凍結乾燥用保護剤及び生理活性物質の製造方法
【課題】生理活性物質の凍結乾燥時及び保存中に活性の低下を抑制し、かつ吸湿性がなく常温で容易に取り扱うことができる凍結乾燥用保護剤、及び生理活性物質の製造方法を提供する。
【解決手段】生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥させる際に生理活性物質が変質することを防止するための保護剤であって、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する凍結乾燥用保護剤、及び凍結乾燥用保護剤の存在下、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥する生理活性物質の製造方法。
【解決手段】生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥させる際に生理活性物質が変質することを防止するための保護剤であって、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する凍結乾燥用保護剤、及び凍結乾燥用保護剤の存在下、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥する生理活性物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥用保護剤及び生理活性物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質（酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド等）は各種研究開発、診断・検査薬、医薬品等として広く利用されている。そして、製造工程中や保存期間中に、生理活性物質の生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。
そのため、生理活性物質を製造する際に水分を除いて生理活性の低下を抑える目的で、凍結乾燥工程が行われる。
凍結乾燥工程中や保存期間中に生理活性物質の生理活性（力価）を損なわないために、凍結乾燥用保護剤が使用される。凍結乾燥用保護剤としては、例えば、糖類（マントース、ラフィノース、スクロース、トレハロース）等が知られている。（特許文献１）。
なお、凍結乾燥用保護剤を使用して得られた生理活性物質は、室温で空気中に放置した場合、経時的に吸湿しないことが必要である。吸湿性があると、凍結乾燥物を少量のバイアル等に保存し、使用時に全量使用するような場合では問題にならないが、大容量の容器に保存し使用時に少量ずつ使用する場合、吸湿しないように低温下で行わなければならない等の使用上の制限がある。
【０００３】
【特許文献１】特表平８−５０４７８４号公報（ＷＯ９４／１４４６５パンフレット）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の凍結乾燥薬理製剤を用いても、保存期間中に、非耐熱性物質の生理活性が損なわれ、生理活性（力価）が１０％程度しか保持されないという問題点がある。
本発明の目的は、生理活性物質の凍結乾燥時及び保存中に活性の低下を抑制し、かつ吸湿性がなく常温で容易に取り扱うことができる凍結乾燥用保護剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の凍結乾燥用保護剤の特徴は、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥させる際に生理活性物質が変質することを防止するための保護剤であって、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する点を要旨とする。
【０００６】
また、本発明の生理活性物質の製造方法は、α位のアミノ基が変性されたアミノ酸エステルと糖類とを含有する凍結乾燥用保護剤の存在下、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥して、生理活性物質を製造する点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥する際に、生理活性物質が変質することを防止することができる。そして、得られる生理活性物質は、長期間保存しても、生理活性（力価）がほとんど低下しない。また、得られる生理活性物質は吸湿性が低く、取り扱いが容易である。
従って、本発明の保護剤は、生理活性物質（酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等）を製造する際に極めて有用であり、本発明の製造方法で得られる生理活性物質は、生理活性物質を用いる分野（各種研究開発、診断・検査薬、医薬品、化粧品等）において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、生理活性物質及び水を含む混合物を凍結乾燥して生理活性物質を精製する過程において使用するものであり、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する。
【０００９】
生理活性物質としては限定されないが、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド等が含まれる。
【００１０】
酵素としては、酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等が挙げられる。
【００１１】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝及びワクチン（Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等）等が挙げられる。
【００１２】
抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等が挙げられる。
【００１３】
ペプチドとしては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
【００１４】
これらの生理活性物質のうち、生理活性維持の観点から、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは酵素及び組み換えタンパク質、次にさらに好ましくは酵素、特に好ましくは酸化還元酵素及び加水分解酵素、最も好ましくは酸化還元酵素である。
【００１５】
水としては、特に限定されない。水の電気伝導率（μＳ／ｃｍ；２５℃）は、安全性の観点から、０．０５５〜１が好ましく、さらに好ましくは０．０５６〜０．１、特に好ましくは０．０５７〜０．０８である。このような電気伝導率が小さい水としては、イオン交換水等が使用できる。
【００１６】
本発明の凍結乾燥用保護剤の第一の成分はα位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルである。α位のアミノ基を変性することは、実施可能なｐＨ領域が広がる点や、生理活性物質の活性を維持する上で有用である。
α位のアミノ基が変性されたアミノ基としては、アシルアミノ基、アルキルアミノ基等が挙げられ、安全性の観点から、一般式（１）で表されるアシルアミノ基が好ましい。
【００１７】
−ＮＨＣＯＲ （１）
【００１８】
一般式（１）中、Ｒは水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基を表す。
Ｒとして具体的に、水素原子、アルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ペンチル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、ヘプタデセニル基及びヘンイコシル基等）、アリール基（フェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、メトキシフェニル基及びメチルフェニル基等）が挙げられる。これらのうち、水溶性及び安全性の観点から、メチル基、エチル基、フェニル基及びｐ−ヒドロキシフェニル基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、次にさらに好ましくはメチル基である。
【００１９】
アルギニンエステルとしては、アルキル（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、オクチル、ノニル、デシル、ラウリル、パルミチル、ステアリル、オレイル及びベヘニル等）エステル、アリール（フェニル、メトキシフェニル、ベンジル及びメチルフェニル等）エステル及び多価アルコール（グリセリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール及びトレハロース等）とのモノエステル等が挙げられる。これらのうち、生理活性維持の観点から、アルキルエステル及び多価アルコールエステルが好ましく、さらに好ましくはメチルエステル、エチルエステル及びグリセリンモノエステル、次にさらに好ましくはメチルエステル及びエチルエステル、特に好ましくはエチルエステルである。
【００２０】
α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルは、１種のみを使用してもよく、２種以上の混合物を使用してもよい。安全性の観点から、１種のみを使用することが好ましい。
【００２１】
本発明の凍結乾燥用保護剤の第二の成分は糖類である。糖類としては、凍結乾燥用保護剤として公知の糖類であればいずれでも良く、スクロース、トレハロース、マントース、ラクトース、ラフィノース及びグルコース等が挙げられる。このうち、入手しやすさの観点から、スクロース、トレハロース及びラクトースが好ましい。
【００２２】
本発明の凍結乾燥用保護剤には、水及び／又は水性溶媒を含んでもよい。水性溶媒としては、緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び硼酸緩衝液等）及び水混和性有機溶剤（メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド及びジメチルフォルムアミド等）等が挙げられる。
【００２３】
凍結乾燥保護剤中に水及び／又は水性溶媒を含む場合、その含有量（重量％）は、乾燥時間の効率化の観点から、凍結乾燥保護剤の重量を基準として８０〜９９．９が好ましく、さらに好ましくは９０〜９９．８、次にさらに好ましくは９５〜９９．７である。
【００２４】
