分析対象物を検出するための試薬及び方法
分析対象物を検出する試薬は、フラビンタンパク質、フェノチアジンメディエーターのようなメディエーター、少なくとも１つの界面活性、ポリマー及び緩衝液を含む。試薬を、複数の電極を含む電気化学試験センサーと共に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に分析対象物の測定のための試薬、方法及び装置に関する。より詳細には、本発明は、血液試料中のグルコースの測定のための試薬、方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
体液中の分析対象物の定量法は、特定の生理学的な体調（身体状態）の診断及び維持において著しく重要である。例えば乳酸塩、コレステロール及びビリルビンを、特定の個人においてモニターするべきである。特に、糖尿病を有する個人は、食事によるグルコース摂取を調節するために体液におけるグルコースレベルを頻繁に検査することが重要である。そのような試験の結果を、あるとすれば、インスリン又は他の薬剤を投与するべきかの決定に使用することができる。一つの種類の血中グルコース試験系において、試験センサーを血液試料の試験に使用する。
【０００３】
試験センサーは、例えば血中グルコースと反応するバイオセンシング又は試薬物質を含有する。センサーの試験端は、試験される流体（例えば、指を刺した後に人の指先に溜まった血液）に設置するように適合されている。流体は、センサーにおいて試験端から試薬物質へ伸びている毛管路の中に毛管作用によって引き込まれ、それにより十分な量の試験される流体がセンサーに引き込まれる。試験は、典型的には、光学的又は電気化学的試験方法を使用して実施される。
【０００４】
電気化学試験センサーは、目的の分析対象物に関わる酵素触媒化学反応に基づいている。グルコースのモニタリングの場合では、関連する化学反応は、グルコースをグルコノラクトン又はその対応する酸に酸化することである。この酸化は、多様な酵素によって触媒され、それらの幾つかは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（ＮＡＤ（Ｐ））のような補酵素を使用することができ、一方、他のものは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）又はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）のような補酵素を使用することができる。
【０００５】
試験センサーの適用において、グルコースの酸化の際に生成されるレドックス等価物は電極の表面に運ばれ、それによって電気信号が生成される。電気信号の大きさは、グルコース濃度と相関関係にある。酵素の化学反応部位から電極の表面へのレドックス等価物の移動は、電子移動メディエーターを使用して達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以前にＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）と共に使用された電子移動メディエーターには、フェリシアン化カリウム、フェナジン−メトスルフェート（ＰＭＳ）、メトキシフェナジン−メトスルフェート、フェナジンメチルスルフェート及びジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）が含まれる。しかし、これらの化合物は、温度及び水分を含む環境条件に高度の感受性を示すことが証明されており、このことは試験センサー試薬に低い安定性をもたらす。例えば、保存の間に、酸化メディエーターと酵素系の相互作用によって還元されたメディエーターが生じうる。メディエーター又は酵素の量が多いほど、生じる還元メディエーターの量が多くなる。経時的に増加するバックグラウンド電流は、一般に、高濃度の還元メディエーターのため、センサーストリップの保存寿命の終わりに近づくにつれて増加する。増加したバックグラウンド電流は、試験センサーの測定の精密度及び正確度を低下させ、それによって試験センサーの限定された保存寿命をもたらしうる。
【０００７】
現在の試験センサーに関連する別の欠点は、比較的ゆっくりとした充填速度である。試薬の再水和が素速くなり、より均一になりうるので、素速い試験センサー充填速度を達成することが望ましい。したがってより素速い充填速度は、一般に、変動が少なく、より精密で、安定した試験センサーをもたらす。
【０００８】
したがって、これらの欠点の１つ以上に対処する試薬を有することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明の一つの態様によると、分析対象物を検出する試薬は、フラビンタンパク質酵素、下記：
【００１０】
【化１】
【００１１】
で示される群又はこれらの組み合わせから選択されるメディエーターを含む。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。試薬は、更に、少なくとも１つの界面活性剤、ポリマー及び緩衝液を含む。界面活性剤及び緩衝液の少なくとも１つは無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比は約３：１未満である。
【００１２】
本発明の別の実施態様によると、流体試料中の分析対象物を検出する試薬は、約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼを含む。試薬は、更に、約５mM〜約１２０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む。試薬は、更に、試薬の約０．０５重量％〜約０．５重量％の濃度を有する界面活性剤を含む。試薬は、更に、試薬の約０．１重量％〜約４重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーと、緩衝液とを含む。界面活性剤及び緩衝液の少なくとも１つは無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比は約３：１未満である。
【００１３】
本発明の別の実施態様によると、電気化学試験センサーは、表面を有する作用電極を含む。試験センサーは、更に、表面を有する対電極を含む。試験センサーは、更に、作用電極の表面の少なくとも一部及び対電極の表面の少なくとも一部を被覆する試薬を含む。試薬は、フラビンタンパク質、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーター、緩衝液、並びに少なくとも１つの界面活性剤及びポリマーを含む。界面活性剤及び緩衝液の少なくとも１つは無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比は約３：１未満である。
【００１４】
本発明の一つの方法によると、分析対象物が化学反応を受ける、流体試料中で分析対象物を検出する方法は、電極の表面を準備する行為を含む。この方法は、更に、界面活性剤を使用して、電極の表面への流体試料の流れを促進する行為を含む。この方法は、更に、フラビンタンパク質酵素により化学反応を触媒する行為を含む。この方法は、更に、化学反応によりレドックス等価物を生成する行為を含む。この方法は、更に、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーターを使用して、レドックス等価物を電極の表面に移動する行為を含む。前記最大動的性能は、約３秒未満である。
【００１５】
別の方法によると、分析対象物を流体試料中で検出し、電極の表面を準備することが含まれる試薬が準備され、その試薬はフラビンタンパク質酵素、下記：
【００１６】
【化２】
【００１７】
で示される群又はこれらの組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）、少なくとも１つの界面活性剤及び緩衝液を含み、その試薬は電極表面と接触している。流体試料を試薬と接触させる。分析対象物の濃度を決定する。前記最大動的性能は、約３秒未満である。
【００１８】
上記の発明の概要は、本発明のそれぞれの実施態様又は全ての態様を表すことを意図しない。本発明の追加の特徴及び利益は、下記に記載される詳細な説明及び図面から明白である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】一つの実施態様による試験センサーである。
【図１ｂ】図１ａの試験センサーの側面図である。
【図２】グルコース濃度の電流測定値をプロットした線グラフである。
【図３】ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（MEGA 8）界面活性剤を含むセンサーとMEGA 8界面活性剤を含まないセンサーの充填時間を比較した棒グラフである。
【図４】MEGA 8界面活性剤を含むセンサーとMEGA 8界面活性剤を含まないセンサーのバックグラウンド電流を比較した棒グラフである。
【図５】界面活性剤を有する又は有さない異なる配合物による試験センサーの充填時間の棒グラフである。
【図６】界面活性剤を含む配合物による時間に対して測定した電流値のプロットである。
【図７】５０mg/dLのグルコース、異なる硫酸塩濃度のメディエーター及び異なるリン酸緩衝液濃度を使用したピーク時間の棒グラフである。
【図８】１００mg/dLのグルコース、異なる硫酸塩濃度のメディエーター及び異なるリン酸緩衝液濃度を使用したピーク時間の棒グラフである。
【図９】４００mg/dLのグルコース、異なる硫酸塩濃度のメディエーター及び異なるリン酸緩衝液濃度を使用したピーク時間の棒グラフである。
【図１０ａ】異なる無機塩濃度を有する配合物による時間に対して測定した電流値のプロットである。
【図１０ｂ】異なる無機塩濃度を有する配合物による時間に対して測定した電流値のプロットである。
【図１１】低塩試薬溶液と高塩試薬配合物のＣＶ％のグラフである。
【００２０】
本発明は多様な変更及び代替的形態を受入可能であるが、特定の実施態様が例として図面に示されており、本明細書において詳細に記載される。しかし、本発明を開示されている特定の形態に限定することが意図されないことを理解するべきである。むしろ、本発明は、本発明の精神及び範囲内にある変更、等価物及び代替物を全て網羅するものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、分析対象物の測定のための試薬、方法及び装置を対象とする。より詳細には、本発明は、（１）フラビンタンパク質酵素、（２）フェノチアジン若しくはフェノキサジンメディエーター、（３）緩衝液、（４）界面活性剤若しくは界面活性剤の混合物、及び／又は（５）セルロース系ポリマーを含む、分析対象物を検出する試験センサー試薬を対象とする。
【００２２】
本明細書に記載される試薬を使用して、流体試料中の分析対象物濃度を決定するのを助けることができる。本発明によりモノターされる分析対象物の性質は、分析対象物が、フラビンタンパク質酵素により触媒される化学反応を受ける限り、制限されない。収集され、分析されうる種類の分析対象物の幾つかの例には、グルコース、脂質プロフィール（例えば、コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ及びＨＤＬ）、マイクロアルブミン、ヘモグロビン、Ａ１Ｃ、フルクトース、乳酸塩又はビリルビンが挙げられる。他の分析対象物の濃度を決定できることが考慮される。分析対象物は、例えば、全血試料、血清試料、血漿試料、ＩＳＦ（間質液）や尿のような他の体液及び非体液の中にあることができる。
【００２３】
本明細書に記載されている試験センサーは、電気化学試験センサーである。電気化学試験センサーにより使用される計測器は、検量情報を検出するための光学的側面及び電気化学的側面を有して、流体試料の分析対象物に関連する情報（例えば、分析対象物濃度）を決定することができる。電気化学試験センサーの一つの非限定例が図１ａに示されている。図１ａは、基部１１、毛管路、並びに複数の電極１６及び１８を含む試験センサー１０を表す。領域１２は、毛管路を画定する（例えば、基部１１を覆って蓋を被せた後）区域を示す。複数の電極には、対電極１６及び作用電極１８が含まれる。電気化学試験センサーは、作用電極、対電極、トリガー電極又は流体試料において干渉物質（例えば、ヘマトクリット、アスコルビン酸塩、尿酸）を検出する別の電極のような、少なくとも３つの電極を含有することもできる。本発明の実施態様の電気化学試験センサーに用いられる作用電極は、炭素、白金、パラジウム、金、これらの組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されない適切な電極によって変わることができる。
【００２４】
電極１６、１８は、例示の実施態様において試験センサー接点１４ａ、ｂと示されている大型の区域で終止している複数の導電性リード線１５ａ、ｂに結合している。毛管路は一般に流体受容区域１９に配置されている。その操作を含む電気化学試験センサーの例は、例えば、Bayer Corporationに譲渡された米国特許第６，５３１，０４０号において見出すことができる。他の電気化学試験センサーを本発明の実施態様に用いてもよいことが考慮される。
【００２５】
流体受容区域１９は、流体試料（例えば、血液）中の目的の分析対象物（例えば、グルコース）を、電極パターンの構成要素により、生成される電流として電気化学的に測定可能な化学種に変換する、少なくとも１つの試薬を含む。試薬は、典型的には、分析対象物及び電子受容体と反応して、電極により検出されうる電気化学的に測定可能な種を生成する分析対象物特異的酵素を含む。試薬は、分析対象物と導体の間で電子を移動するのを助けるメディエーター若しくは他の物質、酵素とメディエーターを一緒に保持する結合剤、他の不活性成分又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００２６】
流体試料（例えば、血液）を流体受容区域１９に適用することができる。流体試料は少なくとも１つの試薬と反応する。試薬と共に複数の電極と反応した後、流体試料は、分析対象物濃度の決定を助ける電気信号を生成する。導電性リード線１５ａ、ｂは、試験センサー１０の第２反対端４２に向かって電気信号を運び、そこで試験センサー接点１４ａ、ｂは、電気信号を計測器に転送する。
【００２７】
図１ｂを参照すると、図１ａの試験センサー１０の側面図が示されている。図１ｂに示されているように、図１ｂの試験センサー１０は、更に、蓋２０及びスペーサー２２を含む。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２は、ポリマー材料のような多様な材料から作製することができる。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を形成するのに使用できるポリマー物質の非限定例には、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリイミド及びこれらの組み合わせが挙げられる。基部１１、蓋２０及び／又はスペーサー２２を形成するのに他の材料が使用できることが考慮される。
【００２８】
図１ａ、１ｂの試験センサー１０を形成するために、基部１１、スペーサー２２及び蓋２０を例えば接着剤又はヒートシールにより取り付ける。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を接着させると、流体受容区域１９が形成される。流体受容区域１９は、流体試料を試験センサー１０に導入する流路を提供する。流体受容区域１９は、試験センサー１０の第１末端又は試験端４０において形成される。本発明の実施態様の試験センサーを、スペーサーなしで基部及び蓋により形成することができ、流体受容区域は基部及び／又は蓋に直接形成される。
