前立腺及び他の癌の治療用の組成物及び方法
【課題】本発明は、熱ショックタンパク（ｈｓｐ）２７を標的とする治療用作用因子をイン・ビボで使用して、ｈｓｐ２７を過剰発現する前立腺癌及び他の癌に罹患している個体、特にヒト個体に対する治療をもたらすものである。
【解決手段】本発明によれば、治療用作用因子、例えば、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡ、例えばヒトｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに配列特異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターを、ｈｓｐ２７を高レベルに発現している前立腺癌又は他の一部の癌に罹患している個体に治療有効量で投与する。治療用作用因子を、製薬上許容される担体を含む薬剤組成物中に適切に配合し、単位剤形に包装する。好ましい単位剤形は、注射可能な単位剤形である。
【解決手段】本発明によれば、治療用作用因子、例えば、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡ、例えばヒトｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに配列特異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターを、ｈｓｐ２７を高レベルに発現している前立腺癌又は他の一部の癌に罹患している個体に治療有効量で投与する。治療用作用因子を、製薬上許容される担体を含む薬剤組成物中に適切に配合し、単位剤形に包装する。好ましい単位剤形は、注射可能な単位剤形である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月２日出願の米国仮出願第６０／４１５，８５９号、及び２００３年４月１８日出願の米国仮出願第６０／４６３，９５２号の特典を請求するものであり、これら両方を、そのような組み込みを許可する法律上の権限において、参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本願は、疾患の発症の少なくとも一部の段階で正常組織と比べて高いレベルのｈｓｐ２７を発現する前立腺癌及び他の癌の治療のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は、男性が罹患する最も一般的な癌であり、欧米世界において男性の癌による死亡の原因の第２位となっている。前立腺癌はアンドロゲン感受性腫瘍であるので、例えば去勢によるアンドロゲン分泌阻害が、進行性前立腺癌患者の治療法において使用されることがある。アンドロゲン分泌阻害によって前立腺癌に広範なアポトーシスが生じ、したがってこの疾患の退縮が生じる。しかし、去勢により誘導されるアポトーシスは完全ではなく、生き残っている細胞のアンドロゲン非依存性への進行が最終的に起こる。この進行が生存率及び生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の向上に対する主な障害であり、したがって、アンドロゲン非依存性細胞を標的とする努力が払われてきた。この努力は、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞を標的とする非ホルモン療法に集中されてきた（非特許文献１及び非特許文献２）が、今までのところ生存率を向上させる非ホルモン性作用因子は存在しない。したがって代替手法を試みるべきであることが示唆される。
【０００４】
アンドロゲン分泌阻害の後、前立腺腫瘍細胞によって多数のタンパクが多量に発現されることが観察されている。これらのタンパクの少なくとも一部は、アンドロゲン分泌阻害で観察される観察されたアポトーシス細胞死と関係することが想定される（非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ ７１（Ｓｕｐｐ．３）：１０９８−１１０９（１９９３）
【非特許文献２】Ｊ．Ｕｒｏｌ．６０：１２２０−１２２９（１９９８）
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．：４４４８−４４４５（１９９５）
【非特許文献４】Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１５６７−１５７６（１９９６）
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：６９４０−６９４４（１９９２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、熱ショックタンパク（ｈｓｐ）２７を標的とする治療用作用因子をイン・ビボで使用して、ｈｓｐ２７を過剰発現する前立腺癌及び他の癌に罹患している個体、特にヒト個体に対する治療をもたらすものである。本発明によれば、治療用作用因子、例えば、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡ、例えばヒトｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに配列特異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターを、ｈｓｐ２７を高レベルに発現している前立腺癌又は他の一部の癌に罹患している個体に治療有効量で投与する。治療用作用因子を、製薬上許容される担体を含む薬剤組成物中に適切に配合し、単位剤形に包装する。好ましい単位剤形は、注射可能な単位剤形である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｂ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｃ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｄ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｅ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｆ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｇ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図２】ＰＣ３細胞中のｈｓｐ２７発現におけるｈｓｐ２７アンチセンスの効果を示す図である。
【図３Ａ】ｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積及び血清ＰＳＡを示す図である。
【図３Ｂ】ｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積及び血清ＰＳＡを示す図である。
【図４Ａ】タキソール入り及びなしでｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積の変化を示す図である。
【図４Ｂ】タキソール入り及びなしでｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積の変化を示す図である。
