再生フィブロインの促進されたゲル化
本発明は、微生物の増殖がない多孔質構造を形成するため、ゲル化剤、好ましくは、シリカを用いて再生絹フィブロインのゲル化時間を短縮する方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[発明の分野]
本発明は、再生フィブロインのゲル化を促進する方法に関する。本発明は、さらに、再生フィブロインの多孔質構造を形成するために、シリカ等の薬品を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）ゲルは、制御可能な機械的特性を得るように変化させることが可能な多孔質微細構造を有することが知られている。フィブロインゲルの高い強度、その多孔度やその生物学的適合性により、フィブロインゲルは、組織工学用の３Ｄ多孔質足場等に利用される、潜在的に興味深い生体適合材料となっている。
【０００３】
ＲＳＦのゲル化時間は、溶液中におけるフィブロインのｐＨおよび濃度によって決まる。フィブロインゲルの潜在的な重要性は、生物医学研究にあり、細胞を増殖させるための所望のｐＨは、７．２〜７．４である。１〜１０ｇ／Ｌの範囲の濃度を有するＲＳＦは、ｐＨ７でのゲル化に３０〜６０日もかかる一方、１０〜１００ｇ／Ｌの範囲の高いタンパク質濃度を有するＲＳＦは、ゲル化するまでにｐＨ７で１０〜２０日かかることが認められる（図１参照）。高タンパク質濃度の溶液から調製されたＲＳＦゲルは、細胞の進入と成長に十分な多孔度を有していない。したがって、ｐＨ７で低いタンパク質濃度のＲＳＦから微孔性ゲルを作り出すことが望ましい。高温度範囲に長時間さらされるとタンパク質の沈殿と微孔構造の損失につながり、これは、ＲＳＦの当初想定した利用を考慮すると望ましくない。このような溶液のゲル化にはかなり長い時間を要し、この間に無菌環境が保たれないと、絹溶液／ゲル内にかびの生育が観測される。組織工学での潜在用途を考慮すると、細胞系が有毒環境の影響下におかれないように、抗カビ剤の使用は避ける必要がある。したがって、ｐＨ７および室温でのＲＳＦのゲル化時間を減少する必要がある。レオロジー国際会議（International Congress on Rheology, 3-8 August 2008）のポスターと、学会誌Phys. Chem. Chem. Phys.（2010, 12, 3834-3844）で、A. Leleらが再生フィブロイン溶液のゲル化のメカニズムを研究している。彼らは、形成された絹ヒドロゲルの構造および特徴についても研究している。
【０００４】
Dr. David L. Kaplanによる「改良された発現と処理のための絹ポリマーの設計（Silk Polymer Designs for Improved Expression and Processing）」と題された論文を参照すると、絹のゲル化を制御すること、そして、絹フィブロインのゲル化が、絹フィブロイン濃度、ゲル生成時の温度とｐＨ、およびフィブロインタンパク質の分子組織内における一次配列−固有の特徴に関連付けることができるタンパク質構造に依存することが開示されている。さらに、前記論文は、絹−無機ナノ複合材料−シリカ系についても記載しており、シリカナノ複合材料を形成するためのクローニング、発現、および絹−Ｒ５融合の機能が研究されている。
【０００５】
Wongらによる「クモの糸−シリカ融合（キメラ）タンパク質由来の新規なナノ複合材料（Novel nanocomposites from spider silk-silica fusion (chimeric) proteins）と題された２００６年の論文を参照すると、融合（キメラ）タンパク質を用いたシリカ複合材料を合成するための新規な生体模倣ナノ複合材料のアプローチが開示されている。融合タンパク質は、生物医学分野[免疫学、癌研究、および薬物送達（１７−２０）を含む]や材料科学[自己組織化材料（例えば、ゲル）、量子ドット複合体（quantum dot bioconjugates）、センサー、および無機物質合成（２１-２７）」]等の広範囲な領域での用途が見つかっている。
【０００６】
Cheng Chengらによる「再生絹フィブロインおよびシリカゾルから構成された複合材料（Composite Material Made of Regenerated Silk Fibroin and Silica Sol）」と題された２００８年１０月に発行の論文を参照すると、再生絹フィブロイン溶液とシリカゾルを混合して、絹フィブロイン／シリカ複合材料を製造することが開示されている。絹タンパク室とシリカとの間に相互作用があるかどうか、さらには、その相互作用によって複合材料の機械的特性を改良できるかどうかを調べるため、絹フィブロイン／シリカ複合材料の構造および特性が、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）とラマン分光法と共に、動的機械分析（ＤＭＡ）によって詳しく調べられた。ＳＥＭの結果は、複合材料中で絹フィブロインとシリカとの相溶性がよいことを明らかにした。ナノサイズシリカ粒子は、絹フィブロインの連続するマトリックス中に均等に分散した。複合材料のラマンスペクトルは、絹フィブロインがβシート構造によって支配されたことを示した。純粋な絹フィブロイン材料と比較して、複合材料は優れた動的機械特性を示した。
【０００７】
国際特許出願公開第ＷＯ２００５１２６０６号を参照すると、当該出願では、水生絹フィブロイン溶液および水生絹フィブロイン溶液の製法、繊維、シルクフォーム（silk foam）、フィルムおよび絹ヒドロゲルを製造する方法の権利を主張している。前記ＰＣＴ出願の３０ページには、絹フィブロイン溶液のゲル化に対する、イオン、ｐＨ、温度およびＰＥＯの影響の調査について考察されている。
【０００８】
先行技術の調査は、ゲル化を促進することで、ゲル化時間を短縮する方法を教示した文献が存在しないことを明らかにしている。特に、促進剤を使用して絹フィブロインのゲル化時間を短縮する方法を教示する先行技術文献は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[発明の目的]
本発明の主要な目的は、ＲＳＦのゲル化時間を短縮して、先行技術の溝を埋めることである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ゲル媒体中で微生物を増殖させることがない製法を用いて、ＲＳＦのゲル化時間を短縮することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、細胞系に有毒でないような製法により、ゲル化時間を短縮することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[発明の概要]
