全反射照明型センサチップ、その製造方法およびそれを用いたセンシング方法
【課題】エバネッセント波を利用した生体物質の検出において、研磨に起因して測定光を全反射させる金属膜形成面に生じる研磨痕により、光が漏れるのを防止する。
【解決手段】誘電体プリズム１０と、該誘電体プリズム１０の一面に形成された金属膜１４ａとを備え、金属膜１４ａに被検出物質Ａを含む試料Ｓを供給し、誘電体プリズム１０と金属膜１４ａとの界面１０ａに対し全反射条件を満たすように測定光Ｌを照射し、測定光Ｌの照射により発生したエバネッセント波Ｅｗを利用して被検出物質Ａを検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、金属膜１４ａが形成された上記一面である金属膜形成面１０ａの研磨痕が、一定の方向に指向性を有するようにする。
【解決手段】誘電体プリズム１０と、該誘電体プリズム１０の一面に形成された金属膜１４ａとを備え、金属膜１４ａに被検出物質Ａを含む試料Ｓを供給し、誘電体プリズム１０と金属膜１４ａとの界面１０ａに対し全反射条件を満たすように測定光Ｌを照射し、測定光Ｌの照射により発生したエバネッセント波Ｅｗを利用して被検出物質Ａを検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、金属膜１４ａが形成された上記一面である金属膜形成面１０ａの研磨痕が、一定の方向に指向性を有するようにする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント波を利用して試料中の物質を検出する方法に用いられる全反射照明型センサチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、全反射照明によって誘起するエバネッセント波または表面プラズモンを利用した検出方法が注目されている。表面プラズモンとは、金属表面の自由電子が集団的に振動することによって生じる自由電子の粗密波である。このような検出方法は、例えば、表面プラズモンの電場増強効果を利用した表面プラズモン電場増強蛍光分光（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＰＦＳ）測定が知られている。
【０００３】
ＳＰＦＳ測定は、誘電体プリズムに配された金属膜上に発生せしめたエバネッセント波によって、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている蛍光標識を励起して、これらからの蛍光を検出することにより、被検出物質を検出する測定である。エバネッセント波は、誘電体プリズムとこの誘電体プリズムに配された金属膜との界面において測定光を全反射させることにより、金属膜上に発生せしめられる。ＳＰＦＳ測定は、取り扱いが容易でかつ同時に複数のサンプルに対して測定できる方法であり、さらにエバネッセント波と金属膜中の自由電子とが共鳴することによって生じる表面プラズモンの電場増強効果によってエバネッセント波が増強されるため、大きな蛍光信号を検出することができるとして広く用いられている。
【０００４】
上記したＳＰＦＳ測定では、一般的に所定領域に金属膜を形成した誘電体プリズムをセンサチップとして用いている（特許文献１）。現在、誘電体プリズムは、ガラスに比べて安価かつ成型が容易なプラスチック製のものも多く用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−９６６０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＰＦＳ測定において検出限界を決めているのは、（i）背景光（装置の遮光漏れなど）、（ii）測定光の散乱光、（iii）測定光の散乱光に起因する光学系の自家蛍光、（iv）センサチップの自家蛍光で形成される蛍光標識に起因しないバックグラウンド光である。（i）の影響は装置設計で比較的容易に低減可能であり、また（ii）の影響も測定光カットフィルタを挿入することで容易に低減できる。（iv）の影響は、センサチップ上の金属膜を介して励起を行うため比較的小さい。
【０００７】
しかしながら、センサチップにコストをかけられない検体検査用途では、成形工程中に生じるキズや突起構造（研磨痕）のないセンサチップの安定製造が困難であるため、上記（iii）の影響を回避することは難しい。これは、金属膜を形成する面（金属膜形成面）の研磨痕の部分から測定光の一部が漏れることによってノイズの上昇を招いていることによる。
特に、ＳＰＦＳ測定の”金属膜近傍の信号のみ強く励起する”という特性を活かし、洗浄を行わずに蛍光検出を行い、蛍光信号の変化量（レート）から被検出物質の量を検出するホモジーニアスアッセイ系においては、（v）測定光の散乱光に起因する浮遊標識からの蛍光の影響も加わり、より深刻な問題である。
【０００８】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、エバネッセント波を利用した試料中の物質の検出において、研磨に起因して金属膜形成面に生じる研磨痕により、測定光が漏れるのを防止し、より定量性の高い検出を可能とする全反射照明型センサチップ、その製造方法およびそれを用いたセンシング方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明に係る全反射照明型センサチップは、
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、
上記一面である金属膜形成面の領域であって金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであることを特徴とするものである。
【００１０】
ここで、「被検出物質を検出する」とは、被検出物質の存在の有無を含み定性的な量のみならず、定量的な量、および活性の程度を検出することも意味するものとする。
【００１１】
「金属膜形成面」とは、金属膜が形成される誘電体プリズムの一面を意味するものとする。
【００１２】
「研磨痕」とは、研磨に起因して誘電体プリズムの金属膜形成面上に形成される痕跡キズ或いは痕跡構造を意味するものとする。つまり研磨痕は、直接金属膜形成面を研磨することにより形成される痕跡キズのみではなく、成型用の型を研磨することにより形成される研磨痕が成型工程により転写された痕跡構造も含むものである。この場合、通常前者の研磨痕は筋状（細長く一続きになっている形状）の凹構造となり、後者の研磨痕は筋状の凸構造となる。
【００１３】
研磨痕が「一の方向に指向性を有する」とは、研磨痕がほぼ一の方向に沿って形成されていることを意味する。つまり、複数の研磨痕が完全に平行状態のまま一の方向に沿って形成されていることのみならず、実質的な作用効果が得られる程度に複数の研磨痕が交わりながら全体として一の方向に沿って形成されていることも含むものとする。したがってより詳細には、本明細書内において「指向性を有する」とは、実施形態で詳細に述べる空間周波数分析法により算出された研磨痕の指向性の度合が、絶対値で３％以上
【００１４】
さらに、本発明に係る全反射照明型センサチップにおいて、
誘電体プリズムは、測定光を透過させるための透過面を有するものであり、
透過面は、この透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成されているものであることが好ましい。
【００１５】
ここで、「射影ベクトル」とは、金属膜形成面への射影成分を表すベクトルを意味するものとする。また、透過面について法線ベクトルの取り方は任意である。
【００１６】
研磨痕の指向性を表す「指向ベクトル」とは、実施形態で詳細に述べるように、空間周波数分析法により、研磨痕の画像の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）処理画像中におけるｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とから算出される、指向性の方向と程度を表すベクトルを意味するものとする。
【００１７】
「空間周波数分析法」とは、研磨痕の画像のＦＦＴ処理画像中におけるｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とから、研磨痕の指向性の度合を算出する方法を意味するものとする。算出の詳細については、実施形態にて詳細に後述する
【００１８】
「略平行となる」とは、完全な平行状態のみならず、実質的な作用効果が得られる程度に平行状態からずれた状態も含むことを意味するものとする。
【００１９】
そして、測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となることが好ましく、或いは、エバネッセント波および金属膜の共鳴により生じる表面プラズモンの伝播方向と、研磨痕が指向性を有する方向とが略平行となることが好ましい。
【００２０】
ここで、「測定光」とは、誘電体プリズムおよび金属膜の界面に入射する光を意味するものとする。
【００２１】
さらに、空間周波数分析法により算出した研磨痕の指向性の度合は、＋１０％以上であることが好ましい。
【００２２】
また、誘電体プリズムは、合成樹脂材料からなるものであることが好ましい。ここで、「合成樹脂材料からなる」とは、合成樹脂材料を主成分とするという意味であり、主成分とは重量比９０％以上含有されている成分をいう。
【００２３】
さらに、本発明に係る全反射照明型センサチップの製造方法は、
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成形し、
上記一面である金属膜形成面を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨することを特徴とするものである。
【００２４】
ここで、「成形」とは、材料を型にはめ込んで造形する成型、および型を用いない光成形等を含むものである。
【００２５】
そして、本発明に係る全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成形すると共に、測定光を透過させるための透過面を誘電体プリズムに形成し、
透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように、金属膜形成面を研磨することが好ましい。
【００２６】
また、空間周波数分析法により算出した研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、金属膜形成面を研磨することが好ましく、誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることが好ましい。
【００２７】
さらに、本発明に係る他の全反射照明型センサチップの製造方法は、
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成型するための型の部分であって上記一面である金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、
上記型を用いて誘電体プリズムを成型することを特徴とするものである。
【００２８】
ここで、誘電体プリズムを成型するための型の部分であって「上記一面である金属膜形成面に対応する部分」とは、誘電体プリズムを成型するための型の部分であって、誘電体プリズムの成型において金属膜形成面の形成に関与する部分を意味するものとする。つまり、金属膜形成面に対応する部分とは、型の内側の部分のうち金属膜形成面と接する部分である。
【００２９】
そして、本発明に係る全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成型すると共に、測定光を透過させるための透過面を、透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することが好ましい。
【００３０】
また、空間周波数分析法により算出した研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、上記型の金属膜形成面に対応する部分を研磨することが好ましく、誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることが好ましい。
【００３１】
さらに、本発明に係るセンシング方法は、
金属膜が一面に形成された誘電体プリズム有する全反射照明型センサチップを用いて、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法において、
上記一面である金属膜形成面の領域であって金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであり、
上記指向性を表す指向ベクトルと、測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、測定光を上記界面に対し照射することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る全反射照明型センサチップおよびその製造方法は、測定光の金属膜形成面への射影成分方向と、金属膜形成面の研磨痕が有する指向性の方向とが略平行となるようにすることを特徴とするものである。これにより、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少し、研磨痕から漏れる測定光の量が減少する。この結果、漏れた測定光に起因する光学系の自家蛍光や浮遊標識からの蛍光を低減することができ、より定量性の高い検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】第１の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略上面図
【図１Ｂ】第１の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略断面図
【図２】第１の実施形態に係る全反射照明型センサチップの製造方法を示す図
【図３】研磨痕の微分干渉画像を撮像する装置を示す概略図
【図４Ａ】ｙ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像を示す図
【図４Ｂ】ｘ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像を示す図
