再生不良性貧血患者血清に存在する自己抗体の検出方法
【課題】再生不良性貧血の検査方法および検査用試薬を提供する。
【解決手段】モエシンを特異的に認識する自己抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法を提供する。また、モエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬を提供する。 自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血とを判別できるため、免疫病態の存在を検出する極めて有用な検査方法であり、利用価値が高い。
【解決手段】モエシンを特異的に認識する自己抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法を提供する。また、モエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬を提供する。 自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血とを判別できるため、免疫病態の存在を検出する極めて有用な検査方法であり、利用価値が高い。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は再生不良性貧血の免疫病態の診断方法および自己抗体の検出試薬に関するものである。具体的には、再生不良性貧血患者血清中に存在するモエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法と、そのための試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生不良性貧血とは、骨髄低形成（骨髄の細胞密度が低下）と、汎血球減少（血中の赤血球、白血球、血小板のすべてが減少）を主徴とする疾患である。再生不良性貧血は、かつては難病であったが、現在では適切な治療により治癒する可能性の高い疾患である。したがって、早期の正確な診断と、適切な治療が必要である。再生不良性貧血の診断は厚生労働省の診断基準(厚生省特定疾患特発性造血障害調査研究班 １９８９年)に基づいて行われている。再生不良性貧血は、骨髄低形成と汎血球減少を来す他の疾患を除外して初めて診断が確定される症候群であり、病態を反映する特異的なマーカーは知られていない。再生不良性貧血には、自己免疫性のものと造血幹細胞異常性のものとがあることが知られているが、両者を判別する方法は知られていない。また、再生不良性貧血の約７割は免疫抑制療法によって改善することから、免疫病態の存在を証明することが重要である。しかし、免疫病態のマーカーについても確立されたものは存在しない。一般に自己免疫疾患では自己細胞成分に対する多種類の抗体（自己抗体）が検出され、その抗体が臨床症状と密接な関係を持つことが知られている。近年、多くの自己抗体の対応抗原（自己抗原）は細胞内の巨大分子であり、しかも種を越えて保存されているタンパク質であることが明らかになっている。しかしながら、自己免疫性の再生不良性貧血患者における自己抗体や、その対応抗原についての解析はほとんどなされていない。
【０００３】
モエシン（ｍｏｅｓｉｎ）はｍｅｍｂｒａｎｅ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎとしてウシの子宮より分離され、ヘパリン硫酸の受容体タンパク質の可能性が示唆されてきた（非特許文献１）。また、ｃＤＮＡクローニングにより、ヒトでは通常５７７アミノ酸から成ることが示されている（非特許文献２）。最近、モエシンは内皮細胞やある種の上皮細胞の尖端絨毛にアクチンとともに局在することが分かったが、その機能は解明されていない。１９９６年に、モエシンに対する自己抗体が慢性関節リウマチ患者の約３０％の血清中に存在することが示された（特許文献１)。しかし、このような抗モエシン抗体が再生不良性貧血のように骨髄の働きが低下する血液疾患の患者に見られることは全く知られていなかった。
【特許文献１】特願平８−５０９３７５
【非特許文献１】ランケスら（Ｌａｎｋｅｓ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、（英国）、第２５１巻、ｐ．８３１−８４２、１９８８年
【非特許文献２】ランケスら（Ｌａｎｋｅｓ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）、（米国）、第８８巻、ｐ．８２９７−８３０１、１９９１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、再生不良性貧血を自己免疫疾患という観点からとらえ、再生不良性貧血患者血清中に存在する自己抗体に着目し、特異的自己抗原と反応する抗体の検出を目指したものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、再生不良性貧血患者血清中の自己抗体と反応する造血幹細胞由来の抗原がモエシンであることを見出したことにより完成された。したがって本発明は、以下に関する、
（１）生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法、
（２）該再生不良性貧血は自己免疫性である、（１）記載の方法、
（３）自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血との判別方法である、（１）記載の方法、
（４）再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、（１）記載の方法、
（５）生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬、
（６）該物質がモエシン又はその部分ペプチドである、（５）記載の試薬。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法を用いれば、従来の再生不良性貧血の診断が除外診断に基づいていたのに対し、血清の分離、抗体価の測定等という簡便な方法により、再生不良性貧血、特に自己免疫性の再生不良性貧血を客観的に診断できる。したがって、本発明は再生不良性貧血の免疫病態の診断を可能とするものであり、特異的な抗原抗体反応に基づく血清診断法として簡便かつ信頼性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の検査方法を適用することができる対象としては、動物であれば特に限定されないが、例えば、哺乳動物等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、対象動物はヒトである。
【０００８】
本発明の方法に用いられ得る生体試料としては、特に限定されないが、例えば、検査対象である動物由来の組織、細胞、細胞抽出成分、体液等が挙げられる。組織としては、脾臓、リンパ節等が、細胞としては、脾細胞、リンパ細胞、抗体産生細胞等が、体液としては、血液、血清、血漿、尿、汗等が挙げられる。検出の容易性などを考慮すると、生体試料としては体液、特に血清・血漿が好ましい。
【０００９】
本発明の検査方法において検出される抗体（以下、「抗モエシン抗体」という場合もある）により認識されるモエシンとは、一般に細胞骨格に結合したタンパク質ファミリー（Ｅｚｒｉｎ Ｒａｄｉｘｉｎ Ｍｏｅｓｉｎ：ＥＲＭファミリー）に属するタンパク質であり、ヒトでは通常５７７アミノ酸から成る。モエシンとしては、上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されないが、好ましくはヒト由来のモエシンである。ヒトモエシンとしては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００２４４４）からなるタンパク質、あるいはその天然のアレル変異体等が挙げられる。
【００１０】
抗体としては、特にそのクラスは限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ等のいずれのものであってもよい。また、抗体の結合性断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等）等も、モエシンに対して特異的に結合する限り「抗体」に含まれる。
【００１１】
本発明で検出される抗体としては、自己のモエシンを特異的に認識する自己抗体である。例えば、生体試料がヒト由来ならば、ヒトのモエシンを特異的に認識するヒト抗体が、好ましくは検出される。
【００１２】
生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体を検出する方法としては、自体公知の方法を用いることができ、特に限定されないが、液相又は固相で起こる反応（例えば抗原抗体反応）を直接測定する方法や、阻害物質を加えることにより免疫反応の阻害を測定する方法などを利用することができる。
【００１３】
上記方法としては、例えば、モエシン又はその部分ペプチドを生体試料と接触させ、生体試料中の抗体のモエシン又はその部分ペプチドに対する特異的結合を、直接的又は間接的に検出する方法が挙げられる。
