具体的に生物学的粒子などの粒子の特徴付けおよびカウントのための方法
【課題】不均一な時間的に可変の力場と、一体型の光センサまたはインピーダンス計センサとによって、粒子を特徴付けるおよび/またはカウントするための、方法ならびに装置を提供する。
【解決手段】力場は、粒子(固体、液体、または気体)の安定平衡点のセットによって特徴付けられる、正もしくは負の誘電泳動の場、電気泳動の場、または電気流体力学的運動の場であることが可能である。試料中に存在する各粒子を効率良くカウントするまたは操作することを目的として、そのような粒子の存在を一体型の光センサもしくはインピーダンス計センサによって検出するおよび/またはそのような粒子の種類を特徴付けるために、そのような粒子を決定論的なまたは統計的な手法で移動させることを目的とした、そのような粒子の位置制御を実行することにある。
【解決手段】力場は、粒子(固体、液体、または気体)の安定平衡点のセットによって特徴付けられる、正もしくは負の誘電泳動の場、電気泳動の場、または電気流体力学的運動の場であることが可能である。試料中に存在する各粒子を効率良くカウントするまたは操作することを目的として、そのような粒子の存在を一体型の光センサもしくはインピーダンス計センサによって検出するおよび/またはそのような粒子の種類を特徴付けるために、そのような粒子を決定論的なまたは統計的な手法で移動させることを目的とした、そのような粒子の位置制御を実行することにある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、粒子の特徴付けおよび/またはカウントのための方法ならびに装置に関するものである。本発明は、主に、単細胞に対する生物学的手続きの実施に応用される。
【背景技術】
【0002】
G. Medoroに属する特許出願:PCT/WO 00/69565は、閉じられた誘電泳動ポテンシャルケージの使用を通した粒子の操作および検出のための装置ならびに方法を記載している。記載された方法は、二次元空間において、各粒子の位置を他の全ての粒子から独立してどのように制御するかを教示している。粒子を浮遊状態で捕捉するために使用される力は、負の誘電泳動である。操作の動作に対する独立制御は、同じ基板内に一体化された電極およびセンサのアレイのそれぞれの要素に関連したメモリ素子および回路のプログラミングを通じて行われる。しかしながら、センサの特性のばらつきに結び付いた固定空間「雑音」(「固定パターン雑音」として技術的に知られる)は、細胞の検出におけるセンサ自体の信頼性を大きく制限する。上記特許は、光センサおよび/またはインピーダンス計センサの使用を報告している。たとえ、センサのゲインの変化を補償するために基準画像を減じた場合でも、例えば照明(光センサの場合)または液体の導電率(インピーダンス計センサの場合)の空間的変化などのその他の要因が未補償であるので、結果は、完全に信頼性のあるものとはならない。
【0003】
Becker et al.による特許:US 6,294,063は、プログラム可能な力の分布を通じてひとまとまりの固形、液状、またはガス状の生物学的物質を操作するための方法および装置を開示している。該特許は、また、センサの使用にも言及している。しかしながら、この場合もやはり、固定パターン雑音の問題がある。
【0004】
液体粒子(液滴)の操作のためのもう1つの既知の方法は、T.B. Jones, Journal of Micromechanics and Microengineering, 15 (2005) 1184-1187に記載された、エレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック(誘電体に対するエレクトロウェッティング、EWOD)である。この場合は、基板上に提供された電極によって及ぼされる電場が、気相に取り囲まれた液滴を、通電された電極の配列によって制御される方向に推進可能にする。この原理に基づくデバイスは、Pamula et al.に属する特許出願:US 2004/0058450 A1によって教示されるようにフタ(やはり誘電体を塗布されている)を含めることによって、あるいは単に、基板の上方において液滴との間に電気的接触を確立する「鎖」と称されるワイヤを含ませることによって、作成することができる。J. Berthier et al., NSTI Nanotech 2005, www.nsti.org, vol. 1, 2005。
【0005】
粒子の操作のためのさらなる力には、電熱フロー(ETF)またはAC電気浸透などの、電気流体力学的(EHD)フローによって生成される粘性摩擦力がある。NG. Green, A. Ramos and H. Morgan, J. Phys. D: Appl. Phys. 33 (2000)では、粒子を表示するために、EHDが使用されている。例えば、PCT WO 2004/071668 A1は、上述された電気流体力学的フローを活用して一部の電極上に粒子を集結させるための装置を記載している。
【0006】
「Impedance Spectroscopy Flow Cytometry: On-Chip Label-Free Cell Differentiation(インピーダンス分光フローサイトメトリ:チップ上における無標識細胞の差別化)」, Cytometry Part A 65A: 124-132 (2005), Cheung K, Gawad S, Renuad Pでは、フロー中の粒子を差別化するために、マイクロチップ上に一体化されたインピーダンス差動センサが使用される。
【0007】
「Near-Field Optical Sensors for Particle Shape Measurements(粒子形状測定のための近接場光センサ)」, IEEE Sensor Journal, vol. 3, No. 5, Oct. 2003, pp. 646-651では、一体型センサ(フォトダイオード)のアレイに基づく粒子形状検出のためのチップが記載されている。しかしながら、粒子の動きは、液体の流れによって操作され、これは、例えばポンプまたはその他の類似のメカニズムを必要とする。したがって、解析対象粒子の位置を正確に制御することが不可能である。
【0008】
Medoro et alによるイタリア特許出願:BO 2005A000481では、電極のアレイによって粒子を操作するためのいくつかの方法、ならびにそれらの粒子を検出するためのいくつかの方法および装置が報告されている。しかしながら、これらは、異なる細胞を差別化する能力について、既に触れられた特許:PCT/WO 00/69565と同様の限界がある。
【0009】
最後に、国際特許出願:PCT/IT02/00524には、第1の生物学的実体が、それに結合する機能を有する第2の生物学的実体を通じて認識される(あるいは逆もまた可)方法が、記載されている。この方法では、第1の生物学的実体は、少なくとも一部を選択的にアクティブ化可能およびアドレス指定可能であるとともに少なくとも第2の電極の方を向くように配置された第1の電極のマトリックスによって定められた表面上に固定され、誘電泳動ケージを通して移動される第2の生物学的実体に接触される。そして、第1および第2の生物学的実体の少なくとも一部の間にもし結合相互作用がある場合に、そのような結合相互作用が、好ましくは、電極内に一体化された光センサを使用して、第2の生物学的実体に結合された蛍光基を第1の周波数の放射で励起させ、その蛍光発光を第2の周波数で検出することによって検出される。したがって、やはり、光学的検出に結び付いた「雑音」(「固定パターン雑音」)を排除するという問題が残る。
【発明の概要】
【0010】
本発明の狙いは、上述された欠点がなく、より具体的には、粒子の正確な操作が得られ、同時にまた、固定パターン雑音の欠点に対して実質的に鈍感であるような、あらゆるタイプの粒子の特徴付けおよび/またはカウントを行うための方法ならびに装置を提供することにある。
【0011】
とりわけ、本発明の狙いは、試料中に存在する各粒子の存在を一体型の光センサおよび/もしくはインピーダンス計センサによって検出するならびに/またはそのような粒子の種類を特徴付けるために、そのような粒子を決定論的なまたは統計的な手法で移動させることを目的とした、そのような粒子の位置制御を実行することにある。
【0012】
本明細書において、以下では、「粒子」という用語は、天然にしろ人工にしろ、細胞、細胞成分、ウィルス、リポソーム、ニオソーム、マイクロ球(マイクロスフィア)、およびナノボールなどの、マイクロメートル規模もしくはナノメートル規模の実体、または高分子、たんぱく質、DNA、およびRNAその他など、より小規模な実体を意味するほか、例えば水中の油もしくは油中の水など、懸濁培地に混じらない流体の滴、または気体中の液滴(空気中の水など)、もしくはひいては液体中の気泡(水中の空気など)なども意図するものとする。
【0013】
細胞という用語が使用される場合もあるが、これは、特にことわりがない限り、上述された広義での、粒子の検出および特徴付けにおける、非限定的な使用例であると解釈されるべきである。
【0014】
本発明は、したがって、上記のように、請求項1,3,5,9,11,20,22にしたがった、粒子の特徴付けおよび/またはカウントのための方法ならびに装置に関する。
【0015】
具体的に言うと、不均一な時間的に可変の力場と、一体型の光センサとが使用される。力場は、粒子(固体、液体、または気体)の安定平衡点のセットによって特徴付けられる、正もしくは負の誘電泳動の場、電気泳動の場、または電気流体力学的運動の場であることが可能である。同じ方法は、国際科学界においてエレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック(誘電体に対するエレクトロウェッティング)の名称で知られる効果の活用によって、液滴(液体粒子)の操作に適用される。
【0016】
このように、既知の技術の制限は、本発明によって克服される。
【0017】
本発明にしたがった方法の実現形態は、照明の空間的変化におよび固定パターン雑音に対して鈍感である。さらに、解析対象粒子の位置決めを困難にするポンプもその他の方法で生成される液体の流れも必要とすることなしに、デバイスで操作される粒子を正確に特徴付けおよび分類することが可能である。
【0018】
最後に、粒子を移動させるために流れを利用するアプローチと異なり、粒子をセンサに対して相対的に移動させる制御された力場を使用することによって、例えば力場を受けた粒子の移動速度からなるような、より多量の情報が得られる。したがって、粒子の特性に関するさらなる情報源が得られる。この情報は、異なる種類の粒子を差別化するために有利に使用することができる。
【0019】
添付の図面を参照にして実施される本発明の非限定的な実施形態に関する以下の説明から、本発明のさらなる特徴および利点が明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】電極のアレイを通して行われる力場の生成の原理を示した図である。
【図2】図4および図9のケージの移動に基づいた検出および特徴付けの方法に関連する波形を示した図である。
【図3】(a)ポリスチレン球、(b)K562細胞、(c)赤血球の画像を顕微鏡で見た図である。
【図4】電極より小寸法の粒子を検出/特徴付けするための一連のステップを示した図である。
【図5】およそ15〜20μmの寸法の細胞または球の推移に際して検出される階調値の一般的な時間的進行と、考えられるいくつかの識別パラメータの表示とを示した図である。
【図6】ケージの移動に続くK562の推移に際して検出される階調値の時間的進展を示した図である。
【図7】小細胞またはマイクロ球の推移に際して検出される階調値の一般的な時間的進行と、考えられるいくつかの識別パラメータの表示とを示した図である。
【図8】ケージの移動に続く10μm、6μm、および3μmのそれぞれのポリスチレン球の推移に際して検出される階調値の時間的進展を示した図である。
【図9】電極1つよりは大きいが電極2つよりは小さい寸法の粒子の検出/特徴付けに有用な一連のステップを示した図である。
【図10】全ケージの運動を通して全粒子を同時に検出するために有用な基本的な一連のステップを示した図である。
【図11】図10の一連のステップの実施を通して取得することができる3つの画像を示した図である。
【図12】ケージを運動させる必要なく全粒子を同時に検出するために示された基本的な一連のステップを示した図である。
【図13】図12のケージのアクティブ化および非アクティブ化に基づいた検出ならびに特徴付けの方法に関連する波形を示した図である。
【図14】ケージ中の粒子の検出/特徴付けに有用な別の一連のステップを示した図である。
【図15】粒子の特徴を高解像度で検査するためのデバイスのアーキテクチャを示した図である。
【図16】垂直および水平の両方向への粒子の移動をリアルタイムで決定するためのデバイスのアーキテクチャを示した図である。
【図17】いくつかの異なる照明モードおよび光学的検出モードを示した図である。
【図18】チップ表面上に発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図19】チップの内部層の上に発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図20】チップ表面上に複数の発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図21】異なる種類の粒子のカウントを、具体的に3種類の場合について幾何学的に表した図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の狙いは、粒子の操作および/または検出を行うための方法ならびに装置を提供することにある。
【0022】
本発明の方法は、不均一な力場(F)の使用に基づいており、該力場を通って単一粒子または粒子群(BEADS)が、安定平衡の位置(CAGE)に引き付けられる(図1)。このような場は、例えば、負の誘電泳動(NDEP)もしくは正の誘電泳動(PDEP)の場、電気泳動の場(EF)、または電気流体力学的(EHD)運動の場、またはひいてはエレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック(EWOD)であることが可能である。
【0023】
検出は、以下の態様の1つ、または以下の態様の組み合わせに関係することができる。
1.単一粒子のカウントまたは定量化
2.識別および/または特徴付け
3.位置特定
【0024】
これに関係して、インピーダンスの変化の測定、および/または蛍光のかたちで伝えられる、拡散される、もしくは発光される光度の変化の測定が、主として活用される。
【0025】
力の生成
粒子を移動させるための場を、基板上に提供された電極(EL)のアレイを通じて生成するための方法として、既知の技術にしたがった様々な方法が挙げられる(図1)。一般に、カバー(LID)が使用される。これは、電極であってよく、液体懸濁液に含まれた状態の粒子(BEADS)を一般に内部に有するマイクロチャンバの範囲を定める。様々な力の様子が図1に示されている。誘電泳動(DEP)の場合、印加される電圧は、加算符号(+)で示された同相周期電圧(Vphip)と、減算符号(−)で示された異相周期電圧(Vphin)である。異相電圧とは、180度位相が異なる電圧を意味する。場は、粒子に作用する力を生成し、粒子は、平衡点(CAGE)に引き付けられる。負のDEP(NDEP)の場合、もしカバー(LID)が導電性の電極であるならば、既知の技術にしたがって、閉じられた力のケージを生成することが可能である。この場合に、もし隣接する電極が逆位相Vphip(+)につながれなおかつカバー(LID)が位相Vphin(−)につながれているならば、平衡点(CAGE)は、Vphin(−)につながれた各電極に対応して提供される。このような平衡点(CAGE)は、通常、電極から隔てられて液体中に存在するので、粒子(BEAD)は、定常状態において、浮遊している。正のDEP(PDEP)の場合、平衡点(CAGE)は、通常、電極を提供された表面に対応して位置しており、粒子(BEADS)は、定常状態において、表面に接触している。PDEPの場合、PDEPの平衡点は、電場の極大に対応するので、カバーにさらなる電極を設ける必要がない。誘電泳動では、荷電粒子を異極性の電極へと引き付けるために、電極のアレイを使用することができる。電気流体力学的(EHD)運動の場合、電極の構成は、流れが最小の点へと粒子を追い立てる何らかの流れを生成する。EWODの場合は、誘電体を塗布された電極を含むカバー(LID)が一般に使用され、電極のマトリックスは、粒子(一般に空気中の液滴である)を引き付ける必要がある点において、カバーに対して異相の信号によって通電される。粒子をその上に存在させてはならない電極は、反対に、浮動状態にとどまる。EWODの場合は、電極のアレイの上方において空気中の液滴を操作することによって、カバーの代わりに一連のワイヤを使用することが可能である。
【0026】
以下では、簡単を期するため、本発明の方法および装置の説明において、閉じられた負の誘電泳動ケージを実行力として使用することは、単に、本発明の目的のための非限定的な例と見なされる(このため、電極として機能する蓋を使用する必要がある)。当業者ならば、以下で説明される方法および装置を、異なる実行力の使用および異なる種類の粒子に合わせてどのように一般化するかが明らかである。
【0027】
使用されるセンサ:
常に簡潔を期するため、以下では、電極を一体化されたフォトダイオードに入射する光パワーを検出可能にする光センサの場合についてのみ言及される。当業者ならば、以下で説明される方法および装置を、様々な場合に、光センサに代わるまたは光センサと組み合わせた一体型インピーダンス計センサの使用に合わせてどのように一般化するかが明らかである。
【0028】
以下では、簡潔を期するため、「一体型センサの出力信号」の同義語として、「階調レベル」という用語も使用される。この信号は、(フォトダイオードなどの光センサに)「入射する光パワー」に、または測定されたインピーダンス(一体型インピーダンス計センサの場合)に比例していることが可能である。
【0029】
光センサの使用に対応した方法:
光センサの場合、一般に、暗視野(BF)タイプの照明の場合について言及される。この場合、照明は、センサに当たる。暗視野(DF)照明法、または蛍光に基づく方法もまた可能であり、本発明の目的の範囲内である。しかしながら、簡単を期するため、以下で扱われるどの方法でも取り上げられず、ここに記載されるにとどまる。
【0030】
図17には、光センサを使用するためのいくつかの方法が示される。この図は、基板(SUB)内に光センサ(PIXEL)を一体化されたデバイスの断面に関する。センサと、電極(EL)を提供する各種メタライズ層との間の誘電体は、単純に、酸化物(OX)層からなることも、あるいは例えば薄膜ダイクロイックミラー技術によって実現されるフィルタ層(DFL)を含むことも可能である。
【0031】