【図５】ＲＮＡｉで処理後のｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの低下を示す図である。
【図６Ａ】ＲＮＡｉで処理した後の発現ｈｓｐ２７タンパク量を示す図である。
【図６Ｂ】ＲＮＡｉで処理した後の発現ｈｓｐ２７タンパク量を示す図である。
【図７Ａ】前立腺癌細胞をアンチセンス及びＲＮＡｉで処理した結果を示す図である。
【図７Ｂ】前立腺癌細胞をアンチセンス及びＲＮＡｉで処理した結果を示す図である。
【図７Ｃ】前立腺癌細胞をアンチセンス及びＲＮＡｉで処理した結果を示す図である。
【図８】Ｔ２４膀胱癌細胞でのｈｓｐ２７発現を示す図である。
【図９】一連のＮＨＴを行った組織中でのｈｓｐ２７の免疫組織学的評価から決定したｈｓｐ２７の免疫反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、活性型ｈｓｐ２７の有効量をイン・ビボで低下させる組成物に関する。本発明において有用な代表的組成物は、アンチセンスｈｓｐ２７オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターである。本発明はさらに、ｈｓｐ２７を多量に発現する前立腺癌及び他の癌の治療におけるこれらの組成物の使用にも関する。
【０００９】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、「活性型ｈｓｐ２７」という用語は、ストレスがかかったときにタンパク構造を安定化させるシャペロンとして活性を有する、具体的には、アポトーシスの媒介物であるカスパーゼ３の活性を抑制するｈｓｐ２７を指している。活性型ｈｓｐ２７レベルの低下は、ｈｓｐ２７の産生を制限すること、ｈｓｐ２７が産生されるより速い速度でそれを分解すること、ｈｓｐ２７を不活性型に転換する、例えば、抗ｈｓｐ２７抗体を用いるなどｈｓｐ２７を不活性複合体中に隔離することのいずれかによってｈｓｐ２７の総量を低下させることで達成することができる。
【００１０】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、治療され得る癌は、同じ組織型の非癌細胞と比べて多量にｈｓｐ２７を発現するものである。代表的な癌には、それだけに限らないが、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、骨肉腫、膵癌、大腸癌、黒色腫、睾丸癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫及び卵巣癌並びに中枢神経系悪性腫瘍が含まれる。
【００１１】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、「配列特異性」という用語は、オリゴヌクレオチドと標的ｈｓｐ２７との間に細胞内条件下で特異的結合が生じるのに十分な、ワトソンクリック塩基対形成を用いた相補的関係が存在することを指している。完全に相補性があることが望ましいが、特に長いオリゴヌクレオチドを使用する場合、このことは必ずしも絶対的に必要ではない。
【００１２】
ヒトｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの配列は、例えばＮＣＢＩ受託番号ＡＢ０２００２７、Ｘ５４０７９、ＮＭ＿００６３０８、ＮＭ＿００１５４０及びＮＭ＿００１５４１から知られている。ｃＤＮＡ配列（配列番号９１）は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターを開発するための基礎をなす。アンチセンス及びＲＮＡｉに好ましい配列は、配列番号９１中のヌクレオチド１３１〜１６１、２４１〜２６１、３６１〜３７１、５５１〜５８０、６６１〜６８１及び７４４〜７６４由来の領域中にある塩基群を標的とするものである。これらの領域内の塩基群を標的とするためには、アンチセンス分子又はＲＮＡｉ分子は列挙した塩基群のうち少なくとも１個、好ましくは列挙した塩基群のうち少なくとも１０個の塩基を含む領域との配列特異性を有していなければならない。
【００１３】
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さ１２〜３５塩基のオリゴヌクレオチドであり、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡ配列と配列特異性を有するものである。実際に作成し、活性型ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの量を低下させることができるかどうか試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号１〜８２で示す。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの５’−ｇｇｇａｃｇｃｇｇｃｇｃｔｃｇｇｔｃａｔ−３’（配列番号８２）の配列を有するもの、並びに配列番号２５、３６、５６、５７、６７、及び７６の配列を有するものである。
【００１４】
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を線蠕虫（ｗｏｒｍ）に導入したとき、それによって遺伝子発現を遮断することができたという観察結果を記載したＦｉｒｅ及びその共同研究者によって最初に作り出された用語である（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１、これを参照により本明細書に組み込む）。ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含めた多くの生物中で遺伝子特異的転写後サイレンシングを起こすように指示し、遺伝子機能を研究するための新しい道具を提供してきた。ＲＮＡｉはｍＲＮＡ分解に関係するが、この干渉の根底にある生化学的機構の多くは知られていない。ＲＮＡｉの使用は、Ｃａｒｔｈｅｗら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，２４４−２４８及びＥｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１，４９４−４９８にさらに記載されており、どちらの文献も参照により本明細書に組み込む。本発明のＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ阻害を媒介する約２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖又は一本鎖ＲＮＡである。すなわち、本発明の単離ＲＮＡｉは、ｈｓｐ２７遺伝子のｍＲＮＡの分解を媒介する。
【００１５】
