化学発光検出装置
【課題】化学発光検出装置において、迅速かつ簡便に測定対象を固定したビーズを微小反応層に充填すること（スループットの向上）と微小反応層と撮像素子を１対１に対応させることを両立させる。
【解決手段】個々の微小反応槽（配列の最小単位が菱形）にから発する光を偏芯または傾いたマイクロレンズアレイを交互に配列させることによって微小反応槽とピクセルの間の一対一対応を実現する。
【解決手段】個々の微小反応槽（配列の最小単位が菱形）にから発する光を偏芯または傾いたマイクロレンズアレイを交互に配列させることによって微小反応槽とピクセルの間の一対一対応を実現する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学発光検出装置に関し、例えば、複数の反応槽からの発光の検出し、その検出結果を核酸分析や遺伝子の塩基配列等を解析するために用いるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ塩基配列決定ではゲル電気泳動と蛍光検出を用いた方法が広く用いられている。この方法ではまず、配列解析を行おうとするＤＮＡ断片のコピーを多数作製する。次に、ＤＮＡの５’末端を始点として種々の長さの蛍光標識断片を作製する。また、これらＤＮＡ断片の３’末端の塩基種に応じて波長の異なる蛍光標識を付加しておく。続いて、ゲル電気泳動により長さの違いを１塩基の差で識別し、それぞれの断片群が発する発光を検出する。そして、検出された発光波長色から測定中のＤＮＡ断片群のＤＮＡ末端塩基種を特定する。ＤＮＡは短い断片群から順次蛍光検出部を通過するので、蛍光色を計測することで短いＤＮＡから順に末端塩基種を知ることができる。これにより、配列決定をする。以上のような蛍光式ＤＮＡシーケンサーは幅広く普及しており、また、ヒトゲノム解析にも大いに活躍した。この方法では、内径５０μｍ程度のガラス細管を、多数本用い、さらに末端検出等の方法を利用し、一台あたりの解析処理数を増加させている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、パイロシーケンシングに代表される段階的化学反応による配列決定法（例えば、非特許文献２及び３参照）は、取り扱いの簡便性から注目されている。概略は以下の通りである。ターゲットとするＤＮＡ鎖にプライマーをハイブリダイズさせ、４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１種類ずつ順番に反応液中に加えて相補鎖合成反応を行う。相補鎖合成反応が起きるとＤＮＡ相補鎖が伸長し、副産物としてピロリン酸（ＰＰｉ）が生成する。ピロリン酸は共存する酵素の働きでＡＴＰに変換され、ルシフェリンとルシフェラーゼの共存下で反応して発光を生じる。この光を検出することで加えた相補鎖合成基質がＤＮＡ鎖に取り込まれたことがわかり、相補鎖の配列情報、従ってターゲットとなったＤＮＡ鎖の配列情報がわかる。
【０００４】
この方法は、多くの反応槽を具備したフローセルを用いることにより高スループット化が可能であり、上記方法を応用して解析処理数を格段に増加させる例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。この応用例では、複数の微小反応槽を１面に有するフローセルが反応槽プレートとして用いられている。ターゲットＤＮＡ鎖を種類毎に直径約３５μｍのセファロース製ビーズに固定したものが多数用意され、各セファロースビーズには約１０８個の同じ種類のＤＮＡが固定される。これらＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせた後、各微小反応槽に１個ビーズを入れる。また、生物発光用酵素（ルシフェラーゼ）等を固定した直径２．８μｍのマイクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を反応槽に、充填している。これらのビーズの充填は、ビーズ含有溶液をフローセルに導入して、遠心器により沈降させることにより実施している。ＤＮＡ塩基配列解析は、フローセル上流より、伸長反応用の４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を逐次導入し、相補鎖合成反応を行うが、相補鎖合成反応が進行した場合にはピロリン酸が生じる。それがＡＴＰに変換され、ルシフェラーゼ反応を行うが、その際に生じる生物発光を観測している。
【０００５】
【非特許文献１】Anal. Chem. 2000、 72、 3423-3430
【非特許文献２】Margulies M, et al., “Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.”, Nature, Vol.437, Sep.15; 2005, pp376-80及びSupplementary Information s1〜s3
【非特許文献３】Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献２では、この反応槽プレート上に形成した微小反応槽中にターゲットＤＮＡ鎖を固定したセファロースビーズを充填するが、セファロースビーズは比重が小さいため、遠心器を用いて、沈降させなければならない。そのため、ターゲットＤＮＡを固定したビーズを充填するために時間がかかる。また、サンプル充填の自動化が困難である。
【０００７】
また、非特許文献２は、例えば、パイロシーケンス等の段階的ＤＮＡ伸長反応を利用して同時に多数のＤＮＡ配列を決定するシステムを示している。このシステムは、多数の微小反応槽でＤＮＡ伸長反応を起こさせ、このとき伸長反応に付随して起きる化学発光を多数の光検出ピクセルから構成された撮像素子（ＣＣＤ）を用いて検出するものである。これによれば、一度に計測することができる微小反応槽を増やすことによって、単位時間あたりの処理能力（スループット）を向上できるため、近年、計測並列数を増やすことによってこのスループットを向上させる努力がなされてきた。
【０００８】
しかしながら、スループット向上のために微小反応槽の数を増やすと、それに比例して、化学発光検出に必要な撮像素子（ＣＣＤ）のピクセル数も増えてしまう。ピクセル数の多い撮像素子（ＣＣＤ）は高価であるばかりでなく、ある程度以上のピクセル数の多い撮像素子は製造することすら困難である。
【０００９】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、迅速かつ簡便にターゲットＤＮＡが固定化されたビーズを微小反応槽に充填でき、同時に、配置格子（単位格子）の異なる微小反応槽と撮像素子（ＣＣＤ）のピクセルを１対１に対応させて、スループット向上に資する化学発光検出装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、微小反応槽の配置領域と撮像領域を一致させた状態で微小反応槽の撮像素子上での像の配置格子をピクセルの配置格子と一致させる手段を設けている。具体的には、微小反応槽からの発光を撮像素子上のピクセルのそれぞれに集光させる光学レンズとして、多数のレンズが平面上に集積したレンズアレイを用い、個々のレンズが１つおきにレンズの向きや中心や屈折率分布などを変えて、菱形の配置格子から撮像素子上の光スポット列の配置格子が長方形になるようにする。
【００１１】
以下に具体的な配置例を使って説明する。図４ａに示すように反応槽プレート上に微小反応槽が配置された様子を示す。黒丸も白丸も微小反応槽の中心位置である。図４ａにおいて、１０５に示すように微小反応槽の配置格子は菱形であり、その対角線１０６が溶液の流れの方向１０７になるように設定している。このように配置するとによって迅速なビーズの充填を実現している。
【００１２】
一方、図４ｂに撮像素子上での微小反応槽の集光像を示している。図４ｂにおいて、黒丸は図４ａ中の黒丸で示された微小反応槽からの光の集光位置に対応し、同様に図４ｂの白丸と図４ａの白丸も対応している。１１２は撮像素子上のピクセルであり、その配置格子は長方形である。いま、微小反応槽と撮像素子の間に特別に設計されたマイクロレンズアレイを適切な位置に配置することによって、このマイクロレンズアレイを使わなければ図４ａと同じ配置になるはずのものを黒丸については矢印Ａの方向に、白丸については矢印Ｂの方向にずらせることができる。この場合、図４ｂに示すように撮像素子上の微小反応槽の像の配置格子は長方形になる。上述のように、スポットの移動はマイクロレンズアレイを構成する個々のレンズの偏芯や光学レンズ中心軸を傾けることによって実現できる。すなわち、レンズの形状をレンズの中心軸に対して回転対称性を破るような非球面レンズを用いるかレンズの中心軸自体を傾けるような非球面レンズを用いればよい。