【００１４】
上記方法に用いられるモエシンは、上述のモエシンタンパク質のうち、検査対象動物の自己抗体である抗モエシン抗体により特異的に認識され得るものであれば特に限定されないが、好ましくは検査対象動物由来のモエシンである。例えば、検査対象がヒトであれば、ヒトモエシン（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいはその天然のアレル変異体等）を用いることが好ましい。
【００１５】
また、本発明においてモエシンの部分ペプチドとしては、本発明で検出される抗モエシン抗体が認識する抗原決定基を含む部分ペプチドであれば特にその長さは限定されない。一般的にタンパク質抗原の抗原決定基は、少なくとも５〜６個のアミノ酸残基により構成されるため、少なくとも５個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上のアミノ酸残基を含むモエシンの部分ペプチドを、本発明において用いることができる。
【００１６】
モエシン又はその部分ペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、例えば、リン酸、糖又は糖鎖、リン脂質、脂質、ヌクレオチド等による修飾などが挙げられる。
【００１７】
本発明で用いられるモエシン又はその部分ペプチドは、前述したヒトやその他の動物から公知の方法によって得ることができる。例えば、脾臓、子宮、腎臓等のようなモエシン発現組織又はその培養細胞、あるいはＵＴ−７等のモエシン発現細胞株などを用いて、モエシンを精製することができる。具体的には、該動物の組織又は細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１８】
本発明のモエシン又はその部分ペプチドは、モエシン又はその部分ペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターを導入した形質転換体を培養してモエシン又はその部分ペプチドを生成し、得られる培養物からモエシン又はその部分ペプチドを分離・精製することによっても製造できる。
【００１９】
本発明で用いられるモエシン又はその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法により製造することもできる。該ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。モエシンを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより、モエシン又はその部分ペプチドを製造することができる。
【００２０】
本発明で用いられるモエシンの部分ペプチドは、上述もしくは後述のいずれかの方法により得られるモエシンを、適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
【００２１】
モエシン又はその部分ペプチドは、精製作業等を容易にすることを目的に、適当なタグが連結されたものであってもよい。該タグとしては、イムノグロブリンＦｃ領域、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ等が挙げられる。
【００２２】
該検出方法としては、特に限定されないが、より具体的には以下の方法が挙げられる。
（１）血球やゼラチン粒子の表面に、モエシン又はその部分ペプチド（抗原）を被覆し、生体試料を加えることにより抗原抗体反応を起こさせ、凝集塊を作らせる凝集反応、
（２）モエシン又はその部分ペプチドを含む抽出液と生体試料を寒天ゲル内で拡散させて沈降反応を起こさせる二重免疫拡散法（ＤＩＤ：ｄｏｕｂｌｅ ｉｍｍｕｎｏ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ：オクタロニー法）、
（３）精製したモエシン又はその部分ペプチドをプレートに固相化し、生体試料を加えて反応させた後、
ｉ）酵素と結合した二次抗体をさらに反応させて、基質の発色を分光光度計で検出するＥＬＩＳＡ法、
ii）蛍光色素と結合した二次抗体をさらに反応させて、蛍光発色を測定する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）あるいは
iii）化学発光物質と結合した二次抗体をさらに反応させて、化学蛍光（ケミルミネッセンス）を測定する化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、
（４）ラテックス粒子やガラスビーズなどの表面をモエシン又はその部分ペプチドで被覆し、該粒子が抗体と遭遇したときに起こる凝集反応液に光をあて、その透過光を測定する免疫比濁法あるいはその散乱光を測定する免疫比朧法（ネフロメトリー法）、
（５）モエシン又はその部分ペプチドを放射性同位元素で標識し、生体試料と反応させ抗原抗体反応を検出するラジオイムノアッセイ、
（６）モエシン又はその部分ペプチドを含む組織の凍結薄切片あるいは細胞をスライドガラス上に貼り付け、生体試料を切片上に滴下することにより反応させ、蛍光色素と結合した二次抗体とさらに反応させて、蛍光を顕微鏡下で検出する蛍光抗体法、
（７）モエシン又はその部分ペプチドをチップ上に固定して生体試料を流すことにより親和性をみる表面プラズモン共鳴解析法。
（８）電気泳動により分離展開したゲル内のモエシン又はその部分ペプチドを、ニトロセルロース膜等に転写し、生体試料と反応させ抗原抗体反応を検出するウエスタンブロッティング法。
【００２３】
例えば検出手段がＥＬＩＳＡ法の場合、具体的には、下記のように検出及び／又は定量を行なうことができる。すなわち、慣用のＥＬＩＳＡの手法に従い、例えば、モエシン又はその部分ペプチドで被覆したマルチウエルプレートの各ウエルに生体試料を供し、各ウエルに酵素標識した２次抗体を添加して反応させ、酵素基質を添加した後、該酵素により生じた産物を検出及び／又は定量することにより、抗原抗体反応の検出及び／又は定量を行なうことができる。
【００２４】
前記ＥＬＩＳＡ法の場合、標識に用いられる酵素としては、通常、ＥＬＩＳＡ法に用いられる慣用の酵素であればよく、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙げられる。より高感度で安定な検出を達成することが可能である観点から、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼが望ましい。また、酵素基質は、用いる酵素により適宜選択することができ、例えば、ペルオキシダーゼの場合、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどが用いられ、アルカリホスファターゼの場合、パラニトロフェニルリン酸ナトリウムなどが用いられる。
【００２５】
酵素により生じた産物の検出及び／又は定量は、該産物の吸光度を測定することにより行なうことができる。例えば、酵素基質として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いた場合、４５０ｎｍにおける吸光度を測定すればよい。
【００２６】
例えば、検出手段が蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）の場合、蛍光色素としては、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５等が挙げられる。
【００２７】
また、例えば、検出手段が化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）の場合、化学蛍光（ケミルミネッセンス）としては、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
【００２８】
生体試料中にモエシンを特異的に認識する抗体が検出された場合、当該生体試料の由来する対象は、再生不良性貧血を発症する／している可能性が高いと判断することができる。この場合、生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体価が高いほど再生不良性貧血を発症する／している可能性が高いとすることもできる。逆に、生体試料中にモエシンを特異的に認識する抗体が検出されない場合、当該生体試料の由来する対象は、再生不良性貧血を発症する／している可能性が低いと判断することができる。
【００２９】
上記発症可能性を判断する場合、その判断基準は抗体の検出・未検出のみに限定されるわけでない。例えば、健常対象由来の生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体量の平均値±３ＳＤ等をカットオフ値と設定し、カットオフ値以上であれば対象は再生不良性貧血を発症する／している可能性が高いと判断し、逆にカットオフ値以下であれば対象は再生不良性貧血を発症する／している可能性が低いと判断してもよい。
【００３０】
