内皮前駆細胞サブセットの単離とそれらの使用方法
内皮前駆細胞を前駆細胞の源から単離する方法であって、系列に関係付けられた（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞を単離し、そしてさらに蛍光活性化細胞分類により系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離することによる方法を提供する。内皮前駆細胞の単離された集団及び血管の誘導、周囲の血管内の血管新生応答の誘導及び炎症性細胞の走化性のためのＣＤ３４＋細胞含有治療用組成物も提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
［０００１］ 本出願は、２００４年８月１３日に出願された米国仮特許出願６０／６０１，１８８に対してＵ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下で優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
［０００２］ 本発明は、一般に、心臓血管疾患の治療のための内皮前駆細胞を単離する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
［０００３］ 組織の虚血に応じての新規な血管の発生は、生理的器官機能に必要な組織還流を維持するために意図される自然な宿主の反応を構成する。この自然な血管新生は、高齢化、糖尿病、及び高コレステロール症において十分に機能しない。これらの症状の各々において、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の内因性の発現の低下があり、そして外来のＶＥＧＦの投与が増強された新規な血管形成を導く。
［０００４］ 虚血性の組織の損傷は一連の事象を誘発し、血中前駆細胞（ＣＰＣ）の損傷部位への移動及び補充を含む。虚血後の血管新生のモデルにおいては、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）と命名されたＣＰＣの亜集団が新規血管内に入る。さらに、動物モデルにおいて、並びに急性心筋梗塞（ａＭＩ）の臨床試験においては、ＥＰＣの全身投与が心筋の血管形成に寄与し、そして改善された心筋機能に付随する。
［０００５］ それらのオリジナルの記載以来、骨髄由来のＥＰＣは血管の損傷を発展させた（ｅｖｏｌｖｉｎｇ）後の再生治療において焦点となってきた。末梢血においては通常低いＣＰＣの数が虚血性事象の後には顕著に増加するため、血管の損傷とＣＰＣ−媒介性修復の間の因果関係が仮定された。虚血後の血管新生の動物モデルにおいては、骨髄由来のＥＰＣが新規の血管に入る。さらに、ＶＥＧＦを含む血管新生成長因子の局所及び全身のレベルが虚血後に上昇し、そして血中のＣＰＣの数の増加と関連する。
［０００６］ 外来の成長因子の投与の明らかな治療上のポテンシャルは、動物及びヒトにおいて成功裏に評価された。様々な動物モデルにおいて、ＶＥＧＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、繊維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、間質（ｓｔｒｏｍａｌ）由来因子（ＳＤＦ−１）又はスタチン薬剤の投与による血管損傷の後のＥＰＣの移動は血中ＥＰＣの数の増加と相関し、そして治療上の血管形成を改善した。ＥＰＣの血管形成ポテンシャルの直接の証拠は、後肢の虚血と有するマウスに移植されたＥＰＣが新規に形成された血管に入ったという研究により提供される（Ｋａｌｋａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，”Ｔｒａｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：３４２２−７，２０００）。心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデルにおいて、ヒトＣＤ３４＋ＣＰＣの静脈内注射は心筋の再血管形成に寄与し、そして心筋機能の救済に関連した（Ｋｏｃｈｅｒ Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，”Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｒｅｄｕｃｅｓ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：４１２−３，２００１）。さらに、ａＭＩの患者における自己のＥＰＣの梗塞動脈への冠動脈内注入は、梗塞エリアの心筋の生存性の増加をもたらした（Ａｓｓｍｕｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ［ＴＯＰＣＡＲＥ−ＡＭＩ］，”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：３００９−１７，２００２）。
［０００７］ 現在の前駆細胞の研究は、治療上の血管形成におけるＣＰＣの臨床上の応用に焦点が向けられている。よって、未来の大規模なＣＰＣの治療上の応用はこれらの細胞の表現型上及び機能上の特性の理解を必要とすることになる。表現型上開散性のＣＰＣサブセットが識別可能であることが証明された。細胞表面マーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ，ｆｌｋ−１）がＣＰＣの一元的又は二元的パラメーターフローサイトメトリー分析のためのＣＰＣマーカーとして用いられており、ＣＤ３４＋前駆細胞（ＰＣ）の富裕化を導く。このアプローチの欠点は技術的限界であって、一通り及び二通りのパラメーター検出により規定されたときにＣＰＣサブセット間の同一性及び関連性を決定することにおいての制限を含む。
［０００８］ おもしろいことに、ＣＰＣの検出及び単離に用いられた方法はＣＰＣ機能アッセイの結果も決定する。フローサイトメトリーにより単離されて血管新生条件下で培養されたとき、ＣＤ３４＋ＣＰＣは紡錘細胞を形成し、時間をかけて毛細血管様構造を組織化する。さらに、これらの細胞は内皮細胞（ＥＣ）に特異的なマーカー、例えば、ＣＤ３１，Ｅ−セレクチン及びＴｉｅ−２を発現する。
［０００９］ 或いは、ＣＰＣは、血管形成性成長因子の存在下でフィブロネクチン又はゼラチンをコートされたプレート上で単核細胞のインビトロ培養に基づいて単離された。低密度のリポプロテイン（ＬＤＬ）陰性であってレクチン結合能力を呈した単離細胞が、ＣＰＣと呼ばれた。これらの細胞はインビボにおいて血管新生を促進できるが、それらは単球の特性を有し、そしてそれらの血管新生能は血管新生因子、例えばＶＥＧＦ、肝臓成長因子（ＨＧＦ）、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦのそれらによる生産により実際には誘導される。即ち、これらのＬＤＬ−，レクチン結合細胞は直接ＥＣを形成しないが、それらは血管新生を変調し得る。
［００１０］ 前記のことに基づいて、内皮前駆細胞の不均質集団及び均質集団の両方が、心臓血管疾患の治療のための機会を示す。
【０００４】
発明の概要
［００１１］ 本発明は、血管を形成することができるか又は血管新生を誘導できるヒト末梢血内皮前駆細胞を生じる細胞及び炎症媒介性細胞の４つのパラメーター蛍光活性化細胞分類を用いた単離の方法を記載する。さらに、本発明は、炎症性細胞に関して血管新生及び／又はケモタクシスを誘導する能力を有する内皮前駆細胞を含む生物分解性移植物を提供する。本発明の一つの態様において、血管形成／血管新生細胞及び炎症媒介新生細胞の両方を生じさせるヒト末梢血内皮前駆細胞のサブセット、ＣＤ３４＋ＣＰＣが同定される。
［００１２］ 本発明の一つの態様において、前駆細胞を、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクロームで標識された抗体に接触させて前駆細胞の源から系列に関係付けられた（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞を割り出し（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）；系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞の集団を形成するように蛍光活性化細胞分類により系列に関係付けられた細胞を枯渇させ；系列陰性細胞をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲからなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクローム標識抗体に接触させるが、その際、各抗体は唯一の放射波長を有するフルオロクロームにより標識されており；そして標識された系列陰性細胞を３色蛍光活性化細胞分類により分類することにより、内皮前駆細胞の集団を形成することを含む。
［００１３］ 本発明の一つの態様において、前駆細胞の源は哺乳類源であって、ヒト源、例えば末梢血を含む。
［００１４］ 本発明の別の態様において、系列に関係付けられた細胞を割り出すのに有用な抗体は、細胞マーカーＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１に特異的な抗体を含む。
［００１５］ 本発明の別の態様において、反応工程は、細胞マーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに特異的な抗体と系列陰性細胞を反応させることを含む。本発明の別の態様において、結果の内皮前駆細胞はＣＤ３４を発現する。本発明の別の態様において、結果の内皮前駆細胞はＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−である。
［００１６］ 本発明の一つの態様において、内皮前駆細胞は、血管生成細胞、炎症媒介性細胞、又は両方である。本発明の別の態様において、血管生成細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である。本発明のまた別の態様において、内皮前駆細胞は、インターロイキン−８を発現できる炎症媒介性細胞である。
［００１７］ 本発明の別の態様において、内皮前駆細胞は、周囲の血管中に血管新生応答を誘導する。
［００１８］ 本発明の一つの態様において、処置された部位において血管新生を誘導する治療用組成物は、その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性マトリックスを含むように提供される。本発明の別の態様において、生物分解性マトリックスは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である。
［００１９］ 本発明の別の態様において、炎症媒介性細胞に対して処置部位においてケモタクシス効果を有する治療用組成物は、その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性の生物適合性マトリックスを含むように提供される。本発明の別の態様において、生物分解性の生物適合性マトリックスは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である。
［００２０］ 本発明のまた別の態様において、生物分解性の生物適合性マトリックスは、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様基質からなる群から選択される。
［００２１］ 本発明の一つの態様において、単離された集団が系列陰性のＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−であるように提供される。
［００２２］ 本発明の別の態様において、内皮前駆細胞の単離された集団は血管生成細胞を含む。本発明の別の態様において、内皮前駆細胞の単離された集団は、インターロイキン−８を発現できる炎症媒介性細胞を含む。本発明の別の態様において、内皮前駆細胞の単離された集団は、周囲の血管に血管新生応答を誘導する。
【０００５】
発明の詳細な説明
［００３５］ 本発明は、４つのパラメーター蛍光活性化細胞分類を用いて、血管を形成できるか又は血管新生及び炎症媒介性細胞を誘導することができる、ヒト末梢血内皮前駆細胞の単離のための方法を記載する。さらに、本発明は、炎症細胞のために血管新生及び／又はケモタクシスを誘導する能力を有する内皮前駆細胞を含む生分解可能な移植物を提供する。一つの態様において、血管形成／血管新生細胞及び炎症媒介細胞の両方を生じさせる、ヒト末梢血内皮前駆細胞、ＣＤ３４＋血中前駆細胞細胞（ＣＰＣ）のサブセットを同定する。ＣＤ３４＋ＣＰＣ，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−細胞のサブセットがこれらの活性に必須であるというのが本発明の非拘束の（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）仮説である。
［００３６］ 過去数年にわたり、ＣＰＣは心臓血管再生治療において活動中心となってきたが、特に、成長因子投与によるＣＰＣの治療上の動員とこれらの細胞の梗塞された領域への移植が虚血状態の患者への利益を証明した。以前、ＣＰＣｓのサブセット、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が血管新生におけるキープレイヤーとして指定された。しかしながら、ＥＰＣが表現型上及び機能上内皮形成能力を有する異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）集団であるという蓄積した証拠が存在する。このＣＰＣの異種集団は、よって、異なる機能を有するＥＰＣｓの源を提供する。この明細書において発明を記載するために、血中前駆細胞と内皮前駆細胞は同じ細胞集団を意味する。
［００３７］ 本発明者らは、予測に反して、系列陰性であり、ＣＤ３４を発現するがＣＤ１３３とＫＤＲを発現せず、血管を形成するのに必須のＣＰＣｓのサブセットを発見した。ＣＤの呼称は、「分化のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」抗原を意味し、白血球細胞表面上に存在する抗原を系統的に同定する。ＣＤ３４は内皮細胞上及び造血幹細胞上に構成的に発現される膜貫通糖蛋白質である。ＣＤ１３３は造血幹細胞抗原であり、プロミニンとしても知られている。ＫＤＲはヒト血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の前駆体であり、Ｆｌｋ−１としても知られる。この血管形成集団のＣＰＣｓがＫＤＲ＋であったと以前は考えられていた。
［００３８］ 幹細胞と前駆細胞は、より成熟した系列に関係付けられた（Ｌｉｎ＋）細胞の特徴である特定のマーカーを欠く。系列特異的マーカーは、限定ではないが、ＣＤ３，ＣＤ８，ＣＤ１０，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ３１及びＣＤ３３を含む。本発明の一つの態様において、Ｌｉｎ＋細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現する。本発明の別の態様において、Ｌｉｎ−細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現しない。
［００３９］ これらのマーカーの発現パターンに基づいてＥＰＣ表現型の転写プロファイリングと優秀な分析により、広く受容されたＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲを発現するヒトＣＰＣの生体での挙動を研究した。３つのグループの患者からのＣＰＣｓを研究した：（ｉ）再度のパフュージョン治療の成功を経験した急性心筋梗塞（ａＭＩ）患者、（ｉｉ）健康なボランティア及び（ｉｉｉ）スタチンドラッグによる治療を経験した安定なアンギナの患者。スタチン治療は治療の開始後早くも７日目にＣＰＣのレベルの増加を報告し、そして多数のａＭＩ患者がスタチン治療を受けている。
［００４０］ 系列陰性集団に関して分類されてＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲの何れかを発現する患者の各グループからの末梢血単核細胞を、ＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの細胞発現の３つのパラメーターの評価（３色蛍光活性化細胞分類）に基づいて７つの別個のサブセット全部に細分類する（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ）ことができる。これらの７つのサブセットは、健康な被験者の血中及びスタチンドラッグによる治療を経験した安定なアンギナ患者の血中に存在し、そしてａＭＩ後は全て細胞数が増加した。
［００４１］ 全３つのＣＰＣサブセット（即ち、ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋）のａＭＩ後の動員は、前駆細胞（ＰＣ）の非選択的補充を示す（図６Ａ）。さらに、内皮細胞の分化及び機能に関与する遺伝子の発現分析は、ａＭＩ患者と健康な対照の間の同じサブセットのＣＰＣ内での遺伝子発現に主な違いはないことを明らかにした。これらの発見は、ａＭＩ後に増加したＣＰＣの動員がこれらの細胞の変化した発現メイクアップの結果ではなく、むしろ骨髄由来のＣＰＣの剥離を増強する外部因子の結果であることを示唆する。さらに、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は虚血性損傷により生じるが、骨髄内のマトリックスメタロプロテイナーゼ−９の発現を誘導する。このプロセスは可溶性Ｋｉｔリガンドの放出をもたらし、ｃＫｉｔ＋幹細胞と前駆細胞の血中への動員を推進する。
［００４２］ これら３つのＣＰＣサブセットのインビボにおける挙動を研究するため、本発明者らは、生物分解性マトリックス、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＢＤバイオサイエンセズ）に封入されたヒトＣＰＣがマウス宿主内で成熟することを許容されたモデルを確立した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は生物分解性で生物適合性の可溶性基底膜マトリックスである。当業者に知られている他の生物分解性マトリックスを本発明の範囲内で使用可能である。生物分解性マトリックスの他の例は、限定ではないが、自己由来の血小板細胞、コラーゲンゲル、又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づいたコラーゲン様基材を含む。生物分解性マトリックスの使用は多数の利点を有すが、その一つはＣＰＣの位置局限であり、相対的に数の少ない標的細胞を観察することを可能にさせる。さらに、ＣＰＣにより生産された可溶性因子は、生物分解性マトリックスを通して自由に拡散して宿主環境に到達できる。よって、ヒトＣＰＣの分化が監視できるのみならず、これらの細胞の宿主由来の血管新生（即ち、周囲のマウス血管の発生）に対する衝撃が容易に可視化できる。さらに、本発明の一つの態様において、生物分解性マトリックスは、前駆細胞の局在化された移植により利益を受ける疾患の治療のための哺乳類へのＣＰＣの移植に有用である。最後に、ヒトＣＰＣとマウス炎症性細胞の間の相互作用を研究することができ、即ち、虚血の後の炎症性リモデリングにおけるＣＰＣの役割に関しての指標を提供する。
［００４３］ 本発明の一つの態様において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）移植物に封入されたがＣＤ１３３＋細胞又はＫＤＲ＋細胞ではないＣＤ３４＋細胞は、成熟した内皮細胞（ＥＣ）を形成した。遺伝子発現分析は、ＣＤ３１転写物が３つ全てのサブセットに存在したことから、内皮形成のポテンシャルを示唆する。ＣＤ３１は単球細胞表現型を有する内皮細胞又は血管新生ポテンシャルを有する単球細胞の代用物として機能し、内皮への関係付け（ｅｎｄｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）の証明としてのＣＤ３１転写物の存在が弱められる。フォンビルブランド因子転写物はＣＤ３４＋細胞及びＣＤ１３３＋細胞において検出可能であったが、ＫＤＲ＋細胞においては常に検出可能ではなかったことから、前者２つのサブセットの分化は内皮系列に対して実は歪められるのかもしれないことを示唆する。
［００４４］ 本発明の別の態様において、成熟した内皮細胞を生じさせるＣＤ３４＋集団も、チロシンキナーゼ受容体であるＴｉｅ−２を発現する。ＣＤ３４，Ｔｉｅ−１，Ｔｉｅ−２，ＶＥＧＦ及びＫＤＲの遺伝子転写物はＣＰＣに特徴的であり、ＣＤ３４＋細胞に存在し、そして低レベルでＣＤ１３３＋細胞に存在したが、ＫＤＲ＋細胞には不在であったことから、前者２つのサブセットの内皮系列への強い関係付けが示される。Ｔｉｅ−２発現はＣＤ３４＋サブセットのみに見いだされたが、インビボにおいて内皮細胞を生じさせる唯一のサブセットであった。Ｔｉｅ−２は内皮細胞の生き残り及び毛細血管の形態形成に必須であるから、この分子の存在はインビボにおいてこのサブセットにおいて内皮細胞を形成するための装置であるかもしれない。
［００４５］ 系列陰性細胞のＣＰＣサブセットを表現型により明確に識別するために、ＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの３つのパラメーターのフローサイトメトリー分析を確立した。以前の技術と比較してのこの戦略の利点は、分析における全てのＣＰＣのサブタイプの偏りのない封入（ｕｎｂｉａｓｅｄ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）からなる。この偏りのない封入は、非関係付けの前駆細胞の使用により達成されて、分析のための出発集団として、ＣＤ３４の予めの選択により系列陰性（Ｌｉｎ−）細胞に関して富裕にされた。このアプローチがインビボにて移植されたＣＰＣ集団の解剖を可能にさせるため（即ち、ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋，ＫＤＲ＋細胞）、インビボにおいて観察された効果に必須の有望なＣＰＣサブセットが同定される。この技術を用いて、主要なＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋細胞集団内の７つの表現型上別々のＣＰＣサブセットが同定された（図６Ｃ，Ｄ）。
