分子状分析物を分離する方法およびデバイス
異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法。この方法は、複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを前記分離体積部の軸に沿って生じさせること、および、前記ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物のうちの第１の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第２の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節すること、ただし、前記第１および第２の分子状分析物は異なるｐＩを有することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年８月２６日に出願されたＰＣＴ／ＩＬ２００８／００１１５９（２００９年３月５日に公開されたＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００９／０２７９７０）、米国仮特許出願Ｎｏ．６１／２７２，１１０（２００９年８月１８日出願）、及び米国仮特許出願Ｎｏ．６１／３４９，９１９（２０１０年５月３１日出願）を参考として組み入れる。
【０００２】
本願は、２００９年８月１８日に出願した米国仮特許出願Ｎｏ．６１／２７２，１１０及び２０１０年５月３１日に出願した米国仮特許出願Ｎｏ．６１／３４９，９１９の利益を主張する。
【０００３】
技術分野
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子の分析および分離に関連し、より具体的には、しかし、限定ではないが、エレクトロフォーカシングを使用する分子の分析および分離のための方法に関連する。
【背景技術】
【０００４】
等電点フォーカシングは、分析物サンプルにおける分子を、分子の異なるイオン的性質を利用することによって分離するための分析技術である。
【０００５】
等電点フォーカシングは通常、固定化されたプロトン濃度勾配、一般には、所与の方向でより高いｐＨからより低いｐＨにまで変化するプロトン濃度勾配を有する電解質溶液（場合によっては、例えば、ポリアクリルアミド、デンプンおよび／またはアガロースに基づくゲル形態での電解質溶液）において行われる。一部の実施では、溶液は、電場のもとでｐＨプロフィルを生じさせる両性電解質を含有する。等電点フォーカシングでは、分離が、分離距離全体を占め、かつ、勾配におけるｐＨが陽極から陰極に向かって増大するｐＨプロフィルにおいて生じる。使用時において、分析物が電解質溶液におけるある場所に負荷される。それぞれの異なる分子の電荷が、分子の様々な官能基の酸性度（ｐＫａ）に従って周囲のプロトン濃度に応答して変化する。
【０００６】
電位が、等電点フォーカシング陽極と、等電点フォーカシング陰極との間でプロトン濃度勾配と平行に加えられる。正味の正電荷を有する分子が電解質溶液を通って陰極に向かって移動し、一方、正味の負電荷を有する分子が電解質溶液を通って陽極に向かって移動する。
【０００７】
これらの分子が移動するにつれ、周囲のｐＨが変化して、分子における正味の電荷を減少させ、ついには、分子が、周囲のｐＨのためではあるが、分子における正味の電荷がゼロとなる等電点（ｐＩ）に達する。ｐＩは、特定の分子または表面が正味の電荷を持たないｐＨである。この地点で、移動中の分子は、ゼロの電荷を有するので停止する。そのような様式において、等電点フォーカシングは、特定のｐＩを有する分子を電解質溶液の比較的狭い体積に集中させる。等電点フォーカシングは、タンパク質をその酸性度に従って特徴づけることによってタンパク質の分析のために有用である。より重要なことであるが、等電点フォーカシングは、タンパク質の混合物を分離するために有用である。
【０００８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日発行、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、プロトンの局所的濃度、プロトン濃度勾配および所望されるプロトン濃度トポグラフィーを、電解質を含む環境（例えば、電解質溶液またはゲルなど）において生じさせる際に有用な方法およびデバイスを記載する。この特許出願はまた、等電点フォーカシングのための方法およびデバイスを開示する。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法が提供される。本方法は、複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを前記分離体積部の軸に沿って生じさせること、および、ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物のうちの第１の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第２の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節すること（ただし、前記第１および第２の分子状分析物は異なるｐＩを有する）を含む。
【００１０】
場合によっては、前記ｐＨプロフィルは、異なるｐＨレベルを有する少なくとも２つのｐＨ段差帯域を有し、前記複数の分子状分析物が、前記調節することの前に、実質的に均一なｐＨを有する前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込められ、前記調節することが、前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを変化させることを含む。
【００１１】
場合によっては、前記調節することが、時間において徐々に行われる。
【００１２】
場合によっては、前記ｐＨプロフィルは少なくとも１つの傾斜部によって定義され、前記複数の分子状分析物が前記少なくとも１つの傾斜部に蓄積する。
【００１３】
場合によっては、前記生じさせることは、電場を前記軸に沿って前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を前記軸に沿った複数の地点において注入して、前記ｐＨプロフィルを確立することを含む。
【００１４】
場合によっては、前記方法は、前記ｐＨプロフィルを安定化させるように少なくとも１つの緩衝剤要素を前記溶液に加えることを含む。
【００１５】
場合によっては、前記方法は、前記第１の分子状分析物を、前記第２の分子状分析物が前記分離体積部に留まっている間に回収することを含む。
【００１６】
場合によっては、前記方法は、前記プロフィルを、前記第２の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第３の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節すること（ただし、前記第２および第３の分子状分析物は異なるｐＩを有する）を含む。
【００１７】
場合によっては、前記調節することは、前記プロフィルを、前記第１および第２の分子状分析物が前記軸に沿って反対方向に移動することを誘導するために調節することを含む。
【００１８】
場合によっては、前記調節することは、前記プロフィルを、前記軸に沿った前記移動の方向を変化させて、その結果、前記第１の分子状分析物が２つの向かい合う方向で連続してドリフト移動するようにするために調節することを含む。
【００１９】
場合によっては、前記複数のｐＨ帯域は、実質的に均一な第２のｐＨを有する中間段差帯域によって区分けられる実質的に均一な第１のｐＨを有する２つの段差帯域を有し、前記混合物が、前記２つの段差帯域のうちの１つと、前記中間段差帯域との間に閉じ込められ、前記調節することが、前記中間段差帯域におけるｐＨを変化させることを含む。
【００２０】
場合によっては、前記複数のｐＨ帯域は、少なくとも３つの異なるｐＨ帯域を含み、前記調節することが、前記第１の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第１の対の間における第１の傾斜帯域に移動し、かつ、前記第２の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第２の対の間における第２の傾斜帯域に移動することを誘導するように徐々に行われる。
【００２１】
場合によっては、前記溶液は緩衝化される。
【００２２】
場合によっては、前記方法は、前記混合物における１つまたは複数の分子状分析物の等電点を提供し、前記溶液を等電点に従って設定し、これにより、前記溶液の緩衝剤濃度を前記等電点に従って決定すること、および、前記溶液を前記決定することに従って設定することを含む。
【００２３】
場合によっては、前記調節することは、前記第１および第２の分子状分析物を前記軸に沿って互いに離れて集束させることを含む。
【００２４】
さらなる場合によっては、さらに、前記第１および第２の集束させた分子状分析物を前記軸に沿った異なる場所から別々に回収することを含む。
【００２５】
場合によっては、前記生じさせることは、前記ｐＨプロフィルを一組の代数式に従って計算することを含む。
【００２６】
場合によっては、前記調節することは、前記ｐＨプロフィルについての少なくとも１つの調節を一組の代数式に従って計算し、前記調節することを前記少なくとも１つの調節に従って行うことを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法が提供される。本方法は、複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、前記複数の分子状分析物を、前記溶液を含有する分離体積部において２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込めること（ただし、それぞれの前記ｐＨ段差帯域が、異なる実質的に均一なｐＨを有する）、および、前記２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを、前記複数の分子状分析物が複数の別個の群で連続して移動することを誘導するために徐々に変化させること（ただし、それぞれの前記群が異なるｐＩを有する）を含む。
【００２８】
場合によっては、前記閉じ込めることは、前記２つのｐＨ段差帯域を確立するために、電場を前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を少なくとも１つの地点において注入することを含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離する方法が提供される。本方法は、複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを、複数の分子状分析物を有する溶液において生じさせること、および、前記ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物がそれらのそれぞれの等電点に従って空間的に分離されることを誘導するために一定の期間にわたって徐々に変化させることを含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離するデバイスが提供される。本デバイスは、複数の分子状分析物を有する溶液を含有するためのサイズおよび形状を有する、軸に沿う容器と、電場を前記溶液において軸に沿って加える電源と、複数のイオン流を注入して、前記溶液の複数の帯域をプロトン化することおよび脱プロトン化することの少なくとも一方に至ることによって、ｐＨプロフィルを前記溶液において前記軸に沿って確立するための複数のイオン源と、前記ｐＨプロフィルを徐々に調節して、その結果、それぞれの前記分子状分析物が前記軸に沿って別々に移動することを誘導するようにするために前記複数のイオン源を操作するコントローラとを含む。
【００３１】
場合によっては、前記デバイスはさらに、コンピュータユニットおよび使用者のうちの少なくとも１つからの複数の指示を受け取るためのインターフェースを含み、ただし、前記コントローラにより、前記複数のイオン源が前記複数の指示に従って操作される。
【００３２】
場合によっては、前記容器は１ミリメートル未満の少なくとも１つの大きさを有する。
【００３３】
場合によっては、前記溶液は非ゲル溶液である。
【００３４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３６】
【図１】図１は、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離する方法のフローチャートである。
【００３７】
【図２Ａ−２Ｅ】図２Ａ−２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による動的ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器における溶液に存在する分子状分析物に対するその影響を概略的に例示するグラフィック図である。
【００３８】
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離体積部において分離する例示的な分離デバイスの側面図の概略図である。
【００３９】
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による、その流路に沿って存在するｐＨセンサーのアレイを有する図３Ａに示されるような例示的な分離デバイスの側面図の概略図である。
【００４０】
【図４Ａ−４Ｅ】図４Ａ−４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従って、図２Ａ−図２Ｅに示される移動とは逆である方向への分子状分析物の移動を誘導するために調節されるｐＨプロフィルの概略図である。図４Ｃ−図４Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物の二方向の動きを誘導するために調節されるｐＨプロフィルの概略図である。
【００４１】
【図４Ｇ−４Ｋ】図４Ｇ−４Ｋは、本発明のいくつかの実施形態による動的な多段階ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器における溶液に存在する分子状分析物に対するその影響を概略的に例示するグラフィック図である。
【００４２】
【図５Ａ−５Ｇ】図５Ａ−５Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物がどのように、ｐＨプロフィルの端部の近くに位置するｐＨ傾斜帯域に向かって連続的にドリフト移動させられるかを図示する概略図である。
【００４３】
【図６】図６は、本発明のいくつかの実施形態による、異なるｐＩを有する分子状分析物をｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度で別々にドリフト移動させる方法である。
【００４４】
【図７Ａ−７Ｅ】図７Ａ−７Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物がどのように、動的ｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度でドリフト移動させられるかを図示する概略図である。
【００４５】
【図８Ａ−８Ｅ】図８Ａ−８Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物がどのように、動的ｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度でドリフト移動させられるかを図示するさらなる概略図である。
【００４６】
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａは、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらのｐＩに基づいて分離する例示的なデバイスの概略図である。図９Ｂ−９Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による図９Ａの例示的なデバイスにおいて使用され得る例示的なイオン源の概略図である。
【００４７】
【図１０Ａ−１０Ｈ】図１０Ａおよび１０Ｅは、本発明のいくつかの実施形態によるプロトン注入およびヒドロキシル注入の場合において、非緩衝化溶液を有する容器（例えば、図３に示される容器など）を関連した電流密度と一緒に示す。図１０Ｂ−１０Ｄおよび図１０Ｆ−１０Ｈは、本発明のいくつかの実施形態による、軸に沿った動的ｐＨプロフィル（例えば、図１０Ａおよび図１０Ｅに示される動的ｐＨプロフィルなど）をそれぞれ示す。
【００４８】
【図１１Ａ−１１Ｄ】図１１Ａおよび１１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態によるプロトン注入およびヒドロキシル注入の場合において、緩衝化溶液を有する容器（例えば、図３に示される容器など）を関連した電流密度と一緒に示す。図１１Ｂおよび図１１Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による、軸に沿ったｐＨプロフィル（例えば、図１１Ａおよび図１１Ｃに示されるｐＨプロフィルなど）を示す。
【００４９】
【図１２】図１２は、本発明のいくつかの実施形態による、電気電流における変化と、緩衝化溶液および非緩衝化溶液のｐＨとの間の相関を示すグラフである。
【００５０】
【図１３】図１３は、本発明のいくつかの実施形態による、電気電流における変化と、３つの緩衝剤（それらのうちの２つが２つのプロトン化状態を有し、１つが３つのプロトン化状態を有する）を有する溶液におけるｐＨとの間の相関を示すグラフである。
【００５１】
【図１４】図１４は、本発明のいくつかの実施形態による、緩衝化溶液を１つまたは複数の分子状分析物のために設定する方法のフローチャート１４００である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子の分析および分離に関連し、より具体的には、しかし、限定ではないが、エレクトロフォーカシングを使用する分子の分析および分離のための方法に関連する。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する分子状分析物の混合物を時間的に分離する方法およびデバイスが提供される。本方法は、異なるｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを、分子状分析物（例えば、タンパク質など）の混合物を伴う溶液を含む分離体積部において生じさせることに基づく。ｐＨプロフィル（これは場合によっては段階的である）が形成された後で、そのプロフィルが、分子状分析物がそれらのそれぞれのｐＩに従って空間的に分離されることを誘導するために、一定の期間、徐々に変化させられる。場合によっては、プロフィルは、異なるｐＩを有する別個の動きを共通の軸（例えば、ｐＨプロフィル軸など）に沿って誘導するように変化させられる。異なるｐＩを有する分子状分析物が、向かい合う方向で同時または連続して、および／あるいは、共通の方向で連続してドリフト移動し得る。場合によっては、プロフィルは、ｐＨプロフィルの実質的に安定したｐＨを有する１つまたは複数の段差帯域においてｐＨを徐々に増減することによって変化させられる。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なるｐＩを有する複数の分子状分析物の混合物を分離するデバイスが開示される。本デバイスは、複数の分子状分析物を有する溶液を含有するために所定のサイズおよび形状を有する、軸に沿う容器、例えば、約１ミリメートル以下の平均直径を有する流路、例えば、１００×３×０．３ｍｍの切断断面を有する流路を含む。本デバイスはさらに、電場を溶液において軸に沿って、例えば、流路の軸に沿って加える高電圧電源装置を含む。本デバイスはさらに、ｐＨを分離体積部のいくつかの帯域において上げ下げするイオン流を注入することによってｐＨプロフィルを溶液において軸に沿って確立するために設定されるイオン源を含み、例えば、イオン源は、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願）において定義されるようなものであり得る。イオン源は、それぞれの分子状分析物のそれぞれ１つが、場合によっては連続するが、軸に沿って別々に移動することを誘導するようにｐＨプロフィルを徐々に調節するために複数のイオン源を操作するコントローラに接続される。場合によっては、コントローラは、使用者が、ｐＨプロフィルを生じさせるための指示を与え、また、ｐＨプロフィルを、分子状分析物の移動を誘導するために動的に変化させることを可能にするコンピュータユニットおよび／またはインターフェース（例えば、マニュアルインターフェースなど）に接続される。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、および／または図面および／または実施例において例示される構成要素および／または方法の組み立ておよび構成の細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００５６】
次に、図１が参照される。図１は、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点（ｐＩ）に基づいて分離する方法５０のフローチャートである。本明細書中で使用される場合、分子状分析物は、プロトン化／脱プロトン化を受け得る分子、生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドに基づく医薬化合物および生体分子に基づく医薬化合物など）、および、ｐＨに依存する物体（例えば、コロイドなど）または何らかの他の荷電分子を意味する。分離が、場合によっては、分子状分析物を含む溶液（例えば、電解質溶液など）において、分離体積部に沿って行われる。
【００５７】
最初に、５１において示されるように、異なるｐＨ段差帯域を有するｐＨプロフィルが、分子状分析物の混合物を伴う溶液において生じさせられる。ｐＨプロフィルが特定の軸の端から端まで形成される（この軸は本明細書中ではｐＨプロフィル軸として示されることがある）。電気的電位が、例えば、下記で記載されるように、イオン流を誘導するためにｐＨプロフィル軸に沿って加えられる。ｐＨプロフィルが、混合物の分子を異なるｐＨ段差帯域の間におけるｐＨ傾斜帯域に閉じ込められるように形成される。例えば、図２Ａは、３つの分子状分析物（これらは、丸で囲まれた数字（１、２および３）により表される）が、高ｐＨ段差帯域と、低ｐＨ段差帯域との間の傾斜部に存在するｐＨプロフィルを示す。場合によっては、ｐＨプロフィルが、図３Ａおよび図３Ｂに関連して下記で記載されるようなデバイスを使用して生じさせられる。分子状分析物（例えば、タンパク質など）は、プロトン濃度が高い低ｐＨ値では正の電荷を有し、プロトン濃度が低い高ｐＨ値では負の電荷を有すると推測される。ｐＨプロフィルは、ｐＨレベルを、例えば、図３Ａおよび図３Ｂの数字１０２などにおいて示されるように、上記溶液を含有する容器の異なる帯域に沿って制御することによって確立することができる。この制御を、ｐＨ段差帯域におけるプロトン濃度を調節することによって達成することができる。