また、血液中の網状赤血球数、血小板数、白血球数等を指標に、再生不良性貧血を発症していることが判明している患者において、本発明の検査方法により、モエシンを特異的に認識する抗体が検出された場合、該患者は自己免疫性再生不良性貧血を発症している可能性が高いと判定することができる。この場合、該患者は免疫抑制療法の対象として適していると判断することもできる。また、モエシンを特異的に認識する抗体が検出されない場合、該患者は造血幹細胞異常性再生不良性貧血もしくはその他の原因による貧血を発症している可能性が高いと判定することができる。この場合、該患者は免疫抑制療法の対象として適さないと判断することもできる。本発明の検査方法は、特に、再生不良性貧血が自己免疫性再生不良性貧血か造血幹細胞異常性再生不良性貧血かを判別するのに優れている。
【００３１】
なお、本明細書中において、自己免疫性再生不良性貧血とは、造血幹細胞が自己のリンパ球や抗体等により攻撃され減少することに起因する再生不良性貧血を意味し、造血幹細胞異常性再生不良性貧血とは、造血幹細胞が後天性の遺伝子異常により増殖・分化しないことに起因する再生不良性貧血を意味する。
【００３２】
また、本発明では、生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬が提供される。
【００３３】
該物質としては、上述の方法においてモエシンを特異的に認識する抗体の検出を達成しうるものであれば特に限定されないが、好ましくはモエシン又はその部分ペプチドである。また、本発明で検出される抗モエシン抗体が、複数の抗原決定基を認識する抗体群である場合、モエシン中に存在する多くの抗原決定基に、それぞれ特異的に認識する抗体を網羅的に検出させることにより、検出感度を向上させるという観点から、該物質はモエシン（タンパク質の全長）であることが好ましい。
【００３４】
モエシン又はその部分ペプチドは、粉末、溶液等の形態で提供されてもよく、あるいは、血球、ゼラチン粒子、プレート、ラテックス粒子、硝子ビーズ、スライドガラス、チップ、マイクロタイタープレート、遠心管、マイクロビーズ、メンブレン、ペーパーディスク等の不溶性担体に担持された形で提供されてもよい。尚、容器上の担体においては、該担体に保持される溶液が接触する部位、例えばマイクロタイタープレートの場合には、ウエルの部位にモエシン又はその部分ペプチドが担持される。なお、モエシン又はその部分ペプチドの不溶性担体への担持は、公知の方法により行うことができる。
【００３５】
本発明の検査用試薬を用いれば、上述の方法により、容易に再生不良性貧血を検査することができる。
【００３６】
本発明の検査用試薬はまた、上述の検出方法で使用される試薬等をさらに含む、再生不良性貧血検査用キットとすることもできる。該試薬等としては、具体的に、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、蛍光色素、反応容器、陽性対照、陰性対照、検査プロトコールを記載した指示書等が挙げられる。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。該キットを使用することにより、本発明の再生不良性貧血の検査が簡便となり、早期の治療方針決定に非常に有用である。
【００３７】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１） ヒト急性骨髄性白血病由来のＵＴ−７細胞のライセートを用いたウェスタンブロッティングによる抗原抗体反応
約１×１０７個のＵＴ−７細胞をダルベッコＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１．４ｍＭ リン酸カリウム、４．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２．７ｍＭ ＫＣｌ）で２回洗浄後、電気泳動用のローディング液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％グリセロール、５％β−メルカプトエタノール、０．００１％ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））５００μｌに溶解し、超音波処理をおこなった。そのライセートをウェル当たり１０μｌずつロードし、１０％ポリアクリルアミドゲル上で０.１％ＳＤＳ含有１倍泳動液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１９２ｍＭ グリシン ｐＨ８．４）で電気泳動を行った。ゲルの一部はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行いバンドの大きさを確認した。結果を図１のレーン１に示す。図中でレーンｍは分子量マーカー、レーン１はクマシーブリリアントブルー染色である。
染色しないゲル中のタンパク質はメタノール含有転写緩衝液中で１９０ｍＡ定電流で１．５時間かけてｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ(ＰＶＤＦ) ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上に電気的に移し取った。上記ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で４℃で一晩ブロッキングした。その後、１％ＢＳＡ−ＴＢＳ(２５ｍＭ ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｔｒｉｓ)−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、 ２．５ｍＭ ＫＣｌ）で２００倍に希釈した正常人血清、再生不良性貧血患者血清、あるいは抗モエシン抗体 (Ｃｌｏｎｅ ３８／８７、 Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ社)と１〜２時間室温で反応させた後、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０(ＴＢＳ−Ｔ、ｐＨ７．５))で３回洗浄した。ＴＢＳでさらに１回洗浄し１％ＢＳＡ−ＴＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ分画（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）もしくはアルカリフォスファターゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｍ社）と１時間室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＢＳで１回洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ(ＫＰＬ社)を用いて発色させ、再生不良性貧血患者血清と反応するバンドが７７ｋＤであることを確認した。７７ｋＤのバンドは再生不良性貧血患者血清の９検体中４検体と反応した。一方、正常人血清では１０検体中２検体と反応することがわかった。その代表的パターンを図１に示した。レーン２からレーン５は正常ヒト血清、レーン６からレーン９は再生不良性貧血患者血清、レーン１０は抗モエシン抗体である。
【００３９】
（実施例２） ７７ｋＤのバンドの質量分析による解析
約１×１０７個のＵＴ−７細胞を０．５ｍｌＰＢＳ中で３７℃１時間インキュベート後、Ｋｅｎｄｒｏ社製Ｂｉｏｆｕｇｅ ｆｒｅｓｏで５００ｒｐｍ３分間遠心分離した。得られた上清を前述の電気泳動用ローディング液に溶解し電気泳動を行い、ＣＢＢ染色を行った。ＣＢＢ染色したゲル中の７７ｋＤバンドを切り出した後、１００ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、３０ｍＭ ［Ｆｅ（ＣＮ）６］Ｋ３を予め用意し、用時１：１に調製して数分で脱色した。脱色して黄色くなったゲルを目視で透明になるまで水にて洗浄した。何回か水を入れ替えたのち、１０分〜１５分位でゲルが透明になるのを確認した。次に洗浄に用いた水を抜き、ゲルを約１ｍｍ３の大きさに細分化し乾固した。必要量のＴｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社)を含んだ５０ｍＭ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｐＨ８．０ ２％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅで３７℃一晩処理し、目的タンパク質を断片化した。断片化したペプチドはＺｉｐＴｉｐを用いて抽出、脱塩、濃縮も同時に行った。最後に質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ペプチドマスフィンガープリンティング法））によりアミノ酸配列を決定し、データベースで検索した結果、７７ｋＤタンパク質はモエシンであることが判明した。
【００４０】
（実施例３） 抗原タンパク質の製造
１. モエシンの発現ベクターの作成
