医薬組成物
少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットの構造、発現、および／または活性の制御または撹乱のための薬剤的に許容される調節因子、例えばヒトを含む温血動物のピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）複合体のミトコンドリアエネルギー代謝調節の変化を通したもの、およびその使用方法は、複合体のリン酸化状態に影響を与えるための、少なくとも１の有効量のリポ酸誘導体および少なくとも１のその薬剤的に許容される担体を含む。ＰＤＨキナーゼ活性の増大および／またはＰＤＨホスファターゼ活性の減少により、この調節因子は、ＰＤＨ複合体のＥｌαサブユニット活性の阻害を通して嫌気性解糖作用の有毒代謝産物の解毒を阻止し、ミトコンドリアの酸化的なリン酸化活性を強制的に増大させる。腫瘍細胞のような過剰増殖により特徴付けられる細胞は、ＰＤＨ複合体のＥ２サブユニット活性の阻害における調節因子のさらなる作用のためにアセチル−ＣｏＡおよびＮＡＤＨもまた産生できず、ミトコンドリアの膜分極は失われ、細胞死が促進される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用および診断用の組成物に関し、さらに詳細には、癌細胞を含む過剰増殖により特徴付けられる細胞内への選択的な取り込みを示し、かつ酵素の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱を調節し、これによってそれらの細胞の検出および処置または破壊を促進する医薬組成物、およびそれらの使用方法に関する。さらに特異的には、これらの薬剤は、大部分の癌に付随する修飾されたピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）複合体などとして観察される、変化したミトコンドリアエネルギー代謝の活性またはその制御を標的とし、撹乱する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、真核細胞におけるエネルギー産生および生と死の工程に対する主要なコントロールセンターである。残りの細胞との様々な連絡機構が存在するが、可逆的リン酸化はミトコンドリアの機能を制御するための重要な手段である（Ｐａｇｌｉａｒｉｎｉ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ Ｊ．Ｅ．（２００６）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ： ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｔａｋｅｓ ｃｅｎｔｅｒ ｓｔａｇｅ？ ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３１：２６−３４、本明細書の各所に参照として取り込まれる）。報告されたミトコンドリアキナーゼ、ホスファターゼ、およびリン酸化タンパク質の数の着実な増加は、リン酸化がミトコンドリアでの工程の制御における共通のテーマとして現れているであろうことを示唆する。ミトコンドリア酵素の構造、機能および活性制御に付随する病理的または遺伝的な変化は、疾病の治療に貢献し、かつその重要な標的であり得る。
【０００３】
様々な細胞機能の収束点および制御因子としてのそれらの役割に一致して、ミトコンドリアはアポトーシス、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、および細胞ＡＴＰの９０％を超える産生を含む多数の代謝工程において決定的な役割を持つ。さらに、細胞の増殖および分裂に従って新たなミトコンドリアが作られる必要があり、この工程それ自体が、核およびミトコンドリアＤＮＡの転写および翻訳の注意深い協調を要求する。最終的に、細胞エネルギーが変化を必要とするとき、ミトコンドリアはそのＡＴＰ産出を回転させることによって迅速に応答しなければならない。それ故に、ミトコンドリアは細胞機能と連絡する複雑な系を要求する。図１から明らかなように、ミトコンドリアへ出入りするシグナル分子はイオン、気体、代謝産物、ホルモン、転写因子およびタンパク質を含む。結果的に、細胞シグナルを受け取り、統合し、伝達するための中心としてミトコンドリアを認識することは、医薬品の設計および試験における重要な進歩である。
【０００４】
ミトコンドリア制御におけるシグナル伝達の礎石は可逆的リン酸化である。しかしながら、タンパク質キナーゼ現象の最初の実証が１９５４年に報告され、４０年近く前に可逆的リン酸化によってミトコンドリアの中心的機能が制御できるという事実が発見されたにもかかわらず、ミトコンドリアのリン酸化現象についての報告は少ない。このことは、１９８０年代および１９９０年代において、細胞膜を横断し、サイトゾルを通って核へと伸展する多数のシグナル伝達リン酸化カスケードが認識されたことにも全くかかわりなくである。このような知識の不足は、ミトコンドリアタンパク質機構の大部分が二つの脂質二重層の後ろに位置する事実により、サイトゾルシグナル伝達カスケードはミトコンドリアタンパク質に到達できないと考えられていることに部分的な原因があるかもしれない。いずれの現象でも、疾病管理の鍵となる方法において、ミトコンドリアが可逆的リン酸化によりシグナル伝達を制御することは広く受け入れられてはいなかった。それにもかかわらず、表１に示すように、２００６年までに全てのミトコンドリアの区画（すなわち、マトリックス、内膜、膜間腔、および細胞質に面する外表面を含む外膜）内の６０を超えるタンパク質が、ミトコンドリアの機能の広いスペクトルに関係付けられるリン酸化タンパク質として同定された。増加するデータはさらに、ミトコンドリアの標的の可逆的リン酸化の重要性、およびそれを対象とする、改善された癌治療のための組成物の使用について実証している。
【０００５】
表１ ミトコンドリアのリン酸化タンパク質
ａ略語：ＡＡ，アミノ酸（Ｓ，セリン；Ｔ，スレオニン；Ｙ，チロシン）；ＡＮＴ，アデニンヌクレオチド輸送体；Ａｘｍｉｔｏ，ミトコンドリアアネキシン；β−ＯＸ，β−酸化：ＢＣＫＡＤ，分岐鎖ケト酸脱水素酵素；ＣＩ−ＣＶ，呼吸鎖複合体１−５；ＣＰＴ，カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ；ＣＲＥＢ，ｃＡＭＰ反応性エレメント（Ｃｒｅ）結合タンパク質：ＣＹＰ，チトクロムＰ４５０；ＤＢＰ，十二量体結合タンパク質；ＥＦ，伸長因子；ＧＳＴ，グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＨＳＰ，熱ショックタンパク質；ＩＭ，内膜；ＩＭＳ，膜間腔；Ｍ，マトリックス；ＭｎＳＯＤ，マンガンスーパーオキシドジスムターゼ；ｍＴＥＲＦ，ミトコンドリア転写終結因子；ｍｔＧＡＴ，ミトコンドリアグリセロール−３−ホスファターゼアセチルトランスフェラーゼ；ｍｔｈｓｐ，ミトコンドリアＨＳＰ；ｍｔＴＢＰ，ミトコンドリアテロメア結合タンパク質；ＮＤＫ，ヌクレオシド二リン酸キナーゼ；ＯＭ，外膜；ＯＸＰＨＯＳ，酸化的リン酸化；Ｐ部位，リン酸化部位；ＰＤＣ Ｅ１／３，ピルビン酸脱水素酵素複合体Ｅ１／３サブユニット；ＰＤＫ，ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ；ＰＬＡ，ホスホリパーゼＡ；ＳｃＩＲＰ，サブユニットｃ−免疫反応性ペプチド；ＳＳＡＴ，スペルミジン／スペルミンアセチルトランスフェラーゼ；ＳｔＡＲ，ステロイド産生急性調節タンパク質；ＴＣＡ，トリカルボン酸サイクル；ＴＲＡＰ−１，腫瘍壊死因子タイプ１受容体付随タンパク質；ＶＤＡＣ，電位依存性陰イオンチャネル。
ｂ組み換えタンパク質において、リン酸化はｉｎ ｖｉｔｒｏでのみ観察される。
ｃタンパク質はミトコンドリアへ移動する（すなわちタンパク質はミトコンドリアの常在タンパク質ではない）。
【０００６】
ヒトゲノムにおける最も大きなキナーゼおよびホスファターゼファミリーであるタンパク質キナーゼ（ＰＫ）およびタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は、それぞれ５００を超える、および１００を超えるメンバーを有する。キナーゼおよびホスファターゼの比較的小さなファミリーを合わせると、これらのシグナル伝達分子はヒトゲノムによりコードされる全てのタンパク質の３パーセント近くを構成する。前述のリン酸化タンパク質と同様に、驚くべき数の研究によってキナーゼおよびホスファターゼがミトコンドリアの機能に関係付けられており、図２に示すように、これまでに少なくとも２５のキナーゼおよび８のホスファターゼがミトコンドリアに局在していることが報告されている。これらのキナーゼおよびホスファターゼが一つのグループまたはファミリーに限定されていないことは明らかで、むしろそれらはほとんど全ての既知の哺乳類キナーゼおよびホスファターゼのサブグループに相当しており、これはミトコンドリアに影響を及ぼすと考えられるシグナル伝達経路の範囲を反映している。これらのシグナル伝達分子は基質の特異性が変化するキナーゼおよびホスファターゼ（例えばチロシンキナーゼ、古典的ＰＴＰサブグループ、セリン／スレオニンキナーゼ、および二重特異性ＰＴＰ）を含み、これらの変化は触媒的な機構（例えばシステインベースのＰＴＰ、アスパラギン酸ベースのＰＴＰ、および金属依存性ホスファターゼ）および進化的保存性（例えば最近関連ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＫ）およびホスファターゼ（ＰＤＰ）、分岐鎖ケト酸脱水素酵素キナーゼ（ＢＣＫＤＫ）およびホスファターゼ（ＢＣＫＤＰ）、および多数の哺乳類特異的酵素）による。
【０００７】
これらのシグナル伝達分子の大部分は、細胞内でミトコンドリアに関係しないその他の役割を有し、主にミトコンドリアの外に存在することが見出された。大部分のタンパク質について、それらのミトコンドリアへの移行の起動力または機構はよく知られていない。しかしながら、図３から明らかなように、先に記載したリン酸化タンパク質のようなキナーゼおよびホスファターゼがミトコンドリアの全ての区画に存在し、かつそれらの活性が様々なミトコンドリアの機能に影響を与えることははっきりしている。
【０００８】
しかしながら少数のシグナル伝達分子は主にミトコンドリアに局在すると考えられる。ＰＤＫおよびＰＤＰに加え、このグループはＰＴＥＮ誘導性キナーゼであるＰＩＮＫ１、ミトコンドリアＰＴＰＭＴ１を標的とする二重特異性ＰＴＰ、およびアスパラギン酸ベースのホスファターゼ／ＡＴＰアーゼであるＴｉｍ５０を含む。現在これらのタンパク質の多くに対する基質は未知であるが、生物学的および遺伝的データからそれらがミトコンドリアにおいて決定的な機能を有することは明らかである。例えば、そのミトコンドリア下の局在はまだ決定されていないが、ＰＩＮＫ１はＮ末端シグナル配列によってミトコンドリアを標的とする。Ｃａ２＋／カルモジュリン調節性キナーゼファミリーと高い配列相同性を共有するこのキナーゼは、生存促進性の活性に関与すると考えられる。同様にＰＴＰＭＴ１は、主にミトコンドリア内部に局在する最初のＰＴＰとして最近同定され、ＰＩＮＫ１のようにＮ末端シグナルペプチドによってミトコンドリアを標的とし、かつミトコンドリアの内膜のマトリックス面に密接に結合することが見出された。ＰＴＰＭＴ１は、そのミトコンドリアが糖代謝とインスリン分泌の連関に重要な機能を持つ膵臓β細胞に高度に発現する。最後に、ＴＩＭ（内膜の交換輸送体）複合体の鍵となる成分であるＴｉｍ５０は、アスパラギン酸ベースのホスファターゼ／ＡＴＰアーゼのＣＴＤファミリーに対する配列相同性を有する。このファミリーの他のメンバーと同様に、Ｔｉｍ５０はＡＴＰアーゼとして機能し得るが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ホスホチロシン類似体であるパラニトロフェニルホスフェートに対するホスファターゼ活性を有することもまた示されてきた。上記のことから、細胞内の他の場所からミトコンドリアへ動員されるキナーゼおよびホスファターゼのみが見られるのではなく、ミトコンドリア自体が常在するシグナル伝達分子のグループを有すると考えられる。
【０００９】
時おり原因となるキナーゼおよびホスファターゼが同定されていないことから、最もよく知られたミトコンドリアリン酸化タンパク質におけるリン酸化の効果は明らかではないが、幾つかのリン酸化現象が部分的に特徴付けられている。これらの例は、先に考察したリン酸化タンパク質およびシグナル伝達分子のように、ミトコンドリアの一領域に限定されてはいない。
【００１０】
ミトコンドリア外膜におけるリン酸化は、アポトーシスの制御に決定的な役割を持つ。特によく定義されている現象は、ＢＣＬ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバーであるＢＡＤのリン酸化である。生存促進性サイトカインであるインターロイキン−３で処理した後、ＰＫＡが外膜へ移動することが示されている。一旦、外膜のＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）に固定された後、ＰＫＡはＢＡＤをＳｅｒ１１２においてリン酸化して、図３Ａに示す工程であるＢＡＤの不活性化およびミトコンドリアからの分離を導く。ｐ７０Ｓ６キナーゼによるＳｅｒ１３６、および未同定のキナーゼによるＳｅｒ１５５におけるＢＡＤのリン酸化もまた、ＢＡＤの不活性化に関係付けられている。
【００１１】
健常な細胞ミトコンドリアにおける制御機構として作用する可逆的リン酸化の最もよく確立された例は、マトリックス内のＰＤＨ複合体であり、その単純化された下絵を図３Ｂに示す。この複合体は、解糖系由来のピルビン酸塩の、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの主要な前駆体であるアセチルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）への変換を触媒する。これら二つの主要なエネルギー産生経路をつなぐものとして、ＰＤＨ複合体は細胞内グルコースの恒常性維持のために適切に制御されなければならない。
【００１２】
ミトコンドリアリン酸化タンパク質として最初に同定されたことから、ＰＤＨ複合体および可逆的リン酸化によるその制御は徹底的に研究されてきた。ＰＤＨ複合体のリン酸化および脱リン酸化は、それぞれＰＤＫおよびＰＤＰにより行われる。少なくとも４のＰＤＫアイソフォームおよび２のＰＤＰアイソフォームが知られており、それら全てはＰＤＨ複合体のＥ２サブユニットに結合する。リン酸化現象はＥ１サブユニットの別個の三つのセリン残基に起こり、それぞれがこの複合体の著しい不活性化を導く。特に、ＰＤＫそれ自体のリン酸化については現在少なくとも一報告がある。ＰＫＣにより行われるこのリン酸化はＰＤＫを不活性化することが示されており、可逆的リン酸化によるＰＤＨ複合体制御のさらなるレベルを潜在的に証明している。従ってＰＤＨ複合体は、他の保存された工程に制御の段階を加えるためにリン酸化を用いるミトコンドリアの最も重要な例である。
【００１３】
先に記載したミトコンドリアのチロシンキナーゼおよびホスファターゼによって示されるように、この細胞小器官内でのリン酸化はセリンおよびスレオニン残基に限定されない。ミトコンドリアのエネルギーに影響を与えるチロシンリン酸化の例は、図３Ｃに示す内膜でのチトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）の制御に見られる。呼吸鎖における終末酵素としてのＣＯＸは、ポンプによってプロトンが内膜を横切る間、協調的に酸素を水に還元する。ＰＤＨ複合体と同じく、ＣＯＸはＡＴＰおよびＡＤＰ、同様に甲状腺ホルモンＴ２およびおそらくはＣａ２＋イオンによりアロステリックに制御される。これらの制御形式に加え、ＣＯＸはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびＨｅｐＧ２細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ｃＡＭＰ依存性の様式によりリン酸化されることが示されている。ＣＯＸは１３のサブユニットを含み、二量体として結晶化される。リン酸化部位はサブユニット１のＴｙｒ３０４であると同定され、これは膜間の二量体インターフェースに位置する。リン酸化現象は、おそらく二量体形成の中断によってＣＯＸ活性を顕著に阻害する。
【００１４】
ＣＯＸのチロシンリン酸化の第二の例である非受容体型チロシンキナーゼｃ−Ｓｒｃの一部は、Ｌｙｎチロシンキナーゼと同様に、破骨細胞においてミトコンドリア内部に局在してＣＯＸのサブユニットＩＩの未同定部位にチロシンリン酸化を導く。リン酸化現象の結果は、ＣＯＸ活性の増大を導くサブユニットＩに見られる結果とは逆である。
【００１５】
ミトコンドリアシグナル伝達の重要な態様は、キナーゼおよびホスファターゼがそれら自体でどのように制御されるかである。Ａｂｌ、Ａｋｔ、ＧＳＫ３１３およびＰＫＣδのような、主に細胞内の他の場所に存在しているがミトコンドリアを標的とするようになる多数のキナーゼは、それらが活性化された状態においてのみそうするようになると考えられる。従ってミトコンドリア内での幾つかのキナーゼ活性の範囲は、単純に細胞小器官内へ移入される酵素の数によって決定されるであろう。
【００１６】
しかしながら常在するシグナル伝達分子には、異なる制御手段が実施されなければならない。これらの工程は未だ確定されていないものの、セカンドメッセンジャーの役割が鍵となるように思われる。ＰＤＫおよびＰＤＰの活性は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋およびＡＤＰのようなイオンおよび小分子によって制御されることが知られている。ミトコンドリア一酸化窒素合成酵素の性質決定および最近のミトコンドリアにおける可溶性アデニル酸シクラーゼの発見は、ミトコンドリアシグナル伝達分子の制御に寄与するセカンドメッセンジャーに対してさらなる機会を提供する。最後に、細胞内の他の場所でシグナル伝達分子を制御する手段として確立されているＲＯＳは、大量の活性酸素種が産生されるミトコンドリアにおけるキナーゼおよびホスファターゼの制御にほとんど確実に関与するであろう。キナーゼおよびホスファターゼのアイソフォームの相対的な発現レベルは、病理学における重要な役割を果たし、かつ疾病に付随するその他のシグナル伝達現象に関連付けられる可能性がある。遺伝子および発現レベルでの変化もまた、これらの変化に関連し得る。
【００１７】
幾つかのプロテオミクス調査を通した後であっても、哺乳類ミトコンドリアプロテオームの３分の２のみが知られていると推定される。残りの３分の１の多くは、これらのマススペクトロメトリー分析の検出レベル未満である、シグナル伝達タンパク質のような少量のタンパク質により構成されると思われる。これらの研究から、異なる組織由来のミトコンドリアの間で、含まれるタンパク質に高い可変性があることも明らかになった。例えばこれらのプロテオミクスの試みにおいて、〜５０％のタンパク質のみが、調査された四つの組織（すなわち脳、心臓、肝臓および骨格筋）にわたって保存されることが見出された。異なるミトコンドリアシグナル伝達経路は、組織から組織において同様の方向で変動し得るのみではなく、この観察されるミトコンドリアの多様性に非常によく寄与していると考えられる。
【００１８】
それにもかかわらず、可逆的リン酸化がミトコンドリアでの工程の制御に関与すると結論付けるための十分すぎる証拠が存在する。報告された６０を超えるリン酸化タンパク質、３０のキナーゼおよびホスファターゼ、および様々な補助的シグナル伝達タンパク質によれば、ミトコンドリアは確かに可逆的リン酸化によるシグナル伝達のための場として正当に評価されておらず、事実としてこのような制御は癌のような過剰増殖疾患に有用となるであろう。
【００１９】
増殖の速い腫瘍細胞の大多数は、形質転換されていない細胞に対する著明な遺伝的、生化学的、および組織学的な相違を示す。これらの多くは、元の組織に比較して変化したエネルギー代謝に関連する。腫瘍細胞において最も悪名高く、かつよく知られたエネルギー代謝の変化は、ワールブルク効果として知られている、高濃度のＯ２存在下であっても解糖能が亢進する現象である。
【００２０】
ワールブルクは最初、腫瘍細胞における亢進した解糖の推進力は、ミトコンドリアの機能の非可逆的損傷によって起こるエネルギー欠乏であると提唱し、この場合嫌気性の筋肉と同様に、解糖を通してグルコースが後に分泌される乳酸に変換される。腫瘍細胞におけるこの解糖の流れの増大は、酸素の供給が不十分な固形腫瘍に見られる部分的な低酸素状態のような、Ｏ２濃度の低い環境での生存および増殖を保証するための代謝の戦略であると提唱されてきた。特に、多くのヒト低酸素性腫瘍におけるＯ２濃度は２０μＭよりも低いことから、そこでの酸化的リン酸化は限定される。結果的に、解糖は固形腫瘍（例えば増殖の遅いメラノーマおよび乳腺腺癌）における主要なエネルギー経路であると考えられる。
【００２１】
細胞増殖の比率とＡＴＰ供給の比率との間の比例関係は、増殖の速い腫瘍細胞について確立されてきた。何人かの著者は、高度に脱分化した増殖の速い腫瘍における解糖の比率が、増殖の遅い腫瘍および正常細胞における解糖の比率よりも高くなるように、解糖活性は腫瘍の悪性度と相関することを提唱した。実際に高レベルの乳酸は悪性腫瘍の前兆であると提唱されてきた。これらの現象がさらなるシグナル伝達現象および遺伝的変化に関連すると考えられ、例として低酸素誘導因子および血管新生因子の産生および放出が含まれる。
【００２２】
図４に示すように、何年もの間トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルは、生命体のエネルギー源としてのＡＴＰの産生におけるその役割のみに対して、生物学的に重要であるとみなされるだけであった。しかしながら最近の研究により、ＴＣＡサイクルの活性は、細胞増殖およびアポトーシスの決定を含むシグナル伝達経路の機能にもまた影響を与え、関係する解糖およびＴＣＡサイクル酵素の増加または減少を制御できることが示された。腫瘍の進行と、解糖酵素であるヘキソキナーゼおよびホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）１との間には直接の相関もあり、これらは増殖の速い腫瘍細胞で大きく増加している。従って、その酸化能に不足を示す腫瘍細胞は、活発な酸化的リン酸化を有する腫瘍細胞よりもさらに悪性であると想定されている。低酸素性または好気性の状態にあるか否かに関わらず、癌組織での解糖への依存は悪性度の増大に関連する。
【００２３】
健常な細胞のＰＤＨ複合体におけるリポ酸の役割については、よく研究されてきた。ＰＤＨ複合体は三つの中心的なサブユニット、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３（それぞれピルビン酸脱水素酵素、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、およびジヒドロリポアミド脱水素酵素）を有する。これらの複合体は中心にＥ２コアを持ち、このコアをその他のサブユニットが取り囲んで複合体を形成する。これら二つのサブユニット間のギャップ内で、リポイルドメインが活性部位間での中間体の輸送を行う。リポイルドメイン自体は、可動性のリンカーによってＥ２コアに付着する。ピルビン酸塩とチアミンピロリン酸の反応によるヘミチオアセタールの形成によって、この陰イオンは、リジン残基に付着する酸化されたリポ酸塩種のＳ１を攻撃する。結果的に、リポ酸塩Ｓ２は硫化物またはスルフヒドリル成分として置換され、続く四面体ヘミチオアセタールの崩壊によりチアゾールが放出され、これによりＴＰＰ補助因子が放出され、かつリポ酸塩のＳ１にチオアセテートが産生される。この時点でリポ酸塩−チオエステルの機能性はＥ２活性部位内へ移動され、アシル基転移反応がアセチル基をリポ酸塩の「自在アーム」からコエンザイムＡのチオール基へ転移させる。これによりアセチルＣｏＡが産生され、酵素複合体から放出され、続いてＴＣＡサイクルに入る。ジヒドロリポ酸塩は複合体のリジン残基にまだ結合しているが、その後Ｅ３活性部位へ移動し、フラビンにより仲介される酸化によってそのリポ酸塩静止状態へ戻り、ＦＡＤＨ２（および最終的にはＮＡＤＨ）を産生し、かつリポ酸塩を再生して、コンピテントなアシルアクセプターへ戻る。このリポ酸塩種が遮断された場合、ＦＡＤＨ２への電子の流れまたはアセチルＣｏＡの産生がなくなり得る結果として細胞内にピルビン酸の毒性が蓄積する。癌細胞では、細胞の解毒および生存のためにアセトインの産生が必要なことが示唆されている。
【００２４】
以前に述べたように、ミトコンドリア内でのＰＤＨ複合体の活性は様々なアロステリックエフェクターおよび共有結合性の修飾によって高度に制御される。ＰＤＨ活性はそのリン酸化状態によって制御され、これは脱リン酸化状態で最も活性である。ＰＤＨのリン酸化はＰＤＫにより触媒される。ＰＤＫ活性はＡＴＰ、ＮＡＤＨ、およびアセチルＣｏＡレベルの増加により増大する。ＰＤＫの負のエフェクターは、ＡＴＰレベルが低下した時に増加するＡＤＰ、ＮＡＤ＋、ＣｏＡ−ＳＨ、およびピルビン酸である。脱リン酸化を通してＰＤＨを活性化する酵素であるＰＤＰの制御については完全に理解されていないが、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋がＰＤＰを活性化することが知られている。
【００２５】
複合体の二つの産物であるＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡは、ＰＤＨの脱リン酸化活性型であるＰＤＨ−ａに対する負のアロステリックエフェクターである。これらのエフェクターは、ピルビン酸に対する酵素のアフィニティーを減少させることによって、ＰＤＨ複合体を通した炭素の流れを限定する。加えてＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡは、ＰＤＨをリン酸化ＰＤＨ−ｂ型に変換することにより不活性化する酵素であるＰＤＫの、強力な正のエフェクターである。細胞のエネルギーチャージが高い際にＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡが蓄積されることから、エネルギーの豊富な細胞内で高レベルのＡＴＰがＰＤＫの活性もまた上昇させ、ＰＤＨの活性を減少させることは不思議ではない。しかしながらピルビン酸がＰＤＫの強力な負のエフェクターであることから、ピルビン酸のレベルが増加するときには、高レベルのＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡ存在下であってもＰＤＨ−ａになりやすいであろう。
【００２６】
ＡＴＰの豊富な細胞内ではＰＤＨ−ａを維持するピルビン酸の濃度が十分に高く、アロステリックに減少したＰＤＨの高Ｋｍ型はそれにもかかわらずピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換できる。高いＡＴＰおよびＮＡＤＨレベルを有する細胞内での大量のピルビン酸により、ピルビン酸の炭素は炭素の二つの主な貯蔵型（糖新生を通したグリコーゲンおよび脂肪酸合成を通した脂肪の産生）に方向付けられ得り、ここではアセチルＣｏＡが主要な炭素ドナーである。ＰＤＰ−ｂの制御はよく理解されていないが、減少したＡＴＰ濃度下でピルビン酸の酸化を最大化、および高いＡＴＰ濃度下でＰＤＨ活性を最小化するための制御である可能性がかなり高い。
【００２７】
