医療用ヒドロゲル組織接着剤
ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドを、水分散性マルチアームアミンと反応させて生成したヒドロゲル組織接着剤が記載されている。ヒドロゲルは、外傷または手術に起因する、望ましくない組織−組織間癒着の防止といった、より急速な分解が求められる医療用途の組織接着剤または封止剤として有用であり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、共に２００９年７月２日に出願された米国仮特許出願第６１／２２２７１３号明細書および同第６１／２２２７２０号明細書に基づく米国特許法（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．）１１９条による優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、医療用接着剤の分野に関する。より詳しくは、本発明はペンダントアルデヒド基を含むアルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンとの反応により生成されるヒドロゲル組織接着剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
組織接着剤は、創口閉鎖、体内外科的処置における縫合糸またはステープルの補助または代替、血液、胆汁、胃腸液および脳脊髄液などの体液の漏洩防止、角膜への合成アンレーまたはインレーの接着、薬剤配送装置、並びに、術後の癒着防止のための抗接着バリアとしてなど、多くの医療用途に可能性を有している。従来の組織接着剤は、一般に、幅広い接着用途には適していない。例えば、シアノアクリレート系接着剤は局所的な創口閉鎖に使用されてきたが、有毒な分解生成物を放出することから、体内用途への使用は制限されている。フィブリン系の接着剤は、遅硬性で、機械的強度に乏しく、かつウィルス感染の危険性がある。加えて、フィブリン系の接着剤は下層組織と共有結合しない。
【０００４】
数種類のタイプの異なるヒドロゲル組織接着剤が開発されている。それらは接着性および凝集性が向上しており、かつ毒性もない（例えば、Ｓｅｈｌら、米国特許出願公開第２００３／０１１９９８５号明細書、およびＧｏｌｄｍａｎｎ、米国特許出願公開第２００５／０００２８９３号明細書を参照）。これらのヒドロゲルは、一般に、求核基を有する成分と、この第１成分の求核基と反応することができる求電子基を有する成分との反応により生成され、共有結合を介した架橋網目構造を形成する。しかしながら、これらのヒドロゲルは、通常、膨潤するか、極めて急速に分解するか、または十分な接着強度もしくは機械的強度に欠けるものであり、そのため外科用接着剤としての有効性が損なわれている。
【０００５】
Ｋｏｄｏｋｉａｎら（同時係属中で共願の米国特許出願公開第２００６／００７８５３６号明細書）は、酸化ポリサッカリドと水分散性マルチアームポリエーテルアミンとの反応により生成されたポリサッカリドベースのヒドロゲル組織接着剤を記載している。これらの接着剤は、改善された接着性および凝集性を提供するものであり、体温で容易に架橋し、初期には寸法安定性を維持し、急速には分解せず、細胞に対して無毒であり、組織に炎症を起こさせない。しかしながら、外傷または手術によって生じる望ましくない組織−組織間癒着を防止するというようなある種の用途では、より急速に分解するヒドロゲル組織接着剤が必要である。例えば、癒着防止組成物は、治癒プロセスが始まったならば（通常、１〜３週以内）、その部位にあってはならない。
【０００６】
したがって、Ｋｏｄｏｋｉａｎらに記載されている酸化ポリサッカリドベースの組織接着剤の望ましい特性（上記参照）を有しながら、より短時間で分解するヒドロゲル組織接着剤が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、良好な接着性および凝集性を有し、体温で容易に架橋し、初期には寸法安定性を維持し、細胞に対して無毒であり、組織に炎症を起こさせず、かつ酸化ポリサッカリドベースのヒドロゲル組織接着剤より急速に分解する、ヒドロゲル組織接着剤を提供することにより、上記の必要性に応えるものである。
【０００８】
したがって、一実施形態において本発明は、
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含むキットを提供する。
【０００９】
他の一実施形態において本発明は、
ａ）溶媒中で、（ｉ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと、（ｉｉ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを混合して、ヒドロゲルを生成する工程；および
ｂ）前記ヒドロゲルを処理して前記溶媒の少なくとも一部を除去して、乾燥ヒドロゲルを生成する工程
を含む方法により生成される乾燥ヒドロゲルを提供する。
【００１０】
他の一実施形態において本発明は、
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド、および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
の反応生成物を含む組成物を提供する。
【００１１】
他の一実施形態において本発明は、
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含み、前記少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと前記少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンが、ポリサッカリドのペンダントアルデヒド基と水分散性マルチアームアミンの第１アミン基との間に形成された共有結合を介して架橋されている架橋ヒドロゲル組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上で、また本発明の説明全体を通して使用される場合、次の用語は特に明示しない限り、以下のように定義される。
【００１３】
用語「アルデヒド官能性ポリサッカリド」は、本明細書中では、化学的に修飾されて分子中にペンダントアルデヒド基が導入されたポリサッカリドをいう。ペンダントアルデヒド基は単一のアルデヒド基であってもジアルデヒドであってもよい。本明細書での定義では、アルデヒド官能性ポリサッカリドには、ポリサッカリド環の開裂により酸化されてアルデヒド基が導入されたポリサッカリドは含まれない。ポリサッカリド環の酸化により、ポリサッカリド環が開環してジアルデヒドが形成される。
【００１４】
用語「ペンダントアルデヒド基」は、環の水酸基の１つを介してポリサッカリドの糖に結合したアルデヒド基をいう。
【００１５】
用語「アルデヒド置換率」は、糖の繰り返し単位１モル当たりのペンダントアルデヒド基のモルパーセント、すなわち、（ペンダントアルデヒド基のモル数／糖の繰り返し単位のモル数）×１００をいう。
【００１６】
用語「水分散性マルチアームアミン」は、中心構造体（単一原子、コア分子またはポリマー主鎖であり得る）から広がる、直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい、３つ以上のポリマー鎖（「アーム」）を有するポリマーであって、少なくとも３つの分枝（「アーム」）が少なくとも１つの第１アミン基で終端されているポリマーをいう。水分散性マルチアームアミンは、水溶性であるか、または水に分散して、水性溶液または水性分散液中で第２の反応物質と反応し得るコロイド状懸濁液を形成することができる。
【００１７】
用語「分散液」は、本明細書中では、水性媒体中で第２の反応物質と反応し得るコロイド状の懸濁液をいう。
【００１８】
用語「水分散性マルチアームポリエーテルアミン」は、ポリマーがポリエーテルである水分散性マルチアームアミンをいう。
【００１９】
用語「ポリエーテル」は、繰り返し単位［−Ｏ−Ｒ］−（ここで、Ｒは２〜５個の炭素原子を有するヒドロカルビレン基である）を有するポリマーをいう。ポリエーテルは、また、異なるＲ基を有する異なる繰り返し単位を含むランダムまたはブロックコポリマーであってもよい。
【００２０】
用語「ヒドロカルビレン基」は、炭化水素の２つの異なる炭素原子から１個ずつ２個の水素原子を引き抜くことにより生成される２価の基をいう。
【００２１】
用語「分枝ポリエーテル」は、１個以上の分枝点（「アーム」）を有するポリエーテルをいい、星形、樹枝形、櫛形、高分枝および超分枝ポリエーテルなどが挙げられる。分枝は、１つ以上の、三官能以上の多官能性分枝点から放射状に広がる。
【００２２】
用語「樹枝形ポリエーテル」は、それぞれ連続するモノマー世代がコア分子から放射状に広がる形で規則的に繰り返す分枝構造を有する高分枝ポリエーテルをいう。
【００２３】
用語「櫛形ポリエーテル」は、直鎖状のポリマー主鎖の三官能性分枝点から線形の側鎖が伸びている分枝ポリエーテルをいう。
【００２４】
用語「星形ポリエーテル」は、線形の側鎖が単一原子または対称点を有するコア分子から伸びている分枝ポリエーテルをいう。
【００２５】
用語「超分枝ポリエーテル」は、「高分枝」よりさらに高度に、不完全なデンドリマーに近い程度にまで分枝したポリエーテルをいう。
【００２６】
用語「高分枝ポリエーテル」は、多くの分枝点を有しており、そのため分枝点の間隔がアームの全長より短くなっている分枝ポリエーテルをいう。
【００２７】
用語「第１アミン」は、２個の自由水素を有する中性アミノ基をいう。アミノ基は、第１級、第２級、または第３級の炭素と結合することができる。
【００２８】
用語「多官能性アミン」は、少なくとも２つの官能基を含み、そのうちの少なくとも１つが第１アミン基である化学化合物をいう。
【００２９】
用語「架橋」は、２つの異なるポリマー鎖の間に結合され、これらを結び付ける原子結合または原子鎖をいう。
【００３０】
用語「架橋密度」は、本明細書では、架橋結合サイト間に存在する鎖原子の平均数の逆数と定義する。
【００３１】
用語「重量による％」は、本明細書では「重量％」とも称されるが、特に明示しない限り、溶液または分散液の全重量に対する重量パーセントをいう。
【００３２】
用語「解剖学的部位」は、ヒトまたは動物の体外または体内の任意の部位をいう。
【００３３】
用語「組織」は、ヒトまたは動物における任意の生物学的組織をいい、生きている組織および死んだ組織の両方を含む。
【００３４】
用語「ヒドロゲル」は、共有結合架橋により結合された３次元網目構造の巨大分子からなり、多量の水を吸収して弾性ゲルを形成することができる水膨潤性ポリマーマトリックスをいう。
【００３５】
用語「乾燥ヒドロゲル」は、含有する溶媒の少なくとも一部を除去するよう処理されたヒドロゲルをいう。ヒドロゲルから全溶媒が実質的に全て除去されていることが好ましい。
【００３６】
用語「ＰＥＧ」は、本明細書中では、ポリ（エチレングリコール）をいう。
【００３７】
用語「Ｍw」は、本明細書中では、重量平均分子量をいう。
【００３８】
用語「Ｍn」は、本明細書中では、数平均分子量をいう。
【００３９】
用語「Ｍz］は、本明細書中では、ｚ−平均分子量をいう。
【００４０】
用語「医療用途」は、ヒトおよび動物に関係した医療用途をいう。
【００４１】
使用する略語の意味は次の通りである。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」」はミリリットルを意味し、「Ｌ」」はリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｍｏｌ％」はモルパーセントを意味し、「Ｖｏｌ」」は体積を意味し、「ｗ／ｗ」は重量当たりの重量を意味し、「Ｄａ」」はダルトンを意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、記号表示「１０Ｋ」」はポリマー分子が１０キロダルトンの数平均分子量を有することを意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｋＰａ」はキロパスカルを意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチ当たりのポンドを意味し、「ｒｐｍ」は１分当たりの回転数を意味し、「1Ｈ ＮＭＲ」」はプロトン核磁気共鳴分光法を意味し、「１３−Ｃ ＮＭＲ」は炭素１３核磁気共鳴分光法を意味し、「ｐｐｍ」は百万当たりの部を意味し、「ｃＰ」はセンチポアーズを意味し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を意味し、「ＭＷＣＯ」は分画分子量を意味する。
【００４２】
「Ａｌｄｒｉｃｈ」への言及、または「Ｓｉｇｍａ」への言及は、前記薬品または成分がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手したものであることを意味する。
【００４３】
本明細書においては、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンとの反応により生成されたヒドロゲル組織接着剤を開示している。ヒドロゲルは、外傷または手術に起因する、望ましくない組織−組織間癒着の防止（これには限定されない）といった、より急速な分解が要求される医療用途の組織接着剤または封止剤として有用であり得る。
【００４４】
アルデヒド官能性ポリサッカリド
本明細書中での使用に適したアルデヒド官能性ポリサッカリドは、化学的に修飾して分子内にペンダントアルデヒド基を導入したポリサッカリドである。ペンダントアルデヒド基は単一のアルデヒド基であってもジアルデヒドであってもよい。本明細書中で開示するアルデヒド官能性ポリサッカリドのペンダントアルデヒド基は、結合基を介してポリサッカリドに結合している。一実施形態においては、結合基は、炭素、水素および酸素原子を含むが、窒素原子は含有せず、エーテル結合によりポリサッカリドと結合している。後の実施例で示すように、このようなタイプの結合基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドは、酸化ポリサッカリド、あるいは、窒素原子を含有するか、または他の化学結合（例えば、アミドもしくはウレタンなど）によりポリサッカリドに結合するものなどの他のタイプの結合基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと比べて、水溶液中でより安定である。一実施形態では、結合基はペンダントアルデヒド基のα位に（すなわち、隣接する炭素原子に）結合したアルコキシ基を有する。他の一実施形態では、結合基はペンダントアルデヒド基のβ位に（すなわち、アルデヒド基から２番目の炭素原子に）結合したアルコキシ基を有しない。
【００４５】
本明細書においては、アルデヒド官能性ポリサッカリドには、ポリサッカリド環の開裂によって酸化されてアルデヒド基が導入されたポリサッカリドは含まれない。ポリサッカリド環の酸化により、ポリサッカリド環が開環してジアルデヒドが生成される。したがって、ポリサッカリド環の酸化により生成されたジアルデヒド基は、本明細書で定義されているペンダントアルデヒド基ではない。
【００４６】
アルデヒド官能性ポリサッカリドは、ペンダントアルデヒド基を導入するようポリサッカリドを化学的に修飾することにより調製することができる。有用なアルデヒド官能性ポリサッカリドとしては、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。出発物質のポリサッカリドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの供給源から商業的に入手することができる。当該技術分野で知られているように、ポリサッカリドは、一般に、異なる分子量の分布を有する不均質混合物であり、平均分子量、例えば重量平均分子量（Ｍw）、または数平均分子量（Ｍn）などにより、その特性が示される。したがって、これらのポリサッカリドから調製されるアルデヒド官能性ポリサッカリドも、また、異なる分子量の分布を有する不均質混合物である。好適なアルデヒド官能性ポリサッカリドは、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトン、より具体的には約３，０００〜約２５０，０００ダルトン、より具体的には約５，０００〜約６０，０００ダルトン、より具体的には約７，０００〜約２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有するものである。一実施形態では、アルデヒド官能性ポリサッカリドは、アルデヒド官能性デキストランである。他の一実施形態では、アルデヒド官能性ポリサッカリドは、アルデヒド官能性イヌリンである。
【００４７】
アルデヒド官能性ポリサッカリドは、当該技術分野で知られた方法で調製することができる。アルデヒド官能性ポリサッカリドは、Ｍｅｈｔａら（国際公開第９９／０７７４４号パンフレット）に記載されている任意の方法を使用して調製することができる。後述の実施例で詳述しているように、例えば、酸性の水性媒体中で、デキストランをアリルグリシジルエーテルと反応させてアリルオキシデキストランを生成させ、これを、その後、オゾン分解で酸化することにより、二重結合を開裂させ、末端アルデヒド基を導入することができる。さらに、Ｃｈｅｎ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３：１３１〜１３４、１９８９）に記載されているように、塩基性の水性媒体中で、グリシドールをデキストランなどのポリサッカリドと反応させて、アルキル化ポリサッカリドを得ることができる。アルキル化ポリサッカリドを過ヨウ素酸塩により酸化することにより、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドが得られる。アルデヒド官能性ポリサッカリドは、また、Ｓｏｌａｒｅｋら（米国特許第４，７０３、１１６号明細書）に記載されている、塩基の存在下にポリサッカリドを誘導体化アセタール試薬と反応させ、その後、ｐＨを７．０未満に調整してアセタールを加水分解させる方法で調製することができる。
【００４８】
ジアルデヒド官能基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドは、まず、末端ジエンを含有するペンダント基、または環状の２基置換のオレフィンを、ポリサッカリド環へ結合させることにより調製することができる。ペンダント基の結合は、種々の方法を使用して行うことができ、ポリサッカリドと、環状オレフィンもしくは末端ジエンを含有するグリシジルエーテルとの反応、または、同様に環状オレフィンまたは末端ジエンを含有するカルボン酸またはその誘導体との反応などの方法が含まれる。オゾン分解法など、当該技術分野で知られた方法を使用して、環状オレフィンまたは末端ジエンで誘導体化したポリサッカリドを酸化することにより、ペンダントジアルデヒドで誘導体化されたポリサッカリドが得られる。
【００４９】
アルデヒド置換率は、当該技術分野で知られた方法により測定することができる。例えば、アルデヒド置換率は、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）の方法にしたがい、アルデヒド官能性ポリサッカリドを塩酸ヒドロキシルアミンで滴定することにより測定することができる。好適なアルデヒド官能性ポリサッカリドは、約１０％〜約２００％、より具体的には約３０％〜約２００％、より具体的には約３５％〜約１２０％、より具体的には約４０％〜約１２０％のアルデヒド置換率を有する。
【００５０】
水分散性マルチアームアミン
好適な水分散性マルチアームアミンとしては、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明での使用に適したマルチアームアミンは、通常、約４５０〜約２００，０００ダルトン、より具体的には約２，０００〜約４０，０００ダルトンの数平均分子量を有する。
【００５１】
一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、繰り返し単位［−Ｏ−Ｒ］−（ここで、Ｒは２〜５個の炭素原子を有するヒドロカルビレン基である）を有する水分散性ポリエーテルのマルチアームポリエーテルアミンである。好適なマルチアームポリエーテルアミンとしては、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端星形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、およびＨｕｎｔｓｍａｎ ＬＬＣ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）からＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）ｔｒｉａｍｉｎｅの商品名で販売されているポリオキシアルキレントリアミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。星形ポリエチレンオキサイドアミンの例としては、各種マルチアームポリエチレングリコールアミン、および第１アミンで終端された３、４、６または８本のアームを有する星形ポリエチレングリコール（本明細書では、それぞれ３、４、６または８アームの星形ＰＥＧアミンと称する）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適なＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）トリアミンの例としては、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−４０３（ＣＡＳ Ｎｏ．３９４２３−５１−３）、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−３０００（ＣＡＳ Ｎｏ．６４８５２−２２−８）およびＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−５０００（ＣＡＳ Ｎｏ．６４８５２−２２−８）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、水分散性マルチアームポリエーテルアミンは、第１アミン基で終端された８本のアームを有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アームポリエチレングリコールである。
【００５２】
マルチアームポリエーテルアミンは、上記のように商業的に入手するか、または当該技術分野で知られた方法で調製することができる。例えば、少なくとも３本のアームが第１アミン基で終端されているマルチアームポリエチレングリコールは、Ｂｕｃｋｍａｎｎら（Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９〜１３８４、１９８１）に記載されている方法を使用して、マルチアームポリエチレングリコール（例えば、３、４、６および８アーム星形ポリエチレングリコールは、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＳｕｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ；日油（株）、東京、日本；またはＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸなどの会社から入手可能である）にアミン末端を結合させることにより調製することができる。その方法では、マルチアームポリエチレングリコールを臭化チオニルと反応させて水酸基を臭素に変換し、その後、臭素を１００℃でアンモニアと反応させてアミンに変換する。この方法は他のマルチアームポリエーテルアミンの調製にも広く適用することができる。さらに、マルチアームポリエーテルアミンは、Ｃｈｅｎａｕｌｔ（同時係属中で共願の米国特許出願公開第２００７／０２４９８７０号明細書）に記載されている方法を使用して、マルチアームポリオールから調製することができる。その方法では、マルチアームポリエーテルを塩化チオニルと反応させて水酸基を塩素基へと変換し、その後、塩素基を水性または無水アンモニアと反応させてアミンに変換する。マルチアームポリエーテルアミンを調製するために使用し得る他の方法は、Ｍｅｒｒｉｌｌらが米国特許第５，８３０，９８６号明細書で、またＣｈａｎｇらが国際公開第９７／３０１０３号パンフレットで記載している。
【００５３】
本発明での使用に適した水分散性マルチアームアミンとして、Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（登録商標）Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）の商品名で販売されているアミノ末端樹枝形ポリアミドアミンも挙げることができる。
【００５４】
一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、Ａｒｔｈｕｒ（同時係属中で共願の国際公開第２００８／０６６７８７号パンフレット）に記載されているようなマルチアーム分枝末端アミンである。マルチアーム分枝末端アミンは、ポリマーアームのそれぞれの末端に２つまたは３つの第１アミン基を有する分枝ポリマーである。官能基の数が多ければ、所与の鎖の末端における反応の統計的確率が高くなり、ポリマー網へ分枝分子がより効率的に取り込まれるようになる。分枝末端アミンの調製に使用する出発物質は、櫛形または星形ポリエーテルポリオールなど（これらに限定されるものではない）のマルチアームポリエーテルポリオールのような分枝ポリマーとすることができる。分枝末端アミンは、当該技術分野でよく知られた方法を使用して、ポリマーの末端に水酸基との反応により複数のアミン基を結合させることによって調製することができる。例えば、ポリマーアームの各末端に２つのアミン官能基を有する分枝末端アミンは、上で列挙したような出発物質を塩化チオニルとトルエンなどの適当な溶媒中で反応させて塩化物誘導体を得、次いで、これをトリス（２−アミノエチル）アミンと反応させて、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有する分枝末端反応物を得ることにより調製することができる。
【００５５】
一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アーム分枝末端ポリエチレングリコールアミンである。
【００５６】
他の一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アーム分枝末端ポリエチレングリコールアミンと、１つの第１アミン基で終端された８本のアームを有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アームポリエチレングリコールアミンとの混合物である。
【００５７】
水分散性マルチアームアミンが、一般に、アームの長さに分布を有し、ある場合には、異なる数のアームを持つ種類に分布を有する、やや不均質な混合物であることは、認識されなければならない。マルチアームアミンが、異なる数のアームを持つ種類に分布を有する場合、分布の平均アーム数に基づいて記載される。例えば、一実施形態では、マルチアームアミンは、マルチアーム星形ＰＥＧアミンの混合物であって、あるものは８本未満のアームを有し、あるものは８本を超えるアームを有するが、混合物におけるマルチアーム星形ＰＥＧアミンは平均８本のアームを有する混合物を含む、８アームの星形ＰＥＧアミンである。したがって、本明細書中でマルチアームアミンに言及する際に使用される用語「８アーム」、「６アーム」、「４アーム」、および「３アーム」は、アーム長さに分布を有し、ある場合には異なる数のアームを持つ種類に分布を有する（この場合は、挙げられたアームの数は、混合物におけるアームの平均数である）、不均質混合物をいうものと理解すべきである。
【００５８】
ヒドロゲル組織接着剤の使用方法
本明細書中に開示するヒドロゲル組織接着剤は、種々の形態で使用することができる。一実施形態では、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンは、水溶液もしくは分散液の成分として使用される。アルデヒド官能性ポリサッカリドを含む水溶液もしくは分散液（本明細書では「第１の水溶液もしくは分散液」と称する）の調製には、少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドを水に加え、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約４０％、より具体的には約５％〜約３０％、より具体的には約１０％〜約３０％の濃度とする。さらに、重量平均分子量が異なるか、アルデヒド置換率が異なるか、または重量平均分子量およびアルデヒド置換率が共に異なる、少なくとも２種のアルデヒド官能性ポリサッカリドの混合物を使用することができる。アルデヒド官能性ポリサッカリドの混合物を使用する場合、アルデヒド官能性ポリサッカリドの合計の濃度は、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約４０％、より具体的には約５％〜約３０％、より具体的には約１０％〜約３０％である。