本発明の凍結乾燥用保護剤において、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルの含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、凍結乾燥用保護剤の重量を基準として、０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１５が好ましく、次にさらに好ましくは０．１５〜１０である。
【００２５】
また、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルの含有量（重量％）は、生理活性の維持の観点から、凍結乾燥用水溶液（生理活性物質、水及び凍結乾燥用保護剤の混合溶液）の重量の合計を基準として、０．０１〜５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜４、次にさらに好ましくは０．１５〜３である。
【００２６】
本発明の凍結乾燥用保護剤において、糖類の含有量（重量％）は、生理活性の維持の観点から、凍結乾燥用保護剤の重量を基準として、０．１〜７０が好ましく、さらに好ましくは０．１５〜３０で、次にさらに好ましくは０．２〜２５である。
【００２７】
また、糖類の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、凍結乾燥用水溶液（生理活性物質、水及び凍結乾燥用保護剤）の重量の合計を基準として、０．１〜５が好ましく、さらに好ましくは０．１５〜４、次にさらに好ましくは０．２〜３である。
【００２８】
本発明の凍結乾燥用保護剤中の、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類との重量比（アルギニンエステルの重量／糖類の重量）は、凍結乾燥における生理活性物質の安定化効果及び得られる生理活性物質の吸湿性の観点から、１／９９〜７０／３０が好ましく、さらに好ましくは５／９５〜５０／５０、最も好ましくは１０／９０〜３０／７０である。
【００２９】
生理活性物質及び水を含む混合物には水性溶媒を含有してもよい。水性溶媒としては、緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び硼酸緩衝液等）及び水混和性有機溶剤（メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド及びジメチルフォルムアミド等）等が挙げられる。
水性溶媒を含む場合の添加量は、生理活性の維持の観点から、生理活性物質及び水を含む混合物と凍結乾燥用保護剤を合わせた１００重量部に対して０〜１０重量部が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量部である。
【００３０】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類、並びに必要により水及び水性溶媒とを均一混合することにより容易に得られる。
α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類、並びに必要により水及び水性溶媒とを均一混合する方法としては、特に限定されないが、容易かつ短時間で均一に混合できるという観点等から、アルギニンエステルと水を混合し、必要により水性溶媒を混合した後、糖類を混合する方法が好ましい。このとき、糖類が水溶液であると、さらに混合性が優れる。
均一混合する際の温度及び時間には制限はなく、製造する規模や設備等に応じて適宜決めることができ、例えば、製造規模が数ｋｇ程度の場合、５〜４０℃で０．１〜５時間程度が好ましい。
【００３１】
混合装置としては、撹拌機又は分散機等が使用できる。
撹拌機としては、メカニカルスターラー及びマグネチックスターラー等が含まれる。
分散機としては、ホモジナイザー、超音波分散機、ボールミル及びビーズミル等が含まれる。
【００３２】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、生理活性物質及び水を含む混合物を凍結乾燥する際に使用するものであり、公知｛特表平８−５０４７８４号公報（ＷＯ９４／１４４６５パンフレット）等｝の凍結乾燥において、公知の凍結乾燥用保護剤に代えて使用する方法等で使用できる。
【００３３】
本発明の別の実施態様は、上記の凍結乾燥用保護剤を用いて、生理活性物質及び水を含む混合物を凍結乾燥する生理活性物質の製造方法である。
【００３４】
本発明の生理活性物質の製造方法において、凍結乾燥用保護剤の使用量（重量％）は、生理活性物質の重量に基づいて、１〜１，０００が好ましく、さらに好ましくは１０〜５００、次に好ましくは３０〜３００、特に好ましくは６０〜１００、最も好ましくは６４〜８１である。この範囲であると、生理活性（力価）の保持率がさらに良好となる。
【００３５】
本発明の凍結乾燥用保護剤と、生理活性物質及び水を含む混合物とは、凍結乾燥する直前に均一混合してもよいし、それより前の工程で均一混合してもよい。
【００３６】
凍結乾燥の条件（温度、減圧度等）は制限がないが、公知｛特表平８−５０４７８４号公報（ＷＯ９４／１４４６５パンフレット）等記載｝の方法が利用できる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部を意味する。
【００３８】
＜製造例１＞
Ｎ−α−アセチルアルギニン（エムピーバイオジャパン社製）１２．６部（０．０５モル部）、メタンスルホン酸１部及びエタノール９２部（２モル部）を均一混合し、８０℃で５時間加熱撹拌し、エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）を得た。
【００３９】
＜製造例２＞
製造例１において、エタノール９２部（２モル部）をメタノール６４部（２モル部）に変更する以外は製造例１と同様におこない、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンメチルエステル｝（２）を得た。
【００４０】
＜製造例３＞
製造例１において、エタノール９２部（２モル部）をグリセリン１８４部（２モル部）に変更する以外は製造例１と同様におこない、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンモノグリセリンエステル｝（３）を得た。
【００４１】
＜製造例４＞
アルギニンエチルエステル（和光純薬工業製）２０部（０．１モル部）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸６９部（０．５モル部）、エタノール１８４部（４モル部）を均一溶解させ、８０℃で５時間還流し、エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、｛Ｎ−α−ｐ−ヒドロキシベンゾイルアルギニンエチルエステル｝（４）を得た。
【００４２】
［酵素の凍結乾燥保存］
＜実施例１＞
リゾチーム（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）５０ｍｇをイオン交換水５ｇに溶解させリゾチーム水溶液を得た。製造例１で得た｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）を３０ｍｇをイオン交換水５ｇに溶解させ、さらにスクロース１２０ｍｇを加え溶解させた凍結乾燥用保護剤に、リゾチーム水溶液５ｇを混合して凍結乾燥用水溶液を調製した。この水溶液を容積２０ｍＬの密栓付きガラス瓶に移し、このガラス瓶を凍結乾燥機（アルバック製ＤＦ−０１Ｈ）内に移し、−４０℃で３時間凍結させた。その後、常温で減圧下（１３．３Ｐａ）、３０時間かけて凍結乾燥して、乾燥体を得た。引き続き、乾燥体を、五酸化リンが入ったデシケーター内で２０℃で３日間保存して、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００４３】
＜実施例２＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを５００ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを３００ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−２）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：５重量％、糖類の濃度：３重量％、濃度比：６３／３７）
【００４４】
＜実施例３＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを１ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−３）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．０１重量％、糖類の濃度：０．２重量％、濃度比：５／９５）
【００４５】
＜実施例４＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを４０ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを５００ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−４）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．４重量％、糖類の濃度：５重量％、濃度比：７／９３）
【００４６】
＜実施例５＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを２０ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを１０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−５）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．２重量％、糖類の濃度：０．１重量％、濃度比：６７／３３）
【００４７】
＜実施例６＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝の添加量３０ｍｇを１ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを９９ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−６）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．０１重量％、糖類の濃度：０．９９重量％、濃度比：１／９９）
