単核細胞と血小板の濃縮方法
【課題】赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から、簡便な操作で、血液製剤を使用せずに単核細胞と血小板を高濃度に濃縮する方法の提供。
【解決手段】入口と出口を有する容器に細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器１１と、回路と、バッグ１３とを有するフィルターシステムを用いて、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法であって、バッグに貯留された前記体液に赤血球沈降剤を添加し、有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離して、有核細胞と血小板に偏った層のみを細胞捕捉器に導入して有核細胞と血小板をフィルター材４１に捕捉させた後に、細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、フィルター材を通過した濾液のみを、気体で押し出してフィルター材に導入して、フィルター材に捕捉されている単核細胞と血小板を選択的に回収する、該方法。
【解決手段】入口と出口を有する容器に細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器１１と、回路と、バッグ１３とを有するフィルターシステムを用いて、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法であって、バッグに貯留された前記体液に赤血球沈降剤を添加し、有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離して、有核細胞と血小板に偏った層のみを細胞捕捉器に導入して有核細胞と血小板をフィルター材４１に捕捉させた後に、細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、フィルター材を通過した濾液のみを、気体で押し出してフィルター材に導入して、フィルター材に捕捉されている単核細胞と血小板を選択的に回収する、該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は赤血球、有核細胞、血小板を含む体液から、簡便な操作にて目的の単核細胞と血小板を効率的に高純度かつ高濃度に濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療や細胞治療のような細胞を用いた研究や治療が注目され実用化されつつある。このような用途に使用される細胞は骨髄液、臍帯血や末梢血などから採取されることが多いが、これらの中には研究や治療に必要な細胞以外にも多様な細胞が含有されている。例えば骨髄液、臍帯血や末梢血には通常赤血球が多量に含まれているが、赤血球は目的とする細胞の増殖を妨げ、また細胞治療においては細胞の生着能を低下させる。そこで、いかに赤血球の混入を低減して必要とする間葉系幹細胞、脂肪細胞、造血幹細胞、単核球のような単核細胞を選択的に採取するかが課題であった。
【０００３】
また治療効果の観点から、必要とする単核細胞の回収率が高く、濃度が高いことが求められている。さらに再生医療において、再生における重要三要素の一つである成長因子を豊富に含有する細胞等が高濃度に共存することで、さらなる高い治療効果が実現できる。
【０００４】
従来、このような多量の赤血球を除去して必要な細胞のみを選択的に採取する方法としては、比重遠心法、赤血球凝集法、バフィーコート法、抗体を用いたアフィニティ分離法などが行われてきた。
しかしながら、比重遠心法は、赤血球除去率が高く、容積を小さくできるため細胞濃縮率も高いが、その反面、細胞の回収率は低く、また非常に熟練した技術が要求される煩雑な操作であり、さらに開放系での操作になるため雑菌の混入リスクが高く、安全性の面でも問題がある。
【０００５】
また、赤血球凝集法では、ヒドロキシエチルスターチやデキストランと混和して赤血球の連銭形成により赤血球を凝集、沈降させて上層の必要な細胞を回収するが（非特許文献１、２）、赤血球の除去を高めようとすると界面に存在する細胞も除去してしまうために細胞の回収率が低下し、細胞の回収率を高めようとすると赤血球の混入を低減できず、この両方を満足することはできなかった。またこの方法では、液量の減容ができず充分な必要細胞濃度が得られなかった。
【０００６】
バフィーコート法では、血液が貯留されたバッグを強遠心して上層の血漿層、中間層の主に白血球と血小板からなるバフィーコート層、下層の赤血球層を形成させ、上層の血漿層と下層の赤血球層をバッグから追い出して中間層のバフィーコート層を回収するが（非特許文献３）、やはり赤血球凝集法と同じ問題がある。
【０００７】
抗体を用いたアフィニティ分離法では、特異性は高く減容効果は大きいものの、分離した細胞を回収するためには、結合した抗体分子を酵素処理するため、細胞の損傷、高コスト、操作の煩雑さなどの問題がある。
【０００８】
また、赤血球の混入が少量である場合には、赤血球を低浸透圧下で溶血して除去する方法などもある。しかし、このような低浸透圧状態では必要とする細胞までもがダメージを受け、赤血球が除去できる一方で必要な細胞本来の細胞機能が失われる。また、実用化において安全性の観点から、できるだけ他家のものは用いずに全て自己の成分のみで構成され、操作が簡便であることが求められている。
【０００９】
フィルター装置を用いて細胞含有液から簡便な操作で不要細胞の混入を低減し、効率的に有核細胞を分離回収する方法として、特許文献１では、細胞含有液を不要細胞に富む層と有核細胞に富んだ層に分離し、先ず不要細胞に富む層からフィルター装置に導入し、次に有核細胞に富んだ層を導入した後、フィルターに捕捉された有核細胞を回収液で回収する方法が開示されている。しかし、この方法では赤血球のような不要細胞に富む層もフィルターに導入するため、赤血球の除去率が十分でなく、また回収時に一定量の回収液を用いるため細胞濃度も低く、再生医療や細胞治療用途に適した赤血球除去と細胞濃縮液は得られなかった。さらに、有核細胞全般を回収し、かつ血小板を不要細胞として除去してしまう為に有益な単核細胞と血小板を選択的に濃縮する効果はない。
【００１０】
また、特許文献２では、細胞含有液をフィルターに導入した後、フィルターを通過した濾液を少量残存させることにより、回収時に市販製剤の血清蛋白質を用いずに、細胞を高率に回収できる方法が開示されている。しかしながら、細胞含有液をそのままフィルターに導入することから赤血球のような不要細胞が多量に混入し、さらには細胞の回収率を高めるために一定量の高粘度の回収液を用いることから細胞濃度も低く、さらに遠心等の操作が必要となり操作が煩雑で時間がかかる。また、血小板を濃縮する効果については一切記載されていない。
【００１１】
さらに特許文献３では、単核球捕捉フィルターに細胞集団を導入した後に、アルブミンを含むリンス液を導入してフィルター装置内に残存する赤血球を洗い流した後、フィルター装置に回収液を導入してフィルター装置内に捕捉された目的細胞を回収する方法が開示されている。この方法では、リンス液を導入している為に赤血球の混入は減少しているが、赤血球もフィルターに導入するために、これでもなお赤血球除去率が不十分である。さらにリンス液の作用によって血小板はむしろ洗い流される可能性があるためか血小板を濃縮するような記載はない。また、回収液としてヒト血清アルブミンを使用しているため感染のリスクも高い。さらに操作性に関して、リンス液を通液する際にフィルター装置に血液回路中の空気が入り込んで濾過不能（エアブロック）になる、フィルター装置に空気が入らないように濾過前にリンス液でフィルター装置および血液回路をプライミングしておく必要があるなど、非常に煩雑な操作を余儀なくされる上に、一定量の回収液を用いる為に細胞濃度も低く十分でない。
【００１２】
特許文献４では、細胞集団を細胞分離フィルターで濾過した後に、細胞分離フィルターの下流側から先ず液体を導入し、引き続いて気体を導入することで回収必要細胞を高率かつ細胞にダメージを与えずに分離回収する方法が開示されている。しかしながら、特許文献４の方法では赤血球もフィルターに導入するために赤血球の混入量が多く、また回収必要細胞を高濃度に濃縮することはできず、血小板に関しては濃縮どころか除去してしまうことから回収さえもできなかった。
【００１３】
以上より、多様な細胞を含有する細胞含有液から、簡便な操作法で単核細胞や血小板のような必要な細胞を効率的に高純度かつ高濃度に濃縮する細胞調製方法はいまだ確立されていなかった。
【特許文献１】国際公開第２００５／０３５７３７号パンフレット
【特許文献２】特開２０００−３２５０７１号公報
【特許文献３】特開２００４−１２１１４４号公報
【特許文献４】特開２００１−７８７５７号公報
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ１０１１９−１０１２２（１９９５）
【非特許文献２】Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１０６，ｐｐ１６−１９（１９９７）
【非特許文献３】Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２３，ｐｐ５０５−５０９（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から、簡便な操作で、血液製剤を使用せずに、単核細胞と血小板を高濃度に濃縮する方法であって、赤血球の混入率が低く、単核細胞と血小板の回収率が高い濃縮方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、少なくとも赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液に赤血球沈降剤を添加して有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離させた後に、有核細胞と血小板に偏った層のみを細胞捕捉フィルター材に通過させ、細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満のフィルター材を通過した濾液と気体で回収することで、簡便な操作で赤血球を高率除去できかつ単核細胞と血小板を効率的に回収して高濃度に濃縮できることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）入口と出口を有する容器に細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器と、回路と、バッグとを有するフィルターシステムを用いて、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法であって、
バッグに貯留された前記体液に赤血球沈降剤を添加し、
有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離して、
前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入して有核細胞と血小板を前記フィルター材に捕捉させた後に、
前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液のみを、気体で押し出して前記フィルター材に導入して、
前記フィルター材に捕捉されている単核細胞と血小板を選択的に回収することを特徴とする赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（２）前記気体が、空気であることを特徴とする前記（１）に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（３）前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液が、前記細胞捕捉器と回路に残存した濾液であることを特徴とする前記（１）または（２）に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（４）前記赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランのいずれかであることを特徴とする前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（５）前記有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離した後に、前記赤血球に偏った層をバッグから排出して、前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入することを特徴とする前記（１）乃至（４）のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（６）前記赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液が、末梢血、臍帯血、骨髄液からなる群より選択される一の体液であることを特徴とする前記（１）乃至（５）のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る単核細胞と血小板を濃縮する方法によれば、赤血球や有核細胞や血小板を含む細胞含有液から、簡便な操作で、血液製剤を使用せずに、単核細胞と血小板を選択的に高濃度に濃縮することができ、しかも赤血球の混入率は極めて低く、単核細胞と血小板の回収率は高くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明でいう赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液とは、骨髄液、臍帯血、末梢血などであり、これらは採取したままのものであっても、生理食塩液、抗凝固剤液や培養液などで希釈されたものであっても良い。本発明でいう有核細胞とは、核を有する細胞であればいずれの細胞であっても良いが、白血球、単核細胞、顆粒球などが挙げられる。