［００４６］ ３つの主要な集団全てにおいて回帰性の（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）ＣＰＣサブセットは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋又は三重に陽性のサブセット細胞である。ＣＤ３４＋細胞の予めの選択後に、これらの細胞は以前に記載されており、ＥＰＣを運ぶことが示された。本発明者らの支配下では（ｉｎ ｔｈｅ ｈａｎｄｓ ｏｆ）、これらの細胞はインビボにおいてＥＣ形成に寄与せず、おそらくはそれらの頻度の低さによる。
［００４７］ ＫＤＲ＋集団内では、３つのさらなるＥＰＣサブセットが同定された：ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞、ＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞及びＣＤ３４―ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞。ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋細胞は有力な造血幹細胞又は成人の血管芽細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ）として記述されてきた。ＣＤ１３３は一次前駆細胞のマーカーであるが成熟内皮細胞のマーカーではない。よって、検出されたＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞は、より成熟した細胞であるかもしれない。ＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞の有意さはまだ決定するのが難しいが、ＫＤＲが様々な前駆細胞上に発現されるからである。ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋細胞は血管の外傷に際して血中に補充されたＥＰＣであるという観察から、ＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞の可能な同定が推理され得る。さらに、このサブセットは、これら３つのマーカーの発現に関する限り、Ｒｅｙｅｓら（Ｒｅｙｅｓ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：３３７−４６，２００２）に記載された骨髄からの間組織幹細胞集団に似ており、彼らは、これらの細胞の内皮細胞形成能力も証明した。それらの表現型にも拘わらず、しかしながら、これら４つのサブセットの組み合わせ（即ち、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＫＤＲ＋，ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋／ＫＤＲ＋，ＣＤ３４−／ＣＤ１３３−／ＫＤＲ＋，及びＣＤ３４＋／ＣＤ１３３−／ＫＤＲ＋）は、実施例３に示されるとおりＥＣ分化をもたらさなかった（図２及び３）。
［００４８］ ＫＤＲ＋細胞に類似して、ＣＤ１３３＋細胞は単独ではインビボにおいて内皮細胞を形成しない。ＣＤ１３３＋集団は、以前に論じられたとおり、ＫＤＲ＋集団とＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋サブセットを共有する。ＣＤ１３３＋集団内の残りの２つのサブセットはＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−とＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−である。ＣＤ３４−ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を生じるそれらの能力に基づくと、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞の前駆体であるらしい。この後者の表現型（ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋）に関して、造血前駆細胞、ＥＰＣ及び血管リンパ細胞前駆体の機能が提案されている。しかしながら、実施例３に記載されたインビボシステムにおいては、４つのＣＤ１３３＋ＰＣサブセットの組み合わせは内皮細胞を生じなかったことから、因子の配列が内皮細胞分化を誘導するのに十分でなかったらしいことが示唆される。
［００４９］ ７つのＣＰＣサブセットの表現型と挙動の要約を下の表１に掲載する。
【０００６】
【表１】
【０００７】
［００５０］ 本発明の一つの態様において、ＣＤ３４＋集団は、レクチンＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅｕｓ−１アグルチニン（ＵＥＡ−１）への結合、ＣＤ３４＋及びＣＤ３１＋の発現、スピンドルの形態及びネットワークの組織により示されるとおり、成熟ＥＣをインビボにおいて形成するための７つの同定されたＣＰＣ亜集団の一つにすぎない。ＣＤ３４＋集団は、ＣＤ１３３＋集団と、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットを共有し、そしてＫＤＲ＋集団と、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットを共有する。これらの２つのサブセットはそれぞれＣＤ１３３＋集団とＫＤＲ＋集団のコンテクストにおいて内皮細胞分化に寄与しなかったが、それらは、ＣＤ３４＋集団に独特の、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットとの組み合わせにおいてそうでなかった。末梢血単核細胞（ＭＮＣ）におけるＣＤ３４の発現は、Ａｓａｈａｒａら（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：９６４−９６７，１９９７）がこの表現型を有する細胞をフィブロネクチン上で血管新生条件下で生育させたら、内皮細胞を生じ得たことを観察したという基準（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）であった。
［００５１］ 本発明の態様において、ＣＤ３４＋細胞のインビボ内皮細胞形成能力は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−細胞の存在によるものであり、そしてオプションとしては、このサブセット内のＴｉｅ−２の発現による。本発明の別の態様において、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞とＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞の組み合わさった存在は、可能性としてＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットの組み合わせであり、内皮細胞分化に必要かもしれない。
［００５２］ 予測に反して、ＣＤ３４＋ＣＰＣサブセットはＥＣに分化する上、マウスの血管のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）への内部への成長（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）も刺激した。細胞外マトリックス成分と成長因子のその組成物により血管新生性であったが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）自体（はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））は、１４日の観察期間の間にマウスの血管の内部成長を誘導しなかった（実施例３と実施例５）。
［００５３］ ＣＤ３４＋ＣＰＣの移植は、２日で血管新生をもたらす。最初に、ヒトＣＤ３４＋ＣＰＣがヒト内皮細胞に侵入する。続いて、ヒトＣＤ３４＋ＣＰＣが宿主による血管内部侵入を誘導する。全てのＣＤ３４＋ ＣＰＣサブセットが宿主血管新生を等しく誘導はしなかった。ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットとＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットが宿主血管新生に重要であった。大きな血管が最初にＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットにおいて観察され、そしてより少ない程度にてＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットにおいて観察された。さらに、これら２つのサブセットの組み合わせは相乗的でなく、サブセット単独に比べて高レベルの血管新生を導かなかった。さらに、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−とＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットの組み合わせは、毛細血管の形成をもたらしたのみであり、小さい血管及び大きい血管の形成はもたらさなかった。初代毛細血管の誘導は虚血性心臓疾患を治療するのに有用かもしれない。
［００５４］ ここまでは、ＣＰＣが新規な血管を直接生じて損傷後に血管新生に寄与することができた細胞として考察された。本発明者らによる意外な観察は、ＣＰＣが局所脈管構造に対する変調機能を及ぼし得て、血管新生を発生させることを証明する。この発見は、改善された治療用血管新生に関する新規な展望を提供する。
［００５５］ 本発明の別の態様において、本発明の教示により単離されたＣＤ３４＋ＣＰＣｓは、単球／マクロファージ系列の炎症性細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のマイクロ環境へ補充する。はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）はマウスのマクロファージの誘因をほとんど行使しなかったことから、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に対する低いグレードの外来身体反応（ｆｏｒｅｉｇｎ ｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のみがマウントされたことを示す。ＣＤ１３３＋細胞又はＫＤＲ＋細胞を負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に対する炎症性応答ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のそれらを超えなかったので、これらのサブセットはそれら自身によりマクロファージの浸潤を変調しなかった。比較して、ＣＤ３４＋細胞を負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のマクロファージ浸潤は顕著に高かったため、これらの細胞の追加のマクロファージ誘因効果がＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の効果に重ねられたことが示される。よって、ＣＰＣの機能は内皮細胞への分化のそれを超えて拡大するかもしれず、そして追加の治療用の含蓄を有するかもしれない。本発明のまた別の態様において、虚血性の心筋からの損傷シグナルにより補充された前駆細胞は、内皮細胞へ直接に分化して局所血管の成長を促進させることにより血管新生に寄与するのみならず、炎症性細胞を損傷したエリアに補充するのかもしれない。
［００５６］ 前炎症性化学誘引因子（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ）はＣＤ３４＋前駆細胞により生産される。ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋３つ全てのサブセットが炎症関連サイトカイン／ケモカイン腫瘍ネクローシス因子−α（ＴＮＦ−α）及びマクロファージ炎症性蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）の転写物を含んだが、炎症性細胞を補充するのに必須のＣＤ３４＋亜集団のみは高いレベルのヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）を発現した（ＫＤＲ＋細胞よりも３倍増加）。さらに、ヒトＩＬ−８の単一の細胞による発現はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）移植の１４日後まで持続した。
［００５７］ 本発明者らによる驚くべき観察は、ＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲのようなマーカーの発現に以前はただ基づいていたＣＰＣの存在する定義を書き換える必要性を指摘するが、なぜならば、これらの分子の発現パターンを変えた様々なサブセットが存在するからであり、等しく内皮細胞へ分化することができない。急性のＭＩは全ての検出された前駆細胞サブタイプの移動を導くことが、健康な個体及びａＭＩ患者からのＣＰＣサブセットにおける類似の遺伝子発現パターンから証明されたことから、ＣＰＣは損傷シグナルに適合可能に応答せず、むしろ、骨髄から受動的に放出されることを示す。最後に、ＣＤ３４＋前駆細胞は血管新生のポテンシャル並びに免疫変調ポテンシャルを有し、本発明の教示を用いて新規な治療戦略の生成に関して開発されるかもしれない。
［００５８］ 本発明の一つの態様において、４つのパラメーターの蛍光活性化細胞分類を用いて、血管形成細胞と炎症媒介細胞の両方を生じるＣＰＣを同定する。本発明の４つのパラメーターは系列、ＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲである。
［００５９］ 本発明の一つの態様において、所望の細胞を規定するモノクローナル又はポリクローナルの何れかの抗体のカクテル又は混合物に細胞を暴露することにより、所望の細胞集団を含む細胞源を所望の集団及び不所望の集団に分離する。蛍光活性化細胞ソーターに、一つ又はそれより多い抗体が結合していた細胞を同定させるように、当該抗体に蛍光標識をコンジュゲートする。個々の抗体は、当業者によく知られている様々な蛍光標識（フルオロクローム）にコンジュゲートすることができる。本発明の一つの態様において、抗体は、同じか又は唯一の蛍光放射波長を有する一つ又はそれより多くのフルオロクロームに結合させることができる。各蛍光放射波長は色に対応する。例示のフルオロクロームは、限定ではないが、テキサスレッド（登録商標）（モリキュラープローブス、ユージーン、ＯＲ）、アロフィコシアニン、フィコエリスリン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、スペクトラルレッド（登録商標）（サザンバイオテック、バーミンガム、ＡＬ）、Ｃｙ−クローム、及びその他を含む。
［００６０］ 本発明の一つの態様において、内皮前駆細胞又は血中前駆細胞の源を、系列―関係付け（Ｌｉｎ＋）細胞を定義する抗体のカクテルと接触させる。本発明の一つの態様において、この抗体のカクテルを全て同じフルオロクロームにコンジュゲートさせる。本発明の別の態様において、系列に関係付けられたマーカーは、限定ではないが、ＣＤ３，ＣＤ８，ＣＤ１０，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ３１及びＣＤ３３を含む。本発明の別の態様において、Ｌｉｎ＋細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現する。本発明の別の態様において、系列非関係付けられた（前駆、Ｌｉｎ−）細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現しない。
［００６１］ 本発明の別の態様において、Ｌｉｎ−細胞は、ＣＰＣの源をフルオロクローム標識された抗体のカクテルに接触させ、そして滅菌精製された細胞の集団が得られるように蛍光活性化細胞ソーター上で当該細胞を分類することにより、単離される。蛍光活性化細胞分類のプロトコルと方法は、容易に利用可能であって、当業者にはよく知られている。
［００６２］ 本発明の別の態様において、単離された前駆細胞は、Ｌｉｎ−細胞をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対するフルオロクローム標識抗体に接触させ、そしてＣＤ３４を発現するがＣＤ１３３又はＫＤＲを発現しないＬｉｎ−細胞の集団を同定するために、標識細胞を分類することにより、得られる。本発明の一つの態様において、この分類工程は滅菌条件下で行われる。
［００６３］ 本発明の一つの態様において、単離された前駆細胞は、患者において新規の血管の形成を誘導するのに有用である。新規な血管は脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）（胚性前駆細胞からの血管の形成）、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（周囲の組織からの血管の内部成長）又は新血管新生の形成（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（それらが以前に存在しなかった新規な血管の形成）により形成することができ、存在する血管に結合する内皮前駆細胞から血管を形成することを含む。外傷、外科手術又は急性あるいは慢性の疾患によるケガのような新規な血管の形成を哺乳類が必要としているかもしれない多数の条件が存在する。非限定例においては、哺乳類が治癒を必要とする創傷を有するかもしれない。別の非限定例においては、患者が心臓血管外科手術、心臓血管血管形成術（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、頸動脈血管形成術、冠動脈血管形成術を受けているかもしれず、全てが新規の血管形成を必要とする。別の非限定例においては、心筋梗塞、例えばａＭＩの患者は新規な血管形成の必要がある。新規の血管形成を必要とするかもしれない別の条件は、鎌状赤血球貧血及び地中海貧血を含む。
［００６４］ 本発明の別の態様において、単離された前駆細胞は、新規な血管形成の必要な部位へ細胞の優先的移動を可能にするあらゆる経路又は方法により、新規な血管形成の必要のある哺乳類へ投与することができる。例示の投与経路は、限定ではないが、生物適合性溶液又は生物分解性生物適合性マトリックス中の前駆細胞の、全身投与、例えば、静脈内注射、局所移植、例えば局所筋肉内又は皮下注射を含む。生物適合性溶液は当業者に知られている。生物分解性生物適合性マトリックスの例は、限定ではないが、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様サブストレートを含む。
［００６５］ これらの実施例は、本発明の一つ又はそれより多くの態様を例示することを意図し、以下に記載されるものに発明を限定することを意図しない。
【０００８】
実施例１
４つのパラメーターのフローサイトメトリーによる７つのＣＰＣの同定
［００６６］ ３つの血中前駆細胞（ＣＰＣ）マーカーであるＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの組み合わされた発現のパターンに基づく内皮前駆細胞（ＣＰＣ）の表現型上の不均一性を、４つのパラメーター（３色）フローサイトメトリー分析を用いて分析した。
［００６７］ 単核細胞をヘパリン化血液からリンフォプレップ密度勾配遠心分離（ナイコメッド、オスロ、ノルウエー）により単離した。表現型に拘わらず血中前駆細胞（ＰＣ）の数は低いため、系列陰性（Ｌｉｎ−）細胞、即ち、非関係付けの有力なＰＣｓを、全末梢血単核細胞（ＭＮＣ）から、高速フローサイトメトリー分類により富裕化し、Ｌｉｎ＋細胞は捨てた（図６Ａ）。全ＭＮＣを、ＣＤ３（Ｔ細胞），ＣＤ１４（単球），ＣＤ１９（Ｂ細胞），ＣＤ１６／５６（ＮＫ細胞）及びＣＤ３１（成熟内皮細胞）に対するフィコエリスリン（ＰＥ）−標識されたモノクローナル抗体（ｍｏＡｂｓ）（全てＩＱ社、グロニンゲン、オランダ）のカクテルで染色した。Ｌｉｎ−細胞は塩基性内皮培地（ベクトンディッキンソン、エレンボーデゲム−アルスト、ベルギー）中で高速フローサイトメトリーによりＭｏＦｌｏ細胞ソーター（サイトメーション、フォルトコリンズ、ＣＯ）を用いて分類した。得られたＬｉｎ−集団は典型的にはＬｉｎ＋細胞が９５−９８％フリーであって、全ＭＮＣの平均１１．３％を占めるが（０．６−２２．４％の範囲）、一方健康なからだにおいては（ｈｃ，ｎ＝９）平均３．０％のＭＮＣがＬｉｎ−であった（平均１．０−５．５％；Ｐ＝０．０００３）（図６Ａ）。
［００６８］ ＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの発現パターンを決定するため、分類されたＬｉｎ−細胞をＣＤ３４−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（クローン５８１、ＩＱ社）、ＣＤ１３３−ＰＥ（ミルテニイバイオテック、ドイツ）及びウサギポリクローナル抗ＫＤＲフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（シグマケミカルズ社）を用いた３色染色に供した。
