制御性Ｔ細胞のＩＮＶＩＶＯにおける増殖
ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５、ＤＲ３）に特異的な組成物は、制御性Ｔ細胞を制御することによって免疫応答を調節する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府からの資金援助による研究についての記述
本発明は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により授与された助成金番号５ＰＯ１ＣＡｌ０９０９４−０３、および国立アレルギー・感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）により授与された助成金番号５ＲＯ１ＡＩ０６１８０７−０５の下で、米国政府の資金援助によって為された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、２００９年８月３日に提出された米国仮出願第６１／２７３，２９９号に基づく優先権を主張する。
【０００３】
本発明の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞を制御する組成物および方法に関する。特に、該組成物および方法によってヒトＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞が制御される。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）は、リンパ系および非リンパ系細胞の両方に差次的かつ時間的に発現する、少なくとも１９のリガンドおよび３０の受容体（ＴＮＦＲＳＦ）からなる。ＣＤ３＋Ｔ細胞において、ＴＮＦＳＦシグナルは、極性化、増殖、エフェクター機能、減少、メモリー、および細胞死を含む免疫応答の様々な段階を支持するために、抗原に特異的および非特異的な両方の方法で機能する。ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）はＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３、以下ＴＮＦＲ２５と称する）のリガンドであり、これはデスドメインを含むＴＮＦＲ２５の細胞質側末端を通してＴＲＡＤＤまたはＦＡＤＤのシグナル伝達カスケードを開始することにより、ＴＮＦＲ２５を発現するＴおよびＮＫＴ細胞を正または負に調節することができる。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、および関節リウマチ（ＲＡ）を含む様々な自己炎症性状態において観察される病態に重要な役割を果たす。抗体によるＴＬ１Ａの遮断によってマウスの急性喘息を阻止することができ、またＴＮＦＲ２５の遺伝子ノックアウトによってＥＡＥまたはＲＡの実験モデルにおける病的現象は著しく減少する。ＴＬ１Ａは、ＮＫＴ、Ｔｈ２、およびＴｈ１７細胞の極性化、分化、およびエフェクター機能を増大させることによって、これらの疾病を進行させる。
【発明の概要】
【０００５】
本概要により、本発明の性質および内容を簡単に示す、本発明の概要を提示する。これは請求項の範囲または意味を限定するために用いられるものではないことの理解と共に提示される。
【０００６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞上に恒常的に発現するＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５、ＤＲ３）を通したシグナル伝達により、ＴＨ２およびＴＨ１７サイトカインの産生は増大し、喘息、炎症性腸疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎、および関節リウマチの疾患モデルに病的炎症を起こす。
【０００７】
好ましい実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤によって免疫細胞応答が調節される。これらの薬剤により、疾病およびその状態に対する新規な治療法が提供される。例えば、ＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニストは投与後４日以内にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の迅速かつ広範なｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を導き、これは全てのＣＤ４＋細胞の３０〜３５％となった。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増加は、高レベルのＧＩＴＲおよびＣＤ１０３を発現するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞の増殖によるものであった。ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストによって増殖したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＧＦ−βに依存する抑制活性を保持していたが、これは持続するＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達によって無効になった。ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達は、エフェクター細胞の応答の調節に加えて、制御性Ｔ細胞の増殖および活性のコントロールを通し、炎症性応答の誘導および回復の両方に重要な役割を果たしている。
【０００８】
本発明のその他の態様については以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＴＮＦＲ２５がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの迅速な増殖を刺激することを示した図である。図１Ａ：従来型および制御性Ｔ細胞におけるＴＮＦＲ２５、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢの差次的発現。未処理のＦＩＲマウスの脾細胞から得た、高度に精製したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｔｃｏｎｖ）およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲＳＦの発現をフローサイトメトリーにより決定した。図１Ｂ：４Ｃ１２注射後の、末梢血中のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の動態および用量依存性の増殖。ＦｏｘＰ３−ＲＦＰレポーター（ＦＩＲ）マウスに、表示する量の精製した４Ｃ１２を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスからは毎日採血を行い、末梢血液細胞中のＦｏｘＰ３−ＲＦＰの発現をフローサイトメトリーにより分析した。図１Ｃ：その他のＴＮＦＲアゴニスト抗体による処理後に、Ｔｒｅｇの増殖を比較した。０日目に、表示する抗体（１００μｇ）をマウスへｉ．ｐ．注射した。図１Ｂのようにマウスからは６日間毎日採血を行い、４日目の末梢血中の全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＴｒｅｇのパーセンテージを示す。これらのデータは、独立した８回の実験において再現された。エラーバーは平均±ＳＥＭを示す。有意性はスチューデントｔ検定（図１Ｂ）、またはチューキー事後検定付きの一元配置ＡＮＯＶＡ（図１Ｃ）により決定した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＴＣＲおよびＩＬ−２のシグナル伝達が必要であることを示した図である。ＦＩＲマウスからのＣＤ４＋細胞をＦＡＣＳソーティングによって高度に精製し、ＭＨＣＩＩ−／−またはＣＤ４−／−マウスへ養子移入した。養子移入後、レシピエントマウスを４Ｃ１２またはアイソタイプのコントロール抗体によって処置し、抗体処置後４日目にＦｏｘＰ３−ＲＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（図２Ａ）および絶対数（図２Ｂ）を分析した。ＦＩＲマウスを、方法に記載するように、シクロスポリンＡ（図２Ｃ）もしくはＦＫ５０６（図２Ｄ）またはビヒクルコントロールのｉ．ｐ．注射によって１〜４日処置した。マウスを４Ｃ１２抗体またはＩｇＧコントロール抗体で処置し、４日目に末梢血中の全ＣＤ４＋細胞に対するＦｏｘＰ３−ＲＦＰ陽性細胞の割合を分析した。４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置後４日目に、ＩＬ−２受容体ベータ欠損マウス（図２Ｅ）またはＣＤ８０／８６−／−マウス（図２Ｆ）の全ＣＤ４＋脾細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合を、Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウスに比較して分析した。これらのデータは、１実験あたりの１群あたり≧３のマウスを用いた、少なくとも２回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇではＩＬ−２に対する応答が亢進しており、Ａｋｔの活性化が必要とされることを示した図である。図３Ａ：コントロールＩｇＧまたは４Ｃ１２抗体による処置後４日目にＦＩＲマウスからＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を精製し、表示する量のＩＬ−２と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした。培養３日目に、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖をトリチウム標識チミジンの取り込みによって測定した。図３Ｂ：ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を（図３Ａ）のように精製し、ＩＬ−２Ｒγ（ＣＤ１３２）またはＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）の表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。図３Ｃ：ＩｇＧまたは４Ｃ１２抗体による処置後４日目のＦＩＲマウスから精製したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２によって処理し、１５分後にｐＳＴＡＴ５の発現を分析した。ＦＩＲマウスを、方法に記載するように、１日１回のラパマイシン（図３Ｄ）もしくは１日２回のＡｋｔ阻害剤Ｖ（図３Ｅ）またはビヒクルコントロールのｉ．ｐ．注射によって１〜４日処置した。マウスを０日目に４Ｃ１２またはコントロールＩｇＧ抗体で処置し、４日目に末梢血中の全ＣＤ４＋細胞に対するＦｏｘＰ３−ＲＦＰ陽性細胞の割合を分析した。これらのデータは、１実験あたりの１群あたり≧２のマウスを用いた、少なくとも２回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。ｎｓは有意差のないことを示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、ＴＮＦＲ２５によるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖がアレルギー性喘息における炎症を阻害することを示した図である。アレルギー性喘息は、材料と方法に記載するように、ｏｖａ／ミョウバンによる免疫誘導とそれに続くｏｖａ／ＰＢＳによるエアロゾル曝露によって誘導した。図４Ａ：４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置後に末梢血を採取し、ｏｖａ／ミョウバンにより免疫誘導したマウスの全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞画分を、免疫誘導していないマウスとの比較において分析した。データは平均±ＳＥＭを示す。図４Ｂ：全肺細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。表示する各細胞集団の総数を示す。データは平均±ＳＥＭを示す。図４Ｃ：全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージを示す。図４Ｄ：記載するように、ｏｖａ／ＰＢＳによるエアロゾル曝露から３日後に気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収した。好酸球の総数を示す。データは平均±ＳＥＭを示す。図４Ｅ：全肺細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。４Ｃ１２またはアイソタイプコントロールにより処置したマウスにおけるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現レベルを、生理食塩水によってエアロゾル曝露したコントロール肺細胞に比較して示す。図４Ｆ：肺を採取して薄切し、組織切片を作製した。各処置群について、Ｈ＆Ｅ（左パネル）およびＰＡＳ（右パネル）を得た。代表的な像を示す。これらのデータは、独立した４回の実験において少なくとも３マウス／群／実験により反復した。図４Ｇ：方法に記載するように、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いてＰＡＳ染色した切片を定量化した。各≧５マウスである別々の２回の実験から、２つの代表的な像を定量化した。統計的有意性は、チューキー事後検定付きの一元配置ＡＮＯＶＡにより決定した。表示するように、ＩｇＧ群または生理食塩水コントロール群に比較した４Ｃ１２またはＩＡＣのいずれかについて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、ＴＮＦＲ２５の刺激が、現存のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖を誘導することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖を導くことを示した図である。図５Ａ：ＦＩＲマウスを０日目にＩｇＧまたは４Ｃ１２で処置し、４日後に脾細胞を収集してフローサイトメトリーにより分析した。表示する処置後４日目にマウスから採取した末梢血液細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。図５Ｂ：表示する処置後４日目の脾細胞におけるＣＤ２５ｈｉ対ＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの平均的比率。図５Ｃ：ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋細胞に予めゲートをかけた代表的なドットプロットを示す。パーセンテージは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の全画分に対する各表現型の割合を示す。図５Ｄ：図５Ａに記載する処置後の、ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの間でのＫｉ６７＋またはＫｉ６７−の平均的割合を示す。データは平均±ＳＥＭである。図５Ｅ：ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−および図５Ｆ：ＣＤ４５．２＋ＦｌＲマウスからＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を＞９９％の純度によって選別し、各サブセットから２×１０６の細胞をＣＤ４５．１コンジェニックＢ６−ＳＪＬマウスへ養子移入した。２４時間後、マウスに各２０ｍｇの４Ｃ１２またはＩｇＧをｉ．ｐ．注射した。図５Ｅ、１２Ｇ：ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−および（図５Ｆ、５Ｈ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞のコンジェニックＣＤ４５．１ Ｂ６−ＳＪＬマウスへの移入。図５Ｅ、５Ｆ：養子移入後５日目の、ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４５．２＋およびＲＦＰ＋（ＦｏｘＰ３＋）細胞のパーセンテージを示すヒストグラム。図５Ｇ、５Ｈ：４Ｃ１２またはハムスターＩｇＧによる処置後の、移入細胞の減少の動態。ホストＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞のうちの移入細胞（ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋）のパーセンテージ（図５Ｅ）、またはホストＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋のパーセンテージ（図５Ｆ）を示す。エラーバーは、２回の独立した実験それぞれの、各１群あたり３マウスの平均パーセンテージ±ＳＥＭを示す。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖したＴｒｅｇの抑制活性を示した図である。４Ｃ１２およびＩｇＧアイソタイプコントロールを注射したマウスから４日後にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞を選別し、ＴｃｏｎｖとしてのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ２５−細胞および可溶性α−ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）を用いる標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイに７２時間供した（９６ウェル、丸底プレート）。アッセイは、様々な比率のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ（図６Ａ、６Ｂ）を用いて、１：１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の非存在（図６Ａ、６Ｃ）または存在（図６Ｂ、６Ｄ）下に行った。図６Ｃおよび６Ｄにおいて、抑制アッセイにＩｇＧ、４Ｃ１２、またはＤＴＡ１（１０ｇ／ｍｌ）抗体を添加した。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比は、一定の１：２の比率を保持した。図６Ｅ：ＴＮＦＲ２５ドミナントネガティブ（ＤＮ）マウス由来のＴｅｆｆ細胞およびｗｔマウス由来のＴｒｅｇ細胞を用いた。抑制アッセイにＩｇＧまたは４Ｃ１２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比は１：２である。図６Ｆ：ＩｇＧまたは４Ｃ１２を注射したマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇ細胞を用いた。アッセイをシンチレーションカウンターで分析する６時間前に３Ｈチミジンを添加した。パーセント増殖は、表示する条件について得られたカウントを用いて、Ｔｒｅｇが存在せず、Ｔｅｆｆを含むウェルから得られた総カウントのパーセンテージとして算出した。データは、１実験あたりの１群あたり＞６マウスを用いた、独立した２実験それぞれの各条件について、≧４サンプルの平均±ＳＥＭとして表した。
【図７】図７Ａ、７Ｂは、４Ｃ１２または組み換えＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体（ＩＡＣ）を用いた処置によって増殖したＴｒｅｇの比較を示した図である。図７Ａ：ＦＩＲマウスを、０日目に４Ｃ１２（１０μｇ）によって処置するか、または０〜２日目にＩＡＣの一連の３回の注射によって処置した。末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＦｏｘＰ３＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって毎日測定した。図７Ｂ：ＩＡＣ、４Ｃ１２、またはアイソタイプコントロールＩｇＧによる処置後４日目に、ＦＩＲマウス４から脾細胞を分離した。ＣＤ２５および増殖マーカーＫｉ６７を発現するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、４Ｃ１２による処置が、分析した全ての組織においてＴｒｅｇの増殖を誘導することを示した図である。図８Ａ：ＣＤ４およびＦｏｘＰ３（ＲＦＰ）を染色した、典型的なフローサイトメトリードットプロットの例。図８Ｂ〜８Ｄに示すように、後のＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔ細胞の分析のため、象限Ｑ２−１のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞にゲートをかけた。図８Ｂ：ＧＩＴＲの比率、および図８Ｃ：表示する処置から４日後の脾細胞における、ＣＤ２５ｈｉ対ＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇのＣＤ１０３の発現。図８Ｄ：データは、１実験あたりの１群あたり少なくとも３マウスを用いる、８回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表す。対の分析はスチューデントＴ検定を用いて行った。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂはソーティング計画と得られた結果の一例を示した図である。図９Ａ：ＦＩＲマウスから脾細胞を収集し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮して、ＣＤ４＋およびＦｏｘＰ３＋（ＲＦＰ）に基づいて選別した。左パネルに、脾細胞の典型的なＣＤ４濃縮集団を示す。中央および右パネルに、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｐ３ゲート）およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（Ｐ４ゲート）集団に対する代表的な選別後の分析を示す。図９Ｂ：幾つかの実験のために、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞（ゲートＰ３）をＣＤ２５の発現に基づいて選別した。ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔの選別に対するゲーティング計画を表す代表的なプロットを示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストが、クローン病のマウスモデルである、デキストラン−硫酸ナトリウム誘導性大腸炎から保護し得ることを示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬ１Ａノックアウトマウスに、３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を溶解した飲料水を７日間自由に摂取させた。幾つかの実験では、実験０日目にマウスをＩｇＧアイソタイプコントロール抗体またはＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２により処置した。ＤＳＳを供給する４日前（実験−４日目）に始まり、体重を毎日モニターした。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。動物が開始時の体重を≧２０％減少させた時点で死亡率を測定した（図１０Ａ）。幾つかの実験では、実験５日目に動物を屠殺し、急速冷凍してＰＢＳで洗浄した大腸組織からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製した。続いてＲＮＡの逆転写を行い（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＲＴ、Ｑｉａｇｅｎ）、表示する転写物に対するＴａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した（図１０Ｂ）。データは、ＴＬ１Ａノックアウトマウスにおける発現をＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスに比較した倍率変化によって示す。各実験ごとに、実験の全過程にわたって体重減少のパーセンテージをモニターし、プロットした（図１０Ｃ）。実験５日目にＲＮＡ分離のために動物を屠殺した実験では、制御性Ｔ細胞プールの指標となる転写因子ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析するために、腸間膜リンパ節を分離した（図１０Ｄ）。最後に、図１０Ｂに記載するように、表示する処置群から分離したＲＮＡを用いて逆転写を行い、表示する転写物に対するＲＴ−ＰＣＲに供した。エラーバーは１実験あたり≧３マウス、１パネルあたり最少で２実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【図１１】図１１は、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストが、マウスの異所性心臓移植モデルにおける同種異系心臓の急性拒絶反応を遅延させることを示した図である。４Ｃ１２によって増殖した天然型Ｔｒｅｇによる寛容性の誘導について試験するため、寛容性試験について十分に記載されている異所性心臓移植モデルを用いた。０日目に、ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｄ）の心臓をＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ２ｂ）の腹部へ移植した。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。移植時に、４Ｃ１２処置群の血中におけるＴｒｅｇの増殖を確認した。心臓を用手で触診することによって同種移植片の生存をモニターし、脈拍を０〜４（０＝脈拍なし；１＝非常に弱い；２＝弱い；３＝中程度；４＝強い）のスケールで類別した。拒絶は、心臓拍動の触知不可能として定義した。拒絶時（＝心臓拍動の停止時）に移植片を除き、ホルマリン固定後に病理検査へ供した。移植から４８時間以内に移植片の機能が失われた時には技術的な失敗とみなし（＜５％）、その後の分析を行わなかった。
【図１２】図１２は、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストは制御性Ｔ細胞のうち天然のものを選択的に増殖させるが、誘導されたものは増殖させないことを示した図である。ＦｏｘＰ３−ＲＦＰレポーター遺伝子を発現するマウスからＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を分離し、ＩＬ−２、ＴＧＦベータ、抗ＣＤ３抗体、およびレチノイン酸の存在下にｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間、標準的なプロトコルに従って培養した。培養の終わりに、生存細胞には７０−８５％のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ＲＦＰ＋誘導性の制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を含むＣＤ４＋集団が含まれた。これらの細胞を高速細胞ソーティングによって精製した。同時に、ＦｏｘＰ３−ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するマウスから全ＣＤ４＋細胞を分離した（従って、これらの細胞はｉＴｒｅｇおよびいわゆる胸腺由来の天然型制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）を含む）。ｉＴｒｅｇ（６×１０５のｉＴｒｅｇ細胞を、８×１０５のＴｒｅｇを含むＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウスから分離した全ＣＤ４＋細胞と混合した）を、ＣＤ４−／−レシピエントマウスに養子移入（静脈内注射により）した。２日後に、ＲＦＰ陽性ｉＴｒｅｇおよびＧＦＰ陽性ｎＴｒｅｇを含むＣＤ４−／−レシピエントマウスを、４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した（２０μｇ／マウス、腹腔内注射による）。５日後に、ＲＦＰ陽性ｉＴｒｅｇおよびＧＦＰ陽性の全Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇを唯一の源として含む）の割合を、分離した脾細胞のフローサイトメトリーにより決定した（図１２）。
【００１０】
詳細な説明
本発明は、類似または同等の要素を指定するために図面を通して参照数字が用いられるように、添付の図面への参照によって記載される。図面は一定の基準のために描かれたものではなく、単にその場での発明を例証するために提供される。以下に記載する本発明の幾つかの態様は、例証のために実施例応用への参照により記載される。多くの特定の詳細、関連性、および方法は、本発明の完全な理解のために示されることが理解されなければならない。しかしながら関連する技術分野における当業者は、１以上の特定の詳細なしで、または他の方法によって、本発明を実行できることを容易に認識するであろう。幾つかの行為は、異なる要求において、かつ／またはその他の行為もしくは現象と同時に起こり得ることから、本発明は例証される行為または現象の要求によって限定されるものではない。さらに、本発明に従う方法論を実行するために、例証される行為または現象の全てが必要とされるものではない。
【００１１】
本明細書に開示される全ての遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物は、本明細書に開示される組成物および方法が応用できるいずれの種に由来するホモログにも相当することが意図される。従って、これらの語には、ヒトならびにマウス由来の遺伝子または遺伝子産物が含まれるが、限定されるものではない。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物について開示される場合、この開示は例証のみを意図していること、および文脈中で明らかに指示されるとみられる場合を除き、限定的に解釈されてはならないことを理解されたい。従って例えば、その他の哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類を含むがこれらに限定されないその他の動物に由来する、相同的な、および／またはオルソロガスな遺伝子もしくは遺伝子産物を包含することが意図された哺乳類の核酸およびアミノ酸配列に関する幾つかの実施形態では、本明細書に開示される分子、例えば４Ｃ２はマウスに限定されず、ヒト抗体が好ましい。好ましい実施形態では、遺伝子または核酸配列はヒトのものである。
【００１２】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての語（技術的および科学的用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に用いられる辞書で定義されるような語は、関連技術の文脈内でのそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されなければならず、かつ、本明細書中で明確にそのように定義されない限り、理想的な、または過度に型にはまった意味で解釈されてはならないことがさらに理解されるであろう。
【００１３】
定義
本明細書の専門用語は特定の実施形態のみを記述する目的のために用いられ、本発明を限定しようと意図するものではない。文脈に明らかに他の指示がない限り、本明細書で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形も同様に含むことが意図される。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ））」、「と共に（ｗｉｔｈ）」、またはその変異形の語が詳細な説明および／または請求項のいずれかで用いられる範囲で、これらの語は「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語と同様に包括的であることが意図される。
【００１４】
「約」または「おおよそ」の語は、当業者により決定された特定の値についての許容される誤差範囲を意味し、これは値がどのように測定または決定されたかということ、すなわち測定系の限界に部分的に依存し得る。例えば「約」は、当該技術分野における実践あたりの、１以内または１を超える標準偏差を意味する。あるいは「約」は、所定の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、さらに好ましくは５％まで、なおさらに好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたは過程に関する際、この語は規模の桁の範囲内を意味することができ、好ましくは値の５倍以内、さらに好ましくは２倍以内である。本出願および請求項に特定の値が記される際、他に記載のない限り、「約」は特定の値の許容される誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
【００１５】
「制御性Ｔ細胞」、すなわち「Ｔｒｅｇ細胞」または「Ｔｒ細胞」は、Ｔ細胞応答を調節することのできる細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は転写因子Ｆｏｘｐ３を発現するが、これはＴ細胞の活性化によって発現増加せず、活性化エフェクター細胞からＴｒｅｇを区別する。Ｔｒｅｇは、細胞表面マーカーのＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、およびＧＩＴＲによって同定される。自己免疫および慢性炎症性応答の阻害能を有し、腫瘍を有するホストにおいて免疫寛容を維持する、幾つかのＴｒｅｇサブセットが同定された。これらのサブセットには、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を分泌するＴ制御性タイプ１（Ｔｒ１）細胞、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）を分泌するＴヘルパータイプ３（Ｔｈ３）細胞、および「天然型」ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（Ｔｒｎ）が含まれる（Ｆｅｈｅｒｖａｒｉ ａｎｄ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，１１４：１２０９−１２１７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４，２６５：１２３７−１２４０；Ｇｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７，３８９：７３７−７４２）。
【００１６】
本明細書において「ＴＮＦＲ２５アゴニスト」、「ＴＮＦＲ２５薬剤」、「ＴＮＦＲ２５組成物」は互換的に用いられ、これはＴＮＦＲ２５受容体に結合して、ＴＮＦＲ２５受容体を発現する細胞に、天然のＴＮＦＲ２５リガンド、例えばＴＬ１Ａへの該細胞の曝露によって観察され得る応答と同様の応答を引き起こす物質を指す。アンタゴニストもまた受容体に結合し得るが、受容体を活性化できず、実際には内在性または外来性のアゴニストによる活性化を完全または部分的に遮断するという意味において、アゴニストはアンタゴニストの反対である。部分的アゴニストは受容体を活性化するが、完全なアゴニストにより引き起こされるほどの生理的変化は起こさない。あるいは、ＴＮＦＲ２５アゴニストのもう一つの例は、ＴＮＦＲ２５に結合し、活性化することのできる抗体である。抗ＴＮＦＲ抗体の一例は４Ｃ１２（アゴニスト）である。（マイアミ大学に代わり、ブダペスト条約の下に寄託される；ＡＴＣＣ（登録商標）による種子／株の受領日：２００９年５月５日；ＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託指定：ＰＴＡ−１００００。寄託者による識別の参照：ハイブリドーマ細胞株；４Ｃ１２；寄託物は２００９年６月４日に試験され、この日に種子／株は生存していた。国際寄託当局：アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））、マナッサス、バージニア州、米国）。
【００１７】
本明細書において「ＴＮＦＲ２５アンタゴニスト」はＴＮＦＲ２５受容体の正常な生理的機能を阻害する物質を指す。このような薬剤は、ＴＬ１Ａのような内在性の受容体アゴニスト／リガンドのＴＮＦＲ２５受容体への結合に干渉することによって作用する。
【００１８】
ＴＮＦＲ２５アンタゴニストまたはアゴニストは、アプタマーの形であってよい。「アプタマー」は、その他の分子に結合するそれらの能力に基づいて無作為のプールから選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。アプタマーは標的分子に特異的に結合し、ここで核酸分子は、その天然の設定において標的分子により認識される配列を含んでなる配列を有する。あるいはアプタマーは、標的分子が天然では核酸に結合しない、該標的分子に結合する核酸分子であってもよい。標的分子は、関心のあるいずれの分子であってもよい。例えば、アプタマーをタンパク質のリガンド結合ドメインに結合させ、それによって天然のリガンドとタンパク質との相互作用を妨げるために用いることもできる。これは限定されない例であり、当業者は、当該技術分野において一般に公知である技術を用いて他の実施形態を容易に生み出せることを認識するであろう（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３，１９９５；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５，２０００；Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１００，２０００；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７，２０００；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０，２０００；およびＪａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．４５：１６２８，１９９９を参照）。
【００１９】
本明細書で用いられる「抗体」の語は、ヒトを含む全ての種に対して包括的であり、ヒト化抗体および抗原性の標的、例えばＴＮＦＲ２５はいずれの種由来であってもよい。従って抗体、例えば抗ＴＮＦＲ２５は、マウス抗ヒトＴＮＦＲ２５、ヤギ抗ヒトＴＮＦＲ２５；ヤギ抗マウスＴＮＦＲ２５；ラット抗ヒトＴＮＦＲ２５；マウス抗ラットＴＮＦＲ２５などであってよい。特定の種において、別の種由来の、またはある場合には同じ種由来の（例えば、自己免疫性または炎症性応答における）抗原標的、例えばＴＮＦＲ２５に対して産生された抗体の組み合わせに制限はなく、本発明では全ての種が具体化される。抗体の語は最も広範な意味で用いられ、これには完全に構築された抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗原に結合できる抗体断片（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）が含まれ、これらが望まれる生物学的活性を示すものであれば、前述のものの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる。
【００２０】
「標的分子」は、タンパク質、炭水化物、酵素、多糖、糖タンパク質、受容体、抗原、抗体、増殖因子を含むいずれかの高分子を含むか；またはホルモン、基質、代謝産物、補助因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、殺虫剤、ペプチドを含むいずれかの低有機分子であってよいか；または金属、金属イオン、金属酸化物、および金属複合体を含む無機分子であってよいか；細菌、ウイルス、および原生動物のような単細胞真核生物を含む生命体の全体であってもよい。
【００２１】
状況、疾患、もしくは状態を「処置する」またはそれらの「処置」には：（１）状況、疾患、もしくは状態にかかっている可能性があるかまたはかかりやすいが、その状況、疾患、もしくは状態の、臨床または無症候性の症状をまだ経験していないか示していない、哺乳類において発生する状況、疾患、もしくは状態の臨床または無症候性の症状の出現を阻止または遅延させること；または（２）状況、疾患、または状態を阻害すること、すなわち疾病もしくはその再発（維持処置の場合）またはその少なくとも１の臨床もしくは無症候性の症状の発生を抑止、減少、または遅延させること；または（３）疾病を軽減すること、すなわち状況、疾患、もしくは状態またはその少なくとも１の臨床もしくは無症候性の症状を後退させることが含まれる。処置される被験体にとっての利点は、統計的に有意であるか、または少なくとも患者または医師に知覚される。
【００２２】
「患者」または「被験体」は哺乳類を指し、ヒトおよび獣医学の被験体を含む。
【００２３】
「予防的に有効な量」は、望ましい予防的結果を達成するための、投薬量における、および必要な期間の間に有効な量を指す。典型的には、予防的な用量は、疾病の前かまたは早い段階で被験体に用いられることから、予防的に有効な量は治療上有効な量よりも少ない可能性がある。
【００２４】
免疫応答の調節
ＣＤ４Ｔ細胞サブセットの特性：ＣＤ４Ｔ細胞の活性化および増殖によって、異なるサイトカインプロファイルおよび特徴的なエフェクター機能を有する、異なるＴヘルパー（ＴＨ）細胞が発生する。侵入する病原体に対するホストの防御に最も適したＴＨ細胞のエフェクター細胞への適切な分化は、免疫系にとって決定的に重要である。ＣＤ４Ｔ細胞は、少なくとも４の既知のサブセット、３のエフェクターサブセット（ＴＨ１、ＴＨ２、およびＴＨ１７）、および１のＴ制御性サブセット（Ｔｒｅｇ）に分化する。Ｔ細胞は、それらが産生するサイトカインに基づいて歴史的にＴＨ１およびＴＨ２細胞に分類されたが、これによって、自然免疫系の細胞により生み出された特異的なサイトカイン環境がどのように適応免疫の発生を導くかについて理解するためのフレーム構造が提供された。ＩＬ−１２を分泌する樹状細胞（ＤＣ）により強力に誘導されるＴＨ１細胞は、系列特異的な転写因子Ｔ−ｂｅｔ（Ｔ ｂｏｘ ２１）の発現およびＩＦＮ−γの産生により特徴付けられる。分化の間ＩＬ−４に依存し、ＩＬ−１２を欠如するＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３を産生し、転写因子ＧＡＴＡ−３の発現により特徴付けられる。重要なことには、過去５年の間に、ＴＨ１７細胞と呼ばれるＩＬ−１７を産生するエフェクターＴヘルパー細胞による第３のサブセットが発見され、特徴付けられ、転写因子ＲＯＲγｔの発現によって特定化された。
【００２５】
ＴＨ１７細胞は、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２２を産生する。これらのエフェクターサイトカインを産生することにより、ＴＨ１７細胞は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２受容体の広範な分布に起因する大規模な組織反応を誘導する。ＴＨ１７細胞はまた、ＩＬ−２１も分泌して免疫系の細胞と連絡する。マウスおよびヒトにおいては、サイトカインであるトランスフォーミング増殖因子ベータアイソフォーム１（ＴＧＦ−β）とインターロイキン（ＩＬ）−６との相乗作用によってＴＨ１７細胞の発生が誘導されるが、ＩＬ−２３はこれらの細胞の増殖を支持する。ＴＨ１７細胞の発生に関わる分化因子（ＴＧＦ−βに加えて、ＩＬ−６またはＩＬ−２１）、増殖および安定化因子（ＩＬ−２３）、ならびに転写因子（ＳＴＡＴ３、ＲＯＲ−γｔ（ＲＯＲ−ｃ）、およびＲＯＲ−ａ）は、ごく最近同定された。ＴＧＦ−βは、末梢の免疫区画においてナイーブＴ細胞のＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇへの分化も誘導することから、ＴＨ１７細胞の分化におけるＴＧＦ−βの関与は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に密接に関連するＴＨ１７系列に与えられる。Ｔｒｅｇ細胞は免疫系の活性化を抑制するために作用するＴ細胞の特殊な亜集団であり、これによって自己抗原に対する免疫系の恒常性および寛容性を維持する。自己免疫疾患を抑制できるＴｒｅｇ細胞の発生は、自己免疫応答を含む免疫応答を駆動できるＴＨ１７細胞と相反的に関連する。Ｔｒｅｇ細胞は、その独特な、転写因子であるフォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）の発現により同定できる。重要なことには、これまでに知られている限り、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇには表現型として同等な２つの集団−天然型および適応型が存在する。天然型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺内で、自己免疫からの保護のために恒常的な状態で発生する。適応型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、感染および癌のような炎症性過程において発生し、直接の接触またはＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのような可溶性因子の産生を含む不均一な機構を通して免疫を抑制する。
【００２６】