腫瘍細胞は、ピルビン酸および付随するアルデヒドおよびラジカル、例えばアセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルを、これらの分子が高濃度において細胞内ｐＨを大幅に低下させるという機構により細胞傷害性であることから、無制限に蓄積できない。従ってＡＳ−３０Ｄおよびエールリッヒヘパトーマについては、ミトコンドリアピルビン酸の有意な画分が、ＰＤＨ複合体のＥ１成分により、結合したβ−ヒドロキシエチルチアミンピロリン酸を通して、活性アセトアルデヒドに脱炭酸されることが記載されている。この活性アセトアルデヒドは第二のアセトアルデヒドと共に次々に縮合し、最終的には元のピルビン酸をアミノ酸のグルタミンまたはリポ酸のいずれかを用いて脱酸または還元して、競合的にＰＤＨを阻害しかつそのピルビン酸前駆体よりも細胞に対する毒性の少ない（例えば細胞内でのｐＨ恒常性を維持することにより）化合物であるアセトイン（３−ヒドロキシブタノン）を産生する。しかしながら、ＡＴＰ産生の源としての解糖への依存によるピルビン酸蓄積の結果としての腫瘍細胞の解毒経路におけるアセトインの重要性にもかかわらず、先行技術には腫瘍細胞生存率に関して、アセトイン産生を遮断する効果についての参考文献は少ない。
【００２８】
最近の研究は、癌細胞にさらなる好気性の代謝を強制することによって腫瘍の増殖が抑制されることを示唆している。従って、ワールブルク代謝への移行はＰＤＨ複合体の遮断を必要とする。図５に示すように、この移行において癌細胞での低酸素誘導因子（ＨＩＦ）によるシグナル伝達の増大が見られることは、グルコースの代謝におけるＨＩＦの重要な役割を考えれば不思議ではない。直接または間接にＨＩＦのシグナル伝達を引き起こす変異は、実際に癌の発生における一般的な機構であると考えられる。ＨＩＦはＰＤＫ１の過剰発現を誘導し、これが次にＰＤＨ複合体の減少に働く。ＰＤＫ１によるリン酸化は、このアイソフォームがＰＤＨ複合体の第１のサブユニットであるＥ１のアルファサブユニットの三つのセリン残基を独自にリン酸化することから、不活性なＰＤＨ複合体の維持に特に有効となる。Ｅ１の再活性化は、三つのリン酸基全ての除去を必要とする。さらに、ＰＤＨ複合体の活性化はＲＯＳ産生の増大を導き得り、これが順にアポトーシスを導き得る。しかしながら、癌に見られるＰＤＫ１の変化は、その濃度の変化によるのみではなく、その活性の変化、およびおそらくは、実に一腫瘍型または一患者と他方との間でのそのアミノ酸配列の変化にもよる可能性がある。加えてＰＤＫ１は、腫瘍の型に依存して、腫瘍に付随する様々な分子と共に異なる複合体を形成し得る。従ってＰＤＫ１の阻害は、腫瘍にアポトーシスを起こすための潜在的な標的であり得る。しかしながら今日までに、既知のＰＤＫ１阻害剤は、このアイソザイムを最大６０％のみ阻害することが示されている。
【００２９】
伝統的な化学療法の標的は細胞の分裂、増殖であるが、全ての臨床的に許容される化学療法的な治療には大量の薬物が用いられ、これがホスト細胞の正常な増殖に深刻な損傷もまた誘導する。従って癌の治療には、さらに選択的な標的指向化が必要とされる。化学療法に付随する別の問題は、多くの腫瘍型において、抗新生物剤に対する固有であるかまたは獲得された抵抗性が存在することである。概して伝統的な化学療法は、現在ほとんどの悪性腫瘍に対する長期的な利点が少なく、かつしばしば生存期間またはその質を減少させる有害な副作用に関連する。従って、生命の適正な質を可能にしながら腫瘍の長期的な管理を提供できる、徹底的な新しいアプローチが必要とされている。
【００３０】
新しい化学療法の開発において、薬物の有効性、送達、および副作用は確実に解決されなければならない問題である。固形腫瘍における低酸素性の領域への送達は、薬物が異なる細胞層を容易に透過できないときに困難であり得る。このような不確実性を避けるため、少なくともマイクロモル以下の範囲で一定に代謝阻害する抗癌剤の設計に今日的な意味があると考えられる。癌細胞が系統から系統にわたって遺伝的および表現型的に異質であることが立証され得るが、全ての腫瘍細胞株はＡＴＰ供給のための解糖および酸化的リン酸化に依存する。ワールブルク効果に集中することは、健常ホスト組織および臓器の機能性に影響を与えることなく単に腫瘍の代謝および増殖に選択的に影響を与える送達および治療的戦略の設計を促進する、腫瘍および正常細胞の間での物理化学的および生化学的エネルギーの相違に基づく薬物設計を可能にする。
【００３１】
Ｂｉｎｇｈａｍらの米国特許第６，３３１，５５９号および６，９５１，８８７号、同様にＢｉｎｇｈａｍらの米国仮出願第６０／９１２，５９８号は全て参照としてここに取り込まれ、腫瘍細胞およびその他の特定の型の病的な細胞の両方を選択的に標的化しかつ死滅させる、新しい種類のリポ酸誘導体治療薬を開示する。これらの特許はさらに、有効量のこれらのリポ酸誘導体を薬剤的に許容される担体と共に含む医薬組成物、およびその使用法について開示する。しかしながら、これらの特許にはこれらのリポ酸誘導体の構造および一般的使用についてさらに記載されているが、いずれの特許にも、これらの誘導体がＰＤＨ複合体の構造および／または発現レベル、および／または活性の制御における調節に有用であることは指摘されていない。
【００３２】
ＰＤＨ複合体の構造および／または活性が腫瘍活性の重大な決定要因であることが示されていることから、ＰＤＨ複合体の構造および／または活性、またはさらに発現レベルの、薬剤的に許容される調節因子、およびその使用法を提供することは有益であろう。
【００３３】
発明の目的及び産業上の利用可能性
結果的に本発明の目的は、癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられる疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、腫瘍細胞に選択的活性を示す医薬組成物の提供である。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、前記の疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、投与による副作用が最少である医薬組成物の提供である。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、前記の疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、可能な最少の費用で容易に製造され、かつ可能な最長期間保存できる医薬組成物の提供である。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、前記の疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、特に腫瘍細胞のミトコンドリア内のＰＤＨ複合体の構造、活性、および／または発現レベルを通してミトコンドリアのエネルギー代謝を調節する医薬組成物の提供である。
【発明の概要】
【００３７】
前記の目的を達成するため、本発明は、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化により特徴付けられる、ヒトを含む温血動物の癌またはその症候群のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、または症候群の治療、診断、または予防に有用な医薬組成物を広く提供し、ここで該医薬組成物は、その全てが参照としてここに取り込まれる米国特許第６，３３１，５５９号および６，９５１，８８７号、ならびに米国仮出願第６０／９１２，５９８号に記載されるものを含む、少なくとも１の有効量のリポ酸誘導体、および少なくとも１のその薬剤的に許容される担体を含む。
【００３８】
ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することにより、本発明のリポ酸誘導体は病的な細胞におけるミトコンドリア膜電位およびその他のミトコンドリア事象両方の損失の原因となり、結果として非可逆的な細胞死が開始される。本発明のリポ酸誘導体はまた、ＰＤＫの活性化および／またはＰＤＰの阻害によるか、またはＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性阻害を通した、毒性の少ない分子であるアセトインへのピルビン酸の変換の阻害により、ミトコンドリアのエネルギー代謝も阻害し得る。アセトイン合成の阻害は、酸化還元バランスを含むその他の工程を歪め、かつアセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルを含む有毒な副生成物産生の原因となる可能性もあり、結果としてこれらの副生成物自体は病的な細胞のミトコンドリアに非可逆的な損傷を引き起こす。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、およびそれらの各変異体またはアイソフォームの効果を調節し得る。該医薬化合物はまた、ＰＤＰ１、ＰＤＰ２，およびそれらの各アイソフォームの効果も調節し得る。
【００４０】
本発明の医薬組成物はまた、ＰＤＨ複合体中に見出されるホスホリラーゼ、キナーゼ、および脱水素酵素の酵素構成物質の発現レベルも調節し得る。この調節は、転写、翻訳、または適切な遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを含む後翻訳段階において起こり得る。
【００４１】
ＴＣＡサイクルに基本的に付随する分子由来の化合物として、かつ解糖の伸展により、本発明の医薬組成物は腫瘍細胞内への選択的な取り込みを示す。さらにこのような選択的な腫瘍細胞への取り込みは、この医薬組成物の投与が健常な非形質転換細胞および組織に起こし得る副作用を最小化する。
【００４２】
本発明の第１の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式１
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）；芳香族；Ｒ３Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル；ヘテロアリール；Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル；有機金属アリール；アルキル−有機金属アリール；およびセミアセタール Ｒ５ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−から成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
またはその塩である。
【００４３】
本発明の第２の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式２
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ３Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ３Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、およびＲ４ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタールから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３およびＲ４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００４４】
本発明の第３の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式３
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタール Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され、；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ６はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
またはその塩である。
【００４５】
本発明の第４の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式４
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ４Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４およびＲ５は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００４６】
さらに、これらの一般構造のいずれかもしくは全てが細胞またはミトコンドリア内で代謝され得ることから、上に言及された構造の代謝産物は本発明の範囲内にあることが明確に意図される。
【００４７】
それぞれの一般式内で、特定のリポ酸誘導体それぞれの（Ｒ）−異性体は、（Ｓ）−異性体よりも大きな生理活性を有する。結果的にリポ酸誘導体は、単にその（Ｒ）−異性体型かまたは（Ｒ）−および（Ｓ）−異性体の混合物として存在するべきである。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または機能の制御または撹乱の変化を含む、ヒトを含む温血動物の癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、症候群、または症状を診断、治療、または予防するための方法が提供され、ここで該方法は、有効量のここに開示される医薬組成物をこのような動物へ投与することを含む。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化を含む、癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を呈する患者の診断および利益を予想するための方法が提供され、該方法は、患者から細胞サンプルを得ること、有効量の本発明の医薬組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞へ投与すること、およびそこから結果を得ることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
以下の図面は本発明の実施形態の図解であり、明細書および請求項の全体により包含される本出願の範囲を限定しようとするものではない。
【図１】ミトコンドリアへの出入りの両方を標的とする一般的なシグナル伝達分子およびそれらの効果を示した図である。
【図２】ミトコンドリアキナーゼおよびホスファターゼの一覧、およびミトコンドリア内でのそれらの位置を示した図である。
【図３】図３Ａは、ミトコンドリア外膜でのＰＫＡによるＢＡＤのリン酸化、およびそこにおける可逆的リン酸化の効果を示した図である。図３Ｂは、ＰＤＨ複合体の作用による、ミトコンドリアマトリックスでのピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換、およびそこにおける可逆的リン酸化の効果を示した図である。図３Ｃは、酸素の水への還元およびポンプによるプロトンのミトコンドリア内膜の横断におけるＣＯＸの作用、およびそこにおける可逆的リン酸化の効果を示した図である。
【図４】ピルビン酸の解糖による産生における基質および産物の構造を図示し、ＡＴＰおよびＮＡＤＨの産生ならびに付随する酵素もまた示した図である。
【図５】ＨＩＦ−１によるグルコース代謝の制御を示した図である。
【図６】図６Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、正常組織と癌組織の間でのエネルギー代謝の相違を示した図である。図６Ｂは、ＰＤＨ複合体中のリポ酸の生体型と、本発明の医薬組成物の一部を形成するリポ酸誘導体との間の相違を示した図である。図６Ｃは、ＰＤＫのリポイル残基効果による、ＰＤＨ複合体の制御を示した図である。
【図７】異種移植腫瘍の増殖における、本発明の医薬組成物の効果を示した図である。
【図８】三つの腫瘍細胞型および非形質転換細胞における、本発明の医薬組成物を用いた処理の効果を示した図である。
【図９】図９Ａは、致死閾値またはそれを超える量の本発明の医薬組成物により処理した肺癌細胞におけるＡＴＰレベルを示した図である。図９Ｂは、ピルビン酸を含む培地とグルコースを含む培地中での、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成阻害の比較を示した図である。図９Ｃは、乳癌細胞と正常乳房細胞における、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成の阻害を比較した図である。図９Ｄは、肺癌細胞における、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成の阻害と、リポ酸および本発明の不活性型によるＡＴＰ合成の阻害との比較を示した図である。
【図１０】ＰＤＨ複合体およびアルファケトグルタル酸（αＫＤＨ）脱水素酵素の酵素活性の腫瘍細胞ミトコンドリアでのレベルにおける、本発明の医薬組成物の効果を示した図である。
【図１１】図１１Ａは、本発明の医薬組成物による処理またはモック処理した肺癌細胞抽出物の、二次元ゲルのウェスタン分析を示した図である。図１１Ｂは、本発明の医薬組成物による処理またはモック処理した対の二次元ゲルサンプルを、拡大して示した図である。
【図１２】図１２Ａは、ＰＤＨ複合体Ｅ２サブユニットに共有結合した内在性リポ酸塩により調節される、ＰＤＫの制御的役割を示した図である。図１２Ｂは、本発明の医薬組成物による腫瘍細胞ＰＤＨ複合体の差次的な不活性化の、考えられる機構を示した図である。
【図１３】Ｈ４６０肺癌細胞のミトコンドリア膜電位における、本発明の医薬組成物の効果を示した図である。
【図１４】多様な腫瘍細胞型における本発明の医薬組成物による細胞死経路の、ウェスタンブロット分析の結果を示した図である。
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は一般的に、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化を含む、温血動物の癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるもの、またはそれらの症状を含む疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を治療、診断、または予防するための医薬組成物に方向付けられる。このような動物は、癌を含む細胞の過剰増殖によって特徴付けられる疾病ならびにその他の病態および症候群にかかりやすい、ヒト、ウマ、ウシ、イヌおよびネコを含む家畜などのような哺乳類を含む。本発明の医薬組成物は、チオクタンとしても知られる、米国特許第６，３３１，５５９号および６，９５１，８８７号、ならびに米国仮出願第６０／９１２，５９８号に記載されるものを含む、少なくとも１の有効量のリポ酸誘導体、およびそのための薬剤的に許容される担体または賦形剤を含む。ミトコンドリア内に通常見出されるのみではなく、ワールブルク効果に見られるような腫瘍細胞の増大した解糖活性にも役立つ誘導体分子として、本発明のリポ酸誘導体は、腫瘍のような過剰増殖により特徴付けられる細胞および組織のミトコンドリア内への選択的送達ならびに有効な濃度について特によく適しており、これにより正常な細胞および組織は該組成物の効果から逃れる。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、およびそれらの各アイソフォームの効果を可逆的リン酸化を通して調節し得る。該医薬組成物はまた、ＰＤＰ１、ＰＤＰ２，およびそれらの各アイソフォームおよび／または変異体の効果も、可逆的リン酸化を通して調節し得る。これらの調節は、キナーゼもしくはホスファターゼ活性の促進または阻害のいずれかを通して起こり得る。
【００５３】
ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することにより、本発明のリポ酸誘導体は病的な細胞におけるミトコンドリア膜電位およびその他のミトコンドリア事象両方の損失の原因となり、結果として非可逆的な細胞死が開始される。本発明のリポ酸誘導体はまた、ＰＤＫの活性化および／またはＰＤＰの阻害によるか、またはＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性阻害を通した、毒性の少ない分子であるアセトインへのピルビン酸の変換の阻害により、ミトコンドリアのエネルギー代謝も阻害し得る。アセトイン合成の阻害は、酸化還元バランスを含むその他の工程を歪め、かつアセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルを含む有毒な副生成物産生の原因となる可能性もあり、結果としてこれらの副生成物自体は病的な細胞のミトコンドリアに非可逆的な損傷を引き起こす。
【００５４】
本発明の第１の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式１
［式中、ｘは０〜１６を表し、Ｒ１およびＲ２は独立して
（１）アシル基 Ｒ３Ｃ（Ｏ）−であって、Ｒ３がアルキル、アリール、または有機金属アリール基を表し、チオエステル結合を通して連結され、限定はされないがアセチルおよびブタリル（ｂｕｔａｒｙｌ）を含み、特定の例としてビスアセチルリポ酸塩となるアシル基；
（２）チオエステル結合を通して連結される芳香族基であって、限定はされないがベンゾイルまたはベンゾイル誘導体を含み、特定の例としてビスベンゾイルリポ酸塩となる芳香族基；
（３）アルキル基 ＣｎＨ２ｎ＋１であって、ｎが１〜１０を表し、他の成分、例えば−ＯＨ、−Ｃｌ、または−ＮＨ２により置換されたこのようなアルキル基とチオエーテル結合を通して連結され、限定はされないがメチル、エチル、ブチル、デカニル、および６，８−ビスカルボモイル（ｃａｒｂｏｍｏｙｌ）メチルリポ酸塩を含むアルキル基；
（４）アルケニル基 ＣｎＨ２ｎ−１であって、ｎが２〜１０を表し、チオエーテル結合を通して連結され、限定はされないがプロピレン、２，３ジメチル−２−ブテン、およびヘプテンを含むアルケニル基；
（５）アルキニル基 ＣｎＨ２ｎ−３であって、ｎが２〜１０を表し、チオエーテル結合を通して連結され、限定はされないがアセチレン、プロピン、およびオクチンを含むアルキニル基；
（６）鎖式、または複素環を形成するいずれの炭素の付加もしくは置換を有する脂環基による脂環式のいずれかであってよいアルキル、アルケニル、およびアルキニル基であって、限定はされないがシクロプロパン、シクロペンテン、および６，８メチル−スクシンイミドリポ酸塩を含むアルキル、アルケニル、およびアルキニル基；
（７）それらのいずれの炭素にも付加を有してよいアルキル、アルケニル、およびアルキニル基であって、限定はされないがヒドロキシルおよびアミンを含むアルキル、アルケニル、およびアルキニル基；
（８）チオエーテル結合を通して連結され、ベンゼンまたはベンゼン誘導体であってよい芳香族またはアリール基であって、限定はされないがトルエンおよびアニリンを含む芳香族またはアリール基；
（９）硫化アルキル基 ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−であって、限定はされないがｎは０〜９を表してよく、ジスルフィド結合を通して連結される硫化アルキル基；
（１０）イミドイル基 ＣＨＲ４Ｃ（＝ＮＨ）−であって、限定はされないがｎは１〜１０を表してよく、チオアミド結合を通して連結されるイミドイル基；および
（１１）セミアセタール基 Ｒ５ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−であって、Ｒ５が強力な電子求引性の置換基をもつ化合物に限定され、限定はされないがトリクロロアセトアルデヒドおよびピルビン酸を含むセミアセタール基であってよい］
またはその塩により定義される。
【００５５】
上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく、スルホキシドまたはスルホン産生のために酸化できるチオエステル、例えばＣ−Ｓ（Ｏ）−ＲおよびＣ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒもまた含んでよい。
【００５６】
Ｒ１およびＲ２はさらに、チオスルフィン酸またはチオスルホン酸へと酸化できるジスルフィド、例えばそれぞれＣ−Ｓ（Ｏ）−Ｓ−ＲおよびＣ−Ｓ（Ｏ）２−Ｓ−Ｒを含んでよい。
【００５７】
Ｒ３は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよい。同様に、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよい。
【００５８】
Ｒ５は−ＣＣｌ３、−ＣＦ３、または−ＣＯＯＨを表す。
【００５９】
本発明の第２の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式２
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ３Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｎＨ２ｎ−１として定義されるアルケニル、ＣｎＨ２ｎ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ３Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、およびＲ４ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタールから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３およびＲ４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は−ＣＣｌ３、−ＣＦ３、または−ＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、およびｎは０〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００６０】
本発明の第３の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式３
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタール Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され、；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ６はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
またはその塩である。
【００６１】
本発明の第４の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式４
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ４Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４およびＲ５は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００６２】
さらに、これらの一般構造のいずれかもしくは全てが細胞またはミトコンドリア内で代謝され得ることから、上に言及された構造の代謝産物は本発明の範囲内にあることが明確に意図される。
【００６３】
第１および第２両方の一般式内で、特定のリポ酸誘導体それぞれの（Ｒ）−異性体は、（Ｓ）−異性体よりも大きな生理活性を有することが観察されている。従って、本発明における使用のためには両方の異性体が意図されるが、特に好ましい実施形態では（Ｒ）−異性体を優先的に用いるか、または（Ｓ）−異性体との混合物中に（Ｒ）−異性体が存在することが特に意図される。
【００６４】