明視野検出の図(図17−BF)では、光(LIGHT)は、カバー(LID)から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、粒子(BEAD)によって生じた歪みおよび吸収の関数として変化する。
【0032】
暗視野検出の図(図17−DF)では、光(LIGHT)は、センサ(PIXEL)に直接達しない入射角でカバー(LID)を通って入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、直接的に光(LIGHT)が当たったまたは場合によっては電極による反射を経た光(RLIGHT)が当たった粒子(BEAD)からの拡散放射(SLIGHT)の関数として変化する。
【0033】
明視野蛍光検出の図(図17−BFF)では、励起(EXLIGHT)は、カバー(LID)から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、粒子(BEAD)によって発せられた蛍光(EMLIGHT)の関数として変化する。この場合は、発せられた光(EMLIGHT)の信号が励起パワー(EXLIGHT)によって負かされないようにするために、以下の1つまたは複数の工夫を凝らすことが賢明である。
> 励起として発せられる放射の波長のために、フィルタ層(DFL)を使用する。
> 光センサ(PIXEL)が低い量子効率を有するような(すなわちその波長に対し比較的鈍感であるような)励起周波数を使用する。これは、例えば、比較的高い深さにおいてp−n接合を、そして好ましくはUV範囲内の波長の励起放射を使用することによって可能である。波長は、380nm未満であるとなお良い。
【0034】
暗視野蛍光検出(図17−DFF)の図では、励起(EXLIGHT)は、センサ(PIXEL)に直接達しない入射角でカバー(LID)から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、直接的に光(EXLIGHT)が当たったまたは場合によっては電極による反射を経た光(RLIGHT)が当たった粒子(BEAD)から発せられる蛍光の関数として変化する。しかしながら、発せられた光(EMLIGHT)の信号が、粒子によって拡散された光のパワーによって劣化されないようにするためには、明視野蛍光の場合について上述された1つまたは複数の工夫を凝らすことによって、システムの選択性を向上させることが望ましい。
【0035】
ケージのアクティブ化および非アクティブ化を通じて満ケージを検出するための方法:
図12は、ケージ自体を移動させる必要なくどのケージが満で(少なくとも1つの粒子が封入されている)どのケージが空であるかを検出するための、本発明にしたがった方法の、考えられる一連のステップを示している。この方法は、電極への適用パターンがケージの移動を可能にしないほどに密集している場合にとりわけ適している。さらに、ケージを移動させるための回路がデバイス内に存在しない場合に好都合である。
【0036】
方法は、ケージ(CAGE)への粒子の封入/ケージ(CAGE)からの粒子の解放のために実行の位相を交互させることと、一体型センサ(PIXEL)によって1つまたは複数の画像を取得する感知と、に基づく。
【0037】
図13に、波形が図式化されている。
【0038】
ケージの非アクティブ化に際して、粒子は、ケージに入れられた際に想定される安定平衡の位置(PEQ)から開始して、沈降によって堆積しはじめる、なおかつ/またはブラウン運動の結果として自身を側方に移動させはじめる(図12の右側すなわち図12−t_sense)。これらの移動ゆえに、満のケージにおいて検出される階調レベルは、空のケージに関連したセンサ(ピクセル)において生じる読み出し回路および/または光システムの熱雑音に結び付いた階調レベルの変化と比べ、かなり大きく変化する。
【0039】
空のケージまたは満のケージの分類は、以下のように行われる。
1. (数秒程度から何分の数秒程度の時間に及ぶ)ケージの交互操作(アクティブ化または非アクティブ化)によって、そして(例えば100msなど何分の1秒程度から数十秒程度の時間に及ぶ)1つまたは複数の画像の感知によって、一連の画像が取得される(感知される)。
2. CAGE_IJに関連した各センサPIXEL_IJについて、一連の画像NIMGに関し、次式として定義される階調レベルの非正規化標準偏差(この具体的ケースではセンサに入射する光パワーに比例する)が計算される。
【0040】
【数1】
【0041】
ここで、
【数2】
(一連の画像NIMGにおける、PIXEL_IJの階調レベルの平均値)である。
【0042】
3. 空の基準センサ(PIXEL_REF)における階調レベルの非正規化標準偏差平均:
【数3】
と、非正規化標準偏差の相対標準偏差:
【数4】
とが計算される。
【0043】
4. 分類の閾値が次式により定められる。
【数5】
【0044】
5.ケージIJは、満であるものとして分類され、従って、
【数6】
であり、残りのケージは、空であるものとして分類され、従って、
【数7】
である。
【0045】
興味深いことに、このような方法は、信号のパワーをセンサごとに平均値に照らして考慮するが、このような平均値の絶対値は除外しているので、固定パターン雑音(フォトダイオードの特性のばらつきに結び付いた固定空間雑音)とは無関係である。
【0046】
95%を超える精度を得るためには、一般に、NIMG=50〜100回の測定を行う(すなわちNIMG=50〜100の画像を取得する)と十分である。
【0047】
取得するべき画像の数NIMGの動的測定は、基準ピクセルの標準偏差:
【数8】
をその漸近値に収束させるために必要とされる画像の数を考慮することによって得ることができる。
【0048】
もし光の変化に結び付いた雑音1/fを無視できるならば、この漸近値は一定である(fは、雑音を想定される一般的周波数である)。
【0049】
したがって、より一般論として、光センサが使用される場合について特に言及して今説明された方法は、電極(EL)のアレイによって生成され粒子(例えば細胞)に作用する任意の力場(F)(したがって、誘電泳動の場に限られない)の安定平衡点(PEQ)にもし粒子(BEADS)がある場合に、その粒子の存在を検出することを可能にする。このような方法は、以下のステップを含む。
i. 力場(F)を非アクティブ化する。
ii. 非アクティブ化に続き、なおかつ非アクティブ化された場にある粒子が受ける沈降運動および/またはブラウン運動の力学の関数として選択される、少なくとも一つの時間間隔において、安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベル、および力場(F)の電流構成ゆえに絶対に粒子によって占有されえないような空間領域に関連した第2のセンサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定する。
iii. 力場(F)を再びアクティブ化する。
iv. i)からiii)までのステップを、基準とみなされる第2のセンサ(PIXEL_REF)において測定される階調レベルの値の分散量が漸近値に向かう収束速度と実質的に同程度の回数にわたって繰り返す。
v. 想定される時間的に一連の測定において、とある平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサにおいて検出される階調レベル値の標準偏差が既定の閾値(THR)を上回る結果となる場合に、そのような平衡点を粒子によって占有されているものとして分類する。
【0050】
ケージの運動と階調レベルの静的値の差の測定とによって満のケージを検出するための方法:
図10は、満のケージを、その運動と階調レベルの静的値の解析とを通じて検出するための、本発明にしたがった一連の操作ステップを示している。
1. 第1の時点(t0)において、ケージ(CAGE)は、対応する初期の光センサ(PIXEL_STA)のセット上に粒子(BEADS)を配されている。この構成に対応する階調レベルを有する画像が取得される。
2. 続く時点(t1)において、ケージの運動に結び付いた過渡現象が終わると、粒子は、最終的な光センサ(PIXEL_TGT)に対応して自身を配置する。この構成に対応する階調レベルを有する新しい画像が取得される。
3. 時点1および時点2の画像に関連した階調レベルの差分画像が決定される。
4. 差分画像の絶対値が決定される。
5. 各ケージの開始位置および最終位置に関連したピクセル対(PIXEL_STA,PIXEL_TGT)についての階調レベル結果が決定される。
6. ステップ1〜4がNDIFF回にわたって繰り返され、ステップ5において決定された絶対変化に関連する各ケージに関する階調レベルが蓄積される。
7. ケージのアクティブ化/非アクティブ化による分類について上述されたのと同様に、取得された全ての差分画像NDIFFについて、この場合は、確実に空のセンサ(ピクセル)(例えばケージのロウ間のピクセルなど)に対応する差の絶対値の平均および標準偏差を考慮して、分類の閾値THRが決定される。
【0051】
より一般論として、電極のアレイ(EL)によって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)にもし粒子がある場合は、その粒子(BEADS)の存在の検出は、以下の手順によって行われる。
i) 先ず、安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_STA)によって生成される階調レベル、および力場(F)のこの第1の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定する。
ii) 次に、第2の電流構成を付与するために、力場(F)を変更する。このとき、安定平衡点は、第1のセンサとは異なる第2のセンサ(PIXEL_TGT)に対応して移動される。
iii) 次に、第2のセンサ(PIXEL_TGT)によって生成される階調レベル、および力場(F)のこの第2の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定する。
iv) 先行する時点において検出された階調レベル値の間の差(DIFF_IMG)を決定する。
v) ステップi)〜iv)を繰り返す。
vi) 安定平衡点(PEQ)を粒子に占有されたものと占有されていないものとに分類するために、示差階調レベル値を処理する。
【0052】
このような処理は、vii)階調レベルの差の絶対値を決定するステップと、次いで、viii)場(F)の第1および第2の電流構成では粒子に占有されえないような基準センサに関連した階調レベルの平均的変化を大幅に上回る変化を有するセンサに関連した平衡点を、占有されたものとして分類するステップと、を含む。
【0053】
画像の差の絶対値に基づくこの方法も、やはり、固定パターン雑音に影響されず、ケージのアクティブ化/非アクティブ化による方法と同様に、照明のむらに対して比較的鈍感である。
【0054】
第1の方法と比べて、この方法は、ケージを移動させるための回路と、もしケージに封入された細胞がある場合にその移動を一義的に決定するためにケージの運動を可能にするケージ間の距離と、を必要とするという不利点を有する。
【0055】
この方法の利点の1つは、一般に、一定の質の(誤差率の低い)分類を得るために必要とされる画像が少ない(なおかつ時間が短い)ことにある。ケージのアクティブ化/非アクティブ化の方法の場合は、より多くの画像と、より長い時間とが必要とされる。
【0056】
図11には、単一ステップ(NDIFF=1)によって得られる結果が示されている。図11(a)には、光学顕微鏡によって検出可能な画像が報告されており、図11(b)には、対応する階調値のマップが(固定パターン雑音を補償されている)示されており、反対に、図11(c)には、初期の階調値を有する画像と右方向への移動後の画像との差の絶対値の正規化画像が示されている。
【0057】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とによって満のケージを検出するための方法:
図2は、ケージ自体の移動を通じてケージ中の粒子の存在を動的に検出するための方法のステップにおける波形を示している。
【0058】
先ず最初に、ケージの移動が行われるが、粒子が新しい平衡位置に沈降するのを待つことなく、運動ケージに内包された細胞(粒子)が運動している下にある光センサにおいて、その信号の変化が検出される。
【0059】
図4は、IJ位置にあるケージの運動と、光センサ(PIXEL_IJ)上における粒子(BEAD)の推移を決定する平衡点(PEQ)の移動と、をともなう一連のステップを示している。
【0060】
粒子(BEAD)の寸法が電極のそれより大きい場合、センサは、変化を測定するが、粒子を上に有さないピクセルに関する基準値に達することができない。この場合は、図9のような、僅かに異なる図を採用することができる。この場合は、電極より大きい寸法のケージの縁にあるピクセル(PIXEL_IJ)において階調値を測定することによって、電極の実寸法の二倍の寸法の電極を有する場合に相当する状況が再現される。
【0061】
この技術は、ある意味では、(もしフォトダイオードが細胞と同程度の大きさでなおかつこれが垂直に移動される場合に)細胞の水平断面についての積分を考慮して入射パワーに関連した階調値を検出することによって、細胞を走査することを可能にする。以下に示す実行の負荷サイクルを変化させることによって、異なる走査速度が得られる。
【0062】
【数9】
【0063】
これらの操作は、ケージが満である場合に発生する光度の頂点および谷に基づいて粒子の存在を検出することを可能にする。センサの信号を処理することによって、当業者ならば、満のケージを空のケージと区別することを可能にする一連のパラメータ(例えば階調値のピークツーピーク振幅)を容易に検出することができる。
【0064】
したがって、本発明の方法のこの変更形態にしたがうと、電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)にもし粒子がある場合、その粒子(BEADS)の存在は、以下のステップを行うことによって検出される。
i) 粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって安定平衡点(PEQ)が移動されるように、力場(F)を変更する。
ii) 異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
iii) センサによって生成される階調レベルの測定の時間的進展の特性パラメータの測定を通じて、粒子が存在するかまたは欠如しているかの分類を行う。階調レベルは、例えば光センサの場合、入射する光パワーに基づいて生成される。
【0065】
センサによって生成される階調レベルの測定、すなわちセンサに当たる光パワーの測定は、粒子に作用する場をアクティブ化するステップと、上記の場を非アクティブ化するステップとを交互に行うことによって、入射する光パワーをすなわちこうして得られる階調レベルを後ほど測定することによっても、明らかに実現可能である。これは、センサの読み出しによって実行電圧間に生じるあらゆる干渉を、たとえ原則的には実行電圧のアクティブ化に対するセンサの実質的独立性があれば不要ではあるものの、回避するのに有利である。
【0066】
光パワーの測定の時間的進展のパラメータは、階調レベルのピークツーピーク振幅を含むことが好ましく、分類は、好ましくは、想定される力場(F)の構成では粒子によって占有されえないような基準センサにおける光パワーすなわち階調レベルのピークツーピーク測定を、基準センサのピークツーピーク値の標準偏差に比例する係数で増大させることによって決定される、閾値との比較を通じて行われる。
【0067】
このようにして、基準センサ上にある環境照明に起因する雑音1/fも補償される。
【0068】
誤差補償をともなった、満のケージの数に基づいて細胞をカウントするための方法:
上述された方法によって、満のケージの数が決定される。本発明の狙いは、ケージ中の細胞をカウントするための方法を見いだすことにもある。これによって、想定される試料の体積がわかるうえ、細胞の濃度も得られる。
【0069】
第1近似として、とりわけ、ケージあたりの平均細胞数が約0.1を大幅に下回る場合は、満のケージの数は、細胞の数とおおよそ同程度である(この場合は約5%、細胞数が過小評価される)。より高い平均細胞数の場合、本発明にしたがうと、チップ上の実際の細胞数をより高い精度で近似するカウントを得るために、ケージあたりの細胞数の分布統計を補償することができる。
【0070】
以下の仮定が想定される。
1. 細胞は、単位体積あたりに均一に分布される。この仮定は、試料が空のマイクロチャンバに注入される場合は全面的に立証される。反対に、予め緩衝材で満たされたマイクロチャンバに試料が注入される場合は、試料のフロープロファイルに結び付いた細胞密度の変化ゆえに、試料は、局所的にのみ均一である可能性がある。
2. ケージあたりの最大細胞数に結び付いた束縛は、無視することができる。
【0071】
この仮定は、細胞の総体積(平均細胞数あたりの平均細胞体積)がケージの体積(各ケージの引力ボールの体積を意図する)より適度に小さい場合に立証される。
【0072】
これらの仮定のもとでは、細胞の統計的分布は、二項分布によって表される。ここで、
NCAGES=チップ(または想定される部分)内のケージの数
n=NCELLS=チップ(または想定される部分)内の細胞の数
として定義するものとする。ここで、「チップ」とは、電極ELのアレイによって形成されたセットを意図しており、これは、通常、センサPIXELとともに単一の多層チップ内に正確に一体化される。
【0073】
そして、ある細胞が任意のケージの引力ボールに属する確率は、
p=1/NCAGES
である。
【0074】
ケージあたりk個の細胞がある確率は、次式から得られる。
【数10】
ここで、
【数11】
は、n個からk個を一度に選ぶ組み合わせの数である(二項分布)。
【0075】
ケージあたりの細胞の平均値(ケージあたりの平均細胞数:ACPC)は、
【数12】
である。
【0076】
一般に、チップ上には多くのケージがあるので、ケージあたり1,2,...,k個の細胞を有する確率を、ケージの数で乗じることによって、1,2,...,k個の細胞を有するケージの実際の値をよく近似することができる。これを考慮に入れ、さらに、空のケージおよび満のケージの総数が検出されれば、検出値に対応する満のケージおよび空のケージの期待数を提供する値を計算することによって、ケージあたりの平均細胞値(ACPC)を推定することができる。
【0077】
空のケージの期待値は、次式として計算され、実際に検出された空のケージの値で置き換えることによって、細胞をカウントすることができる。
【0078】
【数13】
【0079】
これは、
【数14】
などの単純な推移を経て計算される。
【0080】