ＲＮＡ、ＲＮＡ分子（群）、ＲＮＡセグメント（群）、及びＲＮＡ断片（群）の用語を互換的に使用して、ＲＮＡ干渉を媒介するＲＮＡを指すことができる。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ（部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え体として産生されたＲＮＡ）、並びに１つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により天然に存在するＲＮＡと異なる改変ＲＮＡが含まれる。このような改変は、ＲＮＡの（両側の）末端又は内部（ＲＮＡの１つ又は複数のヌクレオチド）などに対する非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中にあるヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含めた標準的でないヌクレオチドを含むこともできる。このような改変ＲＮＡｉ化合物はすべて総称してアナログ、又は天然に存在するＲＮＡのアナログと呼ばれる。本発明のＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然ＲＮＡに十分に類似しているだけでよい。本明細書においては、「ＲＮＡｉを媒介する」という表現は、どのｍＲＮＡがＲＮＡｉの機構又は過程によって作用を受けるかを識別できることを指し示している。ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡは、ＲＮＡｉの機構と相互作用して、ＲＮＡｉの機構に特定のｍＲＮＡを分解するよう又はその他の方法で標的タンパクの発現を低下させるよう指示する。一実施形態では、本発明は、配列が一致する特定のｍＲＮＡの切断を指示するＲＮＡ分子に関する。配列の完全な一致は不要であるが、そのＲＮＡが、標的ｍＲＮＡの切断又は発現欠如による、ＲＮＡｉを用いた阻害を指示することができるのに十分なほど一致していなければならない。
【００１６】
上記に示した通り、本発明のＲＮＡ分子は、一般にＲＮＡ部分及びある種の付加部分、例えばデオキシリボヌクレオチド部分を含む。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの総数は、ＲＮＡｉの有効な媒介物であるためには４９個より少ないのが適切である。好ましいＲＮＡ分子中では、ヌクレオチド数は１６〜２９個であり、さらに好ましくは１８〜２３個であり、最も好ましくは２１〜２３個である。
【００１７】
適切なＲＮＡｉ分子のＲＮＡ部分を、配列番号８３〜９０で示す。これらの配列はセンスＲＮＡ鎖である。これらは、対応するアンチセンス鎖と組み合わせてＲＮＡｉ治療に使用することができる。
【００１８】
アンチセンス又はＲＮＡｉ分子として使用するオリゴヌクレオチドを修飾して、イン・ビボでのそのオリゴヌクレオチドの安定性を増大させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に高い耐性を有するホスホチオエート誘導体（架橋していないホスホリル基の酸素原子を硫黄原子で置き換えたもの）の形で使用することができる。ＭＯＥ修飾（ＩＳＩＳ主鎖）も有効である。
【００１９】
そのままでの投与、及び製薬上許容される脂質担体中に含まれる形での投与を含め、当技術分野で知られている様々な機構を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を実施することができる。例えば、アンチセンスの送達のための脂質担体は、米国特許第５，８５５，９１１号及び第５，４１７，９７８号において開示されており、これらを参照により本明細書に組み込む。一般に、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与又は経口経路による投与、或いは局所腫瘍に直接注射することによって、アンチセンスを投与する。
【００２０】
投与するアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他の治療用作用因子の量は、活性型ｈｓｐ２７の量を低下させるのに有効な量である。この量は、使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他の治療用作用因子が有効であるかどうかによっても、使用する任意の担体の性質によっても変わることが理解されるであろう。所与の任意の組成物について適切な量を決定することは、当分野の技術の範囲内であり、これは治療に適したレベルを評価するように設計された標準的な一連の試験により決定される。
【００２１】
標的タンパクの発現を阻害することによって治療上の利益が得られるタイプの癌又は他の疾患に罹患しているヒト患者を含めた患者を治療する療法に、本発明のＲＮＡｉ分子を使用する。経口的に、１種又は複数種の毎日の注射（静脈内、皮下、膀胱内、又は髄腔内）で、或いは連続静脈内投与又は連続髄腔内投与で、標的ｍＲＮＡ及びタンパクの制御に適した血漿及び組織濃度に達するまで１つ又は複数の治療サイクルの間、本発明のｓｉＲＮＡ分子を患者に投与する。
【００２２】
前立腺癌は、後期癌において、特にアンドロゲン非依存性となる癌において、ｈｓｐ２７を過剰発現する癌の１つである。図９に、ＮＨＴ（新補助ホルモン療法）を行った一連の組織中でｈｓｐ２７を免疫組織学的に評価することから決定したｈｓｐ２７の免疫反応性を示す。良性の試料では、免疫反応性は基底層に限定されている。新補助療法の持続期間が増大するほど、免疫反応性は増大し、アンドロゲン非依存性腫瘍が非常に強い反応性を示す。前立腺癌の治療については、最初のアンドロゲン分泌阻害の後に本発明の治療用組成物を投与するのが適切である。アンドロゲン分泌阻害の開始は、前立腺癌の治療で現在指示される外科的去勢（両方の睾丸の除去）又は内科的去勢（薬剤で誘導するテストステロン抑制）によって実施することができる。内科的去勢は、ＬＨＲＨ剤又は抗アンドロゲン物質を含めた様々な療法によって実施することができる（Ｇｌｅａｖｅら，ＣＭＡＪ １６０：２２５−２３２（１９９９））。可逆的アンドロゲン分泌阻害をもたらす断続的療法が、Ｇｌｅａｖｅら Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．３４（Ｓｕｐｐ．３）：３７−４１（１９９８）に記載されている。
【００２３】
ｈｓｐ２７発現の阻害は、一時的でよいこともあるが、前立腺癌の治療では、理想的にはアンドロゲン分泌阻害に一致して行なうべきである。このことは、ヒトにおいては、発現阻害をアンドロゲン分泌阻害（前又は後）の１日又は２日以内に始め、それを約３〜６ヶ月続けると有効であるはずであることを意味する。それには、達成するために多くの投与量が必要となる可能性がある。しかし、本発明の範囲を逸脱することなく、それを去勢前に始め、その後かなりの時間続けることで、その期間の終了をさらに延長することができることが理解されるであろう。
【００２４】
本発明による前立腺癌を含めた癌を治療する方法は、化学療法剤及び／又は異なる標的を対象とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与をさらに含むことができる。他の治療用作用因子の例としては、それだけに限らないが、タキサン類（パクリタキセル又はドセタキセル）、ミトキサントロン、並びにＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌ又はｃ−ｍｙｃを対象とするアンチセンスがある。アンチセンス又はＲＮＡｉを用いたｈｓｐ２７の阻害を使用して、タキサン類又はゲムシタビン、並びに前立腺癌、乳癌、肺癌、尿路上皮癌及び他の癌の治療用の生物学的作用因子などの活性を増強することができる。