本発明の医薬組成物はまた、ＰＤＨ複合体中に見出されるホスファターゼ、キナーゼ、および脱水素酵素の酵素構成物質の発現レベルも調節し得る。この調節は、転写、翻訳、または適切な遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを含む後翻訳段階において起こり得る。
【００６５】
本発明の組成物は、薬剤的に許容される担体または賦形剤をさらに含んでよい。薬剤的に許容される担体の例は当該技術分野において公知であり、医薬組成物中で通常用いられるもの、例えば限定はされないが、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、香味料（ｆｌａｖｏｒａｎｔｓ）、着色剤、保存料、生物学的利用能を増大させるための吸収促進剤、抗菌剤、およびそれらの組み合わせを含む。このような添加物の量は望まれる性質に依存し、当業者によって容易に決定できる。
【００６６】
通常本発明の医薬組成物は、塩、緩衝剤、保存料、および適合する担体を、任意にその他の治療的成分と組み合わせて含んでよい。医薬に用いられる場合、塩は薬剤的に許容されなければならないが、薬剤的に許容されない塩が、その薬剤的に許容される塩の調製のために便利に用いられてよく、本発明の範囲から除外されるものではない。このような薬理学的および薬剤的に許容される塩は、限定はされないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、マロン酸、ギ酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されるものを含む。また、薬剤的に許容される塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩のような、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製できる。
【００６７】
本発明はさらに、細胞に有効量の少なくとも１の治療薬または診断薬を送達することによる、患者を治療薬または診断薬によって治療または診断するための、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットの構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化を含む方法を、細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を予防、診断、または治療するために提供する。癌の改良された治療としてのＰＤＨ複合体の調節が特に意図され、これは腫瘍細胞増殖、血管新生、転移性増殖、アポトーシスの制御による原発腫瘍の治療、および外科的な除去の後または同時に起こる微小転移の発生の治療；および原発腫瘍の放射線またはその他の化学療法による治療を含む。本発明の医薬組成物は、原発性または転移性のメラノーマ、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、大腸癌、ならびに腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、および膵臓癌のような癌の型に有用である。
【００６８】
治療および診断への応用のため、該医薬組成物は、薬剤的に許容される担体と組み合わせた場合に患者へ直接投与できる。この方法は、治療薬もしくは診断薬を単独、または有効量のその他の治療薬もしくは診断薬、限定はされないが解糖阻害剤、微小管相互作用剤、細胞増殖抑制剤、葉酸阻害剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ポドフィロトキシンまたはその誘導体、抗腫瘍剤、抗生剤、化学療法剤、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、ナイトロジェンマスタード、核酸挿入剤、およびそれらの組み合わせ、と組み合わせて投与することにより実行されてよい。このような治療薬は、その他の代謝阻害剤をさらに含んでよい。このような治療薬の多くは公知である。組み合わせによる治療法は、治療法に対する患者の反応を増幅または確実にする必要に応じたこのような状態の治療において、同時、連続的、または別々の使用を提供する。
【００６９】
本発明の方法は、医学的に許容される投与のいずれの様式を用いて実行されてもよく、臨床的に許容されない有害作用を起こすことなく、有効濃度の活性化合物を産生する。製剤は特に非経口投与に適することが好ましいが、本発明の組成物はエアロゾル、スプレー、散剤、ゲル、ローション、クリーム、坐薬、軟膏などの形態において、吸入、経口、外用、経皮、経鼻、眼内、肺内、直腸内、経粘膜、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、胸腔内、胸膜内、子宮内、腫瘍内、または点滴の方法論または投与のためにもまた処方できる。このような製剤が望まれる場合、望まれる一貫性およびその他の性質を製剤に与えるため、当該技術分野において公知のその他の添加物が含まれてよい。
【００７０】
当業者は、治療薬または診断薬の特定の投与様式は、投与が疾病、状態、症候群、またはそれらの症状の治療、診断、または予防；治療または診断される医学疾患の重症度；および治療的有効性に要求される投薬量のためであるか否かに関わらず、選択された特定の薬剤に依存することを認識するであろう。例えば、白血病治療のための抗癌剤投与の好ましい様式は静脈内投与を含み得るが、皮膚癌治療の好ましい方法は、局所または皮内投与を含んでよい。
【００７１】
ここで用いられる「有効量」は、望まれる治療効果または診断効果が達成される、治療薬もしくは診断薬の投薬量または複数の投薬量を指す。一般に治療薬または診断薬の有効量は、用いられる特定の薬剤の活性；その薬剤の代謝の安定性および作用の長さ；種、年齢、体重、一般的健康、食事状態、性別および被験体の食事制限；投与の様式および時間；排泄速度；場合により薬物の組み合わせ；および治療される特定の状態の症状および／または重症度の程度によって変動し得る。望まれる結果を得るための１日当たりの１回または数回の投与における正確な投薬量は、当業者によって過度の実験なしに決定でき、かつ該投薬量は望まれる治療効果を達成するためか、またはいずれの合併症の現象において、個々の実行者により調整されてよい。重要なことは、癌治療に用いる際、使用される治療薬の投薬量は正常細胞には実質的に無害であるものの、腫瘍細胞の死滅には十分でなければならないことである。
【００７２】
本発明の医薬組成物に含まれる治療薬または診断薬は、患者へ安全に投与できる最大量までの、望まれるいずれの量においても調製できる。治療薬または診断薬の量は、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満から１０００ｍｇ／ｍＬを超えるまで、好ましくは約５０ｍｇ／ｍＬに変動してよい。
【００７３】
一般に本発明の医薬組成物は、ＰＤＨ複合体の構造および／または活性の調節に有効な量を患者へ投与するために十分な様式で送達され得る。従って投薬量は、約０．３ｍｇ／ｍ２から２０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約６０ｍｇ／ｍ２に変動してよい。投薬量は単一用量において、または個別に分けられた用量の形、例えば１日当たり１から４以上において投与されてよい。被験体の反応がある用量において不十分な場合は、より高い用量（または異なる、さらに限局性の送達経路による有効なより高い用量）が、患者の耐性の範囲まで用いられてよい。１日当たりの複数の用量は、治療薬もしくは診断薬の適切な全身性または標的濃度を達成するために意図される。
【００７４】
さらに本発明の別の実施形態によれば、本発明のリポ酸誘導体はｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断薬および予測薬（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）として用いられてよい。先に述べたように、問題となる特定の腫瘍細胞または細胞型に依存して、様々なリポ酸誘導体は、ＰＤＨ複合体の調節を通した異なる腫瘍の種類の阻害について多かれ少なかれ有効であり得る。従って、例えば診断または適切な化学療法的戦略の選択が困難であり得る場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の培養を、特定の腫瘍細胞型を標的にすることが知られているリポ酸誘導体と共に試験することにより、腫瘍型および有効な治療を特定するための別のアプローチが提供される。
【００７５】
図面に戻ると、図６Ａは、正常組織および腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのエネルギー代謝において考えられる多数の相違を図示する。相当する条件下で正常細胞に比べると、腫瘍細胞はしばしばＡＴＰ産生のためにミトコンドリアのエネルギー代謝よりも細胞質の解糖に強く依存する。ＰＤＨ複合体の発現および制御の変化は、明らかにこの腫瘍特異的な適応の一部である。これらの効果を生み出す、ＰＤＨの触媒成分のレベルの減少および／または抑制性ＰＤＫのレベルの増加により、腫瘍細胞は、ＰＤＨ複合体を攻撃する薬剤に対して正常細胞よりもさらに脆弱となるであろう。
【００７６】
図６Ｂは、リポ酸がＰＤＨ複合体中でピルビン酸からのアセチルＣｏＡ合成に関わる正常の反応を触媒することから、この構造を示す。リポ酸はｉｎ ｖｉｖｏでそのカルボキシル末端を通し、非ペプチドアミド結合によって、Ｅ２リポイルドメイン活性部位におけるリジンのイプシロンアミノ基へ連結する。ＰＤＨ Ｅ２結合リポ酸塩の酸化／還元／アセチル化状態は、Ｅ１αＰＤＨサブユニットのリン酸化の不活性化を制御することによってＰＤＨ活性を制御する、キナーゼおよびホスファターゼによりモニターされることも認められる。この図面はまた、本発明において使用されてよい三つの代表的なリポ酸誘導体の構造も示す。細胞培養において、ＣＰＩ−６１３およびＣＰＩ−０４５は高い抗癌効力を持つが、ＣＰＩ−１５７は活性が少ないかまたは無であり、幾つかの実験ではコントロールとして有用である。
【００７７】
図６Ｃは、Ｅ２をその結合リポ酸塩であるＥ１と共に含むＰＤＨ複合体成分と、調節性ＰＤＫとの間の関連性を示す。高レベルのアセチルリポ酸塩またはジヒドロリポ酸塩（図示していない）はＰＤＫを活性化し、次にこれがＰＤＨ複合体触媒作用の第１段階を触媒するサブユニットであるＥ１αを不活性化することによって、ＰＤＨ複合体を通したさらなる流れを抑制する。図３Ａに見られるように、この工程はＰＤＨ複合体を通した炭素／エネルギーの流れの調速機として作用し、かつこの調節工程は明らかに、様々な腫瘍細胞のエネルギー代謝を支持するために実質的に変更される。
【００７８】
図７は、異種移植腫瘍の増殖における本発明の医薬組成物の効果を示す。実施例２に記載するように、脇腹の背側に細胞を皮下移植した。次に、図に示す日にマウスへの薬物（またはビヒクルのみ；「モック」）の腹腔内注射を開始した。左のパネルに、週に３回１ｍｇ／ｋｇの本発明またはビヒクルコントロールと共に注射した膵臓腫瘍モデルを示す。この実験は、ＢｘＰＣ−３細胞により行った２実験、およびＡｓＰＣ−１細胞により行った２実験の代表である。右の三つのパネルは、週に１回（丸）、週に３回（逆三角形）、または週に５回（ビヒクル処置は三角形、薬物処置は四角形）のいずれかにより示される濃度と共に注射したＨ４６０肺腫瘍モデルを示す。この実験は、Ｈ４６０細胞により行った４実験の代表である。
【００７９】
図８は、三つの腫瘍細胞型および非形質転換細胞型（ＭＤＣＫ）を、２００〜３００μＭ（「処理」）またはモック処理（「モック処理」）のいずれかで、本発明の医薬組成物により処理した効果を示す。細胞は１０％血清を含む適切な組織培地により、または４８時間処理した。実施例２に記載の方法論を通し、三つの癌細胞株にアポトーシスまたはアポトーシス様経路（図１１も参照）による広範な細胞死が観察される。対照的に、非形質転換ＭＤＣＫ細胞は、明らかにこの用量での薬物処理によって影響されない。
【００８０】
図９Ａは、致死閾値（１０％血清中、２００μＭ）またはそれを超える量の本発明の医薬組成物により処理したＨ４６０肺癌細胞におけるＡＴＰレベルを示す。破線は表示される濃度での処理を示す。対応するテクスチャの実線は、表示される時間後に薬物を除去し、薬物を含まない培地中で６０分間回復させる処理を示す。一組の矢印（Ｂｌｏｃｋ ａｒｒｏｗｓ）は、ＡＴＰ回復の間隔を示す。
【００８１】
図９Ｂは、ピルビン酸（ピルビン酸メチルの形）が主要な炭素原である培地（破線）とグルコースが主要な炭素原である培地（実線）中での、ＡＴＰ合成の阻害を比較する。本発明の医薬組成物は、両方の培地中で、同じ閾値濃度において最終的に細胞死を引き起こすが、細胞の全ＡＴＰレベルの早い枯渇はピルビン酸を含む培地中で高度であり、グルコースを含む培地中では見られないことが認められる。また、細胞死の開始は２００μＭよりも３００μＭの薬物濃度でより迅速である。
【００８２】
図９Ｃは、ＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞とＨＭＥＣ正常乳房細胞における、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成の阻害を比較する。図６Ａおよび図６Ｂにその結果が示される実験とは対照的に、これらの実験は無血清培地（ＭＥＢＭ）中で行った。結果として薬物の致死閾値は、約５０μＭと低めであった。正常細胞サンプルにおける２２時間目のＡＴＰレベルの小さな低下は薬物用量には関連せず、普通の実験的変動を反映していることに留意されたい。
【００８３】
図９Ｄは、本発明の医薬組成物（左のグラフ）、リポ酸（中央のグラフ）、および本発明の不活性型（右のグラフ）による、Ｈ４６０肺癌細胞におけるＡＴＰ合成の阻害を比較する。図９Ｃに示すように、これらの実験は、薬物の致死閾値が約５０μＭとなるように無血清培地中で行った。
【００８４】
図１０は、ＰＤＨ（ＰＤＣ）および（αＫＤＨ）の酵素活性の、腫瘍細胞ミトコンドリアでのレベルにおける、本発明の医薬組成物（１０％血清を含むＤＭＥＭ中で４００μＭ）の効果を図示する。ＰＤＨは強力に阻害されるが、αＫＤＨはそうでないことが認められる。実施例２に記載するように、精製したミトコンドリア抽出物中の酵素活性レベルは、添加炭素源に反応するレサズリン還元を用いて測定する。バックグラウンドラインは、添加炭素源なしのレサズリン還元に相当する。
【００８５】
次に図１１Ａでは、本発明の医薬組成物により処理（＋）またはモック処理（−）した（１０％血清を添加したＲＰＭＩ培地中で、４００μＭで１２０分間）Ｈ４６０肺癌細胞抽出物の、二次元ゲルのウェスタン分析を行った。ウェスタン転写は、ＰＤＨ複合体のＥ１αおよびＥ２サブユニットに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いて探査した。ウェスタン転写はＥ２に合わせた。薬物処理サンプル中のＥ１には、高リン酸化型の実質的に高いレベルおよび低リン酸化型の減少したレベルが認められる。左の垂直な白線は、ゲル整列の基準の一つである、Ｅ２サブユニットの移動度を示す。右の垂直な白線は、推定的、酵素的に活性のある成分である、リン酸化の少ないＥ１α型を通る。
【００８６】
図１１Ｂは、本発明の医薬組成物による処理またはモック処理した対の二次元ゲルサンプルを、拡大して示す。エレメントＡは、図８Ａの一部の拡大である。エレメントＢは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞培地中で、モック処理（−）、および８０μＭの組成物で１８０分間処理（＋）されたＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞である。エレメントＣは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞培地中で、モック処理（−）、および８０μＭの組成物で２４０分間処理（＋）されたＨＭＥＣ正常乳房上皮細胞である。エレメントＤは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞培地中で、モック処理（−）、および８０μＭの組成物で２４０分間処理（＋）されたＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞である。垂直な白線は、推定的、酵素的に活性のある成分である、リン酸化の少ないＥ１α型を通る。
【００８７】
図１２Ａおよび１２Ｂは、本発明の医薬組成物のｉｎ ｖｉｖｏでの強力で選択的な抗癌効果に対する作業仮説を示す。例えば図１２Ａは、ＰＤＣ Ｅ２サブユニットに共有結合した内在性リポ酸塩により調節される、ＰＤＫの制御的役割を示す。ＰＤＫは通常、高レベルの還元および／またはアセチル化リポ酸塩に反応してＰＤＣを不活性化し、これは腫瘍細胞内で明らかに実質的に修飾される工程である。
【００８８】
同時に図１２Ｂは、ＰＤＣ内における、ＰＤＫのその基質であるＰＤＣ−Ｅ１に対する比の大きな量的相違を示し、このことはｉｎ ｖｉｖｏで正常および腫瘍細胞を区別すると考えられる。正常細胞では、低レベルのＰＤＫがＰＤＨ複合体の周囲をｈａｎｄ−ｏｖｅｒ−ｈａｎｄに「歩く」（その二つの二量体サブユニットを通して）と考えられており、徐々にＥ１をリン酸化する。このリン酸化は、ＰＤＰの脱リン酸化と定常的に平衡状態である（図示していない）。ここに図示される作業仮説では、チオクタンが、通常アセチルリポ酸塩および／またはジヒドロリポ酸塩が結合するのと同じ部位を通じてＰＤＫを刺激し、これにより１以上のＰＤＫアイソフォームを不活性なＥ１αへと人工的に刺激する。癌細胞では、さらに高レベルのＰＤＫが、チオクタンによりさらに効果的にこの刺激を作り出し、ＰＤＣの酵素活性およびミトコンドリアエネルギー代謝を停止させるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下の限定されない実施例は、本発明の医薬組成物についての理解を促進するために提供される。
【実施例１】
【００９０】
チオクタンの化学合成
リポ酸誘導体（すなわちチオクタン）ＣＰＩ−６１３およびＣＰＩ−１５７は、米国特許第６，３３１，５５９ Ｂ１号および米国特許第６，９５１，８８７ Ｂ２号に記載の方法の改変により、６，８−ビスメルカプトオクタン酸を出発物質として用いて合成した。チオクタンＣＰＩ−０４５は、米国特許第６，３３１，５５９ Ｂ１号に記載の通りに合成した。
【００９１】
三つのチオクタンの構造解析について以下に述べる。ＣＰＩ−０４５とＣＰＩ−６１３の独立した複数の合成は、これらの抗癌特性について区別できなかった。異種移植（図７）およびＡＴＰ測定（図９）に用いたＣＰＩ−６１３の純度は９９％を超えていた。その他の全ての調製品は９８％を超える純度であった。
【００９２】
ＣＰＩ−６１３：６，８−ビスベンジルスルファニルオクタン酸：白色の結晶性固体、ｍ．ｐ．６５〜６６℃（ｌｉｔ．１６７．５〜６９°）；１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１５−７．４（ｍ，１０Ｈ）、３．６６（ｓ，２Ｈ）、３．６４（ｓ，２Ｈ）、２．５２−２．６２（ｍ，１Ｈ）、２．５０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．２９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、１．２−１．８（ｍ，８Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：δ１７９．６、１３８．６、１３８．５、１２８．９、１２８．８、１２８．５、１２８．４、１２６．９、４４．１、３６．４、３５．１、３４．４、３３．８、２８．７、２６．０、２４．４。
【００９３】
ＣＰＩ−１５７：６，８−ビスエチルスルファニルオクタン酸：無色の油；ＴＬＣ
（ＥｔＡｃ：ヘキサン：ＨＡｃ，２００：２００：１ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．６０；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．６４−２．７６（ｍ，１Ｈ）、２．６５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．５２（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．４９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．３６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．４０−１．８５（ｍ，８Ｈ）、１．２５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．２２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１８０．０、４４．３、３４．６、３３．９、２８．９、２６．２、２５．９、２４．５、２４．２、１４．９、１４．７；ＩＲ（フィルム）：２９６３、１７０８、１４４９、１４２３、１２８３、１２６３ｃｍ−１。
【００９４】
ＣＰＩ−０４５：６，８−ビスベンゾイルスルファニルオクタン酸：無色の粘性油；ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＡｃ：ＨＡｃ，１００：５０：１ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．３０；１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．９−８．１（ｍ，４Ｈ）、７．３８−７．６０（ｍ，６Ｈ）、３．８−４．０（ｍ，１Ｈ）、３．０−３．３（ｍ，２Ｈ）、２．３４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．４−２．２（ｍ，８Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９１．７、１９１．５、１７９．７、１３７．０、１３６．９、１３３．３、１２８．５、１２７．３、１２７．１、４３．６、３５．０、３４．６、３３．８、２６．４、２６．２、２４．３；ＩＲ（フィルム）：２９７３、１７１０、１７０４、１６６７、１６６５、１６６２、１４４８、１２０７、１１７５、９１１、７７３、７５７、７３３、６８８、６４８ｃｍ−１。
【実施例２】
【００９５】
チオクタンの抗癌効果決定のために用いた方法
細胞：ヒト腫瘍細胞株はＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの勧告に従って増殖させた。ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）、末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）、および正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）の初代細胞は、ＬＯＮＺＡ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｉｎｃ（ウォーカーズビル、メリーランド州）から得た。各細胞株は、開発した供給業者から購入した適切な培地中で、供給者の指示に従って維持および増殖させた。ここに報告する実験では、３ないし６回継代した正常細胞を使用した。
【００９６】
腫瘍増殖阻害の研究：ＣＤ１−Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスに、ヒトＢｘＰＣ−３もしくはＡｓＰＣ−１膵臓腫瘍細胞、またはＨ４６０ ＮＳＣＬＣを皮下（ＳＣ）注射によって移植した。約８〜１２日後、図の説明文に示される用量およびスケジュールによりマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。薬物またはビヒクルは、体重２５ｇあたり約２ｍｌ注射した。薬物濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌ（約３．１ｍＭ）以下であった。ビヒクル／溶媒は、２５ｍＭ以下のトリエタノールアミン水溶液により構成された。モック処置動物に注射されたビヒクルは、この実験で最も高い薬物用量が注射された溶媒と常に同一であった。マウスは、健康状態および死亡率について毎日モニターされた。体重および腫瘍の体積を、処置前には毎日、処置中および処置後には週に約３回評価した。マウスはＳｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ大学動物施設において、１２時間の明／暗サイクルに置かれ、自由に摂食し、施設の指針に従って飼育された。
【００９７】
細胞死アッセイ：細胞生存率評価のために、ほとんどの場合ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、チオクタンによるＡＴＰ合成の初期の阻害によって混乱させないための十分に長い時間使用した（図９）。典型的な実験では、黒く透明な底の９６ウェルプレートに、細胞をウェルあたり５，０００細胞まいた。１８〜２５時間後に培地を、薬物溶媒（血清を含む培地中に２．８ｍＭ、無血清培地中に０．７ｍＭの、トリエタノールアミン水溶液）または同じ溶媒中のチオクタンＣＰＩ−６１３を含む新鮮な培地に交換した。製造者の指示に従い、薬物用量に応じて、薬物添加後２４または４８時間後にアッセイを行った。
【００９８】
幾つかの場合には、細胞は４８ウェルプレートにウェルあたり１０，０００細胞まき、１８〜２５時間後に培地を、薬物溶媒（最終濃度が１％のＥｔＯＨ）または同じ溶媒中の様々な濃度のチオクタンＣＰＩ−０４５を含む新鮮な培地に交換した。残りの実験の間、細胞を溶媒または薬物を含む培地中にとどめた。薬物添加後２４、４８、および７２時間後にプレートを点検し、コンフルエンスのパーセンテージから細胞数を推定した。これらの条件下でチオクタンにより誘導された細胞死は、閾値に近い用量で高度にアポトーシス性であり、細胞数の推定は非常に信頼できる死の指標である（図１０）。７２時間後にも完全な細胞が残っていた場合には、トリパンブルー排除試験を行った。
【００９９】
表２に、腫瘍細胞に対するチオクタンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの作用についてのデータを示す。ＣＰＩ−６１３および／またはＣＰＩ−０４５による殺傷に対する感受性について本発明者らが調査した、ヒト腫瘍および初代ヒト細胞を収載する。「＋」は、約２００〜３００μＭ（１０％血清存在下で）および無血清培地中で約５０μＭの用量でアポトーシスまたはネクローシス様の細胞死を起こした細胞を示す（図８および図９）。「−−」は、相当する培地中で細胞死誘導のために５倍高い薬物用量を必要とした細胞を示す。「ｎｔ」は、未試験の組み合わせを示す。図８でのＭＤＣＫ正常細胞と同様に、全ての腫瘍細胞株は１０％血清を含む適切な培地中で分析された。加えて、ＨＭＥＣ、ＳＡＥＣ、ＮＨＫＣ初代ヒト細胞、およびＳＫ−ＢＲ−３、Ａ５４９およびＨ４６０腫瘍株もまた、適切な無血清培地中で分析された。初代細胞は接触阻止され、形質転換細胞は同程度の濃度であった。
【０１００】