【００５９】
同様に、水分散性マルチアームアミンを含む水溶液もしくは分散液（本明細書では「第２の水溶液もしくは分散液」と称する）の調製には、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを水に加え、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約７０％、より具体的には約２０％〜約５０％濃度とする。最適な使用濃度は、意図する用途、および第１の水溶液もしくは分散液で使用するアルデヒド官能性ポリサッカリドの濃度に依存する。さらに、数平均分子量が異なるか、アーム数が異なるか、または数平均分子量およびアーム数が共に異なる、異種の水分散性マルチアームアミンの混合物を使用することができる。水分散性マルチアームアミンの混合物を使用する場合、マルチアームアミンの合計の濃度は、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約７０％、より具体的には約２０％〜約５０％である。
【００６０】
生体組織での使用では、第１の水溶液もしくは分散液、および第２の水溶液もしくは分散液は、感染を防止するために殺菌することが好ましい。反応して有効なヒドロゲルを生成する成分の能力に悪影響を及ぼさない方法であれば、当該技術分野で知られている任意の好適な殺菌法を使用することができ、特に限定はされないが、例えば、電子ビーム照射、ガンマ線照射、エチレンオキサイドによる殺菌、または０．２μｍ孔の膜によるろ過などの方法が挙げられる。
【００６１】
第１の水溶液もしくは分散液、および第２の水溶液もしくは分散液は、意図する用途に応じて各種添加剤をさらに含んでいてもよい。添加剤はヒドロゲルの生成に有効なゲル化を阻害しないことが好ましい。添加剤の使用量は特定の用途に依存するものの、当業者であれば通常の実験により容易に決定することができる。例えば、第１の水溶液もしくは分散液および／または第２水溶液もしくは分散液は、ｐＨ調整剤、抗菌剤、着色剤、界面活性剤、調合薬および治療薬から選択される少なくとも１つの添加剤を含むことができる。
【００６２】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、溶液または分散液のｐＨを調整するために、少なくとも１種のｐＨ調整剤を含んでいてもよい。好適なｐＨ調整剤は当該技術分野ではよく知られている。ｐＨ調整剤は酸性化合物であっても塩基性化合物であってもよい。酸性ｐＨ調整剤の例としては、カルボン酸、無機酸およびスルホン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩基性ｐＨ調整剤としては、水酸化物、アルコキシド、第１および第２アミンを除く窒素含有化合物、並びに塩基性炭酸塩およびリン酸塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、少なくとも１種の抗微生物剤を含んでいてもよい。好適な抗微生物性保存剤は当該技術分野ではよく知られている。好適な抗微生物剤の例として、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンおよびブチルパラベンなどのアルキルパラベン；トリクロサン；クロルヘキシジン；クレゾール；クロロクレゾール、ヒドロキノン；安息香酸ナトリウム；および安息香酸カリウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、溶液または分散液の視認性を上げるために、少なくとも１種の着色剤を含んでいてもよい。好適な着色剤としては、染料、顔料および天然着色剤が挙げられる。好適な着色剤の例としては、ＦＤ＆ＣバイオレットＮｏ．２、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．１、Ｄ＆ＣグリーンＮｏ．６、Ｄ＆ＣグリーンＮｏ．５、Ｄ＆ＣバイオレットＮｏ．２などのＦＤ＆ＣおよびＤ＆Ｃ着色剤；並びにビートルートレッド、カンタキサンチン、クロロフィル、エオシン、サフランおよびカルミンなどの天然着色剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、少なくとも１種の界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤は、本明細書では、水の表面張力を低下させる化合物をいう。界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤であっても、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンなどの中性界面活性剤であってもよい。
【００６６】
さらに、第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、少なくとも１種の薬剤または治療薬を含んでいてもよい。好適な薬剤または治療薬は当該技術分野ではよく知られている（例えば、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）（ＵＳＰ）、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ 第１８版、Ｍａｒｋ Ｈ．Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｅｒｋｏｗ（編）、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、２００６；または動物の場合、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第９版、Ｋａｈｎ、Ｃ．Ａ．（編）、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、２００５を参照）。例としては、抗炎症薬、例えばプレドニゾン、デキサメタゾン、ブデソニドなどのグルココルチコイド；インドメタシン、サリチル酸アセテート、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカムおよびナプロキセンなどの非ステロイド性抗炎症薬；組織プラスミノーゲン活性化剤およびストレプトキナーゼなどの線維素溶解薬；ヘパリン、ヒルジン、アンクロッド、ジクマロール、シンクマール、イロプロスト、Ｌ−アルギニン、ジピラミドールおよび他の血小板機能阻害剤などの抗凝血剤；抗体；核酸；ペプチド；ホルモン；成長因子；サイトカイン；ケモカイン；凝固因子；内因性凝固阻止物質；抗菌剤；抗ウィルス剤；抗真菌薬；抗ガン剤；細胞癒着阻止物質；治癒促進剤；ワクチン；トロンビン、フィブリノーゲン、ホモシステインおよびエストラムスチンなどの血液凝固剤；硫酸バリウムおよび金粒子などの放射線不透過化合物、並びに放射標識が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
さらに、マルチアームアミンを含有する第２の水溶液もしくは分散液は、疎水性または修飾された架橋密度などの他の有益な特性を付与するために、１つ以上の第１アミン基を有する少なくとも１種の他の多官能性アミンを含んでいてもよい。多官能性アミンは、水溶液もしくは分散液中で酸化ポリサッカリドと混合するとゲル化を引き起こすことができる。多官能性アミンは、上記したような第２の水分散性マルチアームアミンであっても、他のタイプの多官能性アミン（ジアミノアルカン、ポリアミノアルカンおよびスペルミンなどの直鎖および分枝ジアミン；ポリエチレンイミンなどの分枝ポリアミン；Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、５−アミノ−１，３，３−トリメチルシクロヘキサンメチルアミン、１，３−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、１，４−ジアミノシクロヘキサンおよびｐ−キシレンジアミンなどの環状ジアミン；３−アミノプロピルトリメトキシシランおよび３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノアルキルトリアルコキシシラン；３−アミノプロピルジエトキシメチルシランなどのアミノアルキルジアルコキシアルキルシラン、アジピン酸ジヒドラジドなどのジヒドラジド；直鎖ポリエチレンイミン、α，ω−アミノ末端ポリエーテル、α，ω−ビス（３−アミノプロピル）ポリブタンンジオール、β，ω−１−アミノ末端ポリエーテル（直鎖 Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標））などの直鎖ポリマージアミン；キトサン、ポリアリルアミンおよびポリリシンなどの櫛形ポリアミン、並びにビス（カルボキシヒドラジド）ポリエーテルおよびポリ（カルボキシヒドラジド）星形ポリエーテルなどのジ−およびポリヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されるものではない）であってもよい。これらの化合物の多くは、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＨｕｎｔｓｍａｎ ＬＬＣなどの会社から商業的に入手することができる。多官能性アミンを含む場合、通常、水溶液もしくは分散液中のマルチアームアミンの重量に対し約５重量％〜約１０００重量％の濃度で使用される。
【００６８】
第１の水溶液もしくは分散液と第２の水溶液もしくは分散液を混合すると、それらは反応して、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを含み、そして、少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンが、アルデヒド官能性ポリサッカリドのペンダントアルデヒド基と水分散性マルチアームアミンの第１アミン基との間に形成された共有結合を介して架橋している、架橋ヒドロゲル組成物を生成する。共有結合は、イミン結合であっても、アミナール結合であっても、ヘミアミナール結合であってもよい。ヒドロゲルの分解時間は、後述する実施例で示すように、第１の水溶液もしくは分散液中のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、第２の水溶液もしくは分散液中の水分散性マルチアームアミンの、重量パーセントを単位とした使用量の変更、および／あるいは、水分散性マルチアームアミンのアミン、またはアルデヒド官能性ポリサッカリドアルデヒドのアルデヒドの官能基数の変更により、意図する用途の必要に応じて調整することができる。
【００６９】
第１の水溶液もしくは分散液と第２の水溶液もしくは分散液は、生体組織解剖部位にコーティングを施すのに使用してもよい。これらの２種類の水溶液もしくは分散液は、その部位に、いかなる方法で塗布してもよい。両溶液もしくは分散液がある部位上で混合されると、これらは架橋してヒドロゲルを生成し、その部位にコーティングが施される。
【００７０】
一実施形態では、２種の水溶液もしくは分散液は、スプレー、綿の棒もしくはブラシによるブラッシング、またはピペットもしくはシリンジを使用した押出しなどの任意の好適な手段で連続的にその部位に塗布されるが、これらの手段に限定されるものではない。溶液または分散液はいかなる順序で塗布してもよい。その後、溶液または分散液は、その部位上で、綿棒、スパチュラ、またはピペットもしくはシリンジの先端などの任意の好適な用具を使用して混合される。
【００７１】
他の一実施形態では、２種類の水溶液もしくは分散液は、その部位に塗布する前に手で混合される。その後、得られた混合物を、それが完全に硬化する前に、上記のような好適な塗布用具を使用してその部位に塗布する。
【００７２】
他の一実施形態では、第１の水溶液もしくは分散液と第２水溶液もしくは分散液を、その部位に同時に塗布し、そこで混合してヒドロゲルを生成する。例えば、２種類の水溶液もしくは分散液は、ダブルバレルシリンジの別個のバレルにそれぞれ充填することができる。この方法では、２種類の水溶液もしくは分散液は、シリンジにより同時にその部位に塗布される。好適なダブルバレルシリンジ塗布装置は当該技術分野で知られている。例えば、Ｒｅｄｌは、米国特許第６，６２０，１２５号明細書（特に、第４欄第１０行〜第６欄４７行で説明されている図１、５および６）に、数種のその発明で使用するのに適した塗布装置を記載している。２種類の水溶液もしくは分散液は、また、Ｂｉｓｔｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から入手できるようなダブルルーメンカテーテルを使用してその部位に塗布することができる。さらに、当該技術分野では、２種類の液体成分を内視鏡的に体内へ同時に導入するための注入装置が知られており、本明細書中に開示する２種類の水溶液もしくは分散液の配送に適合させることも可能である（例えば、Ｌｉｎｄｅｒら、米国特許第５，３２２，５１０号明細書を参照）。
【００７３】
他の一実施形態では、第１の水溶液もしくは分散液と第２の水溶液もしくは分散液を、ＣｏｎＰｒｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）またはＭｉｘｐａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ（Ｒｏｔｋｒｕｅｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手できるような静的ミキサーを備えるダブルバレルシリンジを使用して予備混合し、その部位へ配送することができる。あるいは、Ｃｒｕｉｓｅらが米国特許第６，４５８，１４７号明細書で記載しているようなスプレーヘッドを混合チップに装着してもよい。さらに、２種類の水溶液もしくは分散液の混合物をダブルバレルシリンジからカテーテルまたは内視鏡を使用してその部位へ塗布することができる。２種類の液体成分組織接着剤を混合し、得られた混合物を内視鏡的に配送する装置は当該技術分野で知られており、本明細書中に開示する２種類の水溶液もしくは分散液の混合および配送に適合させることができる（例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎ、米国特許第６，７２３，０６７号明細書、およびＲｅｄｌら、米国特許第４，６３１，０５５号明細書を参照）。
【００７４】
他の一実施形態では、２種類の水溶液もしくは分散液は、Ｆｕｋｕｎａｇａら（米国特許第５，５８２，５９６号明細書）、Ｄｅｌｍｏｔｔｅら（米国特許第５，９８９，２１５号明細書）またはＳａｗｈｎｅｙ（米国特許第６，１７９，８６２号明細書）が記載しているようなスプレー装置を使用してその部位に塗布することができる。
【００７５】
他の一実施形態では、２種類の水溶液もしくは分散液は、Ｓａｗｈｎｅｙ（米国特許第７，３４７，８５０号明細書）が記載しているような低侵襲手術用塗布装置を使用してその部位に塗布することができる。
【００７６】
他の一実施形態では、本発明のヒドロゲル組織接着剤は、少なくとも２つの解剖学的部位を接着するために使用される。この実施形態では、第１の水溶液もしくは分散液を少なくとも１つの解剖学的部位に塗布し、第２の水溶液もしくは分散液を同じ部位か、または他方の部位のいずれかの少なくとも１つに、上記の方法を使用して塗布する。２つ以上の部位を接触させ、手、または外科用クランプなどの他の手段により、混合物が硬化するのに十分な時間保持する。あるいは、２種類の水溶液もしくは分散液の混合物を、接着すべき解剖学的部位の少なくとも１つに、上記の方法を使用して塗布する。２つ以上の部位を接触させ、手、または外科用クランプなどの他の手段により、混合物が硬化するのに十分な時間保持する。
【００７７】
他の一実施形態では、アルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンは、細かく粉砕した粉末の形態で使用することができる。粉末は任意の好適な方法を使用して調製することができる。例えば、上記の各水溶液もしくは分散液を、熱、真空、熱と真空の組み合わせにより、または凍結乾燥により乾燥させて、粉末を生成することができる。粉末は、グラインダーによる粉砕、ミルによる粉砕、または乳鉢と乳棒による粉砕など（これらに限定されるものではない）、当該技術分野で知られた方法を用いてより微細な粒子に粉砕してもよい。微細に粉砕された粉末は、上記の方法により殺菌することができる。微細に粉砕された粉末は種々の方法で生体組織の解剖学的部位に塗布することができる。例えば、粉末は、散布またはスプレーすることにより、その部位に任意の順序で個別に塗布することができる。さらに、粉末は予備混合した後、得られた混合物をその部位に散布またはスプレーすることにより塗布することができる。粉末は、水または好適な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）などの水溶液を添加することにより、あるいはその部位に存在する生理液により、その部位で水和させることができる。微細に粉砕された粉末はまた、水溶液もしくは分散液について上で記載したように、２つの解剖学的部位を接着するために使用することができる。あるいは、粉末は、使用の前に水または好適な水溶液で水和して、上記の第１および第２の水溶液もしくは分散液を生成することができる。
【００７８】
他の一実施形態では、本明細書中に開示するヒドロゲル組織接着剤は、乾燥ヒドロゲルの形態で使用することができる。この実施形態では、乾燥ヒドロゲルは、ある溶媒中で、少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを混合してヒドロゲルを生成させ、このヒドロゲルを処理して少なくとも１部の溶媒を除去して乾燥ヒドロゲルを生成することにより調製される。好適な溶媒としては、水、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。２種の異なる溶媒を使用する場合、それらの溶媒は互いに混和性を有する。一実施形態では、溶媒は水である。アルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンは種々の方法で混合することができる。例えば、アルデヒド官能性ポリサッカリドを含む第１の水溶液もしくは分散液と水分散性マルチアームアミンを含む第２の水溶液もしくは分散液は、上記のように調製し、混合して、ヒドロゲルを生成させることができる。ヒドロゲルを調製するために使用される溶液または分散液は、意図する用途に応じて各種添加剤をさらに含むことができる。上記の任意の添加剤を使用することができる。その後、ヒドロゲルを処理して、それに含まれる少なくとも１部の溶媒を除去し、乾燥ヒドロゲルを生成させる。実質的に全ての溶媒がヒドロゲルから除去されることが好ましい。溶媒は、当該技術分野で知られた方法、例えば、熱、真空、熱と真空の組み合わせの使用、あるいはヒドロゲル上に乾燥空気または窒素などの乾燥不活性ガスの流れを流すなどの方法により、ヒドロゲルから除去することができる。乾燥ヒドロゲルは、上述した方法により殺菌することができる。乾燥ヒドロゲルは、後述するように、多くの方法で解剖学的部位に塗布することができる。乾燥ヒドロゲルは、その部位で、水または緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）などの好適な水溶液を添加することにより、あるいはその部位に存在する生理液により、水和させることができる。
【００７９】
一実施形態では、乾燥ヒドロゲルは、フィルムの形態で使用することができる。乾燥ヒドロゲルフィルムは、上記のような溶液または分散液の混合物を適当な基材上にキャスティングし、得られたヒドロゲルを処理して乾燥ヒドロゲルフィルムを形成することにより作製することができる。乾燥ヒドロゲルフィルムは、解剖学的部位に直接貼付することができる。さらに、乾燥ヒドロゲルフィルムは２つの解剖学的部位を接着するために使用することができる。
【００８０】
他の一実施形態では、乾燥ヒドロゲルは、微細に粉砕した粒子の形態で使用することができる。乾燥ヒドロゲル粒子は、乾燥ヒドロゲルを、グラインダーによる粉砕、ミルによる粉砕、または乳鉢と乳棒による粉砕など（これらに限定されるものではない）、当該技術分野で知られた方法を用いて粉砕することにより生成することができる。乾燥ヒドロゲル粒子は、散布またはスプレーなどの種々の方法で解剖学的部位に塗布することができ、また、２つの解剖学的部位を接着するために使用することができる。
【００８１】
キット
一実施形態では、本発明は、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基により終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを含むキットを提供する。
【００８２】
他の一実施形態では、キットは、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドを含む第１の水溶液もしくは分散液と、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基により終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを含む第２の水溶液もしくは分散液とを含む。水溶液もしくは分散液のそれぞれは、バイアルまたはシリンジバレルなどの任意の好適な容器に充填することができる。
【００８３】
他の一実施形態では、キットは、上述したように、微細に粉砕された粉末の形態で、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基により終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを含む。粉末は、個別の容器に充填されてもよく、あるいは予備混合して単一の容器に充填されてもよい。キットはまた、粉末を水和するための水溶液を含んでいてもよい。
【００８４】
他の一実施形態では、キットは上述したような乾燥ヒドロゲルを含む。乾燥ヒドロゲルは、フィルムの形態であっても、微細に粉砕された粒子の形態であっても、他の乾燥された形態であってもよい。キットは、乾燥ヒドロゲルを水和するための水溶液をさらに含んでいてもよい。乾燥ヒドロゲル粒子は任意の好適な容器に充填することができる。
【００８５】
医療用途
本明細書中に開示するヒドロゲルは、外傷または手術に起因する、望ましくない組織−組織間癒着の防止（これには限定されない）といった、より急速な分解時間が要求される医療用途の組織接着剤または封止剤として有用であり得る。これらの用途では、アルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミン、または乾燥ヒドロゲルは、上記の方法により、所望の解剖学的部位に塗布することができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例により、本発明をさらに明示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、単に説明のために示されるべきである。上記説明とこれらの実施例から、当業者であれば本発明の基本的特徴を確かめることができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明に各種の変更と修正を加え、各種の使用および条件に本発明を適合させることができる。
【００８７】
試薬の調製
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１５−９０）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１５ｋＤａの重量平均分子量と約９０％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをアリルグリシジルエーテルと反応させてオレフィン中間体を生成し、その後、これをオゾンと反応させてペンダントアルデヒド基を有するデキストランを生成した。
【００８８】
第１工程では、３０ｇのデキストラン（平均分子量９〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）および３０ｍＬの水を３つ口フラスコに加えた。溶液を１０℃に冷却し、その後、２０重量％ＮａＯＨ溶液３９ｍＬを加えた。得られた溶液を２５分間撹拌し、淡い黄色の溶液を得、その後、８４．５８ｇ（４当量）のアリルグリシジルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。得られた混合物を６５℃まで５．５時間加熱し、その後、室温まで冷却してから、１ＮのＨＣｌでｐＨを７．０に調整した。２００ｍＬの水を加えて混合物を希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、最初の溶液の体積の５倍がろ液として捕集されるまで、純水で連続的にろ液を置換しながら、１ｋＤａのカットオフフィルターを通してろ過することにより精製した。少量のサンプルを採取し、分析用として凍結乾燥させた。残りのろ液を、続くオゾン分解工程でそのまま使用した。置換率を、プロトンＮＭＲにより、４．８〜５．０におけるオレフィンピークとアノマーピークの積分比から測定したところ、１．３３であった。
【００８９】
第２工程では、工程１で得られた４６０ｍＬのろ液を、マグネチック撹拌棒およびスパージャーの注入口を備えた２Ｌの三つ口フラスコに加えた。氷浴中で０〜５℃に溶液を冷却し、オゾン発生機（ＣｌｅａｒＷａｔｅｒ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ．、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ；型番ＣＤ１０）から７％のオゾンを発生する１００％パワーでオゾンの噴霧を開始した。発泡が生じ、これを１−ヘプタノールを数滴加えて制御した。６．２５および７．７５時間にサンプルを採取し、１３−Ｃ ＮＭＲを使用して分析した。１１８および１３４ｐｐｍで共鳴が消失し、７．７５時間後にはオレフィンが消費されていたことを示した。その後、撹拌しながら亜硫酸ナトリウム溶液（１３８ｍＬの水に２３．３ｇ）を滴下した。僅かな発熱が観察され、反応混合物を窒素中で終夜撹拌した。混合物を１Ｌガラス瓶に移し、１ｋＤａのカットオフフィルターを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムによりろ過した。水を連続的に加えて捕集したろ液を置換し、残余分はガラス瓶に戻した。最初の反応物体積の５倍超がろ液として捕集されるまでこの工程を継続した。その後、精製した溶液を冷凍し凍結乾燥して、綿毛のような白色固体５３．９ｇを得た。得られた固体生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：４００、１９９１）の方法を使用して測定したところ、８９％であった。アルデヒド官能性デキストランの重量平均分子量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定したところ、約１５ｋＤａであった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１５−９０と称する。
【００９０】
同様の方法で、このアルデヒド官能性デキストランの第２の調製を行った。得られた生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌの方法を使用して測定したところ、９２％であり、重量平均分子量は、ＳＥＣにより、１６ｋＤａであることがわかった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１６−９２と称する。
【００９１】
ペンダントアルデヒド基を有するイヌリン（ＡＦＩ−１２−４９）の調製：
上記２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１２ｋＤａの重量平均分子量と約４９％のアルデヒド置換率を有するイヌリンを調製した。
【００９２】
第１工程では、２０ｇのイヌリン（平均分子量約４ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）を２００ｍＬの水に懸濁させ、７０℃まで１時間加熱して溶解し、その後、６５℃に冷却した。この溶液に２３ｍＬの水酸化ナトリウム溶液（水に２０重量％）を加え、続いてシリンジポンプによりアリルグリシジルエーテル（５０．７ｇ）を３ｍＬ／ｍｉｎの速度で徐々に加えた。添加後、混合物を６５℃まで６時間加熱した。その後、反応混合物を室温にまで冷却し、５０％ＨＣｌによりｐＨ７に中和した。１０００ＭＷＣＯ膜による限外ろ過により反応混合物を精製した（廃棄物の１０倍の体積を捕集）。
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：ｄ ５．９５ｐｐｍ（ｍ，積分値１．０，ＯＣＨ2Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ2）、５．３１（ｄｄ，積分値２．１，ＯＣＨ２（ＣＨ）＝ＣＨ2）、４．３７（ｂｒ．ｓ，積分値０．４０）、４．２５（ｂｒ．ｓ，積分値０．７６）、４．０〜３．５５（ｂｒ．ｍ，積分値１２．９）
【００９３】
