍ）を作製した。
【００６０】
本実施形態で作製した前記検査ディスクの供給部２および排出部４の開口部の上面部面積は約１ｍｍ２である。また、流路５の「幅×深さ」は「１００μｍ×５６μｍ」、検出部３の容積は０．０２０ｍｍ３（平均幅×長さ×深さ＝３５０μｍ×１０００μｍ×５６μｍ）、流路６の「幅×深さ」は「１００μｍ×５μｍ」である。
【００６１】
抗原固定化マイクロビーズの調製
抗原として腫瘍マーカー「癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）」を使用した。ＣＥＡを直径１０μｍの球体状ポリスチレンマイクロビーズに、カルボジイミド法によって次のように固定化した。該ポリスチレンマイクロビーズの懸濁液０．２ｍＬ、ＥＤＣ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）０．７５ｍＬ、および超純水０．０５ｍＬを混合し、１時間室温でゆっくり攪拌した後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心後に上澄み溶液を取り除いた。さらに、ＣＥＡ溶液（９μｇ／ｍＬ）を２００μＬ混合し、低温室（４℃）で一晩ゆっくり攪拌して反応させた。この反応懸濁液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心後に上澄み溶液を取り除き、ブロッキング剤溶液（４００ｎｇ／ｍＬ）を１ｍＬ添加し、インキュベーター（３７℃）で１．５時間ゆっくり攪拌した。このビーズ懸濁液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心後、上澄み液を取り除き、ビーズを回収した。沈殿したビーズにＴＢＳTバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ；ｐＨ７．６）１ｍＬを加え再懸濁した。その後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心してマイクロビーズを回収する洗浄操作を３回、０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ；ｐＨ７．０）で前記と同様の洗浄操作を２回行い、回収したＣＥＡ固定化マイクロビーズにＰＢを加え懸濁液０．１ｍＬを調製した。前記ＣＥＡ固定化マイクロビーズ懸濁液は、免疫学的検定法を実施するまでは冷蔵庫に保管した。
【００６２】
ＣＥＡの本発明による免疫学検定（検量線の作成と検証）
前記ＣＥＡ固定化マイクロビーズ懸濁液の１．５μＬを、上記の方法により作製した検査ディスク１の供給部２から注入し、遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）で検出部３に送液して該検出部３に保持させた。本実施形態において、検出部３の容積に対する抗原固定化マイクロビーズの総体積の割合は、各検出部とも２６±０．５％となるように充填して保持した。
【００６３】
測定対象ＣＥＡを含む試料溶液と、１０００倍希釈ＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体を１：１で混合し、その混合溶液である測定試料液１μＬを供給部２から注入して遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）で検出部３に送液した。送液後、室温でインキュベートしながら抗原抗体反応を行った。なお、測定対象ＣＥＡ濃度は、０．９、９、９０、９００、および９０００（ｐｇ／ｍＬ）の５種類とし、加えてＣＥＡもＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体も入っていないＰＢについても測定した。なお、この測定は一つの検査ディスク上で、１種類の濃度について３〜５流路を使用して（ｎ数：３〜５）行った。また、インキュベート時間は５、１０、または１５分間の３種類を実施して比較した。
【００６４】
インキュベート後、ＴＢＳＴバッファーで５回、ＰＢで２回、各２μＬずつ供給部２より注入し、遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）により流路５、６内、検出部３、およびマイクロビーズ７を洗浄した（洗浄液は排出部４から排出）。この操作を２回繰り返し、測定試料液中のＣＥＡとＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体との結合物質、未反応のＣＥＡおよびその他の検出時に障害となる物質を除去した。
【００６５】
洗浄後、供給部２から発光基質水溶液（ｐ−ヨードフェノール０．４ｍＭ、ルミノール０．３７５ｍＭおよびＨ２Ｏ２０．７５ｍＭ）を１μＬ注入し遠心力（３０００ｒｐｍ、３０秒間）により検出部に発行基質溶液を送液し、マイクロビーズ７に固定化されたＣＥＡと反応したＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体の標識酵素と反応させた。これにより、マイクロビーズ７上に存在する標識酵素が発光するので、その化学発光強度（ＣＬ強度）をイメージングアナライザーで５分間測定した。上記の測定対象ＣＥＡ濃度の各条件下で抗原抗体反応を行った場合、マイクロビーズ７の表面上に固定化されたＣＥＡと抗体との結合量が異なり、その化学発光強度に差があらわれる。
【００６６】
測定対象ＣＥＡが少なければ、マイクロビーズ表面に固定化されたＣＥＡと反応する酵素標識抗体が多く、反対に、測定対象ＣＥＡが多ければ、該測定対象ＣＥＡと反応する酵素標識抗体が多くなるので、固定化ＣＥＡと反応する酵素標識抗体は少なくなる。したがって、測定対象ＣＥＡが少ないほど、検出部３（マイクロビーズ保持部分）の発光強度が強く、測定対象ＣＥＡが多いほど発光強度が弱い。
【００６７】
試料中のＣＥＡ濃度と発光強度の関係について、その測定結果を図６に示す。抗原抗体反応時間を５分間とした場合の測定結果であるが、該反応時間を１０分間または１５分間とした場合も、ほぼ同じプロットおよび線が得られ、本実施形態において抗原抗体反応時間は５分間であれば十分であることが示された。なお、図６で９０００ｐｇ／ｍｌにおける発光強度は、ＣＥＡもＨＲＰ標識ゴートポリクローナル抗体も入っていないＰＢを検出部３に送液した後、発光基質水溶液を送液した際のバックグラウンドの発光強度とほとんど差がないことが示された。また、ＣＥＡ固定化マイクロビーズの検査ディスクへの注入から発光強度測定までの測定時間については、約１５分間であり、非特許文献２による方法の１／２〜１／４にまで時間が短縮された。