ＡＴＰアッセイ：黒く透明な底の９６ウェルプレートに、細胞をウェルあたり５，０００細胞まいた。１８〜２５時間後に培地を、薬物溶媒（トリエタノールアミン）またはチオクタン（ＣＰＩ−６１３またはＣＰＩ−１５７）またはリポ酸を含む新鮮な培地に、示される時間間隔および薬物濃度において交換した。トリパンブルー排除を用い、細胞の生存率および完全性を、薬物を除去した後の回収率によって評価した。ＡＴＰは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造者の指示に従って測定した。全ての測定は二重に行い、高い一貫性が示された。平均の標準誤差は、測定値の０．１〜２％の範囲であった。その結果、図９ではエラーバーを省略した。図９のピルビン酸メチル培地は、１０％透析ウシ胎仔血清、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、および１０ｍＭピルビン酸メチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した、グルコースを含まないＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成り、対応するグルコース培地は従来のＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。
【０１０１】
ＰＤＨおよびαＫＤＨ酵素アッセイ：腫瘍細胞を１５ｃｍプレート内で８０％コンフルエンスに増殖させ、示されているようにＣＰＩ−６１３によって処理した。ＭｏｒｅａｄｉｔｈおよびＦｉｓｋｕｍ１の方法に従ってミトコンドリアを分離した。ミトコンドリアを０．４％ラウリルマルトシド中で溶解した。５０μｌのミトコンドリアライセートを９６ウェルプレートへ加えた。５０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２ｍＭ β−ＮＡＤ＋、２２５μＭｖ ＴＰＰ、２ｍＭピルビン酸またはα−ケトグルタル酸、１５０μＭコエンザイムＡ、２．６ｍＭシステイン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）をミトコンドリアライセートに加え、混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。この時点で、混合物に１５μＭのレサズリンおよび０．５Ｕ／ｍｌのジアホラーゼを加え、さらに５分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ）内での５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長を用いた蛍光測定により、ＮＡＤＨの産生をモニターした。全ての測定は二重に行い、高い一貫性が示された。平均の標準誤差は、測定値の０．３〜４％の範囲であった。その結果、図１０ではエラーバーを省略した。
【０１０２】
Ｅ１αのリン酸化：
２−Ｄゲルのための細胞ライセート：細胞を６０ｍｍディッシュ内で９５％コンフルエンスに増殖させ、示されているように薬物または溶媒によって処理した。細胞をｉｎ ｓｉｔｕで４５０μｌの溶解緩衝液Ａ［４５５μｌ Ｚｏｏｍ ２Ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ １（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５μｌ １Ｍトリスベース、５μｌ １００Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡを含まないＣｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ）；５μｌ ２Ｍ ＤＴＴ］により溶解した。細胞ライセートを１．５ｍｌ微量遠心チューブへ移し、氷上で５０％出力にて１５段階の超音波処理を行った。室温での１０分間のインキュベーション後に２．５μｌのジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、ライセートをさらに１０分間インキュベートした。５μｌの２Ｍ ＤＴＴを加えて、過剰のＤＭＡを中和した。ライセートを１６，０００ｘｇで１５分間遠心した。
【０１０３】
２−Ｄゲル：Ｚｏｏｍ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って使用した。簡単に述べると、３０〜５０μｌのライセートを０．８μｌ ｐＨ３〜１０両性電解質、０．７５μｌ ２Ｍ ＤＴＴと混合し、Ｚｏｏｍ ２Ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ １にて１５０μｌにした。１５０μｌのサンプルをＩＰＧ ｒｕｎｎｅｒ内に装填し、ｐＨ３〜１０のＮＬ ＩＰＧストリップを加えた。ストリップを室温で一晩浸漬した。等電点（ｉｓｏｌｅｃｔｒｉｃ）電気泳動には段階的プロトコルを使用した（２５０Ｖ、２０分；４５０Ｖ、１５分；７５０Ｖ、１５分 ２０００Ｖ、３０分）。ストリップを１Ｘローディング緩衝液で１５分間、続いて１Ｘローディング緩衝液および１６０ｍＭヨード酢酸で１５分間処理した。ストリップはＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ＺＯＯＭゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動した。
【０１０４】
表２ 腫瘍および初代細胞に対するチオクタンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果
【０１０５】
ウェスタン：タンパク質はＰＶＤＦ ４．５μｍメンブレンにブロットした。ｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＤＨ Ｅ１αおよびＥ２を検出した。
【０１０６】
カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの切断：Ｒｏｙ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ．２に従い、切断されたカスパーゼ−３をウェスタンブロットにて検出した。簡単に述べると、薬物または溶媒処理後に細胞をかき取り、培地／細胞／アポトーシス小体の混合物を６０００ｘｇにて遠心した。ペレットを溶解緩衝液Ｃ（４Ｍ尿素、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００３％ＢＰＢ；５％ ２−メルカプトエタノール）により溶解した。ウェルあたり３０μｇの全細胞ライセートタンパク質を、１２％ビス−トリスゲルにロードした。タンパク質はＰＶＤＦ ４．５μｍメンブレンにブロットした。抗カスパーゼ３ｍＡｂ（マウスモノクローナル［３１Ａ１０６７］；ａｂｃａｍ）により、プロ−および活性化カスパーゼ３を検出した。モノクローナル抗ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ抗体、クローンＣ−２−１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＰＡＲＰ切断を検出した。
【０１０７】
ミトコンドリアＣａ２＋の検出：細胞を３５ｍｍガラス底プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３ｘ１０５まき、一晩増殖させて、示されているように薬物または溶媒によって処理した。次に細胞をカルシウム色素Ｆｌｕｏ−４、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１またはＲｈｏｄ−２（４μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にフェノールレッドを含まない培地中にロードし、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ（Ｚｅｉｓｓ）デコンボリューション顕微鏡を用い、固定した露光時間で、ＦＩＴＣフィルターを用いて画像を得た。蛍光の定量化は、製造者より提供されたソフトウェアを用いて行った。Ｘ−Ｒｈｏｄ−１およびＲｈｏｄ−２からは同様の結果が得られ（図１３）、これらの色素はミトコンドリアＣａ２＋シグナルを測定していることが示された３−４。
【０１０８】
参考文献
１．Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ ＲＷ ａｎｄ Ｆｉｓｋｕｍ Ｇ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｒｏｍ Ａｓｃｉｔｅｓ Ｔｕｍｏｕｒ−Ｃｅｌｌｓ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３７，３６０−３６７（１９８４）．
２．Ｒｏｙ Ｓ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＤＷ．Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｃａｓｐａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ３２２，１１０−１２５（２０００）．
３．Ｇｅｒｅｎｃｓｅｒ ＡＡ ａｎｄ Ａｄａｍ−Ｖｉｚｉ Ｖ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ３０，３１１−３２１（２００１）．
４．Ｇｙｏｒｇｙ Ｈ，Ｇｙｏｒｇｙ Ｃ，Ｄａｓ Ｓ，Ｇａｒｃｉａ−Ｐｅｒｅｚ Ｃ，Ｓａｏｔｏｍｅ Ｍ，Ｒｏｙ ＳＳ，ａｎｄ Ｙｉ ＭＱ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃａ２＋ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ４０，５５３−５６０（２００６）．
【実施例３】
【０１０９】
チオクタンによるミトコンドリア膜電位およびＣａ２＋取り込みの撹乱
チオクタンによるＡＴＰ合成の阻害における基質効果（図９）は、該薬物がミトコンドリアマトリックス内でＴＣＡサイクルに干渉することを示す。これが事実であれば、ミトコンドリア膜電位は致死閾値用量以上で損傷し得ると本発明者らは予測する１。電位感受性の色素であるＴＭＲＥを用い、本発明者らは予想された効果を観察する（図１３）。ミトコンドリア膜電位は、薬物処理の開始によって迅速に低下する。膜電位低下の動態は、ミトコンドリア基質存在下でのＡＴＰ合成の損失によく似ている（図９）。
【０１１０】
ミトコンドリアでのＡＴＰの枯渇は、小胞体を含む細胞質貯蔵から放出されたＣａ２＋の取り込みを含む恒常性反応を誘発することが知られている２。さらに、このＣａ２＋のミトコンドリアマトリックス内への移入には、ミトコンドリア膜電位が必要であると考えられている。従って、進行的に損なわれる膜電位を考えると、本発明者らは、致死閾値以上でのチオクタン処理が持続性のＣａ２＋の細胞質放出と共にイオンの一過性のミトコンドリアへの取り込みを起こし得ると予測する。本発明者らはミトコンドリアＣａ２＋の測定にＸ−Ｒｈｏｄ−１およびＲｈｏｄ−２、および細胞質Ｃａ２＋の測定にＦｌｕｏ−４を用いて、これらの予想される効果を観察する（図１３）。
【０１１１】
致死閾値かまたはそれよりもわずかに高いＣＰＩの用量において、約２時間までに（図９および１３を比較されたい）ミトコンドリア膜電位が低下するに従い、この最初のミトコンドリアの一過性Ｃａ２＋の取り込みは減衰する。この４〜６時間後、カルシウム依存性細胞死経路の開始に付随すると推定される、第２の大きなミトコンドリアＣａ２＋ピークが続く３。
【０１１２】
参考文献
１．Ｇａｒｒｅｔｔ Ｒ ａｎｄ Ｇｒｉｓｈａｍ ＣＭ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ，Ｓｏｕｔｈｂａｎｋ，Ｖｉｃ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ； Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ．（２００７）．
２．Ｇｒａｉｅｒ ＷＦ，Ｆｒｉｅｄｅｎ Ｍ，ａｎｄ Ｍａｌｌｉ Ｒ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ Ｃａ２＋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｏｌｄ ｇｕｅｓｔｓ，ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈｉｖ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ４５５，３７５−３９６（２００７）．
３．Ｇｙｏｒｇｙ Ｈ，Ｇｙｏｒｇｙ Ｃ，Ｄａｓ Ｓ，Ｇａｒｃｉａ−Ｐｅｒｅｚ Ｃ，Ｓａｏｔｏｍｅ Ｍ，Ｒｏｙ ＳＳ，ａｎｄ Ｙｉ ＭＱ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃａ２＋ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ４０，５５３−５６０（２００６）．
【実施例４】
【０１１３】
チオクタンにより誘導される多様な細胞死プログラム
詳しい機構は完全には理解されていないが、ある状況下では、ミトコンドリアエネルギー代謝の減少は細胞死経路へ入るための決定に関連することが知られている１−３。閾値を超えるが、この最小の殺傷用量の２倍以内であるチオクタン用量においては、試験された全ての癌細胞型が形態的には主にアポトーシス様である細胞死を起こす（図８）。この条件下でのアポトーシス様の死は、従来のアネキシン免疫染色およびＴＵＮＥＬ ＤＮＡ末端標識アッセイによって確認した（結果は提示していない）。
【０１１４】
さらに高い薬物用量（閾値の２倍を超える値よりも多い）において、活性のあるチオクタンは、形態的なアポトーシスへの関連を示さずに細胞死を誘導し（再プレートによる生存率アッセイ、およびトリパンブルーまたはプロピジウム排除による評価として）、これはネクローシス様経路を示唆している（結果は提示していない）。
【０１１５】
これらのデータは、チオクタンＣＰＩ−６１３によるミトコンドリアエネルギー代謝の阻害が、細胞死誘導に正確に関連することを確証する。
【０１１６】
異なる多様な細胞死経路についての不活性化変異を含むと知られているかまたは推定される多様な腫瘍細胞４は全て、ほとんど同様のチオクタン用量において殺傷される（図８および表２）という知見が著しい。この知見はこれらの薬物が、複数の、潜在的に重複性である遠位細胞死遂行経路に関与できるマスターシグナルを誘導することを示唆する５。
【０１１７】
この可能性に一致して、本発明者らは一般的なカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫが、チオクタンで処理された細胞における細胞死の形態をわずかに変化させるが、該薬剤の致死閾値用量では識別可能な効果をもたないことを見出している。
【０１１８】
チオクタン誘導性の細胞死が複数の末端遂行機構を通して進行できる可能性をさらに試験するため、本発明者らは異なる細胞死経路の指標であるカスパーゼ−３およびＰＡＲＰ−Ｉによる切断５について検討した。本発明者らは、チオクタンＣＰＩ−６１３およびＣＰＩ−０４５の両方が、異なる細胞において非常に変化しやすいレベルのこれらの二つの切断現象を誘導することを見出している（図１４）。
【０１１９】
まとめるとこれらの結果は、チオクタンが、薬物用量および細胞型に依存して死への戦略的なコミットメントを誘導することができ、その決定の末端での戦術的な遂行について作動性であることを示す。
【０１２０】
参考文献
１．Ｗａｔａｂｅ Ｍ ａｎｄ Ｎａｋａｋｉ Ｔ． ＡＴＰ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５２，５３６−５４１（２００７）．
２．Ｙｕｎｅｖａ Ｍ，Ｚａｍｂｏｎｉ Ｎ，Ｏｅｆｈｅｒ Ｐ，Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ Ｒ，ａｎｄ Ｌａｚｅｂｎｉｋ Ｙ． Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ＭＹＣ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，９３−１０５（２００７）．
３．Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ ＶＰ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｔｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ １１，４７３−４８５ （２００６）．
４．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ＲＷ，Ｒｕｅｆｌｉ ＡＡ，ａｎｄ Ｌｏｗｅ ＳＷ． Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｅｌｌ １０８，１５３−１６４（２００２）．
５．Ｃｒｅｇａｎ ＳＰ，Ｄａｗｓｏｎ ＶＬ，ａｎｄ Ｓｌａｃｋ ＲＳ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＩＦ ｉｎ ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，２７８５−２７９６（２００４）．
【実施例５】
【０１２１】
リポ酸誘導体類似体の構造
以下に提示する様々なリポ酸誘導体類似体の限定されない例は、製造され、ここに開示される。
【０１２２】
前述の考察は、本発明の単なる典型的な実施形態を開示および記述するものである。当業者はこれらの考察および添付の請求項から、以下の請求項に定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、ここに様々な変更、改変、および変動があってよいことを容易に認識するであろう。さらに、ここには典型的な実施形態が表されているが、その他の当業者は本発明のその他の設計または使用について気付くであろう。従って、本発明はその典型的な実施形態と関連して記述されているが、設計および使用の両方に対する多数の改変が当業者に明らかとなるであろうこと、およびこの応用がそのいずれの適応または変動も網羅するように意図されることが理解されるであろう。それ故本発明は、請求項およびその均等物のみによって限定されることが明白に意図される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用および診断用の組成物に関し、さらに詳細には、癌細胞を含む過剰増殖により特徴付けられる細胞内への選択的な取り込みを示し、かつ酵素の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱を調節し、これによってそれらの細胞の検出および処置または破壊を促進する医薬組成物、およびそれらの使用方法に関する。さらに特異的には、これらの薬剤は、大部分の癌に付随する修飾されたピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）複合体などとして観察される、変化したミトコンドリアエネルギー代謝の活性またはその制御を標的とし、撹乱する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、真核細胞におけるエネルギー産生および生と死の工程に対する主要なコントロールセンターである。残りの細胞との様々な連絡機構が存在するが、可逆的リン酸化はミトコンドリアの機能を制御するための重要な手段である（Ｐａｇｌｉａｒｉｎｉ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ Ｊ．Ｅ．（２００６）．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ： ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｔａｋｅｓ ｃｅｎｔｅｒ ｓｔａｇｅ？ ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３１：２６−３４、本明細書の各所に参照として取り込まれる）。報告されたミトコンドリアキナーゼ、ホスファターゼ、およびリン酸化タンパク質の数の着実な増加は、リン酸化がミトコンドリアでの工程の制御における共通のテーマとして現れているであろうことを示唆する。ミトコンドリア酵素の構造、機能および活性制御に付随する病理的または遺伝的な変化は、疾病の治療に貢献し、かつその重要な標的であり得る。
【０００３】
様々な細胞機能の収束点および制御因子としてのそれらの役割に一致して、ミトコンドリアはアポトーシス、活性酸素種（ＲＯＳ）の産生、および細胞ＡＴＰの９０％を超える産生を含む多数の代謝工程において決定的な役割を持つ。さらに、細胞の増殖および分裂に従って新たなミトコンドリアが作られる必要があり、この工程それ自体が、核およびミトコンドリアＤＮＡの転写および翻訳の注意深い協調を要求する。最終的に、細胞エネルギーが変化を必要とするとき、ミトコンドリアはそのＡＴＰ産出を回転させることによって迅速に応答しなければならない。それ故に、ミトコンドリアは細胞機能と連絡する複雑な系を要求する。図１から明らかなように、ミトコンドリアへ出入りするシグナル分子はイオン、気体、代謝産物、ホルモン、転写因子およびタンパク質を含む。結果的に、細胞シグナルを受け取り、統合し、伝達するための中心としてミトコンドリアを認識することは、医薬品の設計および試験における重要な進歩である。
【０００４】
ミトコンドリア制御におけるシグナル伝達の礎石は可逆的リン酸化である。しかしながら、タンパク質キナーゼ現象の最初の実証が１９５４年に報告され、４０年近く前に可逆的リン酸化によってミトコンドリアの中心的機能が制御できるという事実が発見されたにもかかわらず、ミトコンドリアのリン酸化現象についての報告は少ない。このことは、１９８０年代および１９９０年代において、細胞膜を横断し、サイトゾルを通って核へと伸展する多数のシグナル伝達リン酸化カスケードが認識されたことにも全くかかわりなくである。このような知識の不足は、ミトコンドリアタンパク質機構の大部分が二つの脂質二重層の後ろに位置する事実により、サイトゾルシグナル伝達カスケードはミトコンドリアタンパク質に到達できないと考えられていることに部分的な原因があるかもしれない。いずれの現象でも、疾病管理の鍵となる方法において、ミトコンドリアが可逆的リン酸化によりシグナル伝達を制御することは広く受け入れられてはいなかった。それにもかかわらず、表１に示すように、２００６年までに全てのミトコンドリアの区画（すなわち、マトリックス、内膜、膜間腔、および細胞質に面する外表面を含む外膜）内の６０を超えるタンパク質が、ミトコンドリアの機能の広いスペクトルに関係付けられるリン酸化タンパク質として同定された。増加するデータはさらに、ミトコンドリアの標的の可逆的リン酸化の重要性、およびそれを対象とする、改善された癌治療のための組成物の使用について実証している。
【０００５】
表１ ミトコンドリアのリン酸化タンパク質
ａ略語：ＡＡ，アミノ酸（Ｓ，セリン；Ｔ，スレオニン；Ｙ，チロシン）；ＡＮＴ，アデニンヌクレオチド輸送体；Ａｘｍｉｔｏ，ミトコンドリアアネキシン；β−ＯＸ，β−酸化：ＢＣＫＡＤ，分岐鎖ケト酸脱水素酵素；ＣＩ−ＣＶ，呼吸鎖複合体１−５；ＣＰＴ，カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ；ＣＲＥＢ，ｃＡＭＰ反応性エレメント（Ｃｒｅ）結合タンパク質：ＣＹＰ，チトクロムＰ４５０；ＤＢＰ，十二量体結合タンパク質；ＥＦ，伸長因子；ＧＳＴ，グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＨＳＰ，熱ショックタンパク質；ＩＭ，内膜；ＩＭＳ，膜間腔；Ｍ，マトリックス；ＭｎＳＯＤ，マンガンスーパーオキシドジスムターゼ；ｍＴＥＲＦ，ミトコンドリア転写終結因子；ｍｔＧＡＴ，ミトコンドリアグリセロール−３−ホスファターゼアセチルトランスフェラーゼ；ｍｔｈｓｐ，ミトコンドリアＨＳＰ；ｍｔＴＢＰ，ミトコンドリアテロメア結合タンパク質；ＮＤＫ，ヌクレオシド二リン酸キナーゼ；ＯＭ，外膜；ＯＸＰＨＯＳ，酸化的リン酸化；Ｐ部位，リン酸化部位；ＰＤＣ Ｅ１／３，ピルビン酸脱水素酵素複合体Ｅ１／３サブユニット；ＰＤＫ，ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ；ＰＬＡ，ホスホリパーゼＡ；ＳｃＩＲＰ，サブユニットｃ−免疫反応性ペプチド；ＳＳＡＴ，スペルミジン／スペルミンアセチルトランスフェラーゼ；ＳｔＡＲ，ステロイド産生急性調節タンパク質；ＴＣＡ，トリカルボン酸サイクル；ＴＲＡＰ−１，腫瘍壊死因子タイプ１受容体付随タンパク質；ＶＤＡＣ，電位依存性陰イオンチャネル。
ｂ組み換えタンパク質において、リン酸化はｉｎ ｖｉｔｒｏでのみ観察される。
ｃタンパク質はミトコンドリアへ移動する（すなわちタンパク質はミトコンドリアの常在タンパク質ではない）。
【０００６】
ヒトゲノムにおける最も大きなキナーゼおよびホスファターゼファミリーであるタンパク質キナーゼ（ＰＫ）およびタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）は、それぞれ５００を超える、および１００を超えるメンバーを有する。キナーゼおよびホスファターゼの比較的小さなファミリーを合わせると、これらのシグナル伝達分子はヒトゲノムによりコードされる全てのタンパク質の３パーセント近くを構成する。前述のリン酸化タンパク質と同様に、驚くべき数の研究によってキナーゼおよびホスファターゼがミトコンドリアの機能に関係付けられており、図２に示すように、これまでに少なくとも２５のキナーゼおよび８のホスファターゼがミトコンドリアに局在していることが報告されている。これらのキナーゼおよびホスファターゼが一つのグループまたはファミリーに限定されていないことは明らかで、むしろそれらはほとんど全ての既知の哺乳類キナーゼおよびホスファターゼのサブグループに相当しており、これはミトコンドリアに影響を及ぼすと考えられるシグナル伝達経路の範囲を反映している。これらのシグナル伝達分子は基質の特異性が変化するキナーゼおよびホスファターゼ（例えばチロシンキナーゼ、古典的ＰＴＰサブグループ、セリン／スレオニンキナーゼ、および二重特異性ＰＴＰ）を含み、これらの変化は触媒的な機構（例えばシステインベースのＰＴＰ、アスパラギン酸ベースのＰＴＰ、および金属依存性ホスファターゼ）および進化的保存性（例えば最近関連ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＫ）およびホスファターゼ（ＰＤＰ）、分岐鎖ケト酸脱水素酵素キナーゼ（ＢＣＫＤＫ）およびホスファターゼ（ＢＣＫＤＰ）、および多数の哺乳類特異的酵素）による。
【０００７】
これらのシグナル伝達分子の大部分は、細胞内でミトコンドリアに関係しないその他の役割を有し、主にミトコンドリアの外に存在することが見出された。大部分のタンパク質について、それらのミトコンドリアへの移行の起動力または機構はよく知られていない。しかしながら、図３から明らかなように、先に記載したリン酸化タンパク質のようなキナーゼおよびホスファターゼがミトコンドリアの全ての区画に存在し、かつそれらの活性が様々なミトコンドリアの機能に影響を与えることははっきりしている。
【０００８】
しかしながら少数のシグナル伝達分子は主にミトコンドリアに局在すると考えられる。ＰＤＫおよびＰＤＰに加え、このグループはＰＴＥＮ誘導性キナーゼであるＰＩＮＫ１、ミトコンドリアＰＴＰＭＴ１を標的とする二重特異性ＰＴＰ、およびアスパラギン酸ベースのホスファターゼ／ＡＴＰアーゼであるＴｉｍ５０を含む。現在これらのタンパク質の多くに対する基質は未知であるが、生物学的および遺伝的データからそれらがミトコンドリアにおいて決定的な機能を有することは明らかである。例えば、そのミトコンドリア下の局在はまだ決定されていないが、ＰＩＮＫ１はＮ末端シグナル配列によってミトコンドリアを標的とする。Ｃａ２＋／カルモジュリン調節性キナーゼファミリーと高い配列相同性を共有するこのキナーゼは、生存促進性の活性に関与すると考えられる。同様にＰＴＰＭＴ１は、主にミトコンドリア内部に局在する最初のＰＴＰとして最近同定され、ＰＩＮＫ１のようにＮ末端シグナルペプチドによってミトコンドリアを標的とし、かつミトコンドリアの内膜のマトリックス面に密接に結合することが見出された。ＰＴＰＭＴ１は、そのミトコンドリアが糖代謝とインスリン分泌の連関に重要な機能を持つ膵臓β細胞に高度に発現する。最後に、ＴＩＭ（内膜の交換輸送体）複合体の鍵となる成分であるＴｉｍ５０は、アスパラギン酸ベースのホスファターゼ／ＡＴＰアーゼのＣＴＤファミリーに対する配列相同性を有する。このファミリーの他のメンバーと同様に、Ｔｉｍ５０はＡＴＰアーゼとして機能し得るが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ホスホチロシン類似体であるパラニトロフェニルホスフェートに対するホスファターゼ活性を有することもまた示されてきた。上記のことから、細胞内の他の場所からミトコンドリアへ動員されるキナーゼおよびホスファターゼのみが見られるのではなく、ミトコンドリア自体が常在するシグナル伝達分子のグループを有すると考えられる。
