免疫調節物質
ある種の血管障害を含めて、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療用医薬品の製造に使用される、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に由来する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節物質、特に細胞免疫応答を調節するワクチン及びその使用に関する。本発明は、ある種の血管障害を含めて自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療及び／又は予防用医薬品の製造における免疫調節物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、体を防御し、細菌、ウイルス及び他の侵入異物に起因する感染を排除するのに通常働く細胞及び細胞成分（分子）の複雑なネットワークである。人が自己免疫疾患を有する場合、免疫系は誤って自己を攻撃し、人自身の体の細胞、組織及び器官を標的にする。標的部位における免疫系細胞及び分子の集合は、大まかに炎症と称することができる。
【０００３】
多数の異なる自己免疫疾患があり、それらは各々異なる方法で体に影響を及ぼし得る。自己免疫疾患の多くはまれなものである。しかし、グループとすると、自己免疫疾患は数百万人が罹患している。
【０００４】
一部の自己免疫疾患は、ウイルス感染、寄生虫感染、慢性細菌感染などのある誘因によって開始又は悪化することが知られている。それほど理解されていない他の作用が免疫系に影響を及ぼし、自己免疫疾患の過程は加齢、慢性ストレス、ホルモン及び妊娠を含む。
【０００５】
自己免疫疾患は慢性であることが多く、人が健康に見える又は感じることができるときでも生涯にわたる注意及び監視が必要である。現在、ほとんどの自己免疫疾患は治療によって治癒又は寛解することができない。
【０００６】
医師は、ほとんどの場合、自己免疫疾患に起因する炎症の結果を患者が管理する助けとなる。一部の人においては、限定された数の免疫抑制薬物療法が疾患の寛解をもたらすことがある。しかし、彼らの疾患が寛解した場合でも、患者は薬物療法を中止できることはまれである。免疫抑制薬物療法の長期副作用はかなりのものになり得る。
【０００７】
血管損傷の開始及び進行は複雑でさまざまな原因によって起こるプロセスであるが、炎症反応が重要な役割を果たしている証拠が増えている。血管損傷は、アテローム性動脈硬化症の発症及び心筋梗塞、発作、末梢動脈閉塞などの急性虚血性症候群をもたらす血栓プロセスに関与する
【０００８】
免疫機構は、アテローム性動脈硬化症及びＭＩＨ（myointimal hyperplasia）の発症及び維持に重要となり得る。
【０００９】
ＭＩＨは、バルーン血管形成術などの傷害に対する過度の治癒応答とみなすことができる。一連の事象は、基底膜の損失、ＶＳＭＣ（vascular smooth muscle cell）の中膜から内膜への移動、ＶＳＭＣの増殖及びより分泌性である線維芽細胞型への表現型の変化並びに細胞外基質の生成増加をもたらし、血管の狭窄又は閉塞を最終的にもたらす。これはバイパス移植及びバルーン血管形成術後に起こり、臨床実務におけるかかる症例の約３０％に影響を及ぼす。これはかかる手順の失敗の主原因であり、生じた狭窄及び閉塞血管／移植片の治療は問題となる。ＭＩＨをもたらす基本的な細胞機序は十分に理解されておらず、それを有効に防止することができる療法は現在まで開発されていない。本特許の臨床的な妥当性は、英国及び世界中で毎年実施されるきわめて多数の冠動脈血管形成術に関係する。薬物を溶出するステントは有望な結果を現在生み出しているが、それが再狭窄を完全に防止しそうにはない。本特許に提案される免疫療法などの安全で比較的安価な補助的治療は、臨床的に重大な影響を有する。
【００１０】
再狭窄に対する免疫療法に関わるこれらの機序は複雑であり、完全には解明されていない。血管形成術に起因する内皮傷害は、ｈｓｐに対する宿主免疫応答によって増悪し得る。Ｈｓｐは、アテローム性動脈硬化症を含めてさまざまな免疫障害の病態発生及び病態生理に結び付けられるストレスを受けた細胞によって産生されるタンパク質である（Xu Q et al.、Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799）。これは、血管形成領域中の内皮及び平滑筋細胞上に存在する可能性がある。事実上、ｈｓｐは、免疫系によってその後攻撃され得る自己抗原として働く。この状況は、ウサギ及びマウスにおいて内皮損傷をもたらす交差反応性マイコバクテリアｈｓｐ（ｈｓｐ６５）で免疫化することによって実験的に引き起こすことができる（Xu Q et al.、Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799及びGeorge J et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210）。この効果は、Ｔｈ２リンパ球によって分泌されるＩＬ−４に依存すると考えられ、抗体によっておそらく媒介されるGeorge J et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210及びSchett G et al.、J Clin. Invest. 1995; 96: 2569-2577）。これらの観察とヒトとの関連性は、ｈｓｐ６５カラムから溶出し親和性によって精製されたヒト抗体が、ストレスを受けたヒト内皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで損傷する能力によって示唆される。この知見は、この抗体が、ｈｓｐ６５のヒト相同体であるｈｓｐ６０と交差反応し、ストレスを受けた内皮細胞の膜上で発現されたときに抗体に接近することができることを示唆する。ストレスを受けた内皮細胞に結合したかかる抗体が、心臓移植後の冠動脈疾患を発生させる要因であることが示唆された（Crisp SJ et al.、J Heart Lung Transplant 1994; 81-91）。Mukherjee et al.（Thromb Haemost 1996; 75: 258-60）は、手術前のｈｓｐ６５に対する抗体のレベルと冠動脈再狭窄との関連性がないことを示したが、血管形成術後にかかる抗体レベルが低下した患者はより再狭窄しにくいことを示した。実際には、血管疾患患者は抗体が増加するだけでなく、ｈｓｐレベル自体も増加するので、ｈｓｐに対する抗体の役割は複雑になり得る（Wright BH et al.、Heart Vessels 2000; 15: 18-22）。したがって、抗体レベルの見掛けの低下は、単にこのタンパク質レベルの増加を示しているに過ぎない恐れがある。さらに、ｈｓｐは調節効果を有し、動脈の平滑筋細胞に結合し、内在化を必要とせずにより長く残存する（Johnson AD et al.、Atherosclerosis 1990; 84: 111-119）。
【非特許文献１】Xu Q et al.、Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799
【非特許文献２】George J et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210
【非特許文献３】Schett G et al.、J Clin. Invest. 1995; 96: 2569-2577）
【非特許文献４】Crisp SJ et al.、J Heart Lung Transplant 1994; 81-91）
【非特許文献５】Mukherjee et al.(Thromb Haemost 1996; 75: 258-60）
【非特許文献６】Wright BH et al.、Heart Vessels 2000; 15: 18-22）
【非特許文献７】Johnson AD et al.、Atherosclerosis 1990; 84: 111-119）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、対象に投与された放線菌類ロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドニア（Gordonia）属、ノカルジア（Nocardia）属、ダイエツィア（Dietzia）属、ツカムレラ（Tsukamurella）属及びノカルジオイデス（Nocardioides）属のいずれか１種の属に属する細菌の全細胞が、その対象の免疫系、特に細胞免疫系の改変を誘発することができ、自己免疫疾患又は自己免疫異常、特に例えば血管内膜の炎症を含むものに対する防止及び／又は治療効果をもたらすという予想外の発見に基づく。
【００１２】
自己免疫疾患及び自己免疫異常、特に例えば血管内膜の炎症を含むものを有効に治療及び／又は予防するために、放線菌類ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属のいずれか１種の属に属する細菌の全細胞を含む組成物を使用する利点は、この治療及び／又は予防が、常法に従って現在使用されている化学療法、すなわち免疫抑制薬物療法よりも長期副作用を抑えつつ実施されるということであろう。
【００１３】
本明細書では「細胞免疫系」という句は、Ｔリンパ球の存在に依存する細胞性免疫応答を含む。「Ｔリンパ球」という用語は、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び調節性Ｔ細胞を含む。例えば自己免疫疾患又は異常を含めた細胞性免疫不全を例えば克服するために細胞性免疫応答の改変を使用することができる。
【００１４】
本明細書では「調節する（modulate）」、「改変する（modify）」、「改変（modification）」という用語及び他のその派生語は、細胞免疫系の成分を下方制御、阻害、誘導、刺激、上方制御、変更し、又はそれに影響を及ぼすことを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、さらに、自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００１６】
適切には、自己免疫疾患又は自己免疫異常は、対象自身の免疫系が対象組織の１個又は複数に損傷を与える型のものである。適切には、自己免疫応答は、対象内の何か又は対象の環境内の何かによって引き起こされることがある。
【００１７】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、誘因後のものであり得る。例えば、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、感染及び／又は他のある誘因に起因するものであり得る。潜在的誘因は、例として、老齢、感染（例えば寄生虫感染）、ステロイド治療、ミョウバンを用いたワクチン接種の繰り返し、妊娠及び／又は癌であり得る。
【００１８】
本発明は、さらに、自己免疫疾患を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用であって、自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管内膜の炎症を含む、使用を提供する。
【００１９】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管内膜の炎症を含むと同様に、血管筋層又は心筋の炎症を含む。
【００２０】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものであり得る。
【００２１】
本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１つ又は複数であり得る。
【００２２】
適切には、本発明による血管障害は、自己免疫エレメント、例えば自己免疫応答に起因するものを含む任意の血管疾患又は異常を含むことができる。
【００２３】
適切には、本発明による血管障害は、レイノー病又はレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１つ又は複数を含むことができる。
【００２４】
適切には、本発明による移植片拒絶は、特に免疫抑制薬の非存在下での慢性移植片拒絶とすることができる。したがって、本発明による組成物は、移植前、移植中及び／又は移植後に投与される従来の免疫抑制薬の代用品として使用することができる。本発明による組成物は、角膜、骨髄、器官（例えば、腎臓、肝臓）、水晶体、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織、島細胞の１つ又は複数などの天然又は人工細胞、組織及び器官を移植するときに使用することができる。
【００２５】
本発明は、さらに、血液障害を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２６】
本発明は、さらに、関節炎、特に関節リウマチを治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、移植片拒絶を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２８】
さらに別の態様においては、本発明は、さらに、乾癬を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２９】
本明細書では「免疫調節物質」という用語は、対象の細胞免疫系を調節する物質を意味する。
【００３０】
本明細書では「全細胞」という用語は、完全な細菌又は実質的に完全な細菌を意味する。特に、本明細書では「完全な」という用語は、全細胞、特に生細胞全体に存在する成分のすべてを含む細菌及び／又はそれから１個若しくは複数の成分を除去するために特に処理されていない細菌を意味する。本明細書では「実質的に完全」という用語は、細菌を得るのに使用される単離及び／又は精製プロセスが、例えば、細胞にわずかな改変をもたらし、且つ／又は細胞の１個若しくは複数の成分を除去し得るが、かかる改変及び／又は除去が起こる程度が重要でないことを意味する。特に、本発明による実質的に完全な細胞は、それから１個又は複数の成分を除去するために特に処理されていない。
【００３１】
細菌細胞の個々の成分はアジュバント効果を誘発するために使用できることが示唆されるが、本発明によるロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞の使用は本発明の前に企図されなかった。驚くべきことに、前記属に属する細菌の全細胞を使用することによって、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療及び／又は予防を実施できるということが見出された。前記細菌の前記全細胞の投与に起因する細胞免疫応答の改変は、細菌の個々の成分の投与によって誘発される応答よりも有利には長時間持続することができる。
【００３２】
好ましくは、本発明による組成物は、１個を超える全細胞を含み、より好ましくは複数の全細胞を含む。
【００３３】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物は抗原及びアジュバントを含むことができ、前記アジュバントは、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む。前記抗原は、これらの属によって、他の微生物及び真核生物細胞、例えば脊椎動物細胞のミトコンドリアと共有されるものとすることができる。
【００３４】
別の態様においては、免疫調節物質組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物であって、薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を場合によっては含んでいてもよい薬剤組成物とすることができ、使用される前記免疫調節物質組成物は細胞免疫応答を改変する。
【００３５】
さらに別の態様においては、免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞と、例えばインターロイキン２などの少なくとも１種の追加のサイトカインとを含むことができる。サイトカインは、本発明の免疫調節作用を強化するのに役立ち得る。
【００３６】
適切には、抗原又は抗原決定基は、（英国特許第００２５６９４．１号に教示される）ＢＣＧ（bacillus of Calmette and Guerin）ワクチン、ジフテリアトキソイドワクチン、ジフテリア／破傷風／百日咳（ＤＴＰ又は三種混合）ワクチン、百日咳ワクチン、破傷風トキソイドワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、経口ポリオワクチン（ＯＰＶ（oral poliomyelitis vaccine））及びマイコバクテリアワクチン（Mycobacterium vaccae）又はその一部の１又は２以上からの抗原又は抗原決定基とすることができる。このリストは決して限定的なものではなく、他の出所に由来する適切な抗原を本発明による組成物に添加することができる。これらの抗原に対する応答も、本発明による組成物の投与に起因して誘導された応答調節の恩恵を受けることができる。他の適切な抗原は、本発明による調節物質組成物中に天然に存在しない他のウイルス、腫よう、寄生生物又は他の細菌に由来する抗原とすることができる。
【００３７】
適切には、免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、２個以上のかかる抗原又は抗原決定基を含むことができる。
【００３８】
さらに別の態様においては、本発明によるロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物はワクチン中で使用することができ、又はワクチンとして使用することができる。
【００３９】
適切には、ワクチンは予防ワクチン又は治療ワクチンとすることができる。
【００４０】
さらに別の態様においては、本発明は、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療又は予防に使用されるロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物を提供する。
【００４１】
一態様においては、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を下方制御することができる。
【００４２】
別の態様においては、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ１応答を上方制御することができる。
【００４３】
適切には、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を下方制御しＴｈ１応答を上方制御することができる。
【００４４】
或いは、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答に影響を及ぼさずにＴｈ１応答を上方制御することができる。
【００４５】
或いは、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を下方制御し、Ｔｈ１応答も下方制御することができる。
【００４６】
或いは、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を上方制御し、Ｔｈ１応答も上方制御することができる。
【００４７】
別の態様においては、本発明は、自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防する方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与するステップを含み、前記組成物が細胞免疫応答を調節する、方法を提供する。
【００４８】
適切には、有効量の薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を単回投与することができる。或いは、有効量の薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を複数回（繰り返し）、例えば２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、１０回以上又は２０回以上繰り返し投与することができる。
【００４９】
特に、かかる繰り返し投与は、例えば定着した慢性症状の治療に必要とされることがある。
【００５０】
本発明のさらに別の態様においては、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を投与することを含む、自己免疫疾患又は自己免疫異常に対して免疫を含めて対象を防御する方法が提供される。
【００５１】
本明細書では「防御された」という用語は、本発明による組成物を用いた治療を受けていない対象又は本発明による組成物を投与されていない対象よりも、対象が疾患／障害に罹患し難いこと、及び／或いは本発明による組成物を用いた治療を受けていない対象又は本発明による組成物を投与されていない対象よりも、対象が疾患／障害に対抗する又は疾患／障害を克服することができることを意味する。
【００５２】
別の態様においては、本発明は、本発明による薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与するステップであって、前記組成物が抗原又は抗原決定基と同時投与されるステップを提供する。
【００５３】
本組成物が本発明によって抗原又は抗原決定基と同時投与されるときには、抗原又は抗原決定基は、適切には、（英国特許第００２５６９４．１号に教示される）ＢＣＧワクチン、ジフテリアトキソイドワクチン、ジフテリア／破傷風／百日咳（ＤＴＰ又は三種混合）ワクチン、百日咳ワクチン、破傷風トキソイドワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）及びマイコバクテリアワクチン又はその一部の１個若しくは複数からの抗原又は抗原決定基とすることができる。適切には、かかる抗原又は抗原決定基の２個以上又は３個以上を本発明による薬剤組成物又は免疫調節物質組成物と同時投与することができる。
【００５４】
好ましくは、本発明による医薬品は、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療又は予防に使用される。
【００５５】
本発明のさらに別の態様においては、本発明による薬剤組成物又は免疫調節物質組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１種を超える属に属する細菌を含むことができる。適切には、本組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属のいずれか１種に属する２個以上又は３個以上の細菌を含ロドコッカスむことができる。
【００５６】
好ましくは、本発明に従って使用される細菌は、例えばゴルドニア・ブロンチアリス（Gordonia bronchialis）、ゴルドニア・アマレア（G. amarae）、ゴルドニア・スプチ（G. sputi）、ゴルドニア・テレア（G. terrae）、ノカルジア・アステロイド（Nocardia asteroides）、ダイエツィア・マリス（Dietzia maris）、ツカムレラ・パウロメタボラ（Tsukamurella paurometabola）、ロドコッカス・ルベル（Rhodococcus ruber）、ロドコッカス・ロドニイ（Rhodococcus rhodnii）、ロドコッカス・コプロフィラス（R. coprophilus）、ノカルジオイデス・アルバス（Nocardioides albus）、ツカムレラ・インコネンシス（Tsukamurella inchonensis）などのこれらの属のいずれかに属する任意の種を含めて、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する。適切には、特定の各属から使用される種は、低抗原性培地、好ましくは非抗原性培地である培地上で増殖することができるものである。単なる例として、適切な非抗原性培地はソートン培地である。
【００５７】
適切には、本発明に従って使用される細菌は、（以前はノカルジア・ルブラ（Nocardia rubra）として知られた）ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・ルホドクラウス（Rhodococcus rhodocrous）、ロドコッカス・ロドニイ、ロドコッカス・コプロフィラス、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）、ロドコッカス・エリトポレス（Rhodococcus erythopolis）を含めて、ロドコッカス属に属することができる。
【００５８】
適切には、本発明に従って使用される細菌はロドコッカス・ルベルとすることができる。
【００５９】
好ましくは、本発明による細菌は使用前に死滅させる。適切には、本発明による細菌は、その熱処理、例えば、オートクレーブ中１２１℃で１５分間の熱処理によって死滅させることができる。
【００６０】
他の適切な滅菌処理としては、紫外若しくは電離放射線、フェノール、アルコール、ホルマリンなどの化学物質による処理などが挙げられる。
【００６１】
適切には、本発明による細菌は精製及び／又は単離することができる。
【００６２】
適切には、本発明による細菌は、水又は緩衝食塩水、適切にはｐＨ８で緩衝されたボラート中に懸濁することができる。
【００６３】
本明細書では「対象」という用語は動物を意味する。適切には、対象は、トリ、（例えばエビなどの）甲殻類、魚及び哺乳動物を含む、例えば、任意の動物とすることができる。好ましくは、対象は、例えば家畜及びヒトを含めて、哺乳動物である。本発明の一部の態様においては、対象は適切にはヒトとすることができる。
【００６４】
薬剤組成物又は免疫調節物質組成物を（１回を超える投与がなされる場合には初めて）家畜に投与するときには、家畜が初めて授乳した後に投与することが好ましい。特に、一部の適用例では、（１回を超える投与がある場合には）初回又は１回のみの薬剤組成物又は免疫調節物質組成物を投与する前に親の初乳を乳児に摂取及び／又は消化させることが重要なことがある。不確かさを回避するために、一部の適用例では、薬剤組成物又は免疫調節物質組成物の最初の投与は、生後約１〜４日目、好ましくは生後１〜３日目、より好ましくは生後１〜２日目、好ましくは生後２〜３日目で行うべきである。次の投与は、最初の注射から７日後及び／又は８〜１２週後に行うことができる。
【００６５】
本明細書では「免疫調節物質」という用語はワクチンを含む。
【００６６】
細菌は放線菌目（Actinomycetales）に属する細菌であることが好ましい。しかし、細菌はマイコバクテリアワクチンではないことが好ましい。一実施形態においては、細菌はマイコバクテリア属に由来しないことが好ましい。
【００６７】
治療用途
本発明の免疫調節物質は治療に使用することができる。特にかかる化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴリンパ球応答を調節するために使用することができ、且つ／又はｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答に関与する他の細胞を調節するために使用することができる。
【００６８】
Ｔ細胞増殖及び／又は分化及び／又は活性を調節、特に遮断することができる免疫調節物質／薬剤組成物は、適応免疫応答、すなわち細胞免疫応答の調節によって予防又は治療に感受性が高いあらゆる障害に対して使用することができる。
【００６９】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、対象自身の免疫系が対象組織の１つ又は複数に損傷を与える型のものである。適切には、自己免疫応答は、対象内の何か又は対象の環境内の何かによって引き起こされることがある。
【００７０】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は誘因後のものであり得る。例えば、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、感染及び／又は他のある誘因に起因するものであり得る。潜在的誘因は、例として、老齢、感染（例えば寄生虫感染）、ステロイド治療、アラムを用いたワクチン接種の繰り返し、妊娠及び／又は癌であり得る。
【００７１】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管内膜の炎症を含むものとすることができる。
【００７２】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管内膜の炎症を含むと共に、血管筋層又は心筋の炎症を含む。
【００７３】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものであり得る。
【００７４】
本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１つ又は複数とすることができる。
【００７５】
適切には、本発明による血管障害は、自己免疫エレメント、例えば自己免疫応答に起因するものを含む任意の血管疾患又は異常を含むことができる。
【００７６】
適切には、本発明による血管障害は、レイノー病及びレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１つ又は複数を含むことができる。
【００７７】
適切には、本発明による移植片拒絶は、特に免疫抑制薬の非存在下での慢性移植片拒絶とすることができる。したがって、本発明による組成物は、移植前、移植中及び／又は移植後に投与される従来の免疫抑制薬の代用品として使用することができる。本発明による組成物は、角膜、骨髄、器官（例えば、腎臓、肝臓）、水晶体、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織、島細胞の１つ又は複数などの天然又は人工の細胞、組織及び器官を移植するときに使用することができる。