【００２５】
本発明を、以下の非限定的な実施例に関して次にさらに記載する。
【実施例１】
【００２６】
配列番号１〜８１に定義した複数のアンチセンス化合物を調製し、各配列について、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）担体中の５０ｎＭの特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドにヒト前立腺癌ＰＣ３細胞をさらした後、ノーザンブロットによってその細胞のＨｓｐ２７ ｍＲＮＡ発現のレベルを試験した。この試験の結果を、配列番号１〜８１についてオリゴフェクタミンのみの対照に対する百分率として、図１Ａ〜Ｇに示す。そこに示すように、すべてのアンチセンス配列が有効であるわけではないが、有効なアンチセンス配列は、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの全体にわたって見られる。
【実施例２】
【００２７】
ＰＣ３前立腺癌細胞に、４０％コンフルエント時に１０ｃｍディッシュ中でオリゴフェクタミン担体を用いて６種類の異なるｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチドを３種類の濃度（１０、３０及び５０ｎＭ）で２回連続してトランスフェクトした。ＲＮＡを最初の処理の４８時間後に抽出し、ノーザンブロットで分析した。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６７、５７、２５、７６、５６及び３６を含むものであった。対照として、乱雑な（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）配列のオリゴヌクレオチド及びオリゴフェクタミンのみの実験を行った。試験したすべてのオリゴヌクレオチドが、少なくとも１種類の濃度で対照群と比べてｈｓｐ２７の下方制御を示した。図２に、その結果をＧＡＰＤＨ対照と対比してグラフに示す。
【実施例３】
【００２８】
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の異種移植片をマウスに導入し、去勢によるアンドロゲン分泌阻害後、１０ｍｇ／ｋｇで１日１回４週間腹腔内投与したｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号８２）の腹腔内注射の効果を評価した。図３Ａ及び３Ｂに示すように、腫瘍体積及び血清ＰＳＡは、乱雑な配列の対照で処置した後数週間で増大した。このことから、アンドロゲン非依存性が進行し、それによって去勢療法の効力が消失したことが示唆される。それに対して、ｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したとき同じ時点でこのアンドロゲン非依存性への進行は観察されなかった。
【実施例４】
【００２９】
ＰＣ３前立腺癌細胞の異種移植片をマウスに導入し、タキソール入り及びなしで１０ｍｇ／ｋｇで１日１回４週間腹腔内投与したｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号８２）の腹腔内注射の効果を評価した。図４Ａ及び４Ｂに示すように、腫瘍体積は、ｈｓｐ２７アンチセンスを用いた処置によって、乱雑な配列のオリゴヌクレオチドと比べて有意に低下した。この効果は、タキソール処置をアンチセンス処置と組み合わせたとき増強された。図４Ａは、単一の作用因子による抗腫瘍活性を示しており、一方、図４Ｂは、ｈｓｐ２７アンチセンスを投与すると、イン・ビボでパクリタキセルに対する細胞の感受性を高めることができることを示している。図４Ｂにおける対照は、乱雑配列＋タキソールである。
【実施例５】
【００３０】
配列番号８４、８５、８７、８８及び９０の配列を有するＲＮＡｉ分子を、ＰＣ３細胞中で試験した。
ＰＣ細胞に、様々な量のｈｓｐ２７ ｓｉＲＮＡ又は乱雑配列の対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロッティングによりｈｓｐ２７及び２８Ｓレベルについて分析した。オリゴフェクタミンのみで処理した細胞を追加の対照として使用した。図５は、２８Ｓ ｍＲＮＡ対照で標準化した後のｈｓｐ２７ ｍＲＮＡのデンシトメトリーによる測定結果を示す。そこに示すように、配列番号８４、８５、８７、８８及び９０はすべて、乱雑配列の対照と比べてｈｓｐ２７発現を有意に低下させる効果が高い。
【実施例６】
【００３１】
配列番号８４の配列を有するＲＮＡｉ分子をＰＣ３細胞にトランスフェクトし、発現したｈｓｐ２７タンパクの量を、ビンキュリン発現と比較して決定した。その結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。そこに示すように、ｈｓｐ２７発現における量依存的低下がＲＮＡｉ分子で処理した後に観察された。
【実施例７】
【００３２】
ＬＮＣａＰ細胞（１ウェル当たり１０４個の細胞、１２穴プレート中で培養）に、イン・ビトロで配列番号８４の配列を有する１ｎＭのＲＮＡｉ分子をトランスフェクトした。クリスタルバイオレット法を用いて細胞増殖をモニターした。図７Ａに示すように、ＲＮＡｉで処理すると、オリゴフェクタミンのみ又は乱雑配列の対照の処理に比べて細胞増殖が低下した。この実験を、ＰＣ３細胞を用いて反復した。図７Ｂは、トランスフェクションの３日後における生存細胞の％を示す。図７Ｃは、配列番号８２のｈｓｐ２７アンチセンスを用いて処理した後、イン・ビトロでＰＣ３細胞の増殖が抑制されたことを示す。
【実施例８】
【００３３】
ｈｓｐ２７アンチセンス（配列番号８２）又はＲＮＡｉ（配列番号８４）分子をトランスフェクトしたヒト膀胱癌Ｔ２４細胞を、ｈｓｐ２７発現について試験した。図８に示すように、ＲＮＡｉ及びアンチセンス分子はどちらも、この細胞中で発現ｈｓｐ２７量を低下させる効果があった。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月２日出願の米国仮出願第６０／４１５，８５９号、及び２００３年４月１８日出願の米国仮出願第６０／４６３，９５２号の特典を請求するものであり、これら両方を、そのような組み込みを許可する法律上の権限において、参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本願は、疾患の発症の少なくとも一部の段階で正常組織と比べて高いレベルのｈｓｐ２７を発現する前立腺癌及び他の癌の治療のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は、男性が罹患する最も一般的な癌であり、欧米世界において男性の癌による死亡の原因の第２位となっている。前立腺癌はアンドロゲン感受性腫瘍であるので、例えば去勢によるアンドロゲン分泌阻害が、進行性前立腺癌患者の治療法において使用されることがある。アンドロゲン分泌阻害によって前立腺癌に広範なアポトーシスが生じ、したがってこの疾患の退縮が生じる。しかし、去勢により誘導されるアポトーシスは完全ではなく、生き残っている細胞のアンドロゲン非依存性への進行が最終的に起こる。この進行が生存率及び生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）の向上に対する主な障害であり、したがって、アンドロゲン非依存性細胞を標的とする努力が払われてきた。この努力は、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞を標的とする非ホルモン療法に集中されてきた（非特許文献１及び非特許文献２）が、今までのところ生存率を向上させる非ホルモン性作用因子は存在しない。したがって代替手法を試みるべきであることが示唆される。