【００５８】
次に、５２において示されるように、ｐＨプロフィルのプロフィルが、分子状分析物の１つまたは複数が、例えば、ｐＨプロフィル軸に沿って、それらの等電点に基づいて移動することを誘導するために調節される。ｐＨプロフィルの調節により、分子状分析物のそれらのｐＩに基づく可動化がもたらされる。それぞれの分子状分析物がｐＨプロフィル軸に沿ってドリフト移動し、ついには、それぞれの分子状分析物が、そのｐＨが正味の電気的電荷を携行させないｐＨ帯域に達する。この帯域において、その局所的ｐＨはそのｐＩに等しく、その結果、分子状分析物のドリフト移動速度がほぼゼロに低下し、分子状分析物は停止する。下記でさらに記載されるように、そのような移動は、異なるｐＩを有する複数の別個の分子状分析物群をｐＨプロフィル軸の端から端まで形成する。場合によっては、分離は、外部電場の存在下における荷電分子状分析物の移動度特性（例えば、そのドリフト移動速度）に基づく。これらの特性はそれらの電荷に比例しており、したがって、ｐＨプロフィル軸に沿った帯域における変化するｐＨに沿って変化する。
【００５９】
場合によっては、ｐＨプロフィルが時間的に制御される。例えば、ｐＨプロフィルが、ある期間に沿ったモニターされている間隔で徐々に調節される。異なるｐＩを有する異なる分子状分析物は異なるドリフト移動速度を有するので、ｐＨプロフィルに沿ったそれらの移動の速さが異なる。そのようなものとして、分子状分析物が特定のプロフィルにおけるｐＨプロフィルに沿って特定の距離を移動するために要する時間により、そのｐＩが示される。そのようなものとして、異なる分子状分析物が、特定のプロフィルを有するｐＨプロフィルに沿った特定の目標場所に到達する順番により、その相対的ｐＩ値が示される。そのうえ、ドリフト移動速度が分子状分析物毎に異なるので、分子状分析物の群を、分子状分析物の群を分離体積部においてｐＨプロフィル軸に沿って異なる速度で可動化することによって分離することができる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、一定の期間中に制御可能に調節されるｐＨプロフィルは動的ｐＨプロフィルとして示される。動的ｐＨプロフィルを分離体積部において確立することによって、分子状分析物は、空間的に分離されるのではなく、すなわち、異なるｐＨ帯域に対して分離されるのではなく、時間的に分離され、すなわち、異なる時間枠で分離体積部における共通の場所に到達するように分離される。例えば、ｐＨプロフィルを上記のように変化させることにより、分離体積部における特定の帯域への分子状分析物の到達を時間的に分離することが可能となる。このことは、下記でさらに記載されるように、その前方で可動化される分子状分析物をプローブ探査するためのプローブ探査ユニット、または、その前方で可動化される分子状分析物を診断するための診断ユニットを設置することを可能にする。ｐＨプロフィルが特定の静的プロフィルで設定されるとき、分子状分析物はそれに沿って特定の場所に停止させられる。ｐＨプロフィルのプロフィルが動的に徐々に変化させられるとき、特定の帯域における時間依存的ｐＨ変化が、異なる分子の間における時間での分離をもたらすので、分子状分析物が連続して放出される。ｐＨプロフィルのゆっくりした変化によって、接近したｐＩ値を有する２つの分子の、特定のｐＨ傾斜帯域（タンパク質が分離前にこの傾斜帯域に濃縮される）からの放出時間における分離を任意に大きくすることができ、このことは、任意に小さいｐＩ差によって特徴づけられるタンパク質の分離をもたらす。そのような分離が空間的に達成される。
【００６１】
次に、図３Ａが参照される。図３Ａは、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点（ｐＩ）に基づいて分離体積部において分離する例示的な分離デバイス１００の側面図の概略図である。この分離は、分子状分析物を別々に診断および／または回収することを可能にする。分離デバイス１００は、時間依存的なｐＨ閉じ込めを溶液において有する時空的ｐＨプロフィル、すなわち、動的ｐＨプロフィルをもたらす。ｐＨプロフィルが、ｐＨをｐＨ段差帯域の１つに対して変化させることによって調節されるとき、一部の分子状分析物が閉じ込めから放出され、一方、一部は閉じ込められたままである。そのような様式で、異なる分子状分析物を互いに分離させることができる。分離デバイス１００は、分離体積部を規定し、かつ、溶液（例えば、電解質溶液など）を含有する容器１０２のごく近くにアレイとして場合によっては配置される複数のイオン源１０１を含む。容器１０２は本明細書中では流路および／またはフォーカシング用流路として示されることがある。下記でさらに記載されるように、イオン源１０１は、容器１０２の複数の異なる帯域において複数のイオン流を容器１０２に供給することによってｐＨプロフィルを溶液において確立するために設置される（ただし、それぞれのイオン流により、異なる帯域のｐＨレベルが変化させられる）。それぞれのイオン源１０１が、ｐＨプロフィルが確立される容器１０２内の分離体積部におけるそれぞれのｐＨ帯域においてｐＨを変化させる。場合によっては、イオン源１０１は、イオン流を生じさせ、そのイオン流をフォーカシング用流路１０２に注入することによって、ｐＨレベルを、容器１０２の長さ軸９９と平行するｐＨプロフィル軸、または、それと平行する任意の他の軸に沿った異なる帯域において制御する。場合によっては、例えば、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、イオン源１０１はｐＨ発生器であり、容器はフォーカシング用流路である。
【００６２】
図３Ａに示されるように、容器１０２の左側面および右側面のそれぞれ１つが、供給リザーバーとして示されることがある溶液受器（１０３、１０４）に接続される。電解質溶液受器の一方１０３が陰極１０５に接続され、他方１０４が陽極１０６に接続され、陰極１０５および陽極１０６は高電圧電源装置１０８に接続され、高電圧（ＨＶ）を分離体積部に沿って容器１０２において加えるために設定される。場合によっては、システム１００はさらに、主電流源１０８および／またはイオン源１０１を場合によっては別々に制御するコントローラ１１０を含む。コントローラ１１０は、ｐＨをそれぞれの帯域において変化させることをイオン源１０１の一部またはすべてに指示することによってｐＨプロフィルを変化させることができる。
【００６３】
３つだけのイオン源１０１が示されるが、分離デバイス１００は任意の数のイオン源１０１（例えば、４個、８個、１２個、１６個、２０個、１００個、あるいは、任意の中間の数またはより多くの数）を有し得ることには留意しなければならない。
【００６４】
場合によっては、図３Ｂにおいて示されるように、また、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、ｐＨセンサー３１３のアレイが、コントローラ１１０およびプロトン／ヒドロキシル源１０１と一緒にフィードバックループを閉じるために、流路に沿って置かれる。使用時において、流路１０２は、場合によって下記のように選択される溶液により満たされる。その後、コントローラには、溶液に加えられる特定の混合物を分離するために適する所望される動的ｐＨプロフィルを形成するための指示が与えられる。場合によっては、コントローラ１１０は、動的ｐＨプロフィルを手動で提供することを可能にするユーザーインターフェースに接続される。別の実施形態において、コントローラ１１０に接続されるコンピュータユニット（示されず）により、動的ｐＨプロフィルが、例えば、プローブ探査された分子状分析物のｐＩに基づいて、場合によっては下記の式を使用して、自動的に計算される。次に、ＨＶ電源装置１０８が、分離体積部において、例えば、３００Ｖの電位差を維持するために始動させられる。その後、コントローラ１１０はイオン源１０１を使用者の入力および／またはコンピュータユニットに従って操作し、そして、ｐＨセンサー３１３が存在するならば、フィードバックループを作動させて、所望されるｐＨプロフィルを時間とともに維持する。後者が確立されるとき、混合物が、場合によっては容器１０２の面の１つに位置するローダーを介して流路１０２に挿入される。その後、分子状分析物が流路１０２の内部のｐＨおよび電場に従って移動する。後者が移動し、集束するにつれ、使用者はｐＨプロフィルを所望される動的ｐＨプロフィルに従って再設定する。その後、コントローラ１１０は、受け取った指示に従ってイオン源１０１をリアルタイムで操作する。本明細書中で使用される場合、リアルタイムは、ｐＨプロフィルを、数秒を超えるコンピュータ遅延を伴うことなく調節することを意味する。最後に、下記でさらに記載されるように、移動している分子状分析物が収集ユニットにより別々に回収されるか、または、流路に沿った位置でプローブ探査される。この分離デバイス１００は、既存の等電点フォーカシングデバイスと比較した場合、数多くの好都合な特徴を有する。例えば、本デバイスは、ゲルおよび／または両性電解質非含有溶液を使用することを可能にし、このことは、より大きい精製収率およびより短い精製時間を容易にする。そのうえ、本分離デバイス１００は、それぞれの流出している分子が、その分子が精製されるまで約１ミリメートル（ｍｍ）のほんの短い距離を移動し、これにより、精製時間を比較的短くするように設計することができる。加えて、分離戦略のいくつかにおいては、分子が共通の軌跡に沿って移動し、このことにより、収集ユニットおよび／または診断ユニットの設計および／または操作が簡略化される。これらのユニットは、分子のすべてが取り出され得るか、またはプローブ探査され得る規定された地点に配置することができる。最後に、ｐＨプロフィルは、最適な精製プロセスをどの生体分子混合物に対しても行うために時間的および／または空間的に適し得る。
【００６５】
そのような分離デンバイス１００は、分子状分析物の一部が容器１０２における分離体積部に形成されるｐＨプロフィルに沿って移動することを誘導することによって分子状分析物を分離するために使用することができる。
【００６６】
例えば、次に図２Ａ〜図２Ｅが参照される。図２Ａ〜図２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による動的ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器１０２における溶液に存在する分子状分析物に対するその影響を概略的に例示するグラフィック図である。２つのイオン源１０１が、図２Ａに示されるｐＨプロフィルを確立するために設定される。上記で概略されるように、図２Ａは、３つの異なる分子状分析物を、ｐＨプロフィルの高ｐＨ段差帯域と、低ｐＨ段差帯域との間のｐＨ傾斜帯域において示す。これら３つの帯域の空間的大きさは、１０マイクロメートルから何センチメートル（ｃｍ）（例えば、１０ｃｍ、２０ｃｍ、５０ｃｍ、あるいは、任意の中間の数字またはより大きい数字）までであるように選択することができ、一方、ｐＨ傾斜帯域の典型的な大きさは数十マイクロメートルである。電場が、陰極１０５および陽極１０６によって、数字２０１によって示される方向で加えられる。ｐＨプロフィルにおけるｐＨ傾斜帯域２０２が、ｐＨを容器の様々な帯域において変化させて、その結果、ｐＨレベルが下記のように規定されることによって規定される：
上記において、ｐＨ（Ｉ）〜ｐＨ（ＩＩＩ）は、高ｐＨ段差帯域、ｐＨ傾斜帯域および低ｐＨ段差帯域におけるｐＨレベルをそれぞれ示し、ｐＩ１〜ｐＩ３は、第１、第２および第３の分子状分析物のｐＩをそれぞれ示す。図２Ａにおいて、３つの分子状分析物（例えば、３つのタンパク質）の混合物が、段差帯域Ｉまたは段差帯域ＩＩＩのどちらかに注入された後でｐＨ傾斜帯域ＩＩにおいて濃縮される。分子状分析物は、これらが高ｐＨ段差帯域（例えば、帯域Ｉなど）に挿入されるならば、負の電気的電荷を有することが推測され、したがって、低ｐＨ段差帯域に向かって電場の方向とは反対にドリフト移動する。分子状分析物が低ｐＨ段差帯域（例えば、帯域ＩＩＩなど）に注入されるならば、分子状分析物は、正の電荷を有するとして推測され、したがって、高ｐＨ側のｐＨ段差帯域に向かって電場の方向でドリフト移動する。どちらの場合にせよ、分子状分析物は、溶液に形成される電場においてドリフト移動して、ｐＨ傾斜ＩＩとして表されるｐＨ傾斜帯域に向かい、このｐＨ傾斜帯域において、それらのｐＩがそのｐＨレベルにあり、したがって、分子状分析物は電気的な正味の電荷を携行しないので、分子状分析物が閉じ込められる。低ｐＨ段差帯域は、分子状分析物が正の電荷を獲得することを誘導し、高ｐＨプラトー部は、分子状分析物が負の電荷を獲得することを誘導するので、分子状分析物の分子が閉じ込められる。
【００６７】
次に、図２Ｂにおいて示されように、ｐＨプロフィルが、分子状分析物のうちの１つが移動することを誘導するために調節される。示された例では、ｐＨプロフィルが変化させられ、その結果、帯域ＩＩＩにおけるｐＨが、ｐＩ３と、ｐＩ２との間における中間の値に、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３である点にまで上げられる。このプロフィルのもとでは、第３の分子状分析物は負に荷電し、その結果、電場の流れ方向に逆らって、例えば、図２Ｃにおいて示されるように、ｐＨプロフィルのｐＨ傾斜帯域から低ｐＨ段差帯域の右端に向かってドリフト移動するようになる。明確化のために、図２Ａ〜図２Ｅにおけるドリフト移動方向が黒塗り矢印により表され、電場が、記号Ｅを伴う矢印によって表される。同時に、第１および第２の分子状分析物はｐＨ傾斜帯域に留まる。このとき、第３の分子状分析物を、例えば、容器１０２の分離体積部の右手側で回収および／またはプローブ探査することができる。第２の分子状分析物を第１の分子状分析物から分離するために、低ｐＨ段差帯域におけるｐＨがさらに、例えば、図２Ｄにおいて示されるように、ｐＨ１と、ｐＨ２との間における中間の値に、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３である点にまで上げられる。今回は、第２の分子状分析物が負に荷電し、その結果、第２の分子状分析物が第１および第３の分子状分析物とは別に回収および／または診断され得るｐＨプロフィルの右端に向かってドリフト移動するようになる。最後に、図２Ｅにおいて示されるように、高ｐＨ段差帯域におけるｐＨ値が、ｐＩ１を超える値に上げられ、第１の分子状分析物が負に荷電し、その結果、第１の分子状分析物が第３および第２の分子状分析物とは別に回収および／または診断され得るｐＨプロフィルの右端に向かってドリフト移動するようになる。明らかなことではあるが、どのような数の分子状分析物も、回収時間および／または診断時間が、回収および／または診断された分子状分析物のｐＩと時間的に同期され得るこの様式で別々に回収および／または診断することができる。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分離デバイス１００はｐＨプロフィルを徐々に変化させる。例えば、分離デバイス１００は、ｐＨを帯域の１つにおいて、例えば、高ｐＨ段差帯域において、時間とともに単調に、例えば、直線的に増加させる。そのような様式では、分子状分析物が、図２Ｅにおいて示されるように、別個のドリフト移動するバンド（これは群として示されることがある）を形成した状態で、連続して放出される。これらのバンドの間における空間的分離が、特定の帯域（例えば、低ｐＨ段差帯域など）のｐＨにおける任意にゆっくりした増大によって任意に大きくすることができ、したがって、バンド間のｐＩ分離における任意に大きい分解能を得ることができる。場合によっては、これら３つのバンドを、従来のフラクションコレクターによって、および／または、他のタンパク質収集技術によって、ｐＨプロフィルの右端と一致する領域の右端で別個の群として回収することができる。加えて、または、代替において、これら３つのバンドを、従来の分子プローブによって、および／または、他の分子プロービング技術によって、ｐＨプロフィルの右端と一致する領域の右端で別個に診断することができる。
【００６９】
ｐＨプロフィルは、反対方向への分子状分析物の移動を、例えば、図４Ａおよび図４Ｂにおいて示されるように、帯域の１つまたは複数のｐＨを下げることによって誘導するために、場合によっては徐々にではあるが、調節され得ることには留意しなければならない。例えば、ｐＨプロフィルが、帯域ＩのｐＨを低下させることによって分子状分析物（例えば、上記分子状分析物の第１および第２の分子状分析物）の移動を誘導するために調節される。示された例では、ｐＨプロフィルが変化させられ、その結果、帯域ＩにおけるｐＨが、ｐＩ１と、ｐＩ２との間において、その後、ｐＩ２と、ｐＩ３との間において中間の値に、すなわち、ｐＩ１＞ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）であり、その後、ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）である点にまで下げられる。
【００７０】
場合によっては、図４Ｃにおいて示されるように、ｐＨプロフィルが、２つの向かい合う方向への分子状分析物の移動を誘導するために変化させられる。例えば、図１Ａに示される上記ｐＨプロフィルは、同時的および／または徐々にであれ、帯域ＩのｐＨを低下させ、帯域ＩＩＩのｐＨを上げることによって、向かい合う方向への分子状分析物（例えば、上記分子状分析物の第１および第２の分子状分析物）の移動を誘導するために調節される。
【００７１】
分子状分析物が、特定の帯域に濃縮されることなく分離され得ることには留意しなければならない。例えば、図４Ｄに示されるように、分離が、あるｐＨ段差帯域において生じ得るが、このとき、この帯域におけるｐＨはその中における分子状分析物のｐＩと異なる。分子状分析物Ｉが正であり、分子状分析物ＩＩおよび分子状分析物ＩＩＩが負であり、したがって、異なる方向に移動するので、分離が、分子状分析物Ｉと、分子状分析物ＩＩおよび分子状分析物ＩＩＩとの間で形成される。
【００７２】
同じ戦略を、例えば、図４Ｅにおいて示されるように、第２の分子状分析物を中間のｐＨ傾斜帯域に保持しながら、第１の分子状分析物を左側に、第３の分子状分析物を右側に放出させ、これにより、それらを異なるｐＨ傾斜部において捕獲するために適用することができる。
【００７３】
次に、図４Ｇ〜図４Ｋが参照される。図４Ｇ〜図４Ｋは、本発明のいくつかの実施形態による動的な多段階ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器における溶液に存在する分子状分析物に対するそれらの影響を概略的に例示するグラフィック図である。示された実施形態において、いくつかのｐＨ傾斜帯域が、それらのｐＨに基づいて連続して配置される異なるｐＨ段差帯域の間に形成される。これは、異なるｐＩを有する分子状分析物を、ｐＨプロフィル軸に沿った異なる場所から、および／または、ｐＨプロフィル軸に沿った異なる場所において収集および／または診断することを可能にする。そのような多段階ｐＨプロフィルは、従来のタンパク質バンド収集方法によって収集することが容易である十分に規定されたタンパク質バンドを形成することを可能にする。図４Ｇは、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）を満たす図２Ａと同一である。図４Ｈにおいて、低ｐＨ段差（これは帯域ＩＩＩとして表される）が、ｐＩ３と、ｐＩ２との間において中間の値に、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３である点にまで上げられる。さらなるｐＨ傾斜帯域（これはＩＶとして示される）および別のｐＨ段差帯域（これはＶとして示される）が、図４Ｈにおいて示されるように、帯域ＩＩＩの右側に形成され、その結果、ｐＩ３＞ｐＨ（Ｖ）であるようにされる。そのようなｐＨパターン、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｖ）のもとでは、第３の分子状分析物が負に荷電し、その結果、右端に向かってドリフト移動して、図４Ｉにおいて示されるように、ｐＨ傾斜部ＩＶに閉じ込められる。第１および第２の分子状分析物はｐＨ傾斜帯域ＩＩに閉じ込められたままである。ｐＨが、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３である点へｐＨ段差帯域ＩＩＩにおいてさらに上げられると、第３のｐＨ傾斜帯域および第３のｐＨ段差帯域（これらはそれぞれ、図４ＪではＶＩおよびＶＩＩとして表される）が形成され、その結果、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＶＩＩ）＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｖ）であるようにされる。第２の分子状分析物が閉じ込めから放出され、ｐＨ傾斜帯域ＶＩにおいて捕獲されるまで右端に向かってドリフト移動する。今回は、これら３つの分子状分析物のそれぞれ１つが、図４Ｋにおいて示されるように、異なるｐＨ傾斜帯域において捕獲され、また、これら３つの分子状分析物のそれぞれ１つを直接に診断および／または収集することができ、ならびに／あるいは、右端で回収されるために、場合によっては異なった時間で別々に放出させることができる。
【００７４】
そのような実施形態において、分離が、イオンを特定のパターンに従って流路に単に注入することによって行われる。これは、分子状分析物（例えば、タンパク質など）を流路に沿ったいくつかの所（それぞれがｐＨ傾斜帯域にある）に集束させることを可能にする。集束させることが、分子状分析物を別々に回収および／または診断する前に行われる。そのような様式で、収率を増大させることができ、また、異なるタンパク質を、異なる事前設定された場所に何度も集束させることができ、その結果、収集ユニットが、固定された場所で収集することができる。
【００７５】
ｐＨプロフィルの左端に向かう分子状分析物の移動を誘導することが、１つまたは複数の帯域のｐＨが低下させられるときに同様に行われ得ることには留意しなければならない。例えば、図５Ａ〜図５Ｇは、分子状分析物（例えば、種々のタンパク質など）がどのように、ｐＨプロフィルの左端の近くに位置する傾斜部に向かって連続してドリフト移動させられるかを示す。これらの図において示される徐々に進むドリフト移動が、ｐＨ段差帯域ＶにおけるｐＨを下げることによって行われる。これは、分子状分析物を連続的かつ別々に回収および／または診断することを可能にする。
【００７６】