【００２９】
本発明におけるフラビンタンパク質は、フラビン補助因子を有する任意の酵素を含む。フラビンタンパク質の幾つかの非限定例には、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ（酵素分類（Enzyme Classification）番号１．１．３．４）、フラビン−ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．５）及びＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．９９．１０）が挙げられる。本発明において使用される追加のオキシダーゼ酵素には、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ（例えば、メタノールオキシダーゼ）、ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びこれらのＦＡＤ誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明に使用される望ましいフラビンタンパク質は、ＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）である。
【００３０】
本発明によるメディエーターには、下記式：
【００３１】
【化３】
【００３２】
を有するフェノチアジン及び下記式：
【００３３】
【化４】
【００３４】
を有するフェノキサジンが含まれ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。これらの異性体が形成されうることも考慮される。
【００３５】
ＮＡＤＨメディエーターとして調製され、適切な特性を有することが見出されたフェノチアジンの一つの望ましい例は、下記式：
【００３６】
【化５】
【００３７】
を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンの水溶性ナトリウム又はアンモニウム塩である。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンは、特に低いバックグラウンド電流を伴い、改善された信号対雑音比をもたらす。もう一つの望ましい例は、ＮＡＤＨメディエーターとして調製され、適切な特性を有することが見出された３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。これらのフェノチアジンのバックグラウンド電流は、以前に使用されたメディエーターよりも有意に少ないことが見出された。
【００３８】
ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出された他のフェノチアジン及びフェノキサジンは、３−（４’−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ニトロ−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−アセチル−３−（４’−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−トリフルオロメチル−３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾリル）フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−エチルフェニル）アミノ−３−（４’−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕−エトキシフェニル）アミノ−３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンボロン酸；３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−カルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（３’，５−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン；３−（２’，５’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸；及び３−（３’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸である。
【００３９】
一つの実施態様において、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、フェノチアジン（１．５３mol、１．１当量、３０６ｇ）を撹拌しながら６．０Lのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、次に０℃に冷却することによって調製した。アニリン２，５−ジスルホン酸（１．３８mol、３５０ｇ）を７．０Lの水に溶解し、１Mの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（１２８ml）を、撹拌しながら加えた。アニリン２，５−ジスルホン酸溶液をフェノチアジン溶液に約２時間かけてゆっくりと加えて、白色で曇った懸濁液を得た。フェノチアジン／アニリン懸濁液は約０℃〜約４℃の温度であった。過硫酸ナトリウム（５．５２mol、４当量、１３１４ｇ）を４．０Lの水に溶解して、過硫酸ナトリウム溶液を形成した。
【００４０】
過硫酸ナトリウム溶液を約０℃〜約３℃の温度でフェノチアジン／アニリン懸濁液に３時間かけて滴加し、濃暗色の溶液をもたらした。濃暗色溶液を、氷浴を使用して冷却状態を保ち、一晩撹拌した。次に内容物をBuchiロータリーエバポレーターに移し、テトラヒドロフランを３５℃未満の温度で約２時間かけて除去した。蒸発行為の後、残留溶液を２５Lの分離器に移し、酢酸エチルで溶媒相洗浄した。残留溶液を、毎回２Lの酢酸エチルを使用して、３回溶媒相洗浄した反応流体を、アセトン／ＣＯ２浴中で撹拌しながら、−３℃に冷却した。沈殿固体を、同日に、２つの２４cmのブフナー漏斗の２枚のクロスを介して濾過した。沈殿固体を漏斗に一晩放置して乾燥し、次に２Lのアセトニトリルが入っているフラスコに移し、室温で約１時間撹拌した。次に、残留水を除去するため、試料を濾過し、更なるアセトニトリルで洗浄した。メディエーターを、真空炉により３５℃で乾燥して、恒量にした。
【００４１】
３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを有する試薬を使用して達成される低いバックグラウンド電流のため、同じ試薬配合物を、電気化学試験センサーの作用電極と対電極の両方に適用することができる。同じ試薬を作用電極と対電極の両方に適用することは、製造過程を簡素化し、それによって関わる費用を減少する。加えて、低いバックグラウンド電流は、特に低グルコース濃度を有する試料から正確なグルコース読み取り値を得ることを助け、このことは特に新生児血中グルコースアッセイを行うに当って重要である。
【００４２】
本発明の実施態様の試薬は、更に、界面活性剤若しくは界面活性剤の組み合わせ及び／又はセルロース系ポリマーを含む。界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせは、センサー血液充填速度及び乾燥試薬の再水和を促進する。より素速い血液充填速度及び試薬再水和速度は、約２０％〜約７０％のヘマトクリット範囲にわたる、より迅速なアッセイ（例えば、５秒未満のアッセイ）を達成するために望ましい。
【００４３】
界面活性剤は、望ましくは、糖類系界面活性剤又はホスホリルコリン系界面活性剤を含む生体適合性のものから選択される。糖類系界面活性剤の一つの非限定例は、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Sigma-Aldrich of St. Louis, MOのMEGA 8）である。MEGA 8のような界面活性剤は、試験センサーの熱安定性の増大を助ける。加えて、MEGA 8のような界面活性剤は、高ヘマトクリットレベルを有する血液試料においてさえも素速い充填速度を助ける。MEGA 8のような界面活性剤を、試薬配合物において他の不活性成分（例えば、ヒドロキシエチルセルロースポリマー及び／又は中性ｐＨ緩衝液）と共に使用することは、高温であっても大きな安定性を有するセンサーをもたらす。ホスホリルコリン系界面活性剤の非限定例には、Lipidureシリーズ（NOF Corporation, Japan）が挙げられる。
【００４４】
界面活性剤を、エトキシル化オレイルアルコール（Cranbury, NJのRhodia Inc.からのRhodasurf ON870）のような従来の中性界面活性剤から選択することもできる。界面活性剤を、ナトリウムメチルココイルタウレート（Rhodia Inc.のGeropon TC-42）及びアルキルフェノールエトキシレートホスフェート（Chicago, ILのAkzo-Nobel Surface Chemistry LLCからのPhospholan CS131）のようなアニオン性界面活性剤から選択することもできる。他の界面活性剤を試薬の形成に使用できることが考慮される。
【００４５】
代替的に又は追加的に、本発明の実施態様の試薬はポリマーを含む。試薬は、ヒドロキシエチルセルロースポリマーのようなセルロース系ポリマーを含むことができる。幾つかの実施態様において、セルロース系ポリマーは、低から中分子量のセルロース系ポリマーである。セルロース系ポリマーのようなポリマーは、試薬が、乾燥したときにセンサー基体において元の位置に留まるように、試薬に向上した安定性及び適切な粘度を与えることを助ける。例えばポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）のような他のポリマーを使用できることが考慮される。
【００４６】
試薬は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）及び／又は他の不活性成分を含むこともできる。適切な緩衝溶液の非限定例には、グッド緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ（すなわち、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（すなわち、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（すなわち、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸））、マッキルベン緩衝液、これらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
望ましいアッセイ精密度、熱安定性及び最大動的性能を提供するために、無機塩とメディエーターの比率は、約３：１未満であるべきである。無機塩の供給源は、緩衝剤及び／又はメディエーターでありうる。無機塩とメディエーターの比率が約２：１未満、さらには約１．５：１未満であることが更に望ましい。
【００４８】
本発明の一つの実施態様によると、試薬は、ＦＡＤ−ＧＤＨ、低バックグラウンドフェノチアジンメディエーター、界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせ、セルロース系ポリマー、並びにセンサー性能及び安定性の改善を達成する緩衝液を含む。試薬を使用して、血液、血漿、血清又は尿のような生物学的分析対象物中のグルコース濃度を決定することができる。一つの実施態様において、フェノチアジンメディエーターは、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである。別の実施態様において、界面活性剤はMEGA 8であり、ポリマーはヒドロキシエチルセルロースである。一つの実施態様において、試薬は、約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの範囲の活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約５mM〜約１２０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．０５重量％〜約０．５重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．１重量％〜約４重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約４〜約８のｐＨを有する約２５mM〜約２００mMの緩衝液を含む。別の実施態様において、試薬は、約０．５単位／μL〜約２．５単位／μLの範囲の活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約３０mM〜約６０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．１重量％〜約０．４重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．０１〜約０．１％のGeropon TC-42、約０．２重量％〜約０．５重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約６〜約７のｐＨを有する約５０mM〜約１５０mMの緩衝液を含む。
【実施例】
【００４９】
実施例１
図２に示されているように、４つのロットのセンサーの化学反応性は、約１．７５単位／μLの活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ酵素、約４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．２５重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約６．５のｐＨを有する約１００mMのリン酸緩衝液を含むセンサーのグルコース用量依存性曲線を生成することによって分析した。センサーを約４０％のヘマトクリットレベルの全血試料で試験した。血液試料の血中グルコース濃度は、約０mg/dL、３８mg/dL、６７mg/dL、１１２mg/dL、２２２mg/dL、３３９mg/dL及び６２２mg/dLであった。それぞれの血液試料では、それぞれのセンサーロットについて１０個の複製を収集した。図２に示されているように、それぞれの試料の平均電流を、それぞれのセンサーロットでYellow Springs Glucose Analyzer（YSI, Inc., Yellow Springs, Ohio）により測定した試料グルコース濃度（mg/dL）に対してプロットした。用量反応線の勾配は約２０nA/mg/dLであり、試験センサーの比較的高い感受性を示した。ｙ切片は、０nAに比較的近く、低いバックグラウンド雑音レベルを示した。これらの結果は、本明細書に記載されている試薬を含む試験センサーを使用して、正確な読み取りが達成できることを示す。
【００５０】
変動係数を、図２のグラフの作成に使用したセンサーロットの１０個の複製のそれぞれについて決定した。下記の表１は、４つのセンサーロットの平均変動係数率（ＣＶ％）を示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
本発明の実施態様の試薬を含むセンサーの低いバックグラウンド雑音のため、平均アッセイＣＶ％は、低グルコース濃度を有する試料であっても３．５％未満であった。このようにＣＶ％値は十分に５％未満であり、このことは、多くの場合に標準許容限界として考慮される。この低ＣＶ％は、試験センサーの高い精密度を示す。加えて、低ＣＶ％は試験センサー間の低い変動に関係しており、一定の試験結果を得るために望ましい。