本明細書では互換的にデスレセプター３（ＤＲ３）と称される腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）は、Ｔ細胞機能の制御因子である。デスレセプター３（ＤＲ３）（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０，１９９６）はＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。これはＴＲＡＭＰ（Ｂｏｄｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：７９，１９９７）、ｗｓｌ−１（Ｋｉｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３７２，１９９６）、Ａｐｏ−３（Ｍａｒｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ６：１６６９，１９９６）、およびＬＡＲＤ（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４６１５，１９９７）としても知られ、典型的なデスドメインを含む。２９３細胞へのヒトＤＲ３（ｈＤＲ３）のトランスフェクションにより、アポトーシスおよびＮＦ−κＢの活性化が誘導された。ヒトＤＲ３のｍＲＮＡには複数のスプライシング型が観察されることから、転写後レベルでの制御が示唆される（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４６１５，１９９７）。
【００２７】
ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、胸腺における負の選択を免れる自己反応性エフェクターＴ細胞の活性を抑制することができる。Ｔｒｅｇは、ＩＢＤ、喘息、およびＥＡＥの実験モデルにおいて、自己免疫性の病態を阻止または遅延するために十分である。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇによるＣＤ４＋ＣＤ２５−の阻害を遮断するが、抗原特異的なＣＤ８＋細胞の阻害は遮断しない。興味深いことに、ＣＤ２プロモーターの下で完全長のＴＮＦＲ２５を発現するトランスジェニックマウスは、高レベルのＴＨ２およびＴＨ１７サイトカインを発現し、二次リンパ組織での細胞充実性が減少する。ＴＮＦＲ２５トランスジェニックマウスにおける、制御性Ｔ細胞の活性低下、細胞充実性の減少、およびサイトカイン産生の増大の同時発生により、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、ＴＮＦＲ２５のシグナルが受け取られた状況によって炎症促進性および抗炎症性の両方となり得ることが示唆される。
【００２８】
簡単に述べると、本明細書で行われた実験により、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦＲ２５の刺激が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞プールの迅速かつ全身性の増殖を誘導するという、予想外の知見が示された。抗体（４Ｃ１２）により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、外来性抗原には依存せずに起こり、投与後４日以内に、全ＣＤ４＋細胞のうちのＴｒｅｇのパーセンテージに３〜４倍の増加をもたらした。このＴｒｅｇの増殖は主にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖からもたらされ、持続的であり、２週間、無刺激のレベルまで減少しなかった。４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇは、ＴＧＦβにより仲介されるエフェクターＴ細胞のサプレッサー機能をｅｘ ｖｉｖｏで保持したが；ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の継続により、４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇの抑制活性は無効となった。理論に制約されるものではないが、これらの知見により、ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、Ｔｒｅｇの増殖の増大およびＴｒｅｇの抑制活性の阻害の二重の機能を有することが示唆される。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達による、Ｔｒｅｇによる抑制の阻害は高度に可塑性であり、ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の除去または継続それぞれに従って、元に戻るかまたは維持され得る。ＴＨ２およびＴＨ１７による応答の共刺激因子としてのＴＮＦＲ２５の役割にこの情報を加えることで、免疫のシグナル伝達におけるＴＮＦＲ２５の役割は、炎症性応答を誘導する間にエフェクター細胞の機能を同時に増大し、炎症性刺激の除去に従って抑制活性を回復するＴｒｅｇのプールの局所的増殖を通して、炎症の消散を促進することであると示唆される。まとめると、これらの知見により、ＴＮＦＲ２５を標的とした治療法は、それらが投与される炎症性の状況に応じて免疫の活性化を増大するかまたは阻害するために役立ち得ることが証明され、これは自己免疫疾患、慢性感染、移植、および癌の領域に対して広く影響する。
【００２９】
好ましい一実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を制御する方法は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与することを含んでなる。好ましい機能は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖の誘導をもたらす、ＴＮＦＲＳＦ２５により仲介されるシグナル伝達である。ＴＮＦＲＳＦ２５分子の刺激により、免疫応答を抑制するＴｒｅｇ細胞が誘導される。しかしながらＴＮＦＲＳＦ２５分子の連続する刺激はＴｒｅｇ細胞の抑制活性を無効にするため、それによって免疫応答が制御される。
【００３０】
ＣＤ４＋Ｔ細胞上にはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５、ＤＲ３）が恒常的に発現しており、これを通したシグナル伝達によるＴＨ２およびＴＨ１７のサイトカイン産生の増大が、喘息、炎症性腸疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、および関節リウマチの疾病モデルにおける病的炎症に寄与する。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答の制御によって、免疫応答に付随する疾病または疾患が処置される。このような疾病または疾患は、例えば：心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、膵臓、小腸、肢、筋肉、神経、椎間板、気管、筋芽細胞、軟骨などのような臓器または組織の移植による拒絶反応；骨髄移植に続く移植片対宿主反応；関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、１型糖尿病などのような自己免疫疾患；病原微生物（例えばアスペルギルス・フミガーツス、フザリウム・オキシスポラム、トリコフィトン・アステロイデスなど）により引き起こされる感染；炎症性もしくは過剰増殖性の皮膚疾患または免疫による疾病の皮膚症状（例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹様皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、紅班、皮膚好酸球増加症、紅斑性狼瘡、ざ瘡、および円形脱毛症）；眼の自己免疫疾患（例えば角結膜炎、春季カタル、ベーチェット病に付随するぶどう膜炎、角膜炎、ヘルペス性角膜炎、円錐角膜炎、角膜上皮変性症、角膜白斑、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーブス眼症、フォークト・小柳・原田症候群、乾性角結膜炎（ドライアイ）、フリクテン、虹彩毛様体炎、サルコイドーシス、内分泌性眼障害など）；可逆性気道閉塞疾患［喘息（例えば気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、および塵埃喘息）、特に慢性または難治性喘息（例えば遅発型喘息および気道過敏症）気管支炎など；粘膜または血管の炎症（例えば胃潰瘍、虚血性または血栓性の血管傷害、虚血性腸疾患、腸炎、壊死性腸炎、熱傷に付随する腸の損傷、ロイコトリエンＢ４による疾病）；小腸炎／アレルギー（例えばセリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、および潰瘍性大腸炎）；消化管から離れた症候性の症状を伴う食物関連のアレルギー疾患（例えば片頭痛、鼻炎、および湿疹）；腎臓病（例えば間質性腎炎、グッドパスチャー症候群、溶血性尿毒症症候群、および糖尿病性腎症）；神経疾患（例えば多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎、単発性神経炎、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および神経根症）；脳の虚血性疾患（例えば頭部外傷、脳の出血（例えばくも膜下出血、脳内出血）、脳血栓症、脳塞栓症、心停止、脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、高血圧性脳症、脳梗塞）；内分泌疾患（例えば甲状腺機能亢進症、およびバセドウ病）；血液疾患（例えば赤芽球癆、再生不良性貧血、低形成性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、無顆粒球症、悪性貧血、巨赤芽球性貧血、および赤血球形成不全）；骨疾患（例えば骨粗鬆症）；呼吸器疾患（例えばサルコイドーシス、肺線維症、および特発性／間質性肺炎）；皮膚疾患（例えば皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光線過敏症、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫）；循環器疾患（例えば動脈硬化、アテローム性動脈硬化症、大動脈炎症候群、結節性多発動脈炎、および心筋症）；膠原病（例えば強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、およびシェーグレン症候群）；脂肪症；好酸球性筋膜炎；歯周病（例えば歯肉、歯周組織、歯槽骨、または歯のセメント質への損傷）；ネフローゼ症候群（例えば糸球体腎炎）；男性型脱毛症、老人性脱毛症；筋ジストロフィー；膿皮症およびセザリー症候群；染色体異常が付随する疾病（例えばダウン症候群）；アジソン病；活性酸素による疾病［例えば保存、移植、または虚血性疾患（例えば血栓症、心筋梗塞など）に付随する臓器（例えば心臓、肝臓、腎臓、消化管など）の臓器傷害（例えば虚血性循環器疾患）；腸疾患（例えば内毒素ショック、偽膜性大腸炎、および薬物または照射により誘導される大腸炎）；腎臓病（例えば虚血性急性腎不全、慢性腎不全）；肺疾患（例えば肺の酸素または薬物（例えばパラコート、ブレオマイシンなど）により引き起こされる中毒、肺癌、および肺気腫）；眼疾患（例えば白内障、鉄蓄積症（眼球鉄症）、網膜炎、網膜色素変性症、老人斑、硝子体瘢痕、角膜のアルカリ火傷）；皮膚炎（例えば多形性紅班、リニア免疫グロブリンＡ水疱性皮膚炎、セメント皮膚炎）；およびその他の疾病（例えば歯肉炎、歯周炎、敗血症、膵炎、および環境汚染（例えば大気汚染）により引き起こされる疾病、加齢、発癌物質、癌の転移、および高山病）］；ヒスタミン放出またはロイコトリエンＣ４放出により引き起こされる疾病；血管形成術および術後癒着防止後の冠動脈の再狭窄；自己免疫疾患および炎症状態（例えば原発性粘膜浮腫、自己免疫性萎縮性胃炎、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体原性ぶどう膜炎、特発性白血球減少症、活動性慢性肝炎、特発性肝硬変、円板状紅斑性狼瘡、自己免疫性精巣炎、関節炎（例えば変形関節炎）、または多発性軟骨炎）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＡＩＤＳ；アレルギー性結膜炎；ならびに外傷、火傷、または外科手術による肥厚性瘢痕およびケロイドを含んでなる。
【００３２】
好ましい一実施形態によれば、薬剤はＴｒｅｇ細胞による抑制効果を維持するため、単一用量または一期間にわたり拡散して投与される。例えば、自己免疫疾患の治療である。
【００３３】
別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果が無効になるように、複数または多数の用量により投与される。例えば、異常細胞の免疫による除去を必要とする癌、ウイルス性疾患、またはその他の疾病の処置においてである。
【００３４】
別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、Ｔｒｅｇ細胞による免疫系の抑制を無効にするための、ＴＮＦＲＳＦ２５の一定の刺激が供給されるように、持続放出処方により投与される。
【００３５】
別の好ましい実施形態によれば、患者において少なくとも１の薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖を誘導する。Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果はモニターすることができ、免疫応答の低下が望ましい疾病または状態、例えば自己免疫、移植の拒絶などにおいて抑制効果を維持するために、薬剤の用量を調節することができる。
【００３６】
別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１の薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、胸腺で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導するが、末梢で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖は誘導しない。Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果はモニターすることができ、免疫応答の低下が望ましい疾病または状態、例えば自己免疫、移植の拒絶などにおいて抑制効果を維持するために、薬剤の用量を調節することができる。
【００３７】
別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１の薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、末梢で誘導されたＴｒｅｇ細胞により認識される同種抗原の存在が既知である場合に、胸腺および末梢で誘導された両方のＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する。Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果はモニターすることができ、免疫応答の低下が望ましい疾病または状態、例えば自己免疫、移植の拒絶などにおいて抑制効果を維持するために、薬剤の用量を調節することができる。
【００３８】
別の好ましい実施形態によれば、１の、または組み合わせた薬剤が、患者の免疫応答を調節するために患者に投与され得る。例えば、患者におけるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖によるか、または望ましい応答を測定するその他のいずれかのアッセイによって決定された、治療上有効な用量の１以上の薬剤が患者に投与され得る。例えば免疫測定法、バイオマーカーの検出、ＦＡＣＳ、免疫ブロット、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどである。Ｔｒｅｇ細胞は、例えばＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞として同定され得る。幾つかの態様では、ＣＤ１０３が共発現する。ＴｒｅｇによるＣＤ１０３の発現により、組織は組織内に保持される。ＴＮＦＲＳＦ２５により仲介されるＴｒｅｇの増殖に干渉しないことが知られている薬剤にはラパマイシンが含まれる。
【００３９】
別の好ましい実施形態によれば、ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤は、抗体、アプタマー、リガンド、小分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機または無機分子のうち少なくとも１を含んでなる。
【００４０】
好ましい一実施形態によれば、薬剤はＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニストである。
【００４１】
別の好ましい実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を抑制する方法は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）により仲介されるシグナル伝達の機能を調節し、抑制的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与することを含んでなる。
【００４２】
別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５のシグナル伝達を調節し、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の抑制活性を阻害する。
【００４３】
別の好ましい実施形態によれば、免疫応答を調節する組成物はＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤を含んでなる。一実施形態によれば、薬剤は、サプレッサーＴｒｅｇが免疫応答を抑制するように患者に投与される。別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、サプレッサーＴｒｅｇ細胞の阻害を導いて免疫応答を高めるシグナルを無効にする用量または条件下で患者に投与される。
【００４４】
別の好ましい実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで癌を処置する方法は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能的シグナル伝達を調節する少なくとも１の薬剤を、Ｔｒｅｇ細胞の抑制効果を無効にして癌に対する免疫応答を誘導できる、ＴＮＦＲＳＦ２５の連続的な刺激を供給する用量および条件において、患者の必要に応じて患者に投与することを含んでなる。
【００４５】
別の好ましい実施形態によれば、免疫細胞の調節およびそれに続く応答は、例えば癌、ウイルス性疾患、またはいずれかの感染性の生命体により引き起こされる疾病のような疾病にかかった患者を処置する方法を含んでなり、該方法では、抗ＴＮＦＲ２５組成物が患者に投与されて、免疫細胞の機能、例えば以前に抑制されたかもしくは減弱されたリンパ球の増殖を調節するか、または免疫応答は正常である場合に、免疫応答の増大によってさらに有効で迅速な患者の処置がもたらされる。腫瘍の固有の免疫原性（すなわち、操作されていない腫瘍が防御的免疫を刺激する能力）が失われていない場合の負の制御経路は、腫瘍の進行の免疫によるコントロールの阻止に重要な役割を果たす。治療上の意味としては、免疫の減弱／抑制性の制御回路に対抗することによって免疫による癌のコントロールは成功し、これは少なくとも強力なワクチン接種プロトコルの開発よりも重要なことである。
【００４６】
腫瘍ワクチン：このようにＴＮＦＲ２５アゴニストは、Ｔ細胞の活性化および腫瘍特異的な抗原に対する細胞性免疫応答を亢進することから、例えば腫瘍ワクチンに対する有効な生物学的応答の修飾因子であるが、一方でＴＮＦＲ２５アンタゴニストはＴ細胞の活性化を遮断または阻害する。従って本発明の別の態様は、腫瘍ワクチンの有効性を増大させる方法および治療薬に関する。
【００４７】
腫瘍ワクチンは、癌と戦うために身体の自然免疫系の要素を用いる試みである。腫瘍ワクチンは１以上の腫瘍特異的な抗原を含み、かつアジュバントおよび生物学的応答の修飾因子を含み得る。腫瘍特異的な抗原は、腫瘍細胞内または腫瘍細胞上に実質的に限定して発現し、かつこれらの腫瘍細胞を標的とすることが意図された免疫応答を刺激するために用いることのできるポリペプチドである。異なる型のワクチンが、異なる型の癌を処置するために用いられる。抗原性組成物がワクチンとして有用であるためには、抗原性組成物は、細胞または組織内で抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。本明細書で用いられる「抗原性組成物」は、抗原（例えばペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば抗原の発現ベクター）、または抗原を発現もしくは提示する細胞を含んでなってよい。
【００４８】
ワクチンまたはその他の抗原性の刺激物質に対する免疫応答の増大は、例えば増殖アッセイ、サイトカインの分泌、分泌されるサイトカインの型、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどのような従来法のいずれかを用いて測定することができる。増大した免疫応答は、処置をモニターすることによってもまた検出できる。例えば癌を処置する場合、増大した免疫応答は、以下の効果のうち１以上を観察することによってもモニターできる：（１）（ｉ）速度の減少（ｉｉ）血管新生の抑制、および（ｉｉ）増殖の完全な停止を含む、ある程度までの腫瘍増殖の抑制；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの維持；（４）腫瘍サイズの縮小；（５）（ｉ）縮小（ｉｉ）速度の減少、または（ｉｉｉ）腫瘍細胞の末梢臓器への浸潤の完全な防止を含む抑制；（６）（ｉ）縮小（ｉｉ）速度の減少、または（ｉｉｉ）転移の完全な防止を含む抑制；（７）（ｉ）腫瘍サイズの維持（ｉｉ）腫瘍サイズの縮小（ｉｉｉ）腫瘍の増殖速度の減少（ｉｖ）浸潤の縮小、速度の減少、または防止をもたらし得る抗腫瘍免疫応答の増大、および／または（８）疾患に付随する１以上の症状の重症度または数のある程度までの軽減。
【００４９】
別の好ましい実施形態によれば、抗ＴＮＦＲ２５は、抗ＴＮＦＲ２５抗体を発現するベクターコンストラクトとして投与することができる。加えてベクターコンストラクトは、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のようなサイトカイン、およびＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０のような共刺激分子をコードするヌクレオチド配列を含んでよい。サイトカインは、抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球応答の両方を含む被験体の免疫系の応答を微調整して、感染または疾病状態をコントロールまたは排除するために必要とされる応答の特定のレベルを引き出すため、様々に組み合わせて用いることができる。ポリヌクレオチドはまた、抗原性ポリペプチド、例えば抗腫瘍抗原、抗ウイルス性抗原など、およびＣＴＬＡ−４のような共刺激分子を含む融合産物をコードしてもよい。適切なベクターの例は、ポリオウイルス、ワクシニア、カナリアポックス、および鶏痘のようなポックスウイルス類、ナマズ疱疹ウイルス（ｃａｔｆｉｓｈ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）を含む疱疹ウイルス類、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルス類を含むウイルス性ベクターを含んでなる。代表的な細菌性ベクターには、サルモネラ、シゲラ、エドワージエラ・イクタルリ、エルシニア・ラッケリ、およびリステリア・モノサイトゲネスの弱毒化型が含まれる。Ｌ．モノサイトゲネスは、動物におけるＴｒｅｇの増殖刺激に用いて、後に動物あたりのＴｒｅｇを高い収率で回収するための研究ツールとしても役立つ。
【００５０】
併用療法
好ましい実施形態によれば、免疫応答の増大または上方制御のために１以上の治療法が併用され得る。抗ＴＮＦＲ２５抗体は、例えば、１以上の薬剤または処置方法による処置前に、処置と同時に、または処置後に投与することができる。
【００５１】
別の実施形態によれば、ＴＮＦＲ２５組成物は自己細胞に投与することができ、これによって増殖した細胞の患者への再注入が可能となる。
【００５２】
ＴＮＦＲ２５刺激剤は、ベクター内のポリヌクレオチド、リポソーム、核酸、ペプチドなどとして、医薬組成物中に加えることができる。
【００５３】
別の好ましい実施形態によれば、ＴＮＦＲ２５刺激薬は、追加の１以上の薬理学的に有効な薬剤と共に投与してよい。本明細書で用いられる「薬理学的に有効な薬剤」の語は、原核生物または真核生物の細胞において、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで生理的な効果（例えば治療上の、または予防的な効果）を有することのできる薬物のようないずれの薬剤も指し、限定はされないが、これらには化学療法剤、毒素、放射線療法、放射線感作薬剤、遺伝子治療ベクター、アンチセンス核酸コンストラクトまたは低分子干渉ＲＮＡ、造影剤、診断薬、細胞内タンパク質、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドと相互作用することが知られている薬剤が含まれる。
【００５４】
さらなる薬理学的に有効な薬剤は、例えば、鎮痛剤、麻酔薬、抗炎症薬、駆虫薬、抗不整脈薬剤、抗ぜんそく薬、抗生物質（ペニシリンを含む）、抗癌剤（タキソールを含む）、抗凝固剤、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗てんかん薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、降圧薬、抗ムスカリン薬、抗ミコバクテリア薬、抗悪性腫瘍薬、抗酸化剤、解熱剤、免疫抑制剤、免疫賦活薬、抗甲状腺薬、抗ウイルス薬、抗不安、鎮静剤（催眠剤および神経遮断薬）、収斂剤、静菌剤、ベータアドレナリン受容体遮断薬、血液製剤および代替薬、気管支拡張薬、緩衝剤、心変力薬、化学療法剤、造影剤、副腎皮質ステロイド、鎮咳薬（去痰薬および粘液溶解薬）、診断薬、診断用造影剤、利尿薬、ドーパミン作動薬（抗パーキンソン病薬）、フリーラジカル消去剤、増殖因子、止血剤、免疫薬、脂質調節剤、筋弛緩剤、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチド、副交感神経刺激薬、副甲状腺のカルシトニンおよび二ホスホン酸塩、プロスタグランジン、放射性医薬品、ホルモン、性ホルモン（ステロイドを含む）、徐放性結合剤、抗アレルギー薬、刺激薬および食欲抑制薬、ステロイド、交感神経作動薬、甲状腺薬、ワクチン、血管拡張薬、およびキサンチンを含む、様々な既知の薬物の分類から選択することができる。
【００５５】
さらなる薬理学的に有効な薬剤は、治療薬である必要はない。例えば薬剤は、それが送達される局所的な細胞に対して細胞傷害性であってよいが、被験体に対しては概して有益な効果を有する。さらに薬剤は、バイオイメージングのための造影剤のように、それ自体は直接に治療上の活性をもたない診断薬であってもよい。
【００５６】
化学療法：ＴＮＦＲ２５組成物は、化学療法を伴って投与されてよい。例えば抗ＴＮＦＲ２５の投与により、化学療法の必要が減じ得るか、または化学療法がなお必要とされるかもしくは推奨される場合でも用量は減少する可能性があり、これによってこれらの化学療法剤の幾つかの有害な副作用が軽減される。癌の治療法には、化学薬剤および照射の両方による処置を用いた、様々な併用療法もまた含まれる。併用の化学療法には、例えばシスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤、超プラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサート、または前述のいずれかの類似体もしくは誘導変異体が含まれる。
【００５７】
放射線療法：組成物は、放射線療法と併用してよい。ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く用いられているその他の因子には、一般にガンマ線、Ｘ線として知られるもの、および／または腫瘍細胞へ向けた放射性同位元素の送達が含まれる。ＤＮＡ損傷因子のその他の型は、マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および米国特許第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射などとしてもまた意図される。おそらくこれらの因子は全て、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持において、ＤＮＡに広範な損傷を与える効果があると考えられる。Ｘ線の用量範囲は、長期間（３〜４週間）に対する一日用量の５０〜２００レントゲンから、単一用量の２０００〜６０００レントゲンである。放射性同位元素の用量範囲は非常に広範であり、同位元素の半減期、放出される放射線の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００５８】
免疫療法：抗ＴＮＦＲ２５薬剤は、免疫療法のその他の型と併用してよい。例えば癌の処置に関して免疫療法は一般に、癌細胞を標的とし、これを破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子（例えばモノクローナル抗体）の使用に依存している。このような例は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））またはベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））である。免疫エフェクターは、例えば腫瘍細胞表面のあるマーカーに特異的な抗体であってよい。抗体単独で治療法のエフェクターとして役立つか、または実際に細胞を死滅させる効果のために、その他の細胞が動員され得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合させて、単に標的指向化剤としてもよい。あるいはエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。治療様式の併用、すなわち直接の細胞傷害活性、および例えば抗ＴＮＦＲ２５抗体によるその免疫エフェクター応答の増大により、癌の処置における治療上の利点が提供され得る。
【００５９】
抗原特異的な免疫応答は１以上の腫瘍抗原を標的とする可能性があり、ＴＮＦＲ２５組成物の投与によってこれらの腫瘍抗原に向けられた免疫応答は増大し得る。多くの腫瘍マーカーが存在し、それらのいずれも本発明に関連する標的指向化に適し得る。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、およびｐ１５５が含まれる。免疫療法の別の態様は、抗癌効果の免疫刺激効果との併用である。存在する免疫刺激分子には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマＩＦＮのようなサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８のようなケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドのような増殖因子が含まれる。免疫刺激分子を、タンパク質として、または遺伝子送達を用いて、ＭＤＡ−７のような腫瘍抑制因子と併用することで抗腫瘍効果は増大する。
【００６０】
癌の受動免疫療法に対する幾つかの異なったアプローチが存在する。これらは大まかには以下のように分類され得る：抗体単独の注射；抗体と毒素または化学療法剤を組み合わせた注射；抗体と放射性同位元素を組み合わせた注射；抗イディオタイプ抗体の注射；および最後に、骨髄内の腫瘍細胞の一掃。患者における副作用が少ないかまたは無であることから、好ましくはモノクローナル抗体が受動免疫療法に用いられる。
【００６１】
能動免疫療法では、抗原性のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自己もしくは同種の腫瘍細胞組成物、すなわち「ワクチン」が、一般には特徴的な細菌性アジュバントと共に投与される。メラノーマの免疫療法では、高いＩｇＭ応答を誘発する患者は、ＩｇＭ抗体の誘発が無であるかまたは低い患者よりもしばしば長く生存する。ＩｇＭ抗体は普通は一過性の抗体であるが、抗ガングリオシドまたは抗炭水化物抗体については例外であると思われる。
【００６２】
養子免疫療法では、患者の循環リンパ球、または腫瘍浸潤性のリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで分離し、ＩＬ−２のようなリンホカインで活性化するか、または腫瘍壊死のための遺伝子を導入する。ＴＮＦＲ２５組成物、例えば抗ＴＮＦＲ２５抗体は、次に再注入する細胞と共に投与するかまたは培養する。これを達成するため、免疫学的に有効な量の活性化リンパ球が、抗ＴＮＦＲ２５、および任意に、アジュバントが取り込まれた抗原性のペプチド組成物と組み合わせて、動物またはヒト患者へ投与され得る。活性化リンパ球は、血液または腫瘍サンプルから予め分離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化した（または「増殖した」）患者自身の細胞が最も好ましいであろう。この形の免疫療法は、幾つかの事例においてメラノーマおよび腎癌の退縮を導いたが、応答した者のパーセンテージは応答しなかった者よりも低かった。抗ＴＮＦＲ２５は、処置を行う医師または看護師によって決定され得る投与計画に従って、細胞の再注入後に患者へ投与され得る。
【００６３】
免疫抑制剤：１以上のＴＮＦＲＳＦ２５薬剤は、抑制された免疫応答を維持することが望ましい場合に（例えば自己免疫疾患）、１以上の免疫抑制剤と共に投与されてよい。免疫抑制剤の例には、ミコフェノール酸、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、エリデル；タクロリムスおよびシロリムス；ミノサイクリン；レフルノミド；またはメトトレキサートが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
外科手術：癌患者のおおよそ６０％が、予防的な、診断用またはステージ分類用の、根治的な、および対症療法的な外科手術を含む、何らかの型の外科手術を経験し得る。根治的外科手術は、本発明による処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法のようなその他の治療法と併用して用いられ得る、癌の処置である。
【００６５】
根治的外科手術には、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、摘出、および／または破壊する、切除が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡的に制御された外科手術（モース術）が含まれる。本発明は、表在癌、前癌病変、または正常組織の偶発的な量の除去と併用して用いられ得ることがさらに意図される。
【００６６】
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部もしくは全部の摘出により、身体には空洞が形成され得る。処置は、追加の抗癌療法による、領域の灌流、直接注射、または局所的適用によって達成され得る。このような処置は、例えば１、２、３、４、５、６、もしくは７日おきに、または１、２、３、４、および５週間おきに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月おきに反復され得る。これらの処置では、投薬量も同様に変動し得る。
【００６７】
その他の薬剤：処置の治療上の有効性を改善するため、その他の薬剤を本発明と併用し得ることが意図される。これらの追加薬剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合の増加に影響を与える免疫調節剤、細胞接着を阻害し、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感度を増大させる細胞増殖阻害剤および分化誘導剤、またはその他の薬剤が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマ；ＩＬ−２およびその他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよびその他のサイトカイン類似体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、およびその他のケモカインが含まれる。細胞表面受容体またはそのリガンド、例えばＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４、もしくはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ−２リガンド）の増加により、本発明の能力を増強し得ることがさらに意図される。ギャップ結合の数の増加による細胞内シグナル伝達の増大は、望ましい細胞集団における増殖効果を増大し得る。
【００６８】
Ａｐｏ２リガンド（Ａｐｏ２Ｌ、ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）サイトカインファミリーのメンバーである。ＴＲＡＩＬは多くの型の癌細胞において迅速にアポトーシスを起こすが、正常細胞に対してはなお無毒である。ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡは広く様々な組織で発生する。ほとんどの正常細胞はＴＲＡＩＬの細胞傷害作用に対して抵抗性であると思われることから、ＴＲＡＩＬによるアポトーシスの誘導に対して保護可能な機構の存在が示唆される。デスレセプター４（ＤＲ４）とも呼ばれる、ＴＲＡＩＬについて記載された第１の受容体は細胞質「デスドメイン」を含み；ＤＲ４はＴＲＡＩＬにより運ばれるアポトーシスシグナルを伝達する。ＴＲＡＩＬに結合するさらなる受容体が同定されている。ＤＲ５と呼ばれる一受容体は細胞質デスドメインを含み、ＤＲ４に非常によく似たアポトーシスシグナルを伝達する。ＤＲ４およびＤＲ５のｍＲＮＡは、多くの正常組織および腫瘍細胞株に発現する。ＴＲＡＩＬによるＤＲ４およびＤＲ５を通したアポトーシスの誘導を阻止する、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２のようなデコイ受容体が同定された。従ってこれらのデコイ受容体は、アポトーシス促進性サイトカインに対する感度を細胞表面で直接制御するための新規な機構を表す。正常組織におけるこれらの抑制性受容体の優先的な発現により、ＴＲＡＩＬは、癌細胞にアポトーシスを誘導するが正常細胞には寛容である抗癌剤として有用であり得ることが示唆される。
【００６９】
細胞傷害性の化学療法薬を導入した癌の治療法には多くの利点がある。しかしながら、化学療法の結果の一つは薬物抵抗性をもつ表現型の発生／取得および多剤耐性の発生である。薬物抵抗性の発生は、いまだにこのような腫瘍の処置における主要な障害であることから、免疫応答の増大によって代替アプローチが提供される。
【００７０】
治療法の別の形には、患者の組織を高温（１０６°Ｆまで）に曝露する手順である、温熱療法が含まれる。外部または内部の加温装置が、局所、領域、または全身への温熱療法の適用に関与し得る。局所的温熱療法は、腫瘍のような小さな領域への熱の適用に関与する。熱は、身体外の装置からの腫瘍を標的とした高周波によって外部から発生し得る。内部の熱は、細い、熱した針金もしくは温水を満たした中空のチューブを含む無菌プローブ、埋め込まれたマイクロ波アンテナ、または高周波電極に関与し得る。
【００７１】
患者の臓器または肢を、磁石のような高エネルギーを発生する装置を用いて達成される領域的治療法のために加温する。あるいは、患者の血液の幾らかを、内部で加温され得る領域内へ還流する前に採取し、加温してよい。癌が身体に拡散した場合には、全身の加温も行われ得る。この目的のために、温水毛布、ホットワックス、誘導コイル、および熱チャンバーが用いられてよい。
【００７２】
ホルモン療法もまた、本発明と併用して、またはこれまでに記載したその他の癌治療法のいずれかと組み合わせて用いられてよい。ホルモンの使用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頸癌のような特定の癌の処置において、テストステロンまたはエストロゲンのような特定のホルモンの効果のレベルを低下させるかまたは遮断するために利用され得る。この処置は、処置の選択肢として、または転移の危険性を減少させるために、しばしば少なくとも１のその他の癌治療法と併用される。
【００７３】
組成物の投与
医薬製剤およびワクチンは、経口（固体または液体）、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン泳動もしくはエレクトロポレーションの使用）、経粘膜（経鼻、経膣、経直腸、または舌下）、もしくは吸入の投与経路によって、または生分解性の挿入剤を用いて投与されてよく、かつ各投与経路に適した剤形に処方することができる。
【００７４】
ｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍細胞を標的とするため、上記の組成物は、適切ないずれかの製剤によってヒトを含む動物に投与されてよい。例えば腫瘍細胞を標的とするための組成物は、生理食塩水もしくは緩衝食塩水のような、薬剤的に許容される担体または希釈剤中に処方されてよい。適切な担体および希釈剤は、投与の方法および経路ならびに標準的な薬務に基づいて選択できる。代表的な薬剤的に許容される担体および希釈剤、ならびに医薬製剤についての記述は、この分野の標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＵＳＰ／ＮＦに見出される。組成物の安定および／または保存のため、その他の物質が組成物に添加されてよい。
【００７５】
本発明の組成物は、いずれかの従来法によって動物に投与されてよい。組成物は、例えば内部または外部の標的部位への外科的送達によって、または血管が到達できる部位へのカテーテルによって、標的部位へ直接投与されてよい。送達のその他の方法、例えばリポソームによる送達、または組成物を浸透させた装置からの拡散は、当該技術分野において公知である。組成物は、単回のボーラス、複数回の注射、または持続的な点滴（例えば静脈内への）によって投与されてよい。非経口投与のために、組成物は、好ましくは無菌で発熱物質を含まない形に処方される。
【００７６】
幾つかの実施形態によれば、組成物またはワクチンは、肺への送達によって投与される。組成物またはワクチンは、吸入する間に哺乳類の肺へ送達され、肺上皮の内面から血流へと横断する［例えば、Ａｄｊｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０；７：５６５ ５６９；Ａｄｊｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １９９０；６３：１３５ １４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９８９；１３（ｓｕｐ５）：１４３ １４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，ｐｐ．２０６ ２１２（αｌアンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９；８４：１１４５−１１４６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，１９９０；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組み換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；１４０：３４８２ ３４８８（インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子α）；およびＰｌａｔｚ，ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を参照されたい。全身性の効果のための、薬物の肺への送達についての方法および組成物については、Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，４５１，５６９号に記載される。Ｌｉｃａｌｓｉ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，６５１，６５５号も参照されたい。
【００７７】
本発明の実行における使用が意図されるものは、治療上の産物を肺へ送達するために設計された広範な機械装置であり、全てが当業者に公知である噴霧器、定量吸入器、および散剤吸入器が含まれるが、これらに限定されない。本発明の実行に適した市販装置の幾つかの特定の例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．，セントルイス、ミズーリ州）；Ａｃｏｒｎ ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，イングルウッド、コロラド州）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，リサーチ・トライアングル・パーク、ノースカロライナ州）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ散剤吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，ベッドフォード、マサチューセッツ州）である。これらの装置は全て、治療薬の分配に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は用いる装置の型に特異的であり、治療法に有用な通常の希釈剤、補助剤、界面活性剤、および／または担体に加えて、適切な噴霧剤物質の使用が含まれ得る。また、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接体、またはその他の型の担体の使用も意図される。