【００１９】
また本発明でいう単核細胞とは、単核の細胞のことをいうが、例えばリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞や骨芽細胞前駆細胞、脂肪細胞などが挙げられ、なかでも単核細胞として選択的に採取されるのは、増殖または分化誘導能を有する造血幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞や骨芽細胞前駆細胞である。
【００２０】
本発明でいう細胞捕捉フィルター材とは、有核細胞を捕捉し赤血球のような不要な細胞は通過する多孔質フィルター材をいう。ここでいう有核細胞を捕捉するとは、細胞含有液から有核細胞の６０％以上、より好ましくは７０％以上を回収することをいう。また、赤血球のような不要な細胞を通過するとは、細胞含有液から赤血球の９０％以上、より好ましくは９５％以上をフィルターに捕捉せずに通過させることをいう。
【００２１】
本発明に用いられる細胞捕捉フィルター材は、水不溶性担体であればいかなる材質でも用いることができるが、様々な形状に加工でき、医療材料として滅菌可能でありかつ生体適合性の高いものが挙げられる。例えば、セルロース、デキストラン、キチン、キトサン、デンプン、アガロース、蛋白質、天然ゴムなどの天然ポリマー、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体、ポリメタクリル酸エステル、ポリ塩化ビニル、ポリアミノ酸などの合成ポリマー、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、アルミナなどのセラミックス、チタン等が挙げられる。
【００２２】
また、細胞捕捉フィルター材の表面に特定の細胞と親和性を持たせるような加工を施しているものも良好に用いられる。例えば、特定の細胞表面抗原に対する抗体、ペプチドやそのポリマー、またフィブロネクチンのような細胞接着分子、コラーゲンのような細胞外基質及びその変性体であるゼラチンなどをフィルター材表面に固定またはコーティングするなどして目的とする細胞をより選択的に捕捉することができる。これらのフィルター表面の加工剤は目的とする細胞に応じて選択され、複数種類を組み合わせて用いることもできる。
【００２３】
細胞捕捉フィルター材の形状は、細胞を捕捉するのに十分な表面積を有することが必要であることから、例えば粒状・繊維塊・綿状・布状・糸状・中空糸状・糸束状・織布状・不織布状・スポンジ状等が挙げられるが、体積当りの表面積が大きい点から不織布やスポンジ状がより好ましく用いられる。
【００２４】
細胞捕捉フィルター材が不織布の場合、平均繊維径は１．０μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは１．０μｍ以上２０μｍ以下であり、さらにより好ましくは１．５μｍ以上１０μｍ以下である。１．０μｍ未満では有核細胞が強固に捕捉されてしまい回収困難となる可能性があるだけでなく、不要細胞の通過、特に凝集させた場合の通過を困難にする。また、３０μｍを超えると有核細胞が繊維に捕捉されず素通りする可能性が高くなる。いずれの場合も回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。
【００２５】
ここでいう平均繊維径とは、以下の手順に従って求められる値をいう。即ち実質的に均一と認められる細胞捕捉フィルター材の一部をサンプリングし、走査型電子顕微鏡などを用いて、１０００倍〜３０００倍の倍率で写真に撮る。サンプリングに際しては、細胞捕捉フィルター材の有効濾過断面積部分を、一辺が０．５ｃｍ〜１ｃｍの正方形によって区分し、その中から３ヶ所以上、好ましくは５ヶ所以上をランダムサンプリングする。ランダムサンプリングするには、例えば上記各区分に番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要箇所以上の区分を選べばよい。またサンプリングした各区分について、３ヶ所以上、好ましくは５ヶ所以上を写真に撮る。このようにして得た写真について、写っている全ての繊維の直径を測定する。ここで直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維径とする。但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になってその幅が測定できない場合、また複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、更に著しく直径の異なる繊維が混在している場合、等々の場合には、これらのデータは削除する。以上の方法により、５００本以上、好ましくは１０００本以上のデータにより平均繊維径を求める。
【００２６】
また、本発明でいう細胞捕捉器の容器としては特に限定はないが、細胞含有液を導入可能とするような入口と出口を有し、細胞捕捉フィルター材に効率的に細胞を捕捉できるような構造であることが好ましい。例えば、細胞捕捉フィルター材として不織布を用いる場合、細胞捕捉器の容器の形状は、細胞含有液の入口と出口の距離が最長となるように、入口と出口が対角線の両端に位置する平板の正方形であることが好ましい。細胞捕捉フィルター材の有効濾過断面積は、捕捉する細胞数にも因るが、４．０ｃｍ２〜４５ｃｍ２の範囲にあることが好ましく、細胞捕捉フィルター材に捕捉された細胞が高い線速によって剥離しないよう、より好ましくは９．０ｃｍ２〜４５ｃｍ２の範囲であり、細胞捕捉フィルター材の全体を均一に有効利用するには、９．０ｃｍ２〜１８ｃｍ２であることが最も好ましい。
【００２７】
細胞捕捉器の容器の材質としては、水不溶性で成形性、密閉性、滅菌性に優れ、生体適合性の高い材質が好ましい。さらに、細胞含有液が細胞捕捉フィルター材を通過する際や、濾液で細胞捕捉フィルター材の単核細胞を回収する際などに、細胞捕捉器内部に負荷される圧力によって実質的に膨張したり漏洩したりしない硬い材質であることが好ましい。これらの観点から好ましい材質としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられ、硬度の観点からより好ましいのはポリカーボネート、ポリスチレンであり、容器への細胞付着による細胞ロスの観点からするとポリカーボネートが最も好ましく用いられる。
【００２８】
本発明でいう赤血球沈降剤とは、多様な細胞を含有する細胞含有液から赤血球のみを連銭形成等により沈降させる成分を含有するものをいい、具体的にはヒドロキシエチルスターチ、デキストランなどが挙げられる。血液に対するヒドロキシエチルスターチ添加量としては、例えばヒドロキシエチルスターチの平均分子量が４０万で１０％生理食塩水溶液の場合、血液１に対して、１／３量〜１／１０量が好ましく、濃度としては、０．９〜２．５％が好ましい。また静置する時間としては１０分以上８０分以下、好ましくは２０分以上５０分以下が好ましい。ヒドロキシエチルスターチ添加量が１／１０量未満、もしくは静置する時間が１０分未満の場合、赤血球の連銭形成が不十分で層分離が不十分となり好ましくない。一方、ヒドロキシエチルスターチ添加量が１／３量より多いか、もしくは静置する時間が８０分より長い場合、層分離が急速に進み、細胞も沈降してしまうので好ましくない。また、ヒドロキシエチルスターチの分子量は７万〜４０万の範囲にあることが好ましいが、赤血球の沈降速度や沈降性をより高くする観点から２０万〜４０万の分子量のものがより好ましく用いられる。
【００２９】
デキストランの血液に対する添加量は、例えば分子量が７万で、５％のデキストラン生理食塩液の場合、血液１に対して１．５量〜３．０量が好ましく、濃度としては１．０〜４．５％が好ましい。静置する時間は３０分〜７５分が好ましく、デキストラン添加量が血液に対して１．５量未満、もしくは静置する時間が３０分未満の場合は、赤血球の連銭形成が不十分で層分離の界面が明瞭でなくなるため好ましくない。一方、デキストラン添加量が３．０量よりも多いか、もしくは静置時間が７５分よりも長い場合は、層分離が過剰に進み、細胞も沈降してしまうので好ましくない。また、分子量は５万〜２０万の範囲にあることが好ましいが、ヒドロキシエチルスターチと同様の理由から７万〜２０万の分子量のものが良好に用いられる。
【００３０】
本発明でいう赤血球に偏った層とは、層分離する前の赤血球と有核細胞と血小板を含む体液中の赤血球の６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が含有される層のことをいう。
【００３１】
また、本発明でいう有核細胞と血小板に偏った層とは、層分離する前の赤血球と有核細胞と血小板を含む体液中の有核細胞と血小板の６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が含有される層のことをいう。
【００３２】
本発明で単核細胞と血小板を選択的に回収するとは、細胞捕捉フィルター材に捕捉された有核細胞と血小板を回収する際に、フィルターを通過した濾液を少量気体で押出すことで、フィルターに捕捉された有核細胞と血小板から、単核細胞と血小板を優先的に回収することをいう。細胞表面の特性から有核細胞のうち粘着性の低い単核細胞が粘着性の高い多核細胞よりも優先的に回収される。
【００３３】
本発明の方法では、濾液を回収液として使用するため、回収液を別途調製する必要がない。また、濾液は血漿蛋白等の血漿成分を含有しているため、回収液に細胞安定化剤として通常添加する血液製剤由来の血清アルブミンを補充する必要がなく、感染のリスクもない。回収液として用いる濾液量は、細胞捕捉フィルター材に捕捉された単核細胞と血小板を高い回収率で回収するために、細胞捕捉器の容積に対して０．２容以上である必要がある。回収に使用する濾液量が細胞捕捉器の容積の０．２容未満であると、泡立ち易くなり、細胞の回収率が低下する。また、回収に使用する濾液量を細胞捕捉器の１．０容以上にしても、目的とする単核細胞と血小板の回収率は向上しないから、濾液量を増加した分、目的とする単核細胞や血小板の濃度が減少する。よって、単核細胞と血小板の濃縮液を得るには、回収液に使用する濾液量が細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満であることが必須である。
【００３４】
回収に使用する濾液の流速は、剪断力を高め、単核細胞を高率で回収するためにできるだけ高速が好ましいが、内圧上昇による細胞捕捉器と細胞導入管の接続部のはずれや、有核細胞へのダメージを起こさない流速に制御することが好ましい。また、回収に使用する濾液を細胞捕捉器に導入する手段は、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いるものや、簡便法としてシリンジを手で押す方法、貯留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差処理等が挙げられる。更に、有核細胞の回収率をより高めるために、フィルター装置に振動を加えるとか、ストップドフロー等を行ってもよい。回収に使用する濾液をフィルター装置に導入する方向は、体液を導入した方向と同方向または逆方向があるが、一般的に後者の方が細胞回収率が高いので好ましい。
【００３５】
本発明で使用する濾液量は細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満と少量であり、濾液だけでは細胞を回収できないので、濾液を細胞捕捉フィルター材に通し回収バッグまで押し出すために、気体を使用する。気体は濾液のｐＨや細胞の生存率に影響しない無菌状態のものであればどのような気体であっても良いが、窒素ガスや酸素ガス、空気が好ましく、簡便さの点で空気が最も好ましい。
【００３６】
図１と図２のシステムを例にとって、赤血球と有核細胞と血小板を含む体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法を説明する。まず、赤血球廃棄管１上のクランプ２０を閉じて、注入部３または赤血球廃棄管１から体液貯留バッグ１４に赤血球と有核細胞と血小板を含む体液を導入する。体液貯留バッグ１４の注入部３から赤血球沈降剤を導入し、一定時間静置させて体液を有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに層分離する。次に、クランプ２０を開けて、赤血球に偏った層を体液貯留バッグ１４の赤血球廃棄管１から排出してから、クランプ２０を閉じて有核細胞と血小板に偏った層のみを体液貯留バッグ１４に残す。赤血球沈降剤によって沈降した赤血球に偏った層の廃棄は、体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続する前に行ってもよいし、接続後に行ってもよい。
【００３７】
図２において、フィルターシステム（濃縮システム１００）は、細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器１１と、バック即ちドレインバッグ１２、回収バッグ１３、体液貯留バッグ１４とを、それぞれ回路即ち赤血球廃棄管１、濾液回収管５、細胞回収管７、細胞導入管４、注入管６及びＴ字管３１、３２を介して接続して形成されている。また、注入管６には、注入口３３が設けられ、細胞導入管４のクランプ２１とＴ字管３１との間には、エアベントフィルター４１が設けられ、更にクランプ２０〜２３が配置されている。濃縮システム１００のクランプ２１〜２３をすべて閉じた状態で、体液貯留バッグ１４の細胞導入管接続部２と濃縮システム１００の細胞導入管４を接続し、Ｔ字管３１は体液貯留バッグ１４と細胞捕捉器１１のみが連通するようにし、Ｔ字管３２は細胞捕捉器１１とドレインバッグ１２のみが連通するようにする。濃縮システム１００はスタンドなどの固定台に吊り下げて、重力方向上から、体液貯留バッグ１４、細胞捕捉器１１、ドレインバッグ１２の順に配置されるようにする。