次に、図６が参照される。図６は、本発明のいくつかの実施形態による、異なるｐＩを有する分子状分析物をｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度で別々にドリフト移動させる方法７００である。上記で記載されるように、分子状分析物がｐＨプロフィル軸に沿ってドリフト移動し、ついには、分子状分析物は、分子状分析物が正味の電気的電荷を携行しない帯域に達する。それぞれの分子状分析物のドリフト移動速度は、溶液におけるホスト帯域におけるｐＨから派生したものであるその電荷に比例している。最初に、７０１において示されるように、中間の段差帯域を２つの高ｐＨ／低ｐＨ段差帯域の間に有するｐＨプロフィルが形成される。このｐＨプロフィルは、低い中間ｐＨ段差帯域によって区分けられる２つの高ｐＨ段差帯域を含むことができ、または、高い中間ｐＨ段差帯域によって区分けられる２つの低ｐＨ段差帯域を有するｐＨプロフィルを含むことができる。簡潔化のために、そのようなプロフィルを有するｐＨプロフィルが、本明細書中では高低高型ｐＨプロフィルおよび低高低型ｐＨプロフィルとしてそれぞれ示される。図７Ａおよび図８Ａはそのようなプロフィルを３つの例示的な分子状分析物についてそれぞれ示す。
【００７７】
次に、７０２において示されるように、分子状分析物が、ｐＨプロフィルのパターンに依存して、ｐＨプロフィル軸の一方の側から、例えば、容器１０２の一方の側から、例えば、左側から提供される。注入することが、分子状分析物をｐＨ傾斜帯域に閉じ込めるように行われる。プロフィルが高低高型であるならば、分子状分析物を、高電位側の高段差帯域（例えば、図７では右側）を除くどこからでも流路に注入することができる。そうでない場合、分子状分析物は集束しないかもしれない。この場合には、分子状分析物は、例えば、図７の左側に示されるように、より低い電位側に位置する傾斜部に集束する。代替において、プロフィルが低高低型であるならば、分析物を、例えば、図８の左側に示されるように、低電位側の低段差帯域を除くどこからでも流路に注入することができる。この場合には、分子状分析物は、例えば、図８の右側に示されるように、より高い電位側に位置する傾斜部に集束する。分子状分析物は、例えば、図７Ａおよび図８Ａにおいて示されるように、高段差帯域と、低段差帯域との間のｐＨ傾斜帯域に閉じ込められるまでドリフト移動する。上記で記載されるように、閉じ込められた分子状分析物は、一方の側にドリフト移動させようとすることが、分子状分析物を閉じ込め帯域に押し戻す負の電荷によって染み込むようにもたらされ、別の側にドリフト移動させようとすることが、同様に分子状分析物を閉じ込め域に押し戻す正の電荷によって染み込むようにもたらされるときに閉じ込められる。
【００７８】
最初は、図７Ａに示されるように、プロフィルが、ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）＞ＰＩ１＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）であるように規定され、３つの例示的な分子状分析物（例えば、タンパク質など）がｐＨ傾斜帯域ＩＩにおいて捕らえられる。段差帯域ＩＩＩは、それらの電荷が比較的小さい帯域ＩＩＩにおけるタンパク質移動時間を最小限に抑えるために、可能な限り短くされ、好ましくは、約１０マイクロメートル〜１０００マイクロメートルの間の範囲である。
【００７９】
次に、７０３において示されるように、ｐＨプロフィルの中間段差帯域が、閉じ込められた分子状分析物の１つまたは複数の移動を誘導するために調節される。例えば、図７Ｂは、中間プラトー部のｐＨを、ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３である点にまで上げることによって、第３の分子状分析物（これはｐＩ３として表される）の移動を誘導するためにｐＨプロフィルを調節することを示す。この増加は第３の分子状分析物を前記のようにｐＨ傾斜帯域から放出させ、一方、それ以外の分子状分析物は閉じ込められたままである。わずかに負に荷電した第３の分子状分析物が、ｐＨ傾斜帯域ＩＶにたどり着くまで右端にドリフト移動する。その地点において、ｐＨ、したがって、第３の分子状分析物の負の電荷が劇的に大きくなる。結果として、第３の分子状分析物のドリフト移動速度が、図７Ｃにおいて示されるように、劇的に加速され、例えば、１０倍、１００倍または１０００倍速くなり、このことは、図１に示される方法による分離に関して分離時間を短縮する。簡潔にするために、より大きい速度が二重矢印によって表される。７０４において示されるように、プロフィルは、分子状分析物を連続様式で放出するように複数の段階で調節することができる。例えば、中間ｐＨ段差帯域におけるｐＨが、例えば、図７Ａ〜図７Ｅおよび図８Ａ〜図８Ｅにおいて示されるように、連続様式で増大および／または低下させられる。図８Ａ〜図８Ｅでは、分離が、ｐＩが小さくなる順で行われる。３つの例示的な分子状分析物のための開始ｐＨプロフィルは、ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）であり、ｐＨ傾斜帯域ＩＶに閉じ込められる３つの分子状分析物が図８Ａに示される。使用時において、ｐＨ段差帯域ＩＩＩのｐＨが、ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）である点にまで時間の関数としてゆっくり下げられる。この形態では、第１の分子状分析物は正に荷電し、左側へドリフト移動することを開始する。ｐＨ傾斜部ＩＩにたどり着くと、ｐＨが低下し、第１の分子状分析物の正の電荷およびそのドリフト移動速度が、例えば、図８Ｃにおいて示されるように、劇的に大きくなる。同じプロセスが、図８Ｄおよび図８Ｅにおいて示されるように、第２および第３の繰り返された分子状分析に関して連続して繰り返される。
【００８０】
次に、図９Ａが参照される。図９Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従って、１つまたは複数の分子状分析物を有する混合物を回収および／または診断するために、分子状分析物をそれらのｐＩに基づいて分離する例示的なデバイス９００の概略図である。図９Ａはさらに、例示的デバイス９００の容器１０２において生じるｐＨプロフィルのプロフィルの概略的プロットを示す。
【００８１】
例示的デバイス９００は、図３Ａに示される通りであり、しかしながら、イオン源１０１が、下記でさらに記載されるように、イオン注入に基づく。適正な電解質溶液を有する容器１０２は、ｐＨプロフィルが、例えば、上記で記載されるように生成および調節される限定された分離体積部を規定する。電場が、例えば、上記で記載されるように、分離体積部を横切る。イオン源１０１が、分離体積部に形成されるｐＨプロフィル軸に沿う特定の帯域に対してプロトンおよび／またはヒドロキシルイオンを制御された様式で注入するために設定される。容器は、分子状分析物（例えば、タンパク質など）の混合物を導入し、また、分離プロセスの生成物を収集するための手段を含む。
【００８２】
示された実施形態において、デバイスの容器１０２は、２つのリザーバーによって供給される細長い流路における分離を規定する。流路１０２の長さは、微細加工技術によって製造されるならば、数十ミクロンから、従来の方法によって製造されるならば、数ミリメートル、数センチメートルまたは数十センチメートルにまで変化し得る。流路の平均直径および平均厚さは、例えば、幅が１マイクロメートルおよび／または１ミリメートルの間であるが、１マイクロメートル〜数センチメートルの間で変化し得る。プロトン源およびヒドロキシルイオン源１０１が流路に沿って分布し、イオンを流路における帯域に注入するために設定される。例えば、３つのヒドロキシル源および２つのプロトン源が、図４および図５に示されるｐＨプロフィルを形成するためにそれぞれ使用される。そのようなイオン源についての例が、本発明のいくつかの実施形態による例示的なデバイス９００において同時または交換可能に使用され得る様々な例示的なイオン源の概略図である図９Ｂ〜図９Ｄに示される。図９Ｂは、分離流路１０２に開口部９１３および透析膜９１４を介して接続される小さいチャンバー９１２を含むプロトン／ヒドロキシル源９１１を示す。透析膜は、分離流路１０２から小さいチャンバー９１２へのタンパク質漏出を防止するか、または低下させ、一方、これらの体積部の間におけるイオン交換を可能にする。プロトン／ヒドロキシル源９１１は、酸溶液および塩基溶液をチャンバー９１２において混合することによって、ｐＨを分離体積部における最も近い帯域において設定する。例えば、イオン源がプロトン源であるならば、過剰な酸溶液が、７未満の全体的ｐＨを有する帯域を与えるために、塩基溶液と混合される。イオン源がヒドロキシル源であるならば、逆のことが維持され、７を超えるｐＨがその帯域において形成される。場合によっては、酸溶液および塩基溶液が、対応するプロトン／ヒドロキシル源チャンバーに所望の量で供給される別々の容器に置かれる。
【００８３】
図９Ｃは、二極性メンブラン９２２、および、分離流路１０２と、プロトン源チャンバー９２４に浸けられる白金電極９２３との間においてメンブランの両側に加えられる電圧を使用して水を解裂させることによってプロトンを生じさせる電気分解型イオン源９２１を示す。場合によっては、電気分解型イオン源９２１は、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）において規定される通りである。二極性メンブラン９２２の極性が、プロトンがメンブラン９２２の流路側で生じ、一方、ヒドロキシルイオンがチャンバー側で生じるように選ばれる。メンブラン９２２に加えられるバイアスが、負の端子がメンブランの流路側に供給され、一方、正の端子が白金電極に供給されるように選ばれる。これらの条件のもと、水がメンブランにおいて解裂する。生じたプロトンが流路に注入され、ヒドロキシルイオンがメンブランからチャンバーに注入され、チャンバーにおいて、ヒドロキシルイオンは、白金電極９２３上で生じたプロトンと再結合して、水を形成する。明らかなことではあるが、また、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号に記載されるように、ヒドロキシルイオン源を同様に組み立てることができる。その目的のために、二極性メンブランが電圧源の極性と一緒に反転させられる。この形態では、メンブラン９２２における水の解裂によって生じるヒドロキシルイオンが分離流路に注入され、一方、プロトンがヒドロキシル源チャンバー９２４に注入され、ヒドロキシル源チャンバー９２４において、プロトンは、白金電極上で生じたヒドロキシルイオンと再結合して、水を与える。
【００８４】
図９Ｄは、水が、供給源チャンバー９３６に浸けられる２つの白金電極（９３２、９３３）の間に電圧を加えることによって電気分解される別のイオン源９３１を示す。流路９３５に隣接する白金電極９３３は、流路へのイオン輸送を改善するために穴を開けることができる。陰極電極が分離流路のより近くにある場合、ヒドロキシルイオンが流路に注入される。プロトンを流路に注入するために、バイアス極性が反転させられ、その結果、今度は、陽極が流路に隣接する。
【００８５】
次に、ｐＨプロフィルを、ｐＨプロフィルの軸に沿った分子状分析物の移動を誘導するために形成および調節する方法の記載が参照される。この方法は、プロトンおよび／またはヒドロキシルイオンを、ｐＨプロフィルの生成のために利用される電場を支える流路（例えば、容器１０２など）に注入することによって行われる。本明細書中の記載はまた、所望されるｐＨプロフィルを空間において達成するための適切な電解質および注入電流の選択、ならびに、場合によってはそれらを時間において変化させることを教示する。完全なコンピュータ計算に対する単純な近似が、図９Ａに関連して上記で記載されるデバイスによる分離プロセスを設計するためのデバイス操作のシミュレータのためのアルゴリズムとして本明細書中に開示される。
【００８６】
流路（例えば、１０２など）における分離体積部に広がるｐＨ分布を、右側境界条件および開始条件において、下記のポアソン・ボルツマンの式（式２）と一緒になった、関与するすべてのイオンについての下記の輸送式（式１）によって記述することができる：
メートル、キログラムおよび／または秒（ＭＫＳ）の単位で、Ｃｉは化学種ｉのイオンのモル濃度を示し、Ｄｉはｉの拡散係数を示し、μｉはｉの電気移動度を示し、ｚｉはｉのプロトン電荷単位での電荷を示し、Ｆはファラデー定数を示し、Ｒｉは化学種ｉの反応項を示し、ベクトルＥは、例えば、容器１０２のフォーカシング用流路における電場を示す。本明細書中の例はプロトンに関して記載されるが、どの分子状分析物も使用され得ることには留意しなければならない。
【００８７】
場合によっては、後者の式では、溶液において生じる化学反応が、数値解をコンピュータ計算することを可能にする一組のいくつかの非線形微分方程式を形成するように考慮に入れられる。
【００８８】
場合によっては、下記により、動的ｐＨプロフィルを上記分離プロセスのために生じさせるｐＨプロフィル発生器のプログラミングが可能になる。化学反応（例えば、プロトン−ヒドロキシル再結合など）が比較的速いという事実、および、外部電場におけるイオンのドリフト移動が、プロトン／ヒドロキシル注入のごく近傍を除いて、ある種のイオン拡散よりも優位であるという事実を利用すると、定常状態における本質的な物理的現象を取り込む解析的に扱いやすいモデルを定式化することができる。このモデルにより、分離プロセス期間中の上記デバイスの運用法が解明され、所望されるｐＨプロフィルを生じさせるためにパラメータを選択するためのツールが提供される。したがって、そのような単純化されたモデルは、分子状分析物の分離アッセイ（例えば、タンパク質アッセイなど）をデバイスについて計画することにおいて有用なシミュレータのためのアルゴリズムを開示する。
【００８９】
簡潔化のために、２つのタイプのｐＨ変化操作が定義される：フォーカシング用ｐＨ傾斜部および脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部。フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、例えば、図２Ａに示されるように、ｐＨ傾斜部の低電位側でのより大きいｐＨ値およびｐＨ傾斜部の高電位側でのより低いｐＨ値によって特徴づけられる。脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部は逆であり、すなわち、ｐＨ傾斜部の低電位側でのより低いｐＨ値およびｐＨ傾斜部の高電位側でのより大きいｐＨ値によって特徴づけられる（例えば、図７Ａに示されるｐＨ傾斜部ＩＶ）。フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、ｐＩを、ｐＨ傾斜部の高ｐＨ値と、低ｐＨ値との間に有するすべてのタンパク質を捕らえる。脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部はタンパク質を長期間にわたって捕らえない。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプロフィルが、緩衝剤分子を有しない生理的食塩水溶液において形成される。図１０Ａおよび図１０Ｅは、例えば、上記のデバイス１００およびデバイス９００の分離流路１０００へのプロトン注入およびヒドロキシル注入をそれぞれ示す。分離流路１０００は、これには左側および右側のリザーバーによって供給されるが、本明細書中ではｐＨＡおよびｐＨＢ（ただし、ｐＨＡ＞ｐＨＢ）としてそれぞれ示される２つのｐＨ値によって特徴づけられる。流路における関連したイオン（粒子）電流密度が、流路１０００内への注入電流１００１および電場１００２の方向と一緒に示される。図１０Ｂ〜図１０Ｄおよび図１０Ｆ〜図１０Ｈは、様々な注入条件のもとでのｐＨプロフィル軸に沿った例示的なｐＨプロフィルを示す。ｐＨプロフィル軸が図１０Ａおよび図１０Ｅにおいて点線Ａ−Ａとして表される。図１０Ｂ〜図１０Ｄにおいて、ｐＨＡ＝１１およびｐＨＢ＝５。図１０Ｂは、注入電流の非存在（ＪＨ＝０）下におけるｐＨプロフィルを示す。左側リザーバーによって供給されるヒドロキシル電流が、右側リザーバーによって供給されるプロトン電流よりも優位であり、プロトン−ヒドロキシル再結合の前線が、分離流路と、右側リザーバーとの境界で安定化する。流路全域でのｐＨが左側リザーバーにおけるｐＨと同一である。
【００９１】
図１０Ｃは、一部のプロトンが流路に注入された後のｐＨプロフィルを示す。ｐＨ段差帯域ＩＩＩにおける注入点の右側に対するｐＨが、図１０Ｃにおいて実線によって示されるように低下して、フォーカシング用ｐＨ傾斜部を形成する。増大したプロトン注入のために、フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、例えば、図１０Ｃにおいて一点鎖線によって表されるが、この傾斜部がその最大値に達するまで急峻化し続ける。注入を増大して、イオン電流のこの限界値を超えると、ｐＨ傾斜部の反転が生じ、これにより、このｐＨ傾斜部はフォーカシング用ｐＨ傾斜部から脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部に変換されるであろう。結果が図１０Ｄに示される。フォーカシング用ｐＨ傾斜部において、帯域ＩのｐＨは留まっており、一方、帯域ＩＩＩのｐＨは電流に従って変化することには言及しなければならない。逆のことが脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部において当てはまり、すなわち、帯域ＩＩＩにおけるｐＨは一定のままであり、一方、帯域Ｉにおけるその対応する値は、加えられた電流に従って変化する。
【００９２】
例えば、図２Ａに示されるような動的ｐＨプロフィルが生じるとき、図１０Ｃの得られた一点鎖線のフォーカシング用ｐＨ傾斜部は、ｐＩをｐＨ１１〜ｐＨ７の間に有するすべてのタンパク質を集束させる。プロトン注入電流が、図１０Ｃの実線によって示されるｐＨ傾斜部を生じさせるために下げられるとき、ｐＩをｐＨ７〜ｐＨ９の間に有するすべてのタンパク質が放出される。
【００９３】
図７Ａに関連して、図１０Ｄに示される脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、３未満のｐＩを有するタンパク質の右側への移動を加速させることができる。過度なプロトン注入において生じる脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部を、フォーカシング用ｐＨ傾斜部および脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部の両方が必要とされる図７Ａ〜図７Ｅに示される動的ｐＨプロフィルを実行するために利用することができる。
【００９４】
図１０Ｆは、ｐＨＡ＝９、ｐＨＢ＝３およびＪＯＨ＝０である場合についてのｐＨプロフィルを示す。右側のリザーバーによって供給されるプロトン電流が、左側のリザーバーによって供給されるヒドロキシル電流よりも優位であるので、流路１０２におけるｐＨはｐＨＢに等しい。図１０Ｇにおいて、図１０Ｃに示されるのと同様に、ヒドロキシルイオンの少しの注入により、実線によって示されるフォーカシング用ｐＨ傾斜部がもたらされ、一方、一点鎖線は、限界電流が加えられるときに達成される最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部を例示する。この電流を超えると、図１０Ｈに示されるように、ｐＨ傾斜部が反転することが引き起こされるであろう。図４Ａ〜図４Ｅに示されるシーケンスを、等電点をｐＨ３〜ｐＨ７の間に有するタンパク質についてこの形態で実現することができる。
【００９５】
図１０Ａ〜図１０Ｄの帯域Ｉおよび帯域ＩＩＩにおける定常状態ｐＨ値を、下記の式を使用してコンピュータ計算することができる：
また、図１０Ｅ〜図１０Ｈに示されるようなヒドロキシルイオン注入の場合については、式は下記の通りである：
式３および式５はヒドロキシルイオンの保存を表し、式４および式６はプロトン電流の保存を表す。これら２つの式では、下記の反応による水の生成および分解：
ならびに、対応する質量作用の法則：
が考慮に入れられる。
【００９６】
これらの式において、ＪＨＩ，ＩＩＩ、ＪＯＨＩ，ＩＩＩ、ＪＨ２ＯＩ，ＩＩＩは、帯域Ｉおよび帯域ＩＩＩにおける、プロトン、ヒドロキシルおよび水の粒子電流密度をそれぞれ示し、［Ｈ＋］Ｉ，ＩＩＩ、［ＯＨ−］Ｉ，ＩＩＩは、それぞれの帯域におけるプロトンおよびヒドロキシルイオンのモル濃度をそれぞれ示し、Ｋｗ＝１０−１４Ｍ−２は水の平衡定数を示す。
【００９７】
これらの例示的条件のもとでは、電場によって引き起こされたイオンのドリフト移動が、拡散によって引き起こされるドリフト移動よりも優位であり、電流密度は下記のイオン密度に単に比例するだけである：
【００９８】
プロトン注入についての式３、式４、式８および式９、ならびに／または、ヒドロキシル注入についての式５、式６、式８および式９を解くことにより、分子状分析物の移動を誘導するための、また、ｐＨプロフィルに沿って集束させるための動的ｐＨプロフィルを生じさせるために必要とされるパラメータが与えられる。帯域Ｉおよび帯域ＩＩＩにおけるイオン濃度の関係を、フォーカシング用ｐＨ傾斜部または脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部のサイズを注入イオンの関数として計算することを可能にすることによって得ることができる。加えて、モデルにより、ｐＨ傾斜部が反転する前の最大の達成可能なｐＨフォーカシング用傾斜部の値が、その対応する限界電流とともに予測される。解くべきこの一組の式は、偏微分方程式ではなく、むしろ、代数方程式であり、したがって、生じるｐＨ傾斜部の迅速な計算が、比較的低い計算力を使用して短時間で容易になることには留意されたい。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプロフィルが緩衝化溶液（例えば、緩衝剤分子を有する生理的食塩水溶液など）において形成される。
【０１００】
ＡＨ−およびＡ−２として本明細書中で示される２つの緩衝剤化学種が、下記の平衡定数Ｋａ（式１１）を有する下記の反応（式１０）に関与する：
プロトン注入の場合、プロトン、ヒドロキシルイオンおよび緩衝剤分子についての質量バランスを下記のように定義することができる：
上記式において、ＪＡＮＩ，ＩＩＩおよびＪＡＩ，ＩＩＩは２つの緩衝剤形態の電流密度を示す。ヒドロキシルイオンについての質量バランス（これは式３で定義される通りである）は同じままであり、一方、プロトンの質量バランス（これは式１２で定義される通りである）は、緩衝剤分子によって運ばれるプロトンを説明するために修正される。式１３は、緩衝剤分子についての質量バランスを定義する。式９において定められるプロトンおよびヒドロキシルイオンの場合でのように、これらの化学種の電流はそれらの濃度に比例している：
【０１０１】
プロトンではなく、むしろ、ヒドロキシルイオンが注入されるならば、ＪＨは式１２から除かれなければならず、かつ、ＪＯＨが式３の左辺に加えられなければならない。
【０１０２】
式３、式８〜式９および式１１〜式１４を解くことにより、それぞれの帯域における化学種濃度の関係が与えられ、ｐＨ傾斜部の険しさ、最大のｐＨフォーカシング用傾斜部、および、対応する限界電流の計算が可能になる。