【０００９】
時おり原因となるキナーゼおよびホスファターゼが同定されていないことから、最もよく知られたミトコンドリアリン酸化タンパク質におけるリン酸化の効果は明らかではないが、幾つかのリン酸化現象が部分的に特徴付けられている。これらの例は、先に考察したリン酸化タンパク質およびシグナル伝達分子のように、ミトコンドリアの一領域に限定されてはいない。
【００１０】
ミトコンドリア外膜におけるリン酸化は、アポトーシスの制御に決定的な役割を持つ。特によく定義されている現象は、ＢＣＬ−２ファミリーのアポトーシス促進性メンバーであるＢＡＤのリン酸化である。生存促進性サイトカインであるインターロイキン−３で処理した後、ＰＫＡが外膜へ移動することが示されている。一旦、外膜のＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）に固定された後、ＰＫＡはＢＡＤをＳｅｒ１１２においてリン酸化して、図３Ａに示す工程であるＢＡＤの不活性化およびミトコンドリアからの分離を導く。ｐ７０Ｓ６キナーゼによるＳｅｒ１３６、および未同定のキナーゼによるＳｅｒ１５５におけるＢＡＤのリン酸化もまた、ＢＡＤの不活性化に関係付けられている。
【００１１】
健常な細胞ミトコンドリアにおける制御機構として作用する可逆的リン酸化の最もよく確立された例は、マトリックス内のＰＤＨ複合体であり、その単純化された下絵を図３Ｂに示す。この複合体は、解糖系由来のピルビン酸塩の、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの主要な前駆体であるアセチルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）への変換を触媒する。これら二つの主要なエネルギー産生経路をつなぐものとして、ＰＤＨ複合体は細胞内グルコースの恒常性維持のために適切に制御されなければならない。
【００１２】
ミトコンドリアリン酸化タンパク質として最初に同定されたことから、ＰＤＨ複合体および可逆的リン酸化によるその制御は徹底的に研究されてきた。ＰＤＨ複合体のリン酸化および脱リン酸化は、それぞれＰＤＫおよびＰＤＰにより行われる。少なくとも４のＰＤＫアイソフォームおよび２のＰＤＰアイソフォームが知られており、それら全てはＰＤＨ複合体のＥ２サブユニットに結合する。リン酸化現象はＥ１サブユニットの別個の三つのセリン残基に起こり、それぞれがこの複合体の著しい不活性化を導く。特に、ＰＤＫそれ自体のリン酸化については現在少なくとも一報告がある。ＰＫＣにより行われるこのリン酸化はＰＤＫを不活性化することが示されており、可逆的リン酸化によるＰＤＨ複合体制御のさらなるレベルを潜在的に証明している。従ってＰＤＨ複合体は、他の保存された工程に制御の段階を加えるためにリン酸化を用いるミトコンドリアの最も重要な例である。
【００１３】
先に記載したミトコンドリアのチロシンキナーゼおよびホスファターゼによって示されるように、この細胞小器官内でのリン酸化はセリンおよびスレオニン残基に限定されない。ミトコンドリアのエネルギーに影響を与えるチロシンリン酸化の例は、図３Ｃに示す内膜でのチトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）の制御に見られる。呼吸鎖における終末酵素としてのＣＯＸは、ポンプによってプロトンが内膜を横切る間、協調的に酸素を水に還元する。ＰＤＨ複合体と同じく、ＣＯＸはＡＴＰおよびＡＤＰ、同様に甲状腺ホルモンＴ２およびおそらくはＣａ２＋イオンによりアロステリックに制御される。これらの制御形式に加え、ＣＯＸはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびＨｅｐＧ２細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ｃＡＭＰ依存性の様式によりリン酸化されることが示されている。ＣＯＸは１３のサブユニットを含み、二量体として結晶化される。リン酸化部位はサブユニット１のＴｙｒ３０４であると同定され、これは膜間の二量体インターフェースに位置する。リン酸化現象は、おそらく二量体形成の中断によってＣＯＸ活性を顕著に阻害する。
【００１４】
ＣＯＸのチロシンリン酸化の第二の例である非受容体型チロシンキナーゼｃ−Ｓｒｃの一部は、Ｌｙｎチロシンキナーゼと同様に、破骨細胞においてミトコンドリア内部に局在してＣＯＸのサブユニットＩＩの未同定部位にチロシンリン酸化を導く。リン酸化現象の結果は、ＣＯＸ活性の増大を導くサブユニットＩに見られる結果とは逆である。
【００１５】
ミトコンドリアシグナル伝達の重要な態様は、キナーゼおよびホスファターゼがそれら自体でどのように制御されるかである。Ａｂｌ、Ａｋｔ、ＧＳＫ３１３およびＰＫＣδのような、主に細胞内の他の場所に存在しているがミトコンドリアを標的とするようになる多数のキナーゼは、それらが活性化された状態においてのみそうするようになると考えられる。従ってミトコンドリア内での幾つかのキナーゼ活性の範囲は、単純に細胞小器官内へ移入される酵素の数によって決定されるであろう。
【００１６】
しかしながら常在するシグナル伝達分子には、異なる制御手段が実施されなければならない。これらの工程は未だ確定されていないものの、セカンドメッセンジャーの役割が鍵となるように思われる。ＰＤＫおよびＰＤＰの活性は、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｋ＋およびＡＤＰのようなイオンおよび小分子によって制御されることが知られている。ミトコンドリア一酸化窒素合成酵素の性質決定および最近のミトコンドリアにおける可溶性アデニル酸シクラーゼの発見は、ミトコンドリアシグナル伝達分子の制御に寄与するセカンドメッセンジャーに対してさらなる機会を提供する。最後に、細胞内の他の場所でシグナル伝達分子を制御する手段として確立されているＲＯＳは、大量の活性酸素種が産生されるミトコンドリアにおけるキナーゼおよびホスファターゼの制御にほとんど確実に関与するであろう。キナーゼおよびホスファターゼのアイソフォームの相対的な発現レベルは、病理学における重要な役割を果たし、かつ疾病に付随するその他のシグナル伝達現象に関連付けられる可能性がある。遺伝子および発現レベルでの変化もまた、これらの変化に関連し得る。
【００１７】
幾つかのプロテオミクス調査を通した後であっても、哺乳類ミトコンドリアプロテオームの３分の２のみが知られていると推定される。残りの３分の１の多くは、これらのマススペクトロメトリー分析の検出レベル未満である、シグナル伝達タンパク質のような少量のタンパク質により構成されると思われる。これらの研究から、異なる組織由来のミトコンドリアの間で、含まれるタンパク質に高い可変性があることも明らかになった。例えばこれらのプロテオミクスの試みにおいて、〜５０％のタンパク質のみが、調査された四つの組織（すなわち脳、心臓、肝臓および骨格筋）にわたって保存されることが見出された。異なるミトコンドリアシグナル伝達経路は、組織から組織において同様の方向で変動し得るのみではなく、この観察されるミトコンドリアの多様性に非常によく寄与していると考えられる。
【００１８】
それにもかかわらず、可逆的リン酸化がミトコンドリアでの工程の制御に関与すると結論付けるための十分すぎる証拠が存在する。報告された６０を超えるリン酸化タンパク質、３０のキナーゼおよびホスファターゼ、および様々な補助的シグナル伝達タンパク質によれば、ミトコンドリアは確かに可逆的リン酸化によるシグナル伝達のための場として正当に評価されておらず、事実としてこのような制御は癌のような過剰増殖疾患に有用となるであろう。
【００１９】
増殖の速い腫瘍細胞の大多数は、形質転換されていない細胞に対する著明な遺伝的、生化学的、および組織学的な相違を示す。これらの多くは、元の組織に比較して変化したエネルギー代謝に関連する。腫瘍細胞において最も悪名高く、かつよく知られたエネルギー代謝の変化は、ワールブルク効果として知られている、高濃度のＯ２存在下であっても解糖能が亢進する現象である。
【００２０】
ワールブルクは最初、腫瘍細胞における亢進した解糖の推進力は、ミトコンドリアの機能の非可逆的損傷によって起こるエネルギー欠乏であると提唱し、この場合嫌気性の筋肉と同様に、解糖を通してグルコースが後に分泌される乳酸に変換される。腫瘍細胞におけるこの解糖の流れの増大は、酸素の供給が不十分な固形腫瘍に見られる部分的な低酸素状態のような、Ｏ２濃度の低い環境での生存および増殖を保証するための代謝の戦略であると提唱されてきた。特に、多くのヒト低酸素性腫瘍におけるＯ２濃度は２０μＭよりも低いことから、そこでの酸化的リン酸化は限定される。結果的に、解糖は固形腫瘍（例えば増殖の遅いメラノーマおよび乳腺腺癌）における主要なエネルギー経路であると考えられる。
【００２１】
細胞増殖の比率とＡＴＰ供給の比率との間の比例関係は、増殖の速い腫瘍細胞について確立されてきた。何人かの著者は、高度に脱分化した増殖の速い腫瘍における解糖の比率が、増殖の遅い腫瘍および正常細胞における解糖の比率よりも高くなるように、解糖活性は腫瘍の悪性度と相関することを提唱した。実際に高レベルの乳酸は悪性腫瘍の前兆であると提唱されてきた。これらの現象がさらなるシグナル伝達現象および遺伝的変化に関連すると考えられ、例として低酸素誘導因子および血管新生因子の産生および放出が含まれる。
【００２２】
図４に示すように、何年もの間トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルは、生命体のエネルギー源としてのＡＴＰの産生におけるその役割のみに対して、生物学的に重要であるとみなされるだけであった。しかしながら最近の研究により、ＴＣＡサイクルの活性は、細胞増殖およびアポトーシスの決定を含むシグナル伝達経路の機能にもまた影響を与え、関係する解糖およびＴＣＡサイクル酵素の増加または減少を制御できることが示された。腫瘍の進行と、解糖酵素であるヘキソキナーゼおよびホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）１との間には直接の相関もあり、これらは増殖の速い腫瘍細胞で大きく増加している。従って、その酸化能に不足を示す腫瘍細胞は、活発な酸化的リン酸化を有する腫瘍細胞よりもさらに悪性であると想定されている。低酸素性または好気性の状態にあるか否かに関わらず、癌組織での解糖への依存は悪性度の増大に関連する。
【００２３】
健常な細胞のＰＤＨ複合体におけるリポ酸の役割については、よく研究されてきた。ＰＤＨ複合体は三つの中心的なサブユニット、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３（それぞれピルビン酸脱水素酵素、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、およびジヒドロリポアミド脱水素酵素）を有する。これらの複合体は中心にＥ２コアを持ち、このコアをその他のサブユニットが取り囲んで複合体を形成する。これら二つのサブユニット間のギャップ内で、リポイルドメインが活性部位間での中間体の輸送を行う。リポイルドメイン自体は、可動性のリンカーによってＥ２コアに付着する。ピルビン酸塩とチアミンピロリン酸の反応によるヘミチオアセタールの形成によって、この陰イオンは、リジン残基に付着する酸化されたリポ酸塩種のＳ１を攻撃する。結果的に、リポ酸塩Ｓ２は硫化物またはスルフヒドリル成分として置換され、続く四面体ヘミチオアセタールの崩壊によりチアゾールが放出され、これによりＴＰＰ補助因子が放出され、かつリポ酸塩のＳ１にチオアセテートが産生される。この時点でリポ酸塩−チオエステルの機能性はＥ２活性部位内へ移動され、アシル基転移反応がアセチル基をリポ酸塩の「自在アーム」からコエンザイムＡのチオール基へ転移させる。これによりアセチルＣｏＡが産生され、酵素複合体から放出され、続いてＴＣＡサイクルに入る。ジヒドロリポ酸塩は複合体のリジン残基にまだ結合しているが、その後Ｅ３活性部位へ移動し、フラビンにより仲介される酸化によってそのリポ酸塩静止状態へ戻り、ＦＡＤＨ２（および最終的にはＮＡＤＨ）を産生し、かつリポ酸塩を再生して、コンピテントなアシルアクセプターへ戻る。このリポ酸塩種が遮断された場合、ＦＡＤＨ２への電子の流れまたはアセチルＣｏＡの産生がなくなり得る結果として細胞内にピルビン酸の毒性が蓄積する。癌細胞では、細胞の解毒および生存のためにアセトインの産生が必要なことが示唆されている。
【００２４】
以前に述べたように、ミトコンドリア内でのＰＤＨ複合体の活性は様々なアロステリックエフェクターおよび共有結合性の修飾によって高度に制御される。ＰＤＨ活性はそのリン酸化状態によって制御され、これは脱リン酸化状態で最も活性である。ＰＤＨのリン酸化はＰＤＫにより触媒される。ＰＤＫ活性はＡＴＰ、ＮＡＤＨ、およびアセチルＣｏＡレベルの増加により増大する。ＰＤＫの負のエフェクターは、ＡＴＰレベルが低下した時に増加するＡＤＰ、ＮＡＤ＋、ＣｏＡ−ＳＨ、およびピルビン酸である。脱リン酸化を通してＰＤＨを活性化する酵素であるＰＤＰの制御については完全に理解されていないが、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋がＰＤＰを活性化することが知られている。
【００２５】
複合体の二つの産物であるＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡは、ＰＤＨの脱リン酸化活性型であるＰＤＨ−ａに対する負のアロステリックエフェクターである。これらのエフェクターは、ピルビン酸に対する酵素のアフィニティーを減少させることによって、ＰＤＨ複合体を通した炭素の流れを限定する。加えてＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡは、ＰＤＨをリン酸化ＰＤＨ−ｂ型に変換することにより不活性化する酵素であるＰＤＫの、強力な正のエフェクターである。細胞のエネルギーチャージが高い際にＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡが蓄積されることから、エネルギーの豊富な細胞内で高レベルのＡＴＰがＰＤＫの活性もまた上昇させ、ＰＤＨの活性を減少させることは不思議ではない。しかしながらピルビン酸がＰＤＫの強力な負のエフェクターであることから、ピルビン酸のレベルが増加するときには、高レベルのＮＡＤＨおよびアセチルＣｏＡ存在下であってもＰＤＨ−ａになりやすいであろう。
【００２６】
ＡＴＰの豊富な細胞内ではＰＤＨ−ａを維持するピルビン酸の濃度が十分に高く、アロステリックに減少したＰＤＨの高Ｋｍ型はそれにもかかわらずピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換できる。高いＡＴＰおよびＮＡＤＨレベルを有する細胞内での大量のピルビン酸により、ピルビン酸の炭素は炭素の二つの主な貯蔵型（糖新生を通したグリコーゲンおよび脂肪酸合成を通した脂肪の産生）に方向付けられ得り、ここではアセチルＣｏＡが主要な炭素ドナーである。ＰＤＰ−ｂの制御はよく理解されていないが、減少したＡＴＰ濃度下でピルビン酸の酸化を最大化、および高いＡＴＰ濃度下でＰＤＨ活性を最小化するための制御である可能性がかなり高い。
【００２７】
腫瘍細胞は、ピルビン酸および付随するアルデヒドおよびラジカル、例えばアセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルを、これらの分子が高濃度において細胞内ｐＨを大幅に低下させるという機構により細胞傷害性であることから、無制限に蓄積できない。従ってＡＳ−３０Ｄおよびエールリッヒヘパトーマについては、ミトコンドリアピルビン酸の有意な画分が、ＰＤＨ複合体のＥ１成分により、結合したβ−ヒドロキシエチルチアミンピロリン酸を通して、活性アセトアルデヒドに脱炭酸されることが記載されている。この活性アセトアルデヒドは第二のアセトアルデヒドと共に次々に縮合し、最終的には元のピルビン酸をアミノ酸のグルタミンまたはリポ酸のいずれかを用いて脱酸または還元して、競合的にＰＤＨを阻害しかつそのピルビン酸前駆体よりも細胞に対する毒性の少ない（例えば細胞内でのｐＨ恒常性を維持することにより）化合物であるアセトイン（３−ヒドロキシブタノン）を産生する。しかしながら、ＡＴＰ産生の源としての解糖への依存によるピルビン酸蓄積の結果としての腫瘍細胞の解毒経路におけるアセトインの重要性にもかかわらず、先行技術には腫瘍細胞生存率に関して、アセトイン産生を遮断する効果についての参考文献は少ない。
【００２８】
最近の研究は、癌細胞にさらなる好気性の代謝を強制することによって腫瘍の増殖が抑制されることを示唆している。従って、ワールブルク代謝への移行はＰＤＨ複合体の遮断を必要とする。図５に示すように、この移行において癌細胞での低酸素誘導因子（ＨＩＦ）によるシグナル伝達の増大が見られることは、グルコースの代謝におけるＨＩＦの重要な役割を考えれば不思議ではない。直接または間接にＨＩＦのシグナル伝達を引き起こす変異は、実際に癌の発生における一般的な機構であると考えられる。ＨＩＦはＰＤＫ１の過剰発現を誘導し、これが次にＰＤＨ複合体の減少に働く。ＰＤＫ１によるリン酸化は、このアイソフォームがＰＤＨ複合体の第１のサブユニットであるＥ１のアルファサブユニットの三つのセリン残基を独自にリン酸化することから、不活性なＰＤＨ複合体の維持に特に有効となる。Ｅ１の再活性化は、三つのリン酸基全ての除去を必要とする。さらに、ＰＤＨ複合体の活性化はＲＯＳ産生の増大を導き得り、これが順にアポトーシスを導き得る。しかしながら、癌に見られるＰＤＫ１の変化は、その濃度の変化によるのみではなく、その活性の変化、およびおそらくは、実に一腫瘍型または一患者と他方との間でのそのアミノ酸配列の変化にもよる可能性がある。加えてＰＤＫ１は、腫瘍の型に依存して、腫瘍に付随する様々な分子と共に異なる複合体を形成し得る。従ってＰＤＫ１の阻害は、腫瘍にアポトーシスを起こすための潜在的な標的であり得る。しかしながら今日までに、既知のＰＤＫ１阻害剤は、このアイソザイムを最大６０％のみ阻害することが示されている。
【００２９】
伝統的な化学療法の標的は細胞の分裂、増殖であるが、全ての臨床的に許容される化学療法的な治療には大量の薬物が用いられ、これがホスト細胞の正常な増殖に深刻な損傷もまた誘導する。従って癌の治療には、さらに選択的な標的指向化が必要とされる。化学療法に付随する別の問題は、多くの腫瘍型において、抗新生物剤に対する固有であるかまたは獲得された抵抗性が存在することである。概して伝統的な化学療法は、現在ほとんどの悪性腫瘍に対する長期的な利点が少なく、かつしばしば生存期間またはその質を減少させる有害な副作用に関連する。従って、生命の適正な質を可能にしながら腫瘍の長期的な管理を提供できる、徹底的な新しいアプローチが必要とされている。
【００３０】
新しい化学療法の開発において、薬物の有効性、送達、および副作用は確実に解決されなければならない問題である。固形腫瘍における低酸素性の領域への送達は、薬物が異なる細胞層を容易に透過できないときに困難であり得る。このような不確実性を避けるため、少なくともマイクロモル以下の範囲で一定に代謝阻害する抗癌剤の設計に今日的な意味があると考えられる。癌細胞が系統から系統にわたって遺伝的および表現型的に異質であることが立証され得るが、全ての腫瘍細胞株はＡＴＰ供給のための解糖および酸化的リン酸化に依存する。ワールブルク効果に集中することは、健常ホスト組織および臓器の機能性に影響を与えることなく単に腫瘍の代謝および増殖に選択的に影響を与える送達および治療的戦略の設計を促進する、腫瘍および正常細胞の間での物理化学的および生化学的エネルギーの相違に基づく薬物設計を可能にする。
【００３１】
Ｂｉｎｇｈａｍらの米国特許第６，３３１，５５９号および６，９５１，８８７号、同様にＢｉｎｇｈａｍらの米国仮出願第６０／９１２，５９８号は全て参照としてここに取り込まれ、腫瘍細胞およびその他の特定の型の病的な細胞の両方を選択的に標的化しかつ死滅させる、新しい種類のリポ酸誘導体治療薬を開示する。これらの特許はさらに、有効量のこれらのリポ酸誘導体を薬剤的に許容される担体と共に含む医薬組成物、およびその使用法について開示する。しかしながら、これらの特許にはこれらのリポ酸誘導体の構造および一般的使用についてさらに記載されているが、いずれの特許にも、これらの誘導体がＰＤＨ複合体の構造および／または発現レベル、および／または活性の制御における調節に有用であることは指摘されていない。
【００３２】
ＰＤＨ複合体の構造および／または活性が腫瘍活性の重大な決定要因であることが示されていることから、ＰＤＨ複合体の構造および／または活性、またはさらに発現レベルの、薬剤的に許容される調節因子、およびその使用法を提供することは有益であろう。
【００３３】
発明の目的及び産業上の利用可能性
結果的に本発明の目的は、癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられる疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、腫瘍細胞に選択的活性を示す医薬組成物の提供である。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、前記の疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、投与による副作用が最少である医薬組成物の提供である。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、前記の疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、可能な最少の費用で容易に製造され、かつ可能な最長期間保存できる医薬組成物の提供である。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、前記の疾病、状態、または症候群の治療または診断に使用され、特に腫瘍細胞のミトコンドリア内のＰＤＨ複合体の構造、活性、および／または発現レベルを通してミトコンドリアのエネルギー代謝を調節する医薬組成物の提供である。
【発明の概要】
【００３７】
前記の目的を達成するため、本発明は、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化により特徴付けられる、ヒトを含む温血動物の癌またはその症候群のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、または症候群の治療、診断、または予防に有用な医薬組成物を広く提供し、ここで該医薬組成物は、その全てが参照としてここに取り込まれる米国特許第６，３３１，５５９号および６，９５１，８８７号、ならびに米国仮出願第６０／９１２，５９８号に記載されるものを含む、少なくとも１の有効量のリポ酸誘導体、および少なくとも１のその薬剤的に許容される担体を含む。
【００３８】
ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することにより、本発明のリポ酸誘導体は病的な細胞におけるミトコンドリア膜電位およびその他のミトコンドリア事象両方の損失の原因となり、結果として非可逆的な細胞死が開始される。本発明のリポ酸誘導体はまた、ＰＤＫの活性化および／またはＰＤＰの阻害によるか、またはＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性阻害を通した、毒性の少ない分子であるアセトインへのピルビン酸の変換の阻害により、ミトコンドリアのエネルギー代謝も阻害し得る。アセトイン合成の阻害は、酸化還元バランスを含むその他の工程を歪め、かつアセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルを含む有毒な副生成物産生の原因となる可能性もあり、結果としてこれらの副生成物自体は病的な細胞のミトコンドリアに非可逆的な損傷を引き起こす。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、およびそれらの各変異体またはアイソフォームの効果を調節し得る。該医薬化合物はまた、ＰＤＰ１、ＰＤＰ２，およびそれらの各アイソフォームの効果も調節し得る。
【００４０】
本発明の医薬組成物はまた、ＰＤＨ複合体中に見出されるホスホリラーゼ、キナーゼ、および脱水素酵素の酵素構成物質の発現レベルも調節し得る。この調節は、転写、翻訳、または適切な遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを含む後翻訳段階において起こり得る。
【００４１】
ＴＣＡサイクルに基本的に付随する分子由来の化合物として、かつ解糖の伸展により、本発明の医薬組成物は腫瘍細胞内への選択的な取り込みを示す。さらにこのような選択的な腫瘍細胞への取り込みは、この医薬組成物の投与が健常な非形質転換細胞および組織に起こし得る副作用を最小化する。
【００４２】
本発明の第１の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式１
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）；芳香族；Ｒ３Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル；ヘテロアリール；Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル；有機金属アリール；アルキル−有機金属アリール；およびセミアセタール Ｒ５ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−から成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
またはその塩である。
【００４３】
本発明の第２の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式２
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ３Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ３Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、およびＲ４ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタールから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３およびＲ４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００４４】
本発明の第３の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式３