［００６９］ Ｌｉｎ−集団内では、３つのマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの一つを発現する細胞をゲートに通し（ｇａｔｅｄ）、残りの２つのマーカーの発現を分析した（図６Ｂ：ＣＤ３４，図６Ｃ：ＣＤ３４，図６Ｄ：ＫＤＲ）。このアプローチを用いて、７つのＣＰＣサブセットをＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの組み合わされた発現に基づいて検出した。３重陰性細胞はＥＰＣと考えなかった。７つのサブセット全てがａＭＩ患者及び健康な対照に存在した。
［００７０］ ＣＤ３４＋集団は、主に、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（ａＭＩ，全ＣＤ３４＋細胞の平均６２％、３３−８９％の範囲；健康な対照、平均３８％、範囲２４−５０％）及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−細胞（ａＭＩ，全ＣＤ３４＋細胞の３７％、１０−６１％の範囲；健康な対照、平均６０％、範囲０．１−０．８％）からなったが、３重陽性サブセット及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットはこの集団を１％も占めなかった（図６Ｃ）。
［００７１］ ａＭＩ患者のＣＤ１３３＋集団においては、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（全ＣＤ１３３＋細胞の平均５２％、３３−８９％の範囲）及びＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（全ＣＤ１３３＋細胞の平均２８％、０．１−８５％の範囲）が支配的であったが、健康な対照においては、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（平均３８％、１３−７６％の範囲、１異常値（ｏｕｔｌｉｅｒ）１％）及びＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（平均５８％、１２−７３％の範囲）が支配的なサブセットであった（図６Ｂ）。
［００７２］ ａＭＩ患者と健康な対照の間の違いはＫＤＲ＋集団にも存在したが、ａＭＩ患者においては主にＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞（平均６５％、１−９５％の範囲）及びＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞（平均３３％、３−７１％の範囲）からなった（図６Ｄ）。健康な対照においては、ＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞が支配的（平均９３％、５２−９９％の範囲）であり、ＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットは全ＫＤＲ＋細胞のほんの約５％しか含まなかった（図６Ｄ）。
【０００９】
実施例２
ａＭＩ患者と健康な対照におけるＣＰＣの数
［００７３］ １０人のａＭＩ患者と９人の健康な対照ボランティアをＥＰＣの数に関して比較することにより、７つのＣＰＣサブセット中の細胞の数がａＭＩの事象に相関したか否かを決定した。ＣＰＣの数とａＭＩの間の可能性のある相関は、（ＣＰＣが検出されたうちの）Ｌｉｎ−細胞の数に反映された。Ｌｉｎ−細胞の数を２つの被験者群の間で比較した。ａＭＩ患者においては、Ｌｉｎ−細胞の数が平均２．６ｘ１０５細胞／ｍＬ血液であり（範囲０．２−４．７ｘ１０５細胞／ｍＬ血液）、健康な対照（平均０．５ｘ１０５細胞／ｍＬ血液、範囲０．０４−１．４ｘ１０５細胞／ｍＬ血液）よりも有意に高く（Ｐ＝０．００１）（図７）、対照と比較してａＭＩ患者において５．２倍高い数のＬｉｎ−細胞に等しかった。
［００７４］ ＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲを発現するＣＰＣの数をａＭＩ患者と健康な対照において比較した。３つ全てのサブセット中のＣＰＣの数は健康な対照に比べてａＭＩ患者において有意に高かった。ＣＤ３４サブセットにおいては、健康な対照（平均０．３ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．０６−１．２ｘ１０４細胞／ｍＬ血液）に比較すると、８．６倍高い数の細胞がａＭＩ患者において見いだされた（平均２．６ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、２．１−１１．０ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、Ｐ＝０．００５）。ＣＤ１３３サブセットにおいては、健康な対照（平均０．３ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．０７−０．７ｘ１０４細胞／ｍＬ血液）に比較すると、１１．６倍高い数の細胞がａＭＩ患者において見いだされた（平均３．５ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．５−１３．５ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、Ｐ＝０．０００１）。最後に、ＫＤＲサブセットにおいては、健康な対照（平均０．２ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．００９−０．８ｘ１０４細胞／ｍＬ血液）に比較すると、６．２倍高い数の細胞がａＭＩ患者において見いだされた（平均１．３ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．０３−５．８ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、Ｐ＝０．００５）。
［００７５］ 可能性として損傷した心筋の血管の修復のために、ａＭＩが特定のＣＰＣサブセットの移動を誘発したか否かを確認するため、７つのサブセットの中のＣＰＣの数を測定した。全７サブセットにおいて、それらの表現型に拘わらず、健康な対照に比べて有意に高いＣＰＣ数がａＭＩ患者に存在した（図８）。患者レベルにおいては、特定のサブセットの中のＣＰＣ数の異常値（ｏｕｔｌｉｅｒｓ）が容易に明白であるが、これらの患者においてＣＰＣ数は全７ＣＰＣサブセットにおいて一貫して高くはなかった。
［００７６］ ＣＰＣの数がそれらの表現型に拘わらずａＭＩ患者において増加しており、心臓血管の損傷とＣＰＣ補充の間の原因となるリンクを示唆するため、ＣＰＣ数と疾患のパラメーターの間の相関を探求した（表２）。１５人のａＭＩ患者と安定な狭心症の１０人の患者をこの分析に含めた。心臓血管疾患（ＣＶＤ）の病歴は、患者におけるＣＶＤのエピソードを示す。ａＭＩの数は現在のａＭＩエピソードの数を示す。表２に掲載したａＭＩのリスク因子に加えて、年齢（＞６０歳）と男性はａＭＩのリスク因子と考えたため、全部で６人の可能性のあるリスク因子をもたらす。累積のリスク因子は、用意した患者に存在するこれら６つの可能なリスク因子の数を示す。
［００７７］ 様々なサブセットと年齢におけるＣＶＤ数とリスク因子又は虚血時間の蓄積した数の間には相関がなかった。さらに、ＥＰＣ数と血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンホスホキナーゼ心筋バンド（ＣＫＭＢ）又はトロポニンの間にも相関はなかった。
【００１０】
【表２】
【００１１】
実施例３
ＣＶＤサブセットの血管形成活性
［００７８］ この実験は、主に成熟内皮細胞（ＥＣ）への分化に関して、インビボにおけるＣＰＣサブセットの挙動を調査した。ＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲの何れかを発現するＣＰＣを２００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）内に保存して、１０ｎｇの塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ，ケミコン、テメキュラ、ＣＡ）及び１２Ｕのヘパリン（レオファーマ、ボーラーアップ、デンマーク）を５，０００から１５，０００細胞／移植物にて添加して、ヌードマウスに皮下移植した。はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）はｂ−ＦＧＦおよびヘパリン添加物を含む。１４日後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを外植し、液体窒素中で免疫組織化学のため部分的にスナップ凍結するか、又は０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中の２％パラホルムアルデヒド中で固定し、脱水し、そして樹脂（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ ８１００，ヒーリアスクルツァー、ヴエアーハイム、ドイツ）に埋め込んだ。全体の形態の評価のために、樹脂に埋め込まれたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のペレットの切片２μｍをトルイジンブルーで染色した。移植物の形態分析は、移植の１４日後にＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において高い細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）が存在したことを示した（図２Ｂ）。細胞性はＣＤ１３３＋−負荷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において顕著に低く（図２Ｃ）、そしてＫＤＲ＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）においては最小であった（図２Ａ）。紡錘形態の細胞からなるネットワーク構造は毛細管ネットワークに酷似しており、ＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において豊富であったが、ＣＤ１３３＋細胞、ＫＤＲ＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）においては事実上不在であった。
［００７９］ これらのネットワーク構造がヒトＰＣにより形成されたか否かを決定するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）切片を、ヒトＥＣには特異的に結合するがマウスＥＣには結合しないＵＥＡ−１で染色した（図３Ａ，Ｂ）。ヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＵＥＡ−１染色のための陽性対照として用い（図３Ａ）、そしてＨ５Ｖ細胞（マウスＥＣ系）を陰性対照として用いた（図３Ｂ）。ＣＤ３４＋移植物のネットワーク構造はＵＥＡ−１に関して陽性である；しかしながら、ＵＥＡ−１陽性細胞は、他のサブセットを植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において存在しなかった。
［００８０］ ＵＥＡ−１染色はインビボにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のネットワーク構造のヒトオリジンを証明したが前駆ＥＣと成熟ＥＣの間を識別できないため、外植物をＥＰＣ／ＥＣマーカーＣＤ３４及びＥＣ成熟マーカーＣＤ３１により染色した。ＣＤ３４＋ＥＰＣを植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中では、紡錘形態の細胞が場合によりネットワーク構造に配置されてＵＥＡ−１による染色後に観察される細胞に類似しており、ヒトＣＤ３４に関して陽性であった（図３Ｄ）。ＣＤ３１は、ＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）における形態に類似した細胞上に存在した（図３Ｅ）。ＣＤ３４もＣＤ３１も、ＣＤ１３３＋ＣＰＣ，ＫＤＲ＋ＣＰＣを植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）にて検出できなかった。
【００１２】
実施例４
インビボＣＰＣサブセットに対する血管新生の誘導と炎症性応答
［００８１］ ＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中に検出された全ての細胞がヒトＥＣマーカーに関して染色されなかったため、それらがマウスＥＣであったか否かを調査した。免疫組織化学を用いて、マウスの血管と炎症性細胞を、マウスＣＤ３１（サザンバイオテック、バーミンガム、ＡＬ）及び単球／マクロファージ（ＭｏＭａ，セロテック、オックスフォード、ＵＫ）に対して向けられたラットモノクローナル抗体を用いて検出した。強い宿主由来の血管新生応答が、ヒトＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に対して検出された（図４Ｂ，Ｅ）。しかしながら、ヒトＣＤ１３３＋細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は弱いマウス血管新生応答を誘発し（図４Ｃ，Ｆ）、ＫＤＲ＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の移植に際しての血管新生反応は下限に近かった（図４Ａ，Ｄ）。ヒトＣＤ３４＋細胞に対するマウスＭｏＭａ＋炎症性細胞の強い流入と他の２つのサブセットに対する弱い応答（図４Ｄ−Ｆ）が５つの全ての試験された被験者において観察され（２人のａＭＩ患者、３人の健康な対照）、そしてａＭＩ患者からのＣＰＣと健康な対照からのＣＰＣの間に差異はなかった。ヒト単球（ＣＤ１４＋細胞）又はマクロファージ（ＣＤ６８＋，図４Ｅ挿入図）に対して差異は検出されなかった
実施例５
ＣＤ３４＋サブセットの血管新生に対する効果
［００８２］ ＣＤ３４＋ＣＰＣを実施例１に記載されたとおりに単離し、ヨウ化プロピジウム染色を含めることにより、生きた細胞のみが単離されたことを保証した（図９）。４つのＣＤ３４＋サブセットが、さらにＣＤ３４＋集団：ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−（＋――）；ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−（＋＋―）；ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋（＋―＋）；ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋（＋＋＋）から単離された。４つのＣＤ３４＋ＣＰＣサブセットを追加されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に懸濁して、実施例３に記載されるとおりにヌードマウスに移植した。単一のサブセット又は混合された集団を表３の実験セットアップに従いマウスに移植した。
【００１３】
【表３】
【００１４】
［００８３］ 全体の組織学上の評価のため、２μｍの切片を樹脂埋め込みＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）沈殿物から調製してトイジンブルーにより染色した。血管の数を数え、そして調査した組織の面積に関して補正し、平方マイクロメーターあたりの血管の数を出した。血管は以下の通りに定義される：大きな血管は赤血球を含み、平滑筋に囲まれる；中間の血管は赤血球と平滑筋からなる；そして毛細血管。
［００８４］ レクチンの内皮への特異的結合を用いて、ヒト及びマウスの内皮細胞両方の存在を検出した。レクチンＵＥＡ−１はヒト内皮とＢＳ−１レクチンに特異的に結合し（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ−１，シグマ）、マウス内皮に選択的に結合する。さらに、内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１に対して特異的に向けられた抗体を用いた。検出はＡＢＣキット（ベクターラブス（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ））及びアミノ−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を用いて成し遂げた。ＣＤ３１−陽性細胞の数を数えて組織の面積に関して補正した。
［００８５］ ＣＤ３４＋ＣＰＣ含有Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に比較して血管新生を増加させた。ヒトＣＤ３１に関してこれらのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）沈殿物を染色することは、未成熟内皮細胞を示す大きなＣＤ３１−陽性細胞クラスターの存在を証明する（図１０Ａ）。これらのクラスターは、主に、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットに存在した。血管様構造に関連した少数のヒトＣＤ３１−陽性細胞はＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットに観察された（図１０Ｂ）。
［００８６］ ヒトＣＰＣｓはヒト血管に分化しなかったが、ＣＤ３４＋ヒトＣＰＣサブセットは宿主マウスの血管新生の誘導性作用を提供した。ＣＤ３４＋ＣＰＣ−負荷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）においてマウスＣＤ３１−陽性脈管構造の発生の増加があり、血管のサイズは毛細血管から大きな血管までの範囲であった（図１1）。
［００８７］ マウスＣＤ３１−陽性血管の数／ｍｍ２（毛細血管、小さい血管及び大きな血管を含む）を表３に掲載した５つの実験群に関して測定した（図１２）。血管の同定の基準は、毛細血管が１−２内皮細胞を有する；小さな血管が３−５内皮細胞を有する；そして大きな血管が５より多い内皮細胞を有し、そして血管の周囲に血管平滑筋を有するかもしれない。ＣＤ３４＋ＣＰＣサブセットは、はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を超えて、高いレベルの宿主マウス血管新生を誘導した。もっとも高いレベルの血管新生は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットに観察された。大きな血管は主にＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットに観察され、そしてＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットにおいては、より程度が劣った。さらに、これら２つのサブセットの組み合わせは相乗的ではなく、サブセット何れか単独よりも高いレベルの血管新生を導かなかった。さらに、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットとＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットの組み合わせは毛細血管の形成のみをもたらし、小さな血管及び大きな血管の形成をもたらさなかった。
【００１５】
実施例６
ａＭＩ患者と健康な対照のＣＰＣ転写プロファイル
［００８８］ 以前の研究は、ＣＰＣがそれらの分化及び機能に関連したマーカーの一団を発現し得ることを示す。上記の４パラメーターフローサイトメトリー分析は単一のＣＰＣに対する３つのＣＰＣマーカーの同時評価を可能にするが、このアプローチはこれまで知られている全てのＣＰＣマーカーをカバーしない。よって、定量性ＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、ＣＰＣ分化、成熟及び機能に関連した転写物の数の存在及び発現レベルを調査して、何れの因子がＣＤ３４＋ＣＰＣにおいて観察された前血管新生及び前炎症効果に介在したのかを決定した。
［００８９］ 全ＲＮＡを所望の表現型（ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋）及びランダムヘキサマーからの１０３−１０４ＣＰＣから単離し、そしてコピーのＤＮＡを合成した。ヒトＧＡＰＤＫ，ベータ−２−マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ベータ−アクチン、ｃ−ａｂｌ，ＣＤ３４，ＣＤ１３３，Ｔｉｅ−１，Ｔｉｅ−２，ｆｌｔ−１，ＫＤＲ，ＶＥＧＦ，ＣＤ３１，ＶＥ−カドヘリン、フォンワイルブランド因子（ｖＷＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍ネクローシス因子−α（ＴＮＦ−α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ化学誘因性蛋白質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３に関するプライマー／プローブセット（ＴａｑＭａｎ，アプライドバイオシステムズ、フォスターシティー、ＣＡ）をＣＰＣ転写分析に用いた。３重のＲＴ−ＰＣＲ反応を等量のｃＤＮＡに対して以下のパラメーターを用いて実施した：２分５０℃、１０分９５℃そして４５サイクルの１５秒の変性（９５℃）そして１分のアニーリング／伸長合成（６０℃）。組み合わされたｃＤＮＡ合成とＰＣＲの変量（ＳＤ）は、ＧＡＰＤＨハウスキーピングｍＲＮＡに関して０．５ＣＴ未満（サイクル閾値）であった。サイクル閾値の値をベータ−２−マイクログロブリンに対して△ＣＴ法を用いて標準化し、そして患者と対照の間又はサブセット間の発現レベルの差異を発現の倍分散（ｆｏｌｄ ｖａｒｉａｎｃｅ）として表現ｓｉ，２−△△ＣＴとして計算する（Ｌｉｖａｋ ＫＪ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２−△△Ｃ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５：４０２−８，２００１）。