こうして、細胞数の優れた推定が得られ、そして、もし空のケージおよび満のケージの数が統計的に多数であるならば、1を上回るACPC値の場合もまた、優れたカウント精度が得られる。このようにして、実際は、満のケージのみをカウントするその他の場合に見られる細胞数の過小評価に結び付いた誤差が軽減される。言うまでもなく、空のケージの検出数(ECmeasure)は、ゼロより大きくなければならず、ケージの数NCAGES未満またはそれに等しくなる。以下の表は、ケージが6,400個であるような具体的な一例を、様々な細胞濃度の場合について数値的に示している。表からわかるように、カウント誤差は激減されており、これは、ケージあたりの平均細胞濃度が高い場合にとりわけ顕著である。実際は、報告値は、確率の密度に基づくものに過ぎないが、多数のケージを想定すれば、確率推定によって、予想される測定値をよく近似することが可能である。
【0081】
【表1】
【0082】
言い換えると、本発明にしたがうと、ここまでに説明されてきた任意の方法にしたがって実施される満のケージおよび空のケージのカウントによって、電極ELのアレイとカバー(LID)とによって範囲を定められたチャンバに注入される試料中に実際に存在する粒子(例えば細胞)の総数のカウントを得ることができ、予め一般的存在を検出されている単一粒子をカウントするステップは、本発明のこの態様にしたがって、以下のように、統計的基礎に基づいて推定方式で行われる。
a) 電極(EL)のアレイによって生成される場(F)の中に存在している、いかなる粒子(BEAD)も含まない、以下ではケージとも称される安定平衡点(PEQ)の数(ECmeasure)が、センサによって測定される。
b) 粒子(BEAD)のカウント(NCELLS)が、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数といかなる粒子も含まない安定平衡点(PEQ)の測定数(ECmeasure)の対数との差の、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数と安定平衡点(PEQ)の数から1を引いた数(NCAGES−1)の対数との差に対する比率として決定される。
【0083】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とを通じてケージ中の細胞を特徴付けるための方法:
図3に示されるように、球(例えば図3(a))、ある種類の細胞(例えば図3(b)にあるようなK562)、または別の種類の細胞(例えば図3(c)にあるような赤血球)は、異なる寸法、形状、吸光度プロファイル、および屈折率を有するので、ケージにセンサの上を通らせることによって、それが満であるかどうかを検出するのみならず、本発明のさらなる一態様にしたがえば、もし粒子が存在する場合はその粒子の種類を特徴付けることが可能である。
【0084】
細胞(および特定の種類のマイクロ球)は、負ピーク(細胞の暗い縁部分)および正ピーク(細胞が光を集中させる明るい中心部分)をともなう階調レベルの変化を発生させる光の歪み(ある種のレンズ効果)を呈する。
【0085】
図5に報告される、重要だが非限定的な例にあるように、階調レベルの負ピーク(Gnp)および正ピーク(Gpp)の振幅の測定、ならびに例えばケージの運動と第1の階調変化の検出との間の遅延(td)、あるいはさらには変化の時間的長さなどの、階調レベルの動的進化に結び付けられたパラメータを、追加の情報を得るためおよび細胞の種類を分類するために使用することが可能である。
【0086】
式:
第一近似として、移動速度は、誘電泳動移動度に比例し、v ∝ k・R2となる。したがって、第一近似としての階調レベルの変化の長さは、次式の通りである。
【0087】
【数15】
【0088】
すなわち、粒子の半径に反比例する(Rが増大すると減少する)。実行と階調レベルの変化の開始との間の時間遅延tdは、第一近似として(単一電極上に一細胞がある図4の場合)、次式に等しくなる(やはりRが増大すると減少する)。
【0089】
【数16】
【0090】
図6は、K562細胞について測定された実際の過程を示している。
図7は、透明でない球、または上記の「レンズ」効果よりも吸光度の効果のほうが支配的であるような小細胞について期待される一般的な過程を示している。
図8は、ケージの移動に続く10μm、6μm、および3μmのポリスチレンの球の推移に際して検出された階調値の時間的進展を示している。
【0091】
適切な識別パラメータを抽出することによって、当業者にとって明らかな方法で、満のケージおよび空のケージの分類について上述されたのと同様に、分類の基準を定めることが可能である。
【0092】
具体的に言うと、識別方法は、粒子の際立った特性を抽出すること、ならびにニューラルネットワークに基づくアルゴリズム、第1の閉じられたks、閾値アルゴリズム、および/または主成分解析、またはこれらを組み合わせたものなどを使用することを含むことができる。
【0093】
図14は、同じ原理に基づく代替の一技術を示している。この技術によれば、細胞をセンサの上方で側方に移動させることによって、細胞を、水平断面内において、より高い解像度で走査することが可能である。実際、想定される細胞の「薄片」は、より小寸法である。細胞の通過にともなって、取得中の点の数に等しい水平解像度および電極間のギャップ(距離)に等しい垂直解像度で、階調値の導関数から、細胞の水平断面に沿った階調値の点値を計算することができる。
【0094】
したがって、上述された内容に基づくと、本発明は、電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する粒子(BEADS)を、以下のステップを行うことによって特徴付ける(すなわち、例えばそれらの物理的性質を確立する)ことも可能にすることがわかる。
a. 上記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって上記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、力場(F)を変更する。
b. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
c. 粒子の性質を推定するために、階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理する。
【0095】
この全体は、常に、センサによって検出可能な背景「雑音」、すなわち固定パターン雑音による影響を受けない。
【0096】
使用されるセンサが光センサであり、なおかつ階調レベルの測定がセンサに当たる光パワーの測定であるような説明された例では、このような測定は、好ましくは、以下のステップ:
i. 粒子に作用する場をアクティブ化する。
ii. 場を非アクティブ化し、入射する光パワーを測定する。
を交互に行うことによって実施される、あるいは、ケージ中の粒子の存在を動的に検出するためのものとして上述されたのと同じ好ましいシステムを使用して実施される。光パワーの測定の時間的進展のパラメータは、上述された内容に基づいて、
i. 力場(F)の変化と、光パワーの第1の変化との間の遅延(td)、
ii. 光パワーの一過性の変化の長さ(tw)、
iii. 光パワー値の正ピーク(Gpp)の振幅、および
iv. 光パワー値の負ピーク(Gnp)の振幅、
からなる群より選択される少なくとも1つのパラメータを含む。
【0097】
異成分からなる試料中の異種の細胞をカウントするための方法:
本発明にしたがうと、単一集団の細胞をカウントするための方法論を、単一ケージ中の粒子を特徴付けるための方法論と組み合わせることによって、異種の粒子からなる試料の組成を決定することが可能である。
【0098】
一般に、2つ以上の細胞を含むケージ中の粒子の組成を差別化することは容易でない。しかしながら、ケージ内容の特徴付けを目的として上述のように記録された、階調レベルの力学を処理すれば、そのケージが単一粒子を含むのか、あるいは多様な粒子(MC)を含むのかを決定することは、比較的簡単である。
【0099】
異種の粒子の分布は、互いに独立している(直交している)とみなすことができる。したがって、単一粒子をともなうケージにおいて得られる各種類の粒子の数と、空のケージ(EC)の数およびケージの総数に関する情報を組み合わせれば、数値的な手順を経て、異種集団の粒子の数を推定することが可能である。問題は、NPTが変化する関数の最小化である(ここで、NPT=粒子の種類の数である)。図21には、NPT=3である場合の問題が報告されている。
【0100】
各種類の粒子:t=1,...,NPTについて、複数の粒子(NCELLSt)の存在が想定される場合、ケージの中にある種類t単独の粒子の数(その他の種類の粒子は無視する)を表しているNPT次元の空間を有する超立方体の体積は、事実上、固定値(Pt_1)のままである。図21(a)を参照すると、第1の種類の粒子について、単一ケージではP1_1個の粒子が、複数ケージではP1_M個の粒子が、種類P1の粒子をともなわないケージではP1_0個の粒子が得られる(図示された体積の測定値である)。単一ケージ中における種類tの粒子の検出数は、しかしながら、同じケージ中に1つまたは複数のその他の種類の粒子が存在しうることを考慮に入れる必要がある。したがって、図21(d)に示されるように、各種類tの単一粒子の検出値(Pt_1_MEAS)は、異種の粒子を少なくとも1つ含むq<>t、h>0の超立方体をともなう場合に、種類tの粒子の超立方体の体積(Pt_1)からPt_1とPq_hとの超立方体交差部分の体積を引いた値に相当する。空のケージの超立方体の体積(EC_MEAS)も知られている。
【0101】
値のセット:NCELLSt(t=1,...,NPT)は、数値的に計算される。こうして、(統計的)期待値は、各種類tの単一粒子をともなうケージの実測数(Pt_1)および空のケージの実測数(EC_MEAS)に、より良く対応することができる。
【0102】
したがって、上述された内容に基づくと、本発明は、電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する多様な種類(NTP)の粒子(BEADS)の数を、以下のステップの実行を通じてカウントすることも可能にすることがわかる。
a. 上記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって上記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、力場(F)を変更する。
b. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
c. 関連のケージが空であるか、またはある種の粒子を含むかもしくはより多くの粒子を含むかを検出するために、各安定平衡点(PEQ)に関連した階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理する。
d. 各種の単一粒子をともなうケージの測定値(Pt_1_MEAS)および空のケージの測定値(EC_MEAS)により良く近似される、各種の粒子のカウント(NCELLSt)の組み合わせを数値的に決定する。
【0103】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とを通じてケージ中の細胞を高解像度で特徴付けるための装置:
本発明にしたがうと、これまでに説明されてきた動的検出方法の解像度を高めるためには、より高い空間解像度によって特徴付けられるフォトダイオード(PIXEL_V1,…,PIXEL_VN)に関連した一連の電極(EL)を組み合わせる(図15)ことによって、粒子を様々な電極の上で順次移動させ、粒子の様々な断面を順次解析することが可能である。
【0104】
解像限界は、このように、フォトリソグラフィ解像度の最小形状によって決定され、電極(ピクセル)のアドレス指定用に異なるトランジスタを配置する必要がなく、所要面積を増大させなくてすむ。例えば、フォトダイオードの上に配されるめっきの上に、何らかの開口(SLITS)を設け、その開口に対応する部分でのみ高感度にすることができる。
【0105】
このように、上記安定平衡点(PEQ)は、粒子(BEADS)が複数のそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移されるように移動され、センサ(PIXEL_IJ)は、光センサであり、粒子およびセンサ自体の寸法を大幅に下回る空間部分に入射する光パワーがセンサによって検出されるように(比較的小さい既定の振幅の開口SLITSを備えた上記めっき層を通して)シールドされるような、さらなるステップを、これまでに説明されてきた全ての方法において、実施することができる。
【0106】
ケージの移動速度の自動制御によって細胞を操作するための方法:
こうして、ケージの移動速度の自動制御による操作の方法は、上述のように、細胞の推移検出の使用に基づくことが可能である。軌跡に沿った次のステップを直ちに開始させるため、(電極のアレイをともなう)チップ上で運動している細胞を有するケージについて、階調レベルの進化を監視するとともに、新しい平衡点への沈降遷移の終わりを検出することができる。異なる瞬間における異なる粒子の速度に時間を動的に適応させることによる、時間の最適化のほかに、このようなアプローチもまた、各細胞がブロックされたままにないように保証することができる。
【0107】
1つの電極あたり1つの光センサが、例えば図4に示されるように2つの電極間の垂直ギャップ(距離)などに関連付けられる場合、この方法は、幅1電極×縦2電極(水平位置に1電極×垂直位置に2電極)のケージを使用して行うことができる。実際、水平移動の場合は、粒子は、2つの電極間のセンサ上において自身を全速力で位置付けし、その運動は、初期平衡点および/または最終平衡点に対応してセンサを監視することによって追跡することができる。これは、ケージの形状に対して束縛をもたらすが、後述される装置の使用によって克服することができる。
【0108】
ケージの寸法に対する束縛をともなうことなくケージの移動速度の自動制御によって細胞を操作するための装置:
図16には、水平方向の運動決定のためのセンサ(PIXEL_H)および垂直方向の運動決定のためのセンサ(PIXEL_V)の両方のセンサ(ピクセル)を有する装置の図である。このような装置は、ケージの移動速度の1つに統合されたかたちで実施される閉鎖制御によって粒子の操作を実現するのに有利である。この装置を使用すれば、1×1のケージによる水平移動も可能である。なぜならば、いかなる場合も、細胞/粒子は、2つの電極間に水平軸に沿って配されたセンサ(PIXEL_H)上を推移するからである。
【0109】
今説明されたさらなる方法および装置を使用すれば、上述された粒子の検出および特徴付けの全ての方法に適用することが可能なステップを実現することができる。該ステップは、新しい平衡地点への粒子の沈降遷移の終わりを決定し、この測定から、新しい安定平衡点(PEQ)に向かう粒子(BEADS)の移動速度へと戻るために、粒子を含む安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルの変化の過程を制御することからなる。このような沈降遷移の終わりでは、所望の既定の軌跡(図15において矢印によって示される)に沿って安定平衡点(PEQ)の新たな移動を生じさせる目的で、電極自身によって生成される力場(F)の変化を(例えば電極ELのアレイの、さらには既知のタイプの制御ユニットCTRLに実装された適切なソフトウェアを通じて(図15))自動的に生成することができる。
【0110】
ケージ中の細胞を蛍光によって検出するおよび/または特徴付けするための、一体型ダイクロイックフィルタをともなう装置:
細胞の蛍光検出および/または蛍光特徴付けを目的として、本発明にしたがったいくつかの好ましい実装形態が報告されている。これらの実装形態は、蛍光発光は通過させるが励起は軽減させるようなフィルタ素子を一体化されている。これらのフィルタ素子は、ダイクロイックフィルタの実現に適した屈折率を有する材料を薄膜状に堆積させるなどの、チップの実行よりも下流のプロセスステップによって、一体化することができる。フィルタ効果は、センサ(PIXEL)によって検出される励起帯中の光パワーの一部を軽減させることによって、センサ自体のダイナミックレンジに結び付けられた必要条件を減らすことができる。
【0111】
図18には、蛍光細胞の検出および/または特徴付けにとりわけ適した装置の図が示されている。発光に対応する周波数を通過させるダイクロイックフィルタ(DFL)が、当業者に知られた技術によって、チップ上に堆積される。堆積後は、電極(EL)と液体との間の電気的接触を向上させる狙いで、オプションとして、電極自体に対応していくつかの窓がダイクロイック層上に開けられる。このようにすれば、例えば、誘電泳動の場合、ダイクロイックフィルタで構成された誘電体層の存在に結び付いた電圧降下をともなうことなく高伝導性の溶液をも使用することが可能になる。この実行方式は、標準的なCMOSウエハの製造の使用に適合しており、ウエハのポスト処理のみを必要とする。
【0112】
あるいは、ダイクロイックフィルタは、図19に示されるように、電極の下方で実現することができる。これは、CMOSプロセスが変更可能である場合に有用である。また、CMOSプロセスの変更がない場合でも、この図は、より複雑ではあるが、フィルタをあてがうこと、CMOSの頂部金属にコンタクトを開けること、および電極(EL)を実現するためにさらなるめっきを施すこと、によって表されるポスト処理を実施することによって実現可能である。電極(EL)の上方であるか下方であるかによらず、図20に示されるように、異なる通過帯(DFL1,DFLN)を有する空間的に組織された複数のダイクロイックフィルタを実現すると有利である。これは、細胞/粒子の蛍光を異なる発光周波数で分割および個別検出するのに有用である。
【0113】
明らかなように、細胞の位置をチェックすることによって、それらを例えば異なる蛍光の存在について、異なるセンサ上において順次解析することが可能である。今説明された本発明のこの態様にしたがうと、本発明は、上述されたような、粒子の検出および/または特徴付けのための装置に関するが、さらに、センサのシールド手段と、各センサについて少なくとも1つの数の開口とを有する。開口は、シールド手段を通じて得られ、検出される/特徴付けられる粒子よりも小さい既定の寸法を有する。
【0114】
本発明にしたがった装置は、さらに、センサ(PIXEL)が光センサである場合にセンサを少なくとも部分的にシールドするように構成された、既定の通過帯を有する少なくとも1つのダイクロイックフィルタを含むことができ、好ましくは、それぞれが他と異なる通過帯を有し、間で重なり合うようになおかつセンサ(PIXEL)を少なくとも部分的にシールドするように配置された、複数のダイクロイックミラーを含む。もし、少なくとも1つのダイクロイックフィルタが電極(EL)を覆うように配置される場合は、それは、各電極の少なくとも一部に対応して設けられた割り込み開口を備えている。
【0115】
励起のフィルタリング:
装置は、解析対象となる各蛍光に合わせて(外部で)励起源がフィルタリングされ最適化されるという事実をうまく活用してもよいし、しなくてもよい。これは、デバイスに一体化されていないフィルタによって容易に実現することができる。これに加えて、あるいはこの代わりに、チップの蓋に、チップのピクセルごとに異なってもよいし異ならなくてもよい下位のダイクロイックフィルタに対応した励起フィルタリングの一部を一体化することも可能である。
【0116】
蓋に励起フィルタリングが一体化される場合は、異なるピクセルの励起間のクロストークを回避するために、均一なダイクロイックフィルタを有するゾーンを広くする必要がある。この場合、被試験細胞は、異なる蛍光について解析されるために、より長い距離を網羅しなければならない。本発明のこの追加の態様にしたがうと、これまでに説明されてきた装置は、したがって、検出される/特徴付けられる粒子を含む流体試料の受け取りおよび内包に適したチャンバまたはマイクロチャンバを前記電極のアレイと協働して定めるカバー(LID)に対応して配置された、既定の通過帯を有する少なくとも一つのダイクロイックフィルタを含むことができる。
【0117】
照明雑音の補償方法ころん
上述された全ての方法において、光センサが使用される場合、粒子の検出または特徴付けのための信号は、照明のパワーに依存する。したがって、この種の変化は、検出される光パワーのレベルに、信号(粒子の存在および/または位置)に結び付かない何らかの変化を生じさせる可能性がある。これは、普通は問題にならないが、これらの方法は、このような変化を基準ピクセル(入射する光パワーが照明のパワーによってのみ影響される空のケージに確実に対応するピクセル)の平均検出に対して正規化された値を使用して補償することによって、性能を向上させる(精度を上げる、速度を上げる)ことが可能である。
【0118】
これは、低周波数の照明雑音に、主として当てはまる。なぜならば、雑音パワーのスペクトル密度(1/fに比例する)ゆえに、それによる影響力がより大きくなるからである。
【0119】
インピーダンスセンサのための雑音補償方法:
上述された全ての方法において、インピーダンス計センサが使用される場合、粒子の検出および特徴付けのための信号は、粒子の懸濁培地の導電率および誘電率に依存し、これらは、ひいては、例えば温度、塩濃度、他の分子その他に依存する。したがって、これらの変化は、検出されるインピーダンスのレベルに、信号(粒子の存在および/または位置)に結び付かない何らかの変化を生じさせる可能性がある。これは、普通は問題にならないが、これらの方法は、このような変化を基準ピクセル(インピーダンスが懸濁培地の導電率および誘電率によってのみ影響される空のケージに確実に対応するピクセル)の平均検出に対して正規化された値を使用して補償することによって、性能を向上させる(精度を上げる、速度を上げる)ことが可能である。
【0120】
したがって、想定される力場(F)の電流構成では粒子によって絶対に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)の平均検出に対して正規化された値を使用して、上記センサ(PIXEL_IJ)によって検出される階調レベルを補償することからなる、さらなるステップを、これまでに説明されてきた全ての検出および特徴付けの方法において、導入することができる。
【0121】
用途に関する備考:
これまでに説明されてきた方法および装置は、一般的な使用に関するものであり、複数の用途を見いだすことができる。本発明を限定しない例として、最も重要ないくつかの用途が挙げられる。
○ 血液試料を解析する:(例えば閉じられた誘電泳動ケージを使用している)チップ上に試料を導入することによって、赤血球は、占有されている全てのケージを第一近似としてカウントすることによって、その数をカウントすることができる(実際は、存在の可能性があるその他の細胞は非常に濃度が小さいので、通常必要とされる精度の場合は無視できる)。
○ Emochroma:血液中の細胞の数および種類を特徴付ける:この場合、存在する各単一細胞の正確な特徴付けを実施するための上述された方法が用いられ、その細胞を赤血球、血小板、リンパ球などに分類する。
○ 試料中に存在するバクテリアをカウントする:既知の量の試料を(閉じられたDEPケージを有する)チップ上に注入することによって、存在する全てのバクテリアが検出され、もし光センサによって検出される特性サインを通じて区別可能であるならば、必要に応じてバクテリアの種類が検出される。
○ 混合集団から、蛍光で標識された細胞を分離する/カウントする。この種の問題は、研究および診断の両方に広く普及している。
【0122】
例えば、牛乳、ヨーグルト、アイスクリームの調製品などの、乳製品の試料中のバクテリアを検出することができる。
【0123】
別の一例として、葡萄マストの発酵用のバクテリア(例えば環境保護の用途)を検出することができる。
【0124】
さらなる一例として、飲用水中に存在するバクテリアを検出することができる。
【技術分野】
【0001】
本発明は、粒子の特徴付けおよび/またはカウントのための方法ならびに装置に関するものである。本発明は、主に、単細胞に対する生物学的手続きの実施に応用される。
【背景技術】
【0002】
G. Medoroに属する特許出願:PCT/WO 00/69565は、閉じられた誘電泳動ポテンシャルケージの使用を通した粒子の操作および検出のための装置ならびに方法を記載している。記載された方法は、二次元空間において、各粒子の位置を他の全ての粒子から独立してどのように制御するかを教示している。粒子を浮遊状態で捕捉するために使用される力は、負の誘電泳動である。操作の動作に対する独立制御は、同じ基板内に一体化された電極およびセンサのアレイのそれぞれの要素に関連したメモリ素子および回路のプログラミングを通じて行われる。しかしながら、センサの特性のばらつきに結び付いた固定空間「雑音」(「固定パターン雑音」として技術的に知られる)は、細胞の検出におけるセンサ自体の信頼性を大きく制限する。上記特許は、光センサおよび/またはインピーダンス計センサの使用を報告している。たとえ、センサのゲインの変化を補償するために基準画像を減じた場合でも、例えば照明(光センサの場合)または液体の導電率(インピーダンス計センサの場合)の空間的変化などのその他の要因が未補償であるので、結果は、完全に信頼性のあるものとはならない。
【0003】
Becker et al.による特許:US 6,294,063は、プログラム可能な力の分布を通じてひとまとまりの固形、液状、またはガス状の生物学的物質を操作するための方法および装置を開示している。該特許は、また、センサの使用にも言及している。しかしながら、この場合もやはり、固定パターン雑音の問題がある。
【0004】
液体粒子(液滴)の操作のためのもう1つの既知の方法は、T.B. Jones, Journal of Micromechanics and Microengineering, 15 (2005) 1184-1187に記載された、エレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック(誘電体に対するエレクトロウェッティング、EWOD)である。この場合は、基板上に提供された電極によって及ぼされる電場が、気相に取り囲まれた液滴を、通電された電極の配列によって制御される方向に推進可能にする。この原理に基づくデバイスは、Pamula et al.に属する特許出願:US 2004/0058450 A1によって教示されるようにフタ(やはり誘電体を塗布されている)を含めることによって、あるいは単に、基板の上方において液滴との間に電気的接触を確立する「鎖」と称されるワイヤを含ませることによって、作成することができる。J. Berthier et al., NSTI Nanotech 2005, www.nsti.org, vol. 1, 2005。
【0005】
粒子の操作のためのさらなる力には、電熱フロー(ETF)またはAC電気浸透などの、電気流体力学的(EHD)フローによって生成される粘性摩擦力がある。NG. Green, A. Ramos and H. Morgan, J. Phys. D: Appl. Phys. 33 (2000)では、粒子を表示するために、EHDが使用されている。例えば、PCT WO 2004/071668 A1は、上述された電気流体力学的フローを活用して一部の電極上に粒子を集結させるための装置を記載している。
【0006】
「Impedance Spectroscopy Flow Cytometry: On-Chip Label-Free Cell Differentiation(インピーダンス分光フローサイトメトリ:チップ上における無標識細胞の差別化)」, Cytometry Part A 65A: 124-132 (2005), Cheung K, Gawad S, Renuad Pでは、フロー中の粒子を差別化するために、マイクロチップ上に一体化されたインピーダンス差動センサが使用される。
【0007】
「Near-Field Optical Sensors for Particle Shape Measurements(粒子形状測定のための近接場光センサ)」, IEEE Sensor Journal, vol. 3, No. 5, Oct. 2003, pp. 646-651では、一体型センサ(フォトダイオード)のアレイに基づく粒子形状検出のためのチップが記載されている。しかしながら、粒子の動きは、液体の流れによって操作され、これは、例えばポンプまたはその他の類似のメカニズムを必要とする。したがって、解析対象粒子の位置を正確に制御することが不可能である。
【0008】
Medoro et alによるイタリア特許出願:BO 2005A000481では、電極のアレイによって粒子を操作するためのいくつかの方法、ならびにそれらの粒子を検出するためのいくつかの方法および装置が報告されている。しかしながら、これらは、異なる細胞を差別化する能力について、既に触れられた特許:PCT/WO 00/69565と同様の限界がある。
【0009】
最後に、国際特許出願:PCT/IT02/00524には、第1の生物学的実体が、それに結合する機能を有する第2の生物学的実体を通じて認識される(あるいは逆もまた可)方法が、記載されている。この方法では、第1の生物学的実体は、少なくとも一部を選択的にアクティブ化可能およびアドレス指定可能であるとともに少なくとも第2の電極の方を向くように配置された第1の電極のマトリックスによって定められた表面上に固定され、誘電泳動ケージを通して移動される第2の生物学的実体に接触される。そして、第1および第2の生物学的実体の少なくとも一部の間にもし結合相互作用がある場合に、そのような結合相互作用が、好ましくは、電極内に一体化された光センサを使用して、第2の生物学的実体に結合された蛍光基を第1の周波数の放射で励起させ、その蛍光発光を第2の周波数で検出することによって検出される。したがって、やはり、光学的検出に結び付いた「雑音」(「固定パターン雑音」)を排除するという問題が残る。
【発明の概要】
【0010】
本発明の狙いは、上述された欠点がなく、より具体的には、粒子の正確な操作が得られ、同時にまた、固定パターン雑音の欠点に対して実質的に鈍感であるような、あらゆるタイプの粒子の特徴付けおよび/またはカウントを行うための方法ならびに装置を提供することにある。
【0011】
とりわけ、本発明の狙いは、試料中に存在する各粒子の存在を一体型の光センサおよび/もしくはインピーダンス計センサによって検出するならびに/またはそのような粒子の種類を特徴付けるために、そのような粒子を決定論的なまたは統計的な手法で移動させることを目的とした、そのような粒子の位置制御を実行することにある。
【0012】
本明細書において、以下では、「粒子」という用語は、天然にしろ人工にしろ、細胞、細胞成分、ウィルス、リポソーム、ニオソーム、マイクロ球(マイクロスフィア)、およびナノボールなどの、マイクロメートル規模もしくはナノメートル規模の実体、または高分子、たんぱく質、DNA、およびRNAその他など、より小規模な実体を意味するほか、例えば水中の油もしくは油中の水など、懸濁培地に混じらない流体の滴、または気体中の液滴(空気中の水など)、もしくはひいては液体中の気泡(水中の空気など)なども意図するものとする。
【0013】
細胞という用語が使用される場合もあるが、これは、特にことわりがない限り、上述された広義での、粒子の検出および特徴付けにおける、非限定的な使用例であると解釈されるべきである。
【0014】
本発明は、したがって、上記のように、請求項1,3,5,9,11,20,22にしたがった、粒子の特徴付けおよび/またはカウントのための方法ならびに装置に関する。
【0015】
具体的に言うと、不均一な時間的に可変の力場と、一体型の光センサとが使用される。力場は、粒子(固体、液体、または気体)の安定平衡点のセットによって特徴付けられる、正もしくは負の誘電泳動の場、電気泳動の場、または電気流体力学的運動の場であることが可能である。同じ方法は、国際科学界においてエレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック(誘電体に対するエレクトロウェッティング)の名称で知られる効果の活用によって、液滴(液体粒子)の操作に適用される。
【0016】
このように、既知の技術の制限は、本発明によって克服される。
【0017】
本発明にしたがった方法の実現形態は、照明の空間的変化におよび固定パターン雑音に対して鈍感である。さらに、解析対象粒子の位置決めを困難にするポンプもその他の方法で生成される液体の流れも必要とすることなしに、デバイスで操作される粒子を正確に特徴付けおよび分類することが可能である。
【0018】
最後に、粒子を移動させるために流れを利用するアプローチと異なり、粒子をセンサに対して相対的に移動させる制御された力場を使用することによって、例えば力場を受けた粒子の移動速度からなるような、より多量の情報が得られる。したがって、粒子の特性に関するさらなる情報源が得られる。この情報は、異なる種類の粒子を差別化するために有利に使用することができる。
【0019】
添付の図面を参照にして実施される本発明の非限定的な実施形態に関する以下の説明から、本発明のさらなる特徴および利点が明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】電極のアレイを通して行われる力場の生成の原理を示した図である。
【図2】図4および図9のケージの移動に基づいた検出および特徴付けの方法に関連する波形を示した図である。
【図3】(a)ポリスチレン球、(b)K562細胞、(c)赤血球の画像を顕微鏡で見た図である。
【図4】電極より小寸法の粒子を検出/特徴付けするための一連のステップを示した図である。
【図5】およそ15〜20μmの寸法の細胞または球の推移に際して検出される階調値の一般的な時間的進行と、考えられるいくつかの識別パラメータの表示とを示した図である。
【図6】ケージの移動に続くK562の推移に際して検出される階調値の時間的進展を示した図である。
【図7】小細胞またはマイクロ球の推移に際して検出される階調値の一般的な時間的進行と、考えられるいくつかの識別パラメータの表示とを示した図である。
【図8】ケージの移動に続く10μm、6μm、および3μmのそれぞれのポリスチレン球の推移に際して検出される階調値の時間的進展を示した図である。
【図9】電極1つよりは大きいが電極2つよりは小さい寸法の粒子の検出/特徴付けに有用な一連のステップを示した図である。
【図10】全ケージの運動を通して全粒子を同時に検出するために有用な基本的な一連のステップを示した図である。
【図11】図10の一連のステップの実施を通して取得することができる3つの画像を示した図である。
【図12】ケージを運動させる必要なく全粒子を同時に検出するために示された基本的な一連のステップを示した図である。
【図13】図12のケージのアクティブ化および非アクティブ化に基づいた検出ならびに特徴付けの方法に関連する波形を示した図である。
【図14】ケージ中の粒子の検出/特徴付けに有用な別の一連のステップを示した図である。
【図15】粒子の特徴を高解像度で検査するためのデバイスのアーキテクチャを示した図である。
【図16】垂直および水平の両方向への粒子の移動をリアルタイムで決定するためのデバイスのアーキテクチャを示した図である。
【図17】いくつかの異なる照明モードおよび光学的検出モードを示した図である。
【図18】チップ表面上に発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図19】チップの内部層の上に発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図20】チップ表面上に複数の発光フィルタを一体化された、蛍光細胞の検出を促進するための特殊なデバイスについて、その上面および断面を示した図である。
【図21】異なる種類の粒子のカウントを、具体的に3種類の場合について幾何学的に表した図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の狙いは、粒子の操作および/または検出を行うための方法ならびに装置を提供することにある。
【0022】
本発明の方法は、不均一な力場(F)の使用に基づいており、該力場を通って単一粒子または粒子群(BEADS)が、安定平衡の位置(CAGE)に引き付けられる(図1)。このような場は、例えば、負の誘電泳動(NDEP)もしくは正の誘電泳動(PDEP)の場、電気泳動の場(EF)、または電気流体力学的(EHD)運動の場、またはひいてはエレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック(EWOD)であることが可能である。
【0023】
検出は、以下の態様の1つ、または以下の態様の組み合わせに関係することができる。
1.単一粒子のカウントまたは定量化
2.識別および/または特徴付け
3.位置特定
【0024】
これに関係して、インピーダンスの変化の測定、および/または蛍光のかたちで伝えられる、拡散される、もしくは発光される光度の変化の測定が、主として活用される。
【0025】
力の生成