名古屋大学大学院医学系研究科細胞情報薬理学講座よりモエシンのｃＤＮＡを入手し、Ｋｐｎ Ｉをもちいてコーディング部位を含む領域を切り出し、ｐＥＴ−４４ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に組込んだ。
２. 遺伝子組換えモエシンの大腸菌による発現
実施例３の１で得られた発現プラスミドｐＥＴ−４４ｃ−ｍｏｅｓｉｎを用いて大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換させ、得られた単一コロニーを発現実験の種菌とした。独立した４クローンをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ（ルリアベターニ）プレート上に一面に塗布し、３７℃で一夜静置培養した。プレートの菌体を白金耳でかきとり、アンピシリン含有ＬＢ培地３ｍｌに植え、３７℃で約１.５時間振とう培養を行った。その後、吸光度５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）を測定し、２０ｍｌの同培地にＯＤ５５０＝０．２となるように培養液を加え、振とう培養を続けた。培養後、約２時間でＯＤ５５０＝０．８に達した時点でＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭになるように加えた。ＩＰＴＧ添加から、０、４、１８時間後において、菌のＯＤ５５０＝１.０相当を１３０００ｒｐｍ、２分間遠心後集菌した。サンプル液を上記電気泳動用ローディング液に溶解し、そのライセート１０μlをウエルにロードして１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、組換えモエシンの発現を確認した。精製用の菌体の発現は１００ｍＬスケールで行い、１８〜２０時間培養を続け、トミー精工製ＲＬ−１３１で３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心により菌を集めた。
３．遺伝子組換えモエシンの精製
菌体を１× Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｈｉｓ・ＢｉｎｄＫｉｔｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ社） ４０ｍｌに懸濁した後、１ｍｌずつエッペンドルフチューブに分注し、約１分間の超音波破砕を３回繰り返した後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心し、沈渣を得た。この沈渣を２０ｍｌ １×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、６Ｍ尿素を含む１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍｌで６０分間氷上においた後、溶出した上清を遠心により回収した。上清中に含まれるＨｉｓタグのついた組換えモエシンはＨｉｓ・ＢｉｎｄＫｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の変性条件下でのプロトコールに従い、クロマトグラフィ分離し、抗原蛋白とした。
【００４１】
（実施例４） 遺伝子組換えモエシンを用いた患者血清中の抗モエシン抗体の検出
１．ウエスタンブロッティング
実施例３で得られた抗原タンパク質を１ウエルあたり２００ｎｇ電気泳動した。そのゲル中の抗原タンパク質をメタノール含有転写緩衝液中で、１９０ｍＡ定電流で１．５時間かけてＰＶＤＦ膜上に電気的に移し取った。上記ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で４℃で一晩ブロッキングを行った。その後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍に希釈した正常人血清、患者血清あるいは抗モエシン抗体と１〜２時間室温で反応させた後ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。さらにＴＢＳで１回洗浄し１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ分画（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）もしくはアルカリフォスファターゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｍ社）と１時間室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、さらにＴＢＳで１回洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ社）を用いて発色を起こさせた。図２はその代表的なパターンを示したものである。レーンｍは分子量マーカー、レーン１からレーン２は正常ヒト血清、レーン３からレーン５は再生不良性貧血患者血清、レーン６は抗モエシン抗体の結果を示す。
２．ＥＬＩＳＡ
実施例３で得られた組換えタンパク質２５０〜５００ｎｇを９６−ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に４℃で一夜コートした。Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ) ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＰＢＳ−ＦＣＳ）で３回洗浄後ＰＢＳ−ＦＣＳを加え、４℃で一夜ブロッキングしたものをＥＬＩＳＡ用プレートとした。１０００倍に希釈した血清を５０μｌ加え、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＦＣＳで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（１：５０００、 Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で６０分間インキュベートし、同様に洗浄した。その後、３, ３',５, ５'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）による発色操作を行い、ＯＤ４５０の吸光度を測定した。この結果を図３に示す。正常ヒト血清(Ｂ)の平均値±３ＳＤを各々の抗原に対するカットオフ値(ＯＤ４５０＝０．２８４）とした場合、再生不良性貧血患者の４７％が有意に高い抗体価を示した。すなわちこのＥＬＩＳＡ系を用いることにより、免疫病態をもつ再生不良性貧血を治療前に診断することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
上述した結果から明らかなように、本発明の検査方法を用いれば、再生不良性貧血が自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血のいずれかを判別することができるため、適切な治療方針の決定を速やかに下すことができる。以上より、この自己抗原タンパク質を用いた免疫学的検出法は再生不良性貧血の自己抗原に基づく血清診断法であり、簡便かつ信頼性が高いことから極めて利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＵＴ−７より粗精製した抗原タンパク質を電気泳動したパターンである。クマシーブリリアントブルー染色した結果（レーン１）と、正常ヒト血清又は再生不良性貧血患者血清を用いてウエスタンブロッティング分析した結果（レーン２〜９）を示す図である。
【図２】大腸菌から得られた組換え型モエシンを電気泳動し、再生不良性貧血患者血清もしくは健常人血清を用いてウエスタンブロッティング分析したものを示す図である。バンドは融合タンパク質として約１５０ｋＤに検出される。
【図３】組換え型モエシンを抗原としたときの再生不良性貧血患者血清（Ａ）および正常ヒト血清（Ｂ）のＥＬＩＳＡによる反応性の相違を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は再生不良性貧血の免疫病態の診断方法および自己抗体の検出試薬に関するものである。具体的には、再生不良性貧血患者血清中に存在するモエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法と、そのための試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生不良性貧血とは、骨髄低形成（骨髄の細胞密度が低下）と、汎血球減少（血中の赤血球、白血球、血小板のすべてが減少）を主徴とする疾患である。再生不良性貧血は、かつては難病であったが、現在では適切な治療により治癒する可能性の高い疾患である。したがって、早期の正確な診断と、適切な治療が必要である。再生不良性貧血の診断は厚生労働省の診断基準(厚生省特定疾患特発性造血障害調査研究班 １９８９年)に基づいて行われている。再生不良性貧血は、骨髄低形成と汎血球減少を来す他の疾患を除外して初めて診断が確定される症候群であり、病態を反映する特異的なマーカーは知られていない。再生不良性貧血には、自己免疫性のものと造血幹細胞異常性のものとがあることが知られているが、両者を判別する方法は知られていない。また、再生不良性貧血の約７割は免疫抑制療法によって改善することから、免疫病態の存在を証明することが重要である。しかし、免疫病態のマーカーについても確立されたものは存在しない。一般に自己免疫疾患では自己細胞成分に対する多種類の抗体（自己抗体）が検出され、その抗体が臨床症状と密接な関係を持つことが知られている。近年、多くの自己抗体の対応抗原（自己抗原）は細胞内の巨大分子であり、しかも種を越えて保存されているタンパク質であることが明らかになっている。しかしながら、自己免疫性の再生不良性貧血患者における自己抗体や、その対応抗原についての解析はほとんどなされていない。