【００７８】
Ｔヘルパー細胞
本明細書では「Ｔｈ１」という用語は、１型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）を指す。この用語は、かかる細胞型によって媒介される応答又はかかる細胞型を介した応答を指すのに本明細書では使用することもできる。かかる応答は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の分泌、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌、マクロファージの活性化、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化又は任意の他のＴｈ１関連事象の１つ若しくは複数を含むことができる。したがって、「Ｔｈ１」という用語は、Ｔｈ１細胞及びかかる細胞が生成する免疫応答を含むことができる。
【００７９】
本明細書では「Ｔｈ２」という用語は、２型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）を指す。この用語は、かかる細胞型によって媒介される応答又はかかる細胞型を介した応答を指すのに本明細書では使用することもできる。かかる応答は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の分泌、スプライスバリアントインターロイキンＩＬ−４δ２の分泌、インターロイキン−５（ＩＬ−５）の分泌、リンパ球上の細胞決定因子３０（ＣＤ３０）レベルの増加、血中又は血液の好酸球中の免疫グロブリン−Ｅ（ＩｇＥ）レベルの増加又は任意の他のＴｈ２関連事象の１つ若しくは複数を含むことができる。したがって、「Ｔｈ２」という用語は、Ｔｈ２細胞及びかかる細胞が生成する免疫応答を含むことができる。
【００８０】
さまざまな条件は、特にＴｈ１及び／又はＴｈ２の活性化及び／又は増殖において、制御されていない細胞免疫応答又は不適当に調節された細胞免疫応答をもたらし、或いはそれらの細胞免疫応答に起因し得ることが知られている。これは、調節されていない場合又は不適当に調節されたままにされた場合、対象に対して１つ又は複数の有害な効果をもたらすことが見出された。
【００８１】
調節されていない又は不適当に調節された細胞免疫応答は、例えば動脈硬化症などの炎症性血管疾患、血管形成術後の筋内膜増殖、前部ブドウ膜炎などの自己免疫異常において、また、移植／拒絶中にも認められる。さらなる例として、Stansby et al.、Eur J Vasc Endovasc Surg 2002; 23: 23-28は、抗体応答を調節するマイコバクテリア調製物による治療によって、ラット血管形成モデルにおいて血管疾患、すなわち再狭窄が減少するという仮説を検定した。ヒトにおける使用に適切なマイコバクテリア材料による免疫調節はＭＩＨを抑制できることが判明した。かかる調節は低リスクなので、これは、再狭窄と闘う重要な新しい治療様式の見通しを開くものである。
【００８２】
したがって、本発明の一目的は、調節されていない又は不適当に調節された細胞免疫応答のマイナス効果を克服するように、Ｔｈ１及び／又はＴｈ２の制御又は調節を含めて細胞免疫応答の制御を促進し確立することである。
【００８３】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１又はＴｈ２応答、すなわち例えば組織損傷をもたらすＴｈ１又はＴｈ２応答が制御される。
【００８４】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１応答を減少させ、Ｔｈ２応答を減少させることができる。
【００８５】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ２応答に影響を及ぼさずにＴｈ１応答を増大させることができる。
【００８６】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を減少させることができる。
【００８７】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を増大させることができる。
【００８８】
適切には、当業者は、本発明による各属の特定の種を試験して、その特定のＴｈ１／Ｔｈ２応答を測定することができる。
【００８９】
調節されていない又は不適当に調節された免疫応答は、一部の疾患がＴｈ１及び／又はＴｈ２応答を変化させるという事実或いはＴｈ１及び／又はＴｈ２応答の変化の結果であるという事実のために、疾患の確立においてある役割を果たす。これらの非定型Ｔｈ１及びＴｈ２反応に付随するのは、組織病理の根底にある機序に関与し得る一連の異常な炎症反応である。
【００９０】
単なる例として、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は自己免疫疾患又は自己免疫異常に対抗することができる。
【００９１】
ワクチン
１個又は複数の物質を活性成分として含有するワクチンの調製は当業者に公知である。一般に、かかるワクチンは溶液又は懸濁液として、注射剤として調製される。注射前に溶液又は懸濁液にするのに適切な固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化することもでき、リポソームに封入された活性成分とすることもできる。活性成分は、薬剤として許容され該活性成分と適合性である賦形剤と混合されることが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど及びこれらの組合せである。或いは、ワクチンは、例えば、経口摂取されるように、且つ／又は吸入可能なように調製することができる。
【００９２】
また、必要に応じて、ワクチンは、少量の湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助的物質を含有することができる。
【００９３】
投与
一般に、医師は、個々の対象に最も適切であるワクチン、免疫調節物質組成物及び薬剤組成物の実際の投与量を決定する。それは、個々の患者の年齢、体重及び応答に応じて変わる。以下の投与量は平均的な症例の例示である。高い又は低い投与量範囲が有利である個々の場合があり得るのは言うまでもない。
【００９４】
使用する実際の投与量は、対象に対する毒性が最小限に抑えられることが好ましい。
【００９５】
本発明の組成物は、直接注射によって投与することができる。本組成物は、非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、皮内又は経皮投与用に処方することができる。
【００９６】
適切には、本発明による組成物は、生物１ナノグラムから１００ミリグラム、好ましくは生物１０ナノグラムから１０ミリグラム、より好ましくは生物１００ナノグラムから５ミリグラム、さらにより好ましくは生物１００ナノグラムから１ミリグラムの用量で投与することができる。一般に、本発明による組成物は、ヒト及び動物用に細菌１００マイクログラムから１ミリグラムの用量で投与することができる。
【００９７】
本発明の組成物を免疫増強剤として投与する場合には、ヒト及び動物用に生物１ナノグラムから１００ミリグラム／回、好ましくは生物１０ナノグラムから１０ミリグラム／回、より好ましくは生物１００ナノグラムから５ミリグラム／回、さらにより好ましくは生物１００ナノグラムから１ミリグラム／回、さらにより好ましくは、細菌１００マイクログラムから１ミリグラム／回を規則的な間隔で投与することができる。
【００９８】
当業者には容易に理解されるように、投与量は、その用量が投与される生物によって決まる。
【００９９】
「投与する」という用語は、注射、脂質によって媒介される形質移入、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、ＣＦＡ（cationic facial amphiphile）及びそれらの組合せ、さらにはウイルスの送達を含めた送達機序による送達を含む。かかる送達機序の経路としては、粘膜、鼻、口、非経口、胃腸、局所又は舌下経路などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１００】
「投与する」という用語は、例えば、吸入用点鼻薬若しくはエアゾール剤として粘膜経路による送達、又は摂取溶液、カプセル剤若しくは錠剤としての送達、送達が例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下経路などの注射用剤形による親経路を含むが、これらだけに限定されない。
【０１０１】
「同時投与する」という用語は、本発明のアジュバント、抗原及び／又は抗原決定基の各々の投与部位及び時間が、免疫系の必要な調節が達成されるようなものであることを意味する。したがって、抗原とアジュバントは同時に同じ部位に投与することができるが、アジュバントとは異なる時間で異なる部位に抗原及び／又は抗原決定基を投与することが有利なこともある。抗原及び／又は抗原決定基とアジュバントは同じ送達ビヒクルで送達することさえできる。抗原及び／又は抗原決定基とアジュバントは結合及び／又は非結合とすることができ、且つ／或いは遺伝子的に結合及び／又は非結合とすることができる。単なる例として、本発明による免疫調節物質組成物は、１又は２以上の抗原又はさらに別の抗原の投与前、投与と同時に又は投与後に投与することができる。
【０１０２】
抗原、抗原決定基、ペプチド若しくは相同体又はそれらの模倣体は、単回投与又は複数回投与で宿主対象に別個にでも同時にでも投与することができる。
【０１０３】
本発明の免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、（非経口、皮下、皮内及び筋肉内注射を含む）注射、鼻腔内、粘膜、経口、膣内、尿道、眼球投与などいくつかの異なる経路によって投与することができる。
【０１０４】
本発明においては、投与は注射によることが好ましい。注射は皮内であることがより好ましい。
【０１０５】
本発明においては、投与は、経口的に許容される組成物によることが好ましい。
【０１０６】
ワクチン接種の場合には、本組成物は、水溶液、好ましくは緩衝生理食塩水０．１から０．２ｍｌで提供することができ、非経口的に、例えば皮内接種によって投与する。本発明によるワクチンは好ましくは皮内注射する。軽度の膨潤及び発赤、時折かゆみも注射部位において見られることがある。投与方法、用量及び投与回数は、当業者が公知の方法で最適化することができる。
【０１０７】
抗原
本明細書では「抗原」は、免疫適格性宿主に導入されたときに、実体と組み合わせることができる特異抗体又は抗体の産生を変える実体並びに／或いはＴｈ２及び／又はＴｈ１などの関連するＴｈ応答を変える実体を意味する。抗原は、（細胞、細胞断片、細胞超音波処理物を含めて）純粋な物質、物質の混合物、可溶性材料又は粒子材料とすることができる。この意味で、この用語は、任意の適切な抗原決定基、交差反応抗原、同種抗原、異種抗原、寛容原、アレルゲン、ハプテン及び免疫原又はそれらの一部並びにそれらの任意の組合せを含み、これらの用語は本明細書を通して区別なく使用される。
【０１０８】
本明細書では「抗原決定基又はエピトープ」という用語は、抗体若しくはＴ細胞受容体によって認識される抗原上の部位又はＴヘルパー細胞応答を惹起する原因である抗原上の部位を指す。これは、タンパク質抗原に由来する短いペプチド又はタンパク質抗原の一部としての短いペプチドであることが好ましい。しかし、この用語は、糖ペプチド及び炭水化物エピトープも含むものとする。この用語は、生物全体を認識する応答を刺激するアミノ酸の改変配列又は炭水化物も含む。
【０１０９】
「防止」又は「予防」ワクチンは、投薬を受けたことがない個体に投与して、防御免疫を刺激することなどによって発症を防止するワクチンである。
【０１１０】
「治療」ワクチンは、既存の症状を有する個体に投与されて症状を軽減し、又は最小限に抑え、或いは症状の免疫病理学的結果を抑止するワクチンである。
【０１１１】
アジュバント
本明細書では「アジュバント」という用語は、免疫応答の影響を増大させることができる実体又はそれに関与することができる実体を意味する。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を助け、増大させ、下方制御し、改変し、又は多様化する任意の物質又は物質の混合物である。
【０１１２】
本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の有効性を高める１個又は複数のアジュバントを含むことができる。有効であり得る追加のアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型乳濁液、水中油型乳濁液、ムラミルジペプチド、菌体内毒素、脂質Ｘ、コリネバクトリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（プロピオノバクテリウム・アクネス（Propionobacterium acnes））、百日咳菌（Bordetella pertussis）、マイコバクテリアワクチン、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、インターロイキン２、インターロイキン１２などのインターロイキン、サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックドコポリマー又は他の合成アジュバントが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかるアジュバントは、さまざまな供給源から商業的に入手可能であり、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）又はフロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)である。ヒト用には水酸化アルミニウムのみが認可されている。例えばマイコバクテリアワクチンなどの他のアジュバントの一部は、臨床試験が認可された。
【０１１３】
適切には、アジュバントは、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属のいずれか１種に属する細菌の全細胞とすることができる。
【０１１４】
当技術分野では、金粒子に結合した本質的にＤＮＡ配列であり、ヘリウム銃によって皮膚中に発射されるＤＮＡワクチンは、効率的なワクチン送達システムであることが知られている。従来のワクチンとは異なり、これらのＤＮＡワクチンは在来のアジュバント成分を必要としない。本発明の別の態様によれば、本明細書の免疫調節物質組成物は、適切には、かかるＤＮＡワクチンと併用して、免疫応答の影響を増大させ、又はそれに関与することができる。
【０１１５】
薬剤組成物
本発明は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞の治療有効量を含む薬剤組成物であって、薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を（それらの組合せを含めて）場合によっては含んでいてもよい薬剤組成物にも関する。
【０１１６】
本薬剤組成物は、第１の成分が抗原を含み、第２の成分がそのアジュバントを含む２種類の成分を含むことができる。第１の成分と第２の成分は、連続して、同時又は一緒に、さらには異なる投与経路によって送達することができる。
【０１１７】
本薬剤組成物は、ヒトの医学及び獣医学においてヒト又は動物に使用することができ、一般に、薬剤として許容される希釈剤、担体又は賦形剤のいずれかの１又は２以上を含む。治療用に許容される担体又は希釈剤は、薬剤技術においては周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。薬剤担体、賦形剤又は希釈剤は、意図する投与経路及び製薬上の標準的実務に照らして選択することができる。
【０１１８】
薬剤組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として又はそれらに加えて、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【０１１９】
防腐剤、安定剤、色素、さらには香味料も薬剤組成物中に入れることができる。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤も使用することもできる。
【０１２０】
異なる送達系に応じて様々な組成／処方要件があり得る。例として示すと、本発明の薬剤組成物は、ミニポンプを用いて、或いは粘膜経路によって、例えば、吸入又は摂取可能な溶液用の経鼻スプレー又はエアゾール剤として、或いは、例えば、静脈内、筋肉内、皮内又は皮下経路による送達用に該組成物が注射用剤形によって処方される非経口で送達されるように処方することができる。或いは、本製剤は、両方の経路によって送達されるように設計することができる。
【０１２１】
本発明においては、本製剤は注射用剤形であることが好ましい。本製剤は皮内注射されることがより好ましい。
【０１２２】
本発明においては、本製剤は経口的に許容される組成物であることが好ましい。
【０１２３】
薬剤は、胃腸管粘膜を経由して送達される場合には、消化管通過中に安定なままでいることができるようにすべきである。例えば、薬剤はタンパク質分解に抵抗性であり、酸ｐＨにおいて安定であり、胆汁の洗浄効果に抵抗性とすべきである。
【０１２４】
適切な場合には、薬剤組成物は、吸入によって、坐剤又はペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布粉の剤形で局所的に、皮膚貼付薬を使用して、デンプン、ラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形で経口で、或いはカプセル剤又は胚珠（ovule）を単独又は賦形剤との混合物で、或いは香味料若しくは着色剤を含むエリキシル剤、溶液又は懸濁液の剤形で投与することができ、或いは、非経口、例えば、静脈内、筋肉内又は皮下注射することができる。非経口投与の場合には、組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含むことができる無菌水溶液の剤形で最適に使用することができる。頬又は舌下投与の場合には、組成物は、従来の方法で処方することができる錠剤又は舐剤の形で投与することができる。
【０１２５】
薬剤の組合せ
本発明の薬剤は、１個又は複数の薬剤的に活性な他の物質と一緒に投与することができる。例として、本発明は、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物並びに１個若しくは複数のステロイド、鎮痛薬、抗ウイルス性、ＩＬ−２などのインターロイキン又は薬剤的に活性な他の物質との同時又は連続治療を網羅する。
【０１２６】
これらの投薬計画は、それらの物質を連続的に、同時又は一緒に投与することを含むことを理解されたい。
【０１２７】
免疫増強剤
本明細書では「免疫増強剤」という用語は、対象に投与されたときにその対象の健康を利する単離又は培養された１個又は複数の細菌を意味する。この利点は、対象の細胞免疫応答を改変することによって得られることが好ましい。
【０１２８】
本発明によれば、免疫増強剤は、例えば、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療又は予防に使用することができる。
【０１２９】
免疫増強剤は、特別に設計された食物又は動物の餌に入れて消費することによって投与することができる。
【０１３０】
免疫増強剤は、直接注射などの他の経路によって投与することもできる。
【０１３１】
細菌は、生きた生成物を維持する困難を回避するために死滅されることが好ましい。
【０１３２】
細胞免疫応答を調節する細菌の特定
別の態様においては、本発明は、細胞免疫応答を調節する（例えば、改変する）ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の１個又は複数の全細胞を同定する方法であって、（ａ）第１の試験動物を免疫賦活薬と接触させるステップと、（ｂ）第２の試験動物を、細菌と混合された免疫賦活薬と接触させるステップと、（ｃ）前記試験動物の各々における細胞免疫応答を測定するステップと、（ｄ）前記試験動物の各々における細胞免疫応答を比較するステップとを含み、細菌と混合された免疫賦活薬からの細胞免疫応答が免疫賦活薬単独よりも小さいことによって細菌による細胞免疫応答の改変が示される方法に関する。
【０１３３】
別の態様においては、本発明は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属から選択される細菌種のＴｈ１／Ｔｈ２応答を測定する方法であって、ツベルクリン皮膚試験の利用を含む方法に関する。マウスにおいては、ツベルクリン皮膚試験は、好ましくは足跡に対して実施される。支配的なＴｈ１反応においては、陽性の足跡免疫応答は２４時間で最大であり、４８時間で減少する。しかし、Ｔｈ２反応性が増大するにつれ、４８時間の陽性足跡免疫応答が増大し、２４時間における足跡免疫応答を超えることさえある。
【０１３４】
ＢＣＧワクチン接種の効果は、このツベルクリン皮膚試験を用いて詳細に記録されている。したがって、この試験アッセイは、本発明による免疫調節物質組成物を導入することによってＢＣＧ細胞免疫応答が調節されるかどうかを評価するために使用することができる。
【０１３５】
本明細書では「試験動物」という用語は、免疫賦活薬に対して細胞免疫応答を誘発するあらゆる動物を指す。試験動物は哺乳動物であることが好ましい。試験動物はラット、ハムスター、ウサギ、モルモット又はマウスであることがより好ましい。試験動物はマウスであることがより好ましい。
【０１３６】
細菌はＴヘルパー細胞応答を改変することが好ましい。適切には、細菌は、Ｔｈ１及びＴｈ２応答を減少させることによってＴヘルパー細胞応答を改変することができる。適切には、細菌は、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を減少させることによってＴヘルパー細胞応答を改変することができる。適切には、細菌は、Ｔｈ２応答に影響を及ぼすことなくＴｈ１応答を増大させることによってＴヘルパー細胞応答を改変することができる。
【０１３７】
免疫賦活薬は、既知のＴｈ１及びＴｈ２応答を有することが好ましい。例えば、免疫賦活薬ＢＣＧを用いて、それがＴｈ１応答の指標であるときには、反応は通常は２４時間で最も大きく、４８時間における反応は通常はそれよりも小さく、Ｔｈ２の寄与を含む。ＢＣＧは主としてＴｈ１応答を刺激することが知られている。かかる免疫賦活薬を使用することによって、試験細菌のＴｈ１／Ｔｈ２応答を測定することができ、したがって、特定の疾患及び／又は障害を治療及び／又は予防する所望のＴｈ１／Ｔｈ２応答を有する１又は２以上の細菌を特定することができる。
【０１３８】
細胞免疫応答はツベルクリン皮膚試験によって測定されることが好ましい。ＢＣＧなどの免疫賦活薬によるワクチン接種によって、その後試験したときにツベルクリン（Tubercle bacilliの可溶性製剤）を用いた皮膚試験に対して応答が誘導される。局所反応は、ツベルクリン注射後さまざまな間隔、例えば、２４時間、４８時間及び７２時間目に測定する。手短に述べると、ツベルクリンに対して陽性の免疫応答を誘導する免疫賦活薬（例えば、ＢＣＧ）が使用される。試験動物においては、ツベルクリン皮膚試験は、好ましくは足跡に対して実施される。支配的なＴｈ１反応においては、陽性の足跡免疫応答は通常は２４時間で最大であり、４８時間で減少する。しかし、Ｔｈ２反応性が増大するにつれ、４８時間の陽性足跡免疫応答が増大し、２４時間における足跡免疫応答を超えることさえある。したがって、このアッセイは、本発明による免疫調節物質組成物を導入することによって細胞免疫応答が調節されるかどうかを評価するために使用することができる。
【０１３９】
免疫賦活薬はＢＣＧであることが好ましい。
【０１４０】
本発明を実施例によって以下にさらに詳細に説明する。これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのを助けるのに役立つものであって、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【０１４１】
実施例
方法
ツベルクリン皮膚試験
ツベルクリン皮膚試験は、細胞免疫応答に対する免疫調節物質組成物、すなわち本発明による死滅された細菌細胞全体を含む細菌組成物／懸濁液の効果を評価する適切なモデルアッセイである。
【０１４２】
ＢＣＧワクチン接種は、ツベルクリンに対して陽性の免疫応答を誘導する。マウスにおいては、ツベルクリン皮膚試験は、好ましくは足跡に対して実施される。支配的なＴｈ１反応においては、陽性の足跡免疫応答は２４時間で最大であり、４８時間で減少する。しかし、Ｔｈ２反応性が増大するにつれ、４８時間の陽性足跡免疫応答が増大し、２４時間における足跡免疫応答を超えることさえある。
【０１４３】
ＢＣＧワクチン接種の効果は、このツベルクリン皮膚試験を用いて詳細に記録されている。したがって、この試験アッセイは、本発明による免疫調節物質組成物を導入することによってＢＣＧ細胞免疫応答が調節されるかどうかを評価するために使用することができる。
【０１４４】
細菌懸濁液の調製
ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌種は、発酵槽中でソートン培地など抗原を含まない培地中で２から２８日間増殖させることができる。或いは、目的とする細菌種を固体勾配上で増殖させることができる。代替方法は、当業者に容易に利用可能なはずである。
【０１４５】
生成した細菌集団を収集し、直接又は洗浄後に使用して緩衝剤懸濁液を調製することができる。細菌細胞懸濁液は、１００ナノグラムから１０ミリグラムかん菌／回を含むように調製される。細菌細胞は水又は食塩水中に再懸濁される。食塩水は、ホウ酸塩によってｐＨ８．０に緩衝されることが好ましい。かん菌は、適切には、オートクレーブ中で１２１℃で１５分間加熱することによって不活性化される（死滅される）ことが好ましい。生成した細菌懸濁液は全細胞を含む。
【実施例１】
【０１４６】
ロドコッカス・ルベル（Ｒ．ｒ．）による細胞免疫応答の調節
群１：若年成体メス非近交系マウスは、対照群としてワクチン接種を行わなかった。
群２：若年成体メス非近交系マウスは、０日目に首筋にＢＣＧ（かん菌１０５個）（Evans）を接種された。
群３：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したマイコバクテリアワクチン（Ｍ．ｖ．）（かん菌１０７個）が添加されたＢＧＣ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
【０１４７】
群１〜３中の全マウスは、１０日目及び３０日目にツベルクリン免疫応答について足跡試験された。次いで、各マウスは、加熱滅菌したマイコバクテリアワクチン（かん菌１０７個）を４０日目に注射された。５０日目に足跡に対するツベルクリン検査が繰り返された。
【０１４８】
群４：若年成体メス非近交系マウスは、さらなる対照群としてワクチン接種を行わなかった。
群５：若年成体メス非近交系マウスは、０日目に首筋にＢＣＧ（Evans）（かん菌１０５個）を接種した。
群６：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したマイコバクテリアワクチン（かん菌１０７個）が添加されたＢＧＣ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
群７：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したロドコッカス・ルベル（かん菌１０７個）が添加されたＢＧＣ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
群８：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したロドコッカス・ルベル（かん菌１０６個）が添加されたＢＣＧ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
【０１４９】
群４〜７の全マウスは、３０日目にツベルクリン免疫応答について足跡試験した。次いで、４０日目に、各群は、各群の半数がそれ以上治療せず、各群の残り半数がロドコッカス・ルベル（かん菌１０７個）の注射を受けるように分割した。５０日目に足跡に対するツベルクリン検査を繰り返した。
実施例１の結果を表１に示す。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
対照群１において、マイコバクテリアワクチン治療は、２４時間後（ｐ＜０．０１）と４８時間後（ｐ＜０．００１）の両方でツベルクリンに対する免疫応答の統計的に有意な増加をもたらした。しかし、対照群４においては、ロドコッカス・ルベルを用いた治療は、２４時間後でも４８時間後でもツベルクリンに対する免疫応答に有意な変化をもたらさなかった。両方の時点において、Ｍ．ｖ．の結果はＲ．ｒ．の結果よりもかなり大きかった（ｐ＜０．０２）。
【０１５２】
ＢＣＧ群（群２及び群５）においては、２４時間と４８時間の間のツベルクリンに対する応答の減少は、ロドコッカス・ルベルによる治療を受けたマウス（平均減少は２８．２±１５．７であった）がマイコバクテリアワクチンによる治療を受けたマウス（平均減少は１４．９±９．６であった）よりも大きかった（ｐ＝０．０６）。
【０１５３】
ＢＣＧ＋マイコバクテリアワクチン群（群３及び群６）においては、２４時間と４８時間の間のツベルクリンに対する応答の減少は、ロドコッカス・ルベルによる治療を受けた群（平均減少は４１．０±４１．０であった）がマイコバクテリアワクチンによる治療を受けたマウス（平均減少は１２．７±７．０であった）よりもやはり大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０１５４】