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタール Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され、；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ６はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
またはその塩である。
【００４５】
本発明の第４の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式４
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ４Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４およびＲ５は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００４６】
さらに、これらの一般構造のいずれかもしくは全てが細胞またはミトコンドリア内で代謝され得ることから、上に言及された構造の代謝産物は本発明の範囲内にあることが明確に意図される。
【００４７】
それぞれの一般式内で、特定のリポ酸誘導体それぞれの（Ｒ）−異性体は、（Ｓ）−異性体よりも大きな生理活性を有する。結果的にリポ酸誘導体は、単にその（Ｒ）−異性体型かまたは（Ｒ）−および（Ｓ）−異性体の混合物として存在するべきである。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または機能の制御または撹乱の変化を含む、ヒトを含む温血動物の癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、症候群、または症状を診断、治療、または予防するための方法が提供され、ここで該方法は、有効量のここに開示される医薬組成物をこのような動物へ投与することを含む。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化を含む、癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を呈する患者の診断および利益を予想するための方法が提供され、該方法は、患者から細胞サンプルを得ること、有効量の本発明の医薬組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞へ投与すること、およびそこから結果を得ることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
以下の図面は本発明の実施形態の図解であり、明細書および請求項の全体により包含される本出願の範囲を限定しようとするものではない。
【図１】ミトコンドリアへの出入りの両方を標的とする一般的なシグナル伝達分子およびそれらの効果を示した図である。
【図２】ミトコンドリアキナーゼおよびホスファターゼの一覧、およびミトコンドリア内でのそれらの位置を示した図である。
【図３】図３Ａは、ミトコンドリア外膜でのＰＫＡによるＢＡＤのリン酸化、およびそこにおける可逆的リン酸化の効果を示した図である。図３Ｂは、ＰＤＨ複合体の作用による、ミトコンドリアマトリックスでのピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換、およびそこにおける可逆的リン酸化の効果を示した図である。図３Ｃは、酸素の水への還元およびポンプによるプロトンのミトコンドリア内膜の横断におけるＣＯＸの作用、およびそこにおける可逆的リン酸化の効果を示した図である。
【図４】ピルビン酸の解糖による産生における基質および産物の構造を図示し、ＡＴＰおよびＮＡＤＨの産生ならびに付随する酵素もまた示した図である。
【図５】ＨＩＦ−１によるグルコース代謝の制御を示した図である。
【図６】図６Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、正常組織と癌組織の間でのエネルギー代謝の相違を示した図である。図６Ｂは、ＰＤＨ複合体中のリポ酸の生体型と、本発明の医薬組成物の一部を形成するリポ酸誘導体との間の相違を示した図である。図６Ｃは、ＰＤＫのリポイル残基効果による、ＰＤＨ複合体の制御を示した図である。
【図７】異種移植腫瘍の増殖における、本発明の医薬組成物の効果を示した図である。
【図８】三つの腫瘍細胞型および非形質転換細胞における、本発明の医薬組成物を用いた処理の効果を示した図である。
【図９】図９Ａは、致死閾値またはそれを超える量の本発明の医薬組成物により処理した肺癌細胞におけるＡＴＰレベルを示した図である。図９Ｂは、ピルビン酸を含む培地とグルコースを含む培地中での、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成阻害の比較を示した図である。図９Ｃは、乳癌細胞と正常乳房細胞における、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成の阻害を比較した図である。図９Ｄは、肺癌細胞における、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成の阻害と、リポ酸および本発明の不活性型によるＡＴＰ合成の阻害との比較を示した図である。
【図１０】ＰＤＨ複合体およびアルファケトグルタル酸（αＫＤＨ）脱水素酵素の酵素活性の腫瘍細胞ミトコンドリアでのレベルにおける、本発明の医薬組成物の効果を示した図である。
【図１１】図１１Ａは、本発明の医薬組成物による処理またはモック処理した肺癌細胞抽出物の、二次元ゲルのウェスタン分析を示した図である。図１１Ｂは、本発明の医薬組成物による処理またはモック処理した対の二次元ゲルサンプルを、拡大して示した図である。
【図１２】図１２Ａは、ＰＤＨ複合体Ｅ２サブユニットに共有結合した内在性リポ酸塩により調節される、ＰＤＫの制御的役割を示した図である。図１２Ｂは、本発明の医薬組成物による腫瘍細胞ＰＤＨ複合体の差次的な不活性化の、考えられる機構を示した図である。
【図１３】Ｈ４６０肺癌細胞のミトコンドリア膜電位における、本発明の医薬組成物の効果を示した図である。
【図１４】多様な腫瘍細胞型における本発明の医薬組成物による細胞死経路の、ウェスタンブロット分析の結果を示した図である。
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は一般的に、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニット、例えばＰＤＨ複合体の構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化を含む、温血動物の癌のような細胞の過剰増殖によって特徴付けられるもの、またはそれらの症状を含む疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を治療、診断、または予防するための医薬組成物に方向付けられる。このような動物は、癌を含む細胞の過剰増殖によって特徴付けられる疾病ならびにその他の病態および症候群にかかりやすい、ヒト、ウマ、ウシ、イヌおよびネコを含む家畜などのような哺乳類を含む。本発明の医薬組成物は、チオクタンとしても知られる、米国特許第６，３３１，５５９号および６，９５１，８８７号、ならびに米国仮出願第６０／９１２，５９８号に記載されるものを含む、少なくとも１の有効量のリポ酸誘導体、およびそのための薬剤的に許容される担体または賦形剤を含む。ミトコンドリア内に通常見出されるのみではなく、ワールブルク効果に見られるような腫瘍細胞の増大した解糖活性にも役立つ誘導体分子として、本発明のリポ酸誘導体は、腫瘍のような過剰増殖により特徴付けられる細胞および組織のミトコンドリア内への選択的送達ならびに有効な濃度について特によく適しており、これにより正常な細胞および組織は該組成物の効果から逃れる。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、およびそれらの各アイソフォームの効果を可逆的リン酸化を通して調節し得る。該医薬組成物はまた、ＰＤＰ１、ＰＤＰ２，およびそれらの各アイソフォームおよび／または変異体の効果も、可逆的リン酸化を通して調節し得る。これらの調節は、キナーゼもしくはホスファターゼ活性の促進または阻害のいずれかを通して起こり得る。
【００５３】
ミトコンドリアのエネルギー代謝を阻害することにより、本発明のリポ酸誘導体は病的な細胞におけるミトコンドリア膜電位およびその他のミトコンドリア事象両方の損失の原因となり、結果として非可逆的な細胞死が開始される。本発明のリポ酸誘導体はまた、ＰＤＫの活性化および／またはＰＤＰの阻害によるか、またはＰＤＨ複合体のＥ１サブユニットの活性阻害を通した、毒性の少ない分子であるアセトインへのピルビン酸の変換の阻害により、ミトコンドリアのエネルギー代謝も阻害し得る。アセトイン合成の阻害は、酸化還元バランスを含むその他の工程を歪め、かつアセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルを含む有毒な副生成物産生の原因となる可能性もあり、結果としてこれらの副生成物自体は病的な細胞のミトコンドリアに非可逆的な損傷を引き起こす。
【００５４】
本発明の第１の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式１
［式中、ｘは０〜１６を表し、Ｒ１およびＲ２は独立して
（１）アシル基 Ｒ３Ｃ（Ｏ）−であって、Ｒ３がアルキル、アリール、または有機金属アリール基を表し、チオエステル結合を通して連結され、限定はされないがアセチルおよびブタリル（ｂｕｔａｒｙｌ）を含み、特定の例としてビスアセチルリポ酸塩となるアシル基；
（２）チオエステル結合を通して連結される芳香族基であって、限定はされないがベンゾイルまたはベンゾイル誘導体を含み、特定の例としてビスベンゾイルリポ酸塩となる芳香族基；
（３）アルキル基 ＣｎＨ２ｎ＋１であって、ｎが１〜１０を表し、他の成分、例えば−ＯＨ、−Ｃｌ、または−ＮＨ２により置換されたこのようなアルキル基とチオエーテル結合を通して連結され、限定はされないがメチル、エチル、ブチル、デカニル、および６，８−ビスカルボモイル（ｃａｒｂｏｍｏｙｌ）メチルリポ酸塩を含むアルキル基；
（４）アルケニル基 ＣｎＨ２ｎ−１であって、ｎが２〜１０を表し、チオエーテル結合を通して連結され、限定はされないがプロピレン、２，３ジメチル−２−ブテン、およびヘプテンを含むアルケニル基；
（５）アルキニル基 ＣｎＨ２ｎ−３であって、ｎが２〜１０を表し、チオエーテル結合を通して連結され、限定はされないがアセチレン、プロピン、およびオクチンを含むアルキニル基；
（６）鎖式、または複素環を形成するいずれの炭素の付加もしくは置換を有する脂環基による脂環式のいずれかであってよいアルキル、アルケニル、およびアルキニル基であって、限定はされないがシクロプロパン、シクロペンテン、および６，８メチル−スクシンイミドリポ酸塩を含むアルキル、アルケニル、およびアルキニル基；
（７）それらのいずれの炭素にも付加を有してよいアルキル、アルケニル、およびアルキニル基であって、限定はされないがヒドロキシルおよびアミンを含むアルキル、アルケニル、およびアルキニル基；
（８）チオエーテル結合を通して連結され、ベンゼンまたはベンゼン誘導体であってよい芳香族またはアリール基であって、限定はされないがトルエンおよびアニリンを含む芳香族またはアリール基；
（９）硫化アルキル基 ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−であって、限定はされないがｎは０〜９を表してよく、ジスルフィド結合を通して連結される硫化アルキル基；
（１０）イミドイル基 ＣＨＲ４Ｃ（＝ＮＨ）−であって、限定はされないがｎは１〜１０を表してよく、チオアミド結合を通して連結されるイミドイル基；および
（１１）セミアセタール基 Ｒ５ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−であって、Ｒ５が強力な電子求引性の置換基をもつ化合物に限定され、限定はされないがトリクロロアセトアルデヒドおよびピルビン酸を含むセミアセタール基であってよい］
またはその塩により定義される。
【００５５】
上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく、スルホキシドまたはスルホン産生のために酸化できるチオエステル、例えばＣ−Ｓ（Ｏ）−ＲおよびＣ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒもまた含んでよい。
【００５６】
Ｒ１およびＲ２はさらに、チオスルフィン酸またはチオスルホン酸へと酸化できるジスルフィド、例えばそれぞれＣ−Ｓ（Ｏ）−Ｓ−ＲおよびＣ−Ｓ（Ｏ）２−Ｓ−Ｒを含んでよい。
【００５７】
Ｒ３は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよい。同様に、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよい。
【００５８】
Ｒ５は−ＣＣｌ３、−ＣＦ３、または−ＣＯＯＨを表す。
【００５９】
本発明の第２の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式２
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ３Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｎＨ２ｎ−１として定義されるアルケニル、ＣｎＨ２ｎ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ３Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、およびＲ４ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタールから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３およびＲ４は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は−ＣＣｌ３、−ＣＦ３、または−ＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、およびｎは０〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００６０】
本発明の第３の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式３
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタール Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され、；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ６はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
またはその塩である。
【００６１】
本発明の第４の実施形態によれば、リポ酸誘導体は一般式４
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ４Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され；
式中、上に定義されるＲ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４およびＲ５は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
またはその塩により定義される。
【００６２】
さらに、これらの一般構造のいずれかもしくは全てが細胞またはミトコンドリア内で代謝され得ることから、上に言及された構造の代謝産物は本発明の範囲内にあることが明確に意図される。
【００６３】
第１および第２両方の一般式内で、特定のリポ酸誘導体それぞれの（Ｒ）−異性体は、（Ｓ）−異性体よりも大きな生理活性を有することが観察されている。従って、本発明における使用のためには両方の異性体が意図されるが、特に好ましい実施形態では（Ｒ）−異性体を優先的に用いるか、または（Ｓ）−異性体との混合物中に（Ｒ）−異性体が存在することが特に意図される。
【００６４】
本発明の医薬組成物はまた、ＰＤＨ複合体中に見出されるホスファターゼ、キナーゼ、および脱水素酵素の酵素構成物質の発現レベルも調節し得る。この調節は、転写、翻訳、または適切な遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングを含む後翻訳段階において起こり得る。
【００６５】
本発明の組成物は、薬剤的に許容される担体または賦形剤をさらに含んでよい。薬剤的に許容される担体の例は当該技術分野において公知であり、医薬組成物中で通常用いられるもの、例えば限定はされないが、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、香味料（ｆｌａｖｏｒａｎｔｓ）、着色剤、保存料、生物学的利用能を増大させるための吸収促進剤、抗菌剤、およびそれらの組み合わせを含む。このような添加物の量は望まれる性質に依存し、当業者によって容易に決定できる。
【００６６】
通常本発明の医薬組成物は、塩、緩衝剤、保存料、および適合する担体を、任意にその他の治療的成分と組み合わせて含んでよい。医薬に用いられる場合、塩は薬剤的に許容されなければならないが、薬剤的に許容されない塩が、その薬剤的に許容される塩の調製のために便利に用いられてよく、本発明の範囲から除外されるものではない。このような薬理学的および薬剤的に許容される塩は、限定はされないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、マロン酸、ギ酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されるものを含む。また、薬剤的に許容される塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩のような、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製できる。
【００６７】
本発明はさらに、細胞に有効量の少なくとも１の治療薬または診断薬を送達することによる、患者を治療薬または診断薬によって治療または診断するための、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットの構造、発現、および／または活性の制御または撹乱の変化を含む方法を、細胞の過剰増殖によって特徴付けられるものを含む疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を予防、診断、または治療するために提供する。癌の改良された治療としてのＰＤＨ複合体の調節が特に意図され、これは腫瘍細胞増殖、血管新生、転移性増殖、アポトーシスの制御による原発腫瘍の治療、および外科的な除去の後または同時に起こる微小転移の発生の治療；および原発腫瘍の放射線またはその他の化学療法による治療を含む。本発明の医薬組成物は、原発性または転移性のメラノーマ、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、大腸癌、ならびに腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、および膵臓癌のような癌の型に有用である。
【００６８】
治療および診断への応用のため、該医薬組成物は、薬剤的に許容される担体と組み合わせた場合に患者へ直接投与できる。この方法は、治療薬もしくは診断薬を単独、または有効量のその他の治療薬もしくは診断薬、限定はされないが解糖阻害剤、微小管相互作用剤、細胞増殖抑制剤、葉酸阻害剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ポドフィロトキシンまたはその誘導体、抗腫瘍剤、抗生剤、化学療法剤、アポトーシス誘導剤、抗血管新生剤、ナイトロジェンマスタード、核酸挿入剤、およびそれらの組み合わせ、と組み合わせて投与することにより実行されてよい。このような治療薬は、その他の代謝阻害剤をさらに含んでよい。このような治療薬の多くは公知である。組み合わせによる治療法は、治療法に対する患者の反応を増幅または確実にする必要に応じたこのような状態の治療において、同時、連続的、または別々の使用を提供する。
【００６９】
本発明の方法は、医学的に許容される投与のいずれの様式を用いて実行されてもよく、臨床的に許容されない有害作用を起こすことなく、有効濃度の活性化合物を産生する。製剤は特に非経口投与に適することが好ましいが、本発明の組成物はエアロゾル、スプレー、散剤、ゲル、ローション、クリーム、坐薬、軟膏などの形態において、吸入、経口、外用、経皮、経鼻、眼内、肺内、直腸内、経粘膜、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、胸腔内、胸膜内、子宮内、腫瘍内、または点滴の方法論または投与のためにもまた処方できる。このような製剤が望まれる場合、望まれる一貫性およびその他の性質を製剤に与えるため、当該技術分野において公知のその他の添加物が含まれてよい。
【００７０】
当業者は、治療薬または診断薬の特定の投与様式は、投与が疾病、状態、症候群、またはそれらの症状の治療、診断、または予防；治療または診断される医学疾患の重症度；および治療的有効性に要求される投薬量のためであるか否かに関わらず、選択された特定の薬剤に依存することを認識するであろう。例えば、白血病治療のための抗癌剤投与の好ましい様式は静脈内投与を含み得るが、皮膚癌治療の好ましい方法は、局所または皮内投与を含んでよい。
【００７１】
ここで用いられる「有効量」は、望まれる治療効果または診断効果が達成される、治療薬もしくは診断薬の投薬量または複数の投薬量を指す。一般に治療薬または診断薬の有効量は、用いられる特定の薬剤の活性；その薬剤の代謝の安定性および作用の長さ；種、年齢、体重、一般的健康、食事状態、性別および被験体の食事制限；投与の様式および時間；排泄速度；場合により薬物の組み合わせ；および治療される特定の状態の症状および／または重症度の程度によって変動し得る。望まれる結果を得るための１日当たりの１回または数回の投与における正確な投薬量は、当業者によって過度の実験なしに決定でき、かつ該投薬量は望まれる治療効果を達成するためか、またはいずれの合併症の現象において、個々の実行者により調整されてよい。重要なことは、癌治療に用いる際、使用される治療薬の投薬量は正常細胞には実質的に無害であるものの、腫瘍細胞の死滅には十分でなければならないことである。
【００７２】
本発明の医薬組成物に含まれる治療薬または診断薬は、患者へ安全に投与できる最大量までの、望まれるいずれの量においても調製できる。治療薬または診断薬の量は、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満から１０００ｍｇ／ｍＬを超えるまで、好ましくは約５０ｍｇ／ｍＬに変動してよい。
【００７３】
一般に本発明の医薬組成物は、ＰＤＨ複合体の構造および／または活性の調節に有効な量を患者へ投与するために十分な様式で送達され得る。従って投薬量は、約０．３ｍｇ／ｍ２から２０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約６０ｍｇ／ｍ２に変動してよい。投薬量は単一用量において、または個別に分けられた用量の形、例えば１日当たり１から４以上において投与されてよい。被験体の反応がある用量において不十分な場合は、より高い用量（または異なる、さらに限局性の送達経路による有効なより高い用量）が、患者の耐性の範囲まで用いられてよい。１日当たりの複数の用量は、治療薬もしくは診断薬の適切な全身性または標的濃度を達成するために意図される。
【００７４】
さらに本発明の別の実施形態によれば、本発明のリポ酸誘導体はｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断薬および予測薬（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）として用いられてよい。先に述べたように、問題となる特定の腫瘍細胞または細胞型に依存して、様々なリポ酸誘導体は、ＰＤＨ複合体の調節を通した異なる腫瘍の種類の阻害について多かれ少なかれ有効であり得る。従って、例えば診断または適切な化学療法的戦略の選択が困難であり得る場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の培養を、特定の腫瘍細胞型を標的にすることが知られているリポ酸誘導体と共に試験することにより、腫瘍型および有効な治療を特定するための別のアプローチが提供される。
【００７５】
図面に戻ると、図６Ａは、正常組織および腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのエネルギー代謝において考えられる多数の相違を図示する。相当する条件下で正常細胞に比べると、腫瘍細胞はしばしばＡＴＰ産生のためにミトコンドリアのエネルギー代謝よりも細胞質の解糖に強く依存する。ＰＤＨ複合体の発現および制御の変化は、明らかにこの腫瘍特異的な適応の一部である。これらの効果を生み出す、ＰＤＨの触媒成分のレベルの減少および／または抑制性ＰＤＫのレベルの増加により、腫瘍細胞は、ＰＤＨ複合体を攻撃する薬剤に対して正常細胞よりもさらに脆弱となるであろう。
【００７６】
図６Ｂは、リポ酸がＰＤＨ複合体中でピルビン酸からのアセチルＣｏＡ合成に関わる正常の反応を触媒することから、この構造を示す。リポ酸はｉｎ ｖｉｖｏでそのカルボキシル末端を通し、非ペプチドアミド結合によって、Ｅ２リポイルドメイン活性部位におけるリジンのイプシロンアミノ基へ連結する。ＰＤＨ Ｅ２結合リポ酸塩の酸化／還元／アセチル化状態は、Ｅ１αＰＤＨサブユニットのリン酸化の不活性化を制御することによってＰＤＨ活性を制御する、キナーゼおよびホスファターゼによりモニターされることも認められる。この図面はまた、本発明において使用されてよい三つの代表的なリポ酸誘導体の構造も示す。細胞培養において、ＣＰＩ−６１３およびＣＰＩ−０４５は高い抗癌効力を持つが、ＣＰＩ−１５７は活性が少ないかまたは無であり、幾つかの実験ではコントロールとして有用である。
【００７７】
図６Ｃは、Ｅ２をその結合リポ酸塩であるＥ１と共に含むＰＤＨ複合体成分と、調節性ＰＤＫとの間の関連性を示す。高レベルのアセチルリポ酸塩またはジヒドロリポ酸塩（図示していない）はＰＤＫを活性化し、次にこれがＰＤＨ複合体触媒作用の第１段階を触媒するサブユニットであるＥ１αを不活性化することによって、ＰＤＨ複合体を通したさらなる流れを抑制する。図３Ａに見られるように、この工程はＰＤＨ複合体を通した炭素／エネルギーの流れの調速機として作用し、かつこの調節工程は明らかに、様々な腫瘍細胞のエネルギー代謝を支持するために実質的に変更される。
【００７８】
図７は、異種移植腫瘍の増殖における本発明の医薬組成物の効果を示す。実施例２に記載するように、脇腹の背側に細胞を皮下移植した。次に、図に示す日にマウスへの薬物（またはビヒクルのみ；「モック」）の腹腔内注射を開始した。左のパネルに、週に３回１ｍｇ／ｋｇの本発明またはビヒクルコントロールと共に注射した膵臓腫瘍モデルを示す。この実験は、ＢｘＰＣ−３細胞により行った２実験、およびＡｓＰＣ−１細胞により行った２実験の代表である。右の三つのパネルは、週に１回（丸）、週に３回（逆三角形）、または週に５回（ビヒクル処置は三角形、薬物処置は四角形）のいずれかにより示される濃度と共に注射したＨ４６０肺腫瘍モデルを示す。この実験は、Ｈ４６０細胞により行った４実験の代表である。
【００７９】