【０００３】
モエシン（ｍｏｅｓｉｎ）はｍｅｍｂｒａｎｅ−ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎとしてウシの子宮より分離され、ヘパリン硫酸の受容体タンパク質の可能性が示唆されてきた（非特許文献１）。また、ｃＤＮＡクローニングにより、ヒトでは通常５７７アミノ酸から成ることが示されている（非特許文献２）。最近、モエシンは内皮細胞やある種の上皮細胞の尖端絨毛にアクチンとともに局在することが分かったが、その機能は解明されていない。１９９６年に、モエシンに対する自己抗体が慢性関節リウマチ患者の約３０％の血清中に存在することが示された（特許文献１)。しかし、このような抗モエシン抗体が再生不良性貧血のように骨髄の働きが低下する血液疾患の患者に見られることは全く知られていなかった。
【特許文献１】特願平８−５０９３７５
【非特許文献１】ランケスら（Ｌａｎｋｅｓ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、（英国）、第２５１巻、ｐ．８３１−８４２、１９８８年
【非特許文献２】ランケスら（Ｌａｎｋｅｓ，Ｗ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．）、（米国）、第８８巻、ｐ．８２９７−８３０１、１９９１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、再生不良性貧血を自己免疫疾患という観点からとらえ、再生不良性貧血患者血清中に存在する自己抗体に着目し、特異的自己抗原と反応する抗体の検出を目指したものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、再生不良性貧血患者血清中の自己抗体と反応する造血幹細胞由来の抗原がモエシンであることを見出したことにより完成された。したがって本発明は、以下に関する、
（１）生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法、
（２）該再生不良性貧血は自己免疫性である、（１）記載の方法、
（３）自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血との判別方法である、（１）記載の方法、
（４）再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、（１）記載の方法、
（５）生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬、
（６）該物質がモエシン又はその部分ペプチドである、（５）記載の試薬。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法を用いれば、従来の再生不良性貧血の診断が除外診断に基づいていたのに対し、血清の分離、抗体価の測定等という簡便な方法により、再生不良性貧血、特に自己免疫性の再生不良性貧血を客観的に診断できる。したがって、本発明は再生不良性貧血の免疫病態の診断を可能とするものであり、特異的な抗原抗体反応に基づく血清診断法として簡便かつ信頼性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の検査方法を適用することができる対象としては、動物であれば特に限定されないが、例えば、哺乳動物等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、対象動物はヒトである。
【０００８】
本発明の方法に用いられ得る生体試料としては、特に限定されないが、例えば、検査対象である動物由来の組織、細胞、細胞抽出成分、体液等が挙げられる。組織としては、脾臓、リンパ節等が、細胞としては、脾細胞、リンパ細胞、抗体産生細胞等が、体液としては、血液、血清、血漿、尿、汗等が挙げられる。検出の容易性などを考慮すると、生体試料としては体液、特に血清・血漿が好ましい。
【０００９】
本発明の検査方法において検出される抗体（以下、「抗モエシン抗体」という場合もある）により認識されるモエシンとは、一般に細胞骨格に結合したタンパク質ファミリー（Ｅｚｒｉｎ Ｒａｄｉｘｉｎ Ｍｏｅｓｉｎ：ＥＲＭファミリー）に属するタンパク質であり、ヒトでは通常５７７アミノ酸から成る。モエシンとしては、上述の哺乳動物由来のものであれば特に限定されないが、好ましくはヒト由来のモエシンである。ヒトモエシンとしては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００２４４４）からなるタンパク質、あるいはその天然のアレル変異体等が挙げられる。
【００１０】
抗体としては、特にそのクラスは限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ等のいずれのものであってもよい。また、抗体の結合性断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等）等も、モエシンに対して特異的に結合する限り「抗体」に含まれる。
【００１１】
本発明で検出される抗体としては、自己のモエシンを特異的に認識する自己抗体である。例えば、生体試料がヒト由来ならば、ヒトのモエシンを特異的に認識するヒト抗体が、好ましくは検出される。
【００１２】
生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体を検出する方法としては、自体公知の方法を用いることができ、特に限定されないが、液相又は固相で起こる反応（例えば抗原抗体反応）を直接測定する方法や、阻害物質を加えることにより免疫反応の阻害を測定する方法などを利用することができる。
【００１３】
上記方法としては、例えば、モエシン又はその部分ペプチドを生体試料と接触させ、生体試料中の抗体のモエシン又はその部分ペプチドに対する特異的結合を、直接的又は間接的に検出する方法が挙げられる。
【００１４】
上記方法に用いられるモエシンは、上述のモエシンタンパク質のうち、検査対象動物の自己抗体である抗モエシン抗体により特異的に認識され得るものであれば特に限定されないが、好ましくは検査対象動物由来のモエシンである。例えば、検査対象がヒトであれば、ヒトモエシン（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいはその天然のアレル変異体等）を用いることが好ましい。
【００１５】
また、本発明においてモエシンの部分ペプチドとしては、本発明で検出される抗モエシン抗体が認識する抗原決定基を含む部分ペプチドであれば特にその長さは限定されない。一般的にタンパク質抗原の抗原決定基は、少なくとも５〜６個のアミノ酸残基により構成されるため、少なくとも５個以上、好ましくは８個以上、より好ましくは１０個以上のアミノ酸残基を含むモエシンの部分ペプチドを、本発明において用いることができる。
【００１６】
モエシン又はその部分ペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、例えば、リン酸、糖又は糖鎖、リン脂質、脂質、ヌクレオチド等による修飾などが挙げられる。
【００１７】
本発明で用いられるモエシン又はその部分ペプチドは、前述したヒトやその他の動物から公知の方法によって得ることができる。例えば、脾臓、子宮、腎臓等のようなモエシン発現組織又はその培養細胞、あるいはＵＴ−７等のモエシン発現細胞株などを用いて、モエシンを精製することができる。具体的には、該動物の組織又は細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１８】
本発明のモエシン又はその部分ペプチドは、モエシン又はその部分ペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターを導入した形質転換体を培養してモエシン又はその部分ペプチドを生成し、得られる培養物からモエシン又はその部分ペプチドを分離・精製することによっても製造できる。
【００１９】
本発明で用いられるモエシン又はその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法により製造することもできる。該ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。モエシンを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより、モエシン又はその部分ペプチドを製造することができる。