【０１０３】
図１１Ａおよび図１１Ｃが参照される。図１１Ａおよび図１１Ｃは、プロトン注入およびヒドロキシル注入の場合において、緩衝化溶液を有する容器（例えば、１０２など）を関連した電流密度と一緒にそれぞれ示す。図１１Ａおよび図１１Ｂの場合でのように、リザーバーにおけるｐＨレベルが、プロトンが注入されるときはｐＨＡ＝１１およびｐＨＢ＝５であり、ヒドロキシルイオンが注入されるときはｐＨＡ＝９およびｐＨＢ＝３である。図１１Ｂおよび図１１Ｄもまた参照される。図１１Ｂおよび図１１Ｄは、軸（例えば、図１１Ａおよび図１１Ｃにおいて点線Ａ−Ａなど）に沿ったｐＨプロフィルを示す。前記のように、図１１Ｂおよび図１１Ｄにおける実線は、小さい注入電流を加えることによってもたらされるフォーカシング用ｐＨ傾斜部を示し、一方、一点鎖線は、限界電流密度が加えられるときに達成可能な最長のフォーカシング用ｐＨ傾斜部を示す。上記と同様に、電流を、その限界値を超えて上げることにより、ｐＨ傾斜部の反転が生じる。図１１Ｂと、図１０Ｃとを、また、図１１Ｄと、図１０Ｇとを比較することによって、緩衝剤分子の存在下における最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部が、緩衝剤分子が存在しないときのそれらの対応する最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部よりも長いことが明らかである。図１１Ｂに示されるプロトン注入の具体的な例では、適量の緩衝剤が、右側リザーバーの値よりも低い値に至る酸性ｐＨに達する最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部サイズを可能にするために加えられる。このことは、非緩衝化溶液における最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部が結局は中性ｐＨに達することを明らかにする図１１Ｃとは対称的である。図１２は、プロトンが注入されるときの帯域ＩＩＩにおいて、電気電流における変化と、緩衝化溶液および非緩衝化溶液のｐＨとの間における相関を示すグラフであり、この点をさらに強調する。これは、図１２が、１１．５の初期ｐＨおよびその限界電流での終了ｐＨにおける２つのｐＨプロットの間における差を示すからである。一方が緩衝化溶液１２０１についてであり（ｐＫａ＝７およびＡＴＯＴ＝Ａ−２＋ＡＨ−＝１０ｍＭ）、他方が非緩衝化溶液１２０２についてである。図１２に示されるように、緩衝化溶液１２０１の限界電流が非緩衝化溶液１２０２の限界電流よりもはるかに大きい。さらに、前者における最小ｐＨレベルが後者における最小ｐＨレベルよりもはるかに低い。この図をより綿密に調べることにより、ｐＨ１１．５と、ｐＨ９との間において、これら２つの溶液は基本的に同じ挙動を有することが明らかにされる。これは、この範囲において、プロトンと反応する唯一の化学種がヒドロキシルイオンであるからである。この点を超えると、非緩衝化系は急速に崩れ、例えば、脱フォーカシング用傾斜部に変わり、一方、緩衝化溶液は、安定したフォーカシング用ｐＨ傾斜部をＡ−分子の消費により維持し続ける。この特徴は、図１１Ｂでもまた明らかにされるが、緩衝化溶液では、より長いフォーカシング用ｐＨ傾斜部が生じ得ることを示している。緩衝剤の非存在下では、フォーカシング用ｐＨは、ｐＨ≒７よりも低く下げることができず、一方、適切な緩衝剤の存在下では、範囲を、ｐＨ≒４、また、それどころか、それよりも低いｐＨに至る酸性状況にまで広げることができ、このことは、より大きいｐＨ範囲でのｐＨプロフィルの実行を可能にする。ｐＨ段差サイズの拡大が、ヒドロキシルイオンが注入されるときの基本的状況でもまた行われ得ることには言及されなければならない。例えば、図１１Ｃに示されるように、適切な緩衝剤の存在下におけるｐＨ段差サイズは、ｐＨ≒１０と同じ程度の塩基性ｐＨ、また、それどころか、それを超えたｐＨを達成することができる。図１２に示されるように、電流に対する大きい抵抗性に、緩衝剤の対数での酸解離定数（ｐＫａ）に等しいｐＨ７で達する。このことは、安定したフォーカシング用ｐＨ傾斜部が、そのｐＫａがｐＨＩまたはｐＨＩＩＩのどちらかに近い緩衝剤を使用してもたらされ得ることを示唆する。
【０１０４】
場合によっては、緩衝化溶液は、系に加えられるべき電流の選択された範囲を得るために調節される。例えば、容器１０２は、１ｍｍの典型的な断面を有し、かつ、ｐＨ８の非緩衝化溶液で満たされる流路である。プロトン濃度がｐＨ７に上がる非緩衝化溶液は、およそ約４・１０−８Ａの電流を必要とし、そのような電流は、加えることが極めて困難である。さらに、この場合における傾斜部の安定性は非常に低いであろう。これは、このまさにその電流からのどのような小さいずれも、ｐＨにおける強いずれを生じさせるであろうからである。しかしながら、ｐＫａ＝７の、１０ｍＭの緩衝剤が加えられるならば、そのような傾斜部をもたらすための必要な電流が約５・１０−５Ａに増大し、これは、変動に対してはるかにより大きい安定性を伴ったはるかにより実現可能な電流である。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプロフィルが、様々な電荷（例えば、２または３）を有する複数のプロトン化状態を有する緩衝剤の混合物を含有する多重緩衝化溶液において形成される。簡潔化のために、Ａｉ−２およびＡＨｉ−が負の荷電の化学種についての２段階緩衝剤を示し、Ｂｊ＋およびＢＨｊ＋２が正荷電の化学種についての２段階緩衝剤を示し、ＫａｉおよびＫｂｊがそれぞれの平衡定数を示し（ただし、ｉおよびｊは緩衝剤添え字を示す）、ＡＤ，ｋ−３、ＡＤＨｋ−２およびＡＤＨ２，ｋ−が、Ｋａ１Ｄ，ｋ、Ｋａ２Ｄ，ｋの平衡定数を有する３段階緩衝剤を示し、ＢＤ，ｌ＋、ＢＤＨｌ＋２およびＢＤＨ２，ｌ＋３が、Ｋｂ１Ｄ，ｋおよびＫｂ２Ｄ，ｋの平衡定数を有する３段階緩衝剤を示す（ただし、ｋおよびｌは緩衝剤添え字を示す）。緩衝剤化学種のそれぞれ１つが、下記でさらに記載されるように、正または負のどちらかで荷電することには留意しなければならない。これらの緩衝剤のプロトン化反応は下記のように定義することができる：
この式系は、下記の質量バランス：
および、質量作用の法則：
ならびに、
から構成される。
【０１０６】
これらの式を、数値法を使用して解くことにより、上記と同様に、最大注入電流、最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部などとしての必要なパラメータが与えられる。これらの代数方程式（式１６〜式１８）を解くことにより、上記で記載されたように、１つまたは複数のｐＨ傾斜部を計算することが可能になることには留意しなければならない。そのような様式で、偏微分方程式（式１および式２など）の計算を回避することができ、したがって、計算プロセスのコンピュータ計算の複雑性が削減される。
【０１０７】
図１３は３つの緩衝剤（それらのうちの２つが２つのプロトン化状態を有し、１つが３つのプロトン化状態を有する）のシミュレーションである。様々な平衡定数が示される。３つの緩衝剤が関与するので、ｐＨプロフィルが、様々な地点での様々なフォーカシング用ｐＨ傾斜部の生成を容易にする広い範囲で存在している。これらの種類の混合物により、様々な動的ｐＨプロフィルを効率的に確立することができる。
【０１０８】
次に、本発明のいくつかの実施形態による、分離体積部のための電解質溶液を選択するプロセスが参照される。電解質は２つの大きな群に分けることができる：分離体積部（例えば、容器１０２）において反応を受ける緩衝剤分子、および、背景媒体として作用する支持イオン。
【０１０９】
分子状分析物の移動を容易にするために、緩衝化溶液のプロトン化状態は、動的ｐＨプロフィルの帯域のすべてによって規定されるｐＨ範囲で荷電しなければならない。そのような様式で、ｐＨ傾斜部における定常状態を達成することができ、容器１０２におけるイオン流束が、加えられた電場によって維持される。緩衝化溶液が荷電するとき、化学種がｐＨプロフィルに沿って動くが、時間とともに蓄積しない。対照的に、中性分子は場によって影響されず、両方向にゆっくり拡散し、このことは、定常状態に達する時間を相当に増大させる。
【０１１０】
体積分離を容易にするために、容器１０２における緩衝剤は、推定されるｐＨプロフィルのｐＨ範囲全体を覆うように選択される。さらに、電流に対するデバイスの抵抗がｐＨ範囲にわたって変化することが、図１２および図１３において以前に示された。すなわち、注入電流密度における所与の増大についての生じるΔｐＨがｐＨ依存的である。
【０１１１】
次に、図１４が参照される。図１４は、本発明のいくつかの実施形態による、緩衝化溶液を１つまたは複数の分子状分析物（例えば、分子状分析物の特定の混合物）のために設定する方法のフローチャート１４００である。緩衝剤要素は、ピロリン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、炭酸塩および／またはＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンなどであり得る。
【０１１２】
最初に、１４０１において示されるように、プローブ探査された混合物における１つまたは複数の分子状分析物のｐＩが提供される。その後、１４０２において示されるように、緩衝剤が、受け取られたｐＩに従って選択される。次に、１４０３において示されるように、緩衝剤の濃度およびタイプが選定され、例えば、受け取られたｐＩに従ってコンピュータ計算および選択される。緩衝剤の濃度が、高い緩衝剤濃度では、大きい電流を伴うイオン源が必要とされ、低い緩衝剤濃度では、電流変動に対して安定していない不安定なｐＨ傾斜部が形成されるかもしれないことを考慮に入れながら計算される。
【０１１３】
例えば、混合物が、ｐＩを５〜７の間に有するタンパク質を含有するならば、適切な電解質は、ｐＫａをそれぞれの範囲に有するか、または、ｐＫａがそれぞれの範囲に十分に近い少なくとも１つの緩衝剤を含有しなければならない。加えて、この緩衝剤の総濃度は、イオン注入における避けられない変動がｐＨ傾斜部の安定性に対する強い影響を有しないであろうように十分に高くなければならない。上記モデルを正確に保つために、容器１０２に沿った電気的性質（例えば、電気伝導性）は一定に維持される。そのような様式で、容器１０２における溶液の電気的性質は、例えば、上記で記載されるように、分子状分析物の移動を安定的および／または予測通りに誘導する動的ｐＨプロフィルを生じさせるために好適なままである。そのような支持イオンが存在しない場合、ｐＨ傾斜帯域の２つの側の間での電気伝導性における差が、異なるイオンプロフィルに起因して予想される。支持イオン（これは本明細書中では支持電解質として示される）を特定の濃度で加えることにより、分離溶液における電気伝導性の差が小さくなり、したがって、モデルの予測がより正確になる。しかしながら、濃度が特定の閾値を超えて大きくなるとき、容器１０２の望ましくない加熱が誘導されるかもしれない。適切な支持電解質を選定するときには、容器１０２の総イオン強度、加えられた電場の大きさ、および、容器１０２の大きさを考慮に入れなければならない。例えば、１１．５〜４のｐＨ範囲における実行のために好適な電解質のふさわしい処方が下記の通りである：
【０１１４】
次に、１４０４において示されるように、２つ以上の分子状分析物を分離するプロセスのために設定される緩衝剤濃度を有する緩衝化溶液が１４０２に従って設定される。緩衝剤濃度を設定することが、溶液をよりｐＨ抵抗性にするように、したがって、上記イオン注入によって誘導される変動に対してより安定となるように行われる。
【０１１５】
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連する方法およびシステムが開発されることが予想され、コントローラ、センサーおよびコンピュータユニットの用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
【０１１６】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１１７】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含する。
【０１１８】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１２０】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０１２１】
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０１２２】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１２３】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１２４】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１２５】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１２６】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年８月２６日に出願されたＰＣＴ／ＩＬ２００８／００１１５９（２００９年３月５日に公開されたＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ２００９／０２７９７０）、米国仮特許出願Ｎｏ．６１／２７２，１１０（２００９年８月１８日出願）、及び米国仮特許出願Ｎｏ．６１／３４９，９１９（２０１０年５月３１日出願）を参考として組み入れる。
【０００２】
本願は、２００９年８月１８日に出願した米国仮特許出願Ｎｏ．６１／２７２，１１０及び２０１０年５月３１日に出願した米国仮特許出願Ｎｏ．６１／３４９，９１９の利益を主張する。
【０００３】
技術分野
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子の分析および分離に関連し、より具体的には、しかし、限定ではないが、エレクトロフォーカシングを使用する分子の分析および分離のための方法に関連する。
【背景技術】
【０００４】
等電点フォーカシングは、分析物サンプルにおける分子を、分子の異なるイオン的性質を利用することによって分離するための分析技術である。
【０００５】
等電点フォーカシングは通常、固定化されたプロトン濃度勾配、一般には、所与の方向でより高いｐＨからより低いｐＨにまで変化するプロトン濃度勾配を有する電解質溶液（場合によっては、例えば、ポリアクリルアミド、デンプンおよび／またはアガロースに基づくゲル形態での電解質溶液）において行われる。一部の実施では、溶液は、電場のもとでｐＨプロフィルを生じさせる両性電解質を含有する。等電点フォーカシングでは、分離が、分離距離全体を占め、かつ、勾配におけるｐＨが陽極から陰極に向かって増大するｐＨプロフィルにおいて生じる。使用時において、分析物が電解質溶液におけるある場所に負荷される。それぞれの異なる分子の電荷が、分子の様々な官能基の酸性度（ｐＫａ）に従って周囲のプロトン濃度に応答して変化する。
【０００６】
電位が、等電点フォーカシング陽極と、等電点フォーカシング陰極との間でプロトン濃度勾配と平行に加えられる。正味の正電荷を有する分子が電解質溶液を通って陰極に向かって移動し、一方、正味の負電荷を有する分子が電解質溶液を通って陽極に向かって移動する。
【０００７】
これらの分子が移動するにつれ、周囲のｐＨが変化して、分子における正味の電荷を減少させ、ついには、分子が、周囲のｐＨのためではあるが、分子における正味の電荷がゼロとなる等電点（ｐＩ）に達する。ｐＩは、特定の分子または表面が正味の電荷を持たないｐＨである。この地点で、移動中の分子は、ゼロの電荷を有するので停止する。そのような様式において、等電点フォーカシングは、特定のｐＩを有する分子を電解質溶液の比較的狭い体積に集中させる。等電点フォーカシングは、タンパク質をその酸性度に従って特徴づけることによってタンパク質の分析のために有用である。より重要なことであるが、等電点フォーカシングは、タンパク質の混合物を分離するために有用である。
【０００８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２００９／０２７９７０（２００９年３月５日発行、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、プロトンの局所的濃度、プロトン濃度勾配および所望されるプロトン濃度トポグラフィーを、電解質を含む環境（例えば、電解質溶液またはゲルなど）において生じさせる際に有用な方法およびデバイスを記載する。この特許出願はまた、等電点フォーカシングのための方法およびデバイスを開示する。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法が提供される。本方法は、複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを前記分離体積部の軸に沿って生じさせること、および、ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物のうちの第１の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第２の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節すること（ただし、前記第１および第２の分子状分析物は異なるｐＩを有する）を含む。
【００１０】
場合によっては、前記ｐＨプロフィルは、異なるｐＨレベルを有する少なくとも２つのｐＨ段差帯域を有し、前記複数の分子状分析物が、前記調節することの前に、実質的に均一なｐＨを有する前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込められ、前記調節することが、前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを変化させることを含む。
【００１１】
場合によっては、前記調節することが、時間において徐々に行われる。
【００１２】
場合によっては、前記ｐＨプロフィルは少なくとも１つの傾斜部によって定義され、前記複数の分子状分析物が前記少なくとも１つの傾斜部に蓄積する。
【００１３】
場合によっては、前記生じさせることは、電場を前記軸に沿って前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を前記軸に沿った複数の地点において注入して、前記ｐＨプロフィルを確立することを含む。
【００１４】
場合によっては、前記方法は、前記ｐＨプロフィルを安定化させるように少なくとも１つの緩衝剤要素を前記溶液に加えることを含む。
【００１５】
場合によっては、前記方法は、前記第１の分子状分析物を、前記第２の分子状分析物が前記分離体積部に留まっている間に回収することを含む。
【００１６】
場合によっては、前記方法は、前記プロフィルを、前記第２の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第３の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節すること（ただし、前記第２および第３の分子状分析物は異なるｐＩを有する）を含む。
【００１７】
場合によっては、前記調節することは、前記プロフィルを、前記第１および第２の分子状分析物が前記軸に沿って反対方向に移動することを誘導するために調節することを含む。
【００１８】
場合によっては、前記調節することは、前記プロフィルを、前記軸に沿った前記移動の方向を変化させて、その結果、前記第１の分子状分析物が２つの向かい合う方向で連続してドリフト移動するようにするために調節することを含む。
【００１９】
場合によっては、前記複数のｐＨ帯域は、実質的に均一な第２のｐＨを有する中間段差帯域によって区分けられる実質的に均一な第１のｐＨを有する２つの段差帯域を有し、前記混合物が、前記２つの段差帯域のうちの１つと、前記中間段差帯域との間に閉じ込められ、前記調節することが、前記中間段差帯域におけるｐＨを変化させることを含む。
【００２０】
場合によっては、前記複数のｐＨ帯域は、少なくとも３つの異なるｐＨ帯域を含み、前記調節することが、前記第１の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第１の対の間における第１の傾斜帯域に移動し、かつ、前記第２の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第２の対の間における第２の傾斜帯域に移動することを誘導するように徐々に行われる。
【００２１】
場合によっては、前記溶液は緩衝化される。
【００２２】
場合によっては、前記方法は、前記混合物における１つまたは複数の分子状分析物の等電点を提供し、前記溶液を等電点に従って設定し、これにより、前記溶液の緩衝剤濃度を前記等電点に従って決定すること、および、前記溶液を前記決定することに従って設定することを含む。
【００２３】
場合によっては、前記調節することは、前記第１および第２の分子状分析物を前記軸に沿って互いに離れて集束させることを含む。
【００２４】
さらなる場合によっては、さらに、前記第１および第２の集束させた分子状分析物を前記軸に沿った異なる場所から別々に回収することを含む。
【００２５】
場合によっては、前記生じさせることは、前記ｐＨプロフィルを一組の代数式に従って計算することを含む。
【００２６】
場合によっては、前記調節することは、前記ｐＨプロフィルについての少なくとも１つの調節を一組の代数式に従って計算し、前記調節することを前記少なくとも１つの調節に従って行うことを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法が提供される。本方法は、複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、前記複数の分子状分析物を、前記溶液を含有する分離体積部において２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込めること（ただし、それぞれの前記ｐＨ段差帯域が、異なる実質的に均一なｐＨを有する）、および、前記２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを、前記複数の分子状分析物が複数の別個の群で連続して移動することを誘導するために徐々に変化させること（ただし、それぞれの前記群が異なるｐＩを有する）を含む。
【００２８】