【００５３】
実施例２
図３は、６０％ヘマトクリット全血を使用したセンサー充填速度に対するMEGA 8界面活性剤の効果を例示するグラフを示す。図３に使用されている試験センサーは、約１単位／μL（約１９２単位／mg）の活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約４重量％（約１２０mM）のフェリシアン化カリウムメディエーター、試薬の約１．６重量％である４重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約５．０のｐＨの約３５mMのクエン酸緩衝液を含んだ。フェリシアン化カリウムメディエーターを使用して、MEGA 8界面活性剤が、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターなしで、試験センサーに対して望ましい影響を与えるかについて試験した。約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤を含む３０個の試験センサー群の充填速度を、MEGA 8界面活性剤を含まない３０個の試験センサー対照群と比較した。２つの群からのそれぞれ１０個のセンサーの初期充填速度を測定した。次に、各群からの１０個のセンサーを約−２０℃の温度に約２週間暴露した。最後に各群からの１０個のセンサーを約５０℃の温度に約２週間暴露した。試験センサーの各群及び下位集団の平均充填時間を計算し、図３に示す。血液は、界面活性剤を有する試薬及び６０％ヘマトクリット全血試料により、試験センサーの反応室を０．３秒未満で充填する。図３に示されているように、MEGA 8界面活性剤を含むセンサーの充填速度は、MEGA 8界面活性剤を含まないセンサーの少なくとも２倍速く、最大約４倍速かった。
【００５４】
実施例３
MEGA 8界面活性剤を含む熱ストレスセンサーのバックグラウンド電流を、MEGA 8界面活性剤を含まない熱ストレスセンサーのバックグラウンド電流と比較した。図４に使用されている試験センサーは、約１単位／μLの活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約５０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、試薬の約０．７５重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約７のｐＨの約５０mMの緩衝液を含んだ。第１群の４０個の試験センサーは、MEGA 8界面活性剤を含まなかった。第２群の４０個の試験センサーは、約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤を含んだ。第１及び第２群は、それぞれ２つの下位集団：Amano Enzyme Inc.（Nagoya, Japan）からのＦＡＤ−ＧＤＨを有する２０個の試験センサーを含む第１下位集団及びToyobo Co.（Osaka, Japan）からのＦＡＤ−ＧＤＨを有する２０個の試験センサーを含む第２下位集団を含んだ。それぞれの下位集団からの１０個の試験センサーを約５０℃で約２週間保存した。残りの試験センサーを約−２０℃で約２週間保存した。次にセンサーのバックグラウンド電流を、約０mg/dLのグルコース濃度を有する４０％ヘマトクリット全血試料を使用して試験した。試料１つあたり１０個の複製を収集した。図４は、１０個の複製からの平均センサーバックグラウンド電流を例示するグラフを示す。図４に示されているように、MEGA 8界面活性剤を含む試験センサーは、MEGA 8界面活性剤を含まない試験センサーと比較して、有意に低いセンサーバックグラウンド電流変化を有し、試薬は、MEGA 8界面活性剤が試薬に添加されたときにより安定することを示した。
【００５５】
実施例４
本発明の実施態様の試験センサーの熱安定性も試験した。この実施例に使用されている試験センサーは、約２単位／μLの活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．２５重量％のヒドロキシエチルセルロースの試薬及び約６．５のｐＨの約１００mMの緩衝液を含んだ。第１群の試験センサーを約５０℃で約２週間保存した。第２群の試験センサーを約−２０℃で約２週間保存した。次に、それぞれの群のセンサーの性能を、約５０mg/dL、約１００mg/dL及び約４００mg/dLのグルコース濃度を有する４０％ヘマトクリット全血試料を使用して評価した。試料１つあたり１０個の複製を収集した。５０℃で保存した試験センサーと−２０℃で保存したものとのグルコース濃度の平均差を計算し、幾つかの異なる種類の自己試験血中グルコースモニタリング系と比較した。本発明の実施態様の試験センサーのグルコースアッセイの偏りは、無視できるものであった。このように、センサーを比較的厳しい温度で２週間保存した後でも、グルコースアッセイの結果に明白な変化はなかった。対照的に、比較としての市販試験センサーのグルコースアッセイの偏りは、一般に約５％〜約１２％であった。このように、本発明の実施態様の試験センサーの熱安定性は、現存の試験センサーよりも著しく良好であった。
【００５６】
実施例５
試験センサーを使用して試験を実施し、高ヘマトクリット血液試料による充填速度を決定した。具体的には、図５に示されているように、界面活性剤を使用しない配合物（配合１）及び界面活性剤を使用する配合物（配合２〜７）を試験した。配合物を下記の表２に提示する。
【００５７】
【表２】
メディエーター＝３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン
緩衝液＝配合６がＴＥＳを使用した以外はリン酸
ＴＥＳ＝（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）
ＨＥＣ＝ヒドロキシエチルセルロース
【００５８】
具体的には、配合２及び３は、界面活性剤MEGA 8を含み、一方、配合４及び５は界面活性剤Rhodasurfを含んだ。配合６は、界面活性剤Zwittergentを含み、配合７は界面活性剤MEGA 8及びPhospholan CS131を含んだ。配合１〜７には、２つの異なる条件によりストレスをかけた。具体的には、配合１〜７には、−２０℃の温度で２週間ストレスをかけ、その上、５０℃で２週間ストレスをかけた。
【００５９】
これらの条件によりストレスをかけた後、配合１〜７を試験センサーの電極上に設置した。センサーを垂直（９０°）の位置で６０〜７０％ヘマトクリットの全血により試験した。センサーを充填の際にビデオ撮影し、時間を測定した。配合１〜７について高ヘマトクリット血液がセンサー反応室全体を充填するのに必要な時間を図５に示す。配合１（界面活性剤を有さない）のセンサー充填時間は、−２０℃及び５０℃／２週間で保存したセンサーでは、それぞれ約０．６及び０．７秒であった。一方、配合２〜７は、−２０℃及び５０℃／２週間の両方において、約０．５秒以下のセンサー充填時間を有した。配合２〜７の大部分では、−２０℃及び５０℃／２週間の両方において、約０．４秒以下のセンサー充填時間を有し、幾つかは約０．３秒未満であった。このように、界面活性剤を有する配合２〜７は、界面活性剤を有さない配合１よりもはるかに改善された充填時間を有した。
【００６０】
実施例６
試薬を試験して、最大動的性能を決定した。試薬は、４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、５０mMのリン酸緩衝液、２．００U/ulのＦＡＤ−ＧＤＨ、０．２５重量％のヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）及び０．２０重量％の界面活性剤MEGA 8を含んだ。
【００６１】
図６は、グルコース濃度４００mg/dL及び７０％ヘマトクリットの血液試料を有する試験センサーからの出力信号を示す。測定装置によるセンサーストリップへの信号入力は、米国特許出願第２００８／０１７３５５２号に記載されているように、７個の緩和により離されている８個のパルス励起を含むゲート電流測定パルス系列であった。励起は持続時間が１秒未満であった。３つの出力電流値をそれぞれの励起の際に記録した。
【００６２】
入力信号からの出力電流値が試料の分析対象物濃度と相関するためには、励起の初期電流値は、好ましくは続く減衰のものよりも大きい。図６のセンサーストリップの出力信号は、血液試料がストリップに導入された約２秒後において減衰する初期高電流値を示した。これによって、電流値の減衰を伴う高い初期電流値を有する第１出力電流が、出力電流１１０で観察された。
【００６３】
入力信号からの出力電流値が試料の分析対象物濃度と相関するためには、また、異なる試料分析対象物濃度は、好ましくは出力電流値の間に実質的に一定の差を示す。好ましくは、出力電流値又は試料の分析対象物濃度と相関する出力電流値も、センサーストリップの最大動的性能を反映する減衰する電流データから取られる。出力電流の基礎にあるレドックス反応速度は、多数の要因により影響を受ける。これらの要因には、試薬組成物が再水和する速度、酵素系が分析対象物と反応する速度、酵素系が電子をメディエーターに移動する速度及びメディエーターが電子を電極に移動する速度が含まれうる。出力電流に影響を与えるこれら及び他の動的要因のうち、試薬組成物が再水和する速度は、出力電流値に最大の影響を与えると考えられる。
【００６４】
センサーストリップの最大動的性能は、減衰電流値を有する励起の初期電流値が多数の励起の中で最大であるとき、ゲート電流測定パルス系列の励起の際に達成することができる。これを、センサーピーク時間と呼ぶこともできる。好ましくは、センサーストリップの最大動的性能は、減衰電流値を有する励起により得られる終期電流値が、多数の励起により得られる終期電流値のうちで最大であるときに達成される。より詳細には、センサーストリップの最大動的性能は、減衰電流値を有する励起の初期電流値が多数の励起のうちで最大であるとき、そして同じ励起により得られる終期電流値が多数の励起により得られる終期電流値のうちで最大であるときに達成される。
【００６５】
センサーストリップの最大動的性能は、望ましくは約３秒未満、より望ましくは約２秒未満である。
【００６６】
試験センサーの最大動的性能を決定するのに使用されるゲート電流測定パルス系列は、励起が約０．４秒の持続時間であり、緩和が１秒の持続時間であり、試料を通過するゼロ電流の流れを含み、開放回路により提供される、少なくとも７つの動作周期を含んだ。少なくとも３つの出力電流値を、それぞれの励起の際に測定する。センサーストリップへの潜在的な入力は、２５０mVで実質的に一定に保持し、試料温度は２３℃である。動作周期の前に、４００mVのパルスを０．９秒間適用した。
【００６７】
図６の４００mg/dLのグルコースを有するセンサーストリップは、センサーストリップへの試料の導入の３〜４秒間の出力電流１２０及び１２５を含む励起減退の際に最大動的性能に達した。このことは、減衰電流値を有する励起から得られた最大初期及び最大終期電流値の両方が、出力電流１２０及び１２５を含む周期に存在するときに確立した。初期出力電流１２０を出力電流１１０、１３０、１４０、１５０及び１７０と比較すること、また、終期電流１２５を出力電流１１５、１３５、１４５、１５５、１６５及び１７５と比較すること。このように、センサーは、７０％ヘマトクリット血液試料であっても、３〜４秒の間に最大動的性能に達する。
【００６８】
実施例７
図７〜９は、試薬配合物が異なるヘマトクリットレベルの血液における最大動的性能にも影響を与えうることを示す。最初に図７を参照すると、５０mg/dLのグルコース濃度では、センサーピーク時間を使用した最大動的性能は、ヘマトクリットレベルが増加すると増大した。少ない硫酸塩率（５％の硫酸塩）を含むメディエーターは、一般に同等のヘマトクリットレベル及び緩衝液濃度においてはるかに速いピーク時間を有した。例えば、５０mMのリン酸緩衝液を使用したヘマトクリットレベル６０％を参照すること（５％の硫酸塩を使用したメディエーターの３．５秒と、２０％の硫酸塩を使用したメディエーターの７．５秒とを比較すること）。緩衝液強度及びメディエーターの残留硫酸塩含有量のような試薬配合は、一般にセンサーの反応ピーク時間に対して、特に高ヘマトクリット（＞４０％）の試料において大きな影響を与える。したがって、センサー配合における高無機塩（硫酸塩濃度に関しては緩衝液又はメディエーターからの）は、センサーピーク時間を増加する（すなわち、センサーの反応を遅くする）。図８は、１００mg/dLのグルコース濃度を使用した同様の結果を示す。４００mg/dLという高グルコース濃度を使用した場合、図９は、一般に約３又は３．５秒未満のセンサーピーク時間を費やす最大動的性能を示すが、多くのセンサーピーク時間は２秒である。５％硫酸塩及び１００mMのリン酸緩衝液は、高ヘマトクリットレベルにおいて、センサーピーク時間の約４．５又は５秒を費やす最大動的性能を有した。
【００６９】
このように、５０mg/dL及び１００mg/dLグルコース濃度で示されているように、高ヘマトクリットの試料において素速い試薬再水和及びグルコース反応を達成するためには、試料配合物の塩含有量は低い必要がある。
【００７０】
実施例８
試験センサーをストレス条件下（−２０℃及び５０℃／４週間）で保存した後、２つの配合物を最大動的性能について試験した。図１０ａの配合物は、５０mMのリン酸緩衝液及び５重量％の硫酸塩を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含んだ。図１０ｂの配合物は、１００mMのリン酸緩衝液及び２０重量％の硫酸塩を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含んだ。この実施例に使用したゲート電流測定パルス系列は、上記の実施例６に記載されたものと同様であった。
【００７１】
図１０ａに示されているように、最大動的性能は、−２０℃で４週間ストレスを受けた試料では約２秒であった。最大動的性能は、−５０℃で４週間ストレスを受けた試料では約３．５秒であった。図１０ｂを参照すると、最大動的性能は、−２０℃で４週間ストレスを受けた試料では約３．５秒であり、−５０℃で４週間ストレスを受けた試料では約５秒であった。このように、低無機塩量（例えば、図１０ａ）を有する配合物は、高無機塩量（例えば、図１０ｂ）を有する配合物と比較して、改善された最大動的性能を有した。
【００７２】
加えて、図１０ａにおいて使用したセンサーピーク時間が２秒の配合物ロットを、アッセイ偏り又は偏り％について試験した。１００mg/dL以下のグルコース濃度の偏り％は、約＋／−２％未満であった。４００mg/dLのグルコース濃度の偏り％は、約＋／−４％であった。３〜４秒のピーク時間を有する図１０ｂにおいて使用した配合物ロットのアッセイ偏りも試験した。１００mg/dL以下のグルコース濃度の偏り％は、約＋／−３％未満であった。４００mg/dLのグルコース濃度の偏り％は、約＋／−１０％であった。このように、３〜４秒のセンサーピーク時間を有するロットのアッセイ偏りは、２秒のセンサーピーク時間を有するロットよりも大きかった。
【００７３】
実施例９
図１１を参照すると、異なるグルコース濃度の４０％ヘマトクリット全血試料を使用した変動係数％（ＣＶ％）を示す。グルコース濃度は、３６mg/dL〜６２７mg/dLの範囲である。低塩含有量ロットを有する試薬溶液を、高塩含有量ロットを有する試薬溶液と比較した。低塩ロットは、ｐＨ６．５の５０mMのリン酸緩衝液、２U/ulのＦＡＤ−ＧＤＨ、５重量％の硫酸塩を有する４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、０．２５％のヒドロキシエチルセルロース−３００ｋ及び０．２％のMEGA8界面活性剤を含んだ。高塩ロットは、ｐＨ６．５の１００mMのリン酸緩衝液、２U/ulのＦＡＤ−ＧＤＨ、２０重量％の硫酸塩を有する４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、０．２５％のヒドロキシエチルセルロース−３００ｋ及び０．２％のMEGA8界面活性剤を含んだ。