【００２０】
本発明で用いられるモエシンの部分ペプチドは、上述もしくは後述のいずれかの方法により得られるモエシンを、適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
【００２１】
モエシン又はその部分ペプチドは、精製作業等を容易にすることを目的に、適当なタグが連結されたものであってもよい。該タグとしては、イムノグロブリンＦｃ領域、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ等が挙げられる。
【００２２】
該検出方法としては、特に限定されないが、より具体的には以下の方法が挙げられる。
（１）血球やゼラチン粒子の表面に、モエシン又はその部分ペプチド（抗原）を被覆し、生体試料を加えることにより抗原抗体反応を起こさせ、凝集塊を作らせる凝集反応、
（２）モエシン又はその部分ペプチドを含む抽出液と生体試料を寒天ゲル内で拡散させて沈降反応を起こさせる二重免疫拡散法（ＤＩＤ：ｄｏｕｂｌｅ ｉｍｍｕｎｏ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ：オクタロニー法）、
（３）精製したモエシン又はその部分ペプチドをプレートに固相化し、生体試料を加えて反応させた後、
ｉ）酵素と結合した二次抗体をさらに反応させて、基質の発色を分光光度計で検出するＥＬＩＳＡ法、
ii）蛍光色素と結合した二次抗体をさらに反応させて、蛍光発色を測定する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）あるいは
iii）化学発光物質と結合した二次抗体をさらに反応させて、化学蛍光（ケミルミネッセンス）を測定する化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、
（４）ラテックス粒子やガラスビーズなどの表面をモエシン又はその部分ペプチドで被覆し、該粒子が抗体と遭遇したときに起こる凝集反応液に光をあて、その透過光を測定する免疫比濁法あるいはその散乱光を測定する免疫比朧法（ネフロメトリー法）、
（５）モエシン又はその部分ペプチドを放射性同位元素で標識し、生体試料と反応させ抗原抗体反応を検出するラジオイムノアッセイ、
（６）モエシン又はその部分ペプチドを含む組織の凍結薄切片あるいは細胞をスライドガラス上に貼り付け、生体試料を切片上に滴下することにより反応させ、蛍光色素と結合した二次抗体とさらに反応させて、蛍光を顕微鏡下で検出する蛍光抗体法、
（７）モエシン又はその部分ペプチドをチップ上に固定して生体試料を流すことにより親和性をみる表面プラズモン共鳴解析法。
（８）電気泳動により分離展開したゲル内のモエシン又はその部分ペプチドを、ニトロセルロース膜等に転写し、生体試料と反応させ抗原抗体反応を検出するウエスタンブロッティング法。
【００２３】
例えば検出手段がＥＬＩＳＡ法の場合、具体的には、下記のように検出及び／又は定量を行なうことができる。すなわち、慣用のＥＬＩＳＡの手法に従い、例えば、モエシン又はその部分ペプチドで被覆したマルチウエルプレートの各ウエルに生体試料を供し、各ウエルに酵素標識した２次抗体を添加して反応させ、酵素基質を添加した後、該酵素により生じた産物を検出及び／又は定量することにより、抗原抗体反応の検出及び／又は定量を行なうことができる。
【００２４】
前記ＥＬＩＳＡ法の場合、標識に用いられる酵素としては、通常、ＥＬＩＳＡ法に用いられる慣用の酵素であればよく、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、エステラーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼなどが挙げられる。より高感度で安定な検出を達成することが可能である観点から、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼが望ましい。また、酵素基質は、用いる酵素により適宜選択することができ、例えば、ペルオキシダーゼの場合、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどが用いられ、アルカリホスファターゼの場合、パラニトロフェニルリン酸ナトリウムなどが用いられる。
【００２５】
酵素により生じた産物の検出及び／又は定量は、該産物の吸光度を測定することにより行なうことができる。例えば、酵素基質として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを用いた場合、４５０ｎｍにおける吸光度を測定すればよい。
【００２６】
例えば、検出手段が蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）の場合、蛍光色素としては、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５等が挙げられる。
【００２７】
また、例えば、検出手段が化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）の場合、化学蛍光（ケミルミネッセンス）としては、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
【００２８】
生体試料中にモエシンを特異的に認識する抗体が検出された場合、当該生体試料の由来する対象は、再生不良性貧血を発症する／している可能性が高いと判断することができる。この場合、生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体価が高いほど再生不良性貧血を発症する／している可能性が高いとすることもできる。逆に、生体試料中にモエシンを特異的に認識する抗体が検出されない場合、当該生体試料の由来する対象は、再生不良性貧血を発症する／している可能性が低いと判断することができる。
【００２９】
上記発症可能性を判断する場合、その判断基準は抗体の検出・未検出のみに限定されるわけでない。例えば、健常対象由来の生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体量の平均値±３ＳＤ等をカットオフ値と設定し、カットオフ値以上であれば対象は再生不良性貧血を発症する／している可能性が高いと判断し、逆にカットオフ値以下であれば対象は再生不良性貧血を発症する／している可能性が低いと判断してもよい。
【００３０】
また、血液中の網状赤血球数、血小板数、白血球数等を指標に、再生不良性貧血を発症していることが判明している患者において、本発明の検査方法により、モエシンを特異的に認識する抗体が検出された場合、該患者は自己免疫性再生不良性貧血を発症している可能性が高いと判定することができる。この場合、該患者は免疫抑制療法の対象として適していると判断することもできる。また、モエシンを特異的に認識する抗体が検出されない場合、該患者は造血幹細胞異常性再生不良性貧血もしくはその他の原因による貧血を発症している可能性が高いと判定することができる。この場合、該患者は免疫抑制療法の対象として適さないと判断することもできる。本発明の検査方法は、特に、再生不良性貧血が自己免疫性再生不良性貧血か造血幹細胞異常性再生不良性貧血かを判別するのに優れている。
【００３１】
なお、本明細書中において、自己免疫性再生不良性貧血とは、造血幹細胞が自己のリンパ球や抗体等により攻撃され減少することに起因する再生不良性貧血を意味し、造血幹細胞異常性再生不良性貧血とは、造血幹細胞が後天性の遺伝子異常により増殖・分化しないことに起因する再生不良性貧血を意味する。
【００３２】
また、本発明では、生体試料中のモエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬が提供される。
【００３３】
該物質としては、上述の方法においてモエシンを特異的に認識する抗体の検出を達成しうるものであれば特に限定されないが、好ましくはモエシン又はその部分ペプチドである。また、本発明で検出される抗モエシン抗体が、複数の抗原決定基を認識する抗体群である場合、モエシン中に存在する多くの抗原決定基に、それぞれ特異的に認識する抗体を網羅的に検出させることにより、検出感度を向上させるという観点から、該物質はモエシン（タンパク質の全長）であることが好ましい。
【００３４】
モエシン又はその部分ペプチドは、粉末、溶液等の形態で提供されてもよく、あるいは、血球、ゼラチン粒子、プレート、ラテックス粒子、硝子ビーズ、スライドガラス、チップ、マイクロタイタープレート、遠心管、マイクロビーズ、メンブレン、ペーパーディスク等の不溶性担体に担持された形で提供されてもよい。尚、容器上の担体においては、該担体に保持される溶液が接触する部位、例えばマイクロタイタープレートの場合には、ウエルの部位にモエシン又はその部分ペプチドが担持される。なお、モエシン又はその部分ペプチドの不溶性担体への担持は、公知の方法により行うことができる。