これらのデータによれば、ロドコッカス・ルベルによる治療後にＴｈ２応答が下方制御される。これはマイコバクテリアワクチンによる治療後には見られない。
【０１５５】
ＢＣＧ＋Ｒ．ｒ．群（群７及び８）においては、Ｒ．ｒ．１０７（群７）又は１０６（群８）をＢＣＧに添加する効果はきわめて類似しており、Ｒ．ｒ．の２回目の注射後に２４時間と４８時間の間で応答が実質的に減少した（１５．５±１０．０）。
【実施例２】
【０１５６】
ノカルジア・アステロイド（Ｎ．ａ．）、ゴルドニア・ブロンチアリス（Ｇ．ｂ．）又はツカムレラ・インコネンシス（Ｔ．ｐ．）を用いた細胞免疫応答の調節
この実験は、６匹のマウスからなる群にＢＣＧ単独又は１０７Ｍ．ｖ．、Ｒ．ｒ．、ノカルジア・アステロイド（Ｎ．ａ．）、ゴルドニア・ブロンチアリス（Ｇ．ｂ．）若しくはツカムレラ・インコネンシス（Ｔ．ｐ．）を添加して接種してから２８日後にツベルクリンを用いた足跡試験の効果を比較するように設計した。これらの添加生物の各々に対する免疫応答に対する効果を見るために、動物群は、ツベルクリンを用いて試験した２８日後に、それらのワクチン接種（ワクチン、Rubin、Asterin、Bronchialin及びInchonensin）に含まれる生物でできた皮膚試験試薬を用いてもう一方の足跡で試験した。
【０１５７】
結果を表２に詳細に示す。
【０１５８】
【表２】
【０１５９】
細菌懸濁液のすべてによって、ＢＣＧ単独に続く場合と比較して２４時間と４８時間の両方で測定された２８日ツベルクリン応答が低下した（ｐ＝０．０５；ｐ＝０．２）。
【０１６０】
これは、ツベルクリン及びワクチンを除いて、これらの皮膚試験試薬のいずれかが使用された最初であった。新しい試薬に対する２４時間における応答性の差は、タンパク質評価による場合を除いておそらくは平衡になっていないためであった。しかし、５０日目における２４時間と４８時間の間の応答はすべて低下し、免疫調節性活性が示唆された。
【実施例３】
【０１６１】
成体モルモットにおける皮内注射に対する局所的皮膚反応
３匹の動物の左脇腹をせん毛して、１０８マイコバクテリアワクチンを含む皮内注射０．１ｍｌを動物の頭部末端に、１０９マイコバクテリアワクチンを含む０．１ｍｌを尾部末端側５ｃｍに投与した。
【０１６２】
別の３匹の動物の右脇腹をせん毛して、１０８ロドコッカス・ルベルを含む皮内注射０．１ｍｌを動物の頭部末端に、１０９ロドコッカス・ルベルを含む０．１ｍｌを尾部末端側５ｃｍに投与した。
【０１６３】
硬結部（in duration）の直径（単位ｍｍ）
【０１６４】
【０１６５】
３匹のモルモットにおける１０９ロドコッカス・ルベル（ヒト及び動物用途に対する典型的な用量）の皮内注射（獣医及び医事に一般に使用される注射経路）に対する局所反応は、別の３匹のモルモットにおける同じ用量のマイコバクテリアワクチンに対する反応と類似していた。注射後４８時間において、ロドコッカス・ルベルに対する反応はマイコバクテリアワクチンに対する反応よりも小さかった（ｐ＜０．０５）。７日又は１４日において差はなかった。したがって、ロドコッカス・ルベルはマイコバクテリアワクチンよりも薬剤としてはるかに許容することができる。用量１０８においてどちらの製剤にも局所反応はない。
【実施例４】
【０１６６】
皮下注射後の毒性
１日齢、１４日齢及び２８日齢のときにロドコッカス・ルベルを３回注射した１７匹のラットにおいて、皮下投与に対する毒性の証拠は認められなかった。
【０１６７】
７日目及び１４日目において差はなかった。多数のマウスに本発明のさまざまな細菌種を注射したが、毒性の証拠は何らなかった。
【実施例５】
【０１６８】
Ｔｈ１応答のみを増大させる細菌の決定
アジュバント関節炎は、動物において油とマイコバクテリア抽出物の混合物（マイコバクテリア・ブチリカム（Mycobacterium butyricum）を含む調製物が特に有効である）によって誘発される実験上の重篤な関節炎である。この応答を誘導するには強力なＴｈ１アジュバントが必要と考えられる。この関節炎は、Ｔｈ２を下方制御する機序によって調節される（関節炎はＴｈ１とＴｈ２の両方の機序を必要とする）。
【０１６９】
実験１：ロドコッカス・ルベルがアジュバント関節炎を誘発することができるかどうかを明らかにすること。
６０〜９０日齢のラットからなる３群の右後足足跡に、
１．マイコバクテリア・ブチリカムの油懸濁液１ｍｇ／０．１ｍＬ（ｎ＝８）
２．ロドコッカス・ルベルの油懸濁液１ｍｇ（ｎ＝８）
３．油と食塩水の乳濁液（ｎ＝８）
を投与した。
【０１７０】
第１の群の動物は四肢すべてを含めた関節炎を発症したのに対して、ロドコッカス・ルベルの油懸濁液を投与されたラットは注射された足のみが罹患した。
【０１７１】
実験２：マイコバクテリア・ブチリカムの油懸濁液を投与した後にロドコッカス・ルベルがＴｈ２調節性応答を誘導することができるかどうかを明らかにすること。
これを試験するために、マイコバクテリア・ブチリカムの油乳濁液を投与する４２、２８及び１４日前にロドコッカス・ルベル１０７個の緩衝食塩水を１５匹のラットの異なる部位に皮下注射した。１０匹のラットからなる対照群は、同じスケジュールに従って生理食塩水で前処理され、さらに投与された。
【０１７２】
アジュバント関節炎の巨視的評価は、個々の関節を目視採点することによって実施された（J Rheumatol 1992; 19:513-5）。各肢は０〜４で採点され、最大で１６点／ラットに達する。
【０１７３】
【０１７４】
両方の群は、関節炎病変の発症時間（通常、誘導後９〜１１日）にも関節炎徴候の重症度にも違いがなかった。動物は、疾患の進行のために倫理的理由によって１８日目に屠殺された。
【０１７５】
結論
これらの実験は、ロドコッカス・ルベルがＴｈ１アジュバント活性を有するがＴｈ２「調節性」活性を持たないことを明確に示している。アジュバント関節炎における関節損傷は、Ｔｈ１とＴｈ２の複合作用である。
【実施例６】
【０１７６】
毒性、特に新生仔マウスにおける成長速度及びその後のＢＣＧワクチン接種に対するロドコッカス・コプロフィラス NCIMB 11211、ゴルドニア・ブロンチアリス NC10667及びツカムレラ・インコネンシスNC13040の効果を検討すること
毒性の代替試験は、ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コプロフィラス又はツカムレラ・インコネンシスの皮下注射が誕生日になされ、２１日目に離れた部位に再度なされるものである。これらの動物及び食塩水を注射された対照は、３カ月間規則的な間隔で計量された。
【０１７７】
方法
９匹の後期妊娠Balb Cマウスを使用する。
【０１７８】
滅菌された細菌懸濁液の調製：１０日間のソートン消泡ブロス培養から調製し、遠心分離し、１０ｍｇ／ｍｌのホウ酸塩緩衝食塩水として再懸濁し、加圧滅菌し、４℃で貯蔵した懸濁液。１０ｍｇ／ｍｌ、１０１０／ｍｌをホウ酸塩で１／２希釈して５×１０９とし、次いでホウ酸塩緩衝剤で１／１０希釈して、２０μ中最終濃度１０７として使用する。
【０１７９】
１日目
新生仔マウスを誕生日に個々に取り出し、同腹仔の首筋に１０７滅菌懸濁液を注射し、母親に戻す。
【０１８０】
対照同腹仔の首筋にＭ１５ホウ酸塩緩衝食塩水２０μリットルを注射する。
同腹仔１＝メス２匹＋オス３匹（ロドコッカス・コプロフィラス NCIMB 11211）
同腹仔２＝メス２匹＋オス３匹（ロドコッカス・コプロフィラス NCIMB 11211）
同腹仔３＝メス５匹＋オス３匹（ゴルドニア・ブロンチアリス NC10667）
同腹仔４＝メス３匹＋オス４匹（ゴルドニア・ブロンチアリス NC10667）
同腹仔５＝メス１匹＋オス１匹（ホウ酸塩緩衝食塩水）
同腹仔６＝メス３匹＋オス１匹（ホウ酸塩緩衝食塩水）
同腹仔７＝メス５匹＋オス３匹（ツカムレラ・インコネンシス NC13040）
同腹仔８＝メス５匹＋オス４匹（ツカムレラ・インコネンシス NC13040）
同腹仔９＝メス４匹＋オス５匹（ホウ酸塩緩衝食塩水）
【０１８１】
２１日目
マウスを離乳させ、性別を見分け、同腹仔をオスとメスの２群に分割する。
【０１８２】
計量し、ワクチンを再接種する。消えないペンで尾部にマーキングすることによって個体を標識する。
【０１８３】
３カ月間計量し、毎週尾部に再マーキングする（re tail mark）。
【０１８４】
図１に、離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔メス試験及び対照の結果を示す。
【０１８５】
図２に、離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔オス試験及び対照の結果を示す。
【０１８６】
体重増加は全群で同じであり、わずか２／５７動物しか３カ月間に死亡しなかった。両方ともオスであり、離乳後に他のオスと一緒にした直後に死亡した。したがって、動物の体重増加及び発育は、試験された３種によって影響されなかったと結論することができる。
【実施例７】
【０１８７】
ツベルクリン皮膚試験応答によって測定されたＢＣＧ免疫化に対する効果
免疫調節物質試験モデルは、４週間後に試験したときにＢＣＧワクチン接種によってツベルクリン（Tubercle bacilliの可溶性製剤）皮膚試験に対する応答が誘導されるという原理に基づいて考案されている。局所反応はツベルクリン注射後２４時間、４８時間及び７２時間後に測定する。マウスにおいては、局所反応は通常２４時間で最大であり、それがツベルクリン中の抗原に対するＴｈ１応答の指標である。４８時間における局所反応は通常それよりも小さく、Ｔｈ２の寄与を含む。７２時間における局所反応は４８時間におけるよりもわずかに小さいことが多く、Ｔｈ２応答である。このＢＣＧ後ツベルクリン反応は、前の初回抗原刺激によって調節することができ、その結果、反応のＴｈ１及びＴｈ２成分は初回刺激試薬の性質を反映する。
【０１８８】
方法
３カ月齢のときに実施例６に従って初回抗原刺激されたマウスは、各試験の半分及び対照群が１０６ＢＣＧ１００μｌを首筋に注射した。
【０１８９】
４カ月における試薬T1475 １ｍｇ／ｍｌによるツベルクリン検査。１００μリットルを１．９ｍｌで希釈して、最終濃度を５０μｇ／ｍｌにする。４℃で貯蔵する。用量は、後足足跡に投与された２．５μｇの５０μリットル溶液である。２４、４８及び７２時間においてマイクロメータを用いて測定されたツベルクリン応答膨潤。
【０１９０】
結果
図３は、ゴルドニア・ブロンチアリスが２４時間ＴＨ１効果を増大させることを示している。
【０１９１】
図４は、ツカムレラ・インコネンシスが２４時間ＴＨ１応答を増大させ、７２時間ＴＨ２応答を抑制することを示している。
【０１９２】
図５は、ロドコッカス・コプロフィラスがＴＨ１応答とＴＨ２応答の両方を抑制することを示している。
【０１９３】
結論
上記３種は、ＢＣＧ投与後のツベルクリン検査に対して各々異なる効果をもたらした。
【０１９４】
ゴルドニア・ブロンチアリスは、Ｔｈ２応答を変えずにＴｈ１応答を増大させた。ロドコッカス・ルベルもこの機能を有する。
【０１９５】
ツカムレラ・インコネンシスは、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を下方制御した。
【０１９６】
ロドコッカス・コプロフィラスは、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の両方を下方制御した。
【０１９７】
これらの試薬のいずれかをアジュバントとして投与すると、その後の抗原に対する免疫応答を調節することができる。
【０１９８】
これらの結果は、本発明の代表的な３種のいずれかによる２回の初回抗原刺激免疫の影響が２回目の免疫後少なくとも９週間持続することも明確に示している。
【実施例８】
【０１９９】
免疫調節物質試験モデル
免疫調節物質試験モデルは、４週後に試験されたときにＢＣＧワクチン接種によってツベルクリン（Tubercle bacilliの可溶性製剤）皮膚試験に対する応答が誘導されるという原理に基づいて考案されている。局所反応はツベルクリン注射後２４時間、４８時間及び７２時間後に測定する。局所反応は通常２４時間で最大であり、それがツベルクリン中の抗原に対するＴｈ１応答の指標である。４８時間における局所反応は通常それよりも小さく、Ｔｈ２の寄与を含む。７２時間における局所反応は４８時間におけるよりもわずかに小さいことが多く、Ｔｈ２応答である。このＢＣＧ後ツベルクリン反応は、前の初回抗原刺激によって調節することができ、その結果、反応のＴｈ１及びＴｈ２成分は初回刺激試薬の性質を反映する。
【０２００】
公知の免疫賦活薬であるＢＣＧを若い３週齢マウスの首筋に注射し、マウス足跡へのツベルクリン皮下注射によってツベルクリン応答を１カ月後に測定する。次いで、生成する膨潤、すなわち「ツベルクリン応答」を２４、４８及び７２時間で測定する。２４時間における膨潤は初期又はＴｈ１媒介応答とみなされ、４８及び７２時間における膨潤は後期又はＴｈ２媒介応答とみなされる。健康なマウスにおいてＢＣＧはＴｈ１応答を主として刺激する。
【０２０１】
方法
（ａ）ＢＣＧ皮内ワクチン１０回分のバイアル（Evans Medical）
シリンジ及び針を用いて供給滅菌水１ｍｌで戻して、５分間溶解する。１×１０７／ｍｌとすべきである。
【０２０２】
シリンジ及び針を用いてワクチンのすべてを除去し、プラスチックビジューボトル（bijou bottle）に移す。
【０２０３】
０．１５ｍｌをＭ１５ホウ酸塩緩衝食塩水１．３５ｍ１で１／１０希釈して１０５ １００μリットルとする。
【０２０４】
用量は１０５ １００μｌであり、首筋に投与される。
【０２０５】
（ｂ）ツベルクリン
T1475 １ｍｇ／ｍｌ。
【０２０６】
１００μリットルを１．９ｍｌで希釈して、最終濃度を５０μｇ／ｍｌにする。
【０２０７】
４℃で貯蔵する。
【０２０８】
用量は２．５μｇ ５０μｌであり、後足足跡に皮内投与される。
【０２０９】
ツベルクリン応答は、２４、４８及び７２時間においてマイクロメータを用いて測定される。
【０２１０】
図６に、非ワクチン接種対照と比較された１カ月後のＢＣＧに対するツベルクリン応答を示す。
【０２１１】
（ｃ）試験懸濁液の調製
培養物は、遠心分離によって収集したソートンブロス中で増殖させ、Ｍ１５ホウ酸塩緩衝食塩水に濃度１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、４℃で貯蔵する。
【０２１２】
１０ｍｇ／ｍｌ＝１００μｌ中１０９
【０２１３】
１／１０希釈＝１００μｌ中１０８
【０２１４】
１５０μｌ １０８をＭ１５ホウ酸塩１．２ｍｌに添加し、ＢＣＧ１５０μｌを添加する。
【０２１５】
用量は、今回、１０５ＢＣＧ＋１０７試験生物１００μｌであり、首筋に注射する。
【０２１６】
結果
図７は、３種類の細菌によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４及び４８時間目に測定する。代表的な種は、（Ｎａ）ノカルジア・アステロイド、（Ｇｂ）ゴルドニア・ブロンチアリス及び（Ｔｐ）ツカムレラ・インコネンシスである。
【０２１７】
図８は、２種類の細菌によるＢＣＧ／ＢＣＧ＋の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。代表的な種は（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス及び（Ｄｍ）ダイエツィア・マリスである。
【０２１８】
図９は、ロドコッカス属内の選択された種によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス、（Ｒｒｕ）ロドコッカス・ルベル、（Ｒｒｈｏｄ）ロドコッカス・ロドニイ、（Ｒｃｏｐ）ロドコッカス・コプロフィラス、（Ｒｏｐａ）ロドコッカス・オパカス、（Ｒｅｒｙｔｈ）ロドコッカス・エリトポレス。
【０２１９】
図１０は、ロドコッカス・ルベルの１０８から１０４の対数希釈で改変されたＢＣＧを用いたロドコッカス・ルベルの最適用量をＢＣＧ単独と比較して示すグラフである。
【０２２０】
結論
このスクリーニング試験は、試験懸濁液をＢＣＧと混合し、ＢＣＧ単独と比較することによって、２８日後にツベルクリン検査がＢＣＧに対する応答の測定値として調節又は改変されたことを示している。この簡単なモデルにおいては、免疫調節は、２４時間と４８時間目両方における応答サイズの低下として示される。これは、より長期の実験においてさらに検討することができる。試験懸濁液を用いた初回抗原刺激は、ＢＣＧ投与とそれに続くツベルクリン検査の数週間前に実施する。
【実施例９】
【０２２１】
細菌の全細胞の懸濁液が細胞抽出物よりも免疫調節に有効であることを示すために、比較調製物が作り、ＢＣＧ投与／ツベルクリン皮膚試験系において試験する
あらかじめ計量された遠心管中の緩衝食塩水（ｐＨ８．０）にツカムレラ・インコネンシス１００ｍｇを生物１０ｍｇ湿重量／ｍｌの濃度で懸濁する。全量１０ｍｌを超音波処理器で処理して、生物の大多数（７０〜８０％）を破壊した。
【０２２２】
超音波処理物を管中で１５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、上清を慎重に除去し、試験抽出物として孔径０．２μｍのメンブランフィルターを通過させる。堆積物を含む管を再度計量して、破壊されていない全生物と細胞壁破片などの割合を求める。これは６４ｍｇである。次いで、ツカムレラ・インコネンシス０．０１ｍｇに等しい抽出体積を推定し、これを相当物の全かん菌（１０７個に近い）０．０１ｍｇと比較する。
【０２２３】
１０匹の動物からなる群に抽出物又は（０．０１ｍｇ／回に等しい）かん菌全細胞懸濁液又は緩衝食塩水プラセボを離乳時及び７日後に首筋に注射する。２週間後に動物にＢＣＧを投与する。２８日後にツベルクリン検査を実施し、２４、４８及び７２時間で読取る。
【０２２４】
結果：
初回抗原刺激なしで、或いはホウ酸塩緩衝剤、ツカムレラ・インコネンシス全細胞又は可溶性抗原（ろ過された超音波処理物）の初回抗原刺激後に投与されたＢＣＧワクチン接種後のマウスにおけるツベルクリン応答。
【０２２５】
初回抗原刺激されていない動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
Ｎｏ． ２４時間 ４８時間 ７２時間
６ ９±４．２ ７．７±３．３９ ３．６７±３．５
【０２２６】
ホウ酸塩緩衝剤単体で初回刺激された動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
６ ９±５．７ ６．３±７．１ ３．１７±２．９３
【０２２７】
ホウ酸塩緩衝剤による初回刺激は、ＢＣＧ後ツベルクリン検査に対して効果がない。
【０２２８】
加熱滅菌ツカムレラ・インコネンシス全体で初回刺激された動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
６ ７．３±１．０３ ６．１７±３．８７ １．５±２．０７
【０２２９】
ツカムレラ・インコネンシス全体で初回抗原刺激するとツベルクリン応答が特に７２時間において減少する（Ｔｈ２応答性）。
【０２３０】
ツカムレラ・インコネンシス可溶性調製物（ろ過された超音波処理物）で初回刺激された動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
６ ６．８±６．８ １１．０±８．０ ４．６±６．８
【０２３１】
ツカムレラ・インコネンシスろ過超音波処理物で初回刺激すると４８時間及び７２時間における応答が増大する（Ｔｈ２応答性）。これは、おそらく、ＢＣＧとツカムレラ・インコネンシスで共有された抗原に対する炎症性抗体産生が増加したためである。これらの結果は、超音波処理物による初回刺激が、死滅生物全体による初回刺激後の応答とは異なる応答をもたらすことを示している。
【０２３２】
予備調査によれば、細菌の全細胞は細胞抽出物よりも免疫調節に有効であることが示唆される。
【実施例１０】
【０２３３】
血管疾患モデル−ラット血管形成術試験
このモデルは、バルーン血管形成術後に認められたラットの総頚動脈内膜層の誘導された肥厚減少に基づく。
【０２３４】
実験群は各々１５匹のオスのラットからなる。
【０２３５】
群１はｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった（対照）。
【０２３６】
群２は、加熱滅菌された環境雑菌ゴルドニア・ブロンチアリスを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった。
【０２３７】
群３は、加熱滅菌された環境雑菌ロドコッカス・コプロフィラスを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった。
【０２３８】
群４は、加熱滅菌された環境雑菌ツカムレラ・インコネンシスを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった。
【０２３９】
群５は、加熱滅菌された環境雑菌マイコバクテリアワクチンを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった（正の対照）。
【０２４０】
実験の手順予定表：
すべての動物は、０日目に実験を開始する前に７〜１０日順応された。すべての動物を０日目に計量し、その後は健康の指標として週間隔で計量した。
【０２４１】
全群のラットは、標準ラット固形飼料を給餌され、水を自由に摂取することができた。
【０２４２】
０日目にラットに上記対照又は活性薬剤を皮下注射した（生物の用量は０．１ｍｌ中５０マイクログラム、すなわち５００マイクログラム／ｍｌであった）。
【０２４３】
２１日目にラットに第２の用量の対照／活性薬剤を皮下注射した（生物の用量は０．１ｍｌ中１００マイクログラム、すなわち１ｍｇ／ｍｌであった）。
【０２４４】
４９日目に血液０．７５ｍＬを各ラットの尾静脈から採取し、サイトカインのＲＮＡを後で測定できるように適切な方法で貯蔵した。
【０２４５】
５６日目に全ラットに麻酔下で左総頚動脈バルーンによる外傷を与えた。
【０２４６】
７０日目に全ラットを計量し、一級分類表（Schedule 1）法によって安楽死させ、頚動脈、ひ臓、左腎臓、左肺の一部、肝臓中葉の一部、心臓及び胸部大動脈を組織学的及び免疫学的分析のために採取した。血液もさらなる分析のために採取された。
【０２４７】
各左頚動脈の横断面を切断し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。筋肉層及び内膜層は個別に顕微鏡測定され、血管の断面域として表された。さらなる断面は、存在する免疫細胞型及び放出されているサイトカインを特定する免疫組織化学用に使用される。
【０２４８】
４９日目及び７０日目に採取された血液試料は、サイトカイン、ケモカイン及び血管疾患に関連する他の物質のＲＮＡをその後分析するために適切な方法で貯蔵された。
【０２４９】
結果
ラット体重の結果を下表及び図１１に示す。
【０２５０】
【０２５１】
ゴルドニア・ブロンチアリス（２）の注射で初回刺激された動物は、２つの時点においてプラセボ群（１）よりもかなりの重量増加を示す。
【０２５２】
内膜及び中膜厚さの測定結果を下表に示す。内膜／中膜比の結果を図１２に示す。
【０２５３】
＊検査された断面数
【０２５４】
【０２５５】
活性薬剤のレシピエントとプラセボのレシピエントの間で大きな有意差が見られる。
【０２５６】
内膜の結果が低いのは、血管形成術後の筋内膜増殖の減少を示している。これは全４種類の細菌調製物で起こり、ゴルドニア・ブロンチアリス、ツカムレラ・インコネンシス及びマイコバクテリアワクチンで最も顕著である。この効果は、血管形成術の成功に大きく寄与することができる。
【０２５７】
プラセボ群において失われた中膜厚さは、積極的治療群において保持され、ロドコッカス・コプロフィラス及びＴ・インチネンシス（T.inchinensis）の後で最も顕著である。減少した内膜厚さと保持された中膜厚さとの組合せは、ツカムレラ・インコネンシスによる治療後に最もよく見られ、慢性移植片拒絶の潜在的抑制における重要な進歩を証明することができる。
【実施例１１】
【０２５８】
トリパノソーマ症感染ラットにおける心筋炎
動物の調製
ｉ）１日齢オス「１」ラットの首筋に１０７ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・コプロフィラス、ツカムレラ・インコネンシス又はマイコバクテリアワクチン０．１ｍｌを皮下注射した。（これは下表に示すように２回の実験で実施された）。
ii）１４日後、オス「１」ラットの左側に１０７の同じ生物０．１ｍｌの第２の皮下注射をした。
iii）動物に、クルーズ・トリパノソーマ（T.cruzi）のツラフエン（Tulahuen）系統の１０６錐鞭毛体を用いて生きたクルーズ・トリパノソーマを２１日目に皮下経路で投与した。感染血液錐鞭毛体は、ＣＢｉマウスにおける連続継代によって維持した。
iv）クルーズ・トリパノソーマの血流型は、ｐｉ（post-infection）７及び１４日においてヘパリン処置尾部静脈血５μｌの直接顕微鏡観察によって標準条件下で評価した。データは寄生生物数／５０視野として表した。
ｖ）７日後に、１０７個の同じ生物０．１ｍｌの追加の皮下注射を右側に投与した。
【０２５９】
対照動物のみにクルーズ・トリパノソーマを投与した。
【０２６０】
別の動物群は、比較のために投与しなかった。
【０２６１】
【０２６２】
クルーズ・トリパノソーマ対照と比較してマイコバクテリアワクチンはＰ＜０．０１及びロドコッカス・ルベルはＰ＝０．００１
【０２６３】
動物の調製
１日齢オス「１」ラットの首筋に１０７ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コプロフィラス又はツカムレラ・インコネンシス０．１ｍｌを皮下注射した。（これは下表に示すように２回の実験で実施された）
【０２６４】
１４及び２８日後、オス「１」ラットの左側に１０７の同じ生物０．１ｍｌの第２及び第３の皮下注射をした。
【０２６５】
動物に、クルーズ・トリパノソーマのツラフエン系統の１０６錐鞭毛体を用いて生きたクルーズ・トリパノソーマを２１日目に皮下経路で投与した。感染血液錐鞭毛体は、Ｃｂｉマウスにおける連続継代によって維持された。
【０２６６】
対照動物のみにクルーズ・トリパノソーマを投与した。
【０２６７】
別の動物群は、比較のために放置した。
【０２６８】
【０２６９】
クルーズ・トリパノソーマ対照と比較してロドコッカス・コプロフィラスの７日目でＰ＝０．０３２及び１４日目でＰ＝０．０５（Kruskall-Wallis分散分析）。
【０２７０】
クルーズ・トリパノソーマ感染から２８日後のクルーズ・トリパノソーマに特異的な血清ＩｇＧ抗体
【０２７１】
クルーズ・トリパノソーマ投与から７、１４及び２１日後の心筋中のＣＤ４＋ｖｅ細胞
【０２７２】
さらに別の対象の心筋を、慢性心筋炎の評価のためにクルーズ・トリパノソーマ感染から３カ月後に分析する。予備調査によれば、マイコバクテリアワクチンは慢性心筋炎を軽減するのに有益な効果を有することが判明し、上記データから、試験生物の一部は慢性心筋炎の予防に有益な効果を有すると予想される。
【実施例１２】
【０２７３】
冠動脈血管形成術後のＭＩＨを低減するためのツカムレラ・インコネンシスの使用
アテローム硬化型血管疾患は、世界中で最も一般的な死因及び能力障害原因である。アテローム性動脈硬化症の発症は複雑なプロセスであり、脂質の沈着が動脈の狭窄及び内皮機能不全をもたらす。血管損傷部位における炎症反応がアテローム性動脈硬化症の素因において鍵となる役割を果たす証拠が増加しつつある（Schett G et al.、J Clin. Invest. 1995, 96: 2569-2477）。アテローム硬化型プラークの破裂は、心筋梗塞、発作、末梢動脈閉塞などの急性虚血性症候群をもたらす突然の動脈閉塞の最も一般的な原因である。急性虚血性症状の出現に続いて、ある種のサイトカイン及びＣＲＰ（C-reactive protein）を含めていくつかの炎症性マーカーが増加する（George et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210; Hansson et al.、Arteriosclerosis 1989; 9: 567-578; Yokota et al.、J Intern Med. 1995; 238; 479-489; Ikeda J. Mol. Cell. Cardiol. 1992 Jun 24 (6): 579-584; Hojo et al.、Heart 2000 Jul; 84 (1) 83-7。
【０２７４】
ストレスタンパク質の発現は、内膜への完全な応力損傷部位においてさえ局所的免疫応答をもたらし、そのときの個体において優勢である免疫応答型に従って中膜及び内膜中にサイトカインが放出される（Chan et al.、Eur J. Vasc. Enodvasc. Surg. 1999 Nov. 18(5): 381-5; Mukherjee et al.、Thromb. Haemost 1996; 75: 258-260; Wright Heart Vessels 2000; 15: 18-22; Sanchez-Margalet et al.、Clin Chem Lab. Med 2002 Aug; 40(8); 769-774）。一部のサイトカインは、内膜の肥厚及び中膜の平滑筋細胞における表現型の変化をもたらし、同時にＭＩＨを生じる。他のサイトカインの局所的放出によって、血流の閉塞を最小限に抑えながら内膜が修復される（Hansson et al.、Proc. Natl Acac. Sci. USA 1991; 88: 10530-10534; D'Elios et al.、Transplant Proc 1998; 30: 2373-7; Feldman et al.、Circulation 2000 Feb 29; 101(8): 908-916; Tashiro Coron Artery Dis 2001 Mar.; 12(2): 107-13; Hojo et al.、Atherosclerosis 2001 May; 156(1): 165-170; Yang et al.、Circulation 2000 Mar 7; 101(9); 1019-26; Anguera et al.、Am. Heart J. 2002 Nov. 144(5): 811-817; Takase et al.、Can J. Cardiol. 2003 July; 19(8): 902-906; Tutar et al.、Circulation 2003 Sep 30; 108(13):1581-1584 E-pub 2003 Sep 15; Del Prete et al.、Blood 1995 Jul 1; 86(1): 250-257）。本発明者らの提案の目的は、後者の機序が確実に実施されるようにすることである。