【００７８】
一般に、定量吸入装置による使用のための製剤は、界面活性剤の補助によって噴霧剤中に懸濁された治療薬を含む、微粉化した散剤を含んでなり得る。噴霧剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、もしくはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはそれらの組み合わせのような、この目的のために用いられる従来の物質のいずれであってもよい。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸もまた界面活性剤として有用である。
【００７９】
散剤吸入装置から分配するための製剤は、治療薬を含み、かつ乳糖、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールのような増量剤を、装置からの散剤の分散を促進する量、例えば製剤の５０〜９０重量％において含み得る、微粉化した乾燥散剤を含んでなってよい。治療薬は、最も有利には、肺の遠位へ最も効果的に送達するため、平均粒径が１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５ｍｍである、粒状の形に調製されなけらばならない。
【００８０】
治療薬の経鼻またはその他の粘膜送達もまた意図される。経鼻送達により、組成物の鼻への投与後、産物の肺における沈着を必要とせずに血流への直接の通過が可能となる。経鼻送達のための製剤には、補助剤としてデキストランまたはシクロデキストランおよびサポニンを含むものが含まれる。
【００８１】
本発明の組成物またはワクチンは、１以上の追加の有効成分、医薬組成物、またはワクチンと併用して投与され得る。本発明の治療薬は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトへ投与され得る。
【００８２】
持続放出系：第１の持続放出系には、薬剤が、薬剤の水性環境（すなわち消化管液）への放出を遅延させる別の物質のマトリックス内に包埋または分散される、マトリックス系が含まれる。薬剤がこの種のマトリックス内に分散されると、主にマトリックス表面から薬物の放出が起こる。従って、薬物はマトリックスを組み入れた装置の表面から、薬物がマトリックスを通して拡散した後か、または該装置の表面が浸食されて薬物が曝露されたときに放出される。幾つかの実施形態によれば、両機構は同時に作動させることができる。マトリックス系は大きな、すなわち錠剤のサイズ（約１ｃｍ）であるか、または小さい（＜０．３ｃｍ）サイズであってよい。この系は単一（例えばボーラス）であってよいか、実質的に同時に投与される幾つかのサブユニット（例えば単一用量を構成する幾つかのカプセル）からの構成によって分割されてよいか、または多粒子とも表される複数の粒子を含んでなってよい。多粒子は多くの製剤へ応用できる。例えば多粒子は、カプセル殻に満たされた散剤として用いてよいか、または摂取を容易にするため、それ自体を食物に混合して用いてもよい。
【００８３】
特定の実施形態によれば、マトリックス多粒子は薬剤を含む複数の粒子を含んでなり、各粒子は、薬剤および／またはその類似体を、例えば薬剤の水性溶媒中への溶解率を制御できるマトリックスを形成するために選択される１以上の賦形剤と共に固溶体／分散剤の形で含んでなってよい。この実施形態に有用なマトリックス物質は、一般にワックス、幾つかのセルロース誘導体、またはその他の疎水性ポリマーのような疎水性物質である。必要に応じ、マトリックス物質は任意に、結合剤または賦活薬として使用できる疎水性物質と共に処方されてもよい。これらの剤形の製造に有用なマトリックス材料は、エチルセルロース、パラフィン、加工植物油、カルナウバろう、水素化ヒマシ油、蜜ろうなどのようなワックス、およびポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、酢酸ビニルとエチレンの共重合体、ポリスチレンなどのような合成ポリマーである。マトリックス内へ任意に処方できる水溶性もしくは親水性の結合剤または放出改変剤には、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリジノン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、キサンタンガム、カラギーナンのような親水性ポリマー、ならびにその他のこのような天然および合成の材料が含まれる。加えて、放出改変剤として作用する物質には、糖類または塩類のような水溶性物質が含まれる。好ましい水溶性物質には、乳糖、ショ糖、グルコース、およびマンニトール、ならびに例えばＨＰＣ、ＨＰＭＣ、およびＰＶＰのような親水性ポリマーが含まれる。
【００８４】
特定の実施形態によれば、多粒子産物は制御された凝集によって処理されたものとして定義される。この場合薬剤は、適切で溶解可能な担体に溶解されるかまたは部分的に溶解され、マトリックス物質を含んでなる担体粒子上にスプレーされる。
【００８５】
用量：ここに開示される主題の組成物の有効用量が、被験体の必要に応じて被験体に投与される。「処置の有効量」または「治療的な量」は、測定可能な応答（例えば、処置される被験体における生物学的または臨床的な関連応答）を生み出すために十分な治療用組成物の量である。ここに開示される主題の組成物における有効成分の実際の投薬量レベルは、特定の被験体に対して望ましい治療上の応答を達成するために有効な単数または複数の有効化合物量を投与するために変動し得る。選択される投薬量レベルは、治療用組成物の活性、投与経路、その他の薬物または処置との併用、処置される状態の重症度、ならびに処置される被験体の状態および事前の病歴に依存し得る。しかしながら、化合物の用量を、望ましい治療上の効果の達成に必要とされるよりも低いレベルから開始し、望ましい効果が達成されるまで投薬量を次第に増大させることは、当該技術分野における技術の範囲内である。組成物の効力は様々であり得ることから、「処置効果の量」も様々であり得る。しかしながら本明細書に記載されるアッセイ法を用いることにより、当業者はここに開示される主題の候補となる化合物の効力および有効性を容易に評価し、それに従って最適投薬方式を調整することができる。
【００８６】
本明細書に提示される、ここに開示される主題の開示を再検討した後、当業者は、特定の製剤、組成物に用いられる投与方法、および処置される特定の疾病を考慮して、個別の被験体に対する投薬量を調整することができる。用量のさらなる算出には、被験体の身長および体重、症状の重症度および段階、ならびにさらなる有害な健康状態の存在が考慮され得る。このような調整または変動、およびこのような調整または変動をいつどのように行うかについての評価は、医学分野における当業者に公知である。
【００８７】
上に本発明の様々な実施形態を記載したが、これらは例としてのみ提示したものであって、限定ではないことが理解されなければならない。開示される実施形態には、本明細書における開示に従って、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多くの変更が為され得る。従って本発明の広さおよび範囲は、上記実施形態のいずれによっても限定されてはならない。
【００８８】
本明細書において言及する全ての文書は、参照により本明細書に取り込まれる。本出願に引用する全ての出版物および特許文書は、あらゆる目的のために、あたかも個々の出版物および特許文書それぞれが個別に表示されたかのように、同程度まで参照により取り込まれる。本文書内の様々な参考文献におけるそれらの引用によって、出願者は特定の参考文献のいずれも、それらの発明に対する「先行技術」であるとは認めない。発明組成物の実施形態および方法を、以下の実施例において例証する。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下の限定されない実施例は、選択された本発明の実施形態の例証に役立つものである。表示される、割合における変動および成分要素の代替物は当業者に明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることが認識されるであろう。
【実施例１】
【００９０】
ＴＮＦＲＳＦ２５によるＩｎ Ｖｉｖｏでの治療用Ｔｒｅｇの増殖は、アレルギー性の肺炎症を阻止する。
腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）は、リンパ系および非リンパ系細胞の両方に差次的に発現する少なくとも１９のリガンドおよび３０の受容体（ＴＮＦＲＳＦ）からなる。ＣＤ３＋Ｔ細胞において、ＴＮＦＳＦシグナルは、極性化、増殖、エフェクター機能、減少、メモリー、および細胞死を含む免疫応答の様々な段階を支持するために、通常はＴＣＲ依存性の方法で機能する。ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３、以下ＴＮＦＲ２５と称する）は、ごく最近発見されたＴＮＦＳＦメンバーの一つであり、主にＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴならびにナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に発現する（Ｆａｎｇ，Ｌ．，Ａｄｋｉｎｓ，Ｂ．，Ｄｅｙｅｖ，Ｖ．，ａｎｄ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０３７−１０４８）。ＴＮＦＲ２５のリガンドであるＴＮＦＳＦ１（ＴＬ１Ａ）は一部の内皮細胞に発現し、ＴＬＲ４またはＦｃγＲのシグナル伝達に従って樹状細胞およびマクロファージ／単球上に迅速に誘導される（Ｍｅｙｌａｎ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９：７９−８９；Ｐｒｅｈｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：４０３３−４０３８）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験により、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはナチュラルキラーＴ細胞におけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達が、ＴＣＲの活性化またはＩＬ−１２およびＩＬ−１８による共刺激に続いて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＦＮγの産生を増大することが示された（Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：４９８５−４９９０）。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達はまた、ＩＬ−２依存性の機構による、ＣＤ２８の共刺激なしのＴＣＲによる増殖に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の閾値も低くする（Ｍｅｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｍｉｇｏｎｅ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：４７９−４９２）。
【００９１】
ＴＬ１ＡによるＴＮＦＲ２５の活性化は、実験的喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における病態を悪化させる（Ｐａｐｐｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０４９−１０６２）。これらの各研究で、ＴＮＦＲ２５は抗原依存性にＴｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７の極性化を刺激し、かつＴＣＲにより活性化されたエフェクターＴ細胞は、各Ｔヘルパーサブセットからの関連するエフェクターサイトカインの産生を増大させる。ＴＮＦＲ２５のシグナルは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７系統への分化には必用とされない。これらの報告のいくつかにおいて、ＴＮＦＲ２５またはＴＬ１Ａ遺伝子を除去されたマウスモデル（Ｐａｐｐｕ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔａｋｅｄａｔｓｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５：５５２−５６７．Ｂｕｌｌ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：２４５７−２４６４）、ドミナントネガティブＴＮＦＲ２５を発現するトランスジェニックマウスモデル、または抗体によるＴＬ１Ａの全身性の遮断が研究された。ＴＬ１ＡもしくはＴＮＦＲ２５を欠損したマウスモデルまたはＴＬ１ＡからＴＮＦＲ２５への正常なシグナル伝達が阻害される自己攻撃性疾患（ａｕｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）モデルにおいて、免疫異常または疾病感受性は観察されなかった。さらにこれらの各報告において、ＴＮＦＲ２５またはＴＬ１Ａの発現は、動物にとってＴＮＦＲ２５またはＴＬ１Ａが存在しないことよりもさらに有害であると思われる、炎症誘発性の表現型を生み出す。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）がＴＮＦＲ２５を発現し得るにもかかわらず（Ｐａｐｐｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０４９−１０６２）、今日までＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５の役割について試験したという報告はない。致死的な自己免疫の防止におけるＴｒｅｇの重要性、ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の発現、および複数の自己攻撃性疾患（ａｕｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）モデルの病因におけるＴＮＦＲ２５の機能を考え、本発明者らは、Ｔｒｅｇの機能におけるＴＮＦＲ２５の役割について研究することを決定した。この研究により、ＴＮＦＲ２５は、従来のＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）によってではなく、Ｔｒｅｇによって高度に発現することが明らかになった。外来性抗原の非存在下で、アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２を用いてｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ２５を刺激すると、４Ｃ１２による処置後４日以内に、Ｔｃｏｎｖではなく天然型Ｔｒｅｇが、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の３０〜３５％まで迅速かつ選択的に増殖し、これはＴＣＲのＭＨＣＩＩとの会合およびＩＬ−２シグナル伝達に依存する。ＴＮＦＲ２５によるＴｒｅｇの増殖は、気道からの抗原曝露による肺炎症から感作マウスを保護する。これらのデータにより、Ｔｒｅｇの制御因子としての、ＴＮＦＲ２５の新規な役割が示される。この役割により、アレルギー性喘息の病因から保護され得る。さらに、ヒトにおけるＴｒｅｇを用いた治療法の臨床における使用を促進するために、ＴＮＦＲ２５アゴニストによるｉｎ ｖｉｖｏでの天然型Ｔｒｅｇの増殖によって、ＩＬ−２またはｅｘ ｖｉｖｏに基づくアプローチの代替法としての、臨床応用可能な方法が提供され得る。
【００９２】
材料および方法：
マウス：野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入した。Ｂ６バックグラウンドのＦｏｘｐ３−ＲＦＰレポーターマウス（Ｗａｎ，Ｙ．Ｙ．，ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．２００５．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：５１２６−５１３１））、ＦｏｘＰ３−ＧＦＰ（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：３２９−３４１；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｇａｖｉｎ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．２００３．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：３３０−３３６）、ならびにＣＤ４５．１ ＳＪＬ、ＭＨＣ ＩＩ−／−、ＩＬ−２受容体ベータ変異体、ＣＤ８０／８６−／−、およびＣＤ４−／−マウスは、発明者らの動物施設で繁殖させた。ＴＬ１Ａ−／−マウスはＬｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（ウッドランド、テキサス州）から購入し、Ｓｐｅｅｄ ＣｏｎｇｅｎｉｃｓによってＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドへ戻し交配した。マウスは６〜１２週齢で使用し、ＵＭ動物施設において、病原体のない状態で維持した。全ての動物の使用手順は、マイアミ大学動物実験委員会によって承認された。
【００９３】
抗体および試薬。フローサイトメトリーに使用するための市販の抗体は、ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。アルメニアンハムスターＩｇＧアイソタイプコントロールは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＤＴＡ−１（α−ＧＩＴＲ）はＢｉｏＸＣｅｌｌから、ＬＧ．３Ａ１０（α−ｌＬ−２７）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから、および１５８３２１（α−４−１ＢＢ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。組み換えマウスＩＬ−２、および抗ＩＬ−２モノクローナル抗体であるクローンＪＥＳ６−１Ａ１２は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。組み換えマウスＩＬ−２／抗ＩＬ−２複合体（ＩＡＣ）は、１０，０００単位のｒｍＩＬ−２を、５μｇのＪＥＳ６−１Ａ１２と共に１５分間２５℃にてインキュベートすることにより産生した。マウスＴＮＦＲ２５に対する抗体（４Ｃ１２、アゴニスト）を産生するアルメニアンハムスターハイブリドーマは、以前に記載されるように産生した（Ｆａｎｇ，Ｌ．，Ａｄｋｉｎｓ，Ｂ．，Ｄｅｙｅｖ，Ｖ．，ａｎｄ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０３７−１０４８）。４Ｃ１２（α−ＴＮＦＲ２５）およびＯＸ−８６（α−ＯＸ４０）は、ホローファイバーバイオリアクター（Ｆｉｂｅｒｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、フレデリック、メリーランド州）内で産生し、無血清の上清からプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）によって精製した。ラパマイシン（ラパミューン、Ｗｙｅｔｈ）は、以前に記載されるように（Ａｒａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ ４６０：１０８−１１２．）、７５μｇ／ｋｇ／日において使用した。シクロスポリンＡ（２５ｍｇ／ｋｇ／日）、ＦＫ５０６（３ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＡｋｔ阻害剤Ｖ（Ｔｒｉｃｉｒｂｉｎｅ、指示されるように、１．５ｍｇ／ｋｇ／日、または１日２回）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤから購入し、腹腔内注射により投与した。
【００９４】
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング：脾臓およびリンパ球から単一細胞懸濁液を調製した。１０６個の細胞を抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２によってプレブロックし、異なる抗体の組み合わせによって染色した。標準的な手順に従い、細胞内染色を行った。フローサイトメトリー分析は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ装置およびＤＩＶＡまたはＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアにより行った。細胞ソーティングは、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されるＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ Ｐｒｅ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔを用いて脾細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ）により行った。
【００９５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：急速冷凍した大腸または肺組織切片から全ＲＮＡを抽出し、ＱＩＡＧＥＮから市販されるＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＫｉｔおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔをそれぞれ用いて逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されるＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＡＢＩ ７３００ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒにより、リアルタイムＰＣＲを二重に行った。サンプルはβアクチンに対して標準化した。
【００９６】
養子移入。図２Ａおよび２Ｂの研究のため、ＦＩＲマウスから全ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳソーティングし、ソーティング後にＦｏｘＰ３＋ＲＦＰ＋細胞のパーセンテージを決定した。−２日目に、１０６個のＦｏｘＰ３＋細胞を含む全ＣＤ４＋細胞を、ＭＨＣＩＩ−／−またはＣＤ４−／−マウスへ養子移入（ｉ．ｖ．）した。０日目に、マウスを４Ｃ１２抗体またはアイソタイプコントロールによって処置した。図１１Ａ〜１１Ｅの研究のため、ＣＤ４５．２＋ＦＩＲマウスからＦＡＣＳソーティングした２×１０６個のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を、静脈内注射を通してＣＤ４５．１コンジェニックＳＪＬマウスに養子移入した。１日後、１０μｇの４Ｃ１２を腹腔内注射によって投与した。末梢血液細胞中の移入細胞の増殖を、ＦＡＣＳにより毎日（３日後に開始）追跡した。
【００９７】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイ：１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を９６ウェル丸底プレートにまき、ＡＰＣ（比率１：１）および異なる比率のＣＤ４＋ＦＩＲ＋制御性Ｔ細胞の存在または非存在下に、２μｇの可溶性抗ＣＤ３（２Ｃ１１）抗体によって活性化した。表示するように、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ、４Ｃ１２、ＤＴＡ１抗体を添加した。７２時間培養し、最後の６時間を３Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によってパルスした。取り込まれた同位元素を、液体シンチレーション計数（Ｍｉｃｒｏ Ｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって測定した。
【００９８】
アレルギー性喘息の誘導：０日目に、２００μｌのＰＢＳ中の、６．６ｍｇのミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム塩；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に吸収させた６６μｇの卵白アルブミン（結晶化鶏卵アルブミン、グレードＶ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）のｉ．ｐ．注射によってマウスを感作し、５日目にブーストした。１２日目に、２００μｌのＰＢＳ中の、２０μｇの抗ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体（４Ｃ１２）または２０μｇのヤギ抗ハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，ウェストグローブ、ペンシルベニア州）を、マウスにｉ．ｐ．注射した。１６日目に、ＢＡＮＧ噴霧器（ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウェストウッド、ニュージャージー州）をＪａｅｇｅｒ−ＮＹＵ Ｎｏｓｅ−Ｏｎｌｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ−Ｆｌｏｗ Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で用いることにより、マウスをＰＢＳ中の０．５％卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に１時間エアロゾル曝露した。１９日目にマウスを屠殺し、ＰＢＳで灌流した肺、および気管支肺胞洗浄液を得た。ＲＮＡ、またはフローサイトメトリー分析のために肺ホモジネートから調製される単一細胞懸濁液、または肺組織検査のために肺葉を処理した。続くＲＮＡ分析およびフローサイトメトリー分析のために、気管支の流入領域リンパ節もまた調達した。ＭａｃＢｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いた色調解析（Ｈ ＰＡＳベクターを用いる）およびそれに続く画像の閾値設定（カラー［２］、１００に設定）により、ならびに核計数器（限界を１００〜１０００に設定）を用いた計数により、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した肺切片の定量化を行った。
【００９９】
統計解析：全てのグラフ化および統計解析はＡＢｌ Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて行った。対の分析はスチューデントＴ検定を用いて行った。複数の変数分析は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびチューキー事後検定を用いて行った。有意性は、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、および＊＊＊（ｐ＜０．００１）として示す。
【０１００】
結果
ＴＮＦＲ２５は制御性Ｔ細胞によって高度に発現する：この研究よりも前に、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるＴＮＦＲ２５の機能について示した報告はない。ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の発現の有無を確認するため、ＦｏｘＰ３レポーターマウスからＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋（Ｔｃｏｎｖ）およびＴｒｅｇを、９９％を超える純度で単一細胞ソーティングし、続いてＴＮＦＲ２５、ならびにＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、および４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ１３７）の発現をフローサイトメトリーにより分析した。ＦｏｘＰ３プロモーターに基づくバイシストロニックコンストラクトからの赤色蛍光タンパク質ノックイン導入遺伝子を発現するＦｏｘＰ３レポーターマウス（ＦＩＲマウス）の使用により、Ｔｒｅｇ生細胞のソーティングが可能となった。この分析により、ＴＮＦＲ２５、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および４−１ＢＢは全てＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖによって発現するが、Ｔｃｏｎｖによる低い発現に比較して、ＴｒｅｇではＴＮＦＲ２５の非常に高い発現が観察されたことにより、発現レベルにおける最も大きな相対的相違が観察されたことが明らかになった（図１Ａ）。理論に制約されるものではないが、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖの間の差次的なＴＮＦＲ２５の発現により、ＴＮＦＲ２５がＴｒｅｇの機能において重要な役割を果たし得ることが示された。
【０１０１】
ＴＮＦＲ２５の刺激はＴｒｅｇをＩｎ Ｖｉｖｏで迅速に増殖させる：ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の産生については以前に記載している（Ｆａｎｇ，Ｌ．，Ａｄｋｉｎｓ，Ｂ．，Ｄｅｙｅｖ，Ｖ．，ａｎｄ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０３７−１０４８）。ＦＩＲマウスを使用して、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体である４Ｃ１２で処置した後、末梢血におけるＴｒｅｇ集団の頻度および表現型を連続的にモニターした。４Ｃ１２の腹腔内（ｉ．ｐ）注射により、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏにおける迅速で高い再現性のある増殖が誘導された（図１Ｂ）。この増殖は４Ｃ１２注射後４日目および５日目に最大となり、応答のピーク時の末梢血では、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇが全ＣＤ４＋Ｔ細胞の３０〜３５％を含んでなっていた。４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇは、末梢血中、および試験した全ての組織部位で２週間持続したが、ゆっくりと無刺激のレベルまで減少した。４Ｃ１２を腹腔内、皮下、または静脈内注射した後のＴｒｅｇの増殖は同等であることが示されたことから、注射部位はこの増殖に影響しなかった。４Ｃ１２注射後のＴｒｅｇの増殖は用量依存性であり、おおよそ０．４ｍｇ／ｋｇ体重に相当する、わずかに１０μｇの用量によって最大の応答が観察された（図１Ｂ）。ＦＩＲマウスを精製マウスＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合タンパク質（１００μｇ）で処置することにより、４Ｃ１２抗体による処置と同様の規模および動態で、Ｔｒｅｇの増殖が誘導されることが見出された。ＦＩＲマウスにおけるＲＦＰ発現の検出は、ＦｏｘＰ３の転写が存在することを正確に表しているが、ＦｏｘＰ３とＲＦＰはＦｏｘＰ３−ＲＦＰ転写物から独立して翻訳されるため、これによってＦｏｘＰ３タンパク質の発現は保証されない可能性がある。従って、４Ｃ１２投与後のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖は、野生型マウスにおけるＦｏｘＰ３抗体を用いた染色によって、およびＦｏｘＰ３−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＦｏｘＰ３−ＧＦＰノックインレポーターマウスにおいて確認された。
【０１０２】
Ｔｒｅｇが発現するＴＮＦＲメンバーのうち、ＴＮＦＲ２５はＴｒｅｇの増殖を引き起こすことにおいて独特である：ＴＮＦＲＳＦメンバーであるＧＩＴＲおよびＯＸ４０はＴｒｅｇによって発現し（図１Ａ）、Ｔｒｅｇの活性および増殖に効果を及ぼす。４−１ＢＢによるＴｒｅｇの刺激により、これらの細胞の活性および増殖の両方を調節できると考えられる。さらに、ＴＮＦＲＳＦメンバーのＣＤ２７を介したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞の刺激により、ＦｏｘＰ３の発現が誘導されると考えられる。ＴＮＦＲ２５とこれらその他のＴＮＦＳＦメンバーとの間での、機能的抑制またはＴｒｅｇの誘導いずれかの重複を考え、ＴＮＦＲ２５、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、またはＣＤ２７で刺激した後に、Ｔｒｅｇの増殖をｉｎ ｖｉｖｏで比較した。全ての例で、特異的なシグナル伝達を引き起こすために、各受容体に対する十分に特徴付けられたアゴニストモノクローナル抗体を用いた。これらの研究により、試験したＴＮＦＲＳＦの中でもＴＮＦＲ２５は、Ｔｒｅｇの増殖を選択的に誘導するその能力によって独特であることが示された（図１Ｃ）。最近、ＯＸ４０により誘導されるＴｒｅｇの増殖には、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＦＮγの枯渇が必要であったことが報告された（Ｒｕｂｙ，ＣＥ．，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３：４８５３−４８５７）。対照的に、ＴＮＦＲ２５により誘導されるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖には、さらなる操作は必要とされなかった。
【０１０３】
ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩおよびＩＬ−２のシグナルが必要とされる：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｔｒｅｇの増殖は、ＴＣＲ刺激性の抗体、抗原提示細胞、およびＩＬ−２シグナルの様々な組み合わせによって誘導できる。これらの研究では、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体の存在下または非存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体、組み換えＩＬ−２、ＴＧＦ−β、およびレチノイン酸の多くの異なる組み合わせを用いてＴｒｅｇ増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導を試みたが、全ての例においてＴＮＦＲ２５の刺激はｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ増殖を増大させなかったことから、さらなるシグナルが必要であることが示唆された（表１）。
【０１０４】
表１：ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に対する要件を検討するために、様々な精製したリンパ球集団（表示される）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した条件。
【０１０５】
ＴＮＦＲ２５はＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲシグナルに対する応答性に影響を与え得ることから、次の実験は、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖がｉｎ ｖｉｖｏでのＴＣＲシグナル伝達に依存するか否かを決定するために行った。ＭＨＣＩＩ−／−またはＣＤ４−／−マウスに、ＦＩＲマウスから精製した１０６個のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を含む全ＣＤ４＋細胞を養子移入した。ＭＨＣＩＩ−／−マウスはＣＤ４＋Ｔ細胞を欠損していることから、ＣＤ４＋Ｔ細胞が欠損した環境への養子移入に続いて起こり得るいずれかの恒常性の増殖を制御するため、コントロール集団としてＣＤ４−／−マウスを用いることを決定した。養子移入後２日目に、マウスを４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体によって処置し、抗体注射後４日目および６日目にＴｒｅｇのパーセンテージおよび絶対数を決定した（図２Ａ、２Ｂ）。これらのデータにより、Ｔｒｅｇは野生型およびＣＤ４−／−マウスにおいて同程度まで増殖するが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩ分子が必要であることが示された。ＭＨＣＩＩ−／−マウスはＣＤ４−／−マウスのベースラインよりも多数のＣＤ４＋細胞を有することから、ＭＨＣＩＩ−／−マウスに養子移入されたＴｒｅｇのパーセンテージは、ＣＤ４−／−マウスよりも低いことが観察された（図２Ａ）。しかしながら、養子移入されたＴｒｅｇの絶対数の比較により（図２Ｂ）、２つの群で同等なＴｒｅｇの絶対数が回復したことが示唆される。これらの研究により、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩシグナルが必要であることが示され、このことはＴｃｏｎｖ細胞におけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達と同様、ＴｒｅｇがＴＮＦＲ２５のシグナル伝達に対して許容状態になるためにはＴＣＲシグナル伝達が必要であることが間接的に暗示される。ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にＴＣＲシグナルが必要であることのさらなる証拠を提供するため、マウスをシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６で前処置し、４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置に続いてＴｒｅｇの数を分析した（図２Ｃ、２Ｄ）。これらの研究により、ＭＨＣＩＩシグナルが存在しない場合に観察されたものと同様に；シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６の存在下で、ＴＮＦＲ２５はＴｒｅｇの増殖を誘導できないことが示される。ＭＨＣＩＩにおける同種自己抗原の必要性についてはさらなる研究を行っているが、このような必要性は、外来性抗原の非存在下でのＴＮＦＲ２５のＴｒｅｇ選択性についてのさらなる説明（ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５の選択的発現に加えて、図８Ａ〜８Ｃ）を提供し得る。
【０１０６】
ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達により、ＣＤ２８の共刺激の非存在下でＴＣＲシグナルに続いて起こるＩＬ−２シグナルに対する、Ｔｃｏｎｖの応答性は増大すると考えられる。ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩとＮＦＡＴ両方の活性化が必要であることを考え（図２Ａ〜２Ｄ）、ＩＬ−２またはＣＤ８０／８６のシグナルがさらに必要であるか否かについて決定した。非機能的なＩＬ−２受容体ベータ鎖を発現するマウス（図２Ｅ）およびＣＤ８０／８６−／−マウス（図２Ｆ）におけるＴｒｅｇの増殖を、４Ｃ１２の注射後４日目に決定した。これらのデータにより、ＴＮＦＲ２５により誘導されるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖にＴＣＲおよびＩＬ−２受容体のシグナル伝達は必要であるが、ＣＤ８０またはＣＤ８６の共刺激は必要でないことが示される。理論に制約されるものではないが、ＴｒｅｇにおけるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のシグナル伝達は、ＴＮＦＲ２５により誘導される増殖には必要でない可能性がある。さらに、ＴＮＦＲ２５、ＴＣＲの刺激、およびＩＬ−２シグナル伝達の組み合わせがｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇの増殖を誘導できなかったことから、研究中のさらなるシグナルが必要とされる。
【０１０７】
ＴＮＦＲ２５により刺激されたＴｒｅｇは、Ｅｘ ＶｉｖｏでＩＬ−２により誘導される増殖に対して高応答性である：ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要なものについてはさらなる研究が必要であるが、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体によって処置したマウスから精製したＴｒｅｇは、ｅｘ ｖｉｖｏでのＩＬ−２により誘導される増殖に対して高応答性であることが観察された（図３Ａ）。これらのデータは、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖におけるＩＬ−２シグナルの重要性を実証し（図２Ｅ）、ＴＮＦＲ２５は、ＩＬ−２に対するＴｒｅｇの感受性に影響することによってＴｒｅｇの増殖を誘導することを示唆するものである。この観察を説明し得る、幾つかの可能性のある機構が想像される：１）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてＩＬ−２受容体サブユニットの発現を増大し得る、２）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてＳＴＡＴ５の活性化を増大し得る、３）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてｍＴＯＲの活性化を増大し得る、および４）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔの活性化を増大し得る。ＩＬ−２受容体アルファ、ベータ、およびガンマ鎖の発現を判定するため、４Ｃ１２抗体による処置後にｉｎ ｖｉｖｏで増殖するＴｒｅｇについてフローサイトメトリーを行い、ＩｇＧコントロール抗体によって処置したマウスから分離したＴｒｅｇと比較した（図３Ｂ）。これらのデータにより、ＩＬ−２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）は、４Ｃ１２への曝露後に実際に減少したが（図７Ａ）、ベータおよびガンマ鎖（それぞれＣＤ１２２およびＣＤ１３２）については、４Ｃ１２およびアイソタイプコントロール抗体により処置したマウスから分離したＴｒｅｇにおいて変化は見られなかったことが示され（図３Ｂ）、選択肢（１）の可能性は事実上除外された。ＳＴＡＴ５のリン酸化が、４Ｃ１２により処置したマウスにおいて増大するか否かを判定するため、予め４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体によって４日間処置したマウスからＴｒｅｇを分離し、ｅｘ ｖｉｖｏでＩＬ−２に曝露した（１０ｎｇ／ｍｌ、１５分）。続いてこれらのＴｒｅｇをリン酸特異的な抗体で染色することにより、４Ｃ１２で処置したマウスから分離したＴｒｅｇでは、コントロールマウスに比較して、ＳＴＡＴ５またはＳ６どちらのリン酸化も増大しなかったことが示され、第２の可能性は事実上除外された（図３Ｃ）。続いて、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ２５により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、ｍＴＯＲの阻害剤であるラパマイシンの存在下で変化しなかったことが見出され、第３の可能性は除外された（図３Ｄ）。最後に、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にＡｋｔのシグナル伝達が必要であるか否かを判定するため、Ａｋｔ１／２／３の選択的阻害剤であるトリシリビン（Ａｋｔ阻害剤Ｖ、ＡｋｔｉＶ）の存在下または非存在下で、マウスをＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体またはコントロール抗体によって処置した。これらの研究により、Ａｋｔ活性化の選択的阻害はＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖の阻害に十分であることが示され、これはビヒクル処置コントロールの３３．６９±１．２５３％から、、ＡｋｔｉＶによる１日１回の処置では２２．４３±１．３５２％（Ｎ＝６）（データ未提示、ｐ＜０．００１）、ＡｋｔｉＶによる１日２回の処置では１８．２０±２．１１７％（Ｎ＝３）（図３Ｅ、ｐ＝０．０００３）となった。
【０１０８】
抗原未処置マウスにおける、ＴＮＦＲ２５またはＩＬ−２抗体複合体により誘導されたＴｒｅｇの増殖の比較：ｉｎ ｖｉｖｏで選択的にＴｒｅｇを増殖させる唯一のその他の薬剤が、組み換えＩＬ−２および特異的な抗ＩＬ−２抗体であるクローンＪＥＳ６−１Ａ１２との複合体（ＩＡＣ）の使用を通し、Ｂｏｙｍａｎらにより報告された（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１：１９２４−１９２７，２００６）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖を、４Ｃ１２またはＩＡＣのいずれかによる処置後に直接比較した（図７Ａ）。この分析により、ｉｎ ｖｉｖｏでの４Ｃ１２またはＩＡＣによる処置後の、Ｔｒｅｇ増殖の規模および動態は同様であったことが示された。しかしながら、４Ｃ１２による処置後に増殖したＴｒｅｇの減少は、ＩＡＣに比較して長引くことが観察された。ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇが中程度のＣＤ２５を発現するのとは対照的に、ＩＡＣにより増殖したＴｒｅｇは高レベルのＣＤ２５を発現することが観察された（図７Ｂ）。４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇとＩＡＣにより増殖したＴｒｅｇの比較により、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、細胞内もしくは細胞外ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＩＬ−１７Ａ、またはＩＦＮγの発現にその他の相違は見出されなかった。