【００３５】
本発明の検査用試薬を用いれば、上述の方法により、容易に再生不良性貧血を検査することができる。
【００３６】
本発明の検査用試薬はまた、上述の検出方法で使用される試薬等をさらに含む、再生不良性貧血検査用キットとすることもできる。該試薬等としては、具体的に、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、蛍光色素、反応容器、陽性対照、陰性対照、検査プロトコールを記載した指示書等が挙げられる。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。該キットを使用することにより、本発明の再生不良性貧血の検査が簡便となり、早期の治療方針決定に非常に有用である。
【００３７】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
（実施例１） ヒト急性骨髄性白血病由来のＵＴ−７細胞のライセートを用いたウェスタンブロッティングによる抗原抗体反応
約１×１０７個のＵＴ−７細胞をダルベッコＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１．４ｍＭ リン酸カリウム、４．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２．７ｍＭ ＫＣｌ）で２回洗浄後、電気泳動用のローディング液（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％グリセロール、５％β−メルカプトエタノール、０．００１％ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））５００μｌに溶解し、超音波処理をおこなった。そのライセートをウェル当たり１０μｌずつロードし、１０％ポリアクリルアミドゲル上で０.１％ＳＤＳ含有１倍泳動液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１９２ｍＭ グリシン ｐＨ８．４）で電気泳動を行った。ゲルの一部はクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行いバンドの大きさを確認した。結果を図１のレーン１に示す。図中でレーンｍは分子量マーカー、レーン１はクマシーブリリアントブルー染色である。
染色しないゲル中のタンパク質はメタノール含有転写緩衝液中で１９０ｍＡ定電流で１．５時間かけてｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ(ＰＶＤＦ) ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上に電気的に移し取った。上記ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で４℃で一晩ブロッキングした。その後、１％ＢＳＡ−ＴＢＳ(２５ｍＭ ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（Ｔｒｉｓ)−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １５０ｍＭ ＮａＣｌ、 ２．５ｍＭ ＫＣｌ）で２００倍に希釈した正常人血清、再生不良性貧血患者血清、あるいは抗モエシン抗体 (Ｃｌｏｎｅ ３８／８７、 Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ社)と１〜２時間室温で反応させた後、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０(ＴＢＳ−Ｔ、ｐＨ７．５))で３回洗浄した。ＴＢＳでさらに１回洗浄し１％ＢＳＡ−ＴＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ分画（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）もしくはアルカリフォスファターゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｍ社）と１時間室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＢＳで１回洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ(ＫＰＬ社)を用いて発色させ、再生不良性貧血患者血清と反応するバンドが７７ｋＤであることを確認した。７７ｋＤのバンドは再生不良性貧血患者血清の９検体中４検体と反応した。一方、正常人血清では１０検体中２検体と反応することがわかった。その代表的パターンを図１に示した。レーン２からレーン５は正常ヒト血清、レーン６からレーン９は再生不良性貧血患者血清、レーン１０は抗モエシン抗体である。
【００３９】
（実施例２） ７７ｋＤのバンドの質量分析による解析
約１×１０７個のＵＴ−７細胞を０．５ｍｌＰＢＳ中で３７℃１時間インキュベート後、Ｋｅｎｄｒｏ社製Ｂｉｏｆｕｇｅ ｆｒｅｓｏで５００ｒｐｍ３分間遠心分離した。得られた上清を前述の電気泳動用ローディング液に溶解し電気泳動を行い、ＣＢＢ染色を行った。ＣＢＢ染色したゲル中の７７ｋＤバンドを切り出した後、１００ｍＭ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、３０ｍＭ ［Ｆｅ（ＣＮ）６］Ｋ３を予め用意し、用時１：１に調製して数分で脱色した。脱色して黄色くなったゲルを目視で透明になるまで水にて洗浄した。何回か水を入れ替えたのち、１０分〜１５分位でゲルが透明になるのを確認した。次に洗浄に用いた水を抜き、ゲルを約１ｍｍ３の大きさに細分化し乾固した。必要量のＴｒｙｐｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社)を含んだ５０ｍＭ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｐＨ８．０ ２％ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅで３７℃一晩処理し、目的タンパク質を断片化した。断片化したペプチドはＺｉｐＴｉｐを用いて抽出、脱塩、濃縮も同時に行った。最後に質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ペプチドマスフィンガープリンティング法））によりアミノ酸配列を決定し、データベースで検索した結果、７７ｋＤタンパク質はモエシンであることが判明した。
【００４０】
（実施例３） 抗原タンパク質の製造
１. モエシンの発現ベクターの作成
名古屋大学大学院医学系研究科細胞情報薬理学講座よりモエシンのｃＤＮＡを入手し、Ｋｐｎ Ｉをもちいてコーディング部位を含む領域を切り出し、ｐＥＴ−４４ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に組込んだ。
２. 遺伝子組換えモエシンの大腸菌による発現
実施例３の１で得られた発現プラスミドｐＥＴ−４４ｃ−ｍｏｅｓｉｎを用いて大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換させ、得られた単一コロニーを発現実験の種菌とした。独立した４クローンをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有のＬＢ（ルリアベターニ）プレート上に一面に塗布し、３７℃で一夜静置培養した。プレートの菌体を白金耳でかきとり、アンピシリン含有ＬＢ培地３ｍｌに植え、３７℃で約１.５時間振とう培養を行った。その後、吸光度５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）を測定し、２０ｍｌの同培地にＯＤ５５０＝０．２となるように培養液を加え、振とう培養を続けた。培養後、約２時間でＯＤ５５０＝０．８に達した時点でＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭになるように加えた。ＩＰＴＧ添加から、０、４、１８時間後において、菌のＯＤ５５０＝１.０相当を１３０００ｒｐｍ、２分間遠心後集菌した。サンプル液を上記電気泳動用ローディング液に溶解し、そのライセート１０μlをウエルにロードして１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、組換えモエシンの発現を確認した。精製用の菌体の発現は１００ｍＬスケールで行い、１８〜２０時間培養を続け、トミー精工製ＲＬ−１３１で３０００ｒｐｍ、３０分間の遠心により菌を集めた。
３．遺伝子組換えモエシンの精製