［００９０］ ＣＰＣの成熟と機能に関与する可能性のある１４のマーカーのｍＲＮＡ転写物の存在を決定するためのＲＴ−ＰＣＲの結果を表４に示す。遺伝子発現に関して個人間の変化があったので、与えられたＣＰＣサブセットにおける遺伝子の発現を少なくとも３／５被験者におけるＰＣＲ産物の存在として規定した（即ち、ＣＴ値＜４５）。この規定に基づくと、ａＭＩ患者と健康な対照の遺伝子発現プロファイルは類似していた。
【００１６】
【表４】
【００１７】
［００９１］ ３つのＣＰＣサブセットを比較すると、遺伝子発現の獲得は、ＫＤＲ→ＣＤ１３３→ＣＤ３４の順なのが明確であった。Ｔｉｅ−１，ＣＤ３４そして健康な対照においてはＣＤ１３３とｖＷＦ転写物がＣＤ１３３サブセットには存在したが、ＫＤＲサブセットには存在しなかった。Ｆｌｔ−１転写物はＫＤＲ＋サブセットにおいて検出可能であったが、ＣＤ１３３＋細胞には不在であった。ＣＤ３４＋サブセットにおいては、Ｔｉｅ−２，ｆｌｔ−１，ＣＤ１３３そしてａＭＩ患者においては、ＣＤ３４が、ＫＤＲ＋及びＣＤ１３３＋細胞との比較において獲得された。
［００９２］ 炎症関連分子の転写物ＧＭ−ＣＳＦ，ＭＣＰ−１，ＣＭＰ−２及びＭＣＰ−３は、全てのサブセットにおいてＰＣＴ検出限界を下回った。ＴＮＦ−αとＭＩＰ−１α転写物は類似の量でＣＤ３４＋ＣＰＣとＫＤＲ＋ＣＰＣ存在した。インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、全ての含まれる個体からのＣＤ３４＋転写物に存在した。ＫＤＲ＋ＣＰＣにおいては、しかしながら、ＩＬ−８転写物が５人の個体のうちの２人にしか見いだされなかった。さらに、ＩＬ−８転写物レベルは、ＣＤ３４＋サブセットにおいてＫＤＲ＋サブセットにおけるよりも３倍高かった。インターロイキンー８転写物は、ヌードマウスにおいてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中で、分類直後及び移植１４日後の両方においてＣＤ３４＋ＣＰＣに見いだされた。
［００９３］ 他に示さなければ、明細書及び特許請求の範囲において用いられる、成分の量、特性、例えば分子量、反応条件等を表す全ての数字は、用語「約」により全ての例において修飾されるものとして理解される。従って、反対を指示しなければ、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示された数値パラメーターは、本発明において得られることが求められている所望の特性に依存して変更してよい近似値である。少なく見ても、そして特許請求の範囲への均等な学説を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、報告された顕著なディジットの数の見地から、そして通常のラウンディング技術を適用することにより、少なくとも構築されるべきである。発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似しているにも拘わらず、特定の実施例において示された数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、如何なる数値も、それらの試験測定において見いだされる標準偏差から必然的にもたらされる一定の誤差を本来は含む。
［００９４］ 発明を記載するコンテクストにおいて用いられる用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の関係語（特に、以下の特許請求の範囲のコンテクストにおいて）は、他に示さない限り単数及び複数の両方をカバーすることを意図する。本明細書に記載された値の範囲の詳説は単にその範囲内に該当する各々の別々の値を個々に言及する速記法として機能することを意図する。他に示さなければ、各々の個別の値は個別に詳説されたごとくに明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての方法は、他に示さない限り又はコンテクストにより明確に否定されない限り、あらゆる適切な順序にて実施され得る。本明細書に提供される全ての実施例、又は例示の用語（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ」）の使用は、発明を良好に例示することを単に意図するものであり、他に請求された発明の範囲の限定の態度を取るのではない。明細書中の言語は発明の実施に必須のあらゆる請求されない要素を示すものとして解釈されるべきである。
［００９５］ 本明細書に開示された発明の別の要素又は態様のグループ分けは、限定と解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、又は本明細書に見いだされるグループの他のメンバー又は他の要素とのあらゆる組み合わせにおいて、言及されて請求されてよい。一つ又はそれより多くのグループメンバーが、便利性及び／又は特許性の理由に関してグループないに含まれるか又はグループから削除してよいことが認識される。そのような包含又は削除の如何なるものが起きたときも、明細書はここでは修飾されたものとしてグループを含むと見なされ、即ち、特許請求の範囲内で使用される全てのマーカッシュグループの書かれた記載を実行する。
［００９６］ この発明の好ましい態様は本明細書に記載されており、発明を実施するために発明者らに公知のベストモードを含む。もちろん、それらの好ましい態様におけるバリエーションは上記記載を読んだ当業者には明らかである。発明者は当業者がそのようなバリエーションを適切なものとして用いることを期待し、そして発明者は、発明が、本明細書にて特別に記載されたよりも他に実行されることを意図する。従って、この発明は、適用可能な法律により許可される添付の特許請求の範囲に詳説された主題の全ての修飾物と均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記の要素のあらゆる組み合わせが、他に示さない限り又は他にコンテクストにより否定されない限り、発明に包含される。
［００９７］ さらに、数値のレファレンスはこの明細書を通して特許及び印刷された刊行物に対してなされた。上記の引用されたレファレンスと印刷された刊行物の各々は、それら全てを引用により別個に本明細書に取り込む。
［００９８］ 終わりに、本明細書に開示された発明の態様が本発明の原理の例示であることは、理解されるべきである。採用されるかもしれない他の修飾は発明の範囲内である。即ち、例示の目的で、しかし限定ではなく、本発明の別の配置を本明細書内の教示に従い利用してよい。従って、本発明は示されて記載された通りに正確に発明を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】［００２３］ 図１は、フローサイトメトリーにより測定された、本発明の教示に従いＬｉｎ−，ＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲとして規定された、急性心筋梗塞の患者（ａＭＩ，ｎ＝１０）、安定狭心症（ｓＡＰ、ｎ＝１０）及び健康な対照（ｈｃ，ｎ＝９）からの末梢血中の血中前駆細胞（ＣＰＣ）の数を描写する。
【図２】［００２４］ 図２は、本発明の教示に従い１４日後にヌードマウスに移植されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレット中に分類されたＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋の何れかのヒトＣＰＣサブセットのインビボの挙動を描写する。（Ａ）はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）；（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、及び（Ｃ）ＣＤ１３３＋細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）。矢印は、有力なＥＰＣと考えられた紡錘細胞により形成された代表的なネットワーク構造を示す。対物レンズ４０倍。
【図３】［００２５］ 図３は、本発明の教示に従い、ヌードマウスに移植されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットに封入された（ｅｎｃｌｏｓｅｄ）単離ＣＰＣ上のヒト内皮前駆マーカーの形態上の検出を描写する。パネルＡ−Ｃにおいて、ヒト内皮細胞（ＥＣ）をレクチンＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅｕｓ−１アグルチニン（ＴＲＩＴＣにコンジュゲートされたＵＥＡ−１）、ヒト−及びＥＣ−特異的レクチンにより検出された；（Ａ）ヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）陽性細胞；（Ｂ）マウスＥＣ細胞系（Ｈ５Ｖ）陰性対照；（Ｃ）ヒトＣＤ３４＋ＥＰＣ結合ＵＥＡ−１レクチンと植えられた（ｓｅｅｄｅｄ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中の細胞。ＵＥＡ−１結合細胞は紡錘形であり、そして接触させた（矢印）。パネルＤ−Ｅにおいては、（Ｄ）ヒトＣＤ３４（ＥＣ，ＥＣ）、及び（Ｅ）ＣＤ３１（ＥＣ）に関して染色することによりＥＣ表現型を確認した。陽性の内皮細胞を矢印で示す。挿入物は、ヒト血管の追加の例を示す。対物レンズ４０倍。
【図４】［００２６］ 図４は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中でヌードマウスに移植された、本発明の教示に従い単離された、ヒトＣＰＣサブセットに対するマウスの血管新生及び炎症の応答を描写する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のマウスの血管の形成は、マウスＣＤ３１に特異的なモノクローナル抗体を用いて検出した（Ａ−Ｃ）。マウス単球／マクロファージは、それらの細胞に特異的なモノクローナルにより検出した（Ｄ−Ｆ）。パネルＥ中の挿入物は、切片中のヒトＣＤ６８＋マクロファージにより検出した。対物レンズ４０倍。
【図５】［００２７］ 図５は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中でヌードマウスに移植された、本発明の教示に従い単離された、ＣＤ３４＋細胞中のインターロイキン−８（ＩＬ−８）の検出を描写する。インターロイキン−８発現は、分類直後（Ａ）及び移植の１４日後（Ｂ）に測定した。対物レンズ４０倍。
【図６Ａ】［００２８］ 図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図６Ｂ】図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図６Ｃ】図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図６Ｄ】図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図７】［００２９］ 図７は、Ｌｉｎ−，ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋又はＫＤＲ＋として規定されたサブセットとして、ａＭＩ（ｎ＝１０）及び健康な対照（ｈｃ，ｎ＝９）からの末梢血中のＣＰＣの数を描写する。点は個体を表す；水平線は中央値を表す；平均に基づいて倍数増加。Ｐ＝ｐ値。
【図８】［００３０］ 図８は、ａＭＩ（ｎ＝１０）及び健康な対照（ｈｃ，ｎ＝９）における本発明の教示に従って定義された７つのＣＰＣサブセットの、フローサイトメトリー分析により測定された細胞の数を描写する。水平線は中央値を表す；平均に基づいて倍数増加。
【図９】［００３１］ 図９は、本発明の教示に従う、４つのＣＤ３４＋ＣＰＣサブセット、又はサブセットの組み合わせの、フローサイトメトリー分類を描写する。（Ａ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−；（Ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋；（Ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−；（Ｄ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋。
【図１０】［００３２］ 図１０は、ヌードマウスにおける移植１４日後の、本発明の教示に従う、ＣＤ３４＋ＣＰＣ−負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のヒトＣＤ３１−陽性細胞の存在を描写する。（Ａ）ヒトＣＤ３１−陽性細胞クラスターと成熟表現型；（Ｂ）血管様構造中のヒト、ＣＤ３１−陽性細胞。
【図１１】［００３３］ 図１１は、ヌードマウスにおける移植１４日後の、本発明の教示に従う、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−ＣＰＣ−負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のマウスＣＤ３１−陽性細胞の存在を描写する。毛細管（矢印）から小（星印）及び大（挿入が（ｉｎｓｅｔ））までの範囲の異なるサイズの血管を検出した。両イメージ（大と小）をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットの同じ切片の同じ拡大にて撮った。
【図１２】［００３４］ 図１２は、ヌードマウスにおける移植１４日後の、本発明の教示に従う、ＣＤ３４＋サブセットからのＣＤ３４＋ＣＰＣを負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のマウスＣＤ３１−陽性血管／ｎｍ２の定量を描写する。（Ａ）毛細管、（Ｂ）小さい血管及び（Ｃ）大きい血管。＋＋−，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋；＋――，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−；＋＋＋，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋；＋―＋，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋；Ｂ，そのままのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）。
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
［０００１］ 本出願は、２００４年８月１３日に出願された米国仮特許出願６０／６０１，１８８に対してＵ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下で優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
［０００２］ 本発明は、一般に、心臓血管疾患の治療のための内皮前駆細胞を単離する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
［０００３］ 組織の虚血に応じての新規な血管の発生は、生理的器官機能に必要な組織還流を維持するために意図される自然な宿主の反応を構成する。この自然な血管新生は、高齢化、糖尿病、及び高コレステロール症において十分に機能しない。これらの症状の各々において、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の内因性の発現の低下があり、そして外来のＶＥＧＦの投与が増強された新規な血管形成を導く。
［０００４］ 虚血性の組織の損傷は一連の事象を誘発し、血中前駆細胞（ＣＰＣ）の損傷部位への移動及び補充を含む。虚血後の血管新生のモデルにおいては、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）と命名されたＣＰＣの亜集団が新規血管内に入る。さらに、動物モデルにおいて、並びに急性心筋梗塞（ａＭＩ）の臨床試験においては、ＥＰＣの全身投与が心筋の血管形成に寄与し、そして改善された心筋機能に付随する。
［０００５］ それらのオリジナルの記載以来、骨髄由来のＥＰＣは血管の損傷を発展させた（ｅｖｏｌｖｉｎｇ）後の再生治療において焦点となってきた。末梢血においては通常低いＣＰＣの数が虚血性事象の後には顕著に増加するため、血管の損傷とＣＰＣ−媒介性修復の間の因果関係が仮定された。虚血後の血管新生の動物モデルにおいては、骨髄由来のＥＰＣが新規の血管に入る。さらに、ＶＥＧＦを含む血管新生成長因子の局所及び全身のレベルが虚血後に上昇し、そして血中のＣＰＣの数の増加と関連する。
［０００６］ 外来の成長因子の投与の明らかな治療上のポテンシャルは、動物及びヒトにおいて成功裏に評価された。様々な動物モデルにおいて、ＶＥＧＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、繊維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ−１）、間質（ｓｔｒｏｍａｌ）由来因子（ＳＤＦ−１）又はスタチン薬剤の投与による血管損傷の後のＥＰＣの移動は血中ＥＰＣの数の増加と相関し、そして治療上の血管形成を改善した。ＥＰＣの血管形成ポテンシャルの直接の証拠は、後肢の虚血と有するマウスに移植されたＥＰＣが新規に形成された血管に入ったという研究により提供される（Ｋａｌｋａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，”Ｔｒａｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：３４２２−７，２０００）。心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデルにおいて、ヒトＣＤ３４＋ＣＰＣの静脈内注射は心筋の再血管形成に寄与し、そして心筋機能の救済に関連した（Ｋｏｃｈｅｒ Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，”Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｒｅｄｕｃｅｓ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：４１２−３，２００１）。さらに、ａＭＩの患者における自己のＥＰＣの梗塞動脈への冠動脈内注入は、梗塞エリアの心筋の生存性の増加をもたらした（Ａｓｓｍｕｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ［ＴＯＰＣＡＲＥ−ＡＭＩ］，”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０６：３００９−１７，２００２）。
［０００７］ 現在の前駆細胞の研究は、治療上の血管形成におけるＣＰＣの臨床上の応用に焦点が向けられている。よって、未来の大規模なＣＰＣの治療上の応用はこれらの細胞の表現型上及び機能上の特性の理解を必要とすることになる。表現型上開散性のＣＰＣサブセットが識別可能であることが証明された。細胞表面マーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ，ｆｌｋ−１）がＣＰＣの一元的又は二元的パラメーターフローサイトメトリー分析のためのＣＰＣマーカーとして用いられており、ＣＤ３４＋前駆細胞（ＰＣ）の富裕化を導く。このアプローチの欠点は技術的限界であって、一通り及び二通りのパラメーター検出により規定されたときにＣＰＣサブセット間の同一性及び関連性を決定することにおいての制限を含む。
［０００８］ おもしろいことに、ＣＰＣの検出及び単離に用いられた方法はＣＰＣ機能アッセイの結果も決定する。フローサイトメトリーにより単離されて血管新生条件下で培養されたとき、ＣＤ３４＋ＣＰＣは紡錘細胞を形成し、時間をかけて毛細血管様構造を組織化する。さらに、これらの細胞は内皮細胞（ＥＣ）に特異的なマーカー、例えば、ＣＤ３１，Ｅ−セレクチン及びＴｉｅ−２を発現する。
［０００９］ 或いは、ＣＰＣは、血管形成性成長因子の存在下でフィブロネクチン又はゼラチンをコートされたプレート上で単核細胞のインビトロ培養に基づいて単離された。低密度のリポプロテイン（ＬＤＬ）陰性であってレクチン結合能力を呈した単離細胞が、ＣＰＣと呼ばれた。これらの細胞はインビボにおいて血管新生を促進できるが、それらは単球の特性を有し、そしてそれらの血管新生能は血管新生因子、例えばＶＥＧＦ、肝臓成長因子（ＨＧＦ）、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦのそれらによる生産により実際には誘導される。即ち、これらのＬＤＬ−，レクチン結合細胞は直接ＥＣを形成しないが、それらは血管新生を変調し得る。
［００１０］ 前記のことに基づいて、内皮前駆細胞の不均質集団及び均質集団の両方が、心臓血管疾患の治療のための機会を示す。
【０００４】
発明の概要
［００１１］ 本発明は、血管を形成することができるか又は血管新生を誘導できるヒト末梢血内皮前駆細胞を生じる細胞及び炎症媒介性細胞の４つのパラメーター蛍光活性化細胞分類を用いた単離の方法を記載する。さらに、本発明は、炎症性細胞に関して血管新生及び／又はケモタクシスを誘導する能力を有する内皮前駆細胞を含む生物分解性移植物を提供する。本発明の一つの態様において、血管形成／血管新生細胞及び炎症媒介新生細胞の両方を生じさせるヒト末梢血内皮前駆細胞のサブセット、ＣＤ３４＋ＣＰＣが同定される。