【図４Ｃ】丸く研磨された研磨痕の微分干渉画像を示す図
【図５】第１の実施形態における画像処理ソフトの設定画面を示す図
【図６Ａ】ｙ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像のＦＦＴ画像を示す図
【図６Ｂ】ｘ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像のＦＦＴ画像を示す図
【図６Ｃ】丸く研磨された研磨痕の微分干渉画像のＦＦＴ画像を示す図
【図７】ＦＦＴ画像における低周波数成分および高周波数成分を説明する図
【図８】ＦＦＴ画像から指向性を定量する際に抽出する領域の取り方を説明する図
【図９】研磨痕から測定光が漏れている現象を示す図
【図１０】研磨痕により全反射条件が満たされなくなる現象を説明する図
【図１１Ａ】第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略上面図
【図１１Ｂ】第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略断面図
【図１２】第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップの製造方法を示す図
【図１３】第２の実施形態に係るセンサチップを用いた蛍光検出装置の概略図
【図１４】サンドイッチ法によるアッセイ手順を示す概略断面図
【図１５Ａ】実施例における検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比を示す図
【図１５Ｂ】比較例における検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比を示す図
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００３５】
「全反射照明型センサチップおよびその製造方法」
＜全反射照明型センサチップの第１の実施形態＞
まず、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ１の構成について説明する。図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ１の概略上面図および概略断面図である。ここで、図１Ｂは、図１ＡのＡＡ’における断面図である。ただし、視認しやすくするため、図中、各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜異ならせてある。
【００３６】
図１Ａおよび図１Ｂに示すように、全反射照明型センサチップＣ１は、誘電体プリズム１０と、誘電体プリズム１０上に形成される流路１３の側壁となる側壁材１１と、この流路１３の上面となるフタ材１２と、流路１３内の所定領域に形成された金属膜１４ａおよび１４ｂとを備えている。
【００３７】
誘電体プリズム１０は、被検出物質を含む試料等を流すための流路１３を形成するための基板となるものである。また、誘電体プリズム１０は、測定光が誘電体プリズムと金属膜との界面へ向けて進行する際に透過するように設けられた透過面１０ｂ（測定光が誘電体プリズム内に入射する際に通る誘電体プリズムの面）を有している。ただし、透過面１０ｂは必ずしもｚ−ｘ平面に対して傾いている必要はない。また、透過面１０ｂは必ずしも必要なものでもない。ここで、座標系は、図１Ａにおいて下向きをｘ軸、右向きをｙ軸、そして右手座標系を形成するように紙面垂直向きをｚ軸とするものである。つまり、照射され得る測定光Ｌの金属膜形成面１０ａ（金属膜が形成されている誘電体プリズムの一面）への射影成分の向きをｙ軸、金属膜形成面１０ａに対して垂直上方をｚ軸、そして右手座標系を形成するようにｘ軸をとっている（以下、本明細書において特に説明のない限り、座標系は上記の座標系とする。）。また、透過面１０ｂは、この透過面１０ｂの法線ベクトルの、金属膜形成面１０ａへの射影成分の向きと、ｙ軸（後述する、研磨痕の指向性を表す指向ベクトル）とが略平行となるように形成されているものであることが好ましい。誘電体プリズム１０の材料は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プリズム１０は、合成樹脂（プラスチック）材料から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）、ＺＥＯＮＥＸ（日本ゼオン社）等の合成樹脂材料を用いることがより好ましい。そして、金属膜形成面１０ａは、研磨痕がｙ軸に沿うように研磨されている。
【００３８】
流路１３は、誘電体プリズム１０上に形成された側壁材１１とこの側壁材１１上に装着されたフタ材１２から形成されている。さらに、流路１３の両端には液下用或いは廃液用の液溜めが形成されている。また、流路１３の所定領域には、検出部となる金属膜１４ａ・１４ｂが形成されている。本実施形態では、測定用の検出部として金属膜１４ａを、リファレンス用の検出部として金属膜１４ｂを設けている。ただし、検出部は、測定用の検出部が１つあればよく、上記のようなリファレンス用の検出部は必ずしも必要ではない。金属膜１４ａ・１４ｂの材料としては、特に制限されるものではなく、例えばプラズモンを効率よく誘起する観点から、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ｔｉ等が挙げられ、電場増強効果の高いＡｕ，Ａｇ等が特に好ましい。金属膜１４ａ・１４ｂの厚みは、金属膜１４ａ・１４ｂの材料と、測定光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが好ましい。例えば、測定光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜１４ａ・１４ｂとして金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜１４ａ・１４ｂの厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。金属膜は、所定領域に開口を有するマスクを流路上に形成し、既知のスパッタ法・蒸着法等により成膜形成することができる。
【００３９】
側壁材１１は、誘電体プリズム１０上に幅を設けて形成することにより、流路１３の側壁を形成するためのものである。例えば、シール材として貼り付けることにより用意に形成することができる。側壁材１１は、流路１３の両端に液下用或いは廃液用の液溜めとしての空間を確保するために、流路１３の幅よりも広くなるような空間を有するように形成されている。また、フタ材１２は、上記側壁材１１上に装着することにより流路１３の上面を形成するためのものである。フタ材１２は、液下用の液溜めに接続する試料等を流下するための注入口１５ａ、および廃液用の液溜めに接続する空気等を抜くための空気孔１５ｂを有している。側壁材１１およびフタ材１２の材料としては、前述した誘電体プリズム１０と同様の材料を用いることができる。また、側壁材１１およびフタ材１２が一体となっている形状のギャップカバーグラスや成型分品等を用いることもできる。
【００４０】
次に、全反射照明型センサチップＣ１の製造方法について、図２を用いて説明する。
全反射照明型センサチップＣ１の製造方法は、まず成形によりセンサチップの基板となる誘電体プリズム１０を形成し（図２Ａ）、誘電体プリズム１０の金属膜形成面１０ａを研磨痕がｙ軸に沿うように研磨材５０で図中の矢印方向へ研磨し（図２Ｂ）、流路の側壁を形成するように金属膜形成面１０ａ上に側壁材１１を配置し（図２Ｃ）、流路の所定領域に金属膜１４ａおよび１４ｂを形成し（図２Ｄ）、フタ材１２を側壁材１１上に装着する（図２Ｅ）ものである。
【００４１】
誘電体プリズム１０の成形は、特に制限されるものではなく、通常用いられる射出成型や光成形等によって実施することができる。また、市販の誘電体プリズムを使用することも可能である。
【００４２】
金属膜形成面１０ａの研磨は、研磨痕がｙ軸に沿うように、つまり研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するように行う。この研磨は、最終的に研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するようになっていればよいため、例えば最初は円を描きながら全体的に均一に研磨し、その後ｙ軸に沿って研磨するようにしてもよい。ここで、研磨を行う研磨材５０は特に制限されるものではない。例えば、樹脂用の研磨剤として市販されている、柳瀬株式会社製樹脂研磨剤２４Ｐ（商品名）や株式会社光陽社製ダンジーＤ−４９１（商品名）などを用い必要な時間手研磨することができ、さらには株式会社光陽社製樹脂用コンパウンド サンライトＫＦＦ−Ｗなどをポリッシャに取り付け研磨することもできる。
【００４３】
研磨痕の指向性は下記に示す空間周波数分析法により数値化し定義する。
【００４４】
（１）金属膜形成面の研磨痕の微分干渉画像を撮影する。
図３は、研磨痕の微分干渉画像（以下、単に画像と言う。）を撮像するために用いた装置を示す。ここで、顕微鏡はオリンパス株式会社製ＢＸ５１ＷＩ（商品名）であり、対物レンズはオリンパス株式会社製ＬＭＰｌａｎＦＩ×５０（商品名）であり、ＣＣＤは株式会社フローベル製ＡＤＴ−１００（商品名）である。ＣＣＤには、画像の保存および処理を行うためのパーソナルコンピューター（ＰＣ）が接続されている。そして、上記装置を用いて研磨痕の画像を撮像すると、例えば図４Ａ〜Ｃに示すような画像が得られる。図４Ａのｉｍａｇｅ−Ａは研磨痕がｙ軸に沿うように研磨された誘電体プリズムの画像であり、図４Ｂのｉｍａｇｅ−Ｂは研磨痕がｘ軸に沿うように研磨された誘電体プリズムの画像であり、図４Ｃのｉｍａｇｅ−Ｃは丸く研磨された誘電体プリズムの画像である。
【００４５】
（２）研磨痕の画像に高速フーリエ変換処理を行う。
次に、（１）で得たそれぞれの画像に対して高速フーリエ変換（ＦＦＴ）処理を行いそれぞれの研磨痕のＦＦＴ画像を得る。ＦＦＴ処理は、画像処理ソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅを用いて行う。ここで、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅの設定画面において単位を実寸に設定しておく必要がある。例えば図５は、（１）で得た画像のサイズが、視野：１００ｕｍ角、ｐｉｘｅｌ：５１２×５１２の場合における設定を示す。画像をＦＦＴ処理すると図６Ａ〜Ｃに示すようなＦＦＴ画像が得られる。ＦＦＴ−Ａ、ＦＦＴ−ＢおよびＦＦＴ−Ｃは、それぞれｉｍａｇｅ−Ａ、ｉｍａｇｅ−Ｂおよびｉｍａｇｅ−ＣについてのＦＦＴ画像である。ＦＦＴ画像は、元になる画像中に含まれる周波数成分のパワー（絶対値の二乗）を濃淡で表したものであり、ＦＦＴ画像の中心に近いほど低周波数成分のパワーを表し、逆にＦＦＴ画像の中心から離れるほど高周波数成分のパワーを表している（図７）。
【００４６】
（３）ＦＦＴ画像からｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とを定量し、研磨痕の指向性の度合を算出する。
例えば、ＦＦＴ画像のｋｘ軸の近傍の濃度は、画像中のｘ軸方向に周期的な構造が存在することを示唆し、また同様にＦＦＴ画像のｋｙ軸の近傍の濃度は、画像中のｙ軸方向に周期的な構造が存在することを示唆している。つまり、ＦＦＴ画像のｋｘ軸の近傍に濃度が集中する場合は、画像中のｙ軸に沿った構造の存在を表し、また同様にＦＦＴ画像のｋｙ軸の近傍に濃度が集中する場合は、画像中のｘ軸に沿った構造の存在を表している。ここでｋｘ軸およびｋｙ軸は、ＦＦＴ画像における空間周波数での座標を表し、図８に示すようにＦＦＴ画像の右向きおよび上方を、それぞれｋｘ軸およびｋｙ軸としている。本発明では、ＦＦＴ画像のｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とを抽出および数値化し、この数値化されたそれぞれの濃度から研磨痕の指向性の度合を定義する。ここでｋｘ軸近傍領域とは、ｋｘ軸の値の大きさが０．５ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上、かつｋｙ方向は１０ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上の領域（図８中の領域Ｘ）とし、ｋｙ軸近傍領域とは、ｋｙ軸の値の大きさが０．５ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上かつｋｘ方向は１０ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上の領域とする。０．５ｕｍ／ｃｙｃｌｅよりも低周波数成分としたのは、経験上０．５ｕｍ以上の幅を持った研磨痕から光が漏れていることに基づく。ＦＦＴ画像は、画像の中心でシンメトリとなっている（図７）ため、各軸のプラス側のみを定量してもいいが、本明細書では両方の濃度を定量するものとして説明する。
【００４７】
そして、研磨痕の実空間における指向性の度合を次のように定義する。
研磨痕の指向性の度合（％）＝（領域Ｘの濃さ（％））−（領域Ｙの濃さ（％））
ここで、領域Ｘの濃さ（％）とは、（領域Ｘの平均濃度−全体領域の平均濃度）／（全体領域の平均濃度）×１００であり、領域Ｙの濃さ（％）とは、（領域Ｙの平均濃度−全体領域の平均濃度）／（全体領域の平均濃度）×１００である。また、「全体領域」とはＦＦＴ画像の全領域を指すが、必ずしもこれに限られるものではなく、「全体領域」は領域Ｘおよび領域Ｙを含むように全体的に広く指定した領域としてもよい。各領域の平均濃度は、画像処理ソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅの機能を用いて定量することができる。上記の研磨痕の指向性の度合は、その数値がプラスであれば実空間のｘ軸よりもｙ軸に沿った構造が多いこと、つまり研磨痕がｙ軸方向へ指向性を有することを示す。また逆にこの度合は、その数値がマイナスであれば実空間のｙ軸よりもｘ軸に沿った構造が多いこと、つまり研磨痕がｘ軸方向へ指向性を有することを示す。
【００４８】
例えば、図６Ａ〜Ｃに示す３つのＦＦＴ画像に対して上記空間周波数分析法を適用して指向性の度合を定量するとそれぞれ下記表１のようになる。
【表１】
【００４９】