第２工程では、氷／水浴を使用してろ液を約５℃に冷却した。撹拌されている溶液中にオゾンを６時間噴霧した。１−ヘプタノールを加えて（数滴）発泡を制御した。反応の終点で亜硫酸ナトリウム溶液（１００ｍＬの水に１６ｇ）を冷却した溶液（氷／水浴中で冷却）に加えた。溶液を室温で終夜撹拌した。生成物を限外ろ過により精製した（ＭＷＣＯ１０００、廃棄物の１２倍の体積を捕集）。ろ液を凍結乾燥し白色固体を得た。
【００９４】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝１．２×１０4、Ｍn＝７．３×１０3、Ｍz＝１．５×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．６。
【００９５】
アルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、イヌリンアルデヒドのヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、約４９％であった。本明細書では、このアルデヒド官能性イヌリンをＡＦＩ−１２−４９と称する。
【００９６】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−７−８６）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約５〜１１ｋＤａの重量平均分子量と８６％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約５〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをグリシドールと反応させて、アルキル化デキストランを生成した。第２工程では、アルキル化デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化して、第１工程で付加した末端ジオール基を酸化してペンダントアルデヒド基を有するデキストランを得た。
【００９７】
第１工程では、２０ｇのデキストラン（平均分子量５〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）を２０ｍＬの水に懸濁させ、５５℃に加熱した。この溶液に２５ｍＬの水酸化ナトリウム溶液（水に２０重量％）を加え、続いてシリンジポンプによりグリシドール（３６ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を５５℃で、１．０ｍＬ／ｍｉｎの速度で徐々に加えた。その後、混合物を５５℃まで６時間加熱し、続いて混合物を室温にまで冷却した。生成物を２０ｍＬのエーテルで２回洗浄し、過剰の試薬を除去した。得られた黄色の均質混合物を氷上で５０％のＨＣｌにより中和した（最終ｐＨは７．３であった）。サンプルを約５倍の体積の冷イソプロパノール中（約０℃）で沈殿させた。イソプロパノール層をデカンテーションにより除去し、固体生成物を冷イソプロパノールで洗浄し、溶解とそれに続く沈殿プロセスをさらに２回繰り返した。固体生成物を真空中で４８時間乾燥した。
【００９８】
第２工程では、第１工程で得られた１５ｇの固体生成物を丸底フラスコ中の１５０ｍＬの水に溶解させ、その後、得られた溶液を４℃に冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム溶液（８５ｍＬの水に８．２５ｇ）を３０分にわたって丸底フラスコに滴下した。反応混合物を４℃で２時間撹拌し、その後、反応混合物に１０．４ｇ（９．３ｍＬ）のエチレングリコールを加え、続いて１０分間撹拌した。生成物を、カットオフ分子量１０００の膜を備えたＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して精製し、凍結乾燥させて１０ｇの白色粉末を得た。生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、８６％であった。
【００９９】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝７．４×１０3、Ｍn＝４．８×１０3、Ｍz＝１．１×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．５。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−７−８６と称する。
【０１００】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−９−１２０）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約９ｋＤａの重量平均分子量と１２０％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約５〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをグリシドールと反応させてアルキル化デキストランを生成した。第２工程では、アルキル化デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化し、第１工程で付加した末端ジオール基を酸化してペンダントアルデヒド基を有するデキストランを得た。
【０１０１】
第１工程では、３バッチのデキストランをグリシドールと反応させてアルキル化デキストランを生成した。バッチのうち２つでは、ＡＦＤ−７−８６を調製した上記第１工程と同じ方法で、２０ｇのデキストラン（平均分子量５〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）をグリシドール（３６ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させた。第３のバッチでは、デキストランに対するグリシドールのモル比を変えた。１０ｍＬの水と１２．５ｍＬの水酸化ナトリウム溶液（２０重量％）とを混合して生成した溶液にデキストラン（１０ｇ）を溶解した。シリンジポンプを使用して、デキストラン溶液にグリシドール（４４ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．７ｍＬ／ｍｉｎの速度で加えた。混合物を５５℃に加熱し、２０ｍＬの水を加えた。反応混合物を５５℃まで６時間加熱した。ＡＦＤ−７−８６について上で記載したようにして、生成物を単離した。３バッチを混合し、第２工程用材料のマスターバッチとした。
【０１０２】
第２工程では、上記マスターバッチからの２５ｇの固体生成物を、丸底フラスコ中の２５０ｍＬの水に溶解し、その後、得られた溶液を４℃に冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１２５ｍＬの水に２０．８ｇ）を１時間にわたって丸底フラスコに滴下した。反応混合物を４℃で２時間撹拌し、その後、反応混合物に６６ｇのエチレングリコールを加え、続いて３０分間撹拌した。その後、反応混合物をろ過した。ろ液を、カットオフ分子量１０００の膜を備えたＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））を使用して精製し、凍結乾燥させて１７ｇの白色粉末を得た。生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、１２０％であった。
【０１０３】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝８．９×１０3、Ｍn＝６．８×１０3、Ｍz＝１．２×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．３。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−９−１２０と称する。
【０１０４】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１３−６４）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１３ｋＤａの重量平均分子量と６４％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約５〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをグリシドールと反応させてアルキル化デキストランを生成した。第２工程では、アルキル化デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化し、第１工程で付加した末端ジオール基を酸化してペンダントアルデヒド基を有するデキストランを得た。
【０１０５】
第１工程はＡＦＤ−９−１２０について上で記載したように行った。第２工程では、ＡＦＤ−９−１２０について上で記載したアルキル化デキストランのマスターバッチからの固体生成物２５ｇを、丸底フラスコ中の２５０ｍＬの水に溶解し、その後、得られた溶液を４℃に冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム溶液（６０ｍＬの水に１０．４ｇ）を１時間にわたって丸底フラスコに滴下した。反応混合物を４℃で２時間撹拌し、その後、反応混合物に６ｇのエチレングリコールを加え、続いて３０分間撹拌した。その後、反応混合物をろ過した。ろ液を、カットオフ分子量１０００の膜を備えたＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して精製し、凍結乾燥させて１７ｇの白色粉末を得た。生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、６４％であった。
【０１０６】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝１．３×１０4、Ｍn＝９．８×１０3、Ｍz＝１．８×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．３。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１３−６４と称する。
【０１０７】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１３−４６）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１３ｋＤａの重量平均分子量と４６％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをアリルグリシジルエーテルと反応させてオレフィン中間体を生成し、その後、これをオゾンと反応させてペンダントアルデヒド基を有するデキストランを生成した。
【０１０８】
第１工程では、３０ｇのデキストラン（平均分子量９〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）および３０ｍＬの水を３つ口フラスコに加えた。溶液を１０℃に冷却し、その後、２０重量％ＮａＯＨ溶液３９ｍＬを加えた。得られた溶液を２５分間撹拌し、淡い黄色の溶液を得、その後、４２．２７ｇ（２当量）のアリルグリシジルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。得られた混合物を６５℃まで５．５時間加熱し、その後、室温にまで冷却してから、１ＮのＨＣｌでｐＨを７．０に調整した。２００ｍＬの水を加えて混合物を希釈し、１ｋＤａのカットオフフィルターを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により、最初の溶液の体積の５倍がろ液として捕集されるまで、純水で連続的にろ液を置換しながら精製した。少量のろ液サンプルを採取し、分析用として凍結乾燥させた。残りのろ液を、続くオゾン分解工程でそのまま使用した。置換率を、ＮＭＲによりアノマー共鳴に対するオレフィンのピークを積分したところ、０．８４であることがわかった。
【０１０９】
第２工程では、工程１で得られた４７５ｍＬのろ液を、マグネチック撹拌棒およびスパージャー注入口を備えた２Ｌの３つ口フラスコに加えた。氷浴中で０〜５℃に溶液を冷却し、その後、オゾン発生機（ＣｌｅａｒＷａｔｅｒ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ．、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ；型番ＣＤ１０）から７％のオゾンを発生する１００％パワーでオゾンの噴霧を開始した。発泡が生じ、これを１−ヘプタノールを数滴加えて制御した。２および４時間にサンプルを採取し、１３−Ｃ ＮＭＲを使用して分析した。１１８および１３４ｐｐｍで共鳴が消失し、４時間後にはオレフィンが消費されていたことを示した。その後、撹拌しながら亜硫酸ナトリウム溶液（１１７ｍＬの水に１９．６ｇ）を滴下した。僅かな発熱が観察され、反応混合物を窒素中で終夜撹拌した。混合物を１Ｌのガラス瓶に移し、１ｋＤａのカットオフフィルターを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムでろ過した。水を連続的に加えて捕集したろ液を置換し、残余分はガラス瓶に戻した。最初の反応物体積の５倍超がろ液として捕集されるまでこの工程を継続した。その後、精製した溶液を冷凍し凍結乾燥して、綿毛のような白色固体２８．６ｇを得た。得られた固体生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，８：４００）の方法を使用して測定したところ、４６％であった。アルデヒド官能性デキストランの重量平均分子量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定したところ、約１３ｋＤａであった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１３−４６と称する。
【０１１０】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１９−６４）の調製：
上記２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１９ｋＤａの重量平均分子量と６０％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。
【０１１１】
第１工程では、３０ｇのデキストラン（平均分子量９〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）および３０ｍＬの水を３つ口フラスコに加えた。溶液を１０℃に冷却し、その後、２０重量％ＮａＯＨ溶液３９ｍＬを加えた。得られた溶液を２５分間撹拌し、淡い黄色の溶液を得、その後、６３．４１ｇ（３当量）のアリルグリシジルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。得られた混合物を６５℃まで５．５時間加熱し、その後室温にまで冷却してから１ＮのＨＣｌでｐＨを７．０に調整した。２００ｍＬの水を加えて混合物を希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムを使用して、最初の溶液の体積の５倍がろ液として捕集されるまで純水で連続的にろ液を置換しながら、１ｋＤａのカットオフフィルターを通してろ過することにより精製した。少量のサンプルを採取し、分析用として凍結乾燥させた。残りのろ液を、続くオゾン分解工程でそのまま使用した。置換率を、ＮＭＲにより、４．８〜５．０におけるオレフィンピークとアノマーピークの積分比から測定したところ、０．９９であった。
【０１１２】
第２工程では、第１工程で得られた４７５ｍＬのろ液を、マグネチック撹拌棒およびスパージャー注入口を備えた２Ｌの３つ口フラスコに加えた。氷浴中で０〜５℃に溶液を冷却し、その後、オゾン発生機（ＣｌｅａｒＷａｔｅｒ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ．、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ；型番ＣＤ１０）から７％のオゾンを発生する１００％パワーでオゾンの噴霧を開始した。発泡が生じ、これを１−ヘプタノールを数滴加えて制御した。４および５．７５時間にサンプルを採取し、１３−Ｃ ＮＭＲを使用して分析した。１１８および１３４ｐｐｍで共鳴が消失し、５．７５時間後にはオレフィンが消費されていたことを示した。その後、撹拌しながら亜硫酸ナトリウム溶液（１３９ｍＬの水に２３．３ｇ）を滴下した。僅かな発熱が観察され、反応混合物を窒素中で終夜撹拌した。混合物を１Ｌのガラス瓶に移し、１ｋＤａのカットオフフィルターを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムによりろ過した。水を連続的に加えて捕集したろ液を置換し、残余分はガラス瓶に戻した。最初の反応物体積の５倍超がろ液に捕集されるまでこの工程を継続した。その後、精製した溶液を冷凍し凍結乾燥して、綿毛のような白色固体３９．１ｇを得た。得られた固体生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，８：４００）の方法を使用して測定したところ、６０％であった。アルデヒド官能性デキストランの重量平均分子量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定したところ、約１９ｋＤａであった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１９−６４と称する。
【０１１３】
ペンダントジアルデヒド基を有するデキストラン（ＤＡＦＤ−１０−１６）の調製：
３段階法により、ペンダントジアルデヒド基がデキストラン主鎖にエーテル結合で結合しているジアルデヒド官能性デキストランを調製した。
【０１１４】
工程１：
マグネチック撹拌棒および窒素導入口を備えた３００ｍＬの２口フラスコに、４０重量％の水酸化ナトリウム溶液７３．４ｍＬと臭化テトラブチルアンモニウム０．９４ｇ（２．９１ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を５〜１０℃に冷却し、５．０ｇ（５９．４４ｍｍｏｌ）の３−シクロペンテン−１−オールで処理し、続いて、２０分にわたって２２．０ｇ（２３７．７６ｍｍｏｌ）のエピクロロヒドリンを滴下した。反応混合物を室温で終夜撹拌した。その後、反応混合物を約５０ｍＬの氷／水に注ぎ、撹拌して溶液を得、これを５０ｍＬのジエチルエーテルで３回抽出した。結合した有機層をリトマスで中性になるまで塩水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して茶色の液体を得た。粗生成物を蒸留により精製した。生成物を１１８℃、２５ｍｍＨｇ（３．３ｋＰａ）で捕集した。
ＣＤＣｌ3中1Ｈ ＮＭＲのδｐｐｍ（２．４２，ｍ，２Ｈ；２．５，ｍ，１Ｈ；２．６，ｍ，２Ｈ、２．７８、ｍ、１Ｈ；３．１５、ｍ、１Ｈ；３．４、ｍ、１Ｈ；３．６５〜３．６８，ｍ，１Ｈ；４．２６，ｍ，１Ｈ；５．６８ｓ，２Ｈ）
【０１１５】
工程２：
０．５８ｍＬの水、続いて約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストラン０．５７７８ｇ（３．５６７ｍｍｏｌ）を、マグネチック撹拌棒および還流冷却器を備えた、１０ｍＬの窒素導入口付２口フラスコに入れた。溶液を撹拌して懸濁液とした。２０重量％ＮａＯＨ溶液０．７５ｍＬをフラスコに加えた。３０分間、撹拌した後、１．０ｇ（７．１３４ｍｍｏｌ）のグリシジル３−シクロペンテニルエーテルを加えた。溶液を油浴中で６５℃で５．５時間加熱した。その後、反応混合物を室温にまで冷却し、０．５ＭのＨＣｌによりｐＨを７．０に調整した。得られた溶液を水で約４００ｍＬにまで希釈し、その後、カットオフ分子量が１０００のカセットを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムを使用して精製した。少量のアリコットを分析用に凍結乾燥させた。
Ｄ2Ｏ中で1Ｈ ＮＭＲを得た。δｐｐｍ（２．２，ｄ；２．４，ｄ；３．３１〜３．７，ｍ；４．１，ｓ；４．７７，ｓ；４．９，ｓ（ｂ）；５．５５，ｓ）
【０１１６】
溶液の残りをオゾンで処理して官能性デキストランを得た。置換率を、ＮＭＲから５．０〜５．２ｐｐｍのアノマーピーク対オレフィンピークの積分により測定した。置換率は０．５２であることがわかった。
【０１１７】
工程３：
４００ｍＬの官能性デキストラン水溶液（前工程から）を含有する、１Ｌの３つ口フラスコ（約８℃）に、オゾンを５．５時間噴霧した。オゾンの流れを停止し、３ｍＬの水に０．４５ｇの亜硫酸ナトリウムを溶解した溶液を８℃でフラスコに加えた。溶液を終夜撹拌し、１０００ＭＷＣＯのカセットを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムによる限外ろ過により精製した。最終溶液を冷凍し凍結乾燥させて０．６８ｇの泡状の固体を得た。
Ｄ2Ｏ中で1Ｈ ＮＭＲを得た。δｐｐｍ（１．３１８，ｍ；１．５２３，ｍ；１．８，ｍ；２．１，ｍ；２．３〜２．４８，ｍ；３．３〜３．９，ｍ；４．９，ｓ；５．１，ｓ（ｂ）；５．５，ｓ）
【０１１８】
アルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ジアルデヒド官能性デキストランのヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、約１６％であった。本明細書では、このジアルデヒド官能性デキストランをＤＡＦＤ−１０−１６と称する。
【０１１９】
ペンダントジアルデヒド基を有するデキストラン（ＤＡＦＤ−エステル結合）の調製：
２段階法により、ペンダントジアルデヒド基がデキストラン主鎖にエステル結合で結合しているジアルデヒド官能性デキストランを調製した。
【０１２０】
工程１：
２２ｍＬのジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、続いて約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストラン１．８１７ｇ（１１．２１７ｍｍｏｌ）および塩化リチウム１．０９ｇ（２５．７１ｍｍｏｌ）を、マグネチック撹拌棒および還流冷却器を備えた５０ｍＬの３つ口フラスコへ入れた。懸濁液を生成し、これを、透明な溶液が得られるまで、９０℃まで１時間加熱した。溶液を室温にまで冷却し、０．９１ｍＬ（１１．２１７ｍｍｏｌ）のピリジンを加え、次いで、２．１８ｇ（１１．２１７ｍｍｏｌ）の３−シクロペンテンカルボニルクロリドを滴下した。４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、Ａｌｄｒｉｃｈ）（３０ｍｇ）を加え、混合物を終夜、すなわち約２０時間、６０℃で加熱した。冷却後、撹拌しながら、得られた茶色の溶液を２００ｍＬの冷水に滴下し、黄色の溶液を得た。０．２５ＮのＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを２．１５から６．０へ調整した。粗生成物を、カットオフ分子量が１０００のカセットを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムで精製した。少量のアリコットを冷凍し凍結乾燥させて分析試料を得た。
1Ｈ ＮＭＲ。δｐｐｍ（２．５９〜２．６６，ｍ）；（２．８５，ｓ）；（３．０，ｓ）；（３．２４（ｂ），ｓ）；（３．４６〜３．５１，ｍ）；（３．５２〜３．７１，ｍ）；（３．８４，ｄ）；（３．９３，ｄ）；（４．９１，ｓ）；（４．９７，ｓ）；（５．１２、ｔ）；（５．６８、ｓ）
【０１２１】
工程２：
前工程で得られた３５０ｍＬの溶液を含有する、マグネチック撹拌棒を備えた１Ｌの３つ口フラスコ（約８℃）に、オゾン流を５時間噴霧した。オゾン噴霧を停止後、８．４ｍＬの水に１．４１ｇの亜硫酸ナトリウムを溶解した溶液を加えた。得られた混合物を室温で終夜撹拌し、その後、カットオフ分子量が１０００のカセットフィルターを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムを用いて精製した。溶液を冷凍し凍結乾燥させて１．９２ｇの白色固体を得た。
Ｄ2Ｏ中の1Ｈ ＮＭＲが提示された。δｐｐｍ（３．４９〜３．７９，ｍ）；（３．８９〜３．９７，ｍ）；（４．９７ ｄ，（ブロード））；５．１６（ｓ，（ｂ））
【０１２２】
本明細書では、このジアルデヒド官能性デキストランをＤＡＦＤ−エステル結合と称する。
【０１２３】
酸化デキストラン（Ｄ１０−５０）の調製
水溶液中、デキストランをメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することにより、デキストランアルデヒドを生成する。Ｃｏｈｅｎ（同時係属中で共願の国際公開第０８／１３３８４７号パンフレット）らが記載している方法により、８，５００〜１１，５００ダルトンの重量％平均分子量を有するデキストラン（Ｓｉｇｍａ）から、約１０，０００Ｄａの平均分子量および約５０％の酸化転化率（すなわち、デキストランポリマー中の約半分のグルコース環が酸化されジアルデヒドになる）を有する酸化デキストランを調製する。典型的な手順をここに記載する。
【０１２４】
機械式撹拌機、添加用ロート、内部温度プローブおよび窒素パージを備えた２０Ｌの反応器に、１０００ｇのデキストランおよび９．００Ｌの脱イオン水を入れる。混合物を室温で撹拌してデキストランを溶解し、その後、１０〜１５℃に冷却する。冷却したデキストラン溶液に、９．００Ｌの脱イオン水に１０００ｇの過ヨード酸ナトリウムを溶解した溶液を、反応温度を２５℃未満に維持しながら１時間にわたって添加する。全ての過ヨード酸ナトリウムを加えたところで、混合物を２０〜２５℃でさらに４時間撹拌する。その後、反応混合物を０℃に冷却し、ろ過して透明にする。塩化カルシウム（５００ｇ）をろ液に加え、混合物を室温で３０分撹拌し、その後、ろ過する。ヨウ化カリウム（４００ｇ）をろ液に加え、この混合物を室温で３０分間撹拌する。得られた赤色溶液の一部３Ｌを、１０〜１５分かけて９．０Ｌのアセトンに加えるが、その間は機械式撹拌機により激しく撹拌する。さらに数分撹拌した後、凝集生成物を上澄み液から分離する。第２のろ液にヨウ化カリウムを加えることにより得られた残りの赤色溶液を、上と同様に処理する。凝集生成物を一緒にしたものを破砕し、大きなステンレス鋼製のブレンダー内で２Ｌのメタノールと混合し、固体が顆粒になるまでブレンドする。顆粒状固体をろ過により回収し、窒素パージしながら真空下で乾燥させる。その後、顆粒状固体をハンマーミルで微粉末に粉砕する。２０Ｌの反応器に１０．８Ｌの脱イオン水および７．２Ｌのメタノールを入れ、この混合物を０℃に冷却する。前工程で生成した顆粒状固体を反応器に加え、スラリーを１時間激しく撹拌する。撹拌を停止し、固体を反応器の底に沈殿させる。上澄み液に真空によるデカンテーションを行い、１５Ｌのメタノールを反応器に加え、スラリーを０℃に冷却しながら３０〜４５分間撹拌する。スラリーを部分に分けてろ過し、回収した固体をメタノールで洗浄し、混合し、窒素パージをしながら真空下で乾燥させて約６００ｇの酸化デキストランを得た。これを、本明細書では、Ｄ１０−５０と称する。
【０１２５】
生成物の酸化率は、プロトンＮＭＲによる測定で、約５０％（アルデヒド基１つ当たりの当量＝１４６）である。ＮＭＲ法では、２つのピーク領域、より詳しくは、約百万分の６．２部（ｐｐｍ）〜約４．１５ｐｐｍの−Ｏ2ＣＨx−（ＨＯＤのピークを減算）および約４．１５ｐｐｍ〜約２．８ｐｐｍの−ＯＣＨx−（メタノールのピークが存在するならば全て減算）の積分値を求める。酸化度の計算は、これらの面積の計算比（Ｒ）、詳しくはＲ＝（ＯＣＨ）／（Ｏ2ＣＨ）に基づく。
【０１２６】
８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアミン（Ｐ８−１０−１）の調製：
同時係属中で共願の米国特許出願公開第２００７／０２４９８７０号明細書でＣｈｅｎａｕｌｔが記載している２段階法により、８アームのＰＥＧ１０Ｋオクタアミン（Ｍn＝１０ｋＤａ）を合成する。第１工程では、塩化チオニルと８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアルコールを反応させて、８アームＰＥＧ１０Ｋクロリドを生成する。第２工程では、８アームＰＥＧ１０Ｋクロリドをアンモニア水と反応させて８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアミンを得る。典型的手順をここに記載する。
【０１２７】
８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアルコール（Ｍn＝１００００；ＮＯＦ ＳｕｎＢｒｉｇｈｔ ＨＧＥＯ−１００００）（５００ｍＬ丸底フラスコ中に１００ｇ）を真空下（０．０６ｍｍ水銀柱（８．０Ｐａ））、８５℃で撹拌しながら４時間加熱するか、または減圧下（２ｋＰａ）、ポット温度６０℃で５０ｇのトルエンと共沸蒸留して乾燥させる。８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアルコールを室温にまで冷却し、還流冷却器を備えたフラスコに塩化チオニル（３５ｍＬ、０．４８ｍｏｌ）を加え、混合物を窒素で覆い、撹拌しながら８５℃まで２４時間加熱する。過剰の塩化チオニルをロータリーエバポレーターにより蒸発除去する（浴温４０℃）。１回当たり５０ｍＬのトルエンを続けて２回加え、減圧下（２ｋＰａ、浴温６０℃）で蒸発させ、塩化チオニルを完全に除去する。１つの合成から得られたプロトンＮＭＲの結果は次の通りである：