［００１２］ 本発明の一つの態様において、前駆細胞を、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクロームで標識された抗体に接触させて前駆細胞の源から系列に関係付けられた（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞を割り出し（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）；系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞の集団を形成するように蛍光活性化細胞分類により系列に関係付けられた細胞を枯渇させ；系列陰性細胞をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲからなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクローム標識抗体に接触させるが、その際、各抗体は唯一の放射波長を有するフルオロクロームにより標識されており；そして標識された系列陰性細胞を３色蛍光活性化細胞分類により分類することにより、内皮前駆細胞の集団を形成することを含む。
［００１３］ 本発明の一つの態様において、前駆細胞の源は哺乳類源であって、ヒト源、例えば末梢血を含む。
［００１４］ 本発明の別の態様において、系列に関係付けられた細胞を割り出すのに有用な抗体は、細胞マーカーＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１に特異的な抗体を含む。
［００１５］ 本発明の別の態様において、反応工程は、細胞マーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに特異的な抗体と系列陰性細胞を反応させることを含む。本発明の別の態様において、結果の内皮前駆細胞はＣＤ３４を発現する。本発明の別の態様において、結果の内皮前駆細胞はＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−である。
［００１６］ 本発明の一つの態様において、内皮前駆細胞は、血管生成細胞、炎症媒介性細胞、又は両方である。本発明の別の態様において、血管生成細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である。本発明のまた別の態様において、内皮前駆細胞は、インターロイキン−８を発現できる炎症媒介性細胞である。
［００１７］ 本発明の別の態様において、内皮前駆細胞は、周囲の血管中に血管新生応答を誘導する。
［００１８］ 本発明の一つの態様において、処置された部位において血管新生を誘導する治療用組成物は、その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性マトリックスを含むように提供される。本発明の別の態様において、生物分解性マトリックスは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である。
［００１９］ 本発明の別の態様において、炎症媒介性細胞に対して処置部位においてケモタクシス効果を有する治療用組成物は、その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性の生物適合性マトリックスを含むように提供される。本発明の別の態様において、生物分解性の生物適合性マトリックスは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である。
［００２０］ 本発明のまた別の態様において、生物分解性の生物適合性マトリックスは、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様基質からなる群から選択される。
［００２１］ 本発明の一つの態様において、単離された集団が系列陰性のＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−であるように提供される。
［００２２］ 本発明の別の態様において、内皮前駆細胞の単離された集団は血管生成細胞を含む。本発明の別の態様において、内皮前駆細胞の単離された集団は、インターロイキン−８を発現できる炎症媒介性細胞を含む。本発明の別の態様において、内皮前駆細胞の単離された集団は、周囲の血管に血管新生応答を誘導する。
【０００５】
発明の詳細な説明
［００３５］ 本発明は、４つのパラメーター蛍光活性化細胞分類を用いて、血管を形成できるか又は血管新生及び炎症媒介性細胞を誘導することができる、ヒト末梢血内皮前駆細胞の単離のための方法を記載する。さらに、本発明は、炎症細胞のために血管新生及び／又はケモタクシスを誘導する能力を有する内皮前駆細胞を含む生分解可能な移植物を提供する。一つの態様において、血管形成／血管新生細胞及び炎症媒介細胞の両方を生じさせる、ヒト末梢血内皮前駆細胞、ＣＤ３４＋血中前駆細胞細胞（ＣＰＣ）のサブセットを同定する。ＣＤ３４＋ＣＰＣ，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−細胞のサブセットがこれらの活性に必須であるというのが本発明の非拘束の（ｎｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）仮説である。
［００３６］ 過去数年にわたり、ＣＰＣは心臓血管再生治療において活動中心となってきたが、特に、成長因子投与によるＣＰＣの治療上の動員とこれらの細胞の梗塞された領域への移植が虚血状態の患者への利益を証明した。以前、ＣＰＣｓのサブセット、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が血管新生におけるキープレイヤーとして指定された。しかしながら、ＥＰＣが表現型上及び機能上内皮形成能力を有する異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）集団であるという蓄積した証拠が存在する。このＣＰＣの異種集団は、よって、異なる機能を有するＥＰＣｓの源を提供する。この明細書において発明を記載するために、血中前駆細胞と内皮前駆細胞は同じ細胞集団を意味する。
［００３７］ 本発明者らは、予測に反して、系列陰性であり、ＣＤ３４を発現するがＣＤ１３３とＫＤＲを発現せず、血管を形成するのに必須のＣＰＣｓのサブセットを発見した。ＣＤの呼称は、「分化のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」抗原を意味し、白血球細胞表面上に存在する抗原を系統的に同定する。ＣＤ３４は内皮細胞上及び造血幹細胞上に構成的に発現される膜貫通糖蛋白質である。ＣＤ１３３は造血幹細胞抗原であり、プロミニンとしても知られている。ＫＤＲはヒト血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の前駆体であり、Ｆｌｋ−１としても知られる。この血管形成集団のＣＰＣｓがＫＤＲ＋であったと以前は考えられていた。
［００３８］ 幹細胞と前駆細胞は、より成熟した系列に関係付けられた（Ｌｉｎ＋）細胞の特徴である特定のマーカーを欠く。系列特異的マーカーは、限定ではないが、ＣＤ３，ＣＤ８，ＣＤ１０，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ３１及びＣＤ３３を含む。本発明の一つの態様において、Ｌｉｎ＋細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現する。本発明の別の態様において、Ｌｉｎ−細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現しない。
［００３９］ これらのマーカーの発現パターンに基づいてＥＰＣ表現型の転写プロファイリングと優秀な分析により、広く受容されたＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲを発現するヒトＣＰＣの生体での挙動を研究した。３つのグループの患者からのＣＰＣｓを研究した：（ｉ）再度のパフュージョン治療の成功を経験した急性心筋梗塞（ａＭＩ）患者、（ｉｉ）健康なボランティア及び（ｉｉｉ）スタチンドラッグによる治療を経験した安定なアンギナの患者。スタチン治療は治療の開始後早くも７日目にＣＰＣのレベルの増加を報告し、そして多数のａＭＩ患者がスタチン治療を受けている。
［００４０］ 系列陰性集団に関して分類されてＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲの何れかを発現する患者の各グループからの末梢血単核細胞を、ＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの細胞発現の３つのパラメーターの評価（３色蛍光活性化細胞分類）に基づいて７つの別個のサブセット全部に細分類する（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ）ことができる。これらの７つのサブセットは、健康な被験者の血中及びスタチンドラッグによる治療を経験した安定なアンギナ患者の血中に存在し、そしてａＭＩ後は全て細胞数が増加した。
［００４１］ 全３つのＣＰＣサブセット（即ち、ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋）のａＭＩ後の動員は、前駆細胞（ＰＣ）の非選択的補充を示す（図６Ａ）。さらに、内皮細胞の分化及び機能に関与する遺伝子の発現分析は、ａＭＩ患者と健康な対照の間の同じサブセットのＣＰＣ内での遺伝子発現に主な違いはないことを明らかにした。これらの発見は、ａＭＩ後に増加したＣＰＣの動員がこれらの細胞の変化した発現メイクアップの結果ではなく、むしろ骨髄由来のＣＰＣの剥離を増強する外部因子の結果であることを示唆する。さらに、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は虚血性損傷により生じるが、骨髄内のマトリックスメタロプロテイナーゼ−９の発現を誘導する。このプロセスは可溶性Ｋｉｔリガンドの放出をもたらし、ｃＫｉｔ＋幹細胞と前駆細胞の血中への動員を推進する。
［００４２］ これら３つのＣＰＣサブセットのインビボにおける挙動を研究するため、本発明者らは、生物分解性マトリックス、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＢＤバイオサイエンセズ）に封入されたヒトＣＰＣがマウス宿主内で成熟することを許容されたモデルを確立した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は生物分解性で生物適合性の可溶性基底膜マトリックスである。当業者に知られている他の生物分解性マトリックスを本発明の範囲内で使用可能である。生物分解性マトリックスの他の例は、限定ではないが、自己由来の血小板細胞、コラーゲンゲル、又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づいたコラーゲン様基材を含む。生物分解性マトリックスの使用は多数の利点を有すが、その一つはＣＰＣの位置局限であり、相対的に数の少ない標的細胞を観察することを可能にさせる。さらに、ＣＰＣにより生産された可溶性因子は、生物分解性マトリックスを通して自由に拡散して宿主環境に到達できる。よって、ヒトＣＰＣの分化が監視できるのみならず、これらの細胞の宿主由来の血管新生（即ち、周囲のマウス血管の発生）に対する衝撃が容易に可視化できる。さらに、本発明の一つの態様において、生物分解性マトリックスは、前駆細胞の局在化された移植により利益を受ける疾患の治療のための哺乳類へのＣＰＣの移植に有用である。最後に、ヒトＣＰＣとマウス炎症性細胞の間の相互作用を研究することができ、即ち、虚血の後の炎症性リモデリングにおけるＣＰＣの役割に関しての指標を提供する。
［００４３］ 本発明の一つの態様において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）移植物に封入されたがＣＤ１３３＋細胞又はＫＤＲ＋細胞ではないＣＤ３４＋細胞は、成熟した内皮細胞（ＥＣ）を形成した。遺伝子発現分析は、ＣＤ３１転写物が３つ全てのサブセットに存在したことから、内皮形成のポテンシャルを示唆する。ＣＤ３１は単球細胞表現型を有する内皮細胞又は血管新生ポテンシャルを有する単球細胞の代用物として機能し、内皮への関係付け（ｅｎｄｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）の証明としてのＣＤ３１転写物の存在が弱められる。フォンビルブランド因子転写物はＣＤ３４＋細胞及びＣＤ１３３＋細胞において検出可能であったが、ＫＤＲ＋細胞においては常に検出可能ではなかったことから、前者２つのサブセットの分化は内皮系列に対して実は歪められるのかもしれないことを示唆する。
［００４４］ 本発明の別の態様において、成熟した内皮細胞を生じさせるＣＤ３４＋集団も、チロシンキナーゼ受容体であるＴｉｅ−２を発現する。ＣＤ３４，Ｔｉｅ−１，Ｔｉｅ−２，ＶＥＧＦ及びＫＤＲの遺伝子転写物はＣＰＣに特徴的であり、ＣＤ３４＋細胞に存在し、そして低レベルでＣＤ１３３＋細胞に存在したが、ＫＤＲ＋細胞には不在であったことから、前者２つのサブセットの内皮系列への強い関係付けが示される。Ｔｉｅ−２発現はＣＤ３４＋サブセットのみに見いだされたが、インビボにおいて内皮細胞を生じさせる唯一のサブセットであった。Ｔｉｅ−２は内皮細胞の生き残り及び毛細血管の形態形成に必須であるから、この分子の存在はインビボにおいてこのサブセットにおいて内皮細胞を形成するための装置であるかもしれない。
［００４５］ 系列陰性細胞のＣＰＣサブセットを表現型により明確に識別するために、ＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの３つのパラメーターのフローサイトメトリー分析を確立した。以前の技術と比較してのこの戦略の利点は、分析における全てのＣＰＣのサブタイプの偏りのない封入（ｕｎｂｉａｓｅｄ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）からなる。この偏りのない封入は、非関係付けの前駆細胞の使用により達成されて、分析のための出発集団として、ＣＤ３４の予めの選択により系列陰性（Ｌｉｎ−）細胞に関して富裕にされた。このアプローチがインビボにて移植されたＣＰＣ集団の解剖を可能にさせるため（即ち、ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋，ＫＤＲ＋細胞）、インビボにおいて観察された効果に必須の有望なＣＰＣサブセットが同定される。この技術を用いて、主要なＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋細胞集団内の７つの表現型上別々のＣＰＣサブセットが同定された（図６Ｃ，Ｄ）。
［００４６］ ３つの主要な集団全てにおいて回帰性の（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ）ＣＰＣサブセットは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋又は三重に陽性のサブセット細胞である。ＣＤ３４＋細胞の予めの選択後に、これらの細胞は以前に記載されており、ＥＰＣを運ぶことが示された。本発明者らの支配下では（ｉｎ ｔｈｅ ｈａｎｄｓ ｏｆ）、これらの細胞はインビボにおいてＥＣ形成に寄与せず、おそらくはそれらの頻度の低さによる。
［００４７］ ＫＤＲ＋集団内では、３つのさらなるＥＰＣサブセットが同定された：ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞、ＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞及びＣＤ３４―ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞。ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋細胞は有力な造血幹細胞又は成人の血管芽細胞（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ）として記述されてきた。ＣＤ１３３は一次前駆細胞のマーカーであるが成熟内皮細胞のマーカーではない。よって、検出されたＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞は、より成熟した細胞であるかもしれない。ＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞の有意さはまだ決定するのが難しいが、ＫＤＲが様々な前駆細胞上に発現されるからである。ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋細胞は血管の外傷に際して血中に補充されたＥＰＣであるという観察から、ＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞の可能な同定が推理され得る。さらに、このサブセットは、これら３つのマーカーの発現に関する限り、Ｒｅｙｅｓら（Ｒｅｙｅｓ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：３３７−４６，２００２）に記載された骨髄からの間組織幹細胞集団に似ており、彼らは、これらの細胞の内皮細胞形成能力も証明した。それらの表現型にも拘わらず、しかしながら、これら４つのサブセットの組み合わせ（即ち、ＣＤ３４＋／ＣＤ１３３＋／ＫＤＲ＋，ＣＤ３４−／ＣＤ１３３＋／ＫＤＲ＋，ＣＤ３４−／ＣＤ１３３−／ＫＤＲ＋，及びＣＤ３４＋／ＣＤ１３３−／ＫＤＲ＋）は、実施例３に示されるとおりＥＣ分化をもたらさなかった（図２及び３）。
［００４８］ ＫＤＲ＋細胞に類似して、ＣＤ１３３＋細胞は単独ではインビボにおいて内皮細胞を形成しない。ＣＤ１３３＋集団は、以前に論じられたとおり、ＫＤＲ＋集団とＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋サブセットを共有する。ＣＤ１３３＋集団内の残りの２つのサブセットはＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−とＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−である。ＣＤ３４−ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞を生じるそれらの能力に基づくと、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞の前駆体であるらしい。この後者の表現型（ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋）に関して、造血前駆細胞、ＥＰＣ及び血管リンパ細胞前駆体の機能が提案されている。しかしながら、実施例３に記載されたインビボシステムにおいては、４つのＣＤ１３３＋ＰＣサブセットの組み合わせは内皮細胞を生じなかったことから、因子の配列が内皮細胞分化を誘導するのに十分でなかったらしいことが示唆される。
［００４９］ ７つのＣＰＣサブセットの表現型と挙動の要約を下の表１に掲載する。
【０００６】
【表１】
【０００７】
［００５０］ 本発明の一つの態様において、ＣＤ３４＋集団は、レクチンＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅｕｓ−１アグルチニン（ＵＥＡ−１）への結合、ＣＤ３４＋及びＣＤ３１＋の発現、スピンドルの形態及びネットワークの組織により示されるとおり、成熟ＥＣをインビボにおいて形成するための７つの同定されたＣＰＣ亜集団の一つにすぎない。ＣＤ３４＋集団は、ＣＤ１３３＋集団と、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットを共有し、そしてＫＤＲ＋集団と、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットを共有する。これらの２つのサブセットはそれぞれＣＤ１３３＋集団とＫＤＲ＋集団のコンテクストにおいて内皮細胞分化に寄与しなかったが、それらは、ＣＤ３４＋集団に独特の、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットとの組み合わせにおいてそうでなかった。末梢血単核細胞（ＭＮＣ）におけるＣＤ３４の発現は、Ａｓａｈａｒａら（Ａｓａｈａｒａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：９６４−９６７，１９９７）がこの表現型を有する細胞をフィブロネクチン上で血管新生条件下で生育させたら、内皮細胞を生じ得たことを観察したという基準（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）であった。
［００５１］ 本発明の態様において、ＣＤ３４＋細胞のインビボ内皮細胞形成能力は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−細胞の存在によるものであり、そしてオプションとしては、このサブセット内のＴｉｅ−２の発現による。本発明の別の態様において、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞とＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞の組み合わさった存在は、可能性としてＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットの組み合わせであり、内皮細胞分化に必要かもしれない。