したがって、本発明は、多孔質構造を有する再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）のゲル化を促進する方法であって、
ａ）再生絹フィブロイン溶液のｐＨをｐＨ５〜７．５に調整し、その濃度を０．１〜４０％の範囲に調整するステップと、
ｂ）所望の濃度のゲル化剤を添加し、温度条件を維持するステップと、
ｃ）ＲＳＦゲルを得るため、管反転法（tube inversion method）によりゲル化を確認するステップと、を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、前記ゲル化剤は、シリカ、ＴｉＯ２、ＦｅＯ２ＳｉＮ３、ヒドロキシアパタイト、および他の生体適合性無機化合物からなるグループ、好ましくは、シリカから選択される。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、前記ゲル化は、任意選択的に、アルカリ性条件下でタンパク質、好ましくは、フィブロインタンパク質のβシートを用いてセルフシーディング（self seeding）を行うことで行われる。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、前記方法が、２０〜７０℃の範囲の温度で実施される。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、前記ゲル化剤は、１ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、好ましくは、１〜５ｇ／ｌの濃度範囲で使用される。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、前記ゲル化剤の粒径は、１ｎｍ〜１μ、好ましくは、１ｎｍ〜４００ｎｍの範囲である。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルは、前記ゲルの細孔径が１〜１０ミクロンの範囲である。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態では、多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルは、前記ゲルが１〜５００ｎｍの範囲の多孔度のナノ多孔質壁を含む。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態では、多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルは、前記ゲルで微生物が増殖しない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】様々なｐＨにおけるＲＳＦのゲル化時間（D. Kaplan, JPCB, 110, 2006, 21630-21638）を示す。
【図２】ｐＨ７、２５℃で、ＲＳＦゾルおよび本発明の様々なシリカナノ粒子を含むＲＳＦゲルに対して行った円偏光二色性調査を示す。
【図３】ナノ粒子を含む場合と含まない場合における、本発明のＲＳＦゲルに対する体積弾性係数の測定を示す。
【図４】様々な濃度のナノ粒子の存在下で、５ｇ／ＬのＲＳＦゲルに対する体積弾性係数とゲル時間の調査を示す。
【図５】濃度５ｇ／Ｌ、ｐＨ２、５０℃でのＲＳＦゲルのＣＳＬＭ画像（画像の幅は１６０μｍを表す）で、多孔質構造を形成するタンパク質が観測される。
【図６】ゲルが形成されたことを示す、反転した管を示す。第１の管は、ＲＳＦのゾルを示す。第２の管は、ゲルの形成を確認する管反転法（tube inversion method）により試験を行った、形成されたゲルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[発明の詳細な説明]
本発明は、ＲＳＦのゲル化時間を減少する方法を開示する。ＲＳＦとゲル化剤の組成物は、ｐＨ７〜８で２〜２４時間でゲル化すると、ナノ多孔質壁を有する微孔性ゲルが得られる。組成物は、細胞の培養と活性剤の送達のため、粉末、フィルム、加工体、成形品等である。
【００２３】
「再生絹フィブロイン」および「再生タンパク質フィブロイン」という表現は、本明細書中では区別なく使用され、当業者にもそのように理解される。「絹」と「タンパク質」という表現は、本明細書中では区別なく使用され、当業者にもそのように理解される。
【００２４】
本発明の目的に従って、ＲＳＦゲルのゲル化時間を減少させるために様々な方法が試された。ＲＳＦゲルは、室温、ｐＨ７．０で、タンパク質（絹）の濃度に応じて約２週間〜３ヶ月で形成される（図１参照）。ゲル化時間を減少させるため、１つの選択肢としてｐＨを減少させることが考えられるが、酸性ｐＨでは細胞が増殖しない。驚いたことに、実験結果の１つに、シリカナノ粒子を添加することで、ゲル化時間が数か月から数日または数時間にまで減少したことが発見された。ゲル化時間は、処理温度、タンパク質の濃度、およびシリカナノ粒子の粒径の変化に伴って変化する。得られた組成物は、再生絹フィブロインゲル、水、およびゲル化時間を減少させる薬品からなり、再生フィブロインの多孔質構造を形成する。
【００２５】
したがって、本発明は、多孔質構造を有する再生絹フィブロインのゲル化を促進する方法であって、
ａ. 再生絹フィブロイン溶液のｐＨをｐＨ７に調整し、その濃度を調整するステップと、
ｂ. ゲル化剤を添加し、温度条件を維持するステップと、
ｃ. 管反転法（tube inversion method）によりゲル化を確認するステップと、
を含むことを特徴とする方法を開示する。
【００２６】
ゲルの形成は、図６に示すような管反転法によって確認する。
【００２７】
ゲル化剤を使用することで、ゲル化時間を短縮できるだけでなく、微生物増殖の問題も解消することができる。ゲル化剤を使用しない場合、ｐＨ７〜８、５〜７０℃の範囲の温度で、ゲル化に３週間を超える時間を要し、この間に微生物の増殖が確認された。しかしながら、シリカナノ粒子の存在下では、ゲル化の前に微生物の増殖は確認されなかった。
【００２８】
さらに、このような薬剤は、生体適合性を有し、ＲＳＦゲルのこのような微孔性ネットワーク上で成長する細胞系に対して毒性を示さない。
【００２９】