【００４８】
＜実施例７＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝の添加量３０ｍｇを７０ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを３０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−７）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．７重量％、糖類の濃度：０．３重量％、濃度比：７０／３０）
【００４９】
＜実施例８＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、｛Ｎ−α−ベンゾイルアルギニンエチルエステル｝（エムピーバイオジャパン社製）３０ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−８）を得た。（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５０】
＜実施例９＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、製造例２で得た｛Ｎ−α−アセチルアルギニンメチルエステル｝（２）を３０ｍｇ使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−９）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５１】
＜実施例１０＞
実施例１において、スクロースをトレハロース１２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１０）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５２】
＜実施例１１＞
実施例１において、スクロースをラクトース１２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１１）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５３】
＜実施例１２＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンモノグリセリンエステル｝（３）３０ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１２）を得た。（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５４】
＜実施例１３＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、｛Ｎ−α−ｐ−ヒドロキシベンゾイルアルギニンエチルエステル｝（４）を使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１３）を得た。（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５５】
＜実施例１４＞
実施例１において、リゾチームをコレステロールオキシダーゼ（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）５０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（Ｒ−１４）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５６】
［組み換えタンパク質の凍結乾燥保存］
＜実施例１５＞
実施例１において、リゾチームを組み換え型ヒト骨形成因子ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製、大腸菌由来）５０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥ＢＭＰ−２（Ｒ−１５）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５７】
［抗体の凍結乾燥保存］
＜実施例１６＞
実施例１において、リゾチームを抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＣｒｙＪ１ ｍＡｂ ０２６抗体：生化学工業社製）５０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（Ｒ−１６）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５８】
＜比較例１＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝を加えないこと以外は実施例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−１）を得た。
【００５９】
＜比較例２＞
｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝を加えず、スクロースをトレハロース１２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−２）を得た。
【００６０】
＜比較例３＞
スクロースを加えないこと以外は実施例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−３）を得た。
【００６１】
＜比較例４＞
リゾチームをコレステロールオキシターゼ５０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−４）を得た。
【００６２】
＜比較例５＞
リゾチームをコレステロールオキシターゼ５０ｍｇに変更する以外は比較例３と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−５）を得た。
【００６３】
＜比較例６＞
リゾチームを組み換え型ヒト骨形成因子ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製、大腸菌由来）５０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−６）を得た。
【００６４】
＜比較例７＞
リゾチームを組み換え型ヒト骨形成因子ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製、大腸菌由来）５０ｍｇに変更する以外は比較例３と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−７）を得た。
【００６５】
＜比較例８＞
リゾチームを抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（生化学工業社製）５０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−８）を得た。
【００６６】
＜比較例９＞
リゾチームを抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（生化学工業社製）５０ｍｇに変更する以外は比較例３と同様に行い、比較用の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−９）を得た。
【００６７】
実施例及び比較例で得た凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）〜（Ｒ−１３）、（ＨＲ−１）〜（ＨＲ−３）、実施例及び比較例で得た凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（Ｒ−１４）、（ＨＲ−４）〜（ＨＲ−５）、実施例及び比較例で得た凍結乾燥ＢＭＰ−２（Ｒ−１５）、（ＨＲ−６）〜（ＨＲ−７）、及び実施例及び比較例で得た凍結乾燥抗ヒト血液型Ａ分泌型モノクローナル抗体（Ｒ−１６）、（ＨＲ−８）〜（ＨＲ−９）について、吸湿性を評価し表１及び表２にまとめた。また、凍結乾燥直後の酵素活性（力価）保持率及び２５℃で６ヶ月間保存した場合の酵素活性（力価）保持率を測定し、合わせて表１及び表２にまとめた。
【００６８】
＜吸湿性の評価＞
測定試料（凍結乾燥リゾチーム、凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ、凍結乾燥ＢＭＰ−２又は凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体）５０ｍｇをスクリュー管に取り、２０℃で開栓したまま２週間放置した。その後、微量水分測定装置（平沼産業株式会社製、ＡＱ−３００）で測定試料中の水分をそれぞれ２回測定し、平均値を算出した。
【００６９】
吸湿性の評価は下記の通り行った。
◎：水分が３重量％未満
○：水分が３重量％以上５重量％未満
×：水分が５重量％以上
【００７０】
＜凍結乾燥リゾチームの酵素活性（力価）保持率の測定＞
測定試料（凍結乾燥リゾチーム）１６ｍｇを、５ｇのイオン交換水に溶解させた後、この水溶液１０μＬを、３０℃の０．４％枯草菌懸濁液（２０％枯草菌懸濁液１ｍｌ、イオン交換水４６．５ｍＬ及び１モル／Ｌリン酸カリウム水溶液２．５ｍＬを均一混合したもの）３ｍＬに加えて、測定液を得た。
直ちに、この測定液について、３０℃で、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を測定し、さらに３０℃で５分間放置後にもう一度、３０℃で吸光度（Ａ５）を測定し、これらの差（Ａ５−Ａ０）（ΔＡ）を算出した。
【００７１】
一方、測定試料（凍結乾燥リゾチーム）をリゾチーム（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ａ５−Ａ０）（ΔＡｂ）を算出し、次式から酵素活性保持率を算出した。
【００７２】
酵素活性保持率（％）＝（ΔＡ／ΔＡｂ） ×１００
【００７３】
＜凍結乾燥コレステロールオキシダーゼの酵素活性（力価）保持率の測定＞
測定試料（凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ）１６ｍｇを、５ｇのイオン交換水に溶解させて、酵素水溶液を調製した。
