反応性物質が結合した微小粒子の安定化方法および該微小粒子含有試薬
【課題】反応性物質結合微小粒子の分散液中で該微小粒子を安定化することにより、分散液中の反応性物質結合微小粒子の反応性を長期間維持する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、反応性を有する物質が結合した微小粒子の安定化方法を提供し、該方法は、該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む。含硫アミノ酸としては、システイン、シスチン、およびメチオニンが好ましい。本発明の方法は、特に、分散液中に、ポリアニオン、デキストランなどの沈降抑制物質を共存させる場合に有用である。
【解決手段】本発明は、反応性を有する物質が結合した微小粒子の安定化方法を提供し、該方法は、該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む。含硫アミノ酸としては、システイン、シスチン、およびメチオニンが好ましい。本発明の方法は、特に、分散液中に、ポリアニオン、デキストランなどの沈降抑制物質を共存させる場合に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体または抗原などの反応性を有する物質が結合した微小粒子（以下、反応性物質結合微小粒子という）の安定化方法および該反応性物質結合微小粒子を用いた免疫測定用試薬に関する。特に、主として臨床検査の分野で、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定に用いられる反応性物質結合微小粒子の安定化方法および該反応性物質結合微小粒子を用いた免疫測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査などの各種検査においては、自動化および測定時間の短縮化が図られている。例えば、免疫反応を利用して、生体試料中の微量物質を測定する方法が広く用いられている。この免疫測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などが挙げられる。その中でも、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法などの反応性を有する物質が結合した微小粒子（反応性物質結合微小粒子）を用いる方法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないため、特に測定の自動化や短時間化に適している。
【０００３】
しかし、これらのラテックス凝集法および金コロイド凝集法は、反応性物質結合微小粒子が分散液中で不安定であり、沈降や自己凝集などにより反応性を長期間維持することができないことから、測定精度を減ずることなく試薬を長期間保存することが困難という問題がある。
【０００４】
特許文献１には、反応性物質結合微小粒子の分散液中に、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種を共存させる工程を含む、反応性物質結合微小粒子の沈降抑制方法が記載されている。これは、試薬溶液中の反応性物質結合微小粒子が沈降するのを抑制することにより、反応性物質結合微小粒子を安定化させようとするものである。しかし、反応性物質結合微小粒子を含む試薬を長期間保存した場合、反応性物質結合微小粒子は自己凝集を生じ、反応性が低下するという問題がある。
【０００５】
特許文献２には、金属イオンおよびキレート物質を安定化剤として添加する方法が記載され、特許文献３には、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸、またはそれらの塩を添加する方法が記載されている。しかし、自己凝集、反応性の低下などの問題が依然として残っている。
【０００６】
ところで、特許文献４には、チオール基およびアミノ基を有する化合物の共存下で塩化金酸を還元することを特徴とするカチオン性表面をもつ金ナノ粒子の作製法が記載されている（請求項１）。特許文献５には、混合単層膜をコーティングした金属質ナノ粒子であるチオプロニン単層膜保護金ナノ粒子の合成法が記載されている（実施例３）。特許文献６には、金粒子に対し、少なくとも１個のシステインを含むペプチドを、前記システイン中の硫黄原子を介して結合させることを特徴とする免疫反応性凝集剤が記載されている（請求項１）。しかし、これらはいずれも、単に反応性の向上などを目的として金粒子表面上に物質を結合した金粒子の調製方法を示したものであり、金粒子の安定化方法については開示していない。
【特許文献１】特開２００７−１１４１２９号公報
【特許文献２】特開２０００−１４６９６７号公報
【特許文献３】特開平１１−１０１７９９号公報
【特許文献４】特開２００５−２８７５０７号公報
【特許文献５】特表２００５−５３４８１０号公報
【特許文献６】特開２００６−３１７４０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存を図るために、反応性物質結合微小粒子を分散液中で安定化し、反応性を長期間維持する技術が望まれている。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、反応性物質結合微小粒子の分散液中で該微小粒子を安定化する方法を提供することである。本発明の目的はまた、反応性が長期間維持された反応性物質結合微小粒子を含む、測定精度を減ずることなく長期間保存できる試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討した結果、反応性物質結合微小粒子の分散液中において、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させることにより、反応性物質結合微小粒子を安定化し、かつ反応性物質結合微小粒子の反応性を長期間維持できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、反応性を有する物質が結合した微小粒子の安定化方法を提供し、該方法は、該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む。