本発明で使用するゲル化剤は、シリカ、ＴｉＯ２、ＦｅＯ２ＳｉＮ３、ヒドロキシアパタイト（hydroxyapetite）、および他の生体適合性無機化合物から選択される。
【００３０】
ゲル化時間は、ゲル化剤の濃度が増加（１ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌまたはそれ以上変化する）するのに応じて減少する。薬剤の粒径は、１ｎｍ〜４００ｎｍで変化し、ゲル化剤を使用しない場合の時間に比べて、少なくとも半分は減少する。場合によっては、ゲル化時間が少なくとも１桁分減少する。さらに、ゲル化を促進する方法は、２０℃〜７０℃の範囲の温度で実施される。
【００３１】
異なる温度範囲と異なるゲル化剤の濃度で様々な試験を行った結果は、下記の表１、２、および３に記入した通りである。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
上記の結果から、タンパク質濃度が１ｇ／Ｌであった場合、４００ｎｍのシリカ粒子の２５℃におけるゲル化時間はたったの５日となり、７０℃でｐＨ５〜７の条件で処理する場合には、１０時間まで減少する。５ｇ／Ｌの高いタンパク質濃度では、４００ｎｍの粒径のシリカで温度が７０℃、ｐＨ７．２の場合、ゲル化時間が３時間である。したがって、ゲル化剤の濃度を増加する一方、温度を維持しつつ希塩酸を使用してｐＨを維持することによって、ＲＳＦのゲル化プロセスを促進することができる。
【００３６】
本発明では、タンパク質濃度が０．１〜４０％まで変化する。組成物は、１〜１０ミクロンの範囲にわたる細孔径を有し、１〜５００ｎｍの範囲にわたる壁の多孔度を有するナノ多孔質壁を有する微孔性ゲルのネットワークを形成する。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの特徴では、タンパク質のβシートを用いたセルフシーディング（self seeding）を行うことが、ゲル時間の短縮につながったことである。
【００３８】
好ましい特徴では、アルカリ性条件下でゲルを用いてＲＳＦ溶液のセルフシーディングを行うことで、ＲＳＦのゲル化時間が短縮される。このＲＳＦ中にシリカは存在しない。
【００３９】
【表４】
【００４０】
組成物はフィルムとしてキャストされるか、組成物が粉末または加工体または成形品である。組成物は、フィルムをキャストする際または対象物として成形する際に役立つ添加剤を含む。
【００４１】
各ゲルは、本明細書中で例示するように、その機械的特性と３Ｄ多孔度により特徴づけられる。このような組成物は、薬物送達剤等として、細胞の培養に利用を見出せる。
【００４２】
[実施例]
以下の実施例は例証としてのみ示すものであり、本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない
【００４３】
[実施例１]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて１ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４４】
[実施例２]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて１ｇ／Ｌに調整した。既知重量の１５０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４５】
[実施例３]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて１ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４００ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４６】
[実施例４]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて５ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４７】
[実施例５]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて５ｇ／Ｌに調整した。既知重量の１５０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４８】
[実施例６]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて５ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４００ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４９】
異なる濃度のシリカ−ＲＳＦ溶液で実施例１〜６について、ＲＳＦのゲル化時間の短縮結果を上述した表１、２、および３に示した。
【００５０】
[実施例７]
機械的特性
本発明のＲＳＦゲルの体積弾性係数（Ｅ′）は、アメリカ合衆国デラウェア州ニューキャッスルのティー・エイ・インスツルメント−ウォーターズ社（TA instrument-Waters LLC, New Castle DE 1970）製の測定機器、レオメトリックシリーズＲＳＡ-ＩＩＩテストステーション（Rheometric Series RSA-III test station）によって測定した。試料ホルダとして機能する、直径１５ｍｍの上部プレートと内径２７ｍｍ×高さ４ｍｍのシリンダ、および下部プレートとを含む自社製アクセサリを使用して試料の試験を行った。１５ｍｌの培養バイアル中に形成したＲＳＦゲルを試料ホルダに載置した。約３０分の待機時間の後、ＲＳＦゲルからの水分損失を防ぐために、GE Bayer Silicones社（インド）のシリコン油（ＳＦ-１０００）を試料の端部に塗布した。すべての試料に対して、周波数１Ｈｚ、０．０１％のインクリメントで０．０１％から３％までひずみを増加させて、動的ひずみ掃引試験（dynamic strain sweep test）を行った。表５および６は、ナノ粒子を含むＲＳＦゲル、ナノ粒子を含まないＲＳＦゲルそれぞれについて、測定した体積弾性係数を示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
[実施例８]
ＣＬＳＭによる多孔度の測定値