［００５２］ 予測に反して、ＣＤ３４＋ＣＰＣサブセットはＥＣに分化する上、マウスの血管のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）への内部への成長（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）も刺激した。細胞外マトリックス成分と成長因子のその組成物により血管新生性であったが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）自体（はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））は、１４日の観察期間の間にマウスの血管の内部成長を誘導しなかった（実施例３と実施例５）。
［００５３］ ＣＤ３４＋ＣＰＣの移植は、２日で血管新生をもたらす。最初に、ヒトＣＤ３４＋ＣＰＣがヒト内皮細胞に侵入する。続いて、ヒトＣＤ３４＋ＣＰＣが宿主による血管内部侵入を誘導する。全てのＣＤ３４＋ ＣＰＣサブセットが宿主血管新生を等しく誘導はしなかった。ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットとＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットが宿主血管新生に重要であった。大きな血管が最初にＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットにおいて観察され、そしてより少ない程度にてＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットにおいて観察された。さらに、これら２つのサブセットの組み合わせは相乗的でなく、サブセット単独に比べて高レベルの血管新生を導かなかった。さらに、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−とＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットの組み合わせは、毛細血管の形成をもたらしたのみであり、小さい血管及び大きい血管の形成はもたらさなかった。初代毛細血管の誘導は虚血性心臓疾患を治療するのに有用かもしれない。
［００５４］ ここまでは、ＣＰＣが新規な血管を直接生じて損傷後に血管新生に寄与することができた細胞として考察された。本発明者らによる意外な観察は、ＣＰＣが局所脈管構造に対する変調機能を及ぼし得て、血管新生を発生させることを証明する。この発見は、改善された治療用血管新生に関する新規な展望を提供する。
［００５５］ 本発明の別の態様において、本発明の教示により単離されたＣＤ３４＋ＣＰＣｓは、単球／マクロファージ系列の炎症性細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のマイクロ環境へ補充する。はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）はマウスのマクロファージの誘因をほとんど行使しなかったことから、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に対する低いグレードの外来身体反応（ｆｏｒｅｉｇｎ ｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のみがマウントされたことを示す。ＣＤ１３３＋細胞又はＫＤＲ＋細胞を負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に対する炎症性応答ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のそれらを超えなかったので、これらのサブセットはそれら自身によりマクロファージの浸潤を変調しなかった。比較して、ＣＤ３４＋細胞を負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のマクロファージ浸潤は顕著に高かったため、これらの細胞の追加のマクロファージ誘因効果がＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の効果に重ねられたことが示される。よって、ＣＰＣの機能は内皮細胞への分化のそれを超えて拡大するかもしれず、そして追加の治療用の含蓄を有するかもしれない。本発明のまた別の態様において、虚血性の心筋からの損傷シグナルにより補充された前駆細胞は、内皮細胞へ直接に分化して局所血管の成長を促進させることにより血管新生に寄与するのみならず、炎症性細胞を損傷したエリアに補充するのかもしれない。
［００５６］ 前炎症性化学誘引因子（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ）はＣＤ３４＋前駆細胞により生産される。ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋３つ全てのサブセットが炎症関連サイトカイン／ケモカイン腫瘍ネクローシス因子−α（ＴＮＦ−α）及びマクロファージ炎症性蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）の転写物を含んだが、炎症性細胞を補充するのに必須のＣＤ３４＋亜集団のみは高いレベルのヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）を発現した（ＫＤＲ＋細胞よりも３倍増加）。さらに、ヒトＩＬ−８の単一の細胞による発現はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）移植の１４日後まで持続した。
［００５７］ 本発明者らによる驚くべき観察は、ＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲのようなマーカーの発現に以前はただ基づいていたＣＰＣの存在する定義を書き換える必要性を指摘するが、なぜならば、これらの分子の発現パターンを変えた様々なサブセットが存在するからであり、等しく内皮細胞へ分化することができない。急性のＭＩは全ての検出された前駆細胞サブタイプの移動を導くことが、健康な個体及びａＭＩ患者からのＣＰＣサブセットにおける類似の遺伝子発現パターンから証明されたことから、ＣＰＣは損傷シグナルに適合可能に応答せず、むしろ、骨髄から受動的に放出されることを示す。最後に、ＣＤ３４＋前駆細胞は血管新生のポテンシャル並びに免疫変調ポテンシャルを有し、本発明の教示を用いて新規な治療戦略の生成に関して開発されるかもしれない。
［００５８］ 本発明の一つの態様において、４つのパラメーターの蛍光活性化細胞分類を用いて、血管形成細胞と炎症媒介細胞の両方を生じるＣＰＣを同定する。本発明の４つのパラメーターは系列、ＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲである。
［００５９］ 本発明の一つの態様において、所望の細胞を規定するモノクローナル又はポリクローナルの何れかの抗体のカクテル又は混合物に細胞を暴露することにより、所望の細胞集団を含む細胞源を所望の集団及び不所望の集団に分離する。蛍光活性化細胞ソーターに、一つ又はそれより多い抗体が結合していた細胞を同定させるように、当該抗体に蛍光標識をコンジュゲートする。個々の抗体は、当業者によく知られている様々な蛍光標識（フルオロクローム）にコンジュゲートすることができる。本発明の一つの態様において、抗体は、同じか又は唯一の蛍光放射波長を有する一つ又はそれより多くのフルオロクロームに結合させることができる。各蛍光放射波長は色に対応する。例示のフルオロクロームは、限定ではないが、テキサスレッド（登録商標）（モリキュラープローブス、ユージーン、ＯＲ）、アロフィコシアニン、フィコエリスリン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、スペクトラルレッド（登録商標）（サザンバイオテック、バーミンガム、ＡＬ）、Ｃｙ−クローム、及びその他を含む。
［００６０］ 本発明の一つの態様において、内皮前駆細胞又は血中前駆細胞の源を、系列―関係付け（Ｌｉｎ＋）細胞を定義する抗体のカクテルと接触させる。本発明の一つの態様において、この抗体のカクテルを全て同じフルオロクロームにコンジュゲートさせる。本発明の別の態様において、系列に関係付けられたマーカーは、限定ではないが、ＣＤ３，ＣＤ８，ＣＤ１０，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ３１及びＣＤ３３を含む。本発明の別の態様において、Ｌｉｎ＋細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現する。本発明の別の態様において、系列非関係付けられた（前駆、Ｌｉｎ−）細胞は、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１を発現しない。
［００６１］ 本発明の別の態様において、Ｌｉｎ−細胞は、ＣＰＣの源をフルオロクローム標識された抗体のカクテルに接触させ、そして滅菌精製された細胞の集団が得られるように蛍光活性化細胞ソーター上で当該細胞を分類することにより、単離される。蛍光活性化細胞分類のプロトコルと方法は、容易に利用可能であって、当業者にはよく知られている。
［００６２］ 本発明の別の態様において、単離された前駆細胞は、Ｌｉｎ−細胞をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対するフルオロクローム標識抗体に接触させ、そしてＣＤ３４を発現するがＣＤ１３３又はＫＤＲを発現しないＬｉｎ−細胞の集団を同定するために、標識細胞を分類することにより、得られる。本発明の一つの態様において、この分類工程は滅菌条件下で行われる。
［００６３］ 本発明の一つの態様において、単離された前駆細胞は、患者において新規の血管の形成を誘導するのに有用である。新規な血管は脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）（胚性前駆細胞からの血管の形成）、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（周囲の組織からの血管の内部成長）又は新血管新生の形成（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（それらが以前に存在しなかった新規な血管の形成）により形成することができ、存在する血管に結合する内皮前駆細胞から血管を形成することを含む。外傷、外科手術又は急性あるいは慢性の疾患によるケガのような新規な血管の形成を哺乳類が必要としているかもしれない多数の条件が存在する。非限定例においては、哺乳類が治癒を必要とする創傷を有するかもしれない。別の非限定例においては、患者が心臓血管外科手術、心臓血管血管形成術（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）、頸動脈血管形成術、冠動脈血管形成術を受けているかもしれず、全てが新規の血管形成を必要とする。別の非限定例においては、心筋梗塞、例えばａＭＩの患者は新規な血管形成の必要がある。新規の血管形成を必要とするかもしれない別の条件は、鎌状赤血球貧血及び地中海貧血を含む。
［００６４］ 本発明の別の態様において、単離された前駆細胞は、新規な血管形成の必要な部位へ細胞の優先的移動を可能にするあらゆる経路又は方法により、新規な血管形成の必要のある哺乳類へ投与することができる。例示の投与経路は、限定ではないが、生物適合性溶液又は生物分解性生物適合性マトリックス中の前駆細胞の、全身投与、例えば、静脈内注射、局所移植、例えば局所筋肉内又は皮下注射を含む。生物適合性溶液は当業者に知られている。生物分解性生物適合性マトリックスの例は、限定ではないが、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様サブストレートを含む。
［００６５］ これらの実施例は、本発明の一つ又はそれより多くの態様を例示することを意図し、以下に記載されるものに発明を限定することを意図しない。
【０００８】
実施例１
４つのパラメーターのフローサイトメトリーによる７つのＣＰＣの同定
［００６６］ ３つの血中前駆細胞（ＣＰＣ）マーカーであるＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの組み合わされた発現のパターンに基づく内皮前駆細胞（ＣＰＣ）の表現型上の不均一性を、４つのパラメーター（３色）フローサイトメトリー分析を用いて分析した。
［００６７］ 単核細胞をヘパリン化血液からリンフォプレップ密度勾配遠心分離（ナイコメッド、オスロ、ノルウエー）により単離した。表現型に拘わらず血中前駆細胞（ＰＣ）の数は低いため、系列陰性（Ｌｉｎ−）細胞、即ち、非関係付けの有力なＰＣｓを、全末梢血単核細胞（ＭＮＣ）から、高速フローサイトメトリー分類により富裕化し、Ｌｉｎ＋細胞は捨てた（図６Ａ）。全ＭＮＣを、ＣＤ３（Ｔ細胞），ＣＤ１４（単球），ＣＤ１９（Ｂ細胞），ＣＤ１６／５６（ＮＫ細胞）及びＣＤ３１（成熟内皮細胞）に対するフィコエリスリン（ＰＥ）−標識されたモノクローナル抗体（ｍｏＡｂｓ）（全てＩＱ社、グロニンゲン、オランダ）のカクテルで染色した。Ｌｉｎ−細胞は塩基性内皮培地（ベクトンディッキンソン、エレンボーデゲム−アルスト、ベルギー）中で高速フローサイトメトリーによりＭｏＦｌｏ細胞ソーター（サイトメーション、フォルトコリンズ、ＣＯ）を用いて分類した。得られたＬｉｎ−集団は典型的にはＬｉｎ＋細胞が９５−９８％フリーであって、全ＭＮＣの平均１１．３％を占めるが（０．６−２２．４％の範囲）、一方健康なからだにおいては（ｈｃ，ｎ＝９）平均３．０％のＭＮＣがＬｉｎ−であった（平均１．０−５．５％；Ｐ＝０．０００３）（図６Ａ）。
［００６８］ ＣＰＣマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの発現パターンを決定するため、分類されたＬｉｎ−細胞をＣＤ３４−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（クローン５８１、ＩＱ社）、ＣＤ１３３−ＰＥ（ミルテニイバイオテック、ドイツ）及びウサギポリクローナル抗ＫＤＲフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（シグマケミカルズ社）を用いた３色染色に供した。
［００６９］ Ｌｉｎ−集団内では、３つのマーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの一つを発現する細胞をゲートに通し（ｇａｔｅｄ）、残りの２つのマーカーの発現を分析した（図６Ｂ：ＣＤ３４，図６Ｃ：ＣＤ３４，図６Ｄ：ＫＤＲ）。このアプローチを用いて、７つのＣＰＣサブセットをＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲの組み合わされた発現に基づいて検出した。３重陰性細胞はＥＰＣと考えなかった。７つのサブセット全てがａＭＩ患者及び健康な対照に存在した。
［００７０］ ＣＤ３４＋集団は、主に、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（ａＭＩ，全ＣＤ３４＋細胞の平均６２％、３３−８９％の範囲；健康な対照、平均３８％、範囲２４−５０％）及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−細胞（ａＭＩ，全ＣＤ３４＋細胞の３７％、１０−６１％の範囲；健康な対照、平均６０％、範囲０．１−０．８％）からなったが、３重陽性サブセット及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットはこの集団を１％も占めなかった（図６Ｃ）。
［００７１］ ａＭＩ患者のＣＤ１３３＋集団においては、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（全ＣＤ１３３＋細胞の平均５２％、３３−８９％の範囲）及びＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（全ＣＤ１３３＋細胞の平均２８％、０．１−８５％の範囲）が支配的であったが、健康な対照においては、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（平均３８％、１３−７６％の範囲、１異常値（ｏｕｔｌｉｅｒ）１％）及びＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−細胞（平均５８％、１２−７３％の範囲）が支配的なサブセットであった（図６Ｂ）。
［００７２］ ａＭＩ患者と健康な対照の間の違いはＫＤＲ＋集団にも存在したが、ａＭＩ患者においては主にＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋細胞（平均６５％、１−９５％の範囲）及びＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞（平均３３％、３−７１％の範囲）からなった（図６Ｄ）。健康な対照においては、ＣＤ３４−ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋細胞が支配的（平均９３％、５２−９９％の範囲）であり、ＣＤ３４−ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋サブセットは全ＫＤＲ＋細胞のほんの約５％しか含まなかった（図６Ｄ）。
【０００９】
実施例２
ａＭＩ患者と健康な対照におけるＣＰＣの数
［００７３］ １０人のａＭＩ患者と９人の健康な対照ボランティアをＥＰＣの数に関して比較することにより、７つのＣＰＣサブセット中の細胞の数がａＭＩの事象に相関したか否かを決定した。ＣＰＣの数とａＭＩの間の可能性のある相関は、（ＣＰＣが検出されたうちの）Ｌｉｎ−細胞の数に反映された。Ｌｉｎ−細胞の数を２つの被験者群の間で比較した。ａＭＩ患者においては、Ｌｉｎ−細胞の数が平均２．６ｘ１０５細胞／ｍＬ血液であり（範囲０．２−４．７ｘ１０５細胞／ｍＬ血液）、健康な対照（平均０．５ｘ１０５細胞／ｍＬ血液、範囲０．０４−１．４ｘ１０５細胞／ｍＬ血液）よりも有意に高く（Ｐ＝０．００１）（図７）、対照と比較してａＭＩ患者において５．２倍高い数のＬｉｎ−細胞に等しかった。
［００７４］ ＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲを発現するＣＰＣの数をａＭＩ患者と健康な対照において比較した。３つ全てのサブセット中のＣＰＣの数は健康な対照に比べてａＭＩ患者において有意に高かった。ＣＤ３４サブセットにおいては、健康な対照（平均０．３ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．０６−１．２ｘ１０４細胞／ｍＬ血液）に比較すると、８．６倍高い数の細胞がａＭＩ患者において見いだされた（平均２．６ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、２．１−１１．０ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、Ｐ＝０．００５）。ＣＤ１３３サブセットにおいては、健康な対照（平均０．３ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．０７−０．７ｘ１０４細胞／ｍＬ血液）に比較すると、１１．６倍高い数の細胞がａＭＩ患者において見いだされた（平均３．５ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．５−１３．５ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、Ｐ＝０．０００１）。最後に、ＫＤＲサブセットにおいては、健康な対照（平均０．２ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．００９−０．８ｘ１０４細胞／ｍＬ血液）に比較すると、６．２倍高い数の細胞がａＭＩ患者において見いだされた（平均１．３ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、０．０３−５．８ｘ１０４細胞／ｍＬ血液、Ｐ＝０．００５）。
［００７５］ 可能性として損傷した心筋の血管の修復のために、ａＭＩが特定のＣＰＣサブセットの移動を誘発したか否かを確認するため、７つのサブセットの中のＣＰＣの数を測定した。全７サブセットにおいて、それらの表現型に拘わらず、健康な対照に比べて有意に高いＣＰＣ数がａＭＩ患者に存在した（図８）。患者レベルにおいては、特定のサブセットの中のＣＰＣ数の異常値（ｏｕｔｌｉｅｒｓ）が容易に明白であるが、これらの患者においてＣＰＣ数は全７ＣＰＣサブセットにおいて一貫して高くはなかった。
［００７６］ ＣＰＣの数がそれらの表現型に拘わらずａＭＩ患者において増加しており、心臓血管の損傷とＣＰＣ補充の間の原因となるリンクを示唆するため、ＣＰＣ数と疾患のパラメーターの間の相関を探求した（表２）。１５人のａＭＩ患者と安定な狭心症の１０人の患者をこの分析に含めた。心臓血管疾患（ＣＶＤ）の病歴は、患者におけるＣＶＤのエピソードを示す。ａＭＩの数は現在のａＭＩエピソードの数を示す。表２に掲載したａＭＩのリスク因子に加えて、年齢（＞６０歳）と男性はａＭＩのリスク因子と考えたため、全部で６人の可能性のあるリスク因子をもたらす。累積のリスク因子は、用意した患者に存在するこれら６つの可能なリスク因子の数を示す。
［００７７］ 様々なサブセットと年齢におけるＣＶＤ数とリスク因子又は虚血時間の蓄積した数の間には相関がなかった。さらに、ＥＰＣ数と血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンホスホキナーゼ心筋バンド（ＣＫＭＢ）又はトロポニンの間にも相関はなかった。
【００１０】
【表２】
【００１１】
実施例３
ＣＶＤサブセットの血管形成活性