粒子を移動させるための場を、基板上に提供された電極(EL)のアレイを通じて生成するための方法として、既知の技術にしたがった様々な方法が挙げられる(図1)。一般に、カバー(LID)が使用される。これは、電極であってよく、液体懸濁液に含まれた状態の粒子(BEADS)を一般に内部に有するマイクロチャンバの範囲を定める。様々な力の様子が図1に示されている。誘電泳動(DEP)の場合、印加される電圧は、加算符号(+)で示された同相周期電圧(Vphip)と、減算符号(−)で示された異相周期電圧(Vphin)である。異相電圧とは、180度位相が異なる電圧を意味する。場は、粒子に作用する力を生成し、粒子は、平衡点(CAGE)に引き付けられる。負のDEP(NDEP)の場合、もしカバー(LID)が導電性の電極であるならば、既知の技術にしたがって、閉じられた力のケージを生成することが可能である。この場合に、もし隣接する電極が逆位相Vphip(+)につながれなおかつカバー(LID)が位相Vphin(−)につながれているならば、平衡点(CAGE)は、Vphin(−)につながれた各電極に対応して提供される。このような平衡点(CAGE)は、通常、電極から隔てられて液体中に存在するので、粒子(BEAD)は、定常状態において、浮遊している。正のDEP(PDEP)の場合、平衡点(CAGE)は、通常、電極を提供された表面に対応して位置しており、粒子(BEADS)は、定常状態において、表面に接触している。PDEPの場合、PDEPの平衡点は、電場の極大に対応するので、カバーにさらなる電極を設ける必要がない。誘電泳動では、荷電粒子を異極性の電極へと引き付けるために、電極のアレイを使用することができる。電気流体力学的(EHD)運動の場合、電極の構成は、流れが最小の点へと粒子を追い立てる何らかの流れを生成する。EWODの場合は、誘電体を塗布された電極を含むカバー(LID)が一般に使用され、電極のマトリックスは、粒子(一般に空気中の液滴である)を引き付ける必要がある点において、カバーに対して異相の信号によって通電される。粒子をその上に存在させてはならない電極は、反対に、浮動状態にとどまる。EWODの場合は、電極のアレイの上方において空気中の液滴を操作することによって、カバーの代わりに一連のワイヤを使用することが可能である。
【0026】
以下では、簡単を期するため、本発明の方法および装置の説明において、閉じられた負の誘電泳動ケージを実行力として使用することは、単に、本発明の目的のための非限定的な例と見なされる(このため、電極として機能する蓋を使用する必要がある)。当業者ならば、以下で説明される方法および装置を、異なる実行力の使用および異なる種類の粒子に合わせてどのように一般化するかが明らかである。
【0027】
使用されるセンサ:
常に簡潔を期するため、以下では、電極を一体化されたフォトダイオードに入射する光パワーを検出可能にする光センサの場合についてのみ言及される。当業者ならば、以下で説明される方法および装置を、様々な場合に、光センサに代わるまたは光センサと組み合わせた一体型インピーダンス計センサの使用に合わせてどのように一般化するかが明らかである。
【0028】
以下では、簡潔を期するため、「一体型センサの出力信号」の同義語として、「階調レベル」という用語も使用される。この信号は、(フォトダイオードなどの光センサに)「入射する光パワー」に、または測定されたインピーダンス(一体型インピーダンス計センサの場合)に比例していることが可能である。
【0029】
光センサの使用に対応した方法:
光センサの場合、一般に、暗視野(BF)タイプの照明の場合について言及される。この場合、照明は、センサに当たる。暗視野(DF)照明法、または蛍光に基づく方法もまた可能であり、本発明の目的の範囲内である。しかしながら、簡単を期するため、以下で扱われるどの方法でも取り上げられず、ここに記載されるにとどまる。
【0030】
図17には、光センサを使用するためのいくつかの方法が示される。この図は、基板(SUB)内に光センサ(PIXEL)を一体化されたデバイスの断面に関する。センサと、電極(EL)を提供する各種メタライズ層との間の誘電体は、単純に、酸化物(OX)層からなることも、あるいは例えば薄膜ダイクロイックミラー技術によって実現されるフィルタ層(DFL)を含むことも可能である。
【0031】
明視野検出の図(図17−BF)では、光(LIGHT)は、カバー(LID)から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、粒子(BEAD)によって生じた歪みおよび吸収の関数として変化する。
【0032】
暗視野検出の図(図17−DF)では、光(LIGHT)は、センサ(PIXEL)に直接達しない入射角でカバー(LID)を通って入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、直接的に光(LIGHT)が当たったまたは場合によっては電極による反射を経た光(RLIGHT)が当たった粒子(BEAD)からの拡散放射(SLIGHT)の関数として変化する。
【0033】
明視野蛍光検出の図(図17−BFF)では、励起(EXLIGHT)は、カバー(LID)から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、粒子(BEAD)によって発せられた蛍光(EMLIGHT)の関数として変化する。この場合は、発せられた光(EMLIGHT)の信号が励起パワー(EXLIGHT)によって負かされないようにするために、以下の1つまたは複数の工夫を凝らすことが賢明である。
> 励起として発せられる放射の波長のために、フィルタ層(DFL)を使用する。
> 光センサ(PIXEL)が低い量子効率を有するような(すなわちその波長に対し比較的鈍感であるような)励起周波数を使用する。これは、例えば、比較的高い深さにおいてp−n接合を、そして好ましくはUV範囲内の波長の励起放射を使用することによって可能である。波長は、380nm未満であるとなお良い。
【0034】
暗視野蛍光検出(図17−DFF)の図では、励起(EXLIGHT)は、センサ(PIXEL)に直接達しない入射角でカバー(LID)から入り、センサによって検出される光パワーは、実質的に、直接的に光(EXLIGHT)が当たったまたは場合によっては電極による反射を経た光(RLIGHT)が当たった粒子(BEAD)から発せられる蛍光の関数として変化する。しかしながら、発せられた光(EMLIGHT)の信号が、粒子によって拡散された光のパワーによって劣化されないようにするためには、明視野蛍光の場合について上述された1つまたは複数の工夫を凝らすことによって、システムの選択性を向上させることが望ましい。
【0035】
ケージのアクティブ化および非アクティブ化を通じて満ケージを検出するための方法:
図12は、ケージ自体を移動させる必要なくどのケージが満で(少なくとも1つの粒子が封入されている)どのケージが空であるかを検出するための、本発明にしたがった方法の、考えられる一連のステップを示している。この方法は、電極への適用パターンがケージの移動を可能にしないほどに密集している場合にとりわけ適している。さらに、ケージを移動させるための回路がデバイス内に存在しない場合に好都合である。
【0036】
方法は、ケージ(CAGE)への粒子の封入/ケージ(CAGE)からの粒子の解放のために実行の位相を交互させることと、一体型センサ(PIXEL)によって1つまたは複数の画像を取得する感知と、に基づく。
【0037】
図13に、波形が図式化されている。
【0038】
ケージの非アクティブ化に際して、粒子は、ケージに入れられた際に想定される安定平衡の位置(PEQ)から開始して、沈降によって堆積しはじめる、なおかつ/またはブラウン運動の結果として自身を側方に移動させはじめる(図12の右側すなわち図12−t_sense)。これらの移動ゆえに、満のケージにおいて検出される階調レベルは、空のケージに関連したセンサ(ピクセル)において生じる読み出し回路および/または光システムの熱雑音に結び付いた階調レベルの変化と比べ、かなり大きく変化する。
【0039】
空のケージまたは満のケージの分類は、以下のように行われる。
1. (数秒程度から何分の数秒程度の時間に及ぶ)ケージの交互操作(アクティブ化または非アクティブ化)によって、そして(例えば100msなど何分の1秒程度から数十秒程度の時間に及ぶ)1つまたは複数の画像の感知によって、一連の画像が取得される(感知される)。
2. CAGE_IJに関連した各センサPIXEL_IJについて、一連の画像NIMGに関し、次式として定義される階調レベルの非正規化標準偏差(この具体的ケースではセンサに入射する光パワーに比例する)が計算される。
【0040】
【数1】
【0041】
ここで、
【数2】
(一連の画像NIMGにおける、PIXEL_IJの階調レベルの平均値)である。
【0042】
3. 空の基準センサ(PIXEL_REF)における階調レベルの非正規化標準偏差平均:
【数3】
と、非正規化標準偏差の相対標準偏差:
【数4】
とが計算される。
【0043】
4. 分類の閾値が次式により定められる。
【数5】
【0044】
5.ケージIJは、満であるものとして分類され、従って、
【数6】
であり、残りのケージは、空であるものとして分類され、従って、
【数7】
である。
【0045】
興味深いことに、このような方法は、信号のパワーをセンサごとに平均値に照らして考慮するが、このような平均値の絶対値は除外しているので、固定パターン雑音(フォトダイオードの特性のばらつきに結び付いた固定空間雑音)とは無関係である。
【0046】
95%を超える精度を得るためには、一般に、NIMG=50〜100回の測定を行う(すなわちNIMG=50〜100の画像を取得する)と十分である。
【0047】
取得するべき画像の数NIMGの動的測定は、基準ピクセルの標準偏差:
【数8】
をその漸近値に収束させるために必要とされる画像の数を考慮することによって得ることができる。
【0048】
もし光の変化に結び付いた雑音1/fを無視できるならば、この漸近値は一定である(fは、雑音を想定される一般的周波数である)。
【0049】
したがって、より一般論として、光センサが使用される場合について特に言及して今説明された方法は、電極(EL)のアレイによって生成され粒子(例えば細胞)に作用する任意の力場(F)(したがって、誘電泳動の場に限られない)の安定平衡点(PEQ)にもし粒子(BEADS)がある場合に、その粒子の存在を検出することを可能にする。このような方法は、以下のステップを含む。
i. 力場(F)を非アクティブ化する。
ii. 非アクティブ化に続き、なおかつ非アクティブ化された場にある粒子が受ける沈降運動および/またはブラウン運動の力学の関数として選択される、少なくとも一つの時間間隔において、安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベル、および力場(F)の電流構成ゆえに絶対に粒子によって占有されえないような空間領域に関連した第2のセンサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定する。
iii. 力場(F)を再びアクティブ化する。
iv. i)からiii)までのステップを、基準とみなされる第2のセンサ(PIXEL_REF)において測定される階調レベルの値の分散量が漸近値に向かう収束速度と実質的に同程度の回数にわたって繰り返す。
v. 想定される時間的に一連の測定において、とある平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサにおいて検出される階調レベル値の標準偏差が既定の閾値(THR)を上回る結果となる場合に、そのような平衡点を粒子によって占有されているものとして分類する。
【0050】
ケージの運動と階調レベルの静的値の差の測定とによって満のケージを検出するための方法:
図10は、満のケージを、その運動と階調レベルの静的値の解析とを通じて検出するための、本発明にしたがった一連の操作ステップを示している。
1. 第1の時点(t0)において、ケージ(CAGE)は、対応する初期の光センサ(PIXEL_STA)のセット上に粒子(BEADS)を配されている。この構成に対応する階調レベルを有する画像が取得される。
2. 続く時点(t1)において、ケージの運動に結び付いた過渡現象が終わると、粒子は、最終的な光センサ(PIXEL_TGT)に対応して自身を配置する。この構成に対応する階調レベルを有する新しい画像が取得される。
3. 時点1および時点2の画像に関連した階調レベルの差分画像が決定される。
4. 差分画像の絶対値が決定される。
5. 各ケージの開始位置および最終位置に関連したピクセル対(PIXEL_STA,PIXEL_TGT)についての階調レベル結果が決定される。
6. ステップ1〜4がNDIFF回にわたって繰り返され、ステップ5において決定された絶対変化に関連する各ケージに関する階調レベルが蓄積される。
7. ケージのアクティブ化/非アクティブ化による分類について上述されたのと同様に、取得された全ての差分画像NDIFFについて、この場合は、確実に空のセンサ(ピクセル)(例えばケージのロウ間のピクセルなど)に対応する差の絶対値の平均および標準偏差を考慮して、分類の閾値THRが決定される。
【0051】
より一般論として、電極のアレイ(EL)によって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)にもし粒子がある場合は、その粒子(BEADS)の存在の検出は、以下の手順によって行われる。
i) 先ず、安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_STA)によって生成される階調レベル、および力場(F)のこの第1の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定する。
ii) 次に、第2の電流構成を付与するために、力場(F)を変更する。このとき、安定平衡点は、第1のセンサとは異なる第2のセンサ(PIXEL_TGT)に対応して移動される。
iii) 次に、第2のセンサ(PIXEL_TGT)によって生成される階調レベル、および力場(F)のこの第2の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定する。
iv) 先行する時点において検出された階調レベル値の間の差(DIFF_IMG)を決定する。
v) ステップi)〜iv)を繰り返す。
vi) 安定平衡点(PEQ)を粒子に占有されたものと占有されていないものとに分類するために、示差階調レベル値を処理する。
【0052】
このような処理は、vii)階調レベルの差の絶対値を決定するステップと、次いで、viii)場(F)の第1および第2の電流構成では粒子に占有されえないような基準センサに関連した階調レベルの平均的変化を大幅に上回る変化を有するセンサに関連した平衡点を、占有されたものとして分類するステップと、を含む。
【0053】
画像の差の絶対値に基づくこの方法も、やはり、固定パターン雑音に影響されず、ケージのアクティブ化/非アクティブ化による方法と同様に、照明のむらに対して比較的鈍感である。
【0054】
第1の方法と比べて、この方法は、ケージを移動させるための回路と、もしケージに封入された細胞がある場合にその移動を一義的に決定するためにケージの運動を可能にするケージ間の距離と、を必要とするという不利点を有する。
【0055】
この方法の利点の1つは、一般に、一定の質の(誤差率の低い)分類を得るために必要とされる画像が少ない(なおかつ時間が短い)ことにある。ケージのアクティブ化/非アクティブ化の方法の場合は、より多くの画像と、より長い時間とが必要とされる。
【0056】
図11には、単一ステップ(NDIFF=1)によって得られる結果が示されている。図11(a)には、光学顕微鏡によって検出可能な画像が報告されており、図11(b)には、対応する階調値のマップが(固定パターン雑音を補償されている)示されており、反対に、図11(c)には、初期の階調値を有する画像と右方向への移動後の画像との差の絶対値の正規化画像が示されている。
【0057】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とによって満のケージを検出するための方法:
図2は、ケージ自体の移動を通じてケージ中の粒子の存在を動的に検出するための方法のステップにおける波形を示している。
【0058】
先ず最初に、ケージの移動が行われるが、粒子が新しい平衡位置に沈降するのを待つことなく、運動ケージに内包された細胞(粒子)が運動している下にある光センサにおいて、その信号の変化が検出される。
【0059】
図4は、IJ位置にあるケージの運動と、光センサ(PIXEL_IJ)上における粒子(BEAD)の推移を決定する平衡点(PEQ)の移動と、をともなう一連のステップを示している。
【0060】
粒子(BEAD)の寸法が電極のそれより大きい場合、センサは、変化を測定するが、粒子を上に有さないピクセルに関する基準値に達することができない。この場合は、図9のような、僅かに異なる図を採用することができる。この場合は、電極より大きい寸法のケージの縁にあるピクセル(PIXEL_IJ)において階調値を測定することによって、電極の実寸法の二倍の寸法の電極を有する場合に相当する状況が再現される。
【0061】
この技術は、ある意味では、(もしフォトダイオードが細胞と同程度の大きさでなおかつこれが垂直に移動される場合に)細胞の水平断面についての積分を考慮して入射パワーに関連した階調値を検出することによって、細胞を走査することを可能にする。以下に示す実行の負荷サイクルを変化させることによって、異なる走査速度が得られる。
【0062】
【数9】
【0063】
これらの操作は、ケージが満である場合に発生する光度の頂点および谷に基づいて粒子の存在を検出することを可能にする。センサの信号を処理することによって、当業者ならば、満のケージを空のケージと区別することを可能にする一連のパラメータ(例えば階調値のピークツーピーク振幅)を容易に検出することができる。
【0064】
したがって、本発明の方法のこの変更形態にしたがうと、電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)にもし粒子がある場合、その粒子(BEADS)の存在は、以下のステップを行うことによって検出される。
i) 粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって安定平衡点(PEQ)が移動されるように、力場(F)を変更する。
ii) 異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
iii) センサによって生成される階調レベルの測定の時間的進展の特性パラメータの測定を通じて、粒子が存在するかまたは欠如しているかの分類を行う。階調レベルは、例えば光センサの場合、入射する光パワーに基づいて生成される。
【0065】
センサによって生成される階調レベルの測定、すなわちセンサに当たる光パワーの測定は、粒子に作用する場をアクティブ化するステップと、上記の場を非アクティブ化するステップとを交互に行うことによって、入射する光パワーをすなわちこうして得られる階調レベルを後ほど測定することによっても、明らかに実現可能である。これは、センサの読み出しによって実行電圧間に生じるあらゆる干渉を、たとえ原則的には実行電圧のアクティブ化に対するセンサの実質的独立性があれば不要ではあるものの、回避するのに有利である。
【0066】
光パワーの測定の時間的進展のパラメータは、階調レベルのピークツーピーク振幅を含むことが好ましく、分類は、好ましくは、想定される力場(F)の構成では粒子によって占有されえないような基準センサにおける光パワーすなわち階調レベルのピークツーピーク測定を、基準センサのピークツーピーク値の標準偏差に比例する係数で増大させることによって決定される、閾値との比較を通じて行われる。