【００３８】
次に、クランプ２１と２２を開けて、体液貯留バッグ１４に残った有核細胞と血小板に偏った層を細胞捕捉フィルター材を備える細胞捕捉器１１に導入する。赤血球に偏った層を細胞捕捉器に導入せずに有核細胞と血小板に偏った層のみを細胞捕捉器１１に導入することによって、赤血球の混入が低減することはもとより、細胞捕捉器に捕捉された細胞が、多量の赤血球のずり応力によって細胞捕捉フィルター材の深部に潜り込まず回収されやすい状態で保持される。例えば、層分離せずに体液を細胞捕捉器１１に導入した場合、赤血球が混入するだけでなく、単核細胞と血小板の濃縮率も低減するため好ましくない。また、赤血球の層分離効率が悪い場合も同様のことが起こるため、十分な層分離を行った後に赤血球に偏った層を体液貯留バッグから慎重に排出することが好ましい。赤血球廃棄管が接続されている体液貯留バッグ１４の接続部分は、出口に向かって傾斜していると赤血球に偏った層が残留しにくいため好ましい。また、有核細胞と血小板に偏った層を細胞捕捉器１１に導入する手段については特に限定はないが、落差やポンプ、あるいは体液貯留バッグを押しつぶして導入しても良い。操作時間の観点から、落差やポンプによる導入が好ましく、簡便さの点から落差が最も好ましい。細胞捕捉器１１から排出された液はドレインバッグ１２に貯留される。体液貯留バッグ１４内の有核細胞と血小板に偏った層が全て細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉フィルター材を通過したら、クランプ２１と２２を閉じる。この時、細胞捕捉器１１と注入管６には、細胞捕捉器１１の０．２容以上１．０容未満の濾液が残るようにする。
【００３９】
次に、Ｔ字管３２は注入口３３と細胞捕捉器のみが連通するようにし、Ｔ字管３１は細胞捕捉器１１と回収液バッグ１３のみが連通するようにし、クランプ２３を開けて注入口３３から空気を細胞捕捉器１１に導入し、回収バッグ１３に単核細胞と血小板を回収する。注入する空気の量は、濾液がすべて回収バッグ１３に回収できれば良い。回収バッグ１３に濾液がすべて回収されたら、クランプ２３を閉じる。
【００４０】
あるいは、細胞捕捉器１１と注入管６に濾液を残さずに、エアベントフィルター４１からシリンジ等を用いて空気を導入し、細胞捕捉器１１と濾液回収管５に残留した濾液を押し出してドレインバッグ１２に回収しても良い。この場合は、ドレインバッグ１２からシリンジ等を用いて細胞捕捉器１１の０．２容以上１．０容未満の濾液を回収して、注入口３３から導入し、導入した濾液を空気で押し出して回収液バッグ１３に回収しても良い。この方法は、濾液の導入量を正確に設定できるという利点がある。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４２】
[実施例１]
（１）細胞捕捉器の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦４３ｍｍ 、横４３ｍｍ 、高さ２．９ｍｍ （ 有効濾過断面積１８．５ｃｍ2 、内容積７ｍＬ） で、液体流入口と液体流出口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器に有核細胞捕捉材として、容器の入口側から平均繊維径約１２μｍのポリエステル不織布０ ．１４ｇと、平均繊維径１．７μｍ のポリエステル不織布１．２８ｇ と、平均繊維径１．１μｍのポリエステル不織布０．１９ｇからなる有核細胞捕捉フィルター材を充填した。尚、充填密度はそれぞれ入口側から０．２０ｇ／ｃｍ3、 ０．２４ｇ／ｃｍ3および０．２０ｇ／ｃｍ3であった。
（２） 赤血球層排出操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４に、６％ヒドロキシエチルスターチ（ニプロファーマ「ＨＥＳ４０（赤血球沈降剤）」を１２ｍＬ添加して、１０分間混和した。そして、３０分間静置して赤血球を沈降させた後、体液貯留バッグ１４の下方に沈降した赤血球に偏った層を赤血球廃棄管１を通じで体液貯留バッグ１４の外に排出した。この時、下層の赤血球に偏った層と上層の有核細胞と血小板に偏った層との界面を乱さないように注意し、かつ上層を排出しないようにゆっくりと排出した。なお、この時濃縮システムにおいて事前にクランプ２１ 、２３を閉じてある。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、９．０×１０９個であった。
（３） 細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。この時、有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に流れ、濾過された細胞浮遊液はドレインバッグ１２ に貯留した。体液貯留バッグ１４の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１ に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間の容器内は空気で満たされ、細胞捕捉器１１の出口側空間の容器内にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１ 、２２を閉じた。続いてシリンジに空気３８ｍＬを充填し、クランプ２３ を開けて注入口３３ から手動で空気３８ｍＬを押出し、細胞捕捉器１１内の出口側空間に残留している濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は５．４ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．７７容）であった。
（４）分析
本細胞濃縮操作により得られた細胞濃縮液の赤血球除去率、単核細胞回収率、単核細胞濃縮倍率、単核細胞含有率、血小板濃縮倍率、をそれぞれ以下の計算式にて算出した。
また、赤血球数、単核細胞数、単核細胞濃度、全細胞数、血小板濃度のカウントは多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した。
・赤血球除去率（％）＝｛（ＣＰＤ加血液中の赤血球数−細胞濃縮液中の赤血球数）／ＣＰＤ加血液中の赤血球数｝×１００
・単核細胞回収率（％）＝（細胞濃縮液中の単核細胞数／ＣＰＤ加血液中の単核細胞数）×１００
・単核細胞濃縮倍率＝（細胞濃縮液中の単核細胞濃度／ＣＰＤ加血液中の単核細胞濃度）
・単核細胞含有率（％）＝（細胞濃縮液中の単核細胞数／細胞濃縮液中の全細胞数）×１００
・血小板濃縮倍率＝（細胞濃縮液中の血小板濃度／ＣＰＤ加血液中の血小板濃度）
（５）結果
本細胞濃縮操作により、細胞濃縮液の赤血球数は７．８×１０８個、赤血球除去率は９９．４％、単核細胞回収率は７４．６％、単核細胞濃度は６．９×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は８．１倍、単核細胞含有率は５０．２％、血小板濃縮倍率は２．９倍であった。
【００４３】
[実施例２]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同様のものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同様の操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．４×１０１１個、８．９×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層（細胞浮遊液）が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。この時、有核細胞と血小板に偏った層は細胞捕捉器１１に流れ、濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器１１の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１を閉じてクランプ２３を開けてエアベントフィルター４１にシリンジを用いて空気３．５ｍＬを導入して細胞捕捉器１１内の出口側空間に残留している濾液を押出し、ドレインバッグ１２へ貯留した。この時、細胞捕捉器１１内の出口側空間や注入管６には、少量の濾液が残存していた。以後の操作は実施例１と全く同じ操作を行った。この時に回収された細胞濃縮液量は１．８ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．２６容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．０×１０９個、赤血球除去率は９９．３％、単核細胞回収率は６５．１％、単核細胞濃度は１．９×１０７個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は２１．７倍、単核細胞含有率は４９．８％、血小板濃縮倍率は５．５倍であった。
【００４４】
[実施例３]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同じ操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、１．０×１０１０個であった。
（３）細胞濃縮操作
実施例１と同様に、有核細胞と血小板に偏った層を落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過が終了した後、クランプ２１ 、２２を閉じた。次に、ドレインバッグ１２に流入したフィルター材を通過した濾液１．０ｍＬを、濾液採取ポート８にシリンジを接続して採取し、さらに空気を３７ｍＬ充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の濾液と空気を押出し、細胞捕捉器１１内のフィルター材を通過した濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は６．７ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．９６容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は７．１×１０８個、赤血球除去率は９９．５％、単核細胞回収率は７２．５％、単核細胞濃度は５．４×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は６．３倍、単核細胞含有率は４９．４％、血小板濃縮倍率は２．３倍であった。
【００４５】
[実施例４]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同様の操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、９．０×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１を閉じてエアベントフィルター４１にシリンジを用いて空気３０ｍＬを導入して細胞捕捉器１１内に残留している濾液を完全に押出し、ドレインバッグ１２へ貯留した。続いて、ドレインバッグ１２に貯留された濾液６．０ｍＬを、濾液液採取ポート８にシリンジを接続して採取し、さらに空気を３２ｍＬ充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の濾液と空気を押出し、濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は６．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．８７容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は８．１×１０８個、赤血球除去率は９９．４％、単核細胞回収率は６８．５％、単核細胞濃度は５．６×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は６．５倍、単核細胞含有率は４９．１％、血小板濃縮倍率は２．４倍であった。
【００４６】
[実施例５]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４に、５％デキストラン（和光純薬「Ｄｅｘｔｒａｎ２００，０００」）を溶解した生理食塩液３０ｍＬを添加して、１０分間混和した。そして、３０分間静置して赤血球を沈降させた後、体液貯留バッグ１４の下方に沈降した赤血球に偏った層を赤血球廃棄管１を通じで体液貯留バッグ１４の外に排出した。この時、下層の赤血球に偏った層と上層の有核細胞と血小板に偏った層との界面を乱さないように注意し、かつ上層を排出しないようにゆっくりと排出した。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、９．１×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
実施例１と同様の操作を行った。この時に回収された細胞濃縮液量は５．０ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．７１容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は７．３×１０８個、赤血球除去率は９９．４％、単核細胞回収率は７１．３％、単核細胞濃度は７．１×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は８．３倍、単核細胞含有率は５１．２％、血小板濃縮倍率は２．７倍であった。