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ３．７１〜３．６９（ｍ，１６Ｈ）、３．６７〜３．６５（ｍ，１６Ｈ）、３．５（ｓ，約８００Ｈ）
【０１２８】
８アームＰＥＧ１０Ｋオクタクロリド（１００ｇ）を６４０ｍＬの濃縮アンモニア水（２８重量％）に溶解し、圧力容器中、６０℃で４８時間加熱する。溶液に乾燥窒素を１〜２時間噴霧し５０〜７０ｇのアンモニアを放出させる。その後、水酸化物形態の強塩基性アニオン交換樹脂（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）Ａ−８６０、Ｔｈｅ Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃｏ．、Ｂａｌａ−Ｃｙｎｗｙｄ、ＰＡ）のカラム（ベッド体積５００ｍＬ）に溶液を通す。溶離液を捕集し、１回当たり２５０ｍＬの脱イオン水をカラムに３回通して、これも捕集する。水溶液を混合して減圧下（２ｋＰａ、浴温６０℃）で約２００ｇに濃縮し、小分けにして冷凍し、凍結乾燥させて、無色のワックス様固体として、本明細書ではＰ８−１０−１と称する、８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアミンを得る。
【０１２９】
８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミン（Ｐ８−１０−２）の調製：
Ａｒｔｈｕｒが国際公開第０８／０６６７８７号パンフレットで記載しているような、８アームＰＥＧ１０Ｋを、ジクロロメタン中、トリエチルアミンの存在下に塩化メタンスルホニルと反応させて８アームＰＥＧ１０Ｋメシレートを生成し、次いで、これをトリス（２−アミノエチル）アミンと反応させて、８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミンを得るという２段階法により、アームの末端に２つの第１アミン基を有する、本明細書「ｐ８−１０−２」と称する８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミンを調製した。典型的合成法をここに記載する。
【０１３０】
窒素雰囲気下で撹拌され、０℃に冷却されている、５０ｍＬのジクロロメタンに１０ｇの８アームＰＥＧ１０Ｋ（Ｍn＝１０，０００、日油（株）、東京、日本）を溶解させた溶液に、２．２ｍＬのトリエチルアミン、続いて１．２ｍＬの塩化メタンスルホニルを加える。混合物を室温に暖め、終夜撹拌する。反応混合物を分液ロートに移し、１５ｍＬの１Ｍリン酸二水素カリウムで３回、次いで１５ｍＬの１Ｍ炭酸カリウム、そして１５ｍＬの水で穏やかに洗浄する。ジクロロメタン層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、ロータリーエバポレーターにより濃縮し、１１．１７ｇの８アームＰＥＧ１０Ｋメシラートを得る。
【０１３１】
４５ｍＬの水に溶解させた、１０ｇの８アームＰＥＧ１０Ｋメシラートと４５ｍＬのトリス（２−アミノエチル）アミンとの混合物を、室温で２４時間撹拌する。反応混合物を５％（ｗ／ｗ）重炭酸ナトリウム水４５ｍＬで希釈し、合計５００ｍＬを３分割したジクロロメタンで抽出する。ジクロロメタン溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで２０〜２５ｇに濃縮する。濃縮ジクロロメタン溶液にエーテル（１００ｍＬ）を激しく撹拌しながら加え、混合物を０℃に冷却して、ワックス状固体を溶液から分離させる。溶媒をデカンテーションによりワックス状固体から除去し、ワックス状固体を真空下で乾燥させて８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミン（Ｐ８−１０−２）を得る。
【０１３２】
実施例１〜１５
豚子宮角のメス切開シール部のインビトロ開裂試験
これらの実施例の目的は、豚の子宮角切開に対してなされた各種ヒドロゲルによるシールの開裂強度を明示することであった。
【０１３３】
豚の子宮角の一部の切開に対するシールの開裂強度の測定に、シリンジポンプシステムを使用した。シリンジポンプ（型番２２、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を改造し、「Ｙ形」継手により互いに連結されている２本の３０ｍＬシリンジを装着した。１本のＴｙｇｏｎ（登録商標）Ｒ−３６チューブ（直径０．６ｃｍ）と圧力計（ＰＤＧ ５０００Ｌ型、Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を通して、ポンプで水を送った。地元の食肉処理場から入手した清浄な豚子宮角の約１２．５ｃｍ部分の一端に、シリンジポンプからの水を供給するための供給ライン継ぎ手を備えた金属プラグを装着し、他端に機械ネジでシール可能なネジ穴を有する金属プラグを装着した。プラグは腸管の外周の適当な位置にナイロン紐で保持した。切開は、＃１５の外科用メスの刃を装着したＢａｒｄ Ｐａｒｋｅｒ（商標）の外科用メスハンドル５（ＢＤ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪから入手）で穿刺することにより、子宮角の壁から内部に向けて行われた。子宮角の外側の切開部はメスの刃より広く（通常、４〜５ｍｍ）、一方、内壁を通る孔は約３ｍｍ（刃にほぼ等しい）であった。このサイズの切開は、腸管を切断した後に縫合する場合の、断続縫合の間隔を模したものである。子宮角にシリンジポンプにより紫色染料を含有する水を、その水が末端プラグの開いた孔から、また子宮角壁のメスの穿刺部からも漏れ始めるまで、充填した。その後、ポンプの電源を切り、末端プラグを機械ネジでシールした。メス切開部をペーパータオルで拭き乾燥させた。
【０１３４】
アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンの溶液を、表１に示すように、水中で、３７℃、１７５ｒｐｍで終夜振盪して調製した。２つの溶液を、１６または１２段の静的ミキサー（Ｍｉｘｐａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ）を備えたダブルバレルシリンジ（Ｍｉｘｐａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ（Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、切開部に塗布した。塗布後、接着剤は室温で２分以内に硬化した。シールした腸にシリンジポンプから１１ｍＬ／ｍｉｎの流量で水を送り、生体接着シールから漏洩が始まるまで加圧して（この時点の圧力を記録した）、開裂圧力試験（本明細書では、漏洩圧力試験とも称する）を行った。ヒドロゲルと組織表面の間のシールの下から水漏れがあった場合、接着不良が原因であると考えられた。水が浸透しヒドロゲル自身から漏れた場合は、凝集不良が原因であると考えられた。開裂試験の結果を表１に要約する。
【０１３５】
表１
開裂圧力試験結果
【０１３６】
表１に示した結果は、単一のペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドを、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有する８アーム分枝末端ポリエチレングリコールアミン（すなわちＰ８−１０−２）とポリマーアームの末端に１つの第１アミン基を有する８アームポリエチレングリコールアミン（Ｐ８−１０−１）との混合物と反応させて生成したヒドロゲルは、生物学的組織に良好に接着し、かつこれをシールすることを明示している。
【０１３７】
実施例１６〜２６
インビトロ生体適合性試験−細胞毒性
これらの実施例の目的は、アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンとの反応から得られるヒドロゲルの安全性をインビトロ試験で明示することにある。
【０１３８】
試験は、ＩＳＯ１０９９３−５：１９９９にしたがって、ＮＩＨ３Ｔ３ヒト線維芽細胞培養物を使用して実施した。ＮＩＨ３Ｔ３ヒト線維芽細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％の牛胎児血清を加えたダルベッコ変法必須培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【０１３９】
表２に示すように、等体積の、アルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液とマルチアームＰＥＧアミンの水溶液を混合して調製したヒドロゲルを、ＮＩＨ３Ｔ３ヒト線維芽細胞培養体に与えた。実施例１〜１５に記載したように、水溶液を調製し、混合して、ヒドロゲルを生成した。各ヒドロゲルを、ポリスチレン培養プレートのウエルの底に、ウエルの底の約１／４が覆われるように置いた。その後、ＵＶ光でウエルを殺菌し、５０，０００〜１００，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種した。
【０１４０】
細胞は、通常、集密的に成長し、ウエルの底を被覆し、ヒドロゲルの辺縁にまで増殖した。しかしながら、それらはヒドロゲルを越えて増殖することはなかった。これらの結果を表２に要約するが、ヒドロゲルに細胞毒性がなく、また細胞培養体がヒドロゲルに対し接着性を有していないことを明示している。
【０１４１】
表２
細胞毒性の結果
【０１４２】
実施例２７〜３７
ヒドロゲルの体外分解
これらの実施例の目的は、アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンとの反応で生成したヒドロゲルがインビトロ試験で容易に加水分解することを明示することにあった。
【０１４３】
表３に示すように、等体積の、アルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液とマルチアームＰＥＧアミンの水溶液を混合して、ヒドロゲル試料を調製した。実施例１〜１５に記載したように、水溶液を調製し、混合して、ヒドロゲルを生成した。ヒドロゲルを硬化させた後、試料を秤量し、ｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の入った瓶の中に入れた。この瓶を、８０ｒｐｍ、３７℃にセットした温度制御振盪機内に置いた。様々な時間に瓶から試料を取り出し、過剰の溶液を拭き取って除去し、秤量した。その後、試料を容器に戻した。
【０１４４】
結果を表３に要約する。表中に記載したパーセント増加は、本実験の経過期間中に測定したヒドロゲルの重量をヒドロゲルの初期重量で除し、１００を乗じたものである。
【０１４５】
表３
ヒドロゲルの体外分解
【０１４６】
（表３続き）
【０１４７】
表３の結果は、アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンとの反応で生成したヒドロゲルは、インビトロ試験で容易に加水分解することを明示している。重量％を単位とした成分の使用量の変更、および／または、ＰＥＧアミンのアミンもしくはアルデヒド官能性ポリサッカリドのアルデヒドの官能基数の変更により、分解時間を数時間から長い日数まで調整することができる。加水分解の結果は、本明細書中に開示されたヒドロゲルが体内で容易に分解するであろうことを示唆している。
【０１４８】
実施例３８および３９
ジアルデヒド官能性デキストランを使用して生成したヒドロゲルの体外分解
これらの実施例の目的は、ジアルデヒド官能性デキストランとマルチアームＰＥＧアミンとの反応で生成したヒドロゲルの体外分解を調べることにあった。
【０１４９】
実施例１〜１５に記載したように、ジアルデヒド官能性デキストランＤＡＦＤ−１０−１６（実施例３８）またはＤＡＦＤ−１０−エステル結合（実施例３９）を２０重量％の濃度で含有する水溶液を、マルチアームＰＥＧアミンＰ８−１０−１（２５重量％）を含有する水溶液と混合し、ヒドロゲルを生成した。ヒドロゲルの分解は、実施例２７〜３７に記載した方法により求めた。結果を表４に要約する。
【０１５０】
表４
ヒドロゲルの体外分解
【０１５１】
これらの結果は、ジアルデヒド官能性デキストランがマルチアームＰＥＧアミンＰ−８−１０−１とともにヒドロゲルのゲルを生成すること、および、水性環境中では広範な分解速度を有するヒドロゲルが得られることを明示している。より詳しくは、デキストラン主鎖への結合が、エーテル結合したジアルデヒド官能性デキストランのように化学的に安定なペンダントジアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランを使用することにより、長寿命のヒドロゲルを生成することができる（実施例３８）。また、エステル結合のように、加水分解に対して潜在的に不安定なペンダントジアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランを使用することにより、極めて迅速に分解するヒドロゲル調製することができる（実施例３９）。
【０１５２】
実施例４０〜４４
水溶液中のアルデヒド官能性デキストランの安定性−粘度測定
これらの実施例の目的は、アルデヒド官能性デキストランの水溶液中における安定性が、酸化デキストランＤ１０−５０と比べて高いことを、粘度の測定によって明示することにあった。
【０１５３】
表５に示すように、酸化デキストランの水溶液（２５重量％）と各種のアルデヒド官能性デキストランの水溶液（２５重量％）を１２日間４５℃で加熱した。水溶液の３０℃における粘度を、様々な時点で測定した。結果を表５に要約する。
【０１５４】
表５
酸化デキストランおよびアルデヒド官能性デキストラン水溶液の粘度
【０１５５】
表５の結果は、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランを含有する水溶液は、１２日後に０％〜１１％の範囲で粘度が低下したのに対し、酸化デキストランを含有する水溶液の粘度は同じ時間で２２％減少したことを示している。これらの結果は、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランは、水溶液中で酸化デキストランより安定であることを示唆している。
【０１５６】
実施例４５〜４８
水溶液中のアルデヒド官能性デキストランの安定性−レオメトリ測定
これらの実施例の目的は、水溶液中のアルデヒド官能性デキストランの安定性を明示することにあった。アルデヒド官能性デキストラン溶液の安定性の尺度として、アルデヒド官能性デキストランとマルチアームポリエーテルアミンとの反応で得られたヒドロゲルの振動ディスクレオメトリを使用した。
【０１５７】
表６に示すように、一方のバレルに各種アルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液を、他方のバレルにマルチアームＰＥＧアミンの水溶液を充填したダブルバルブシリンジを２通り用意した。他の２つのダブルバレルシリンジには、一方のバレルに酸化デキストランＤ１０−５０の水溶液を、他方のバレルにＰ８−１０−１の水溶液（２０重量％）を満たした。ダブルバレルシリンジに充填した水溶液を、静的混合チップを通してＡＰＡ２０００型レオメータ（Ａｌｐｈａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｋｒｏｎ、ＯＨ）の試料台に送り、混合物の貯蔵弾性率（Ｇ’）を測定し、０日目の値とした。６０秒におけるＧ’の値をゲル化速度の尺度とした。
【０１５８】
一方のグループのシリンジを２５℃で様々な時間貯蔵し、第２のグループのシリンジは、熱的にエージングしたアルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液を提供するために、（表６に示すように）様々な時間４０℃に加熱した。混合溶液の貯蔵弾性率を、様々な時間に、上記のように測定した。結果を、０日目のＧ’に対するパーセントで表し、表６に示す。
【０１５９】
表６
ヒドロゲル生成物のレオメトリ測定結果
【０１６０】
表６の結果は、アルデヒド官能性ポリサッカリドは水溶液中で酸化デキストランより安定であることを示唆している。
【０１６１】
実施例４９
レオメトリ測定法を用いたＡＦＤ−１３−６４の水溶液中における熱安定性
この実施例の目的は、振動ディスクレオメトリ測定法により、アルデヒド官能性デキストランＡＦＤ−１３−６４の水溶液中における熱安定性を明示することにあった。
【０１６２】
それぞれ、一方のバレルにＡＦＤ−１３−６４の水溶液（２０重量％）を、他方のバレルにＰ８−１０−１の水溶液（２０重量％）を充填した２つのダブルバレルシリンジを用意した。一方のシリンジは４０℃で１９日間加熱し、他方のシリンジは同期間４℃で保管した。その後、各シリンジから得られた混合物の貯蔵弾性率を、ＡＰＡ２０００型レオメータ（Ａｌｐｈａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｋｒｏｎ、ＯＨ）を用いて測定した。４０℃で１９日間貯蔵したシリンジから得られた混合物について得られた貯蔵弾性率は、同期間４℃で貯蔵したシリンジから得られた混合物について得られた貯蔵弾性率と実質的に同一であり、アルデヒド官能性デキストランＡＦＤ−１３−６４が良好な熱安定性を有することを示唆するものであった。
【０１６３】
実施例５０、比較例
アミド結合により結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性カルボキシメチルデキストラン
この実施例の目的は、アミド結合でポリサッカリドと結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドが、エーテル結合でポリサッカリドと結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドほど、水溶液中で安定でないことを明示することにあった。
【０１６４】
カルボキシメチル化率が１．１の１１ｋＤａカルボキシメチルデキストランの調製（ＣＭＤＸ−１１−１．１）の調製：
８．５〜１１ｋＤａの平均分子量を有するデキストラン（Ｓｉｇｍａ）を、１２３．７５ｍＬの６ＮのＮａＯＨに０℃で溶解した。この冷溶液に、３０．７５ｇのクロロ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。この反応混合物を６０℃まで２０分間加熱し、その後、冷却して、濃塩酸でｐＨ７．０に中和した。中和した溶液に１．０Ｌのメタノールを滴下して生成物を沈殿させた。固体をろ過により捕集し、メタノールから再沈殿させた。その後、全手順を３回繰り返し、置換率を所望のレベルにまで高めた。最後の繰り返しの後、限外ろ過により生成物をさらに精製した。溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ ＴＦＦシステムを使用して透析ろ過した。一定の残余分体積を維持するために連続的に水を加えながら、合計で６倍の体積の浸透液を捕集した。その後、残余分を捕集し、凍結乾燥させて、１４．２５ｇの綿毛のような白色固体を得た。カルボキシメチル化率をＨｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５２：９１６、１９８０）の方法により測定したところ、１．１であった。本明細書では、このカルボキシメチルデキストラン生成物をＣＭＤＸ−１１−１．１と称する。
1Ｈ ＮＭＲ δ４．９〜５．２ｍｕｌｔ．（１Ｈ），３．４〜４．４ｍｕｌｔ（９．５Ｈ）．
【０１６５】
アミド結合により結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性カルボキシメチルデキストランの調製：
３リットルの３つ口フラスコに、１３．７ｇのＣＭＤＸ−６０−１．７、並びにテトラメチルエチレンジアミン緩衝液およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の１：１溶液９１６．６ｍＬを加えた。ｐＨ４．９４の透明な溶液が生成した。１．０ＭのＨＣｌを加えてｐＨを４．７に調整した。この溶液に、４７．７４ｇの１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｓｉｇｍａ）、続いて２８．８７ｇのｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。溶液のｐＨを４．７に再調整し、２時間撹拌した。その後、ｐＨが４．７を越えて上昇しないように、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（５３．８８ｇ）を小分けにして３．５時間にわたって加えた。反応の終点に向けてｐＨを６．２５に上昇させ、その後、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をガラス瓶に移し、水で希釈し、１ｋＤａのカットオフフィルターを備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムでろ過した。連続的にリサイクルし、浸透液を置換するために連続的に新鮮な水を加えて、浸透液として合計で５倍の体積を捕集した。ろ過した溶液を凍結乾燥させ、白色固体生成物を得た。その後、ペンダントアセタール基の結合を増加させるために、白色固体生成物を出発材料として上記手順を繰り返した。最終の収率は２０．３ｇであった。
【０１６６】
固体を４００ｍＬの水に溶解し、ｐＨ２．５で１．０ＭのＨＣｌにより終夜処理することにより、アセタール基を除去した。ＮａＯＨで中和後、前述したように、溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムでろ過し、凍結乾燥させて１６．４５ｇの白色固体を得た。分子量を、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ、４９ｋＤａであった。環１個当たりのアルデヒド置換率を、加水分解した試料のＮＭＲにより測定したところ、０．３７であった。ＮＭＲ法では、２つのピーク領域、具体的には、百万分の約６．２（ｐｐｍ）〜約４．１５ｐｐｍの−Ｏ2ＣＨx−（ＨＯＤのピークは減算）および約４．１５ｐｐｍ〜約２．８ｐｐｍの−ＯＣＨx−（メタノールのピークが存在するならば全て減算）の積分値を測定する。酸化度の計算は、これらの面積について計算した比（Ｒ）、具体的には、Ｒ＝（ＯＣＨ）／（Ｏ2ＣＨ）に基づく。
【０１６７】
アルデヒド官能性カルボキシメチルデキストランの水溶液中における不安定性
上記のようにして得た固体生成物５．１ｇを、１５．３ｇのオートクレーブ水に溶解することにより、アミド結合で結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性カルボキシメチルデキストランの水溶液を調製した。この混合物をインキュベータ中、３７℃、１９０ｒｐｍで１時間振盪した。得られた溶液を５．０μｍ膜に通してろ過し、５ｍＬの溶液試料を２つ、５５℃のインキュベータに入れた。１９時間後、両試料は流動性を示さない琥珀色のゲルを生成した。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、共に２００９年７月２日に出願された米国仮特許出願第６１／２２２７１３号明細書および同第６１／２２２７２０号明細書に基づく米国特許法（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．）１１９条による優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、医療用接着剤の分野に関する。より詳しくは、本発明はペンダントアルデヒド基を含むアルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンとの反応により生成されるヒドロゲル組織接着剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
組織接着剤は、創口閉鎖、体内外科的処置における縫合糸またはステープルの補助または代替、血液、胆汁、胃腸液および脳脊髄液などの体液の漏洩防止、角膜への合成アンレーまたはインレーの接着、薬剤配送装置、並びに、術後の癒着防止のための抗接着バリアとしてなど、多くの医療用途に可能性を有している。従来の組織接着剤は、一般に、幅広い接着用途には適していない。例えば、シアノアクリレート系接着剤は局所的な創口閉鎖に使用されてきたが、有毒な分解生成物を放出することから、体内用途への使用は制限されている。フィブリン系の接着剤は、遅硬性で、機械的強度に乏しく、かつウィルス感染の危険性がある。加えて、フィブリン系の接着剤は下層組織と共有結合しない。
【０００４】
数種類のタイプの異なるヒドロゲル組織接着剤が開発されている。それらは接着性および凝集性が向上しており、かつ毒性もない（例えば、Ｓｅｈｌら、米国特許出願公開第２００３／０１１９９８５号明細書、およびＧｏｌｄｍａｎｎ、米国特許出願公開第２００５／０００２８９３号明細書を参照）。これらのヒドロゲルは、一般に、求核基を有する成分と、この第１成分の求核基と反応することができる求電子基を有する成分との反応により生成され、共有結合を介した架橋網目構造を形成する。しかしながら、これらのヒドロゲルは、通常、膨潤するか、極めて急速に分解するか、または十分な接着強度もしくは機械的強度に欠けるものであり、そのため外科用接着剤としての有効性が損なわれている。
【０００５】
Ｋｏｄｏｋｉａｎら（同時係属中で共願の米国特許出願公開第２００６／００７８５３６号明細書）は、酸化ポリサッカリドと水分散性マルチアームポリエーテルアミンとの反応により生成されたポリサッカリドベースのヒドロゲル組織接着剤を記載している。これらの接着剤は、改善された接着性および凝集性を提供するものであり、体温で容易に架橋し、初期には寸法安定性を維持し、急速には分解せず、細胞に対して無毒であり、組織に炎症を起こさせない。しかしながら、外傷または手術によって生じる望ましくない組織−組織間癒着を防止するというようなある種の用途では、より急速に分解するヒドロゲル組織接着剤が必要である。例えば、癒着防止組成物は、治癒プロセスが始まったならば（通常、１〜３週以内）、その部位にあってはならない。
【０００６】
したがって、Ｋｏｄｏｋｉａｎらに記載されている酸化ポリサッカリドベースの組織接着剤の望ましい特性（上記参照）を有しながら、より短時間で分解するヒドロゲル組織接着剤が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、良好な接着性および凝集性を有し、体温で容易に架橋し、初期には寸法安定性を維持し、細胞に対して無毒であり、組織に炎症を起こさせず、かつ酸化ポリサッカリドベースのヒドロゲル組織接着剤より急速に分解する、ヒドロゲル組織接着剤を提供することにより、上記の必要性に応えるものである。
【０００８】
したがって、一実施形態において本発明は、
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含むキットを提供する。
【０００９】
他の一実施形態において本発明は、
ａ）溶媒中で、（ｉ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと、（ｉｉ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを混合して、ヒドロゲルを生成する工程；および
ｂ）前記ヒドロゲルを処理して前記溶媒の少なくとも一部を除去して、乾燥ヒドロゲルを生成する工程
を含む方法により生成される乾燥ヒドロゲルを提供する。
【００１０】
他の一実施形態において本発明は、
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド、および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
の反応生成物を含む組成物を提供する。
【００１１】
他の一実施形態において本発明は、
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含み、前記少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと前記少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンが、ポリサッカリドのペンダントアルデヒド基と水分散性マルチアームアミンの第１アミン基との間に形成された共有結合を介して架橋されている架橋ヒドロゲル組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上で、また本発明の説明全体を通して使用される場合、次の用語は特に明示しない限り、以下のように定義される。
【００１３】