【００１１】
１つの実施態様においては、上記含硫アミノ酸は、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１２】
他の実施態様においては、上記分散液中に、上記含硫アミノ酸またはその誘導体は０．００１〜２．０質量％の割合で含有される。
【００１３】
別の実施態様においては、上記分散液中に、沈降抑制物質をさらに共存させる工程を含む。
【００１４】
別の実施態様においては、上記沈降抑制物質は、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１５】
別の実施態様においては、上記ポリアニオンは、デキストラン硫酸またはヘパリンである。
【００１６】
別の実施態様においては、上記反応性を有する物質が結合した微小粒子は、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である。
【００１７】
本発明の試薬は、反応性を有する物質が結合した微小粒子と、含硫アミノ酸またはその誘導体とを含み、そのため該微小粒子が安定化されている。
【００１８】
１つの実施態様においては、上記含硫アミノ酸は、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１９】
他の実施態様においては、上記試薬中に、上記含硫アミノ酸またはその誘導体は０．００１〜２．０質量％の割合で含有される。
【００２０】
別の実施態様においては、上記試薬は、沈降抑制物質をさらに含む。
【００２１】
別の実施態様においては、上記沈降抑制物質は、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００２２】
別の実施態様においては、上記ポリアニオンは、デキストラン硫酸またはヘパリンである。
【００２３】
別の実施態様においては、上記反応性を有する物質が結合した微小粒子は、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である。
【００２４】
本発明はまた、上記試薬を含む試薬キットを提供する。
【００２５】
本発明はさらに、上記試薬と試料とを混合する工程を含む自動化免疫測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、臨床検査などの分野で抗原抗体反応を利用した免疫学的測定に用いられる反応性物質結合微小粒子の分散液中で該微小粒子を安定化することができる。本発明によれば、反応性が長期間維持された反応性物質結合微小粒子を含む試薬を提供することができる。本発明の試薬を使用することで、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１．反応性物質結合微小粒子の安定化方法
本明細書において、反応性物質結合微小粒子の安定化とは、反応性物質結合微小粒子の反応性が経時的に実質上変化しないこと、すなわち長期間維持されることをいう。反応性物質結合微小粒子を安定化することにより、該微小粒子を含む、測定精度を減ずることなく長期間保存できる試薬を提供することができる。
【００２８】
本発明の反応性物質結合微小粒子の安定化方法は、該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む。
【００２９】
本発明の方法に用いられる反応性物質結合微小粒子は、免疫測定試薬として使用され得る微小粒子であり、好ましくはラテックス粒子および金属コロイド粒子である。金属コロイド粒子としては、金、銀、セレンなどのコロイド粒子があるが、金コロイド粒子が一般的に利用され易く、好ましく用いられる。金コロイド粒子は、市販品を用いてもよく、当業者が通常用いる方法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法により調製してもよい。金コロイド粒子の粒径は、通常５ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【００３０】
上記微小粒子に結合させる物質については、測定対象物質に特異的に結合するものであれば利用可能である。例えば、抗体、還元ＩｇＧ、抗体のＦ（ａｂ’）２断片またはＦａｂ’断片、抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。
【００３１】
本発明の方法においては、含硫アミノ酸またはその誘導体が用いられる。本明細書においては、これらの化合物を安定化物質という。安定化物質は、単独で用いてもよく、２以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
本明細書において、含硫アミノ酸とは、天然の含硫アミノ酸、および天然のアミノ酸であって硫黄原子が導入されたものをいう。また、誘導体とは、有機化学で一般的に用いられる概念を意味し、置換体、付加体などをいう。
【００３３】
上記安定化物質である含硫アミノ酸のうち、天然の含硫アミノ酸としては、例えば、システイン、シスチン、およびメチオニンが挙げられ、含硫アミノ酸の誘導体としては、例えば、メチオニノール、メチニナール、メチオニンアミド、２−アルキルシステイン、Ｓ−メチルシステイン、システイノール、システイナール、およびシステインアミドが挙げられる。システイン、シスチン、およびメチオニンは市販されており、本発明においては、これらを利用するのが好ましい。特に好ましいのは、メチオニンである。
【００３４】