ＦＦＴ−Ａは、図４Ａのｉｍａｇｅ−Ａの画像についてのＦＦＴ画像であるため、その研磨痕のｙ軸方向への指向性は１３．７％と高くなっている。また、ＦＦＴ−Ｂは、ｉｍａｇｅ−Ｂの画像についてのＦＦＴ画像であるため、その研磨痕のｘ軸方向への指向性は８．７％と高くなっている。そして、ＦＦＴ−Ｃは、ｉｍａｇｅ−Ｃが丸く磨いた場合の研磨痕を示すものであるため、その指向性は小さくなっている。指向性の度合は、測定感度の観点から＋５％以上あることが好ましく、＋１０％以上あることがより好ましい。ここで、本発明において上記指向性の度合の大きさおよびその指向性の向きを持つベクトルを指向ベクトルという。つまり、＋１０％の指向性については、１０という値を持つｙ軸方向へのベクトルを対応させることができる。
【００５０】
以下、本発明に係るセンサチップの作用について説明する。
本出願人は、誘電体プリズムの金属膜形成面に研磨痕が存在すると、図９に示すようにｘ軸に沿った研磨痕から測定光が漏れるという現象を発見した。図９は、金属膜形成面の下方（誘電体プリズムの内部）において測定光を全反射させて、その様子を金属膜形成面の上方（誘電体プリズムの外部）から観察した様子である。図９中にはｙ軸に沿った研磨痕も存在しているが、ｘ軸に沿った研磨痕から測定光が漏れているのがはっきりと示されている。これは、図１０に示すように、研磨痕５２が存在する部分において測定光Ｌが金属膜形成面１０ａでの全反射条件を満たさなくなることに起因していると考えられる。このように測定光Ｌが全反射条件を満たさなくなるのは、図１０から分かるように測定光Ｌの金属膜形成面１０ａへの射影成分の方向（ｙ軸方向或いはエバネッセント波の進行方向）と研磨痕５２の方向（ｘ軸方向）とがほぼ垂直となっているためである。したがって、本発明に係るセンサチップでは、測定光Ｌの金属膜形成面１０ａへの射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕５２の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することにより、測定光Ｌが金属膜形成面１０ａでの全反射条件を満たさなくなることを防止し、測定光が漏れるという問題を解消することができる。
【００５１】
以上のように、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ１は、測定光の金属膜形成面への射影成分方向と、金属膜形成面の研磨痕が有する指向性の方向とが略平行となるようにすることを特徴とするものである。これにより、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少し、研磨痕から漏れる測定光の量が減少する。この結果、漏れた測定光に起因する光学系の自家蛍光や浮遊標識からの蛍光を低減することができ、より定量性の高い検出が可能となる。
【００５２】
さらに、本発明に係るセンサチップＣ１によれば、研磨痕から測定光が漏れることを防止すると共に、表面プラズモンのエネルギーが漏れ出る測定光と共に逃げていくことも防止することができる。例えば波長６３０ｎｍの測定光を金（Ａｕ）膜と水との界面に照射した場合、１点に全反射条件を満たさない領域が存在すると、そのプラズモン伝播長に相当する周囲半径３ｕｍ内の金膜内に蓄えられていた表面プラズモンのエネルギーがその１点から逃げてしまうということが知られている（”Surface plasmon resonance sensors: review”, Sensors and Actuators B: Chemical, Vol. 54, No. 1-2. (25 January 1999), pp. 3-15）。さらに、波長が８５０ｎｍの場合には、その半径は２４ｕｍにもなる。つまりこれは、全反射条件を満たさない領域以上の大きい領域から蓄えられていた表面プラズモンのエネルギーが逃げることにより、表面プラズモンによる電場増強の効果も大きく減少することを意味する。したがって、本発明に係るセンサチップＣ１によれば、表面プラズモンのエネルギーが漏れ出る測定光と共に逃げていくことも防止することができるため、表面プラズモンによる電場増強の効果を効率よく利用することができる。その結果、信号光（標識の蛍光等）を効率よく検出することができ、より高感度の測定を行うことができる。
【００５３】
＜全反射照明型センサチップの第２の実施形態＞
まず、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２の構成について説明する。図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれ本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２の概略上面図および概略断面図である。ここで、図１１Ｂは、図１１ＡのＢＢ’における断面図である。全反射照明型センサチップＣ２は、第1の実施形態に係るセンサチップＣ１と同様の構成であるが、型を用いた成型によって誘電体プリズム２０に直接流路（上面を除く）が形成されるという点でセンサチップＣ１と大きく異なる。したがって、センサチップＣ１と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
【００５４】
図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、全反射照明型センサチップＣ２は、誘電体プリズム２０と、誘電体プリズム２０に形成された流路２３（溝）と、この流路２３を塞ぐように配置されたフタ材２２と、流路２３内の所定領域に形成された金属膜２４ａおよび２４ｂとを備えている。
【００５５】
次に、全反射照明型センサチップＣ２の製造方法について、図１２を用いて説明する。
センサチップＣ２の製造方法は、まず成型用の型６０を用意し、この型６０の部分であって金属膜が形成される上記一面である金属膜形成面２０ａ（流路の底面）に対応する部分６２を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨材５０で図中の矢印方向へ研磨し（図１２Ａ）、この型６０を用いてセンサチップの基板となる誘電体プリズム２０を成型し（図１２Ｂ）、流路２３の所定領域に金属膜２４ａおよび２４ｂを形成し（図１２Ｃ）、フタ材２２を誘電体プリズム２０上に装着する（図１２Ｄ）ものである。
【００５６】
成型用の型６０は、例えばＪＩＳ規格（日本工業規格）ＳＫＤ−１１、ＳＫＤ−６１等のダイス鋼からなる焼入型金型である。例えば、大同特殊鋼株式会社製ＤＣ１１（商品名）、日立金属株式会社製ＳＬＤ（商品名）、日本高周波鋼業株式会社製ＫＤ１１（商品名）等がこれに該当する。
【００５７】
型６０の研磨は、転写により生じる誘電体プリズムの研磨痕がｙ軸に沿うように、つまりこの研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するように行う。より詳細には例えば型６０の研磨は、フライス盤を用いた平フライスを行う或いは平削り盤を用いたフライス削りを行った後、平面研削盤を用いた平面研削を行い、その後超仕上を行い、最後の仕上げとしてラッピングを手作業で行うことにより実施する。「超仕上」とは、細かい砥粒の砥石を低い圧力で加工物表面に押し付けて加工物表面に平行な細かい振動(オシレーション)を与え、加工物を研磨方向と垂直な方向に動かすと同時に、優れた洗浄性を持つクーラントオイルを多量に注ぎながら、微細な切削を行わせて、滑らかに表面を仕上ると共に精度の高い仕上面を得る加工方法である。例えば、砥石の大きさ１５×１５ｍｍ、押し付け圧力０．２５ＭＰａ、砥石の振動数３０Ｈｚ、砥石の振動の幅（振幅の２倍）２ｍｍ、加工物の送り速さ２８ｍ／ｍｉｎの条件下で、３０秒間超仕上を行えばその研磨面を１ｕｍ以下の凹凸に仕上げることができる。ラッピングは、ラップ材（細かい目のやすり）に加工面を接触させて、その研磨痕が一の方向に指向性を有するように実施する。ここで、この一の方向は、型６０の研磨痕が転写されることにより生じる誘電体プリズムの研磨痕がｙ軸に沿うように選択される。ラップ材は、粗い目（粒度３００）のものから細かい目（粒度１０００）のものまで粒度を上げていくことが好ましい。
【００５８】
本実施形態のセンサチップＣ２は、流路２３に対して垂直方向がｙ軸となるため、流路２３の底面２０ａに対応する部分の研磨も、その流路２３の底面２０ａに転写される研磨痕が流路２３と垂直になるように行う。この研磨は、第１の実施形態と同様に、最終的に研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するようになっていればよいため、例えば最初は円を描きながら全体的に均一に研磨し、その後流路の底面に転写される研磨痕が流路と垂直になるように研磨してもよい。
【００５９】
本実施形態に係るセンサチップＣ２の研磨痕は、型の研磨痕が転写されたものであるという点で、第１の実施形態に係るセンサチップＣ１の研磨痕と大きく異なる。つまり、センサチップＣ１の研磨痕は、誘電体プリズム１０が削られた構造（筋状の凹構造）となり、センサチップＣ２の研磨痕は、誘電体プリズム２０に盛られた構造（筋状の凸構造）となる。しかしながら、センサチップＣ２のような研磨痕であっても、測定光が漏れるという問題については第１の実施形態と同様に議論できる。つまり、センサチップＣ２についても、研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するようにすることで、研磨痕から測定光が漏れることを防ぐことができる。また、センサチップＣ２の研磨痕についても、第１の実施形態で説明した空間周波数分析法を同様に適用することにより、その研磨痕の指向性の度合を定義することができる。
【００６０】
以上のように、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２は、成型用の型の部分であって金属膜が形成される金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、測定光の金属膜形成面への射影成分方向と、金属膜形成面の研磨痕が有する指向性の方向とが略平行となるようにすることを特徴とするものである。これにより、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少すると共に、表面プラズモンのエネルギーを効率よく利用することができ、第１の実施形態と同様の効果を得ることが可能である。
【００６１】
「センシング装置およびセンシング方法」
図１３は、第２の実施形態に係るセンサチップＣ２を用いた蛍光検出装置の概略図である。なお、本発明に係るセンサチップを用いるセンシング装置は、これに限られるものではない。
【００６２】
図示の通り、この蛍光検出装置１００は、前述した第２の実施形態例に係る全反射照明型センサチップＣ２と、蛍光標識Ｆを励起する波長６５７ｎｍの測定光Ｌを発する光源１２１と、センサチップＣ２上に供給された蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆ等を検出する光検出器１３０と、光検出器１３０に蛍光等を導光するように配置された２つの平凸レンズ１２４と、２つの平凸レンズ１２４の間に配置された、増強電場Ｅｗの散乱光Ｌｓは遮断しかつ蛍光Ｌｆは透過させる光学フィルタ１２３と、光検出器１３０が接続されたデータ処理部１４０からなる。ここで、光源１２１は、センサチップＣ２上で増強電場Ｅｗを生じせしめるようにセンサチップＣ２の下方に配置されており、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜２４ａに固定されている。また、図１３中の符号１２５は、２つの平凸レンズ１２４と光学フィルタ１２３とを含み、光検出器１３０が装着されている光学系保持部である。
【００６３】
光源１２１は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また、光源１２１は、前述のように、センサチップＣ２の誘電体プリズムと金属膜との界面で、測定光Ｌが全反射すると共に金属膜で表面プラズモン共鳴する共鳴角で入射するように配置されている。ここで、光源１２１とセンサチップＣ２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。本発明では、指向性を表す指向ベクトルと、測定光Ｌの金属膜形成面２０ａへの射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、測定光Ｌを誘電体プリズム２０と金属膜２４ａとの界面に対し照射する。なお、測定光Ｌは、表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００６４】
光検出器１３０は、試料Ｓ中に含まれる蛍光標識Ｆが発する蛍光Ｌｆを定量的に検出するものであればよく、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器１３０は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。ここで、エバネッセント波の散乱光Ｌｓは遮断しかつ蛍光Ｌｆは透過させる光学フィルタ１２３を、２つの平凸レンズ１２４の間に配置することにより、ノイズを抑えて効率よく蛍光Ｌｆを検出することができる。すなわち、蛍光Ｌｆを散乱光Ｌｓと分離して測定することができる。なお、このエバネッセント波の散乱光Ｌｓと、前述した研磨痕から漏れた測定光とは異なるものである。そして、光学系保持部１２５は、２つの平凸レンズ１２４、光学フィルタ１２３および光検出器１３０を備えるものとして、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）等を好適に用いることができる。
【００６５】
データ処理部１４０は、光検出器１３０によって検出された蛍光信号等のデータを処理する役割を果たす。具体的にはパーソナルコンピュータが挙げられる。なお、上記データ処理と同様の役割を果たせば、特にパーソナルコンピュータに制限されず他の電子計算機等を用いてもよい。
【００６６】
以下、上記蛍光検出装置１００を用いて、被検出物質としての抗原Ａを含む試料から、抗原Ａを検出する場合における蛍光検出方法について、図１４を用いて説明する。
【００６７】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料から、抗原Ａを検出する場合を考える。