場合によっては、前記閉じ込めることは、前記２つのｐＨ段差帯域を確立するために、電場を前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を少なくとも１つの地点において注入することを含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離する方法が提供される。本方法は、複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを、複数の分子状分析物を有する溶液において生じさせること、および、前記ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物がそれらのそれぞれの等電点に従って空間的に分離されることを誘導するために一定の期間にわたって徐々に変化させることを含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離するデバイスが提供される。本デバイスは、複数の分子状分析物を有する溶液を含有するためのサイズおよび形状を有する、軸に沿う容器と、電場を前記溶液において軸に沿って加える電源と、複数のイオン流を注入して、前記溶液の複数の帯域をプロトン化することおよび脱プロトン化することの少なくとも一方に至ることによって、ｐＨプロフィルを前記溶液において前記軸に沿って確立するための複数のイオン源と、前記ｐＨプロフィルを徐々に調節して、その結果、それぞれの前記分子状分析物が前記軸に沿って別々に移動することを誘導するようにするために前記複数のイオン源を操作するコントローラとを含む。
【００３１】
場合によっては、前記デバイスはさらに、コンピュータユニットおよび使用者のうちの少なくとも１つからの複数の指示を受け取るためのインターフェースを含み、ただし、前記コントローラにより、前記複数のイオン源が前記複数の指示に従って操作される。
【００３２】
場合によっては、前記容器は１ミリメートル未満の少なくとも１つの大きさを有する。
【００３３】
場合によっては、前記溶液は非ゲル溶液である。
【００３４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００３６】
【図１】図１は、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離する方法のフローチャートである。
【００３７】
【図２Ａ−２Ｅ】図２Ａ−２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による動的ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器における溶液に存在する分子状分析物に対するその影響を概略的に例示するグラフィック図である。
【００３８】
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離体積部において分離する例示的な分離デバイスの側面図の概略図である。
【００３９】
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による、その流路に沿って存在するｐＨセンサーのアレイを有する図３Ａに示されるような例示的な分離デバイスの側面図の概略図である。
【００４０】
【図４Ａ−４Ｅ】図４Ａ−４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に従って、図２Ａ−図２Ｅに示される移動とは逆である方向への分子状分析物の移動を誘導するために調節されるｐＨプロフィルの概略図である。図４Ｃ−図４Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物の二方向の動きを誘導するために調節されるｐＨプロフィルの概略図である。
【００４１】
【図４Ｇ−４Ｋ】図４Ｇ−４Ｋは、本発明のいくつかの実施形態による動的な多段階ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器における溶液に存在する分子状分析物に対するその影響を概略的に例示するグラフィック図である。
【００４２】
【図５Ａ−５Ｇ】図５Ａ−５Ｇは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物がどのように、ｐＨプロフィルの端部の近くに位置するｐＨ傾斜帯域に向かって連続的にドリフト移動させられるかを図示する概略図である。
【００４３】
【図６】図６は、本発明のいくつかの実施形態による、異なるｐＩを有する分子状分析物をｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度で別々にドリフト移動させる方法である。
【００４４】
【図７Ａ−７Ｅ】図７Ａ−７Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物がどのように、動的ｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度でドリフト移動させられるかを図示する概略図である。
【００４５】
【図８Ａ−８Ｅ】図８Ａ−８Ｅは、本発明のいくつかの実施形態に従って、分子状分析物がどのように、動的ｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度でドリフト移動させられるかを図示するさらなる概略図である。
【００４６】
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａは、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらのｐＩに基づいて分離する例示的なデバイスの概略図である。図９Ｂ−９Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による図９Ａの例示的なデバイスにおいて使用され得る例示的なイオン源の概略図である。
【００４７】
【図１０Ａ−１０Ｈ】図１０Ａおよび１０Ｅは、本発明のいくつかの実施形態によるプロトン注入およびヒドロキシル注入の場合において、非緩衝化溶液を有する容器（例えば、図３に示される容器など）を関連した電流密度と一緒に示す。図１０Ｂ−１０Ｄおよび図１０Ｆ−１０Ｈは、本発明のいくつかの実施形態による、軸に沿った動的ｐＨプロフィル（例えば、図１０Ａおよび図１０Ｅに示される動的ｐＨプロフィルなど）をそれぞれ示す。
【００４８】
【図１１Ａ−１１Ｄ】図１１Ａおよび１１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態によるプロトン注入およびヒドロキシル注入の場合において、緩衝化溶液を有する容器（例えば、図３に示される容器など）を関連した電流密度と一緒に示す。図１１Ｂおよび図１１Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による、軸に沿ったｐＨプロフィル（例えば、図１１Ａおよび図１１Ｃに示されるｐＨプロフィルなど）を示す。
【００４９】
【図１２】図１２は、本発明のいくつかの実施形態による、電気電流における変化と、緩衝化溶液および非緩衝化溶液のｐＨとの間の相関を示すグラフである。
【００５０】
【図１３】図１３は、本発明のいくつかの実施形態による、電気電流における変化と、３つの緩衝剤（それらのうちの２つが２つのプロトン化状態を有し、１つが３つのプロトン化状態を有する）を有する溶液におけるｐＨとの間の相関を示すグラフである。
【００５１】
【図１４】図１４は、本発明のいくつかの実施形態による、緩衝化溶液を１つまたは複数の分子状分析物のために設定する方法のフローチャート１４００である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、分子の分析および分離に関連し、より具体的には、しかし、限定ではないが、エレクトロフォーカシングを使用する分子の分析および分離のための方法に関連する。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なる等電点（ｐＩ）を有する分子状分析物の混合物を時間的に分離する方法およびデバイスが提供される。本方法は、異なるｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを、分子状分析物（例えば、タンパク質など）の混合物を伴う溶液を含む分離体積部において生じさせることに基づく。ｐＨプロフィル（これは場合によっては段階的である）が形成された後で、そのプロフィルが、分子状分析物がそれらのそれぞれのｐＩに従って空間的に分離されることを誘導するために、一定の期間、徐々に変化させられる。場合によっては、プロフィルは、異なるｐＩを有する別個の動きを共通の軸（例えば、ｐＨプロフィル軸など）に沿って誘導するように変化させられる。異なるｐＩを有する分子状分析物が、向かい合う方向で同時または連続して、および／あるいは、共通の方向で連続してドリフト移動し得る。場合によっては、プロフィルは、ｐＨプロフィルの実質的に安定したｐＨを有する１つまたは複数の段差帯域においてｐＨを徐々に増減することによって変化させられる。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、異なるｐＩを有する複数の分子状分析物の混合物を分離するデバイスが開示される。本デバイスは、複数の分子状分析物を有する溶液を含有するために所定のサイズおよび形状を有する、軸に沿う容器、例えば、約１ミリメートル以下の平均直径を有する流路、例えば、１００×３×０．３ｍｍの切断断面を有する流路を含む。本デバイスはさらに、電場を溶液において軸に沿って、例えば、流路の軸に沿って加える高電圧電源装置を含む。本デバイスはさらに、ｐＨを分離体積部のいくつかの帯域において上げ下げするイオン流を注入することによってｐＨプロフィルを溶液において軸に沿って確立するために設定されるイオン源を含み、例えば、イオン源は、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願）において定義されるようなものであり得る。イオン源は、それぞれの分子状分析物のそれぞれ１つが、場合によっては連続するが、軸に沿って別々に移動することを誘導するようにｐＨプロフィルを徐々に調節するために複数のイオン源を操作するコントローラに接続される。場合によっては、コントローラは、使用者が、ｐＨプロフィルを生じさせるための指示を与え、また、ｐＨプロフィルを、分子状分析物の移動を誘導するために動的に変化させることを可能にするコンピュータユニットおよび／またはインターフェース（例えば、マニュアルインターフェースなど）に接続される。
【００５５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるか、および／または図面および／または実施例において例示される構成要素および／または方法の組み立ておよび構成の細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００５６】
次に、図１が参照される。図１は、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点（ｐＩ）に基づいて分離する方法５０のフローチャートである。本明細書中で使用される場合、分子状分析物は、プロトン化／脱プロトン化を受け得る分子、生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドに基づく医薬化合物および生体分子に基づく医薬化合物など）、および、ｐＨに依存する物体（例えば、コロイドなど）または何らかの他の荷電分子を意味する。分離が、場合によっては、分子状分析物を含む溶液（例えば、電解質溶液など）において、分離体積部に沿って行われる。
【００５７】
最初に、５１において示されるように、異なるｐＨ段差帯域を有するｐＨプロフィルが、分子状分析物の混合物を伴う溶液において生じさせられる。ｐＨプロフィルが特定の軸の端から端まで形成される（この軸は本明細書中ではｐＨプロフィル軸として示されることがある）。電気的電位が、例えば、下記で記載されるように、イオン流を誘導するためにｐＨプロフィル軸に沿って加えられる。ｐＨプロフィルが、混合物の分子を異なるｐＨ段差帯域の間におけるｐＨ傾斜帯域に閉じ込められるように形成される。例えば、図２Ａは、３つの分子状分析物（これらは、丸で囲まれた数字（１、２および３）により表される）が、高ｐＨ段差帯域と、低ｐＨ段差帯域との間の傾斜部に存在するｐＨプロフィルを示す。場合によっては、ｐＨプロフィルが、図３Ａおよび図３Ｂに関連して下記で記載されるようなデバイスを使用して生じさせられる。分子状分析物（例えば、タンパク質など）は、プロトン濃度が高い低ｐＨ値では正の電荷を有し、プロトン濃度が低い高ｐＨ値では負の電荷を有すると推測される。ｐＨプロフィルは、ｐＨレベルを、例えば、図３Ａおよび図３Ｂの数字１０２などにおいて示されるように、上記溶液を含有する容器の異なる帯域に沿って制御することによって確立することができる。この制御を、ｐＨ段差帯域におけるプロトン濃度を調節することによって達成することができる。
【００５８】
次に、５２において示されるように、ｐＨプロフィルのプロフィルが、分子状分析物の１つまたは複数が、例えば、ｐＨプロフィル軸に沿って、それらの等電点に基づいて移動することを誘導するために調節される。ｐＨプロフィルの調節により、分子状分析物のそれらのｐＩに基づく可動化がもたらされる。それぞれの分子状分析物がｐＨプロフィル軸に沿ってドリフト移動し、ついには、それぞれの分子状分析物が、そのｐＨが正味の電気的電荷を携行させないｐＨ帯域に達する。この帯域において、その局所的ｐＨはそのｐＩに等しく、その結果、分子状分析物のドリフト移動速度がほぼゼロに低下し、分子状分析物は停止する。下記でさらに記載されるように、そのような移動は、異なるｐＩを有する複数の別個の分子状分析物群をｐＨプロフィル軸の端から端まで形成する。場合によっては、分離は、外部電場の存在下における荷電分子状分析物の移動度特性（例えば、そのドリフト移動速度）に基づく。これらの特性はそれらの電荷に比例しており、したがって、ｐＨプロフィル軸に沿った帯域における変化するｐＨに沿って変化する。
【００５９】
場合によっては、ｐＨプロフィルが時間的に制御される。例えば、ｐＨプロフィルが、ある期間に沿ったモニターされている間隔で徐々に調節される。異なるｐＩを有する異なる分子状分析物は異なるドリフト移動速度を有するので、ｐＨプロフィルに沿ったそれらの移動の速さが異なる。そのようなものとして、分子状分析物が特定のプロフィルにおけるｐＨプロフィルに沿って特定の距離を移動するために要する時間により、そのｐＩが示される。そのようなものとして、異なる分子状分析物が、特定のプロフィルを有するｐＨプロフィルに沿った特定の目標場所に到達する順番により、その相対的ｐＩ値が示される。そのうえ、ドリフト移動速度が分子状分析物毎に異なるので、分子状分析物の群を、分子状分析物の群を分離体積部においてｐＨプロフィル軸に沿って異なる速度で可動化することによって分離することができる。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、一定の期間中に制御可能に調節されるｐＨプロフィルは動的ｐＨプロフィルとして示される。動的ｐＨプロフィルを分離体積部において確立することによって、分子状分析物は、空間的に分離されるのではなく、すなわち、異なるｐＨ帯域に対して分離されるのではなく、時間的に分離され、すなわち、異なる時間枠で分離体積部における共通の場所に到達するように分離される。例えば、ｐＨプロフィルを上記のように変化させることにより、分離体積部における特定の帯域への分子状分析物の到達を時間的に分離することが可能となる。このことは、下記でさらに記載されるように、その前方で可動化される分子状分析物をプローブ探査するためのプローブ探査ユニット、または、その前方で可動化される分子状分析物を診断するための診断ユニットを設置することを可能にする。ｐＨプロフィルが特定の静的プロフィルで設定されるとき、分子状分析物はそれに沿って特定の場所に停止させられる。ｐＨプロフィルのプロフィルが動的に徐々に変化させられるとき、特定の帯域における時間依存的ｐＨ変化が、異なる分子の間における時間での分離をもたらすので、分子状分析物が連続して放出される。ｐＨプロフィルのゆっくりした変化によって、接近したｐＩ値を有する２つの分子の、特定のｐＨ傾斜帯域（タンパク質が分離前にこの傾斜帯域に濃縮される）からの放出時間における分離を任意に大きくすることができ、このことは、任意に小さいｐＩ差によって特徴づけられるタンパク質の分離をもたらす。そのような分離が空間的に達成される。
【００６１】
次に、図３Ａが参照される。図３Ａは、本発明のいくつかの実施形態による、分子状分析物をそれらの等電点（ｐＩ）に基づいて分離体積部において分離する例示的な分離デバイス１００の側面図の概略図である。この分離は、分子状分析物を別々に診断および／または回収することを可能にする。分離デバイス１００は、時間依存的なｐＨ閉じ込めを溶液において有する時空的ｐＨプロフィル、すなわち、動的ｐＨプロフィルをもたらす。ｐＨプロフィルが、ｐＨをｐＨ段差帯域の１つに対して変化させることによって調節されるとき、一部の分子状分析物が閉じ込めから放出され、一方、一部は閉じ込められたままである。そのような様式で、異なる分子状分析物を互いに分離させることができる。分離デバイス１００は、分離体積部を規定し、かつ、溶液（例えば、電解質溶液など）を含有する容器１０２のごく近くにアレイとして場合によっては配置される複数のイオン源１０１を含む。容器１０２は本明細書中では流路および／またはフォーカシング用流路として示されることがある。下記でさらに記載されるように、イオン源１０１は、容器１０２の複数の異なる帯域において複数のイオン流を容器１０２に供給することによってｐＨプロフィルを溶液において確立するために設置される（ただし、それぞれのイオン流により、異なる帯域のｐＨレベルが変化させられる）。それぞれのイオン源１０１が、ｐＨプロフィルが確立される容器１０２内の分離体積部におけるそれぞれのｐＨ帯域においてｐＨを変化させる。場合によっては、イオン源１０１は、イオン流を生じさせ、そのイオン流をフォーカシング用流路１０２に注入することによって、ｐＨレベルを、容器１０２の長さ軸９９と平行するｐＨプロフィル軸、または、それと平行する任意の他の軸に沿った異なる帯域において制御する。場合によっては、例えば、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、イオン源１０１はｐＨ発生器であり、容器はフォーカシング用流路である。
【００６２】
図３Ａに示されるように、容器１０２の左側面および右側面のそれぞれ１つが、供給リザーバーとして示されることがある溶液受器（１０３、１０４）に接続される。電解質溶液受器の一方１０３が陰極１０５に接続され、他方１０４が陽極１０６に接続され、陰極１０５および陽極１０６は高電圧電源装置１０８に接続され、高電圧（ＨＶ）を分離体積部に沿って容器１０２において加えるために設定される。場合によっては、システム１００はさらに、主電流源１０８および／またはイオン源１０１を場合によっては別々に制御するコントローラ１１０を含む。コントローラ１１０は、ｐＨをそれぞれの帯域において変化させることをイオン源１０１の一部またはすべてに指示することによってｐＨプロフィルを変化させることができる。
【００６３】
３つだけのイオン源１０１が示されるが、分離デバイス１００は任意の数のイオン源１０１（例えば、４個、８個、１２個、１６個、２０個、１００個、あるいは、任意の中間の数またはより多くの数）を有し得ることには留意しなければならない。
【００６４】
場合によっては、図３Ｂにおいて示されるように、また、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように、ｐＨセンサー３１３のアレイが、コントローラ１１０およびプロトン／ヒドロキシル源１０１と一緒にフィードバックループを閉じるために、流路に沿って置かれる。使用時において、流路１０２は、場合によって下記のように選択される溶液により満たされる。その後、コントローラには、溶液に加えられる特定の混合物を分離するために適する所望される動的ｐＨプロフィルを形成するための指示が与えられる。場合によっては、コントローラ１１０は、動的ｐＨプロフィルを手動で提供することを可能にするユーザーインターフェースに接続される。別の実施形態において、コントローラ１１０に接続されるコンピュータユニット（示されず）により、動的ｐＨプロフィルが、例えば、プローブ探査された分子状分析物のｐＩに基づいて、場合によっては下記の式を使用して、自動的に計算される。次に、ＨＶ電源装置１０８が、分離体積部において、例えば、３００Ｖの電位差を維持するために始動させられる。その後、コントローラ１１０はイオン源１０１を使用者の入力および／またはコンピュータユニットに従って操作し、そして、ｐＨセンサー３１３が存在するならば、フィードバックループを作動させて、所望されるｐＨプロフィルを時間とともに維持する。後者が確立されるとき、混合物が、場合によっては容器１０２の面の１つに位置するローダーを介して流路１０２に挿入される。その後、分子状分析物が流路１０２の内部のｐＨおよび電場に従って移動する。後者が移動し、集束するにつれ、使用者はｐＨプロフィルを所望される動的ｐＨプロフィルに従って再設定する。その後、コントローラ１１０は、受け取った指示に従ってイオン源１０１をリアルタイムで操作する。本明細書中で使用される場合、リアルタイムは、ｐＨプロフィルを、数秒を超えるコンピュータ遅延を伴うことなく調節することを意味する。最後に、下記でさらに記載されるように、移動している分子状分析物が収集ユニットにより別々に回収されるか、または、流路に沿った位置でプローブ探査される。この分離デバイス１００は、既存の等電点フォーカシングデバイスと比較した場合、数多くの好都合な特徴を有する。例えば、本デバイスは、ゲルおよび／または両性電解質非含有溶液を使用することを可能にし、このことは、より大きい精製収率およびより短い精製時間を容易にする。そのうえ、本分離デバイス１００は、それぞれの流出している分子が、その分子が精製されるまで約１ミリメートル（ｍｍ）のほんの短い距離を移動し、これにより、精製時間を比較的短くするように設計することができる。加えて、分離戦略のいくつかにおいては、分子が共通の軌跡に沿って移動し、このことにより、収集ユニットおよび／または診断ユニットの設計および／または操作が簡略化される。これらのユニットは、分子のすべてが取り出され得るか、またはプローブ探査され得る規定された地点に配置することができる。最後に、ｐＨプロフィルは、最適な精製プロセスをどの生体分子混合物に対しても行うために時間的および／または空間的に適し得る。
【００６５】
そのような分離デンバイス１００は、分子状分析物の一部が容器１０２における分離体積部に形成されるｐＨプロフィルに沿って移動することを誘導することによって分子状分析物を分離するために使用することができる。
【００６６】