用語「アルデヒド官能性ポリサッカリド」は、本明細書中では、化学的に修飾されて分子中にペンダントアルデヒド基が導入されたポリサッカリドをいう。ペンダントアルデヒド基は単一のアルデヒド基であってもジアルデヒドであってもよい。本明細書での定義では、アルデヒド官能性ポリサッカリドには、ポリサッカリド環の開裂により酸化されてアルデヒド基が導入されたポリサッカリドは含まれない。ポリサッカリド環の酸化により、ポリサッカリド環が開環してジアルデヒドが形成される。
【００１４】
用語「ペンダントアルデヒド基」は、環の水酸基の１つを介してポリサッカリドの糖に結合したアルデヒド基をいう。
【００１５】
用語「アルデヒド置換率」は、糖の繰り返し単位１モル当たりのペンダントアルデヒド基のモルパーセント、すなわち、（ペンダントアルデヒド基のモル数／糖の繰り返し単位のモル数）×１００をいう。
【００１６】
用語「水分散性マルチアームアミン」は、中心構造体（単一原子、コア分子またはポリマー主鎖であり得る）から広がる、直鎖状であっても分枝鎖状であってもよい、３つ以上のポリマー鎖（「アーム」）を有するポリマーであって、少なくとも３つの分枝（「アーム」）が少なくとも１つの第１アミン基で終端されているポリマーをいう。水分散性マルチアームアミンは、水溶性であるか、または水に分散して、水性溶液または水性分散液中で第２の反応物質と反応し得るコロイド状懸濁液を形成することができる。
【００１７】
用語「分散液」は、本明細書中では、水性媒体中で第２の反応物質と反応し得るコロイド状の懸濁液をいう。
【００１８】
用語「水分散性マルチアームポリエーテルアミン」は、ポリマーがポリエーテルである水分散性マルチアームアミンをいう。
【００１９】
用語「ポリエーテル」は、繰り返し単位［−Ｏ−Ｒ］−（ここで、Ｒは２〜５個の炭素原子を有するヒドロカルビレン基である）を有するポリマーをいう。ポリエーテルは、また、異なるＲ基を有する異なる繰り返し単位を含むランダムまたはブロックコポリマーであってもよい。
【００２０】
用語「ヒドロカルビレン基」は、炭化水素の２つの異なる炭素原子から１個ずつ２個の水素原子を引き抜くことにより生成される２価の基をいう。
【００２１】
用語「分枝ポリエーテル」は、１個以上の分枝点（「アーム」）を有するポリエーテルをいい、星形、樹枝形、櫛形、高分枝および超分枝ポリエーテルなどが挙げられる。分枝は、１つ以上の、三官能以上の多官能性分枝点から放射状に広がる。
【００２２】
用語「樹枝形ポリエーテル」は、それぞれ連続するモノマー世代がコア分子から放射状に広がる形で規則的に繰り返す分枝構造を有する高分枝ポリエーテルをいう。
【００２３】
用語「櫛形ポリエーテル」は、直鎖状のポリマー主鎖の三官能性分枝点から線形の側鎖が伸びている分枝ポリエーテルをいう。
【００２４】
用語「星形ポリエーテル」は、線形の側鎖が単一原子または対称点を有するコア分子から伸びている分枝ポリエーテルをいう。
【００２５】
用語「超分枝ポリエーテル」は、「高分枝」よりさらに高度に、不完全なデンドリマーに近い程度にまで分枝したポリエーテルをいう。
【００２６】
用語「高分枝ポリエーテル」は、多くの分枝点を有しており、そのため分枝点の間隔がアームの全長より短くなっている分枝ポリエーテルをいう。
【００２７】
用語「第１アミン」は、２個の自由水素を有する中性アミノ基をいう。アミノ基は、第１級、第２級、または第３級の炭素と結合することができる。
【００２８】
用語「多官能性アミン」は、少なくとも２つの官能基を含み、そのうちの少なくとも１つが第１アミン基である化学化合物をいう。
【００２９】
用語「架橋」は、２つの異なるポリマー鎖の間に結合され、これらを結び付ける原子結合または原子鎖をいう。
【００３０】
用語「架橋密度」は、本明細書では、架橋結合サイト間に存在する鎖原子の平均数の逆数と定義する。
【００３１】
用語「重量による％」は、本明細書では「重量％」とも称されるが、特に明示しない限り、溶液または分散液の全重量に対する重量パーセントをいう。
【００３２】
用語「解剖学的部位」は、ヒトまたは動物の体外または体内の任意の部位をいう。
【００３３】
用語「組織」は、ヒトまたは動物における任意の生物学的組織をいい、生きている組織および死んだ組織の両方を含む。
【００３４】
用語「ヒドロゲル」は、共有結合架橋により結合された３次元網目構造の巨大分子からなり、多量の水を吸収して弾性ゲルを形成することができる水膨潤性ポリマーマトリックスをいう。
【００３５】
用語「乾燥ヒドロゲル」は、含有する溶媒の少なくとも一部を除去するよう処理されたヒドロゲルをいう。ヒドロゲルから全溶媒が実質的に全て除去されていることが好ましい。
【００３６】
用語「ＰＥＧ」は、本明細書中では、ポリ（エチレングリコール）をいう。
【００３７】
用語「Ｍw」は、本明細書中では、重量平均分子量をいう。
【００３８】
用語「Ｍn」は、本明細書中では、数平均分子量をいう。
【００３９】
用語「Ｍz］は、本明細書中では、ｚ−平均分子量をいう。
【００４０】
用語「医療用途」は、ヒトおよび動物に関係した医療用途をいう。
【００４１】
使用する略語の意味は次の通りである。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」」はミリリットルを意味し、「Ｌ」」はリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｍｏｌ％」はモルパーセントを意味し、「Ｖｏｌ」」は体積を意味し、「ｗ／ｗ」は重量当たりの重量を意味し、「Ｄａ」」はダルトンを意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、記号表示「１０Ｋ」」はポリマー分子が１０キロダルトンの数平均分子量を有することを意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｋＰａ」はキロパスカルを意味し、「ｐｓｉ」は１平方インチ当たりのポンドを意味し、「ｒｐｍ」は１分当たりの回転数を意味し、「1Ｈ ＮＭＲ」」はプロトン核磁気共鳴分光法を意味し、「１３−Ｃ ＮＭＲ」は炭素１３核磁気共鳴分光法を意味し、「ｐｐｍ」は百万当たりの部を意味し、「ｃＰ」はセンチポアーズを意味し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を意味し、「ＭＷＣＯ」は分画分子量を意味する。
【００４２】
「Ａｌｄｒｉｃｈ」への言及、または「Ｓｉｇｍａ」への言及は、前記薬品または成分がＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手したものであることを意味する。
【００４３】
本明細書においては、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンとの反応により生成されたヒドロゲル組織接着剤を開示している。ヒドロゲルは、外傷または手術に起因する、望ましくない組織−組織間癒着の防止（これには限定されない）といった、より急速な分解が要求される医療用途の組織接着剤または封止剤として有用であり得る。
【００４４】
アルデヒド官能性ポリサッカリド
本明細書中での使用に適したアルデヒド官能性ポリサッカリドは、化学的に修飾して分子内にペンダントアルデヒド基を導入したポリサッカリドである。ペンダントアルデヒド基は単一のアルデヒド基であってもジアルデヒドであってもよい。本明細書中で開示するアルデヒド官能性ポリサッカリドのペンダントアルデヒド基は、結合基を介してポリサッカリドに結合している。一実施形態においては、結合基は、炭素、水素および酸素原子を含むが、窒素原子は含有せず、エーテル結合によりポリサッカリドと結合している。後の実施例で示すように、このようなタイプの結合基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドは、酸化ポリサッカリド、あるいは、窒素原子を含有するか、または他の化学結合（例えば、アミドもしくはウレタンなど）によりポリサッカリドに結合するものなどの他のタイプの結合基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと比べて、水溶液中でより安定である。一実施形態では、結合基はペンダントアルデヒド基のα位に（すなわち、隣接する炭素原子に）結合したアルコキシ基を有する。他の一実施形態では、結合基はペンダントアルデヒド基のβ位に（すなわち、アルデヒド基から２番目の炭素原子に）結合したアルコキシ基を有しない。
【００４５】
本明細書においては、アルデヒド官能性ポリサッカリドには、ポリサッカリド環の開裂によって酸化されてアルデヒド基が導入されたポリサッカリドは含まれない。ポリサッカリド環の酸化により、ポリサッカリド環が開環してジアルデヒドが生成される。したがって、ポリサッカリド環の酸化により生成されたジアルデヒド基は、本明細書で定義されているペンダントアルデヒド基ではない。
【００４６】
アルデヒド官能性ポリサッカリドは、ペンダントアルデヒド基を導入するようポリサッカリドを化学的に修飾することにより調製することができる。有用なアルデヒド官能性ポリサッカリドとしては、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。出発物質のポリサッカリドは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの供給源から商業的に入手することができる。当該技術分野で知られているように、ポリサッカリドは、一般に、異なる分子量の分布を有する不均質混合物であり、平均分子量、例えば重量平均分子量（Ｍw）、または数平均分子量（Ｍn）などにより、その特性が示される。したがって、これらのポリサッカリドから調製されるアルデヒド官能性ポリサッカリドも、また、異なる分子量の分布を有する不均質混合物である。好適なアルデヒド官能性ポリサッカリドは、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトン、より具体的には約３，０００〜約２５０，０００ダルトン、より具体的には約５，０００〜約６０，０００ダルトン、より具体的には約７，０００〜約２０，０００ダルトンの重量平均分子量を有するものである。一実施形態では、アルデヒド官能性ポリサッカリドは、アルデヒド官能性デキストランである。他の一実施形態では、アルデヒド官能性ポリサッカリドは、アルデヒド官能性イヌリンである。
【００４７】
アルデヒド官能性ポリサッカリドは、当該技術分野で知られた方法で調製することができる。アルデヒド官能性ポリサッカリドは、Ｍｅｈｔａら（国際公開第９９／０７７４４号パンフレット）に記載されている任意の方法を使用して調製することができる。後述の実施例で詳述しているように、例えば、酸性の水性媒体中で、デキストランをアリルグリシジルエーテルと反応させてアリルオキシデキストランを生成させ、これを、その後、オゾン分解で酸化することにより、二重結合を開裂させ、末端アルデヒド基を導入することができる。さらに、Ｃｈｅｎ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３：１３１〜１３４、１９８９）に記載されているように、塩基性の水性媒体中で、グリシドールをデキストランなどのポリサッカリドと反応させて、アルキル化ポリサッカリドを得ることができる。アルキル化ポリサッカリドを過ヨウ素酸塩により酸化することにより、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドが得られる。アルデヒド官能性ポリサッカリドは、また、Ｓｏｌａｒｅｋら（米国特許第４，７０３、１１６号明細書）に記載されている、塩基の存在下にポリサッカリドを誘導体化アセタール試薬と反応させ、その後、ｐＨを７．０未満に調整してアセタールを加水分解させる方法で調製することができる。
【００４８】
ジアルデヒド官能基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドは、まず、末端ジエンを含有するペンダント基、または環状の２基置換のオレフィンを、ポリサッカリド環へ結合させることにより調製することができる。ペンダント基の結合は、種々の方法を使用して行うことができ、ポリサッカリドと、環状オレフィンもしくは末端ジエンを含有するグリシジルエーテルとの反応、または、同様に環状オレフィンまたは末端ジエンを含有するカルボン酸またはその誘導体との反応などの方法が含まれる。オゾン分解法など、当該技術分野で知られた方法を使用して、環状オレフィンまたは末端ジエンで誘導体化したポリサッカリドを酸化することにより、ペンダントジアルデヒドで誘導体化されたポリサッカリドが得られる。
【００４９】
アルデヒド置換率は、当該技術分野で知られた方法により測定することができる。例えば、アルデヒド置換率は、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）の方法にしたがい、アルデヒド官能性ポリサッカリドを塩酸ヒドロキシルアミンで滴定することにより測定することができる。好適なアルデヒド官能性ポリサッカリドは、約１０％〜約２００％、より具体的には約３０％〜約２００％、より具体的には約３５％〜約１２０％、より具体的には約４０％〜約１２０％のアルデヒド置換率を有する。
【００５０】
水分散性マルチアームアミン
好適な水分散性マルチアームアミンとしては、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明での使用に適したマルチアームアミンは、通常、約４５０〜約２００，０００ダルトン、より具体的には約２，０００〜約４０，０００ダルトンの数平均分子量を有する。
【００５１】
一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、繰り返し単位［−Ｏ−Ｒ］−（ここで、Ｒは２〜５個の炭素原子を有するヒドロカルビレン基である）を有する水分散性ポリエーテルのマルチアームポリエーテルアミンである。好適なマルチアームポリエーテルアミンとしては、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端星形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、およびＨｕｎｔｓｍａｎ ＬＬＣ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）からＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）ｔｒｉａｍｉｎｅの商品名で販売されているポリオキシアルキレントリアミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。星形ポリエチレンオキサイドアミンの例としては、各種マルチアームポリエチレングリコールアミン、および第１アミンで終端された３、４、６または８本のアームを有する星形ポリエチレングリコール（本明細書では、それぞれ３、４、６または８アームの星形ＰＥＧアミンと称する）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適なＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）トリアミンの例としては、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−４０３（ＣＡＳ Ｎｏ．３９４２３−５１−３）、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−３０００（ＣＡＳ Ｎｏ．６４８５２−２２−８）およびＪｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）Ｔ−５０００（ＣＡＳ Ｎｏ．６４８５２−２２−８）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、水分散性マルチアームポリエーテルアミンは、第１アミン基で終端された８本のアームを有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アームポリエチレングリコールである。
【００５２】
マルチアームポリエーテルアミンは、上記のように商業的に入手するか、または当該技術分野で知られた方法で調製することができる。例えば、少なくとも３本のアームが第１アミン基で終端されているマルチアームポリエチレングリコールは、Ｂｕｃｋｍａｎｎら（Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９〜１３８４、１９８１）に記載されている方法を使用して、マルチアームポリエチレングリコール（例えば、３、４、６および８アーム星形ポリエチレングリコールは、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＳｕｎＢｉｏ，Ｉｎｃ．Ａｎｙａｎｇ Ｃｉｔｙ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ；日油（株）、東京、日本；またはＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＵＳＡ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸなどの会社から入手可能である）にアミン末端を結合させることにより調製することができる。その方法では、マルチアームポリエチレングリコールを臭化チオニルと反応させて水酸基を臭素に変換し、その後、臭素を１００℃でアンモニアと反応させてアミンに変換する。この方法は他のマルチアームポリエーテルアミンの調製にも広く適用することができる。さらに、マルチアームポリエーテルアミンは、Ｃｈｅｎａｕｌｔ（同時係属中で共願の米国特許出願公開第２００７／０２４９８７０号明細書）に記載されている方法を使用して、マルチアームポリオールから調製することができる。その方法では、マルチアームポリエーテルを塩化チオニルと反応させて水酸基を塩素基へと変換し、その後、塩素基を水性または無水アンモニアと反応させてアミンに変換する。マルチアームポリエーテルアミンを調製するために使用し得る他の方法は、Ｍｅｒｒｉｌｌらが米国特許第５，８３０，９８６号明細書で、またＣｈａｎｇらが国際公開第９７／３０１０３号パンフレットで記載している。
【００５３】
本発明での使用に適した水分散性マルチアームアミンとして、Ｓｔａｒｂｕｒｓｔ（登録商標）Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）の商品名で販売されているアミノ末端樹枝形ポリアミドアミンも挙げることができる。
【００５４】
一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、Ａｒｔｈｕｒ（同時係属中で共願の国際公開第２００８／０６６７８７号パンフレット）に記載されているようなマルチアーム分枝末端アミンである。マルチアーム分枝末端アミンは、ポリマーアームのそれぞれの末端に２つまたは３つの第１アミン基を有する分枝ポリマーである。官能基の数が多ければ、所与の鎖の末端における反応の統計的確率が高くなり、ポリマー網へ分枝分子がより効率的に取り込まれるようになる。分枝末端アミンの調製に使用する出発物質は、櫛形または星形ポリエーテルポリオールなど（これらに限定されるものではない）のマルチアームポリエーテルポリオールのような分枝ポリマーとすることができる。分枝末端アミンは、当該技術分野でよく知られた方法を使用して、ポリマーの末端に水酸基との反応により複数のアミン基を結合させることによって調製することができる。例えば、ポリマーアームの各末端に２つのアミン官能基を有する分枝末端アミンは、上で列挙したような出発物質を塩化チオニルとトルエンなどの適当な溶媒中で反応させて塩化物誘導体を得、次いで、これをトリス（２−アミノエチル）アミンと反応させて、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有する分枝末端反応物を得ることにより調製することができる。
【００５５】
一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アーム分枝末端ポリエチレングリコールアミンである。
【００５６】
他の一実施形態では、水分散性マルチアームアミンは、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アーム分枝末端ポリエチレングリコールアミンと、１つの第１アミン基で終端された８本のアームを有し、かつ約１０，０００ダルトンの数平均分子量を有する８アームポリエチレングリコールアミンとの混合物である。
【００５７】
水分散性マルチアームアミンが、一般に、アームの長さに分布を有し、ある場合には、異なる数のアームを持つ種類に分布を有する、やや不均質な混合物であることは、認識されなければならない。マルチアームアミンが、異なる数のアームを持つ種類に分布を有する場合、分布の平均アーム数に基づいて記載される。例えば、一実施形態では、マルチアームアミンは、マルチアーム星形ＰＥＧアミンの混合物であって、あるものは８本未満のアームを有し、あるものは８本を超えるアームを有するが、混合物におけるマルチアーム星形ＰＥＧアミンは平均８本のアームを有する混合物を含む、８アームの星形ＰＥＧアミンである。したがって、本明細書中でマルチアームアミンに言及する際に使用される用語「８アーム」、「６アーム」、「４アーム」、および「３アーム」は、アーム長さに分布を有し、ある場合には異なる数のアームを持つ種類に分布を有する（この場合は、挙げられたアームの数は、混合物におけるアームの平均数である）、不均質混合物をいうものと理解すべきである。
【００５８】
ヒドロゲル組織接着剤の使用方法
本明細書中に開示するヒドロゲル組織接着剤は、種々の形態で使用することができる。一実施形態では、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンは、水溶液もしくは分散液の成分として使用される。アルデヒド官能性ポリサッカリドを含む水溶液もしくは分散液（本明細書では「第１の水溶液もしくは分散液」と称する）の調製には、少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドを水に加え、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約４０％、より具体的には約５％〜約３０％、より具体的には約１０％〜約３０％の濃度とする。さらに、重量平均分子量が異なるか、アルデヒド置換率が異なるか、または重量平均分子量およびアルデヒド置換率が共に異なる、少なくとも２種のアルデヒド官能性ポリサッカリドの混合物を使用することができる。アルデヒド官能性ポリサッカリドの混合物を使用する場合、アルデヒド官能性ポリサッカリドの合計の濃度は、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約４０％、より具体的には約５％〜約３０％、より具体的には約１０％〜約３０％である。
【００５９】
同様に、水分散性マルチアームアミンを含む水溶液もしくは分散液（本明細書では「第２の水溶液もしくは分散液」と称する）の調製には、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを水に加え、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約７０％、より具体的には約２０％〜約５０％濃度とする。最適な使用濃度は、意図する用途、および第１の水溶液もしくは分散液で使用するアルデヒド官能性ポリサッカリドの濃度に依存する。さらに、数平均分子量が異なるか、アーム数が異なるか、または数平均分子量およびアーム数が共に異なる、異種の水分散性マルチアームアミンの混合物を使用することができる。水分散性マルチアームアミンの混合物を使用する場合、マルチアームアミンの合計の濃度は、溶液または分散液の全重量に対する重量で約５％〜約７０％、より具体的には約２０％〜約５０％である。
【００６０】
生体組織での使用では、第１の水溶液もしくは分散液、および第２の水溶液もしくは分散液は、感染を防止するために殺菌することが好ましい。反応して有効なヒドロゲルを生成する成分の能力に悪影響を及ぼさない方法であれば、当該技術分野で知られている任意の好適な殺菌法を使用することができ、特に限定はされないが、例えば、電子ビーム照射、ガンマ線照射、エチレンオキサイドによる殺菌、または０．２μｍ孔の膜によるろ過などの方法が挙げられる。
【００６１】
第１の水溶液もしくは分散液、および第２の水溶液もしくは分散液は、意図する用途に応じて各種添加剤をさらに含んでいてもよい。添加剤はヒドロゲルの生成に有効なゲル化を阻害しないことが好ましい。添加剤の使用量は特定の用途に依存するものの、当業者であれば通常の実験により容易に決定することができる。例えば、第１の水溶液もしくは分散液および／または第２水溶液もしくは分散液は、ｐＨ調整剤、抗菌剤、着色剤、界面活性剤、調合薬および治療薬から選択される少なくとも１つの添加剤を含むことができる。
【００６２】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、溶液または分散液のｐＨを調整するために、少なくとも１種のｐＨ調整剤を含んでいてもよい。好適なｐＨ調整剤は当該技術分野ではよく知られている。ｐＨ調整剤は酸性化合物であっても塩基性化合物であってもよい。酸性ｐＨ調整剤の例としては、カルボン酸、無機酸およびスルホン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩基性ｐＨ調整剤としては、水酸化物、アルコキシド、第１および第２アミンを除く窒素含有化合物、並びに塩基性炭酸塩およびリン酸塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、少なくとも１種の抗微生物剤を含んでいてもよい。好適な抗微生物性保存剤は当該技術分野ではよく知られている。好適な抗微生物剤の例として、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベンおよびブチルパラベンなどのアルキルパラベン；トリクロサン；クロルヘキシジン；クレゾール；クロロクレゾール、ヒドロキノン；安息香酸ナトリウム；および安息香酸カリウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、溶液または分散液の視認性を上げるために、少なくとも１種の着色剤を含んでいてもよい。好適な着色剤としては、染料、顔料および天然着色剤が挙げられる。好適な着色剤の例としては、ＦＤ＆ＣバイオレットＮｏ．２、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．１、Ｄ＆ＣグリーンＮｏ．６、Ｄ＆ＣグリーンＮｏ．５、Ｄ＆ＣバイオレットＮｏ．２などのＦＤ＆ＣおよびＤ＆Ｃ着色剤；並びにビートルートレッド、カンタキサンチン、クロロフィル、エオシン、サフランおよびカルミンなどの天然着色剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、少なくとも１種の界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤は、本明細書では、水の表面張力を低下させる化合物をいう。界面活性剤はラウリル硫酸ナトリウムなどのイオン性界面活性剤であっても、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンなどの中性界面活性剤であってもよい。
【００６６】
さらに、第１の水溶液もしくは分散液および／または第２の水溶液もしくは分散液は、少なくとも１種の薬剤または治療薬を含んでいてもよい。好適な薬剤または治療薬は当該技術分野ではよく知られている（例えば、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）（ＵＳＰ）、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ 第１８版、Ｍａｒｋ Ｈ．Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｅｒｋｏｗ（編）、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、２００６；または動物の場合、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第９版、Ｋａｈｎ、Ｃ．Ａ．（編）、Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、２００５を参照）。例としては、抗炎症薬、例えばプレドニゾン、デキサメタゾン、ブデソニドなどのグルココルチコイド；インドメタシン、サリチル酸アセテート、イブプロフェン、スリンダク、ピロキシカムおよびナプロキセンなどの非ステロイド性抗炎症薬；組織プラスミノーゲン活性化剤およびストレプトキナーゼなどの線維素溶解薬；ヘパリン、ヒルジン、アンクロッド、ジクマロール、シンクマール、イロプロスト、Ｌ−アルギニン、ジピラミドールおよび他の血小板機能阻害剤などの抗凝血剤；抗体；核酸；ペプチド；ホルモン；成長因子；サイトカイン；ケモカイン；凝固因子；内因性凝固阻止物質；抗菌剤；抗ウィルス剤；抗真菌薬；抗ガン剤；細胞癒着阻止物質；治癒促進剤；ワクチン；トロンビン、フィブリノーゲン、ホモシステインおよびエストラムスチンなどの血液凝固剤；硫酸バリウムおよび金粒子などの放射線不透過化合物、並びに放射標識が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