【0067】
このようにして、基準センサ上にある環境照明に起因する雑音1/fも補償される。
【0068】
誤差補償をともなった、満のケージの数に基づいて細胞をカウントするための方法:
上述された方法によって、満のケージの数が決定される。本発明の狙いは、ケージ中の細胞をカウントするための方法を見いだすことにもある。これによって、想定される試料の体積がわかるうえ、細胞の濃度も得られる。
【0069】
第1近似として、とりわけ、ケージあたりの平均細胞数が約0.1を大幅に下回る場合は、満のケージの数は、細胞の数とおおよそ同程度である(この場合は約5%、細胞数が過小評価される)。より高い平均細胞数の場合、本発明にしたがうと、チップ上の実際の細胞数をより高い精度で近似するカウントを得るために、ケージあたりの細胞数の分布統計を補償することができる。
【0070】
以下の仮定が想定される。
1. 細胞は、単位体積あたりに均一に分布される。この仮定は、試料が空のマイクロチャンバに注入される場合は全面的に立証される。反対に、予め緩衝材で満たされたマイクロチャンバに試料が注入される場合は、試料のフロープロファイルに結び付いた細胞密度の変化ゆえに、試料は、局所的にのみ均一である可能性がある。
2. ケージあたりの最大細胞数に結び付いた束縛は、無視することができる。
【0071】
この仮定は、細胞の総体積(平均細胞数あたりの平均細胞体積)がケージの体積(各ケージの引力ボールの体積を意図する)より適度に小さい場合に立証される。
【0072】
これらの仮定のもとでは、細胞の統計的分布は、二項分布によって表される。ここで、
NCAGES=チップ(または想定される部分)内のケージの数
n=NCELLS=チップ(または想定される部分)内の細胞の数
として定義するものとする。ここで、「チップ」とは、電極ELのアレイによって形成されたセットを意図しており、これは、通常、センサPIXELとともに単一の多層チップ内に正確に一体化される。
【0073】
そして、ある細胞が任意のケージの引力ボールに属する確率は、
p=1/NCAGES
である。
【0074】
ケージあたりk個の細胞がある確率は、次式から得られる。
【数10】
ここで、
【数11】
は、n個からk個を一度に選ぶ組み合わせの数である(二項分布)。
【0075】
ケージあたりの細胞の平均値(ケージあたりの平均細胞数:ACPC)は、
【数12】
である。
【0076】
一般に、チップ上には多くのケージがあるので、ケージあたり1,2,...,k個の細胞を有する確率を、ケージの数で乗じることによって、1,2,...,k個の細胞を有するケージの実際の値をよく近似することができる。これを考慮に入れ、さらに、空のケージおよび満のケージの総数が検出されれば、検出値に対応する満のケージおよび空のケージの期待数を提供する値を計算することによって、ケージあたりの平均細胞値(ACPC)を推定することができる。
【0077】
空のケージの期待値は、次式として計算され、実際に検出された空のケージの値で置き換えることによって、細胞をカウントすることができる。
【0078】
【数13】
【0079】
これは、
【数14】
などの単純な推移を経て計算される。
【0080】
こうして、細胞数の優れた推定が得られ、そして、もし空のケージおよび満のケージの数が統計的に多数であるならば、1を上回るACPC値の場合もまた、優れたカウント精度が得られる。このようにして、実際は、満のケージのみをカウントするその他の場合に見られる細胞数の過小評価に結び付いた誤差が軽減される。言うまでもなく、空のケージの検出数(ECmeasure)は、ゼロより大きくなければならず、ケージの数NCAGES未満またはそれに等しくなる。以下の表は、ケージが6,400個であるような具体的な一例を、様々な細胞濃度の場合について数値的に示している。表からわかるように、カウント誤差は激減されており、これは、ケージあたりの平均細胞濃度が高い場合にとりわけ顕著である。実際は、報告値は、確率の密度に基づくものに過ぎないが、多数のケージを想定すれば、確率推定によって、予想される測定値をよく近似することが可能である。
【0081】
【表1】
【0082】
言い換えると、本発明にしたがうと、ここまでに説明されてきた任意の方法にしたがって実施される満のケージおよび空のケージのカウントによって、電極ELのアレイとカバー(LID)とによって範囲を定められたチャンバに注入される試料中に実際に存在する粒子(例えば細胞)の総数のカウントを得ることができ、予め一般的存在を検出されている単一粒子をカウントするステップは、本発明のこの態様にしたがって、以下のように、統計的基礎に基づいて推定方式で行われる。
a) 電極(EL)のアレイによって生成される場(F)の中に存在している、いかなる粒子(BEAD)も含まない、以下ではケージとも称される安定平衡点(PEQ)の数(ECmeasure)が、センサによって測定される。
b) 粒子(BEAD)のカウント(NCELLS)が、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数といかなる粒子も含まない安定平衡点(PEQ)の測定数(ECmeasure)の対数との差の、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数と安定平衡点(PEQ)の数から1を引いた数(NCAGES−1)の対数との差に対する比率として決定される。
【0083】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とを通じてケージ中の細胞を特徴付けるための方法:
図3に示されるように、球(例えば図3(a))、ある種類の細胞(例えば図3(b)にあるようなK562)、または別の種類の細胞(例えば図3(c)にあるような赤血球)は、異なる寸法、形状、吸光度プロファイル、および屈折率を有するので、ケージにセンサの上を通らせることによって、それが満であるかどうかを検出するのみならず、本発明のさらなる一態様にしたがえば、もし粒子が存在する場合はその粒子の種類を特徴付けることが可能である。
【0084】
細胞(および特定の種類のマイクロ球)は、負ピーク(細胞の暗い縁部分)および正ピーク(細胞が光を集中させる明るい中心部分)をともなう階調レベルの変化を発生させる光の歪み(ある種のレンズ効果)を呈する。
【0085】
図5に報告される、重要だが非限定的な例にあるように、階調レベルの負ピーク(Gnp)および正ピーク(Gpp)の振幅の測定、ならびに例えばケージの運動と第1の階調変化の検出との間の遅延(td)、あるいはさらには変化の時間的長さなどの、階調レベルの動的進化に結び付けられたパラメータを、追加の情報を得るためおよび細胞の種類を分類するために使用することが可能である。
【0086】
式:
第一近似として、移動速度は、誘電泳動移動度に比例し、v ∝ k・R2となる。したがって、第一近似としての階調レベルの変化の長さは、次式の通りである。
【0087】
【数15】
【0088】
すなわち、粒子の半径に反比例する(Rが増大すると減少する)。実行と階調レベルの変化の開始との間の時間遅延tdは、第一近似として(単一電極上に一細胞がある図4の場合)、次式に等しくなる(やはりRが増大すると減少する)。
【0089】
【数16】
【0090】
図6は、K562細胞について測定された実際の過程を示している。
図7は、透明でない球、または上記の「レンズ」効果よりも吸光度の効果のほうが支配的であるような小細胞について期待される一般的な過程を示している。
図8は、ケージの移動に続く10μm、6μm、および3μmのポリスチレンの球の推移に際して検出された階調値の時間的進展を示している。
【0091】
適切な識別パラメータを抽出することによって、当業者にとって明らかな方法で、満のケージおよび空のケージの分類について上述されたのと同様に、分類の基準を定めることが可能である。
【0092】
具体的に言うと、識別方法は、粒子の際立った特性を抽出すること、ならびにニューラルネットワークに基づくアルゴリズム、第1の閉じられたks、閾値アルゴリズム、および/または主成分解析、またはこれらを組み合わせたものなどを使用することを含むことができる。
【0093】
図14は、同じ原理に基づく代替の一技術を示している。この技術によれば、細胞をセンサの上方で側方に移動させることによって、細胞を、水平断面内において、より高い解像度で走査することが可能である。実際、想定される細胞の「薄片」は、より小寸法である。細胞の通過にともなって、取得中の点の数に等しい水平解像度および電極間のギャップ(距離)に等しい垂直解像度で、階調値の導関数から、細胞の水平断面に沿った階調値の点値を計算することができる。
【0094】
したがって、上述された内容に基づくと、本発明は、電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する粒子(BEADS)を、以下のステップを行うことによって特徴付ける(すなわち、例えばそれらの物理的性質を確立する)ことも可能にすることがわかる。
a. 上記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって上記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、力場(F)を変更する。
b. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
c. 粒子の性質を推定するために、階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理する。
【0095】
この全体は、常に、センサによって検出可能な背景「雑音」、すなわち固定パターン雑音による影響を受けない。
【0096】
使用されるセンサが光センサであり、なおかつ階調レベルの測定がセンサに当たる光パワーの測定であるような説明された例では、このような測定は、好ましくは、以下のステップ:
i. 粒子に作用する場をアクティブ化する。
ii. 場を非アクティブ化し、入射する光パワーを測定する。
を交互に行うことによって実施される、あるいは、ケージ中の粒子の存在を動的に検出するためのものとして上述されたのと同じ好ましいシステムを使用して実施される。光パワーの測定の時間的進展のパラメータは、上述された内容に基づいて、
i. 力場(F)の変化と、光パワーの第1の変化との間の遅延(td)、
ii. 光パワーの一過性の変化の長さ(tw)、
iii. 光パワー値の正ピーク(Gpp)の振幅、および
iv. 光パワー値の負ピーク(Gnp)の振幅、
からなる群より選択される少なくとも1つのパラメータを含む。
【0097】
異成分からなる試料中の異種の細胞をカウントするための方法:
本発明にしたがうと、単一集団の細胞をカウントするための方法論を、単一ケージ中の粒子を特徴付けるための方法論と組み合わせることによって、異種の粒子からなる試料の組成を決定することが可能である。
【0098】
一般に、2つ以上の細胞を含むケージ中の粒子の組成を差別化することは容易でない。しかしながら、ケージ内容の特徴付けを目的として上述のように記録された、階調レベルの力学を処理すれば、そのケージが単一粒子を含むのか、あるいは多様な粒子(MC)を含むのかを決定することは、比較的簡単である。
【0099】
異種の粒子の分布は、互いに独立している(直交している)とみなすことができる。したがって、単一粒子をともなうケージにおいて得られる各種類の粒子の数と、空のケージ(EC)の数およびケージの総数に関する情報を組み合わせれば、数値的な手順を経て、異種集団の粒子の数を推定することが可能である。問題は、NPTが変化する関数の最小化である(ここで、NPT=粒子の種類の数である)。図21には、NPT=3である場合の問題が報告されている。
【0100】
各種類の粒子:t=1,...,NPTについて、複数の粒子(NCELLSt)の存在が想定される場合、ケージの中にある種類t単独の粒子の数(その他の種類の粒子は無視する)を表しているNPT次元の空間を有する超立方体の体積は、事実上、固定値(Pt_1)のままである。図21(a)を参照すると、第1の種類の粒子について、単一ケージではP1_1個の粒子が、複数ケージではP1_M個の粒子が、種類P1の粒子をともなわないケージではP1_0個の粒子が得られる(図示された体積の測定値である)。単一ケージ中における種類tの粒子の検出数は、しかしながら、同じケージ中に1つまたは複数のその他の種類の粒子が存在しうることを考慮に入れる必要がある。したがって、図21(d)に示されるように、各種類tの単一粒子の検出値(Pt_1_MEAS)は、異種の粒子を少なくとも1つ含むq<>t、h>0の超立方体をともなう場合に、種類tの粒子の超立方体の体積(Pt_1)からPt_1とPq_hとの超立方体交差部分の体積を引いた値に相当する。空のケージの超立方体の体積(EC_MEAS)も知られている。
【0101】
値のセット:NCELLSt(t=1,...,NPT)は、数値的に計算される。こうして、(統計的)期待値は、各種類tの単一粒子をともなうケージの実測数(Pt_1)および空のケージの実測数(EC_MEAS)に、より良く対応することができる。
【0102】
したがって、上述された内容に基づくと、本発明は、電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する多様な種類(NTP)の粒子(BEADS)の数を、以下のステップの実行を通じてカウントすることも可能にすることがわかる。
a. 上記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって上記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、力場(F)を変更する。
b. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定する。
c. 関連のケージが空であるか、またはある種の粒子を含むかもしくはより多くの粒子を含むかを検出するために、各安定平衡点(PEQ)に関連した階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理する。
d. 各種の単一粒子をともなうケージの測定値(Pt_1_MEAS)および空のケージの測定値(EC_MEAS)により良く近似される、各種の粒子のカウント(NCELLSt)の組み合わせを数値的に決定する。
【0103】
ケージの運動と階調レベルの動的値の測定とを通じてケージ中の細胞を高解像度で特徴付けるための装置:
本発明にしたがうと、これまでに説明されてきた動的検出方法の解像度を高めるためには、より高い空間解像度によって特徴付けられるフォトダイオード(PIXEL_V1,…,PIXEL_VN)に関連した一連の電極(EL)を組み合わせる(図15)ことによって、粒子を様々な電極の上で順次移動させ、粒子の様々な断面を順次解析することが可能である。
【0104】
解像限界は、このように、フォトリソグラフィ解像度の最小形状によって決定され、電極(ピクセル)のアドレス指定用に異なるトランジスタを配置する必要がなく、所要面積を増大させなくてすむ。例えば、フォトダイオードの上に配されるめっきの上に、何らかの開口(SLITS)を設け、その開口に対応する部分でのみ高感度にすることができる。
【0105】
このように、上記安定平衡点(PEQ)は、粒子(BEADS)が複数のそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移されるように移動され、センサ(PIXEL_IJ)は、光センサであり、粒子およびセンサ自体の寸法を大幅に下回る空間部分に入射する光パワーがセンサによって検出されるように(比較的小さい既定の振幅の開口SLITSを備えた上記めっき層を通して)シールドされるような、さらなるステップを、これまでに説明されてきた全ての方法において、実施することができる。
【0106】
ケージの移動速度の自動制御によって細胞を操作するための方法:
こうして、ケージの移動速度の自動制御による操作の方法は、上述のように、細胞の推移検出の使用に基づくことが可能である。軌跡に沿った次のステップを直ちに開始させるため、(電極のアレイをともなう)チップ上で運動している細胞を有するケージについて、階調レベルの進化を監視するとともに、新しい平衡点への沈降遷移の終わりを検出することができる。異なる瞬間における異なる粒子の速度に時間を動的に適応させることによる、時間の最適化のほかに、このようなアプローチもまた、各細胞がブロックされたままにないように保証することができる。
【0107】
1つの電極あたり1つの光センサが、例えば図4に示されるように2つの電極間の垂直ギャップ(距離)などに関連付けられる場合、この方法は、幅1電極×縦2電極(水平位置に1電極×垂直位置に2電極)のケージを使用して行うことができる。実際、水平移動の場合は、粒子は、2つの電極間のセンサ上において自身を全速力で位置付けし、その運動は、初期平衡点および/または最終平衡点に対応してセンサを監視することによって追跡することができる。これは、ケージの形状に対して束縛をもたらすが、後述される装置の使用によって克服することができる。
【0108】
ケージの寸法に対する束縛をともなうことなくケージの移動速度の自動制御によって細胞を操作するための装置:
図16には、水平方向の運動決定のためのセンサ(PIXEL_H)および垂直方向の運動決定のためのセンサ(PIXEL_V)の両方のセンサ(ピクセル)を有する装置の図である。このような装置は、ケージの移動速度の1つに統合されたかたちで実施される閉鎖制御によって粒子の操作を実現するのに有利である。この装置を使用すれば、1×1のケージによる水平移動も可能である。なぜならば、いかなる場合も、細胞/粒子は、2つの電極間に水平軸に沿って配されたセンサ(PIXEL_H)上を推移するからである。
【0109】
今説明されたさらなる方法および装置を使用すれば、上述された粒子の検出および特徴付けの全ての方法に適用することが可能なステップを実現することができる。該ステップは、新しい平衡地点への粒子の沈降遷移の終わりを決定し、この測定から、新しい安定平衡点(PEQ)に向かう粒子(BEADS)の移動速度へと戻るために、粒子を含む安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルの変化の過程を制御することからなる。このような沈降遷移の終わりでは、所望の既定の軌跡(図15において矢印によって示される)に沿って安定平衡点(PEQ)の新たな移動を生じさせる目的で、電極自身によって生成される力場(F)の変化を(例えば電極ELのアレイの、さらには既知のタイプの制御ユニットCTRLに実装された適切なソフトウェアを通じて(図15))自動的に生成することができる。
【0110】
ケージ中の細胞を蛍光によって検出するおよび/または特徴付けするための、一体型ダイクロイックフィルタをともなう装置:
細胞の蛍光検出および/または蛍光特徴付けを目的として、本発明にしたがったいくつかの好ましい実装形態が報告されている。これらの実装形態は、蛍光発光は通過させるが励起は軽減させるようなフィルタ素子を一体化されている。これらのフィルタ素子は、ダイクロイックフィルタの実現に適した屈折率を有する材料を薄膜状に堆積させるなどの、チップの実行よりも下流のプロセスステップによって、一体化することができる。フィルタ効果は、センサ(PIXEL)によって検出される励起帯中の光パワーの一部を軽減させることによって、センサ自体のダイナミックレンジに結び付けられた必要条件を減らすことができる。
【0111】
図18には、蛍光細胞の検出および/または特徴付けにとりわけ適した装置の図が示されている。発光に対応する周波数を通過させるダイクロイックフィルタ(DFL)が、当業者に知られた技術によって、チップ上に堆積される。堆積後は、電極(EL)と液体との間の電気的接触を向上させる狙いで、オプションとして、電極自体に対応していくつかの窓がダイクロイック層上に開けられる。このようにすれば、例えば、誘電泳動の場合、ダイクロイックフィルタで構成された誘電体層の存在に結び付いた電圧降下をともなうことなく高伝導性の溶液をも使用することが可能になる。この実行方式は、標準的なCMOSウエハの製造の使用に適合しており、ウエハのポスト処理のみを必要とする。
【0112】
あるいは、ダイクロイックフィルタは、図19に示されるように、電極の下方で実現することができる。これは、CMOSプロセスが変更可能である場合に有用である。また、CMOSプロセスの変更がない場合でも、この図は、より複雑ではあるが、フィルタをあてがうこと、CMOSの頂部金属にコンタクトを開けること、および電極(EL)を実現するためにさらなるめっきを施すこと、によって表されるポスト処理を実施することによって実現可能である。電極(EL)の上方であるか下方であるかによらず、図20に示されるように、異なる通過帯(DFL1,DFLN)を有する空間的に組織された複数のダイクロイックフィルタを実現すると有利である。これは、細胞/粒子の蛍光を異なる発光周波数で分割および個別検出するのに有用である。
【0113】
明らかなように、細胞の位置をチェックすることによって、それらを例えば異なる蛍光の存在について、異なるセンサ上において順次解析することが可能である。今説明された本発明のこの態様にしたがうと、本発明は、上述されたような、粒子の検出および/または特徴付けのための装置に関するが、さらに、センサのシールド手段と、各センサについて少なくとも1つの数の開口とを有する。開口は、シールド手段を通じて得られ、検出される/特徴付けられる粒子よりも小さい既定の寸法を有する。
【0114】
本発明にしたがった装置は、さらに、センサ(PIXEL)が光センサである場合にセンサを少なくとも部分的にシールドするように構成された、既定の通過帯を有する少なくとも1つのダイクロイックフィルタを含むことができ、好ましくは、それぞれが他と異なる通過帯を有し、間で重なり合うようになおかつセンサ(PIXEL)を少なくとも部分的にシールドするように配置された、複数のダイクロイックミラーを含む。もし、少なくとも1つのダイクロイックフィルタが電極(EL)を覆うように配置される場合は、それは、各電極の少なくとも一部に対応して設けられた割り込み開口を備えている。
【0115】
励起のフィルタリング:
装置は、解析対象となる各蛍光に合わせて(外部で)励起源がフィルタリングされ最適化されるという事実をうまく活用してもよいし、しなくてもよい。これは、デバイスに一体化されていないフィルタによって容易に実現することができる。これに加えて、あるいはこの代わりに、チップの蓋に、チップのピクセルごとに異なってもよいし異ならなくてもよい下位のダイクロイックフィルタに対応した励起フィルタリングの一部を一体化することも可能である。
【0116】
蓋に励起フィルタリングが一体化される場合は、異なるピクセルの励起間のクロストークを回避するために、均一なダイクロイックフィルタを有するゾーンを広くする必要がある。この場合、被試験細胞は、異なる蛍光について解析されるために、より長い距離を網羅しなければならない。本発明のこの追加の態様にしたがうと、これまでに説明されてきた装置は、したがって、検出される/特徴付けられる粒子を含む流体試料の受け取りおよび内包に適したチャンバまたはマイクロチャンバを前記電極のアレイと協働して定めるカバー(LID)に対応して配置された、既定の通過帯を有する少なくとも一つのダイクロイックフィルタを含むことができる。
【0117】
照明雑音の補償方法ころん
上述された全ての方法において、光センサが使用される場合、粒子の検出または特徴付けのための信号は、照明のパワーに依存する。したがって、この種の変化は、検出される光パワーのレベルに、信号(粒子の存在および/または位置)に結び付かない何らかの変化を生じさせる可能性がある。これは、普通は問題にならないが、これらの方法は、このような変化を基準ピクセル(入射する光パワーが照明のパワーによってのみ影響される空のケージに確実に対応するピクセル)の平均検出に対して正規化された値を使用して補償することによって、性能を向上させる(精度を上げる、速度を上げる)ことが可能である。
【0118】
これは、低周波数の照明雑音に、主として当てはまる。なぜならば、雑音パワーのスペクトル密度(1/fに比例する)ゆえに、それによる影響力がより大きくなるからである。
【0119】
インピーダンスセンサのための雑音補償方法:
上述された全ての方法において、インピーダンス計センサが使用される場合、粒子の検出および特徴付けのための信号は、粒子の懸濁培地の導電率および誘電率に依存し、これらは、ひいては、例えば温度、塩濃度、他の分子その他に依存する。したがって、これらの変化は、検出されるインピーダンスのレベルに、信号(粒子の存在および/または位置)に結び付かない何らかの変化を生じさせる可能性がある。これは、普通は問題にならないが、これらの方法は、このような変化を基準ピクセル(インピーダンスが懸濁培地の導電率および誘電率によってのみ影響される空のケージに確実に対応するピクセル)の平均検出に対して正規化された値を使用して補償することによって、性能を向上させる(精度を上げる、速度を上げる)ことが可能である。
【0120】
したがって、想定される力場(F)の電流構成では粒子によって絶対に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)の平均検出に対して正規化された値を使用して、上記センサ(PIXEL_IJ)によって検出される階調レベルを補償することからなる、さらなるステップを、これまでに説明されてきた全ての検出および特徴付けの方法において、導入することができる。
【0121】
用途に関する備考:
これまでに説明されてきた方法および装置は、一般的な使用に関するものであり、複数の用途を見いだすことができる。本発明を限定しない例として、最も重要ないくつかの用途が挙げられる。
○ 血液試料を解析する:(例えば閉じられた誘電泳動ケージを使用している)チップ上に試料を導入することによって、赤血球は、占有されている全てのケージを第一近似としてカウントすることによって、その数をカウントすることができる(実際は、存在の可能性があるその他の細胞は非常に濃度が小さいので、通常必要とされる精度の場合は無視できる)。
○ Emochroma:血液中の細胞の数および種類を特徴付ける:この場合、存在する各単一細胞の正確な特徴付けを実施するための上述された方法が用いられ、その細胞を赤血球、血小板、リンパ球などに分類する。
○ 試料中に存在するバクテリアをカウントする:既知の量の試料を(閉じられたDEPケージを有する)チップ上に注入することによって、存在する全てのバクテリアが検出され、もし光センサによって検出される特性サインを通じて区別可能であるならば、必要に応じてバクテリアの種類が検出される。
○ 混合集団から、蛍光で標識された細胞を分離する/カウントする。この種の問題は、研究および診断の両方に広く普及している。
【0122】
例えば、牛乳、ヨーグルト、アイスクリームの調製品などの、乳製品の試料中のバクテリアを検出することができる。
【0123】
別の一例として、葡萄マストの発酵用のバクテリア(例えば環境保護の用途)を検出することができる。
【0124】
さらなる一例として、飲用水中に存在するバクテリアを検出することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する可能性がある前記粒子(BEADS)の存在を検出するための方法であって、
i. 力場(F)を非アクティブ化するステップと、
ii. 非アクティブ化に続き、なおかつ非アクティブ化された場にある前記粒子が受ける沈降運動および/またはブラウン運動の力学の関数として選択される、少なくとも一つの時間間隔において、前記安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベル、および前記力場(F)の電流構成ゆえに絶対に粒子によって占有されえないような空間領域に関連した第2のセンサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定するステップと、
iii. 力場(F)を再びアクティブ化するステップと、
iv. i)からiii)までのステップを、基準とみなされる前記第2のセンサ(PIXEL_REF)において測定される階調レベルの値の分散が漸近値に向かう収束速度と実質的に同程度の回数にわたって繰り返すステップと、
v. 想定される時間的に一連の測定において、とある平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサにおいて検出される階調レベルの値の標準偏差が既定の閾値(THR)を上回る結果となる場合に、そのような平衡点を粒子によって占有されているものとして分類するステップと、
を備える方法。
【請求項2】
請求項1に記載の方法であって、
前記閾値(THR)は、粒子によって占有されえないような前記空間領域に関連した前記第2のセンサ(PIXEL_REF)において検出される階調レベル値の平均値を、前記第2のセンサ(PIXEL_REF)において検出される階調レベルの標準偏差値に比例する係数で増大させたものに相当することを特徴とする、方法。
【請求項3】
電極のアレイ(EL)によって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する可能性がある前記粒子(BEADS)の存在を検出するための方法であって、
i) 前記安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_STA)によって生成される階調レベル、および前記力場(F)の第1の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定するステップと、
ii) 第2の電流構成を付与するために、前記力場(F)を変更するステップであって、前記安定平衡点は、第1のセンサとは異なる第2のセンサ(PIXEL_TGT)に対応して移動される、ステップと、
iii) 第2のセンサ(PIXEL_TGT)によって生成される階調レベル、および前記力場(F)の前記第2の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定するステップと、
iv) 先行する時点i)およびiii)において検出された階調レベル値の間の差(DIFF_IMG)を決定するステップと、
v) ステップi)〜iv)を繰り返すステップと、
vi) 安定平衡点(PEQ)を粒子に占有されたものと占有されていないものとに分類するために、示差階調レベル値を処理するステップと、
を備える方法。
【請求項4】
請求項3に記載の方法であって、
このような処理は、階調レベルの差の絶対値を決定するステップと、場(F)の前記第1および第2の電流構成では粒子に占有されえないような前記基準センサに関連した階調レベルの平均的変化を大幅に上回る変化を有するセンサに関連した平衡点を、占有されたものとして分類するステップと、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項5】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する可能性がある前記粒子(BEADS)の存在を検出するための方法であって、
i) 前記安定平衡点(PEQ)を移動させ、前記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させるように、前記力場(F)を変更するステップと、
ii) 前記異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベルを、新しい平衡位置への前記粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定するステップと、
iii) 前記センサ(PIXEL_IJ)によって測定される階調レベルの時間的進展の少なくとも一つの特性パラメータの測定を通じて、粒子が存在するかまたは欠如しているかの分類を行うステップと、
を備える方法。
【請求項6】
請求項5に記載の方法であって、
前記センサ(PIXEL_IJ)における階調レベルの測定の時間的進展の前記特性パラメータは、ピークツーピーク振幅を含むことを特徴とする、方法。
【請求項7】
請求項6に記載の方法であって、
分類は、想定される力場(F)の構成では粒子によって占有されえないような基準センサにおける階調レベルのピークツーピーク測定を、前記基準センサの前記ピークツーピーク値の標準偏差に比例する係数で増大させることによって決定される、閾値との比較を通じて行われることを特徴とする、方法。
【請求項8】
請求項1ないし7のいずれかに記載の方法であって、さらに、
存在を検出された粒子の総数をカウントするステップを備え、
前記カウントするステップは、統計的基礎に基づく推定方式によって、
i 電極(EL)のアレイによって生成される場(F)の中に存在する、いかなる粒子(BEAD)も含まない安定平衡点の数(ECmeasure)が、センサによって測定され、
ii) 粒子(BEAD)のカウント(NCELLS)が、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数といかなる粒子も含まない安定平衡点(PEQ)の測定数(ECmeasure)の対数との差の、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数と安定平衡点(PEQ)の数から1を引いた数(NCAGES−1)の対数との差に対する比率として決定される、
ように行われることを特徴とする、方法。
【請求項9】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する前記粒子(BEADS)を特徴付けるための方法であって、
i. 前記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって前記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、前記力場(F)を変更するステップと、
ii. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベルを、新しい平衡位置への前記粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定するステップと、
iii. 前記粒子の性質を推定するために、階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理するステップと、
を備える方法。
【請求項10】
請求項9に記載の方法であって、
階調レベルの時間的進展の前記パラメータは、
i. 力場(F)の変化と、階調レベルの第1の変化との間の遅延(td)、
ii. 階調レベルの一過性の変化の長さ(tw)、
iii. 階調レベルの正ピーク(Gpp)の幅、および
iv. 階調レベルの負ピーク(Gnp)の幅、
からなる群より選択される少なくとも1つのパラメータを含むことを特徴とする、方法。
【請求項11】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する多様な種類(NTP)の前記粒子(BEADS)の数を、
i. 前記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって前記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、前記力場(F)を変更するステップと、
ii. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定するステップと、
iii. 関連のケージが空であるか、またはある種の粒子を含むかもしくはより多くの粒子を含むかを検出するために、各安定平衡点(PEQ)に関連した階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理するステップと、
iv. 各種の単一粒子をともなうケージの測定値(Pt_1_MEAS)および空のケージの測定値(EC_MEAS)により良く近似される、各種の粒子のカウント(NCELLSt)の組み合わせを数値的に決定するステップと、
の実行を通じてカウントするための方法。
【請求項12】
請求項5、9、または11に記載の方法であって、
前記安定平衡点(PEQ)は、前記粒子(BEADS)が複数のそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移されるように移動され、前記センサ(PIXEL_IJ)は、光センサであり、粒子の寸法を大幅に下回る空間部分に入射する光パワーを検出するようにシールドされることを特徴とする、方法。
【請求項13】
請求項5、9、または12に記載の方法であって、
新しい平衡位置への前記粒子の沈降遷移の終わりを決定し、この測定から、前記安定平衡点(PEQ)の移動速度へと戻るために、粒子を含む前記安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルの変化の過程が制御されることを特徴とする、方法。
【請求項14】
請求項13に記載の方法であって、
前記沈降遷移の終わりでは、前記安定平衡点(PEQ)の新たな移動を生じさせるために、前記力場(F)の変化が起こされることを特徴とする、方法。
【請求項15】
請求項1ないし11のいずれかに記載の方法であって、
前記センサは、光センサであり、前記階調レベルは、センサに当たる光パワーに相当することを特徴とする、方法。
【請求項16】
請求項1ないし11のいずれかに記載の方法であって、
前記センサは、インピーダンス計センサであることを特徴とする、方法。
【請求項17】
請求項1ないし16のいずれかに記載の方法であって、
前記センサ(PIXEL_IJ)によって検出される階調レベルの値の補償は、前記力場(F)の前記電流構成では粒子によって絶対に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)の平均検出に正規化された値を使用して行われることを特徴とする、方法。