ＲＳＦゲルの多孔度は、共焦点レーザ顕微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope: CLSM）によって定量的に算出した。図５に示すＲＳＦゲルの顕微鏡画像は、カール・ツァイス社製の、共焦点顕微鏡を使用して得た。ＲＳＦゲルの多孔度は、対物レンズの既知の倍率から算出した。ＲＳＦゲルの多孔度は、１ｇ／Ｌ〜５ｇ／ＬのＲＳＦ濃度に対して、１００ミクロン〜１０ミクロンまでの幅があった。図５は、濃度５ｇ／Ｌ、ｐＨ２、温度５０℃の条件下でのＲＳＦゲルのＣＳＬＭ画像を示す。
【００５４】
[実施例９]
シーディング時間に応じたＲＳＦのゲル化分析
下記の方法を用いてＲＳＦを調製した。繭糸を０．５ｗｔ-％の重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）中で１時間煮沸してセリシンを取り除いた。煮沸したフィブロイン繊維を過剰量の水で十分に洗浄して、ＮａＨＣＯ３を取り除いた。このようにして得られた絹フィブロインを９．３ＭＬｉＢｒ溶液に溶解して、１０ｗｔ％の溶液を得た。この溶液を脱イオン水に対して４８時間透析した（シグマアルドリッチ社製の酢酸セルロース透析袋、ＭＷＣ＝１０，０００）。脱イオン水の最初のバッチを３時間後に、そしてその後は９時間毎に交換した。透析したＲＳＦ溶液を１５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、その後、モル吸光係数を１１．８とした紫外−可視分光法（UV visible spectroscopy）（１９６８年、飯塚ら）を用いて、タンパク質濃度を測定した。透析した溶液は常に冷蔵庫内で５〜７℃で保存した。透析した溶液のｐＨは、計測した結果８．７であった。
【００５５】
０.１ＭＨＣＬ溶液の滴を常に攪拌しながら添加することで、透析した溶液の一部のｐＨを調整した。ｐＨを調整する間、タンパク質の一部が沈殿し、この沈殿したタンパク質の一部を１５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離することで取り除いた。このようにして得られ、以下では「ゾル」と称する、上澄みのタンパク質溶液は、透明であり、さらなる分析に使用する前に紫外−可視分光法によりその濃度を測定した。それぞれ５ｍｌのゾルを含む９つの試料バイアルを調製した。２７μｌの３ＭＮａＯＨを試料バイアル１番に添加して、透析したＲＳＦのｐＨと等しい８．７までｐＨを増加させた。この試料を「シーディング」時間がゼロの試料と称する。その他８つのバイアル中のゾル試料は、表４に示したように、低ｐＨで０〜２４時間までの異なる「シーディング」時間維持し、その後、２７μｌの３ＭＮａＯＨをそれぞれの試料に添加した。ＮａＯＨ溶液を添加した時点での試料の状態と、ＮａＯＨの添加後のゲル化時間が表４に記載されている。
【００５６】
発明の利点
１．温度およびｐＨの周囲条件により、ゲル化プロセスが促進される。
２．促進された結果、ゲル化時間が数日から数時間に減少する。
３．ゲル化時間の減少により、多種多様にゲルを利用することが可能となる。
４．ゲルでは微生物が増殖し難い。
５．広範囲にわたる多孔度を有する微孔性ネットワークが得られる。
６．セルフシーディングの代替的方法でも、ゲル化時間が短縮される。
【技術分野】
【０００１】
[発明の分野]
本発明は、再生フィブロインのゲル化を促進する方法に関する。本発明は、さらに、再生フィブロインの多孔質構造を形成するために、シリカ等の薬品を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）ゲルは、制御可能な機械的特性を得るように変化させることが可能な多孔質微細構造を有することが知られている。フィブロインゲルの高い強度、その多孔度やその生物学的適合性により、フィブロインゲルは、組織工学用の３Ｄ多孔質足場等に利用される、潜在的に興味深い生体適合材料となっている。
【０００３】
ＲＳＦのゲル化時間は、溶液中におけるフィブロインのｐＨおよび濃度によって決まる。フィブロインゲルの潜在的な重要性は、生物医学研究にあり、細胞を増殖させるための所望のｐＨは、７．２〜７．４である。１〜１０ｇ／Ｌの範囲の濃度を有するＲＳＦは、ｐＨ７でのゲル化に３０〜６０日もかかる一方、１０〜１００ｇ／Ｌの範囲の高いタンパク質濃度を有するＲＳＦは、ゲル化するまでにｐＨ７で１０〜２０日かかることが認められる（図１参照）。高タンパク質濃度の溶液から調製されたＲＳＦゲルは、細胞の進入と成長に十分な多孔度を有していない。したがって、ｐＨ７で低いタンパク質濃度のＲＳＦから微孔性ゲルを作り出すことが望ましい。高温度範囲に長時間さらされるとタンパク質の沈殿と微孔構造の損失につながり、これは、ＲＳＦの当初想定した利用を考慮すると望ましくない。このような溶液のゲル化にはかなり長い時間を要し、この間に無菌環境が保たれないと、絹溶液／ゲル内にかびの生育が観測される。組織工学での潜在用途を考慮すると、細胞系が有毒環境の影響下におかれないように、抗カビ剤の使用は避ける必要がある。したがって、ｐＨ７および室温でのＲＳＦのゲル化時間を減少する必要がある。レオロジー国際会議（International Congress on Rheology, 3-8 August 2008）のポスターと、学会誌Phys. Chem. Chem. Phys.（2010, 12, 3834-3844）で、A. Leleらが再生フィブロイン溶液のゲル化のメカニズムを研究している。彼らは、形成された絹ヒドロゲルの構造および特徴についても研究している。
【０００４】
Dr. David L. Kaplanによる「改良された発現と処理のための絹ポリマーの設計（Silk Polymer Designs for Improved Expression and Processing）」と題された論文を参照すると、絹のゲル化を制御すること、そして、絹フィブロインのゲル化が、絹フィブロイン濃度、ゲル生成時の温度とｐＨ、およびフィブロインタンパク質の分子組織内における一次配列−固有の特徴に関連付けることができるタンパク質構造に依存することが開示されている。さらに、前記論文は、絹−無機ナノ複合材料−シリカ系についても記載しており、シリカナノ複合材料を形成するためのクローニング、発現、および絹−Ｒ５融合の機能が研究されている。
【０００５】
Wongらによる「クモの糸−シリカ融合（キメラ）タンパク質由来の新規なナノ複合材料（Novel nanocomposites from spider silk-silica fusion (chimeric) proteins）と題された２００６年の論文を参照すると、融合（キメラ）タンパク質を用いたシリカ複合材料を合成するための新規な生体模倣ナノ複合材料のアプローチが開示されている。融合タンパク質は、生物医学分野[免疫学、癌研究、および薬物送達（１７−２０）を含む]や材料科学[自己組織化材料（例えば、ゲル）、量子ドット複合体（quantum dot bioconjugates）、センサー、および無機物質合成（２１-２７）」]等の広範囲な領域での用途が見つかっている。