【００７４】
ＣＶ％は、センサーピーク時間を使用して最大動的性能の平均を取り、これらのセンサーピーク時間の標準偏差で割ることによって計算した。この得られた値に１００を掛けて、ＣＶ％をもたらした。合計４０個の試料を低塩試薬溶液及び高塩試薬溶液の両方について試験した。
【００７５】
低塩試薬溶液は、３秒未満のセンサーピーク時間を費して最大動的性能に達成し、高塩試薬溶液と比較して、４０％ヘマトクリット全血試料においてより良好なＣＶ％をもたらした。低塩試薬溶液は、低グルコース濃度の試料においてはるかに良好なＣＶ％を有した。
【００７６】
本明細書に提示された実施例は本発明による試験センサー試薬のインビトロ（生体外）の適用に関するが、これらの試薬を、メディエーターを化学的に固定化し（例えば、芳香族環の１つ以上の置換基における化学反応により）、固定化したメディエーターを、患者に皮下移植できる装置に組み込むことによって、分析対象物をインビボ（生体内）モニタリングすることに適合することもできる。本明細書に記載された実施態様の試薬を、連続分析対象物モニタリング系と共に使用することもできる。
【００７７】
代替実施態様Ａ
試薬が、
フラビンタンパク質酵素と；
下記：
【００７８】
【化６】
【００７９】
で示される群又はその組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）と；
少なくとも１つの界面活性剤と；
ポリマーと；
緩衝液と
を含む、分析対象物を検出するための試薬。
【００８０】
代替実施態様Ｂ
フラビンタンパク質酵素がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼである、代替実施態様Ａの試薬。
【００８１】
代替実施態様Ｃ
メディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、代替実施態様Ａの試薬。
【００８２】
代替実施態様Ｄ
界面活性剤が、糖類系界面活性剤又はホスホリルコリン系界面活性剤を含む、代替実施態様Ａの試薬。
【００８３】
代替実施態様Ｅ
ポリマーがセルロース系ポリマーである、代替実施態様Ａの試薬。
【００８４】
代替実施態様Ｆ
緩衝液がリン酸緩衝液を含む、代替実施態様Ａの試薬。
【００８５】
代替実施態様Ｇ
流体試料中で分析対象物を検出するための試薬であって、
前記試薬が、
約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼと；
約５mM〜約１２０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターと；
試薬の約０．０５重量％〜約０．５重量％の濃度を有するヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤と；
試薬の約０．１重量％〜約４重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーと
を含む。
【００８６】
代替実施態様Ｈ
リン酸緩衝液を更に含む、代替実施態様Ｇの試薬。
【００８７】
代替実施態様Ｉ
リン酸緩衝液が、約２５mM〜約２００mMの濃度及び約４〜約８のｐＨを有する、代替実施態様Ｈの試薬。
【００８８】
代替実施態様Ｊ
リン酸緩衝液が、約５０mM〜約１５０mMの濃度及び約６〜約７のｐＨを有する、代替実施態様Ｉの試薬。
【００８９】
代替実施態様Ｋ
試薬が、約０．５単位／μL〜約２．５単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ、約３０mM〜約６０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、試薬の約０．１重量％〜約０．４重量％の濃度を有するヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤及び試薬の約０．２重量％〜約０．５重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーを含む、代替実施態様Ｇの試薬。
【００９０】
代替実施態様Ｌ
表面を有する作用電極；
表面を有する対電極；及び
作用電極の表面の少なくとも一部及び対電極の表面の少なくとも一部を被覆する試薬であって、前記試薬がフラビンタンパク質、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーター、緩衝液、並びに少なくとも１つの界面活性剤及びポリマーを含む試薬
を含む、電気化学試験センサー。
【００９１】
代替実施態様Ｍ
フラビンタンパク質酵素がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼを含む、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９２】
代替実施態様Ｎ
フェノチアジンメディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９３】
代替実施態様Ｏ
少なくとも１つの界面活性剤がヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミドを含む、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９４】
代替実施態様Ｐ
ポリマーがセルロース系ポリマーである、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９５】
代替的方法Ｑ
流体試料中で分析対象物を検出する方法であって、前記分析対象物が化学反応を受け、
前記方法が電極の表面を準備する行為；
少なくとも１つの界面活性剤を使用して、電極表面への流体試料の流れを促進する行為；
フラビンタンパク質酵素により化学反応を触媒する行為；
化学反応によりレドックス等価物を生成する行為；及び
フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーターを使用して、レドックス等価物を電極に移動する行為
を含む方法。
【００９６】
代替的方法Ｒ
電極表面が作用電極及び対電極を含み、電極表面が、少なくとも１つの界面活性剤、フラビンタンパク質酵素、フェノチアジンメディエーター及び緩衝液を含む試薬を含む、代替的方法Ｑの方法。
【００９７】
代替的方法Ｓ
試薬が更にセルロース系ポリマーを含む、代替的方法Ｒの方法。
【００９８】
代替的方法Ｔ
ポリマーがセルロース系ポリマーである、代替的方法Ｓの方法。
【００９９】
代替的方法Ｕ
緩衝液がリン酸緩衝液を含む、代替的方法Ｒの方法。
【０１００】
本発明は多様な変更及び代替的形態を受入可能であるが、特定の実施態様及び方法が例として図面に示されており、本明細書において詳細に記載されている。しかし、本発明を開示されている特定の形態又は方法に限定することは意図されず、それと逆に、意図されることは、本発明の精神及び範囲内の変更、均等物及び代替案を全て網羅することであることを理解するべきである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に分析対象物の測定のための試薬、方法及び装置に関する。より詳細には、本発明は、血液試料中のグルコースの測定のための試薬、方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
体液中の分析対象物の定量法は、特定の生理学的な体調（身体状態）の診断及び維持において著しく重要である。例えば乳酸塩、コレステロール及びビリルビンを、特定の個人においてモニターするべきである。特に、糖尿病を有する個人は、食事によるグルコース摂取を調節するために体液におけるグルコースレベルを頻繁に検査することが重要である。そのような試験の結果を、あるとすれば、インスリン又は他の薬剤を投与するべきかの決定に使用することができる。一つの種類の血中グルコース試験系において、試験センサーを血液試料の試験に使用する。
【０００３】
試験センサーは、例えば血中グルコースと反応するバイオセンシング又は試薬物質を含有する。センサーの試験端は、試験される流体（例えば、指を刺した後に人の指先に溜まった血液）に設置するように適合されている。流体は、センサーにおいて試験端から試薬物質へ伸びている毛管路の中に毛管作用によって引き込まれ、それにより十分な量の試験される流体がセンサーに引き込まれる。試験は、典型的には、光学的又は電気化学的試験方法を使用して実施される。
【０００４】
電気化学試験センサーは、目的の分析対象物に関わる酵素触媒化学反応に基づいている。グルコースのモニタリングの場合では、関連する化学反応は、グルコースをグルコノラクトン又はその対応する酸に酸化することである。この酸化は、多様な酵素によって触媒され、それらの幾つかは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（ＮＡＤ（Ｐ））のような補酵素を使用することができ、一方、他のものは、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）又はピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）のような補酵素を使用することができる。
【０００５】
試験センサーの適用において、グルコースの酸化の際に生成されるレドックス等価物は電極の表面に運ばれ、それによって電気信号が生成される。電気信号の大きさは、グルコース濃度と相関関係にある。酵素の化学反応部位から電極の表面へのレドックス等価物の移動は、電子移動メディエーターを使用して達成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以前にＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）と共に使用された電子移動メディエーターには、フェリシアン化カリウム、フェナジン−メトスルフェート（ＰＭＳ）、メトキシフェナジン−メトスルフェート、フェナジンメチルスルフェート及びジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）が含まれる。しかし、これらの化合物は、温度及び水分を含む環境条件に高度の感受性を示すことが証明されており、このことは試験センサー試薬に低い安定性をもたらす。例えば、保存の間に、酸化メディエーターと酵素系の相互作用によって還元されたメディエーターが生じうる。メディエーター又は酵素の量が多いほど、生じる還元メディエーターの量が多くなる。経時的に増加するバックグラウンド電流は、一般に、高濃度の還元メディエーターのため、センサーストリップの保存寿命の終わりに近づくにつれて増加する。増加したバックグラウンド電流は、試験センサーの測定の精密度及び正確度を低下させ、それによって試験センサーの限定された保存寿命をもたらしうる。
【０００７】
現在の試験センサーに関連する別の欠点は、比較的ゆっくりとした充填速度である。試薬の再水和が素速くなり、より均一になりうるので、素速い試験センサー充填速度を達成することが望ましい。したがってより素速い充填速度は、一般に、変動が少なく、より精密で、安定した試験センサーをもたらす。
【０００８】
したがって、これらの欠点の１つ以上に対処する試薬を有することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明の一つの態様によると、分析対象物を検出する試薬は、フラビンタンパク質酵素、下記：
【００１０】
【化１】
【００１１】
で示される群又はこれらの組み合わせから選択されるメディエーターを含む。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。試薬は、更に、少なくとも１つの界面活性剤、ポリマー及び緩衝液を含む。界面活性剤及び緩衝液の少なくとも１つは無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比は約３：１未満である。
【００１２】
本発明の別の実施態様によると、流体試料中の分析対象物を検出する試薬は、約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼを含む。試薬は、更に、約５mM〜約１２０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを含む。試薬は、更に、試薬の約０．０５重量％〜約０．５重量％の濃度を有する界面活性剤を含む。試薬は、更に、試薬の約０．１重量％〜約４重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーと、緩衝液とを含む。界面活性剤及び緩衝液の少なくとも１つは無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比は約３：１未満である。
【００１３】
本発明の別の実施態様によると、電気化学試験センサーは、表面を有する作用電極を含む。試験センサーは、更に、表面を有する対電極を含む。試験センサーは、更に、作用電極の表面の少なくとも一部及び対電極の表面の少なくとも一部を被覆する試薬を含む。試薬は、フラビンタンパク質、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーター、緩衝液、並びに少なくとも１つの界面活性剤及びポリマーを含む。界面活性剤及び緩衝液の少なくとも１つは無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比は約３：１未満である。
【００１４】
本発明の一つの方法によると、分析対象物が化学反応を受ける、流体試料中で分析対象物を検出する方法は、電極の表面を準備する行為を含む。この方法は、更に、界面活性剤を使用して、電極の表面への流体試料の流れを促進する行為を含む。この方法は、更に、フラビンタンパク質酵素により化学反応を触媒する行為を含む。この方法は、更に、化学反応によりレドックス等価物を生成する行為を含む。この方法は、更に、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーターを使用して、レドックス等価物を電極の表面に移動する行為を含む。前記最大動的性能は、約３秒未満である。
【００１５】
別の方法によると、分析対象物を流体試料中で検出し、電極の表面を準備することが含まれる試薬が準備され、その試薬はフラビンタンパク質酵素、下記：
【００１６】
【化２】
【００１７】
で示される群又はこれらの組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）、少なくとも１つの界面活性剤及び緩衝液を含み、その試薬は電極表面と接触している。流体試料を試薬と接触させる。分析対象物の濃度を決定する。前記最大動的性能は、約３秒未満である。
【００１８】
上記の発明の概要は、本発明のそれぞれの実施態様又は全ての態様を表すことを意図しない。本発明の追加の特徴及び利益は、下記に記載される詳細な説明及び図面から明白である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】一つの実施態様による試験センサーである。
【図１ｂ】図１ａの試験センサーの側面図である。
【図２】グルコース濃度の電流測定値をプロットした線グラフである。
【図３】ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（MEGA 8）界面活性剤を含むセンサーとMEGA 8界面活性剤を含まないセンサーの充填時間を比較した棒グラフである。