【００４７】
[比較例１]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同様のものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
赤血球排出操作は行わず、ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４をそのまま用いた。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、１．３×１０１１個であった。
（３）細胞濃縮操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留されたＣＰＤ加ヒト末梢血液を落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全てのＣＰＤ加ヒト末梢血液が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間には濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１、２２を閉じた。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体２３ｍＬと空気１５ｍＬをシリンジに充填し、クランプ２３ を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の液体と空気を押出し、フィルターに捕捉された細胞を回収バッグ１３ に回収して細胞濃縮液を得た。この時回収された細胞濃縮液量は２５．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の３．５９容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．６×１０１０個、赤血球除去率は８７．７％、単核細胞回収率は７７．９％、単核細胞濃度は１．３×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は１．８倍、単核細胞含有率は３９．０％、血小板濃縮倍率は０．５倍であり、赤血球の混入が多く単核細胞の濃度や血小板濃縮倍率も低かった。
【００４８】
[比較例２]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同じ操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、６．３×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
濾過終了後にエアベントフィルター４１にシリンジを用いて空気４．５ｍＬを導入して細胞捕捉器内に残留している濾液を押出し、ドレインバッグ１２へ貯留した以外は、実施例２と同様の操作を行った。この時の回収された細胞濃縮液量は１．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．１６容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．６×１０９個、赤血球除去率は９８．８％、単核細胞回収率は４４．１％、単核細胞濃度は２．１×１０７個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は２４．５倍、単核細胞含有率は４８．１％、血小板濃縮倍率は５．３倍であり、単核細胞の回収率が低く、細胞のロスが多かった。
【００４９】
[比較例３]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同じ操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．２×１０１１個、５．７×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
回収時に、ドレインバッグ１２に流入しフィルター材を通過した濾液５．５ｍＬを、濾液採取ポート８にシリンジを接続して採取し、さらに空気を３２．５ｍＬ充填し、クランプ２３を開けて注入口３３ から手動でシリンジ中の濾液と空気を押出す以外は実施例３と同じ操作を行った。この時の回収された細胞濃縮液量は１２．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の１．７３容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．９×１０９個、赤血球除去率は９８．４％、単核細胞回収率は７５．０％、単核細胞濃度は３．１×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は３．６倍、単核細胞含有率は３９．５％、血小板濃縮倍率は１．４倍であり、単核細胞濃度や濃縮倍率が低く、また単核細胞含有率も低値であり効率的な単核細胞の濃縮ができなかった。
【００５０】
[比較例４]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
赤血球排出操作は行わず、ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４をそのまま用いた。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、１．６×１０１１個であった。
（３）細胞濃縮操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留されたＣＰＤ加ヒト末梢血液を落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全てのＣＰＤ加ヒト末梢血液が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１、２２を閉じた。続いてシリンジに空気３８ｍＬを充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の空気を押出し、細胞捕捉器内のフィルター材を通過した濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は３．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．４４容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は９．１×１０９個、赤血球除去率は９４．２％、単核細胞回収率は５０．６％、単核細胞濃度は７．１×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は９．６倍、単核細胞含有率は４７．４％、血小板濃縮倍率は２．４倍であり、赤血球の混入が多くまた単核細胞の回収率も低値であった。
【００５１】
[比較例５]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
赤血球層排出操作は行わず、ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４に６％ヒドロキシエチルスターチ（ニプロファーマ「ＨＥＳ４０（赤血球沈降剤）」）を１２ｍＬ添加して、１０分間混和した。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、１．７×１０１１個であった。
（３）細胞濃縮操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液と６％ヒドロキシエチルスターチが貯留された体液貯留バッグ１４を１０分間混和した後に細胞導入管４と接続した状態で３０分間静置して赤血球を沈降させた。次に、クランプ２１を開き、体液貯留バッグ１４の下層の赤血球に偏った層を細胞捕捉器１１に導入し、続いて上層の有核細胞と血小板に偏った層を同様に細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての赤血球に偏った層と有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体２３ｍＬと空気１５ｍＬをシリンジに充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の液体と空気を押出し、フィルターに捕捉された細胞を回収バッグ１３に回収して細胞濃縮液を得た。この時回収された細胞濃縮液量は２５．８ｍＬ（細胞捕捉器１１の３．６９容）であった。
（３）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（４）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．２×１０１０個、赤血球除去率は９２．８％、単核細胞回収率は６５．１％、単核細胞濃度は１．３×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は１．５倍、単核細胞含有率は４０．２％、血小板濃縮倍率は０．５倍であり、赤血球の混入が多くかつ単核細胞濃度も低値であった。
【００５２】
[比較例６]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同様の操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．４×１０１１個、８．９×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１ に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器１１の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体２３ｍＬと空気１５ｍＬをシリンジに充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の液体と空気を押出し、フィルターに捕捉された細胞を回収バッグ１３ に回収して細胞濃縮液を得た。この時回収された細胞濃縮液量は２５．８ｍＬ（細胞捕捉器１１の３．６９容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は２．６×１０９個、赤血球除去率は９８．１％、単核細胞回収率は７２．５％、単核細胞濃度は１．４×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は１．６倍、単核細胞含有率は４０．１％、血小板濃縮倍率は０．６倍であり、赤血球の混入もあり単核細胞濃度も低く単核細胞含有率も低値であり効率的に単核細胞を濃縮できなかった。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明による単核細胞と血小板の濃縮方法は、簡便に高濃度の単核細胞と血小板の混合溶液が調製可能であり、かつ完全自己成分のみで構成されるため感染等のリスクもないので、再生医療や細胞治療において有用である。本発明による濃縮方法は効率的なので、体液量が少量の場合、特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の赤血球沈降剤を添加し、有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離するためのシステムの一例を示す模式図である。
【図２】本発明の単核細胞と血小板の濃縮を行うための濃縮システムの一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５７】
１・・・赤血球廃棄管
２・・・細胞導入管接続部
３・・・注入部
４・・・細胞導入管
５・・・濾液回収管
６・・・注入管
７・・・細胞回収管
８・・・濾液採取ポート
１１・・・細胞捕捉器
１２・・・ドレインバッグ
１３・・・回収バッグ
１４・・・体液貯留バッグ
２１、２２、２３・・・クランプ
３１、３２・・・Ｔ字管
３３・・・注入口
４１・・・エアベントフィルター
１００・・・濃縮システム
【技術分野】
【０００１】
本発明は赤血球、有核細胞、血小板を含む体液から、簡便な操作にて目的の単核細胞と血小板を効率的に高純度かつ高濃度に濃縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療や細胞治療のような細胞を用いた研究や治療が注目され実用化されつつある。このような用途に使用される細胞は骨髄液、臍帯血や末梢血などから採取されることが多いが、これらの中には研究や治療に必要な細胞以外にも多様な細胞が含有されている。例えば骨髄液、臍帯血や末梢血には通常赤血球が多量に含まれているが、赤血球は目的とする細胞の増殖を妨げ、また細胞治療においては細胞の生着能を低下させる。そこで、いかに赤血球の混入を低減して必要とする間葉系幹細胞、脂肪細胞、造血幹細胞、単核球のような単核細胞を選択的に採取するかが課題であった。
【０００３】
また治療効果の観点から、必要とする単核細胞の回収率が高く、濃度が高いことが求められている。さらに再生医療において、再生における重要三要素の一つである成長因子を豊富に含有する細胞等が高濃度に共存することで、さらなる高い治療効果が実現できる。
【０００４】
従来、このような多量の赤血球を除去して必要な細胞のみを選択的に採取する方法としては、比重遠心法、赤血球凝集法、バフィーコート法、抗体を用いたアフィニティ分離法などが行われてきた。
しかしながら、比重遠心法は、赤血球除去率が高く、容積を小さくできるため細胞濃縮率も高いが、その反面、細胞の回収率は低く、また非常に熟練した技術が要求される煩雑な操作であり、さらに開放系での操作になるため雑菌の混入リスクが高く、安全性の面でも問題がある。