【０００６】
Cheng Chengらによる「再生絹フィブロインおよびシリカゾルから構成された複合材料（Composite Material Made of Regenerated Silk Fibroin and Silica Sol）」と題された２００８年１０月に発行の論文を参照すると、再生絹フィブロイン溶液とシリカゾルを混合して、絹フィブロイン／シリカ複合材料を製造することが開示されている。絹タンパク室とシリカとの間に相互作用があるかどうか、さらには、その相互作用によって複合材料の機械的特性を改良できるかどうかを調べるため、絹フィブロイン／シリカ複合材料の構造および特性が、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）とラマン分光法と共に、動的機械分析（ＤＭＡ）によって詳しく調べられた。ＳＥＭの結果は、複合材料中で絹フィブロインとシリカとの相溶性がよいことを明らかにした。ナノサイズシリカ粒子は、絹フィブロインの連続するマトリックス中に均等に分散した。複合材料のラマンスペクトルは、絹フィブロインがβシート構造によって支配されたことを示した。純粋な絹フィブロイン材料と比較して、複合材料は優れた動的機械特性を示した。
【０００７】
国際特許出願公開第ＷＯ２００５１２６０６号を参照すると、当該出願では、水生絹フィブロイン溶液および水生絹フィブロイン溶液の製法、繊維、シルクフォーム（silk foam）、フィルムおよび絹ヒドロゲルを製造する方法の権利を主張している。前記ＰＣＴ出願の３０ページには、絹フィブロイン溶液のゲル化に対する、イオン、ｐＨ、温度およびＰＥＯの影響の調査について考察されている。
【０００８】
先行技術の調査は、ゲル化を促進することで、ゲル化時間を短縮する方法を教示した文献が存在しないことを明らかにしている。特に、促進剤を使用して絹フィブロインのゲル化時間を短縮する方法を教示する先行技術文献は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[発明の目的]
本発明の主要な目的は、ＲＳＦのゲル化時間を短縮して、先行技術の溝を埋めることである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ゲル媒体中で微生物を増殖させることがない製法を用いて、ＲＳＦのゲル化時間を短縮することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、細胞系に有毒でないような製法により、ゲル化時間を短縮することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[発明の概要]
したがって、本発明は、多孔質構造を有する再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）のゲル化を促進する方法であって、
ａ）再生絹フィブロイン溶液のｐＨをｐＨ５〜７．５に調整し、その濃度を０．１〜４０％の範囲に調整するステップと、
ｂ）所望の濃度のゲル化剤を添加し、温度条件を維持するステップと、
ｃ）ＲＳＦゲルを得るため、管反転法（tube inversion method）によりゲル化を確認するステップと、を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
本発明の一実施形態では、前記ゲル化剤は、シリカ、ＴｉＯ２、ＦｅＯ２ＳｉＮ３、ヒドロキシアパタイト、および他の生体適合性無機化合物からなるグループ、好ましくは、シリカから選択される。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、前記ゲル化は、任意選択的に、アルカリ性条件下でタンパク質、好ましくは、フィブロインタンパク質のβシートを用いてセルフシーディング（self seeding）を行うことで行われる。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、前記方法が、２０〜７０℃の範囲の温度で実施される。
【００１６】
本発明のさらに別の実施形態では、前記ゲル化剤は、１ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、好ましくは、１〜５ｇ／ｌの濃度範囲で使用される。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、前記ゲル化剤の粒径は、１ｎｍ〜１μ、好ましくは、１ｎｍ〜４００ｎｍの範囲である。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルは、前記ゲルの細孔径が１〜１０ミクロンの範囲である。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態では、多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルは、前記ゲルが１〜５００ｎｍの範囲の多孔度のナノ多孔質壁を含む。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態では、多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルは、前記ゲルで微生物が増殖しない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】様々なｐＨにおけるＲＳＦのゲル化時間（D. Kaplan, JPCB, 110, 2006, 21630-21638）を示す。
【図２】ｐＨ７、２５℃で、ＲＳＦゾルおよび本発明の様々なシリカナノ粒子を含むＲＳＦゲルに対して行った円偏光二色性調査を示す。
【図３】ナノ粒子を含む場合と含まない場合における、本発明のＲＳＦゲルに対する体積弾性係数の測定を示す。
【図４】様々な濃度のナノ粒子の存在下で、５ｇ／ＬのＲＳＦゲルに対する体積弾性係数とゲル時間の調査を示す。
【図５】濃度５ｇ／Ｌ、ｐＨ２、５０℃でのＲＳＦゲルのＣＳＬＭ画像（画像の幅は１６０μｍを表す）で、多孔質構造を形成するタンパク質が観測される。