【図４】MEGA 8界面活性剤を含むセンサーとMEGA 8界面活性剤を含まないセンサーのバックグラウンド電流を比較した棒グラフである。
【図５】界面活性剤を有する又は有さない異なる配合物による試験センサーの充填時間の棒グラフである。
【図６】界面活性剤を含む配合物による時間に対して測定した電流値のプロットである。
【図７】５０mg/dLのグルコース、異なる硫酸塩濃度のメディエーター及び異なるリン酸緩衝液濃度を使用したピーク時間の棒グラフである。
【図８】１００mg/dLのグルコース、異なる硫酸塩濃度のメディエーター及び異なるリン酸緩衝液濃度を使用したピーク時間の棒グラフである。
【図９】４００mg/dLのグルコース、異なる硫酸塩濃度のメディエーター及び異なるリン酸緩衝液濃度を使用したピーク時間の棒グラフである。
【図１０ａ】異なる無機塩濃度を有する配合物による時間に対して測定した電流値のプロットである。
【図１０ｂ】異なる無機塩濃度を有する配合物による時間に対して測定した電流値のプロットである。
【図１１】低塩試薬溶液と高塩試薬配合物のＣＶ％のグラフである。
【００２０】
本発明は多様な変更及び代替的形態を受入可能であるが、特定の実施態様が例として図面に示されており、本明細書において詳細に記載される。しかし、本発明を開示されている特定の形態に限定することが意図されないことを理解するべきである。むしろ、本発明は、本発明の精神及び範囲内にある変更、等価物及び代替物を全て網羅するものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、分析対象物の測定のための試薬、方法及び装置を対象とする。より詳細には、本発明は、（１）フラビンタンパク質酵素、（２）フェノチアジン若しくはフェノキサジンメディエーター、（３）緩衝液、（４）界面活性剤若しくは界面活性剤の混合物、及び／又は（５）セルロース系ポリマーを含む、分析対象物を検出する試験センサー試薬を対象とする。
【００２２】
本明細書に記載される試薬を使用して、流体試料中の分析対象物濃度を決定するのを助けることができる。本発明によりモノターされる分析対象物の性質は、分析対象物が、フラビンタンパク質酵素により触媒される化学反応を受ける限り、制限されない。収集され、分析されうる種類の分析対象物の幾つかの例には、グルコース、脂質プロフィール（例えば、コレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ及びＨＤＬ）、マイクロアルブミン、ヘモグロビン、Ａ１Ｃ、フルクトース、乳酸塩又はビリルビンが挙げられる。他の分析対象物の濃度を決定できることが考慮される。分析対象物は、例えば、全血試料、血清試料、血漿試料、ＩＳＦ（間質液）や尿のような他の体液及び非体液の中にあることができる。
【００２３】
本明細書に記載されている試験センサーは、電気化学試験センサーである。電気化学試験センサーにより使用される計測器は、検量情報を検出するための光学的側面及び電気化学的側面を有して、流体試料の分析対象物に関連する情報（例えば、分析対象物濃度）を決定することができる。電気化学試験センサーの一つの非限定例が図１ａに示されている。図１ａは、基部１１、毛管路、並びに複数の電極１６及び１８を含む試験センサー１０を表す。領域１２は、毛管路を画定する（例えば、基部１１を覆って蓋を被せた後）区域を示す。複数の電極には、対電極１６及び作用電極１８が含まれる。電気化学試験センサーは、作用電極、対電極、トリガー電極又は流体試料において干渉物質（例えば、ヘマトクリット、アスコルビン酸塩、尿酸）を検出する別の電極のような、少なくとも３つの電極を含有することもできる。本発明の実施態様の電気化学試験センサーに用いられる作用電極は、炭素、白金、パラジウム、金、これらの組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されない適切な電極によって変わることができる。
【００２４】
電極１６、１８は、例示の実施態様において試験センサー接点１４ａ、ｂと示されている大型の区域で終止している複数の導電性リード線１５ａ、ｂに結合している。毛管路は一般に流体受容区域１９に配置されている。その操作を含む電気化学試験センサーの例は、例えば、Bayer Corporationに譲渡された米国特許第６，５３１，０４０号において見出すことができる。他の電気化学試験センサーを本発明の実施態様に用いてもよいことが考慮される。
【００２５】
流体受容区域１９は、流体試料（例えば、血液）中の目的の分析対象物（例えば、グルコース）を、電極パターンの構成要素により、生成される電流として電気化学的に測定可能な化学種に変換する、少なくとも１つの試薬を含む。試薬は、典型的には、分析対象物及び電子受容体と反応して、電極により検出されうる電気化学的に測定可能な種を生成する分析対象物特異的酵素を含む。試薬は、分析対象物と導体の間で電子を移動するのを助けるメディエーター若しくは他の物質、酵素とメディエーターを一緒に保持する結合剤、他の不活性成分又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００２６】
流体試料（例えば、血液）を流体受容区域１９に適用することができる。流体試料は少なくとも１つの試薬と反応する。試薬と共に複数の電極と反応した後、流体試料は、分析対象物濃度の決定を助ける電気信号を生成する。導電性リード線１５ａ、ｂは、試験センサー１０の第２反対端４２に向かって電気信号を運び、そこで試験センサー接点１４ａ、ｂは、電気信号を計測器に転送する。
【００２７】
図１ｂを参照すると、図１ａの試験センサー１０の側面図が示されている。図１ｂに示されているように、図１ｂの試験センサー１０は、更に、蓋２０及びスペーサー２２を含む。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２は、ポリマー材料のような多様な材料から作製することができる。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を形成するのに使用できるポリマー物質の非限定例には、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリイミド及びこれらの組み合わせが挙げられる。基部１１、蓋２０及び／又はスペーサー２２を形成するのに他の材料が使用できることが考慮される。
【００２８】
図１ａ、１ｂの試験センサー１０を形成するために、基部１１、スペーサー２２及び蓋２０を例えば接着剤又はヒートシールにより取り付ける。基部１１、蓋２０及びスペーサー２２を接着させると、流体受容区域１９が形成される。流体受容区域１９は、流体試料を試験センサー１０に導入する流路を提供する。流体受容区域１９は、試験センサー１０の第１末端又は試験端４０において形成される。本発明の実施態様の試験センサーを、スペーサーなしで基部及び蓋により形成することができ、流体受容区域は基部及び／又は蓋に直接形成される。
【００２９】
本発明におけるフラビンタンパク質は、フラビン補助因子を有する任意の酵素を含む。フラビンタンパク質の幾つかの非限定例には、ＦＡＤ−グルコースオキシダーゼ（酵素分類（Enzyme Classification）番号１．１．３．４）、フラビン−ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ番号１．１．３．５）及びＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．９９．１０）が挙げられる。本発明において使用される追加のオキシダーゼ酵素には、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ（例えば、メタノールオキシダーゼ）、ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、コリンオキシダーゼ及びこれらのＦＡＤ誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明に使用される望ましいフラビンタンパク質は、ＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ−ＧＤＨ）である。
【００３０】
本発明によるメディエーターには、下記式：
【００３１】
【化３】
【００３２】
を有するフェノチアジン及び下記式：
【００３３】
【化４】
【００３４】
を有するフェノキサジンが含まれ、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。これらの異性体が形成されうることも考慮される。
【００３５】
ＮＡＤＨメディエーターとして調製され、適切な特性を有することが見出されたフェノチアジンの一つの望ましい例は、下記式：
【００３６】
【化５】
【００３７】
を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンの水溶性ナトリウム又はアンモニウム塩である。３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンは、特に低いバックグラウンド電流を伴い、改善された信号対雑音比をもたらす。もう一つの望ましい例は、ＮＡＤＨメディエーターとして調製され、適切な特性を有することが見出された３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターである。これらのフェノチアジンのバックグラウンド電流は、以前に使用されたメディエーターよりも有意に少ないことが見出された。
【００３８】
ＮＡＤＨメディエーターとして適切な特性を有することが見出された他のフェノチアジン及びフェノキサジンは、３−（４’−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ニトロ−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−アセチル−３−（４’−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；７−トリフルオロメチル−３−（４’−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾリル）フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−エチルフェニル）アミノ−３−（４’−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；６−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕−エトキシフェニル）アミノ−３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンボロン酸；３−（３’，５’−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（４’−カルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン；３−（３’，５−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン；３−（２’，５’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸；及び３−（３’−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸である。
【００３９】
一つの実施態様において、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターは、フェノチアジン（１．５３mol、１．１当量、３０６ｇ）を撹拌しながら６．０Lのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、次に０℃に冷却することによって調製した。アニリン２，５−ジスルホン酸（１．３８mol、３５０ｇ）を７．０Lの水に溶解し、１Mの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（１２８ml）を、撹拌しながら加えた。アニリン２，５−ジスルホン酸溶液をフェノチアジン溶液に約２時間かけてゆっくりと加えて、白色で曇った懸濁液を得た。フェノチアジン／アニリン懸濁液は約０℃〜約４℃の温度であった。過硫酸ナトリウム（５．５２mol、４当量、１３１４ｇ）を４．０Lの水に溶解して、過硫酸ナトリウム溶液を形成した。
【００４０】
過硫酸ナトリウム溶液を約０℃〜約３℃の温度でフェノチアジン／アニリン懸濁液に３時間かけて滴加し、濃暗色の溶液をもたらした。濃暗色溶液を、氷浴を使用して冷却状態を保ち、一晩撹拌した。次に内容物をBuchiロータリーエバポレーターに移し、テトラヒドロフランを３５℃未満の温度で約２時間かけて除去した。蒸発行為の後、残留溶液を２５Lの分離器に移し、酢酸エチルで溶媒相洗浄した。残留溶液を、毎回２Lの酢酸エチルを使用して、３回溶媒相洗浄した反応流体を、アセトン／ＣＯ２浴中で撹拌しながら、−３℃に冷却した。沈殿固体を、同日に、２つの２４cmのブフナー漏斗の２枚のクロスを介して濾過した。沈殿固体を漏斗に一晩放置して乾燥し、次に２Lのアセトニトリルが入っているフラスコに移し、室温で約１時間撹拌した。次に、残留水を除去するため、試料を濾過し、更なるアセトニトリルで洗浄した。メディエーターを、真空炉により３５℃で乾燥して、恒量にした。
【００４１】
３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターを有する試薬を使用して達成される低いバックグラウンド電流のため、同じ試薬配合物を、電気化学試験センサーの作用電極と対電極の両方に適用することができる。同じ試薬を作用電極と対電極の両方に適用することは、製造過程を簡素化し、それによって関わる費用を減少する。加えて、低いバックグラウンド電流は、特に低グルコース濃度を有する試料から正確なグルコース読み取り値を得ることを助け、このことは特に新生児血中グルコースアッセイを行うに当って重要である。
【００４２】
本発明の実施態様の試薬は、更に、界面活性剤若しくは界面活性剤の組み合わせ及び／又はセルロース系ポリマーを含む。界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせは、センサー血液充填速度及び乾燥試薬の再水和を促進する。より素速い血液充填速度及び試薬再水和速度は、約２０％〜約７０％のヘマトクリット範囲にわたる、より迅速なアッセイ（例えば、５秒未満のアッセイ）を達成するために望ましい。
【００４３】
界面活性剤は、望ましくは、糖類系界面活性剤又はホスホリルコリン系界面活性剤を含む生体適合性のものから選択される。糖類系界面活性剤の一つの非限定例は、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Sigma-Aldrich of St. Louis, MOのMEGA 8）である。MEGA 8のような界面活性剤は、試験センサーの熱安定性の増大を助ける。加えて、MEGA 8のような界面活性剤は、高ヘマトクリットレベルを有する血液試料においてさえも素速い充填速度を助ける。MEGA 8のような界面活性剤を、試薬配合物において他の不活性成分（例えば、ヒドロキシエチルセルロースポリマー及び／又は中性ｐＨ緩衝液）と共に使用することは、高温であっても大きな安定性を有するセンサーをもたらす。ホスホリルコリン系界面活性剤の非限定例には、Lipidureシリーズ（NOF Corporation, Japan）が挙げられる。
【００４４】