【０２７５】
ＭＩＨと炎症の関連：
【０２７６】
ＭＩＨの発生及び維持をもたらす免疫機構は、制限された血流、脂肪線条の沈着及びアテローム性動脈硬化症のプラークに付随する応力の増加をもたらす。損傷が最小限に抑えられた内膜細胞上で発現されるストレスタンパク質に対するＩｇＧ２抗体レベルの上昇は、補体カスケードの局所的誘導及び損傷細胞の破壊をもたらす（Schett et al.（前記）；Chan et al.（前記）；Crisp et al.、J. Heart Lung Transplant 1994; 81-91; Johnson et al.、Atherosclerosis 1990; 84: 111-119）。この部位に、局所的サイトカイン産生を惹起するＴリンパ球が引きつけられる（Hansson 1991（前記）；D'Elios（前記）；Mickelson et al.、J Am Coll Cardiol. 1996 Aug; 28(2): 345-53）。脂肪線条は損傷内膜上に堆積し、その下で修復又はアテローム硬化型の進行を決定する有益又は有害なサイトカイン活性が発生する。局所的炎症の非特異的な結果として、サイトカインＩＬ（interleukin）−１ベータ及びＴＮＦ−α（tumour necrosis factor alpha）はＩＬ−６を誘導し、ＩＬ−６は肝細胞による急性期タンパク質（例えば、フィブリノーゲン、ＣＲＰ）の生合成を増強する（Ikeda et al.（前記）；Hojo et al.（前記）；Spaziani et al.、Ital Heart J. 2002 Oct: 3(10): 593-597）。
【０２７７】
ＭＩＨは、ＰＣＩ（percutaneous coronary intervention）後の血管損傷に対する過度の治癒応答とみなすことができる。
・基底膜の損失
・中膜から内膜へのＶＳＭＣの移行
・ＶＳＭＣ増殖及びより分泌性である線維芽細胞型への表現型の変化
・細胞外基質の産生増加
を含めて、最終的に血管狭窄又は閉塞をもたらす一連の事象が起こりうる。
【０２７８】
臨床的な再狭窄は、ＰＣＩバルーン血管形成術後に起こり、臨床実務においてかかる症例の約３０％に影響を及ぼす。これはかかる手順の失敗の主原因であり、生じた狭窄及び閉塞血管／移植片の治療は問題が多い。ＭＩＨをもたらす根本的細胞機序は十分に理解されていないが、サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５を産生するＴｈ２（helper T cells of type 2）の優勢に関連すると考えられ、その存在下でＴＮＦ−αは組織損傷的になる（Hernandez-Pando et al.、Immunology 1994; 82: 591-595）。このプロセスを有効に防止することができる治療はこれまで開発されていない。しかし、より全身的な現象にその後なり得る局所的に媒介された炎症反応の役割は、ＰＣＩの失敗の鍵となる部分として認められている。現行プロジェクトの臨床的な妥当性は、英国（約４０，０００）及び世界中で毎年実施されるきわめて多数の経皮冠動脈インターベンションに関係する。新世代の薬物溶出ステントは、「むき出しの金属」ステントよりも再狭窄率がきわめて低いが、再狭窄を完全に防止できそうになく高価である。このプロトコルに提案される免疫療法などＭＩＨを防止する安全で比較的安価な補助的治療は臨床的に重大な影響を有する。
【０２７９】
ある細菌種は、死滅したときに、それらに提示される熱ショックタンパク質などの抗原に対する免疫応答を調節する能力を有する。かかる死滅細菌の懸濁液は使用するのにきわめて安全であり、さまざまな種を用いて所望の免疫調節を得ることができる。本発明者らの研究室における最近の研究によれば、アテローム性動脈硬化症患者はＴｈ１免疫が同年齢の対照よりも減少し得ることが判明した。したがって、血管傷害に対する炎症反応は、適切な免疫療法によって応答パターンを変えることによって改変することができる。
【０２８０】
結核、喘息、関節リウマチ、いくつかの自己免疫症状など他のさまざまなヒト疾患においてＴｈ１及びＴｈ２サイトカインが果たす役割は非常に注目されている（D'Elios M, Del PG. Transplant Proc 1998; 30: 2373-7；Shirakawa T et al.、Science 1996; 275: 77-79及びHernandez-Pando R, Rook GAW. Immunology 1994; 82: 591-595）。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２（interleukin-2）及びＴＮＦを産生する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生する（Lin E et al.、Surgery 2000; 127: 117-126）。どちらの型のＴ細胞も細胞性炎症を起こすことができ、抗体を形成することができるが、異なる免疫グロブリンサブクラスが含まれ、Ｔｈ２応答に付随する抗体量は通常はるかに多い。Ｔｈ１応答の調節が失敗すると、多発性硬化症などのＴｈ１によって媒介される自己免疫疾患が起こり得る（Genain CP et al.、Science 1996; 274: 2054-2057）。調節されていないＴｈ２応答は、アレルギー反応、Ｔｈ２媒介自己免疫及びＩＰＦ（idiopathic pulmonary fibrosis）において見られるものなどの慢性線維性炎症をも含めてさまざまな病態をもたらし得る（Wallace W et al.、Clin. Exp. Immunol. 1995; 101: 436-441及びDu Bois RM. New Engl. J Med 1999; 341: 1302-1304）。
【０２８１】
内皮及びＶＳＭＣ抗原に対するかかるＴＨ２応答は、臨床のＭＩＨにおいて原因となる類似した役割を果たす。
【０２８２】
結核、関節リウマチなどの一部の状況においては、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインの同時産生はさらなる組織損傷をもたらし得る。これに対する少なくとも１つの機序は、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５の存在下でＴｈ１関連ＴＮＦ−γの組織壊死活性が増大することである。かかる複合活性によって演じられる役割はＭＩＨでは不確かであるが、それが起こる結核、ウシのヨーネ病などの放線菌疾患はアテローム性動脈硬化症の素因になることが知られている（Alibasoglu M et al.、Am J Vet Res. 1962 Jan; 23: 49-57）。
【０２８３】
炎症は、現在、アテローム硬化型血管疾患の進行と結び付けられている。プラークの自発的破裂又は血管形成術によって自然に起こる血管損傷は、治癒に有害に作用して筋内膜増殖を起こし得る炎症反応を刺激する。本発明による加熱滅菌細菌に由来する調製物は、症候性冠動脈疾患に対して経皮冠動脈インターベンションを行った患者において血管損傷に対する免疫応答を調節する。ストレスタンパク質、ある範囲のサイトカイン、コルチゾル、ＤＨＥＡ（de-hydro epi-androsterone）及びＣ反応性タンパク質に対する抗体の静脈血レベルによって測定される炎症反応は、この活性調製物を投与された対象において改変されるはずである。５０人の患者のサンプルサイズは、これらのマーカーレベルの約２０％の差を検出するのに十分である。
【０２８４】
免疫調節は炎症反応に影響を及ぼし得る。
【０２８５】
加熱滅菌ツカムレラ・インコネンシスの作用様式は、細菌調製物とヒト組織のそれとで共有される抗原に関係したＴ細胞成熟の制御因子としてであると考えられる。特に、これらは、細菌的な６５及び７０ｋＤａ熱ショックタンパク質とそのアミノ酸鎖長相同性の約６０％を共有することが知られているミトコンドリア起源の６０及び７０ｋＤａストレスタンパク質を含む。ツカムレラ・インコネンシスの調節活性は、Ｔｈ２機序を抑制し、Ｔｈ１機序を増強し、ストレスタンパク質の内膜発現に対する応答を変化させ、サイトカインを局所的に産生することによってＶＳＭＣの表現型を制御する。ストレスタンパク質に対して高い抗体力価を有する優勢なＴｈ２応答によって、２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）が局所的に放出され、補体活性化経路によってこれらのタンパク質を発現する内膜細胞が破壊され、ＶＳＭＣの表現型が迅速な複製の１つに改変される。Ｔｈ１応答では、ストレスタンパク質を発現する内膜細胞は、１型サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−α及びＴＮＦ−α）を放出するＴ細胞によって個々に破壊され、ＶＳＭＣにおけるより低増殖性の表現型変化及び局所的組織修復を誘導すると考えられる。これらの機序のうち第１の機序はさらなる損傷及び再狭窄をもたらすのに対して、第２の機序は再狭窄を刺激せずに内膜の修復をもたらすはずである。
【０２８６】
Ｔｈ細胞活性のかかる変化は血漿コルチゾルの減少と血漿ＤＨＥＡの増加を伴い、炎症を効果的に調節するとＣ反応性タンパク質などが正常値に戻る。
【０２８７】
理論に拘泥するものではないが、血管壁中の１個の自己免疫標的はＨＳＰ（heat shock protein）７０とすることができる。
【０２８８】
免疫療法が血管損傷後の炎症反応を改変する機序は十分には理解されていないが、かん菌と組織とで共有される抗原と一緒に、ツカムレラ・インコネンシスの特定のアジュバント活性の組合せは、免疫媒介組織損傷を抑制するものに対して免疫調節をもたらすと考えられる。血管形成術に起因する内皮傷害は、ＨＳＰに対する宿主免疫応答によって増悪し得る。ストレスタンパク質の密接に類似した形のこれらのＨＳＰは、アテローム性動脈硬化症を含めてさまざまな免疫障害の病態発生及び病態生理に関係している、ストレスを受けた細胞によって産生される（Xu et al.、Arterioscler. Thromb. 1992; 12: 789-799）。これは、血管形成領域中の内皮及び平滑筋細胞上に存在する可能性がある。実際にはｈｓｐ／ストレスタンパク質は、免疫系によって適切な方法でその後に扱うことができる自己抗原として働く。この状況は、ウサギ及びマウスにおいて内皮損傷をもたらす交差反応性マイコバクテリアｈｓｐ（ｈｓｐ６５）で免疫することによって実験的に誘導することができる。この効果は、上述したように、Ｔｈ２リンパ球によって分泌されるＩＬ−４に依存すると考えられ、おそらく抗体によって媒介される。
【０２８９】
動物試験からのこれらの観察とヒトとの関連性は、ｈｓｐ６５カラムから溶出し親和性によって精製されたヒト抗体が、ストレスを受けたヒト内皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで損傷する能力によって示唆される（Schett et al.（前記））。この知見は、この抗体が、ｈｓｐ６５のヒト相同体であるｈｓｐ６０と交差反応し、ストレスを受けた内皮細胞の膜上で発現されたときに抗体に接近することができることを示唆する。ストレスを受けた内皮細胞に結合するかかる抗体は、心臓移植後に冠動脈疾患を生成する要因であることが示唆された（Crisp et al.（前記））。Mukherjee et al.は、ｈｓｐ６５に対する手術前抗体レベルと冠動脈再狭窄との関連性がないことを示したが、かかる抗体レベルが血管形成術後に低下した患者はより再狭窄しにくいことを示した（Mukherjee et al.（前記））。彼らは、ｈｓｐ ６５に対する抗体が属するＩｇＧサブクラスを明らかにせず、記録された低レベルはＩｇＧ４（Ｔｈ１関連抗体）への転換のためであった可能性がある。実際には、血管疾患患者は抗体が増加するだけでなく、ｈｓｐ／ストレスタンパク質レベル自体も増加するので、ｈｓｐに対する抗体の役割は複雑になり得る（Wright et al.（前記））。したがって、抗体レベルの見掛けの低下は、タンパク質レベル又はタンパク質に結合する抗体レベルの増加を単に反映している可能性がある。さらに、ｈｓｐ／ストレスタンパク質は調節効果を有し、動脈の平滑筋細胞に結合し、内在化を必要とせずにより長く残存する（Johnson et al.（前記））。
【０２９０】
加熱滅菌ツカムレラ・インコネンシスから調製された免疫調節試薬を用いて経皮冠動脈インターベンションを行うための患者の前処置によって、炎症プロセスが下方制御され、局所的筋内膜増殖の生成とそれに続く動脈のアテローム形成及び再狭窄が抑制される。これは、２２種類の異なるサイトカインを測定するきわめて高感度の「Luminex」法を用いて、末梢血中のサイトカイン含量の変化によって確認することができる。それは、ある種のストレスタンパク質及びそれらに対する抗体のレベルの変化並びに血清コルチゾル、ＤＨＥＡ（dehydroepiandrosterone）及びそれらの誘導体の変化によっても検出可能である。
【０２９１】
待機的ＰＣＩ（percutaneous coronary angioplasty）後に観察される（ｉ）インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０のレベルによって測定される炎症反応、（ii）Ｔヘルパー細胞調節及び機能の他の尺度、（iii）循環ストレスタンパク質及びそれに対する抗体のレベル、（iv）Ｃ反応性タンパク質並びに（５）コルチゾル及びデヒドロエピアンドロステロンの血漿中濃度に対するツカムレラ・インコネンシスの加熱殺菌調製物の注射の効果を試験するために、無作為化二重盲検対照並行群試験が使用される。
【０２９２】
臨床的理由でＰＣＩを必要とする患者は参加する資格がある。試験サイズは、ツカムレラ・インコネンシス又は不活性ビヒクルを用いた免疫治療に対して無作為化される５０人の患者である。患者は、血管形成術の６週間前と３週間前に２回の注射を受け、処置の４週間後に３回目の注射を受ける。炎症マーカーは、最初の注射の前、処置の直前、処置の２４から４８時間後及び処置の６から８週間後に測定される。
【０２９３】
試験は２段階あり、最初の段階においては無作為化され、活性生成物又はプラセボを投与される１０人の患者が前記全パラメータによる検査を受ける。第２段階では、残りの患者が、第１段階から最も適切として選択された方法によって検査される。
【０２９４】
最初の注射は、予定された血管形成術の６週間前に上腕又は肩部域に皮内投与され、２回目の注射はその３週間後に投与される。処置は２回目の注射から３〜５週間後に実施され、３回目及び最終の注射は、処置から４週間後に投与される。ＰＣＩは通常示されるように行われるべきであり、６〜８週間でさらに経過観察されるべきである。これは定常的な臨床の取り決めと一致すべきである。免疫学的マーカー及び炎症性マーカー用の血液試料は、ベースライン（最初の免疫治療又はプラセボ注射前）、ＰＣＩ処置の直前、ＰＣＩ処置後２４〜４８時間及びＰＣＩ処置後６〜８週間において採取されるべきである。
【０２９５】
血液試料採取プロトコル：静脈血試料１０〜１５ｍｌは前記４回の機会の各々で収集される。これらは、定常的な血液学的試験及び生化学試験、一連の血清サイトカイン及びケモカイン評価、循環ストレスタンパク質及びそれに対する抗体のレベル測定、血漿コルチゾル及びＤＨＥＡの評価、炎症性マーカー及び血管疾患マーカーの測定並びに細胞内サイトカイン産生の分析用ＲＮＡの貯蔵のためである。
【０２９６】
免疫治療調製物の詳細：調製物は、Ｍ／１５、ホウ酸塩緩衝（ｐＨ８）非発熱性生理食塩水（プラセボ）であり、又は同じホウ酸塩緩衝剤に１０ｍｇ／ｍｌで懸濁された好気性放線菌種ツカムレラ・インコネンシスの加熱滅菌生物の懸濁液である。
【０２９７】
かん菌は獣医学研究局（Veterinary Medicines Directorate）によって動物ウイルスがないと承認された）非抗原性非動物産物液体培地上で増殖させた。インキュベーションは３２℃の振とう水浴中であった。かん菌は、良好な成長がインキュベーション１０日後に得られたときに収集した。
【０２９８】
プラセボ及び細菌懸濁液は無菌２ｍｌ複数回投与用バイアル中に個々の投与量０．５±０．１ｍｌ体積で分注した。バイアルは、定期的に維持されたオートクレーブ中で効果指示薬と一緒に１２１℃で１５分間加圧滅菌された。冷却後、バイアルを標識し、試験専用の箱中で４℃±１℃で貯蔵した。
【０２９９】
無作為化：これは、（離脱患者又はバイアルの故障を埋め合わせるために）コンピュータによって作成される無作為な数列、１から１０及び１１から６０の生成による。
【０３００】
バイアルの標識は、患者の試験数とそれが１回目、２回目又は３回目の注射に使用されるかどうかを示すＡ、Ｂ又はＣとによる（投与日に対して患者の注意を持続させることができ、はがして使われる自己粘着性ラベルを各バイアルに貼付する）。プラセボ及び活性生成物のバイアルは、コンピュータが作成した無作為化スキームに従って同様に標識され、使用順に箱に保存される。
【０３０１】
インターベンションの投与は、左肩部から始まって交互の三角筋にわたる皮内注射による。患者に対して正確なバイアルを冷蔵庫から取り出す。シリンジに吸い取る直前にバイアルを約２０秒間激しく振とうしてかん菌粒子を懸濁させる。次いで、「ＢＤミクロファイン（BD Microfine）＋０．３３ｍｍ（２９Ｇ）×１２．７（融着）針付き１ｍｌ Ｕ−１００インスリンシリンジ」に０．１ｍｌを吸い取り、小面積の橙皮状皮膚を生じるように注意しながらすぐに投与する。全用量０．１ｍｌを注射すべきである。
【０３０２】
注射後、その内容物を含む残りのバイアルを今後の検査のために冷蔵庫中の特別な箱に必要に応じて戻す。
【０３０３】
【０３０４】
インターベンション試験は血管形成術前２回とその後１回の３回実施される。最初の２回は２１±３日離れているべきである。血管形成術は２回目の注射から２８〜５２日後とすべきであり、試験治療の３回目の注射は血管形成術から２８±３日後（すなわち２回目の注射から５２〜８０日後）とすべきである。
【０３０５】
試験結果：対象となる主要な結果は、免疫調節及び急性期反応のレベルの変化を指標又は炎症として示す血清マーカーである。血液試料はさまざまなマーカーについて分析されるが、試験の主な結果基準は、ベースライン試料及びＰＣＩ直前に採取された試料と比較された追跡血液試料における２つの投与群間で検出される差の比較である。
【０３０６】
以下の調査を、試験の第１段階において１０人の患者について実施した。
１．２２個の異なるサイトカインのルミネックス（Luminex）評価。
２．血漿コルチゾル、ＤＨＥＡ及び代謝産物。
３．６０／６５ｋＤａ及び７０ｋＤａ ｈｓｐ／ストレスタンパク質及びそれらに対する抗体の血清レベル。
４．Ｃ反応性タンパク質レベル。
５．賛辞活性化。
６．血管疾患マーカー。
７．定常的血液学など。
８．上記試験の結果が不適当である場合には、細胞内サイトカインのPax−Geneシステム研究を実施する。
【０３０７】
試験の第２のより大きな段階に実施すべき調査は、以下に示すように、段階１から得られる結果から選択する。
【０３０８】
最初の１０人の患者に対して得られた結果は、
１．血液試料１と２で差を示す患者（免疫調節効果）。
２．血液試料２と３で差を示す患者（手術手技の効果）。
３．血液試料１と４で差を示す患者（治療及び処置の長期効果）。
について研究者の各々によって分析される。
【０３０９】
次いで、それらの結果は患者の積極的治療又はプラセボ治療に従って分析される。これら２群間で差を示す選択調査は、試験の第２の主要な局面に適用される。
【０３１０】
二次的成果：一定分量の血液試料は、エンドセリン、フォンウィルブランド因子などの他の血管炎症性マーカーのありうる後日の分析のために貯蔵される。
【０３１１】
予備調査によれば、ツカムレラ・インコネンシスは冠動脈血管形成術後のＭＩＨを抑制すると示唆される。
【０３１２】
上記明細書に述べられたすべての刊行物を参照により本明細書に援用する。本発明に記載の方法及びシステムの様々な改変形態及び変更形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求する本発明がかかる具体的実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態の様々な変形形態は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３１３】
【図１】離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔メス試験及び対照の結果を示すグラフである。
【図２】離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔オス試験及び対照の結果を示すグラフである。
【図３】ゴルドニア・ブロンチアリスが初期のＴＨ１効果を増強することを示すグラフである。
【図４】ツカムレラ・インコネンシスが初期のＴＨ１応答を増強し、後期のＴＨ２応答を抑制することを示すグラフである。
【図５】ロドコッカス・コプロフィラスがＴＨ１応答とＴＨ２応答の両方を抑制することを示すグラフである。
【図６】非ワクチン接種対照と比較された１カ月後のＢＣＧに対するツベルクリン応答を示すグラフである。
【図７】３種類の細菌によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４及び４８時間目に測定する。代表的な種は、（Ｎａ）ノカルジア・アステロイド、（Ｇｂ）ゴルドニア・ブロンチアリス及び（Ｔｐ）ツカムレラ・インコネンシスである。
【図８】２種類の細菌によるＢＣＧ／ＢＣＧ＋の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。代表的な種は、（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス及び（Ｄｍ）ダイエツィア・マリスである。
【図９】ロドコッカス属内の選択された種によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス、（Ｒｒｕ）ロドコッカス・ルベル、（Ｒｒｈｏｄ）ロドコッカス・ロドニイ、（Ｒｃｏｐ）ロドコッカス・コプロフィラス、（Ｒｏｐａ）ロドコッカス・オパカス、（Ｒｅｒｙｔｈ）ロドコッカス・エリトポレス。
【図１０】ロドコッカス・ルベルの１０８から１０４の対数希釈で改変されたＢＣＧを用いたロドコッカス・ルベルの最適用量をＢＣＧ単独と比較して示すグラフである。
【図１１】未処理対照及びマイコバクテリアワクチンで処理された対照と比較された、ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コルプロフィラス（Rhodococcus corprophilus）又はツカムレラ・インコネンシスで処理後の平均ラット体重増加を示すラット血管形成術試験からのグラフである。
【図１２】未処理対照及びマイコバクテリアワクチンで処理された対照と比較された、ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コルプロフィラス又はツカムレラ・インコネンシスで処理後のラットにおける内膜／中膜厚さ比の結果を示すグラフである。ＧＰ１＝対照、ＧＰ２＝ゴルドニア・ブロンチアリス、ＧＰ３＝ロドコッカス・コプロフィラス、ＧＰ４＝ツカムレラ・インコネンシス、ＧＰ５＝マイコバクテリアワクチン）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節物質、特に細胞免疫応答を調節するワクチン及びその使用に関する。本発明は、ある種の血管障害を含めて自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療及び／又は予防用医薬品の製造における免疫調節物質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、体を防御し、細菌、ウイルス及び他の侵入異物に起因する感染を排除するのに通常働く細胞及び細胞成分（分子）の複雑なネットワークである。人が自己免疫疾患を有する場合、免疫系は誤って自己を攻撃し、人自身の体の細胞、組織及び器官を標的にする。標的部位における免疫系細胞及び分子の集合は、大まかに炎症と称することができる。
【０００３】
多数の異なる自己免疫疾患があり、それらは各々異なる方法で体に影響を及ぼし得る。自己免疫疾患の多くはまれなものである。しかし、グループとすると、自己免疫疾患は数百万人が罹患している。
【０００４】
一部の自己免疫疾患は、ウイルス感染、寄生虫感染、慢性細菌感染などのある誘因によって開始又は悪化することが知られている。それほど理解されていない他の作用が免疫系に影響を及ぼし、自己免疫疾患の過程は加齢、慢性ストレス、ホルモン及び妊娠を含む。
【０００５】
自己免疫疾患は慢性であることが多く、人が健康に見える又は感じることができるときでも生涯にわたる注意及び監視が必要である。現在、ほとんどの自己免疫疾患は治療によって治癒又は寛解することができない。
【０００６】
医師は、ほとんどの場合、自己免疫疾患に起因する炎症の結果を患者が管理する助けとなる。一部の人においては、限定された数の免疫抑制薬物療法が疾患の寛解をもたらすことがある。しかし、彼らの疾患が寛解した場合でも、患者は薬物療法を中止できることはまれである。免疫抑制薬物療法の長期副作用はかなりのものになり得る。
【０００７】
血管損傷の開始及び進行は複雑でさまざまな原因によって起こるプロセスであるが、炎症反応が重要な役割を果たしている証拠が増えている。血管損傷は、アテローム性動脈硬化症の発症及び心筋梗塞、発作、末梢動脈閉塞などの急性虚血性症候群をもたらす血栓プロセスに関与する
【０００８】
免疫機構は、アテローム性動脈硬化症及びＭＩＨ（myointimal hyperplasia）の発症及び維持に重要となり得る。
【０００９】
ＭＩＨは、バルーン血管形成術などの傷害に対する過度の治癒応答とみなすことができる。一連の事象は、基底膜の損失、ＶＳＭＣ（vascular smooth muscle cell）の中膜から内膜への移動、ＶＳＭＣの増殖及びより分泌性である線維芽細胞型への表現型の変化並びに細胞外基質の生成増加をもたらし、血管の狭窄又は閉塞を最終的にもたらす。これはバイパス移植及びバルーン血管形成術後に起こり、臨床実務におけるかかる症例の約３０％に影響を及ぼす。これはかかる手順の失敗の主原因であり、生じた狭窄及び閉塞血管／移植片の治療は問題となる。ＭＩＨをもたらす基本的な細胞機序は十分に理解されておらず、それを有効に防止することができる療法は現在まで開発されていない。本特許の臨床的な妥当性は、英国及び世界中で毎年実施されるきわめて多数の冠動脈血管形成術に関係する。薬物を溶出するステントは有望な結果を現在生み出しているが、それが再狭窄を完全に防止しそうにはない。本特許に提案される免疫療法などの安全で比較的安価な補助的治療は、臨床的に重大な影響を有する。
【００１０】
再狭窄に対する免疫療法に関わるこれらの機序は複雑であり、完全には解明されていない。血管形成術に起因する内皮傷害は、ｈｓｐに対する宿主免疫応答によって増悪し得る。Ｈｓｐは、アテローム性動脈硬化症を含めてさまざまな免疫障害の病態発生及び病態生理に結び付けられるストレスを受けた細胞によって産生されるタンパク質である（Xu Q et al.、Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799）。これは、血管形成領域中の内皮及び平滑筋細胞上に存在する可能性がある。事実上、ｈｓｐは、免疫系によってその後攻撃され得る自己抗原として働く。この状況は、ウサギ及びマウスにおいて内皮損傷をもたらす交差反応性マイコバクテリアｈｓｐ（ｈｓｐ６５）で免疫化することによって実験的に引き起こすことができる（Xu Q et al.、Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799及びGeorge J et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210）。この効果は、Ｔｈ２リンパ球によって分泌されるＩＬ−４に依存すると考えられ、抗体によっておそらく媒介されるGeorge J et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210及びSchett G et al.、J Clin. Invest. 1995; 96: 2569-2577）。これらの観察とヒトとの関連性は、ｈｓｐ６５カラムから溶出し親和性によって精製されたヒト抗体が、ストレスを受けたヒト内皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで損傷する能力によって示唆される。この知見は、この抗体が、ｈｓｐ６５のヒト相同体であるｈｓｐ６０と交差反応し、ストレスを受けた内皮細胞の膜上で発現されたときに抗体に接近することができることを示唆する。ストレスを受けた内皮細胞に結合したかかる抗体が、心臓移植後の冠動脈疾患を発生させる要因であることが示唆された（Crisp SJ et al.、J Heart Lung Transplant 1994; 81-91）。Mukherjee et al.（Thromb Haemost 1996; 75: 258-60）は、手術前のｈｓｐ６５に対する抗体のレベルと冠動脈再狭窄との関連性がないことを示したが、血管形成術後にかかる抗体レベルが低下した患者はより再狭窄しにくいことを示した。実際には、血管疾患患者は抗体が増加するだけでなく、ｈｓｐレベル自体も増加するので、ｈｓｐに対する抗体の役割は複雑になり得る（Wright BH et al.、Heart Vessels 2000; 15: 18-22）。したがって、抗体レベルの見掛けの低下は、単にこのタンパク質レベルの増加を示しているに過ぎない恐れがある。さらに、ｈｓｐは調節効果を有し、動脈の平滑筋細胞に結合し、内在化を必要とせずにより長く残存する（Johnson AD et al.、Atherosclerosis 1990; 84: 111-119）。