【０１０９】
ＴＮＦＲ２５によるＩｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖は、アレルギー性の肺炎症を軽減する：４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇが疾病モデルにおける炎症を阻止するか否かを判定するため、マウスを卵白アルブミン／ミョウバンでプライムし、次に気道を卵白アルブミンへ曝露することで誘導された、アレルギー性肺炎症の十分に特徴付けられたモデルにおける炎症を、この処置が軽減し得るか否かについて試験した。０日目および５日目にマウスを卵白アルブミン／ミョウバンでプライムし、次いで１２日目に４Ｃ１２またはハムスターＩｇＧによって処置した。４日後、Ｔｒｅｇ増殖の最大時に、気道をＰＢＳ中でエアロゾル化した卵白アルブミンまたはＰＢＳ生理食塩水コントロールに曝露した。この期間に、末梢血中のＴｒｅｇをモニターすることによってＴｒｅｇの最大増殖を確認した（図４Ａ）。卵白アルブミン／ミョウバン感作後に４Ｃ１２により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、最初の２日間は非感作マウスに比較してわずかに遅延したが、４日目までにＴｒｅｇは全ＣＤ４＋Ｔ細胞の高い割合（５０〜５５％）まで迅速に増殖した（図４Ｂ、４Ｃ）。エアロゾル曝露から３日後、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、気管支リンパ節（ｂＬＮ）、および肺組織を分析した。
【０１１０】
コントロールまたは４Ｃ１２で処置した動物の間で、肺から分離した細胞の総数に変化はなかった。この観察に一致して、肺内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、コントロールと４Ｃ１２で処置したマウスの間で同様であったが、４Ｃ１２により処置したマウスではＴｒｅｇの数が著しく増加していた（図４Ｂ）。肺組織内におけるＴｒｅｇの構成の分析により、４Ｃ１２投与から７日後の（およびエアロゾル曝露から３日後の）肺におけるＴｒｅｇの頻度はなお全ＣＤ４＋Ｔ細胞の５５％であったが、これに比較してハムスターＩｇＧで処置したマウスでは２２％であることが明らかになった（図４Ｃ）。Ｔｃｏｎｖ対Ｔｒｅｇのバランスは、単なるＴｒｅｇの総数よりも良好に疾病の病因を予測することが報告されている（Ｔａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２８：６８７−６９７；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８１：５８９５−５９０３）；肺組織におけるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｔｃｏｎｖ）対Ｔｒｅｇの比を決定した（表２）。肺浸潤Ｔｒｅｇの表現型が、疾病のないマウスにおいてＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇの表現型と一致することを確認するために、肺浸潤Ｔｒｅｇを分析し、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ６９の発現について、ＩｇＧで処置したマウスから分離した肺浸潤Ｔｒｅｇと区別できないことが見出された。
【０１１１】
表２：図１０Ａ〜１０Ｅに記載するように収集した全肺細胞からの、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｔｃｏｎｖ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）の総数、およびＴｃｏｎｖ対Ｔｒｅｇ細胞の比を示す。細胞数は、左肺の単一細胞懸濁液中で得られた細胞数に、ｘフローサイトメトリーによって分析した全細胞のうちのリンパ系ゲートをかけた細胞のパーセンテージｘリンパ系ゲートをかけた細胞集団内のＴｃｏｎｖまたはＴｒｅｇ細胞のパーセンテージを掛けることによって算出した。
【０１１２】
肺組織細胞の分析に一致して、ＢＡＬＦから分離した細胞の総数は、卵白アルブミンを含むエアロゾルへの曝露後に有意に増加したが、生理食塩水のエアロゾルコントロールでは全ての条件で増加せず、４Ｃ１２処置によっては顕著に減少した。ＢＡＬＦ中の好酸球の総数は、ＢＡＬＦ細胞の総数をおおざっぱに反映しており、４Ｃ１２による前処置によって気道好酸球増多症の重症度は有意に低下することが観察された（図４Ｄ）。
【０１１３】
炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３は、アレルギー性肺炎症の病因に大きく関与している。これらのサイトカインの発現が４Ｃ１２による前処置によって減少するか否かを決定するため、エアロゾル曝露から３日後に急速冷凍した肺から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。この分析により、生理食塩水のエアロゾル化コントロールに比較して、肺浸潤ＣＤ４＋細胞の中でのＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現は、４Ｃ１２による処置後に有意に減少するが、アイソタイプコントロール抗体による処置後では上昇したままであることが示された（図４Ｅ）。追加のコントロールとしてＦｏｘＰ３ＲＮＡの発現レベルを分析すると、フローサイトメトリーで観察されたＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞と同様の相対的割合を反映していた（図４Ｃと４Ｅを比較されたい）。肺組織検査によると、生理食塩水のエアロゾル化コントロールに比較して、４Ｃ１２による処置後にはリンパ球浸潤の減少および気道からの粘液産生が示され、これらの知見が確認された（図４Ｆ、および図４Ｇで定量化した）。
【０１１４】
ＴＮＦＲ２５は、Ｔｃｏｎｖを活性化または増殖させることなくＴｒｅｇを増殖させる：４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇの表現型を決定するため、本発明者らは、４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロールを注射したマウスの末梢リンパ節、腸間膜リンパ節、および脾臓から分離したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を分析した。４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇは、主にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（ｉｎｔ）細胞であり、これは分析した全ての二次リンパ器官で増殖したことが見出された（図５Ａ、５Ｂ、および図８Ａ、８Ｄ）。４Ｃ１２による処置は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、細胞内もしくは細胞外ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＩＬ−１７Ａ、またはＩＦＮγのＴｒｅｇによる発現を変化させなかった。４Ｃ１２による処置後に全てのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞はＧＩＴＲ陽性のままであったが、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合は、４Ｃ１２による処置後にＣＤ２５ ｉｎｔサブセットに移行する傾向があった（図８Ｂ）。αＥβ７インテグリンは、ＣＤ２５陽性または陰性のいずれであってもよいＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋の高度に抑制性であるサブセットに発現する。ＣＤ１０３の発現の分析により、４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇではＣＤ１０３の発現が増大したが、コントロールＴｒｅｇでは増大しなかったことが明らかになった（図８Ｃ）。重要なことに、４Ｃ１２による処置後のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞およびＣＤ８＋細胞の分析により、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、これらのいずれの細胞集団の絶対数または割合も増大させないことが明らかになった。４Ｃ１２による処置が、非Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激したか否かを判定するため、これらの細胞を増殖マーカーであるＫｉ６７で染色した。この分析により、外来性抗原の非存在下での４Ｃ１２による処置は、ＴｃｏｎｖまたはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増大させないことが例証された。さらに、ＣＤ８＋細胞ならびにＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ６９の染色では、４Ｃ１２とＩｇＧにより処置されたマウスの間に相違はないことが明らかになった。従ってＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、外来性抗原の非存在下で、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の増殖もしくは活性化を誘導することなく、選択的にＴｒｅｇを増殖させる。
【０１１５】
ＴＮＦＲ２５の刺激は、ｉｎ ｖｉｖｏで天然型Ｔｒｅｇの増殖を誘導する：４Ｃ１２による処置後のＴｒｅｇの増加は、ＦｏｘＰ３のｄｅ ｎｏｖｏの発現またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖のいずれかよりもたらされ得る。これらの２つの可能性を区別するため、増殖マーカーであるＫｉ６７の、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞における発現を判定した（図５Ｃ、５Ｄ）。データがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｈｉ細胞に対するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の比率の増加を示すように、４Ｃ１２によって処置したマウスにおけるＫｉ６７＋細胞の大多数はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔであった。少ない割合（〜２７％）で、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞はＫｉ６７について染色されず（図５Ｃ、５Ｄ）、これらの細胞の大多数はＣＤ２５ｈｉであった。４Ｃ１２による処置後に観察されたＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖が、ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の選択的な刺激からもたらされたものであるか、またはＴｒｅｇが、増殖の間にＣＤ２５の発現が低下したにもかかわらず増殖刺激を受けたのかについては不明なままである。
【０１１６】
ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞による増殖の増大は、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞によるＦｏｘＰ３のｄｅ ｎｏｖｏの発現を刺激し得る可能性を決定的に除外するものではない。この可能性について試験するため、ＣＤ４５．２＋ＦＩＲマウス由来の高度に精製した（＞９９％純度）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を、ＣＤ４５．１コンジェニックＢ６／ＳＪＬマウスへ注入する養子移入実験を行った。これらの研究では、ＣＤ４５．１＋ホストにおける４Ｃ１２による処置後の、養子移入したＣＤ４５．２＋細胞の追跡、および養子移入したＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞によるＦｏｘＰ３−ＲＦＰの持続、誘導、またはサイレンシングのモニターが可能になった（図５Ｅ〜５Ｈ）。遺伝的または実験的に免疫不全の系統へ養子移入を行った後に、恒常的なＴｒｅｇの増殖によって発生し得るいずれの合併症も避けるため、これらの実験は、完全に免疫応答性のマウスにおいて行うことを計画的に選択した。免疫応答性のＣＤ４５．１＋レシピエントへの、選別した２×１０６個の細胞（図９Ａ）の移入は、養子移入後少なくとも２週間の末梢血において、まれではあるが容易に区別可能なＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞の集団を検出するために十分であった（図５Ｇ、５Ｈ）。養子移入後の、４Ｃ１２によるレシピエントマウスのＴＮＦＲ２５の刺激は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞によるＦｏｘＰ３のｄｅ ｎｏｖｏの発現を刺激せず（図５Ｅ）、これは４Ｃ１２によるか、またはコントロール抗体による処置かにかかわらず、０．５％の頻度で、ＦｏｘＰ３−ＲＦＰ−のままであった。２×１０６個の細胞を養子移入した後のＦｏｘＰ３＋ＲＦＰ＋細胞の頻度は、コントロール抗体で処置したマウス末梢血中ではＣＤ４細胞の０．０４％であり、４Ｃ１２で処置したマウスでは０．１１％に増加し（図５Ｆ）、ＦｏｘＰ３＋ＲＦＰ＋ＣＤ４５．２＋細胞は３倍の増加率であった。この結果は、移入していないマウスにおける、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体によるＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの増殖の程度に一致する（図１Ｂ）。このデータにより、４Ｃ１２による処置が、増殖後にＦｏｘＰ３の発現を維持するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖を選択的に刺激することが示された（図５Ｆ）。このデータにより、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は最初にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖を増大させ、これによりＴｒｅｇの全身性の増加がもたらされることが示された。これらの研究はまた、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞は４Ｃ１２による処置後のいかなる時点でも増殖しないが（図５Ｇ）、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖は、ＦＩＲマウスにおける内在性Ｔｒｅｇの増殖および減少と同様の動態に従うことも示した（図５Ｈと図１Ｂを比較されたい）。重要なことに、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞は、増殖中および増殖後の両方でＦｏｘＰ３の発現を維持したことから、増殖したＴｒｅｇプールにみられる減少はＦｏｘＰ３の発現低下よりもむしろ細胞死によるものであることが示唆される（図５Ｆ、５Ｈ）。実験を通したどの時点でも、養子移入したＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖プールがＦｏｘＰ３の発現を失う場合には、ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞の画分が増加し得るが、これは起こらなかった。実験を通して、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞の少ない割合（＜５％）がＦｏｘＰ３の発現を示し（図５Ｅ）、移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の少ない割合（＜５％）がＦｏｘＰ３の発現を失う（図５Ｆ）ことが観察された。ＦｏｘＰ３の発現におけるこのようにわずかな不安定性によって、これらの観察が説明されると思われる。
【０１１７】
ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇは、Ｅｘ Ｖｉｖｏで高度に抑制性である：４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇが抑制活性を保持しているか否かを判定するため、４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロール抗体による処置後４日目にＦＩＲマウスからＴｒｅｇ細胞を精製した（図８Ａ）。次にこれらのＴｒｅｇサブセットを従来の増殖アッセイに用いた。４Ｃ１２により処置したマウスから精製したＴｒｅｇは、アイソタイプコントロール抗体により処置したマウスからのものに比較して、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞の増殖をより大きく抑制した（図６Ａ〜６Ｄ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイにおいて、４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇによるＴｃｏｎｖの増殖の抑制は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下および非存在下の両方で観察された（図６Ａ対６Ｂ）。抑制アッセイ中の４Ｃ１２の添加がＴｒｅｇの抑制活性を調節するか否かを決定するため、記載するように（図６Ａ、６Ｂ）、４Ｃ１２、またはＴｃｏｎｖをＴｒｅｇにより仲介される抑制から解放することが知られているＧＩＴＲアゴニスト抗体（クローンＤＴＡ−１）、またはアイソタイプコントロール抗体の存在下で（図６Ｃ、６Ｄ）、同等のアッセイを行った。アゴニストＴＮＦＲ２５またはＧＩＴＲ抗体の存在により、Ｔｒｅｇが４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロールによって処置したマウスのどちらから得られたかにかかわらず、両方の抗体がＡＰＣの非存在下で同様の効果を生んだことにより、Ｔｃｏｎｖの増殖は部分的に回復した（図６Ｃ）。興味深いことに、ＡＰＣ、ＤＴＡ−１の存在下で誘導されたＴｃｏｎｖの増殖の程度は、４Ｃ１２で処置したマウスからのＴｒｅｇの存在下よりも、ＩｇＧアイソタイプコントロールで処置したマウスからのＴｒｅｇの存在下で大きかった（図６Ｄ）。ＡＰＣの存在は、４Ｃ１２の存在下でのＴｃｏｎｖ増殖の部分的な回復を有意に変更しなかった。コントロールもまた、Ｔｃｏｎｖ単独における４Ｃ１２の刺激効果は最小であり、ＴｃｏｎｖにおけるＧＩＴＲの刺激効果よりも著しく低いことを示した（図６Ｃ、６Ｄ）。４Ｃ１２によるＴｒｅｇの抑制活性の阻害は、Ｔｃｏｎｖではなく、Ｔｒｅｇによって発現するＴＮＦＲ２５の効果に特異的であることをさらに示すため、ドミナントネガティブＴＮＦＲ２５を発現するトランスジェニックＴｃｏｎｖを用いて抑制アッセイを行った（図６Ｅ）。これらのデータにより、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達によるＴｒｅｇの抑制活性の阻害はＴｒｅｇのみが機能的ＴＮＦＲ２５を発現している条件下で起こることから、この効果は、Ｔｃｏｎｖではなく、ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達によるものであることが示される。特に、４Ｃ１２によってｉｎ ｖｉｖｏで増殖し、次にｉｎ ｖｉｔｒｏでの抑制アッセイに供されたＴｒｅｇ（図６Ａ〜６Ｂ）は、４Ｃ１２抗体がそれ以上存在しない条件下で高度に抑制性であった。抑制アッセイの間に４Ｃ１２抗体が維持されている場合のみに、Ｔｒｅｇ抑制活性の部分的阻害が観察された。４Ｃ１２はＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの増殖を誘導し、かつ幾つかの研究ではＣＤ２５の発現レベルによってＴｒｅｇの抑制活性が予測されることから、４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置後のマウスから選別したＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの抑制活性を比較した（図９Ｂおよび図６Ｆ）。ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇは両方とも増殖アッセイにおいて高度に抑制性であったことから、抑制活性はＣＤ２５の発現レベルに依存しなかった（図６Ｆ）。興味深いことに、４Ｃ１２により増殖したＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇは、ＩｇＧで処置したマウス由来のＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇよりもわずかに抑制活性が大きかった（図６Ｆ、バー３〜４）。この知見により、４Ｃ１２により増殖したＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの、ＩｇＧで処置したＴｒｅｇに比較した抑制活性の増大は（図６Ａ〜６Ｄ）、少なくとも部分的にＣＤ２５ｉｎｔ細胞の活性に起因することが示される。
【０１１８】
考察
ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーは、免疫エフェクター細胞応答の重要な共刺激因子として、かつアポトーシス誘導因子として認識されている。ここに、制御性Ｔ細胞の制御因子としての、ＴＮＦＲ２５の新規な非重複性の機能が同定された。ＴＮＦＲ２５は、免疫応答性マウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇの強固な増殖を仲介する一方、同時にそれらの抑制活性を部分的に制限する。その他のＴＮＦＲファミリーメンバーを含むその他の生理的なシグナルが、Ｔｒｅｇに同様の活性を与えることは報告されていない。さらに、ＴＮＦＲ２５シグナルは、Ｔｒｅｇを選択的に増殖することが報告される唯一のその他の薬剤（ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体（Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１：１９２４−１９２７）と同様の規模および動態によってＴｒｅｇの増殖を誘導するという観察から、ＴＮＦＲ２５アゴニストは、ヒトにおける治療用のための、ＩＬ−２に基づく治療法の臨床応用可能な代替法を提供し得ることが示唆される。
【０１１９】
理論に制約されるものではないが、様々な疾病モデルにおける病的炎症の発生には、ＴＮＦＲ２５およびＴＬ１Ａ受容体：リガンドの組み合わせが関係している。これまでに、健康の維持または疾病の防止におけるＴＮＦＲ２５もしくはＴＬ１Ａの役割を同定した単一の報告はないことから、このような役割は発見されていないことが示唆される。ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体である４Ｃ１２が有効であることにより、ＴＮＦＲ２５シグナル、炎症性シグナル、および外来性抗原の時間的な有効性が独立して制御され得る設定での、様々なＴ細胞サブセットにおけるＴＮＦＲ２５についての研究が初めて可能となった。アレルギー性肺炎症における、ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇの防御的役割の同定は、アレルギー性肺炎症の悪化にＴＬ１Ａを関係付ける以前の研究と矛盾するものではなく、その理由は、本研究ではＴＮＦＲ２５のシグナル伝達が抗原への曝露に先立つが、以前の研究ではＴＮＦＲ２５シグナルが抗原への曝露の後に続くことである。むしろ、Ｔｃｏｎｖ（低発現）に比較した、ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の差次的な発現（高発現）から、Ｔ細胞の抗原への曝露の順序によって、共刺激またはＴＬ１Ａが、特定の炎症性応答がＴｒｅｇにより抑制されるか、またはＴｃｏｎｖにより誘導されるかを支配し得ることが示唆される。本研究では、気道の抗原への曝露に先立つＴＮＦＲ２５アゴニストによる処置が、気道内に、Ｔｃｏｎｖではなく、Ｔｒｅｇの優先的な蓄積を誘導し、かつＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の産生減少、ならびに気管支肺胞腔内の好酸球増多症および粘液産生の低下を伴った。
【０１２０】
ＣＤ８０／８６共刺激ではなく、ＭＨＣＩＩおよびＩＬ−２シグナルが、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要とされた。ＭＨＣＩＩおよびＩＬ−２のシグナルはＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要であるが、ＴＣＲおよびＩＬ−２のシグナルの供給はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇの増殖を誘導するためには十分でないことから、研究中の追加のシグナルが必要であり得ることが示唆される。ＭＨＣＩＩの必要性は、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖において、ＴＣＲを発現するＴｒｅｇに強く関係するが、これらのデータは間接的である。この過程におけるＴＣＲの役割についてのさらなる証拠として、ＴＮＦＲ２５は、ＮＦＡＴ阻害剤であるシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６の存在下でＴｒｅｇの増殖を誘導できないことが観察され；ＴＣＲの下流で起こるシグナル伝達がＴｒｅｇの増殖に影響を与えることの証拠を提供した。これらのデータにより、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖの両方が、ＴＣＲのライゲーションに続くＴＮＦＲ２５のシグナル伝達に対して許容状態になり、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体のＴｒｅｇ選択性は、少なくとも部分的には、非炎症性状態での自己抗原の有効性によるものである可能性が示唆される。自己抗原による持続性のＴＣＲ刺激も、Ｔｃｏｎｖに比較したＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５の発現増加に寄与するか否か、またはこの相違が無関係のシグナル伝達経路によって維持されるか否かについても未知である。
【０１２１】
少なくとも２のさらなる受容体経路（ＩＬ−２受容体およびＴＣＲ）がＴＮＦＲ２５により誘発されるＴｒｅｇの増殖に必要とされることを考えると、これらの受容体の下流にあるＴｒｅｇの増殖を導くシグナル伝達経路の集合は複雑である可能性がある。これらの経路がどのように相互作用し得るかについての手がかりは、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ２５により誘発されるＴｒｅｇが、ＩＬ−２シグナルに対して高応答性であったという観察により提供された。続いて、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路が、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に重要であるＩＬ−２受容体の下流へのつながりを提供することが特定された。これらのデータにより、ＰＴＥＮを介したＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路の阻害が、ＩＬ−２シグナル伝達の下流でＴｒｅｇの増殖を制限することが示唆された。ＭＨＣＩＩ、ＩＬ−２Ｒ、ＮＦＡＴ、およびＡｋｔの同定により、結果的にＴｒｅｇの増殖を導く、ＴＮＦＲ２５の下流で起こるシグナル伝達を解明するための明確な開始点が提供されたが、これらの様々な経路のクロストークの分子機構を解明するために、さらなる研究を行う必要がある。
【０１２２】
ＴＮＦＲ２５により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、ＩＡＣにより誘導されたＴｒｅｇの増殖と同様の動態および規模で起こるが、ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の割合がＣＤ２５ｈｉ細胞よりも多くなる。この観察の重要性については未知である；しかしながら、ＩＡＣへの曝露後のＴｒｅｇによるＣＤ２５の発現から、ＩＬ−２の利用可能性の増大による正のフィードバックループが示唆される。ＴＮＦＲ２５により誘導されたＴｒｅｇの増殖の場合には、ＩＬ−２の濃度は操作されていないことから、増殖したＴｒｅｇによるＣＤ２５の発現低下は、増殖したＴｒｅｇ集団由来の内在性ＩＬ−２との競合の増加に起因し得る。Ｔｒｅｇが発現するその他の表面マーカーを調べることにより、ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇとＩＡＣにより増殖したＴｒｅｇの間で少数の相違が明らかになったが、ＧＩＴＲを含む幾つかはＣＤ２５ｉｎｔとＣＤ２５ｈｉ集団の間で変動した。分析したマーカーのうち、４Ｃ１２による処置後に一貫して増加したものは、組織内でのＴｒｅｇの保持に寄与するＣＤ１０３であった。
【０１２３】
このデータは、Ｔｒｅｇの抑制活性の阻害による炎症性応答の誘導におけるＴＮＦＲ２５の刺激の役割について報告している最近のデータを補完し、組織の炎症の誘導および回復の両方におけるＴＬ１Ａ：ＴＮＦＲ２５の相互作用の役割についての理論へと統一するものである。ＴＮＦＲ２５の刺激が、Ｔｒｅｇの増殖およびそれらの抑制活性の阻害の両方を誘導することの正確な機構については不明なままであるが、その部分的な理由は、ＴＮＦＲ２５シグナルによって活性化されるシグナル伝達がよく理解されておらず、さらなる研究が進められていることである。加えて、ＴＮＦＲ２５によりｉｎ ｖｉｖｏで誘導されるＴｒｅｇの増殖が自己抗原の認識に依存するか否かは不明であり、かつＩＡＣと同様に、ＴＮＦＲ２５によりｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要な条件は不明なままで、さらなる研究が進められている。理論に制約されるものではないが、ＭＨＣＩＩがＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖を許容するためのｉｎ ｖｉｖｏでの要件の同定によって、ＴＣＲの会合はＴＮＦＲ２５により誘導されるＴ細胞の共刺激に対する一般的な要件であること、および外来性抗原の非存在下でのＴＮＦＲ２５のＴｒｅｇに対する選択性は、ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の優先的な発現、およびＭＨＣＩＩによる自己抗原提示の利用可能性の両方によって維持されることが示されると仮定される。免疫されていないマウスに対して、免疫されたマウスではＴＮＦＲ２５の刺激に対するＴｒｅｇの応答性が増大していることもまた興味深く、一次免疫応答と二次免疫応答ではＴＮＦＲ２５の機能が異なる可能性が示唆される。
【０１２４】
その機構にかかわらず、増加する炎症性疾患（喘息、ＩＢＤ、ＥＡＥ、ＲＡ）の病因に対するＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の重要性のために、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達が様々なＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに及ぼす時空間的な役割を理解することが重要である。ＯＸ４０と同様に、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の時間的な背景は、炎症性または制御性免疫を差次的に導き得る可能性が高い。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋天然制御性Ｔ細胞を迅速に増殖させ、一過性に阻害する、ＴＮＦＲ２５シグナルの独特な能力は、自己免疫疾患、慢性感染、移植、および癌の処置に対して重要な結果をもたらし得るであろう。
【実施例２】
【０１２５】
ＴＮＦＲＳＦ２５による、治療用ＴｒｅｇのＩｎ Ｖｉｖｏでの増殖は、異所性心臓移植モデルにおける同種異系心臓の急性拒絶反応を遅延させる。
４Ｃ１２によって増殖した天然型Ｔｒｅｇによる寛容性の誘導について試験するため、寛容性試験について十分に記載されている異所性心臓移植モデルを選択した。０日目に、ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｄ）の心臓をＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ２ｂ）の腹部へ移植した。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。移植時に、４Ｃ１２処置群の血中におけるＴｒｅｇの増殖を確認した。心臓を用手で触診することによって同種移植片の生存をモニターし、脈拍を０〜４（０＝脈拍なし；１＝非常に弱い；２＝弱い；３＝中程度；４＝強い）のスケールで類別した。拒絶は、心臓拍動の触知不可能として定義した。拒絶時（＝心臓拍動の停止時）に移植片を除き、ホルマリン固定後に病理検査へ供した。移植から４８時間以内に移植片の機能が失われた時には技術的な失敗とみなし（＜５％）、その後の分析を行わなかった。
【実施例３】
【０１２６】
ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストによる、治療用ＴｒｅｇのＩｎ Ｖｉｖｏでの増殖は、クローン病のマウスモデルであるデキストラン−硫酸ナトリウム誘導性大腸炎から保護する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬ１Ａノックアウトマウスに、３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を溶解した飲料水を７日間自由に摂取させた。ＤＳＳを供給する４日前（実験−４日目）に始まり、体重を毎日モニターした。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。動物が開始時の体重を≧２０％減少させた時点で死亡率を測定した（図１０Ａ）。幾つかの実験では、実験５日目に動物を屠殺し、急速冷凍してＰＢＳで洗浄した大腸組織からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製した。続いてＲＮＡの逆転写を行い（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＲＴ、Ｑｉａｇｅｎ）、表示する転写物に対するＴａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した（図１０Ｂ）。データは、ＴＬ１Ａノックアウトマウスにおける発現をＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスに比較した倍率変化によって示す。各実験ごとに、実験の全過程にわたって体重減少のパーセンテージをモニターし、プロットした（図１０Ｃ）。実験５日目にＲＮＡ分離のために動物を屠殺した実験では、制御性Ｔ細胞プールの指標となる転写因子ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析するために、腸間膜リンパ節を分離した（図１０Ｄ）。最後に、図１０Ｂに記載するように、表示する処置群から分離したＲＮＡを用いて逆転写を行い、表示する転写物に対するＲＴ−ＰＣＲに供した。エラーバーは１実験あたり≧３マウス、１パネルあたり最少で２実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【０１２７】
これらのデータにより、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体による前処置は、腸内でのＦｏｘＰ３＋制御性細胞の増殖、体重減少および大腸の致死的な炎症の阻止、ならびにＩＬ−１ベータおよびＩＬ−６を含む炎症性サイトカインの大腸組織内での発現の阻止を導くことが示される。まとめると、これらのデータにより、ＴＮＦＲＳＦ２５の刺激は、ヒトのクローン病の炎症特性を模倣するために一般に用いられるマウスモデルにおいて、致命的な腸の炎症を阻止できることの証拠が提供される。
【０１２８】
本発明は１以上の実行に関して図示および記載されているが、本明細書および添付の図面を読み、理解した上で、当業者による等価な変更および改変がなされてよい。加えて、本発明の特定の特徴は、幾つかの実行のうちの１のみに関して開示され得るが、このような特徴は、所定のまたは特定の応用のいずれかに対して望ましく、かつ有利である場合に、その他の実行の１以上のその他の特徴と組み合わせてよい。
【０１２９】
開示の要約により、読者は技術的開示の性質をすぐに確認することが可能となり得る。これは、以下の請求項の範囲もしくは意味を解釈または限定するために用いられ得ないという理解の下に提出される。
【技術分野】
【０００１】
連邦政府からの資金援助による研究についての記述
本発明は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により授与された助成金番号５ＰＯ１ＣＡｌ０９０９４−０３、および国立アレルギー・感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）により授与された助成金番号５ＲＯ１ＡＩ０６１８０７−０５の下で、米国政府の資金援助によって為された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、２００９年８月３日に提出された米国仮出願第６１／２７３，２９９号に基づく優先権を主張する。
【０００３】
本発明の実施形態は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞を制御する組成物および方法に関する。特に、該組成物および方法によってヒトＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞が制御される。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）は、リンパ系および非リンパ系細胞の両方に差次的かつ時間的に発現する、少なくとも１９のリガンドおよび３０の受容体（ＴＮＦＲＳＦ）からなる。ＣＤ３＋Ｔ細胞において、ＴＮＦＳＦシグナルは、極性化、増殖、エフェクター機能、減少、メモリー、および細胞死を含む免疫応答の様々な段階を支持するために、抗原に特異的および非特異的な両方の方法で機能する。ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）はＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３、以下ＴＮＦＲ２５と称する）のリガンドであり、これはデスドメインを含むＴＮＦＲ２５の細胞質側末端を通してＴＲＡＤＤまたはＦＡＤＤのシグナル伝達カスケードを開始することにより、ＴＮＦＲ２５を発現するＴおよびＮＫＴ細胞を正または負に調節することができる。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、および関節リウマチ（ＲＡ）を含む様々な自己炎症性状態において観察される病態に重要な役割を果たす。抗体によるＴＬ１Ａの遮断によってマウスの急性喘息を阻止することができ、またＴＮＦＲ２５の遺伝子ノックアウトによってＥＡＥまたはＲＡの実験モデルにおける病的現象は著しく減少する。ＴＬ１Ａは、ＮＫＴ、Ｔｈ２、およびＴｈ１７細胞の極性化、分化、およびエフェクター機能を増大させることによって、これらの疾病を進行させる。
【発明の概要】
【０００５】
本概要により、本発明の性質および内容を簡単に示す、本発明の概要を提示する。これは請求項の範囲または意味を限定するために用いられるものではないことの理解と共に提示される。
【０００６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞上に恒常的に発現するＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５、ＤＲ３）を通したシグナル伝達により、ＴＨ２およびＴＨ１７サイトカインの産生は増大し、喘息、炎症性腸疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、実験的自己免疫性脳脊髄炎、および関節リウマチの疾患モデルに病的炎症を起こす。
【０００７】
好ましい実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤によって免疫細胞応答が調節される。これらの薬剤により、疾病およびその状態に対する新規な治療法が提供される。例えば、ＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニストは投与後４日以内にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の迅速かつ広範なｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を導き、これは全てのＣＤ４＋細胞の３０〜３５％となった。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増加は、高レベルのＧＩＴＲおよびＣＤ１０３を発現するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋細胞の増殖によるものであった。ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストによって増殖したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＧＦ−βに依存する抑制活性を保持していたが、これは持続するＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達によって無効になった。ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達は、エフェクター細胞の応答の調節に加えて、制御性Ｔ細胞の増殖および活性のコントロールを通し、炎症性応答の誘導および回復の両方に重要な役割を果たしている。
【０００８】