【００１３】
また、このレンズの偏芯や光学レンズ中心の傾きはレンズ内の屈折率分布にひずみを加えることによっても実現できる。図５ａにレンズが偏芯した場合の断面図を示す。反応槽プレート１０１上に微小反応槽１０２を形成し、この微小反応槽に対応してマイクロレンズアレイ５０１を配置した。図の破線５０２は微小反応槽の中心を通り、反応槽プレートに垂直な直線を示し、破線５０３はマイクロレンズアレイを構成するレンズの中心軸を示す。図５ａ及びｂから分かるように、破線５０２と５０３は平行にずらしてあり、微小反応槽に対して、マイクロレンズをずらせた方向とは反対方向に微小反応槽から発した光が集光される方向が破線５０２方向から傾いた方向に変わる。これに対応して、撮像素子上での微小反応槽の像が矢印の方向にずれることになる。
【００１４】
なお、マイクロレンズの中心のずれの大きさに比例して像のずれが大きくなる。よって、マイクロレンズの偏芯をどの程度にすべきかについては、配置格子が長方形になるためにはどの程度像をどの程度ずらさなければならないかによって決定される。
【００１５】
同様に、図５ｂにレンズ中心軸を傾けた場合の断面図を示す。図中のマイクロレンズアレイ５０４の中心軸５０５は微小反応槽の中心軸に対して平行でないように設置する。微小反応槽からの光の集光方向はマイクロレンズの傾き量に比例するので、この場合も前記と同様に像の配置格子が長方形にするために必要な像のずれ量からマイクロレンズの傾きを決定する。
【００１６】
即ち、本発明による化学発光検出装置は、複数の凹部を有する第一部材と、第一部材の凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ導出部から液体を導出する液流制御部と、複数の画素を有し、複数の凹部について光学検出をする検出部と、１の凹部の内部の発光が１の画素の位置に対応するように発光を集束させる光集束部と、を備える。そして、複数の凹部は、２次元配置として配置され、２次元配置の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形である。また、複数の画素は２次元配置され、複数の凹部の中心軸と複数の凹部に対応する複数の画素の中心軸とがずれて配置される。
【００１７】
また、複数の画素を有する検出部の画素の配置格子（単位格子）が長方形または正方形である。この場合、光集束部は、配置格子の最小単位が長方形以外の菱形で２次元配列された複数の凹部からの光を、長方形または正方形の配置格子に配列した画素の中心付近に集光させる。
【００１８】
また、本発明による化学発光検出装置は、次のようにも表される。つまり、本装置は、２次元配置された複数の凹部を有する第一部材と、第一部材の凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ導出部から液体を導出する液流制御部と、複数の画素を有し、複数の凹部のそれぞれからの発光を検出する検出部と、複数の凹部と検出部との間に配置され、複数の凹部からのそれぞれの発光を検出部の複数の画素のそれぞれに対応させるためのマイクロレンズアレイと、を備える。そして、２次元配置された複数の凹部の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形であり、マイクロレンズアレイは、複数の凹部からの発光の光軸を変更することにより、複数の凹部からのそれぞれの発光を検出部の複数の画素のそれぞれに対応させる。
【００１９】
さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、パイロシーケンシング解析の際に、安価で高スループット、かつ高精度で蛍光検出できる化学発光検出装置を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、スループットを向上させつつ、フローセル中の微小反応槽と撮像素子上のピクセルを１対１に対応させる化学発光検出装置を提供するものであるが、まず、微小反応槽の迅速なビーズの充填と均一な化学発光のために適切な配置について示し、この微小反応槽の配置に対して、ピクセルを１対１に対応させることが従来困難であったかをより詳細に説明し、続いて本発明の実施形態について説明することとする。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００２２】
＜微小反応槽と撮像素子上のピクセルを１対１に対応させることの困難性＞
非特許文献２及び３に示されるように、微小反応槽はプレート上の凹みとして形成する。また、当該出願人の先願である特願２００６−２９３４８３（先願１）の明細書及び図面において示されるように、スループット向上のため、比重の重いビーズをフローセル中に流し、ビーズを重力によって沈降させ、迅速かつ簡便にターゲットＤＮＡを固定したビーズをフローセル中の微小反応槽に充填するようにしている。特に、試料溶液の流れ方向に対して反応槽を斜めに分布させ、配置格子の最小単位は長方形ではなく菱形とすることによって、反応槽間の距離を維持しながら、ビーズと反応槽の出会う確率をさらに向上させることができる。これによってビーズの捕捉率が高まり、迅速かつ簡便なビーズの充填が可能となる。なお、ＤＮＡを固定したビーズをこの凹みに迅速かつ簡便に充填するためには、ビーズの比重が４以上であることと、試料溶液の流れ方向に対して反応槽を斜めに分布させ、配置格子（単位格子）を長方形ではなく菱形とすることが有効である（ただし、斜めに配置した正方形は菱形に含まれる）。反応槽プレート１０１上に微小反応槽１０２を多数配置した具体例を図１に示した。ＤＮＡを固定したビーズを１０７の方向に流すことによって、ビーズの大きな比重によって、速やかに沈降し、微小反応槽１０２に充填される。このとき、流路入り口１１０から入った溶液およびビーズは反応槽プレート上を流れ、溶液が流路出口１１１から排出される。このとき、反応槽プレート上の流路部分はその上に設置されたスペーサ１０８によってスムーズな溶液の流れを実現する。矢印１０７は溶液およびビーズの流れの方向を示している。溶液およびビーズを反応槽プレート上で往復させてより確実にビーズを微小反応槽に充填することも可能である。
【００２３】
このように迅速かつ簡便にビーズが充填できるのは微小反応槽の配置格子が菱形であり、微小反応槽の配列のどの位置からビーズが矢印７の方向にながれても、必ず微小反応槽の直上を通過するため実現できているからである。
【００２４】
しかし、現在知られている多くの撮像素子のピクセルの配置格子は長方形または正方形である。そのため、拡大縮小を含む従来知られている光学系では、微小反応槽の２次元アレイからの発光像を撮像素子上において、微小反応槽とピクセルを１対１に対応することができない。
【００２５】
この問題に鑑み、当該出願人の先願である特願２００７−１１３０９５（先願２）の明細書及び図面では、１つの微小反応槽に必要なピクセル数を１個にすること、すなわち、フローセル中の微小反応槽と撮像素子上のピクセルを１対１に対応させる化学発光検出システムを開示している。
【００２６】
しかし、上述のように、ある程度以上のピクセル数の多い撮像素子は製造することは困難であるので、当該先願のシステムだとスループットを向上させるには自ずと限界がある。
【００２７】
図１において、この溶液の流路部分の最大幅１０９は広すぎると均一に溶液が流れないため、微小反応中の伸長反応および化学発光反応が極端に不均一におきてしまう。そのため、流路の幅１０９は流路長さから決まる上限がある（この上限の数値は流路表面の溶液に対する濡れ性等によって大きく異なるため上限の数値を一意に定めることはできない。）。一方、流路中にできる限り、多くの微小反応槽を配置した方が、スループットが向上する。高スループットを実現するため、微小反応槽の配置領域１０３は、撮像素子による撮影領域１０４と重ねて、２辺が流速方向１０７と平行な長方形または正方形が望ましい。図１には正方形の場合を描いた。今、先願１の記載に従って、微小反応槽１０２の配置格子１０５は菱形（図１では特に斜めに配置した正方形（＝菱形の特別な場合））になるようにする。