【非特許文献１】Xu Q et al.、Arterioscler Thromb 1992; 12: 789-799
【非特許文献２】George J et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210
【非特許文献３】Schett G et al.、J Clin. Invest. 1995; 96: 2569-2577）
【非特許文献４】Crisp SJ et al.、J Heart Lung Transplant 1994; 81-91）
【非特許文献５】Mukherjee et al.(Thromb Haemost 1996; 75: 258-60）
【非特許文献６】Wright BH et al.、Heart Vessels 2000; 15: 18-22）
【非特許文献７】Johnson AD et al.、Atherosclerosis 1990; 84: 111-119）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、対象に投与された放線菌類ロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドニア（Gordonia）属、ノカルジア（Nocardia）属、ダイエツィア（Dietzia）属、ツカムレラ（Tsukamurella）属及びノカルジオイデス（Nocardioides）属のいずれか１種の属に属する細菌の全細胞が、その対象の免疫系、特に細胞免疫系の改変を誘発することができ、自己免疫疾患又は自己免疫異常、特に例えば血管内膜の炎症を含むものに対する防止及び／又は治療効果をもたらすという予想外の発見に基づく。
【００１２】
自己免疫疾患及び自己免疫異常、特に例えば血管内膜の炎症を含むものを有効に治療及び／又は予防するために、放線菌類ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属のいずれか１種の属に属する細菌の全細胞を含む組成物を使用する利点は、この治療及び／又は予防が、常法に従って現在使用されている化学療法、すなわち免疫抑制薬物療法よりも長期副作用を抑えつつ実施されるということであろう。
【００１３】
本明細書では「細胞免疫系」という句は、Ｔリンパ球の存在に依存する細胞性免疫応答を含む。「Ｔリンパ球」という用語は、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び調節性Ｔ細胞を含む。例えば自己免疫疾患又は異常を含めた細胞性免疫不全を例えば克服するために細胞性免疫応答の改変を使用することができる。
【００１４】
本明細書では「調節する（modulate）」、「改変する（modify）」、「改変（modification）」という用語及び他のその派生語は、細胞免疫系の成分を下方制御、阻害、誘導、刺激、上方制御、変更し、又はそれに影響を及ぼすことを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、さらに、自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００１６】
適切には、自己免疫疾患又は自己免疫異常は、対象自身の免疫系が対象組織の１個又は複数に損傷を与える型のものである。適切には、自己免疫応答は、対象内の何か又は対象の環境内の何かによって引き起こされることがある。
【００１７】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、誘因後のものであり得る。例えば、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、感染及び／又は他のある誘因に起因するものであり得る。潜在的誘因は、例として、老齢、感染（例えば寄生虫感染）、ステロイド治療、ミョウバンを用いたワクチン接種の繰り返し、妊娠及び／又は癌であり得る。
【００１８】
本発明は、さらに、自己免疫疾患を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用であって、自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管内膜の炎症を含む、使用を提供する。
【００１９】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管内膜の炎症を含むと同様に、血管筋層又は心筋の炎症を含む。
【００２０】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものであり得る。
【００２１】
本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１つ又は複数であり得る。
【００２２】
適切には、本発明による血管障害は、自己免疫エレメント、例えば自己免疫応答に起因するものを含む任意の血管疾患又は異常を含むことができる。
【００２３】
適切には、本発明による血管障害は、レイノー病又はレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１つ又は複数を含むことができる。
【００２４】
適切には、本発明による移植片拒絶は、特に免疫抑制薬の非存在下での慢性移植片拒絶とすることができる。したがって、本発明による組成物は、移植前、移植中及び／又は移植後に投与される従来の免疫抑制薬の代用品として使用することができる。本発明による組成物は、角膜、骨髄、器官（例えば、腎臓、肝臓）、水晶体、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織、島細胞の１つ又は複数などの天然又は人工細胞、組織及び器官を移植するときに使用することができる。
【００２５】
本発明は、さらに、血液障害を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２６】
本発明は、さらに、関節炎、特に関節リウマチを治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、移植片拒絶を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２８】
さらに別の態様においては、本発明は、さらに、乾癬を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用を提供する。
【００２９】
本明細書では「免疫調節物質」という用語は、対象の細胞免疫系を調節する物質を意味する。
【００３０】
本明細書では「全細胞」という用語は、完全な細菌又は実質的に完全な細菌を意味する。特に、本明細書では「完全な」という用語は、全細胞、特に生細胞全体に存在する成分のすべてを含む細菌及び／又はそれから１個若しくは複数の成分を除去するために特に処理されていない細菌を意味する。本明細書では「実質的に完全」という用語は、細菌を得るのに使用される単離及び／又は精製プロセスが、例えば、細胞にわずかな改変をもたらし、且つ／又は細胞の１個若しくは複数の成分を除去し得るが、かかる改変及び／又は除去が起こる程度が重要でないことを意味する。特に、本発明による実質的に完全な細胞は、それから１個又は複数の成分を除去するために特に処理されていない。
【００３１】
細菌細胞の個々の成分はアジュバント効果を誘発するために使用できることが示唆されるが、本発明によるロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞の使用は本発明の前に企図されなかった。驚くべきことに、前記属に属する細菌の全細胞を使用することによって、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療及び／又は予防を実施できるということが見出された。前記細菌の前記全細胞の投与に起因する細胞免疫応答の改変は、細菌の個々の成分の投与によって誘発される応答よりも有利には長時間持続することができる。
【００３２】
好ましくは、本発明による組成物は、１個を超える全細胞を含み、より好ましくは複数の全細胞を含む。
【００３３】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物は抗原及びアジュバントを含むことができ、前記アジュバントは、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む。前記抗原は、これらの属によって、他の微生物及び真核生物細胞、例えば脊椎動物細胞のミトコンドリアと共有されるものとすることができる。
【００３４】
別の態様においては、免疫調節物質組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物であって、薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を場合によっては含んでいてもよい薬剤組成物とすることができ、使用される前記免疫調節物質組成物は細胞免疫応答を改変する。
【００３５】
さらに別の態様においては、免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞と、例えばインターロイキン２などの少なくとも１種の追加のサイトカインとを含むことができる。サイトカインは、本発明の免疫調節作用を強化するのに役立ち得る。
【００３６】
適切には、抗原又は抗原決定基は、（英国特許第００２５６９４．１号に教示される）ＢＣＧ（bacillus of Calmette and Guerin）ワクチン、ジフテリアトキソイドワクチン、ジフテリア／破傷風／百日咳（ＤＴＰ又は三種混合）ワクチン、百日咳ワクチン、破傷風トキソイドワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、経口ポリオワクチン（ＯＰＶ（oral poliomyelitis vaccine））及びマイコバクテリアワクチン（Mycobacterium vaccae）又はその一部の１又は２以上からの抗原又は抗原決定基とすることができる。このリストは決して限定的なものではなく、他の出所に由来する適切な抗原を本発明による組成物に添加することができる。これらの抗原に対する応答も、本発明による組成物の投与に起因して誘導された応答調節の恩恵を受けることができる。他の適切な抗原は、本発明による調節物質組成物中に天然に存在しない他のウイルス、腫よう、寄生生物又は他の細菌に由来する抗原とすることができる。
【００３７】
適切には、免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、２個以上のかかる抗原又は抗原決定基を含むことができる。
【００３８】
さらに別の態様においては、本発明によるロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物はワクチン中で使用することができ、又はワクチンとして使用することができる。
【００３９】
適切には、ワクチンは予防ワクチン又は治療ワクチンとすることができる。
【００４０】
さらに別の態様においては、本発明は、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療又は予防に使用されるロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物を提供する。
【００４１】
一態様においては、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を下方制御することができる。
【００４２】
別の態様においては、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ１応答を上方制御することができる。
【００４３】
適切には、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を下方制御しＴｈ１応答を上方制御することができる。
【００４４】
或いは、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答に影響を及ぼさずにＴｈ１応答を上方制御することができる。
【００４５】
或いは、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を下方制御し、Ｔｈ１応答も下方制御することができる。
【００４６】
或いは、本発明による細菌の全細胞は、Ｔｈ２応答を上方制御し、Ｔｈ１応答も上方制御することができる。
【００４７】
別の態様においては、本発明は、自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防する方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与するステップを含み、前記組成物が細胞免疫応答を調節する、方法を提供する。
【００４８】
適切には、有効量の薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を単回投与することができる。或いは、有効量の薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を複数回（繰り返し）、例えば２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、１０回以上又は２０回以上繰り返し投与することができる。
【００４９】
特に、かかる繰り返し投与は、例えば定着した慢性症状の治療に必要とされることがある。
【００５０】
本発明のさらに別の態様においては、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を投与することを含む、自己免疫疾患又は自己免疫異常に対して免疫を含めて対象を防御する方法が提供される。
【００５１】
本明細書では「防御された」という用語は、本発明による組成物を用いた治療を受けていない対象又は本発明による組成物を投与されていない対象よりも、対象が疾患／障害に罹患し難いこと、及び／或いは本発明による組成物を用いた治療を受けていない対象又は本発明による組成物を投与されていない対象よりも、対象が疾患／障害に対抗する又は疾患／障害を克服することができることを意味する。
【００５２】
別の態様においては、本発明は、本発明による薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与するステップであって、前記組成物が抗原又は抗原決定基と同時投与されるステップを提供する。
【００５３】
本組成物が本発明によって抗原又は抗原決定基と同時投与されるときには、抗原又は抗原決定基は、適切には、（英国特許第００２５６９４．１号に教示される）ＢＣＧワクチン、ジフテリアトキソイドワクチン、ジフテリア／破傷風／百日咳（ＤＴＰ又は三種混合）ワクチン、百日咳ワクチン、破傷風トキソイドワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、経口ポリオワクチン（ＯＰＶ）及びマイコバクテリアワクチン又はその一部の１個若しくは複数からの抗原又は抗原決定基とすることができる。適切には、かかる抗原又は抗原決定基の２個以上又は３個以上を本発明による薬剤組成物又は免疫調節物質組成物と同時投与することができる。
【００５４】
好ましくは、本発明による医薬品は、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療又は予防に使用される。
【００５５】
本発明のさらに別の態様においては、本発明による薬剤組成物又は免疫調節物質組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１種を超える属に属する細菌を含むことができる。適切には、本組成物は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属のいずれか１種に属する２個以上又は３個以上の細菌を含ロドコッカスむことができる。
【００５６】
好ましくは、本発明に従って使用される細菌は、例えばゴルドニア・ブロンチアリス（Gordonia bronchialis）、ゴルドニア・アマレア（G. amarae）、ゴルドニア・スプチ（G. sputi）、ゴルドニア・テレア（G. terrae）、ノカルジア・アステロイド（Nocardia asteroides）、ダイエツィア・マリス（Dietzia maris）、ツカムレラ・パウロメタボラ（Tsukamurella paurometabola）、ロドコッカス・ルベル（Rhodococcus ruber）、ロドコッカス・ロドニイ（Rhodococcus rhodnii）、ロドコッカス・コプロフィラス（R. coprophilus）、ノカルジオイデス・アルバス（Nocardioides albus）、ツカムレラ・インコネンシス（Tsukamurella inchonensis）などのこれらの属のいずれかに属する任意の種を含めて、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する。適切には、特定の各属から使用される種は、低抗原性培地、好ましくは非抗原性培地である培地上で増殖することができるものである。単なる例として、適切な非抗原性培地はソートン培地である。
【００５７】
適切には、本発明に従って使用される細菌は、（以前はノカルジア・ルブラ（Nocardia rubra）として知られた）ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・ルホドクラウス（Rhodococcus rhodocrous）、ロドコッカス・ロドニイ、ロドコッカス・コプロフィラス、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）、ロドコッカス・エリトポレス（Rhodococcus erythopolis）を含めて、ロドコッカス属に属することができる。
【００５８】
適切には、本発明に従って使用される細菌はロドコッカス・ルベルとすることができる。
【００５９】
好ましくは、本発明による細菌は使用前に死滅させる。適切には、本発明による細菌は、その熱処理、例えば、オートクレーブ中１２１℃で１５分間の熱処理によって死滅させることができる。
【００６０】
他の適切な滅菌処理としては、紫外若しくは電離放射線、フェノール、アルコール、ホルマリンなどの化学物質による処理などが挙げられる。
【００６１】
適切には、本発明による細菌は精製及び／又は単離することができる。
【００６２】
適切には、本発明による細菌は、水又は緩衝食塩水、適切にはｐＨ８で緩衝されたボラート中に懸濁することができる。
【００６３】
本明細書では「対象」という用語は動物を意味する。適切には、対象は、トリ、（例えばエビなどの）甲殻類、魚及び哺乳動物を含む、例えば、任意の動物とすることができる。好ましくは、対象は、例えば家畜及びヒトを含めて、哺乳動物である。本発明の一部の態様においては、対象は適切にはヒトとすることができる。
【００６４】
薬剤組成物又は免疫調節物質組成物を（１回を超える投与がなされる場合には初めて）家畜に投与するときには、家畜が初めて授乳した後に投与することが好ましい。特に、一部の適用例では、（１回を超える投与がある場合には）初回又は１回のみの薬剤組成物又は免疫調節物質組成物を投与する前に親の初乳を乳児に摂取及び／又は消化させることが重要なことがある。不確かさを回避するために、一部の適用例では、薬剤組成物又は免疫調節物質組成物の最初の投与は、生後約１〜４日目、好ましくは生後１〜３日目、より好ましくは生後１〜２日目、好ましくは生後２〜３日目で行うべきである。次の投与は、最初の注射から７日後及び／又は８〜１２週後に行うことができる。
【００６５】
本明細書では「免疫調節物質」という用語はワクチンを含む。
【００６６】
細菌は放線菌目（Actinomycetales）に属する細菌であることが好ましい。しかし、細菌はマイコバクテリアワクチンではないことが好ましい。一実施形態においては、細菌はマイコバクテリア属に由来しないことが好ましい。
【００６７】
治療用途
本発明の免疫調節物質は治療に使用することができる。特にかかる化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴリンパ球応答を調節するために使用することができ、且つ／又はｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答に関与する他の細胞を調節するために使用することができる。
【００６８】
Ｔ細胞増殖及び／又は分化及び／又は活性を調節、特に遮断することができる免疫調節物質／薬剤組成物は、適応免疫応答、すなわち細胞免疫応答の調節によって予防又は治療に感受性が高いあらゆる障害に対して使用することができる。
【００６９】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、対象自身の免疫系が対象組織の１つ又は複数に損傷を与える型のものである。適切には、自己免疫応答は、対象内の何か又は対象の環境内の何かによって引き起こされることがある。
【００７０】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は誘因後のものであり得る。例えば、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、感染及び／又は他のある誘因に起因するものであり得る。潜在的誘因は、例として、老齢、感染（例えば寄生虫感染）、ステロイド治療、アラムを用いたワクチン接種の繰り返し、妊娠及び／又は癌であり得る。
【００７１】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管内膜の炎症を含むものとすることができる。
【００７２】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管内膜の炎症を含むと共に、血管筋層又は心筋の炎症を含む。
【００７３】
適切には、本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものであり得る。
【００７４】
本発明による自己免疫疾患又は自己免疫異常は、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１つ又は複数とすることができる。
【００７５】
適切には、本発明による血管障害は、自己免疫エレメント、例えば自己免疫応答に起因するものを含む任意の血管疾患又は異常を含むことができる。
【００７６】
適切には、本発明による血管障害は、レイノー病及びレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１つ又は複数を含むことができる。
【００７７】
適切には、本発明による移植片拒絶は、特に免疫抑制薬の非存在下での慢性移植片拒絶とすることができる。したがって、本発明による組成物は、移植前、移植中及び／又は移植後に投与される従来の免疫抑制薬の代用品として使用することができる。本発明による組成物は、角膜、骨髄、器官（例えば、腎臓、肝臓）、水晶体、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織、島細胞の１つ又は複数などの天然又は人工の細胞、組織及び器官を移植するときに使用することができる。
【００７８】
Ｔヘルパー細胞
本明細書では「Ｔｈ１」という用語は、１型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）を指す。この用語は、かかる細胞型によって媒介される応答又はかかる細胞型を介した応答を指すのに本明細書では使用することもできる。かかる応答は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の分泌、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の分泌、マクロファージの活性化、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化又は任意の他のＴｈ１関連事象の１つ若しくは複数を含むことができる。したがって、「Ｔｈ１」という用語は、Ｔｈ１細胞及びかかる細胞が生成する免疫応答を含むことができる。
【００７９】
本明細書では「Ｔｈ２」という用語は、２型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）を指す。この用語は、かかる細胞型によって媒介される応答又はかかる細胞型を介した応答を指すのに本明細書では使用することもできる。かかる応答は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の分泌、スプライスバリアントインターロイキンＩＬ−４δ２の分泌、インターロイキン−５（ＩＬ−５）の分泌、リンパ球上の細胞決定因子３０（ＣＤ３０）レベルの増加、血中又は血液の好酸球中の免疫グロブリン−Ｅ（ＩｇＥ）レベルの増加又は任意の他のＴｈ２関連事象の１つ若しくは複数を含むことができる。したがって、「Ｔｈ２」という用語は、Ｔｈ２細胞及びかかる細胞が生成する免疫応答を含むことができる。
【００８０】
さまざまな条件は、特にＴｈ１及び／又はＴｈ２の活性化及び／又は増殖において、制御されていない細胞免疫応答又は不適当に調節された細胞免疫応答をもたらし、或いはそれらの細胞免疫応答に起因し得ることが知られている。これは、調節されていない場合又は不適当に調節されたままにされた場合、対象に対して１つ又は複数の有害な効果をもたらすことが見出された。
【００８１】
調節されていない又は不適当に調節された細胞免疫応答は、例えば動脈硬化症などの炎症性血管疾患、血管形成術後の筋内膜増殖、前部ブドウ膜炎などの自己免疫異常において、また、移植／拒絶中にも認められる。さらなる例として、Stansby et al.、Eur J Vasc Endovasc Surg 2002; 23: 23-28は、抗体応答を調節するマイコバクテリア調製物による治療によって、ラット血管形成モデルにおいて血管疾患、すなわち再狭窄が減少するという仮説を検定した。ヒトにおける使用に適切なマイコバクテリア材料による免疫調節はＭＩＨを抑制できることが判明した。かかる調節は低リスクなので、これは、再狭窄と闘う重要な新しい治療様式の見通しを開くものである。
【００８２】
したがって、本発明の一目的は、調節されていない又は不適当に調節された細胞免疫応答のマイナス効果を克服するように、Ｔｈ１及び／又はＴｈ２の制御又は調節を含めて細胞免疫応答の制御を促進し確立することである。
【００８３】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１又はＴｈ２応答、すなわち例えば組織損傷をもたらすＴｈ１又はＴｈ２応答が制御される。
【００８４】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１応答を減少させ、Ｔｈ２応答を減少させることができる。
【００８５】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ２応答に影響を及ぼさずにＴｈ１応答を増大させることができる。
【００８６】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を減少させることができる。
【００８７】
適切には、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の使用によって、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を増大させることができる。
【００８８】
適切には、当業者は、本発明による各属の特定の種を試験して、その特定のＴｈ１／Ｔｈ２応答を測定することができる。
【００８９】
調節されていない又は不適当に調節された免疫応答は、一部の疾患がＴｈ１及び／又はＴｈ２応答を変化させるという事実或いはＴｈ１及び／又はＴｈ２応答の変化の結果であるという事実のために、疾患の確立においてある役割を果たす。これらの非定型Ｔｈ１及びＴｈ２反応に付随するのは、組織病理の根底にある機序に関与し得る一連の異常な炎症反応である。
【００９０】
単なる例として、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は自己免疫疾患又は自己免疫異常に対抗することができる。
【００９１】
ワクチン
１個又は複数の物質を活性成分として含有するワクチンの調製は当業者に公知である。一般に、かかるワクチンは溶液又は懸濁液として、注射剤として調製される。注射前に溶液又は懸濁液にするのに適切な固体剤形を調製することもできる。調製物は乳化することもでき、リポソームに封入された活性成分とすることもできる。活性成分は、薬剤として許容され該活性成分と適合性である賦形剤と混合されることが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど及びこれらの組合せである。或いは、ワクチンは、例えば、経口摂取されるように、且つ／又は吸入可能なように調製することができる。
【００９２】
また、必要に応じて、ワクチンは、少量の湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助的物質を含有することができる。
【００９３】
投与
一般に、医師は、個々の対象に最も適切であるワクチン、免疫調節物質組成物及び薬剤組成物の実際の投与量を決定する。それは、個々の患者の年齢、体重及び応答に応じて変わる。以下の投与量は平均的な症例の例示である。高い又は低い投与量範囲が有利である個々の場合があり得るのは言うまでもない。