［００７８］ この実験は、主に成熟内皮細胞（ＥＣ）への分化に関して、インビボにおけるＣＰＣサブセットの挙動を調査した。ＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲの何れかを発現するＣＰＣを２００μＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）内に保存して、１０ｎｇの塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ，ケミコン、テメキュラ、ＣＡ）及び１２Ｕのヘパリン（レオファーマ、ボーラーアップ、デンマーク）を５，０００から１５，０００細胞／移植物にて添加して、ヌードマウスに皮下移植した。はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）はｂ−ＦＧＦおよびヘパリン添加物を含む。１４日後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを外植し、液体窒素中で免疫組織化学のため部分的にスナップ凍結するか、又は０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中の２％パラホルムアルデヒド中で固定し、脱水し、そして樹脂（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ ８１００，ヒーリアスクルツァー、ヴエアーハイム、ドイツ）に埋め込んだ。全体の形態の評価のために、樹脂に埋め込まれたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のペレットの切片２μｍをトルイジンブルーで染色した。移植物の形態分析は、移植の１４日後にＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において高い細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）が存在したことを示した（図２Ｂ）。細胞性はＣＤ１３３＋−負荷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において顕著に低く（図２Ｃ）、そしてＫＤＲ＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）においては最小であった（図２Ａ）。紡錘形態の細胞からなるネットワーク構造は毛細管ネットワークに酷似しており、ＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において豊富であったが、ＣＤ１３３＋細胞、ＫＤＲ＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）においては事実上不在であった。
［００７９］ これらのネットワーク構造がヒトＰＣにより形成されたか否かを決定するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）切片を、ヒトＥＣには特異的に結合するがマウスＥＣには結合しないＵＥＡ−１で染色した（図３Ａ，Ｂ）。ヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＵＥＡ−１染色のための陽性対照として用い（図３Ａ）、そしてＨ５Ｖ細胞（マウスＥＣ系）を陰性対照として用いた（図３Ｂ）。ＣＤ３４＋移植物のネットワーク構造はＵＥＡ−１に関して陽性である；しかしながら、ＵＥＡ−１陽性細胞は、他のサブセットを植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において存在しなかった。
［００８０］ ＵＥＡ−１染色はインビボにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のネットワーク構造のヒトオリジンを証明したが前駆ＥＣと成熟ＥＣの間を識別できないため、外植物をＥＰＣ／ＥＣマーカーＣＤ３４及びＥＣ成熟マーカーＣＤ３１により染色した。ＣＤ３４＋ＥＰＣを植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中では、紡錘形態の細胞が場合によりネットワーク構造に配置されてＵＥＡ−１による染色後に観察される細胞に類似しており、ヒトＣＤ３４に関して陽性であった（図３Ｄ）。ＣＤ３１は、ＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）における形態に類似した細胞上に存在した（図３Ｅ）。ＣＤ３４もＣＤ３１も、ＣＤ１３３＋ＣＰＣ，ＫＤＲ＋ＣＰＣを植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）にて検出できなかった。
【００１２】
実施例４
インビボＣＰＣサブセットに対する血管新生の誘導と炎症性応答
［００８１］ ＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中に検出された全ての細胞がヒトＥＣマーカーに関して染色されなかったため、それらがマウスＥＣであったか否かを調査した。免疫組織化学を用いて、マウスの血管と炎症性細胞を、マウスＣＤ３１（サザンバイオテック、バーミンガム、ＡＬ）及び単球／マクロファージ（ＭｏＭａ，セロテック、オックスフォード、ＵＫ）に対して向けられたラットモノクローナル抗体を用いて検出した。強い宿主由来の血管新生応答が、ヒトＣＤ３４＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に対して検出された（図４Ｂ，Ｅ）。しかしながら、ヒトＣＤ１３３＋細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は弱いマウス血管新生応答を誘発し（図４Ｃ，Ｆ）、ＫＤＲ＋細胞を植えたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又ははだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の移植に際しての血管新生反応は下限に近かった（図４Ａ，Ｄ）。ヒトＣＤ３４＋細胞に対するマウスＭｏＭａ＋炎症性細胞の強い流入と他の２つのサブセットに対する弱い応答（図４Ｄ−Ｆ）が５つの全ての試験された被験者において観察され（２人のａＭＩ患者、３人の健康な対照）、そしてａＭＩ患者からのＣＰＣと健康な対照からのＣＰＣの間に差異はなかった。ヒト単球（ＣＤ１４＋細胞）又はマクロファージ（ＣＤ６８＋，図４Ｅ挿入図）に対して差異は検出されなかった
実施例５
ＣＤ３４＋サブセットの血管新生に対する効果
［００８２］ ＣＤ３４＋ＣＰＣを実施例１に記載されたとおりに単離し、ヨウ化プロピジウム染色を含めることにより、生きた細胞のみが単離されたことを保証した（図９）。４つのＣＤ３４＋サブセットが、さらにＣＤ３４＋集団：ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−（＋――）；ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−（＋＋―）；ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋（＋―＋）；ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋（＋＋＋）から単離された。４つのＣＤ３４＋ＣＰＣサブセットを追加されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に懸濁して、実施例３に記載されるとおりにヌードマウスに移植した。単一のサブセット又は混合された集団を表３の実験セットアップに従いマウスに移植した。
【００１３】
【表３】
【００１４】
［００８３］ 全体の組織学上の評価のため、２μｍの切片を樹脂埋め込みＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）沈殿物から調製してトイジンブルーにより染色した。血管の数を数え、そして調査した組織の面積に関して補正し、平方マイクロメーターあたりの血管の数を出した。血管は以下の通りに定義される：大きな血管は赤血球を含み、平滑筋に囲まれる；中間の血管は赤血球と平滑筋からなる；そして毛細血管。
［００８４］ レクチンの内皮への特異的結合を用いて、ヒト及びマウスの内皮細胞両方の存在を検出した。レクチンＵＥＡ−１はヒト内皮とＢＳ−１レクチンに特異的に結合し（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ−１，シグマ）、マウス内皮に選択的に結合する。さらに、内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１に対して特異的に向けられた抗体を用いた。検出はＡＢＣキット（ベクターラブス（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ））及びアミノ−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）を用いて成し遂げた。ＣＤ３１−陽性細胞の数を数えて組織の面積に関して補正した。
［００８５］ ＣＤ３４＋ＣＰＣ含有Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に比較して血管新生を増加させた。ヒトＣＤ３１に関してこれらのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）沈殿物を染色することは、未成熟内皮細胞を示す大きなＣＤ３１−陽性細胞クラスターの存在を証明する（図１０Ａ）。これらのクラスターは、主に、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットに存在した。血管様構造に関連した少数のヒトＣＤ３１−陽性細胞はＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットに観察された（図１０Ｂ）。
［００８６］ ヒトＣＰＣｓはヒト血管に分化しなかったが、ＣＤ３４＋ヒトＣＰＣサブセットは宿主マウスの血管新生の誘導性作用を提供した。ＣＤ３４＋ＣＰＣ−負荷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）においてマウスＣＤ３１−陽性脈管構造の発生の増加があり、血管のサイズは毛細血管から大きな血管までの範囲であった（図１1）。
［００８７］ マウスＣＤ３１−陽性血管の数／ｍｍ２（毛細血管、小さい血管及び大きな血管を含む）を表３に掲載した５つの実験群に関して測定した（図１２）。血管の同定の基準は、毛細血管が１−２内皮細胞を有する；小さな血管が３−５内皮細胞を有する；そして大きな血管が５より多い内皮細胞を有し、そして血管の周囲に血管平滑筋を有するかもしれない。ＣＤ３４＋ＣＰＣサブセットは、はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を超えて、高いレベルの宿主マウス血管新生を誘導した。もっとも高いレベルの血管新生は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−及びＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットに観察された。大きな血管は主にＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットに観察され、そしてＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットにおいては、より程度が劣った。さらに、これら２つのサブセットの組み合わせは相乗的ではなく、サブセット何れか単独よりも高いレベルの血管新生を導かなかった。さらに、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−サブセットとＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−サブセットの組み合わせは毛細血管の形成のみをもたらし、小さな血管及び大きな血管の形成をもたらさなかった。
【００１５】
実施例６
ａＭＩ患者と健康な対照のＣＰＣ転写プロファイル
［００８８］ 以前の研究は、ＣＰＣがそれらの分化及び機能に関連したマーカーの一団を発現し得ることを示す。上記の４パラメーターフローサイトメトリー分析は単一のＣＰＣに対する３つのＣＰＣマーカーの同時評価を可能にするが、このアプローチはこれまで知られている全てのＣＰＣマーカーをカバーしない。よって、定量性ＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、ＣＰＣ分化、成熟及び機能に関連した転写物の数の存在及び発現レベルを調査して、何れの因子がＣＤ３４＋ＣＰＣにおいて観察された前血管新生及び前炎症効果に介在したのかを決定した。
［００８９］ 全ＲＮＡを所望の表現型（ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋及びＫＤＲ＋）及びランダムヘキサマーからの１０３−１０４ＣＰＣから単離し、そしてコピーのＤＮＡを合成した。ヒトＧＡＰＤＫ，ベータ−２−マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ベータ−アクチン、ｃ−ａｂｌ，ＣＤ３４，ＣＤ１３３，Ｔｉｅ−１，Ｔｉｅ−２，ｆｌｔ−１，ＫＤＲ，ＶＥＧＦ，ＣＤ３１，ＶＥ−カドヘリン、フォンワイルブランド因子（ｖＷＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍ネクローシス因子−α（ＴＮＦ−α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症性蛋白質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ化学誘因性蛋白質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３に関するプライマー／プローブセット（ＴａｑＭａｎ，アプライドバイオシステムズ、フォスターシティー、ＣＡ）をＣＰＣ転写分析に用いた。３重のＲＴ−ＰＣＲ反応を等量のｃＤＮＡに対して以下のパラメーターを用いて実施した：２分５０℃、１０分９５℃そして４５サイクルの１５秒の変性（９５℃）そして１分のアニーリング／伸長合成（６０℃）。組み合わされたｃＤＮＡ合成とＰＣＲの変量（ＳＤ）は、ＧＡＰＤＨハウスキーピングｍＲＮＡに関して０．５ＣＴ未満（サイクル閾値）であった。サイクル閾値の値をベータ−２−マイクログロブリンに対して△ＣＴ法を用いて標準化し、そして患者と対照の間又はサブセット間の発現レベルの差異を発現の倍分散（ｆｏｌｄ ｖａｒｉａｎｃｅ）として表現ｓｉ，２−△△ＣＴとして計算する（Ｌｉｖａｋ ＫＪ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２−△△Ｃ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５：４０２−８，２００１）。
［００９０］ ＣＰＣの成熟と機能に関与する可能性のある１４のマーカーのｍＲＮＡ転写物の存在を決定するためのＲＴ−ＰＣＲの結果を表４に示す。遺伝子発現に関して個人間の変化があったので、与えられたＣＰＣサブセットにおける遺伝子の発現を少なくとも３／５被験者におけるＰＣＲ産物の存在として規定した（即ち、ＣＴ値＜４５）。この規定に基づくと、ａＭＩ患者と健康な対照の遺伝子発現プロファイルは類似していた。
【００１６】
【表４】
【００１７】
［００９１］ ３つのＣＰＣサブセットを比較すると、遺伝子発現の獲得は、ＫＤＲ→ＣＤ１３３→ＣＤ３４の順なのが明確であった。Ｔｉｅ−１，ＣＤ３４そして健康な対照においてはＣＤ１３３とｖＷＦ転写物がＣＤ１３３サブセットには存在したが、ＫＤＲサブセットには存在しなかった。Ｆｌｔ−１転写物はＫＤＲ＋サブセットにおいて検出可能であったが、ＣＤ１３３＋細胞には不在であった。ＣＤ３４＋サブセットにおいては、Ｔｉｅ−２，ｆｌｔ−１，ＣＤ１３３そしてａＭＩ患者においては、ＣＤ３４が、ＫＤＲ＋及びＣＤ１３３＋細胞との比較において獲得された。
［００９２］ 炎症関連分子の転写物ＧＭ−ＣＳＦ，ＭＣＰ−１，ＣＭＰ−２及びＭＣＰ−３は、全てのサブセットにおいてＰＣＴ検出限界を下回った。ＴＮＦ−αとＭＩＰ−１α転写物は類似の量でＣＤ３４＋ＣＰＣとＫＤＲ＋ＣＰＣ存在した。インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、全ての含まれる個体からのＣＤ３４＋転写物に存在した。ＫＤＲ＋ＣＰＣにおいては、しかしながら、ＩＬ−８転写物が５人の個体のうちの２人にしか見いだされなかった。さらに、ＩＬ−８転写物レベルは、ＣＤ３４＋サブセットにおいてＫＤＲ＋サブセットにおけるよりも３倍高かった。インターロイキンー８転写物は、ヌードマウスにおいてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中で、分類直後及び移植１４日後の両方においてＣＤ３４＋ＣＰＣに見いだされた。
［００９３］ 他に示さなければ、明細書及び特許請求の範囲において用いられる、成分の量、特性、例えば分子量、反応条件等を表す全ての数字は、用語「約」により全ての例において修飾されるものとして理解される。従って、反対を指示しなければ、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示された数値パラメーターは、本発明において得られることが求められている所望の特性に依存して変更してよい近似値である。少なく見ても、そして特許請求の範囲への均等な学説を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、報告された顕著なディジットの数の見地から、そして通常のラウンディング技術を適用することにより、少なくとも構築されるべきである。発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似しているにも拘わらず、特定の実施例において示された数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、如何なる数値も、それらの試験測定において見いだされる標準偏差から必然的にもたらされる一定の誤差を本来は含む。
［００９４］ 発明を記載するコンテクストにおいて用いられる用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の関係語（特に、以下の特許請求の範囲のコンテクストにおいて）は、他に示さない限り単数及び複数の両方をカバーすることを意図する。本明細書に記載された値の範囲の詳説は単にその範囲内に該当する各々の別々の値を個々に言及する速記法として機能することを意図する。他に示さなければ、各々の個別の値は個別に詳説されたごとくに明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての方法は、他に示さない限り又はコンテクストにより明確に否定されない限り、あらゆる適切な順序にて実施され得る。本明細書に提供される全ての実施例、又は例示の用語（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ」）の使用は、発明を良好に例示することを単に意図するものであり、他に請求された発明の範囲の限定の態度を取るのではない。明細書中の言語は発明の実施に必須のあらゆる請求されない要素を示すものとして解釈されるべきである。
［００９５］ 本明細書に開示された発明の別の要素又は態様のグループ分けは、限定と解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、又は本明細書に見いだされるグループの他のメンバー又は他の要素とのあらゆる組み合わせにおいて、言及されて請求されてよい。一つ又はそれより多くのグループメンバーが、便利性及び／又は特許性の理由に関してグループないに含まれるか又はグループから削除してよいことが認識される。そのような包含又は削除の如何なるものが起きたときも、明細書はここでは修飾されたものとしてグループを含むと見なされ、即ち、特許請求の範囲内で使用される全てのマーカッシュグループの書かれた記載を実行する。
［００９６］ この発明の好ましい態様は本明細書に記載されており、発明を実施するために発明者らに公知のベストモードを含む。もちろん、それらの好ましい態様におけるバリエーションは上記記載を読んだ当業者には明らかである。発明者は当業者がそのようなバリエーションを適切なものとして用いることを期待し、そして発明者は、発明が、本明細書にて特別に記載されたよりも他に実行されることを意図する。従って、この発明は、適用可能な法律により許可される添付の特許請求の範囲に詳説された主題の全ての修飾物と均等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションにおける上記の要素のあらゆる組み合わせが、他に示さない限り又は他にコンテクストにより否定されない限り、発明に包含される。
［００９７］ さらに、数値のレファレンスはこの明細書を通して特許及び印刷された刊行物に対してなされた。上記の引用されたレファレンスと印刷された刊行物の各々は、それら全てを引用により別個に本明細書に取り込む。
［００９８］ 終わりに、本明細書に開示された発明の態様が本発明の原理の例示であることは、理解されるべきである。採用されるかもしれない他の修飾は発明の範囲内である。即ち、例示の目的で、しかし限定ではなく、本発明の別の配置を本明細書内の教示に従い利用してよい。従って、本発明は示されて記載された通りに正確に発明を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】［００２３］ 図１は、フローサイトメトリーにより測定された、本発明の教示に従いＬｉｎ−，ＣＤ３４，ＣＤ１３３又はＫＤＲとして規定された、急性心筋梗塞の患者（ａＭＩ，ｎ＝１０）、安定狭心症（ｓＡＰ、ｎ＝１０）及び健康な対照（ｈｃ，ｎ＝９）からの末梢血中の血中前駆細胞（ＣＰＣ）の数を描写する。