【００２８】
一方、撮像素子のピクセルの配置格子は正方形または長方形（図１では正方形の場合を記した）である。図１から分かるようにピクセルの配置１１２と微小反応槽は１対１に対応させることができない。これは微小反応槽の配置格子は菱形であり、撮像素子のピクセルの配置格子が長方形（流れに平行に配置した正方形を含む）であり、異なるためである。すなわち、通常の光学系で微小反応槽からの発光像をこのように配置された撮像素子で計測しても、微小反応槽とピクセルを１対１に対応させて計測することはできない。
【００２９】
また、微小反応槽の配置格子が菱型（斜めに配置された正方形）であるから、これにピクセルの配置格子をあわせるように、撮像素子を４５度回転させて配置した場合を図２に示す。特に微小反応槽が斜めに配置された正方形で、ピクセルも正方形だとすると、撮像素子を４５回転させることによって、図２から分かるように一部の微小反応槽はピクセルと１対１に対応させることが可能である。しかし、撮像領域だけれども微小反応槽がない領域１１３および、微小反応槽はあるけれども撮像領域ではない領域１１４がどうしても出てきてしまう。特にこのような撮像領域と微小反応層の配置領域の不一致は両者が長方形である場合に顕著である。このような微小反応槽の配置領域が長方形の場合の撮像領域と微小反応槽の配置領域の重なり具合を図３に示す。撮像領域だけれども微小反応槽がない領域１１３、微小反応槽はあるけれども撮像領域ではない領域１１４ともに撮像領域に対して大きな割合を占める。
【００３０】
しかし、前述のように、流路の最大幅１０９は広くせずに微小反応槽の数を増やしてスループットを向上させる必要がある。このためには微小反応槽の配置領域と撮像領域の重なりをできるだけ大きく取るようにした場合の配置を図３に示す。ただし、この場合でも、撮像領域は有効に活用することができず、少ないピクセルで高いスループットを実現することができない。
【００３１】
以上のように、撮像領域の有効活用と微小反応槽とピクセルの１対１対応を両立させるためには困難が生じることになる。以下、これらを両立することのできる実施形態について詳細に説明する。
【００３２】
＜第１の実施形態＞
（１）化学発光検出装置の構成
図６は、本発明の第１の実施形態による化学発光検出装置１の概略構成を示す図である。化学発光検出装置１は、反応槽プレートから出る化学発光を、偏芯したマイクロレンズアレイを用いて微小反応槽の撮像素子であるＣＣＤ上での集光像の配置格子を長方形に変形し、微小反応槽とＣＣＤピクセルを１対１に対応させて発光を計測した例である。この構成によって、微小反応槽中に導入された、測定対象の遺伝子の配列は、パイロシーケンシング法の原理を用いて決定することができる。
【００３３】
図６において、化学発光検出装置１は、フローセル中の微小反応槽での化学発光を計測するシステムとして、フローセル６０１、発光画像を検出する冷却型ＣＣＤカメラなどの検出部である２次元撮像カメラ６０２、カメラ内部の（２次元）撮像素子６０３上に微小反応槽からの発光像を撮像素子上に結像する光学系として、マイクロレンズアレイ５０１とファイババンドル６０４から構成される。
【００３４】
また、化学発光検出装置１は、微小反応槽に試薬を送液するシステムとして、順次フローセルに試薬を分注するために４種の核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの４種類など）を各々収める試薬槽６０６〜６０９と、伸長反応測定後にフローセル内を洗浄するための洗浄試薬を収める洗浄試薬槽６１０と、洗浄後にセル内の洗浄試薬成分の残留を洗い流すためのコンディショニング試薬を収めるコンディショニング試薬槽６１１と、それらを選択的にフローセル側に注入するための注入部（選択バルブ６１２及び試薬をハンドリングするためのポンプ６１３）と、廃液ボトル６１４等により構成される。
【００３５】
（２）フローセルの構造
次に、図７を参照して、フローセル６０１の構造を説明する。フローセル６０１は、後述の試料固定ビーズを保持するための複数の微小反応槽（凹部）１０２を表面に有する反応槽プレート１０１と、試薬流入口７０３と、試薬排出口７０４と、必要に応じて設けられる試料投入口（図示せず）を有する上板７０１と、流路を形成するスペーサ７０２とを備えている。ここでマイクロレンズアレイ５０１または５０４は上板７０１の一部に形成する。このマイクロレンズアレイは上板７０１と一体成型し、材料としてはポリカーボーネート（屈折率１．５８５）等の光透過性があり化学的に安定なプラスティック材料を用いた。プラスティック材料の代わりにＢＫ等のガラス材料を用いてもよい。また、プラスティック材料として、ポリプロピレンやポリエチレンその他のプラスティック材料を用いても良いし、ガラス材料についても合成石英などの材料を用いてもよい。図８は、フローセル６０１のＡＡ’での断面図を示している。図８において、試薬溶液は上板７０１と反応槽プレート１０１の間に形成された流路７０９内を流れ、このとき微小反応槽１０２中に必要な試薬溶液が供給される。そして、微小反応槽１０２の中に解析対象となるＤＮＡを固定化したビーズ７０８を挿入する。
【００３６】
なお、微小反応槽１０２の形状は、例えば円柱状が好ましい。形状は、基板の素材や製作方法により決定される。例えば、基板としてステンレス材を用いて切削加工により製作した反応槽プレート、シリコンウエハーを用いてマスクとウエットエッチングにより製作した反応槽プレート、スライドガラス等のガラスを用いて粒子によるブラスタ加工で製作した反応槽プレート、及びポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン等を用いて金型の射出成型により製作した反応槽プレート等が使用可能である。ただし、これらは微小反応層の材料や製作法について制限するものではない。
【００３７】
また、反応槽プレート１０１上に配置格子を菱形として直径３．５μｍ深さ３．５μｍの円柱状の微小反応槽を形成する。配置格子である菱形は流れに平行な長い方の対角線の長さを８０μｍ、流れに垂直な短い方の対角線を４０μｍとする。このときフローセルの上板上に形成したマイクロレンズは図８の５０１に示すように偏芯した球面レンズを配置する。ここでは微小反応槽とマイクロレンズの中心軸とのずれは１５μｍとしている。そして、偏芯の向きはマイクロレンズアレイの配置において流れに平行な方向を列としたときに、１列置きに偏芯の向きを交互に変更して設定する。すなわち、隣の列ではマイクロレンズの偏芯の向きは反対となるようになっている。これにより、図４ａで示したような集光を実現することができる。
【００３８】
また、レンズの曲率半径は３０μｍ、フローセル上板７０１の厚みを７μｍとし、溶液が流れる部分の厚み、すなわち、スペーサ７０２の厚みは１０μｍとする。直径３μｍのファイバを束ねたファイババンドルの端面がフローセルの上板の下側（溶液と接する面）から４０μｍだけ隔たるように設置した。マイクロレンズ材料はポリカーボネートとし、射出成型により加工する。ただし、マイクロレンズアレイの材料および寸法は上述したものだけでなく、微小反応槽の菱形の配置格子を撮像素子上の像において長方形にできるように、材料の屈折率等にあわせて設計するものである。
【００３９】
このようなマイクロレンズアレイを用いて、得られる撮像素子上での微小反応槽の像を図９に示す。図９は一辺が４０μｍの正方形のピクセルが配置されている様子を示し、点線で撮像素子のピクセル間の境界を示している。図９には、９つのピクセルが描かれている。そのうち、３つに微小反応槽からの像がある場合を示している。発光像はその集光強度を等高線で示し、最大強度の１／５までの強度を描いている。また、点線で描かれた円形はマイクロレンズアレイに偏芯がない場合の発光像の位置をしめし、１０６の菱形は微小反応槽の配置格子に対応する。マイクロレンズアレイの偏芯によって、矢印９０１または９０２の方向に像が移動している。このとき移動量は１０μｍである。また、マイクロレンズアレイは、像の配置が正方形となるように、列ごとに矢印９０１及び９０２に対応して逆方向に偏芯させている。
【００４０】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態は、マイクロレンズを偏芯させるのではなく中心線を傾けた例に関するものである。図１０は、本実施形態による、フローセルとマイクロレンズアレイおよびファイババンドルの断面図を示している。
【００４１】