例えば、次に図２Ａ〜図２Ｅが参照される。図２Ａ〜図２Ｅは、本発明のいくつかの実施形態による動的ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器１０２における溶液に存在する分子状分析物に対するその影響を概略的に例示するグラフィック図である。２つのイオン源１０１が、図２Ａに示されるｐＨプロフィルを確立するために設定される。上記で概略されるように、図２Ａは、３つの異なる分子状分析物を、ｐＨプロフィルの高ｐＨ段差帯域と、低ｐＨ段差帯域との間のｐＨ傾斜帯域において示す。これら３つの帯域の空間的大きさは、１０マイクロメートルから何センチメートル（ｃｍ）（例えば、１０ｃｍ、２０ｃｍ、５０ｃｍ、あるいは、任意の中間の数字またはより大きい数字）までであるように選択することができ、一方、ｐＨ傾斜帯域の典型的な大きさは数十マイクロメートルである。電場が、陰極１０５および陽極１０６によって、数字２０１によって示される方向で加えられる。ｐＨプロフィルにおけるｐＨ傾斜帯域２０２が、ｐＨを容器の様々な帯域において変化させて、その結果、ｐＨレベルが下記のように規定されることによって規定される：
上記において、ｐＨ（Ｉ）〜ｐＨ（ＩＩＩ）は、高ｐＨ段差帯域、ｐＨ傾斜帯域および低ｐＨ段差帯域におけるｐＨレベルをそれぞれ示し、ｐＩ１〜ｐＩ３は、第１、第２および第３の分子状分析物のｐＩをそれぞれ示す。図２Ａにおいて、３つの分子状分析物（例えば、３つのタンパク質）の混合物が、段差帯域Ｉまたは段差帯域ＩＩＩのどちらかに注入された後でｐＨ傾斜帯域ＩＩにおいて濃縮される。分子状分析物は、これらが高ｐＨ段差帯域（例えば、帯域Ｉなど）に挿入されるならば、負の電気的電荷を有することが推測され、したがって、低ｐＨ段差帯域に向かって電場の方向とは反対にドリフト移動する。分子状分析物が低ｐＨ段差帯域（例えば、帯域ＩＩＩなど）に注入されるならば、分子状分析物は、正の電荷を有するとして推測され、したがって、高ｐＨ側のｐＨ段差帯域に向かって電場の方向でドリフト移動する。どちらの場合にせよ、分子状分析物は、溶液に形成される電場においてドリフト移動して、ｐＨ傾斜ＩＩとして表されるｐＨ傾斜帯域に向かい、このｐＨ傾斜帯域において、それらのｐＩがそのｐＨレベルにあり、したがって、分子状分析物は電気的な正味の電荷を携行しないので、分子状分析物が閉じ込められる。低ｐＨ段差帯域は、分子状分析物が正の電荷を獲得することを誘導し、高ｐＨプラトー部は、分子状分析物が負の電荷を獲得することを誘導するので、分子状分析物の分子が閉じ込められる。
【００６７】
次に、図２Ｂにおいて示されように、ｐＨプロフィルが、分子状分析物のうちの１つが移動することを誘導するために調節される。示された例では、ｐＨプロフィルが変化させられ、その結果、帯域ＩＩＩにおけるｐＨが、ｐＩ３と、ｐＩ２との間における中間の値に、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３である点にまで上げられる。このプロフィルのもとでは、第３の分子状分析物は負に荷電し、その結果、電場の流れ方向に逆らって、例えば、図２Ｃにおいて示されるように、ｐＨプロフィルのｐＨ傾斜帯域から低ｐＨ段差帯域の右端に向かってドリフト移動するようになる。明確化のために、図２Ａ〜図２Ｅにおけるドリフト移動方向が黒塗り矢印により表され、電場が、記号Ｅを伴う矢印によって表される。同時に、第１および第２の分子状分析物はｐＨ傾斜帯域に留まる。このとき、第３の分子状分析物を、例えば、容器１０２の分離体積部の右手側で回収および／またはプローブ探査することができる。第２の分子状分析物を第１の分子状分析物から分離するために、低ｐＨ段差帯域におけるｐＨがさらに、例えば、図２Ｄにおいて示されるように、ｐＨ１と、ｐＨ２との間における中間の値に、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３である点にまで上げられる。今回は、第２の分子状分析物が負に荷電し、その結果、第２の分子状分析物が第１および第３の分子状分析物とは別に回収および／または診断され得るｐＨプロフィルの右端に向かってドリフト移動するようになる。最後に、図２Ｅにおいて示されるように、高ｐＨ段差帯域におけるｐＨ値が、ｐＩ１を超える値に上げられ、第１の分子状分析物が負に荷電し、その結果、第１の分子状分析物が第３および第２の分子状分析物とは別に回収および／または診断され得るｐＨプロフィルの右端に向かってドリフト移動するようになる。明らかなことではあるが、どのような数の分子状分析物も、回収時間および／または診断時間が、回収および／または診断された分子状分析物のｐＩと時間的に同期され得るこの様式で別々に回収および／または診断することができる。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分離デバイス１００はｐＨプロフィルを徐々に変化させる。例えば、分離デバイス１００は、ｐＨを帯域の１つにおいて、例えば、高ｐＨ段差帯域において、時間とともに単調に、例えば、直線的に増加させる。そのような様式では、分子状分析物が、図２Ｅにおいて示されるように、別個のドリフト移動するバンド（これは群として示されることがある）を形成した状態で、連続して放出される。これらのバンドの間における空間的分離が、特定の帯域（例えば、低ｐＨ段差帯域など）のｐＨにおける任意にゆっくりした増大によって任意に大きくすることができ、したがって、バンド間のｐＩ分離における任意に大きい分解能を得ることができる。場合によっては、これら３つのバンドを、従来のフラクションコレクターによって、および／または、他のタンパク質収集技術によって、ｐＨプロフィルの右端と一致する領域の右端で別個の群として回収することができる。加えて、または、代替において、これら３つのバンドを、従来の分子プローブによって、および／または、他の分子プロービング技術によって、ｐＨプロフィルの右端と一致する領域の右端で別個に診断することができる。
【００６９】
ｐＨプロフィルは、反対方向への分子状分析物の移動を、例えば、図４Ａおよび図４Ｂにおいて示されるように、帯域の１つまたは複数のｐＨを下げることによって誘導するために、場合によっては徐々にではあるが、調節され得ることには留意しなければならない。例えば、ｐＨプロフィルが、帯域ＩのｐＨを低下させることによって分子状分析物（例えば、上記分子状分析物の第１および第２の分子状分析物）の移動を誘導するために調節される。示された例では、ｐＨプロフィルが変化させられ、その結果、帯域ＩにおけるｐＨが、ｐＩ１と、ｐＩ２との間において、その後、ｐＩ２と、ｐＩ３との間において中間の値に、すなわち、ｐＩ１＞ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）であり、その後、ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）である点にまで下げられる。
【００７０】
場合によっては、図４Ｃにおいて示されるように、ｐＨプロフィルが、２つの向かい合う方向への分子状分析物の移動を誘導するために変化させられる。例えば、図１Ａに示される上記ｐＨプロフィルは、同時的および／または徐々にであれ、帯域ＩのｐＨを低下させ、帯域ＩＩＩのｐＨを上げることによって、向かい合う方向への分子状分析物（例えば、上記分子状分析物の第１および第２の分子状分析物）の移動を誘導するために調節される。
【００７１】
分子状分析物が、特定の帯域に濃縮されることなく分離され得ることには留意しなければならない。例えば、図４Ｄに示されるように、分離が、あるｐＨ段差帯域において生じ得るが、このとき、この帯域におけるｐＨはその中における分子状分析物のｐＩと異なる。分子状分析物Ｉが正であり、分子状分析物ＩＩおよび分子状分析物ＩＩＩが負であり、したがって、異なる方向に移動するので、分離が、分子状分析物Ｉと、分子状分析物ＩＩおよび分子状分析物ＩＩＩとの間で形成される。
【００７２】
同じ戦略を、例えば、図４Ｅにおいて示されるように、第２の分子状分析物を中間のｐＨ傾斜帯域に保持しながら、第１の分子状分析物を左側に、第３の分子状分析物を右側に放出させ、これにより、それらを異なるｐＨ傾斜部において捕獲するために適用することができる。
【００７３】
次に、図４Ｇ〜図４Ｋが参照される。図４Ｇ〜図４Ｋは、本発明のいくつかの実施形態による動的な多段階ｐＨプロフィル、および、一定の期間にわたって容器における溶液に存在する分子状分析物に対するそれらの影響を概略的に例示するグラフィック図である。示された実施形態において、いくつかのｐＨ傾斜帯域が、それらのｐＨに基づいて連続して配置される異なるｐＨ段差帯域の間に形成される。これは、異なるｐＩを有する分子状分析物を、ｐＨプロフィル軸に沿った異なる場所から、および／または、ｐＨプロフィル軸に沿った異なる場所において収集および／または診断することを可能にする。そのような多段階ｐＨプロフィルは、従来のタンパク質バンド収集方法によって収集することが容易である十分に規定されたタンパク質バンドを形成することを可能にする。図４Ｇは、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）を満たす図２Ａと同一である。図４Ｈにおいて、低ｐＨ段差（これは帯域ＩＩＩとして表される）が、ｐＩ３と、ｐＩ２との間において中間の値に、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３である点にまで上げられる。さらなるｐＨ傾斜帯域（これはＩＶとして示される）および別のｐＨ段差帯域（これはＶとして示される）が、図４Ｈにおいて示されるように、帯域ＩＩＩの右側に形成され、その結果、ｐＩ３＞ｐＨ（Ｖ）であるようにされる。そのようなｐＨパターン、すなわち、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｖ）のもとでは、第３の分子状分析物が負に荷電し、その結果、右端に向かってドリフト移動して、図４Ｉにおいて示されるように、ｐＨ傾斜部ＩＶに閉じ込められる。第１および第２の分子状分析物はｐＨ傾斜帯域ＩＩに閉じ込められたままである。ｐＨが、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３である点へｐＨ段差帯域ＩＩＩにおいてさらに上げられると、第３のｐＨ傾斜帯域および第３のｐＨ段差帯域（これらはそれぞれ、図４ＪではＶＩおよびＶＩＩとして表される）が形成され、その結果、ｐＨ（Ｉ）＞ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＶＩＩ）＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｖ）であるようにされる。第２の分子状分析物が閉じ込めから放出され、ｐＨ傾斜帯域ＶＩにおいて捕獲されるまで右端に向かってドリフト移動する。今回は、これら３つの分子状分析物のそれぞれ１つが、図４Ｋにおいて示されるように、異なるｐＨ傾斜帯域において捕獲され、また、これら３つの分子状分析物のそれぞれ１つを直接に診断および／または収集することができ、ならびに／あるいは、右端で回収されるために、場合によっては異なった時間で別々に放出させることができる。
【００７４】
そのような実施形態において、分離が、イオンを特定のパターンに従って流路に単に注入することによって行われる。これは、分子状分析物（例えば、タンパク質など）を流路に沿ったいくつかの所（それぞれがｐＨ傾斜帯域にある）に集束させることを可能にする。集束させることが、分子状分析物を別々に回収および／または診断する前に行われる。そのような様式で、収率を増大させることができ、また、異なるタンパク質を、異なる事前設定された場所に何度も集束させることができ、その結果、収集ユニットが、固定された場所で収集することができる。
【００７５】
ｐＨプロフィルの左端に向かう分子状分析物の移動を誘導することが、１つまたは複数の帯域のｐＨが低下させられるときに同様に行われ得ることには留意しなければならない。例えば、図５Ａ〜図５Ｇは、分子状分析物（例えば、種々のタンパク質など）がどのように、ｐＨプロフィルの左端の近くに位置する傾斜部に向かって連続してドリフト移動させられるかを示す。これらの図において示される徐々に進むドリフト移動が、ｐＨ段差帯域ＶにおけるｐＨを下げることによって行われる。これは、分子状分析物を連続的かつ別々に回収および／または診断することを可能にする。
【００７６】
次に、図６が参照される。図６は、本発明のいくつかの実施形態による、異なるｐＩを有する分子状分析物をｐＨプロフィルに沿って比較的大きい速度で別々にドリフト移動させる方法７００である。上記で記載されるように、分子状分析物がｐＨプロフィル軸に沿ってドリフト移動し、ついには、分子状分析物は、分子状分析物が正味の電気的電荷を携行しない帯域に達する。それぞれの分子状分析物のドリフト移動速度は、溶液におけるホスト帯域におけるｐＨから派生したものであるその電荷に比例している。最初に、７０１において示されるように、中間の段差帯域を２つの高ｐＨ／低ｐＨ段差帯域の間に有するｐＨプロフィルが形成される。このｐＨプロフィルは、低い中間ｐＨ段差帯域によって区分けられる２つの高ｐＨ段差帯域を含むことができ、または、高い中間ｐＨ段差帯域によって区分けられる２つの低ｐＨ段差帯域を有するｐＨプロフィルを含むことができる。簡潔化のために、そのようなプロフィルを有するｐＨプロフィルが、本明細書中では高低高型ｐＨプロフィルおよび低高低型ｐＨプロフィルとしてそれぞれ示される。図７Ａおよび図８Ａはそのようなプロフィルを３つの例示的な分子状分析物についてそれぞれ示す。
【００７７】
次に、７０２において示されるように、分子状分析物が、ｐＨプロフィルのパターンに依存して、ｐＨプロフィル軸の一方の側から、例えば、容器１０２の一方の側から、例えば、左側から提供される。注入することが、分子状分析物をｐＨ傾斜帯域に閉じ込めるように行われる。プロフィルが高低高型であるならば、分子状分析物を、高電位側の高段差帯域（例えば、図７では右側）を除くどこからでも流路に注入することができる。そうでない場合、分子状分析物は集束しないかもしれない。この場合には、分子状分析物は、例えば、図７の左側に示されるように、より低い電位側に位置する傾斜部に集束する。代替において、プロフィルが低高低型であるならば、分析物を、例えば、図８の左側に示されるように、低電位側の低段差帯域を除くどこからでも流路に注入することができる。この場合には、分子状分析物は、例えば、図８の右側に示されるように、より高い電位側に位置する傾斜部に集束する。分子状分析物は、例えば、図７Ａおよび図８Ａにおいて示されるように、高段差帯域と、低段差帯域との間のｐＨ傾斜帯域に閉じ込められるまでドリフト移動する。上記で記載されるように、閉じ込められた分子状分析物は、一方の側にドリフト移動させようとすることが、分子状分析物を閉じ込め帯域に押し戻す負の電荷によって染み込むようにもたらされ、別の側にドリフト移動させようとすることが、同様に分子状分析物を閉じ込め域に押し戻す正の電荷によって染み込むようにもたらされるときに閉じ込められる。
【００７８】
最初は、図７Ａに示されるように、プロフィルが、ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）＞ＰＩ１＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（ＩＩＩ）であるように規定され、３つの例示的な分子状分析物（例えば、タンパク質など）がｐＨ傾斜帯域ＩＩにおいて捕らえられる。段差帯域ＩＩＩは、それらの電荷が比較的小さい帯域ＩＩＩにおけるタンパク質移動時間を最小限に抑えるために、可能な限り短くされ、好ましくは、約１０マイクロメートル〜１０００マイクロメートルの間の範囲である。
【００７９】
次に、７０３において示されるように、ｐＨプロフィルの中間段差帯域が、閉じ込められた分子状分析物の１つまたは複数の移動を誘導するために調節される。例えば、図７Ｂは、中間プラトー部のｐＨを、ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ３である点にまで上げることによって、第３の分子状分析物（これはｐＩ３として表される）の移動を誘導するためにｐＨプロフィルを調節することを示す。この増加は第３の分子状分析物を前記のようにｐＨ傾斜帯域から放出させ、一方、それ以外の分子状分析物は閉じ込められたままである。わずかに負に荷電した第３の分子状分析物が、ｐＨ傾斜帯域ＩＶにたどり着くまで右端にドリフト移動する。その地点において、ｐＨ、したがって、第３の分子状分析物の負の電荷が劇的に大きくなる。結果として、第３の分子状分析物のドリフト移動速度が、図７Ｃにおいて示されるように、劇的に加速され、例えば、１０倍、１００倍または１０００倍速くなり、このことは、図１に示される方法による分離に関して分離時間を短縮する。簡潔にするために、より大きい速度が二重矢印によって表される。７０４において示されるように、プロフィルは、分子状分析物を連続様式で放出するように複数の段階で調節することができる。例えば、中間ｐＨ段差帯域におけるｐＨが、例えば、図７Ａ〜図７Ｅおよび図８Ａ〜図８Ｅにおいて示されるように、連続様式で増大および／または低下させられる。図８Ａ〜図８Ｅでは、分離が、ｐＩが小さくなる順で行われる。３つの例示的な分子状分析物のための開始ｐＨプロフィルは、ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ１＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）であり、ｐＨ傾斜帯域ＩＶに閉じ込められる３つの分子状分析物が図８Ａに示される。使用時において、ｐＨ段差帯域ＩＩＩのｐＨが、ｐＩ１＞ｐＨ（ＩＩＩ）＞ｐＩ２＞ｐＩ３＞ｐＨ（Ｉ）＝ｐＨ（Ｖ）である点にまで時間の関数としてゆっくり下げられる。この形態では、第１の分子状分析物は正に荷電し、左側へドリフト移動することを開始する。ｐＨ傾斜部ＩＩにたどり着くと、ｐＨが低下し、第１の分子状分析物の正の電荷およびそのドリフト移動速度が、例えば、図８Ｃにおいて示されるように、劇的に大きくなる。同じプロセスが、図８Ｄおよび図８Ｅにおいて示されるように、第２および第３の繰り返された分子状分析に関して連続して繰り返される。
【００８０】
次に、図９Ａが参照される。図９Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従って、１つまたは複数の分子状分析物を有する混合物を回収および／または診断するために、分子状分析物をそれらのｐＩに基づいて分離する例示的なデバイス９００の概略図である。図９Ａはさらに、例示的デバイス９００の容器１０２において生じるｐＨプロフィルのプロフィルの概略的プロットを示す。
【００８１】
例示的デバイス９００は、図３Ａに示される通りであり、しかしながら、イオン源１０１が、下記でさらに記載されるように、イオン注入に基づく。適正な電解質溶液を有する容器１０２は、ｐＨプロフィルが、例えば、上記で記載されるように生成および調節される限定された分離体積部を規定する。電場が、例えば、上記で記載されるように、分離体積部を横切る。イオン源１０１が、分離体積部に形成されるｐＨプロフィル軸に沿う特定の帯域に対してプロトンおよび／またはヒドロキシルイオンを制御された様式で注入するために設定される。容器は、分子状分析物（例えば、タンパク質など）の混合物を導入し、また、分離プロセスの生成物を収集するための手段を含む。
【００８２】
示された実施形態において、デバイスの容器１０２は、２つのリザーバーによって供給される細長い流路における分離を規定する。流路１０２の長さは、微細加工技術によって製造されるならば、数十ミクロンから、従来の方法によって製造されるならば、数ミリメートル、数センチメートルまたは数十センチメートルにまで変化し得る。流路の平均直径および平均厚さは、例えば、幅が１マイクロメートルおよび／または１ミリメートルの間であるが、１マイクロメートル〜数センチメートルの間で変化し得る。プロトン源およびヒドロキシルイオン源１０１が流路に沿って分布し、イオンを流路における帯域に注入するために設定される。例えば、３つのヒドロキシル源および２つのプロトン源が、図４および図５に示されるｐＨプロフィルを形成するためにそれぞれ使用される。そのようなイオン源についての例が、本発明のいくつかの実施形態による例示的なデバイス９００において同時または交換可能に使用され得る様々な例示的なイオン源の概略図である図９Ｂ〜図９Ｄに示される。図９Ｂは、分離流路１０２に開口部９１３および透析膜９１４を介して接続される小さいチャンバー９１２を含むプロトン／ヒドロキシル源９１１を示す。透析膜は、分離流路１０２から小さいチャンバー９１２へのタンパク質漏出を防止するか、または低下させ、一方、これらの体積部の間におけるイオン交換を可能にする。プロトン／ヒドロキシル源９１１は、酸溶液および塩基溶液をチャンバー９１２において混合することによって、ｐＨを分離体積部における最も近い帯域において設定する。例えば、イオン源がプロトン源であるならば、過剰な酸溶液が、７未満の全体的ｐＨを有する帯域を与えるために、塩基溶液と混合される。イオン源がヒドロキシル源であるならば、逆のことが維持され、７を超えるｐＨがその帯域において形成される。場合によっては、酸溶液および塩基溶液が、対応するプロトン／ヒドロキシル源チャンバーに所望の量で供給される別々の容器に置かれる。
【００８３】
図９Ｃは、二極性メンブラン９２２、および、分離流路１０２と、プロトン源チャンバー９２４に浸けられる白金電極９２３との間においてメンブランの両側に加えられる電圧を使用して水を解裂させることによってプロトンを生じさせる電気分解型イオン源９２１を示す。場合によっては、電気分解型イオン源９２１は、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号（２００９年８月１８日出願、これは参照によって本明細書中に組み込まれる）において規定される通りである。二極性メンブラン９２２の極性が、プロトンがメンブラン９２２の流路側で生じ、一方、ヒドロキシルイオンがチャンバー側で生じるように選ばれる。メンブラン９２２に加えられるバイアスが、負の端子がメンブランの流路側に供給され、一方、正の端子が白金電極に供給されるように選ばれる。これらの条件のもと、水がメンブランにおいて解裂する。生じたプロトンが流路に注入され、ヒドロキシルイオンがメンブランからチャンバーに注入され、チャンバーにおいて、ヒドロキシルイオンは、白金電極９２３上で生じたプロトンと再結合して、水を形成する。明らかなことではあるが、また、米国仮特許出願第６１／２７２１１０号に記載されるように、ヒドロキシルイオン源を同様に組み立てることができる。その目的のために、二極性メンブランが電圧源の極性と一緒に反転させられる。この形態では、メンブラン９２２における水の解裂によって生じるヒドロキシルイオンが分離流路に注入され、一方、プロトンがヒドロキシル源チャンバー９２４に注入され、ヒドロキシル源チャンバー９２４において、プロトンは、白金電極上で生じたヒドロキシルイオンと再結合して、水を与える。
【００８４】
図９Ｄは、水が、供給源チャンバー９３６に浸けられる２つの白金電極（９３２、９３３）の間に電圧を加えることによって電気分解される別のイオン源９３１を示す。流路９３５に隣接する白金電極９３３は、流路へのイオン輸送を改善するために穴を開けることができる。陰極電極が分離流路のより近くにある場合、ヒドロキシルイオンが流路に注入される。プロトンを流路に注入するために、バイアス極性が反転させられ、その結果、今度は、陽極が流路に隣接する。