本実施形態による蛍光検出方法は、後述するサンドイッチ法によるアッセイを行うことによって、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜２４ａ上に蛍光標識Ｆを固定し、次に光源１２１より発せられる測定光Ｌを、センサチップＣ２の誘電体プリズムと金属膜との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度となるように、かつ金属膜形成面の研磨痕の指向性を表す指向ベクトルと、この測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように入射して、エバネッセント波を励起し、このエバネッセント波と金属膜２４ａ中の自由電子とを共鳴させることにより金属膜２４ａ中に表面プラズモンを発生させ、この表面プラズモンによる増強電場Ｅｗで蛍光標識Ｆを励起して蛍光Ｌｆを生じせしめ、この蛍光Ｌｆを光検出器１３０で検出して、その蛍光量をデータ処理部１４０でデータ処理するものである。
【００６８】
ここで、以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識Ｆであるが、この蛍光標識Ｆは抗原Ａがなければ金属膜２４ａ上に固定されないものと考えて、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、間接的に抗原Ａの存在を確認している。
【００６９】
１次抗体Ｂ１は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原がＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原と特異的に結合するモノクロナール抗体（２次抗体Ｂ２と少なくともエピトープが異なる）等を用いることができ、既存の技術を用いて金属膜２４ａ上に固定することができる。
【００７０】
蛍光標識Ｆは、測定光Ｌによって励起されて所定波長の蛍光Ｌｆを発するものであり、特に制限なく、測定条件（被検出物質や励起光の波長）に応じて適宜選択することができる。例えば、測定光Ｌの波長が６５０ｎｍ程度の場合、Ｃｙ５色素（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）等を用いることができる。
【００７１】
増強電場Ｅｗは、金属膜２４ａ中に発生する表面プラズモンによって形成される電場であって、金属膜２４ａ上の局所的な領域に発生する、通常のエバネッセント波よりも増強された電場である。この増強電場Ｅｗによって、標識から発せられる蛍光等の信号の強度を増幅することができる。表面プラズモンは、エバネッセント波と金属膜２４ａ中の自由電子とを共鳴させることにより金属膜２４ａ中に発生せしめられる。
【００７２】
蛍光標識Ｆを金属膜２４ａに固定するためのサンドイッチ法によるアッセイは、以下に示す手順により行われる。血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合について図１４を参照して説明する。また、以下の手順において、標識２次抗体ＢＦ（２次抗体Ｂ２と蛍光標識Ｆとの結合物質）が流路２３の検出部上流側に乾燥状態で配置されたセンサチップＣ２を用いている。
ｓｔｅｐ１：注入口２５ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１４において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルタ２６により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルタ２６で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路２３に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：流路２３に染み出した血漿Ｓと、流路２３の検出部上流側に乾燥状態で配置された標識２次抗体ＢＦとが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ４：血漿Ｓは流路２３に沿って空気孔２５ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、測定用のセンサ部２８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ５：結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は、リファレンス用の検出部２９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに、１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが検出部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、検出部上に浮遊している標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
【００７３】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、前述したように上記の蛍光検出装置１００において、測定用の検出部２８からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を高感度に検出することができる。その後、リファレンス用の検出部２９からの検出信号を検出できるようにセンサチップＣ２を移動させ、同様に、リファレンス用の検出部２９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定しているリファレンス用の検出部２９からの検出信号は、標識２次抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した検出信号であると考えられる。したがって、この検出信号をリファレンスとして、測定用の検出部からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、リファレンス用の検出部２９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子等）をあらかじめ固定しておき、リファレンス用の検出部２９からの信号をリファレンスとして測定用の検出部からの検出信号を補正してもよい。
【００７４】
ここで、前述のホモジーニアスアッセイの場合、上記ｓｔｅｐ５は行わずに、検出を行う。また、抗原抗体反応終了後に測定を行うエンドポイント法について実施例を挙げたが、蛍光検出方法は、反応中（ｓｔｅｐ４中）に一定時間間隔で測定を行い、蛍光信号の変化量を測定するレート法等の方法でもよい。
【００７５】
以上のように、上記蛍光検出装置および蛍光検出方法では、全反射照明型センサチップとして、本発明に係る全反射照明型センサチップＣ２を用いている。したがって、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少すると共に、表面プラズモンのエネルギーを効率よく利用することができ、より高感度の測定が可能となる。
【実施例】
【００７６】
＜実施例＞
第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２（誘電体プリズムの材料：ＰＭＭＡ、金属膜：Ａｕの蒸着膜、金属膜の厚さ：５０ｎｍ、研磨痕：ｙ軸方向に指向性を有する（図４Ａ））を用い、抗原としてｈＣＧ（抗原濃度：９０ｐＭ）、抗体として抗ｈＣＧを反応させ、２次反応後ＰＢＳで洗浄し、図１３に示す蛍光検出装置によりセンシング測定を行った。その結果、図１５Ａに示すような検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比が得られた。
【００７７】
＜比較例＞
研磨痕がｘ軸方向に指向性を有する（図４Ｂ）点以外は実施例のセンサチップＣ２と同じ条件のセンサチップを用い、実施例と同様のセンシング測定を行った。その結果、図１５Ｂに示すような検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比が得られた。
【００７８】
＜評価＞
図１５ＡおよびＢにおけるＮｏｉｓｅ中のｎ１は標識の非特異的吸着によるノイズを表し、ｎ２は装置或いは光学系の自家蛍光によるノイズを表し、そしてｎ３は電子機器を扱う際に生じる電子的なノイズを表している。実施例では、上記のｎ２を低減することができることが実証された。また全体的にも、実施例では検出信号全体に対するノイズの構成比が約２６％であるのに対し、比較例ではそれが約３３％となっていることから、本発明に係るセンサチップＣ２を用いることによりノイズを低減できていることがわかる。実施例および比較例のＳ／Ｎ比は、それぞれ２．８および２．０である。これは、測定系の検出限界が（Ｓ／Ｎ比＞０．０３）という場合には、実施例では１ｐＭまで、比較例では１．５ｐＭまで測定可能であることを示している。したがって、実施例では検出限界が１．５倍改善されたことが立証された。また、実施例および比較例においてＰＢＳでの洗浄を行わない場合には、サンドイッチを形成していない浮遊標識を研磨痕から漏れた測定光が励起してしまうため、それぞれのＳ／Ｎ比の差が大きくなった。具体的には、実施例（洗浄なし）では検出限界が２倍改善された。
【符号の説明】
【００７９】
Ａ 抗原
Ｃ１ 全反射照明型センサチップ
Ｃ２ 全反射照明型センサチップ
Ｅｗ 増強電場
Ｆ 蛍光標識
Ｌ 測定光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｓ 散乱光
１０ 誘電体プリズム
１０ａ 金属膜形成面
１０ｂ 透過面
１１ 側壁材
１２ フタ材
１３ 流路
１４ａ・１４ｂ 金属膜
１５ａ・２５ａ 注入口
１５ｂ・２５ｂ 空気孔
２０ 誘電体プリズム
２０ａ 金属膜形成面
２２ フタ材
２３ 流路
２４ａ・２４ｂ 金属膜
２６ メンブレンフィルタ
５０ 研磨材
５２ 研磨痕
６０・６１ 成型用の型
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エバネッセント波を利用して試料中の物質を検出する方法に用いられる全反射照明型センサチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質やＤＮＡ等を検出するバイオ測定において、全反射照明によって誘起するエバネッセント波または表面プラズモンを利用した検出方法が注目されている。表面プラズモンとは、金属表面の自由電子が集団的に振動することによって生じる自由電子の粗密波である。このような検出方法は、例えば、表面プラズモンの電場増強効果を利用した表面プラズモン電場増強蛍光分光（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＰＦＳ）測定が知られている。
【０００３】
ＳＰＦＳ測定は、誘電体プリズムに配された金属膜上に発生せしめたエバネッセント波によって、試料中に含まれる被検出物質あるいはこの被検出物質に付けられている蛍光標識を励起して、これらからの蛍光を検出することにより、被検出物質を検出する測定である。エバネッセント波は、誘電体プリズムとこの誘電体プリズムに配された金属膜との界面において測定光を全反射させることにより、金属膜上に発生せしめられる。ＳＰＦＳ測定は、取り扱いが容易でかつ同時に複数のサンプルに対して測定できる方法であり、さらにエバネッセント波と金属膜中の自由電子とが共鳴することによって生じる表面プラズモンの電場増強効果によってエバネッセント波が増強されるため、大きな蛍光信号を検出することができるとして広く用いられている。
【０００４】
上記したＳＰＦＳ測定では、一般的に所定領域に金属膜を形成した誘電体プリズムをセンサチップとして用いている（特許文献１）。現在、誘電体プリズムは、ガラスに比べて安価かつ成型が容易なプラスチック製のものも多く用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−９６６０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＰＦＳ測定において検出限界を決めているのは、（i）背景光（装置の遮光漏れなど）、（ii）測定光の散乱光、（iii）測定光の散乱光に起因する光学系の自家蛍光、（iv）センサチップの自家蛍光で形成される蛍光標識に起因しないバックグラウンド光である。（i）の影響は装置設計で比較的容易に低減可能であり、また（ii）の影響も測定光カットフィルタを挿入することで容易に低減できる。（iv）の影響は、センサチップ上の金属膜を介して励起を行うため比較的小さい。
【０００７】
しかしながら、センサチップにコストをかけられない検体検査用途では、成形工程中に生じるキズや突起構造（研磨痕）のないセンサチップの安定製造が困難であるため、上記（iii）の影響を回避することは難しい。これは、金属膜を形成する面（金属膜形成面）の研磨痕の部分から測定光の一部が漏れることによってノイズの上昇を招いていることによる。
特に、ＳＰＦＳ測定の”金属膜近傍の信号のみ強く励起する”という特性を活かし、洗浄を行わずに蛍光検出を行い、蛍光信号の変化量（レート）から被検出物質の量を検出するホモジーニアスアッセイ系においては、（v）測定光の散乱光に起因する浮遊標識からの蛍光の影響も加わり、より深刻な問題である。
【０００８】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、エバネッセント波を利用した試料中の物質の検出において、研磨に起因して金属膜形成面に生じる研磨痕により、測定光が漏れるのを防止し、より定量性の高い検出を可能とする全反射照明型センサチップ、その製造方法およびそれを用いたセンシング方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、本発明に係る全反射照明型センサチップは、
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、
上記一面である金属膜形成面の領域であって金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであることを特徴とするものである。
【００１０】