反応槽プレート上には、第１の実施形態と同様に、配置格子を菱形として直径３．５μｍ、深さ３．５μｍの円柱状の微小反応槽が形成されている。この菱形の対角線の長さもそれぞれ８０μｍと４０μｍである。また、本実施形態では、中心軸５０５が微小反応槽の中心軸５０２に対して１０度傾いたマイクロレンズ５０４をポリカーボネートの射出成型によって作製されている。マイクロレンズは球面レンズとし、その曲率半径は１２μｍである。また、フローセル６０１の上板７０１の厚さは８μｍである。流路の厚さすなわち、スペーサ７０２の厚さは、第１の実施形態と同様に１０μｍである。さらに、レンズの結像面である、ファイババンドルの表面と上板７０１の溶液と接する面との距離を６０μｍである。
【００４２】
このようなマイクロレンズアレイを用いて、得られる撮像素子上の受光像が図１１に示されている。図１１においても、９つのピクセルの一辺が４０μｍのＣＣＤ素子上の像を受光強度の等高線にて示されている。
【００４３】
本実施形態のマイクロレンズアレイは一列おきにしかレンズの中心軸を傾けておらず、図１１の９つのピクセルのうち左側と右側の４つの受光像は移動していない。
【００４４】
一方、真ん中の像は２０μｍ下方向に移動し、像の配置格子が正方形になるように修正されている。
【００４５】
＜まとめ＞
本発明では、微小反応槽からのそれぞれの発光の出射方向を変更するマイクロレンズアレイを、撮像素子と反応槽プレートとの間に配置するようにしている。また、反応槽プレートの各微小反応槽の最小配列単位を菱形（長方形を除く）とする。これにより、撮像素子の撮像領域の構成に制約されずに、反応槽プレートの各微小反応槽と撮像素子の画素を１対１に対応させることができるようになる。したがって、スループットを低下させることもなくなる。つまり、画素と微小反応槽との１対１対応とスループット向上を両立させることができるようになる。
【００４６】
発光の出射方向の変更については、例えば、微小反応槽の中心軸を偏芯させて撮像素子の画素の中心軸と合致させる方法や、発光の光軸を傾斜させる方法が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】当該出願人による先願（特願２００６−２９３４８３）において、微小反応槽とピクセルの配置の間の１対１対応が取れないことを示す図である。
【図２】微小反応槽の配置領域を正方形としたときの、撮像領域と微小反応槽の配置領域の不一致を示す図である。
【図３】微小反応槽の配置領域を長方形としたときの、撮像領域と微小反応槽の配置領域の不一致を示す図である。
【図４】本発明において微小反応槽の配置と撮像素子のピクセルの配置の関係を示した図である。
【図５】偏芯や中心軸の傾きを持たせたマイクロレンズアレイの断面図である。
【図６】本発明の第１の実施形態におけるＤＮＡ配列決定装置（化学発行検出装置）の概略構成を示す図である。
【図７】フローセルの組み立て図である。
【図８】第１の実施形態におけるフローセルおよびマイクロレンズアレイの断面図である。
【図９】第１の実施形態における撮像素子上での微小反応槽からの光の集光像である。
【図１０】第２の実施形態におけるフローセルおよびマイクロレンズアレイの断面図である。
【図１１】第２の実施形態における撮像素子上での微小反応槽からの光の集光像である。
【符号の説明】
【００４８】
１・・・化学発光検出装置、１０１・・・反応槽プレート、１０２・・・微小反応槽、１０３・・・微小反応槽配置領域、１０４・・・撮像領域、１０５・・・微小反応槽の配置格子、１０６・・・微小反応槽配置格子の対角線、１０７・・・ビーズおよび（試薬）溶液の流れの方向、１０８・・・流路形状を決めるスペーサ、１０９・・・流路最大幅、１１０・・・流路入り口、１１１・・・流路出口、１１２・・・ピクセル対応領域、１１３・・・撮像領域だけれども微小反応槽がない領域、１１４・・・微小反応槽はあるけれども撮像領域ではない領域、５０１・・・偏芯したマイクロレンズ（アレイ）、５０２・・・微小反応槽の中心を通り、反応槽プレートに垂直な直線、５０３・・・マイクロレンズアレイを構成するレンズの中心軸（偏芯した場合）、５０４・・・傾いたマイクロレンズ（アレイ）、５０５・・・マイクロレンズアレイを構成するレンズの中心軸（傾けた場合）、６０１・・・フローセル、６０２・・・２次元撮像カメラ、６０３・・・撮像素子、６０４・・・ファイババンドル、６０６〜６０９・・・試薬槽、６１０・・・洗浄試薬槽、６１１・・・コンディショニング試薬槽、６１２・・・選択バルブ、６１３・・・ポンプ、６１４・・・廃液ボトル、７０１・・・フローセルの上板、７０２・・・スペーサ、７０３・・・試薬流入口、７０４・・・試薬排出口、７０８・・・ＤＮＡを固定化したビーズ、７０９・・・フローセル中の流路、９０１及び９０２・・・像の移動方向を示す矢印
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学発光検出装置に関し、例えば、複数の反応槽からの発光の検出し、その検出結果を核酸分析や遺伝子の塩基配列等を解析するために用いるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ塩基配列決定ではゲル電気泳動と蛍光検出を用いた方法が広く用いられている。この方法ではまず、配列解析を行おうとするＤＮＡ断片のコピーを多数作製する。次に、ＤＮＡの５’末端を始点として種々の長さの蛍光標識断片を作製する。また、これらＤＮＡ断片の３’末端の塩基種に応じて波長の異なる蛍光標識を付加しておく。続いて、ゲル電気泳動により長さの違いを１塩基の差で識別し、それぞれの断片群が発する発光を検出する。そして、検出された発光波長色から測定中のＤＮＡ断片群のＤＮＡ末端塩基種を特定する。ＤＮＡは短い断片群から順次蛍光検出部を通過するので、蛍光色を計測することで短いＤＮＡから順に末端塩基種を知ることができる。これにより、配列決定をする。以上のような蛍光式ＤＮＡシーケンサーは幅広く普及しており、また、ヒトゲノム解析にも大いに活躍した。この方法では、内径５０μｍ程度のガラス細管を、多数本用い、さらに末端検出等の方法を利用し、一台あたりの解析処理数を増加させている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、パイロシーケンシングに代表される段階的化学反応による配列決定法（例えば、非特許文献２及び３参照）は、取り扱いの簡便性から注目されている。概略は以下の通りである。ターゲットとするＤＮＡ鎖にプライマーをハイブリダイズさせ、４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を１種類ずつ順番に反応液中に加えて相補鎖合成反応を行う。相補鎖合成反応が起きるとＤＮＡ相補鎖が伸長し、副産物としてピロリン酸（ＰＰｉ）が生成する。ピロリン酸は共存する酵素の働きでＡＴＰに変換され、ルシフェリンとルシフェラーゼの共存下で反応して発光を生じる。この光を検出することで加えた相補鎖合成基質がＤＮＡ鎖に取り込まれたことがわかり、相補鎖の配列情報、従ってターゲットとなったＤＮＡ鎖の配列情報がわかる。
【０００４】
この方法は、多くの反応槽を具備したフローセルを用いることにより高スループット化が可能であり、上記方法を応用して解析処理数を格段に増加させる例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。この応用例では、複数の微小反応槽を１面に有するフローセルが反応槽プレートとして用いられている。ターゲットＤＮＡ鎖を種類毎に直径約３５μｍのセファロース製ビーズに固定したものが多数用意され、各セファロースビーズには約１０８個の同じ種類のＤＮＡが固定される。これらＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせた後、各微小反応槽に１個ビーズを入れる。また、生物発光用酵素（ルシフェラーゼ）等を固定した直径２．８μｍのマイクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を反応槽に、充填している。これらのビーズの充填は、ビーズ含有溶液をフローセルに導入して、遠心器により沈降させることにより実施している。ＤＮＡ塩基配列解析は、フローセル上流より、伸長反応用の４種の相補鎖合成核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を逐次導入し、相補鎖合成反応を行うが、相補鎖合成反応が進行した場合にはピロリン酸が生じる。それがＡＴＰに変換され、ルシフェラーゼ反応を行うが、その際に生じる生物発光を観測している。