図８は、三つの腫瘍細胞型および非形質転換細胞型（ＭＤＣＫ）を、２００〜３００μＭ（「処理」）またはモック処理（「モック処理」）のいずれかで、本発明の医薬組成物により処理した効果を示す。細胞は１０％血清を含む適切な組織培地により、または４８時間処理した。実施例２に記載の方法論を通し、三つの癌細胞株にアポトーシスまたはアポトーシス様経路（図１１も参照）による広範な細胞死が観察される。対照的に、非形質転換ＭＤＣＫ細胞は、明らかにこの用量での薬物処理によって影響されない。
【００８０】
図９Ａは、致死閾値（１０％血清中、２００μＭ）またはそれを超える量の本発明の医薬組成物により処理したＨ４６０肺癌細胞におけるＡＴＰレベルを示す。破線は表示される濃度での処理を示す。対応するテクスチャの実線は、表示される時間後に薬物を除去し、薬物を含まない培地中で６０分間回復させる処理を示す。一組の矢印（Ｂｌｏｃｋ ａｒｒｏｗｓ）は、ＡＴＰ回復の間隔を示す。
【００８１】
図９Ｂは、ピルビン酸（ピルビン酸メチルの形）が主要な炭素原である培地（破線）とグルコースが主要な炭素原である培地（実線）中での、ＡＴＰ合成の阻害を比較する。本発明の医薬組成物は、両方の培地中で、同じ閾値濃度において最終的に細胞死を引き起こすが、細胞の全ＡＴＰレベルの早い枯渇はピルビン酸を含む培地中で高度であり、グルコースを含む培地中では見られないことが認められる。また、細胞死の開始は２００μＭよりも３００μＭの薬物濃度でより迅速である。
【００８２】
図９Ｃは、ＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞とＨＭＥＣ正常乳房細胞における、本発明の医薬組成物によるＡＴＰ合成の阻害を比較する。図６Ａおよび図６Ｂにその結果が示される実験とは対照的に、これらの実験は無血清培地（ＭＥＢＭ）中で行った。結果として薬物の致死閾値は、約５０μＭと低めであった。正常細胞サンプルにおける２２時間目のＡＴＰレベルの小さな低下は薬物用量には関連せず、普通の実験的変動を反映していることに留意されたい。
【００８３】
図９Ｄは、本発明の医薬組成物（左のグラフ）、リポ酸（中央のグラフ）、および本発明の不活性型（右のグラフ）による、Ｈ４６０肺癌細胞におけるＡＴＰ合成の阻害を比較する。図９Ｃに示すように、これらの実験は、薬物の致死閾値が約５０μＭとなるように無血清培地中で行った。
【００８４】
図１０は、ＰＤＨ（ＰＤＣ）および（αＫＤＨ）の酵素活性の、腫瘍細胞ミトコンドリアでのレベルにおける、本発明の医薬組成物（１０％血清を含むＤＭＥＭ中で４００μＭ）の効果を図示する。ＰＤＨは強力に阻害されるが、αＫＤＨはそうでないことが認められる。実施例２に記載するように、精製したミトコンドリア抽出物中の酵素活性レベルは、添加炭素源に反応するレサズリン還元を用いて測定する。バックグラウンドラインは、添加炭素源なしのレサズリン還元に相当する。
【００８５】
次に図１１Ａでは、本発明の医薬組成物により処理（＋）またはモック処理（−）した（１０％血清を添加したＲＰＭＩ培地中で、４００μＭで１２０分間）Ｈ４６０肺癌細胞抽出物の、二次元ゲルのウェスタン分析を行った。ウェスタン転写は、ＰＤＨ複合体のＥ１αおよびＥ２サブユニットに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いて探査した。ウェスタン転写はＥ２に合わせた。薬物処理サンプル中のＥ１には、高リン酸化型の実質的に高いレベルおよび低リン酸化型の減少したレベルが認められる。左の垂直な白線は、ゲル整列の基準の一つである、Ｅ２サブユニットの移動度を示す。右の垂直な白線は、推定的、酵素的に活性のある成分である、リン酸化の少ないＥ１α型を通る。
【００８６】
図１１Ｂは、本発明の医薬組成物による処理またはモック処理した対の二次元ゲルサンプルを、拡大して示す。エレメントＡは、図８Ａの一部の拡大である。エレメントＢは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞培地中で、モック処理（−）、および８０μＭの組成物で１８０分間処理（＋）されたＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞である。エレメントＣは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞培地中で、モック処理（−）、および８０μＭの組成物で２４０分間処理（＋）されたＨＭＥＣ正常乳房上皮細胞である。エレメントＤは、ＭＥＢＭ無血清乳房上皮細胞培地中で、モック処理（−）、および８０μＭの組成物で２４０分間処理（＋）されたＳＫ−Ｂｒ−３乳癌細胞である。垂直な白線は、推定的、酵素的に活性のある成分である、リン酸化の少ないＥ１α型を通る。
【００８７】
図１２Ａおよび１２Ｂは、本発明の医薬組成物のｉｎ ｖｉｖｏでの強力で選択的な抗癌効果に対する作業仮説を示す。例えば図１２Ａは、ＰＤＣ Ｅ２サブユニットに共有結合した内在性リポ酸塩により調節される、ＰＤＫの制御的役割を示す。ＰＤＫは通常、高レベルの還元および／またはアセチル化リポ酸塩に反応してＰＤＣを不活性化し、これは腫瘍細胞内で明らかに実質的に修飾される工程である。
【００８８】
同時に図１２Ｂは、ＰＤＣ内における、ＰＤＫのその基質であるＰＤＣ−Ｅ１に対する比の大きな量的相違を示し、このことはｉｎ ｖｉｖｏで正常および腫瘍細胞を区別すると考えられる。正常細胞では、低レベルのＰＤＫがＰＤＨ複合体の周囲をｈａｎｄ−ｏｖｅｒ−ｈａｎｄに「歩く」（その二つの二量体サブユニットを通して）と考えられており、徐々にＥ１をリン酸化する。このリン酸化は、ＰＤＰの脱リン酸化と定常的に平衡状態である（図示していない）。ここに図示される作業仮説では、チオクタンが、通常アセチルリポ酸塩および／またはジヒドロリポ酸塩が結合するのと同じ部位を通じてＰＤＫを刺激し、これにより１以上のＰＤＫアイソフォームを不活性なＥ１αへと人工的に刺激する。癌細胞では、さらに高レベルのＰＤＫが、チオクタンによりさらに効果的にこの刺激を作り出し、ＰＤＣの酵素活性およびミトコンドリアエネルギー代謝を停止させるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
以下の限定されない実施例は、本発明の医薬組成物についての理解を促進するために提供される。
【実施例１】
【００９０】
チオクタンの化学合成
リポ酸誘導体（すなわちチオクタン）ＣＰＩ−６１３およびＣＰＩ−１５７は、米国特許第６，３３１，５５９ Ｂ１号および米国特許第６，９５１，８８７ Ｂ２号に記載の方法の改変により、６，８−ビスメルカプトオクタン酸を出発物質として用いて合成した。チオクタンＣＰＩ−０４５は、米国特許第６，３３１，５５９ Ｂ１号に記載の通りに合成した。
【００９１】
三つのチオクタンの構造解析について以下に述べる。ＣＰＩ−０４５とＣＰＩ−６１３の独立した複数の合成は、これらの抗癌特性について区別できなかった。異種移植（図７）およびＡＴＰ測定（図９）に用いたＣＰＩ−６１３の純度は９９％を超えていた。その他の全ての調製品は９８％を超える純度であった。
【００９２】
ＣＰＩ−６１３：６，８−ビスベンジルスルファニルオクタン酸：白色の結晶性固体、ｍ．ｐ．６５〜６６℃（ｌｉｔ．１６７．５〜６９°）；１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．１５−７．４（ｍ，１０Ｈ）、３．６６（ｓ，２Ｈ）、３．６４（ｓ，２Ｈ）、２．５２−２．６２（ｍ，１Ｈ）、２．５０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．２９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、１．２−１．８（ｍ，８Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤＣ１３）：δ１７９．６、１３８．６、１３８．５、１２８．９、１２８．８、１２８．５、１２８．４、１２６．９、４４．１、３６．４、３５．１、３４．４、３３．８、２８．７、２６．０、２４．４。
【００９３】
ＣＰＩ−１５７：６，８−ビスエチルスルファニルオクタン酸：無色の油；ＴＬＣ
（ＥｔＡｃ：ヘキサン：ＨＡｃ，２００：２００：１ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．６０；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２．６４−２．７６（ｍ，１Ｈ）、２．６５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．５２（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．４９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．３６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．４０−１．８５（ｍ，８Ｈ）、１．２５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、１．２２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１８０．０、４４．３、３４．６、３３．９、２８．９、２６．２、２５．９、２４．５、２４．２、１４．９、１４．７；ＩＲ（フィルム）：２９６３、１７０８、１４４９、１４２３、１２８３、１２６３ｃｍ−１。
【００９４】
ＣＰＩ−０４５：６，８−ビスベンゾイルスルファニルオクタン酸：無色の粘性油；ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＡｃ：ＨＡｃ，１００：５０：１ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．３０；１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．９−８．１（ｍ，４Ｈ）、７．３８−７．６０（ｍ，６Ｈ）、３．８−４．０（ｍ，１Ｈ）、３．０−３．３（ｍ，２Ｈ）、２．３４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．４−２．２（ｍ，８Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（６２．９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９１．７、１９１．５、１７９．７、１３７．０、１３６．９、１３３．３、１２８．５、１２７．３、１２７．１、４３．６、３５．０、３４．６、３３．８、２６．４、２６．２、２４．３；ＩＲ（フィルム）：２９７３、１７１０、１７０４、１６６７、１６６５、１６６２、１４４８、１２０７、１１７５、９１１、７７３、７５７、７３３、６８８、６４８ｃｍ−１。
【実施例２】
【００９５】
チオクタンの抗癌効果決定のために用いた方法
細胞：ヒト腫瘍細胞株はＡＴＣＣから入手し、ＡＴＣＣの勧告に従って増殖させた。ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）、末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）、および正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）の初代細胞は、ＬＯＮＺＡ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， Ｉｎｃ（ウォーカーズビル、メリーランド州）から得た。各細胞株は、開発した供給業者から購入した適切な培地中で、供給者の指示に従って維持および増殖させた。ここに報告する実験では、３ないし６回継代した正常細胞を使用した。
【００９６】
腫瘍増殖阻害の研究：ＣＤ１−Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスに、ヒトＢｘＰＣ−３もしくはＡｓＰＣ−１膵臓腫瘍細胞、またはＨ４６０ ＮＳＣＬＣを皮下（ＳＣ）注射によって移植した。約８〜１２日後、図の説明文に示される用量およびスケジュールによりマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。薬物またはビヒクルは、体重２５ｇあたり約２ｍｌ注射した。薬物濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌ（約３．１ｍＭ）以下であった。ビヒクル／溶媒は、２５ｍＭ以下のトリエタノールアミン水溶液により構成された。モック処置動物に注射されたビヒクルは、この実験で最も高い薬物用量が注射された溶媒と常に同一であった。マウスは、健康状態および死亡率について毎日モニターされた。体重および腫瘍の体積を、処置前には毎日、処置中および処置後には週に約３回評価した。マウスはＳｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ大学動物施設において、１２時間の明／暗サイクルに置かれ、自由に摂食し、施設の指針に従って飼育された。
【００９７】
細胞死アッセイ：細胞生存率評価のために、ほとんどの場合ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、チオクタンによるＡＴＰ合成の初期の阻害によって混乱させないための十分に長い時間使用した（図９）。典型的な実験では、黒く透明な底の９６ウェルプレートに、細胞をウェルあたり５，０００細胞まいた。１８〜２５時間後に培地を、薬物溶媒（血清を含む培地中に２．８ｍＭ、無血清培地中に０．７ｍＭの、トリエタノールアミン水溶液）または同じ溶媒中のチオクタンＣＰＩ−６１３を含む新鮮な培地に交換した。製造者の指示に従い、薬物用量に応じて、薬物添加後２４または４８時間後にアッセイを行った。
【００９８】
幾つかの場合には、細胞は４８ウェルプレートにウェルあたり１０，０００細胞まき、１８〜２５時間後に培地を、薬物溶媒（最終濃度が１％のＥｔＯＨ）または同じ溶媒中の様々な濃度のチオクタンＣＰＩ−０４５を含む新鮮な培地に交換した。残りの実験の間、細胞を溶媒または薬物を含む培地中にとどめた。薬物添加後２４、４８、および７２時間後にプレートを点検し、コンフルエンスのパーセンテージから細胞数を推定した。これらの条件下でチオクタンにより誘導された細胞死は、閾値に近い用量で高度にアポトーシス性であり、細胞数の推定は非常に信頼できる死の指標である（図１０）。７２時間後にも完全な細胞が残っていた場合には、トリパンブルー排除試験を行った。
【００９９】
表２に、腫瘍細胞に対するチオクタンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの作用についてのデータを示す。ＣＰＩ−６１３および／またはＣＰＩ−０４５による殺傷に対する感受性について本発明者らが調査した、ヒト腫瘍および初代ヒト細胞を収載する。「＋」は、約２００〜３００μＭ（１０％血清存在下で）および無血清培地中で約５０μＭの用量でアポトーシスまたはネクローシス様の細胞死を起こした細胞を示す（図８および図９）。「−−」は、相当する培地中で細胞死誘導のために５倍高い薬物用量を必要とした細胞を示す。「ｎｔ」は、未試験の組み合わせを示す。図８でのＭＤＣＫ正常細胞と同様に、全ての腫瘍細胞株は１０％血清を含む適切な培地中で分析された。加えて、ＨＭＥＣ、ＳＡＥＣ、ＮＨＫＣ初代ヒト細胞、およびＳＫ−ＢＲ−３、Ａ５４９およびＨ４６０腫瘍株もまた、適切な無血清培地中で分析された。初代細胞は接触阻止され、形質転換細胞は同程度の濃度であった。
【０１００】
ＡＴＰアッセイ：黒く透明な底の９６ウェルプレートに、細胞をウェルあたり５，０００細胞まいた。１８〜２５時間後に培地を、薬物溶媒（トリエタノールアミン）またはチオクタン（ＣＰＩ−６１３またはＣＰＩ−１５７）またはリポ酸を含む新鮮な培地に、示される時間間隔および薬物濃度において交換した。トリパンブルー排除を用い、細胞の生存率および完全性を、薬物を除去した後の回収率によって評価した。ＡＴＰは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造者の指示に従って測定した。全ての測定は二重に行い、高い一貫性が示された。平均の標準誤差は、測定値の０．１〜２％の範囲であった。その結果、図９ではエラーバーを省略した。図９のピルビン酸メチル培地は、１０％透析ウシ胎仔血清、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、および１０ｍＭピルビン酸メチル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した、グルコースを含まないＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から成り、対応するグルコース培地は従来のＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。
【０１０１】
ＰＤＨおよびαＫＤＨ酵素アッセイ：腫瘍細胞を１５ｃｍプレート内で８０％コンフルエンスに増殖させ、示されているようにＣＰＩ−６１３によって処理した。ＭｏｒｅａｄｉｔｈおよびＦｉｓｋｕｍ１の方法に従ってミトコンドリアを分離した。ミトコンドリアを０．４％ラウリルマルトシド中で溶解した。５０μｌのミトコンドリアライセートを９６ウェルプレートへ加えた。５０μｌの反応混合物（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、２ｍＭ β−ＮＡＤ＋、２２５μＭｖ ＴＰＰ、２ｍＭピルビン酸またはα−ケトグルタル酸、１５０μＭコエンザイムＡ、２．６ｍＭシステイン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）をミトコンドリアライセートに加え、混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。この時点で、混合物に１５μＭのレサズリンおよび０．５Ｕ／ｍｌのジアホラーゼを加え、さらに５分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ）内での５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長を用いた蛍光測定により、ＮＡＤＨの産生をモニターした。全ての測定は二重に行い、高い一貫性が示された。平均の標準誤差は、測定値の０．３〜４％の範囲であった。その結果、図１０ではエラーバーを省略した。
【０１０２】
Ｅ１αのリン酸化：
２−Ｄゲルのための細胞ライセート：細胞を６０ｍｍディッシュ内で９５％コンフルエンスに増殖させ、示されているように薬物または溶媒によって処理した。細胞をｉｎ ｓｉｔｕで４５０μｌの溶解緩衝液Ａ［４５５μｌ Ｚｏｏｍ ２Ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ １（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５μｌ １Ｍトリスベース、５μｌ １００Ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡを含まないＣｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ）；５μｌ ２Ｍ ＤＴＴ］により溶解した。細胞ライセートを１．５ｍｌ微量遠心チューブへ移し、氷上で５０％出力にて１５段階の超音波処理を行った。室温での１０分間のインキュベーション後に２．５μｌのジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、ライセートをさらに１０分間インキュベートした。５μｌの２Ｍ ＤＴＴを加えて、過剰のＤＭＡを中和した。ライセートを１６，０００ｘｇで１５分間遠心した。
【０１０３】
２−Ｄゲル：Ｚｏｏｍ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の指示に従って使用した。簡単に述べると、３０〜５０μｌのライセートを０．８μｌ ｐＨ３〜１０両性電解質、０．７５μｌ ２Ｍ ＤＴＴと混合し、Ｚｏｏｍ ２Ｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ １にて１５０μｌにした。１５０μｌのサンプルをＩＰＧ ｒｕｎｎｅｒ内に装填し、ｐＨ３〜１０のＮＬ ＩＰＧストリップを加えた。ストリップを室温で一晩浸漬した。等電点（ｉｓｏｌｅｃｔｒｉｃ）電気泳動には段階的プロトコルを使用した（２５０Ｖ、２０分；４５０Ｖ、１５分；７５０Ｖ、１５分 ２０００Ｖ、３０分）。ストリップを１Ｘローディング緩衝液で１５分間、続いて１Ｘローディング緩衝液および１６０ｍＭヨード酢酸で１５分間処理した。ストリップはＮｕＰＡＧＥ ４−１２％ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ＺＯＯＭゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動した。
【０１０４】
表２ 腫瘍および初代細胞に対するチオクタンのｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果
【０１０５】
ウェスタン：タンパク質はＰＶＤＦ ４．５μｍメンブレンにブロットした。ｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＤＨ Ｅ１αおよびＥ２を検出した。
【０１０６】
カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの切断：Ｒｏｙ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ．２に従い、切断されたカスパーゼ−３をウェスタンブロットにて検出した。簡単に述べると、薬物または溶媒処理後に細胞をかき取り、培地／細胞／アポトーシス小体の混合物を６０００ｘｇにて遠心した。ペレットを溶解緩衝液Ｃ（４Ｍ尿素、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００３％ＢＰＢ；５％ ２−メルカプトエタノール）により溶解した。ウェルあたり３０μｇの全細胞ライセートタンパク質を、１２％ビス−トリスゲルにロードした。タンパク質はＰＶＤＦ ４．５μｍメンブレンにブロットした。抗カスパーゼ３ｍＡｂ（マウスモノクローナル［３１Ａ１０６７］；ａｂｃａｍ）により、プロ−および活性化カスパーゼ３を検出した。モノクローナル抗ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ抗体、クローンＣ−２−１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ＰＡＲＰ切断を検出した。
【０１０７】
ミトコンドリアＣａ２＋の検出：細胞を３５ｍｍガラス底プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３ｘ１０５まき、一晩増殖させて、示されているように薬物または溶媒によって処理した。次に細胞をカルシウム色素Ｆｌｕｏ−４、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１またはＲｈｏｄ−２（４μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にフェノールレッドを含まない培地中にロードし、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ（Ｚｅｉｓｓ）デコンボリューション顕微鏡を用い、固定した露光時間で、ＦＩＴＣフィルターを用いて画像を得た。蛍光の定量化は、製造者より提供されたソフトウェアを用いて行った。Ｘ−Ｒｈｏｄ−１およびＲｈｏｄ−２からは同様の結果が得られ（図１３）、これらの色素はミトコンドリアＣａ２＋シグナルを測定していることが示された３−４。
【０１０８】
参考文献
１．Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ ＲＷ ａｎｄ Ｆｉｓｋｕｍ Ｇ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｆｒｏｍ Ａｓｃｉｔｅｓ Ｔｕｍｏｕｒ−Ｃｅｌｌｓ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３７，３６０−３６７（１９８４）．
２．Ｒｏｙ Ｓ ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＤＷ．Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｃａｓｐａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ３２２，１１０−１２５（２０００）．
３．Ｇｅｒｅｎｃｓｅｒ ＡＡ ａｎｄ Ａｄａｍ−Ｖｉｚｉ Ｖ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ３０，３１１−３２１（２００１）．
４．Ｇｙｏｒｇｙ Ｈ，Ｇｙｏｒｇｙ Ｃ，Ｄａｓ Ｓ，Ｇａｒｃｉａ−Ｐｅｒｅｚ Ｃ，Ｓａｏｔｏｍｅ Ｍ，Ｒｏｙ ＳＳ，ａｎｄ Ｙｉ ＭＱ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃａ２＋ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ４０，５５３−５６０（２００６）．
【実施例３】
【０１０９】
チオクタンによるミトコンドリア膜電位およびＣａ２＋取り込みの撹乱
チオクタンによるＡＴＰ合成の阻害における基質効果（図９）は、該薬物がミトコンドリアマトリックス内でＴＣＡサイクルに干渉することを示す。これが事実であれば、ミトコンドリア膜電位は致死閾値用量以上で損傷し得ると本発明者らは予測する１。電位感受性の色素であるＴＭＲＥを用い、本発明者らは予想された効果を観察する（図１３）。ミトコンドリア膜電位は、薬物処理の開始によって迅速に低下する。膜電位低下の動態は、ミトコンドリア基質存在下でのＡＴＰ合成の損失によく似ている（図９）。
【０１１０】
ミトコンドリアでのＡＴＰの枯渇は、小胞体を含む細胞質貯蔵から放出されたＣａ２＋の取り込みを含む恒常性反応を誘発することが知られている２。さらに、このＣａ２＋のミトコンドリアマトリックス内への移入には、ミトコンドリア膜電位が必要であると考えられている。従って、進行的に損なわれる膜電位を考えると、本発明者らは、致死閾値以上でのチオクタン処理が持続性のＣａ２＋の細胞質放出と共にイオンの一過性のミトコンドリアへの取り込みを起こし得ると予測する。本発明者らはミトコンドリアＣａ２＋の測定にＸ−Ｒｈｏｄ−１およびＲｈｏｄ−２、および細胞質Ｃａ２＋の測定にＦｌｕｏ−４を用いて、これらの予想される効果を観察する（図１３）。
【０１１１】
致死閾値かまたはそれよりもわずかに高いＣＰＩの用量において、約２時間までに（図９および１３を比較されたい）ミトコンドリア膜電位が低下するに従い、この最初のミトコンドリアの一過性Ｃａ２＋の取り込みは減衰する。この４〜６時間後、カルシウム依存性細胞死経路の開始に付随すると推定される、第２の大きなミトコンドリアＣａ２＋ピークが続く３。
【０１１２】
参考文献
１．Ｇａｒｒｅｔｔ Ｒ ａｎｄ Ｇｒｉｓｈａｍ ＣＭ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ，Ｓｏｕｔｈｂａｎｋ，Ｖｉｃ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ； Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ．（２００７）．