一方、コール酸ナトリウム７８ｍｇ（０．１８ミリモル、６０ミリモル／Ｌ）、ノニルフェノールエチレンオキシド付加物｛ユニオンカーバイドアンドプラスチック社製、商品名：トライトンＸ−１００｝９ｍｇ（０．３重量％）、アミノアンチピリン０．８５ｍｇ（０．００４ミリモル、１．４ミリモル／Ｌ）、フェノール５．９ｍｇ（０．０６３ミリモル、２１ミリモル／Ｌ）、ペルオキシダーゼ｛東洋紡社製｝１５ｕｎｉｔｓ（５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、コレステロール１．０ｍｇ（０．００２７ミリモル、０．９ミリモル／Ｌ）及び５０ミリモル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３ｍＬを均一混合して、基質溶液を調製した。なお、カッコ内に記載した濃度は、リン酸緩衝液に対する濃度を表す。
【００７４】
ついで、酵素水溶液１０μＬを基質溶液３ｍＬに加えて、測定液を得た。直ちに、この測定液について、３０℃で、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で５００ｎｍにおける吸光度（Ｂ０）を測定し、さらに３０℃で５分間放置後にもう一度、３０℃で吸光度（Ｂ５）を測定し、これらの差（Ｂ５−Ｂ０）（ΔＢ）を算出した。
【００７５】
一方、測定試料（凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ）をコレステロールオキシダーゼ（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｂ５−Ｂ０）（ΔＢｂ）を算出し、次式から酵素活性保持率を算出した。
【００７６】
酵素活性保持率（％）＝（ΔＢ／ΔＢｂ） ×１００
【００７７】
＜凍結乾燥ＢＭＰ−２の活性（力価）保持率の測定＞
ＢＭＰ−２の活性測定は公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２（１９９０）２９５−２９９）と同様に下記の通り行った。
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ品）を２ミリモル／Ｌのグルタミン、１ミリモル／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０重量％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）中で３７℃、１０重量％二酸化炭素条件下培養した。２４穴プレートに１×１０5個のＣ２Ｃ１２細胞を含む培地を注ぎ培養し、３７℃、２４時間後に凍結乾燥ＢＭＰ−２を含む新しい前述の培地（凍結乾燥ＢＭＰ−２の濃度：０．００１重量％）で培地交換した。４日後、タンパク抽出用溶液（０．１モル／Ｌのグリセロール、ｐＨ９．６、１重量％のＮＰ−４０、１ミリモル／Ｌの塩化マグネシウム、１ミリモルの塩化亜鉛を含む）０．２ｍＬをプレートに加え１時間静置した。静置後プレート上のタンパク抽出液５０μＬを０．３ミリモル／Ｌのｐ−ニトロフェニルフォスフェート（シグマ社製）をタンパク抽出用溶液に溶解させた溶液１５０μＬに加え、９６穴プレートで３７℃、放置した。マイクロリーダー（和光純薬工業製、サンライズサーモ）で加えた直後の４０５ｎｍにおける吸光度（Ｃ０）を測定し、さらに３７℃で３０分間放置後にもう一度、３７℃で吸光度（Ｃ３０）を測定し、これらの差（Ｃ３０−Ｃ０）（ΔＣ）を算出した。
【００７８】
一方、測定試料（凍結乾燥ＢＭＰ−２）をＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製）に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｃ３０−Ｃ０）（ΔＣｂ）を算出し、次式から活性保持率を算出した。
【００７９】
活性保持率（％）＝（ΔＣ／ΔＣｂ） ×１００
【００８０】
＜凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体の活性（力価）保持率の測定＞
抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体の活性は下記の通りＥＬＩＳＡ法で測定した。
ＰＢＳで１０００倍に希釈したスギ花粉アレルゲンＣｒｙＪ１溶液を９６穴マイクロプレートに１穴につき５０μＬずつ加え、プレートシールで上面をシールし、２０℃で２時間静置した。サンプル溶液を除去した後、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）でウェルを処理し、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で１０μｇ／ｍＬとなるように希釈した凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体溶液を５０μｌ加え、２０℃で４時間静置した。次に、西洋わさびペルオキシターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１，０００倍の濃度に希釈し、プレートに１穴につき５０μＬずつ加えた。プレートシールで上面をシールし、室温で４時間静置した。抗体をプレートから除去し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、フェニレンジアミン溶液を１穴につき２００μＬずつ加え、２０分間静置した。２Ｎ硫酸を１穴につき１００μＬずつ加え、直後の４９２ｎｍの吸光度（Ｄ０）を測定し、さらに２０℃で２０分間放置後にもう一度、２０℃で吸光度（Ｄ２０）を測定し、これらの差（Ｄ２０−Ｄ０）（ΔＤ）を算出した。
【００８１】
一方、測定試料（凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体）を抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｄ２０−Ｄ０）（ΔＤｂ）を算出し、次式から活性保持率を算出した。
【００８２】
活性保持率（％）＝（ΔＤ／ΔＤｂ） ×１００
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
表１及び表２から、比較の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−１）、（ＨＲ−２）、比較の凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（ＨＲ−４）、比較の凍結乾燥ＢＭＰ（ＨＲ−６）及び比較の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−８）は、凍結乾燥後の酵素活性又は力価の保持率が低い。さらに全ての比較の凍結乾燥リゾチーム、比較の凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ、比較の凍結乾燥ＢＭＰ及び比較の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体は経時的に酵素活性が低下することがわかる。一方、本発明の凍結乾燥用保護剤を用いて得られたものは、凍結乾燥後の酵素活性又は力価の保持率が高く、経時的な酵素活性又は力価の低下も抑えられている。
また、本発明の凍結乾燥用保護剤を使用した凍結乾燥酵素、凍結乾燥組み換えタンパク質及び凍結乾燥抗体は吸湿性が低いことがわかる。一方、比較の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−３）、比較の凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（ＨＲ−５）、比較の凍結乾燥ＢＭＰ（ＨＲ−７）及び比較の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−９）は吸湿性が高い。
すなわち、本発明の凍結乾燥用保護剤を用いて得られたものは、凍結乾燥後の酵素活性又は力価の保持率が高く、経時的な酵素活性又は力価の低下も抑えられ、さらに、吸湿性が低い。これら全てを満足するものは、比較の凍結乾燥用保護剤を用いて得られたものには、無いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、タンパク質などの生理活性物質を凍結乾燥する過程において使用できる。生理活性物質としては、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド及びコラーゲン等のタンパク質、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等の多糖類、アミノ酸、核酸、抗生物質及びビタミン類が挙げられる。また、本発明の生理活性物質の製造方法は、凍結乾燥時に生理活性物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しない。さらに凍結乾燥物は吸湿性が非常に少ないので、特に食品、医薬品、化粧品及び生化学の分野において有効に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥用保護剤及び生理活性物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性物質（酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド等）は各種研究開発、診断・検査薬、医薬品等として広く利用されている。そして、製造工程中や保存期間中に、生理活性物質の生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。
そのため、生理活性物質を製造する際に水分を除いて生理活性の低下を抑える目的で、凍結乾燥工程が行われる。
凍結乾燥工程中や保存期間中に生理活性物質の生理活性（力価）を損なわないために、凍結乾燥用保護剤が使用される。凍結乾燥用保護剤としては、例えば、糖類（マントース、ラフィノース、スクロース、トレハロース）等が知られている。（特許文献１）。
なお、凍結乾燥用保護剤を使用して得られた生理活性物質は、室温で空気中に放置した場合、経時的に吸湿しないことが必要である。吸湿性があると、凍結乾燥物を少量のバイアル等に保存し、使用時に全量使用するような場合では問題にならないが、大容量の容器に保存し使用時に少量ずつ使用する場合、吸湿しないように低温下で行わなければならない等の使用上の制限がある。