界面活性剤を、エトキシル化オレイルアルコール（Cranbury, NJのRhodia Inc.からのRhodasurf ON870）のような従来の中性界面活性剤から選択することもできる。界面活性剤を、ナトリウムメチルココイルタウレート（Rhodia Inc.のGeropon TC-42）及びアルキルフェノールエトキシレートホスフェート（Chicago, ILのAkzo-Nobel Surface Chemistry LLCからのPhospholan CS131）のようなアニオン性界面活性剤から選択することもできる。他の界面活性剤を試薬の形成に使用できることが考慮される。
【００４５】
代替的に又は追加的に、本発明の実施態様の試薬はポリマーを含む。試薬は、ヒドロキシエチルセルロースポリマーのようなセルロース系ポリマーを含むことができる。幾つかの実施態様において、セルロース系ポリマーは、低から中分子量のセルロース系ポリマーである。セルロース系ポリマーのようなポリマーは、試薬が、乾燥したときにセンサー基体において元の位置に留まるように、試薬に向上した安定性及び適切な粘度を与えることを助ける。例えばポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）のような他のポリマーを使用できることが考慮される。
【００４６】
試薬は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）及び／又は他の不活性成分を含むこともできる。適切な緩衝溶液の非限定例には、グッド緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ（すなわち、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（すなわち、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（すなわち、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸））、マッキルベン緩衝液、これらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
望ましいアッセイ精密度、熱安定性及び最大動的性能を提供するために、無機塩とメディエーターの比率は、約３：１未満であるべきである。無機塩の供給源は、緩衝剤及び／又はメディエーターでありうる。無機塩とメディエーターの比率が約２：１未満、さらには約１．５：１未満であることが更に望ましい。
【００４８】
本発明の一つの実施態様によると、試薬は、ＦＡＤ−ＧＤＨ、低バックグラウンドフェノチアジンメディエーター、界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせ、セルロース系ポリマー、並びにセンサー性能及び安定性の改善を達成する緩衝液を含む。試薬を使用して、血液、血漿、血清又は尿のような生物学的分析対象物中のグルコース濃度を決定することができる。一つの実施態様において、フェノチアジンメディエーターは、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである。別の実施態様において、界面活性剤はMEGA 8であり、ポリマーはヒドロキシエチルセルロースである。一つの実施態様において、試薬は、約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの範囲の活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約５mM〜約１２０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．０５重量％〜約０．５重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．１重量％〜約４重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約４〜約８のｐＨを有する約２５mM〜約２００mMの緩衝液を含む。別の実施態様において、試薬は、約０．５単位／μL〜約２．５単位／μLの範囲の活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約３０mM〜約６０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．１重量％〜約０．４重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．０１〜約０．１％のGeropon TC-42、約０．２重量％〜約０．５重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約６〜約７のｐＨを有する約５０mM〜約１５０mMの緩衝液を含む。
【実施例】
【００４９】
実施例１
図２に示されているように、４つのロットのセンサーの化学反応性は、約１．７５単位／μLの活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ酵素、約４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．２５重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約６．５のｐＨを有する約１００mMのリン酸緩衝液を含むセンサーのグルコース用量依存性曲線を生成することによって分析した。センサーを約４０％のヘマトクリットレベルの全血試料で試験した。血液試料の血中グルコース濃度は、約０mg/dL、３８mg/dL、６７mg/dL、１１２mg/dL、２２２mg/dL、３３９mg/dL及び６２２mg/dLであった。それぞれの血液試料では、それぞれのセンサーロットについて１０個の複製を収集した。図２に示されているように、それぞれの試料の平均電流を、それぞれのセンサーロットでYellow Springs Glucose Analyzer（YSI, Inc., Yellow Springs, Ohio）により測定した試料グルコース濃度（mg/dL）に対してプロットした。用量反応線の勾配は約２０nA/mg/dLであり、試験センサーの比較的高い感受性を示した。ｙ切片は、０nAに比較的近く、低いバックグラウンド雑音レベルを示した。これらの結果は、本明細書に記載されている試薬を含む試験センサーを使用して、正確な読み取りが達成できることを示す。
【００５０】
変動係数を、図２のグラフの作成に使用したセンサーロットの１０個の複製のそれぞれについて決定した。下記の表１は、４つのセンサーロットの平均変動係数率（ＣＶ％）を示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
本発明の実施態様の試薬を含むセンサーの低いバックグラウンド雑音のため、平均アッセイＣＶ％は、低グルコース濃度を有する試料であっても３．５％未満であった。このようにＣＶ％値は十分に５％未満であり、このことは、多くの場合に標準許容限界として考慮される。この低ＣＶ％は、試験センサーの高い精密度を示す。加えて、低ＣＶ％は試験センサー間の低い変動に関係しており、一定の試験結果を得るために望ましい。
【００５３】
実施例２
図３は、６０％ヘマトクリット全血を使用したセンサー充填速度に対するMEGA 8界面活性剤の効果を例示するグラフを示す。図３に使用されている試験センサーは、約１単位／μL（約１９２単位／mg）の活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約４重量％（約１２０mM）のフェリシアン化カリウムメディエーター、試薬の約１．６重量％である４重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約５．０のｐＨの約３５mMのクエン酸緩衝液を含んだ。フェリシアン化カリウムメディエーターを使用して、MEGA 8界面活性剤が、３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターなしで、試験センサーに対して望ましい影響を与えるかについて試験した。約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤を含む３０個の試験センサー群の充填速度を、MEGA 8界面活性剤を含まない３０個の試験センサー対照群と比較した。２つの群からのそれぞれ１０個のセンサーの初期充填速度を測定した。次に、各群からの１０個のセンサーを約−２０℃の温度に約２週間暴露した。最後に各群からの１０個のセンサーを約５０℃の温度に約２週間暴露した。試験センサーの各群及び下位集団の平均充填時間を計算し、図３に示す。血液は、界面活性剤を有する試薬及び６０％ヘマトクリット全血試料により、試験センサーの反応室を０．３秒未満で充填する。図３に示されているように、MEGA 8界面活性剤を含むセンサーの充填速度は、MEGA 8界面活性剤を含まないセンサーの少なくとも２倍速く、最大約４倍速かった。
【００５４】
実施例３
MEGA 8界面活性剤を含む熱ストレスセンサーのバックグラウンド電流を、MEGA 8界面活性剤を含まない熱ストレスセンサーのバックグラウンド電流と比較した。図４に使用されている試験センサーは、約１単位／μLの活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約５０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、試薬の約０．７５重量％のヒドロキシエチルセルロース及び約７のｐＨの約５０mMの緩衝液を含んだ。第１群の４０個の試験センサーは、MEGA 8界面活性剤を含まなかった。第２群の４０個の試験センサーは、約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤を含んだ。第１及び第２群は、それぞれ２つの下位集団：Amano Enzyme Inc.（Nagoya, Japan）からのＦＡＤ−ＧＤＨを有する２０個の試験センサーを含む第１下位集団及びToyobo Co.（Osaka, Japan）からのＦＡＤ−ＧＤＨを有する２０個の試験センサーを含む第２下位集団を含んだ。それぞれの下位集団からの１０個の試験センサーを約５０℃で約２週間保存した。残りの試験センサーを約−２０℃で約２週間保存した。次にセンサーのバックグラウンド電流を、約０mg/dLのグルコース濃度を有する４０％ヘマトクリット全血試料を使用して試験した。試料１つあたり１０個の複製を収集した。図４は、１０個の複製からの平均センサーバックグラウンド電流を例示するグラフを示す。図４に示されているように、MEGA 8界面活性剤を含む試験センサーは、MEGA 8界面活性剤を含まない試験センサーと比較して、有意に低いセンサーバックグラウンド電流変化を有し、試薬は、MEGA 8界面活性剤が試薬に添加されたときにより安定することを示した。
【００５５】
実施例４
本発明の実施態様の試験センサーの熱安定性も試験した。この実施例に使用されている試験センサーは、約２単位／μLの活性を有するＦＡＤ−ＧＤＨ、約４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、約０．２重量％のMEGA 8界面活性剤、約０．２５重量％のヒドロキシエチルセルロースの試薬及び約６．５のｐＨの約１００mMの緩衝液を含んだ。第１群の試験センサーを約５０℃で約２週間保存した。第２群の試験センサーを約−２０℃で約２週間保存した。次に、それぞれの群のセンサーの性能を、約５０mg/dL、約１００mg/dL及び約４００mg/dLのグルコース濃度を有する４０％ヘマトクリット全血試料を使用して評価した。試料１つあたり１０個の複製を収集した。５０℃で保存した試験センサーと−２０℃で保存したものとのグルコース濃度の平均差を計算し、幾つかの異なる種類の自己試験血中グルコースモニタリング系と比較した。本発明の実施態様の試験センサーのグルコースアッセイの偏りは、無視できるものであった。このように、センサーを比較的厳しい温度で２週間保存した後でも、グルコースアッセイの結果に明白な変化はなかった。対照的に、比較としての市販試験センサーのグルコースアッセイの偏りは、一般に約５％〜約１２％であった。このように、本発明の実施態様の試験センサーの熱安定性は、現存の試験センサーよりも著しく良好であった。
【００５６】
実施例５
試験センサーを使用して試験を実施し、高ヘマトクリット血液試料による充填速度を決定した。具体的には、図５に示されているように、界面活性剤を使用しない配合物（配合１）及び界面活性剤を使用する配合物（配合２〜７）を試験した。配合物を下記の表２に提示する。
【００５７】
【表２】
メディエーター＝３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン
緩衝液＝配合６がＴＥＳを使用した以外はリン酸
ＴＥＳ＝（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）
ＨＥＣ＝ヒドロキシエチルセルロース
【００５８】
具体的には、配合２及び３は、界面活性剤MEGA 8を含み、一方、配合４及び５は界面活性剤Rhodasurfを含んだ。配合６は、界面活性剤Zwittergentを含み、配合７は界面活性剤MEGA 8及びPhospholan CS131を含んだ。配合１〜７には、２つの異なる条件によりストレスをかけた。具体的には、配合１〜７には、−２０℃の温度で２週間ストレスをかけ、その上、５０℃で２週間ストレスをかけた。
【００５９】
これらの条件によりストレスをかけた後、配合１〜７を試験センサーの電極上に設置した。センサーを垂直（９０°）の位置で６０〜７０％ヘマトクリットの全血により試験した。センサーを充填の際にビデオ撮影し、時間を測定した。配合１〜７について高ヘマトクリット血液がセンサー反応室全体を充填するのに必要な時間を図５に示す。配合１（界面活性剤を有さない）のセンサー充填時間は、−２０℃及び５０℃／２週間で保存したセンサーでは、それぞれ約０．６及び０．７秒であった。一方、配合２〜７は、−２０℃及び５０℃／２週間の両方において、約０．５秒以下のセンサー充填時間を有した。配合２〜７の大部分では、−２０℃及び５０℃／２週間の両方において、約０．４秒以下のセンサー充填時間を有し、幾つかは約０．３秒未満であった。このように、界面活性剤を有する配合２〜７は、界面活性剤を有さない配合１よりもはるかに改善された充填時間を有した。
【００６０】
実施例６
試薬を試験して、最大動的性能を決定した。試薬は、４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、５０mMのリン酸緩衝液、２．００U/ulのＦＡＤ−ＧＤＨ、０．２５重量％のヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）及び０．２０重量％の界面活性剤MEGA 8を含んだ。
【００６１】
図６は、グルコース濃度４００mg/dL及び７０％ヘマトクリットの血液試料を有する試験センサーからの出力信号を示す。測定装置によるセンサーストリップへの信号入力は、米国特許出願第２００８／０１７３５５２号に記載されているように、７個の緩和により離されている８個のパルス励起を含むゲート電流測定パルス系列であった。励起は持続時間が１秒未満であった。３つの出力電流値をそれぞれの励起の際に記録した。
【００６２】
入力信号からの出力電流値が試料の分析対象物濃度と相関するためには、励起の初期電流値は、好ましくは続く減衰のものよりも大きい。図６のセンサーストリップの出力信号は、血液試料がストリップに導入された約２秒後において減衰する初期高電流値を示した。これによって、電流値の減衰を伴う高い初期電流値を有する第１出力電流が、出力電流１１０で観察された。
【００６３】