本発明のその他の態様については以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＴＮＦＲ２５がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの迅速な増殖を刺激することを示した図である。図１Ａ：従来型および制御性Ｔ細胞におけるＴＮＦＲ２５、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢの差次的発現。未処理のＦＩＲマウスの脾細胞から得た、高度に精製したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｔｃｏｎｖ）およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲＳＦの発現をフローサイトメトリーにより決定した。図１Ｂ：４Ｃ１２注射後の、末梢血中のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の動態および用量依存性の増殖。ＦｏｘＰ３−ＲＦＰレポーター（ＦＩＲ）マウスに、表示する量の精製した４Ｃ１２を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスからは毎日採血を行い、末梢血液細胞中のＦｏｘＰ３−ＲＦＰの発現をフローサイトメトリーにより分析した。図１Ｃ：その他のＴＮＦＲアゴニスト抗体による処理後に、Ｔｒｅｇの増殖を比較した。０日目に、表示する抗体（１００μｇ）をマウスへｉ．ｐ．注射した。図１Ｂのようにマウスからは６日間毎日採血を行い、４日目の末梢血中の全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＴｒｅｇのパーセンテージを示す。これらのデータは、独立した８回の実験において再現された。エラーバーは平均±ＳＥＭを示す。有意性はスチューデントｔ検定（図１Ｂ）、またはチューキー事後検定付きの一元配置ＡＮＯＶＡ（図１Ｃ）により決定した。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＴＣＲおよびＩＬ−２のシグナル伝達が必要であることを示した図である。ＦＩＲマウスからのＣＤ４＋細胞をＦＡＣＳソーティングによって高度に精製し、ＭＨＣＩＩ−／−またはＣＤ４−／−マウスへ養子移入した。養子移入後、レシピエントマウスを４Ｃ１２またはアイソタイプのコントロール抗体によって処置し、抗体処置後４日目にＦｏｘＰ３−ＲＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（図２Ａ）および絶対数（図２Ｂ）を分析した。ＦＩＲマウスを、方法に記載するように、シクロスポリンＡ（図２Ｃ）もしくはＦＫ５０６（図２Ｄ）またはビヒクルコントロールのｉ．ｐ．注射によって１〜４日処置した。マウスを４Ｃ１２抗体またはＩｇＧコントロール抗体で処置し、４日目に末梢血中の全ＣＤ４＋細胞に対するＦｏｘＰ３−ＲＦＰ陽性細胞の割合を分析した。４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置後４日目に、ＩＬ−２受容体ベータ欠損マウス（図２Ｅ）またはＣＤ８０／８６−／−マウス（図２Ｆ）の全ＣＤ４＋脾細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合を、Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウスに比較して分析した。これらのデータは、１実験あたりの１群あたり≧３のマウスを用いた、少なくとも２回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇではＩＬ−２に対する応答が亢進しており、Ａｋｔの活性化が必要とされることを示した図である。図３Ａ：コントロールＩｇＧまたは４Ｃ１２抗体による処置後４日目にＦＩＲマウスからＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を精製し、表示する量のＩＬ−２と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートした。培養３日目に、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖をトリチウム標識チミジンの取り込みによって測定した。図３Ｂ：ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を（図３Ａ）のように精製し、ＩＬ−２Ｒγ（ＣＤ１３２）またはＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）の表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。図３Ｃ：ＩｇＧまたは４Ｃ１２抗体による処置後４日目のＦＩＲマウスから精製したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２によって処理し、１５分後にｐＳＴＡＴ５の発現を分析した。ＦＩＲマウスを、方法に記載するように、１日１回のラパマイシン（図３Ｄ）もしくは１日２回のＡｋｔ阻害剤Ｖ（図３Ｅ）またはビヒクルコントロールのｉ．ｐ．注射によって１〜４日処置した。マウスを０日目に４Ｃ１２またはコントロールＩｇＧ抗体で処置し、４日目に末梢血中の全ＣＤ４＋細胞に対するＦｏｘＰ３−ＲＦＰ陽性細胞の割合を分析した。これらのデータは、１実験あたりの１群あたり≧２のマウスを用いた、少なくとも２回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。ｎｓは有意差のないことを示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、ＴＮＦＲ２５によるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖がアレルギー性喘息における炎症を阻害することを示した図である。アレルギー性喘息は、材料と方法に記載するように、ｏｖａ／ミョウバンによる免疫誘導とそれに続くｏｖａ／ＰＢＳによるエアロゾル曝露によって誘導した。図４Ａ：４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置後に末梢血を採取し、ｏｖａ／ミョウバンにより免疫誘導したマウスの全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞画分を、免疫誘導していないマウスとの比較において分析した。データは平均±ＳＥＭを示す。図４Ｂ：全肺細胞を採取し、フローサイトメトリーによって分析した。表示する各細胞集団の総数を示す。データは平均±ＳＥＭを示す。図４Ｃ：全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇのパーセンテージを示す。図４Ｄ：記載するように、ｏｖａ／ＰＢＳによるエアロゾル曝露から３日後に気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を回収した。好酸球の総数を示す。データは平均±ＳＥＭを示す。図４Ｅ：全肺細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。４Ｃ１２またはアイソタイプコントロールにより処置したマウスにおけるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現レベルを、生理食塩水によってエアロゾル曝露したコントロール肺細胞に比較して示す。図４Ｆ：肺を採取して薄切し、組織切片を作製した。各処置群について、Ｈ＆Ｅ（左パネル）およびＰＡＳ（右パネル）を得た。代表的な像を示す。これらのデータは、独立した４回の実験において少なくとも３マウス／群／実験により反復した。図４Ｇ：方法に記載するように、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いてＰＡＳ染色した切片を定量化した。各≧５マウスである別々の２回の実験から、２つの代表的な像を定量化した。統計的有意性は、チューキー事後検定付きの一元配置ＡＮＯＶＡにより決定した。表示するように、ＩｇＧ群または生理食塩水コントロール群に比較した４Ｃ１２またはＩＡＣのいずれかについて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、ＴＮＦＲ２５の刺激が、現存のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖を誘導することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖を導くことを示した図である。図５Ａ：ＦＩＲマウスを０日目にＩｇＧまたは４Ｃ１２で処置し、４日後に脾細胞を収集してフローサイトメトリーにより分析した。表示する処置後４日目にマウスから採取した末梢血液細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。図５Ｂ：表示する処置後４日目の脾細胞におけるＣＤ２５ｈｉ対ＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの平均的比率。図５Ｃ：ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋細胞に予めゲートをかけた代表的なドットプロットを示す。パーセンテージは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の全画分に対する各表現型の割合を示す。図５Ｄ：図５Ａに記載する処置後の、ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの間でのＫｉ６７＋またはＫｉ６７−の平均的割合を示す。データは平均±ＳＥＭである。図５Ｅ：ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−および図５Ｆ：ＣＤ４５．２＋ＦｌＲマウスからＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を＞９９％の純度によって選別し、各サブセットから２×１０６の細胞をＣＤ４５．１コンジェニックＢ６−ＳＪＬマウスへ養子移入した。２４時間後、マウスに各２０ｍｇの４Ｃ１２またはＩｇＧをｉ．ｐ．注射した。図５Ｅ、１２Ｇ：ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−および（図５Ｆ、５Ｈ）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞のコンジェニックＣＤ４５．１ Ｂ６−ＳＪＬマウスへの移入。図５Ｅ、５Ｆ：養子移入後５日目の、ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４５．２＋およびＲＦＰ＋（ＦｏｘＰ３＋）細胞のパーセンテージを示すヒストグラム。図５Ｇ、５Ｈ：４Ｃ１２またはハムスターＩｇＧによる処置後の、移入細胞の減少の動態。ホストＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞のうちの移入細胞（ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋）のパーセンテージ（図５Ｅ）、またはホストＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋のパーセンテージ（図５Ｆ）を示す。エラーバーは、２回の独立した実験それぞれの、各１群あたり３マウスの平均パーセンテージ±ＳＥＭを示す。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖したＴｒｅｇの抑制活性を示した図である。４Ｃ１２およびＩｇＧアイソタイプコントロールを注射したマウスから４日後にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞を選別し、ＴｃｏｎｖとしてのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ＣＤ２５−細胞および可溶性α−ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）を用いる標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイに７２時間供した（９６ウェル、丸底プレート）。アッセイは、様々な比率のＴｒｅｇ：Ｔｃｏｎｖ（図６Ａ、６Ｂ）を用いて、１：１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の非存在（図６Ａ、６Ｃ）または存在（図６Ｂ、６Ｄ）下に行った。図６Ｃおよび６Ｄにおいて、抑制アッセイにＩｇＧ、４Ｃ１２、またはＤＴＡ１（１０ｇ／ｍｌ）抗体を添加した。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比は、一定の１：２の比率を保持した。図６Ｅ：ＴＮＦＲ２５ドミナントネガティブ（ＤＮ）マウス由来のＴｅｆｆ細胞およびｗｔマウス由来のＴｒｅｇ細胞を用いた。抑制アッセイにＩｇＧまたは４Ｃ１２抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。Ｔｒｅｇ：Ｔｅｆｆ比は１：２である。図６Ｆ：ＩｇＧまたは４Ｃ１２を注射したマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇ細胞を用いた。アッセイをシンチレーションカウンターで分析する６時間前に３Ｈチミジンを添加した。パーセント増殖は、表示する条件について得られたカウントを用いて、Ｔｒｅｇが存在せず、Ｔｅｆｆを含むウェルから得られた総カウントのパーセンテージとして算出した。データは、１実験あたりの１群あたり＞６マウスを用いた、独立した２実験それぞれの各条件について、≧４サンプルの平均±ＳＥＭとして表した。
【図７】図７Ａ、７Ｂは、４Ｃ１２または組み換えＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体（ＩＡＣ）を用いた処置によって増殖したＴｒｅｇの比較を示した図である。図７Ａ：ＦＩＲマウスを、０日目に４Ｃ１２（１０μｇ）によって処置するか、または０〜２日目にＩＡＣの一連の３回の注射によって処置した。末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＦｏｘＰ３＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって毎日測定した。図７Ｂ：ＩＡＣ、４Ｃ１２、またはアイソタイプコントロールＩｇＧによる処置後４日目に、ＦＩＲマウス４から脾細胞を分離した。ＣＤ２５および増殖マーカーＫｉ６７を発現するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、４Ｃ１２による処置が、分析した全ての組織においてＴｒｅｇの増殖を誘導することを示した図である。図８Ａ：ＣＤ４およびＦｏｘＰ３（ＲＦＰ）を染色した、典型的なフローサイトメトリードットプロットの例。図８Ｂ〜８Ｄに示すように、後のＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔ細胞の分析のため、象限Ｑ２−１のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞にゲートをかけた。図８Ｂ：ＧＩＴＲの比率、および図８Ｃ：表示する処置から４日後の脾細胞における、ＣＤ２５ｈｉ対ＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇのＣＤ１０３の発現。図８Ｄ：データは、１実験あたりの１群あたり少なくとも３マウスを用いる、８回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表す。対の分析はスチューデントＴ検定を用いて行った。＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｂはソーティング計画と得られた結果の一例を示した図である。図９Ａ：ＦＩＲマウスから脾細胞を収集し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮して、ＣＤ４＋およびＦｏｘＰ３＋（ＲＦＰ）に基づいて選別した。左パネルに、脾細胞の典型的なＣＤ４濃縮集団を示す。中央および右パネルに、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｐ３ゲート）およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（Ｐ４ゲート）集団に対する代表的な選別後の分析を示す。図９Ｂ：幾つかの実験のために、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞（ゲートＰ３）をＣＤ２５の発現に基づいて選別した。ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔの選別に対するゲーティング計画を表す代表的なプロットを示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストが、クローン病のマウスモデルである、デキストラン−硫酸ナトリウム誘導性大腸炎から保護し得ることを示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬ１Ａノックアウトマウスに、３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を溶解した飲料水を７日間自由に摂取させた。幾つかの実験では、実験０日目にマウスをＩｇＧアイソタイプコントロール抗体またはＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２により処置した。ＤＳＳを供給する４日前（実験−４日目）に始まり、体重を毎日モニターした。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。動物が開始時の体重を≧２０％減少させた時点で死亡率を測定した（図１０Ａ）。幾つかの実験では、実験５日目に動物を屠殺し、急速冷凍してＰＢＳで洗浄した大腸組織からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製した。続いてＲＮＡの逆転写を行い（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＲＴ、Ｑｉａｇｅｎ）、表示する転写物に対するＴａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した（図１０Ｂ）。データは、ＴＬ１Ａノックアウトマウスにおける発現をＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスに比較した倍率変化によって示す。各実験ごとに、実験の全過程にわたって体重減少のパーセンテージをモニターし、プロットした（図１０Ｃ）。実験５日目にＲＮＡ分離のために動物を屠殺した実験では、制御性Ｔ細胞プールの指標となる転写因子ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析するために、腸間膜リンパ節を分離した（図１０Ｄ）。最後に、図１０Ｂに記載するように、表示する処置群から分離したＲＮＡを用いて逆転写を行い、表示する転写物に対するＲＴ−ＰＣＲに供した。エラーバーは１実験あたり≧３マウス、１パネルあたり最少で２実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【図１１】図１１は、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストが、マウスの異所性心臓移植モデルにおける同種異系心臓の急性拒絶反応を遅延させることを示した図である。４Ｃ１２によって増殖した天然型Ｔｒｅｇによる寛容性の誘導について試験するため、寛容性試験について十分に記載されている異所性心臓移植モデルを用いた。０日目に、ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｄ）の心臓をＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ２ｂ）の腹部へ移植した。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。移植時に、４Ｃ１２処置群の血中におけるＴｒｅｇの増殖を確認した。心臓を用手で触診することによって同種移植片の生存をモニターし、脈拍を０〜４（０＝脈拍なし；１＝非常に弱い；２＝弱い；３＝中程度；４＝強い）のスケールで類別した。拒絶は、心臓拍動の触知不可能として定義した。拒絶時（＝心臓拍動の停止時）に移植片を除き、ホルマリン固定後に病理検査へ供した。移植から４８時間以内に移植片の機能が失われた時には技術的な失敗とみなし（＜５％）、その後の分析を行わなかった。
【図１２】図１２は、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストは制御性Ｔ細胞のうち天然のものを選択的に増殖させるが、誘導されたものは増殖させないことを示した図である。ＦｏｘＰ３−ＲＦＰレポーター遺伝子を発現するマウスからＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞を分離し、ＩＬ−２、ＴＧＦベータ、抗ＣＤ３抗体、およびレチノイン酸の存在下にｉｎ ｖｉｔｒｏで５日間、標準的なプロトコルに従って培養した。培養の終わりに、生存細胞には７０−８５％のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−ＲＦＰ＋誘導性の制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を含むＣＤ４＋集団が含まれた。これらの細胞を高速細胞ソーティングによって精製した。同時に、ＦｏｘＰ３−ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するマウスから全ＣＤ４＋細胞を分離した（従って、これらの細胞はｉＴｒｅｇおよびいわゆる胸腺由来の天然型制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）を含む）。ｉＴｒｅｇ（６×１０５のｉＴｒｅｇ細胞を、８×１０５のＴｒｅｇを含むＦｏｘＰ３−ＧＦＰマウスから分離した全ＣＤ４＋細胞と混合した）を、ＣＤ４−／−レシピエントマウスに養子移入（静脈内注射により）した。２日後に、ＲＦＰ陽性ｉＴｒｅｇおよびＧＦＰ陽性ｎＴｒｅｇを含むＣＤ４−／−レシピエントマウスを、４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した（２０μｇ／マウス、腹腔内注射による）。５日後に、ＲＦＰ陽性ｉＴｒｅｇおよびＧＦＰ陽性の全Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇを唯一の源として含む）の割合を、分離した脾細胞のフローサイトメトリーにより決定した（図１２）。
【００１０】
詳細な説明
本発明は、類似または同等の要素を指定するために図面を通して参照数字が用いられるように、添付の図面への参照によって記載される。図面は一定の基準のために描かれたものではなく、単にその場での発明を例証するために提供される。以下に記載する本発明の幾つかの態様は、例証のために実施例応用への参照により記載される。多くの特定の詳細、関連性、および方法は、本発明の完全な理解のために示されることが理解されなければならない。しかしながら関連する技術分野における当業者は、１以上の特定の詳細なしで、または他の方法によって、本発明を実行できることを容易に認識するであろう。幾つかの行為は、異なる要求において、かつ／またはその他の行為もしくは現象と同時に起こり得ることから、本発明は例証される行為または現象の要求によって限定されるものではない。さらに、本発明に従う方法論を実行するために、例証される行為または現象の全てが必要とされるものではない。
【００１１】
本明細書に開示される全ての遺伝子、遺伝子名、および遺伝子産物は、本明細書に開示される組成物および方法が応用できるいずれの種に由来するホモログにも相当することが意図される。従って、これらの語には、ヒトならびにマウス由来の遺伝子または遺伝子産物が含まれるが、限定されるものではない。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物について開示される場合、この開示は例証のみを意図していること、および文脈中で明らかに指示されるとみられる場合を除き、限定的に解釈されてはならないことを理解されたい。従って例えば、その他の哺乳類、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類を含むがこれらに限定されないその他の動物に由来する、相同的な、および／またはオルソロガスな遺伝子もしくは遺伝子産物を包含することが意図された哺乳類の核酸およびアミノ酸配列に関する幾つかの実施形態では、本明細書に開示される分子、例えば４Ｃ２はマウスに限定されず、ヒト抗体が好ましい。好ましい実施形態では、遺伝子または核酸配列はヒトのものである。
【００１２】
他に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての語（技術的および科学的用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に用いられる辞書で定義されるような語は、関連技術の文脈内でのそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されなければならず、かつ、本明細書中で明確にそのように定義されない限り、理想的な、または過度に型にはまった意味で解釈されてはならないことがさらに理解されるであろう。
【００１３】
定義
本明細書の専門用語は特定の実施形態のみを記述する目的のために用いられ、本発明を限定しようと意図するものではない。文脈に明らかに他の指示がない限り、本明細書で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形も同様に含むことが意図される。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ））」、「と共に（ｗｉｔｈ）」、またはその変異形の語が詳細な説明および／または請求項のいずれかで用いられる範囲で、これらの語は「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語と同様に包括的であることが意図される。
【００１４】
「約」または「おおよそ」の語は、当業者により決定された特定の値についての許容される誤差範囲を意味し、これは値がどのように測定または決定されたかということ、すなわち測定系の限界に部分的に依存し得る。例えば「約」は、当該技術分野における実践あたりの、１以内または１を超える標準偏差を意味する。あるいは「約」は、所定の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、さらに好ましくは５％まで、なおさらに好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたは過程に関する際、この語は規模の桁の範囲内を意味することができ、好ましくは値の５倍以内、さらに好ましくは２倍以内である。本出願および請求項に特定の値が記される際、他に記載のない限り、「約」は特定の値の許容される誤差範囲内を意味すると想定されるべきである。
【００１５】
「制御性Ｔ細胞」、すなわち「Ｔｒｅｇ細胞」または「Ｔｒ細胞」は、Ｔ細胞応答を調節することのできる細胞を指す。Ｔｒｅｇ細胞は転写因子Ｆｏｘｐ３を発現するが、これはＴ細胞の活性化によって発現増加せず、活性化エフェクター細胞からＴｒｅｇを区別する。Ｔｒｅｇは、細胞表面マーカーのＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、およびＧＩＴＲによって同定される。自己免疫および慢性炎症性応答の阻害能を有し、腫瘍を有するホストにおいて免疫寛容を維持する、幾つかのＴｒｅｇサブセットが同定された。これらのサブセットには、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）を分泌するＴ制御性タイプ１（Ｔｒ１）細胞、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）を分泌するＴヘルパータイプ３（Ｔｈ３）細胞、および「天然型」ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（Ｔｒｎ）が含まれる（Ｆｅｈｅｒｖａｒｉ ａｎｄ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，１１４：１２０９−１２１７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４，２６５：１２３７−１２４０；Ｇｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７，３８９：７３７−７４２）。
【００１６】
本明細書において「ＴＮＦＲ２５アゴニスト」、「ＴＮＦＲ２５薬剤」、「ＴＮＦＲ２５組成物」は互換的に用いられ、これはＴＮＦＲ２５受容体に結合して、ＴＮＦＲ２５受容体を発現する細胞に、天然のＴＮＦＲ２５リガンド、例えばＴＬ１Ａへの該細胞の曝露によって観察され得る応答と同様の応答を引き起こす物質を指す。アンタゴニストもまた受容体に結合し得るが、受容体を活性化できず、実際には内在性または外来性のアゴニストによる活性化を完全または部分的に遮断するという意味において、アゴニストはアンタゴニストの反対である。部分的アゴニストは受容体を活性化するが、完全なアゴニストにより引き起こされるほどの生理的変化は起こさない。あるいは、ＴＮＦＲ２５アゴニストのもう一つの例は、ＴＮＦＲ２５に結合し、活性化することのできる抗体である。抗ＴＮＦＲ抗体の一例は４Ｃ１２（アゴニスト）である。（マイアミ大学に代わり、ブダペスト条約の下に寄託される；ＡＴＣＣ（登録商標）による種子／株の受領日：２００９年５月５日；ＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託指定：ＰＴＡ−１００００。寄託者による識別の参照：ハイブリドーマ細胞株；４Ｃ１２；寄託物は２００９年６月４日に試験され、この日に種子／株は生存していた。国際寄託当局：アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標））、マナッサス、バージニア州、米国）。
【００１７】
本明細書において「ＴＮＦＲ２５アンタゴニスト」はＴＮＦＲ２５受容体の正常な生理的機能を阻害する物質を指す。このような薬剤は、ＴＬ１Ａのような内在性の受容体アゴニスト／リガンドのＴＮＦＲ２５受容体への結合に干渉することによって作用する。
【００１８】
ＴＮＦＲ２５アンタゴニストまたはアゴニストは、アプタマーの形であってよい。「アプタマー」は、その他の分子に結合するそれらの能力に基づいて無作為のプールから選択されたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。アプタマーは標的分子に特異的に結合し、ここで核酸分子は、その天然の設定において標的分子により認識される配列を含んでなる配列を有する。あるいはアプタマーは、標的分子が天然では核酸に結合しない、該標的分子に結合する核酸分子であってもよい。標的分子は、関心のあるいずれの分子であってもよい。例えば、アプタマーをタンパク質のリガンド結合ドメインに結合させ、それによって天然のリガンドとタンパク質との相互作用を妨げるために用いることもできる。これは限定されない例であり、当業者は、当該技術分野において一般に公知である技術を用いて他の実施形態を容易に生み出せることを認識するであろう（例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３，１９９５；Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：５，２０００；Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１００，２０００；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７，２０００；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０，２０００；およびＪａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．４５：１６２８，１９９９を参照）。
【００１９】
本明細書で用いられる「抗体」の語は、ヒトを含む全ての種に対して包括的であり、ヒト化抗体および抗原性の標的、例えばＴＮＦＲ２５はいずれの種由来であってもよい。従って抗体、例えば抗ＴＮＦＲ２５は、マウス抗ヒトＴＮＦＲ２５、ヤギ抗ヒトＴＮＦＲ２５；ヤギ抗マウスＴＮＦＲ２５；ラット抗ヒトＴＮＦＲ２５；マウス抗ラットＴＮＦＲ２５などであってよい。特定の種において、別の種由来の、またはある場合には同じ種由来の（例えば、自己免疫性または炎症性応答における）抗原標的、例えばＴＮＦＲ２５に対して産生された抗体の組み合わせに制限はなく、本発明では全ての種が具体化される。抗体の語は最も広範な意味で用いられ、これには完全に構築された抗体、モノクローナル抗体（ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗原に結合できる抗体断片（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）が含まれ、これらが望まれる生物学的活性を示すものであれば、前述のものの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる。
【００２０】
「標的分子」は、タンパク質、炭水化物、酵素、多糖、糖タンパク質、受容体、抗原、抗体、増殖因子を含むいずれかの高分子を含むか；またはホルモン、基質、代謝産物、補助因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、殺虫剤、ペプチドを含むいずれかの低有機分子であってよいか；または金属、金属イオン、金属酸化物、および金属複合体を含む無機分子であってよいか；細菌、ウイルス、および原生動物のような単細胞真核生物を含む生命体の全体であってもよい。
【００２１】
状況、疾患、もしくは状態を「処置する」またはそれらの「処置」には：（１）状況、疾患、もしくは状態にかかっている可能性があるかまたはかかりやすいが、その状況、疾患、もしくは状態の、臨床または無症候性の症状をまだ経験していないか示していない、哺乳類において発生する状況、疾患、もしくは状態の臨床または無症候性の症状の出現を阻止または遅延させること；または（２）状況、疾患、または状態を阻害すること、すなわち疾病もしくはその再発（維持処置の場合）またはその少なくとも１の臨床もしくは無症候性の症状の発生を抑止、減少、または遅延させること；または（３）疾病を軽減すること、すなわち状況、疾患、もしくは状態またはその少なくとも１の臨床もしくは無症候性の症状を後退させることが含まれる。処置される被験体にとっての利点は、統計的に有意であるか、または少なくとも患者または医師に知覚される。
【００２２】
「患者」または「被験体」は哺乳類を指し、ヒトおよび獣医学の被験体を含む。
【００２３】
「予防的に有効な量」は、望ましい予防的結果を達成するための、投薬量における、および必要な期間の間に有効な量を指す。典型的には、予防的な用量は、疾病の前かまたは早い段階で被験体に用いられることから、予防的に有効な量は治療上有効な量よりも少ない可能性がある。
【００２４】
免疫応答の調節
ＣＤ４Ｔ細胞サブセットの特性：ＣＤ４Ｔ細胞の活性化および増殖によって、異なるサイトカインプロファイルおよび特徴的なエフェクター機能を有する、異なるＴヘルパー（ＴＨ）細胞が発生する。侵入する病原体に対するホストの防御に最も適したＴＨ細胞のエフェクター細胞への適切な分化は、免疫系にとって決定的に重要である。ＣＤ４Ｔ細胞は、少なくとも４の既知のサブセット、３のエフェクターサブセット（ＴＨ１、ＴＨ２、およびＴＨ１７）、および１のＴ制御性サブセット（Ｔｒｅｇ）に分化する。Ｔ細胞は、それらが産生するサイトカインに基づいて歴史的にＴＨ１およびＴＨ２細胞に分類されたが、これによって、自然免疫系の細胞により生み出された特異的なサイトカイン環境がどのように適応免疫の発生を導くかについて理解するためのフレーム構造が提供された。ＩＬ−１２を分泌する樹状細胞（ＤＣ）により強力に誘導されるＴＨ１細胞は、系列特異的な転写因子Ｔ−ｂｅｔ（Ｔ ｂｏｘ ２１）の発現およびＩＦＮ−γの産生により特徴付けられる。分化の間ＩＬ−４に依存し、ＩＬ−１２を欠如するＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３を産生し、転写因子ＧＡＴＡ−３の発現により特徴付けられる。重要なことには、過去５年の間に、ＴＨ１７細胞と呼ばれるＩＬ−１７を産生するエフェクターＴヘルパー細胞による第３のサブセットが発見され、特徴付けられ、転写因子ＲＯＲγｔの発現によって特定化された。
【００２５】
ＴＨ１７細胞は、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２２を産生する。これらのエフェクターサイトカインを産生することにより、ＴＨ１７細胞は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２受容体の広範な分布に起因する大規模な組織反応を誘導する。ＴＨ１７細胞はまた、ＩＬ−２１も分泌して免疫系の細胞と連絡する。マウスおよびヒトにおいては、サイトカインであるトランスフォーミング増殖因子ベータアイソフォーム１（ＴＧＦ−β）とインターロイキン（ＩＬ）−６との相乗作用によってＴＨ１７細胞の発生が誘導されるが、ＩＬ−２３はこれらの細胞の増殖を支持する。ＴＨ１７細胞の発生に関わる分化因子（ＴＧＦ−βに加えて、ＩＬ−６またはＩＬ−２１）、増殖および安定化因子（ＩＬ−２３）、ならびに転写因子（ＳＴＡＴ３、ＲＯＲ−γｔ（ＲＯＲ−ｃ）、およびＲＯＲ−ａ）は、ごく最近同定された。ＴＧＦ−βは、末梢の免疫区画においてナイーブＴ細胞のＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇへの分化も誘導することから、ＴＨ１７細胞の分化におけるＴＧＦ−βの関与は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に密接に関連するＴＨ１７系列に与えられる。Ｔｒｅｇ細胞は免疫系の活性化を抑制するために作用するＴ細胞の特殊な亜集団であり、これによって自己抗原に対する免疫系の恒常性および寛容性を維持する。自己免疫疾患を抑制できるＴｒｅｇ細胞の発生は、自己免疫応答を含む免疫応答を駆動できるＴＨ１７細胞と相反的に関連する。Ｔｒｅｇ細胞は、その独特な、転写因子であるフォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）の発現により同定できる。重要なことには、これまでに知られている限り、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇには表現型として同等な２つの集団−天然型および適応型が存在する。天然型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺内で、自己免疫からの保護のために恒常的な状態で発生する。適応型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞は、感染および癌のような炎症性過程において発生し、直接の接触またはＩＬ−１０およびＴＧＦ−βのような可溶性因子の産生を含む不均一な機構を通して免疫を抑制する。
【００２６】
本明細書では互換的にデスレセプター３（ＤＲ３）と称される腫瘍壊死因子受容体２５（ＴＮＦＲ２５）は、Ｔ細胞機能の制御因子である。デスレセプター３（ＤＲ３）（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９０，１９９６）はＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーである。これはＴＲＡＭＰ（Ｂｏｄｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：７９，１９９７）、ｗｓｌ−１（Ｋｉｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３７２，１９９６）、Ａｐｏ−３（Ｍａｒｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ６：１６６９，１９９６）、およびＬＡＲＤ（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４６１５，１９９７）としても知られ、典型的なデスドメインを含む。２９３細胞へのヒトＤＲ３（ｈＤＲ３）のトランスフェクションにより、アポトーシスおよびＮＦ−κＢの活性化が誘導された。ヒトＤＲ３のｍＲＮＡには複数のスプライシング型が観察されることから、転写後レベルでの制御が示唆される（Ｓｃｒｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４６１５，１９９７）。
【００２７】
ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、胸腺における負の選択を免れる自己反応性エフェクターＴ細胞の活性を抑制することができる。Ｔｒｅｇは、ＩＢＤ、喘息、およびＥＡＥの実験モデルにおいて、自己免疫性の病態を阻止または遅延するために十分である。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇによるＣＤ４＋ＣＤ２５−の阻害を遮断するが、抗原特異的なＣＤ８＋細胞の阻害は遮断しない。興味深いことに、ＣＤ２プロモーターの下で完全長のＴＮＦＲ２５を発現するトランスジェニックマウスは、高レベルのＴＨ２およびＴＨ１７サイトカインを発現し、二次リンパ組織での細胞充実性が減少する。ＴＮＦＲ２５トランスジェニックマウスにおける、制御性Ｔ細胞の活性低下、細胞充実性の減少、およびサイトカイン産生の増大の同時発生により、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、ＴＮＦＲ２５のシグナルが受け取られた状況によって炎症促進性および抗炎症性の両方となり得ることが示唆される。
【００２８】
簡単に述べると、本明細書で行われた実験により、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦＲ２５の刺激が、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞プールの迅速かつ全身性の増殖を誘導するという、予想外の知見が示された。抗体（４Ｃ１２）により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、外来性抗原には依存せずに起こり、投与後４日以内に、全ＣＤ４＋細胞のうちのＴｒｅｇのパーセンテージに３〜４倍の増加をもたらした。このＴｒｅｇの増殖は主にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖からもたらされ、持続的であり、２週間、無刺激のレベルまで減少しなかった。４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇは、ＴＧＦβにより仲介されるエフェクターＴ細胞のサプレッサー機能をｅｘ ｖｉｖｏで保持したが；ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の継続により、４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇの抑制活性は無効となった。理論に制約されるものではないが、これらの知見により、ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、Ｔｒｅｇの増殖の増大およびＴｒｅｇの抑制活性の阻害の二重の機能を有することが示唆される。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達による、Ｔｒｅｇによる抑制の阻害は高度に可塑性であり、ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の除去または継続それぞれに従って、元に戻るかまたは維持され得る。ＴＨ２およびＴＨ１７による応答の共刺激因子としてのＴＮＦＲ２５の役割にこの情報を加えることで、免疫のシグナル伝達におけるＴＮＦＲ２５の役割は、炎症性応答を誘導する間にエフェクター細胞の機能を同時に増大し、炎症性刺激の除去に従って抑制活性を回復するＴｒｅｇのプールの局所的増殖を通して、炎症の消散を促進することであると示唆される。まとめると、これらの知見により、ＴＮＦＲ２５を標的とした治療法は、それらが投与される炎症性の状況に応じて免疫の活性化を増大するかまたは阻害するために役立ち得ることが証明され、これは自己免疫疾患、慢性感染、移植、および癌の領域に対して広く影響する。
【００２９】
好ましい一実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を制御する方法は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与することを含んでなる。好ましい機能は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖の誘導をもたらす、ＴＮＦＲＳＦ２５により仲介されるシグナル伝達である。ＴＮＦＲＳＦ２５分子の刺激により、免疫応答を抑制するＴｒｅｇ細胞が誘導される。しかしながらＴＮＦＲＳＦ２５分子の連続する刺激はＴｒｅｇ細胞の抑制活性を無効にするため、それによって免疫応答が制御される。
【００３０】
ＣＤ４＋Ｔ細胞上にはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー２５（ＴＮＦＲＳＦ２５、ＤＲ３）が恒常的に発現しており、これを通したシグナル伝達によるＴＨ２およびＴＨ１７のサイトカイン産生の増大が、喘息、炎症性腸疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、および関節リウマチの疾病モデルにおける病的炎症に寄与する。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答の制御によって、免疫応答に付随する疾病または疾患が処置される。このような疾病または疾患は、例えば：心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、膵臓、小腸、肢、筋肉、神経、椎間板、気管、筋芽細胞、軟骨などのような臓器または組織の移植による拒絶反応；骨髄移植に続く移植片対宿主反応；関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、１型糖尿病などのような自己免疫疾患；病原微生物（例えばアスペルギルス・フミガーツス、フザリウム・オキシスポラム、トリコフィトン・アステロイデスなど）により引き起こされる感染；炎症性もしくは過剰増殖性の皮膚疾患または免疫による疾病の皮膚症状（例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹様皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、紅班、皮膚好酸球増加症、紅斑性狼瘡、ざ瘡、および円形脱毛症）；眼の自己免疫疾患（例えば角結膜炎、春季カタル、ベーチェット病に付随するぶどう膜炎、角膜炎、ヘルペス性角膜炎、円錐角膜炎、角膜上皮変性症、角膜白斑、眼天疱瘡、モーレン潰瘍、強膜炎、グレーブス眼症、フォークト・小柳・原田症候群、乾性角結膜炎（ドライアイ）、フリクテン、虹彩毛様体炎、サルコイドーシス、内分泌性眼障害など）；可逆性気道閉塞疾患［喘息（例えば気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息、および塵埃喘息）、特に慢性または難治性喘息（例えば遅発型喘息および気道過敏症）気管支炎など；粘膜または血管の炎症（例えば胃潰瘍、虚血性または血栓性の血管傷害、虚血性腸疾患、腸炎、壊死性腸炎、熱傷に付随する腸の損傷、ロイコトリエンＢ４による疾病）；小腸炎／アレルギー（例えばセリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、および潰瘍性大腸炎）；消化管から離れた症候性の症状を伴う食物関連のアレルギー疾患（例えば片頭痛、鼻炎、および湿疹）；腎臓病（例えば間質性腎炎、グッドパスチャー症候群、溶血性尿毒症症候群、および糖尿病性腎症）；神経疾患（例えば多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎、単発性神経炎、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および神経根症）；脳の虚血性疾患（例えば頭部外傷、脳の出血（例えばくも膜下出血、脳内出血）、脳血栓症、脳塞栓症、心停止、脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、高血圧性脳症、脳梗塞）；内分泌疾患（例えば甲状腺機能亢進症、およびバセドウ病）；血液疾患（例えば赤芽球癆、再生不良性貧血、低形成性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、無顆粒球症、悪性貧血、巨赤芽球性貧血、および赤血球形成不全）；骨疾患（例えば骨粗鬆症）；呼吸器疾患（例えばサルコイドーシス、肺線維症、および特発性／間質性肺炎）；皮膚疾患（例えば皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光線過敏症、および皮膚Ｔ細胞リンパ腫）；循環器疾患（例えば動脈硬化、アテローム性動脈硬化症、大動脈炎症候群、結節性多発動脈炎、および心筋症）；膠原病（例えば強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、およびシェーグレン症候群）；脂肪症；好酸球性筋膜炎；歯周病（例えば歯肉、歯周組織、歯槽骨、または歯のセメント質への損傷）；ネフローゼ症候群（例えば糸球体腎炎）；男性型脱毛症、老人性脱毛症；筋ジストロフィー；膿皮症およびセザリー症候群；染色体異常が付随する疾病（例えばダウン症候群）；アジソン病；活性酸素による疾病［例えば保存、移植、または虚血性疾患（例えば血栓症、心筋梗塞など）に付随する臓器（例えば心臓、肝臓、腎臓、消化管など）の臓器傷害（例えば虚血性循環器疾患）；腸疾患（例えば内毒素ショック、偽膜性大腸炎、および薬物または照射により誘導される大腸炎）；腎臓病（例えば虚血性急性腎不全、慢性腎不全）；肺疾患（例えば肺の酸素または薬物（例えばパラコート、ブレオマイシンなど）により引き起こされる中毒、肺癌、および肺気腫）；眼疾患（例えば白内障、鉄蓄積症（眼球鉄症）、網膜炎、網膜色素変性症、老人斑、硝子体瘢痕、角膜のアルカリ火傷）；皮膚炎（例えば多形性紅班、リニア免疫グロブリンＡ水疱性皮膚炎、セメント皮膚炎）；およびその他の疾病（例えば歯肉炎、歯周炎、敗血症、膵炎、および環境汚染（例えば大気汚染）により引き起こされる疾病、加齢、発癌物質、癌の転移、および高山病）］；ヒスタミン放出またはロイコトリエンＣ４放出により引き起こされる疾病；血管形成術および術後癒着防止後の冠動脈の再狭窄；自己免疫疾患および炎症状態（例えば原発性粘膜浮腫、自己免疫性萎縮性胃炎、早発閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体原性ぶどう膜炎、特発性白血球減少症、活動性慢性肝炎、特発性肝硬変、円板状紅斑性狼瘡、自己免疫性精巣炎、関節炎（例えば変形関節炎）、または多発性軟骨炎）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＡＩＤＳ；アレルギー性結膜炎；ならびに外傷、火傷、または外科手術による肥厚性瘢痕およびケロイドを含んでなる。