【０００３】
【特許文献１】特表平８−５０４７８４号公報（ＷＯ９４／１４４６５パンフレット）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の凍結乾燥薬理製剤を用いても、保存期間中に、非耐熱性物質の生理活性が損なわれ、生理活性（力価）が１０％程度しか保持されないという問題点がある。
本発明の目的は、生理活性物質の凍結乾燥時及び保存中に活性の低下を抑制し、かつ吸湿性がなく常温で容易に取り扱うことができる凍結乾燥用保護剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明の凍結乾燥用保護剤の特徴は、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥させる際に生理活性物質が変質することを防止するための保護剤であって、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する点を要旨とする。
【０００６】
また、本発明の生理活性物質の製造方法は、α位のアミノ基が変性されたアミノ酸エステルと糖類とを含有する凍結乾燥用保護剤の存在下、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥して、生理活性物質を製造する点を要旨とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥する際に、生理活性物質が変質することを防止することができる。そして、得られる生理活性物質は、長期間保存しても、生理活性（力価）がほとんど低下しない。また、得られる生理活性物質は吸湿性が低く、取り扱いが容易である。
従って、本発明の保護剤は、生理活性物質（酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等）を製造する際に極めて有用であり、本発明の製造方法で得られる生理活性物質は、生理活性物質を用いる分野（各種研究開発、診断・検査薬、医薬品、化粧品等）において極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、生理活性物質及び水を含む混合物を凍結乾燥して生理活性物質を精製する過程において使用するものであり、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する。
【０００９】
生理活性物質としては限定されないが、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド等が含まれる。
【００１０】
酵素としては、酸化還元酵素（コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等）、加水分解酵素（リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等）、異性化酵素（グルコースイソメラーゼ等）、転移酵素（アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等）、合成酵素（脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等）及び脱離酵素（ペクチンリアーゼ等）等が挙げられる。
【００１１】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤｛骨形成因子（ＢＭＰ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝及びワクチン（Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等）等が挙げられる。
【００１２】
抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体等が挙げられる。
【００１３】
ペプチドとしては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
【００１４】
これらの生理活性物質のうち、生理活性維持の観点から、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、さらに好ましくは酵素及び組み換えタンパク質、次にさらに好ましくは酵素、特に好ましくは酸化還元酵素及び加水分解酵素、最も好ましくは酸化還元酵素である。
【００１５】
水としては、特に限定されない。水の電気伝導率（μＳ／ｃｍ；２５℃）は、安全性の観点から、０．０５５〜１が好ましく、さらに好ましくは０．０５６〜０．１、特に好ましくは０．０５７〜０．０８である。このような電気伝導率が小さい水としては、イオン交換水等が使用できる。
【００１６】
本発明の凍結乾燥用保護剤の第一の成分はα位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルである。α位のアミノ基を変性することは、実施可能なｐＨ領域が広がる点や、生理活性物質の活性を維持する上で有用である。
α位のアミノ基が変性されたアミノ基としては、アシルアミノ基、アルキルアミノ基等が挙げられ、安全性の観点から、一般式（１）で表されるアシルアミノ基が好ましい。
【００１７】
−ＮＨＣＯＲ （１）
【００１８】
一般式（１）中、Ｒは水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基を表す。
Ｒとして具体的に、水素原子、アルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ペンチル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、ヘプタデセニル基及びヘンイコシル基等）、アリール基（フェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、メトキシフェニル基及びメチルフェニル基等）が挙げられる。これらのうち、水溶性及び安全性の観点から、メチル基、エチル基、フェニル基及びｐ−ヒドロキシフェニル基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、次にさらに好ましくはメチル基である。
【００１９】
アルギニンエステルとしては、アルキル（メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、オクチル、ノニル、デシル、ラウリル、パルミチル、ステアリル、オレイル及びベヘニル等）エステル、アリール（フェニル、メトキシフェニル、ベンジル及びメチルフェニル等）エステル及び多価アルコール（グリセリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール及びトレハロース等）とのモノエステル等が挙げられる。これらのうち、生理活性維持の観点から、アルキルエステル及び多価アルコールエステルが好ましく、さらに好ましくはメチルエステル、エチルエステル及びグリセリンモノエステル、次にさらに好ましくはメチルエステル及びエチルエステル、特に好ましくはエチルエステルである。
【００２０】
α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルは、１種のみを使用してもよく、２種以上の混合物を使用してもよい。安全性の観点から、１種のみを使用することが好ましい。
【００２１】
本発明の凍結乾燥用保護剤の第二の成分は糖類である。糖類としては、凍結乾燥用保護剤として公知の糖類であればいずれでも良く、スクロース、トレハロース、マントース、ラクトース、ラフィノース及びグルコース等が挙げられる。このうち、入手しやすさの観点から、スクロース、トレハロース及びラクトースが好ましい。
【００２２】
本発明の凍結乾燥用保護剤には、水及び／又は水性溶媒を含んでもよい。水性溶媒としては、緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び硼酸緩衝液等）及び水混和性有機溶剤（メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド及びジメチルフォルムアミド等）等が挙げられる。
【００２３】
凍結乾燥保護剤中に水及び／又は水性溶媒を含む場合、その含有量（重量％）は、乾燥時間の効率化の観点から、凍結乾燥保護剤の重量を基準として８０〜９９．９が好ましく、さらに好ましくは９０〜９９．８、次にさらに好ましくは９５〜９９．７である。
【００２４】
本発明の凍結乾燥用保護剤において、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルの含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、凍結乾燥用保護剤の重量を基準として、０．０１〜３０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１５が好ましく、次にさらに好ましくは０．１５〜１０である。
【００２５】
また、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルの含有量（重量％）は、生理活性の維持の観点から、凍結乾燥用水溶液（生理活性物質、水及び凍結乾燥用保護剤の混合溶液）の重量の合計を基準として、０．０１〜５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜４、次にさらに好ましくは０．１５〜３である。
【００２６】
本発明の凍結乾燥用保護剤において、糖類の含有量（重量％）は、生理活性の維持の観点から、凍結乾燥用保護剤の重量を基準として、０．１〜７０が好ましく、さらに好ましくは０．１５〜３０で、次にさらに好ましくは０．２〜２５である。
【００２７】
また、糖類の含有量（重量％）は、ハンドリング性の観点から、凍結乾燥用水溶液（生理活性物質、水及び凍結乾燥用保護剤）の重量の合計を基準として、０．１〜５が好ましく、さらに好ましくは０．１５〜４、次にさらに好ましくは０．２〜３である。
【００２８】
本発明の凍結乾燥用保護剤中の、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類との重量比（アルギニンエステルの重量／糖類の重量）は、凍結乾燥における生理活性物質の安定化効果及び得られる生理活性物質の吸湿性の観点から、１／９９〜７０／３０が好ましく、さらに好ましくは５／９５〜５０／５０、最も好ましくは１０／９０〜３０／７０である。