さらに、マルチアームアミンを含有する第２の水溶液もしくは分散液は、疎水性または修飾された架橋密度などの他の有益な特性を付与するために、１つ以上の第１アミン基を有する少なくとも１種の他の多官能性アミンを含んでいてもよい。多官能性アミンは、水溶液もしくは分散液中で酸化ポリサッカリドと混合するとゲル化を引き起こすことができる。多官能性アミンは、上記したような第２の水分散性マルチアームアミンであっても、他のタイプの多官能性アミン（ジアミノアルカン、ポリアミノアルカンおよびスペルミンなどの直鎖および分枝ジアミン；ポリエチレンイミンなどの分枝ポリアミン；Ｎ，Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、５−アミノ−１，３，３−トリメチルシクロヘキサンメチルアミン、１，３−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、１，４−ジアミノシクロヘキサンおよびｐ−キシレンジアミンなどの環状ジアミン；３−アミノプロピルトリメトキシシランおよび３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノアルキルトリアルコキシシラン；３−アミノプロピルジエトキシメチルシランなどのアミノアルキルジアルコキシアルキルシラン、アジピン酸ジヒドラジドなどのジヒドラジド；直鎖ポリエチレンイミン、α，ω−アミノ末端ポリエーテル、α，ω−ビス（３−アミノプロピル）ポリブタンンジオール、β，ω−１−アミノ末端ポリエーテル（直鎖 Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標））などの直鎖ポリマージアミン；キトサン、ポリアリルアミンおよびポリリシンなどの櫛形ポリアミン、並びにビス（カルボキシヒドラジド）ポリエーテルおよびポリ（カルボキシヒドラジド）星形ポリエーテルなどのジ−およびポリヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されるものではない）であってもよい。これらの化合物の多くは、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＨｕｎｔｓｍａｎ ＬＬＣなどの会社から商業的に入手することができる。多官能性アミンを含む場合、通常、水溶液もしくは分散液中のマルチアームアミンの重量に対し約５重量％〜約１０００重量％の濃度で使用される。
【００６８】
第１の水溶液もしくは分散液と第２の水溶液もしくは分散液を混合すると、それらは反応して、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを含み、そして、少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンが、アルデヒド官能性ポリサッカリドのペンダントアルデヒド基と水分散性マルチアームアミンの第１アミン基との間に形成された共有結合を介して架橋している、架橋ヒドロゲル組成物を生成する。共有結合は、イミン結合であっても、アミナール結合であっても、ヘミアミナール結合であってもよい。ヒドロゲルの分解時間は、後述する実施例で示すように、第１の水溶液もしくは分散液中のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、第２の水溶液もしくは分散液中の水分散性マルチアームアミンの、重量パーセントを単位とした使用量の変更、および／あるいは、水分散性マルチアームアミンのアミン、またはアルデヒド官能性ポリサッカリドアルデヒドのアルデヒドの官能基数の変更により、意図する用途の必要に応じて調整することができる。
【００６９】
第１の水溶液もしくは分散液と第２の水溶液もしくは分散液は、生体組織解剖部位にコーティングを施すのに使用してもよい。これらの２種類の水溶液もしくは分散液は、その部位に、いかなる方法で塗布してもよい。両溶液もしくは分散液がある部位上で混合されると、これらは架橋してヒドロゲルを生成し、その部位にコーティングが施される。
【００７０】
一実施形態では、２種の水溶液もしくは分散液は、スプレー、綿の棒もしくはブラシによるブラッシング、またはピペットもしくはシリンジを使用した押出しなどの任意の好適な手段で連続的にその部位に塗布されるが、これらの手段に限定されるものではない。溶液または分散液はいかなる順序で塗布してもよい。その後、溶液または分散液は、その部位上で、綿棒、スパチュラ、またはピペットもしくはシリンジの先端などの任意の好適な用具を使用して混合される。
【００７１】
他の一実施形態では、２種類の水溶液もしくは分散液は、その部位に塗布する前に手で混合される。その後、得られた混合物を、それが完全に硬化する前に、上記のような好適な塗布用具を使用してその部位に塗布する。
【００７２】
他の一実施形態では、第１の水溶液もしくは分散液と第２水溶液もしくは分散液を、その部位に同時に塗布し、そこで混合してヒドロゲルを生成する。例えば、２種類の水溶液もしくは分散液は、ダブルバレルシリンジの別個のバレルにそれぞれ充填することができる。この方法では、２種類の水溶液もしくは分散液は、シリンジにより同時にその部位に塗布される。好適なダブルバレルシリンジ塗布装置は当該技術分野で知られている。例えば、Ｒｅｄｌは、米国特許第６，６２０，１２５号明細書（特に、第４欄第１０行〜第６欄４７行で説明されている図１、５および６）に、数種のその発明で使用するのに適した塗布装置を記載している。２種類の水溶液もしくは分散液は、また、Ｂｉｓｔｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）から入手できるようなダブルルーメンカテーテルを使用してその部位に塗布することができる。さらに、当該技術分野では、２種類の液体成分を内視鏡的に体内へ同時に導入するための注入装置が知られており、本明細書中に開示する２種類の水溶液もしくは分散液の配送に適合させることも可能である（例えば、Ｌｉｎｄｅｒら、米国特許第５，３２２，５１０号明細書を参照）。
【００７３】
他の一実施形態では、第１の水溶液もしくは分散液と第２の水溶液もしくは分散液を、ＣｏｎＰｒｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）またはＭｉｘｐａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ（Ｒｏｔｋｒｕｅｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手できるような静的ミキサーを備えるダブルバレルシリンジを使用して予備混合し、その部位へ配送することができる。あるいは、Ｃｒｕｉｓｅらが米国特許第６，４５８，１４７号明細書で記載しているようなスプレーヘッドを混合チップに装着してもよい。さらに、２種類の水溶液もしくは分散液の混合物をダブルバレルシリンジからカテーテルまたは内視鏡を使用してその部位へ塗布することができる。２種類の液体成分組織接着剤を混合し、得られた混合物を内視鏡的に配送する装置は当該技術分野で知られており、本明細書中に開示する２種類の水溶液もしくは分散液の混合および配送に適合させることができる（例えば、Ｎｉｅｌｓｏｎ、米国特許第６，７２３，０６７号明細書、およびＲｅｄｌら、米国特許第４，６３１，０５５号明細書を参照）。
【００７４】
他の一実施形態では、２種類の水溶液もしくは分散液は、Ｆｕｋｕｎａｇａら（米国特許第５，５８２，５９６号明細書）、Ｄｅｌｍｏｔｔｅら（米国特許第５，９８９，２１５号明細書）またはＳａｗｈｎｅｙ（米国特許第６，１７９，８６２号明細書）が記載しているようなスプレー装置を使用してその部位に塗布することができる。
【００７５】
他の一実施形態では、２種類の水溶液もしくは分散液は、Ｓａｗｈｎｅｙ（米国特許第７，３４７，８５０号明細書）が記載しているような低侵襲手術用塗布装置を使用してその部位に塗布することができる。
【００７６】
他の一実施形態では、本発明のヒドロゲル組織接着剤は、少なくとも２つの解剖学的部位を接着するために使用される。この実施形態では、第１の水溶液もしくは分散液を少なくとも１つの解剖学的部位に塗布し、第２の水溶液もしくは分散液を同じ部位か、または他方の部位のいずれかの少なくとも１つに、上記の方法を使用して塗布する。２つ以上の部位を接触させ、手、または外科用クランプなどの他の手段により、混合物が硬化するのに十分な時間保持する。あるいは、２種類の水溶液もしくは分散液の混合物を、接着すべき解剖学的部位の少なくとも１つに、上記の方法を使用して塗布する。２つ以上の部位を接触させ、手、または外科用クランプなどの他の手段により、混合物が硬化するのに十分な時間保持する。
【００７７】
他の一実施形態では、アルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンは、細かく粉砕した粉末の形態で使用することができる。粉末は任意の好適な方法を使用して調製することができる。例えば、上記の各水溶液もしくは分散液を、熱、真空、熱と真空の組み合わせにより、または凍結乾燥により乾燥させて、粉末を生成することができる。粉末は、グラインダーによる粉砕、ミルによる粉砕、または乳鉢と乳棒による粉砕など（これらに限定されるものではない）、当該技術分野で知られた方法を用いてより微細な粒子に粉砕してもよい。微細に粉砕された粉末は、上記の方法により殺菌することができる。微細に粉砕された粉末は種々の方法で生体組織の解剖学的部位に塗布することができる。例えば、粉末は、散布またはスプレーすることにより、その部位に任意の順序で個別に塗布することができる。さらに、粉末は予備混合した後、得られた混合物をその部位に散布またはスプレーすることにより塗布することができる。粉末は、水または好適な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）などの水溶液を添加することにより、あるいはその部位に存在する生理液により、その部位で水和させることができる。微細に粉砕された粉末はまた、水溶液もしくは分散液について上で記載したように、２つの解剖学的部位を接着するために使用することができる。あるいは、粉末は、使用の前に水または好適な水溶液で水和して、上記の第１および第２の水溶液もしくは分散液を生成することができる。
【００７８】
他の一実施形態では、本明細書中に開示するヒドロゲル組織接着剤は、乾燥ヒドロゲルの形態で使用することができる。この実施形態では、乾燥ヒドロゲルは、ある溶媒中で、少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを混合してヒドロゲルを生成させ、このヒドロゲルを処理して少なくとも１部の溶媒を除去して乾燥ヒドロゲルを生成することにより調製される。好適な溶媒としては、水、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。２種の異なる溶媒を使用する場合、それらの溶媒は互いに混和性を有する。一実施形態では、溶媒は水である。アルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミンは種々の方法で混合することができる。例えば、アルデヒド官能性ポリサッカリドを含む第１の水溶液もしくは分散液と水分散性マルチアームアミンを含む第２の水溶液もしくは分散液は、上記のように調製し、混合して、ヒドロゲルを生成させることができる。ヒドロゲルを調製するために使用される溶液または分散液は、意図する用途に応じて各種添加剤をさらに含むことができる。上記の任意の添加剤を使用することができる。その後、ヒドロゲルを処理して、それに含まれる少なくとも１部の溶媒を除去し、乾燥ヒドロゲルを生成させる。実質的に全ての溶媒がヒドロゲルから除去されることが好ましい。溶媒は、当該技術分野で知られた方法、例えば、熱、真空、熱と真空の組み合わせの使用、あるいはヒドロゲル上に乾燥空気または窒素などの乾燥不活性ガスの流れを流すなどの方法により、ヒドロゲルから除去することができる。乾燥ヒドロゲルは、上述した方法により殺菌することができる。乾燥ヒドロゲルは、後述するように、多くの方法で解剖学的部位に塗布することができる。乾燥ヒドロゲルは、その部位で、水または緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）などの好適な水溶液を添加することにより、あるいはその部位に存在する生理液により、水和させることができる。
【００７９】
一実施形態では、乾燥ヒドロゲルは、フィルムの形態で使用することができる。乾燥ヒドロゲルフィルムは、上記のような溶液または分散液の混合物を適当な基材上にキャスティングし、得られたヒドロゲルを処理して乾燥ヒドロゲルフィルムを形成することにより作製することができる。乾燥ヒドロゲルフィルムは、解剖学的部位に直接貼付することができる。さらに、乾燥ヒドロゲルフィルムは２つの解剖学的部位を接着するために使用することができる。
【００８０】
他の一実施形態では、乾燥ヒドロゲルは、微細に粉砕した粒子の形態で使用することができる。乾燥ヒドロゲル粒子は、乾燥ヒドロゲルを、グラインダーによる粉砕、ミルによる粉砕、または乳鉢と乳棒による粉砕など（これらに限定されるものではない）、当該技術分野で知られた方法を用いて粉砕することにより生成することができる。乾燥ヒドロゲル粒子は、散布またはスプレーなどの種々の方法で解剖学的部位に塗布することができ、また、２つの解剖学的部位を接着するために使用することができる。
【００８１】
キット
一実施形態では、本発明は、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基により終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを含むキットを提供する。
【００８２】
他の一実施形態では、キットは、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドを含む第１の水溶液もしくは分散液と、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基により終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを含む第２の水溶液もしくは分散液とを含む。水溶液もしくは分散液のそれぞれは、バイアルまたはシリンジバレルなどの任意の好適な容器に充填することができる。
【００８３】
他の一実施形態では、キットは、上述したように、微細に粉砕された粉末の形態で、ペンダントアルデヒド基を有する少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと、少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基により終端されている少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを含む。粉末は、個別の容器に充填されてもよく、あるいは予備混合して単一の容器に充填されてもよい。キットはまた、粉末を水和するための水溶液を含んでいてもよい。
【００８４】
他の一実施形態では、キットは上述したような乾燥ヒドロゲルを含む。乾燥ヒドロゲルは、フィルムの形態であっても、微細に粉砕された粒子の形態であっても、他の乾燥された形態であってもよい。キットは、乾燥ヒドロゲルを水和するための水溶液をさらに含んでいてもよい。乾燥ヒドロゲル粒子は任意の好適な容器に充填することができる。
【００８５】
医療用途
本明細書中に開示するヒドロゲルは、外傷または手術に起因する、望ましくない組織−組織間癒着の防止（これには限定されない）といった、より急速な分解時間が要求される医療用途の組織接着剤または封止剤として有用であり得る。これらの用途では、アルデヒド官能性ポリサッカリドと水分散性マルチアームアミン、または乾燥ヒドロゲルは、上記の方法により、所望の解剖学的部位に塗布することができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例により、本発明をさらに明示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、単に説明のために示されるべきである。上記説明とこれらの実施例から、当業者であれば本発明の基本的特徴を確かめることができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明に各種の変更と修正を加え、各種の使用および条件に本発明を適合させることができる。
【００８７】
試薬の調製
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１５−９０）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１５ｋＤａの重量平均分子量と約９０％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをアリルグリシジルエーテルと反応させてオレフィン中間体を生成し、その後、これをオゾンと反応させてペンダントアルデヒド基を有するデキストランを生成した。
【００８８】
第１工程では、３０ｇのデキストラン（平均分子量９〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）および３０ｍＬの水を３つ口フラスコに加えた。溶液を１０℃に冷却し、その後、２０重量％ＮａＯＨ溶液３９ｍＬを加えた。得られた溶液を２５分間撹拌し、淡い黄色の溶液を得、その後、８４．５８ｇ（４当量）のアリルグリシジルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。得られた混合物を６５℃まで５．５時間加熱し、その後、室温まで冷却してから、１ＮのＨＣｌでｐＨを７．０に調整した。２００ｍＬの水を加えて混合物を希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、最初の溶液の体積の５倍がろ液として捕集されるまで、純水で連続的にろ液を置換しながら、１ｋＤａのカットオフフィルターを通してろ過することにより精製した。少量のサンプルを採取し、分析用として凍結乾燥させた。残りのろ液を、続くオゾン分解工程でそのまま使用した。置換率を、プロトンＮＭＲにより、４．８〜５．０におけるオレフィンピークとアノマーピークの積分比から測定したところ、１．３３であった。
【００８９】
第２工程では、工程１で得られた４６０ｍＬのろ液を、マグネチック撹拌棒およびスパージャーの注入口を備えた２Ｌの三つ口フラスコに加えた。氷浴中で０〜５℃に溶液を冷却し、オゾン発生機（ＣｌｅａｒＷａｔｅｒ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ．、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ；型番ＣＤ１０）から７％のオゾンを発生する１００％パワーでオゾンの噴霧を開始した。発泡が生じ、これを１−ヘプタノールを数滴加えて制御した。６．２５および７．７５時間にサンプルを採取し、１３−Ｃ ＮＭＲを使用して分析した。１１８および１３４ｐｐｍで共鳴が消失し、７．７５時間後にはオレフィンが消費されていたことを示した。その後、撹拌しながら亜硫酸ナトリウム溶液（１３８ｍＬの水に２３．３ｇ）を滴下した。僅かな発熱が観察され、反応混合物を窒素中で終夜撹拌した。混合物を１Ｌガラス瓶に移し、１ｋＤａのカットオフフィルターを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムによりろ過した。水を連続的に加えて捕集したろ液を置換し、残余分はガラス瓶に戻した。最初の反応物体積の５倍超がろ液として捕集されるまでこの工程を継続した。その後、精製した溶液を冷凍し凍結乾燥して、綿毛のような白色固体５３．９ｇを得た。得られた固体生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：４００、１９９１）の方法を使用して測定したところ、８９％であった。アルデヒド官能性デキストランの重量平均分子量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定したところ、約１５ｋＤａであった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１５−９０と称する。
【００９０】
同様の方法で、このアルデヒド官能性デキストランの第２の調製を行った。得られた生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌの方法を使用して測定したところ、９２％であり、重量平均分子量は、ＳＥＣにより、１６ｋＤａであることがわかった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１６−９２と称する。
【００９１】
ペンダントアルデヒド基を有するイヌリン（ＡＦＩ−１２−４９）の調製：
上記２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１２ｋＤａの重量平均分子量と約４９％のアルデヒド置換率を有するイヌリンを調製した。
【００９２】
第１工程では、２０ｇのイヌリン（平均分子量約４ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）を２００ｍＬの水に懸濁させ、７０℃まで１時間加熱して溶解し、その後、６５℃に冷却した。この溶液に２３ｍＬの水酸化ナトリウム溶液（水に２０重量％）を加え、続いてシリンジポンプによりアリルグリシジルエーテル（５０．７ｇ）を３ｍＬ／ｍｉｎの速度で徐々に加えた。添加後、混合物を６５℃まで６時間加熱した。その後、反応混合物を室温にまで冷却し、５０％ＨＣｌによりｐＨ７に中和した。１０００ＭＷＣＯ膜による限外ろ過により反応混合物を精製した（廃棄物の１０倍の体積を捕集）。
1Ｈ ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）：ｄ ５．９５ｐｐｍ（ｍ，積分値１．０，ＯＣＨ2Ｃ（Ｈ）＝ＣＨ2）、５．３１（ｄｄ，積分値２．１，ＯＣＨ２（ＣＨ）＝ＣＨ2）、４．３７（ｂｒ．ｓ，積分値０．４０）、４．２５（ｂｒ．ｓ，積分値０．７６）、４．０〜３．５５（ｂｒ．ｍ，積分値１２．９）
【００９３】
第２工程では、氷／水浴を使用してろ液を約５℃に冷却した。撹拌されている溶液中にオゾンを６時間噴霧した。１−ヘプタノールを加えて（数滴）発泡を制御した。反応の終点で亜硫酸ナトリウム溶液（１００ｍＬの水に１６ｇ）を冷却した溶液（氷／水浴中で冷却）に加えた。溶液を室温で終夜撹拌した。生成物を限外ろ過により精製した（ＭＷＣＯ１０００、廃棄物の１２倍の体積を捕集）。ろ液を凍結乾燥し白色固体を得た。
【００９４】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝１．２×１０4、Ｍn＝７．３×１０3、Ｍz＝１．５×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．６。
【００９５】
アルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、イヌリンアルデヒドのヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、約４９％であった。本明細書では、このアルデヒド官能性イヌリンをＡＦＩ−１２−４９と称する。
【００９６】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−７−８６）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約５〜１１ｋＤａの重量平均分子量と８６％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約５〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをグリシドールと反応させて、アルキル化デキストランを生成した。第２工程では、アルキル化デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化して、第１工程で付加した末端ジオール基を酸化してペンダントアルデヒド基を有するデキストランを得た。
【００９７】
第１工程では、２０ｇのデキストラン（平均分子量５〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）を２０ｍＬの水に懸濁させ、５５℃に加熱した。この溶液に２５ｍＬの水酸化ナトリウム溶液（水に２０重量％）を加え、続いてシリンジポンプによりグリシドール（３６ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を５５℃で、１．０ｍＬ／ｍｉｎの速度で徐々に加えた。その後、混合物を５５℃まで６時間加熱し、続いて混合物を室温にまで冷却した。生成物を２０ｍＬのエーテルで２回洗浄し、過剰の試薬を除去した。得られた黄色の均質混合物を氷上で５０％のＨＣｌにより中和した（最終ｐＨは７．３であった）。サンプルを約５倍の体積の冷イソプロパノール中（約０℃）で沈殿させた。イソプロパノール層をデカンテーションにより除去し、固体生成物を冷イソプロパノールで洗浄し、溶解とそれに続く沈殿プロセスをさらに２回繰り返した。固体生成物を真空中で４８時間乾燥した。
【００９８】
第２工程では、第１工程で得られた１５ｇの固体生成物を丸底フラスコ中の１５０ｍＬの水に溶解させ、その後、得られた溶液を４℃に冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム溶液（８５ｍＬの水に８．２５ｇ）を３０分にわたって丸底フラスコに滴下した。反応混合物を４℃で２時間撹拌し、その後、反応混合物に１０．４ｇ（９．３ｍＬ）のエチレングリコールを加え、続いて１０分間撹拌した。生成物を、カットオフ分子量１０００の膜を備えたＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して精製し、凍結乾燥させて１０ｇの白色粉末を得た。生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、８６％であった。
【００９９】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝７．４×１０3、Ｍn＝４．８×１０3、Ｍz＝１．１×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．５。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−７−８６と称する。
【０１００】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−９−１２０）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約９ｋＤａの重量平均分子量と１２０％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約５〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをグリシドールと反応させてアルキル化デキストランを生成した。第２工程では、アルキル化デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化し、第１工程で付加した末端ジオール基を酸化してペンダントアルデヒド基を有するデキストランを得た。
【０１０１】
第１工程では、３バッチのデキストランをグリシドールと反応させてアルキル化デキストランを生成した。バッチのうち２つでは、ＡＦＤ−７−８６を調製した上記第１工程と同じ方法で、２０ｇのデキストラン（平均分子量５〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）をグリシドール（３６ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）と反応させた。第３のバッチでは、デキストランに対するグリシドールのモル比を変えた。１０ｍＬの水と１２．５ｍＬの水酸化ナトリウム溶液（２０重量％）とを混合して生成した溶液にデキストラン（１０ｇ）を溶解した。シリンジポンプを使用して、デキストラン溶液にグリシドール（４４ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．７ｍＬ／ｍｉｎの速度で加えた。混合物を５５℃に加熱し、２０ｍＬの水を加えた。反応混合物を５５℃まで６時間加熱した。ＡＦＤ−７−８６について上で記載したようにして、生成物を単離した。３バッチを混合し、第２工程用材料のマスターバッチとした。
【０１０２】