【００３２】
好ましい一実施形態によれば、薬剤はＴｒｅｇ細胞による抑制効果を維持するため、単一用量または一期間にわたり拡散して投与される。例えば、自己免疫疾患の治療である。
【００３３】
別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果が無効になるように、複数または多数の用量により投与される。例えば、異常細胞の免疫による除去を必要とする癌、ウイルス性疾患、またはその他の疾病の処置においてである。
【００３４】
別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、Ｔｒｅｇ細胞による免疫系の抑制を無効にするための、ＴＮＦＲＳＦ２５の一定の刺激が供給されるように、持続放出処方により投与される。
【００３５】
別の好ましい実施形態によれば、患者において少なくとも１の薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖を誘導する。Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果はモニターすることができ、免疫応答の低下が望ましい疾病または状態、例えば自己免疫、移植の拒絶などにおいて抑制効果を維持するために、薬剤の用量を調節することができる。
【００３６】
別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１の薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、胸腺で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導するが、末梢で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖は誘導しない。Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果はモニターすることができ、免疫応答の低下が望ましい疾病または状態、例えば自己免疫、移植の拒絶などにおいて抑制効果を維持するために、薬剤の用量を調節することができる。
【００３７】
別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１の薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、末梢で誘導されたＴｒｅｇ細胞により認識される同種抗原の存在が既知である場合に、胸腺および末梢で誘導された両方のＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する。Ｔｒｅｇ細胞による抑制効果はモニターすることができ、免疫応答の低下が望ましい疾病または状態、例えば自己免疫、移植の拒絶などにおいて抑制効果を維持するために、薬剤の用量を調節することができる。
【００３８】
別の好ましい実施形態によれば、１の、または組み合わせた薬剤が、患者の免疫応答を調節するために患者に投与され得る。例えば、患者におけるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖によるか、または望ましい応答を測定するその他のいずれかのアッセイによって決定された、治療上有効な用量の１以上の薬剤が患者に投与され得る。例えば免疫測定法、バイオマーカーの検出、ＦＡＣＳ、免疫ブロット、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲなどである。Ｔｒｅｇ細胞は、例えばＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞として同定され得る。幾つかの態様では、ＣＤ１０３が共発現する。ＴｒｅｇによるＣＤ１０３の発現により、組織は組織内に保持される。ＴＮＦＲＳＦ２５により仲介されるＴｒｅｇの増殖に干渉しないことが知られている薬剤にはラパマイシンが含まれる。
【００３９】
別の好ましい実施形態によれば、ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤は、抗体、アプタマー、リガンド、小分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機または無機分子のうち少なくとも１を含んでなる。
【００４０】
好ましい一実施形態によれば、薬剤はＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニストである。
【００４１】
別の好ましい実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を抑制する方法は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）により仲介されるシグナル伝達の機能を調節し、抑制的な制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与することを含んでなる。
【００４２】
別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５のシグナル伝達を調節し、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の抑制活性を阻害する。
【００４３】
別の好ましい実施形態によれば、免疫応答を調節する組成物はＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤を含んでなる。一実施形態によれば、薬剤は、サプレッサーＴｒｅｇが免疫応答を抑制するように患者に投与される。別の好ましい実施形態によれば、薬剤は、サプレッサーＴｒｅｇ細胞の阻害を導いて免疫応答を高めるシグナルを無効にする用量または条件下で患者に投与される。
【００４４】
別の好ましい実施形態によれば、ｉｎ ｖｉｖｏで癌を処置する方法は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能的シグナル伝達を調節する少なくとも１の薬剤を、Ｔｒｅｇ細胞の抑制効果を無効にして癌に対する免疫応答を誘導できる、ＴＮＦＲＳＦ２５の連続的な刺激を供給する用量および条件において、患者の必要に応じて患者に投与することを含んでなる。
【００４５】
別の好ましい実施形態によれば、免疫細胞の調節およびそれに続く応答は、例えば癌、ウイルス性疾患、またはいずれかの感染性の生命体により引き起こされる疾病のような疾病にかかった患者を処置する方法を含んでなり、該方法では、抗ＴＮＦＲ２５組成物が患者に投与されて、免疫細胞の機能、例えば以前に抑制されたかもしくは減弱されたリンパ球の増殖を調節するか、または免疫応答は正常である場合に、免疫応答の増大によってさらに有効で迅速な患者の処置がもたらされる。腫瘍の固有の免疫原性（すなわち、操作されていない腫瘍が防御的免疫を刺激する能力）が失われていない場合の負の制御経路は、腫瘍の進行の免疫によるコントロールの阻止に重要な役割を果たす。治療上の意味としては、免疫の減弱／抑制性の制御回路に対抗することによって免疫による癌のコントロールは成功し、これは少なくとも強力なワクチン接種プロトコルの開発よりも重要なことである。
【００４６】
腫瘍ワクチン：このようにＴＮＦＲ２５アゴニストは、Ｔ細胞の活性化および腫瘍特異的な抗原に対する細胞性免疫応答を亢進することから、例えば腫瘍ワクチンに対する有効な生物学的応答の修飾因子であるが、一方でＴＮＦＲ２５アンタゴニストはＴ細胞の活性化を遮断または阻害する。従って本発明の別の態様は、腫瘍ワクチンの有効性を増大させる方法および治療薬に関する。
【００４７】
腫瘍ワクチンは、癌と戦うために身体の自然免疫系の要素を用いる試みである。腫瘍ワクチンは１以上の腫瘍特異的な抗原を含み、かつアジュバントおよび生物学的応答の修飾因子を含み得る。腫瘍特異的な抗原は、腫瘍細胞内または腫瘍細胞上に実質的に限定して発現し、かつこれらの腫瘍細胞を標的とすることが意図された免疫応答を刺激するために用いることのできるポリペプチドである。異なる型のワクチンが、異なる型の癌を処置するために用いられる。抗原性組成物がワクチンとして有用であるためには、抗原性組成物は、細胞または組織内で抗原に対する免疫応答を誘導しなければならない。本明細書で用いられる「抗原性組成物」は、抗原（例えばペプチドまたはポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば抗原の発現ベクター）、または抗原を発現もしくは提示する細胞を含んでなってよい。
【００４８】
ワクチンまたはその他の抗原性の刺激物質に対する免疫応答の増大は、例えば増殖アッセイ、サイトカインの分泌、分泌されるサイトカインの型、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどのような従来法のいずれかを用いて測定することができる。増大した免疫応答は、処置をモニターすることによってもまた検出できる。例えば癌を処置する場合、増大した免疫応答は、以下の効果のうち１以上を観察することによってもモニターできる：（１）（ｉ）速度の減少（ｉｉ）血管新生の抑制、および（ｉｉ）増殖の完全な停止を含む、ある程度までの腫瘍増殖の抑制；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍サイズの維持；（４）腫瘍サイズの縮小；（５）（ｉ）縮小（ｉｉ）速度の減少、または（ｉｉｉ）腫瘍細胞の末梢臓器への浸潤の完全な防止を含む抑制；（６）（ｉ）縮小（ｉｉ）速度の減少、または（ｉｉｉ）転移の完全な防止を含む抑制；（７）（ｉ）腫瘍サイズの維持（ｉｉ）腫瘍サイズの縮小（ｉｉｉ）腫瘍の増殖速度の減少（ｉｖ）浸潤の縮小、速度の減少、または防止をもたらし得る抗腫瘍免疫応答の増大、および／または（８）疾患に付随する１以上の症状の重症度または数のある程度までの軽減。
【００４９】
別の好ましい実施形態によれば、抗ＴＮＦＲ２５は、抗ＴＮＦＲ２５抗体を発現するベクターコンストラクトとして投与することができる。加えてベクターコンストラクトは、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のようなサイトカイン、およびＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０のような共刺激分子をコードするヌクレオチド配列を含んでよい。サイトカインは、抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球応答の両方を含む被験体の免疫系の応答を微調整して、感染または疾病状態をコントロールまたは排除するために必要とされる応答の特定のレベルを引き出すため、様々に組み合わせて用いることができる。ポリヌクレオチドはまた、抗原性ポリペプチド、例えば抗腫瘍抗原、抗ウイルス性抗原など、およびＣＴＬＡ−４のような共刺激分子を含む融合産物をコードしてもよい。適切なベクターの例は、ポリオウイルス、ワクシニア、カナリアポックス、および鶏痘のようなポックスウイルス類、ナマズ疱疹ウイルス（ｃａｔｆｉｓｈ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）を含む疱疹ウイルス類、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルス類を含むウイルス性ベクターを含んでなる。代表的な細菌性ベクターには、サルモネラ、シゲラ、エドワージエラ・イクタルリ、エルシニア・ラッケリ、およびリステリア・モノサイトゲネスの弱毒化型が含まれる。Ｌ．モノサイトゲネスは、動物におけるＴｒｅｇの増殖刺激に用いて、後に動物あたりのＴｒｅｇを高い収率で回収するための研究ツールとしても役立つ。
【００５０】
併用療法
好ましい実施形態によれば、免疫応答の増大または上方制御のために１以上の治療法が併用され得る。抗ＴＮＦＲ２５抗体は、例えば、１以上の薬剤または処置方法による処置前に、処置と同時に、または処置後に投与することができる。
【００５１】
別の実施形態によれば、ＴＮＦＲ２５組成物は自己細胞に投与することができ、これによって増殖した細胞の患者への再注入が可能となる。
【００５２】
ＴＮＦＲ２５刺激剤は、ベクター内のポリヌクレオチド、リポソーム、核酸、ペプチドなどとして、医薬組成物中に加えることができる。
【００５３】
別の好ましい実施形態によれば、ＴＮＦＲ２５刺激薬は、追加の１以上の薬理学的に有効な薬剤と共に投与してよい。本明細書で用いられる「薬理学的に有効な薬剤」の語は、原核生物または真核生物の細胞において、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで生理的な効果（例えば治療上の、または予防的な効果）を有することのできる薬物のようないずれの薬剤も指し、限定はされないが、これらには化学療法剤、毒素、放射線療法、放射線感作薬剤、遺伝子治療ベクター、アンチセンス核酸コンストラクトまたは低分子干渉ＲＮＡ、造影剤、診断薬、細胞内タンパク質、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドと相互作用することが知られている薬剤が含まれる。
【００５４】
さらなる薬理学的に有効な薬剤は、例えば、鎮痛剤、麻酔薬、抗炎症薬、駆虫薬、抗不整脈薬剤、抗ぜんそく薬、抗生物質（ペニシリンを含む）、抗癌剤（タキソールを含む）、抗凝固剤、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗てんかん薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、降圧薬、抗ムスカリン薬、抗ミコバクテリア薬、抗悪性腫瘍薬、抗酸化剤、解熱剤、免疫抑制剤、免疫賦活薬、抗甲状腺薬、抗ウイルス薬、抗不安、鎮静剤（催眠剤および神経遮断薬）、収斂剤、静菌剤、ベータアドレナリン受容体遮断薬、血液製剤および代替薬、気管支拡張薬、緩衝剤、心変力薬、化学療法剤、造影剤、副腎皮質ステロイド、鎮咳薬（去痰薬および粘液溶解薬）、診断薬、診断用造影剤、利尿薬、ドーパミン作動薬（抗パーキンソン病薬）、フリーラジカル消去剤、増殖因子、止血剤、免疫薬、脂質調節剤、筋弛緩剤、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチド、副交感神経刺激薬、副甲状腺のカルシトニンおよび二ホスホン酸塩、プロスタグランジン、放射性医薬品、ホルモン、性ホルモン（ステロイドを含む）、徐放性結合剤、抗アレルギー薬、刺激薬および食欲抑制薬、ステロイド、交感神経作動薬、甲状腺薬、ワクチン、血管拡張薬、およびキサンチンを含む、様々な既知の薬物の分類から選択することができる。
【００５５】
さらなる薬理学的に有効な薬剤は、治療薬である必要はない。例えば薬剤は、それが送達される局所的な細胞に対して細胞傷害性であってよいが、被験体に対しては概して有益な効果を有する。さらに薬剤は、バイオイメージングのための造影剤のように、それ自体は直接に治療上の活性をもたない診断薬であってもよい。
【００５６】
化学療法：ＴＮＦＲ２５組成物は、化学療法を伴って投与されてよい。例えば抗ＴＮＦＲ２５の投与により、化学療法の必要が減じ得るか、または化学療法がなお必要とされるかもしくは推奨される場合でも用量は減少する可能性があり、これによってこれらの化学療法剤の幾つかの有害な副作用が軽減される。癌の治療法には、化学薬剤および照射の両方による処置を用いた、様々な併用療法もまた含まれる。併用の化学療法には、例えばシスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤、超プラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサート、または前述のいずれかの類似体もしくは誘導変異体が含まれる。
【００５７】
放射線療法：組成物は、放射線療法と併用してよい。ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く用いられているその他の因子には、一般にガンマ線、Ｘ線として知られるもの、および／または腫瘍細胞へ向けた放射性同位元素の送達が含まれる。ＤＮＡ損傷因子のその他の型は、マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および米国特許第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射などとしてもまた意図される。おそらくこれらの因子は全て、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持において、ＤＮＡに広範な損傷を与える効果があると考えられる。Ｘ線の用量範囲は、長期間（３〜４週間）に対する一日用量の５０〜２００レントゲンから、単一用量の２０００〜６０００レントゲンである。放射性同位元素の用量範囲は非常に広範であり、同位元素の半減期、放出される放射線の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００５８】
免疫療法：抗ＴＮＦＲ２５薬剤は、免疫療法のその他の型と併用してよい。例えば癌の処置に関して免疫療法は一般に、癌細胞を標的とし、これを破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子（例えばモノクローナル抗体）の使用に依存している。このような例は、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））またはベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））である。免疫エフェクターは、例えば腫瘍細胞表面のあるマーカーに特異的な抗体であってよい。抗体単独で治療法のエフェクターとして役立つか、または実際に細胞を死滅させる効果のために、その他の細胞が動員され得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合させて、単に標的指向化剤としてもよい。あるいはエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。治療様式の併用、すなわち直接の細胞傷害活性、および例えば抗ＴＮＦＲ２５抗体によるその免疫エフェクター応答の増大により、癌の処置における治療上の利点が提供され得る。
【００５９】
抗原特異的な免疫応答は１以上の腫瘍抗原を標的とする可能性があり、ＴＮＦＲ２５組成物の投与によってこれらの腫瘍抗原に向けられた免疫応答は増大し得る。多くの腫瘍マーカーが存在し、それらのいずれも本発明に関連する標的指向化に適し得る。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、およびｐ１５５が含まれる。免疫療法の別の態様は、抗癌効果の免疫刺激効果との併用である。存在する免疫刺激分子には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマＩＦＮのようなサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８のようなケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドのような増殖因子が含まれる。免疫刺激分子を、タンパク質として、または遺伝子送達を用いて、ＭＤＡ−７のような腫瘍抑制因子と併用することで抗腫瘍効果は増大する。
【００６０】
癌の受動免疫療法に対する幾つかの異なったアプローチが存在する。これらは大まかには以下のように分類され得る：抗体単独の注射；抗体と毒素または化学療法剤を組み合わせた注射；抗体と放射性同位元素を組み合わせた注射；抗イディオタイプ抗体の注射；および最後に、骨髄内の腫瘍細胞の一掃。患者における副作用が少ないかまたは無であることから、好ましくはモノクローナル抗体が受動免疫療法に用いられる。
【００６１】
能動免疫療法では、抗原性のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自己もしくは同種の腫瘍細胞組成物、すなわち「ワクチン」が、一般には特徴的な細菌性アジュバントと共に投与される。メラノーマの免疫療法では、高いＩｇＭ応答を誘発する患者は、ＩｇＭ抗体の誘発が無であるかまたは低い患者よりもしばしば長く生存する。ＩｇＭ抗体は普通は一過性の抗体であるが、抗ガングリオシドまたは抗炭水化物抗体については例外であると思われる。
【００６２】
養子免疫療法では、患者の循環リンパ球、または腫瘍浸潤性のリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで分離し、ＩＬ−２のようなリンホカインで活性化するか、または腫瘍壊死のための遺伝子を導入する。ＴＮＦＲ２５組成物、例えば抗ＴＮＦＲ２５抗体は、次に再注入する細胞と共に投与するかまたは培養する。これを達成するため、免疫学的に有効な量の活性化リンパ球が、抗ＴＮＦＲ２５、および任意に、アジュバントが取り込まれた抗原性のペプチド組成物と組み合わせて、動物またはヒト患者へ投与され得る。活性化リンパ球は、血液または腫瘍サンプルから予め分離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化した（または「増殖した」）患者自身の細胞が最も好ましいであろう。この形の免疫療法は、幾つかの事例においてメラノーマおよび腎癌の退縮を導いたが、応答した者のパーセンテージは応答しなかった者よりも低かった。抗ＴＮＦＲ２５は、処置を行う医師または看護師によって決定され得る投与計画に従って、細胞の再注入後に患者へ投与され得る。
【００６３】
免疫抑制剤：１以上のＴＮＦＲＳＦ２５薬剤は、抑制された免疫応答を維持することが望ましい場合に（例えば自己免疫疾患）、１以上の免疫抑制剤と共に投与されてよい。免疫抑制剤の例には、ミコフェノール酸、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、エリデル；タクロリムスおよびシロリムス；ミノサイクリン；レフルノミド；またはメトトレキサートが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
外科手術：癌患者のおおよそ６０％が、予防的な、診断用またはステージ分類用の、根治的な、および対症療法的な外科手術を含む、何らかの型の外科手術を経験し得る。根治的外科手術は、本発明による処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法のようなその他の治療法と併用して用いられ得る、癌の処置である。
【００６５】
根治的外科手術には、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、摘出、および／または破壊する、切除が含まれる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡的に制御された外科手術（モース術）が含まれる。本発明は、表在癌、前癌病変、または正常組織の偶発的な量の除去と併用して用いられ得ることがさらに意図される。
【００６６】
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部もしくは全部の摘出により、身体には空洞が形成され得る。処置は、追加の抗癌療法による、領域の灌流、直接注射、または局所的適用によって達成され得る。このような処置は、例えば１、２、３、４、５、６、もしくは７日おきに、または１、２、３、４、および５週間おきに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月おきに反復され得る。これらの処置では、投薬量も同様に変動し得る。
【００６７】
その他の薬剤：処置の治療上の有効性を改善するため、その他の薬剤を本発明と併用し得ることが意図される。これらの追加薬剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合の増加に影響を与える免疫調節剤、細胞接着を阻害し、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感度を増大させる細胞増殖阻害剤および分化誘導剤、またはその他の薬剤が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマ；ＩＬ−２およびその他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよびその他のサイトカイン類似体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、およびその他のケモカインが含まれる。細胞表面受容体またはそのリガンド、例えばＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４、もしくはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ−２リガンド）の増加により、本発明の能力を増強し得ることがさらに意図される。ギャップ結合の数の増加による細胞内シグナル伝達の増大は、望ましい細胞集団における増殖効果を増大し得る。
【００６８】
Ａｐｏ２リガンド（Ａｐｏ２Ｌ、ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）サイトカインファミリーのメンバーである。ＴＲＡＩＬは多くの型の癌細胞において迅速にアポトーシスを起こすが、正常細胞に対してはなお無毒である。ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡは広く様々な組織で発生する。ほとんどの正常細胞はＴＲＡＩＬの細胞傷害作用に対して抵抗性であると思われることから、ＴＲＡＩＬによるアポトーシスの誘導に対して保護可能な機構の存在が示唆される。デスレセプター４（ＤＲ４）とも呼ばれる、ＴＲＡＩＬについて記載された第１の受容体は細胞質「デスドメイン」を含み；ＤＲ４はＴＲＡＩＬにより運ばれるアポトーシスシグナルを伝達する。ＴＲＡＩＬに結合するさらなる受容体が同定されている。ＤＲ５と呼ばれる一受容体は細胞質デスドメインを含み、ＤＲ４に非常によく似たアポトーシスシグナルを伝達する。ＤＲ４およびＤＲ５のｍＲＮＡは、多くの正常組織および腫瘍細胞株に発現する。ＴＲＡＩＬによるＤＲ４およびＤＲ５を通したアポトーシスの誘導を阻止する、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２のようなデコイ受容体が同定された。従ってこれらのデコイ受容体は、アポトーシス促進性サイトカインに対する感度を細胞表面で直接制御するための新規な機構を表す。正常組織におけるこれらの抑制性受容体の優先的な発現により、ＴＲＡＩＬは、癌細胞にアポトーシスを誘導するが正常細胞には寛容である抗癌剤として有用であり得ることが示唆される。
【００６９】
細胞傷害性の化学療法薬を導入した癌の治療法には多くの利点がある。しかしながら、化学療法の結果の一つは薬物抵抗性をもつ表現型の発生／取得および多剤耐性の発生である。薬物抵抗性の発生は、いまだにこのような腫瘍の処置における主要な障害であることから、免疫応答の増大によって代替アプローチが提供される。
【００７０】
治療法の別の形には、患者の組織を高温（１０６°Ｆまで）に曝露する手順である、温熱療法が含まれる。外部または内部の加温装置が、局所、領域、または全身への温熱療法の適用に関与し得る。局所的温熱療法は、腫瘍のような小さな領域への熱の適用に関与する。熱は、身体外の装置からの腫瘍を標的とした高周波によって外部から発生し得る。内部の熱は、細い、熱した針金もしくは温水を満たした中空のチューブを含む無菌プローブ、埋め込まれたマイクロ波アンテナ、または高周波電極に関与し得る。
【００７１】
患者の臓器または肢を、磁石のような高エネルギーを発生する装置を用いて達成される領域的治療法のために加温する。あるいは、患者の血液の幾らかを、内部で加温され得る領域内へ還流する前に採取し、加温してよい。癌が身体に拡散した場合には、全身の加温も行われ得る。この目的のために、温水毛布、ホットワックス、誘導コイル、および熱チャンバーが用いられてよい。
【００７２】
ホルモン療法もまた、本発明と併用して、またはこれまでに記載したその他の癌治療法のいずれかと組み合わせて用いられてよい。ホルモンの使用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頸癌のような特定の癌の処置において、テストステロンまたはエストロゲンのような特定のホルモンの効果のレベルを低下させるかまたは遮断するために利用され得る。この処置は、処置の選択肢として、または転移の危険性を減少させるために、しばしば少なくとも１のその他の癌治療法と併用される。
【００７３】
組成物の投与
医薬製剤およびワクチンは、経口（固体または液体）、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）、または皮下注射）、経皮（受動的に、またはイオン泳動もしくはエレクトロポレーションの使用）、経粘膜（経鼻、経膣、経直腸、または舌下）、もしくは吸入の投与経路によって、または生分解性の挿入剤を用いて投与されてよく、かつ各投与経路に適した剤形に処方することができる。
【００７４】
ｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍細胞を標的とするため、上記の組成物は、適切ないずれかの製剤によってヒトを含む動物に投与されてよい。例えば腫瘍細胞を標的とするための組成物は、生理食塩水もしくは緩衝食塩水のような、薬剤的に許容される担体または希釈剤中に処方されてよい。適切な担体および希釈剤は、投与の方法および経路ならびに標準的な薬務に基づいて選択できる。代表的な薬剤的に許容される担体および希釈剤、ならびに医薬製剤についての記述は、この分野の標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＵＳＰ／ＮＦに見出される。組成物の安定および／または保存のため、その他の物質が組成物に添加されてよい。
【００７５】
本発明の組成物は、いずれかの従来法によって動物に投与されてよい。組成物は、例えば内部または外部の標的部位への外科的送達によって、または血管が到達できる部位へのカテーテルによって、標的部位へ直接投与されてよい。送達のその他の方法、例えばリポソームによる送達、または組成物を浸透させた装置からの拡散は、当該技術分野において公知である。組成物は、単回のボーラス、複数回の注射、または持続的な点滴（例えば静脈内への）によって投与されてよい。非経口投与のために、組成物は、好ましくは無菌で発熱物質を含まない形に処方される。
【００７６】
幾つかの実施形態によれば、組成物またはワクチンは、肺への送達によって投与される。組成物またはワクチンは、吸入する間に哺乳類の肺へ送達され、肺上皮の内面から血流へと横断する［例えば、Ａｄｊｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９０；７：５６５ ５６９；Ａｄｊｅｉ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １９９０；６３：１３５ １４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １９８９；１３（ｓｕｐ５）：１４３ １４６（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，ｐｐ．２０６ ２１２（αｌアンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９；８４：１１４５−１１４６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，１９９０；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組み換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；１４０：３４８２ ３４８８（インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子α）；およびＰｌａｔｚ，ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）を参照されたい。全身性の効果のための、薬物の肺への送達についての方法および組成物については、Ｗｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第５，４５１，５６９号に記載される。Ｌｉｃａｌｓｉ ｅｔ ａｌ．に付与された米国特許第６，６５１，６５５号も参照されたい。
【００７７】
本発明の実行における使用が意図されるものは、治療上の産物を肺へ送達するために設計された広範な機械装置であり、全てが当業者に公知である噴霧器、定量吸入器、および散剤吸入器が含まれるが、これらに限定されない。本発明の実行に適した市販装置の幾つかの特定の例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｉｎｃ．，セントルイス、ミズーリ州）；Ａｃｏｒｎ ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，イングルウッド、コロラド州）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．，リサーチ・トライアングル・パーク、ノースカロライナ州）；およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ散剤吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．，ベッドフォード、マサチューセッツ州）である。これらの装置は全て、治療薬の分配に適した製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は用いる装置の型に特異的であり、治療法に有用な通常の希釈剤、補助剤、界面活性剤、および／または担体に加えて、適切な噴霧剤物質の使用が含まれ得る。また、リポソーム、マイクロカプセルもしくはミクロスフェア、包接体、またはその他の型の担体の使用も意図される。
【００７８】
一般に、定量吸入装置による使用のための製剤は、界面活性剤の補助によって噴霧剤中に懸濁された治療薬を含む、微粉化した散剤を含んでなり得る。噴霧剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、もしくはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはそれらの組み合わせのような、この目的のために用いられる従来の物質のいずれであってもよい。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが含まれる。オレイン酸もまた界面活性剤として有用である。
【００７９】
散剤吸入装置から分配するための製剤は、治療薬を含み、かつ乳糖、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールのような増量剤を、装置からの散剤の分散を促進する量、例えば製剤の５０〜９０重量％において含み得る、微粉化した乾燥散剤を含んでなってよい。治療薬は、最も有利には、肺の遠位へ最も効果的に送達するため、平均粒径が１０ｍｍ（またはミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５ｍｍである、粒状の形に調製されなけらばならない。
【００８０】
治療薬の経鼻またはその他の粘膜送達もまた意図される。経鼻送達により、組成物の鼻への投与後、産物の肺における沈着を必要とせずに血流への直接の通過が可能となる。経鼻送達のための製剤には、補助剤としてデキストランまたはシクロデキストランおよびサポニンを含むものが含まれる。
【００８１】
本発明の組成物またはワクチンは、１以上の追加の有効成分、医薬組成物、またはワクチンと併用して投与され得る。本発明の治療薬は、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトへ投与され得る。
【００８２】
持続放出系：第１の持続放出系には、薬剤が、薬剤の水性環境（すなわち消化管液）への放出を遅延させる別の物質のマトリックス内に包埋または分散される、マトリックス系が含まれる。薬剤がこの種のマトリックス内に分散されると、主にマトリックス表面から薬物の放出が起こる。従って、薬物はマトリックスを組み入れた装置の表面から、薬物がマトリックスを通して拡散した後か、または該装置の表面が浸食されて薬物が曝露されたときに放出される。幾つかの実施形態によれば、両機構は同時に作動させることができる。マトリックス系は大きな、すなわち錠剤のサイズ（約１ｃｍ）であるか、または小さい（＜０．３ｃｍ）サイズであってよい。この系は単一（例えばボーラス）であってよいか、実質的に同時に投与される幾つかのサブユニット（例えば単一用量を構成する幾つかのカプセル）からの構成によって分割されてよいか、または多粒子とも表される複数の粒子を含んでなってよい。多粒子は多くの製剤へ応用できる。例えば多粒子は、カプセル殻に満たされた散剤として用いてよいか、または摂取を容易にするため、それ自体を食物に混合して用いてもよい。
【００８３】
特定の実施形態によれば、マトリックス多粒子は薬剤を含む複数の粒子を含んでなり、各粒子は、薬剤および／またはその類似体を、例えば薬剤の水性溶媒中への溶解率を制御できるマトリックスを形成するために選択される１以上の賦形剤と共に固溶体／分散剤の形で含んでなってよい。この実施形態に有用なマトリックス物質は、一般にワックス、幾つかのセルロース誘導体、またはその他の疎水性ポリマーのような疎水性物質である。必要に応じ、マトリックス物質は任意に、結合剤または賦活薬として使用できる疎水性物質と共に処方されてもよい。これらの剤形の製造に有用なマトリックス材料は、エチルセルロース、パラフィン、加工植物油、カルナウバろう、水素化ヒマシ油、蜜ろうなどのようなワックス、およびポリ（塩化ビニル）、ポリ（酢酸ビニル）、酢酸ビニルとエチレンの共重合体、ポリスチレンなどのような合成ポリマーである。マトリックス内へ任意に処方できる水溶性もしくは親水性の結合剤または放出改変剤には、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリジノン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、キサンタンガム、カラギーナンのような親水性ポリマー、ならびにその他のこのような天然および合成の材料が含まれる。加えて、放出改変剤として作用する物質には、糖類または塩類のような水溶性物質が含まれる。好ましい水溶性物質には、乳糖、ショ糖、グルコース、およびマンニトール、ならびに例えばＨＰＣ、ＨＰＭＣ、およびＰＶＰのような親水性ポリマーが含まれる。
【００８４】
特定の実施形態によれば、多粒子産物は制御された凝集によって処理されたものとして定義される。この場合薬剤は、適切で溶解可能な担体に溶解されるかまたは部分的に溶解され、マトリックス物質を含んでなる担体粒子上にスプレーされる。
【００８５】
用量：ここに開示される主題の組成物の有効用量が、被験体の必要に応じて被験体に投与される。「処置の有効量」または「治療的な量」は、測定可能な応答（例えば、処置される被験体における生物学的または臨床的な関連応答）を生み出すために十分な治療用組成物の量である。ここに開示される主題の組成物における有効成分の実際の投薬量レベルは、特定の被験体に対して望ましい治療上の応答を達成するために有効な単数または複数の有効化合物量を投与するために変動し得る。選択される投薬量レベルは、治療用組成物の活性、投与経路、その他の薬物または処置との併用、処置される状態の重症度、ならびに処置される被験体の状態および事前の病歴に依存し得る。しかしながら、化合物の用量を、望ましい治療上の効果の達成に必要とされるよりも低いレベルから開始し、望ましい効果が達成されるまで投薬量を次第に増大させることは、当該技術分野における技術の範囲内である。組成物の効力は様々であり得ることから、「処置効果の量」も様々であり得る。しかしながら本明細書に記載されるアッセイ法を用いることにより、当業者はここに開示される主題の候補となる化合物の効力および有効性を容易に評価し、それに従って最適投薬方式を調整することができる。
【００８６】
本明細書に提示される、ここに開示される主題の開示を再検討した後、当業者は、特定の製剤、組成物に用いられる投与方法、および処置される特定の疾病を考慮して、個別の被験体に対する投薬量を調整することができる。用量のさらなる算出には、被験体の身長および体重、症状の重症度および段階、ならびにさらなる有害な健康状態の存在が考慮され得る。このような調整または変動、およびこのような調整または変動をいつどのように行うかについての評価は、医学分野における当業者に公知である。
【００８７】
上に本発明の様々な実施形態を記載したが、これらは例としてのみ提示したものであって、限定ではないことが理解されなければならない。開示される実施形態には、本明細書における開示に従って、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多くの変更が為され得る。従って本発明の広さおよび範囲は、上記実施形態のいずれによっても限定されてはならない。
【００８８】
本明細書において言及する全ての文書は、参照により本明細書に取り込まれる。本出願に引用する全ての出版物および特許文書は、あらゆる目的のために、あたかも個々の出版物および特許文書それぞれが個別に表示されたかのように、同程度まで参照により取り込まれる。本文書内の様々な参考文献におけるそれらの引用によって、出願者は特定の参考文献のいずれも、それらの発明に対する「先行技術」であるとは認めない。発明組成物の実施形態および方法を、以下の実施例において例証する。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下の限定されない実施例は、選択された本発明の実施形態の例証に役立つものである。表示される、割合における変動および成分要素の代替物は当業者に明らかであり、本発明の実施形態の範囲内であることが認識されるであろう。
【実施例１】
【００９０】
ＴＮＦＲＳＦ２５によるＩｎ Ｖｉｖｏでの治療用Ｔｒｅｇの増殖は、アレルギー性の肺炎症を阻止する。
腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）は、リンパ系および非リンパ系細胞の両方に差次的に発現する少なくとも１９のリガンドおよび３０の受容体（ＴＮＦＲＳＦ）からなる。ＣＤ３＋Ｔ細胞において、ＴＮＦＳＦシグナルは、極性化、増殖、エフェクター機能、減少、メモリー、および細胞死を含む免疫応答の様々な段階を支持するために、通常はＴＣＲ依存性の方法で機能する。ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３、以下ＴＮＦＲ２５と称する）は、ごく最近発見されたＴＮＦＳＦメンバーの一つであり、主にＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴならびにナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に発現する（Ｆａｎｇ，Ｌ．，Ａｄｋｉｎｓ，Ｂ．，Ｄｅｙｅｖ，Ｖ．，ａｎｄ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０３７−１０４８）。ＴＮＦＲ２５のリガンドであるＴＮＦＳＦ１（ＴＬ１Ａ）は一部の内皮細胞に発現し、ＴＬＲ４またはＦｃγＲのシグナル伝達に従って樹状細胞およびマクロファージ／単球上に迅速に誘導される（Ｍｅｙｌａｎ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９：７９−８９；Ｐｒｅｈｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．２００７．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７８：４０３３−４０３８）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験により、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはナチュラルキラーＴ細胞におけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達が、ＴＣＲの活性化またはＩＬ−１２およびＩＬ−１８による共刺激に続いて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＦＮγの産生を増大することが示された（Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｋ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：４９８５−４９９０）。ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達はまた、ＩＬ−２依存性の機構による、ＣＤ２８の共刺激なしのＴＣＲによる増殖に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の閾値も低くする（Ｍｅｙｌａｎ ｅｔ ａｌ．２００８；Ｍｉｇｏｎｅ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：４７９−４９２）。