【００６８】
また、試料中のＣＥＡ濃度が０．９ｐｇ／ｍＬと９ｐｇ／ｍＬとで発光強度に明らかな差があり、このことは、試料中の測定対象ＣＥＡ濃度がこの範囲であっても測定できることを示している。この点に関し、ＣＥＡ濃度を変化させた既知試料を数回測定し、全て図６の検量線上にプロットされることを確認した。以上のことから、本発明によって非常に高感度の測定が短時間でかつ高精度に実施可能であることを実証することができた。
【００６９】
このように短時間で高精度に測定できる理由については、明確ではないが、マイクロビーズの体積と検出部であるマイクロチャンバーの容積の比率を特定のものとしたこと、非常に小さなマイクロビーズを使用して反応場である表面積を大きくしたことが一因と考えられる。さらに、これらのことにより、マイクロビーズ表面上での抗原抗体反応の濃度を非特許文献２の方法の１／１０以下とすることができたことによるものと考えられる。すなわち、マイクロビーズ表面上の抗原および抗体の濃度が低くなったことにより、分子量の比較的大きな抗体が立体的障害を受けることなく、固定化抗原と反応がスムーズに進行できるようになったことによるものと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
高感度かつ迅速な免疫学検定が実施可能となることにより、癌あるいは感染症等様々な疾病の早期かつ的確な診断、および予後の追跡による、例えば癌転移の早期発見への応用が可能である。
【符号の説明】
【００７１】
１ 検査ディスク
２、２ａ、２ｂ 供給部
３ 検出部（マイクロチャンバー）
４ 排出部
５、６ 流路
７ マイクロビーズ
８ 固定化抗原
９ 測定対象抗原
１０ 酵素標識抗体
１１ 別形態の検査ディスク
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されているディスク状検査容器を使用して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出する免疫学的検定法。
【請求項２】
前記マイクロビーズに固定化される抗原は腫瘍マーカーである、請求項1に記載の免疫学的検定法。
【請求項３】
１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ濃度の前記腫瘍マーカーの水溶液により、前記マイクロビーズに前記腫瘍マーカーを固定化して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出する、請求項1または２に記載の免疫学的検定法。
【請求項４】
前記検出部の１個の容積は０．００１〜０．１ｍｍ３である、請求項1〜３いずれか一項に記載の免疫学的検定法。
【請求項５】
前記抗原抗体反応の反応時間は１〜５分間である、請求項1〜４いずれか一項に記載の免疫学的検定方法。
【請求項６】
２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されている、免疫学的検定法に使用する検査ディスク。
【請求項７】
前記マイクロビーズに固定化される抗原は、腫瘍マーカーである、請求項６に記載の免疫学的検定法に使用する検査ディスク。
【請求項８】
前記検出部の１個の容積は、０．００１〜０．１ｍｍ３である、請求項６または７に記載の免疫学的検定法に使用する検査ディスク。
【請求項１】
２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されているディスク状検査容器を使用して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出する免疫学的検定法。
【請求項２】
前記マイクロビーズに固定化される抗原は腫瘍マーカーである、請求項1に記載の免疫学的検定法。
【請求項３】
１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ濃度の前記腫瘍マーカーの水溶液により、前記マイクロビーズに前記腫瘍マーカーを固定化して、測定対象物を競合的結合原理によりに検出する、請求項1または２に記載の免疫学的検定法。
【請求項４】
前記検出部の１個の容積は０．００１〜０．１ｍｍ３である、請求項1〜３いずれか一項に記載の免疫学的検定法。
【請求項５】
前記抗原抗体反応の反応時間は１〜５分間である、請求項1〜４いずれか一項に記載の免疫学的検定方法。
【請求項６】
２〜１００本のマイクロ流路が形成され、該マイクロ流路の各々に反応前試料の供給部と、抗原抗体反応の検出部と、反応後試料の排出部とを有し、さらに、抗原を固定化したマイクロビーズが前記検出部に保持されている、免疫学的検定法に使用する検査ディスク。
【請求項７】
前記マイクロビーズに固定化される抗原は、腫瘍マーカーである、請求項６に記載の免疫学的検定法に使用する検査ディスク。
【請求項８】
前記検出部の１個の容積は、０．００１〜０．１ｍｍ３である、請求項６または７に記載の免疫学的検定法に使用する検査ディスク。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２１６９４７（Ｐ２０１０−２１６９４７Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６３０８９（Ｐ２００９−６３０８９）
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【出願人】（５９８１２３１３８）学校法人 創価大学 (49)
【出願人】（８００００００８０）タマティーエルオー株式会社 (255)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１６日（２００９．３．１６）
【出願人】（５９８１２３１３８）学校法人 創価大学 (49)
【出願人】（８００００００８０）タマティーエルオー株式会社 (255)
【Ｆターム（参考）】
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