入力信号からの出力電流値が試料の分析対象物濃度と相関するためには、また、異なる試料分析対象物濃度は、好ましくは出力電流値の間に実質的に一定の差を示す。好ましくは、出力電流値又は試料の分析対象物濃度と相関する出力電流値も、センサーストリップの最大動的性能を反映する減衰する電流データから取られる。出力電流の基礎にあるレドックス反応速度は、多数の要因により影響を受ける。これらの要因には、試薬組成物が再水和する速度、酵素系が分析対象物と反応する速度、酵素系が電子をメディエーターに移動する速度及びメディエーターが電子を電極に移動する速度が含まれうる。出力電流に影響を与えるこれら及び他の動的要因のうち、試薬組成物が再水和する速度は、出力電流値に最大の影響を与えると考えられる。
【００６４】
センサーストリップの最大動的性能は、減衰電流値を有する励起の初期電流値が多数の励起の中で最大であるとき、ゲート電流測定パルス系列の励起の際に達成することができる。これを、センサーピーク時間と呼ぶこともできる。好ましくは、センサーストリップの最大動的性能は、減衰電流値を有する励起により得られる終期電流値が、多数の励起により得られる終期電流値のうちで最大であるときに達成される。より詳細には、センサーストリップの最大動的性能は、減衰電流値を有する励起の初期電流値が多数の励起のうちで最大であるとき、そして同じ励起により得られる終期電流値が多数の励起により得られる終期電流値のうちで最大であるときに達成される。
【００６５】
センサーストリップの最大動的性能は、望ましくは約３秒未満、より望ましくは約２秒未満である。
【００６６】
試験センサーの最大動的性能を決定するのに使用されるゲート電流測定パルス系列は、励起が約０．４秒の持続時間であり、緩和が１秒の持続時間であり、試料を通過するゼロ電流の流れを含み、開放回路により提供される、少なくとも７つの動作周期を含んだ。少なくとも３つの出力電流値を、それぞれの励起の際に測定する。センサーストリップへの潜在的な入力は、２５０mVで実質的に一定に保持し、試料温度は２３℃である。動作周期の前に、４００mVのパルスを０．９秒間適用した。
【００６７】
図６の４００mg/dLのグルコースを有するセンサーストリップは、センサーストリップへの試料の導入の３〜４秒間の出力電流１２０及び１２５を含む励起減退の際に最大動的性能に達した。このことは、減衰電流値を有する励起から得られた最大初期及び最大終期電流値の両方が、出力電流１２０及び１２５を含む周期に存在するときに確立した。初期出力電流１２０を出力電流１１０、１３０、１４０、１５０及び１７０と比較すること、また、終期電流１２５を出力電流１１５、１３５、１４５、１５５、１６５及び１７５と比較すること。このように、センサーは、７０％ヘマトクリット血液試料であっても、３〜４秒の間に最大動的性能に達する。
【００６８】
実施例７
図７〜９は、試薬配合物が異なるヘマトクリットレベルの血液における最大動的性能にも影響を与えうることを示す。最初に図７を参照すると、５０mg/dLのグルコース濃度では、センサーピーク時間を使用した最大動的性能は、ヘマトクリットレベルが増加すると増大した。少ない硫酸塩率（５％の硫酸塩）を含むメディエーターは、一般に同等のヘマトクリットレベル及び緩衝液濃度においてはるかに速いピーク時間を有した。例えば、５０mMのリン酸緩衝液を使用したヘマトクリットレベル６０％を参照すること（５％の硫酸塩を使用したメディエーターの３．５秒と、２０％の硫酸塩を使用したメディエーターの７．５秒とを比較すること）。緩衝液強度及びメディエーターの残留硫酸塩含有量のような試薬配合は、一般にセンサーの反応ピーク時間に対して、特に高ヘマトクリット（＞４０％）の試料において大きな影響を与える。したがって、センサー配合における高無機塩（硫酸塩濃度に関しては緩衝液又はメディエーターからの）は、センサーピーク時間を増加する（すなわち、センサーの反応を遅くする）。図８は、１００mg/dLのグルコース濃度を使用した同様の結果を示す。４００mg/dLという高グルコース濃度を使用した場合、図９は、一般に約３又は３．５秒未満のセンサーピーク時間を費やす最大動的性能を示すが、多くのセンサーピーク時間は２秒である。５％硫酸塩及び１００mMのリン酸緩衝液は、高ヘマトクリットレベルにおいて、センサーピーク時間の約４．５又は５秒を費やす最大動的性能を有した。
【００６９】
このように、５０mg/dL及び１００mg/dLグルコース濃度で示されているように、高ヘマトクリットの試料において素速い試薬再水和及びグルコース反応を達成するためには、試料配合物の塩含有量は低い必要がある。
【００７０】
実施例８
試験センサーをストレス条件下（−２０℃及び５０℃／４週間）で保存した後、２つの配合物を最大動的性能について試験した。図１０ａの配合物は、５０mMのリン酸緩衝液及び５重量％の硫酸塩を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含んだ。図１０ｂの配合物は、１００mMのリン酸緩衝液及び２０重量％の硫酸塩を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含んだ。この実施例に使用したゲート電流測定パルス系列は、上記の実施例６に記載されたものと同様であった。
【００７１】
図１０ａに示されているように、最大動的性能は、−２０℃で４週間ストレスを受けた試料では約２秒であった。最大動的性能は、−５０℃で４週間ストレスを受けた試料では約３．５秒であった。図１０ｂを参照すると、最大動的性能は、−２０℃で４週間ストレスを受けた試料では約３．５秒であり、−５０℃で４週間ストレスを受けた試料では約５秒であった。このように、低無機塩量（例えば、図１０ａ）を有する配合物は、高無機塩量（例えば、図１０ｂ）を有する配合物と比較して、改善された最大動的性能を有した。
【００７２】
加えて、図１０ａにおいて使用したセンサーピーク時間が２秒の配合物ロットを、アッセイ偏り又は偏り％について試験した。１００mg/dL以下のグルコース濃度の偏り％は、約＋／−２％未満であった。４００mg/dLのグルコース濃度の偏り％は、約＋／−４％であった。３〜４秒のピーク時間を有する図１０ｂにおいて使用した配合物ロットのアッセイ偏りも試験した。１００mg/dL以下のグルコース濃度の偏り％は、約＋／−３％未満であった。４００mg/dLのグルコース濃度の偏り％は、約＋／−１０％であった。このように、３〜４秒のセンサーピーク時間を有するロットのアッセイ偏りは、２秒のセンサーピーク時間を有するロットよりも大きかった。
【００７３】
実施例９
図１１を参照すると、異なるグルコース濃度の４０％ヘマトクリット全血試料を使用した変動係数％（ＣＶ％）を示す。グルコース濃度は、３６mg/dL〜６２７mg/dLの範囲である。低塩含有量ロットを有する試薬溶液を、高塩含有量ロットを有する試薬溶液と比較した。低塩ロットは、ｐＨ６．５の５０mMのリン酸緩衝液、２U/ulのＦＡＤ−ＧＤＨ、５重量％の硫酸塩を有する４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、０．２５％のヒドロキシエチルセルロース−３００ｋ及び０．２％のMEGA8界面活性剤を含んだ。高塩ロットは、ｐＨ６．５の１００mMのリン酸緩衝液、２U/ulのＦＡＤ−ＧＤＨ、２０重量％の硫酸塩を有する４０mMの３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、０．２５％のヒドロキシエチルセルロース−３００ｋ及び０．２％のMEGA8界面活性剤を含んだ。
【００７４】
ＣＶ％は、センサーピーク時間を使用して最大動的性能の平均を取り、これらのセンサーピーク時間の標準偏差で割ることによって計算した。この得られた値に１００を掛けて、ＣＶ％をもたらした。合計４０個の試料を低塩試薬溶液及び高塩試薬溶液の両方について試験した。
【００７５】
低塩試薬溶液は、３秒未満のセンサーピーク時間を費して最大動的性能に達成し、高塩試薬溶液と比較して、４０％ヘマトクリット全血試料においてより良好なＣＶ％をもたらした。低塩試薬溶液は、低グルコース濃度の試料においてはるかに良好なＣＶ％を有した。
【００７６】
本明細書に提示された実施例は本発明による試験センサー試薬のインビトロ（生体外）の適用に関するが、これらの試薬を、メディエーターを化学的に固定化し（例えば、芳香族環の１つ以上の置換基における化学反応により）、固定化したメディエーターを、患者に皮下移植できる装置に組み込むことによって、分析対象物をインビボ（生体内）モニタリングすることに適合することもできる。本明細書に記載された実施態様の試薬を、連続分析対象物モニタリング系と共に使用することもできる。
【００７７】
代替実施態様Ａ
試薬が、
フラビンタンパク質酵素と；
下記：
【００７８】
【化６】
【００７９】
で示される群又はその組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）と；
少なくとも１つの界面活性剤と；
ポリマーと；
緩衝液と
を含む、分析対象物を検出するための試薬。
【００８０】
代替実施態様Ｂ
フラビンタンパク質酵素がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼである、代替実施態様Ａの試薬。
【００８１】
代替実施態様Ｃ
メディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、代替実施態様Ａの試薬。
【００８２】
代替実施態様Ｄ
界面活性剤が、糖類系界面活性剤又はホスホリルコリン系界面活性剤を含む、代替実施態様Ａの試薬。
【００８３】
代替実施態様Ｅ
ポリマーがセルロース系ポリマーである、代替実施態様Ａの試薬。
【００８４】
代替実施態様Ｆ
緩衝液がリン酸緩衝液を含む、代替実施態様Ａの試薬。
【００８５】
代替実施態様Ｇ
流体試料中で分析対象物を検出するための試薬であって、
前記試薬が、
約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼと；
約５mM〜約１２０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターと；
試薬の約０．０５重量％〜約０．５重量％の濃度を有するヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤と；
試薬の約０．１重量％〜約４重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーと
を含む。
【００８６】
代替実施態様Ｈ
リン酸緩衝液を更に含む、代替実施態様Ｇの試薬。
【００８７】
代替実施態様Ｉ
リン酸緩衝液が、約２５mM〜約２００mMの濃度及び約４〜約８のｐＨを有する、代替実施態様Ｈの試薬。
【００８８】
代替実施態様Ｊ
リン酸緩衝液が、約５０mM〜約１５０mMの濃度及び約６〜約７のｐＨを有する、代替実施態様Ｉの試薬。
【００８９】
代替実施態様Ｋ
試薬が、約０．５単位／μL〜約２．５単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ、約３０mM〜約６０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、試薬の約０．１重量％〜約０．４重量％の濃度を有するヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤及び試薬の約０．２重量％〜約０．５重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーを含む、代替実施態様Ｇの試薬。
【００９０】
代替実施態様Ｌ
表面を有する作用電極；
表面を有する対電極；及び
作用電極の表面の少なくとも一部及び対電極の表面の少なくとも一部を被覆する試薬であって、前記試薬がフラビンタンパク質、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーター、緩衝液、並びに少なくとも１つの界面活性剤及びポリマーを含む試薬
を含む、電気化学試験センサー。
【００９１】
代替実施態様Ｍ
フラビンタンパク質酵素がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼを含む、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９２】
代替実施態様Ｎ
フェノチアジンメディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９３】
代替実施態様Ｏ
少なくとも１つの界面活性剤がヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミドを含む、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９４】
代替実施態様Ｐ
ポリマーがセルロース系ポリマーである、代替実施態様Ｌのセンサー。
【００９５】
代替的方法Ｑ
流体試料中で分析対象物を検出する方法であって、前記分析対象物が化学反応を受け、
前記方法が電極の表面を準備する行為；
少なくとも１つの界面活性剤を使用して、電極表面への流体試料の流れを促進する行為；
フラビンタンパク質酵素により化学反応を触媒する行為；
化学反応によりレドックス等価物を生成する行為；及び
フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーターを使用して、レドックス等価物を電極に移動する行為
を含む方法。
【００９６】
代替的方法Ｒ
電極表面が作用電極及び対電極を含み、電極表面が、少なくとも１つの界面活性剤、フラビンタンパク質酵素、フェノチアジンメディエーター及び緩衝液を含む試薬を含む、代替的方法Ｑの方法。
【００９７】
代替的方法Ｓ
試薬が更にセルロース系ポリマーを含む、代替的方法Ｒの方法。
【００９８】
代替的方法Ｔ
ポリマーがセルロース系ポリマーである、代替的方法Ｓの方法。
【００９９】
代替的方法Ｕ
緩衝液がリン酸緩衝液を含む、代替的方法Ｒの方法。
【０１００】
本発明は多様な変更及び代替的形態を受入可能であるが、特定の実施態様及び方法が例として図面に示されており、本明細書において詳細に記載されている。しかし、本発明を開示されている特定の形態又は方法に限定することは意図されず、それと逆に、意図されることは、本発明の精神及び範囲内の変更、均等物及び代替案を全て網羅することであることを理解するべきである。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物を検出するための試薬であって、
前記試薬が、
フラビンタンパク質酵素と；
下記：
【化７】
で示される群又はその組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）と；
少なくとも１つの界面活性剤と；
ポリマーと；
緩衝液と
を含み、
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約３：１未満である
分析対象物を検出するための試薬。
【請求項２】
前記フラビンタンパク質酵素がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
前記メディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、請求項１記載の試薬。
【請求項４】
前記界面活性剤が、糖類系界面活性剤又はホスホリルコリン系界面活性剤を含む、請求項１記載の試薬。
【請求項５】
前記ポリマーがセルロース系ポリマーである、請求項１記載の試薬。
【請求項６】
前記緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項１記載の試薬。
【請求項７】