【００９１】
ＴＬ１ＡによるＴＮＦＲ２５の活性化は、実験的喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ（ＲＡ）、および実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）における病態を悪化させる（Ｐａｐｐｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０４９−１０６２）。これらの各研究で、ＴＮＦＲ２５は抗原依存性にＴｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７の極性化を刺激し、かつＴＣＲにより活性化されたエフェクターＴ細胞は、各Ｔヘルパーサブセットからの関連するエフェクターサイトカインの産生を増大させる。ＴＮＦＲ２５のシグナルは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７系統への分化には必用とされない。これらの報告のいくつかにおいて、ＴＮＦＲ２５またはＴＬ１Ａ遺伝子を除去されたマウスモデル（Ｐａｐｐｕ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｔａｋｅｄａｔｓｕ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３５：５５２−５６７．Ｂｕｌｌ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：２４５７−２４６４）、ドミナントネガティブＴＮＦＲ２５を発現するトランスジェニックマウスモデル、または抗体によるＴＬ１Ａの全身性の遮断が研究された。ＴＬ１ＡもしくはＴＮＦＲ２５を欠損したマウスモデルまたはＴＬ１ＡからＴＮＦＲ２５への正常なシグナル伝達が阻害される自己攻撃性疾患（ａｕｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）モデルにおいて、免疫異常または疾病感受性は観察されなかった。さらにこれらの各報告において、ＴＮＦＲ２５またはＴＬ１Ａの発現は、動物にとってＴＮＦＲ２５またはＴＬ１Ａが存在しないことよりもさらに有害であると思われる、炎症誘発性の表現型を生み出す。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）がＴＮＦＲ２５を発現し得るにもかかわらず（Ｐａｐｐｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０４９−１０６２）、今日までＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５の役割について試験したという報告はない。致死的な自己免疫の防止におけるＴｒｅｇの重要性、ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の発現、および複数の自己攻撃性疾患（ａｕｔｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）モデルの病因におけるＴＮＦＲ２５の機能を考え、本発明者らは、Ｔｒｅｇの機能におけるＴＮＦＲ２５の役割について研究することを決定した。この研究により、ＴＮＦＲ２５は、従来のＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）によってではなく、Ｔｒｅｇによって高度に発現することが明らかになった。外来性抗原の非存在下で、アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２を用いてｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ２５を刺激すると、４Ｃ１２による処置後４日以内に、Ｔｃｏｎｖではなく天然型Ｔｒｅｇが、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の３０〜３５％まで迅速かつ選択的に増殖し、これはＴＣＲのＭＨＣＩＩとの会合およびＩＬ−２シグナル伝達に依存する。ＴＮＦＲ２５によるＴｒｅｇの増殖は、気道からの抗原曝露による肺炎症から感作マウスを保護する。これらのデータにより、Ｔｒｅｇの制御因子としての、ＴＮＦＲ２５の新規な役割が示される。この役割により、アレルギー性喘息の病因から保護され得る。さらに、ヒトにおけるＴｒｅｇを用いた治療法の臨床における使用を促進するために、ＴＮＦＲ２５アゴニストによるｉｎ ｖｉｖｏでの天然型Ｔｒｅｇの増殖によって、ＩＬ−２またはｅｘ ｖｉｖｏに基づくアプローチの代替法としての、臨床応用可能な方法が提供され得る。
【００９２】
材料および方法：
マウス：野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州）から購入した。Ｂ６バックグラウンドのＦｏｘｐ３−ＲＦＰレポーターマウス（Ｗａｎ，Ｙ．Ｙ．，ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．２００５．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：５１２６−５１３１））、ＦｏｘＰ３−ＧＦＰ（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２：３２９−３４１；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｇａｖｉｎ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．２００３．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：３３０−３３６）、ならびにＣＤ４５．１ ＳＪＬ、ＭＨＣ ＩＩ−／−、ＩＬ−２受容体ベータ変異体、ＣＤ８０／８６−／−、およびＣＤ４−／−マウスは、発明者らの動物施設で繁殖させた。ＴＬ１Ａ−／−マウスはＬｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（ウッドランド、テキサス州）から購入し、Ｓｐｅｅｄ ＣｏｎｇｅｎｉｃｓによってＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドへ戻し交配した。マウスは６〜１２週齢で使用し、ＵＭ動物施設において、病原体のない状態で維持した。全ての動物の使用手順は、マイアミ大学動物実験委員会によって承認された。
【００９３】
抗体および試薬。フローサイトメトリーに使用するための市販の抗体は、ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。アルメニアンハムスターＩｇＧアイソタイプコントロールは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＤＴＡ−１（α−ＧＩＴＲ）はＢｉｏＸＣｅｌｌから、ＬＧ．３Ａ１０（α−ｌＬ−２７）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから、および１５８３２１（α−４−１ＢＢ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。組み換えマウスＩＬ−２、および抗ＩＬ−２モノクローナル抗体であるクローンＪＥＳ６−１Ａ１２は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。組み換えマウスＩＬ−２／抗ＩＬ−２複合体（ＩＡＣ）は、１０，０００単位のｒｍＩＬ−２を、５μｇのＪＥＳ６−１Ａ１２と共に１５分間２５℃にてインキュベートすることにより産生した。マウスＴＮＦＲ２５に対する抗体（４Ｃ１２、アゴニスト）を産生するアルメニアンハムスターハイブリドーマは、以前に記載されるように産生した（Ｆａｎｇ，Ｌ．，Ａｄｋｉｎｓ，Ｂ．，Ｄｅｙｅｖ，Ｖ．，ａｎｄ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０３７−１０４８）。４Ｃ１２（α−ＴＮＦＲ２５）およびＯＸ−８６（α−ＯＸ４０）は、ホローファイバーバイオリアクター（Ｆｉｂｅｒｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、フレデリック、メリーランド州）内で産生し、無血清の上清からプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）によって精製した。ラパマイシン（ラパミューン、Ｗｙｅｔｈ）は、以前に記載されるように（Ａｒａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔｕｒｅ ４６０：１０８−１１２．）、７５μｇ／ｋｇ／日において使用した。シクロスポリンＡ（２５ｍｇ／ｋｇ／日）、ＦＫ５０６（３ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＡｋｔ阻害剤Ｖ（Ｔｒｉｃｉｒｂｉｎｅ、指示されるように、１．５ｍｇ／ｋｇ／日、または１日２回）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤから購入し、腹腔内注射により投与した。
【００９４】
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング：脾臓およびリンパ球から単一細胞懸濁液を調製した。１０６個の細胞を抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２によってプレブロックし、異なる抗体の組み合わせによって染色した。標準的な手順に従い、細胞内染色を行った。フローサイトメトリー分析は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ装置およびＤＩＶＡまたはＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェアにより行った。細胞ソーティングは、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されるＥａｓｙＳｅｐ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ Ｐｒｅ−Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔを用いて脾細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した後、ＦＡＣＳＡｒｉａ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ）により行った。
【００９５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：急速冷凍した大腸または肺組織切片から全ＲＮＡを抽出し、ＱＩＡＧＥＮから市販されるＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＫｉｔおよびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔをそれぞれ用いて逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されるＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＡＢＩ ７３００ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒにより、リアルタイムＰＣＲを二重に行った。サンプルはβアクチンに対して標準化した。
【００９６】
養子移入。図２Ａおよび２Ｂの研究のため、ＦＩＲマウスから全ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳソーティングし、ソーティング後にＦｏｘＰ３＋ＲＦＰ＋細胞のパーセンテージを決定した。−２日目に、１０６個のＦｏｘＰ３＋細胞を含む全ＣＤ４＋細胞を、ＭＨＣＩＩ−／−またはＣＤ４−／−マウスへ養子移入（ｉ．ｖ．）した。０日目に、マウスを４Ｃ１２抗体またはアイソタイプコントロールによって処置した。図１１Ａ〜１１Ｅの研究のため、ＣＤ４５．２＋ＦＩＲマウスからＦＡＣＳソーティングした２×１０６個のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を、静脈内注射を通してＣＤ４５．１コンジェニックＳＪＬマウスに養子移入した。１日後、１０μｇの４Ｃ１２を腹腔内注射によって投与した。末梢血液細胞中の移入細胞の増殖を、ＦＡＣＳにより毎日（３日後に開始）追跡した。
【００９７】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイ：１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を９６ウェル丸底プレートにまき、ＡＰＣ（比率１：１）および異なる比率のＣＤ４＋ＦＩＲ＋制御性Ｔ細胞の存在または非存在下に、２μｇの可溶性抗ＣＤ３（２Ｃ１１）抗体によって活性化した。表示するように、１０μｇ／ｍｌのコントロールＩｇＧ、４Ｃ１２、ＤＴＡ１抗体を添加した。７２時間培養し、最後の６時間を３Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によってパルスした。取り込まれた同位元素を、液体シンチレーション計数（Ｍｉｃｒｏ Ｂｅｔａ ＴｒｉＬｕｘ ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって測定した。
【００９８】
アレルギー性喘息の誘導：０日目に、２００μｌのＰＢＳ中の、６．６ｍｇのミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム塩；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に吸収させた６６μｇの卵白アルブミン（結晶化鶏卵アルブミン、グレードＶ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）のｉ．ｐ．注射によってマウスを感作し、５日目にブーストした。１２日目に、２００μｌのＰＢＳ中の、２０μｇの抗ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体（４Ｃ１２）または２０μｇのヤギ抗ハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，ウェストグローブ、ペンシルベニア州）を、マウスにｉ．ｐ．注射した。１６日目に、ＢＡＮＧ噴霧器（ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウェストウッド、ニュージャージー州）をＪａｅｇｅｒ−ＮＹＵ Ｎｏｓｅ−Ｏｎｌｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ−Ｆｌｏｗ Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で用いることにより、マウスをＰＢＳ中の０．５％卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に１時間エアロゾル曝露した。１９日目にマウスを屠殺し、ＰＢＳで灌流した肺、および気管支肺胞洗浄液を得た。ＲＮＡ、またはフローサイトメトリー分析のために肺ホモジネートから調製される単一細胞懸濁液、または肺組織検査のために肺葉を処理した。続くＲＮＡ分析およびフローサイトメトリー分析のために、気管支の流入領域リンパ節もまた調達した。ＭａｃＢｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いた色調解析（Ｈ ＰＡＳベクターを用いる）およびそれに続く画像の閾値設定（カラー［２］、１００に設定）により、ならびに核計数器（限界を１００〜１０００に設定）を用いた計数により、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した肺切片の定量化を行った。
【００９９】
統計解析：全てのグラフ化および統計解析はＡＢｌ Ｐｒｉｓｍプログラムを用いて行った。対の分析はスチューデントＴ検定を用いて行った。複数の変数分析は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびチューキー事後検定を用いて行った。有意性は、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、および＊＊＊（ｐ＜０．００１）として示す。
【０１００】
結果
ＴＮＦＲ２５は制御性Ｔ細胞によって高度に発現する：この研究よりも前に、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるＴＮＦＲ２５の機能について示した報告はない。ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の発現の有無を確認するため、ＦｏｘＰ３レポーターマウスからＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋（Ｔｃｏｎｖ）およびＴｒｅｇを、９９％を超える純度で単一細胞ソーティングし、続いてＴＮＦＲ２５、ならびにＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、および４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ１３７）の発現をフローサイトメトリーにより分析した。ＦｏｘＰ３プロモーターに基づくバイシストロニックコンストラクトからの赤色蛍光タンパク質ノックイン導入遺伝子を発現するＦｏｘＰ３レポーターマウス（ＦＩＲマウス）の使用により、Ｔｒｅｇ生細胞のソーティングが可能となった。この分析により、ＴＮＦＲ２５、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および４−１ＢＢは全てＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖによって発現するが、Ｔｃｏｎｖによる低い発現に比較して、ＴｒｅｇではＴＮＦＲ２５の非常に高い発現が観察されたことにより、発現レベルにおける最も大きな相対的相違が観察されたことが明らかになった（図１Ａ）。理論に制約されるものではないが、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖの間の差次的なＴＮＦＲ２５の発現により、ＴＮＦＲ２５がＴｒｅｇの機能において重要な役割を果たし得ることが示された。
【０１０１】
ＴＮＦＲ２５の刺激はＴｒｅｇをＩｎ Ｖｉｖｏで迅速に増殖させる：ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の産生については以前に記載している（Ｆａｎｇ，Ｌ．，Ａｄｋｉｎｓ，Ｂ．，Ｄｅｙｅｖ，Ｖ．，ａｎｄ Ｐｏｄａｃｋ，Ｅ．Ｒ．２００８．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：１０３７−１０４８）。ＦＩＲマウスを使用して、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体である４Ｃ１２で処置した後、末梢血におけるＴｒｅｇ集団の頻度および表現型を連続的にモニターした。４Ｃ１２の腹腔内（ｉ．ｐ）注射により、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏにおける迅速で高い再現性のある増殖が誘導された（図１Ｂ）。この増殖は４Ｃ１２注射後４日目および５日目に最大となり、応答のピーク時の末梢血では、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇが全ＣＤ４＋Ｔ細胞の３０〜３５％を含んでなっていた。４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇは、末梢血中、および試験した全ての組織部位で２週間持続したが、ゆっくりと無刺激のレベルまで減少した。４Ｃ１２を腹腔内、皮下、または静脈内注射した後のＴｒｅｇの増殖は同等であることが示されたことから、注射部位はこの増殖に影響しなかった。４Ｃ１２注射後のＴｒｅｇの増殖は用量依存性であり、おおよそ０．４ｍｇ／ｋｇ体重に相当する、わずかに１０μｇの用量によって最大の応答が観察された（図１Ｂ）。ＦＩＲマウスを精製マウスＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合タンパク質（１００μｇ）で処置することにより、４Ｃ１２抗体による処置と同様の規模および動態で、Ｔｒｅｇの増殖が誘導されることが見出された。ＦＩＲマウスにおけるＲＦＰ発現の検出は、ＦｏｘＰ３の転写が存在することを正確に表しているが、ＦｏｘＰ３とＲＦＰはＦｏｘＰ３−ＲＦＰ転写物から独立して翻訳されるため、これによってＦｏｘＰ３タンパク質の発現は保証されない可能性がある。従って、４Ｃ１２投与後のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖は、野生型マウスにおけるＦｏｘＰ３抗体を用いた染色によって、およびＦｏｘＰ３−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＦｏｘＰ３−ＧＦＰノックインレポーターマウスにおいて確認された。
【０１０２】
Ｔｒｅｇが発現するＴＮＦＲメンバーのうち、ＴＮＦＲ２５はＴｒｅｇの増殖を引き起こすことにおいて独特である：ＴＮＦＲＳＦメンバーであるＧＩＴＲおよびＯＸ４０はＴｒｅｇによって発現し（図１Ａ）、Ｔｒｅｇの活性および増殖に効果を及ぼす。４−１ＢＢによるＴｒｅｇの刺激により、これらの細胞の活性および増殖の両方を調節できると考えられる。さらに、ＴＮＦＲＳＦメンバーのＣＤ２７を介したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞の刺激により、ＦｏｘＰ３の発現が誘導されると考えられる。ＴＮＦＲ２５とこれらその他のＴＮＦＳＦメンバーとの間での、機能的抑制またはＴｒｅｇの誘導いずれかの重複を考え、ＴＮＦＲ２５、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、またはＣＤ２７で刺激した後に、Ｔｒｅｇの増殖をｉｎ ｖｉｖｏで比較した。全ての例で、特異的なシグナル伝達を引き起こすために、各受容体に対する十分に特徴付けられたアゴニストモノクローナル抗体を用いた。これらの研究により、試験したＴＮＦＲＳＦの中でもＴＮＦＲ２５は、Ｔｒｅｇの増殖を選択的に誘導するその能力によって独特であることが示された（図１Ｃ）。最近、ＯＸ４０により誘導されるＴｒｅｇの増殖には、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＦＮγの枯渇が必要であったことが報告された（Ｒｕｂｙ，ＣＥ．，ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８３：４８５３−４８５７）。対照的に、ＴＮＦＲ２５により誘導されるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖には、さらなる操作は必要とされなかった。
【０１０３】
ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩおよびＩＬ−２のシグナルが必要とされる：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ｔｒｅｇの増殖は、ＴＣＲ刺激性の抗体、抗原提示細胞、およびＩＬ−２シグナルの様々な組み合わせによって誘導できる。これらの研究では、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体の存在下または非存在下で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体、組み換えＩＬ−２、ＴＧＦ−β、およびレチノイン酸の多くの異なる組み合わせを用いてＴｒｅｇ増殖のｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導を試みたが、全ての例においてＴＮＦＲ２５の刺激はｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ増殖を増大させなかったことから、さらなるシグナルが必要であることが示唆された（表１）。
【０１０４】
表１：ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に対する要件を検討するために、様々な精製したリンパ球集団（表示される）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した条件。
【０１０５】
ＴＮＦＲ２５はＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲシグナルに対する応答性に影響を与え得ることから、次の実験は、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖がｉｎ ｖｉｖｏでのＴＣＲシグナル伝達に依存するか否かを決定するために行った。ＭＨＣＩＩ−／−またはＣＤ４−／−マウスに、ＦＩＲマウスから精製した１０６個のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を含む全ＣＤ４＋細胞を養子移入した。ＭＨＣＩＩ−／−マウスはＣＤ４＋Ｔ細胞を欠損していることから、ＣＤ４＋Ｔ細胞が欠損した環境への養子移入に続いて起こり得るいずれかの恒常性の増殖を制御するため、コントロール集団としてＣＤ４−／−マウスを用いることを決定した。養子移入後２日目に、マウスを４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体によって処置し、抗体注射後４日目および６日目にＴｒｅｇのパーセンテージおよび絶対数を決定した（図２Ａ、２Ｂ）。これらのデータにより、Ｔｒｅｇは野生型およびＣＤ４−／−マウスにおいて同程度まで増殖するが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩ分子が必要であることが示された。ＭＨＣＩＩ−／−マウスはＣＤ４−／−マウスのベースラインよりも多数のＣＤ４＋細胞を有することから、ＭＨＣＩＩ−／−マウスに養子移入されたＴｒｅｇのパーセンテージは、ＣＤ４−／−マウスよりも低いことが観察された（図２Ａ）。しかしながら、養子移入されたＴｒｅｇの絶対数の比較により（図２Ｂ）、２つの群で同等なＴｒｅｇの絶対数が回復したことが示唆される。これらの研究により、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩシグナルが必要であることが示され、このことはＴｃｏｎｖ細胞におけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達と同様、ＴｒｅｇがＴＮＦＲ２５のシグナル伝達に対して許容状態になるためにはＴＣＲシグナル伝達が必要であることが間接的に暗示される。ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にＴＣＲシグナルが必要であることのさらなる証拠を提供するため、マウスをシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６で前処置し、４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置に続いてＴｒｅｇの数を分析した（図２Ｃ、２Ｄ）。これらの研究により、ＭＨＣＩＩシグナルが存在しない場合に観察されたものと同様に；シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６の存在下で、ＴＮＦＲ２５はＴｒｅｇの増殖を誘導できないことが示される。ＭＨＣＩＩにおける同種自己抗原の必要性についてはさらなる研究を行っているが、このような必要性は、外来性抗原の非存在下でのＴＮＦＲ２５のＴｒｅｇ選択性についてのさらなる説明（ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５の選択的発現に加えて、図８Ａ〜８Ｃ）を提供し得る。
【０１０６】
ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達により、ＣＤ２８の共刺激の非存在下でＴＣＲシグナルに続いて起こるＩＬ−２シグナルに対する、Ｔｃｏｎｖの応答性は増大すると考えられる。ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にはＭＨＣＩＩとＮＦＡＴ両方の活性化が必要であることを考え（図２Ａ〜２Ｄ）、ＩＬ−２またはＣＤ８０／８６のシグナルがさらに必要であるか否かについて決定した。非機能的なＩＬ−２受容体ベータ鎖を発現するマウス（図２Ｅ）およびＣＤ８０／８６−／−マウス（図２Ｆ）におけるＴｒｅｇの増殖を、４Ｃ１２の注射後４日目に決定した。これらのデータにより、ＴＮＦＲ２５により誘導されるｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖にＴＣＲおよびＩＬ−２受容体のシグナル伝達は必要であるが、ＣＤ８０またはＣＤ８６の共刺激は必要でないことが示される。理論に制約されるものではないが、ＴｒｅｇにおけるＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のシグナル伝達は、ＴＮＦＲ２５により誘導される増殖には必要でない可能性がある。さらに、ＴＮＦＲ２５、ＴＣＲの刺激、およびＩＬ−２シグナル伝達の組み合わせがｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇの増殖を誘導できなかったことから、研究中のさらなるシグナルが必要とされる。
【０１０７】
ＴＮＦＲ２５により刺激されたＴｒｅｇは、Ｅｘ ＶｉｖｏでＩＬ−２により誘導される増殖に対して高応答性である：ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要なものについてはさらなる研究が必要であるが、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体によって処置したマウスから精製したＴｒｅｇは、ｅｘ ｖｉｖｏでのＩＬ−２により誘導される増殖に対して高応答性であることが観察された（図３Ａ）。これらのデータは、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖におけるＩＬ−２シグナルの重要性を実証し（図２Ｅ）、ＴＮＦＲ２５は、ＩＬ−２に対するＴｒｅｇの感受性に影響することによってＴｒｅｇの増殖を誘導することを示唆するものである。この観察を説明し得る、幾つかの可能性のある機構が想像される：１）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてＩＬ−２受容体サブユニットの発現を増大し得る、２）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてＳＴＡＴ５の活性化を増大し得る、３）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてｍＴＯＲの活性化を増大し得る、および４）ＴＮＦＲ２５は、ＴｒｅｇにおいてＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔの活性化を増大し得る。ＩＬ−２受容体アルファ、ベータ、およびガンマ鎖の発現を判定するため、４Ｃ１２抗体による処置後にｉｎ ｖｉｖｏで増殖するＴｒｅｇについてフローサイトメトリーを行い、ＩｇＧコントロール抗体によって処置したマウスから分離したＴｒｅｇと比較した（図３Ｂ）。これらのデータにより、ＩＬ−２受容体アルファ鎖（ＣＤ２５）は、４Ｃ１２への曝露後に実際に減少したが（図７Ａ）、ベータおよびガンマ鎖（それぞれＣＤ１２２およびＣＤ１３２）については、４Ｃ１２およびアイソタイプコントロール抗体により処置したマウスから分離したＴｒｅｇにおいて変化は見られなかったことが示され（図３Ｂ）、選択肢（１）の可能性は事実上除外された。ＳＴＡＴ５のリン酸化が、４Ｃ１２により処置したマウスにおいて増大するか否かを判定するため、予め４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体によって４日間処置したマウスからＴｒｅｇを分離し、ｅｘ ｖｉｖｏでＩＬ−２に曝露した（１０ｎｇ／ｍｌ、１５分）。続いてこれらのＴｒｅｇをリン酸特異的な抗体で染色することにより、４Ｃ１２で処置したマウスから分離したＴｒｅｇでは、コントロールマウスに比較して、ＳＴＡＴ５またはＳ６どちらのリン酸化も増大しなかったことが示され、第２の可能性は事実上除外された（図３Ｃ）。続いて、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ２５により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、ｍＴＯＲの阻害剤であるラパマイシンの存在下で変化しなかったことが見出され、第３の可能性は除外された（図３Ｄ）。最後に、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖にＡｋｔのシグナル伝達が必要であるか否かを判定するため、Ａｋｔ１／２／３の選択的阻害剤であるトリシリビン（Ａｋｔ阻害剤Ｖ、ＡｋｔｉＶ）の存在下または非存在下で、マウスをＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体またはコントロール抗体によって処置した。これらの研究により、Ａｋｔ活性化の選択的阻害はＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖の阻害に十分であることが示され、これはビヒクル処置コントロールの３３．６９±１．２５３％から、、ＡｋｔｉＶによる１日１回の処置では２２．４３±１．３５２％（Ｎ＝６）（データ未提示、ｐ＜０．００１）、ＡｋｔｉＶによる１日２回の処置では１８．２０±２．１１７％（Ｎ＝３）（図３Ｅ、ｐ＝０．０００３）となった。
【０１０８】
抗原未処置マウスにおける、ＴＮＦＲ２５またはＩＬ−２抗体複合体により誘導されたＴｒｅｇの増殖の比較：ｉｎ ｖｉｖｏで選択的にＴｒｅｇを増殖させる唯一のその他の薬剤が、組み換えＩＬ−２および特異的な抗ＩＬ−２抗体であるクローンＪＥＳ６−１Ａ１２との複合体（ＩＡＣ）の使用を通し、Ｂｏｙｍａｎらにより報告された（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１：１９２４−１９２７，２００６）。従って、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖を、４Ｃ１２またはＩＡＣのいずれかによる処置後に直接比較した（図７Ａ）。この分析により、ｉｎ ｖｉｖｏでの４Ｃ１２またはＩＡＣによる処置後の、Ｔｒｅｇ増殖の規模および動態は同様であったことが示された。しかしながら、４Ｃ１２による処置後に増殖したＴｒｅｇの減少は、ＩＡＣに比較して長引くことが観察された。ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇが中程度のＣＤ２５を発現するのとは対照的に、ＩＡＣにより増殖したＴｒｅｇは高レベルのＣＤ２５を発現することが観察された（図７Ｂ）。４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇとＩＡＣにより増殖したＴｒｅｇの比較により、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、細胞内もしくは細胞外ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＩＬ−１７Ａ、またはＩＦＮγの発現にその他の相違は見出されなかった。
【０１０９】
ＴＮＦＲ２５によるＩｎ ｖｉｖｏでのＴｒｅｇの増殖は、アレルギー性の肺炎症を軽減する：４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇが疾病モデルにおける炎症を阻止するか否かを判定するため、マウスを卵白アルブミン／ミョウバンでプライムし、次に気道を卵白アルブミンへ曝露することで誘導された、アレルギー性肺炎症の十分に特徴付けられたモデルにおける炎症を、この処置が軽減し得るか否かについて試験した。０日目および５日目にマウスを卵白アルブミン／ミョウバンでプライムし、次いで１２日目に４Ｃ１２またはハムスターＩｇＧによって処置した。４日後、Ｔｒｅｇ増殖の最大時に、気道をＰＢＳ中でエアロゾル化した卵白アルブミンまたはＰＢＳ生理食塩水コントロールに曝露した。この期間に、末梢血中のＴｒｅｇをモニターすることによってＴｒｅｇの最大増殖を確認した（図４Ａ）。卵白アルブミン／ミョウバン感作後に４Ｃ１２により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、最初の２日間は非感作マウスに比較してわずかに遅延したが、４日目までにＴｒｅｇは全ＣＤ４＋Ｔ細胞の高い割合（５０〜５５％）まで迅速に増殖した（図４Ｂ、４Ｃ）。エアロゾル曝露から３日後、マウスを屠殺し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、気管支リンパ節（ｂＬＮ）、および肺組織を分析した。
【０１１０】
コントロールまたは４Ｃ１２で処置した動物の間で、肺から分離した細胞の総数に変化はなかった。この観察に一致して、肺内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、コントロールと４Ｃ１２で処置したマウスの間で同様であったが、４Ｃ１２により処置したマウスではＴｒｅｇの数が著しく増加していた（図４Ｂ）。肺組織内におけるＴｒｅｇの構成の分析により、４Ｃ１２投与から７日後の（およびエアロゾル曝露から３日後の）肺におけるＴｒｅｇの頻度はなお全ＣＤ４＋Ｔ細胞の５５％であったが、これに比較してハムスターＩｇＧで処置したマウスでは２２％であることが明らかになった（図４Ｃ）。Ｔｃｏｎｖ対Ｔｒｅｇのバランスは、単なるＴｒｅｇの総数よりも良好に疾病の病因を予測することが報告されている（Ｔａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２８：６８７−６９７；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２００８．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８１：５８９５−５９０３）；肺組織におけるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｔｃｏｎｖ）対Ｔｒｅｇの比を決定した（表２）。肺浸潤Ｔｒｅｇの表現型が、疾病のないマウスにおいてＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇの表現型と一致することを確認するために、肺浸潤Ｔｒｅｇを分析し、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ６９の発現について、ＩｇＧで処置したマウスから分離した肺浸潤Ｔｒｅｇと区別できないことが見出された。
【０１１１】
表２：図１０Ａ〜１０Ｅに記載するように収集した全肺細胞からの、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−（Ｔｃｏｎｖ）、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）の総数、およびＴｃｏｎｖ対Ｔｒｅｇ細胞の比を示す。細胞数は、左肺の単一細胞懸濁液中で得られた細胞数に、ｘフローサイトメトリーによって分析した全細胞のうちのリンパ系ゲートをかけた細胞のパーセンテージｘリンパ系ゲートをかけた細胞集団内のＴｃｏｎｖまたはＴｒｅｇ細胞のパーセンテージを掛けることによって算出した。
【０１１２】
肺組織細胞の分析に一致して、ＢＡＬＦから分離した細胞の総数は、卵白アルブミンを含むエアロゾルへの曝露後に有意に増加したが、生理食塩水のエアロゾルコントロールでは全ての条件で増加せず、４Ｃ１２処置によっては顕著に減少した。ＢＡＬＦ中の好酸球の総数は、ＢＡＬＦ細胞の総数をおおざっぱに反映しており、４Ｃ１２による前処置によって気道好酸球増多症の重症度は有意に低下することが観察された（図４Ｄ）。
【０１１３】
炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３は、アレルギー性肺炎症の病因に大きく関与している。これらのサイトカインの発現が４Ｃ１２による前処置によって減少するか否かを決定するため、エアロゾル曝露から３日後に急速冷凍した肺から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。この分析により、生理食塩水のエアロゾル化コントロールに比較して、肺浸潤ＣＤ４＋細胞の中でのＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現は、４Ｃ１２による処置後に有意に減少するが、アイソタイプコントロール抗体による処置後では上昇したままであることが示された（図４Ｅ）。追加のコントロールとしてＦｏｘＰ３ＲＮＡの発現レベルを分析すると、フローサイトメトリーで観察されたＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞と同様の相対的割合を反映していた（図４Ｃと４Ｅを比較されたい）。肺組織検査によると、生理食塩水のエアロゾル化コントロールに比較して、４Ｃ１２による処置後にはリンパ球浸潤の減少および気道からの粘液産生が示され、これらの知見が確認された（図４Ｆ、および図４Ｇで定量化した）。
【０１１４】
ＴＮＦＲ２５は、Ｔｃｏｎｖを活性化または増殖させることなくＴｒｅｇを増殖させる：４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇの表現型を決定するため、本発明者らは、４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロールを注射したマウスの末梢リンパ節、腸間膜リンパ節、および脾臓から分離したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を分析した。４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇは、主にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（ｉｎｔ）細胞であり、これは分析した全ての二次リンパ器官で増殖したことが見出された（図５Ａ、５Ｂ、および図８Ａ、８Ｄ）。４Ｃ１２による処置は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、細胞内もしくは細胞外ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＩＬ−１７Ａ、またはＩＦＮγのＴｒｅｇによる発現を変化させなかった。４Ｃ１２による処置後に全てのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞はＧＩＴＲ陽性のままであったが、ＧＩＴＲを発現するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合は、４Ｃ１２による処置後にＣＤ２５ ｉｎｔサブセットに移行する傾向があった（図８Ｂ）。αＥβ７インテグリンは、ＣＤ２５陽性または陰性のいずれであってもよいＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋の高度に抑制性であるサブセットに発現する。ＣＤ１０３の発現の分析により、４Ｃ１２によって増殖したＴｒｅｇではＣＤ１０３の発現が増大したが、コントロールＴｒｅｇでは増大しなかったことが明らかになった（図８Ｃ）。重要なことに、４Ｃ１２による処置後のＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞およびＣＤ８＋細胞の分析により、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、これらのいずれの細胞集団の絶対数または割合も増大させないことが明らかになった。４Ｃ１２による処置が、非Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激したか否かを判定するため、これらの細胞を増殖マーカーであるＫｉ６７で染色した。この分析により、外来性抗原の非存在下での４Ｃ１２による処置は、ＴｃｏｎｖまたはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増大させないことが例証された。さらに、ＣＤ８＋細胞ならびにＦｏｘＰ３−ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ６９の染色では、４Ｃ１２とＩｇＧにより処置されたマウスの間に相違はないことが明らかになった。従ってＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は、外来性抗原の非存在下で、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクター細胞の増殖もしくは活性化を誘導することなく、選択的にＴｒｅｇを増殖させる。