【０００５】
また、赤血球凝集法では、ヒドロキシエチルスターチやデキストランと混和して赤血球の連銭形成により赤血球を凝集、沈降させて上層の必要な細胞を回収するが（非特許文献１、２）、赤血球の除去を高めようとすると界面に存在する細胞も除去してしまうために細胞の回収率が低下し、細胞の回収率を高めようとすると赤血球の混入を低減できず、この両方を満足することはできなかった。またこの方法では、液量の減容ができず充分な必要細胞濃度が得られなかった。
【０００６】
バフィーコート法では、血液が貯留されたバッグを強遠心して上層の血漿層、中間層の主に白血球と血小板からなるバフィーコート層、下層の赤血球層を形成させ、上層の血漿層と下層の赤血球層をバッグから追い出して中間層のバフィーコート層を回収するが（非特許文献３）、やはり赤血球凝集法と同じ問題がある。
【０００７】
抗体を用いたアフィニティ分離法では、特異性は高く減容効果は大きいものの、分離した細胞を回収するためには、結合した抗体分子を酵素処理するため、細胞の損傷、高コスト、操作の煩雑さなどの問題がある。
【０００８】
また、赤血球の混入が少量である場合には、赤血球を低浸透圧下で溶血して除去する方法などもある。しかし、このような低浸透圧状態では必要とする細胞までもがダメージを受け、赤血球が除去できる一方で必要な細胞本来の細胞機能が失われる。また、実用化において安全性の観点から、できるだけ他家のものは用いずに全て自己の成分のみで構成され、操作が簡便であることが求められている。
【０００９】
フィルター装置を用いて細胞含有液から簡便な操作で不要細胞の混入を低減し、効率的に有核細胞を分離回収する方法として、特許文献１では、細胞含有液を不要細胞に富む層と有核細胞に富んだ層に分離し、先ず不要細胞に富む層からフィルター装置に導入し、次に有核細胞に富んだ層を導入した後、フィルターに捕捉された有核細胞を回収液で回収する方法が開示されている。しかし、この方法では赤血球のような不要細胞に富む層もフィルターに導入するため、赤血球の除去率が十分でなく、また回収時に一定量の回収液を用いるため細胞濃度も低く、再生医療や細胞治療用途に適した赤血球除去と細胞濃縮液は得られなかった。さらに、有核細胞全般を回収し、かつ血小板を不要細胞として除去してしまう為に有益な単核細胞と血小板を選択的に濃縮する効果はない。
【００１０】
また、特許文献２では、細胞含有液をフィルターに導入した後、フィルターを通過した濾液を少量残存させることにより、回収時に市販製剤の血清蛋白質を用いずに、細胞を高率に回収できる方法が開示されている。しかしながら、細胞含有液をそのままフィルターに導入することから赤血球のような不要細胞が多量に混入し、さらには細胞の回収率を高めるために一定量の高粘度の回収液を用いることから細胞濃度も低く、さらに遠心等の操作が必要となり操作が煩雑で時間がかかる。また、血小板を濃縮する効果については一切記載されていない。
【００１１】
さらに特許文献３では、単核球捕捉フィルターに細胞集団を導入した後に、アルブミンを含むリンス液を導入してフィルター装置内に残存する赤血球を洗い流した後、フィルター装置に回収液を導入してフィルター装置内に捕捉された目的細胞を回収する方法が開示されている。この方法では、リンス液を導入している為に赤血球の混入は減少しているが、赤血球もフィルターに導入するために、これでもなお赤血球除去率が不十分である。さらにリンス液の作用によって血小板はむしろ洗い流される可能性があるためか血小板を濃縮するような記載はない。また、回収液としてヒト血清アルブミンを使用しているため感染のリスクも高い。さらに操作性に関して、リンス液を通液する際にフィルター装置に血液回路中の空気が入り込んで濾過不能（エアブロック）になる、フィルター装置に空気が入らないように濾過前にリンス液でフィルター装置および血液回路をプライミングしておく必要があるなど、非常に煩雑な操作を余儀なくされる上に、一定量の回収液を用いる為に細胞濃度も低く十分でない。
【００１２】
特許文献４では、細胞集団を細胞分離フィルターで濾過した後に、細胞分離フィルターの下流側から先ず液体を導入し、引き続いて気体を導入することで回収必要細胞を高率かつ細胞にダメージを与えずに分離回収する方法が開示されている。しかしながら、特許文献４の方法では赤血球もフィルターに導入するために赤血球の混入量が多く、また回収必要細胞を高濃度に濃縮することはできず、血小板に関しては濃縮どころか除去してしまうことから回収さえもできなかった。
【００１３】
以上より、多様な細胞を含有する細胞含有液から、簡便な操作法で単核細胞や血小板のような必要な細胞を効率的に高純度かつ高濃度に濃縮する細胞調製方法はいまだ確立されていなかった。
【特許文献１】国際公開第２００５／０３５７３７号パンフレット
【特許文献２】特開２０００−３２５０７１号公報
【特許文献３】特開２００４−１２１１４４号公報
【特許文献４】特開２００１−７８７５７号公報
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ１０１１９−１０１２２（１９９５）
【非特許文献２】Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１０６，ｐｐ１６−１９（１９９７）
【非特許文献３】Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２３，ｐｐ５０５−５０９（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から、簡便な操作で、血液製剤を使用せずに、単核細胞と血小板を高濃度に濃縮する方法であって、赤血球の混入率が低く、単核細胞と血小板の回収率が高い濃縮方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、少なくとも赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液に赤血球沈降剤を添加して有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離させた後に、有核細胞と血小板に偏った層のみを細胞捕捉フィルター材に通過させ、細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満のフィルター材を通過した濾液と気体で回収することで、簡便な操作で赤血球を高率除去できかつ単核細胞と血小板を効率的に回収して高濃度に濃縮できることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）入口と出口を有する容器に細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器と、回路と、バッグとを有するフィルターシステムを用いて、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法であって、
バッグに貯留された前記体液に赤血球沈降剤を添加し、
有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離して、
前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入して有核細胞と血小板を前記フィルター材に捕捉させた後に、
前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液のみを、気体で押し出して前記フィルター材に導入して、
前記フィルター材に捕捉されている単核細胞と血小板を選択的に回収することを特徴とする赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（２）前記気体が、空気であることを特徴とする前記（１）に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（３）前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液が、前記細胞捕捉器と回路に残存した濾液であることを特徴とする前記（１）または（２）に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（４）前記赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランのいずれかであることを特徴とする前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（５）前記有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離した後に、前記赤血球に偏った層をバッグから排出して、前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入することを特徴とする前記（１）乃至（４）のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
（６）前記赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液が、末梢血、臍帯血、骨髄液からなる群より選択される一の体液であることを特徴とする前記（１）乃至（５）のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る単核細胞と血小板を濃縮する方法によれば、赤血球や有核細胞や血小板を含む細胞含有液から、簡便な操作で、血液製剤を使用せずに、単核細胞と血小板を選択的に高濃度に濃縮することができ、しかも赤血球の混入率は極めて低く、単核細胞と血小板の回収率は高くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明でいう赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液とは、骨髄液、臍帯血、末梢血などであり、これらは採取したままのものであっても、生理食塩液、抗凝固剤液や培養液などで希釈されたものであっても良い。本発明でいう有核細胞とは、核を有する細胞であればいずれの細胞であっても良いが、白血球、単核細胞、顆粒球などが挙げられる。
【００１９】
また本発明でいう単核細胞とは、単核の細胞のことをいうが、例えばリンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞や骨芽細胞前駆細胞、脂肪細胞などが挙げられ、なかでも単核細胞として選択的に採取されるのは、増殖または分化誘導能を有する造血幹細胞、間葉系幹細胞、骨芽細胞や骨芽細胞前駆細胞である。
【００２０】
本発明でいう細胞捕捉フィルター材とは、有核細胞を捕捉し赤血球のような不要な細胞は通過する多孔質フィルター材をいう。ここでいう有核細胞を捕捉するとは、細胞含有液から有核細胞の６０％以上、より好ましくは７０％以上を回収することをいう。また、赤血球のような不要な細胞を通過するとは、細胞含有液から赤血球の９０％以上、より好ましくは９５％以上をフィルターに捕捉せずに通過させることをいう。
【００２１】
本発明に用いられる細胞捕捉フィルター材は、水不溶性担体であればいかなる材質でも用いることができるが、様々な形状に加工でき、医療材料として滅菌可能でありかつ生体適合性の高いものが挙げられる。例えば、セルロース、デキストラン、キチン、キトサン、デンプン、アガロース、蛋白質、天然ゴムなどの天然ポリマー、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸グリコール酸共重合体、ポリメタクリル酸エステル、ポリ塩化ビニル、ポリアミノ酸などの合成ポリマー、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、アルミナなどのセラミックス、チタン等が挙げられる。
【００２２】
また、細胞捕捉フィルター材の表面に特定の細胞と親和性を持たせるような加工を施しているものも良好に用いられる。例えば、特定の細胞表面抗原に対する抗体、ペプチドやそのポリマー、またフィブロネクチンのような細胞接着分子、コラーゲンのような細胞外基質及びその変性体であるゼラチンなどをフィルター材表面に固定またはコーティングするなどして目的とする細胞をより選択的に捕捉することができる。これらのフィルター表面の加工剤は目的とする細胞に応じて選択され、複数種類を組み合わせて用いることもできる。
【００２３】
細胞捕捉フィルター材の形状は、細胞を捕捉するのに十分な表面積を有することが必要であることから、例えば粒状・繊維塊・綿状・布状・糸状・中空糸状・糸束状・織布状・不織布状・スポンジ状等が挙げられるが、体積当りの表面積が大きい点から不織布やスポンジ状がより好ましく用いられる。
【００２４】
細胞捕捉フィルター材が不織布の場合、平均繊維径は１．０μｍ以上３０μｍ以下であり、好ましくは１．０μｍ以上２０μｍ以下であり、さらにより好ましくは１．５μｍ以上１０μｍ以下である。１．０μｍ未満では有核細胞が強固に捕捉されてしまい回収困難となる可能性があるだけでなく、不要細胞の通過、特に凝集させた場合の通過を困難にする。また、３０μｍを超えると有核細胞が繊維に捕捉されず素通りする可能性が高くなる。いずれの場合も回収率の低下につながるおそれがあるので好ましくない。
【００２５】