本発明の方法は、上記反応性物質結合微小粒子の分散液中に、上記安定化物質を共存させる。共存させる手段は、特に制限されない。例えば、反応性物質結合微小粒子の分散液に安定化物質を加えてもよく、安定化物質または安定化物質を分散媒で希釈した希釈液に、反応性物質結合微小粒子を加えてもよく、あるいは反応性物質結合微小粒子と安定化物質とを混合し、この混合物を分散媒に加えてもよい。なお、分散媒は、特に制限されないが、例えば、水、あるいは後述する緩衝剤を用いた緩衝液などが用いられる。
【００３５】
本発明の方法において、分散液中の反応性物質結合微小粒子の濃度は、当該分野で通常採用される濃度であり得る。
【００３６】
本発明の方法において、分散液中に共存される安定化物質の濃度は、安定化物質の種類に応じて適宜設定される。例えば、含硫アミノ酸の場合、好ましくは０．００１〜２．０質量％、より好ましくは０．００５〜１．０質量％、さらに好ましくは０．０２〜０．５質量％である。
【００３７】
本発明の方法において、分散液中には、さらに沈降抑制物質が適宜添加されてもよい。本明細書において、沈降抑制物質とは、反応性物質結合微小粒子の分散液中に共存させることによって、該微小粒子の沈降を抑制する物質をいう。
【００３８】
上記沈降抑制物質としては、例えば、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、またはグリセロールが挙げられる。沈降抑制物質は、単独で用いてもよく、２以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
上記沈降抑制物質の１種であるポリアニオンとしては、例えば、デキストラン硫酸、へパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸が挙げられる。ポリアニオンの塩としては、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウムなどが挙げられる。ポリアニオンまたはその塩の中でも、沈降抑制効果が高い観点から、硫酸基を有する水溶性高分子化合物が好適に用いられる。このような化合物は、例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、デキストラン硫酸ナトリウム、およびヘパリンナトリウムである。
【００４０】
本発明の方法において、分散液中に共存される沈降抑制物質の濃度は、沈降抑制物質の種類に応じて適宜設定される。例えば、ポリアニオンまたはその塩の場合、好ましくは０．３〜５．０質量％、より好ましくは０．５〜２．０質量％、さらに好ましくは０．７〜１．１質量％である。デキストランまたはシクロデキストリンの場合、好ましくは０．１〜５．０質量％、より好ましくは０．２〜１．８質量％、さらに好ましくは０．５〜１．５質量％である。ポリエチレングリコールの場合、好ましくは０．３〜５．０質量％、より好ましくは０．５〜３．０質量％である。グリセロールの場合、好ましくは５〜４０質量％、より好ましくは１０〜３５質量％である。
【００４１】
本発明の方法において、分散液中には、さらに他の安定化物質として、金属イオンおよびキレート剤（特許文献２）、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸、およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種（特許文献３）が適宜添加されてもよい。
【００４２】
本発明の方法において、分散液中には、さらに従来用いられている緩衝剤、糖および糖アルコール、アルブミン、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、防腐剤、およびその他の物質が適宜含まれる。
【００４３】
本発明の方法によれば、反応性物質結合微小粒子の分散液中に、安定化物質を共存させることによって、反応性物質結合微小粒子を安定化することができる。したがって、この方法を用いることによって、分散液中で該微小粒子の反応性を長期間維持することが可能となる。特に、分散液中に、ポリアニオン、デキストランなどの沈降抑制物質を共存させる場合に有用である。
【００４４】
２．反応性物質結合微小粒子と安定化物質とを含む試薬
本発明の試薬は、上記反応性物質結合微小粒子と、上記安定化物質とを含み、必要に応じて、上記沈降抑制物質、他の安定化物質、緩衝剤、糖、糖アルコール、アルブミン、塩化ナトリウム、防腐剤、およびその他の添加剤を含む。
【００４５】
本発明の試薬は、反応性物質結合微小粒子が安定化されているため、該微小粒子の反応性が長期間維持される。本発明の試薬の保存温度としては、好ましくは２５℃以下、より好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは８℃以下である。本発明の試薬の他の保存条件としては、好ましくは暗所かつ低湿度下である。
【００４６】
本発明の試薬は、通常、液状であり、反応性物質結合微小粒子を用いた試薬、特に当該分野で通常用いられる免疫測定用試薬として用いられる。
【００４７】
本発明の試薬中の反応性物質結合微小粒子の濃度、および安定化物質の濃度は、特に制限されない。反応性物質結合微小粒子の安定化を高める観点から、上記方法で採用される濃度の範囲内であることが好ましい。
【００４８】
本発明の試薬に含有され得る緩衝剤としては、リン酸緩衝液；トリス塩酸緩衝液；コハク酸緩衝液；グリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）などのグッド緩衝液などが挙げられる。上記緩衝剤は、試薬中のｐＨが５〜９、あるいは濃度が１〜１００ｍＭとなるように含有されることが好ましい。
【００４９】
本発明の試薬に含有され得る糖および糖アルコールとしては、グルコース、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。上記糖または糖アルコールは、試薬中の濃度が０．０１〜１０．０質量％であることが好ましい。
【００５０】
本発明の試薬に含有され得るアルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられる。アルブミンは、試薬中の濃度が０．００１〜１．０質量％であることが好ましい。