【図２】［００２４］ 図２は、本発明の教示に従い１４日後にヌードマウスに移植されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレット中に分類されたＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋の何れかのヒトＣＰＣサブセットのインビボの挙動を描写する。（Ａ）はだかのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）；（Ｂ）ＣＤ３４＋細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、及び（Ｃ）ＣＤ１３３＋細胞を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）。矢印は、有力なＥＰＣと考えられた紡錘細胞により形成された代表的なネットワーク構造を示す。対物レンズ４０倍。
【図３】［００２５］ 図３は、本発明の教示に従い、ヌードマウスに移植されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットに封入された（ｅｎｃｌｏｓｅｄ）単離ＣＰＣ上のヒト内皮前駆マーカーの形態上の検出を描写する。パネルＡ−Ｃにおいて、ヒト内皮細胞（ＥＣ）をレクチンＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐｅｕｓ−１アグルチニン（ＴＲＩＴＣにコンジュゲートされたＵＥＡ−１）、ヒト−及びＥＣ−特異的レクチンにより検出された；（Ａ）ヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）陽性細胞；（Ｂ）マウスＥＣ細胞系（Ｈ５Ｖ）陰性対照；（Ｃ）ヒトＣＤ３４＋ＥＰＣ結合ＵＥＡ−１レクチンと植えられた（ｓｅｅｄｅｄ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中の細胞。ＵＥＡ−１結合細胞は紡錘形であり、そして接触させた（矢印）。パネルＤ−Ｅにおいては、（Ｄ）ヒトＣＤ３４（ＥＣ，ＥＣ）、及び（Ｅ）ＣＤ３１（ＥＣ）に関して染色することによりＥＣ表現型を確認した。陽性の内皮細胞を矢印で示す。挿入物は、ヒト血管の追加の例を示す。対物レンズ４０倍。
【図４】［００２６］ 図４は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中でヌードマウスに移植された、本発明の教示に従い単離された、ヒトＣＰＣサブセットに対するマウスの血管新生及び炎症の応答を描写する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のマウスの血管の形成は、マウスＣＤ３１に特異的なモノクローナル抗体を用いて検出した（Ａ−Ｃ）。マウス単球／マクロファージは、それらの細胞に特異的なモノクローナルにより検出した（Ｄ−Ｆ）。パネルＥ中の挿入物は、切片中のヒトＣＤ６８＋マクロファージにより検出した。対物レンズ４０倍。
【図５】［００２７］ 図５は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中でヌードマウスに移植された、本発明の教示に従い単離された、ＣＤ３４＋細胞中のインターロイキン−８（ＩＬ−８）の検出を描写する。インターロイキン−８発現は、分類直後（Ａ）及び移植の１４日後（Ｂ）に測定した。対物レンズ４０倍。
【図６Ａ】［００２８］ 図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図６Ｂ】図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図６Ｃ】図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図６Ｄ】図６は、本発明の教示に従いａＭＩ（ｎ＝１０）の患者及び健康な対照からの末梢血中のＣＰＣサブセットの封入された分析を描写する。系列陰性（Ｌｉｎ−）（Ａ）細胞集団をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに対する抗体を用いて染色し、そして３つのマーカーの各々を発現する細胞を残りの２つのマーカーに関してゲート化して分析した。（Ｂ）ＣＤ１３３分析；（Ｃ）ＣＤ３４分析；（Ｄ）ＫＤＲ分析。
【図７】［００２９］ 図７は、Ｌｉｎ−，ＣＤ３４＋，ＣＤ１３３＋又はＫＤＲ＋として規定されたサブセットとして、ａＭＩ（ｎ＝１０）及び健康な対照（ｈｃ，ｎ＝９）からの末梢血中のＣＰＣの数を描写する。点は個体を表す；水平線は中央値を表す；平均に基づいて倍数増加。Ｐ＝ｐ値。
【図８】［００３０］ 図８は、ａＭＩ（ｎ＝１０）及び健康な対照（ｈｃ，ｎ＝９）における本発明の教示に従って定義された７つのＣＰＣサブセットの、フローサイトメトリー分析により測定された細胞の数を描写する。水平線は中央値を表す；平均に基づいて倍数増加。
【図９】［００３１］ 図９は、本発明の教示に従う、４つのＣＤ３４＋ＣＰＣサブセット、又はサブセットの組み合わせの、フローサイトメトリー分類を描写する。（Ａ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ−；（Ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋；（Ｃ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−；（Ｄ）ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋。
【図１０】［００３２］ 図１０は、ヌードマウスにおける移植１４日後の、本発明の教示に従う、ＣＤ３４＋ＣＰＣ−負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のヒトＣＤ３１−陽性細胞の存在を描写する。（Ａ）ヒトＣＤ３１−陽性細胞クラスターと成熟表現型；（Ｂ）血管様構造中のヒト、ＣＤ３１−陽性細胞。
【図１１】［００３３］ 図１１は、ヌードマウスにおける移植１４日後の、本発明の教示に従う、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−ＣＰＣ−負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のマウスＣＤ３１−陽性細胞の存在を描写する。毛細管（矢印）から小（星印）及び大（挿入が（ｉｎｓｅｔ））までの範囲の異なるサイズの血管を検出した。両イメージ（大と小）をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットの同じ切片の同じ拡大にて撮った。
【図１２】［００３４］ 図１２は、ヌードマウスにおける移植１４日後の、本発明の教示に従う、ＣＤ３４＋サブセットからのＣＤ３４＋ＣＰＣを負荷されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中のマウスＣＤ３１−陽性血管／ｎｍ２の定量を描写する。（Ａ）毛細管、（Ｂ）小さい血管及び（Ｃ）大きい血管。＋＋−，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋；＋――，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−；＋＋＋，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＫＤＲ＋；＋―＋，ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ＋；Ｂ，そのままのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮前駆細胞を単離する方法であって、
前駆細胞を、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクロームで標識された抗体に接触させて前駆細胞の源から系列に関係付けられた（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞を割り出し（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）；
系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞の集団を形成するように蛍光活性化細胞分類により系列に関係付けられた細胞を枯渇させ；
系列陰性細胞をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲからなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクローム標識抗体に接触させるが、その際、各抗体は唯一の放射波長を有するフルオロクロームにより標識されており；そして
標識された系列陰性細胞を３色蛍光活性化細胞分類により分類することにより、内皮前駆細胞の集団を形成すること
を含む方法。
【請求項２】
前駆細胞の源が哺乳類源である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳類源がヒト源である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前駆細胞の源が末梢血である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
割り出す（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）工程が、細胞マーカーＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１に特異的な抗体に前駆細胞を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
反応工程が、細胞マーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに特異的な抗体と系列陰性細胞を反応させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
内皮前駆細胞がＣＤ３４を発現する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
内皮前駆細胞が血管生成細胞、炎症媒介性細胞、又は両方である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
血管生成細胞がＣＤ３４＋の内皮前駆細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
血管生成細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
炎症媒介性細胞がＣＤ３４＋の内皮前駆細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
炎症媒介性細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
炎症媒介性細胞がインターロイキン−８を発現する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
内皮前駆細胞が周囲の血管仲に血管新生応答を誘導する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
処置部位において血管新生を誘導する治療用組成物であって、
その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性マトリックス
を含む組成物。
【請求項１６】
ＣＤ３４＋内皮前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項１５記載の治療用組成物。
【請求項１７】
生物分解性の生物適合性マトリックスが、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様基質からなる群から選択される、請求項１５記載の治療用組成物。
【請求項１８】
処置部位において炎症媒介性細胞に対して走化性効果を有する治療用組成物であって、
その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性マトリックス
を含む組成物。
【請求項１９】
ＣＤ３４＋内皮前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項１８記載の治療用組成物。
【請求項２０】
生物分解性の生物適合性マトリックスが、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様基質からなる群から選択される、請求項１８記載の治療用組成物。
【請求項２１】
内皮前駆細胞の単離された集団であって、系列陰性でありかつＣＤ３４＋である単離集団。
【請求項２２】
系列陰性でありかつＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−である、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団
【請求項２３】
単離された集団が血管生成細胞を含む、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団。
【請求項２４】
単離された集団が炎症媒介性細胞を含む、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団。
【請求項２５】
単離された集団が周囲の血管において血管新生応答を誘導する、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団。
【請求項１】
内皮前駆細胞を単離する方法であって、
前駆細胞を、ＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１からなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクロームで標識された抗体に接触させて前駆細胞の源から系列に関係付けられた（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞を割り出し（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）；
系列陰性（ｌｉｎｅａｇｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）細胞の集団を形成するように蛍光活性化細胞分類により系列に関係付けられた細胞を枯渇させ；
系列陰性細胞をＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲからなる群から選択される細胞マーカーに特異的な、多数のフルオロクローム標識抗体に接触させるが、その際、各抗体は唯一の放射波長を有するフルオロクロームにより標識されており；そして
標識された系列陰性細胞を３色蛍光活性化細胞分類により分類することにより、内皮前駆細胞の集団を形成すること
を含む方法。
【請求項２】
前駆細胞の源が哺乳類源である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳類源がヒト源である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前駆細胞の源が末梢血である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
割り出す（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）工程が、細胞マーカーＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ１６／５６，ＣＤ１９及びＣＤ３１に特異的な抗体に前駆細胞を接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
反応工程が、細胞マーカーＣＤ３４，ＣＤ１３３及びＫＤＲに特異的な抗体と系列陰性細胞を反応させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
内皮前駆細胞がＣＤ３４を発現する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
内皮前駆細胞が血管生成細胞、炎症媒介性細胞、又は両方である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
血管生成細胞がＣＤ３４＋の内皮前駆細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
血管生成細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
炎症媒介性細胞がＣＤ３４＋の内皮前駆細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
炎症媒介性細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
炎症媒介性細胞がインターロイキン−８を発現する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
内皮前駆細胞が周囲の血管仲に血管新生応答を誘導する、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
処置部位において血管新生を誘導する治療用組成物であって、
その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性マトリックス
を含む組成物。
【請求項１６】
ＣＤ３４＋内皮前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項１５記載の治療用組成物。
【請求項１７】
生物分解性の生物適合性マトリックスが、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様基質からなる群から選択される、請求項１５記載の治療用組成物。
【請求項１８】
処置部位において炎症媒介性細胞に対して走化性効果を有する治療用組成物であって、
その中に配分されたＣＤ３４＋内皮前駆細胞を有する生物分解性マトリックス
を含む組成物。
【請求項１９】
ＣＤ３４＋内皮前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−の内皮前駆細胞である、請求項１８記載の治療用組成物。
【請求項２０】
生物分解性の生物適合性マトリックスが、可溶化されたベースメント膜、自己血小板ゲル、コラーゲンゲル又はエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外マトリックス及び繊維状蛋白質に基づくコラーゲン様基質からなる群から選択される、請求項１８記載の治療用組成物。
【請求項２１】
内皮前駆細胞の単離された集団であって、系列陰性でありかつＣＤ３４＋である単離集団。
【請求項２２】
系列陰性でありかつＣＤ３４＋ＣＤ１３３−ＫＤＲ−である、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団
【請求項２３】
単離された集団が血管生成細胞を含む、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団。
【請求項２４】
単離された集団が炎症媒介性細胞を含む、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団。
【請求項２５】
単離された集団が周囲の血管において血管新生応答を誘導する、請求項２１記載の内皮前駆細胞の単離された集団。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５０９６７８（Ｐ２００８−５０９６７８Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２５８６６（Ｐ２００７−５２５８６６）
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８９２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０９５４
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５９１００７８０４）メドトロニック・インコーポレーテッド (243)
【住所又は居所原語表記】７１０Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｐａｒｋｗａｙ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ５５４３２，Ｕ．Ｓ．Ａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８９２３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０９５４
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５９１００７８０４）メドトロニック・インコーポレーテッド (243)
【住所又は居所原語表記】７１０Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｐａｒｋｗａｙ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ ５５４３２，Ｕ．Ｓ．Ａ
【Ｆターム（参考）】
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