【０１１５】
ＴＮＦＲ２５の刺激は、ｉｎ ｖｉｖｏで天然型Ｔｒｅｇの増殖を誘導する：４Ｃ１２による処置後のＴｒｅｇの増加は、ＦｏｘＰ３のｄｅ ｎｏｖｏの発現またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖のいずれかよりもたらされ得る。これらの２つの可能性を区別するため、増殖マーカーであるＫｉ６７の、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞における発現を判定した（図５Ｃ、５Ｄ）。データがＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｈｉ細胞に対するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の比率の増加を示すように、４Ｃ１２によって処置したマウスにおけるＫｉ６７＋細胞の大多数はＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔであった。少ない割合（〜２７％）で、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞はＫｉ６７について染色されず（図５Ｃ、５Ｄ）、これらの細胞の大多数はＣＤ２５ｈｉであった。４Ｃ１２による処置後に観察されたＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖が、ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の選択的な刺激からもたらされたものであるか、またはＴｒｅｇが、増殖の間にＣＤ２５の発現が低下したにもかかわらず増殖刺激を受けたのかについては不明なままである。
【０１１６】
ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞による増殖の増大は、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達がＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞によるＦｏｘＰ３のｄｅ ｎｏｖｏの発現を刺激し得る可能性を決定的に除外するものではない。この可能性について試験するため、ＣＤ４５．２＋ＦＩＲマウス由来の高度に精製した（＞９９％純度）ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞を、ＣＤ４５．１コンジェニックＢ６／ＳＪＬマウスへ注入する養子移入実験を行った。これらの研究では、ＣＤ４５．１＋ホストにおける４Ｃ１２による処置後の、養子移入したＣＤ４５．２＋細胞の追跡、および養子移入したＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞によるＦｏｘＰ３−ＲＦＰの持続、誘導、またはサイレンシングのモニターが可能になった（図５Ｅ〜５Ｈ）。遺伝的または実験的に免疫不全の系統へ養子移入を行った後に、恒常的なＴｒｅｇの増殖によって発生し得るいずれの合併症も避けるため、これらの実験は、完全に免疫応答性のマウスにおいて行うことを計画的に選択した。免疫応答性のＣＤ４５．１＋レシピエントへの、選別した２×１０６個の細胞（図９Ａ）の移入は、養子移入後少なくとも２週間の末梢血において、まれではあるが容易に区別可能なＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞の集団を検出するために十分であった（図５Ｇ、５Ｈ）。養子移入後の、４Ｃ１２によるレシピエントマウスのＴＮＦＲ２５の刺激は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞によるＦｏｘＰ３のｄｅ ｎｏｖｏの発現を刺激せず（図５Ｅ）、これは４Ｃ１２によるか、またはコントロール抗体による処置かにかかわらず、０．５％の頻度で、ＦｏｘＰ３−ＲＦＰ−のままであった。２×１０６個の細胞を養子移入した後のＦｏｘＰ３＋ＲＦＰ＋細胞の頻度は、コントロール抗体で処置したマウス末梢血中ではＣＤ４細胞の０．０４％であり、４Ｃ１２で処置したマウスでは０．１１％に増加し（図５Ｆ）、ＦｏｘＰ３＋ＲＦＰ＋ＣＤ４５．２＋細胞は３倍の増加率であった。この結果は、移入していないマウスにおける、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体によるＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの増殖の程度に一致する（図１Ｂ）。このデータにより、４Ｃ１２による処置が、増殖後にＦｏｘＰ３の発現を維持するＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖を選択的に刺激することが示された（図５Ｆ）。このデータにより、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達は最初にＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の増殖を増大させ、これによりＴｒｅｇの全身性の増加がもたらされることが示された。これらの研究はまた、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞は４Ｃ１２による処置後のいかなる時点でも増殖しないが（図５Ｇ）、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖は、ＦＩＲマウスにおける内在性Ｔｒｅｇの増殖および減少と同様の動態に従うことも示した（図５Ｈと図１Ｂを比較されたい）。重要なことに、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞は、増殖中および増殖後の両方でＦｏｘＰ３の発現を維持したことから、増殖したＴｒｅｇプールにみられる減少はＦｏｘＰ３の発現低下よりもむしろ細胞死によるものであることが示唆される（図５Ｆ、５Ｈ）。実験を通したどの時点でも、養子移入したＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖プールがＦｏｘＰ３の発現を失う場合には、ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞の画分が増加し得るが、これは起こらなかった。実験を通して、養子移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−細胞の少ない割合（＜５％）がＦｏｘＰ３の発現を示し（図５Ｅ）、移入したＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の少ない割合（＜５％）がＦｏｘＰ３の発現を失う（図５Ｆ）ことが観察された。ＦｏｘＰ３の発現におけるこのようにわずかな不安定性によって、これらの観察が説明されると思われる。
【０１１７】
ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇは、Ｅｘ Ｖｉｖｏで高度に抑制性である：４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇが抑制活性を保持しているか否かを判定するため、４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロール抗体による処置後４日目にＦＩＲマウスからＴｒｅｇ細胞を精製した（図８Ａ）。次にこれらのＴｒｅｇサブセットを従来の増殖アッセイに用いた。４Ｃ１２により処置したマウスから精製したＴｒｅｇは、アイソタイプコントロール抗体により処置したマウスからのものに比較して、ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞の増殖をより大きく抑制した（図６Ａ〜６Ｄ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制アッセイにおいて、４Ｃ１２により増殖したＴｒｅｇによるＴｃｏｎｖの増殖の抑制は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下および非存在下の両方で観察された（図６Ａ対６Ｂ）。抑制アッセイ中の４Ｃ１２の添加がＴｒｅｇの抑制活性を調節するか否かを決定するため、記載するように（図６Ａ、６Ｂ）、４Ｃ１２、またはＴｃｏｎｖをＴｒｅｇにより仲介される抑制から解放することが知られているＧＩＴＲアゴニスト抗体（クローンＤＴＡ−１）、またはアイソタイプコントロール抗体の存在下で（図６Ｃ、６Ｄ）、同等のアッセイを行った。アゴニストＴＮＦＲ２５またはＧＩＴＲ抗体の存在により、Ｔｒｅｇが４Ｃ１２またはＩｇＧアイソタイプコントロールによって処置したマウスのどちらから得られたかにかかわらず、両方の抗体がＡＰＣの非存在下で同様の効果を生んだことにより、Ｔｃｏｎｖの増殖は部分的に回復した（図６Ｃ）。興味深いことに、ＡＰＣ、ＤＴＡ−１の存在下で誘導されたＴｃｏｎｖの増殖の程度は、４Ｃ１２で処置したマウスからのＴｒｅｇの存在下よりも、ＩｇＧアイソタイプコントロールで処置したマウスからのＴｒｅｇの存在下で大きかった（図６Ｄ）。ＡＰＣの存在は、４Ｃ１２の存在下でのＴｃｏｎｖ増殖の部分的な回復を有意に変更しなかった。コントロールもまた、Ｔｃｏｎｖ単独における４Ｃ１２の刺激効果は最小であり、ＴｃｏｎｖにおけるＧＩＴＲの刺激効果よりも著しく低いことを示した（図６Ｃ、６Ｄ）。４Ｃ１２によるＴｒｅｇの抑制活性の阻害は、Ｔｃｏｎｖではなく、Ｔｒｅｇによって発現するＴＮＦＲ２５の効果に特異的であることをさらに示すため、ドミナントネガティブＴＮＦＲ２５を発現するトランスジェニックＴｃｏｎｖを用いて抑制アッセイを行った（図６Ｅ）。これらのデータにより、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達によるＴｒｅｇの抑制活性の阻害はＴｒｅｇのみが機能的ＴＮＦＲ２５を発現している条件下で起こることから、この効果は、Ｔｃｏｎｖではなく、ＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５のシグナル伝達によるものであることが示される。特に、４Ｃ１２によってｉｎ ｖｉｖｏで増殖し、次にｉｎ ｖｉｔｒｏでの抑制アッセイに供されたＴｒｅｇ（図６Ａ〜６Ｂ）は、４Ｃ１２抗体がそれ以上存在しない条件下で高度に抑制性であった。抑制アッセイの間に４Ｃ１２抗体が維持されている場合のみに、Ｔｒｅｇ抑制活性の部分的阻害が観察された。４Ｃ１２はＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの増殖を誘導し、かつ幾つかの研究ではＣＤ２５の発現レベルによってＴｒｅｇの抑制活性が予測されることから、４Ｃ１２またはアイソタイプコントロール抗体による処置後のマウスから選別したＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの抑制活性を比較した（図９Ｂおよび図６Ｆ）。ＣＤ２５ｈｉおよびＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇは両方とも増殖アッセイにおいて高度に抑制性であったことから、抑制活性はＣＤ２５の発現レベルに依存しなかった（図６Ｆ）。興味深いことに、４Ｃ１２により増殖したＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇは、ＩｇＧで処置したマウス由来のＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇよりもわずかに抑制活性が大きかった（図６Ｆ、バー３〜４）。この知見により、４Ｃ１２により増殖したＣＤ２５ｉｎｔＴｒｅｇの、ＩｇＧで処置したＴｒｅｇに比較した抑制活性の増大は（図６Ａ〜６Ｄ）、少なくとも部分的にＣＤ２５ｉｎｔ細胞の活性に起因することが示される。
【０１１８】
考察
ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーは、免疫エフェクター細胞応答の重要な共刺激因子として、かつアポトーシス誘導因子として認識されている。ここに、制御性Ｔ細胞の制御因子としての、ＴＮＦＲ２５の新規な非重複性の機能が同定された。ＴＮＦＲ２５は、免疫応答性マウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇの強固な増殖を仲介する一方、同時にそれらの抑制活性を部分的に制限する。その他のＴＮＦＲファミリーメンバーを含むその他の生理的なシグナルが、Ｔｒｅｇに同様の活性を与えることは報告されていない。さらに、ＴＮＦＲ２５シグナルは、Ｔｒｅｇを選択的に増殖することが報告される唯一のその他の薬剤（ＩＬ−２／抗ＩＬ−２抗体複合体（Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１：１９２４−１９２７）と同様の規模および動態によってＴｒｅｇの増殖を誘導するという観察から、ＴＮＦＲ２５アゴニストは、ヒトにおける治療用のための、ＩＬ−２に基づく治療法の臨床応用可能な代替法を提供し得ることが示唆される。
【０１１９】
理論に制約されるものではないが、様々な疾病モデルにおける病的炎症の発生には、ＴＮＦＲ２５およびＴＬ１Ａ受容体：リガンドの組み合わせが関係している。これまでに、健康の維持または疾病の防止におけるＴＮＦＲ２５もしくはＴＬ１Ａの役割を同定した単一の報告はないことから、このような役割は発見されていないことが示唆される。ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体である４Ｃ１２が有効であることにより、ＴＮＦＲ２５シグナル、炎症性シグナル、および外来性抗原の時間的な有効性が独立して制御され得る設定での、様々なＴ細胞サブセットにおけるＴＮＦＲ２５についての研究が初めて可能となった。アレルギー性肺炎症における、ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇの防御的役割の同定は、アレルギー性肺炎症の悪化にＴＬ１Ａを関係付ける以前の研究と矛盾するものではなく、その理由は、本研究ではＴＮＦＲ２５のシグナル伝達が抗原への曝露に先立つが、以前の研究ではＴＮＦＲ２５シグナルが抗原への曝露の後に続くことである。むしろ、Ｔｃｏｎｖ（低発現）に比較した、ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の差次的な発現（高発現）から、Ｔ細胞の抗原への曝露の順序によって、共刺激またはＴＬ１Ａが、特定の炎症性応答がＴｒｅｇにより抑制されるか、またはＴｃｏｎｖにより誘導されるかを支配し得ることが示唆される。本研究では、気道の抗原への曝露に先立つＴＮＦＲ２５アゴニストによる処置が、気道内に、Ｔｃｏｎｖではなく、Ｔｒｅｇの優先的な蓄積を誘導し、かつＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の産生減少、ならびに気管支肺胞腔内の好酸球増多症および粘液産生の低下を伴った。
【０１２０】
ＣＤ８０／８６共刺激ではなく、ＭＨＣＩＩおよびＩＬ−２シグナルが、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要とされた。ＭＨＣＩＩおよびＩＬ−２のシグナルはＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要であるが、ＴＣＲおよびＩＬ−２のシグナルの供給はｉｎ ｖｉｔｒｏでＴｒｅｇの増殖を誘導するためには十分でないことから、研究中の追加のシグナルが必要であり得ることが示唆される。ＭＨＣＩＩの必要性は、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖において、ＴＣＲを発現するＴｒｅｇに強く関係するが、これらのデータは間接的である。この過程におけるＴＣＲの役割についてのさらなる証拠として、ＴＮＦＲ２５は、ＮＦＡＴ阻害剤であるシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６の存在下でＴｒｅｇの増殖を誘導できないことが観察され；ＴＣＲの下流で起こるシグナル伝達がＴｒｅｇの増殖に影響を与えることの証拠を提供した。これらのデータにより、ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖの両方が、ＴＣＲのライゲーションに続くＴＮＦＲ２５のシグナル伝達に対して許容状態になり、ＴＮＦＲ２５アゴニスト抗体のＴｒｅｇ選択性は、少なくとも部分的には、非炎症性状態での自己抗原の有効性によるものである可能性が示唆される。自己抗原による持続性のＴＣＲ刺激も、Ｔｃｏｎｖに比較したＴｒｅｇにおけるＴＮＦＲ２５の発現増加に寄与するか否か、またはこの相違が無関係のシグナル伝達経路によって維持されるか否かについても未知である。
【０１２１】
少なくとも２のさらなる受容体経路（ＩＬ−２受容体およびＴＣＲ）がＴＮＦＲ２５により誘発されるＴｒｅｇの増殖に必要とされることを考えると、これらの受容体の下流にあるＴｒｅｇの増殖を導くシグナル伝達経路の集合は複雑である可能性がある。これらの経路がどのように相互作用し得るかについての手がかりは、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＮＦＲ２５により誘発されるＴｒｅｇが、ＩＬ−２シグナルに対して高応答性であったという観察により提供された。続いて、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路が、ＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖に重要であるＩＬ−２受容体の下流へのつながりを提供することが特定された。これらのデータにより、ＰＴＥＮを介したＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路の阻害が、ＩＬ−２シグナル伝達の下流でＴｒｅｇの増殖を制限することが示唆された。ＭＨＣＩＩ、ＩＬ−２Ｒ、ＮＦＡＴ、およびＡｋｔの同定により、結果的にＴｒｅｇの増殖を導く、ＴＮＦＲ２５の下流で起こるシグナル伝達を解明するための明確な開始点が提供されたが、これらの様々な経路のクロストークの分子機構を解明するために、さらなる研究を行う必要がある。
【０１２２】
ＴＮＦＲ２５により誘導されたＴｒｅｇの増殖は、ＩＡＣにより誘導されたＴｒｅｇの増殖と同様の動態および規模で起こるが、ＣＤ２５ｉｎｔ細胞の割合がＣＤ２５ｈｉ細胞よりも多くなる。この観察の重要性については未知である；しかしながら、ＩＡＣへの曝露後のＴｒｅｇによるＣＤ２５の発現から、ＩＬ−２の利用可能性の増大による正のフィードバックループが示唆される。ＴＮＦＲ２５により誘導されたＴｒｅｇの増殖の場合には、ＩＬ−２の濃度は操作されていないことから、増殖したＴｒｅｇによるＣＤ２５の発現低下は、増殖したＴｒｅｇ集団由来の内在性ＩＬ−２との競合の増加に起因し得る。Ｔｒｅｇが発現するその他の表面マーカーを調べることにより、ＴＮＦＲ２５により増殖したＴｒｅｇとＩＡＣにより増殖したＴｒｅｇの間で少数の相違が明らかになったが、ＧＩＴＲを含む幾つかはＣＤ２５ｉｎｔとＣＤ２５ｈｉ集団の間で変動した。分析したマーカーのうち、４Ｃ１２による処置後に一貫して増加したものは、組織内でのＴｒｅｇの保持に寄与するＣＤ１０３であった。
【０１２３】
このデータは、Ｔｒｅｇの抑制活性の阻害による炎症性応答の誘導におけるＴＮＦＲ２５の刺激の役割について報告している最近のデータを補完し、組織の炎症の誘導および回復の両方におけるＴＬ１Ａ：ＴＮＦＲ２５の相互作用の役割についての理論へと統一するものである。ＴＮＦＲ２５の刺激が、Ｔｒｅｇの増殖およびそれらの抑制活性の阻害の両方を誘導することの正確な機構については不明なままであるが、その部分的な理由は、ＴＮＦＲ２５シグナルによって活性化されるシグナル伝達がよく理解されておらず、さらなる研究が進められていることである。加えて、ＴＮＦＲ２５によりｉｎ ｖｉｖｏで誘導されるＴｒｅｇの増殖が自己抗原の認識に依存するか否かは不明であり、かつＩＡＣと同様に、ＴＮＦＲ２５によりｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されるＴｒｅｇの増殖に必要な条件は不明なままで、さらなる研究が進められている。理論に制約されるものではないが、ＭＨＣＩＩがＴＮＦＲ２５により誘導されるＴｒｅｇの増殖を許容するためのｉｎ ｖｉｖｏでの要件の同定によって、ＴＣＲの会合はＴＮＦＲ２５により誘導されるＴ細胞の共刺激に対する一般的な要件であること、および外来性抗原の非存在下でのＴＮＦＲ２５のＴｒｅｇに対する選択性は、ＴｒｅｇによるＴＮＦＲ２５の優先的な発現、およびＭＨＣＩＩによる自己抗原提示の利用可能性の両方によって維持されることが示されると仮定される。免疫されていないマウスに対して、免疫されたマウスではＴＮＦＲ２５の刺激に対するＴｒｅｇの応答性が増大していることもまた興味深く、一次免疫応答と二次免疫応答ではＴＮＦＲ２５の機能が異なる可能性が示唆される。
【０１２４】
その機構にかかわらず、増加する炎症性疾患（喘息、ＩＢＤ、ＥＡＥ、ＲＡ）の病因に対するＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の重要性のために、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達が様々なＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに及ぼす時空間的な役割を理解することが重要である。ＯＸ４０と同様に、ＴＮＦＲ２５のシグナル伝達の時間的な背景は、炎症性または制御性免疫を差次的に導き得る可能性が高い。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋天然制御性Ｔ細胞を迅速に増殖させ、一過性に阻害する、ＴＮＦＲ２５シグナルの独特な能力は、自己免疫疾患、慢性感染、移植、および癌の処置に対して重要な結果をもたらし得るであろう。
【実施例２】
【０１２５】
ＴＮＦＲＳＦ２５による、治療用ＴｒｅｇのＩｎ Ｖｉｖｏでの増殖は、異所性心臓移植モデルにおける同種異系心臓の急性拒絶反応を遅延させる。
４Ｃ１２によって増殖した天然型Ｔｒｅｇによる寛容性の誘導について試験するため、寛容性試験について十分に記載されている異所性心臓移植モデルを選択した。０日目に、ＣＢＡ／Ｊマウス（Ｈ２ｄ）の心臓をＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ２ｂ）の腹部へ移植した。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。移植時に、４Ｃ１２処置群の血中におけるＴｒｅｇの増殖を確認した。心臓を用手で触診することによって同種移植片の生存をモニターし、脈拍を０〜４（０＝脈拍なし；１＝非常に弱い；２＝弱い；３＝中程度；４＝強い）のスケールで類別した。拒絶は、心臓拍動の触知不可能として定義した。拒絶時（＝心臓拍動の停止時）に移植片を除き、ホルマリン固定後に病理検査へ供した。移植から４８時間以内に移植片の機能が失われた時には技術的な失敗とみなし（＜５％）、その後の分析を行わなかった。
【実施例３】
【０１２６】
ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニストによる、治療用ＴｒｅｇのＩｎ Ｖｉｖｏでの増殖は、クローン病のマウスモデルであるデキストラン−硫酸ナトリウム誘導性大腸炎から保護する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＴＬ１Ａノックアウトマウスに、３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を溶解した飲料水を７日間自由に摂取させた。ＤＳＳを供給する４日前（実験−４日目）に始まり、体重を毎日モニターした。−４日目にマウスの１群をＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体であるクローン４Ｃ１２の腹腔内注射（２０μｇ／マウス）によって処置し、その他のマウスはハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体によって処置した。動物が開始時の体重を≧２０％減少させた時点で死亡率を測定した（図１０Ａ）。幾つかの実験では、実験５日目に動物を屠殺し、急速冷凍してＰＢＳで洗浄した大腸組織からＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製した。続いてＲＮＡの逆転写を行い（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ ＲＴ、Ｑｉａｇｅｎ）、表示する転写物に対するＴａｑｍａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅した（図１０Ｂ）。データは、ＴＬ１Ａノックアウトマウスにおける発現をＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスに比較した倍率変化によって示す。各実験ごとに、実験の全過程にわたって体重減少のパーセンテージをモニターし、プロットした（図１０Ｃ）。実験５日目にＲＮＡ分離のために動物を屠殺した実験では、制御性Ｔ細胞プールの指標となる転写因子ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析するために、腸間膜リンパ節を分離した（図１０Ｄ）。最後に、図１０Ｂに記載するように、表示する処置群から分離したＲＮＡを用いて逆転写を行い、表示する転写物に対するＲＴ−ＰＣＲに供した。エラーバーは１実験あたり≧３マウス、１パネルあたり最少で２実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す。
【０１２７】
これらのデータにより、ＴＮＦＲＳＦ２５アゴニスト抗体による前処置は、腸内でのＦｏｘＰ３＋制御性細胞の増殖、体重減少および大腸の致死的な炎症の阻止、ならびにＩＬ−１ベータおよびＩＬ−６を含む炎症性サイトカインの大腸組織内での発現の阻止を導くことが示される。まとめると、これらのデータにより、ＴＮＦＲＳＦ２５の刺激は、ヒトのクローン病の炎症特性を模倣するために一般に用いられるマウスモデルにおいて、致命的な腸の炎症を阻止できることの証拠が提供される。
【０１２８】
本発明は１以上の実行に関して図示および記載されているが、本明細書および添付の図面を読み、理解した上で、当業者による等価な変更および改変がなされてよい。加えて、本発明の特定の特徴は、幾つかの実行のうちの１のみに関して開示され得るが、このような特徴は、所定のまたは特定の応用のいずれかに対して望ましく、かつ有利である場合に、その他の実行の１以上のその他の特徴と組み合わせてよい。
【０１２９】
開示の要約により、読者は技術的開示の性質をすぐに確認することが可能となり得る。これは、以下の請求項の範囲もしくは意味を解釈または限定するために用いられ得ないという理解の下に提出される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を制御する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の刺激を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を調節すること；および
免疫応答を制御することを含んでなる方法。
【請求項２】
正常な健常コントロールに比較して、患者において少なくとも１の薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激してＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｒｅｇ細胞が、ＴＮＦＲ２５、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、または４−１ＢＢを含んでなるマーカーの発現によって同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｔｒｅｇ細胞が、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ；ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）に比較して高レベルのＴＮＦＲ２５を差次的に発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１の薬剤が、患者におけるＴｒｅｇ ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖によって決定された治療上有効な用量において患者に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する少なくとも１の薬剤が、治療上有効な複数の用量において患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１の薬剤の治療上有効な複数の用量が患者に投与され、Ｔｒｅｇによる抑制因子の産生、細胞増殖アッセイ、フローサイトメトリー、または免疫アッセイにより測定されるＴｒｅｇ細胞の抑制活性を無効にする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤が、抗体、アプタマー、リガンド、小分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機または無機分子のうち少なくとも１を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニストである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５に特異的なアプタマーまたは抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
アプタマーまたは抗体が、ＴＮＦＲＳＦ２５に対して単一特異性、二重特異性、もしくは多重特異性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アプタマーまたは抗体が、ＴＮＦＲＳＦ２５の１以上の区域に対して単一、二重、もしくは多重特異性である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ１０３＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を抑制する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導すること；および
免疫応答を抑制することを含んでなる方法。
【請求項１５】
薬剤が腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５のシグナル伝達を調節し、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を阻害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５エピトープおよび／または別の標的分子のいずれか１以上に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５および／または別の標的分子に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性アプタマーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＮＦＲＳＦ２５により仲介されるシグナル伝達を調節する薬剤を含んでなる、免疫応答を調節するための組成物。
【請求項１９】
免疫応答が抑制される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｔｒｅｇにより仲介されるＴ細胞の抑制を誘導する条件下で薬剤が投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
免疫応答が刺激される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｔｒｅｇのサプレッサー活性を阻害する条件下で薬剤が投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５エピトープおよび／または別の標的分子のいずれか１以上に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性抗体である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５エピトープおよび／または別の標的分子のいずれか１以上に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性アプタマーである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
ｉｎ ｖｉｖｏで癌を処置する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導すること；および
癌を処置することを含んでなる方法。
【請求項２６】
免疫応答に付随する疾病または状態を処置する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖または阻害を誘導すること；および
免疫応答に付随する疾病または状態を処置することを含んでなる方法。
【請求項２７】
Ｔｒｅｇ細胞が免疫により仲介される応答を抑制する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
免疫応答に付随する疾病または状態が、自己免疫性の疾病もしくは疾患、移植、炎症、喘息、アレルギー、または慢性感染を含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
免疫応答に付随する疾病または状態を処置する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の少なくとも１のアゴニストを、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
免疫応答に付随する疾病または状態を処置することを含んでなる方法。
【請求項３０】
ＴＮＦＲ２５の少なくとも１のアゴニストが、自己免疫性の疾病もしくは疾患、急性の心臓もしくは臓器移植の拒絶、炎症、喘息、アレルギー、または慢性感染を含んでなる、免疫応答に付随する疾病または状態を阻止または処置する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
自己免疫性の疾病もしくは疾患が、喘息、炎症性腸疾患、および関節リウマチを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、胸腺で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導するが、末梢で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖は誘導しない、少なくとも１の薬剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項３３】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、胸腺および末梢で誘導された両方のＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、少なくとも１の薬剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１】
ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を制御する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の刺激を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を調節すること；および
免疫応答を制御することを含んでなる方法。
【請求項２】
正常な健常コントロールに比較して、患者において少なくとも１の薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激してＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｒｅｇ細胞が、ＴＮＦＲ２５、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、または４−１ＢＢを含んでなるマーカーの発現によって同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｔｒｅｇ細胞が、従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ；ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−）に比較して高レベルのＴＮＦＲ２５を差次的に発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１の薬剤が、患者におけるＴｒｅｇ ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増殖によって決定された治療上有効な用量において患者に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する少なくとも１の薬剤が、治療上有効な複数の用量において患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１の薬剤の治療上有効な複数の用量が患者に投与され、Ｔｒｅｇによる抑制因子の産生、細胞増殖アッセイ、フローサイトメトリー、または免疫アッセイにより測定されるＴｒｅｇ細胞の抑制活性を無効にする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を調節する薬剤が、抗体、アプタマー、リガンド、小分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、有機または無機分子のうち少なくとも１を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５のアゴニストである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
薬剤がＴＮＦＲＳＦ２５に特異的なアプタマーまたは抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
アプタマーまたは抗体が、ＴＮＦＲＳＦ２５に対して単一特異性、二重特異性、もしくは多重特異性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アプタマーまたは抗体が、ＴＮＦＲＳＦ２５の１以上の区域に対して単一、二重、もしくは多重特異性である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔｒｅｇ細胞がＣＤ１０３＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を抑制する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導すること；および
免疫応答を抑制することを含んでなる方法。
【請求項１５】
薬剤が腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５のシグナル伝達を調節し、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を阻害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５エピトープおよび／または別の標的分子のいずれか１以上に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５および／または別の標的分子に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性アプタマーである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ＴＮＦＲＳＦ２５により仲介されるシグナル伝達を調節する薬剤を含んでなる、免疫応答を調節するための組成物。
【請求項１９】
免疫応答が抑制される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｔｒｅｇにより仲介されるＴ細胞の抑制を誘導する条件下で薬剤が投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
免疫応答が刺激される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｔｒｅｇのサプレッサー活性を阻害する条件下で薬剤が投与される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５エピトープおよび／または別の標的分子のいずれか１以上に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性抗体である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
薬剤が、ＴＮＦＲＳＦ２５エピトープおよび／または別の標的分子のいずれか１以上に対して選択的に特異的な、単一特異性、二重特異性、または多重特異性アプタマーである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
ｉｎ ｖｉｖｏで癌を処置する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を誘導すること；および
癌を処置することを含んでなる方法。
【請求項２６】
免疫応答に付随する疾病または状態を処置する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の機能を調節する少なくとも１の薬剤を、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖または阻害を誘導すること；および
免疫応答に付随する疾病または状態を処置することを含んでなる方法。
【請求項２７】
Ｔｒｅｇ細胞が免疫により仲介される応答を抑制する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
免疫応答に付随する疾病または状態が、自己免疫性の疾病もしくは疾患、移植、炎症、喘息、アレルギー、または慢性感染を含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
免疫応答に付随する疾病または状態を処置する方法であって：
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体２５（ＴＮＦＲＳＦ２５；ＴＮＦＲ２５；ＤＲ３）の少なくとも１のアゴニストを、患者の必要に応じて患者に投与すること；および
免疫応答に付随する疾病または状態を処置することを含んでなる方法。
【請求項３０】
ＴＮＦＲ２５の少なくとも１のアゴニストが、自己免疫性の疾病もしくは疾患、急性の心臓もしくは臓器移植の拒絶、炎症、喘息、アレルギー、または慢性感染を含んでなる、免疫応答に付随する疾病または状態を阻止または処置する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
自己免疫性の疾病もしくは疾患が、喘息、炎症性腸疾患、および関節リウマチを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、胸腺で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導するが、末梢で誘導されたＴｒｅｇ細胞の増殖は誘導しない、少なくとも１の薬剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項３３】
ＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達を刺激し、胸腺および末梢で誘導された両方のＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する、少なくとも１の薬剤を含んでなる医薬組成物。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１３−５０１０５７（Ｐ２０１３−５０１０５７Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２３６９２（Ｐ２０１２−５２３６９２）
【出願日】平成２２年８月３日（２０１０．８．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４２１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７３０３
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５９１２７９３５３）ユニバーシティー・オブ・マイアミ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＡＭＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月３日（２０１０．８．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４２１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７３０３
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５９１２７９３５３）ユニバーシティー・オブ・マイアミ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＡＭＩ
【Ｆターム（参考）】
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