【００８５】
次に、ｐＨプロフィルを、ｐＨプロフィルの軸に沿った分子状分析物の移動を誘導するために形成および調節する方法の記載が参照される。この方法は、プロトンおよび／またはヒドロキシルイオンを、ｐＨプロフィルの生成のために利用される電場を支える流路（例えば、容器１０２など）に注入することによって行われる。本明細書中の記載はまた、所望されるｐＨプロフィルを空間において達成するための適切な電解質および注入電流の選択、ならびに、場合によってはそれらを時間において変化させることを教示する。完全なコンピュータ計算に対する単純な近似が、図９Ａに関連して上記で記載されるデバイスによる分離プロセスを設計するためのデバイス操作のシミュレータのためのアルゴリズムとして本明細書中に開示される。
【００８６】
流路（例えば、１０２など）における分離体積部に広がるｐＨ分布を、右側境界条件および開始条件において、下記のポアソン・ボルツマンの式（式２）と一緒になった、関与するすべてのイオンについての下記の輸送式（式１）によって記述することができる：
メートル、キログラムおよび／または秒（ＭＫＳ）の単位で、Ｃｉは化学種ｉのイオンのモル濃度を示し、Ｄｉはｉの拡散係数を示し、μｉはｉの電気移動度を示し、ｚｉはｉのプロトン電荷単位での電荷を示し、Ｆはファラデー定数を示し、Ｒｉは化学種ｉの反応項を示し、ベクトルＥは、例えば、容器１０２のフォーカシング用流路における電場を示す。本明細書中の例はプロトンに関して記載されるが、どの分子状分析物も使用され得ることには留意しなければならない。
【００８７】
場合によっては、後者の式では、溶液において生じる化学反応が、数値解をコンピュータ計算することを可能にする一組のいくつかの非線形微分方程式を形成するように考慮に入れられる。
【００８８】
場合によっては、下記により、動的ｐＨプロフィルを上記分離プロセスのために生じさせるｐＨプロフィル発生器のプログラミングが可能になる。化学反応（例えば、プロトン−ヒドロキシル再結合など）が比較的速いという事実、および、外部電場におけるイオンのドリフト移動が、プロトン／ヒドロキシル注入のごく近傍を除いて、ある種のイオン拡散よりも優位であるという事実を利用すると、定常状態における本質的な物理的現象を取り込む解析的に扱いやすいモデルを定式化することができる。このモデルにより、分離プロセス期間中の上記デバイスの運用法が解明され、所望されるｐＨプロフィルを生じさせるためにパラメータを選択するためのツールが提供される。したがって、そのような単純化されたモデルは、分子状分析物の分離アッセイ（例えば、タンパク質アッセイなど）をデバイスについて計画することにおいて有用なシミュレータのためのアルゴリズムを開示する。
【００８９】
簡潔化のために、２つのタイプのｐＨ変化操作が定義される：フォーカシング用ｐＨ傾斜部および脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部。フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、例えば、図２Ａに示されるように、ｐＨ傾斜部の低電位側でのより大きいｐＨ値およびｐＨ傾斜部の高電位側でのより低いｐＨ値によって特徴づけられる。脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部は逆であり、すなわち、ｐＨ傾斜部の低電位側でのより低いｐＨ値およびｐＨ傾斜部の高電位側でのより大きいｐＨ値によって特徴づけられる（例えば、図７Ａに示されるｐＨ傾斜部ＩＶ）。フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、ｐＩを、ｐＨ傾斜部の高ｐＨ値と、低ｐＨ値との間に有するすべてのタンパク質を捕らえる。脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部はタンパク質を長期間にわたって捕らえない。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプロフィルが、緩衝剤分子を有しない生理的食塩水溶液において形成される。図１０Ａおよび図１０Ｅは、例えば、上記のデバイス１００およびデバイス９００の分離流路１０００へのプロトン注入およびヒドロキシル注入をそれぞれ示す。分離流路１０００は、これには左側および右側のリザーバーによって供給されるが、本明細書中ではｐＨＡおよびｐＨＢ（ただし、ｐＨＡ＞ｐＨＢ）としてそれぞれ示される２つのｐＨ値によって特徴づけられる。流路における関連したイオン（粒子）電流密度が、流路１０００内への注入電流１００１および電場１００２の方向と一緒に示される。図１０Ｂ〜図１０Ｄおよび図１０Ｆ〜図１０Ｈは、様々な注入条件のもとでのｐＨプロフィル軸に沿った例示的なｐＨプロフィルを示す。ｐＨプロフィル軸が図１０Ａおよび図１０Ｅにおいて点線Ａ−Ａとして表される。図１０Ｂ〜図１０Ｄにおいて、ｐＨＡ＝１１およびｐＨＢ＝５。図１０Ｂは、注入電流の非存在（ＪＨ＝０）下におけるｐＨプロフィルを示す。左側リザーバーによって供給されるヒドロキシル電流が、右側リザーバーによって供給されるプロトン電流よりも優位であり、プロトン−ヒドロキシル再結合の前線が、分離流路と、右側リザーバーとの境界で安定化する。流路全域でのｐＨが左側リザーバーにおけるｐＨと同一である。
【００９１】
図１０Ｃは、一部のプロトンが流路に注入された後のｐＨプロフィルを示す。ｐＨ段差帯域ＩＩＩにおける注入点の右側に対するｐＨが、図１０Ｃにおいて実線によって示されるように低下して、フォーカシング用ｐＨ傾斜部を形成する。増大したプロトン注入のために、フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、例えば、図１０Ｃにおいて一点鎖線によって表されるが、この傾斜部がその最大値に達するまで急峻化し続ける。注入を増大して、イオン電流のこの限界値を超えると、ｐＨ傾斜部の反転が生じ、これにより、このｐＨ傾斜部はフォーカシング用ｐＨ傾斜部から脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部に変換されるであろう。結果が図１０Ｄに示される。フォーカシング用ｐＨ傾斜部において、帯域ＩのｐＨは留まっており、一方、帯域ＩＩＩのｐＨは電流に従って変化することには言及しなければならない。逆のことが脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部において当てはまり、すなわち、帯域ＩＩＩにおけるｐＨは一定のままであり、一方、帯域Ｉにおけるその対応する値は、加えられた電流に従って変化する。
【００９２】
例えば、図２Ａに示されるような動的ｐＨプロフィルが生じるとき、図１０Ｃの得られた一点鎖線のフォーカシング用ｐＨ傾斜部は、ｐＩをｐＨ１１〜ｐＨ７の間に有するすべてのタンパク質を集束させる。プロトン注入電流が、図１０Ｃの実線によって示されるｐＨ傾斜部を生じさせるために下げられるとき、ｐＩをｐＨ７〜ｐＨ９の間に有するすべてのタンパク質が放出される。
【００９３】
図７Ａに関連して、図１０Ｄに示される脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部は、３未満のｐＩを有するタンパク質の右側への移動を加速させることができる。過度なプロトン注入において生じる脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部を、フォーカシング用ｐＨ傾斜部および脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部の両方が必要とされる図７Ａ〜図７Ｅに示される動的ｐＨプロフィルを実行するために利用することができる。
【００９４】
図１０Ｆは、ｐＨＡ＝９、ｐＨＢ＝３およびＪＯＨ＝０である場合についてのｐＨプロフィルを示す。右側のリザーバーによって供給されるプロトン電流が、左側のリザーバーによって供給されるヒドロキシル電流よりも優位であるので、流路１０２におけるｐＨはｐＨＢに等しい。図１０Ｇにおいて、図１０Ｃに示されるのと同様に、ヒドロキシルイオンの少しの注入により、実線によって示されるフォーカシング用ｐＨ傾斜部がもたらされ、一方、一点鎖線は、限界電流が加えられるときに達成される最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部を例示する。この電流を超えると、図１０Ｈに示されるように、ｐＨ傾斜部が反転することが引き起こされるであろう。図４Ａ〜図４Ｅに示されるシーケンスを、等電点をｐＨ３〜ｐＨ７の間に有するタンパク質についてこの形態で実現することができる。
【００９５】
図１０Ａ〜図１０Ｄの帯域Ｉおよび帯域ＩＩＩにおける定常状態ｐＨ値を、下記の式を使用してコンピュータ計算することができる：
また、図１０Ｅ〜図１０Ｈに示されるようなヒドロキシルイオン注入の場合については、式は下記の通りである：
式３および式５はヒドロキシルイオンの保存を表し、式４および式６はプロトン電流の保存を表す。これら２つの式では、下記の反応による水の生成および分解：
ならびに、対応する質量作用の法則：
が考慮に入れられる。
【００９６】
これらの式において、ＪＨＩ，ＩＩＩ、ＪＯＨＩ，ＩＩＩ、ＪＨ２ＯＩ，ＩＩＩは、帯域Ｉおよび帯域ＩＩＩにおける、プロトン、ヒドロキシルおよび水の粒子電流密度をそれぞれ示し、［Ｈ＋］Ｉ，ＩＩＩ、［ＯＨ−］Ｉ，ＩＩＩは、それぞれの帯域におけるプロトンおよびヒドロキシルイオンのモル濃度をそれぞれ示し、Ｋｗ＝１０−１４Ｍ−２は水の平衡定数を示す。
【００９７】
これらの例示的条件のもとでは、電場によって引き起こされたイオンのドリフト移動が、拡散によって引き起こされるドリフト移動よりも優位であり、電流密度は下記のイオン密度に単に比例するだけである：
【００９８】
プロトン注入についての式３、式４、式８および式９、ならびに／または、ヒドロキシル注入についての式５、式６、式８および式９を解くことにより、分子状分析物の移動を誘導するための、また、ｐＨプロフィルに沿って集束させるための動的ｐＨプロフィルを生じさせるために必要とされるパラメータが与えられる。帯域Ｉおよび帯域ＩＩＩにおけるイオン濃度の関係を、フォーカシング用ｐＨ傾斜部または脱フォーカシング用ｐＨ傾斜部のサイズを注入イオンの関数として計算することを可能にすることによって得ることができる。加えて、モデルにより、ｐＨ傾斜部が反転する前の最大の達成可能なｐＨフォーカシング用傾斜部の値が、その対応する限界電流とともに予測される。解くべきこの一組の式は、偏微分方程式ではなく、むしろ、代数方程式であり、したがって、生じるｐＨ傾斜部の迅速な計算が、比較的低い計算力を使用して短時間で容易になることには留意されたい。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプロフィルが緩衝化溶液（例えば、緩衝剤分子を有する生理的食塩水溶液など）において形成される。
【０１００】
ＡＨ−およびＡ−２として本明細書中で示される２つの緩衝剤化学種が、下記の平衡定数Ｋａ（式１１）を有する下記の反応（式１０）に関与する：
プロトン注入の場合、プロトン、ヒドロキシルイオンおよび緩衝剤分子についての質量バランスを下記のように定義することができる：
上記式において、ＪＡＮＩ，ＩＩＩおよびＪＡＩ，ＩＩＩは２つの緩衝剤形態の電流密度を示す。ヒドロキシルイオンについての質量バランス（これは式３で定義される通りである）は同じままであり、一方、プロトンの質量バランス（これは式１２で定義される通りである）は、緩衝剤分子によって運ばれるプロトンを説明するために修正される。式１３は、緩衝剤分子についての質量バランスを定義する。式９において定められるプロトンおよびヒドロキシルイオンの場合でのように、これらの化学種の電流はそれらの濃度に比例している：
【０１０１】
プロトンではなく、むしろ、ヒドロキシルイオンが注入されるならば、ＪＨは式１２から除かれなければならず、かつ、ＪＯＨが式３の左辺に加えられなければならない。
【０１０２】
式３、式８〜式９および式１１〜式１４を解くことにより、それぞれの帯域における化学種濃度の関係が与えられ、ｐＨ傾斜部の険しさ、最大のｐＨフォーカシング用傾斜部、および、対応する限界電流の計算が可能になる。
【０１０３】
図１１Ａおよび図１１Ｃが参照される。図１１Ａおよび図１１Ｃは、プロトン注入およびヒドロキシル注入の場合において、緩衝化溶液を有する容器（例えば、１０２など）を関連した電流密度と一緒にそれぞれ示す。図１１Ａおよび図１１Ｂの場合でのように、リザーバーにおけるｐＨレベルが、プロトンが注入されるときはｐＨＡ＝１１およびｐＨＢ＝５であり、ヒドロキシルイオンが注入されるときはｐＨＡ＝９およびｐＨＢ＝３である。図１１Ｂおよび図１１Ｄもまた参照される。図１１Ｂおよび図１１Ｄは、軸（例えば、図１１Ａおよび図１１Ｃにおいて点線Ａ−Ａなど）に沿ったｐＨプロフィルを示す。前記のように、図１１Ｂおよび図１１Ｄにおける実線は、小さい注入電流を加えることによってもたらされるフォーカシング用ｐＨ傾斜部を示し、一方、一点鎖線は、限界電流密度が加えられるときに達成可能な最長のフォーカシング用ｐＨ傾斜部を示す。上記と同様に、電流を、その限界値を超えて上げることにより、ｐＨ傾斜部の反転が生じる。図１１Ｂと、図１０Ｃとを、また、図１１Ｄと、図１０Ｇとを比較することによって、緩衝剤分子の存在下における最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部が、緩衝剤分子が存在しないときのそれらの対応する最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部よりも長いことが明らかである。図１１Ｂに示されるプロトン注入の具体的な例では、適量の緩衝剤が、右側リザーバーの値よりも低い値に至る酸性ｐＨに達する最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部サイズを可能にするために加えられる。このことは、非緩衝化溶液における最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部が結局は中性ｐＨに達することを明らかにする図１１Ｃとは対称的である。図１２は、プロトンが注入されるときの帯域ＩＩＩにおいて、電気電流における変化と、緩衝化溶液および非緩衝化溶液のｐＨとの間における相関を示すグラフであり、この点をさらに強調する。これは、図１２が、１１．５の初期ｐＨおよびその限界電流での終了ｐＨにおける２つのｐＨプロットの間における差を示すからである。一方が緩衝化溶液１２０１についてであり（ｐＫａ＝７およびＡＴＯＴ＝Ａ−２＋ＡＨ−＝１０ｍＭ）、他方が非緩衝化溶液１２０２についてである。図１２に示されるように、緩衝化溶液１２０１の限界電流が非緩衝化溶液１２０２の限界電流よりもはるかに大きい。さらに、前者における最小ｐＨレベルが後者における最小ｐＨレベルよりもはるかに低い。この図をより綿密に調べることにより、ｐＨ１１．５と、ｐＨ９との間において、これら２つの溶液は基本的に同じ挙動を有することが明らかにされる。これは、この範囲において、プロトンと反応する唯一の化学種がヒドロキシルイオンであるからである。この点を超えると、非緩衝化系は急速に崩れ、例えば、脱フォーカシング用傾斜部に変わり、一方、緩衝化溶液は、安定したフォーカシング用ｐＨ傾斜部をＡ−分子の消費により維持し続ける。この特徴は、図１１Ｂでもまた明らかにされるが、緩衝化溶液では、より長いフォーカシング用ｐＨ傾斜部が生じ得ることを示している。緩衝剤の非存在下では、フォーカシング用ｐＨは、ｐＨ≒７よりも低く下げることができず、一方、適切な緩衝剤の存在下では、範囲を、ｐＨ≒４、また、それどころか、それよりも低いｐＨに至る酸性状況にまで広げることができ、このことは、より大きいｐＨ範囲でのｐＨプロフィルの実行を可能にする。ｐＨ段差サイズの拡大が、ヒドロキシルイオンが注入されるときの基本的状況でもまた行われ得ることには言及されなければならない。例えば、図１１Ｃに示されるように、適切な緩衝剤の存在下におけるｐＨ段差サイズは、ｐＨ≒１０と同じ程度の塩基性ｐＨ、また、それどころか、それを超えたｐＨを達成することができる。図１２に示されるように、電流に対する大きい抵抗性に、緩衝剤の対数での酸解離定数（ｐＫａ）に等しいｐＨ７で達する。このことは、安定したフォーカシング用ｐＨ傾斜部が、そのｐＫａがｐＨＩまたはｐＨＩＩＩのどちらかに近い緩衝剤を使用してもたらされ得ることを示唆する。
【０１０４】
場合によっては、緩衝化溶液は、系に加えられるべき電流の選択された範囲を得るために調節される。例えば、容器１０２は、１ｍｍの典型的な断面を有し、かつ、ｐＨ８の非緩衝化溶液で満たされる流路である。プロトン濃度がｐＨ７に上がる非緩衝化溶液は、およそ約４・１０−８Ａの電流を必要とし、そのような電流は、加えることが極めて困難である。さらに、この場合における傾斜部の安定性は非常に低いであろう。これは、このまさにその電流からのどのような小さいずれも、ｐＨにおける強いずれを生じさせるであろうからである。しかしながら、ｐＫａ＝７の、１０ｍＭの緩衝剤が加えられるならば、そのような傾斜部をもたらすための必要な電流が約５・１０−５Ａに増大し、これは、変動に対してはるかにより大きい安定性を伴ったはるかにより実現可能な電流である。
【０１０５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプロフィルが、様々な電荷（例えば、２または３）を有する複数のプロトン化状態を有する緩衝剤の混合物を含有する多重緩衝化溶液において形成される。簡潔化のために、Ａｉ−２およびＡＨｉ−が負の荷電の化学種についての２段階緩衝剤を示し、Ｂｊ＋およびＢＨｊ＋２が正荷電の化学種についての２段階緩衝剤を示し、ＫａｉおよびＫｂｊがそれぞれの平衡定数を示し（ただし、ｉおよびｊは緩衝剤添え字を示す）、ＡＤ，ｋ−３、ＡＤＨｋ−２およびＡＤＨ２，ｋ−が、Ｋａ１Ｄ，ｋ、Ｋａ２Ｄ，ｋの平衡定数を有する３段階緩衝剤を示し、ＢＤ，ｌ＋、ＢＤＨｌ＋２およびＢＤＨ２，ｌ＋３が、Ｋｂ１Ｄ，ｋおよびＫｂ２Ｄ，ｋの平衡定数を有する３段階緩衝剤を示す（ただし、ｋおよびｌは緩衝剤添え字を示す）。緩衝剤化学種のそれぞれ１つが、下記でさらに記載されるように、正または負のどちらかで荷電することには留意しなければならない。これらの緩衝剤のプロトン化反応は下記のように定義することができる：
この式系は、下記の質量バランス：
および、質量作用の法則：
ならびに、
から構成される。
【０１０６】
これらの式を、数値法を使用して解くことにより、上記と同様に、最大注入電流、最大のフォーカシング用ｐＨ傾斜部などとしての必要なパラメータが与えられる。これらの代数方程式（式１６〜式１８）を解くことにより、上記で記載されたように、１つまたは複数のｐＨ傾斜部を計算することが可能になることには留意しなければならない。そのような様式で、偏微分方程式（式１および式２など）の計算を回避することができ、したがって、計算プロセスのコンピュータ計算の複雑性が削減される。
【０１０７】
図１３は３つの緩衝剤（それらのうちの２つが２つのプロトン化状態を有し、１つが３つのプロトン化状態を有する）のシミュレーションである。様々な平衡定数が示される。３つの緩衝剤が関与するので、ｐＨプロフィルが、様々な地点での様々なフォーカシング用ｐＨ傾斜部の生成を容易にする広い範囲で存在している。これらの種類の混合物により、様々な動的ｐＨプロフィルを効率的に確立することができる。
【０１０８】
次に、本発明のいくつかの実施形態による、分離体積部のための電解質溶液を選択するプロセスが参照される。電解質は２つの大きな群に分けることができる：分離体積部（例えば、容器１０２）において反応を受ける緩衝剤分子、および、背景媒体として作用する支持イオン。
【０１０９】
分子状分析物の移動を容易にするために、緩衝化溶液のプロトン化状態は、動的ｐＨプロフィルの帯域のすべてによって規定されるｐＨ範囲で荷電しなければならない。そのような様式で、ｐＨ傾斜部における定常状態を達成することができ、容器１０２におけるイオン流束が、加えられた電場によって維持される。緩衝化溶液が荷電するとき、化学種がｐＨプロフィルに沿って動くが、時間とともに蓄積しない。対照的に、中性分子は場によって影響されず、両方向にゆっくり拡散し、このことは、定常状態に達する時間を相当に増大させる。
【０１１０】
体積分離を容易にするために、容器１０２における緩衝剤は、推定されるｐＨプロフィルのｐＨ範囲全体を覆うように選択される。さらに、電流に対するデバイスの抵抗がｐＨ範囲にわたって変化することが、図１２および図１３において以前に示された。すなわち、注入電流密度における所与の増大についての生じるΔｐＨがｐＨ依存的である。
【０１１１】
次に、図１４が参照される。図１４は、本発明のいくつかの実施形態による、緩衝化溶液を１つまたは複数の分子状分析物（例えば、分子状分析物の特定の混合物）のために設定する方法のフローチャート１４００である。緩衝剤要素は、ピロリン酸塩、リン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、炭酸塩および／またはＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンなどであり得る。
【０１１２】
最初に、１４０１において示されるように、プローブ探査された混合物における１つまたは複数の分子状分析物のｐＩが提供される。その後、１４０２において示されるように、緩衝剤が、受け取られたｐＩに従って選択される。次に、１４０３において示されるように、緩衝剤の濃度およびタイプが選定され、例えば、受け取られたｐＩに従ってコンピュータ計算および選択される。緩衝剤の濃度が、高い緩衝剤濃度では、大きい電流を伴うイオン源が必要とされ、低い緩衝剤濃度では、電流変動に対して安定していない不安定なｐＨ傾斜部が形成されるかもしれないことを考慮に入れながら計算される。
【０１１３】
例えば、混合物が、ｐＩを５〜７の間に有するタンパク質を含有するならば、適切な電解質は、ｐＫａをそれぞれの範囲に有するか、または、ｐＫａがそれぞれの範囲に十分に近い少なくとも１つの緩衝剤を含有しなければならない。加えて、この緩衝剤の総濃度は、イオン注入における避けられない変動がｐＨ傾斜部の安定性に対する強い影響を有しないであろうように十分に高くなければならない。上記モデルを正確に保つために、容器１０２に沿った電気的性質（例えば、電気伝導性）は一定に維持される。そのような様式で、容器１０２における溶液の電気的性質は、例えば、上記で記載されるように、分子状分析物の移動を安定的および／または予測通りに誘導する動的ｐＨプロフィルを生じさせるために好適なままである。そのような支持イオンが存在しない場合、ｐＨ傾斜帯域の２つの側の間での電気伝導性における差が、異なるイオンプロフィルに起因して予想される。支持イオン（これは本明細書中では支持電解質として示される）を特定の濃度で加えることにより、分離溶液における電気伝導性の差が小さくなり、したがって、モデルの予測がより正確になる。しかしながら、濃度が特定の閾値を超えて大きくなるとき、容器１０２の望ましくない加熱が誘導されるかもしれない。適切な支持電解質を選定するときには、容器１０２の総イオン強度、加えられた電場の大きさ、および、容器１０２の大きさを考慮に入れなければならない。例えば、１１．５〜４のｐＨ範囲における実行のために好適な電解質のふさわしい処方が下記の通りである：