前記総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満の比率である、請求項１記載の試薬。
【請求項８】
流体試料中で分析対象物を検出するための試薬であって、
前記試薬が、
約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼと；
約５mM〜約１２０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターと；
前記試薬の約０．０５重量％〜約０．５重量％の濃度を有する界面活性剤と；
前記試薬の約０．１重量％〜約４重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーと；
緩衝液と
を含み、
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが前記無機塩を含み、総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満である試薬。
【請求項９】
更に、リン酸緩衝液を含む、請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
前記界面活性剤がヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤である、請求項８記載の試薬。
【請求項１１】
前記試薬が、約０．５単位／μL〜約２．５単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ、約３０mM〜約６０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、前記試薬の約０．１重量％〜約０．４重量％の濃度を有するヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤及び前記試薬の約０．２重量％〜約０．５重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーを含む、請求項８記載の試薬、
【請求項１２】
電気化学試験センサーであって、
表面を有する作用電極と；
表面を有する対電極と；
作用電極の表面の少なくとも一部及び対電極の表面の少なくとも一部を被覆する試薬であって、前記試薬がフラビンタンパク質、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーター、緩衝液、並びに少なくとも１つの界面活性剤、ポリマーを含み、
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが前記無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約３：１未満である試薬とを含む、電気化学試験センサー。
【請求項１３】
前記フラビンタンパク質がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１４】
前記フェノチアジンメディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの界面活性剤がヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミドを含む、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１６】
前記総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満である、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１７】
流体試料中で分析対象物を検出する方法であって、前記分析対象物が化学反応を受け、前記方法が、
電極の表面を準備する行為；
少なくとも１つの界面活性剤を使用して、電極表面への流体試料の流れを促進する行為；
フラビンタンパク質酵素により化学反応を触媒する行為；
化学反応によりレドックス等価物を生成する行為；及び
フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーターを使用して、レドックス等価物を電極に移動する行為
を含み、
前記最大動的性能が約３秒未満である方法。
【請求項１８】
前記電極表面が作用電極及び対電極を含み、前記電極表面が、前記少なくとも１つの界面活性剤、前記フラビンタンパク質酵素、前記フェノチアジンメディエーター及び緩衝液を含む試薬を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬が更にポリマーを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記最大動的性能が約２秒未満である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
流体試料中の分析対象物を検出する方法であって、前記方法が、
電極の表面を準備する行為；
フラビンタンパク質酵素、下記：
【化８】
で示される群又はこれらの組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）、少なくとも１つの界面活性剤及び緩衝液含む試薬を準備する行為であって、前記試薬が電極表面と接触している行為；
前記流体試料を前記試薬と接触させる行為；並びに
前記分析対象物の濃度を決定する行為
を含み、かつて
前記最大動的性能が約３秒未満である
方法。
【請求項２３】
前記試薬が更にポリマーを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬がフェノチアジンメディエーターを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約３：１未満である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが前記無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記最大動的性能が約２秒未満である、請求項２２記載の方法。
【請求項１】
分析対象物を検出するための試薬であって、
前記試薬が、
フラビンタンパク質酵素と；
下記：
【化７】
で示される群又はその組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）と；
少なくとも１つの界面活性剤と；
ポリマーと；
緩衝液と
を含み、
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約３：１未満である
分析対象物を検出するための試薬。
【請求項２】
前記フラビンタンパク質酵素がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
前記メディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、請求項１記載の試薬。
【請求項４】
前記界面活性剤が、糖類系界面活性剤又はホスホリルコリン系界面活性剤を含む、請求項１記載の試薬。
【請求項５】
前記ポリマーがセルロース系ポリマーである、請求項１記載の試薬。
【請求項６】
前記緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項１記載の試薬。
【請求項７】
前記総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満の比率である、請求項１記載の試薬。
【請求項８】
流体試料中で分析対象物を検出するための試薬であって、
前記試薬が、
約０．１単位／μL〜約１０単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼと；
約５mM〜約１２０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーターと；
前記試薬の約０．０５重量％〜約０．５重量％の濃度を有する界面活性剤と；
前記試薬の約０．１重量％〜約４重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーと；
緩衝液と
を含み、
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが前記無機塩を含み、総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満である試薬。
【請求項９】
更に、リン酸緩衝液を含む、請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
前記界面活性剤がヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤である、請求項８記載の試薬。
【請求項１１】
前記試薬が、約０．５単位／μL〜約２．５単位／μLの活性を有するＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ、約３０mM〜約６０mMの濃度を有する３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンメディエーター、前記試薬の約０．１重量％〜約０．４重量％の濃度を有するヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤及び前記試薬の約０．２重量％〜約０．５重量％の濃度を有するヒドロキシエチルセルロースポリマーを含む、請求項８記載の試薬、
【請求項１２】
電気化学試験センサーであって、
表面を有する作用電極と；
表面を有する対電極と；
作用電極の表面の少なくとも一部及び対電極の表面の少なくとも一部を被覆する試薬であって、前記試薬がフラビンタンパク質、フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーター、緩衝液、並びに少なくとも１つの界面活性剤、ポリマーを含み、
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが前記無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約３：１未満である試薬とを含む、電気化学試験センサー。
【請求項１３】
前記フラビンタンパク質がＦＡＤ−グルコースデヒドロゲナーゼを含む、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１４】
前記フェノチアジンメディエーターが３−（２’，５’−ジスルホフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンを含む、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの界面活性剤がヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミドを含む、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１６】
前記総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満である、請求項１２記載のセンサー。
【請求項１７】
流体試料中で分析対象物を検出する方法であって、前記分析対象物が化学反応を受け、前記方法が、
電極の表面を準備する行為；
少なくとも１つの界面活性剤を使用して、電極表面への流体試料の流れを促進する行為；
フラビンタンパク質酵素により化学反応を触媒する行為；
化学反応によりレドックス等価物を生成する行為；及び
フェノチアジン又はフェノキサジンメディエーターを使用して、レドックス等価物を電極に移動する行為
を含み、
前記最大動的性能が約３秒未満である方法。
【請求項１８】
前記電極表面が作用電極及び対電極を含み、前記電極表面が、前記少なくとも１つの界面活性剤、前記フラビンタンパク質酵素、前記フェノチアジンメディエーター及び緩衝液を含む試薬を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬が更にポリマーを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記最大動的性能が約２秒未満である、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
流体試料中の分析対象物を検出する方法であって、前記方法が、
電極の表面を準備する行為；
フラビンタンパク質酵素、下記：
【化８】
で示される群又はこれらの組み合わせから選択されるメディエーター（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９は、同一であっても異なっていてもよく、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、環式、複素環式、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族ケト、脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される）、少なくとも１つの界面活性剤及び緩衝液含む試薬を準備する行為であって、前記試薬が電極表面と接触している行為；
前記流体試料を前記試薬と接触させる行為；並びに
前記分析対象物の濃度を決定する行為
を含み、かつて
前記最大動的性能が約３秒未満である
方法。
【請求項２３】
前記試薬が更にポリマーを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬がフェノチアジンメディエーターを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約３：１未満である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記界面活性剤及び前記緩衝液の少なくとも１つが前記無機塩を含み、前記総無機塩とメディエーターの比が約２：１未満である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記最大動的性能が約２秒未満である、請求項２２記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０５８３４（Ｐ２０１１−５０５８３４Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８１２３（Ｐ２０１０−５３８１２３）
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６２１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６４３３
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７０２１７５７）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (33)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６２１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６４３３
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０７０２１７５７）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (33)
【氏名又は名称原語表記】Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]