ここでいう平均繊維径とは、以下の手順に従って求められる値をいう。即ち実質的に均一と認められる細胞捕捉フィルター材の一部をサンプリングし、走査型電子顕微鏡などを用いて、１０００倍〜３０００倍の倍率で写真に撮る。サンプリングに際しては、細胞捕捉フィルター材の有効濾過断面積部分を、一辺が０．５ｃｍ〜１ｃｍの正方形によって区分し、その中から３ヶ所以上、好ましくは５ヶ所以上をランダムサンプリングする。ランダムサンプリングするには、例えば上記各区分に番地を指定した後、乱数表を使うなどの方法で、必要箇所以上の区分を選べばよい。またサンプリングした各区分について、３ヶ所以上、好ましくは５ヶ所以上を写真に撮る。このようにして得た写真について、写っている全ての繊維の直径を測定する。ここで直径とは、繊維軸に対して直角方向の繊維の幅をいう。測定した全ての繊維の直径の和を、繊維の数で割った値を平均繊維径とする。但し、複数の繊維が重なり合っており、他の繊維の陰になってその幅が測定できない場合、また複数の繊維が溶融するなどして、太い繊維になっている場合、更に著しく直径の異なる繊維が混在している場合、等々の場合には、これらのデータは削除する。以上の方法により、５００本以上、好ましくは１０００本以上のデータにより平均繊維径を求める。
【００２６】
また、本発明でいう細胞捕捉器の容器としては特に限定はないが、細胞含有液を導入可能とするような入口と出口を有し、細胞捕捉フィルター材に効率的に細胞を捕捉できるような構造であることが好ましい。例えば、細胞捕捉フィルター材として不織布を用いる場合、細胞捕捉器の容器の形状は、細胞含有液の入口と出口の距離が最長となるように、入口と出口が対角線の両端に位置する平板の正方形であることが好ましい。細胞捕捉フィルター材の有効濾過断面積は、捕捉する細胞数にも因るが、４．０ｃｍ２〜４５ｃｍ２の範囲にあることが好ましく、細胞捕捉フィルター材に捕捉された細胞が高い線速によって剥離しないよう、より好ましくは９．０ｃｍ２〜４５ｃｍ２の範囲であり、細胞捕捉フィルター材の全体を均一に有効利用するには、９．０ｃｍ２〜１８ｃｍ２であることが最も好ましい。
【００２７】
細胞捕捉器の容器の材質としては、水不溶性で成形性、密閉性、滅菌性に優れ、生体適合性の高い材質が好ましい。さらに、細胞含有液が細胞捕捉フィルター材を通過する際や、濾液で細胞捕捉フィルター材の単核細胞を回収する際などに、細胞捕捉器内部に負荷される圧力によって実質的に膨張したり漏洩したりしない硬い材質であることが好ましい。これらの観点から好ましい材質としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられ、硬度の観点からより好ましいのはポリカーボネート、ポリスチレンであり、容器への細胞付着による細胞ロスの観点からするとポリカーボネートが最も好ましく用いられる。
【００２８】
本発明でいう赤血球沈降剤とは、多様な細胞を含有する細胞含有液から赤血球のみを連銭形成等により沈降させる成分を含有するものをいい、具体的にはヒドロキシエチルスターチ、デキストランなどが挙げられる。血液に対するヒドロキシエチルスターチ添加量としては、例えばヒドロキシエチルスターチの平均分子量が４０万で１０％生理食塩水溶液の場合、血液１に対して、１／３量〜１／１０量が好ましく、濃度としては、０．９〜２．５％が好ましい。また静置する時間としては１０分以上８０分以下、好ましくは２０分以上５０分以下が好ましい。ヒドロキシエチルスターチ添加量が１／１０量未満、もしくは静置する時間が１０分未満の場合、赤血球の連銭形成が不十分で層分離が不十分となり好ましくない。一方、ヒドロキシエチルスターチ添加量が１／３量より多いか、もしくは静置する時間が８０分より長い場合、層分離が急速に進み、細胞も沈降してしまうので好ましくない。また、ヒドロキシエチルスターチの分子量は７万〜４０万の範囲にあることが好ましいが、赤血球の沈降速度や沈降性をより高くする観点から２０万〜４０万の分子量のものがより好ましく用いられる。
【００２９】
デキストランの血液に対する添加量は、例えば分子量が７万で、５％のデキストラン生理食塩液の場合、血液１に対して１．５量〜３．０量が好ましく、濃度としては１．０〜４．５％が好ましい。静置する時間は３０分〜７５分が好ましく、デキストラン添加量が血液に対して１．５量未満、もしくは静置する時間が３０分未満の場合は、赤血球の連銭形成が不十分で層分離の界面が明瞭でなくなるため好ましくない。一方、デキストラン添加量が３．０量よりも多いか、もしくは静置時間が７５分よりも長い場合は、層分離が過剰に進み、細胞も沈降してしまうので好ましくない。また、分子量は５万〜２０万の範囲にあることが好ましいが、ヒドロキシエチルスターチと同様の理由から７万〜２０万の分子量のものが良好に用いられる。
【００３０】
本発明でいう赤血球に偏った層とは、層分離する前の赤血球と有核細胞と血小板を含む体液中の赤血球の６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が含有される層のことをいう。
【００３１】
また、本発明でいう有核細胞と血小板に偏った層とは、層分離する前の赤血球と有核細胞と血小板を含む体液中の有核細胞と血小板の６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上が含有される層のことをいう。
【００３２】
本発明で単核細胞と血小板を選択的に回収するとは、細胞捕捉フィルター材に捕捉された有核細胞と血小板を回収する際に、フィルターを通過した濾液を少量気体で押出すことで、フィルターに捕捉された有核細胞と血小板から、単核細胞と血小板を優先的に回収することをいう。細胞表面の特性から有核細胞のうち粘着性の低い単核細胞が粘着性の高い多核細胞よりも優先的に回収される。
【００３３】
本発明の方法では、濾液を回収液として使用するため、回収液を別途調製する必要がない。また、濾液は血漿蛋白等の血漿成分を含有しているため、回収液に細胞安定化剤として通常添加する血液製剤由来の血清アルブミンを補充する必要がなく、感染のリスクもない。回収液として用いる濾液量は、細胞捕捉フィルター材に捕捉された単核細胞と血小板を高い回収率で回収するために、細胞捕捉器の容積に対して０．２容以上である必要がある。回収に使用する濾液量が細胞捕捉器の容積の０．２容未満であると、泡立ち易くなり、細胞の回収率が低下する。また、回収に使用する濾液量を細胞捕捉器の１．０容以上にしても、目的とする単核細胞と血小板の回収率は向上しないから、濾液量を増加した分、目的とする単核細胞や血小板の濃度が減少する。よって、単核細胞と血小板の濃縮液を得るには、回収液に使用する濾液量が細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満であることが必須である。
【００３４】
回収に使用する濾液の流速は、剪断力を高め、単核細胞を高率で回収するためにできるだけ高速が好ましいが、内圧上昇による細胞捕捉器と細胞導入管の接続部のはずれや、有核細胞へのダメージを起こさない流速に制御することが好ましい。また、回収に使用する濾液を細胞捕捉器に導入する手段は、シリンジポンプ、ブラッドポンプ、ペリスタポンプ等の装置を用いるものや、簡便法としてシリンジを手で押す方法、貯留したバッグを押しつぶして液流を惹起する方法、落差処理等が挙げられる。更に、有核細胞の回収率をより高めるために、フィルター装置に振動を加えるとか、ストップドフロー等を行ってもよい。回収に使用する濾液をフィルター装置に導入する方向は、体液を導入した方向と同方向または逆方向があるが、一般的に後者の方が細胞回収率が高いので好ましい。
【００３５】
本発明で使用する濾液量は細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満と少量であり、濾液だけでは細胞を回収できないので、濾液を細胞捕捉フィルター材に通し回収バッグまで押し出すために、気体を使用する。気体は濾液のｐＨや細胞の生存率に影響しない無菌状態のものであればどのような気体であっても良いが、窒素ガスや酸素ガス、空気が好ましく、簡便さの点で空気が最も好ましい。
【００３６】
図１と図２のシステムを例にとって、赤血球と有核細胞と血小板を含む体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法を説明する。まず、赤血球廃棄管１上のクランプ２０を閉じて、注入部３または赤血球廃棄管１から体液貯留バッグ１４に赤血球と有核細胞と血小板を含む体液を導入する。体液貯留バッグ１４の注入部３から赤血球沈降剤を導入し、一定時間静置させて体液を有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに層分離する。次に、クランプ２０を開けて、赤血球に偏った層を体液貯留バッグ１４の赤血球廃棄管１から排出してから、クランプ２０を閉じて有核細胞と血小板に偏った層のみを体液貯留バッグ１４に残す。赤血球沈降剤によって沈降した赤血球に偏った層の廃棄は、体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続する前に行ってもよいし、接続後に行ってもよい。
【００３７】
図２において、フィルターシステム（濃縮システム１００）は、細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器１１と、バック即ちドレインバッグ１２、回収バッグ１３、体液貯留バッグ１４とを、それぞれ回路即ち赤血球廃棄管１、濾液回収管５、細胞回収管７、細胞導入管４、注入管６及びＴ字管３１、３２を介して接続して形成されている。また、注入管６には、注入口３３が設けられ、細胞導入管４のクランプ２１とＴ字管３１との間には、エアベントフィルター４１が設けられ、更にクランプ２０〜２３が配置されている。濃縮システム１００のクランプ２１〜２３をすべて閉じた状態で、体液貯留バッグ１４の細胞導入管接続部２と濃縮システム１００の細胞導入管４を接続し、Ｔ字管３１は体液貯留バッグ１４と細胞捕捉器１１のみが連通するようにし、Ｔ字管３２は細胞捕捉器１１とドレインバッグ１２のみが連通するようにする。濃縮システム１００はスタンドなどの固定台に吊り下げて、重力方向上から、体液貯留バッグ１４、細胞捕捉器１１、ドレインバッグ１２の順に配置されるようにする。
【００３８】
次に、クランプ２１と２２を開けて、体液貯留バッグ１４に残った有核細胞と血小板に偏った層を細胞捕捉フィルター材を備える細胞捕捉器１１に導入する。赤血球に偏った層を細胞捕捉器に導入せずに有核細胞と血小板に偏った層のみを細胞捕捉器１１に導入することによって、赤血球の混入が低減することはもとより、細胞捕捉器に捕捉された細胞が、多量の赤血球のずり応力によって細胞捕捉フィルター材の深部に潜り込まず回収されやすい状態で保持される。例えば、層分離せずに体液を細胞捕捉器１１に導入した場合、赤血球が混入するだけでなく、単核細胞と血小板の濃縮率も低減するため好ましくない。また、赤血球の層分離効率が悪い場合も同様のことが起こるため、十分な層分離を行った後に赤血球に偏った層を体液貯留バッグから慎重に排出することが好ましい。赤血球廃棄管が接続されている体液貯留バッグ１４の接続部分は、出口に向かって傾斜していると赤血球に偏った層が残留しにくいため好ましい。また、有核細胞と血小板に偏った層を細胞捕捉器１１に導入する手段については特に限定はないが、落差やポンプ、あるいは体液貯留バッグを押しつぶして導入しても良い。操作時間の観点から、落差やポンプによる導入が好ましく、簡便さの点から落差が最も好ましい。細胞捕捉器１１から排出された液はドレインバッグ１２に貯留される。体液貯留バッグ１４内の有核細胞と血小板に偏った層が全て細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉フィルター材を通過したら、クランプ２１と２２を閉じる。この時、細胞捕捉器１１と注入管６には、細胞捕捉器１１の０．２容以上１．０容未満の濾液が残るようにする。
【００３９】
次に、Ｔ字管３２は注入口３３と細胞捕捉器のみが連通するようにし、Ｔ字管３１は細胞捕捉器１１と回収液バッグ１３のみが連通するようにし、クランプ２３を開けて注入口３３から空気を細胞捕捉器１１に導入し、回収バッグ１３に単核細胞と血小板を回収する。注入する空気の量は、濾液がすべて回収バッグ１３に回収できれば良い。回収バッグ１３に濾液がすべて回収されたら、クランプ２３を閉じる。
【００４０】
あるいは、細胞捕捉器１１と注入管６に濾液を残さずに、エアベントフィルター４１からシリンジ等を用いて空気を導入し、細胞捕捉器１１と濾液回収管５に残留した濾液を押し出してドレインバッグ１２に回収しても良い。この場合は、ドレインバッグ１２からシリンジ等を用いて細胞捕捉器１１の０．２容以上１．０容未満の濾液を回収して、注入口３３から導入し、導入した濾液を空気で押し出して回収液バッグ１３に回収しても良い。この方法は、濾液の導入量を正確に設定できるという利点がある。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４２】
[実施例１]
（１）細胞捕捉器の作製
上容器と下容器からなり、組み立てた後の内寸が縦４３ｍｍ 、横４３ｍｍ 、高さ２．９ｍｍ （ 有効濾過断面積１８．５ｃｍ2 、内容積７ｍＬ） で、液体流入口と液体流出口を最長対角線上にもつポリカーボネート製容器に有核細胞捕捉材として、容器の入口側から平均繊維径約１２μｍのポリエステル不織布０ ．１４ｇと、平均繊維径１．７μｍ のポリエステル不織布１．２８ｇ と、平均繊維径１．１μｍのポリエステル不織布０．１９ｇからなる有核細胞捕捉フィルター材を充填した。尚、充填密度はそれぞれ入口側から０．２０ｇ／ｃｍ3、 ０．２４ｇ／ｃｍ3および０．２０ｇ／ｃｍ3であった。
（２） 赤血球層排出操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４に、６％ヒドロキシエチルスターチ（ニプロファーマ「ＨＥＳ４０（赤血球沈降剤）」を１２ｍＬ添加して、１０分間混和した。そして、３０分間静置して赤血球を沈降させた後、体液貯留バッグ１４の下方に沈降した赤血球に偏った層を赤血球廃棄管１を通じで体液貯留バッグ１４の外に排出した。この時、下層の赤血球に偏った層と上層の有核細胞と血小板に偏った層との界面を乱さないように注意し、かつ上層を排出しないようにゆっくりと排出した。なお、この時濃縮システムにおいて事前にクランプ２１ 、２３を閉じてある。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、９．０×１０９個であった。