【０１１４】
次に、１４０４において示されるように、２つ以上の分子状分析物を分離するプロセスのために設定される緩衝剤濃度を有する緩衝化溶液が１４０２に従って設定される。緩衝剤濃度を設定することが、溶液をよりｐＨ抵抗性にするように、したがって、上記イオン注入によって誘導される変動に対してより安定となるように行われる。
【０１１５】
本出願から成熟する特許の存続期間の期間中には、多くの関連する方法およびシステムが開発されることが予想され、コントローラ、センサーおよびコンピュータユニットの用語の範囲は、すべてのそのような新しい技術を先験的に包含することが意図される。
【０１１６】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１１７】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。この用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含する。
【０１１８】
表現「から本質的になる」は、さらなる成分および／または工程が、特許請求される組成物または方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物または方法がさらなる成分および／または工程を含み得ることを意味する。
【０１１９】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１２０】
用語「例示的」は、本明細書では「例（ｅｘａｍｐｌｅ，ｉｎｓｔａｎｃｅ又はｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として作用する」ことを意味するために使用される。「例示的」として記載されたいかなる実施形態も必ずしも他の実施形態に対して好ましいもしくは有利なものとして解釈されたりかつ／または他の実施形態からの特徴の組み入れを除外するものではない。
【０１２１】
用語「任意選択的」は、本明細書では、「一部の実施形態に与えられるが、他の実施形態には与えられない」ことを意味するために使用される。本発明のいかなる特定の実施形態も対立しない限り複数の「任意選択的」な特徴を含むことができる。
【０１２２】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１２３】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１２４】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１２５】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０１２６】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法であって、
複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、
複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを前記分離体積部の軸に沿って生じさせること、および、
前記ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物のうちの第１の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第２の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節すること、ただし、前記第１および第２の分子状分析物は異なるｐＩを有する、
を含む方法。
【請求項２】
前記ｐＨプロフィルは、異なるｐＨレベルを有する少なくとも２つのｐＨ段差帯域を有し、前記複数の分子状分析物が、前記調節することの前に、実質的に均一なｐＨを有する前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込められ、前記調節することが、前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを変化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調節することが、時間において徐々に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨプロフィルは少なくとも１つの傾斜部によって定義され、前記複数の分子状分析物が前記少なくとも１つの傾斜部に蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生じさせることは、電場を前記軸に沿って前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を前記軸に沿った複数の地点において注入して、前記ｐＨプロフィルを確立することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨプロフィルを安定化させるように少なくとも１つの緩衝剤要素を前記溶液に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の分子状分析物を、前記第２の分子状分析物が前記分離体積部に留まっている間に回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プロフィルを、前記第２の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第３の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節することをさらに含み、ただし、前記第２および第３の分子状分析物は異なるｐＩを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記調節することは、前記プロフィルを、前記第１および第２の分子状分析物が前記軸に沿って反対方向に移動することを誘導するために調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記調節することは、前記プロフィルを、前記軸に沿った前記移動の方向を変化させて、その結果、前記第１の分子状分析物が２つの向かい合う方向で連続してドリフト移動するようにするために調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のｐＨ帯域は、実質的に均一な第２のｐＨを有する中間段差帯域によって区分けられる実質的に均一な第１のｐＨを有する２つの段差帯域を有し、前記混合物が、前記２つの段差帯域のうちの１つと、前記中間段差帯域との間に閉じ込められ、前記調節することが、前記中間段差帯域におけるｐＨを変化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のｐＨ帯域は、少なくとも３つの異なるｐＨ帯域を含み、前記調節することが、前記第１の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第１の対の間における第１の傾斜帯域に移動し、かつ、前記第２の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第２の対の間における第２の傾斜帯域に移動することを誘導するように徐々に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶液は緩衝化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物における１つまたは複数の分子状分析物の等電点を提供し、前記溶液を等電点に従って設定し、これにより、前記溶液の緩衝剤濃度を前記等電点に従って決定すること、および、前記溶液を前記決定することに従って設定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記調節することは、前記第１および第２の分子状分析物を前記軸に沿って互いに離れて集束させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１および第２の集束させた分子状分析物を前記軸に沿った異なる場所から別々に回収することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生じさせることは、前記ｐＨプロフィルを一組の代数式に従って計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記調節することは、前記ｐＨプロフィルについての少なくとも１つの調節を一組の代数式に従って計算し、前記調節することを前記少なくとも１つの調節に従って行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法であって、
複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、
前記複数の分子状分析物を、前記溶液を含有する分離体積部において２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込めること、ただし、それぞれの前記ｐＨ段差帯域が、異なる実質的に均一なｐＨを有する、および、
前記２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを、前記複数の分子状分析物が複数の別個の群で連続して移動することを誘導するために徐々に変化させること、ただし、それぞれの前記群が異なるｐＩを有する、
を含む方法。
【請求項２０】
前記閉じ込めることは、前記２つのｐＨ段差帯域を確立するために、電場を前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を少なくとも１つの地点において注入することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離する方法であって、
複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを、複数の分子状分析物を有する溶液において生じさせること、および、
前記ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物がそれらのそれぞれの等電点に従って空間的に分離されることを誘導するために一定の期間にわたって徐々に変化させること、
を含む方法。
【請求項２２】
異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離するデバイスであって、
複数の分子状分析物を有する溶液を含有するためのサイズおよび形状を有する、軸に沿う容器と、
電場を前記溶液において軸に沿って加える電源と、
複数のイオン流を注入して、前記溶液の複数の帯域をプロトン化することおよび脱プロトン化することの少なくとも一方に至ることによって、ｐＨプロフィルを前記溶液において前記軸に沿って確立するための複数のイオン源と、
前記ｐＨプロフィルを徐々に調節して、その結果、それぞれの前記分子状分析物が前記軸に沿って別々に移動することを誘導するようにするために前記複数のイオン源を操作するコントローラと、
を含むデバイス。
【請求項２３】
コンピュータユニットおよび使用者のうちの少なくとも１つからの複数の指示を受け取るためのインターフェースをさらに含み、前記コントローラにより、前記複数のイオン源が前記複数の指示に従って操作される、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記容器は１ミリメートル未満の少なくとも１つの大きさを有する、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記溶液は非ゲル溶液である、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項１】
異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法であって、
複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、
複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを前記分離体積部の軸に沿って生じさせること、および、
前記ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物のうちの第１の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第２の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節すること、ただし、前記第１および第２の分子状分析物は異なるｐＩを有する、
を含む方法。
【請求項２】
前記ｐＨプロフィルは、異なるｐＨレベルを有する少なくとも２つのｐＨ段差帯域を有し、前記複数の分子状分析物が、前記調節することの前に、実質的に均一なｐＨを有する前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込められ、前記調節することが、前記少なくとも２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを変化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調節することが、時間において徐々に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨプロフィルは少なくとも１つの傾斜部によって定義され、前記複数の分子状分析物が前記少なくとも１つの傾斜部に蓄積する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生じさせることは、電場を前記軸に沿って前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を前記軸に沿った複数の地点において注入して、前記ｐＨプロフィルを確立することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨプロフィルを安定化させるように少なくとも１つの緩衝剤要素を前記溶液に加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の分子状分析物を、前記第２の分子状分析物が前記分離体積部に留まっている間に回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プロフィルを、前記第２の分子状分析物が前記複数の分子状分析物のうちの第３の分子状分析物から離れて前記軸に沿って移動することを誘導するために調節することをさらに含み、ただし、前記第２および第３の分子状分析物は異なるｐＩを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記調節することは、前記プロフィルを、前記第１および第２の分子状分析物が前記軸に沿って反対方向に移動することを誘導するために調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記調節することは、前記プロフィルを、前記軸に沿った前記移動の方向を変化させて、その結果、前記第１の分子状分析物が２つの向かい合う方向で連続してドリフト移動するようにするために調節することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のｐＨ帯域は、実質的に均一な第２のｐＨを有する中間段差帯域によって区分けられる実質的に均一な第１のｐＨを有する２つの段差帯域を有し、前記混合物が、前記２つの段差帯域のうちの１つと、前記中間段差帯域との間に閉じ込められ、前記調節することが、前記中間段差帯域におけるｐＨを変化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のｐＨ帯域は、少なくとも３つの異なるｐＨ帯域を含み、前記調節することが、前記第１の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第１の対の間における第１の傾斜帯域に移動し、かつ、前記第２の分子状分析物が前記複数のｐＨ帯域の第２の対の間における第２の傾斜帯域に移動することを誘導するように徐々に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶液は緩衝化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合物における１つまたは複数の分子状分析物の等電点を提供し、前記溶液を等電点に従って設定し、これにより、前記溶液の緩衝剤濃度を前記等電点に従って決定すること、および、前記溶液を前記決定することに従って設定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記調節することは、前記第１および第２の分子状分析物を前記軸に沿って互いに離れて集束させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１および第２の集束させた分子状分析物を前記軸に沿った異なる場所から別々に回収することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生じさせることは、前記ｐＨプロフィルを一組の代数式に従って計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記調節することは、前記ｐＨプロフィルについての少なくとも１つの調節を一組の代数式に従って計算し、前記調節することを前記少なくとも１つの調節に従って行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離する方法であって、
複数の分子状分析物の混合物を含有する溶液を分離体積部に入れること、
前記複数の分子状分析物を、前記溶液を含有する分離体積部において２つのｐＨ段差帯域の間に閉じ込めること、ただし、それぞれの前記ｐＨ段差帯域が、異なる実質的に均一なｐＨを有する、および、
前記２つのｐＨ段差帯域のうちの１つにおけるｐＨを、前記複数の分子状分析物が複数の別個の群で連続して移動することを誘導するために徐々に変化させること、ただし、それぞれの前記群が異なるｐＩを有する、
を含む方法。
【請求項２０】
前記閉じ込めることは、前記２つのｐＨ段差帯域を確立するために、電場を前記溶液において加えること、および、複数のイオン流を少なくとも１つの地点において注入することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
分子状分析物をそれらの等電点に基づいて分離する方法であって、
複数のｐＨ帯域を有するｐＨプロフィルを、複数の分子状分析物を有する溶液において生じさせること、および、
前記ｐＨプロフィルのプロフィルを、前記複数の分子状分析物がそれらのそれぞれの等電点に従って空間的に分離されることを誘導するために一定の期間にわたって徐々に変化させること、
を含む方法。
【請求項２２】
異なる等電点（ｐＩ）を有する複数の分子状分析物の混合物を分離するデバイスであって、
複数の分子状分析物を有する溶液を含有するためのサイズおよび形状を有する、軸に沿う容器と、
電場を前記溶液において軸に沿って加える電源と、
複数のイオン流を注入して、前記溶液の複数の帯域をプロトン化することおよび脱プロトン化することの少なくとも一方に至ることによって、ｐＨプロフィルを前記溶液において前記軸に沿って確立するための複数のイオン源と、
前記ｐＨプロフィルを徐々に調節して、その結果、それぞれの前記分子状分析物が前記軸に沿って別々に移動することを誘導するようにするために前記複数のイオン源を操作するコントローラと、
を含むデバイス。
【請求項２３】
コンピュータユニットおよび使用者のうちの少なくとも１つからの複数の指示を受け取るためのインターフェースをさらに含み、前記コントローラにより、前記複数のイオン源が前記複数の指示に従って操作される、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記容器は１ミリメートル未満の少なくとも１つの大きさを有する、請求項２２に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記溶液は非ゲル溶液である、請求項２２に記載のデバイス。
【図２Ａ−２Ｅ】
【図４Ａ−４Ｅ】
【図４Ｇ−４Ｋ】
【図５Ａ−５Ｇ】
【図７Ａ−７Ｅ】
【図８Ａ−８Ｅ】
【図９Ａ−９Ｄ】
【図１０Ａ−１０Ｈ】
【図１１Ａ−１１Ｄ】
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図４Ａ−４Ｅ】
【図４Ｇ−４Ｋ】
【図５Ａ−５Ｇ】
【図７Ａ−７Ｅ】
【図８Ａ−８Ｅ】
【図９Ａ−９Ｄ】
【図１０Ａ−１０Ｈ】
【図１１Ａ−１１Ｄ】
【図１】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１３−５０２５７３（Ｐ２０１３−５０２５７３Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５２５２（Ｐ２０１２−５２５２５２）
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００６７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２１１９５
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０４１２７６４７）テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド (20)
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１８日（２０１０．８．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００６７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２１１９５
【国際公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【出願人】（５０４１２７６４７）テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド (20)
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