【０００５】
【非特許文献１】Anal. Chem. 2000、 72、 3423-3430
【非特許文献２】Margulies M, et al., “Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.”, Nature, Vol.437, Sep.15; 2005, pp376-80及びSupplementary Information s1〜s3
【非特許文献３】Electrophoresis 2003, 24, 3769-3777
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献２では、この反応槽プレート上に形成した微小反応槽中にターゲットＤＮＡ鎖を固定したセファロースビーズを充填するが、セファロースビーズは比重が小さいため、遠心器を用いて、沈降させなければならない。そのため、ターゲットＤＮＡを固定したビーズを充填するために時間がかかる。また、サンプル充填の自動化が困難である。
【０００７】
また、非特許文献２は、例えば、パイロシーケンス等の段階的ＤＮＡ伸長反応を利用して同時に多数のＤＮＡ配列を決定するシステムを示している。このシステムは、多数の微小反応槽でＤＮＡ伸長反応を起こさせ、このとき伸長反応に付随して起きる化学発光を多数の光検出ピクセルから構成された撮像素子（ＣＣＤ）を用いて検出するものである。これによれば、一度に計測することができる微小反応槽を増やすことによって、単位時間あたりの処理能力（スループット）を向上できるため、近年、計測並列数を増やすことによってこのスループットを向上させる努力がなされてきた。
【０００８】
しかしながら、スループット向上のために微小反応槽の数を増やすと、それに比例して、化学発光検出に必要な撮像素子（ＣＣＤ）のピクセル数も増えてしまう。ピクセル数の多い撮像素子（ＣＣＤ）は高価であるばかりでなく、ある程度以上のピクセル数の多い撮像素子は製造することすら困難である。
【０００９】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、迅速かつ簡便にターゲットＤＮＡが固定化されたビーズを微小反応槽に充填でき、同時に、配置格子（単位格子）の異なる微小反応槽と撮像素子（ＣＣＤ）のピクセルを１対１に対応させて、スループット向上に資する化学発光検出装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、微小反応槽の配置領域と撮像領域を一致させた状態で微小反応槽の撮像素子上での像の配置格子をピクセルの配置格子と一致させる手段を設けている。具体的には、微小反応槽からの発光を撮像素子上のピクセルのそれぞれに集光させる光学レンズとして、多数のレンズが平面上に集積したレンズアレイを用い、個々のレンズが１つおきにレンズの向きや中心や屈折率分布などを変えて、菱形の配置格子から撮像素子上の光スポット列の配置格子が長方形になるようにする。
【００１１】
以下に具体的な配置例を使って説明する。図４ａに示すように反応槽プレート上に微小反応槽が配置された様子を示す。黒丸も白丸も微小反応槽の中心位置である。図４ａにおいて、１０５に示すように微小反応槽の配置格子は菱形であり、その対角線１０６が溶液の流れの方向１０７になるように設定している。このように配置するとによって迅速なビーズの充填を実現している。
【００１２】
一方、図４ｂに撮像素子上での微小反応槽の集光像を示している。図４ｂにおいて、黒丸は図４ａ中の黒丸で示された微小反応槽からの光の集光位置に対応し、同様に図４ｂの白丸と図４ａの白丸も対応している。１１２は撮像素子上のピクセルであり、その配置格子は長方形である。いま、微小反応槽と撮像素子の間に特別に設計されたマイクロレンズアレイを適切な位置に配置することによって、このマイクロレンズアレイを使わなければ図４ａと同じ配置になるはずのものを黒丸については矢印Ａの方向に、白丸については矢印Ｂの方向にずらせることができる。この場合、図４ｂに示すように撮像素子上の微小反応槽の像の配置格子は長方形になる。上述のように、スポットの移動はマイクロレンズアレイを構成する個々のレンズの偏芯や光学レンズ中心軸を傾けることによって実現できる。すなわち、レンズの形状をレンズの中心軸に対して回転対称性を破るような非球面レンズを用いるかレンズの中心軸自体を傾けるような非球面レンズを用いればよい。
【００１３】
また、このレンズの偏芯や光学レンズ中心の傾きはレンズ内の屈折率分布にひずみを加えることによっても実現できる。図５ａにレンズが偏芯した場合の断面図を示す。反応槽プレート１０１上に微小反応槽１０２を形成し、この微小反応槽に対応してマイクロレンズアレイ５０１を配置した。図の破線５０２は微小反応槽の中心を通り、反応槽プレートに垂直な直線を示し、破線５０３はマイクロレンズアレイを構成するレンズの中心軸を示す。図５ａ及びｂから分かるように、破線５０２と５０３は平行にずらしてあり、微小反応槽に対して、マイクロレンズをずらせた方向とは反対方向に微小反応槽から発した光が集光される方向が破線５０２方向から傾いた方向に変わる。これに対応して、撮像素子上での微小反応槽の像が矢印の方向にずれることになる。
【００１４】
なお、マイクロレンズの中心のずれの大きさに比例して像のずれが大きくなる。よって、マイクロレンズの偏芯をどの程度にすべきかについては、配置格子が長方形になるためにはどの程度像をどの程度ずらさなければならないかによって決定される。
【００１５】
同様に、図５ｂにレンズ中心軸を傾けた場合の断面図を示す。図中のマイクロレンズアレイ５０４の中心軸５０５は微小反応槽の中心軸に対して平行でないように設置する。微小反応槽からの光の集光方向はマイクロレンズの傾き量に比例するので、この場合も前記と同様に像の配置格子が長方形にするために必要な像のずれ量からマイクロレンズの傾きを決定する。
【００１６】
即ち、本発明による化学発光検出装置は、複数の凹部を有する第一部材と、第一部材の凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ導出部から液体を導出する液流制御部と、複数の画素を有し、複数の凹部について光学検出をする検出部と、１の凹部の内部の発光が１の画素の位置に対応するように発光を集束させる光集束部と、を備える。そして、複数の凹部は、２次元配置として配置され、２次元配置の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形である。また、複数の画素は２次元配置され、複数の凹部の中心軸と複数の凹部に対応する複数の画素の中心軸とがずれて配置される。
【００１７】
また、複数の画素を有する検出部の画素の配置格子（単位格子）が長方形または正方形である。この場合、光集束部は、配置格子の最小単位が長方形以外の菱形で２次元配列された複数の凹部からの光を、長方形または正方形の配置格子に配列した画素の中心付近に集光させる。
【００１８】
また、本発明による化学発光検出装置は、次のようにも表される。つまり、本装置は、２次元配置された複数の凹部を有する第一部材と、第一部材の凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ導出部から液体を導出する液流制御部と、複数の画素を有し、複数の凹部のそれぞれからの発光を検出する検出部と、複数の凹部と検出部との間に配置され、複数の凹部からのそれぞれの発光を検出部の複数の画素のそれぞれに対応させるためのマイクロレンズアレイと、を備える。そして、２次元配置された複数の凹部の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形であり、マイクロレンズアレイは、複数の凹部からの発光の光軸を変更することにより、複数の凹部からのそれぞれの発光を検出部の複数の画素のそれぞれに対応させる。
【００１９】
さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、パイロシーケンシング解析の際に、安価で高スループット、かつ高精度で蛍光検出できる化学発光検出装置を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、スループットを向上させつつ、フローセル中の微小反応槽と撮像素子上のピクセルを１対１に対応させる化学発光検出装置を提供するものであるが、まず、微小反応槽の迅速なビーズの充填と均一な化学発光のために適切な配置について示し、この微小反応槽の配置に対して、ピクセルを１対１に対応させることが従来困難であったかをより詳細に説明し、続いて本発明の実施形態について説明することとする。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００２２】
＜微小反応槽と撮像素子上のピクセルを１対１に対応させることの困難性＞
非特許文献２及び３に示されるように、微小反応槽はプレート上の凹みとして形成する。また、当該出願人の先願である特願２００６−２９３４８３（先願１）の明細書及び図面において示されるように、スループット向上のため、比重の重いビーズをフローセル中に流し、ビーズを重力によって沈降させ、迅速かつ簡便にターゲットＤＮＡを固定したビーズをフローセル中の微小反応槽に充填するようにしている。特に、試料溶液の流れ方向に対して反応槽を斜めに分布させ、配置格子の最小単位は長方形ではなく菱形とすることによって、反応槽間の距離を維持しながら、ビーズと反応槽の出会う確率をさらに向上させることができる。これによってビーズの捕捉率が高まり、迅速かつ簡便なビーズの充填が可能となる。なお、ＤＮＡを固定したビーズをこの凹みに迅速かつ簡便に充填するためには、ビーズの比重が４以上であることと、試料溶液の流れ方向に対して反応槽を斜めに分布させ、配置格子（単位格子）を長方形ではなく菱形とすることが有効である（ただし、斜めに配置した正方形は菱形に含まれる）。反応槽プレート１０１上に微小反応槽１０２を多数配置した具体例を図１に示した。ＤＮＡを固定したビーズを１０７の方向に流すことによって、ビーズの大きな比重によって、速やかに沈降し、微小反応槽１０２に充填される。このとき、流路入り口１１０から入った溶液およびビーズは反応槽プレート上を流れ、溶液が流路出口１１１から排出される。このとき、反応槽プレート上の流路部分はその上に設置されたスペーサ１０８によってスムーズな溶液の流れを実現する。矢印１０７は溶液およびビーズの流れの方向を示している。溶液およびビーズを反応槽プレート上で往復させてより確実にビーズを微小反応槽に充填することも可能である。
【００２３】
このように迅速かつ簡便にビーズが充填できるのは微小反応槽の配置格子が菱形であり、微小反応槽の配列のどの位置からビーズが矢印７の方向にながれても、必ず微小反応槽の直上を通過するため実現できているからである。
【００２４】
しかし、現在知られている多くの撮像素子のピクセルの配置格子は長方形または正方形である。そのため、拡大縮小を含む従来知られている光学系では、微小反応槽の２次元アレイからの発光像を撮像素子上において、微小反応槽とピクセルを１対１に対応することができない。
【００２５】
この問題に鑑み、当該出願人の先願である特願２００７−１１３０９５（先願２）の明細書及び図面では、１つの微小反応槽に必要なピクセル数を１個にすること、すなわち、フローセル中の微小反応槽と撮像素子上のピクセルを１対１に対応させる化学発光検出システムを開示している。
【００２６】
しかし、上述のように、ある程度以上のピクセル数の多い撮像素子は製造することは困難であるので、当該先願のシステムだとスループットを向上させるには自ずと限界がある。
【００２７】
図１において、この溶液の流路部分の最大幅１０９は広すぎると均一に溶液が流れないため、微小反応中の伸長反応および化学発光反応が極端に不均一におきてしまう。そのため、流路の幅１０９は流路長さから決まる上限がある（この上限の数値は流路表面の溶液に対する濡れ性等によって大きく異なるため上限の数値を一意に定めることはできない。）。一方、流路中にできる限り、多くの微小反応槽を配置した方が、スループットが向上する。高スループットを実現するため、微小反応槽の配置領域１０３は、撮像素子による撮影領域１０４と重ねて、２辺が流速方向１０７と平行な長方形または正方形が望ましい。図１には正方形の場合を描いた。今、先願１の記載に従って、微小反応槽１０２の配置格子１０５は菱形（図１では特に斜めに配置した正方形（＝菱形の特別な場合））になるようにする。
【００２８】
一方、撮像素子のピクセルの配置格子は正方形または長方形（図１では正方形の場合を記した）である。図１から分かるようにピクセルの配置１１２と微小反応槽は１対１に対応させることができない。これは微小反応槽の配置格子は菱形であり、撮像素子のピクセルの配置格子が長方形（流れに平行に配置した正方形を含む）であり、異なるためである。すなわち、通常の光学系で微小反応槽からの発光像をこのように配置された撮像素子で計測しても、微小反応槽とピクセルを１対１に対応させて計測することはできない。
【００２９】
また、微小反応槽の配置格子が菱型（斜めに配置された正方形）であるから、これにピクセルの配置格子をあわせるように、撮像素子を４５度回転させて配置した場合を図２に示す。特に微小反応槽が斜めに配置された正方形で、ピクセルも正方形だとすると、撮像素子を４５回転させることによって、図２から分かるように一部の微小反応槽はピクセルと１対１に対応させることが可能である。しかし、撮像領域だけれども微小反応槽がない領域１１３および、微小反応槽はあるけれども撮像領域ではない領域１１４がどうしても出てきてしまう。特にこのような撮像領域と微小反応層の配置領域の不一致は両者が長方形である場合に顕著である。このような微小反応槽の配置領域が長方形の場合の撮像領域と微小反応槽の配置領域の重なり具合を図３に示す。撮像領域だけれども微小反応槽がない領域１１３、微小反応槽はあるけれども撮像領域ではない領域１１４ともに撮像領域に対して大きな割合を占める。
【００３０】
しかし、前述のように、流路の最大幅１０９は広くせずに微小反応槽の数を増やしてスループットを向上させる必要がある。このためには微小反応槽の配置領域と撮像領域の重なりをできるだけ大きく取るようにした場合の配置を図３に示す。ただし、この場合でも、撮像領域は有効に活用することができず、少ないピクセルで高いスループットを実現することができない。
【００３１】
以上のように、撮像領域の有効活用と微小反応槽とピクセルの１対１対応を両立させるためには困難が生じることになる。以下、これらを両立することのできる実施形態について詳細に説明する。
【００３２】
＜第１の実施形態＞
（１）化学発光検出装置の構成
図６は、本発明の第１の実施形態による化学発光検出装置１の概略構成を示す図である。化学発光検出装置１は、反応槽プレートから出る化学発光を、偏芯したマイクロレンズアレイを用いて微小反応槽の撮像素子であるＣＣＤ上での集光像の配置格子を長方形に変形し、微小反応槽とＣＣＤピクセルを１対１に対応させて発光を計測した例である。この構成によって、微小反応槽中に導入された、測定対象の遺伝子の配列は、パイロシーケンシング法の原理を用いて決定することができる。
【００３３】
図６において、化学発光検出装置１は、フローセル中の微小反応槽での化学発光を計測するシステムとして、フローセル６０１、発光画像を検出する冷却型ＣＣＤカメラなどの検出部である２次元撮像カメラ６０２、カメラ内部の（２次元）撮像素子６０３上に微小反応槽からの発光像を撮像素子上に結像する光学系として、マイクロレンズアレイ５０１とファイババンドル６０４から構成される。
【００３４】
また、化学発光検出装置１は、微小反応槽に試薬を送液するシステムとして、順次フローセルに試薬を分注するために４種の核酸基質（ｄＡＴＰ、ｄＧＴ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの４種類など）を各々収める試薬槽６０６〜６０９と、伸長反応測定後にフローセル内を洗浄するための洗浄試薬を収める洗浄試薬槽６１０と、洗浄後にセル内の洗浄試薬成分の残留を洗い流すためのコンディショニング試薬を収めるコンディショニング試薬槽６１１と、それらを選択的にフローセル側に注入するための注入部（選択バルブ６１２及び試薬をハンドリングするためのポンプ６１３）と、廃液ボトル６１４等により構成される。
【００３５】
（２）フローセルの構造