ここで、「被検出物質を検出する」とは、被検出物質の存在の有無を含み定性的な量のみならず、定量的な量、および活性の程度を検出することも意味するものとする。
【００１１】
「金属膜形成面」とは、金属膜が形成される誘電体プリズムの一面を意味するものとする。
【００１２】
「研磨痕」とは、研磨に起因して誘電体プリズムの金属膜形成面上に形成される痕跡キズ或いは痕跡構造を意味するものとする。つまり研磨痕は、直接金属膜形成面を研磨することにより形成される痕跡キズのみではなく、成型用の型を研磨することにより形成される研磨痕が成型工程により転写された痕跡構造も含むものである。この場合、通常前者の研磨痕は筋状（細長く一続きになっている形状）の凹構造となり、後者の研磨痕は筋状の凸構造となる。
【００１３】
研磨痕が「一の方向に指向性を有する」とは、研磨痕がほぼ一の方向に沿って形成されていることを意味する。つまり、複数の研磨痕が完全に平行状態のまま一の方向に沿って形成されていることのみならず、実質的な作用効果が得られる程度に複数の研磨痕が交わりながら全体として一の方向に沿って形成されていることも含むものとする。したがってより詳細には、本明細書内において「指向性を有する」とは、実施形態で詳細に述べる空間周波数分析法により算出された研磨痕の指向性の度合が、絶対値で３％以上
【００１４】
さらに、本発明に係る全反射照明型センサチップにおいて、
誘電体プリズムは、測定光を透過させるための透過面を有するものであり、
透過面は、この透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成されているものであることが好ましい。
【００１５】
ここで、「射影ベクトル」とは、金属膜形成面への射影成分を表すベクトルを意味するものとする。また、透過面について法線ベクトルの取り方は任意である。
【００１６】
研磨痕の指向性を表す「指向ベクトル」とは、実施形態で詳細に述べるように、空間周波数分析法により、研磨痕の画像の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）処理画像中におけるｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とから算出される、指向性の方向と程度を表すベクトルを意味するものとする。
【００１７】
「空間周波数分析法」とは、研磨痕の画像のＦＦＴ処理画像中におけるｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とから、研磨痕の指向性の度合を算出する方法を意味するものとする。算出の詳細については、実施形態にて詳細に後述する
【００１８】
「略平行となる」とは、完全な平行状態のみならず、実質的な作用効果が得られる程度に平行状態からずれた状態も含むことを意味するものとする。
【００１９】
そして、測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となることが好ましく、或いは、エバネッセント波および金属膜の共鳴により生じる表面プラズモンの伝播方向と、研磨痕が指向性を有する方向とが略平行となることが好ましい。
【００２０】
ここで、「測定光」とは、誘電体プリズムおよび金属膜の界面に入射する光を意味するものとする。
【００２１】
さらに、空間周波数分析法により算出した研磨痕の指向性の度合は、＋１０％以上であることが好ましい。
【００２２】
また、誘電体プリズムは、合成樹脂材料からなるものであることが好ましい。ここで、「合成樹脂材料からなる」とは、合成樹脂材料を主成分とするという意味であり、主成分とは重量比９０％以上含有されている成分をいう。
【００２３】
さらに、本発明に係る全反射照明型センサチップの製造方法は、
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成形し、
上記一面である金属膜形成面を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨することを特徴とするものである。
【００２４】
ここで、「成形」とは、材料を型にはめ込んで造形する成型、および型を用いない光成形等を含むものである。
【００２５】
そして、本発明に係る全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成形すると共に、測定光を透過させるための透過面を誘電体プリズムに形成し、
透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように、金属膜形成面を研磨することが好ましい。
【００２６】
また、空間周波数分析法により算出した研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、金属膜形成面を研磨することが好ましく、誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることが好ましい。
【００２７】
さらに、本発明に係る他の全反射照明型センサチップの製造方法は、
誘電体プリズムと、誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成型するための型の部分であって上記一面である金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、
上記型を用いて誘電体プリズムを成型することを特徴とするものである。
【００２８】
ここで、誘電体プリズムを成型するための型の部分であって「上記一面である金属膜形成面に対応する部分」とは、誘電体プリズムを成型するための型の部分であって、誘電体プリズムの成型において金属膜形成面の形成に関与する部分を意味するものとする。つまり、金属膜形成面に対応する部分とは、型の内側の部分のうち金属膜形成面と接する部分である。
【００２９】
そして、本発明に係る全反射照明型センサチップの製造方法において、
誘電体プリズムを成型すると共に、測定光を透過させるための透過面を、透過面の法線ベクトルの、金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することが好ましい。
【００３０】
また、空間周波数分析法により算出した研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、上記型の金属膜形成面に対応する部分を研磨することが好ましく、誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることが好ましい。
【００３１】
さらに、本発明に係るセンシング方法は、
金属膜が一面に形成された誘電体プリズム有する全反射照明型センサチップを用いて、金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、誘電体プリズムと金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して被検出物質を検出する検出方法において、
上記一面である金属膜形成面の領域であって金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであり、
上記指向性を表す指向ベクトルと、測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、測定光を上記界面に対し照射することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る全反射照明型センサチップおよびその製造方法は、測定光の金属膜形成面への射影成分方向と、金属膜形成面の研磨痕が有する指向性の方向とが略平行となるようにすることを特徴とするものである。これにより、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少し、研磨痕から漏れる測定光の量が減少する。この結果、漏れた測定光に起因する光学系の自家蛍光や浮遊標識からの蛍光を低減することができ、より定量性の高い検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】第１の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略上面図
【図１Ｂ】第１の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略断面図
【図２】第１の実施形態に係る全反射照明型センサチップの製造方法を示す図
【図３】研磨痕の微分干渉画像を撮像する装置を示す概略図
【図４Ａ】ｙ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像を示す図
【図４Ｂ】ｘ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像を示す図
【図４Ｃ】丸く研磨された研磨痕の微分干渉画像を示す図
【図５】第１の実施形態における画像処理ソフトの設定画面を示す図
【図６Ａ】ｙ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像のＦＦＴ画像を示す図
【図６Ｂ】ｘ軸に沿うように形成された研磨痕の微分干渉画像のＦＦＴ画像を示す図
【図６Ｃ】丸く研磨された研磨痕の微分干渉画像のＦＦＴ画像を示す図
【図７】ＦＦＴ画像における低周波数成分および高周波数成分を説明する図
【図８】ＦＦＴ画像から指向性を定量する際に抽出する領域の取り方を説明する図
【図９】研磨痕から測定光が漏れている現象を示す図
【図１０】研磨痕により全反射条件が満たされなくなる現象を説明する図
【図１１Ａ】第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略上面図
【図１１Ｂ】第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップを示す概略断面図
【図１２】第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップの製造方法を示す図
【図１３】第２の実施形態に係るセンサチップを用いた蛍光検出装置の概略図
【図１４】サンドイッチ法によるアッセイ手順を示す概略断面図
【図１５Ａ】実施例における検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比を示す図
【図１５Ｂ】比較例における検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比を示す図
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００３５】
「全反射照明型センサチップおよびその製造方法」
＜全反射照明型センサチップの第１の実施形態＞
まず、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ１の構成について説明する。図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ１の概略上面図および概略断面図である。ここで、図１Ｂは、図１ＡのＡＡ’における断面図である。ただし、視認しやすくするため、図中、各構成要素の縮尺等は実際のものとは適宜異ならせてある。
【００３６】
図１Ａおよび図１Ｂに示すように、全反射照明型センサチップＣ１は、誘電体プリズム１０と、誘電体プリズム１０上に形成される流路１３の側壁となる側壁材１１と、この流路１３の上面となるフタ材１２と、流路１３内の所定領域に形成された金属膜１４ａおよび１４ｂとを備えている。
【００３７】
誘電体プリズム１０は、被検出物質を含む試料等を流すための流路１３を形成するための基板となるものである。また、誘電体プリズム１０は、測定光が誘電体プリズムと金属膜との界面へ向けて進行する際に透過するように設けられた透過面１０ｂ（測定光が誘電体プリズム内に入射する際に通る誘電体プリズムの面）を有している。ただし、透過面１０ｂは必ずしもｚ−ｘ平面に対して傾いている必要はない。また、透過面１０ｂは必ずしも必要なものでもない。ここで、座標系は、図１Ａにおいて下向きをｘ軸、右向きをｙ軸、そして右手座標系を形成するように紙面垂直向きをｚ軸とするものである。つまり、照射され得る測定光Ｌの金属膜形成面１０ａ（金属膜が形成されている誘電体プリズムの一面）への射影成分の向きをｙ軸、金属膜形成面１０ａに対して垂直上方をｚ軸、そして右手座標系を形成するようにｘ軸をとっている（以下、本明細書において特に説明のない限り、座標系は上記の座標系とする。）。また、透過面１０ｂは、この透過面１０ｂの法線ベクトルの、金属膜形成面１０ａへの射影成分の向きと、ｙ軸（後述する、研磨痕の指向性を表す指向ベクトル）とが略平行となるように形成されているものであることが好ましい。誘電体プリズム１０の材料は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。誘電体プリズム１０は、合成樹脂（プラスチック）材料から形成されたものが好ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）、ＺＥＯＮＥＸ（日本ゼオン社）等の合成樹脂材料を用いることがより好ましい。そして、金属膜形成面１０ａは、研磨痕がｙ軸に沿うように研磨されている。
【００３８】
流路１３は、誘電体プリズム１０上に形成された側壁材１１とこの側壁材１１上に装着されたフタ材１２から形成されている。さらに、流路１３の両端には液下用或いは廃液用の液溜めが形成されている。また、流路１３の所定領域には、検出部となる金属膜１４ａ・１４ｂが形成されている。本実施形態では、測定用の検出部として金属膜１４ａを、リファレンス用の検出部として金属膜１４ｂを設けている。ただし、検出部は、測定用の検出部が１つあればよく、上記のようなリファレンス用の検出部は必ずしも必要ではない。金属膜１４ａ・１４ｂの材料としては、特に制限されるものではなく、例えばプラズモンを効率よく誘起する観点から、Ａｕ，Ａｇ，Ｃｕ，Ｐｔ，Ｎｉ，Ｔｉ等が挙げられ、電場増強効果の高いＡｕ，Ａｇ等が特に好ましい。金属膜１４ａ・１４ｂの厚みは、金属膜１４ａ・１４ｂの材料と、測定光の波長により表面プラズモンが強く励起されるように適宜定めることが好ましい。例えば、測定光として７８０ｎｍに中心波長を有するレーザ光を用い、金属膜１４ａ・１４ｂとして金（Ａｕ）膜を用いる場合、金属膜１４ａ・１４ｂの厚みは５０ｎｍ±５ｎｍが好適である。金属膜は、所定領域に開口を有するマスクを流路上に形成し、既知のスパッタ法・蒸着法等により成膜形成することができる。