【００５１】
本発明の試薬に含有され得る防腐剤としては、アジ化ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤は、試薬中の濃度が０.０１〜０．５質量％であることが好ましい。
【００５２】
本発明の試薬に含有され得るその他の添加剤としては、ツィーン２０、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、５−ブロモサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモールなどが挙げられる。
【００５３】
本発明の試薬は、上記のように、反応性物質結合微小粒子が安定化されているため、該微小粒子の反応性が長期間維持される。したがって、この試薬を用いて免疫測定を行う場合には、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存が可能となる。
【００５４】
３．試薬キット
本発明の試薬キットは、上記反応性物質結合微小粒子と安定化物質とを含む試薬（本発明の試薬）を含む。この試薬キットは、例えば、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法などを用いた免疫測定、特に自動化免疫測定に用いられる。
【００５５】
本発明の試薬キットが免疫測定用試薬キットとして用いられる場合、そのキットは、通常、試料の希釈、試料の免疫反応前の前処理、および免疫反応を補助する成分などを含有する第一試薬、本発明の試薬でなる第二試薬、および必要に応じて、検量線作成用の測定対象物質の標準品から構成され得る。
【００５６】
本発明の試薬キットは、本発明の試薬中の微小粒子に結合された反応性物質に応じて、試料中の種々の物質を測定対象とすることができる。測定対象となり得る物質（測定対象物質）としては、例えば、アルブミン、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ミオグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン、シスタチンＣ、フェリチン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、ペプシノーゲンＩおよびＩＩ、コラーゲンなどの蛋白質；高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質などの脂質蛋白質；デオキシリボ核酸、リボ核酸などの核酸；アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素、リパーゼ、アミラーゼなどの酵素；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、およびこれらに対する抗体などの感染症に関する抗原や抗体；ハロペリドール、ブロムペリドールなどの薬物；性ホルモンなどのホルモンなどが挙げられる。
【００５７】
測定に供する測定対象物質を含む試料としては、血液、血漿、血清、尿、糞便（懸濁液）、髄液、腹水などの生体試料、環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。
【００５８】
４．自動化免疫測定方法
本発明の自動化免疫測定方法は、本発明の試薬を用いて行われる。この自動化免疫測定方法は、試薬中において、反応性物質結合微小粒子が安定化され、反応性が長期間維持されるため、長期間保存された試薬を用いても精度の高い測定値を得ることができる。
【００５９】
本発明の自動化免疫測定方法は、具体的には、試料、第一試薬、および本発明の試薬（第二試薬）を自動分析装置にセットし、試料に、第一試薬および第二試薬を順次自動的に混合することによって行われる。第一試薬と第二試薬との割合は、適宜設定される。好ましくは本発明の試薬（第二試薬）は、２〜９倍、より好ましくは３〜５倍に希釈される。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。以下の実施例において、特に記載がない限り、％はいずれも質量／容量％（Ｗ／Ｖ％）を表す。
【００６１】
調製例１：金コロイド液の調製
９５℃の蒸留水１Ｌに１０％塩化金酸水溶液２ｍＬを攪拌しながら加え、１分後に２％クエン酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間攪拌した後、３０℃に冷却した。冷却後、０．１％炭酸カリウム水溶液でｐＨ７．１に調節した。
【００６２】
調製例２：抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬の調製
抗シスタチンＣ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この抗シスタチンＣ抗体溶液１００ｍＬを、調製例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間攪拌した。さらに、５．４６％マンニトール、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分間攪拌した。次いで、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した後、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた。さらに、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去し、１．５％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＡ溶液で抗体結合金コロイドを分散させ、全量を２４０ｍＬとし、抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬を得た。