次に、図７を参照して、フローセル６０１の構造を説明する。フローセル６０１は、後述の試料固定ビーズを保持するための複数の微小反応槽（凹部）１０２を表面に有する反応槽プレート１０１と、試薬流入口７０３と、試薬排出口７０４と、必要に応じて設けられる試料投入口（図示せず）を有する上板７０１と、流路を形成するスペーサ７０２とを備えている。ここでマイクロレンズアレイ５０１または５０４は上板７０１の一部に形成する。このマイクロレンズアレイは上板７０１と一体成型し、材料としてはポリカーボーネート（屈折率１．５８５）等の光透過性があり化学的に安定なプラスティック材料を用いた。プラスティック材料の代わりにＢＫ等のガラス材料を用いてもよい。また、プラスティック材料として、ポリプロピレンやポリエチレンその他のプラスティック材料を用いても良いし、ガラス材料についても合成石英などの材料を用いてもよい。図８は、フローセル６０１のＡＡ’での断面図を示している。図８において、試薬溶液は上板７０１と反応槽プレート１０１の間に形成された流路７０９内を流れ、このとき微小反応槽１０２中に必要な試薬溶液が供給される。そして、微小反応槽１０２の中に解析対象となるＤＮＡを固定化したビーズ７０８を挿入する。
【００３６】
なお、微小反応槽１０２の形状は、例えば円柱状が好ましい。形状は、基板の素材や製作方法により決定される。例えば、基板としてステンレス材を用いて切削加工により製作した反応槽プレート、シリコンウエハーを用いてマスクとウエットエッチングにより製作した反応槽プレート、スライドガラス等のガラスを用いて粒子によるブラスタ加工で製作した反応槽プレート、及びポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン等を用いて金型の射出成型により製作した反応槽プレート等が使用可能である。ただし、これらは微小反応層の材料や製作法について制限するものではない。
【００３７】
また、反応槽プレート１０１上に配置格子を菱形として直径３．５μｍ深さ３．５μｍの円柱状の微小反応槽を形成する。配置格子である菱形は流れに平行な長い方の対角線の長さを８０μｍ、流れに垂直な短い方の対角線を４０μｍとする。このときフローセルの上板上に形成したマイクロレンズは図８の５０１に示すように偏芯した球面レンズを配置する。ここでは微小反応槽とマイクロレンズの中心軸とのずれは１５μｍとしている。そして、偏芯の向きはマイクロレンズアレイの配置において流れに平行な方向を列としたときに、１列置きに偏芯の向きを交互に変更して設定する。すなわち、隣の列ではマイクロレンズの偏芯の向きは反対となるようになっている。これにより、図４ａで示したような集光を実現することができる。
【００３８】
また、レンズの曲率半径は３０μｍ、フローセル上板７０１の厚みを７μｍとし、溶液が流れる部分の厚み、すなわち、スペーサ７０２の厚みは１０μｍとする。直径３μｍのファイバを束ねたファイババンドルの端面がフローセルの上板の下側（溶液と接する面）から４０μｍだけ隔たるように設置した。マイクロレンズ材料はポリカーボネートとし、射出成型により加工する。ただし、マイクロレンズアレイの材料および寸法は上述したものだけでなく、微小反応槽の菱形の配置格子を撮像素子上の像において長方形にできるように、材料の屈折率等にあわせて設計するものである。
【００３９】
このようなマイクロレンズアレイを用いて、得られる撮像素子上での微小反応槽の像を図９に示す。図９は一辺が４０μｍの正方形のピクセルが配置されている様子を示し、点線で撮像素子のピクセル間の境界を示している。図９には、９つのピクセルが描かれている。そのうち、３つに微小反応槽からの像がある場合を示している。発光像はその集光強度を等高線で示し、最大強度の１／５までの強度を描いている。また、点線で描かれた円形はマイクロレンズアレイに偏芯がない場合の発光像の位置をしめし、１０６の菱形は微小反応槽の配置格子に対応する。マイクロレンズアレイの偏芯によって、矢印９０１または９０２の方向に像が移動している。このとき移動量は１０μｍである。また、マイクロレンズアレイは、像の配置が正方形となるように、列ごとに矢印９０１及び９０２に対応して逆方向に偏芯させている。
【００４０】
＜第２の実施形態＞
第２の実施形態は、マイクロレンズを偏芯させるのではなく中心線を傾けた例に関するものである。図１０は、本実施形態による、フローセルとマイクロレンズアレイおよびファイババンドルの断面図を示している。
【００４１】
反応槽プレート上には、第１の実施形態と同様に、配置格子を菱形として直径３．５μｍ、深さ３．５μｍの円柱状の微小反応槽が形成されている。この菱形の対角線の長さもそれぞれ８０μｍと４０μｍである。また、本実施形態では、中心軸５０５が微小反応槽の中心軸５０２に対して１０度傾いたマイクロレンズ５０４をポリカーボネートの射出成型によって作製されている。マイクロレンズは球面レンズとし、その曲率半径は１２μｍである。また、フローセル６０１の上板７０１の厚さは８μｍである。流路の厚さすなわち、スペーサ７０２の厚さは、第１の実施形態と同様に１０μｍである。さらに、レンズの結像面である、ファイババンドルの表面と上板７０１の溶液と接する面との距離を６０μｍである。
【００４２】
このようなマイクロレンズアレイを用いて、得られる撮像素子上の受光像が図１１に示されている。図１１においても、９つのピクセルの一辺が４０μｍのＣＣＤ素子上の像を受光強度の等高線にて示されている。
【００４３】
本実施形態のマイクロレンズアレイは一列おきにしかレンズの中心軸を傾けておらず、図１１の９つのピクセルのうち左側と右側の４つの受光像は移動していない。
【００４４】
一方、真ん中の像は２０μｍ下方向に移動し、像の配置格子が正方形になるように修正されている。
【００４５】
＜まとめ＞
本発明では、微小反応槽からのそれぞれの発光の出射方向を変更するマイクロレンズアレイを、撮像素子と反応槽プレートとの間に配置するようにしている。また、反応槽プレートの各微小反応槽の最小配列単位を菱形（長方形を除く）とする。これにより、撮像素子の撮像領域の構成に制約されずに、反応槽プレートの各微小反応槽と撮像素子の画素を１対１に対応させることができるようになる。したがって、スループットを低下させることもなくなる。つまり、画素と微小反応槽との１対１対応とスループット向上を両立させることができるようになる。
【００４６】
発光の出射方向の変更については、例えば、微小反応槽の中心軸を偏芯させて撮像素子の画素の中心軸と合致させる方法や、発光の光軸を傾斜させる方法が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】当該出願人による先願（特願２００６−２９３４８３）において、微小反応槽とピクセルの配置の間の１対１対応が取れないことを示す図である。
【図２】微小反応槽の配置領域を正方形としたときの、撮像領域と微小反応槽の配置領域の不一致を示す図である。
【図３】微小反応槽の配置領域を長方形としたときの、撮像領域と微小反応槽の配置領域の不一致を示す図である。
【図４】本発明において微小反応槽の配置と撮像素子のピクセルの配置の関係を示した図である。
【図５】偏芯や中心軸の傾きを持たせたマイクロレンズアレイの断面図である。
【図６】本発明の第１の実施形態におけるＤＮＡ配列決定装置（化学発行検出装置）の概略構成を示す図である。
【図７】フローセルの組み立て図である。
【図８】第１の実施形態におけるフローセルおよびマイクロレンズアレイの断面図である。
【図９】第１の実施形態における撮像素子上での微小反応槽からの光の集光像である。
【図１０】第２の実施形態におけるフローセルおよびマイクロレンズアレイの断面図である。
【図１１】第２の実施形態における撮像素子上での微小反応槽からの光の集光像である。
【符号の説明】
【００４８】
１・・・化学発光検出装置、１０１・・・反応槽プレート、１０２・・・微小反応槽、１０３・・・微小反応槽配置領域、１０４・・・撮像領域、１０５・・・微小反応槽の配置格子、１０６・・・微小反応槽配置格子の対角線、１０７・・・ビーズおよび（試薬）溶液の流れの方向、１０８・・・流路形状を決めるスペーサ、１０９・・・流路最大幅、１１０・・・流路入り口、１１１・・・流路出口、１１２・・・ピクセル対応領域、１１３・・・撮像領域だけれども微小反応槽がない領域、１１４・・・微小反応槽はあるけれども撮像領域ではない領域、５０１・・・偏芯したマイクロレンズ（アレイ）、５０２・・・微小反応槽の中心を通り、反応槽プレートに垂直な直線、５０３・・・マイクロレンズアレイを構成するレンズの中心軸（偏芯した場合）、５０４・・・傾いたマイクロレンズ（アレイ）、５０５・・・マイクロレンズアレイを構成するレンズの中心軸（傾けた場合）、６０１・・・フローセル、６０２・・・２次元撮像カメラ、６０３・・・撮像素子、６０４・・・ファイババンドル、６０６〜６０９・・・試薬槽、６１０・・・洗浄試薬槽、６１１・・・コンディショニング試薬槽、６１２・・・選択バルブ、６１３・・・ポンプ、６１４・・・廃液ボトル、７０１・・・フローセルの上板、７０２・・・スペーサ、７０３・・・試薬流入口、７０４・・・試薬排出口、７０８・・・ＤＮＡを固定化したビーズ、７０９・・・フローセル中の流路、９０１及び９０２・・・像の移動方向を示す矢印