【００２９】
生理活性物質及び水を含む混合物には水性溶媒を含有してもよい。水性溶媒としては、緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び硼酸緩衝液等）及び水混和性有機溶剤（メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド及びジメチルフォルムアミド等）等が挙げられる。
水性溶媒を含む場合の添加量は、生理活性の維持の観点から、生理活性物質及び水を含む混合物と凍結乾燥用保護剤を合わせた１００重量部に対して０〜１０重量部が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量部である。
【００３０】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類、並びに必要により水及び水性溶媒とを均一混合することにより容易に得られる。
α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類、並びに必要により水及び水性溶媒とを均一混合する方法としては、特に限定されないが、容易かつ短時間で均一に混合できるという観点等から、アルギニンエステルと水を混合し、必要により水性溶媒を混合した後、糖類を混合する方法が好ましい。このとき、糖類が水溶液であると、さらに混合性が優れる。
均一混合する際の温度及び時間には制限はなく、製造する規模や設備等に応じて適宜決めることができ、例えば、製造規模が数ｋｇ程度の場合、５〜４０℃で０．１〜５時間程度が好ましい。
【００３１】
混合装置としては、撹拌機又は分散機等が使用できる。
撹拌機としては、メカニカルスターラー及びマグネチックスターラー等が含まれる。
分散機としては、ホモジナイザー、超音波分散機、ボールミル及びビーズミル等が含まれる。
【００３２】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、生理活性物質及び水を含む混合物を凍結乾燥する際に使用するものであり、公知｛特表平８−５０４７８４号公報（ＷＯ９４／１４４６５パンフレット）等｝の凍結乾燥において、公知の凍結乾燥用保護剤に代えて使用する方法等で使用できる。
【００３３】
本発明の別の実施態様は、上記の凍結乾燥用保護剤を用いて、生理活性物質及び水を含む混合物を凍結乾燥する生理活性物質の製造方法である。
【００３４】
本発明の生理活性物質の製造方法において、凍結乾燥用保護剤の使用量（重量％）は、生理活性物質の重量に基づいて、１〜１，０００が好ましく、さらに好ましくは１０〜５００、次に好ましくは３０〜３００、特に好ましくは６０〜１００、最も好ましくは６４〜８１である。この範囲であると、生理活性（力価）の保持率がさらに良好となる。
【００３５】
本発明の凍結乾燥用保護剤と、生理活性物質及び水を含む混合物とは、凍結乾燥する直前に均一混合してもよいし、それより前の工程で均一混合してもよい。
【００３６】
凍結乾燥の条件（温度、減圧度等）は制限がないが、公知｛特表平８−５０４７８４号公報（ＷＯ９４／１４４６５パンフレット）等記載｝の方法が利用できる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、特記しない限り部は重量部を意味する。
【００３８】
＜製造例１＞
Ｎ−α−アセチルアルギニン（エムピーバイオジャパン社製）１２．６部（０．０５モル部）、メタンスルホン酸１部及びエタノール９２部（２モル部）を均一混合し、８０℃で５時間加熱撹拌し、エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）を得た。
【００３９】
＜製造例２＞
製造例１において、エタノール９２部（２モル部）をメタノール６４部（２モル部）に変更する以外は製造例１と同様におこない、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンメチルエステル｝（２）を得た。
【００４０】
＜製造例３＞
製造例１において、エタノール９２部（２モル部）をグリセリン１８４部（２モル部）に変更する以外は製造例１と同様におこない、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンモノグリセリンエステル｝（３）を得た。
【００４１】
＜製造例４＞
アルギニンエチルエステル（和光純薬工業製）２０部（０．１モル部）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸６９部（０．５モル部）、エタノール１８４部（４モル部）を均一溶解させ、８０℃で５時間還流し、エバポレーターで濃縮後、水から再結晶し、減圧乾燥（６０℃、２０Ｐａ）して、｛Ｎ−α−ｐ−ヒドロキシベンゾイルアルギニンエチルエステル｝（４）を得た。
【００４２】
［酵素の凍結乾燥保存］
＜実施例１＞
リゾチーム（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）５０ｍｇをイオン交換水５ｇに溶解させリゾチーム水溶液を得た。製造例１で得た｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）を３０ｍｇをイオン交換水５ｇに溶解させ、さらにスクロース１２０ｍｇを加え溶解させた凍結乾燥用保護剤に、リゾチーム水溶液５ｇを混合して凍結乾燥用水溶液を調製した。この水溶液を容積２０ｍＬの密栓付きガラス瓶に移し、このガラス瓶を凍結乾燥機（アルバック製ＤＦ−０１Ｈ）内に移し、−４０℃で３時間凍結させた。その後、常温で減圧下（１３．３Ｐａ）、３０時間かけて凍結乾燥して、乾燥体を得た。引き続き、乾燥体を、五酸化リンが入ったデシケーター内で２０℃で３日間保存して、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００４３】
＜実施例２＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを５００ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを３００ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−２）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：５重量％、糖類の濃度：３重量％、濃度比：６３／３７）
【００４４】
＜実施例３＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを１ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−３）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．０１重量％、糖類の濃度：０．２重量％、濃度比：５／９５）
【００４５】
＜実施例４＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを４０ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを５００ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−４）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．４重量％、糖類の濃度：５重量％、濃度比：７／９３）
【００４６】
＜実施例５＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の添加量３０ｍｇを２０ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを１０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−５）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．２重量％、糖類の濃度：０．１重量％、濃度比：６７／３３）
【００４７】
＜実施例６＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝の添加量３０ｍｇを１ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを９９ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−６）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．０１重量％、糖類の濃度：０．９９重量％、濃度比：１／９９）
【００４８】
＜実施例７＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝の添加量３０ｍｇを７０ｍｇに変更し、スクロースの添加量１２０ｍｇを３０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−７）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．７重量％、糖類の濃度：０．３重量％、濃度比：７０／３０）
【００４９】
＜実施例８＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、｛Ｎ−α−ベンゾイルアルギニンエチルエステル｝（エムピーバイオジャパン社製）３０ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−８）を得た。（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５０】
＜実施例９＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、製造例２で得た｛Ｎ−α−アセチルアルギニンメチルエステル｝（２）を３０ｍｇ使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−９）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５１】
＜実施例１０＞
実施例１において、スクロースをトレハロース１２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１０）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５２】