（３） 細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。この時、有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に流れ、濾過された細胞浮遊液はドレインバッグ１２ に貯留した。体液貯留バッグ１４の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１ に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間の容器内は空気で満たされ、細胞捕捉器１１の出口側空間の容器内にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１ 、２２を閉じた。続いてシリンジに空気３８ｍＬを充填し、クランプ２３ を開けて注入口３３ から手動で空気３８ｍＬを押出し、細胞捕捉器１１内の出口側空間に残留している濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は５．４ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．７７容）であった。
（４）分析
本細胞濃縮操作により得られた細胞濃縮液の赤血球除去率、単核細胞回収率、単核細胞濃縮倍率、単核細胞含有率、血小板濃縮倍率、をそれぞれ以下の計算式にて算出した。
また、赤血球数、単核細胞数、単核細胞濃度、全細胞数、血小板濃度のカウントは多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した。
・赤血球除去率（％）＝｛（ＣＰＤ加血液中の赤血球数−細胞濃縮液中の赤血球数）／ＣＰＤ加血液中の赤血球数｝×１００
・単核細胞回収率（％）＝（細胞濃縮液中の単核細胞数／ＣＰＤ加血液中の単核細胞数）×１００
・単核細胞濃縮倍率＝（細胞濃縮液中の単核細胞濃度／ＣＰＤ加血液中の単核細胞濃度）
・単核細胞含有率（％）＝（細胞濃縮液中の単核細胞数／細胞濃縮液中の全細胞数）×１００
・血小板濃縮倍率＝（細胞濃縮液中の血小板濃度／ＣＰＤ加血液中の血小板濃度）
（５）結果
本細胞濃縮操作により、細胞濃縮液の赤血球数は７．８×１０８個、赤血球除去率は９９．４％、単核細胞回収率は７４．６％、単核細胞濃度は６．９×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は８．１倍、単核細胞含有率は５０．２％、血小板濃縮倍率は２．９倍であった。
【００４３】
[実施例２]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同様のものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同様の操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．４×１０１１個、８．９×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層（細胞浮遊液）が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。この時、有核細胞と血小板に偏った層は細胞捕捉器１１に流れ、濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器１１の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１を閉じてクランプ２３を開けてエアベントフィルター４１にシリンジを用いて空気３．５ｍＬを導入して細胞捕捉器１１内の出口側空間に残留している濾液を押出し、ドレインバッグ１２へ貯留した。この時、細胞捕捉器１１内の出口側空間や注入管６には、少量の濾液が残存していた。以後の操作は実施例１と全く同じ操作を行った。この時に回収された細胞濃縮液量は１．８ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．２６容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．０×１０９個、赤血球除去率は９９．３％、単核細胞回収率は６５．１％、単核細胞濃度は１．９×１０７個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は２１．７倍、単核細胞含有率は４９．８％、血小板濃縮倍率は５．５倍であった。
【００４４】
[実施例３]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同じ操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、１．０×１０１０個であった。
（３）細胞濃縮操作
実施例１と同様に、有核細胞と血小板に偏った層を落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過が終了した後、クランプ２１ 、２２を閉じた。次に、ドレインバッグ１２に流入したフィルター材を通過した濾液１．０ｍＬを、濾液採取ポート８にシリンジを接続して採取し、さらに空気を３７ｍＬ充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の濾液と空気を押出し、細胞捕捉器１１内のフィルター材を通過した濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は６．７ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．９６容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は７．１×１０８個、赤血球除去率は９９．５％、単核細胞回収率は７２．５％、単核細胞濃度は５．４×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は６．３倍、単核細胞含有率は４９．４％、血小板濃縮倍率は２．３倍であった。
【００４５】
[実施例４]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同様の操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、９．０×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１を閉じてエアベントフィルター４１にシリンジを用いて空気３０ｍＬを導入して細胞捕捉器１１内に残留している濾液を完全に押出し、ドレインバッグ１２へ貯留した。続いて、ドレインバッグ１２に貯留された濾液６．０ｍＬを、濾液液採取ポート８にシリンジを接続して採取し、さらに空気を３２ｍＬ充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の濾液と空気を押出し、濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は６．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．８７容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は８．１×１０８個、赤血球除去率は９９．４％、単核細胞回収率は６８．５％、単核細胞濃度は５．６×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は６．５倍、単核細胞含有率は４９．１％、血小板濃縮倍率は２．４倍であった。
【００４６】
[実施例５]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４に、５％デキストラン（和光純薬「Ｄｅｘｔｒａｎ２００，０００」）を溶解した生理食塩液３０ｍＬを添加して、１０分間混和した。そして、３０分間静置して赤血球を沈降させた後、体液貯留バッグ１４の下方に沈降した赤血球に偏った層を赤血球廃棄管１を通じで体液貯留バッグ１４の外に排出した。この時、下層の赤血球に偏った層と上層の有核細胞と血小板に偏った層との界面を乱さないように注意し、かつ上層を排出しないようにゆっくりと排出した。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、９．１×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
実施例１と同様の操作を行った。この時に回収された細胞濃縮液量は５．０ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．７１容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は７．３×１０８個、赤血球除去率は９９．４％、単核細胞回収率は７１．３％、単核細胞濃度は７．１×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は８．３倍、単核細胞含有率は５１．２％、血小板濃縮倍率は２．７倍であった。
【００４７】
[比較例１]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同様のものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
赤血球排出操作は行わず、ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４をそのまま用いた。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、１．３×１０１１個であった。
（３）細胞濃縮操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留されたＣＰＤ加ヒト末梢血液を落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全てのＣＰＤ加ヒト末梢血液が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間には濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１、２２を閉じた。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体２３ｍＬと空気１５ｍＬをシリンジに充填し、クランプ２３ を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の液体と空気を押出し、フィルターに捕捉された細胞を回収バッグ１３ に回収して細胞濃縮液を得た。この時回収された細胞濃縮液量は２５．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の３．５９容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．６×１０１０個、赤血球除去率は８７．７％、単核細胞回収率は７７．９％、単核細胞濃度は１．３×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は１．８倍、単核細胞含有率は３９．０％、血小板濃縮倍率は０．５倍であり、赤血球の混入が多く単核細胞の濃度や血小板濃縮倍率も低かった。
【００４８】
[比較例２]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同じ操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．３×１０１１個、６．３×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
濾過終了後にエアベントフィルター４１にシリンジを用いて空気４．５ｍＬを導入して細胞捕捉器内に残留している濾液を押出し、ドレインバッグ１２へ貯留した以外は、実施例２と同様の操作を行った。この時の回収された細胞濃縮液量は１．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．１６容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．６×１０９個、赤血球除去率は９８．８％、単核細胞回収率は４４．１％、単核細胞濃度は２．１×１０７個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は２４．５倍、単核細胞含有率は４８．１％、血小板濃縮倍率は５．３倍であり、単核細胞の回収率が低く、細胞のロスが多かった。
【００４９】
[比較例３]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同じ操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．２×１０１１個、５．７×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