【００９４】
使用する実際の投与量は、対象に対する毒性が最小限に抑えられることが好ましい。
【００９５】
本発明の組成物は、直接注射によって投与することができる。本組成物は、非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、皮内又は経皮投与用に処方することができる。
【００９６】
適切には、本発明による組成物は、生物１ナノグラムから１００ミリグラム、好ましくは生物１０ナノグラムから１０ミリグラム、より好ましくは生物１００ナノグラムから５ミリグラム、さらにより好ましくは生物１００ナノグラムから１ミリグラムの用量で投与することができる。一般に、本発明による組成物は、ヒト及び動物用に細菌１００マイクログラムから１ミリグラムの用量で投与することができる。
【００９７】
本発明の組成物を免疫増強剤として投与する場合には、ヒト及び動物用に生物１ナノグラムから１００ミリグラム／回、好ましくは生物１０ナノグラムから１０ミリグラム／回、より好ましくは生物１００ナノグラムから５ミリグラム／回、さらにより好ましくは生物１００ナノグラムから１ミリグラム／回、さらにより好ましくは、細菌１００マイクログラムから１ミリグラム／回を規則的な間隔で投与することができる。
【００９８】
当業者には容易に理解されるように、投与量は、その用量が投与される生物によって決まる。
【００９９】
「投与する」という用語は、注射、脂質によって媒介される形質移入、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、ＣＦＡ（cationic facial amphiphile）及びそれらの組合せ、さらにはウイルスの送達を含めた送達機序による送達を含む。かかる送達機序の経路としては、粘膜、鼻、口、非経口、胃腸、局所又は舌下経路などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１００】
「投与する」という用語は、例えば、吸入用点鼻薬若しくはエアゾール剤として粘膜経路による送達、又は摂取溶液、カプセル剤若しくは錠剤としての送達、送達が例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下経路などの注射用剤形による親経路を含むが、これらだけに限定されない。
【０１０１】
「同時投与する」という用語は、本発明のアジュバント、抗原及び／又は抗原決定基の各々の投与部位及び時間が、免疫系の必要な調節が達成されるようなものであることを意味する。したがって、抗原とアジュバントは同時に同じ部位に投与することができるが、アジュバントとは異なる時間で異なる部位に抗原及び／又は抗原決定基を投与することが有利なこともある。抗原及び／又は抗原決定基とアジュバントは同じ送達ビヒクルで送達することさえできる。抗原及び／又は抗原決定基とアジュバントは結合及び／又は非結合とすることができ、且つ／或いは遺伝子的に結合及び／又は非結合とすることができる。単なる例として、本発明による免疫調節物質組成物は、１又は２以上の抗原又はさらに別の抗原の投与前、投与と同時に又は投与後に投与することができる。
【０１０２】
抗原、抗原決定基、ペプチド若しくは相同体又はそれらの模倣体は、単回投与又は複数回投与で宿主対象に別個にでも同時にでも投与することができる。
【０１０３】
本発明の免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、（非経口、皮下、皮内及び筋肉内注射を含む）注射、鼻腔内、粘膜、経口、膣内、尿道、眼球投与などいくつかの異なる経路によって投与することができる。
【０１０４】
本発明においては、投与は注射によることが好ましい。注射は皮内であることがより好ましい。
【０１０５】
本発明においては、投与は、経口的に許容される組成物によることが好ましい。
【０１０６】
ワクチン接種の場合には、本組成物は、水溶液、好ましくは緩衝生理食塩水０．１から０．２ｍｌで提供することができ、非経口的に、例えば皮内接種によって投与する。本発明によるワクチンは好ましくは皮内注射する。軽度の膨潤及び発赤、時折かゆみも注射部位において見られることがある。投与方法、用量及び投与回数は、当業者が公知の方法で最適化することができる。
【０１０７】
抗原
本明細書では「抗原」は、免疫適格性宿主に導入されたときに、実体と組み合わせることができる特異抗体又は抗体の産生を変える実体並びに／或いはＴｈ２及び／又はＴｈ１などの関連するＴｈ応答を変える実体を意味する。抗原は、（細胞、細胞断片、細胞超音波処理物を含めて）純粋な物質、物質の混合物、可溶性材料又は粒子材料とすることができる。この意味で、この用語は、任意の適切な抗原決定基、交差反応抗原、同種抗原、異種抗原、寛容原、アレルゲン、ハプテン及び免疫原又はそれらの一部並びにそれらの任意の組合せを含み、これらの用語は本明細書を通して区別なく使用される。
【０１０８】
本明細書では「抗原決定基又はエピトープ」という用語は、抗体若しくはＴ細胞受容体によって認識される抗原上の部位又はＴヘルパー細胞応答を惹起する原因である抗原上の部位を指す。これは、タンパク質抗原に由来する短いペプチド又はタンパク質抗原の一部としての短いペプチドであることが好ましい。しかし、この用語は、糖ペプチド及び炭水化物エピトープも含むものとする。この用語は、生物全体を認識する応答を刺激するアミノ酸の改変配列又は炭水化物も含む。
【０１０９】
「防止」又は「予防」ワクチンは、投薬を受けたことがない個体に投与して、防御免疫を刺激することなどによって発症を防止するワクチンである。
【０１１０】
「治療」ワクチンは、既存の症状を有する個体に投与されて症状を軽減し、又は最小限に抑え、或いは症状の免疫病理学的結果を抑止するワクチンである。
【０１１１】
アジュバント
本明細書では「アジュバント」という用語は、免疫応答の影響を増大させることができる実体又はそれに関与することができる実体を意味する。アジュバントは、抗原に対する免疫応答を助け、増大させ、下方制御し、改変し、又は多様化する任意の物質又は物質の混合物である。
【０１１２】
本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物は、免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物の有効性を高める１個又は複数のアジュバントを含むことができる。有効であり得る追加のアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型乳濁液、水中油型乳濁液、ムラミルジペプチド、菌体内毒素、脂質Ｘ、コリネバクトリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（プロピオノバクテリウム・アクネス（Propionobacterium acnes））、百日咳菌（Bordetella pertussis）、マイコバクテリアワクチン、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、インターロイキン２、インターロイキン１２などのインターロイキン、サポニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックドコポリマー又は他の合成アジュバントが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかるアジュバントは、さまざまな供給源から商業的に入手可能であり、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）又はフロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)である。ヒト用には水酸化アルミニウムのみが認可されている。例えばマイコバクテリアワクチンなどの他のアジュバントの一部は、臨床試験が認可された。
【０１１３】
適切には、アジュバントは、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属のいずれか１種に属する細菌の全細胞とすることができる。
【０１１４】
当技術分野では、金粒子に結合した本質的にＤＮＡ配列であり、ヘリウム銃によって皮膚中に発射されるＤＮＡワクチンは、効率的なワクチン送達システムであることが知られている。従来のワクチンとは異なり、これらのＤＮＡワクチンは在来のアジュバント成分を必要としない。本発明の別の態様によれば、本明細書の免疫調節物質組成物は、適切には、かかるＤＮＡワクチンと併用して、免疫応答の影響を増大させ、又はそれに関与することができる。
【０１１５】
薬剤組成物
本発明は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の全細胞の治療有効量を含む薬剤組成物であって、薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を（それらの組合せを含めて）場合によっては含んでいてもよい薬剤組成物にも関する。
【０１１６】
本薬剤組成物は、第１の成分が抗原を含み、第２の成分がそのアジュバントを含む２種類の成分を含むことができる。第１の成分と第２の成分は、連続して、同時又は一緒に、さらには異なる投与経路によって送達することができる。
【０１１７】
本薬剤組成物は、ヒトの医学及び獣医学においてヒト又は動物に使用することができ、一般に、薬剤として許容される希釈剤、担体又は賦形剤のいずれかの１又は２以上を含む。治療用に許容される担体又は希釈剤は、薬剤技術においては周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。薬剤担体、賦形剤又は希釈剤は、意図する投与経路及び製薬上の標準的実務に照らして選択することができる。
【０１１８】
薬剤組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として又はそれらに加えて、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【０１１９】
防腐剤、安定剤、色素、さらには香味料も薬剤組成物中に入れることができる。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤も使用することもできる。
【０１２０】
異なる送達系に応じて様々な組成／処方要件があり得る。例として示すと、本発明の薬剤組成物は、ミニポンプを用いて、或いは粘膜経路によって、例えば、吸入又は摂取可能な溶液用の経鼻スプレー又はエアゾール剤として、或いは、例えば、静脈内、筋肉内、皮内又は皮下経路による送達用に該組成物が注射用剤形によって処方される非経口で送達されるように処方することができる。或いは、本製剤は、両方の経路によって送達されるように設計することができる。
【０１２１】
本発明においては、本製剤は注射用剤形であることが好ましい。本製剤は皮内注射されることがより好ましい。
【０１２２】
本発明においては、本製剤は経口的に許容される組成物であることが好ましい。
【０１２３】
薬剤は、胃腸管粘膜を経由して送達される場合には、消化管通過中に安定なままでいることができるようにすべきである。例えば、薬剤はタンパク質分解に抵抗性であり、酸ｐＨにおいて安定であり、胆汁の洗浄効果に抵抗性とすべきである。
【０１２４】
適切な場合には、薬剤組成物は、吸入によって、坐剤又はペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布粉の剤形で局所的に、皮膚貼付薬を使用して、デンプン、ラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形で経口で、或いはカプセル剤又は胚珠（ovule）を単独又は賦形剤との混合物で、或いは香味料若しくは着色剤を含むエリキシル剤、溶液又は懸濁液の剤形で投与することができ、或いは、非経口、例えば、静脈内、筋肉内又は皮下注射することができる。非経口投与の場合には、組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含むことができる無菌水溶液の剤形で最適に使用することができる。頬又は舌下投与の場合には、組成物は、従来の方法で処方することができる錠剤又は舐剤の形で投与することができる。
【０１２５】
薬剤の組合せ
本発明の薬剤は、１個又は複数の薬剤的に活性な他の物質と一緒に投与することができる。例として、本発明は、本発明による免疫調節物質組成物及び／又は薬剤組成物並びに１個若しくは複数のステロイド、鎮痛薬、抗ウイルス性、ＩＬ−２などのインターロイキン又は薬剤的に活性な他の物質との同時又は連続治療を網羅する。
【０１２６】
これらの投薬計画は、それらの物質を連続的に、同時又は一緒に投与することを含むことを理解されたい。
【０１２７】
免疫増強剤
本明細書では「免疫増強剤」という用語は、対象に投与されたときにその対象の健康を利する単離又は培養された１個又は複数の細菌を意味する。この利点は、対象の細胞免疫応答を改変することによって得られることが好ましい。
【０１２８】
本発明によれば、免疫増強剤は、例えば、自己免疫疾患又は自己免疫異常の治療又は予防に使用することができる。
【０１２９】
免疫増強剤は、特別に設計された食物又は動物の餌に入れて消費することによって投与することができる。
【０１３０】
免疫増強剤は、直接注射などの他の経路によって投与することもできる。
【０１３１】
細菌は、生きた生成物を維持する困難を回避するために死滅されることが好ましい。
【０１３２】
細胞免疫応答を調節する細菌の特定
別の態様においては、本発明は、細胞免疫応答を調節する（例えば、改変する）ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌の１個又は複数の全細胞を同定する方法であって、（ａ）第１の試験動物を免疫賦活薬と接触させるステップと、（ｂ）第２の試験動物を、細菌と混合された免疫賦活薬と接触させるステップと、（ｃ）前記試験動物の各々における細胞免疫応答を測定するステップと、（ｄ）前記試験動物の各々における細胞免疫応答を比較するステップとを含み、細菌と混合された免疫賦活薬からの細胞免疫応答が免疫賦活薬単独よりも小さいことによって細菌による細胞免疫応答の改変が示される方法に関する。
【０１３３】
別の態様においては、本発明は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属から選択される細菌種のＴｈ１／Ｔｈ２応答を測定する方法であって、ツベルクリン皮膚試験の利用を含む方法に関する。マウスにおいては、ツベルクリン皮膚試験は、好ましくは足跡に対して実施される。支配的なＴｈ１反応においては、陽性の足跡免疫応答は２４時間で最大であり、４８時間で減少する。しかし、Ｔｈ２反応性が増大するにつれ、４８時間の陽性足跡免疫応答が増大し、２４時間における足跡免疫応答を超えることさえある。
【０１３４】
ＢＣＧワクチン接種の効果は、このツベルクリン皮膚試験を用いて詳細に記録されている。したがって、この試験アッセイは、本発明による免疫調節物質組成物を導入することによってＢＣＧ細胞免疫応答が調節されるかどうかを評価するために使用することができる。
【０１３５】
本明細書では「試験動物」という用語は、免疫賦活薬に対して細胞免疫応答を誘発するあらゆる動物を指す。試験動物は哺乳動物であることが好ましい。試験動物はラット、ハムスター、ウサギ、モルモット又はマウスであることがより好ましい。試験動物はマウスであることがより好ましい。
【０１３６】
細菌はＴヘルパー細胞応答を改変することが好ましい。適切には、細菌は、Ｔｈ１及びＴｈ２応答を減少させることによってＴヘルパー細胞応答を改変することができる。適切には、細菌は、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を減少させることによってＴヘルパー細胞応答を改変することができる。適切には、細菌は、Ｔｈ２応答に影響を及ぼすことなくＴｈ１応答を増大させることによってＴヘルパー細胞応答を改変することができる。
【０１３７】
免疫賦活薬は、既知のＴｈ１及びＴｈ２応答を有することが好ましい。例えば、免疫賦活薬ＢＣＧを用いて、それがＴｈ１応答の指標であるときには、反応は通常は２４時間で最も大きく、４８時間における反応は通常はそれよりも小さく、Ｔｈ２の寄与を含む。ＢＣＧは主としてＴｈ１応答を刺激することが知られている。かかる免疫賦活薬を使用することによって、試験細菌のＴｈ１／Ｔｈ２応答を測定することができ、したがって、特定の疾患及び／又は障害を治療及び／又は予防する所望のＴｈ１／Ｔｈ２応答を有する１又は２以上の細菌を特定することができる。
【０１３８】
細胞免疫応答はツベルクリン皮膚試験によって測定されることが好ましい。ＢＣＧなどの免疫賦活薬によるワクチン接種によって、その後試験したときにツベルクリン（Tubercle bacilliの可溶性製剤）を用いた皮膚試験に対して応答が誘導される。局所反応は、ツベルクリン注射後さまざまな間隔、例えば、２４時間、４８時間及び７２時間目に測定する。手短に述べると、ツベルクリンに対して陽性の免疫応答を誘導する免疫賦活薬（例えば、ＢＣＧ）が使用される。試験動物においては、ツベルクリン皮膚試験は、好ましくは足跡に対して実施される。支配的なＴｈ１反応においては、陽性の足跡免疫応答は通常は２４時間で最大であり、４８時間で減少する。しかし、Ｔｈ２反応性が増大するにつれ、４８時間の陽性足跡免疫応答が増大し、２４時間における足跡免疫応答を超えることさえある。したがって、このアッセイは、本発明による免疫調節物質組成物を導入することによって細胞免疫応答が調節されるかどうかを評価するために使用することができる。
【０１３９】
免疫賦活薬はＢＣＧであることが好ましい。
【０１４０】
本発明を実施例によって以下にさらに詳細に説明する。これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのを助けるのに役立つものであって、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【０１４１】
実施例
方法
ツベルクリン皮膚試験
ツベルクリン皮膚試験は、細胞免疫応答に対する免疫調節物質組成物、すなわち本発明による死滅された細菌細胞全体を含む細菌組成物／懸濁液の効果を評価する適切なモデルアッセイである。
【０１４２】
ＢＣＧワクチン接種は、ツベルクリンに対して陽性の免疫応答を誘導する。マウスにおいては、ツベルクリン皮膚試験は、好ましくは足跡に対して実施される。支配的なＴｈ１反応においては、陽性の足跡免疫応答は２４時間で最大であり、４８時間で減少する。しかし、Ｔｈ２反応性が増大するにつれ、４８時間の陽性足跡免疫応答が増大し、２４時間における足跡免疫応答を超えることさえある。
【０１４３】
ＢＣＧワクチン接種の効果は、このツベルクリン皮膚試験を用いて詳細に記録されている。したがって、この試験アッセイは、本発明による免疫調節物質組成物を導入することによってＢＣＧ細胞免疫応答が調節されるかどうかを評価するために使用することができる。
【０１４４】
細菌懸濁液の調製
ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属に属する細菌種は、発酵槽中でソートン培地など抗原を含まない培地中で２から２８日間増殖させることができる。或いは、目的とする細菌種を固体勾配上で増殖させることができる。代替方法は、当業者に容易に利用可能なはずである。
【０１４５】
生成した細菌集団を収集し、直接又は洗浄後に使用して緩衝剤懸濁液を調製することができる。細菌細胞懸濁液は、１００ナノグラムから１０ミリグラムかん菌／回を含むように調製される。細菌細胞は水又は食塩水中に再懸濁される。食塩水は、ホウ酸塩によってｐＨ８．０に緩衝されることが好ましい。かん菌は、適切には、オートクレーブ中で１２１℃で１５分間加熱することによって不活性化される（死滅される）ことが好ましい。生成した細菌懸濁液は全細胞を含む。
【実施例１】
【０１４６】
ロドコッカス・ルベル（Ｒ．ｒ．）による細胞免疫応答の調節
群１：若年成体メス非近交系マウスは、対照群としてワクチン接種を行わなかった。
群２：若年成体メス非近交系マウスは、０日目に首筋にＢＣＧ（かん菌１０５個）（Evans）を接種された。
群３：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したマイコバクテリアワクチン（Ｍ．ｖ．）（かん菌１０７個）が添加されたＢＧＣ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
【０１４７】
群１〜３中の全マウスは、１０日目及び３０日目にツベルクリン免疫応答について足跡試験された。次いで、各マウスは、加熱滅菌したマイコバクテリアワクチン（かん菌１０７個）を４０日目に注射された。５０日目に足跡に対するツベルクリン検査が繰り返された。
【０１４８】
群４：若年成体メス非近交系マウスは、さらなる対照群としてワクチン接種を行わなかった。
群５：若年成体メス非近交系マウスは、０日目に首筋にＢＣＧ（Evans）（かん菌１０５個）を接種した。
群６：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したマイコバクテリアワクチン（かん菌１０７個）が添加されたＢＧＣ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
群７：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したロドコッカス・ルベル（かん菌１０７個）が添加されたＢＧＣ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
群８：若年成体メス非近交系マウスは、加熱滅菌したロドコッカス・ルベル（かん菌１０６個）が添加されたＢＣＧ（かん菌１０５個）を０日目に首筋に接種した。
【０１４９】
群４〜７の全マウスは、３０日目にツベルクリン免疫応答について足跡試験した。次いで、４０日目に、各群は、各群の半数がそれ以上治療せず、各群の残り半数がロドコッカス・ルベル（かん菌１０７個）の注射を受けるように分割した。５０日目に足跡に対するツベルクリン検査を繰り返した。
実施例１の結果を表１に示す。
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
対照群１において、マイコバクテリアワクチン治療は、２４時間後（ｐ＜０．０１）と４８時間後（ｐ＜０．００１）の両方でツベルクリンに対する免疫応答の統計的に有意な増加をもたらした。しかし、対照群４においては、ロドコッカス・ルベルを用いた治療は、２４時間後でも４８時間後でもツベルクリンに対する免疫応答に有意な変化をもたらさなかった。両方の時点において、Ｍ．ｖ．の結果はＲ．ｒ．の結果よりもかなり大きかった（ｐ＜０．０２）。
【０１５２】
ＢＣＧ群（群２及び群５）においては、２４時間と４８時間の間のツベルクリンに対する応答の減少は、ロドコッカス・ルベルによる治療を受けたマウス（平均減少は２８．２±１５．７であった）がマイコバクテリアワクチンによる治療を受けたマウス（平均減少は１４．９±９．６であった）よりも大きかった（ｐ＝０．０６）。
【０１５３】
ＢＣＧ＋マイコバクテリアワクチン群（群３及び群６）においては、２４時間と４８時間の間のツベルクリンに対する応答の減少は、ロドコッカス・ルベルによる治療を受けた群（平均減少は４１．０±４１．０であった）がマイコバクテリアワクチンによる治療を受けたマウス（平均減少は１２．７±７．０であった）よりもやはり大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０１５４】
これらのデータによれば、ロドコッカス・ルベルによる治療後にＴｈ２応答が下方制御される。これはマイコバクテリアワクチンによる治療後には見られない。
【０１５５】
ＢＣＧ＋Ｒ．ｒ．群（群７及び８）においては、Ｒ．ｒ．１０７（群７）又は１０６（群８）をＢＣＧに添加する効果はきわめて類似しており、Ｒ．ｒ．の２回目の注射後に２４時間と４８時間の間で応答が実質的に減少した（１５．５±１０．０）。
【実施例２】
【０１５６】
ノカルジア・アステロイド（Ｎ．ａ．）、ゴルドニア・ブロンチアリス（Ｇ．ｂ．）又はツカムレラ・インコネンシス（Ｔ．ｐ．）を用いた細胞免疫応答の調節
この実験は、６匹のマウスからなる群にＢＣＧ単独又は１０７Ｍ．ｖ．、Ｒ．ｒ．、ノカルジア・アステロイド（Ｎ．ａ．）、ゴルドニア・ブロンチアリス（Ｇ．ｂ．）若しくはツカムレラ・インコネンシス（Ｔ．ｐ．）を添加して接種してから２８日後にツベルクリンを用いた足跡試験の効果を比較するように設計した。これらの添加生物の各々に対する免疫応答に対する効果を見るために、動物群は、ツベルクリンを用いて試験した２８日後に、それらのワクチン接種（ワクチン、Rubin、Asterin、Bronchialin及びInchonensin）に含まれる生物でできた皮膚試験試薬を用いてもう一方の足跡で試験した。
【０１５７】
結果を表２に詳細に示す。
【０１５８】
【表２】
【０１５９】
細菌懸濁液のすべてによって、ＢＣＧ単独に続く場合と比較して２４時間と４８時間の両方で測定された２８日ツベルクリン応答が低下した（ｐ＝０．０５；ｐ＝０．２）。
【０１６０】
これは、ツベルクリン及びワクチンを除いて、これらの皮膚試験試薬のいずれかが使用された最初であった。新しい試薬に対する２４時間における応答性の差は、タンパク質評価による場合を除いておそらくは平衡になっていないためであった。しかし、５０日目における２４時間と４８時間の間の応答はすべて低下し、免疫調節性活性が示唆された。
【実施例３】
【０１６１】
成体モルモットにおける皮内注射に対する局所的皮膚反応
３匹の動物の左脇腹をせん毛して、１０８マイコバクテリアワクチンを含む皮内注射０．１ｍｌを動物の頭部末端に、１０９マイコバクテリアワクチンを含む０．１ｍｌを尾部末端側５ｃｍに投与した。
【０１６２】
別の３匹の動物の右脇腹をせん毛して、１０８ロドコッカス・ルベルを含む皮内注射０．１ｍｌを動物の頭部末端に、１０９ロドコッカス・ルベルを含む０．１ｍｌを尾部末端側５ｃｍに投与した。
【０１６３】
硬結部（in duration）の直径（単位ｍｍ）
【０１６４】
【０１６５】
３匹のモルモットにおける１０９ロドコッカス・ルベル（ヒト及び動物用途に対する典型的な用量）の皮内注射（獣医及び医事に一般に使用される注射経路）に対する局所反応は、別の３匹のモルモットにおける同じ用量のマイコバクテリアワクチンに対する反応と類似していた。注射後４８時間において、ロドコッカス・ルベルに対する反応はマイコバクテリアワクチンに対する反応よりも小さかった（ｐ＜０．０５）。７日又は１４日において差はなかった。したがって、ロドコッカス・ルベルはマイコバクテリアワクチンよりも薬剤としてはるかに許容することができる。用量１０８においてどちらの製剤にも局所反応はない。
【実施例４】
【０１６６】
皮下注射後の毒性
１日齢、１４日齢及び２８日齢のときにロドコッカス・ルベルを３回注射した１７匹のラットにおいて、皮下投与に対する毒性の証拠は認められなかった。
【０１６７】
７日目及び１４日目において差はなかった。多数のマウスに本発明のさまざまな細菌種を注射したが、毒性の証拠は何らなかった。
【実施例５】
【０１６８】
Ｔｈ１応答のみを増大させる細菌の決定
アジュバント関節炎は、動物において油とマイコバクテリア抽出物の混合物（マイコバクテリア・ブチリカム（Mycobacterium butyricum）を含む調製物が特に有効である）によって誘発される実験上の重篤な関節炎である。この応答を誘導するには強力なＴｈ１アジュバントが必要と考えられる。この関節炎は、Ｔｈ２を下方制御する機序によって調節される（関節炎はＴｈ１とＴｈ２の両方の機序を必要とする）。
【０１６９】
実験１：ロドコッカス・ルベルがアジュバント関節炎を誘発することができるかどうかを明らかにすること。
６０〜９０日齢のラットからなる３群の右後足足跡に、
１．マイコバクテリア・ブチリカムの油懸濁液１ｍｇ／０．１ｍＬ（ｎ＝８）
２．ロドコッカス・ルベルの油懸濁液１ｍｇ（ｎ＝８）
３．油と食塩水の乳濁液（ｎ＝８）
を投与した。
【０１７０】
第１の群の動物は四肢すべてを含めた関節炎を発症したのに対して、ロドコッカス・ルベルの油懸濁液を投与されたラットは注射された足のみが罹患した。
【０１７１】
実験２：マイコバクテリア・ブチリカムの油懸濁液を投与した後にロドコッカス・ルベルがＴｈ２調節性応答を誘導することができるかどうかを明らかにすること。
これを試験するために、マイコバクテリア・ブチリカムの油乳濁液を投与する４２、２８及び１４日前にロドコッカス・ルベル１０７個の緩衝食塩水を１５匹のラットの異なる部位に皮下注射した。１０匹のラットからなる対照群は、同じスケジュールに従って生理食塩水で前処理され、さらに投与された。
【０１７２】
アジュバント関節炎の巨視的評価は、個々の関節を目視採点することによって実施された（J Rheumatol 1992; 19:513-5）。各肢は０〜４で採点され、最大で１６点／ラットに達する。
【０１７３】
【０１７４】
両方の群は、関節炎病変の発症時間（通常、誘導後９〜１１日）にも関節炎徴候の重症度にも違いがなかった。動物は、疾患の進行のために倫理的理由によって１８日目に屠殺された。
【０１７５】
結論
これらの実験は、ロドコッカス・ルベルがＴｈ１アジュバント活性を有するがＴｈ２「調節性」活性を持たないことを明確に示している。アジュバント関節炎における関節損傷は、Ｔｈ１とＴｈ２の複合作用である。
【実施例６】
【０１７６】
毒性、特に新生仔マウスにおける成長速度及びその後のＢＣＧワクチン接種に対するロドコッカス・コプロフィラス NCIMB 11211、ゴルドニア・ブロンチアリス NC10667及びツカムレラ・インコネンシスNC13040の効果を検討すること
毒性の代替試験は、ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コプロフィラス又はツカムレラ・インコネンシスの皮下注射が誕生日になされ、２１日目に離れた部位に再度なされるものである。これらの動物及び食塩水を注射された対照は、３カ月間規則的な間隔で計量された。
【０１７７】
方法
９匹の後期妊娠Balb Cマウスを使用する。