【００６３】
調製例３：抗シスタチンＣ還元ＩｇＧの調製
抗シスタチンＣ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、および１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）（Ｂ溶液）で透析後、１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＢ溶液で希釈した。この抗体溶液に２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を濃度６ｍｇ／ｍＬになるように添加し、溶解後、３７℃で９０分間加温した。ゲル濾過カラムにて、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を除き、抗シスタチンＣ還元ＩｇＧを得た。
【００６４】
調製例４：抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬の調製
調製例３で調製した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧを、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ溶液１００ｍＬを、調製例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間撹拌した。さらに、５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分間撹拌した。次いで、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した後、Ａ溶液を約１Ｌ加え、還元ＩｇＧ結合金コロイドを分散させた。さらに、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去し、１．５％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＡ溶液で抗体感作金コロイドを分散させ、全量を２４０ｍＬとし、抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａを得た。１．２５％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＡ溶液で抗体感作金コロイドを分散させ、全量を２４０ｍＬとし、抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ｂを得た。
【００６５】
調製例５：シスタチンＣ測定用第一試薬の調製
５％塩化ナトリウム、０．２％ＥＤＴＡ、０．２％アルキルフェニルジスルホン酸ナトリウム塩、および０．３５％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．５Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．７）緩衝液に、反応促進剤としてポリエチレングリコールを１．０〜２．５％程度添加してシスタチンＣ測定用第一試薬とした。
【００６６】
実施例１：メチオニンの添加効果の検討
調製例２で調製した抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬にメチオニンを０．００５％、０．０２％、０．０５％、０．１％、または０．５％の濃度になるように添加してシスタチンＣ測定用第二試薬とした。シスタチンＣ濃度が８ｍｇ／Ｌの試料の測定において、第二試薬の反応性についての保存による経時変化を検討した。対照としてメチオニン無添加の抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬をシスタチンＣ測定用第二試薬とした。第二試薬を２５℃で保存し、開始時、４日後、８日後、２０日後、および３９日後に、調製例５で調製した第一試薬を用いて、以下に示す方法で検討した。
【００６７】
（検討方法）
３μＬの試料に、第一試薬を２００μＬ分注し、３７℃で約５分間加温し、次いで、第二試薬を１００μＬ分注し、３７℃で反応させ、日立７０７０自動分析装置により、主波長５０５ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から２４の吸光度変化量を測定した。保存開始時の吸光度変化量に対する各保存期間経過後の吸光度変化量の割合を第二試薬の反応性（％）とした。結果を表１および図１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
表１および図１の結果から明らかなように、保存２０日後の第二試薬の反応性は、メチオニン無添加の場合、約２０％の低下が認められた。しかし、メチオニンを０．５％含有する場合は、約５％の低下にとどまった。保存３９日後においても、メチオニン無添加の場合は、３０％以上の低下が認められたが、メチオニンを０．５％含有する場合は、約７％の低下にとどまった。保存３９日後においては、メチオニンを０．００５％含有する場合でも、メチオニン無添加の場合と比較して、約７％高いことから、メチオニンの添加による安定化効果が認められた。このことから、メチオニンを抗体結合金コロイド粒子の分散液中に共存させることによって、該粒子を安定化できることがわかった。
【００７０】
実施例２：メチオニンおよびシステインの添加効果の検討