菌体を１× Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｈｉｓ・ＢｉｎｄＫｉｔｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ社） ４０ｍｌに懸濁した後、１ｍｌずつエッペンドルフチューブに分注し、約１分間の超音波破砕を３回繰り返した後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心し、沈渣を得た。この沈渣を２０ｍｌ １×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、６Ｍ尿素を含む１×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍｌで６０分間氷上においた後、溶出した上清を遠心により回収した。上清中に含まれるＨｉｓタグのついた組換えモエシンはＨｉｓ・ＢｉｎｄＫｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の変性条件下でのプロトコールに従い、クロマトグラフィ分離し、抗原蛋白とした。
【００４１】
（実施例４） 遺伝子組換えモエシンを用いた患者血清中の抗モエシン抗体の検出
１．ウエスタンブロッティング
実施例３で得られた抗原タンパク質を１ウエルあたり２００ｎｇ電気泳動した。そのゲル中の抗原タンパク質をメタノール含有転写緩衝液中で、１９０ｍＡ定電流で１．５時間かけてＰＶＤＦ膜上に電気的に移し取った。上記ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で４℃で一晩ブロッキングを行った。その後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍に希釈した正常人血清、患者血清あるいは抗モエシン抗体と１〜２時間室温で反応させた後ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。さらにＴＢＳで１回洗浄し１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ分画（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）もしくはアルカリフォスファターゼ標識ラビット抗マウスＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｍ社）と１時間室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、さらにＴＢＳで１回洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ社）を用いて発色を起こさせた。図２はその代表的なパターンを示したものである。レーンｍは分子量マーカー、レーン１からレーン２は正常ヒト血清、レーン３からレーン５は再生不良性貧血患者血清、レーン６は抗モエシン抗体の結果を示す。
２．ＥＬＩＳＡ
実施例３で得られた組換えタンパク質２５０〜５００ｎｇを９６−ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に４℃で一夜コートした。Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ) ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ（ＰＢＳ−ＦＣＳ）で３回洗浄後ＰＢＳ−ＦＣＳを加え、４℃で一夜ブロッキングしたものをＥＬＩＳＡ用プレートとした。１０００倍に希釈した血清を５０μｌ加え、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＦＣＳで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（１：５０００、 Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で６０分間インキュベートし、同様に洗浄した。その後、３, ３',５, ５'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）による発色操作を行い、ＯＤ４５０の吸光度を測定した。この結果を図３に示す。正常ヒト血清(Ｂ)の平均値±３ＳＤを各々の抗原に対するカットオフ値(ＯＤ４５０＝０．２８４）とした場合、再生不良性貧血患者の４７％が有意に高い抗体価を示した。すなわちこのＥＬＩＳＡ系を用いることにより、免疫病態をもつ再生不良性貧血を治療前に診断することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
上述した結果から明らかなように、本発明の検査方法を用いれば、再生不良性貧血が自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血のいずれかを判別することができるため、適切な治療方針の決定を速やかに下すことができる。以上より、この自己抗原タンパク質を用いた免疫学的検出法は再生不良性貧血の自己抗原に基づく血清診断法であり、簡便かつ信頼性が高いことから極めて利用価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＵＴ−７より粗精製した抗原タンパク質を電気泳動したパターンである。クマシーブリリアントブルー染色した結果（レーン１）と、正常ヒト血清又は再生不良性貧血患者血清を用いてウエスタンブロッティング分析した結果（レーン２〜９）を示す図である。
【図２】大腸菌から得られた組換え型モエシンを電気泳動し、再生不良性貧血患者血清もしくは健常人血清を用いてウエスタンブロッティング分析したものを示す図である。バンドは融合タンパク質として約１５０ｋＤに検出される。
【図３】組換え型モエシンを抗原としたときの再生不良性貧血患者血清（Ａ）および正常ヒト血清（Ｂ）のＥＬＩＳＡによる反応性の相違を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法。
【請求項２】
該再生不良性貧血は自己免疫性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血との判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬。
【請求項６】
該物質がモエシン又はその部分ペプチドである、請求項５記載の試薬。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法。
【請求項２】
該再生不良性貧血は自己免疫性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血との判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
モエシン又はその部分ペプチドを含む、再生不良性貧血の検査用試薬。
【請求項１】
生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法。
【請求項２】
該再生不良性貧血は自己免疫性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血との判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出する物質を含む、再生不良性貧血の検査用試薬。
【請求項６】
該物質がモエシン又はその部分ペプチドである、請求項５記載の試薬。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の、モエシンを特異的に認識する抗体を検出することを含む、再生不良性貧血の検査方法。
【請求項２】
該再生不良性貧血は自己免疫性である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血との判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の適否の判別方法である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
モエシン又はその部分ペプチドを含む、再生不良性貧血の検査用試薬。
【図３】
【図１】
【図２】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２００６−１４５２９９（Ｐ２００６−１４５２９９Ａ）
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３３３７２５（Ｐ２００４−３３３７２５）
【出願日】平成１６年１１月１７日（２００４．１１．１７）
【特許番号】特許第３７３５６７６号（Ｐ３７３５６７６）
【特許公報発行日】平成１８年１月１８日（２００６．１．１８）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１７日（２００４．１１．１７）
【特許番号】特許第３７３５６７６号（Ｐ３７３５６７６）
【特許公報発行日】平成１８年１月１８日（２００６．１．１８）
【出願人】（５０４１６０７８１）国立大学法人金沢大学 (282)
【Ｆターム（参考）】
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