【図６】ゲルが形成されたことを示す、反転した管を示す。第１の管は、ＲＳＦのゾルを示す。第２の管は、ゲルの形成を確認する管反転法（tube inversion method）により試験を行った、形成されたゲルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
[発明の詳細な説明]
本発明は、ＲＳＦのゲル化時間を減少する方法を開示する。ＲＳＦとゲル化剤の組成物は、ｐＨ７〜８で２〜２４時間でゲル化すると、ナノ多孔質壁を有する微孔性ゲルが得られる。組成物は、細胞の培養と活性剤の送達のため、粉末、フィルム、加工体、成形品等である。
【００２３】
「再生絹フィブロイン」および「再生タンパク質フィブロイン」という表現は、本明細書中では区別なく使用され、当業者にもそのように理解される。「絹」と「タンパク質」という表現は、本明細書中では区別なく使用され、当業者にもそのように理解される。
【００２４】
本発明の目的に従って、ＲＳＦゲルのゲル化時間を減少させるために様々な方法が試された。ＲＳＦゲルは、室温、ｐＨ７．０で、タンパク質（絹）の濃度に応じて約２週間〜３ヶ月で形成される（図１参照）。ゲル化時間を減少させるため、１つの選択肢としてｐＨを減少させることが考えられるが、酸性ｐＨでは細胞が増殖しない。驚いたことに、実験結果の１つに、シリカナノ粒子を添加することで、ゲル化時間が数か月から数日または数時間にまで減少したことが発見された。ゲル化時間は、処理温度、タンパク質の濃度、およびシリカナノ粒子の粒径の変化に伴って変化する。得られた組成物は、再生絹フィブロインゲル、水、およびゲル化時間を減少させる薬品からなり、再生フィブロインの多孔質構造を形成する。
【００２５】
したがって、本発明は、多孔質構造を有する再生絹フィブロインのゲル化を促進する方法であって、
ａ. 再生絹フィブロイン溶液のｐＨをｐＨ７に調整し、その濃度を調整するステップと、
ｂ. ゲル化剤を添加し、温度条件を維持するステップと、
ｃ. 管反転法（tube inversion method）によりゲル化を確認するステップと、
を含むことを特徴とする方法を開示する。
【００２６】
ゲルの形成は、図６に示すような管反転法によって確認する。
【００２７】
ゲル化剤を使用することで、ゲル化時間を短縮できるだけでなく、微生物増殖の問題も解消することができる。ゲル化剤を使用しない場合、ｐＨ７〜８、５〜７０℃の範囲の温度で、ゲル化に３週間を超える時間を要し、この間に微生物の増殖が確認された。しかしながら、シリカナノ粒子の存在下では、ゲル化の前に微生物の増殖は確認されなかった。
【００２８】
さらに、このような薬剤は、生体適合性を有し、ＲＳＦゲルのこのような微孔性ネットワーク上で成長する細胞系に対して毒性を示さない。
【００２９】
本発明で使用するゲル化剤は、シリカ、ＴｉＯ２、ＦｅＯ２ＳｉＮ３、ヒドロキシアパタイト（hydroxyapetite）、および他の生体適合性無機化合物から選択される。
【００３０】
ゲル化時間は、ゲル化剤の濃度が増加（１ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌまたはそれ以上変化する）するのに応じて減少する。薬剤の粒径は、１ｎｍ〜４００ｎｍで変化し、ゲル化剤を使用しない場合の時間に比べて、少なくとも半分は減少する。場合によっては、ゲル化時間が少なくとも１桁分減少する。さらに、ゲル化を促進する方法は、２０℃〜７０℃の範囲の温度で実施される。
【００３１】
異なる温度範囲と異なるゲル化剤の濃度で様々な試験を行った結果は、下記の表１、２、および３に記入した通りである。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
上記の結果から、タンパク質濃度が１ｇ／Ｌであった場合、４００ｎｍのシリカ粒子の２５℃におけるゲル化時間はたったの５日となり、７０℃でｐＨ５〜７の条件で処理する場合には、１０時間まで減少する。５ｇ／Ｌの高いタンパク質濃度では、４００ｎｍの粒径のシリカで温度が７０℃、ｐＨ７．２の場合、ゲル化時間が３時間である。したがって、ゲル化剤の濃度を増加する一方、温度を維持しつつ希塩酸を使用してｐＨを維持することによって、ＲＳＦのゲル化プロセスを促進することができる。
【００３６】
本発明では、タンパク質濃度が０．１〜４０％まで変化する。組成物は、１〜１０ミクロンの範囲にわたる細孔径を有し、１〜５００ｎｍの範囲にわたる壁の多孔度を有するナノ多孔質壁を有する微孔性ゲルのネットワークを形成する。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの特徴では、タンパク質のβシートを用いたセルフシーディング（self seeding）を行うことが、ゲル時間の短縮につながったことである。
【００３８】
好ましい特徴では、アルカリ性条件下でゲルを用いてＲＳＦ溶液のセルフシーディングを行うことで、ＲＳＦのゲル化時間が短縮される。このＲＳＦ中にシリカは存在しない。
【００３９】
【表４】
【００４０】
組成物はフィルムとしてキャストされるか、組成物が粉末または加工体または成形品である。組成物は、フィルムをキャストする際または対象物として成形する際に役立つ添加剤を含む。
【００４１】
各ゲルは、本明細書中で例示するように、その機械的特性と３Ｄ多孔度により特徴づけられる。このような組成物は、薬物送達剤等として、細胞の培養に利用を見出せる。
【００４２】
[実施例]
以下の実施例は例証としてのみ示すものであり、本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない
【００４３】
[実施例１]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて１ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４４】
[実施例２]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて１ｇ／Ｌに調整した。既知重量の１５０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４５】
[実施例３]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて１ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４００ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４６】