＜実施例１１＞
実施例１において、スクロースをラクトース１２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１１）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５３】
＜実施例１２＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンモノグリセリンエステル｝（３）３０ｍｇを使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１２）を得た。（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５４】
＜実施例１３＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝（１）の代わりに、｛Ｎ−α−ｐ−ヒドロキシベンゾイルアルギニンエチルエステル｝（４）を使用する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１３）を得た。（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５５】
＜実施例１４＞
実施例１において、リゾチームをコレステロールオキシダーゼ（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）５０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（Ｒ−１４）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５６】
［組み換えタンパク質の凍結乾燥保存］
＜実施例１５＞
実施例１において、リゾチームを組み換え型ヒト骨形成因子ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製、大腸菌由来）５０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥ＢＭＰ−２（Ｒ−１５）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５７】
［抗体の凍結乾燥保存］
＜実施例１６＞
実施例１において、リゾチームを抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＣｒｙＪ１ ｍＡｂ ０２６抗体：生化学工業社製）５０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（Ｒ−１６）を得た。
（凍結乾燥用水溶液中のアルギニンエステルの濃度：０．３重量％、糖類の濃度：１．２重量％、濃度比：２０／８０）
【００５８】
＜比較例１＞
実施例１において、｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝を加えないこと以外は実施例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−１）を得た。
【００５９】
＜比較例２＞
｛Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル｝を加えず、スクロースをトレハロース１２０ｍｇに変更する以外は実施例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−２）を得た。
【００６０】
＜比較例３＞
スクロースを加えないこと以外は実施例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−３）を得た。
【００６１】
＜比較例４＞
リゾチームをコレステロールオキシターゼ５０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−４）を得た。
【００６２】
＜比較例５＞
リゾチームをコレステロールオキシターゼ５０ｍｇに変更する以外は比較例３と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−５）を得た。
【００６３】
＜比較例６＞
リゾチームを組み換え型ヒト骨形成因子ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製、大腸菌由来）５０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−６）を得た。
【００６４】
＜比較例７＞
リゾチームを組み換え型ヒト骨形成因子ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製、大腸菌由来）５０ｍｇに変更する以外は比較例３と同様に行い、比較用の凍結乾燥コレステロールオキシターゼ（ＨＲ−７）を得た。
【００６５】
＜比較例８＞
リゾチームを抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（生化学工業社製）５０ｍｇに変更する以外は比較例１と同様に行い、比較用の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−８）を得た。
【００６６】
＜比較例９＞
リゾチームを抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（生化学工業社製）５０ｍｇに変更する以外は比較例３と同様に行い、比較用の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−９）を得た。
【００６７】
実施例及び比較例で得た凍結乾燥リゾチーム（Ｒ−１）〜（Ｒ−１３）、（ＨＲ−１）〜（ＨＲ−３）、実施例及び比較例で得た凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（Ｒ−１４）、（ＨＲ−４）〜（ＨＲ−５）、実施例及び比較例で得た凍結乾燥ＢＭＰ−２（Ｒ−１５）、（ＨＲ−６）〜（ＨＲ−７）、及び実施例及び比較例で得た凍結乾燥抗ヒト血液型Ａ分泌型モノクローナル抗体（Ｒ−１６）、（ＨＲ−８）〜（ＨＲ−９）について、吸湿性を評価し表１及び表２にまとめた。また、凍結乾燥直後の酵素活性（力価）保持率及び２５℃で６ヶ月間保存した場合の酵素活性（力価）保持率を測定し、合わせて表１及び表２にまとめた。
【００６８】
＜吸湿性の評価＞
測定試料（凍結乾燥リゾチーム、凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ、凍結乾燥ＢＭＰ−２又は凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体）５０ｍｇをスクリュー管に取り、２０℃で開栓したまま２週間放置した。その後、微量水分測定装置（平沼産業株式会社製、ＡＱ−３００）で測定試料中の水分をそれぞれ２回測定し、平均値を算出した。
【００６９】
吸湿性の評価は下記の通り行った。
◎：水分が３重量％未満
○：水分が３重量％以上５重量％未満
×：水分が５重量％以上
【００７０】
＜凍結乾燥リゾチームの酵素活性（力価）保持率の測定＞
測定試料（凍結乾燥リゾチーム）１６ｍｇを、５ｇのイオン交換水に溶解させた後、この水溶液１０μＬを、３０℃の０．４％枯草菌懸濁液（２０％枯草菌懸濁液１ｍｌ、イオン交換水４６．５ｍＬ及び１モル／Ｌリン酸カリウム水溶液２．５ｍＬを均一混合したもの）３ｍＬに加えて、測定液を得た。
直ちに、この測定液について、３０℃で、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で４５０ｎｍにおける吸光度（Ａ０）を測定し、さらに３０℃で５分間放置後にもう一度、３０℃で吸光度（Ａ５）を測定し、これらの差（Ａ５−Ａ０）（ΔＡ）を算出した。
【００７１】
一方、測定試料（凍結乾燥リゾチーム）をリゾチーム（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ａ５−Ａ０）（ΔＡｂ）を算出し、次式から酵素活性保持率を算出した。
【００７２】
酵素活性保持率（％）＝（ΔＡ／ΔＡｂ） ×１００
【００７３】
＜凍結乾燥コレステロールオキシダーゼの酵素活性（力価）保持率の測定＞
測定試料（凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ）１６ｍｇを、５ｇのイオン交換水に溶解させて、酵素水溶液を調製した。
一方、コール酸ナトリウム７８ｍｇ（０．１８ミリモル、６０ミリモル／Ｌ）、ノニルフェノールエチレンオキシド付加物｛ユニオンカーバイドアンドプラスチック社製、商品名：トライトンＸ−１００｝９ｍｇ（０．３重量％）、アミノアンチピリン０．８５ｍｇ（０．００４ミリモル、１．４ミリモル／Ｌ）、フェノール５．９ｍｇ（０．０６３ミリモル、２１ミリモル／Ｌ）、ペルオキシダーゼ｛東洋紡社製｝１５ｕｎｉｔｓ（５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、コレステロール１．０ｍｇ（０．００２７ミリモル、０．９ミリモル／Ｌ）及び５０ミリモル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３ｍＬを均一混合して、基質溶液を調製した。なお、カッコ内に記載した濃度は、リン酸緩衝液に対する濃度を表す。
【００７４】
ついで、酵素水溶液１０μＬを基質溶液３ｍＬに加えて、測定液を得た。直ちに、この測定液について、３０℃で、分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で５００ｎｍにおける吸光度（Ｂ０）を測定し、さらに３０℃で５分間放置後にもう一度、３０℃で吸光度（Ｂ５）を測定し、これらの差（Ｂ５−Ｂ０）（ΔＢ）を算出した。
【００７５】
一方、測定試料（凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ）をコレステロールオキシダーゼ（和光純薬工業製、力価２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｂ５−Ｂ０）（ΔＢｂ）を算出し、次式から酵素活性保持率を算出した。
【００７６】
酵素活性保持率（％）＝（ΔＢ／ΔＢｂ） ×１００
【００７７】
＜凍結乾燥ＢＭＰ−２の活性（力価）保持率の測定＞
ＢＭＰ−２の活性測定は公知の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２（１９９０）２９５−２９９）と同様に下記の通り行った。