【０１７８】
滅菌された細菌懸濁液の調製：１０日間のソートン消泡ブロス培養から調製し、遠心分離し、１０ｍｇ／ｍｌのホウ酸塩緩衝食塩水として再懸濁し、加圧滅菌し、４℃で貯蔵した懸濁液。１０ｍｇ／ｍｌ、１０１０／ｍｌをホウ酸塩で１／２希釈して５×１０９とし、次いでホウ酸塩緩衝剤で１／１０希釈して、２０μ中最終濃度１０７として使用する。
【０１７９】
１日目
新生仔マウスを誕生日に個々に取り出し、同腹仔の首筋に１０７滅菌懸濁液を注射し、母親に戻す。
【０１８０】
対照同腹仔の首筋にＭ１５ホウ酸塩緩衝食塩水２０μリットルを注射する。
同腹仔１＝メス２匹＋オス３匹（ロドコッカス・コプロフィラス NCIMB 11211）
同腹仔２＝メス２匹＋オス３匹（ロドコッカス・コプロフィラス NCIMB 11211）
同腹仔３＝メス５匹＋オス３匹（ゴルドニア・ブロンチアリス NC10667）
同腹仔４＝メス３匹＋オス４匹（ゴルドニア・ブロンチアリス NC10667）
同腹仔５＝メス１匹＋オス１匹（ホウ酸塩緩衝食塩水）
同腹仔６＝メス３匹＋オス１匹（ホウ酸塩緩衝食塩水）
同腹仔７＝メス５匹＋オス３匹（ツカムレラ・インコネンシス NC13040）
同腹仔８＝メス５匹＋オス４匹（ツカムレラ・インコネンシス NC13040）
同腹仔９＝メス４匹＋オス５匹（ホウ酸塩緩衝食塩水）
【０１８１】
２１日目
マウスを離乳させ、性別を見分け、同腹仔をオスとメスの２群に分割する。
【０１８２】
計量し、ワクチンを再接種する。消えないペンで尾部にマーキングすることによって個体を標識する。
【０１８３】
３カ月間計量し、毎週尾部に再マーキングする（re tail mark）。
【０１８４】
図１に、離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔メス試験及び対照の結果を示す。
【０１８５】
図２に、離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔オス試験及び対照の結果を示す。
【０１８６】
体重増加は全群で同じであり、わずか２／５７動物しか３カ月間に死亡しなかった。両方ともオスであり、離乳後に他のオスと一緒にした直後に死亡した。したがって、動物の体重増加及び発育は、試験された３種によって影響されなかったと結論することができる。
【実施例７】
【０１８７】
ツベルクリン皮膚試験応答によって測定されたＢＣＧ免疫化に対する効果
免疫調節物質試験モデルは、４週間後に試験したときにＢＣＧワクチン接種によってツベルクリン（Tubercle bacilliの可溶性製剤）皮膚試験に対する応答が誘導されるという原理に基づいて考案されている。局所反応はツベルクリン注射後２４時間、４８時間及び７２時間後に測定する。マウスにおいては、局所反応は通常２４時間で最大であり、それがツベルクリン中の抗原に対するＴｈ１応答の指標である。４８時間における局所反応は通常それよりも小さく、Ｔｈ２の寄与を含む。７２時間における局所反応は４８時間におけるよりもわずかに小さいことが多く、Ｔｈ２応答である。このＢＣＧ後ツベルクリン反応は、前の初回抗原刺激によって調節することができ、その結果、反応のＴｈ１及びＴｈ２成分は初回刺激試薬の性質を反映する。
【０１８８】
方法
３カ月齢のときに実施例６に従って初回抗原刺激されたマウスは、各試験の半分及び対照群が１０６ＢＣＧ１００μｌを首筋に注射した。
【０１８９】
４カ月における試薬T1475 １ｍｇ／ｍｌによるツベルクリン検査。１００μリットルを１．９ｍｌで希釈して、最終濃度を５０μｇ／ｍｌにする。４℃で貯蔵する。用量は、後足足跡に投与された２．５μｇの５０μリットル溶液である。２４、４８及び７２時間においてマイクロメータを用いて測定されたツベルクリン応答膨潤。
【０１９０】
結果
図３は、ゴルドニア・ブロンチアリスが２４時間ＴＨ１効果を増大させることを示している。
【０１９１】
図４は、ツカムレラ・インコネンシスが２４時間ＴＨ１応答を増大させ、７２時間ＴＨ２応答を抑制することを示している。
【０１９２】
図５は、ロドコッカス・コプロフィラスがＴＨ１応答とＴＨ２応答の両方を抑制することを示している。
【０１９３】
結論
上記３種は、ＢＣＧ投与後のツベルクリン検査に対して各々異なる効果をもたらした。
【０１９４】
ゴルドニア・ブロンチアリスは、Ｔｈ２応答を変えずにＴｈ１応答を増大させた。ロドコッカス・ルベルもこの機能を有する。
【０１９５】
ツカムレラ・インコネンシスは、Ｔｈ１応答を増大させ、Ｔｈ２応答を下方制御した。
【０１９６】
ロドコッカス・コプロフィラスは、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答の両方を下方制御した。
【０１９７】
これらの試薬のいずれかをアジュバントとして投与すると、その後の抗原に対する免疫応答を調節することができる。
【０１９８】
これらの結果は、本発明の代表的な３種のいずれかによる２回の初回抗原刺激免疫の影響が２回目の免疫後少なくとも９週間持続することも明確に示している。
【実施例８】
【０１９９】
免疫調節物質試験モデル
免疫調節物質試験モデルは、４週後に試験されたときにＢＣＧワクチン接種によってツベルクリン（Tubercle bacilliの可溶性製剤）皮膚試験に対する応答が誘導されるという原理に基づいて考案されている。局所反応はツベルクリン注射後２４時間、４８時間及び７２時間後に測定する。局所反応は通常２４時間で最大であり、それがツベルクリン中の抗原に対するＴｈ１応答の指標である。４８時間における局所反応は通常それよりも小さく、Ｔｈ２の寄与を含む。７２時間における局所反応は４８時間におけるよりもわずかに小さいことが多く、Ｔｈ２応答である。このＢＣＧ後ツベルクリン反応は、前の初回抗原刺激によって調節することができ、その結果、反応のＴｈ１及びＴｈ２成分は初回刺激試薬の性質を反映する。
【０２００】
公知の免疫賦活薬であるＢＣＧを若い３週齢マウスの首筋に注射し、マウス足跡へのツベルクリン皮下注射によってツベルクリン応答を１カ月後に測定する。次いで、生成する膨潤、すなわち「ツベルクリン応答」を２４、４８及び７２時間で測定する。２４時間における膨潤は初期又はＴｈ１媒介応答とみなされ、４８及び７２時間における膨潤は後期又はＴｈ２媒介応答とみなされる。健康なマウスにおいてＢＣＧはＴｈ１応答を主として刺激する。
【０２０１】
方法
（ａ）ＢＣＧ皮内ワクチン１０回分のバイアル（Evans Medical）
シリンジ及び針を用いて供給滅菌水１ｍｌで戻して、５分間溶解する。１×１０７／ｍｌとすべきである。
【０２０２】
シリンジ及び針を用いてワクチンのすべてを除去し、プラスチックビジューボトル（bijou bottle）に移す。
【０２０３】
０．１５ｍｌをＭ１５ホウ酸塩緩衝食塩水１．３５ｍ１で１／１０希釈して１０５ １００μリットルとする。
【０２０４】
用量は１０５ １００μｌであり、首筋に投与される。
【０２０５】
（ｂ）ツベルクリン
T1475 １ｍｇ／ｍｌ。
【０２０６】
１００μリットルを１．９ｍｌで希釈して、最終濃度を５０μｇ／ｍｌにする。
【０２０７】
４℃で貯蔵する。
【０２０８】
用量は２．５μｇ ５０μｌであり、後足足跡に皮内投与される。
【０２０９】
ツベルクリン応答は、２４、４８及び７２時間においてマイクロメータを用いて測定される。
【０２１０】
図６に、非ワクチン接種対照と比較された１カ月後のＢＣＧに対するツベルクリン応答を示す。
【０２１１】
（ｃ）試験懸濁液の調製
培養物は、遠心分離によって収集したソートンブロス中で増殖させ、Ｍ１５ホウ酸塩緩衝食塩水に濃度１０ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、４℃で貯蔵する。
【０２１２】
１０ｍｇ／ｍｌ＝１００μｌ中１０９
【０２１３】
１／１０希釈＝１００μｌ中１０８
【０２１４】
１５０μｌ １０８をＭ１５ホウ酸塩１．２ｍｌに添加し、ＢＣＧ１５０μｌを添加する。
【０２１５】
用量は、今回、１０５ＢＣＧ＋１０７試験生物１００μｌであり、首筋に注射する。
【０２１６】
結果
図７は、３種類の細菌によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４及び４８時間目に測定する。代表的な種は、（Ｎａ）ノカルジア・アステロイド、（Ｇｂ）ゴルドニア・ブロンチアリス及び（Ｔｐ）ツカムレラ・インコネンシスである。
【０２１７】
図８は、２種類の細菌によるＢＣＧ／ＢＣＧ＋の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。代表的な種は（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス及び（Ｄｍ）ダイエツィア・マリスである。
【０２１８】
図９は、ロドコッカス属内の選択された種によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス、（Ｒｒｕ）ロドコッカス・ルベル、（Ｒｒｈｏｄ）ロドコッカス・ロドニイ、（Ｒｃｏｐ）ロドコッカス・コプロフィラス、（Ｒｏｐａ）ロドコッカス・オパカス、（Ｒｅｒｙｔｈ）ロドコッカス・エリトポレス。
【０２１９】
図１０は、ロドコッカス・ルベルの１０８から１０４の対数希釈で改変されたＢＣＧを用いたロドコッカス・ルベルの最適用量をＢＣＧ単独と比較して示すグラフである。
【０２２０】
結論
このスクリーニング試験は、試験懸濁液をＢＣＧと混合し、ＢＣＧ単独と比較することによって、２８日後にツベルクリン検査がＢＣＧに対する応答の測定値として調節又は改変されたことを示している。この簡単なモデルにおいては、免疫調節は、２４時間と４８時間目両方における応答サイズの低下として示される。これは、より長期の実験においてさらに検討することができる。試験懸濁液を用いた初回抗原刺激は、ＢＣＧ投与とそれに続くツベルクリン検査の数週間前に実施する。
【実施例９】
【０２２１】
細菌の全細胞の懸濁液が細胞抽出物よりも免疫調節に有効であることを示すために、比較調製物が作り、ＢＣＧ投与／ツベルクリン皮膚試験系において試験する
あらかじめ計量された遠心管中の緩衝食塩水（ｐＨ８．０）にツカムレラ・インコネンシス１００ｍｇを生物１０ｍｇ湿重量／ｍｌの濃度で懸濁する。全量１０ｍｌを超音波処理器で処理して、生物の大多数（７０〜８０％）を破壊した。
【０２２２】
超音波処理物を管中で１５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、上清を慎重に除去し、試験抽出物として孔径０．２μｍのメンブランフィルターを通過させる。堆積物を含む管を再度計量して、破壊されていない全生物と細胞壁破片などの割合を求める。これは６４ｍｇである。次いで、ツカムレラ・インコネンシス０．０１ｍｇに等しい抽出体積を推定し、これを相当物の全かん菌（１０７個に近い）０．０１ｍｇと比較する。
【０２２３】
１０匹の動物からなる群に抽出物又は（０．０１ｍｇ／回に等しい）かん菌全細胞懸濁液又は緩衝食塩水プラセボを離乳時及び７日後に首筋に注射する。２週間後に動物にＢＣＧを投与する。２８日後にツベルクリン検査を実施し、２４、４８及び７２時間で読取る。
【０２２４】
結果：
初回抗原刺激なしで、或いはホウ酸塩緩衝剤、ツカムレラ・インコネンシス全細胞又は可溶性抗原（ろ過された超音波処理物）の初回抗原刺激後に投与されたＢＣＧワクチン接種後のマウスにおけるツベルクリン応答。
【０２２５】
初回抗原刺激されていない動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
Ｎｏ． ２４時間 ４８時間 ７２時間
６ ９±４．２ ７．７±３．３９ ３．６７±３．５
【０２２６】
ホウ酸塩緩衝剤単体で初回刺激された動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
６ ９±５．７ ６．３±７．１ ３．１７±２．９３
【０２２７】
ホウ酸塩緩衝剤による初回刺激は、ＢＣＧ後ツベルクリン検査に対して効果がない。
【０２２８】
加熱滅菌ツカムレラ・インコネンシス全体で初回刺激された動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
６ ７．３±１．０３ ６．１７±３．８７ １．５±２．０７
【０２２９】
ツカムレラ・インコネンシス全体で初回抗原刺激するとツベルクリン応答が特に７２時間において減少する（Ｔｈ２応答性）。
【０２３０】
ツカムレラ・インコネンシス可溶性調製物（ろ過された超音波処理物）で初回刺激された動物に投与されたＢＣＧに続くツベルクリン応答：
６ ６．８±６．８ １１．０±８．０ ４．６±６．８
【０２３１】
ツカムレラ・インコネンシスろ過超音波処理物で初回刺激すると４８時間及び７２時間における応答が増大する（Ｔｈ２応答性）。これは、おそらく、ＢＣＧとツカムレラ・インコネンシスで共有された抗原に対する炎症性抗体産生が増加したためである。これらの結果は、超音波処理物による初回刺激が、死滅生物全体による初回刺激後の応答とは異なる応答をもたらすことを示している。
【０２３２】
予備調査によれば、細菌の全細胞は細胞抽出物よりも免疫調節に有効であることが示唆される。
【実施例１０】
【０２３３】
血管疾患モデル−ラット血管形成術試験
このモデルは、バルーン血管形成術後に認められたラットの総頚動脈内膜層の誘導された肥厚減少に基づく。
【０２３４】
実験群は各々１５匹のオスのラットからなる。
【０２３５】
群１はｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった（対照）。
【０２３６】
群２は、加熱滅菌された環境雑菌ゴルドニア・ブロンチアリスを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった。
【０２３７】
群３は、加熱滅菌された環境雑菌ロドコッカス・コプロフィラスを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった。
【０２３８】
群４は、加熱滅菌された環境雑菌ツカムレラ・インコネンシスを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった。
【０２３９】
群５は、加熱滅菌された環境雑菌マイコバクテリアワクチンを含むｐＨ８のホウ酸塩緩衝食塩水０．１ｍｌを皮下注射されたラットであった（正の対照）。
【０２４０】
実験の手順予定表：
すべての動物は、０日目に実験を開始する前に７〜１０日順応された。すべての動物を０日目に計量し、その後は健康の指標として週間隔で計量した。
【０２４１】
全群のラットは、標準ラット固形飼料を給餌され、水を自由に摂取することができた。
【０２４２】
０日目にラットに上記対照又は活性薬剤を皮下注射した（生物の用量は０．１ｍｌ中５０マイクログラム、すなわち５００マイクログラム／ｍｌであった）。
【０２４３】
２１日目にラットに第２の用量の対照／活性薬剤を皮下注射した（生物の用量は０．１ｍｌ中１００マイクログラム、すなわち１ｍｇ／ｍｌであった）。
【０２４４】
４９日目に血液０．７５ｍＬを各ラットの尾静脈から採取し、サイトカインのＲＮＡを後で測定できるように適切な方法で貯蔵した。
【０２４５】
５６日目に全ラットに麻酔下で左総頚動脈バルーンによる外傷を与えた。
【０２４６】
７０日目に全ラットを計量し、一級分類表（Schedule 1）法によって安楽死させ、頚動脈、ひ臓、左腎臓、左肺の一部、肝臓中葉の一部、心臓及び胸部大動脈を組織学的及び免疫学的分析のために採取した。血液もさらなる分析のために採取された。
【０２４７】
各左頚動脈の横断面を切断し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。筋肉層及び内膜層は個別に顕微鏡測定され、血管の断面域として表された。さらなる断面は、存在する免疫細胞型及び放出されているサイトカインを特定する免疫組織化学用に使用される。
【０２４８】
４９日目及び７０日目に採取された血液試料は、サイトカイン、ケモカイン及び血管疾患に関連する他の物質のＲＮＡをその後分析するために適切な方法で貯蔵された。
【０２４９】
結果
ラット体重の結果を下表及び図１１に示す。
【０２５０】
【０２５１】
ゴルドニア・ブロンチアリス（２）の注射で初回刺激された動物は、２つの時点においてプラセボ群（１）よりもかなりの重量増加を示す。
【０２５２】
内膜及び中膜厚さの測定結果を下表に示す。内膜／中膜比の結果を図１２に示す。
【０２５３】
＊検査された断面数
【０２５４】
【０２５５】
活性薬剤のレシピエントとプラセボのレシピエントの間で大きな有意差が見られる。
【０２５６】
内膜の結果が低いのは、血管形成術後の筋内膜増殖の減少を示している。これは全４種類の細菌調製物で起こり、ゴルドニア・ブロンチアリス、ツカムレラ・インコネンシス及びマイコバクテリアワクチンで最も顕著である。この効果は、血管形成術の成功に大きく寄与することができる。
【０２５７】
プラセボ群において失われた中膜厚さは、積極的治療群において保持され、ロドコッカス・コプロフィラス及びＴ・インチネンシス（T.inchinensis）の後で最も顕著である。減少した内膜厚さと保持された中膜厚さとの組合せは、ツカムレラ・インコネンシスによる治療後に最もよく見られ、慢性移植片拒絶の潜在的抑制における重要な進歩を証明することができる。
【実施例１１】
【０２５８】
トリパノソーマ症感染ラットにおける心筋炎
動物の調製
ｉ）１日齢オス「１」ラットの首筋に１０７ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・コプロフィラス、ツカムレラ・インコネンシス又はマイコバクテリアワクチン０．１ｍｌを皮下注射した。（これは下表に示すように２回の実験で実施された）。
ii）１４日後、オス「１」ラットの左側に１０７の同じ生物０．１ｍｌの第２の皮下注射をした。
iii）動物に、クルーズ・トリパノソーマ（T.cruzi）のツラフエン（Tulahuen）系統の１０６錐鞭毛体を用いて生きたクルーズ・トリパノソーマを２１日目に皮下経路で投与した。感染血液錐鞭毛体は、ＣＢｉマウスにおける連続継代によって維持した。
iv）クルーズ・トリパノソーマの血流型は、ｐｉ（post-infection）７及び１４日においてヘパリン処置尾部静脈血５μｌの直接顕微鏡観察によって標準条件下で評価した。データは寄生生物数／５０視野として表した。
ｖ）７日後に、１０７個の同じ生物０．１ｍｌの追加の皮下注射を右側に投与した。
【０２５９】
対照動物のみにクルーズ・トリパノソーマを投与した。
【０２６０】
別の動物群は、比較のために投与しなかった。
【０２６１】
【０２６２】
クルーズ・トリパノソーマ対照と比較してマイコバクテリアワクチンはＰ＜０．０１及びロドコッカス・ルベルはＰ＝０．００１
【０２６３】
動物の調製
１日齢オス「１」ラットの首筋に１０７ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コプロフィラス又はツカムレラ・インコネンシス０．１ｍｌを皮下注射した。（これは下表に示すように２回の実験で実施された）
【０２６４】
１４及び２８日後、オス「１」ラットの左側に１０７の同じ生物０．１ｍｌの第２及び第３の皮下注射をした。
【０２６５】
動物に、クルーズ・トリパノソーマのツラフエン系統の１０６錐鞭毛体を用いて生きたクルーズ・トリパノソーマを２１日目に皮下経路で投与した。感染血液錐鞭毛体は、Ｃｂｉマウスにおける連続継代によって維持された。
【０２６６】
対照動物のみにクルーズ・トリパノソーマを投与した。
【０２６７】
別の動物群は、比較のために放置した。
【０２６８】
【０２６９】
クルーズ・トリパノソーマ対照と比較してロドコッカス・コプロフィラスの７日目でＰ＝０．０３２及び１４日目でＰ＝０．０５（Kruskall-Wallis分散分析）。
【０２７０】
クルーズ・トリパノソーマ感染から２８日後のクルーズ・トリパノソーマに特異的な血清ＩｇＧ抗体
【０２７１】
クルーズ・トリパノソーマ投与から７、１４及び２１日後の心筋中のＣＤ４＋ｖｅ細胞
【０２７２】
さらに別の対象の心筋を、慢性心筋炎の評価のためにクルーズ・トリパノソーマ感染から３カ月後に分析する。予備調査によれば、マイコバクテリアワクチンは慢性心筋炎を軽減するのに有益な効果を有することが判明し、上記データから、試験生物の一部は慢性心筋炎の予防に有益な効果を有すると予想される。
【実施例１２】
【０２７３】
冠動脈血管形成術後のＭＩＨを低減するためのツカムレラ・インコネンシスの使用
アテローム硬化型血管疾患は、世界中で最も一般的な死因及び能力障害原因である。アテローム性動脈硬化症の発症は複雑なプロセスであり、脂質の沈着が動脈の狭窄及び内皮機能不全をもたらす。血管損傷部位における炎症反応がアテローム性動脈硬化症の素因において鍵となる役割を果たす証拠が増加しつつある（Schett G et al.、J Clin. Invest. 1995, 96: 2569-2477）。アテローム硬化型プラークの破裂は、心筋梗塞、発作、末梢動脈閉塞などの急性虚血性症候群をもたらす突然の動脈閉塞の最も一般的な原因である。急性虚血性症状の出現に続いて、ある種のサイトカイン及びＣＲＰ（C-reactive protein）を含めていくつかの炎症性マーカーが増加する（George et al.、Circ. Res. 2000; 86: 1203-1210; Hansson et al.、Arteriosclerosis 1989; 9: 567-578; Yokota et al.、J Intern Med. 1995; 238; 479-489; Ikeda J. Mol. Cell. Cardiol. 1992 Jun 24 (6): 579-584; Hojo et al.、Heart 2000 Jul; 84 (1) 83-7。
【０２７４】
ストレスタンパク質の発現は、内膜への完全な応力損傷部位においてさえ局所的免疫応答をもたらし、そのときの個体において優勢である免疫応答型に従って中膜及び内膜中にサイトカインが放出される（Chan et al.、Eur J. Vasc. Enodvasc. Surg. 1999 Nov. 18(5): 381-5; Mukherjee et al.、Thromb. Haemost 1996; 75: 258-260; Wright Heart Vessels 2000; 15: 18-22; Sanchez-Margalet et al.、Clin Chem Lab. Med 2002 Aug; 40(8); 769-774）。一部のサイトカインは、内膜の肥厚及び中膜の平滑筋細胞における表現型の変化をもたらし、同時にＭＩＨを生じる。他のサイトカインの局所的放出によって、血流の閉塞を最小限に抑えながら内膜が修復される（Hansson et al.、Proc. Natl Acac. Sci. USA 1991; 88: 10530-10534; D'Elios et al.、Transplant Proc 1998; 30: 2373-7; Feldman et al.、Circulation 2000 Feb 29; 101(8): 908-916; Tashiro Coron Artery Dis 2001 Mar.; 12(2): 107-13; Hojo et al.、Atherosclerosis 2001 May; 156(1): 165-170; Yang et al.、Circulation 2000 Mar 7; 101(9); 1019-26; Anguera et al.、Am. Heart J. 2002 Nov. 144(5): 811-817; Takase et al.、Can J. Cardiol. 2003 July; 19(8): 902-906; Tutar et al.、Circulation 2003 Sep 30; 108(13):1581-1584 E-pub 2003 Sep 15; Del Prete et al.、Blood 1995 Jul 1; 86(1): 250-257）。本発明者らの提案の目的は、後者の機序が確実に実施されるようにすることである。
【０２７５】
ＭＩＨと炎症の関連：
【０２７６】
ＭＩＨの発生及び維持をもたらす免疫機構は、制限された血流、脂肪線条の沈着及びアテローム性動脈硬化症のプラークに付随する応力の増加をもたらす。損傷が最小限に抑えられた内膜細胞上で発現されるストレスタンパク質に対するＩｇＧ２抗体レベルの上昇は、補体カスケードの局所的誘導及び損傷細胞の破壊をもたらす（Schett et al.（前記）；Chan et al.（前記）；Crisp et al.、J. Heart Lung Transplant 1994; 81-91; Johnson et al.、Atherosclerosis 1990; 84: 111-119）。この部位に、局所的サイトカイン産生を惹起するＴリンパ球が引きつけられる（Hansson 1991（前記）；D'Elios（前記）；Mickelson et al.、J Am Coll Cardiol. 1996 Aug; 28(2): 345-53）。脂肪線条は損傷内膜上に堆積し、その下で修復又はアテローム硬化型の進行を決定する有益又は有害なサイトカイン活性が発生する。局所的炎症の非特異的な結果として、サイトカインＩＬ（interleukin）−１ベータ及びＴＮＦ−α（tumour necrosis factor alpha）はＩＬ−６を誘導し、ＩＬ−６は肝細胞による急性期タンパク質（例えば、フィブリノーゲン、ＣＲＰ）の生合成を増強する（Ikeda et al.（前記）；Hojo et al.（前記）；Spaziani et al.、Ital Heart J. 2002 Oct: 3(10): 593-597）。
【０２７７】
ＭＩＨは、ＰＣＩ（percutaneous coronary intervention）後の血管損傷に対する過度の治癒応答とみなすことができる。
・基底膜の損失
・中膜から内膜へのＶＳＭＣの移行
・ＶＳＭＣ増殖及びより分泌性である線維芽細胞型への表現型の変化
・細胞外基質の産生増加
を含めて、最終的に血管狭窄又は閉塞をもたらす一連の事象が起こりうる。
【０２７８】
臨床的な再狭窄は、ＰＣＩバルーン血管形成術後に起こり、臨床実務においてかかる症例の約３０％に影響を及ぼす。これはかかる手順の失敗の主原因であり、生じた狭窄及び閉塞血管／移植片の治療は問題が多い。ＭＩＨをもたらす根本的細胞機序は十分に理解されていないが、サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５を産生するＴｈ２（helper T cells of type 2）の優勢に関連すると考えられ、その存在下でＴＮＦ−αは組織損傷的になる（Hernandez-Pando et al.、Immunology 1994; 82: 591-595）。このプロセスを有効に防止することができる治療はこれまで開発されていない。しかし、より全身的な現象にその後なり得る局所的に媒介された炎症反応の役割は、ＰＣＩの失敗の鍵となる部分として認められている。現行プロジェクトの臨床的な妥当性は、英国（約４０，０００）及び世界中で毎年実施されるきわめて多数の経皮冠動脈インターベンションに関係する。新世代の薬物溶出ステントは、「むき出しの金属」ステントよりも再狭窄率がきわめて低いが、再狭窄を完全に防止できそうになく高価である。このプロトコルに提案される免疫療法などＭＩＨを防止する安全で比較的安価な補助的治療は臨床的に重大な影響を有する。
【０２７９】
ある細菌種は、死滅したときに、それらに提示される熱ショックタンパク質などの抗原に対する免疫応答を調節する能力を有する。かかる死滅細菌の懸濁液は使用するのにきわめて安全であり、さまざまな種を用いて所望の免疫調節を得ることができる。本発明者らの研究室における最近の研究によれば、アテローム性動脈硬化症患者はＴｈ１免疫が同年齢の対照よりも減少し得ることが判明した。したがって、血管傷害に対する炎症反応は、適切な免疫療法によって応答パターンを変えることによって改変することができる。
【０２８０】
結核、喘息、関節リウマチ、いくつかの自己免疫症状など他のさまざまなヒト疾患においてＴｈ１及びＴｈ２サイトカインが果たす役割は非常に注目されている（D'Elios M, Del PG. Transplant Proc 1998; 30: 2373-7；Shirakawa T et al.、Science 1996; 275: 77-79及びHernandez-Pando R, Rook GAW. Immunology 1994; 82: 591-595）。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２（interleukin-2）及びＴＮＦを産生する。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を産生する（Lin E et al.、Surgery 2000; 127: 117-126）。どちらの型のＴ細胞も細胞性炎症を起こすことができ、抗体を形成することができるが、異なる免疫グロブリンサブクラスが含まれ、Ｔｈ２応答に付随する抗体量は通常はるかに多い。Ｔｈ１応答の調節が失敗すると、多発性硬化症などのＴｈ１によって媒介される自己免疫疾患が起こり得る（Genain CP et al.、Science 1996; 274: 2054-2057）。調節されていないＴｈ２応答は、アレルギー反応、Ｔｈ２媒介自己免疫及びＩＰＦ（idiopathic pulmonary fibrosis）において見られるものなどの慢性線維性炎症をも含めてさまざまな病態をもたらし得る（Wallace W et al.、Clin. Exp. Immunol. 1995; 101: 436-441及びDu Bois RM. New Engl. J Med 1999; 341: 1302-1304）。
【０２８１】
内皮及びＶＳＭＣ抗原に対するかかるＴＨ２応答は、臨床のＭＩＨにおいて原因となる類似した役割を果たす。
【０２８２】