２．Ｇｒａｉｅｒ ＷＦ，Ｆｒｉｅｄｅｎ Ｍ，ａｎｄ Ｍａｌｌｉ Ｒ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ Ｃａ２＋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｏｌｄ ｇｕｅｓｔｓ，ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈｉｖ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ４５５，３７５−３９６（２００７）．
３．Ｇｙｏｒｇｙ Ｈ，Ｇｙｏｒｇｙ Ｃ，Ｄａｓ Ｓ，Ｇａｒｃｉａ−Ｐｅｒｅｚ Ｃ，Ｓａｏｔｏｍｅ Ｍ，Ｒｏｙ ＳＳ，ａｎｄ Ｙｉ ＭＱ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｃａ２＋ ｕｐｔａｋｅ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ ４０，５５３−５６０（２００６）．
【実施例４】
【０１１３】
チオクタンにより誘導される多様な細胞死プログラム
詳しい機構は完全には理解されていないが、ある状況下では、ミトコンドリアエネルギー代謝の減少は細胞死経路へ入るための決定に関連することが知られている１−３。閾値を超えるが、この最小の殺傷用量の２倍以内であるチオクタン用量においては、試験された全ての癌細胞型が形態的には主にアポトーシス様である細胞死を起こす（図８）。この条件下でのアポトーシス様の死は、従来のアネキシン免疫染色およびＴＵＮＥＬ ＤＮＡ末端標識アッセイによって確認した（結果は提示していない）。
【０１１４】
さらに高い薬物用量（閾値の２倍を超える値よりも多い）において、活性のあるチオクタンは、形態的なアポトーシスへの関連を示さずに細胞死を誘導し（再プレートによる生存率アッセイ、およびトリパンブルーまたはプロピジウム排除による評価として）、これはネクローシス様経路を示唆している（結果は提示していない）。
【０１１５】
これらのデータは、チオクタンＣＰＩ−６１３によるミトコンドリアエネルギー代謝の阻害が、細胞死誘導に正確に関連することを確証する。
【０１１６】
異なる多様な細胞死経路についての不活性化変異を含むと知られているかまたは推定される多様な腫瘍細胞４は全て、ほとんど同様のチオクタン用量において殺傷される（図８および表２）という知見が著しい。この知見はこれらの薬物が、複数の、潜在的に重複性である遠位細胞死遂行経路に関与できるマスターシグナルを誘導することを示唆する５。
【０１１７】
この可能性に一致して、本発明者らは一般的なカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫが、チオクタンで処理された細胞における細胞死の形態をわずかに変化させるが、該薬剤の致死閾値用量では識別可能な効果をもたないことを見出している。
【０１１８】
チオクタン誘導性の細胞死が複数の末端遂行機構を通して進行できる可能性をさらに試験するため、本発明者らは異なる細胞死経路の指標であるカスパーゼ−３およびＰＡＲＰ−Ｉによる切断５について検討した。本発明者らは、チオクタンＣＰＩ−６１３およびＣＰＩ−０４５の両方が、異なる細胞において非常に変化しやすいレベルのこれらの二つの切断現象を誘導することを見出している（図１４）。
【０１１９】
まとめるとこれらの結果は、チオクタンが、薬物用量および細胞型に依存して死への戦略的なコミットメントを誘導することができ、その決定の末端での戦術的な遂行について作動性であることを示す。
【０１２０】
参考文献
１．Ｗａｔａｂｅ Ｍ ａｎｄ Ｎａｋａｋｉ Ｔ． ＡＴＰ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５２，５３６−５４１（２００７）．
２．Ｙｕｎｅｖａ Ｍ，Ｚａｍｂｏｎｉ Ｎ，Ｏｅｆｈｅｒ Ｐ，Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ Ｒ，ａｎｄ Ｌａｚｅｂｎｉｋ Ｙ． Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｇｌｕｃｏｓｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ＭＹＣ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，９３−１０５（２００７）．
３．Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ ＶＰ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｔｏｐｔｏｓｉｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ １１，４７３−４８５ （２００６）．
４．Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ＲＷ，Ｒｕｅｆｌｉ ＡＡ，ａｎｄ Ｌｏｗｅ ＳＷ． Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｅｌｌ １０８，１５３−１６４（２００２）．
５．Ｃｒｅｇａｎ ＳＰ，Ｄａｗｓｏｎ ＶＬ，ａｎｄ Ｓｌａｃｋ ＲＳ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＩＦ ｉｎ ｃａｓｐａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３，２７８５−２７９６（２００４）．
【実施例５】
【０１２１】
リポ酸誘導体類似体の構造
以下に提示する様々なリポ酸誘導体類似体の限定されない例は、製造され、ここに開示される。
【０１２２】
前述の考察は、本発明の単なる典型的な実施形態を開示および記述するものである。当業者はこれらの考察および添付の請求項から、以下の請求項に定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、ここに様々な変更、改変、および変動があってよいことを容易に認識するであろう。さらに、ここには典型的な実施形態が表されているが、その他の当業者は本発明のその他の設計または使用について気付くであろう。従って、本発明はその典型的な実施形態と関連して記述されているが、設計および使用の両方に対する多数の改変が当業者に明らかとなるであろうこと、およびこの応用がそのいずれの適応または変動も網羅するように意図されることが理解されるであろう。それ故本発明は、請求項およびその均等物のみによって限定されることが明白に意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む温血動物の病的な細胞のミトコンドリア内の、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態のための薬剤的に許容される調節因子であって、該調節因子が、
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタール Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され、；
式中、Ｒ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ６はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
その代謝産物；
またはその塩；
および
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ４Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され；
式中、Ｒ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４およびＲ５は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
その代謝産物；
またはその塩から成る群より選択される調節因子。
【請求項２】
調節が可逆的リン酸化もしくは脱リン酸化を含む、請求項１に記載の調節因子。
【請求項３】
可逆的リン酸化または脱リン酸化が、酵素もしくは酵素複合体、またはそれらのサブユニットのキナーゼ、ホスファターゼ、および／または脱水素酵素に起こる、請求項２に記載の調節因子。
【請求項４】
調節因子がキナーゼ活性を促進または阻害する、請求項３に記載の調節因子。
【請求項５】
キナーゼがピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＫ）１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、およびそれらの各アイソフォームを含む群より選択される、請求項４に記載の調節因子。
【請求項６】
調節因子がホスファターゼ活性を促進または阻害する、請求項３に記載の調節因子。
【請求項７】
ホスファターゼがピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼ（ＰＤＰ）１、ＰＤＰ２、およびそれらの各アイソフォームを含む群より選択される、請求項６に記載の調節因子。
【請求項８】
調節因子が脱水素酵素活性を促進または阻害する、請求項３に記載の調節因子。
【請求項９】
可逆的リン酸化または脱リン酸化がピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）複合体に起こる、請求項２に記載の調節因子。
【請求項１０】
調節がＰＤＨ複合体のＥ１αサブユニットに起こる、請求項９に記載の調節因子。
【請求項１１】
調節がＰＤＰならびにそのアイソフォームおよび変異型の不活性化によって起こる、請求項１０に記載の調節因子。
【請求項１２】
ＰＤＰの不活性がＰＤＰ発現の抑制によって起こる、請求項１１に記載の調節因子。
【請求項１３】
調節がＰＤＫならびにそのアイソフォームおよび変異型の活性化によって起こる、請求項１０に記載の調節因子。
【請求項１４】
病的な細胞が請求項１に記載の調節因子による処理に感受性または非感受性を示す、請求項１に記載の調節因子。
【請求項１５】
、処理に非感受性の病的な細胞が、それらが処理感受性となるように、少なくとも１の修飾された酵素もしくは酵素複合体、またはそれらのサブユニットの発現を誘導されてよい、請求項１４に記載の調節因子。
【請求項１６】
発現が遺伝操作によって誘導される、請求項１５に記載の調節因子。
【請求項１７】
誘導が転写操作によって達成される、請求項１６に記載の調節因子。
【請求項１８】
誘導が翻訳操作によって達成される、請求項１６に記載の調節因子。
【請求項１９】
誘導が翻訳後操作によって達成される、請求項１６に記載の調節因子。
【請求項２０】
発現がエピジェネティック操作によって誘導される、請求項１５に記載の調節因子。
【請求項２１】
発現が表現型操作によって誘導される、請求項１５に記載の調節因子。
【請求項２２】
病的な細胞が、請求項１に記載の調節因子による処理で少なくとも１の修飾された酵素または酵素複合体を発現する、請求項１４に記載の調節因子。
【請求項２３】
調節因子がＰＤＫおよびそのアイソフォームおよび変異型の発現レベルに影響する、請求項１に記載の調節因子。
【請求項２４】
調節因子がＰＤＰおよびそのアイソフォームおよび変異型の発現レベルに影響する、請求項１に記載の調節因子。
【請求項２５】
発現レベルが転写、翻訳、または翻訳後レベルにおいて変化する、請求項２３または２４に記載の調節因子。
【請求項２６】
変化がエピジェネティックである、請求項２５に記載の調節因子。
【請求項２７】
調節因子が有毒代謝産物の生成を阻害する、請求項９に記載の調節因子。
【請求項２８】
調節因子が有毒代謝産物の解毒を促進する、請求項９に記載の調節因子。
【請求項２９】
代謝産物が、アセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルから成る群より選択される、請求項２７または２８に記載の調節因子。
【請求項３０】
調節効果がアセトイン産生の減少により観察される、請求項２８に記載の調節因子。
【請求項３１】
可逆的リン酸化または脱リン酸化が非可逆的となる、請求項９に記載の調節因子。
【請求項３２】
リン酸化または脱リン酸化の効果が細胞死をもたらす、請求項３１に記載の調節因子。
【請求項３３】
効果がアポトーシスである、請求項３２に記載の調節因子。
【請求項３４】
効果がネクローシスである、請求項３２に記載の調節因子。
【請求項３５】
調節因子が、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態の変化を含む、疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状の治療および予防に有用である、請求項１に記載の調節因子。
【請求項３６】
少なくとも１の酵素複合体がＰＤＨ複合体である、請求項３５に記載の調節因子。
【請求項３７】
疾病、状態、または症候群が、細胞の過剰増殖によってさらに特徴付けられる、請求項３５に記載の調節因子。
【請求項３８】
疾病、状態、または症候群が癌である、請求項３７に記載の調節因子。
【請求項３９】
有効量の請求項１に記載の調節因子の投与を含む、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態の変化を含む、疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を呈する患者において、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットを調節する方法。
【請求項４０】
少なくとも１の酵素複合体がＰＤＨ複合体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
疾病、状態、または症候群が、細胞の過剰増殖によってさらに特徴付けられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
疾病、状態、または症候群が癌である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
患者から細胞サンプルを得ること、有効量の請求項１に記載の調節因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞へ投与すること、およびそこから結果を得ることを含む、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態の変化を含む、疾病、状態、または症候群の症状を呈する患者の診断および利益を予想するための方法。
【請求項４４】
少なくとも１の酵素複合体がＰＤＨ複合体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
疾病、状態、または症候群が、細胞の過剰増殖によってさらに特徴付けられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
疾病、状態、または症候群が癌である、請求項４５に記載の方法。
【請求項１】
ヒトを含む温血動物の病的な細胞のミトコンドリア内の、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態のための薬剤的に許容される調節因子であって、該調節因子が、
［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、アルケン ＣｎＨ２ｎ、アルケニル ＣｎＨ２ｎ−１、アルキン ＣｎＨ２ｎ−２、アルキニル ＣｎＨ２ｎ−３、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、ジスルフィドアルキル ＣＨ３ＣＨｔ−Ｓ−Ｓ−、チオカルバミン酸エステル （ＣＨ２）ｎＣ＝ＮＨ−、およびセミチオアセタール ＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−（ここでｎは１〜１０、およびｔは０〜９を表す）、芳香族、Ｒ４Ｃ（Ｏ）−として定義されるアシル、ヘテロアリール、Ｒ５Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、有機金属アリール、アルキル−有機金属アリール、セミアセタール Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され、；
式中、Ｒ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４は水素、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、および有機金属アリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５は水素、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびアルキルヘテロアリールから成る群より選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ６はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨを表し；かつ
式中、ｘは０〜１６を表す］
その代謝産物；
またはその塩；
および
（式中、Ｍは共有結合、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｚ−、または金属がパラジウムではない金属キレートもしくはその他の金属複合体を表し；
式中、Ｒ１およびＲ２は水素、アシル Ｒ４Ｃ（Ｏ）−、アルキル ＣｎＨ２ｎ＋１、ＣｍＨ２ｍ−１として定義されるアルケニル、ＣｍＨ２ｍ−３として定義されるアルキニル、アリール、ヘテロアリール、硫化アルキル ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−、Ｒ４Ｃ（＝ＮＨ）−として定義されるイミドイル、Ｒ６ＣＨ（ＯＨ）−Ｓ−として定義されるヘミアセタール、アミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、ならびにそれらの多量体および組み合わせから成る群より独立して選択され；
式中、Ｒ１およびＲ２は非置換または置換であってよく；
式中、Ｒ３はアミノ酸、炭水化物、核酸、脂質、およびそれらの多量体から成る群より選択され；
式中、Ｒ４およびＲ５は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルから成る群より独立して選択され、そのいずれもが置換または非置換であってよく；
式中、Ｒ５はＣＣｌ３、ＣＦ３、またはＣＯＯＨから成る群より選択され；かつ
式中、ｘは０〜１６、ｚは０〜５、ｎは０〜１０、およびｍは２〜１０を表す）
その代謝産物；
またはその塩から成る群より選択される調節因子。
【請求項２】
調節が可逆的リン酸化もしくは脱リン酸化を含む、請求項１に記載の調節因子。
【請求項３】
可逆的リン酸化または脱リン酸化が、酵素もしくは酵素複合体、またはそれらのサブユニットのキナーゼ、ホスファターゼ、および／または脱水素酵素に起こる、請求項２に記載の調節因子。
【請求項４】
調節因子がキナーゼ活性を促進または阻害する、請求項３に記載の調節因子。
【請求項５】
キナーゼがピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＫ）１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、ＰＤＫ４、およびそれらの各アイソフォームを含む群より選択される、請求項４に記載の調節因子。
【請求項６】
調節因子がホスファターゼ活性を促進または阻害する、請求項３に記載の調節因子。
【請求項７】
ホスファターゼがピルビン酸脱水素酵素ホスファターゼ（ＰＤＰ）１、ＰＤＰ２、およびそれらの各アイソフォームを含む群より選択される、請求項６に記載の調節因子。
【請求項８】
調節因子が脱水素酵素活性を促進または阻害する、請求項３に記載の調節因子。
【請求項９】
可逆的リン酸化または脱リン酸化がピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）複合体に起こる、請求項２に記載の調節因子。
【請求項１０】
調節がＰＤＨ複合体のＥ１αサブユニットに起こる、請求項９に記載の調節因子。
【請求項１１】
調節がＰＤＰならびにそのアイソフォームおよび変異型の不活性化によって起こる、請求項１０に記載の調節因子。
【請求項１２】
ＰＤＰの不活性がＰＤＰ発現の抑制によって起こる、請求項１１に記載の調節因子。
【請求項１３】
調節がＰＤＫならびにそのアイソフォームおよび変異型の活性化によって起こる、請求項１０に記載の調節因子。
【請求項１４】
病的な細胞が請求項１に記載の調節因子による処理に感受性または非感受性を示す、請求項１に記載の調節因子。
【請求項１５】
、処理に非感受性の病的な細胞が、それらが処理感受性となるように、少なくとも１の修飾された酵素もしくは酵素複合体、またはそれらのサブユニットの発現を誘導されてよい、請求項１４に記載の調節因子。
【請求項１６】
発現が遺伝操作によって誘導される、請求項１５に記載の調節因子。
【請求項１７】
誘導が転写操作によって達成される、請求項１６に記載の調節因子。
【請求項１８】
誘導が翻訳操作によって達成される、請求項１６に記載の調節因子。
【請求項１９】
誘導が翻訳後操作によって達成される、請求項１６に記載の調節因子。
【請求項２０】
発現がエピジェネティック操作によって誘導される、請求項１５に記載の調節因子。
【請求項２１】
発現が表現型操作によって誘導される、請求項１５に記載の調節因子。
【請求項２２】
病的な細胞が、請求項１に記載の調節因子による処理で少なくとも１の修飾された酵素または酵素複合体を発現する、請求項１４に記載の調節因子。
【請求項２３】
調節因子がＰＤＫおよびそのアイソフォームおよび変異型の発現レベルに影響する、請求項１に記載の調節因子。
【請求項２４】
調節因子がＰＤＰおよびそのアイソフォームおよび変異型の発現レベルに影響する、請求項１に記載の調節因子。
【請求項２５】
発現レベルが転写、翻訳、または翻訳後レベルにおいて変化する、請求項２３または２４に記載の調節因子。
【請求項２６】
変化がエピジェネティックである、請求項２５に記載の調節因子。
【請求項２７】
調節因子が有毒代謝産物の生成を阻害する、請求項９に記載の調節因子。
【請求項２８】
調節因子が有毒代謝産物の解毒を促進する、請求項９に記載の調節因子。
【請求項２９】
代謝産物が、アセトアルデヒド、スーパーオキシド、過酸化水素、およびヒドロキシルラジカルから成る群より選択される、請求項２７または２８に記載の調節因子。
【請求項３０】
調節効果がアセトイン産生の減少により観察される、請求項２８に記載の調節因子。
【請求項３１】
可逆的リン酸化または脱リン酸化が非可逆的となる、請求項９に記載の調節因子。
【請求項３２】
リン酸化または脱リン酸化の効果が細胞死をもたらす、請求項３１に記載の調節因子。
【請求項３３】
効果がアポトーシスである、請求項３２に記載の調節因子。
【請求項３４】
効果がネクローシスである、請求項３２に記載の調節因子。
【請求項３５】
調節因子が、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態の変化を含む、疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状の治療および予防に有用である、請求項１に記載の調節因子。
【請求項３６】
少なくとも１の酵素複合体がＰＤＨ複合体である、請求項３５に記載の調節因子。
【請求項３７】
疾病、状態、または症候群が、細胞の過剰増殖によってさらに特徴付けられる、請求項３５に記載の調節因子。
【請求項３８】
疾病、状態、または症候群が癌である、請求項３７に記載の調節因子。
【請求項３９】
有効量の請求項１に記載の調節因子の投与を含む、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態の変化を含む、疾病、状態、もしくは症候群、またはそれらの症状を呈する患者において、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットを調節する方法。
【請求項４０】
少なくとも１の酵素複合体がＰＤＨ複合体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
疾病、状態、または症候群が、細胞の過剰増殖によってさらに特徴付けられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
疾病、状態、または症候群が癌である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
患者から細胞サンプルを得ること、有効量の請求項１に記載の調節因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞へ投与すること、およびそこから結果を得ることを含む、少なくとも１の酵素および／または酵素複合体、またはそれらのサブユニットのリン酸化状態の変化を含む、疾病、状態、または症候群の症状を呈する患者の診断および利益を予想するための方法。
【請求項４４】
少なくとも１の酵素複合体がＰＤＨ複合体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
疾病、状態、または症候群が、細胞の過剰増殖によってさらに特徴付けられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
疾病、状態、または症候群が癌である、請求項４５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１１−５１６４７３（Ｐ２０１１−５１６４７３Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２９０８（Ｐ２０１１−５０２９０８）
【出願日】平成２０年４月４日（２００８．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４４１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２３５９７
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２３７２６２）
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＯＲＲ，Ｒｏｂｅｒｔ
【出願人】（５１０２３７２７３）
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ，Ｒｏｂｅｒｔ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月４日（２００８．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００４４１０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２３５９７
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１０２３７２６２）
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＯＲＲ，Ｒｏｂｅｒｔ
【出願人】（５１０２３７２７３）
【氏名又は名称原語表記】ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ，Ｒｏｂｅｒｔ
【Ｆターム（参考）】
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