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ品）を２ミリモル／Ｌのグルタミン、１ミリモル／Ｌのピルビン酸ナトリウム、１０重量％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）中で３７℃、１０重量％二酸化炭素条件下培養した。２４穴プレートに１×１０5個のＣ２Ｃ１２細胞を含む培地を注ぎ培養し、３７℃、２４時間後に凍結乾燥ＢＭＰ−２を含む新しい前述の培地（凍結乾燥ＢＭＰ−２の濃度：０．００１重量％）で培地交換した。４日後、タンパク抽出用溶液（０．１モル／Ｌのグリセロール、ｐＨ９．６、１重量％のＮＰ−４０、１ミリモル／Ｌの塩化マグネシウム、１ミリモルの塩化亜鉛を含む）０．２ｍＬをプレートに加え１時間静置した。静置後プレート上のタンパク抽出液５０μＬを０．３ミリモル／Ｌのｐ−ニトロフェニルフォスフェート（シグマ社製）をタンパク抽出用溶液に溶解させた溶液１５０μＬに加え、９６穴プレートで３７℃、放置した。マイクロリーダー（和光純薬工業製、サンライズサーモ）で加えた直後の４０５ｎｍにおける吸光度（Ｃ０）を測定し、さらに３７℃で３０分間放置後にもう一度、３７℃で吸光度（Ｃ３０）を測定し、これらの差（Ｃ３０−Ｃ０）（ΔＣ）を算出した。
【００７８】
一方、測定試料（凍結乾燥ＢＭＰ−２）をＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ社製）に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｃ３０−Ｃ０）（ΔＣｂ）を算出し、次式から活性保持率を算出した。
【００７９】
活性保持率（％）＝（ΔＣ／ΔＣｂ） ×１００
【００８０】
＜凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体の活性（力価）保持率の測定＞
抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体の活性は下記の通りＥＬＩＳＡ法で測定した。
ＰＢＳで１０００倍に希釈したスギ花粉アレルゲンＣｒｙＪ１溶液を９６穴マイクロプレートに１穴につき５０μＬずつ加え、プレートシールで上面をシールし、２０℃で２時間静置した。サンプル溶液を除去した後、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）でウェルを処理し、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で１０μｇ／ｍＬとなるように希釈した凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体溶液を５０μｌ加え、２０℃で４時間静置した。次に、西洋わさびペルオキシターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１，０００倍の濃度に希釈し、プレートに１穴につき５０μＬずつ加えた。プレートシールで上面をシールし、室温で４時間静置した。抗体をプレートから除去し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、フェニレンジアミン溶液を１穴につき２００μＬずつ加え、２０分間静置した。２Ｎ硫酸を１穴につき１００μＬずつ加え、直後の４９２ｎｍの吸光度（Ｄ０）を測定し、さらに２０℃で２０分間放置後にもう一度、２０℃で吸光度（Ｄ２０）を測定し、これらの差（Ｄ２０−Ｄ０）（ΔＤ）を算出した。
【００８１】
一方、測定試料（凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体）を抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体に変更したこと以外、上記と同様にして、吸光度の差（Ｄ２０−Ｄ０）（ΔＤｂ）を算出し、次式から活性保持率を算出した。
【００８２】
活性保持率（％）＝（ΔＤ／ΔＤｂ） ×１００
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
表１及び表２から、比較の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−１）、（ＨＲ−２）、比較の凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（ＨＲ−４）、比較の凍結乾燥ＢＭＰ（ＨＲ−６）及び比較の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−８）は、凍結乾燥後の酵素活性又は力価の保持率が低い。さらに全ての比較の凍結乾燥リゾチーム、比較の凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ、比較の凍結乾燥ＢＭＰ及び比較の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体は経時的に酵素活性が低下することがわかる。一方、本発明の凍結乾燥用保護剤を用いて得られたものは、凍結乾燥後の酵素活性又は力価の保持率が高く、経時的な酵素活性又は力価の低下も抑えられている。
また、本発明の凍結乾燥用保護剤を使用した凍結乾燥酵素、凍結乾燥組み換えタンパク質及び凍結乾燥抗体は吸湿性が低いことがわかる。一方、比較の凍結乾燥リゾチーム（ＨＲ−３）、比較の凍結乾燥コレステロールオキシダーゼ（ＨＲ−５）、比較の凍結乾燥ＢＭＰ（ＨＲ−７）及び比較の凍結乾燥抗スギ花粉アレルゲンモノクローナル抗体（ＨＲ−９）は吸湿性が高い。
すなわち、本発明の凍結乾燥用保護剤を用いて得られたものは、凍結乾燥後の酵素活性又は力価の保持率が高く、経時的な酵素活性又は力価の低下も抑えられ、さらに、吸湿性が低い。これら全てを満足するものは、比較の凍結乾燥用保護剤を用いて得られたものには、無いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の凍結乾燥用保護剤は、タンパク質などの生理活性物質を凍結乾燥する過程において使用できる。生理活性物質としては、酵素、組み換えタンパク質、抗体、ペプチド及びコラーゲン等のタンパク質、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等の多糖類、アミノ酸、核酸、抗生物質及びビタミン類が挙げられる。また、本発明の生理活性物質の製造方法は、凍結乾燥時に生理活性物質を変性することなく、かつ保存期間中に生理活性が低下しない。さらに凍結乾燥物は吸湿性が非常に少ないので、特に食品、医薬品、化粧品及び生化学の分野において有効に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥させる際に生理活性物質が変質することを防止するための保護剤であって、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する凍結乾燥用保護剤。
【請求項２】
生理活性物質が、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の凍結乾燥用保護剤。
【請求項３】
変性されたアミノ基が、一般式（１）で表されるアシルアミノ基である請求項１又は２に記載の凍結乾燥用保護剤。
−ＮＨＣＯＲ （１）
［Ｒは水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基を表す。］
【請求項４】
糖類がスクロース、トレハロース及びラクトースからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の凍結乾燥用保護剤。
【請求項５】
凍結乾燥用保護剤中のα位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類の重量比（アルギニンエステルの重量／糖類の重量）が１／９９〜７０／３０である請求項１〜４のいずれかに記載の凍結乾燥用保護剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の凍結乾燥用保護剤の存在下、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥して、生理活性物質を製造する生理活性物質の製造方法。
【請求項１】
生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥させる際に生理活性物質が変質することを防止するための保護剤であって、α位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類とを含有する凍結乾燥用保護剤。
【請求項２】
生理活性物質が、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の凍結乾燥用保護剤。
【請求項３】
変性されたアミノ基が、一般式（１）で表されるアシルアミノ基である請求項１又は２に記載の凍結乾燥用保護剤。
−ＮＨＣＯＲ （１）
［Ｒは水素原子又はヘテロ原子を含んでもよい炭素数１〜２１の１価の炭化水素基を表す。］
【請求項４】
糖類がスクロース、トレハロース及びラクトースからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜３のいずれかに記載の凍結乾燥用保護剤。
【請求項５】
凍結乾燥用保護剤中のα位のアミノ基が変性されたアルギニンエステルと糖類の重量比（アルギニンエステルの重量／糖類の重量）が１／９９〜７０／３０である請求項１〜４のいずれかに記載の凍結乾燥用保護剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の凍結乾燥用保護剤の存在下、生理活性物質及び水を含んでなる混合物を凍結乾燥して、生理活性物質を製造する生理活性物質の製造方法。
【公開番号】特開２００９−２０３２２３（Ｐ２００９−２０３２２３Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３３０３２（Ｐ２００８−３３３０３２）
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（０００００２２８８）三洋化成工業株式会社 (1,719)
【Ｆターム（参考）】
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