結核、関節リウマチなどの一部の状況においては、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインの同時産生はさらなる組織損傷をもたらし得る。これに対する少なくとも１つの機序は、Ｔｈ２サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−５の存在下でＴｈ１関連ＴＮＦ−γの組織壊死活性が増大することである。かかる複合活性によって演じられる役割はＭＩＨでは不確かであるが、それが起こる結核、ウシのヨーネ病などの放線菌疾患はアテローム性動脈硬化症の素因になることが知られている（Alibasoglu M et al.、Am J Vet Res. 1962 Jan; 23: 49-57）。
【０２８３】
炎症は、現在、アテローム硬化型血管疾患の進行と結び付けられている。プラークの自発的破裂又は血管形成術によって自然に起こる血管損傷は、治癒に有害に作用して筋内膜増殖を起こし得る炎症反応を刺激する。本発明による加熱滅菌細菌に由来する調製物は、症候性冠動脈疾患に対して経皮冠動脈インターベンションを行った患者において血管損傷に対する免疫応答を調節する。ストレスタンパク質、ある範囲のサイトカイン、コルチゾル、ＤＨＥＡ（de-hydro epi-androsterone）及びＣ反応性タンパク質に対する抗体の静脈血レベルによって測定される炎症反応は、この活性調製物を投与された対象において改変されるはずである。５０人の患者のサンプルサイズは、これらのマーカーレベルの約２０％の差を検出するのに十分である。
【０２８４】
免疫調節は炎症反応に影響を及ぼし得る。
【０２８５】
加熱滅菌ツカムレラ・インコネンシスの作用様式は、細菌調製物とヒト組織のそれとで共有される抗原に関係したＴ細胞成熟の制御因子としてであると考えられる。特に、これらは、細菌的な６５及び７０ｋＤａ熱ショックタンパク質とそのアミノ酸鎖長相同性の約６０％を共有することが知られているミトコンドリア起源の６０及び７０ｋＤａストレスタンパク質を含む。ツカムレラ・インコネンシスの調節活性は、Ｔｈ２機序を抑制し、Ｔｈ１機序を増強し、ストレスタンパク質の内膜発現に対する応答を変化させ、サイトカインを局所的に産生することによってＶＳＭＣの表現型を制御する。ストレスタンパク質に対して高い抗体力価を有する優勢なＴｈ２応答によって、２型サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３）が局所的に放出され、補体活性化経路によってこれらのタンパク質を発現する内膜細胞が破壊され、ＶＳＭＣの表現型が迅速な複製の１つに改変される。Ｔｈ１応答では、ストレスタンパク質を発現する内膜細胞は、１型サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−α及びＴＮＦ−α）を放出するＴ細胞によって個々に破壊され、ＶＳＭＣにおけるより低増殖性の表現型変化及び局所的組織修復を誘導すると考えられる。これらの機序のうち第１の機序はさらなる損傷及び再狭窄をもたらすのに対して、第２の機序は再狭窄を刺激せずに内膜の修復をもたらすはずである。
【０２８６】
Ｔｈ細胞活性のかかる変化は血漿コルチゾルの減少と血漿ＤＨＥＡの増加を伴い、炎症を効果的に調節するとＣ反応性タンパク質などが正常値に戻る。
【０２８７】
理論に拘泥するものではないが、血管壁中の１個の自己免疫標的はＨＳＰ（heat shock protein）７０とすることができる。
【０２８８】
免疫療法が血管損傷後の炎症反応を改変する機序は十分には理解されていないが、かん菌と組織とで共有される抗原と一緒に、ツカムレラ・インコネンシスの特定のアジュバント活性の組合せは、免疫媒介組織損傷を抑制するものに対して免疫調節をもたらすと考えられる。血管形成術に起因する内皮傷害は、ＨＳＰに対する宿主免疫応答によって増悪し得る。ストレスタンパク質の密接に類似した形のこれらのＨＳＰは、アテローム性動脈硬化症を含めてさまざまな免疫障害の病態発生及び病態生理に関係している、ストレスを受けた細胞によって産生される（Xu et al.、Arterioscler. Thromb. 1992; 12: 789-799）。これは、血管形成領域中の内皮及び平滑筋細胞上に存在する可能性がある。実際にはｈｓｐ／ストレスタンパク質は、免疫系によって適切な方法でその後に扱うことができる自己抗原として働く。この状況は、ウサギ及びマウスにおいて内皮損傷をもたらす交差反応性マイコバクテリアｈｓｐ（ｈｓｐ６５）で免疫することによって実験的に誘導することができる。この効果は、上述したように、Ｔｈ２リンパ球によって分泌されるＩＬ−４に依存すると考えられ、おそらく抗体によって媒介される。
【０２８９】
動物試験からのこれらの観察とヒトとの関連性は、ｈｓｐ６５カラムから溶出し親和性によって精製されたヒト抗体が、ストレスを受けたヒト内皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで損傷する能力によって示唆される（Schett et al.（前記））。この知見は、この抗体が、ｈｓｐ６５のヒト相同体であるｈｓｐ６０と交差反応し、ストレスを受けた内皮細胞の膜上で発現されたときに抗体に接近することができることを示唆する。ストレスを受けた内皮細胞に結合するかかる抗体は、心臓移植後に冠動脈疾患を生成する要因であることが示唆された（Crisp et al.（前記））。Mukherjee et al.は、ｈｓｐ６５に対する手術前抗体レベルと冠動脈再狭窄との関連性がないことを示したが、かかる抗体レベルが血管形成術後に低下した患者はより再狭窄しにくいことを示した（Mukherjee et al.（前記））。彼らは、ｈｓｐ ６５に対する抗体が属するＩｇＧサブクラスを明らかにせず、記録された低レベルはＩｇＧ４（Ｔｈ１関連抗体）への転換のためであった可能性がある。実際には、血管疾患患者は抗体が増加するだけでなく、ｈｓｐ／ストレスタンパク質レベル自体も増加するので、ｈｓｐに対する抗体の役割は複雑になり得る（Wright et al.（前記））。したがって、抗体レベルの見掛けの低下は、タンパク質レベル又はタンパク質に結合する抗体レベルの増加を単に反映している可能性がある。さらに、ｈｓｐ／ストレスタンパク質は調節効果を有し、動脈の平滑筋細胞に結合し、内在化を必要とせずにより長く残存する（Johnson et al.（前記））。
【０２９０】
加熱滅菌ツカムレラ・インコネンシスから調製された免疫調節試薬を用いて経皮冠動脈インターベンションを行うための患者の前処置によって、炎症プロセスが下方制御され、局所的筋内膜増殖の生成とそれに続く動脈のアテローム形成及び再狭窄が抑制される。これは、２２種類の異なるサイトカインを測定するきわめて高感度の「Luminex」法を用いて、末梢血中のサイトカイン含量の変化によって確認することができる。それは、ある種のストレスタンパク質及びそれらに対する抗体のレベルの変化並びに血清コルチゾル、ＤＨＥＡ（dehydroepiandrosterone）及びそれらの誘導体の変化によっても検出可能である。
【０２９１】
待機的ＰＣＩ（percutaneous coronary angioplasty）後に観察される（ｉ）インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０のレベルによって測定される炎症反応、（ii）Ｔヘルパー細胞調節及び機能の他の尺度、（iii）循環ストレスタンパク質及びそれに対する抗体のレベル、（iv）Ｃ反応性タンパク質並びに（５）コルチゾル及びデヒドロエピアンドロステロンの血漿中濃度に対するツカムレラ・インコネンシスの加熱殺菌調製物の注射の効果を試験するために、無作為化二重盲検対照並行群試験が使用される。
【０２９２】
臨床的理由でＰＣＩを必要とする患者は参加する資格がある。試験サイズは、ツカムレラ・インコネンシス又は不活性ビヒクルを用いた免疫治療に対して無作為化される５０人の患者である。患者は、血管形成術の６週間前と３週間前に２回の注射を受け、処置の４週間後に３回目の注射を受ける。炎症マーカーは、最初の注射の前、処置の直前、処置の２４から４８時間後及び処置の６から８週間後に測定される。
【０２９３】
試験は２段階あり、最初の段階においては無作為化され、活性生成物又はプラセボを投与される１０人の患者が前記全パラメータによる検査を受ける。第２段階では、残りの患者が、第１段階から最も適切として選択された方法によって検査される。
【０２９４】
最初の注射は、予定された血管形成術の６週間前に上腕又は肩部域に皮内投与され、２回目の注射はその３週間後に投与される。処置は２回目の注射から３〜５週間後に実施され、３回目及び最終の注射は、処置から４週間後に投与される。ＰＣＩは通常示されるように行われるべきであり、６〜８週間でさらに経過観察されるべきである。これは定常的な臨床の取り決めと一致すべきである。免疫学的マーカー及び炎症性マーカー用の血液試料は、ベースライン（最初の免疫治療又はプラセボ注射前）、ＰＣＩ処置の直前、ＰＣＩ処置後２４〜４８時間及びＰＣＩ処置後６〜８週間において採取されるべきである。
【０２９５】
血液試料採取プロトコル：静脈血試料１０〜１５ｍｌは前記４回の機会の各々で収集される。これらは、定常的な血液学的試験及び生化学試験、一連の血清サイトカイン及びケモカイン評価、循環ストレスタンパク質及びそれに対する抗体のレベル測定、血漿コルチゾル及びＤＨＥＡの評価、炎症性マーカー及び血管疾患マーカーの測定並びに細胞内サイトカイン産生の分析用ＲＮＡの貯蔵のためである。
【０２９６】
免疫治療調製物の詳細：調製物は、Ｍ／１５、ホウ酸塩緩衝（ｐＨ８）非発熱性生理食塩水（プラセボ）であり、又は同じホウ酸塩緩衝剤に１０ｍｇ／ｍｌで懸濁された好気性放線菌種ツカムレラ・インコネンシスの加熱滅菌生物の懸濁液である。
【０２９７】
かん菌は獣医学研究局（Veterinary Medicines Directorate）によって動物ウイルスがないと承認された）非抗原性非動物産物液体培地上で増殖させた。インキュベーションは３２℃の振とう水浴中であった。かん菌は、良好な成長がインキュベーション１０日後に得られたときに収集した。
【０２９８】
プラセボ及び細菌懸濁液は無菌２ｍｌ複数回投与用バイアル中に個々の投与量０．５±０．１ｍｌ体積で分注した。バイアルは、定期的に維持されたオートクレーブ中で効果指示薬と一緒に１２１℃で１５分間加圧滅菌された。冷却後、バイアルを標識し、試験専用の箱中で４℃±１℃で貯蔵した。
【０２９９】
無作為化：これは、（離脱患者又はバイアルの故障を埋め合わせるために）コンピュータによって作成される無作為な数列、１から１０及び１１から６０の生成による。
【０３００】
バイアルの標識は、患者の試験数とそれが１回目、２回目又は３回目の注射に使用されるかどうかを示すＡ、Ｂ又はＣとによる（投与日に対して患者の注意を持続させることができ、はがして使われる自己粘着性ラベルを各バイアルに貼付する）。プラセボ及び活性生成物のバイアルは、コンピュータが作成した無作為化スキームに従って同様に標識され、使用順に箱に保存される。
【０３０１】
インターベンションの投与は、左肩部から始まって交互の三角筋にわたる皮内注射による。患者に対して正確なバイアルを冷蔵庫から取り出す。シリンジに吸い取る直前にバイアルを約２０秒間激しく振とうしてかん菌粒子を懸濁させる。次いで、「ＢＤミクロファイン（BD Microfine）＋０．３３ｍｍ（２９Ｇ）×１２．７（融着）針付き１ｍｌ Ｕ−１００インスリンシリンジ」に０．１ｍｌを吸い取り、小面積の橙皮状皮膚を生じるように注意しながらすぐに投与する。全用量０．１ｍｌを注射すべきである。
【０３０２】
注射後、その内容物を含む残りのバイアルを今後の検査のために冷蔵庫中の特別な箱に必要に応じて戻す。
【０３０３】
【０３０４】
インターベンション試験は血管形成術前２回とその後１回の３回実施される。最初の２回は２１±３日離れているべきである。血管形成術は２回目の注射から２８〜５２日後とすべきであり、試験治療の３回目の注射は血管形成術から２８±３日後（すなわち２回目の注射から５２〜８０日後）とすべきである。
【０３０５】
試験結果：対象となる主要な結果は、免疫調節及び急性期反応のレベルの変化を指標又は炎症として示す血清マーカーである。血液試料はさまざまなマーカーについて分析されるが、試験の主な結果基準は、ベースライン試料及びＰＣＩ直前に採取された試料と比較された追跡血液試料における２つの投与群間で検出される差の比較である。
【０３０６】
以下の調査を、試験の第１段階において１０人の患者について実施した。
１．２２個の異なるサイトカインのルミネックス（Luminex）評価。
２．血漿コルチゾル、ＤＨＥＡ及び代謝産物。
３．６０／６５ｋＤａ及び７０ｋＤａ ｈｓｐ／ストレスタンパク質及びそれらに対する抗体の血清レベル。
４．Ｃ反応性タンパク質レベル。
５．賛辞活性化。
６．血管疾患マーカー。
７．定常的血液学など。
８．上記試験の結果が不適当である場合には、細胞内サイトカインのPax−Geneシステム研究を実施する。
【０３０７】
試験の第２のより大きな段階に実施すべき調査は、以下に示すように、段階１から得られる結果から選択する。
【０３０８】
最初の１０人の患者に対して得られた結果は、
１．血液試料１と２で差を示す患者（免疫調節効果）。
２．血液試料２と３で差を示す患者（手術手技の効果）。
３．血液試料１と４で差を示す患者（治療及び処置の長期効果）。
について研究者の各々によって分析される。
【０３０９】
次いで、それらの結果は患者の積極的治療又はプラセボ治療に従って分析される。これら２群間で差を示す選択調査は、試験の第２の主要な局面に適用される。
【０３１０】
二次的成果：一定分量の血液試料は、エンドセリン、フォンウィルブランド因子などの他の血管炎症性マーカーのありうる後日の分析のために貯蔵される。
【０３１１】
予備調査によれば、ツカムレラ・インコネンシスは冠動脈血管形成術後のＭＩＨを抑制すると示唆される。
【０３１２】
上記明細書に述べられたすべての刊行物を参照により本明細書に援用する。本発明に記載の方法及びシステムの様々な改変形態及び変更形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求する本発明がかかる具体的実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態の様々な変形形態は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３１３】
【図１】離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔メス試験及び対照の結果を示すグラフである。
【図２】離乳から１２週間の体重増加平均値／同腹仔オス試験及び対照の結果を示すグラフである。
【図３】ゴルドニア・ブロンチアリスが初期のＴＨ１効果を増強することを示すグラフである。
【図４】ツカムレラ・インコネンシスが初期のＴＨ１応答を増強し、後期のＴＨ２応答を抑制することを示すグラフである。
【図５】ロドコッカス・コプロフィラスがＴＨ１応答とＴＨ２応答の両方を抑制することを示すグラフである。
【図６】非ワクチン接種対照と比較された１カ月後のＢＣＧに対するツベルクリン応答を示すグラフである。
【図７】３種類の細菌によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４及び４８時間目に測定する。代表的な種は、（Ｎａ）ノカルジア・アステロイド、（Ｇｂ）ゴルドニア・ブロンチアリス及び（Ｔｐ）ツカムレラ・インコネンシスである。
【図８】２種類の細菌によるＢＣＧ／ＢＣＧ＋の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。代表的な種は、（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス及び（Ｄｍ）ダイエツィア・マリスである。
【図９】ロドコッカス属内の選択された種によるＢＣＧ効果の免疫調節を示すグラフである。ツベルクリン応答は２４、４８及び７２時間目に測定する。（Ｒｒｈ）ロドコッカス・ルホドクラウス、（Ｒｒｕ）ロドコッカス・ルベル、（Ｒｒｈｏｄ）ロドコッカス・ロドニイ、（Ｒｃｏｐ）ロドコッカス・コプロフィラス、（Ｒｏｐａ）ロドコッカス・オパカス、（Ｒｅｒｙｔｈ）ロドコッカス・エリトポレス。
【図１０】ロドコッカス・ルベルの１０８から１０４の対数希釈で改変されたＢＣＧを用いたロドコッカス・ルベルの最適用量をＢＣＧ単独と比較して示すグラフである。
【図１１】未処理対照及びマイコバクテリアワクチンで処理された対照と比較された、ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コルプロフィラス（Rhodococcus corprophilus）又はツカムレラ・インコネンシスで処理後の平均ラット体重増加を示すラット血管形成術試験からのグラフである。
【図１２】未処理対照及びマイコバクテリアワクチンで処理された対照と比較された、ゴルドニア・ブロンチアリス、ロドコッカス・コルプロフィラス又はツカムレラ・インコネンシスで処理後のラットにおける内膜／中膜厚さ比の結果を示すグラフである。ＧＰ１＝対照、ＧＰ２＝ゴルドニア・ブロンチアリス、ＧＰ３＝ロドコッカス・コプロフィラス、ＧＰ４＝ツカムレラ・インコネンシス、ＧＰ５＝マイコバクテリアワクチン）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用。
【請求項２】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管内膜の炎症を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管筋層又は心筋の炎症をさらに含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１又は２以上から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
血管障害が、自己免疫エレメントを含む血管障害である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
血管障害が、レイノー病又はレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１又は２以上から選択される、請求項５又は請求項６に記載の使用。
【請求項８】
移植片拒絶が慢性移植片拒絶である、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
移植片拒絶が免疫抑制薬の非存在下の慢性移植片拒絶である、請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
細菌が、ゴルドニア・ブロンチアリス、ゴルドニア・アマレア、ゴルドニア・スプチ、ゴルドニア・テレア、ノカルジア・アステロイド、ダイエツィア・マリス、ツカムレラ・パウロメタボラ、ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・ロドニイ、ロドコッカス・コルプロフィラス、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・エリトポレス、ノカルジオイデス・アルバス及びツカムレラ・インコネンシスからなる群の１又は２以上から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
細菌を死滅させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防する方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与することを含み、前記組成物が細胞免疫応答を調節する、方法。
自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防する方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む、細胞免疫応答を調節する薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患又は自己免疫異常に対する免疫を対象に与える方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管内膜の炎症を含む、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管の筋層又は心臓の筋層の炎症をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものである、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１又は２以上から選択される、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
血管障害が、自己免疫エレメントを含む血管障害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血管障害が、レイノー病又はレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１又は２以上から選択される、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
移植片拒絶が慢性移植片拒絶である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
移植片拒絶が免疫抑制薬の非存在下の慢性移植片拒絶である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
細菌が、ゴルドニア・ブロンチアリス、ゴルドニア・アマレア、ゴルドニア・スプチ、ゴルドニア・テレア、ノカルジア・アステロイド、ダイエツィア・マリス、ツカムレラ・パウロメタボラ、ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・ロドニイ、ロドコッカス・コプロフィラス、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・エリトポレス、ノカルジオイデス・アルバス及びツカムレラ・インコネンシスからなる群の１又は２以から選択される、請求項１２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細菌を死滅させる、請求項１２から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１２から２３に実質的に記載された方法。
【請求項２５】
請求項１から１１に実質的に記載された使用。
【請求項１】
自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防するための医薬品の製造における、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む免疫調節物質組成物又は薬剤組成物の使用。
【請求項２】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管内膜の炎症を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管筋層又は心筋の炎症をさらに含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１又は２以上から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
血管障害が、自己免疫エレメントを含む血管障害である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
血管障害が、レイノー病又はレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１又は２以上から選択される、請求項５又は請求項６に記載の使用。
【請求項８】
移植片拒絶が慢性移植片拒絶である、請求項５に記載の使用。
【請求項９】
移植片拒絶が免疫抑制薬の非存在下の慢性移植片拒絶である、請求項５に記載の使用。
【請求項１０】
細菌が、ゴルドニア・ブロンチアリス、ゴルドニア・アマレア、ゴルドニア・スプチ、ゴルドニア・テレア、ノカルジア・アステロイド、ダイエツィア・マリス、ツカムレラ・パウロメタボラ、ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・ロドニイ、ロドコッカス・コルプロフィラス、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・エリトポレス、ノカルジオイデス・アルバス及びツカムレラ・インコネンシスからなる群の１又は２以上から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
細菌を死滅させる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防する方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与することを含み、前記組成物が細胞免疫応答を調節する、方法。
自己免疫疾患又は自己免疫異常を治療又は予防する方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む、細胞免疫応答を調節する薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物の有効量を対象に投与することを含む方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患又は自己免疫異常に対する免疫を対象に与える方法であって、ロドコッカス属、ゴルドニア属、ノカルジア属、ダイエツィア属、ツカムレラ属及びノカルジオイデス属の１又は２以上の属に属する細菌の全細胞を含む薬剤組成物及び／又は免疫調節物質組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管内膜の炎症を含む、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が血管の筋層又は心臓の筋層の炎症をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、血管障害が先行するもの又は血管障害に起因するものである、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患又は自己免疫異常が、関節炎、特に関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節症、強皮症、甲状腺炎、移植後の内膜増殖、移植片拒絶及び血管障害の１又は２以上から選択される、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
血管障害が、自己免疫エレメントを含む血管障害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血管障害が、レイノー病又はレイノー現象、前部ブドウ膜炎、閉塞性血管障害、（動脈硬化症としても知られる）アテローム形成、動脈炎、（自然又は血管形成術後の）筋内膜増殖、血管の内膜及び／又は筋層の炎症性及び自己免疫性肥厚、炎症性血管病変、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心臓伝導障害、心筋炎、心筋梗塞の１又は２以上から選択される、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
移植片拒絶が慢性移植片拒絶である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
移植片拒絶が免疫抑制薬の非存在下の慢性移植片拒絶である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
細菌が、ゴルドニア・ブロンチアリス、ゴルドニア・アマレア、ゴルドニア・スプチ、ゴルドニア・テレア、ノカルジア・アステロイド、ダイエツィア・マリス、ツカムレラ・パウロメタボラ、ロドコッカス・ルベル、ロドコッカス・ロドニイ、ロドコッカス・コプロフィラス、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・エリトポレス、ノカルジオイデス・アルバス及びツカムレラ・インコネンシスからなる群の１又は２以から選択される、請求項１２から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細菌を死滅させる、請求項１２から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１２から２３に実質的に記載された方法。
【請求項２５】
請求項１から１１に実質的に記載された使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００７−５１１４９３（Ｐ２００７−５１１４９３Ａ）
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３８９５３（Ｐ２００６−５３８９５３）
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９０５６
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５０６１６４５４５）ユーシーエル バイオメディカ ピーエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１２日（２００４．１１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４７８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９０５６
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５０６１６４５４５）ユーシーエル バイオメディカ ピーエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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