第２工程では、上記マスターバッチからの２５ｇの固体生成物を、丸底フラスコ中の２５０ｍＬの水に溶解し、その後、得られた溶液を４℃に冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１２５ｍＬの水に２０．８ｇ）を１時間にわたって丸底フラスコに滴下した。反応混合物を４℃で２時間撹拌し、その後、反応混合物に６６ｇのエチレングリコールを加え、続いて３０分間撹拌した。その後、反応混合物をろ過した。ろ液を、カットオフ分子量１０００の膜を備えたＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ））を使用して精製し、凍結乾燥させて１７ｇの白色粉末を得た。生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、１２０％であった。
【０１０３】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝８．９×１０3、Ｍn＝６．８×１０3、Ｍz＝１．２×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．３。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−９−１２０と称する。
【０１０４】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１３−６４）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１３ｋＤａの重量平均分子量と６４％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約５〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをグリシドールと反応させてアルキル化デキストランを生成した。第２工程では、アルキル化デキストランを過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化し、第１工程で付加した末端ジオール基を酸化してペンダントアルデヒド基を有するデキストランを得た。
【０１０５】
第１工程はＡＦＤ−９−１２０について上で記載したように行った。第２工程では、ＡＦＤ−９−１２０について上で記載したアルキル化デキストランのマスターバッチからの固体生成物２５ｇを、丸底フラスコ中の２５０ｍＬの水に溶解し、その後、得られた溶液を４℃に冷却した。過ヨウ素酸ナトリウム溶液（６０ｍＬの水に１０．４ｇ）を１時間にわたって丸底フラスコに滴下した。反応混合物を４℃で２時間撹拌し、その後、反応混合物に６ｇのエチレングリコールを加え、続いて３０分間撹拌した。その後、反応混合物をろ過した。ろ液を、カットオフ分子量１０００の膜を備えたＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して精製し、凍結乾燥させて１７ｇの白色粉末を得た。生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、６４％であった。
【０１０６】
生成物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析から、以下が得られた：Ｍw＝１．３×１０4、Ｍn＝９．８×１０3、Ｍz＝１．８×１０4、Ｍw／Ｍn＝１．３。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１３−６４と称する。
【０１０７】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１３−４６）の調製：
２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１３ｋＤａの重量平均分子量と４６％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。第１工程では、約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストランをアリルグリシジルエーテルと反応させてオレフィン中間体を生成し、その後、これをオゾンと反応させてペンダントアルデヒド基を有するデキストランを生成した。
【０１０８】
第１工程では、３０ｇのデキストラン（平均分子量９〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）および３０ｍＬの水を３つ口フラスコに加えた。溶液を１０℃に冷却し、その後、２０重量％ＮａＯＨ溶液３９ｍＬを加えた。得られた溶液を２５分間撹拌し、淡い黄色の溶液を得、その後、４２．２７ｇ（２当量）のアリルグリシジルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。得られた混合物を６５℃まで５．５時間加熱し、その後、室温にまで冷却してから、１ＮのＨＣｌでｐＨを７．０に調整した。２００ｍＬの水を加えて混合物を希釈し、１ｋＤａのカットオフフィルターを使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）により、最初の溶液の体積の５倍がろ液として捕集されるまで、純水で連続的にろ液を置換しながら精製した。少量のろ液サンプルを採取し、分析用として凍結乾燥させた。残りのろ液を、続くオゾン分解工程でそのまま使用した。置換率を、ＮＭＲによりアノマー共鳴に対するオレフィンのピークを積分したところ、０．８４であることがわかった。
【０１０９】
第２工程では、工程１で得られた４７５ｍＬのろ液を、マグネチック撹拌棒およびスパージャー注入口を備えた２Ｌの３つ口フラスコに加えた。氷浴中で０〜５℃に溶液を冷却し、その後、オゾン発生機（ＣｌｅａｒＷａｔｅｒ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ．、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ；型番ＣＤ１０）から７％のオゾンを発生する１００％パワーでオゾンの噴霧を開始した。発泡が生じ、これを１−ヘプタノールを数滴加えて制御した。２および４時間にサンプルを採取し、１３−Ｃ ＮＭＲを使用して分析した。１１８および１３４ｐｐｍで共鳴が消失し、４時間後にはオレフィンが消費されていたことを示した。その後、撹拌しながら亜硫酸ナトリウム溶液（１１７ｍＬの水に１９．６ｇ）を滴下した。僅かな発熱が観察され、反応混合物を窒素中で終夜撹拌した。混合物を１Ｌのガラス瓶に移し、１ｋＤａのカットオフフィルターを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムでろ過した。水を連続的に加えて捕集したろ液を置換し、残余分はガラス瓶に戻した。最初の反応物体積の５倍超がろ液として捕集されるまでこの工程を継続した。その後、精製した溶液を冷凍し凍結乾燥して、綿毛のような白色固体２８．６ｇを得た。得られた固体生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，８：４００）の方法を使用して測定したところ、４６％であった。アルデヒド官能性デキストランの重量平均分子量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して測定したところ、約１３ｋＤａであった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１３−４６と称する。
【０１１０】
ペンダントアルデヒド基を有するデキストラン（ＡＦＤ−１９−６４）の調製：
上記２段階法により、ペンダントアルデヒド基を有し、かつ約１９ｋＤａの重量平均分子量と６０％のアルデヒド置換率を有するデキストランを調製した。
【０１１１】
第１工程では、３０ｇのデキストラン（平均分子量９〜１１ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）および３０ｍＬの水を３つ口フラスコに加えた。溶液を１０℃に冷却し、その後、２０重量％ＮａＯＨ溶液３９ｍＬを加えた。得られた溶液を２５分間撹拌し、淡い黄色の溶液を得、その後、６３．４１ｇ（３当量）のアリルグリシジルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。得られた混合物を６５℃まで５．５時間加熱し、その後室温にまで冷却してから１ＮのＨＣｌでｐＨを７．０に調整した。２００ｍＬの水を加えて混合物を希釈し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムを使用して、最初の溶液の体積の５倍がろ液として捕集されるまで純水で連続的にろ液を置換しながら、１ｋＤａのカットオフフィルターを通してろ過することにより精製した。少量のサンプルを採取し、分析用として凍結乾燥させた。残りのろ液を、続くオゾン分解工程でそのまま使用した。置換率を、ＮＭＲにより、４．８〜５．０におけるオレフィンピークとアノマーピークの積分比から測定したところ、０．９９であった。
【０１１２】
第２工程では、第１工程で得られた４７５ｍＬのろ液を、マグネチック撹拌棒およびスパージャー注入口を備えた２Ｌの３つ口フラスコに加えた。氷浴中で０〜５℃に溶液を冷却し、その後、オゾン発生機（ＣｌｅａｒＷａｔｅｒ Ｔｅｃｈ，ＬＬＣ．、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ、ＣＡ；型番ＣＤ１０）から７％のオゾンを発生する１００％パワーでオゾンの噴霧を開始した。発泡が生じ、これを１−ヘプタノールを数滴加えて制御した。４および５．７５時間にサンプルを採取し、１３−Ｃ ＮＭＲを使用して分析した。１１８および１３４ｐｐｍで共鳴が消失し、５．７５時間後にはオレフィンが消費されていたことを示した。その後、撹拌しながら亜硫酸ナトリウム溶液（１３９ｍＬの水に２３．３ｇ）を滴下した。僅かな発熱が観察され、反応混合物を窒素中で終夜撹拌した。混合物を１Ｌのガラス瓶に移し、１ｋＤａのカットオフフィルターを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムによりろ過した。水を連続的に加えて捕集したろ液を置換し、残余分はガラス瓶に戻した。最初の反応物体積の５倍超がろ液に捕集されるまでこの工程を継続した。その後、精製した溶液を冷凍し凍結乾燥して、綿毛のような白色固体３９．１ｇを得た。得られた固体生成物のアルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，８：４００）の方法を使用して測定したところ、６０％であった。アルデヒド官能性デキストランの重量平均分子量を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定したところ、約１９ｋＤａであった。本明細書では、このアルデヒド官能性デキストランをＡＦＤ−１９−６４と称する。
【０１１３】
ペンダントジアルデヒド基を有するデキストラン（ＤＡＦＤ−１０−１６）の調製：
３段階法により、ペンダントジアルデヒド基がデキストラン主鎖にエーテル結合で結合しているジアルデヒド官能性デキストランを調製した。
【０１１４】
工程１：
マグネチック撹拌棒および窒素導入口を備えた３００ｍＬの２口フラスコに、４０重量％の水酸化ナトリウム溶液７３．４ｍＬと臭化テトラブチルアンモニウム０．９４ｇ（２．９１ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を５〜１０℃に冷却し、５．０ｇ（５９．４４ｍｍｏｌ）の３−シクロペンテン−１−オールで処理し、続いて、２０分にわたって２２．０ｇ（２３７．７６ｍｍｏｌ）のエピクロロヒドリンを滴下した。反応混合物を室温で終夜撹拌した。その後、反応混合物を約５０ｍＬの氷／水に注ぎ、撹拌して溶液を得、これを５０ｍＬのジエチルエーテルで３回抽出した。結合した有機層をリトマスで中性になるまで塩水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させた。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して茶色の液体を得た。粗生成物を蒸留により精製した。生成物を１１８℃、２５ｍｍＨｇ（３．３ｋＰａ）で捕集した。
ＣＤＣｌ3中1Ｈ ＮＭＲのδｐｐｍ（２．４２，ｍ，２Ｈ；２．５，ｍ，１Ｈ；２．６，ｍ，２Ｈ、２．７８、ｍ、１Ｈ；３．１５、ｍ、１Ｈ；３．４、ｍ、１Ｈ；３．６５〜３．６８，ｍ，１Ｈ；４．２６，ｍ，１Ｈ；５．６８ｓ，２Ｈ）
【０１１５】
工程２：
０．５８ｍＬの水、続いて約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストラン０．５７７８ｇ（３．５６７ｍｍｏｌ）を、マグネチック撹拌棒および還流冷却器を備えた、１０ｍＬの窒素導入口付２口フラスコに入れた。溶液を撹拌して懸濁液とした。２０重量％ＮａＯＨ溶液０．７５ｍＬをフラスコに加えた。３０分間、撹拌した後、１．０ｇ（７．１３４ｍｍｏｌ）のグリシジル３−シクロペンテニルエーテルを加えた。溶液を油浴中で６５℃で５．５時間加熱した。その後、反応混合物を室温にまで冷却し、０．５ＭのＨＣｌによりｐＨを７．０に調整した。得られた溶液を水で約４００ｍＬにまで希釈し、その後、カットオフ分子量が１０００のカセットを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムを使用して精製した。少量のアリコットを分析用に凍結乾燥させた。
Ｄ2Ｏ中で1Ｈ ＮＭＲを得た。δｐｐｍ（２．２，ｄ；２．４，ｄ；３．３１〜３．７，ｍ；４．１，ｓ；４．７７，ｓ；４．９，ｓ（ｂ）；５．５５，ｓ）
【０１１６】
溶液の残りをオゾンで処理して官能性デキストランを得た。置換率を、ＮＭＲから５．０〜５．２ｐｐｍのアノマーピーク対オレフィンピークの積分により測定した。置換率は０．５２であることがわかった。
【０１１７】
工程３：
４００ｍＬの官能性デキストラン水溶液（前工程から）を含有する、１Ｌの３つ口フラスコ（約８℃）に、オゾンを５．５時間噴霧した。オゾンの流れを停止し、３ｍＬの水に０．４５ｇの亜硫酸ナトリウムを溶解した溶液を８℃でフラスコに加えた。溶液を終夜撹拌し、１０００ＭＷＣＯのカセットを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムによる限外ろ過により精製した。最終溶液を冷凍し凍結乾燥させて０．６８ｇの泡状の固体を得た。
Ｄ2Ｏ中で1Ｈ ＮＭＲを得た。δｐｐｍ（１．３１８，ｍ；１．５２３，ｍ；１．８，ｍ；２．１，ｍ；２．３〜２．４８，ｍ；３．３〜３．９，ｍ；４．９，ｓ；５．１，ｓ（ｂ）；５．５，ｓ）
【０１１８】
アルデヒド置換率を、ＺｈａｏおよびＨｅｉｎｄｅｌ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：４００、１９９１）が記載している方法を使用し、ジアルデヒド官能性デキストランのヒドロキシルアミン付加物を滴定することにより測定したところ、約１６％であった。本明細書では、このジアルデヒド官能性デキストランをＤＡＦＤ−１０−１６と称する。
【０１１９】
ペンダントジアルデヒド基を有するデキストラン（ＤＡＦＤ−エステル結合）の調製：
２段階法により、ペンダントジアルデヒド基がデキストラン主鎖にエステル結合で結合しているジアルデヒド官能性デキストランを調製した。
【０１２０】
工程１：
２２ｍＬのジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、続いて約９〜約１１ｋＤａの重量平均分子量を有するデキストラン１．８１７ｇ（１１．２１７ｍｍｏｌ）および塩化リチウム１．０９ｇ（２５．７１ｍｍｏｌ）を、マグネチック撹拌棒および還流冷却器を備えた５０ｍＬの３つ口フラスコへ入れた。懸濁液を生成し、これを、透明な溶液が得られるまで、９０℃まで１時間加熱した。溶液を室温にまで冷却し、０．９１ｍＬ（１１．２１７ｍｍｏｌ）のピリジンを加え、次いで、２．１８ｇ（１１．２１７ｍｍｏｌ）の３−シクロペンテンカルボニルクロリドを滴下した。４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、Ａｌｄｒｉｃｈ）（３０ｍｇ）を加え、混合物を終夜、すなわち約２０時間、６０℃で加熱した。冷却後、撹拌しながら、得られた茶色の溶液を２００ｍＬの冷水に滴下し、黄色の溶液を得た。０．２５ＮのＮａＯＨ溶液を使用して、ｐＨを２．１５から６．０へ調整した。粗生成物を、カットオフ分子量が１０００のカセットを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムで精製した。少量のアリコットを冷凍し凍結乾燥させて分析試料を得た。
1Ｈ ＮＭＲ。δｐｐｍ（２．５９〜２．６６，ｍ）；（２．８５，ｓ）；（３．０，ｓ）；（３．２４（ｂ），ｓ）；（３．４６〜３．５１，ｍ）；（３．５２〜３．７１，ｍ）；（３．８４，ｄ）；（３．９３，ｄ）；（４．９１，ｓ）；（４．９７，ｓ）；（５．１２、ｔ）；（５．６８、ｓ）
【０１２１】
工程２：
前工程で得られた３５０ｍＬの溶液を含有する、マグネチック撹拌棒を備えた１Ｌの３つ口フラスコ（約８℃）に、オゾン流を５時間噴霧した。オゾン噴霧を停止後、８．４ｍＬの水に１．４１ｇの亜硫酸ナトリウムを溶解した溶液を加えた。得られた混合物を室温で終夜撹拌し、その後、カットオフ分子量が１０００のカセットフィルターを使用したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムを用いて精製した。溶液を冷凍し凍結乾燥させて１．９２ｇの白色固体を得た。
Ｄ2Ｏ中の1Ｈ ＮＭＲが提示された。δｐｐｍ（３．４９〜３．７９，ｍ）；（３．８９〜３．９７，ｍ）；（４．９７ ｄ，（ブロード））；５．１６（ｓ，（ｂ））
【０１２２】
本明細書では、このジアルデヒド官能性デキストランをＤＡＦＤ−エステル結合と称する。
【０１２３】
酸化デキストラン（Ｄ１０−５０）の調製
水溶液中、デキストランをメタ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することにより、デキストランアルデヒドを生成する。Ｃｏｈｅｎ（同時係属中で共願の国際公開第０８／１３３８４７号パンフレット）らが記載している方法により、８，５００〜１１，５００ダルトンの重量％平均分子量を有するデキストラン（Ｓｉｇｍａ）から、約１０，０００Ｄａの平均分子量および約５０％の酸化転化率（すなわち、デキストランポリマー中の約半分のグルコース環が酸化されジアルデヒドになる）を有する酸化デキストランを調製する。典型的な手順をここに記載する。
【０１２４】
機械式撹拌機、添加用ロート、内部温度プローブおよび窒素パージを備えた２０Ｌの反応器に、１０００ｇのデキストランおよび９．００Ｌの脱イオン水を入れる。混合物を室温で撹拌してデキストランを溶解し、その後、１０〜１５℃に冷却する。冷却したデキストラン溶液に、９．００Ｌの脱イオン水に１０００ｇの過ヨード酸ナトリウムを溶解した溶液を、反応温度を２５℃未満に維持しながら１時間にわたって添加する。全ての過ヨード酸ナトリウムを加えたところで、混合物を２０〜２５℃でさらに４時間撹拌する。その後、反応混合物を０℃に冷却し、ろ過して透明にする。塩化カルシウム（５００ｇ）をろ液に加え、混合物を室温で３０分撹拌し、その後、ろ過する。ヨウ化カリウム（４００ｇ）をろ液に加え、この混合物を室温で３０分間撹拌する。得られた赤色溶液の一部３Ｌを、１０〜１５分かけて９．０Ｌのアセトンに加えるが、その間は機械式撹拌機により激しく撹拌する。さらに数分撹拌した後、凝集生成物を上澄み液から分離する。第２のろ液にヨウ化カリウムを加えることにより得られた残りの赤色溶液を、上と同様に処理する。凝集生成物を一緒にしたものを破砕し、大きなステンレス鋼製のブレンダー内で２Ｌのメタノールと混合し、固体が顆粒になるまでブレンドする。顆粒状固体をろ過により回収し、窒素パージしながら真空下で乾燥させる。その後、顆粒状固体をハンマーミルで微粉末に粉砕する。２０Ｌの反応器に１０．８Ｌの脱イオン水および７．２Ｌのメタノールを入れ、この混合物を０℃に冷却する。前工程で生成した顆粒状固体を反応器に加え、スラリーを１時間激しく撹拌する。撹拌を停止し、固体を反応器の底に沈殿させる。上澄み液に真空によるデカンテーションを行い、１５Ｌのメタノールを反応器に加え、スラリーを０℃に冷却しながら３０〜４５分間撹拌する。スラリーを部分に分けてろ過し、回収した固体をメタノールで洗浄し、混合し、窒素パージをしながら真空下で乾燥させて約６００ｇの酸化デキストランを得た。これを、本明細書では、Ｄ１０−５０と称する。
【０１２５】
生成物の酸化率は、プロトンＮＭＲによる測定で、約５０％（アルデヒド基１つ当たりの当量＝１４６）である。ＮＭＲ法では、２つのピーク領域、より詳しくは、約百万分の６．２部（ｐｐｍ）〜約４．１５ｐｐｍの−Ｏ2ＣＨx−（ＨＯＤのピークを減算）および約４．１５ｐｐｍ〜約２．８ｐｐｍの−ＯＣＨx−（メタノールのピークが存在するならば全て減算）の積分値を求める。酸化度の計算は、これらの面積の計算比（Ｒ）、詳しくはＲ＝（ＯＣＨ）／（Ｏ2ＣＨ）に基づく。
【０１２６】
８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアミン（Ｐ８−１０−１）の調製：
同時係属中で共願の米国特許出願公開第２００７／０２４９８７０号明細書でＣｈｅｎａｕｌｔが記載している２段階法により、８アームのＰＥＧ１０Ｋオクタアミン（Ｍn＝１０ｋＤａ）を合成する。第１工程では、塩化チオニルと８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアルコールを反応させて、８アームＰＥＧ１０Ｋクロリドを生成する。第２工程では、８アームＰＥＧ１０Ｋクロリドをアンモニア水と反応させて８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアミンを得る。典型的手順をここに記載する。
【０１２７】
８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアルコール（Ｍn＝１００００；ＮＯＦ ＳｕｎＢｒｉｇｈｔ ＨＧＥＯ−１００００）（５００ｍＬ丸底フラスコ中に１００ｇ）を真空下（０．０６ｍｍ水銀柱（８．０Ｐａ））、８５℃で撹拌しながら４時間加熱するか、または減圧下（２ｋＰａ）、ポット温度６０℃で５０ｇのトルエンと共沸蒸留して乾燥させる。８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアルコールを室温にまで冷却し、還流冷却器を備えたフラスコに塩化チオニル（３５ｍＬ、０．４８ｍｏｌ）を加え、混合物を窒素で覆い、撹拌しながら８５℃まで２４時間加熱する。過剰の塩化チオニルをロータリーエバポレーターにより蒸発除去する（浴温４０℃）。１回当たり５０ｍＬのトルエンを続けて２回加え、減圧下（２ｋＰａ、浴温６０℃）で蒸発させ、塩化チオニルを完全に除去する。１つの合成から得られたプロトンＮＭＲの結果は次の通りである：
1Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ３．７１〜３．６９（ｍ，１６Ｈ）、３．６７〜３．６５（ｍ，１６Ｈ）、３．５（ｓ，約８００Ｈ）
【０１２８】
８アームＰＥＧ１０Ｋオクタクロリド（１００ｇ）を６４０ｍＬの濃縮アンモニア水（２８重量％）に溶解し、圧力容器中、６０℃で４８時間加熱する。溶液に乾燥窒素を１〜２時間噴霧し５０〜７０ｇのアンモニアを放出させる。その後、水酸化物形態の強塩基性アニオン交換樹脂（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）Ａ−８６０、Ｔｈｅ Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃｏ．、Ｂａｌａ−Ｃｙｎｗｙｄ、ＰＡ）のカラム（ベッド体積５００ｍＬ）に溶液を通す。溶離液を捕集し、１回当たり２５０ｍＬの脱イオン水をカラムに３回通して、これも捕集する。水溶液を混合して減圧下（２ｋＰａ、浴温６０℃）で約２００ｇに濃縮し、小分けにして冷凍し、凍結乾燥させて、無色のワックス様固体として、本明細書ではＰ８−１０−１と称する、８アームＰＥＧ１０Ｋオクタアミンを得る。
【０１２９】
８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミン（Ｐ８−１０−２）の調製：
Ａｒｔｈｕｒが国際公開第０８／０６６７８７号パンフレットで記載しているような、８アームＰＥＧ１０Ｋを、ジクロロメタン中、トリエチルアミンの存在下に塩化メタンスルホニルと反応させて８アームＰＥＧ１０Ｋメシレートを生成し、次いで、これをトリス（２−アミノエチル）アミンと反応させて、８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミンを得るという２段階法により、アームの末端に２つの第１アミン基を有する、本明細書「ｐ８−１０−２」と称する８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミンを調製した。典型的合成法をここに記載する。
【０１３０】
窒素雰囲気下で撹拌され、０℃に冷却されている、５０ｍＬのジクロロメタンに１０ｇの８アームＰＥＧ１０Ｋ（Ｍn＝１０，０００、日油（株）、東京、日本）を溶解させた溶液に、２．２ｍＬのトリエチルアミン、続いて１．２ｍＬの塩化メタンスルホニルを加える。混合物を室温に暖め、終夜撹拌する。反応混合物を分液ロートに移し、１５ｍＬの１Ｍリン酸二水素カリウムで３回、次いで１５ｍＬの１Ｍ炭酸カリウム、そして１５ｍＬの水で穏やかに洗浄する。ジクロロメタン層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、ロータリーエバポレーターにより濃縮し、１１．１７ｇの８アームＰＥＧ１０Ｋメシラートを得る。
【０１３１】
４５ｍＬの水に溶解させた、１０ｇの８アームＰＥＧ１０Ｋメシラートと４５ｍＬのトリス（２−アミノエチル）アミンとの混合物を、室温で２４時間撹拌する。反応混合物を５％（ｗ／ｗ）重炭酸ナトリウム水４５ｍＬで希釈し、合計５００ｍＬを３分割したジクロロメタンで抽出する。ジクロロメタン溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで２０〜２５ｇに濃縮する。濃縮ジクロロメタン溶液にエーテル（１００ｍＬ）を激しく撹拌しながら加え、混合物を０℃に冷却して、ワックス状固体を溶液から分離させる。溶媒をデカンテーションによりワックス状固体から除去し、ワックス状固体を真空下で乾燥させて８アームＰＥＧ１０Ｋヘキサデカアミン（Ｐ８−１０−２）を得る。
【０１３２】
実施例１〜１５
豚子宮角のメス切開シール部のインビトロ開裂試験
これらの実施例の目的は、豚の子宮角切開に対してなされた各種ヒドロゲルによるシールの開裂強度を明示することであった。
【０１３３】
豚の子宮角の一部の切開に対するシールの開裂強度の測定に、シリンジポンプシステムを使用した。シリンジポンプ（型番２２、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を改造し、「Ｙ形」継手により互いに連結されている２本の３０ｍＬシリンジを装着した。１本のＴｙｇｏｎ（登録商標）Ｒ−３６チューブ（直径０．６ｃｍ）と圧力計（ＰＤＧ ５０００Ｌ型、Ｏｍｅｇａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を通して、ポンプで水を送った。地元の食肉処理場から入手した清浄な豚子宮角の約１２．５ｃｍ部分の一端に、シリンジポンプからの水を供給するための供給ライン継ぎ手を備えた金属プラグを装着し、他端に機械ネジでシール可能なネジ穴を有する金属プラグを装着した。プラグは腸管の外周の適当な位置にナイロン紐で保持した。切開は、＃１５の外科用メスの刃を装着したＢａｒｄ Ｐａｒｋｅｒ（商標）の外科用メスハンドル５（ＢＤ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪから入手）で穿刺することにより、子宮角の壁から内部に向けて行われた。子宮角の外側の切開部はメスの刃より広く（通常、４〜５ｍｍ）、一方、内壁を通る孔は約３ｍｍ（刃にほぼ等しい）であった。このサイズの切開は、腸管を切断した後に縫合する場合の、断続縫合の間隔を模したものである。子宮角にシリンジポンプにより紫色染料を含有する水を、その水が末端プラグの開いた孔から、また子宮角壁のメスの穿刺部からも漏れ始めるまで、充填した。その後、ポンプの電源を切り、末端プラグを機械ネジでシールした。メス切開部をペーパータオルで拭き乾燥させた。
【０１３４】
アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンの溶液を、表１に示すように、水中で、３７℃、１７５ｒｐｍで終夜振盪して調製した。２つの溶液を、１６または１２段の静的ミキサー（Ｍｉｘｐａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ）を備えたダブルバレルシリンジ（Ｍｉｘｐａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ（Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、切開部に塗布した。塗布後、接着剤は室温で２分以内に硬化した。シールした腸にシリンジポンプから１１ｍＬ／ｍｉｎの流量で水を送り、生体接着シールから漏洩が始まるまで加圧して（この時点の圧力を記録した）、開裂圧力試験（本明細書では、漏洩圧力試験とも称する）を行った。ヒドロゲルと組織表面の間のシールの下から水漏れがあった場合、接着不良が原因であると考えられた。水が浸透しヒドロゲル自身から漏れた場合は、凝集不良が原因であると考えられた。開裂試験の結果を表１に要約する。