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の凹部を有する第一部材と、前記第一部材の前記凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、
前記導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ前記導出部から液体を導出する液流制御部と、
複数の画素を有し、前記複数の凹部について光学検出をする検出部と、
１の前記凹部の内部の発光が１の前記画素の位置に対応するように前記発光を集束させる光集束部と、を備え、
前記複数の凹部は、２次元配置として配置され、前記２次元配置の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形であり、
前記複数の画素は２次元配置され、前記複数の凹部の中心軸と前記複数の凹部に対応する前記複数の画素の中心軸とがずれて配置されることを特徴とする化学発光検出装置。
【請求項２】
前記複数の画素を有する検出部の画素の配置格子（単位格子）が長方形または正方形であり、
前記光集束部は、前記配置格子の最小単位が長方形以外の菱形で２次元配列された前記複数の凹部からの光を、長方形または正方形の前記配置格子に配列した画素の中心付近に集光させることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項３】
前記光集束部が、複数のレンズを２次元に配列して構成されたマイクロレンズアレイを含むことを特徴とする請求項２に記載の化学発光検出装置。
【請求項４】
前記ずれは、前記凹部の中心軸と前記画素の中心軸との偏芯によって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項５】
前記偏芯が、前記２次元配置の複数の画素において１列おきに存在することを特徴とする請求項４に記載の化学発光検出装置。
【請求項６】
前記ずれは、前記凹部の中心軸と前記画素の中心軸との傾斜によって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項７】
前記傾斜が、前記２次元配置の複数の画素において１列おきに存在することを特徴とする請求項６に記載の化学発光検出装置。
【請求項８】
２次元配置された複数の凹部を有する第一部材と、前記第一部材の前記凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、
前記導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ前記導出部から液体を導出する液流制御部と、
複数の画素を有し、前記複数の凹部のそれぞれからの発光を検出する検出部と、
前記複数の凹部と前記検出部との間に配置され、前記複数の凹部からのそれぞれの発光を前記検出部の前記複数の画素のそれぞれに対応させるためのマイクロレンズアレイと、を備え、
前記２次元配置された前記複数の凹部の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形であり、
前記マイクロレンズアレイは、前記複数の凹部からの発光の光軸を変更することにより、前記複数の凹部からのそれぞれの発光を前記検出部の前記複数の画素のそれぞれに対応させることを特徴とする化学発光検出装置。
【請求項９】
前記マイクロレンズアレイは、前記発光の光軸を偏芯させることを特徴とする請求項８に記載の化学発光検出装置。
【請求項１０】
前記マイクロレンズアレイは、前記発光の光軸を傾斜させて前記発光の進行方向を変化させることを特徴とする請求項８に記載の化学発光検出装置。
【請求項１】
複数の凹部を有する第一部材と、前記第一部材の前記凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、
前記導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ前記導出部から液体を導出する液流制御部と、
複数の画素を有し、前記複数の凹部について光学検出をする検出部と、
１の前記凹部の内部の発光が１の前記画素の位置に対応するように前記発光を集束させる光集束部と、を備え、
前記複数の凹部は、２次元配置として配置され、前記２次元配置の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形であり、
前記複数の画素は２次元配置され、前記複数の凹部の中心軸と前記複数の凹部に対応する前記複数の画素の中心軸とがずれて配置されることを特徴とする化学発光検出装置。
【請求項２】
前記複数の画素を有する検出部の画素の配置格子（単位格子）が長方形または正方形であり、
前記光集束部は、前記配置格子の最小単位が長方形以外の菱形で２次元配列された前記複数の凹部からの光を、長方形または正方形の前記配置格子に配列した画素の中心付近に集光させることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項３】
前記光集束部が、複数のレンズを２次元に配列して構成されたマイクロレンズアレイを含むことを特徴とする請求項２に記載の化学発光検出装置。
【請求項４】
前記ずれは、前記凹部の中心軸と前記画素の中心軸との偏芯によって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項５】
前記偏芯が、前記２次元配置の複数の画素において１列おきに存在することを特徴とする請求項４に記載の化学発光検出装置。
【請求項６】
前記ずれは、前記凹部の中心軸と前記画素の中心軸との傾斜によって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の化学発光検出装置。
【請求項７】
前記傾斜が、前記２次元配置の複数の画素において１列おきに存在することを特徴とする請求項６に記載の化学発光検出装置。
【請求項８】
２次元配置された複数の凹部を有する第一部材と、前記第一部材の前記凹部と対向し、導入部と導出部とを有する第２部材と、を備えるセルと、
前記導入部から粒子を含む液体を導入し、かつ前記導出部から液体を導出する液流制御部と、
複数の画素を有し、前記複数の凹部のそれぞれからの発光を検出する検出部と、
前記複数の凹部と前記検出部との間に配置され、前記複数の凹部からのそれぞれの発光を前記検出部の前記複数の画素のそれぞれに対応させるためのマイクロレンズアレイと、を備え、
前記２次元配置された前記複数の凹部の配置格子の最小単位は長方形以外の菱形であり、
前記マイクロレンズアレイは、前記複数の凹部からの発光の光軸を変更することにより、前記複数の凹部からのそれぞれの発光を前記検出部の前記複数の画素のそれぞれに対応させることを特徴とする化学発光検出装置。
【請求項９】
前記マイクロレンズアレイは、前記発光の光軸を偏芯させることを特徴とする請求項８に記載の化学発光検出装置。
【請求項１０】
前記マイクロレンズアレイは、前記発光の光軸を傾斜させて前記発光の進行方向を変化させることを特徴とする請求項８に記載の化学発光検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−２５０８７２（Ｐ２００９−２５０８７２Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１０１３６４（Ｐ２００８−１０１３６４）
【出願日】平成２０年４月９日（２００８．４．９）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月９日（２００８．４．９）
【出願人】（０００００５１０８）株式会社日立製作所 (27,607)
【Ｆターム（参考）】
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