[実施例４]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて５ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４７】
[実施例５]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて５ｇ／Ｌに調整した。既知重量の１５０ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４８】
[実施例６]
ＲＳＦの組成物の調製
ＲＳＦ溶液を、Nagarkarらによる論文（Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 0-11）に開示された方法を用いて調製した。透析したＲＳＦ溶液のｐＨは、０．１ＮＨＣＬを常に攪拌しながら添加することで７に調整した。タンパク質の濃度は、ｐＨ７の脱イオン水を用いて５ｇ／Ｌに調整した。既知重量の４００ｎｍのシリカナノ粒子をＲＳＦ溶液に添加した。これらの溶液を一定温度の水浴中で２５℃、５０℃、７０℃に保ち、３時間毎に試料の状態を監視した。ゲル状態とゲル化時間は、バイアル傾斜法（vial tilting method）を用いて記した。
【００４９】
異なる濃度のシリカ−ＲＳＦ溶液で実施例１〜６について、ＲＳＦのゲル化時間の短縮結果を上述した表１、２、および３に示した。
【００５０】
[実施例７]
機械的特性
本発明のＲＳＦゲルの体積弾性係数（Ｅ′）は、アメリカ合衆国デラウェア州ニューキャッスルのティー・エイ・インスツルメント−ウォーターズ社（TA instrument-Waters LLC, New Castle DE 1970）製の測定機器、レオメトリックシリーズＲＳＡ-ＩＩＩテストステーション（Rheometric Series RSA-III test station）によって測定した。試料ホルダとして機能する、直径１５ｍｍの上部プレートと内径２７ｍｍ×高さ４ｍｍのシリンダ、および下部プレートとを含む自社製アクセサリを使用して試料の試験を行った。１５ｍｌの培養バイアル中に形成したＲＳＦゲルを試料ホルダに載置した。約３０分の待機時間の後、ＲＳＦゲルからの水分損失を防ぐために、GE Bayer Silicones社（インド）のシリコン油（ＳＦ-１０００）を試料の端部に塗布した。すべての試料に対して、周波数１Ｈｚ、０．０１％のインクリメントで０．０１％から３％までひずみを増加させて、動的ひずみ掃引試験（dynamic strain sweep test）を行った。表５および６は、ナノ粒子を含むＲＳＦゲル、ナノ粒子を含まないＲＳＦゲルそれぞれについて、測定した体積弾性係数を示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
【表６】
【００５３】
[実施例８]
ＣＬＳＭによる多孔度の測定値
ＲＳＦゲルの多孔度は、共焦点レーザ顕微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope: CLSM）によって定量的に算出した。図５に示すＲＳＦゲルの顕微鏡画像は、カール・ツァイス社製の、共焦点顕微鏡を使用して得た。ＲＳＦゲルの多孔度は、対物レンズの既知の倍率から算出した。ＲＳＦゲルの多孔度は、１ｇ／Ｌ〜５ｇ／ＬのＲＳＦ濃度に対して、１００ミクロン〜１０ミクロンまでの幅があった。図５は、濃度５ｇ／Ｌ、ｐＨ２、温度５０℃の条件下でのＲＳＦゲルのＣＳＬＭ画像を示す。
【００５４】
[実施例９]
シーディング時間に応じたＲＳＦのゲル化分析
下記の方法を用いてＲＳＦを調製した。繭糸を０．５ｗｔ-％の重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）中で１時間煮沸してセリシンを取り除いた。煮沸したフィブロイン繊維を過剰量の水で十分に洗浄して、ＮａＨＣＯ３を取り除いた。このようにして得られた絹フィブロインを９．３ＭＬｉＢｒ溶液に溶解して、１０ｗｔ％の溶液を得た。この溶液を脱イオン水に対して４８時間透析した（シグマアルドリッチ社製の酢酸セルロース透析袋、ＭＷＣ＝１０，０００）。脱イオン水の最初のバッチを３時間後に、そしてその後は９時間毎に交換した。透析したＲＳＦ溶液を１５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離し、その後、モル吸光係数を１１．８とした紫外−可視分光法（UV visible spectroscopy）（１９６８年、飯塚ら）を用いて、タンパク質濃度を測定した。透析した溶液は常に冷蔵庫内で５〜７℃で保存した。透析した溶液のｐＨは、計測した結果８．７であった。
【００５５】
０.１ＭＨＣＬ溶液の滴を常に攪拌しながら添加することで、透析した溶液の一部のｐＨを調整した。ｐＨを調整する間、タンパク質の一部が沈殿し、この沈殿したタンパク質の一部を１５０００ＲＰＭで２０分間遠心分離することで取り除いた。このようにして得られ、以下では「ゾル」と称する、上澄みのタンパク質溶液は、透明であり、さらなる分析に使用する前に紫外−可視分光法によりその濃度を測定した。それぞれ５ｍｌのゾルを含む９つの試料バイアルを調製した。２７μｌの３ＭＮａＯＨを試料バイアル１番に添加して、透析したＲＳＦのｐＨと等しい８．７までｐＨを増加させた。この試料を「シーディング」時間がゼロの試料と称する。その他８つのバイアル中のゾル試料は、表４に示したように、低ｐＨで０〜２４時間までの異なる「シーディング」時間維持し、その後、２７μｌの３ＭＮａＯＨをそれぞれの試料に添加した。ＮａＯＨ溶液を添加した時点での試料の状態と、ＮａＯＨの添加後のゲル化時間が表４に記載されている。
【００５６】
発明の利点
１．温度およびｐＨの周囲条件により、ゲル化プロセスが促進される。
２．促進された結果、ゲル化時間が数日から数時間に減少する。
３．ゲル化時間の減少により、多種多様にゲルを利用することが可能となる。
４．ゲルでは微生物が増殖し難い。
５．広範囲にわたる多孔度を有する微孔性ネットワークが得られる。
６．セルフシーディングの代替的方法でも、ゲル化時間が短縮される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質構造を有する再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）のゲル化を促進する方法であって、
ａ）再生絹フィブロイン溶液のｐＨをｐＨ５〜７．５に調整し、その濃度を０．１〜４０％の範囲に調整するステップと、
ｂ）所望の濃度のゲル化剤を添加し、温度条件を維持するステップと、