【０１３５】
表１
開裂圧力試験結果
【０１３６】
表１に示した結果は、単一のペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドを、ポリマーアームの末端に２つの第１アミン基を有する８アーム分枝末端ポリエチレングリコールアミン（すなわちＰ８−１０−２）とポリマーアームの末端に１つの第１アミン基を有する８アームポリエチレングリコールアミン（Ｐ８−１０−１）との混合物と反応させて生成したヒドロゲルは、生物学的組織に良好に接着し、かつこれをシールすることを明示している。
【０１３７】
実施例１６〜２６
インビトロ生体適合性試験−細胞毒性
これらの実施例の目的は、アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンとの反応から得られるヒドロゲルの安全性をインビトロ試験で明示することにある。
【０１３８】
試験は、ＩＳＯ１０９９３−５：１９９９にしたがって、ＮＩＨ３Ｔ３ヒト線維芽細胞培養物を使用して実施した。ＮＩＨ３Ｔ３ヒト線維芽細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％の牛胎児血清を加えたダルベッコ変法必須培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【０１３９】
表２に示すように、等体積の、アルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液とマルチアームＰＥＧアミンの水溶液を混合して調製したヒドロゲルを、ＮＩＨ３Ｔ３ヒト線維芽細胞培養体に与えた。実施例１〜１５に記載したように、水溶液を調製し、混合して、ヒドロゲルを生成した。各ヒドロゲルを、ポリスチレン培養プレートのウエルの底に、ウエルの底の約１／４が覆われるように置いた。その後、ＵＶ光でウエルを殺菌し、５０，０００〜１００，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を播種した。
【０１４０】
細胞は、通常、集密的に成長し、ウエルの底を被覆し、ヒドロゲルの辺縁にまで増殖した。しかしながら、それらはヒドロゲルを越えて増殖することはなかった。これらの結果を表２に要約するが、ヒドロゲルに細胞毒性がなく、また細胞培養体がヒドロゲルに対し接着性を有していないことを明示している。
【０１４１】
表２
細胞毒性の結果
【０１４２】
実施例２７〜３７
ヒドロゲルの体外分解
これらの実施例の目的は、アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンとの反応で生成したヒドロゲルがインビトロ試験で容易に加水分解することを明示することにあった。
【０１４３】
表３に示すように、等体積の、アルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液とマルチアームＰＥＧアミンの水溶液を混合して、ヒドロゲル試料を調製した。実施例１〜１５に記載したように、水溶液を調製し、混合して、ヒドロゲルを生成した。ヒドロゲルを硬化させた後、試料を秤量し、ｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の入った瓶の中に入れた。この瓶を、８０ｒｐｍ、３７℃にセットした温度制御振盪機内に置いた。様々な時間に瓶から試料を取り出し、過剰の溶液を拭き取って除去し、秤量した。その後、試料を容器に戻した。
【０１４４】
結果を表３に要約する。表中に記載したパーセント増加は、本実験の経過期間中に測定したヒドロゲルの重量をヒドロゲルの初期重量で除し、１００を乗じたものである。
【０１４５】
表３
ヒドロゲルの体外分解
【０１４６】
（表３続き）
【０１４７】
表３の結果は、アルデヒド官能性ポリサッカリドとマルチアームＰＥＧアミンとの反応で生成したヒドロゲルは、インビトロ試験で容易に加水分解することを明示している。重量％を単位とした成分の使用量の変更、および／または、ＰＥＧアミンのアミンもしくはアルデヒド官能性ポリサッカリドのアルデヒドの官能基数の変更により、分解時間を数時間から長い日数まで調整することができる。加水分解の結果は、本明細書中に開示されたヒドロゲルが体内で容易に分解するであろうことを示唆している。
【０１４８】
実施例３８および３９
ジアルデヒド官能性デキストランを使用して生成したヒドロゲルの体外分解
これらの実施例の目的は、ジアルデヒド官能性デキストランとマルチアームＰＥＧアミンとの反応で生成したヒドロゲルの体外分解を調べることにあった。
【０１４９】
実施例１〜１５に記載したように、ジアルデヒド官能性デキストランＤＡＦＤ−１０−１６（実施例３８）またはＤＡＦＤ−１０−エステル結合（実施例３９）を２０重量％の濃度で含有する水溶液を、マルチアームＰＥＧアミンＰ８−１０−１（２５重量％）を含有する水溶液と混合し、ヒドロゲルを生成した。ヒドロゲルの分解は、実施例２７〜３７に記載した方法により求めた。結果を表４に要約する。
【０１５０】
表４
ヒドロゲルの体外分解
【０１５１】
これらの結果は、ジアルデヒド官能性デキストランがマルチアームＰＥＧアミンＰ−８−１０−１とともにヒドロゲルのゲルを生成すること、および、水性環境中では広範な分解速度を有するヒドロゲルが得られることを明示している。より詳しくは、デキストラン主鎖への結合が、エーテル結合したジアルデヒド官能性デキストランのように化学的に安定なペンダントジアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランを使用することにより、長寿命のヒドロゲルを生成することができる（実施例３８）。また、エステル結合のように、加水分解に対して潜在的に不安定なペンダントジアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランを使用することにより、極めて迅速に分解するヒドロゲル調製することができる（実施例３９）。
【０１５２】
実施例４０〜４４
水溶液中のアルデヒド官能性デキストランの安定性−粘度測定
これらの実施例の目的は、アルデヒド官能性デキストランの水溶液中における安定性が、酸化デキストランＤ１０−５０と比べて高いことを、粘度の測定によって明示することにあった。
【０１５３】
表５に示すように、酸化デキストランの水溶液（２５重量％）と各種のアルデヒド官能性デキストランの水溶液（２５重量％）を１２日間４５℃で加熱した。水溶液の３０℃における粘度を、様々な時点で測定した。結果を表５に要約する。
【０１５４】
表５
酸化デキストランおよびアルデヒド官能性デキストラン水溶液の粘度
【０１５５】
表５の結果は、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランを含有する水溶液は、１２日後に０％〜１１％の範囲で粘度が低下したのに対し、酸化デキストランを含有する水溶液の粘度は同じ時間で２２％減少したことを示している。これらの結果は、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性デキストランは、水溶液中で酸化デキストランより安定であることを示唆している。
【０１５６】
実施例４５〜４８
水溶液中のアルデヒド官能性デキストランの安定性−レオメトリ測定
これらの実施例の目的は、水溶液中のアルデヒド官能性デキストランの安定性を明示することにあった。アルデヒド官能性デキストラン溶液の安定性の尺度として、アルデヒド官能性デキストランとマルチアームポリエーテルアミンとの反応で得られたヒドロゲルの振動ディスクレオメトリを使用した。
【０１５７】
表６に示すように、一方のバレルに各種アルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液を、他方のバレルにマルチアームＰＥＧアミンの水溶液を充填したダブルバルブシリンジを２通り用意した。他の２つのダブルバレルシリンジには、一方のバレルに酸化デキストランＤ１０−５０の水溶液を、他方のバレルにＰ８−１０−１の水溶液（２０重量％）を満たした。ダブルバレルシリンジに充填した水溶液を、静的混合チップを通してＡＰＡ２０００型レオメータ（Ａｌｐｈａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｋｒｏｎ、ＯＨ）の試料台に送り、混合物の貯蔵弾性率（Ｇ’）を測定し、０日目の値とした。６０秒におけるＧ’の値をゲル化速度の尺度とした。
【０１５８】
一方のグループのシリンジを２５℃で様々な時間貯蔵し、第２のグループのシリンジは、熱的にエージングしたアルデヒド官能性ポリサッカリドの水溶液を提供するために、（表６に示すように）様々な時間４０℃に加熱した。混合溶液の貯蔵弾性率を、様々な時間に、上記のように測定した。結果を、０日目のＧ’に対するパーセントで表し、表６に示す。
【０１５９】
表６
ヒドロゲル生成物のレオメトリ測定結果
【０１６０】
表６の結果は、アルデヒド官能性ポリサッカリドは水溶液中で酸化デキストランより安定であることを示唆している。
【０１６１】
実施例４９
レオメトリ測定法を用いたＡＦＤ−１３−６４の水溶液中における熱安定性
この実施例の目的は、振動ディスクレオメトリ測定法により、アルデヒド官能性デキストランＡＦＤ−１３−６４の水溶液中における熱安定性を明示することにあった。
【０１６２】
それぞれ、一方のバレルにＡＦＤ−１３−６４の水溶液（２０重量％）を、他方のバレルにＰ８−１０−１の水溶液（２０重量％）を充填した２つのダブルバレルシリンジを用意した。一方のシリンジは４０℃で１９日間加熱し、他方のシリンジは同期間４℃で保管した。その後、各シリンジから得られた混合物の貯蔵弾性率を、ＡＰＡ２０００型レオメータ（Ａｌｐｈａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｋｒｏｎ、ＯＨ）を用いて測定した。４０℃で１９日間貯蔵したシリンジから得られた混合物について得られた貯蔵弾性率は、同期間４℃で貯蔵したシリンジから得られた混合物について得られた貯蔵弾性率と実質的に同一であり、アルデヒド官能性デキストランＡＦＤ−１３−６４が良好な熱安定性を有することを示唆するものであった。
【０１６３】
実施例５０、比較例
アミド結合により結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性カルボキシメチルデキストラン
この実施例の目的は、アミド結合でポリサッカリドと結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドが、エーテル結合でポリサッカリドと結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドほど、水溶液中で安定でないことを明示することにあった。
【０１６４】
カルボキシメチル化率が１．１の１１ｋＤａカルボキシメチルデキストランの調製（ＣＭＤＸ−１１−１．１）の調製：
８．５〜１１ｋＤａの平均分子量を有するデキストラン（Ｓｉｇｍａ）を、１２３．７５ｍＬの６ＮのＮａＯＨに０℃で溶解した。この冷溶液に、３０．７５ｇのクロロ酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。この反応混合物を６０℃まで２０分間加熱し、その後、冷却して、濃塩酸でｐＨ７．０に中和した。中和した溶液に１．０Ｌのメタノールを滴下して生成物を沈殿させた。固体をろ過により捕集し、メタノールから再沈殿させた。その後、全手順を３回繰り返し、置換率を所望のレベルにまで高めた。最後の繰り返しの後、限外ろ過により生成物をさらに精製した。溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ ＴＦＦシステムを使用して透析ろ過した。一定の残余分体積を維持するために連続的に水を加えながら、合計で６倍の体積の浸透液を捕集した。その後、残余分を捕集し、凍結乾燥させて、１４．２５ｇの綿毛のような白色固体を得た。カルボキシメチル化率をＨｏら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５２：９１６、１９８０）の方法により測定したところ、１．１であった。本明細書では、このカルボキシメチルデキストラン生成物をＣＭＤＸ−１１−１．１と称する。
1Ｈ ＮＭＲ δ４．９〜５．２ｍｕｌｔ．（１Ｈ），３．４〜４．４ｍｕｌｔ（９．５Ｈ）．
【０１６５】
アミド結合により結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性カルボキシメチルデキストランの調製：
３リットルの３つ口フラスコに、１３．７ｇのＣＭＤＸ−６０−１．７、並びにテトラメチルエチレンジアミン緩衝液およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の１：１溶液９１６．６ｍＬを加えた。ｐＨ４．９４の透明な溶液が生成した。１．０ＭのＨＣｌを加えてｐＨを４．７に調整した。この溶液に、４７．７４ｇの１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｓｉｇｍａ）、続いて２８．８７ｇのｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。溶液のｐＨを４．７に再調整し、２時間撹拌した。その後、ｐＨが４．７を越えて上昇しないように、４−アミノブチルアルデヒドジエチルアセタール（５３．８８ｇ）を小分けにして３．５時間にわたって加えた。反応の終点に向けてｐＨを６．２５に上昇させ、その後、反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をガラス瓶に移し、水で希釈し、１ｋＤａのカットオフフィルターを備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムでろ過した。連続的にリサイクルし、浸透液を置換するために連続的に新鮮な水を加えて、浸透液として合計で５倍の体積を捕集した。ろ過した溶液を凍結乾燥させ、白色固体生成物を得た。その後、ペンダントアセタール基の結合を増加させるために、白色固体生成物を出発材料として上記手順を繰り返した。最終の収率は２０．３ｇであった。
【０１６６】
固体を４００ｍＬの水に溶解し、ｐＨ２．５で１．０ＭのＨＣｌにより終夜処理することにより、アセタール基を除去した。ＮａＯＨで中和後、前述したように、溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＩＩ 限外ろ過システムでろ過し、凍結乾燥させて１６．４５ｇの白色固体を得た。分子量を、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定したところ、４９ｋＤａであった。環１個当たりのアルデヒド置換率を、加水分解した試料のＮＭＲにより測定したところ、０．３７であった。ＮＭＲ法では、２つのピーク領域、具体的には、百万分の約６．２（ｐｐｍ）〜約４．１５ｐｐｍの−Ｏ2ＣＨx−（ＨＯＤのピークは減算）および約４．１５ｐｐｍ〜約２．８ｐｐｍの−ＯＣＨx−（メタノールのピークが存在するならば全て減算）の積分値を測定する。酸化度の計算は、これらの面積について計算した比（Ｒ）、具体的には、Ｒ＝（ＯＣＨ）／（Ｏ2ＣＨ）に基づく。
【０１６７】
アルデヒド官能性カルボキシメチルデキストランの水溶液中における不安定性
上記のようにして得た固体生成物５．１ｇを、１５．３ｇのオートクレーブ水に溶解することにより、アミド結合で結合したペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性カルボキシメチルデキストランの水溶液を調製した。この混合物をインキュベータ中、３７℃、１９０ｒｐｍで１時間振盪した。得られた溶液を５．０μｍ膜に通してろ過し、５ｍＬの溶液試料を２つ、５５℃のインキュベータに入れた。１９時間後、両試料は流動性を示さない琥珀色のゲルを生成した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含むキット。
【請求項２】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが第１の水溶液もしくは分散液の成分であり、かつ前記水分散性マルチアームアミンが第２の水溶液または分散液の成分である請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１の水溶液もしくは分散液が、前記アルデヒド官能性ポリサッカリドを、前記溶液または分散液の全重量に対して約５重量％〜約４０重量％の濃度で含む請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記第２の水溶液もしくは分散液が、前記水分散性マルチアームアミンを、前記溶液または分散液の全重量に対して約５重量％〜約７０重量％の濃度で含む請求項２に記載のキット。
【請求項５】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体からなる群より選択される請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、アルデヒド官能性デキストランまたはアルデヒド官能性イヌリンである請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンからなる群より選択される請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミンである請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記水分散性マルチアームポリエーテルアミンが、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端星形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、およびポリオキシアルキレントリアミンからなる群より選択される請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ａ）溶媒中で、（ｉ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと、（ｉｉ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを混合して、ヒドロゲルを生成する工程；および
ｂ）前記ヒドロゲルを処理して前記溶媒の少なくとも一部を除去して、乾燥ヒドロゲルを生成する工程
を含む方法により生成される乾燥ヒドロゲル。
【請求項１１】
前記乾燥ヒドロゲルが、フィルムの形態である請求項１０に記載の乾燥ヒドロゲル。
【請求項１２】
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド、および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
の反応生成物を含む組成物。
【請求項１３】
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含み、前記少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと前記少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンが、前記ポリサッカリドの前記ペンダントアルデヒド基と前記水分散性マルチアームアミンの前記第１アミン基との間に形成された共有結合を介して架橋されている架橋ヒドロゲル組成物。
【請求項１４】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体からなる群より選択される請求項１３に記載の架橋ヒドロゲル組成物。
【請求項１５】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンからなる群より選択される請求項１３に記載の架橋ヒドロゲル組成物。
【請求項１６】
生体組織解剖部位にコーティングを施す方法であって、
前記部位に、ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；次いで、ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端され、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを塗布するか、または（ｂ）に次いで（ａ）を塗布する工程、あるいは（ａ）と（ｂ）とを予備混合する工程、および前記得られた混合物を前記部位に、前記得られた混合物が完全に硬化する前に塗布する工程
を含む方法。
【請求項１７】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体からなる群より選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンからなる群より選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含むキット。
【請求項２】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが第１の水溶液もしくは分散液の成分であり、かつ前記水分散性マルチアームアミンが第２の水溶液または分散液の成分である請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記第１の水溶液もしくは分散液が、前記アルデヒド官能性ポリサッカリドを、前記溶液または分散液の全重量に対して約５重量％〜約４０重量％の濃度で含む請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記第２の水溶液もしくは分散液が、前記水分散性マルチアームアミンを、前記溶液または分散液の全重量に対して約５重量％〜約７０重量％の濃度で含む請求項２に記載のキット。
【請求項５】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体からなる群より選択される請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、アルデヒド官能性デキストランまたはアルデヒド官能性イヌリンである請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンからなる群より選択される請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミンである請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記水分散性マルチアームポリエーテルアミンが、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド、アミノ末端星形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端樹枝形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端櫛形ポリプロピレンオキサイド、アミノ末端星形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端樹枝形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、アミノ末端櫛形ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイドコポリマー、およびポリオキシアルキレントリアミンからなる群より選択される請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ａ）溶媒中で、（ｉ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリドと、（ｉｉ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンとを混合して、ヒドロゲルを生成する工程；および
ｂ）前記ヒドロゲルを処理して前記溶媒の少なくとも一部を除去して、乾燥ヒドロゲルを生成する工程
を含む方法により生成される乾燥ヒドロゲル。
【請求項１１】
前記乾燥ヒドロゲルが、フィルムの形態である請求項１０に記載の乾燥ヒドロゲル。
【請求項１２】
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド、および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
の反応生成物を含む組成物。
【請求項１３】
ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；および
ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端されていて、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミン
を含み、前記少なくとも１種のアルデヒド官能性ポリサッカリドと前記少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンが、前記ポリサッカリドの前記ペンダントアルデヒド基と前記水分散性マルチアームアミンの前記第１アミン基との間に形成された共有結合を介して架橋されている架橋ヒドロゲル組成物。
【請求項１４】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体からなる群より選択される請求項１３に記載の架橋ヒドロゲル組成物。
【請求項１５】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンからなる群より選択される請求項１３に記載の架橋ヒドロゲル組成物。
【請求項１６】
生体組織解剖部位にコーティングを施す方法であって、
前記部位に、ａ）約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの重量平均分子量および約１０％〜約２００％のアルデヒド置換率を有する、少なくとも１種の、ペンダントアルデヒド基を有するアルデヒド官能性ポリサッカリド；次いで、ｂ）少なくとも３本のアームが少なくとも１つの第１アミン基で終端され、約４５０〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、少なくとも１種の水分散性マルチアームアミンを塗布するか、または（ｂ）に次いで（ａ）を塗布する工程、あるいは（ａ）と（ｂ）とを予備混合する工程、および前記得られた混合物を前記部位に、前記得られた混合物が完全に硬化する前に塗布する工程
を含む方法。
【請求項１７】
前記アルデヒド官能性ポリサッカリドが、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン、寒天、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、プルラン、イヌリン、レバンおよびヒアルロン酸のアルデヒド官能性誘導体からなる群より選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記水分散性マルチアームアミンが、水分散性マルチアームポリエーテルアミン、アミノ末端樹枝形ポリアミドアミンおよびマルチアーム分枝末端アミンからなる群より選択される請求項１６に記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５３１９５４（Ｐ２０１２−５３１９５４Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１７８９３（Ｐ２０１２−５１７８９３）
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０６０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００２８８８
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１１０９４２９９）アクタマックス サージカル マテリアルズ リミテッド ライアビリティ カンパニー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０６０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００２８８８
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１１０９４２９９）アクタマックス サージカル マテリアルズ リミテッド ライアビリティ カンパニー (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]