【００３９】
側壁材１１は、誘電体プリズム１０上に幅を設けて形成することにより、流路１３の側壁を形成するためのものである。例えば、シール材として貼り付けることにより用意に形成することができる。側壁材１１は、流路１３の両端に液下用或いは廃液用の液溜めとしての空間を確保するために、流路１３の幅よりも広くなるような空間を有するように形成されている。また、フタ材１２は、上記側壁材１１上に装着することにより流路１３の上面を形成するためのものである。フタ材１２は、液下用の液溜めに接続する試料等を流下するための注入口１５ａ、および廃液用の液溜めに接続する空気等を抜くための空気孔１５ｂを有している。側壁材１１およびフタ材１２の材料としては、前述した誘電体プリズム１０と同様の材料を用いることができる。また、側壁材１１およびフタ材１２が一体となっている形状のギャップカバーグラスや成型分品等を用いることもできる。
【００４０】
次に、全反射照明型センサチップＣ１の製造方法について、図２を用いて説明する。
全反射照明型センサチップＣ１の製造方法は、まず成形によりセンサチップの基板となる誘電体プリズム１０を形成し（図２Ａ）、誘電体プリズム１０の金属膜形成面１０ａを研磨痕がｙ軸に沿うように研磨材５０で図中の矢印方向へ研磨し（図２Ｂ）、流路の側壁を形成するように金属膜形成面１０ａ上に側壁材１１を配置し（図２Ｃ）、流路の所定領域に金属膜１４ａおよび１４ｂを形成し（図２Ｄ）、フタ材１２を側壁材１１上に装着する（図２Ｅ）ものである。
【００４１】
誘電体プリズム１０の成形は、特に制限されるものではなく、通常用いられる射出成型や光成形等によって実施することができる。また、市販の誘電体プリズムを使用することも可能である。
【００４２】
金属膜形成面１０ａの研磨は、研磨痕がｙ軸に沿うように、つまり研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するように行う。この研磨は、最終的に研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するようになっていればよいため、例えば最初は円を描きながら全体的に均一に研磨し、その後ｙ軸に沿って研磨するようにしてもよい。ここで、研磨を行う研磨材５０は特に制限されるものではない。例えば、樹脂用の研磨剤として市販されている、柳瀬株式会社製樹脂研磨剤２４Ｐ（商品名）や株式会社光陽社製ダンジーＤ−４９１（商品名）などを用い必要な時間手研磨することができ、さらには株式会社光陽社製樹脂用コンパウンド サンライトＫＦＦ−Ｗなどをポリッシャに取り付け研磨することもできる。
【００４３】
研磨痕の指向性は下記に示す空間周波数分析法により数値化し定義する。
【００４４】
（１）金属膜形成面の研磨痕の微分干渉画像を撮影する。
図３は、研磨痕の微分干渉画像（以下、単に画像と言う。）を撮像するために用いた装置を示す。ここで、顕微鏡はオリンパス株式会社製ＢＸ５１ＷＩ（商品名）であり、対物レンズはオリンパス株式会社製ＬＭＰｌａｎＦＩ×５０（商品名）であり、ＣＣＤは株式会社フローベル製ＡＤＴ−１００（商品名）である。ＣＣＤには、画像の保存および処理を行うためのパーソナルコンピューター（ＰＣ）が接続されている。そして、上記装置を用いて研磨痕の画像を撮像すると、例えば図４Ａ〜Ｃに示すような画像が得られる。図４Ａのｉｍａｇｅ−Ａは研磨痕がｙ軸に沿うように研磨された誘電体プリズムの画像であり、図４Ｂのｉｍａｇｅ−Ｂは研磨痕がｘ軸に沿うように研磨された誘電体プリズムの画像であり、図４Ｃのｉｍａｇｅ−Ｃは丸く研磨された誘電体プリズムの画像である。
【００４５】
（２）研磨痕の画像に高速フーリエ変換処理を行う。
次に、（１）で得たそれぞれの画像に対して高速フーリエ変換（ＦＦＴ）処理を行いそれぞれの研磨痕のＦＦＴ画像を得る。ＦＦＴ処理は、画像処理ソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅを用いて行う。ここで、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅの設定画面において単位を実寸に設定しておく必要がある。例えば図５は、（１）で得た画像のサイズが、視野：１００ｕｍ角、ｐｉｘｅｌ：５１２×５１２の場合における設定を示す。画像をＦＦＴ処理すると図６Ａ〜Ｃに示すようなＦＦＴ画像が得られる。ＦＦＴ−Ａ、ＦＦＴ−ＢおよびＦＦＴ−Ｃは、それぞれｉｍａｇｅ−Ａ、ｉｍａｇｅ−Ｂおよびｉｍａｇｅ−ＣについてのＦＦＴ画像である。ＦＦＴ画像は、元になる画像中に含まれる周波数成分のパワー（絶対値の二乗）を濃淡で表したものであり、ＦＦＴ画像の中心に近いほど低周波数成分のパワーを表し、逆にＦＦＴ画像の中心から離れるほど高周波数成分のパワーを表している（図７）。
【００４６】
（３）ＦＦＴ画像からｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とを定量し、研磨痕の指向性の度合を算出する。
例えば、ＦＦＴ画像のｋｘ軸の近傍の濃度は、画像中のｘ軸方向に周期的な構造が存在することを示唆し、また同様にＦＦＴ画像のｋｙ軸の近傍の濃度は、画像中のｙ軸方向に周期的な構造が存在することを示唆している。つまり、ＦＦＴ画像のｋｘ軸の近傍に濃度が集中する場合は、画像中のｙ軸に沿った構造の存在を表し、また同様にＦＦＴ画像のｋｙ軸の近傍に濃度が集中する場合は、画像中のｘ軸に沿った構造の存在を表している。ここでｋｘ軸およびｋｙ軸は、ＦＦＴ画像における空間周波数での座標を表し、図８に示すようにＦＦＴ画像の右向きおよび上方を、それぞれｋｘ軸およびｋｙ軸としている。本発明では、ＦＦＴ画像のｋｘ軸近傍領域の濃度とｋｙ軸近傍領域の濃度とを抽出および数値化し、この数値化されたそれぞれの濃度から研磨痕の指向性の度合を定義する。ここでｋｘ軸近傍領域とは、ｋｘ軸の値の大きさが０．５ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上、かつｋｙ方向は１０ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上の領域（図８中の領域Ｘ）とし、ｋｙ軸近傍領域とは、ｋｙ軸の値の大きさが０．５ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上かつｋｘ方向は１０ｕｍ／ｃｙｃｌｅ以上の領域とする。０．５ｕｍ／ｃｙｃｌｅよりも低周波数成分としたのは、経験上０．５ｕｍ以上の幅を持った研磨痕から光が漏れていることに基づく。ＦＦＴ画像は、画像の中心でシンメトリとなっている（図７）ため、各軸のプラス側のみを定量してもいいが、本明細書では両方の濃度を定量するものとして説明する。
【００４７】
そして、研磨痕の実空間における指向性の度合を次のように定義する。
研磨痕の指向性の度合（％）＝（領域Ｘの濃さ（％））−（領域Ｙの濃さ（％））
ここで、領域Ｘの濃さ（％）とは、（領域Ｘの平均濃度−全体領域の平均濃度）／（全体領域の平均濃度）×１００であり、領域Ｙの濃さ（％）とは、（領域Ｙの平均濃度−全体領域の平均濃度）／（全体領域の平均濃度）×１００である。また、「全体領域」とはＦＦＴ画像の全領域を指すが、必ずしもこれに限られるものではなく、「全体領域」は領域Ｘおよび領域Ｙを含むように全体的に広く指定した領域としてもよい。各領域の平均濃度は、画像処理ソフトＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅの機能を用いて定量することができる。上記の研磨痕の指向性の度合は、その数値がプラスであれば実空間のｘ軸よりもｙ軸に沿った構造が多いこと、つまり研磨痕がｙ軸方向へ指向性を有することを示す。また逆にこの度合は、その数値がマイナスであれば実空間のｙ軸よりもｘ軸に沿った構造が多いこと、つまり研磨痕がｘ軸方向へ指向性を有することを示す。
【００４８】
例えば、図６Ａ〜Ｃに示す３つのＦＦＴ画像に対して上記空間周波数分析法を適用して指向性の度合を定量するとそれぞれ下記表１のようになる。
【表１】
【００４９】
ＦＦＴ−Ａは、図４Ａのｉｍａｇｅ−Ａの画像についてのＦＦＴ画像であるため、その研磨痕のｙ軸方向への指向性は１３．７％と高くなっている。また、ＦＦＴ−Ｂは、ｉｍａｇｅ−Ｂの画像についてのＦＦＴ画像であるため、その研磨痕のｘ軸方向への指向性は８．７％と高くなっている。そして、ＦＦＴ−Ｃは、ｉｍａｇｅ−Ｃが丸く磨いた場合の研磨痕を示すものであるため、その指向性は小さくなっている。指向性の度合は、測定感度の観点から＋５％以上あることが好ましく、＋１０％以上あることがより好ましい。ここで、本発明において上記指向性の度合の大きさおよびその指向性の向きを持つベクトルを指向ベクトルという。つまり、＋１０％の指向性については、１０という値を持つｙ軸方向へのベクトルを対応させることができる。
【００５０】
以下、本発明に係るセンサチップの作用について説明する。
本出願人は、誘電体プリズムの金属膜形成面に研磨痕が存在すると、図９に示すようにｘ軸に沿った研磨痕から測定光が漏れるという現象を発見した。図９は、金属膜形成面の下方（誘電体プリズムの内部）において測定光を全反射させて、その様子を金属膜形成面の上方（誘電体プリズムの外部）から観察した様子である。図９中にはｙ軸に沿った研磨痕も存在しているが、ｘ軸に沿った研磨痕から測定光が漏れているのがはっきりと示されている。これは、図１０に示すように、研磨痕５２が存在する部分において測定光Ｌが金属膜形成面１０ａでの全反射条件を満たさなくなることに起因していると考えられる。このように測定光Ｌが全反射条件を満たさなくなるのは、図１０から分かるように測定光Ｌの金属膜形成面１０ａへの射影成分の方向（ｙ軸方向或いはエバネッセント波の進行方向）と研磨痕５２の方向（ｘ軸方向）とがほぼ垂直となっているためである。したがって、本発明に係るセンサチップでは、測定光Ｌの金属膜形成面１０ａへの射影成分を表す射影ベクトルと、研磨痕５２の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することにより、測定光Ｌが金属膜形成面１０ａでの全反射条件を満たさなくなることを防止し、測定光が漏れるという問題を解消することができる。
【００５１】
以上のように、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ１は、測定光の金属膜形成面への射影成分方向と、金属膜形成面の研磨痕が有する指向性の方向とが略平行となるようにすることを特徴とするものである。これにより、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少し、研磨痕から漏れる測定光の量が減少する。この結果、漏れた測定光に起因する光学系の自家蛍光や浮遊標識からの蛍光を低減することができ、より定量性の高い検出が可能となる。
【００５２】
さらに、本発明に係るセンサチップＣ１によれば、研磨痕から測定光が漏れることを防止すると共に、表面プラズモンのエネルギーが漏れ出る測定光と共に逃げていくことも防止することができる。例えば波長６３０ｎｍの測定光を金（Ａｕ）膜と水との界面に照射した場合、１点に全反射条件を満たさない領域が存在すると、そのプラズモン伝播長に相当する周囲半径３ｕｍ内の金膜内に蓄えられていた表面プラズモンのエネルギーがその１点から逃げてしまうということが知られている（”Surface plasmon resonance sensors: review”, Sensors and Actuators B: Chemical, Vol. 54, No. 1-2. (25 January 1999), pp. 3-15）。さらに、波長が８５０ｎｍの場合には、その半径は２４ｕｍにもなる。つまりこれは、全反射条件を満たさない領域以上の大きい領域から蓄えられていた表面プラズモンのエネルギーが逃げることにより、表面プラズモンによる電場増強の効果も大きく減少することを意味する。したがって、本発明に係るセンサチップＣ１によれば、表面プラズモンのエネルギーが漏れ出る測定光と共に逃げていくことも防止することができるため、表面プラズモンによる電場増強の効果を効率よく利用することができる。その結果、信号光（標識の蛍光等）を効率よく検出することができ、より高感度の測定を行うことができる。
【００５３】
＜全反射照明型センサチップの第２の実施形態＞
まず、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２の構成について説明する。図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれ本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２の概略上面図および概略断面図である。ここで、図１１Ｂは、図１１ＡのＢＢ’における断面図である。全反射照明型センサチップＣ２は、第1の実施形態に係るセンサチップＣ１と同様の構成であるが、型を用いた成型によって誘電体プリズム２０に直接流路（上面を除く）が形成されるという点でセンサチップＣ１と大きく異なる。したがって、センサチップＣ１と同様の構成要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。
【００５４】
図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、全反射照明型センサチップＣ２は、誘電体プリズム２０と、誘電体プリズム２０に形成された流路２３（溝）と、この流路２３を塞ぐように配置されたフタ材２２と、流路２３内の所定領域に形成された金属膜２４ａおよび２４ｂとを備えている。
【００５５】
次に、全反射照明型センサチップＣ２の製造方法について、図１２を用いて説明する。
センサチップＣ２の製造方法は、まず成型用の型６０を用意し、この型６０の部分であって金属膜が形成される上記一面である金属膜形成面２０ａ（流路の底面）に対応する部分６２を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨材５０で図中の矢印方向へ研磨し（図１２Ａ）、この型６０を用いてセンサチップの基板となる誘電体プリズム２０を成型し（図１２Ｂ）、流路２３の所定領域に金属膜２４ａおよび２４ｂを形成し（図１２Ｃ）、フタ材２２を誘電体プリズム２０上に装着する（図１２Ｄ）ものである。