回収時に、ドレインバッグ１２に流入しフィルター材を通過した濾液５．５ｍＬを、濾液採取ポート８にシリンジを接続して採取し、さらに空気を３２．５ｍＬ充填し、クランプ２３を開けて注入口３３ から手動でシリンジ中の濾液と空気を押出す以外は実施例３と同じ操作を行った。この時の回収された細胞濃縮液量は１２．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の１．７３容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．９×１０９個、赤血球除去率は９８．４％、単核細胞回収率は７５．０％、単核細胞濃度は３．１×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は３．６倍、単核細胞含有率は３９．５％、血小板濃縮倍率は１．４倍であり、単核細胞濃度や濃縮倍率が低く、また単核細胞含有率も低値であり効率的な単核細胞の濃縮ができなかった。
【００５０】
[比較例４]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
赤血球排出操作は行わず、ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４をそのまま用いた。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、１．６×１０１１個であった。
（３）細胞濃縮操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留されたＣＰＤ加ヒト末梢血液を落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全てのＣＰＤ加ヒト末梢血液が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、クランプ２１、２２を閉じた。続いてシリンジに空気３８ｍＬを充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の空気を押出し、細胞捕捉器内のフィルター材を通過した濾液でフィルターに捕捉された細胞を回収し、回収バッグ１３ に細胞濃縮液を回収した。この時の回収された細胞濃縮液量は３．１ｍＬ（細胞捕捉器１１の０．４４容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は９．１×１０９個、赤血球除去率は９４．２％、単核細胞回収率は５０．６％、単核細胞濃度は７．１×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は９．６倍、単核細胞含有率は４７．４％、血小板濃縮倍率は２．４倍であり、赤血球の混入が多くまた単核細胞の回収率も低値であった。
【００５１】
[比較例５]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
赤血球層排出操作は行わず、ＣＰＤ加ヒト末梢血液５８ｍＬが貯留された体液貯留バッグ１４に６％ヒドロキシエチルスターチ（ニプロファーマ「ＨＥＳ４０（赤血球沈降剤）」）を１２ｍＬ添加して、１０分間混和した。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、１．７×１０１１個であった。
（３）細胞濃縮操作
ＣＰＤ加ヒト末梢血液と６％ヒドロキシエチルスターチが貯留された体液貯留バッグ１４を１０分間混和した後に細胞導入管４と接続した状態で３０分間静置して赤血球を沈降させた。次に、クランプ２１を開き、体液貯留バッグ１４の下層の赤血球に偏った層を細胞捕捉器１１に導入し、続いて上層の有核細胞と血小板に偏った層を同様に細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての赤血球に偏った層と有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体２３ｍＬと空気１５ｍＬをシリンジに充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の液体と空気を押出し、フィルターに捕捉された細胞を回収バッグ１３に回収して細胞濃縮液を得た。この時回収された細胞濃縮液量は２５．８ｍＬ（細胞捕捉器１１の３．６９容）であった。
（３）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（４）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は１．２×１０１０個、赤血球除去率は９２．８％、単核細胞回収率は６５．１％、単核細胞濃度は１．３×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は１．５倍、単核細胞含有率は４０．２％、血小板濃縮倍率は０．５倍であり、赤血球の混入が多くかつ単核細胞濃度も低値であった。
【００５２】
[比較例６]
（１）細胞捕捉器の作製
実施例１と同じものを使用した。
（２）赤血球層排出操作
実施例１と同様の操作を行った。この時のＣＰＤ加ヒト末梢血液中の赤血球数と上層の有核細胞と血小板に偏った層の赤血球数を多項目自動血球分析装置（シスメックス社ＳＦ３０００）を用いて測定した結果、それぞれ１．４×１０１１個、８．９×１０９個であった。
（３）細胞濃縮操作
赤血球に偏った層を排出した後の有核細胞と血小板に偏った層が貯留された体液貯留バッグ１４と細胞導入管４を接続し、クランプ２１を開けて体液貯留バッグ１４に貯留された上層の有核細胞と血小板に偏った層４４ｍＬを落差により細胞捕捉器１１に導入して濾過を開始した。濾液はドレインバッグ１２に貯留した。体液貯留バッグ１４内の全ての有核細胞と血小板に偏った層が細胞捕捉器１１ に導入され、細胞捕捉器１１の入口側空間は空気で満たされ、細胞捕捉器１１の出口側空間にはフィルター材を通過した濾液が残留している状態で濾過が終了した。次に、１０％デキストラン生理食塩水溶液（小林製薬「デキストラン４０注」）にヒト血清アルブミンを最終濃度３％になるように添加した液体２３ｍＬと空気１５ｍＬをシリンジに充填し、クランプ２３を開けて注入口３３から手動でシリンジ中の液体と空気を押出し、フィルターに捕捉された細胞を回収バッグ１３ に回収して細胞濃縮液を得た。この時回収された細胞濃縮液量は２５．８ｍＬ（細胞捕捉器１１の３．６９容）であった。
（４）分析
実施例１と同様の計算式にて算出した。
（５）結果
この時の細胞濃縮液の赤血球数は２．６×１０９個、赤血球除去率は９８．１％、単核細胞回収率は７２．５％、単核細胞濃度は１．４×１０６個／ｍＬ、単核細胞濃縮倍率は１．６倍、単核細胞含有率は４０．１％、血小板濃縮倍率は０．６倍であり、赤血球の混入もあり単核細胞濃度も低く単核細胞含有率も低値であり効率的に単核細胞を濃縮できなかった。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明による単核細胞と血小板の濃縮方法は、簡便に高濃度の単核細胞と血小板の混合溶液が調製可能であり、かつ完全自己成分のみで構成されるため感染等のリスクもないので、再生医療や細胞治療において有用である。本発明による濃縮方法は効率的なので、体液量が少量の場合、特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の赤血球沈降剤を添加し、有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離するためのシステムの一例を示す模式図である。
【図２】本発明の単核細胞と血小板の濃縮を行うための濃縮システムの一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５７】
１・・・赤血球廃棄管
２・・・細胞導入管接続部
３・・・注入部
４・・・細胞導入管
５・・・濾液回収管
６・・・注入管
７・・・細胞回収管
８・・・濾液採取ポート
１１・・・細胞捕捉器
１２・・・ドレインバッグ
１３・・・回収バッグ
１４・・・体液貯留バッグ
２１、２２、２３・・・クランプ
３１、３２・・・Ｔ字管
３３・・・注入口
４１・・・エアベントフィルター
１００・・・濃縮システム
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口と出口を有する容器に細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器と、回路と、バッグとを有するフィルターシステムを用いて、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法であって、
バッグに貯留された前記体液に赤血球沈降剤を添加し、
有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離して、
前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入して有核細胞と血小板を前記フィルター材に捕捉させた後に、
前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液のみを、気体で押し出して前記フィルター材に導入して、
前記フィルター材に捕捉されている単核細胞と血小板を選択的に回収することを特徴とする赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項２】
前記気体が、空気であることを特徴とする請求項１に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項３】
前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液が、前記細胞捕捉器と回路に残存した濾液であることを特徴とする請求項１または２に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項４】
前記赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項５】
前記有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離した後に、前記赤血球に偏った層をバッグから排出して、前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項６】
前記赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液が、末梢血、臍帯血、骨髄液からなる群より選択される一の体液であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項１】
入口と出口を有する容器に細胞捕捉フィルター材を充填した細胞捕捉器と、回路と、バッグとを有するフィルターシステムを用いて、赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法であって、
バッグに貯留された前記体液に赤血球沈降剤を添加し、
有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離して、
前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入して有核細胞と血小板を前記フィルター材に捕捉させた後に、
前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液のみを、気体で押し出して前記フィルター材に導入して、
前記フィルター材に捕捉されている単核細胞と血小板を選択的に回収することを特徴とする赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項２】
前記気体が、空気であることを特徴とする請求項１に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項３】
前記細胞捕捉器の０．２容以上１．０容未満の、前記フィルター材を通過した濾液が、前記細胞捕捉器と回路に残存した濾液であることを特徴とする請求項１または２に記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項４】
前記赤血球沈降剤が、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランのいずれかであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項５】
前記有核細胞と血小板に偏った層と赤血球に偏った層とに分離した後に、前記赤血球に偏った層をバッグから排出して、前記有核細胞と血小板に偏った層のみを前記細胞捕捉器に導入することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【請求項６】
前記赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液が、末梢血、臍帯血、骨髄液からなる群より選択される一の体液であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の赤血球と有核細胞と血小板を含んでなる体液から単核細胞と血小板を濃縮する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２８４８６０（Ｐ２００９−２８４８６０Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４２８０３（Ｐ２００８−１４２８０３）
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【出願人】（０００１１６８０６）旭化成クラレメディカル株式会社 (133)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【出願人】（０００１１６８０６）旭化成クラレメディカル株式会社 (133)
【Ｆターム（参考）】
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