ｃ）ＲＳＦゲルを得るため、管反転法によりゲル化を確認するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ゲル化剤は、シリカ、ＴｉＯ２、ＦｅＯ２ＳｉＮ３、ヒドロキシアパタイト、および他の生体適合性無機化合物からなるグループ、好ましくは、シリカから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲル化は、任意選択的に、アルカリ性条件下でタンパク質、好ましくは、フィブロインタンパク質のβシートを用いてセルフシーディングを行うことで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、２０〜７０℃の範囲の温度で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲル化剤は、１ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、好ましくは、１〜５ｇ／Ｌの濃度範囲で使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲル化剤の粒径は、１ｎｍ〜１μ、好ましくは、１ｎｍ〜４００ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の方法で得られた多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルであって、前記ゲルの細孔径は１〜１０ミクロンの範囲であることを特徴とする再生絹フィブロインゲル。
【請求項８】
請求項１の方法で得られた多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルであって、前記ゲルは、１〜５００ｎｍの範囲の多孔度のナノ多孔質壁を含むことを特徴とする再生絹フィブロインゲル。
【請求項９】
請求項１の方法で得られた多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルであって、前記ゲルは微生物が増殖しないことを特徴とする再生絹フィブロインゲル。
【請求項１０】
実質的に明細書に添付した実施例および図面を参照することで定義される、多孔質構造を有する再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）のゲル化を促進する方法。
【請求項１】
多孔質構造を有する再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）のゲル化を促進する方法であって、
ａ）再生絹フィブロイン溶液のｐＨをｐＨ５〜７．５に調整し、その濃度を０．１〜４０％の範囲に調整するステップと、
ｂ）所望の濃度のゲル化剤を添加し、温度条件を維持するステップと、
ｃ）ＲＳＦゲルを得るため、管反転法によりゲル化を確認するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ゲル化剤は、シリカ、ＴｉＯ２、ＦｅＯ２ＳｉＮ３、ヒドロキシアパタイト、および他の生体適合性無機化合物からなるグループ、好ましくは、シリカから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲル化は、任意選択的に、アルカリ性条件下でタンパク質、好ましくは、フィブロインタンパク質のβシートを用いてセルフシーディングを行うことで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、２０〜７０℃の範囲の温度で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲル化剤は、１ｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、好ましくは、１〜５ｇ／Ｌの濃度範囲で使用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲル化剤の粒径は、１ｎｍ〜１μ、好ましくは、１ｎｍ〜４００ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の方法で得られた多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルであって、前記ゲルの細孔径は１〜１０ミクロンの範囲であることを特徴とする再生絹フィブロインゲル。
【請求項８】
請求項１の方法で得られた多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルであって、前記ゲルは、１〜５００ｎｍの範囲の多孔度のナノ多孔質壁を含むことを特徴とする再生絹フィブロインゲル。
【請求項９】
請求項１の方法で得られた多孔質構造を有する再生絹フィブロインゲルであって、前記ゲルは微生物が増殖しないことを特徴とする再生絹フィブロインゲル。
【請求項１０】
実質的に明細書に添付した実施例および図面を参照することで定義される、多孔質構造を有する再生絹フィブロイン（ＲＳＦ）のゲル化を促進する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５０１０８７（Ｐ２０１３−５０１０８７Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２２３４０（Ｐ２０１２−５２２３４０）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２０１０／０００５０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１３１４５
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５１１２９５５０８）カウンシィル オブ サイアンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２０１０／０００５０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１３１４５
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５１１２９５５０８）カウンシィル オブ サイアンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (3)
【Ｆターム（参考）】
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