【０００４】
アンドロゲン分泌阻害の後、前立腺腫瘍細胞によって多数のタンパクが多量に発現されることが観察されている。これらのタンパクの少なくとも一部は、アンドロゲン分泌阻害で観察される観察されたアポトーシス細胞死と関係することが想定される（非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ ７１（Ｓｕｐｐ．３）：１０９８−１１０９（１９９３）
【非特許文献２】Ｊ．Ｕｒｏｌ．６０：１２２０−１２２９（１９９８）
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．：４４４８−４４４５（１９９５）
【非特許文献４】Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：１５６７−１５７６（１９９６）
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：６９４０−６９４４（１９９２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、熱ショックタンパク（ｈｓｐ）２７を標的とする治療用作用因子をイン・ビボで使用して、ｈｓｐ２７を過剰発現する前立腺癌及び他の癌に罹患している個体、特にヒト個体に対する治療をもたらすものである。本発明によれば、治療用作用因子、例えば、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡ、例えばヒトｈｓｐ２７ ｍＲＮＡに配列特異性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターを、ｈｓｐ２７を高レベルに発現している前立腺癌又は他の一部の癌に罹患している個体に治療有効量で投与する。治療用作用因子を、製薬上許容される担体を含む薬剤組成物中に適切に配合し、単位剤形に包装する。好ましい単位剤形は、注射可能な単位剤形である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｂ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｃ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｄ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｅ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｆ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図１Ｇ】配列番号１〜８１のアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらされた細胞でのｍＲＮＡ発現試験の結果を示す図である。
【図２】ＰＣ３細胞中のｈｓｐ２７発現におけるｈｓｐ２７アンチセンスの効果を示す図である。
【図３Ａ】ｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積及び血清ＰＳＡを示す図である。
【図３Ｂ】ｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積及び血清ＰＳＡを示す図である。
【図４Ａ】タキソール入り及びなしでｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積の変化を示す図である。
【図４Ｂ】タキソール入り及びなしでｈｓｐ２７アンチセンスで処置した後の腫瘍体積の変化を示す図である。
【図５】ＲＮＡｉで処理後のｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの低下を示す図である。
【図６Ａ】ＲＮＡｉで処理した後の発現ｈｓｐ２７タンパク量を示す図である。
【図６Ｂ】ＲＮＡｉで処理した後の発現ｈｓｐ２７タンパク量を示す図である。
【図７Ａ】前立腺癌細胞をアンチセンス及びＲＮＡｉで処理した結果を示す図である。
【図７Ｂ】前立腺癌細胞をアンチセンス及びＲＮＡｉで処理した結果を示す図である。
【図７Ｃ】前立腺癌細胞をアンチセンス及びＲＮＡｉで処理した結果を示す図である。
【図８】Ｔ２４膀胱癌細胞でのｈｓｐ２７発現を示す図である。
【図９】一連のＮＨＴを行った組織中でのｈｓｐ２７の免疫組織学的評価から決定したｈｓｐ２７の免疫反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、活性型ｈｓｐ２７の有効量をイン・ビボで低下させる組成物に関する。本発明において有用な代表的組成物は、アンチセンスｈｓｐ２７オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターである。本発明はさらに、ｈｓｐ２７を多量に発現する前立腺癌及び他の癌の治療におけるこれらの組成物の使用にも関する。
【０００９】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、「活性型ｈｓｐ２７」という用語は、ストレスがかかったときにタンパク構造を安定化させるシャペロンとして活性を有する、具体的には、アポトーシスの媒介物であるカスパーゼ３の活性を抑制するｈｓｐ２７を指している。活性型ｈｓｐ２７レベルの低下は、ｈｓｐ２７の産生を制限すること、ｈｓｐ２７が産生されるより速い速度でそれを分解すること、ｈｓｐ２７を不活性型に転換する、例えば、抗ｈｓｐ２７抗体を用いるなどｈｓｐ２７を不活性複合体中に隔離することのいずれかによってｈｓｐ２７の総量を低下させることで達成することができる。
【００１０】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、治療され得る癌は、同じ組織型の非癌細胞と比べて多量にｈｓｐ２７を発現するものである。代表的な癌には、それだけに限らないが、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、骨肉腫、膵癌、大腸癌、黒色腫、睾丸癌、結腸直腸癌、尿路上皮癌、腎細胞癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫及び卵巣癌並びに中枢神経系悪性腫瘍が含まれる。
【００１１】
本願の明細書及び特許請求の範囲において、「配列特異性」という用語は、オリゴヌクレオチドと標的ｈｓｐ２７との間に細胞内条件下で特異的結合が生じるのに十分な、ワトソンクリック塩基対形成を用いた相補的関係が存在することを指している。完全に相補性があることが望ましいが、特に長いオリゴヌクレオチドを使用する場合、このことは必ずしも絶対的に必要ではない。
【００１２】
ヒトｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの配列は、例えばＮＣＢＩ受託番号ＡＢ０２００２７、Ｘ５４０７９、ＮＭ＿００６３０８、ＮＭ＿００１５４０及びＮＭ＿００１５４１から知られている。ｃＤＮＡ配列（配列番号９１）は、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＲＮＡｉヌクレオチドインヒビターを開発するための基礎をなす。アンチセンス及びＲＮＡｉに好ましい配列は、配列番号９１中のヌクレオチド１３１〜１６１、２４１〜２６１、３６１〜３７１、５５１〜５８０、６６１〜６８１及び７４４〜７６４由来の領域中にある塩基群を標的とするものである。これらの領域内の塩基群を標的とするためには、アンチセンス分子又はＲＮＡｉ分子は列挙した塩基群のうち少なくとも１個、好ましくは列挙した塩基群のうち少なくとも１０個の塩基を含む領域との配列特異性を有していなければならない。
【００１３】
適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さ１２〜３５塩基のオリゴヌクレオチドであり、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡ配列と配列特異性を有するものである。実際に作成し、活性型ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの量を低下させることができるかどうか試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列番号１〜８２で示す。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの５’−ｇｇｇａｃｇｃｇｇｃｇｃｔｃｇｇｔｃａｔ−３’（配列番号８２）の配列を有するもの、並びに配列番号２５、３６、５６、５７、６７、及び７６の配列を有するものである。
【００１４】
ＲＮＡ干渉又は「ＲＮＡｉ」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を線蠕虫（ｗｏｒｍ）に導入したとき、それによって遺伝子発現を遮断することができたという観察結果を記載したＦｉｒｅ及びその共同研究者によって最初に作り出された用語である（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１、これを参照により本明細書に組み込む）。ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含めた多くの生物中で遺伝子特異的転写後サイレンシングを起こすように指示し、遺伝子機能を研究するための新しい道具を提供してきた。ＲＮＡｉはｍＲＮＡ分解に関係するが、この干渉の根底にある生化学的機構の多くは知られていない。ＲＮＡｉの使用は、Ｃａｒｔｈｅｗら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，２４４−２４８及びＥｌｂａｓｈｉｒら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１，４９４−４９８にさらに記載されており、どちらの文献も参照により本明細書に組み込む。本発明のＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ阻害を媒介する約２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖又は一本鎖ＲＮＡである。すなわち、本発明の単離ＲＮＡｉは、ｈｓｐ２７遺伝子のｍＲＮＡの分解を媒介する。
【００１５】
ＲＮＡ、ＲＮＡ分子（群）、ＲＮＡセグメント（群）、及びＲＮＡ断片（群）の用語を互換的に使用して、ＲＮＡ干渉を媒介するＲＮＡを指すことができる。これらの用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ（部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え体として産生されたＲＮＡ）、並びに１つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により天然に存在するＲＮＡと異なる改変ＲＮＡが含まれる。このような改変は、ＲＮＡの（両側の）末端又は内部（ＲＮＡの１つ又は複数のヌクレオチド）などに対する非ヌクレオチド物質の付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中にあるヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含めた標準的でないヌクレオチドを含むこともできる。このような改変ＲＮＡｉ化合物はすべて総称してアナログ、又は天然に存在するＲＮＡのアナログと呼ばれる。本発明のＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然ＲＮＡに十分に類似しているだけでよい。本明細書においては、「ＲＮＡｉを媒介する」という表現は、どのｍＲＮＡがＲＮＡｉの機構又は過程によって作用を受けるかを識別できることを指し示している。ＲＮＡｉを媒介するＲＮＡは、ＲＮＡｉの機構と相互作用して、ＲＮＡｉの機構に特定のｍＲＮＡを分解するよう又はその他の方法で標的タンパクの発現を低下させるよう指示する。一実施形態では、本発明は、配列が一致する特定のｍＲＮＡの切断を指示するＲＮＡ分子に関する。配列の完全な一致は不要であるが、そのＲＮＡが、標的ｍＲＮＡの切断又は発現欠如による、ＲＮＡｉを用いた阻害を指示することができるのに十分なほど一致していなければならない。
【００１６】
上記に示した通り、本発明のＲＮＡ分子は、一般にＲＮＡ部分及びある種の付加部分、例えばデオキシリボヌクレオチド部分を含む。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの総数は、ＲＮＡｉの有効な媒介物であるためには４９個より少ないのが適切である。好ましいＲＮＡ分子中では、ヌクレオチド数は１６〜２９個であり、さらに好ましくは１８〜２３個であり、最も好ましくは２１〜２３個である。
【００１７】
適切なＲＮＡｉ分子のＲＮＡ部分を、配列番号８３〜９０で示す。これらの配列はセンスＲＮＡ鎖である。これらは、対応するアンチセンス鎖と組み合わせてＲＮＡｉ治療に使用することができる。
【００１８】
アンチセンス又はＲＮＡｉ分子として使用するオリゴヌクレオチドを修飾して、イン・ビボでのそのオリゴヌクレオチドの安定性を増大させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に高い耐性を有するホスホチオエート誘導体（架橋していないホスホリル基の酸素原子を硫黄原子で置き換えたもの）の形で使用することができる。ＭＯＥ修飾（ＩＳＩＳ主鎖）も有効である。
【００１９】
そのままでの投与、及び製薬上許容される脂質担体中に含まれる形での投与を含め、当技術分野で知られている様々な機構を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を実施することができる。例えば、アンチセンスの送達のための脂質担体は、米国特許第５，８５５，９１１号及び第５，４１７，９７８号において開示されており、これらを参照により本明細書に組み込む。一般に、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与又は経口経路による投与、或いは局所腫瘍に直接注射することによって、アンチセンスを投与する。