【請求項18】
請求項1ないし17のいずれかに記載の方法であって、
階調レベルの前記測定は、前記力場(F)を一時的に非アクティブ化することによって行われることを特徴とする、方法。
【請求項19】
請求項1ないし18のいずれかに記載の方法であって、
前記力場(F)は、一般に、正の誘電泳動、負の誘電泳動、エレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック、電気流体力学的フロー、および電気泳動より選択されることを特徴とする、方法。
【請求項20】
粒子(BEADS)の検出および/または特徴付けのための装置であって、
電極(EL)のアレイによって生成され前記粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)を生成するための手段と、
前記電極に関連した光センサ(PIXELS)と、
を備え、前記光センサは、粒子の寸法を大幅に下回るセンサ部分に入射する光パワーを検出するように作成されることを特徴とする、装置。
【請求項21】
請求項20に記載の装置であって、
前記センサのシールド手段と、
各センサについて少なくとも1つの数の開口であって、前記シールド手段を通して得られ、検出される/特徴付けられる粒子よりも小さい既定の寸法を有する、開口と、
を備えることを特徴とする装置。
【請求項22】
粒子(BEADS)の検出および/または特徴付けのための装置であって、
電極(EL)のアレイによって生成され前記粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)を生成するための手段と、
前記電極に関連した光センサ(PIXELS)と、
を備え、各電極(EL)には、前記粒子の垂直方向への推移を検出するための第1のセンサ(PIXEL_V)と、前記粒子の水平方向への推移を検出するための第2のセンサ(PIXEL_H)とが関連付けられることを特徴とする、装置。
【請求項23】
請求項20ないし22のいずれかに記載の装置であって、
光センサである前記センサ(PIXEL)を少なくとも部分的にシールドするように構成された、既定の通過帯をともなう少なくとも一つのダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【請求項24】
請求項23に記載の装置であって、
異なる通過帯のセットから選択された通過帯をそれぞれ有し、間で重なり合わないようになおかつ前記センサ(PIXEL)をいかなる場合も少なくとも部分的にシールドするように配置された、複数のダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【請求項25】
請求項23または24に記載の装置であって、
前記少なくとも一つのダイクロイックフィルタは、前記電極(EL)を覆うように配置され、前記電極の各自の少なくとも一部に対応して設けられた割り込み開口を備えていることを特徴とする、装置。
【請求項26】
請求項23ないし25のいずれかに記載の装置であって、
前記粒子を含む流体試料の受け取りおよび内包に適したチャンバまたはマイクロチャンバを前記電極のアレイと協働して定めるカバー(LID)に対応して配置された、既定の通過帯を有する少なくとも一つのダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【請求項1】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する可能性がある前記粒子(BEADS)の存在を検出するための方法であって、
i. 力場(F)を非アクティブ化するステップと、
ii. 非アクティブ化に続き、なおかつ非アクティブ化された場にある前記粒子が受ける沈降運動および/またはブラウン運動の力学の関数として選択される、少なくとも一つの時間間隔において、前記安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベル、および前記力場(F)の電流構成ゆえに絶対に粒子によって占有されえないような空間領域に関連した第2のセンサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定するステップと、
iii. 力場(F)を再びアクティブ化するステップと、
iv. i)からiii)までのステップを、基準とみなされる前記第2のセンサ(PIXEL_REF)において測定される階調レベルの値の分散が漸近値に向かう収束速度と実質的に同程度の回数にわたって繰り返すステップと、
v. 想定される時間的に一連の測定において、とある平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサにおいて検出される階調レベルの値の標準偏差が既定の閾値(THR)を上回る結果となる場合に、そのような平衡点を粒子によって占有されているものとして分類するステップと、
を備える方法。
【請求項2】
請求項1に記載の方法であって、
前記閾値(THR)は、粒子によって占有されえないような前記空間領域に関連した前記第2のセンサ(PIXEL_REF)において検出される階調レベル値の平均値を、前記第2のセンサ(PIXEL_REF)において検出される階調レベルの標準偏差値に比例する係数で増大させたものに相当することを特徴とする、方法。
【請求項3】
電極のアレイ(EL)によって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する可能性がある前記粒子(BEADS)の存在を検出するための方法であって、
i) 前記安定平衡点(PEQ)に関連した第1のセンサ(PIXEL_STA)によって生成される階調レベル、および前記力場(F)の第1の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定するステップと、
ii) 第2の電流構成を付与するために、前記力場(F)を変更するステップであって、前記安定平衡点は、第1のセンサとは異なる第2のセンサ(PIXEL_TGT)に対応して移動される、ステップと、
iii) 第2のセンサ(PIXEL_TGT)によって生成される階調レベル、および前記力場(F)の前記第2の電流構成では絶対に粒子に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)によって生成される階調レベルを測定するステップと、
iv) 先行する時点i)およびiii)において検出された階調レベル値の間の差(DIFF_IMG)を決定するステップと、
v) ステップi)〜iv)を繰り返すステップと、
vi) 安定平衡点(PEQ)を粒子に占有されたものと占有されていないものとに分類するために、示差階調レベル値を処理するステップと、
を備える方法。
【請求項4】
請求項3に記載の方法であって、
このような処理は、階調レベルの差の絶対値を決定するステップと、場(F)の前記第1および第2の電流構成では粒子に占有されえないような前記基準センサに関連した階調レベルの平均的変化を大幅に上回る変化を有するセンサに関連した平衡点を、占有されたものとして分類するステップと、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項5】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する可能性がある前記粒子(BEADS)の存在を検出するための方法であって、
i) 前記安定平衡点(PEQ)を移動させ、前記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させるように、前記力場(F)を変更するステップと、
ii) 前記異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベルを、新しい平衡位置への前記粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定するステップと、
iii) 前記センサ(PIXEL_IJ)によって測定される階調レベルの時間的進展の少なくとも一つの特性パラメータの測定を通じて、粒子が存在するかまたは欠如しているかの分類を行うステップと、
を備える方法。
【請求項6】
請求項5に記載の方法であって、
前記センサ(PIXEL_IJ)における階調レベルの測定の時間的進展の前記特性パラメータは、ピークツーピーク振幅を含むことを特徴とする、方法。
【請求項7】
請求項6に記載の方法であって、
分類は、想定される力場(F)の構成では粒子によって占有されえないような基準センサにおける階調レベルのピークツーピーク測定を、前記基準センサの前記ピークツーピーク値の標準偏差に比例する係数で増大させることによって決定される、閾値との比較を通じて行われることを特徴とする、方法。
【請求項8】
請求項1ないし7のいずれかに記載の方法であって、さらに、
存在を検出された粒子の総数をカウントするステップを備え、
前記カウントするステップは、統計的基礎に基づく推定方式によって、
i 電極(EL)のアレイによって生成される場(F)の中に存在する、いかなる粒子(BEAD)も含まない安定平衡点の数(ECmeasure)が、センサによって測定され、
ii) 粒子(BEAD)のカウント(NCELLS)が、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数といかなる粒子も含まない安定平衡点(PEQ)の測定数(ECmeasure)の対数との差の、安定平衡点(PEQ)の数(NCAGES)の対数と安定平衡点(PEQ)の数から1を引いた数(NCAGES−1)の対数との差に対する比率として決定される、
ように行われることを特徴とする、方法。
【請求項9】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する前記粒子(BEADS)を特徴付けるための方法であって、
i. 前記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって前記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、前記力場(F)を変更するステップと、
ii. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって生成される階調レベルを、新しい平衡位置への前記粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定するステップと、
iii. 前記粒子の性質を推定するために、階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理するステップと、
を備える方法。
【請求項10】
請求項9に記載の方法であって、
階調レベルの時間的進展の前記パラメータは、
i. 力場(F)の変化と、階調レベルの第1の変化との間の遅延(td)、
ii. 階調レベルの一過性の変化の長さ(tw)、
iii. 階調レベルの正ピーク(Gpp)の幅、および
iv. 階調レベルの負ピーク(Gnp)の幅、
からなる群より選択される少なくとも1つのパラメータを含むことを特徴とする、方法。
【請求項11】
電極(EL)のアレイによって生成され粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)に存在する多様な種類(NTP)の前記粒子(BEADS)の数を、
i. 前記粒子(BEADS)をそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移させることによって前記安定平衡点(PEQ)を移動させるように、前記力場(F)を変更するステップと、
ii. 粒子を含む異なる安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルを、新しい平衡位置への粒子の沈降時間を大幅に上回る頻度で測定するステップと、
iii. 関連のケージが空であるか、またはある種の粒子を含むかもしくはより多くの粒子を含むかを検出するために、各安定平衡点(PEQ)に関連した階調レベル測定の時間的進展の特性パラメータを処理するステップと、
iv. 各種の単一粒子をともなうケージの測定値(Pt_1_MEAS)および空のケージの測定値(EC_MEAS)により良く近似される、各種の粒子のカウント(NCELLSt)の組み合わせを数値的に決定するステップと、
の実行を通じてカウントするための方法。
【請求項12】
請求項5、9、または11に記載の方法であって、
前記安定平衡点(PEQ)は、前記粒子(BEADS)が複数のそれぞれのセンサ(PIXEL_IJ)に対応して推移されるように移動され、前記センサ(PIXEL_IJ)は、光センサであり、粒子の寸法を大幅に下回る空間部分に入射する光パワーを検出するようにシールドされることを特徴とする、方法。
【請求項13】
請求項5、9、または12に記載の方法であって、
新しい平衡位置への前記粒子の沈降遷移の終わりを決定し、この測定から、前記安定平衡点(PEQ)の移動速度へと戻るために、粒子を含む前記安定平衡点(PEQ)の推移に関連したセンサ(PIXEL_IJ)によって検出可能な階調レベルの変化の過程が制御されることを特徴とする、方法。
【請求項14】
請求項13に記載の方法であって、
前記沈降遷移の終わりでは、前記安定平衡点(PEQ)の新たな移動を生じさせるために、前記力場(F)の変化が起こされることを特徴とする、方法。
【請求項15】
請求項1ないし11のいずれかに記載の方法であって、
前記センサは、光センサであり、前記階調レベルは、センサに当たる光パワーに相当することを特徴とする、方法。
【請求項16】
請求項1ないし11のいずれかに記載の方法であって、
前記センサは、インピーダンス計センサであることを特徴とする、方法。
【請求項17】
請求項1ないし16のいずれかに記載の方法であって、
前記センサ(PIXEL_IJ)によって検出される階調レベルの値の補償は、前記力場(F)の前記電流構成では粒子によって絶対に占有されえないような空間領域に関連した基準センサ(PIXEL_REF)の平均検出に正規化された値を使用して行われることを特徴とする、方法。
【請求項18】
請求項1ないし17のいずれかに記載の方法であって、
階調レベルの前記測定は、前記力場(F)を一時的に非アクティブ化することによって行われることを特徴とする、方法。
【請求項19】
請求項1ないし18のいずれかに記載の方法であって、
前記力場(F)は、一般に、正の誘電泳動、負の誘電泳動、エレクトロウェッティング・オン・ディエレクトリック、電気流体力学的フロー、および電気泳動より選択されることを特徴とする、方法。
【請求項20】
粒子(BEADS)の検出および/または特徴付けのための装置であって、
電極(EL)のアレイによって生成され前記粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)を生成するための手段と、
前記電極に関連した光センサ(PIXELS)と、
を備え、前記光センサは、粒子の寸法を大幅に下回るセンサ部分に入射する光パワーを検出するように作成されることを特徴とする、装置。
【請求項21】
請求項20に記載の装置であって、
前記センサのシールド手段と、
各センサについて少なくとも1つの数の開口であって、前記シールド手段を通して得られ、検出される/特徴付けられる粒子よりも小さい既定の寸法を有する、開口と、
を備えることを特徴とする装置。
【請求項22】
粒子(BEADS)の検出および/または特徴付けのための装置であって、
電極(EL)のアレイによって生成され前記粒子に作用する力場(F)の安定平衡点(PEQ)を生成するための手段と、
前記電極に関連した光センサ(PIXELS)と、
を備え、各電極(EL)には、前記粒子の垂直方向への推移を検出するための第1のセンサ(PIXEL_V)と、前記粒子の水平方向への推移を検出するための第2のセンサ(PIXEL_H)とが関連付けられることを特徴とする、装置。
【請求項23】
請求項20ないし22のいずれかに記載の装置であって、
光センサである前記センサ(PIXEL)を少なくとも部分的にシールドするように構成された、既定の通過帯をともなう少なくとも一つのダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【請求項24】
請求項23に記載の装置であって、
異なる通過帯のセットから選択された通過帯をそれぞれ有し、間で重なり合わないようになおかつ前記センサ(PIXEL)をいかなる場合も少なくとも部分的にシールドするように配置された、複数のダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【請求項25】
請求項23または24に記載の装置であって、
前記少なくとも一つのダイクロイックフィルタは、前記電極(EL)を覆うように配置され、前記電極の各自の少なくとも一部に対応して設けられた割り込み開口を備えていることを特徴とする、装置。
【請求項26】
請求項23ないし25のいずれかに記載の装置であって、
前記粒子を含む流体試料の受け取りおよび内包に適したチャンバまたはマイクロチャンバを前記電極のアレイと協働して定めるカバー(LID)に対応して配置された、既定の通過帯を有する少なくとも一つのダイクロイックフィルタを備えることを特徴とする装置。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【公開番号】特開2012−150123(P2012−150123A)
【公開日】平成24年8月9日(2012.8.9)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2012−72149(P2012−72149)
【出願日】平成24年3月27日(2012.3.27)
【分割の表示】特願2008−537211(P2008−537211)の分割
【原出願日】平成18年3月22日(2006.3.22)
【出願人】(508127694)シリコン・バイオシステムズ・エス.ピー.エー. (6)
【氏名又は名称原語表記】SILICON BIOSYSTEMS S.P.A.
【公開日】平成24年8月9日(2012.8.9)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−72149(P2012−72149)
【出願日】平成24年3月27日(2012.3.27)
【分割の表示】特願2008−537211(P2008−537211)の分割
【原出願日】平成18年3月22日(2006.3.22)
【出願人】(508127694)シリコン・バイオシステムズ・エス.ピー.エー. (6)
【氏名又は名称原語表記】SILICON BIOSYSTEMS S.P.A.
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