【００５６】
成型用の型６０は、例えばＪＩＳ規格（日本工業規格）ＳＫＤ−１１、ＳＫＤ−６１等のダイス鋼からなる焼入型金型である。例えば、大同特殊鋼株式会社製ＤＣ１１（商品名）、日立金属株式会社製ＳＬＤ（商品名）、日本高周波鋼業株式会社製ＫＤ１１（商品名）等がこれに該当する。
【００５７】
型６０の研磨は、転写により生じる誘電体プリズムの研磨痕がｙ軸に沿うように、つまりこの研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するように行う。より詳細には例えば型６０の研磨は、フライス盤を用いた平フライスを行う或いは平削り盤を用いたフライス削りを行った後、平面研削盤を用いた平面研削を行い、その後超仕上を行い、最後の仕上げとしてラッピングを手作業で行うことにより実施する。「超仕上」とは、細かい砥粒の砥石を低い圧力で加工物表面に押し付けて加工物表面に平行な細かい振動(オシレーション)を与え、加工物を研磨方向と垂直な方向に動かすと同時に、優れた洗浄性を持つクーラントオイルを多量に注ぎながら、微細な切削を行わせて、滑らかに表面を仕上ると共に精度の高い仕上面を得る加工方法である。例えば、砥石の大きさ１５×１５ｍｍ、押し付け圧力０．２５ＭＰａ、砥石の振動数３０Ｈｚ、砥石の振動の幅（振幅の２倍）２ｍｍ、加工物の送り速さ２８ｍ／ｍｉｎの条件下で、３０秒間超仕上を行えばその研磨面を１ｕｍ以下の凹凸に仕上げることができる。ラッピングは、ラップ材（細かい目のやすり）に加工面を接触させて、その研磨痕が一の方向に指向性を有するように実施する。ここで、この一の方向は、型６０の研磨痕が転写されることにより生じる誘電体プリズムの研磨痕がｙ軸に沿うように選択される。ラップ材は、粗い目（粒度３００）のものから細かい目（粒度１０００）のものまで粒度を上げていくことが好ましい。
【００５８】
本実施形態のセンサチップＣ２は、流路２３に対して垂直方向がｙ軸となるため、流路２３の底面２０ａに対応する部分の研磨も、その流路２３の底面２０ａに転写される研磨痕が流路２３と垂直になるように行う。この研磨は、第１の実施形態と同様に、最終的に研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するようになっていればよいため、例えば最初は円を描きながら全体的に均一に研磨し、その後流路の底面に転写される研磨痕が流路と垂直になるように研磨してもよい。
【００５９】
本実施形態に係るセンサチップＣ２の研磨痕は、型の研磨痕が転写されたものであるという点で、第１の実施形態に係るセンサチップＣ１の研磨痕と大きく異なる。つまり、センサチップＣ１の研磨痕は、誘電体プリズム１０が削られた構造（筋状の凹構造）となり、センサチップＣ２の研磨痕は、誘電体プリズム２０に盛られた構造（筋状の凸構造）となる。しかしながら、センサチップＣ２のような研磨痕であっても、測定光が漏れるという問題については第１の実施形態と同様に議論できる。つまり、センサチップＣ２についても、研磨痕がｙ軸方向に指向性を有するようにすることで、研磨痕から測定光が漏れることを防ぐことができる。また、センサチップＣ２の研磨痕についても、第１の実施形態で説明した空間周波数分析法を同様に適用することにより、その研磨痕の指向性の度合を定義することができる。
【００６０】
以上のように、本実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２は、成型用の型の部分であって金属膜が形成される金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、測定光の金属膜形成面への射影成分方向と、金属膜形成面の研磨痕が有する指向性の方向とが略平行となるようにすることを特徴とするものである。これにより、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少すると共に、表面プラズモンのエネルギーを効率よく利用することができ、第１の実施形態と同様の効果を得ることが可能である。
【００６１】
「センシング装置およびセンシング方法」
図１３は、第２の実施形態に係るセンサチップＣ２を用いた蛍光検出装置の概略図である。なお、本発明に係るセンサチップを用いるセンシング装置は、これに限られるものではない。
【００６２】
図示の通り、この蛍光検出装置１００は、前述した第２の実施形態例に係る全反射照明型センサチップＣ２と、蛍光標識Ｆを励起する波長６５７ｎｍの測定光Ｌを発する光源１２１と、センサチップＣ２上に供給された蛍光標識Ｆから発せられる蛍光Ｌｆ等を検出する光検出器１３０と、光検出器１３０に蛍光等を導光するように配置された２つの平凸レンズ１２４と、２つの平凸レンズ１２４の間に配置された、増強電場Ｅｗの散乱光Ｌｓは遮断しかつ蛍光Ｌｆは透過させる光学フィルタ１２３と、光検出器１３０が接続されたデータ処理部１４０からなる。ここで、光源１２１は、センサチップＣ２上で増強電場Ｅｗを生じせしめるようにセンサチップＣ２の下方に配置されており、蛍光標識Ｆは、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜２４ａに固定されている。また、図１３中の符号１２５は、２つの平凸レンズ１２４と光学フィルタ１２３とを含み、光検出器１３０が装着されている光学系保持部である。
【００６３】
光源１２１は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また、光源１２１は、前述のように、センサチップＣ２の誘電体プリズムと金属膜との界面で、測定光Ｌが全反射すると共に金属膜で表面プラズモン共鳴する共鳴角で入射するように配置されている。ここで、光源１２１とセンサチップＣ２との間に必要に応じて導光部材を配置してもよい。本発明では、指向性を表す指向ベクトルと、測定光Ｌの金属膜形成面２０ａへの射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、測定光Ｌを誘電体プリズム２０と金属膜２４ａとの界面に対し照射する。なお、測定光Ｌは、表面プラズモンを誘起するようにＰ偏向で界面に対して入射させることが好ましい。
【００６４】
光検出器１３０は、試料Ｓ中に含まれる蛍光標識Ｆが発する蛍光Ｌｆを定量的に検出するものであればよく、検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。また、光検出器１３０は、検出条件に応じて光学フィルタや分光器等の分光手段と組み合わせて用いることができる。ここで、エバネッセント波の散乱光Ｌｓは遮断しかつ蛍光Ｌｆは透過させる光学フィルタ１２３を、２つの平凸レンズ１２４の間に配置することにより、ノイズを抑えて効率よく蛍光Ｌｆを検出することができる。すなわち、蛍光Ｌｆを散乱光Ｌｓと分離して測定することができる。なお、このエバネッセント波の散乱光Ｌｓと、前述した研磨痕から漏れた測定光とは異なるものである。そして、光学系保持部１２５は、２つの平凸レンズ１２４、光学フィルタ１２３および光検出器１３０を備えるものとして、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）等を好適に用いることができる。
【００６５】
データ処理部１４０は、光検出器１３０によって検出された蛍光信号等のデータを処理する役割を果たす。具体的にはパーソナルコンピュータが挙げられる。なお、上記データ処理と同様の役割を果たせば、特にパーソナルコンピュータに制限されず他の電子計算機等を用いてもよい。
【００６６】
以下、上記蛍光検出装置１００を用いて、被検出物質としての抗原Ａを含む試料から、抗原Ａを検出する場合における蛍光検出方法について、図１４を用いて説明する。
【００６７】
今、被検出物質としての抗原Ａを含む試料から、抗原Ａを検出する場合を考える。
本実施形態による蛍光検出方法は、後述するサンドイッチ法によるアッセイを行うことによって、１次抗体Ｂ１、抗原Ａおよび２次抗体Ｂ２を介して金属膜２４ａ上に蛍光標識Ｆを固定し、次に光源１２１より発せられる測定光Ｌを、センサチップＣ２の誘電体プリズムと金属膜との界面に対して全反射角以上の特定の入射角度となるように、かつ金属膜形成面の研磨痕の指向性を表す指向ベクトルと、この測定光の金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように入射して、エバネッセント波を励起し、このエバネッセント波と金属膜２４ａ中の自由電子とを共鳴させることにより金属膜２４ａ中に表面プラズモンを発生させ、この表面プラズモンによる増強電場Ｅｗで蛍光標識Ｆを励起して蛍光Ｌｆを生じせしめ、この蛍光Ｌｆを光検出器１３０で検出して、その蛍光量をデータ処理部１４０でデータ処理するものである。
【００６８】
ここで、以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識Ｆであるが、この蛍光標識Ｆは抗原Ａがなければ金属膜２４ａ上に固定されないものと考えて、この蛍光標識Ｆの存在を確認することにより、間接的に抗原Ａの存在を確認している。
【００６９】
１次抗体Ｂ１は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原がＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原と特異的に結合するモノクロナール抗体（２次抗体Ｂ２と少なくともエピトープが異なる）等を用いることができ、既存の技術を用いて金属膜２４ａ上に固定することができる。
【００７０】
蛍光標識Ｆは、測定光Ｌによって励起されて所定波長の蛍光Ｌｆを発するものであり、特に制限なく、測定条件（被検出物質や励起光の波長）に応じて適宜選択することができる。例えば、測定光Ｌの波長が６５０ｎｍ程度の場合、Ｃｙ５色素（蛍光：６８０ｎｍ、蛍光量子収率：０．３）等を用いることができる。
【００７１】
増強電場Ｅｗは、金属膜２４ａ中に発生する表面プラズモンによって形成される電場であって、金属膜２４ａ上の局所的な領域に発生する、通常のエバネッセント波よりも増強された電場である。この増強電場Ｅｗによって、標識から発せられる蛍光等の信号の強度を増幅することができる。表面プラズモンは、エバネッセント波と金属膜２４ａ中の自由電子とを共鳴させることにより金属膜２４ａ中に発生せしめられる。
【００７２】
蛍光標識Ｆを金属膜２４ａに固定するためのサンドイッチ法によるアッセイは、以下に示す手順により行われる。血液（全血）中に被検出物質である抗原を含むか否について、サンドイッチ法によるアッセイを行う場合について図１４を参照して説明する。また、以下の手順において、標識２次抗体ＢＦ（２次抗体Ｂ２と蛍光標識Ｆとの結合物質）が流路２３の検出部上流側に乾燥状態で配置されたセンサチップＣ２を用いている。
ｓｔｅｐ１：注入口２５ａから検査対象である血液（全血）Ｓｏを注入する。ここでは、この血液Ｓｏ中に被検出物質である抗原Ａが含まれている場合について説明する。図１４において血液Ｓｏは網掛け領域で示している。
ｓｔｅｐ２：血液Ｓｏはメンブレンフィルタ２６により濾過され、赤血球、白血球などの大きな分子が残渣となる。引き続き、メンブレンフィルタ２６で血球分離された血液Ｓ（血漿）が毛細管現象で流路２３に染み出す。または反応を早め、検出時間を短縮するために、空気孔にポンプを接続し、血漿Ｓをポンプの吸引、押し出し操作によって流下させてもよい。図１４において血漿Ｓは斜線領域で示している。
ｓｔｅｐ３：流路２３に染み出した血漿Ｓと、流路２３の検出部上流側に乾燥状態で配置された標識２次抗体ＢＦとが混ぜ合わされ、血漿Ｓ中の抗原Ａが標識２次抗体ＢＦと結合する。
ｓｔｅｐ４：血漿Ｓは流路２３に沿って空気孔２５ｂ側へと徐々に流れ、標識２次抗体ＢＦと結合した抗原Ａが、測定用のセンサ部２８上に固定されている１次抗体Ｂ１と結合し、抗原Ａが１次抗体Ｂ１と標識２次抗体ＢＦで挟み込まれたいわゆるサンドイッチが形成される。
ｓｔｅｐ５：結合しなかった標識２次抗体ＢＦの一部は、リファレンス用の検出部２９上に固定されている１次抗体Ｂ０と結合する。さらに、１次抗体Ｂ０と結合しなかった標識２次抗体ＢＦが検出部上に残っている場合があっても、後続の血漿が洗浄の役割を担い、検出部上に浮遊している標識２次抗体ＢＦを洗い流す。
【００７３】
このように、血液を注入口から注入し、抗原が１次抗体および２次抗体と結合するまでのｓｔｅｐ１からＳｔｅｐ５の後、前述したように上記の蛍光検出装置１００において、測定用の検出部２８からの検出信号を検出することにより、抗原の有無および／またはその濃度を高感度に検出することができる。その後、リファレンス用の検出部２９からの検出信号を検出できるようにセンサチップＣ２を移動させ、同様に、リファレンス用の検出部２９からの検出信号を検出する。標識２次抗体ＢＦと結合する１次抗体Ｂ０を固定しているリファレンス用の検出部２９からの検出信号は、標識２次抗体ＢＦの流下した量、活性などの反応条件を反映した検出信号であると考えられる。したがって、この検出信号をリファレンスとして、測定用の検出部からの検出信号を補正することにより、より精度の高い検出結果を得ることができる。また、リファレンス用の検出部２９に既知量の標識物質（蛍光物質、金属微粒子等）をあらかじめ固定しておき、リファレンス用の検出部２９からの信号をリファレンスとして測定用の検出部からの検出信号を補正してもよい。
【００７４】
ここで、前述のホモジーニアスアッセイの場合、上記ｓｔｅｐ５は行わずに、検出を行う。また、抗原抗体反応終了後に測定を行うエンドポイント法について実施例を挙げたが、蛍光検出方法は、反応中（ｓｔｅｐ４中）に一定時間間隔で測定を行い、蛍光信号の変化量を測定するレート法等の方法でもよい。
【００７５】
以上のように、上記蛍光検出装置および蛍光検出方法では、全反射照明型センサチップとして、本発明に係る全反射照明型センサチップＣ２を用いている。したがって、誘電体プリズムと金属膜との界面における全反射条件を測定光が満たさなくなる領域が減少すると共に、表面プラズモンのエネルギーを効率よく利用することができ、より高感度の測定が可能となる。
【実施例】
【００７６】
＜実施例＞
第２の実施形態に係る全反射照明型センサチップＣ２（誘電体プリズムの材料：ＰＭＭＡ、金属膜：Ａｕの蒸着膜、金属膜の厚さ：５０ｎｍ、研磨痕：ｙ軸方向に指向性を有する（図４Ａ））を用い、抗原としてｈＣＧ（抗原濃度：９０ｐＭ）、抗体として抗ｈＣＧを反応させ、２次反応後ＰＢＳで洗浄し、図１３に示す蛍光検出装置によりセンシング測定を行った。その結果、図１５Ａに示すような検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比が得られた。