【００２０】
投与するアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他の治療用作用因子の量は、活性型ｈｓｐ２７の量を低下させるのに有効な量である。この量は、使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド又は他の治療用作用因子が有効であるかどうかによっても、使用する任意の担体の性質によっても変わることが理解されるであろう。所与の任意の組成物について適切な量を決定することは、当分野の技術の範囲内であり、これは治療に適したレベルを評価するように設計された標準的な一連の試験により決定される。
【００２１】
標的タンパクの発現を阻害することによって治療上の利益が得られるタイプの癌又は他の疾患に罹患しているヒト患者を含めた患者を治療する療法に、本発明のＲＮＡｉ分子を使用する。経口的に、１種又は複数種の毎日の注射（静脈内、皮下、膀胱内、又は髄腔内）で、或いは連続静脈内投与又は連続髄腔内投与で、標的ｍＲＮＡ及びタンパクの制御に適した血漿及び組織濃度に達するまで１つ又は複数の治療サイクルの間、本発明のｓｉＲＮＡ分子を患者に投与する。
【００２２】
前立腺癌は、後期癌において、特にアンドロゲン非依存性となる癌において、ｈｓｐ２７を過剰発現する癌の１つである。図９に、ＮＨＴ（新補助ホルモン療法）を行った一連の組織中でｈｓｐ２７を免疫組織学的に評価することから決定したｈｓｐ２７の免疫反応性を示す。良性の試料では、免疫反応性は基底層に限定されている。新補助療法の持続期間が増大するほど、免疫反応性は増大し、アンドロゲン非依存性腫瘍が非常に強い反応性を示す。前立腺癌の治療については、最初のアンドロゲン分泌阻害の後に本発明の治療用組成物を投与するのが適切である。アンドロゲン分泌阻害の開始は、前立腺癌の治療で現在指示される外科的去勢（両方の睾丸の除去）又は内科的去勢（薬剤で誘導するテストステロン抑制）によって実施することができる。内科的去勢は、ＬＨＲＨ剤又は抗アンドロゲン物質を含めた様々な療法によって実施することができる（Ｇｌｅａｖｅら，ＣＭＡＪ １６０：２２５−２３２（１９９９））。可逆的アンドロゲン分泌阻害をもたらす断続的療法が、Ｇｌｅａｖｅら Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．３４（Ｓｕｐｐ．３）：３７−４１（１９９８）に記載されている。
【００２３】
ｈｓｐ２７発現の阻害は、一時的でよいこともあるが、前立腺癌の治療では、理想的にはアンドロゲン分泌阻害に一致して行なうべきである。このことは、ヒトにおいては、発現阻害をアンドロゲン分泌阻害（前又は後）の１日又は２日以内に始め、それを約３〜６ヶ月続けると有効であるはずであることを意味する。それには、達成するために多くの投与量が必要となる可能性がある。しかし、本発明の範囲を逸脱することなく、それを去勢前に始め、その後かなりの時間続けることで、その期間の終了をさらに延長することができることが理解されるであろう。
【００２４】
本発明による前立腺癌を含めた癌を治療する方法は、化学療法剤及び／又は異なる標的を対象とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与をさらに含むことができる。他の治療用作用因子の例としては、それだけに限らないが、タキサン類（パクリタキセル又はドセタキセル）、ミトキサントロン、並びにＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌ又はｃ−ｍｙｃを対象とするアンチセンスがある。アンチセンス又はＲＮＡｉを用いたｈｓｐ２７の阻害を使用して、タキサン類又はゲムシタビン、並びに前立腺癌、乳癌、肺癌、尿路上皮癌及び他の癌の治療用の生物学的作用因子などの活性を増強することができる。
【００２５】
本発明を、以下の非限定的な実施例に関して次にさらに記載する。
【実施例１】
【００２６】
配列番号１〜８１に定義した複数のアンチセンス化合物を調製し、各配列について、オリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）担体中の５０ｎＭの特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドにヒト前立腺癌ＰＣ３細胞をさらした後、ノーザンブロットによってその細胞のＨｓｐ２７ ｍＲＮＡ発現のレベルを試験した。この試験の結果を、配列番号１〜８１についてオリゴフェクタミンのみの対照に対する百分率として、図１Ａ〜Ｇに示す。そこに示すように、すべてのアンチセンス配列が有効であるわけではないが、有効なアンチセンス配列は、ｈｓｐ２７ ｍＲＮＡの全体にわたって見られる。
【実施例２】
【００２７】
ＰＣ３前立腺癌細胞に、４０％コンフルエント時に１０ｃｍディッシュ中でオリゴフェクタミン担体を用いて６種類の異なるｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチドを３種類の濃度（１０、３０及び５０ｎＭ）で２回連続してトランスフェクトした。ＲＮＡを最初の処理の４８時間後に抽出し、ノーザンブロットで分析した。試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６７、５７、２５、７６、５６及び３６を含むものであった。対照として、乱雑な（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）配列のオリゴヌクレオチド及びオリゴフェクタミンのみの実験を行った。試験したすべてのオリゴヌクレオチドが、少なくとも１種類の濃度で対照群と比べてｈｓｐ２７の下方制御を示した。図２に、その結果をＧＡＰＤＨ対照と対比してグラフに示す。
【実施例３】
【００２８】
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の異種移植片をマウスに導入し、去勢によるアンドロゲン分泌阻害後、１０ｍｇ／ｋｇで１日１回４週間腹腔内投与したｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号８２）の腹腔内注射の効果を評価した。図３Ａ及び３Ｂに示すように、腫瘍体積及び血清ＰＳＡは、乱雑な配列の対照で処置した後数週間で増大した。このことから、アンドロゲン非依存性が進行し、それによって去勢療法の効力が消失したことが示唆される。それに対して、ｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したとき同じ時点でこのアンドロゲン非依存性への進行は観察されなかった。
【実施例４】
【００２９】
ＰＣ３前立腺癌細胞の異種移植片をマウスに導入し、タキソール入り及びなしで１０ｍｇ／ｋｇで１日１回４週間腹腔内投与したｈｓｐ２７アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号８２）の腹腔内注射の効果を評価した。図４Ａ及び４Ｂに示すように、腫瘍体積は、ｈｓｐ２７アンチセンスを用いた処置によって、乱雑な配列のオリゴヌクレオチドと比べて有意に低下した。この効果は、タキソール処置をアンチセンス処置と組み合わせたとき増強された。図４Ａは、単一の作用因子による抗腫瘍活性を示しており、一方、図４Ｂは、ｈｓｐ２７アンチセンスを投与すると、イン・ビボでパクリタキセルに対する細胞の感受性を高めることができることを示している。図４Ｂにおける対照は、乱雑配列＋タキソールである。
【実施例５】
【００３０】
配列番号８４、８５、８７、８８及び９０の配列を有するＲＮＡｉ分子を、ＰＣ３細胞中で試験した。
ＰＣ細胞に、様々な量のｈｓｐ２７ ｓｉＲＮＡ又は乱雑配列の対照をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロッティングによりｈｓｐ２７及び２８Ｓレベルについて分析した。オリゴフェクタミンのみで処理した細胞を追加の対照として使用した。図５は、２８Ｓ ｍＲＮＡ対照で標準化した後のｈｓｐ２７ ｍＲＮＡのデンシトメトリーによる測定結果を示す。そこに示すように、配列番号８４、８５、８７、８８及び９０はすべて、乱雑配列の対照と比べてｈｓｐ２７発現を有意に低下させる効果が高い。
【実施例６】
【００３１】
配列番号８４の配列を有するＲＮＡｉ分子をＰＣ３細胞にトランスフェクトし、発現したｈｓｐ２７タンパクの量を、ビンキュリン発現と比較して決定した。その結果を図６Ａ及び６Ｂに示す。そこに示すように、ｈｓｐ２７発現における量依存的低下がＲＮＡｉ分子で処理した後に観察された。
【実施例７】
【００３２】
ＬＮＣａＰ細胞（１ウェル当たり１０４個の細胞、１２穴プレート中で培養）に、イン・ビトロで配列番号８４の配列を有する１ｎＭのＲＮＡｉ分子をトランスフェクトした。クリスタルバイオレット法を用いて細胞増殖をモニターした。図７Ａに示すように、ＲＮＡｉで処理すると、オリゴフェクタミンのみ又は乱雑配列の対照の処理に比べて細胞増殖が低下した。この実験を、ＰＣ３細胞を用いて反復した。図７Ｂは、トランスフェクションの３日後における生存細胞の％を示す。図７Ｃは、配列番号８２のｈｓｐ２７アンチセンスを用いて処理した後、イン・ビトロでＰＣ３細胞の増殖が抑制されたことを示す。
【実施例８】
【００３３】
ｈｓｐ２７アンチセンス（配列番号８２）又はＲＮＡｉ（配列番号８４）分子をトランスフェクトしたヒト膀胱癌Ｔ２４細胞を、ｈｓｐ２７発現について試験した。図８に示すように、ＲＮＡｉ及びアンチセンス分子はどちらも、この細胞中で発現ｈｓｐ２７量を低下させる効果があった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９１の一部分と相補性があり、配列番号２５、３６、５６、５７、６７、７６及び８２からなる群から選ばれる１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、または配列番号８４の配列からなる１本鎖もしくは２本鎖ｓｉＲＮＡである治療用作用因子であって、該治療用作用因子にさらされたｈｓｐ２７発現細胞中で活性型ｈｓｐ２７の量を低下させるのに有効な治療用作用因子を含む組成物。
【請求項２】
前記治療用作用因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号８２の配列からなる、請求項２の組成物。
【請求項４】
前記治療用作用因子が、配列番号８４の配列からなる１本鎖もしくは２本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡがイン・ビボでのヌクレアーゼ消化に対する耐性をもたらす主鎖修飾を有する、請求項１−４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
癌の治療のために使用する、請求項１−５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記癌が、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、皮膚癌（例えば黒色腫）、腎癌又は卵巣癌或いは中枢神経系悪性腫瘍である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載の組成物と、注射可能な単位剤形にパッケージされた薬剤として許容される担体を含む薬剤組成物。
【請求項１】
配列番号９１の一部分と相補性があり、配列番号２５、３６、５６、５７、６７、７６及び８２からなる群から選ばれる１つのアンチセンスオリゴヌクレオチド、または配列番号８４の配列からなる１本鎖もしくは２本鎖ｓｉＲＮＡである治療用作用因子であって、該治療用作用因子にさらされたｈｓｐ２７発現細胞中で活性型ｈｓｐ２７の量を低下させるのに有効な治療用作用因子を含む組成物。
【請求項２】
前記治療用作用因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号８２の配列からなる、請求項２の組成物。
【請求項４】
前記治療用作用因子が、配列番号８４の配列からなる１本鎖もしくは２本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡがイン・ビボでのヌクレアーゼ消化に対する耐性をもたらす主鎖修飾を有する、請求項１−４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
癌の治療のために使用する、請求項１−５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記癌が、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、膵癌、大腸癌、皮膚癌（例えば黒色腫）、腎癌又は卵巣癌或いは中枢神経系悪性腫瘍である、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
請求項１−７のいずれかに記載の組成物と、注射可能な単位剤形にパッケージされた薬剤として許容される担体を含む薬剤組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２１５６６９（Ｐ２０１０−２１５６６９Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５５３１５（Ｐ２０１０−１５５３１５）
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【分割の表示】特願２００５−５０００１４（Ｐ２００５−５０００１４）の分割
【原出願日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【出願人】（５０３２６５０９４）ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【分割の表示】特願２００５−５０００１４（Ｐ２００５−５０００１４）の分割
【原出願日】平成１５年１０月２日（２００３．１０．２）
【出願人】（５０３２６５０９４）ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア (17)
【Ｆターム（参考）】
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