【００７７】
＜比較例＞
研磨痕がｘ軸方向に指向性を有する（図４Ｂ）点以外は実施例のセンサチップＣ２と同じ条件のセンサチップを用い、実施例と同様のセンシング測定を行った。その結果、図１５Ｂに示すような検出信号全体に対する信号光およびノイズの構成比が得られた。
【００７８】
＜評価＞
図１５ＡおよびＢにおけるＮｏｉｓｅ中のｎ１は標識の非特異的吸着によるノイズを表し、ｎ２は装置或いは光学系の自家蛍光によるノイズを表し、そしてｎ３は電子機器を扱う際に生じる電子的なノイズを表している。実施例では、上記のｎ２を低減することができることが実証された。また全体的にも、実施例では検出信号全体に対するノイズの構成比が約２６％であるのに対し、比較例ではそれが約３３％となっていることから、本発明に係るセンサチップＣ２を用いることによりノイズを低減できていることがわかる。実施例および比較例のＳ／Ｎ比は、それぞれ２．８および２．０である。これは、測定系の検出限界が（Ｓ／Ｎ比＞０．０３）という場合には、実施例では１ｐＭまで、比較例では１．５ｐＭまで測定可能であることを示している。したがって、実施例では検出限界が１．５倍改善されたことが立証された。また、実施例および比較例においてＰＢＳでの洗浄を行わない場合には、サンドイッチを形成していない浮遊標識を研磨痕から漏れた測定光が励起してしまうため、それぞれのＳ／Ｎ比の差が大きくなった。具体的には、実施例（洗浄なし）では検出限界が２倍改善された。
【符号の説明】
【００７９】
Ａ 抗原
Ｃ１ 全反射照明型センサチップ
Ｃ２ 全反射照明型センサチップ
Ｅｗ 増強電場
Ｆ 蛍光標識
Ｌ 測定光
Ｌｆ 蛍光
Ｌｓ 散乱光
１０ 誘電体プリズム
１０ａ 金属膜形成面
１０ｂ 透過面
１１ 側壁材
１２ フタ材
１３ 流路
１４ａ・１４ｂ 金属膜
１５ａ・２５ａ 注入口
１５ｂ・２５ｂ 空気孔
２０ 誘電体プリズム
２０ａ 金属膜形成面
２２ フタ材
２３ 流路
２４ａ・２４ｂ 金属膜
２６ メンブレンフィルタ
５０ 研磨材
５２ 研磨痕
６０・６１ 成型用の型
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜上に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、
前記一面である金属膜形成面の領域であって前記金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであることを特徴とする全反射照明型センサチップ。
【請求項２】
前記誘電体プリズムが、前記測定光を透過させるための透過面を有するものであり、
前記透過面が、該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成されているものであることを特徴とする請求項１に記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項３】
前記測定光の前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となることを特徴とする請求項１または２に記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項４】
前記エバネッセント波および前記金属膜の共鳴により生じる表面プラズモンの伝播方向と、前記研磨痕が指向性を有する方向とが略平行となることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項５】
空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上であることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項６】
前記誘電体プリズムが、合成樹脂材料からなるものであることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項７】
誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
前記誘電体プリズムを成形し、
前記一面である金属膜形成面を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨することを特徴とする全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項８】
前記誘電体プリズムを成形すると共に、前記測定光を透過させるための透過面を該誘電体プリズムに形成し、
該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように、前記金属膜形成面を研磨することを特徴とする請求項７に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項９】
空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、前記金属膜形成面を研磨することを特徴とする請求項７または８に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１０】
前記誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることを特徴とする請求項７から９いずれかに記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１１】
誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
前記誘電体プリズムを成型するための型の部分であって前記一面である金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、
前記型を用いて前記誘電体プリズムを成型することを特徴とする全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１２】
前記誘電体プリズムを成型すると共に、前記測定光を透過させるための透過面を、該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することを特徴とする請求項１１に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１３】
空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、前記型の前記金属膜形成面に対応する部分を研磨することを特徴とする請求項１１または１２に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１４】
前記誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることを特徴とする請求項１１から１３いずれかに記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１５】
金属膜が一面に形成された誘電体プリズム有する全反射照明型センサチップを用いて、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法において、
前記一面である金属膜形成面の領域であって前記金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであり、
前記指向性を表す指向ベクトルと、前記測定光の前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、前記測定光を前記界面に対し照射することを特徴とするセンシング方法。
【請求項１】
誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜上に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップにおいて、
前記一面である金属膜形成面の領域であって前記金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであることを特徴とする全反射照明型センサチップ。
【請求項２】
前記誘電体プリズムが、前記測定光を透過させるための透過面を有するものであり、
前記透過面が、該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成されているものであることを特徴とする請求項１に記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項３】
前記測定光の前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となることを特徴とする請求項１または２に記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項４】
前記エバネッセント波および前記金属膜の共鳴により生じる表面プラズモンの伝播方向と、前記研磨痕が指向性を有する方向とが略平行となることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項５】
空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上であることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項６】
前記誘電体プリズムが、合成樹脂材料からなるものであることを特徴とする請求項１から５いずれかに記載の全反射照明型センサチップ。
【請求項７】
誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
前記誘電体プリズムを成形し、
前記一面である金属膜形成面を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨することを特徴とする全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項８】
前記誘電体プリズムを成形すると共に、前記測定光を透過させるための透過面を該誘電体プリズムに形成し、
該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように、前記金属膜形成面を研磨することを特徴とする請求項７に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項９】
空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、前記金属膜形成面を研磨することを特徴とする請求項７または８に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１０】
前記誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることを特徴とする請求項７から９いずれかに記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１１】
誘電体プリズムと、該誘電体プリズムの一面に形成された金属膜とを備え、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法に用いられる全反射照明型センサチップの製造方法において、
前記誘電体プリズムを成型するための型の部分であって前記一面である金属膜形成面に対応する部分を、研磨痕が一の方向に指向性を有するように研磨し、
前記型を用いて前記誘電体プリズムを成型することを特徴とする全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１２】
前記誘電体プリズムを成型すると共に、前記測定光を透過させるための透過面を、該透過面の法線ベクトルの、前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルと、前記研磨痕の指向性を表す指向ベクトルとが略平行となるように形成することを特徴とする請求項１１に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１３】
空間周波数分析法により算出した前記研磨痕の指向性の度合が、＋１０％以上となるように、前記型の前記金属膜形成面に対応する部分を研磨することを特徴とする請求項１１または１２に記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１４】
前記誘電体プリズムの材料として合成樹脂材料を用いることを特徴とする請求項１１から１３いずれかに記載の全反射照明型センサチップの製造方法。
【請求項１５】
金属膜が一面に形成された誘電体プリズム有する全反射照明型センサチップを用いて、前記金属膜に被検出物質を含む試料を供給し、前記誘電体プリズムと前記金属膜との界面に対し全反射条件を満たすように測定光を照射し、該測定光の照射により発生したエバネッセント波を利用して前記被検出物質を検出する検出方法において、
前記一面である金属膜形成面の領域であって前記金属膜が形成されている領域の研磨痕が、一の方向に指向性を有するものであり、
前記指向性を表す指向ベクトルと、前記測定光の前記金属膜形成面への射影成分を表す射影ベクトルとが略平行となるように、前記測定光を前記界面に対し照射することを特徴とするセンシング方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２１０４５１（Ｐ２０１０−２１０４５１Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５７３１９（Ｐ２００９−５７３１９）
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１１日（２００９．３．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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