調製例４で調製した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａにメチオニンを０．０３％、０．０６％、または０．１２％の濃度に、あるいはシステインを０．０３％の濃度になるように、それぞれ添加してシスタチンＣ測定用第二試薬とした。シスタチンＣ濃度が８ｍｇ／Ｌの試料の測定において、第二試薬の反応性についての保存による経時変化を検討した。対照として６’，６’−ジチオジニコチン酸またはＮ−アセチルチオ尿素を０．０３％の濃度になるように添加した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａおよび無添加の抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬ＡをシスタチンＣ測定用第二試薬とした。第二試薬を冷蔵保存し、開始時、２週後、５週後、９週後、および１３週後に、調製例５で調製した第一試薬を用いて、実施例１と同様の方法で測定した。結果を表２および図２に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
表２および図２の結果から明らかなように、保存１３週後の第二試薬の反応性は、無添加の場合、約１５％の低下が認められた。しかし、メチオニンまたはシステインを含有する場合は、ほとんど低下が認められなかった。一方、含硫化合物ではあるがアミノ酸またはその誘導体ではない６’，６’−ジチオジニコチン酸またはＮ−アセチルチオ尿素を含有する場合は、無添加の場合と同等以上の低下が認められた。このことから、メチオニンまたはシステインを還元ＩｇＧ結合金コロイド粒子の分散液中に共存させることによって、該粒子を安定化できることがわかった。
【００７３】
実施例３：アミノ酸の添加効果の検討
調製例４で調製した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ｂにメチオニン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンを０．０２％の濃度になるように、それぞれ添加してシスタチンＣ測定用第二試薬とした。シスタチンＣ濃度が４ｍｇ／Ｌの試料の測定において、第二試薬の反応性についての保存による経時変化を検討した。対照として無添加の抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬ＢをシスタチンＣ測定用第二試薬とした。第二試薬を冷蔵保存し、開始時、２ヵ月後、４ヵ月後、および６ヵ月後に、調製例５で調製した第一試薬を用いて、実施例１と同様の方法で測定した。結果を表３および図３に示す。
【００７４】
【表３】
【００７５】
表３および図３の結果から明らかなように、第二試薬の反応性は、アミノ酸としてグルタミン、グルタミン酸、またはリジンを含有する場合、無添加の場合と同等の低下が認められた。しかし、メチオニンを含有する場合は、６ヵ月後においても、ほとんど低下が認められなかった。また、自己凝集による凝集物の発生もメチオニンを含有する場合には認められなかった。このことから、アミノ酸の中でも含硫アミノ酸であるメチオニンを還元ＩｇＧ結合金コロイド粒子の分散液中に共存させることによって、該粒子を安定化できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、反応性物質結合微小粒子を安定化することができる。したがって、該微小粒子が安定化された試薬の提供が可能となる。この試薬は、該微小粒子の反応性が長期間維持される。そのため、この試薬を用いて免疫測定を行う場合には、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存が可能となる。この試薬および該試薬を含む試薬キットは、特に自動化免疫装置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】種々の濃度のメチオニンを添加した場合におけるシスタチンＣ測定用第二試薬（抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬）の反応性の経時変化を示すグラフである。
【図２】種々の含硫化合物を添加した場合におけるシスタチンＣ測定用第二試薬（抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａ）の反応性の経時変化を示すグラフである。
【図３】種々のアミノ酸を添加した場合におけるシスタチンＣ測定用第二試薬（抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ｂ）の反応性の経時変化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体または抗原などの反応性を有する物質が結合した微小粒子（以下、反応性物質結合微小粒子という）の安定化方法および該反応性物質結合微小粒子を用いた免疫測定用試薬に関する。特に、主として臨床検査の分野で、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定に用いられる反応性物質結合微小粒子の安定化方法および該反応性物質結合微小粒子を用いた免疫測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査などの各種検査においては、自動化および測定時間の短縮化が図られている。例えば、免疫反応を利用して、生体試料中の微量物質を測定する方法が広く用いられている。この免疫測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、イムノクロマト法などが挙げられる。その中でも、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法などの反応性を有する物質が結合した微小粒子（反応性物質結合微小粒子）を用いる方法は、反応液の分離や洗浄操作を必要としないため、特に測定の自動化や短時間化に適している。
【０００３】
しかし、これらのラテックス凝集法および金コロイド凝集法は、反応性物質結合微小粒子が分散液中で不安定であり、沈降や自己凝集などにより反応性を長期間維持することができないことから、測定精度を減ずることなく試薬を長期間保存することが困難という問題がある。
【０００４】
特許文献１には、反応性物質結合微小粒子の分散液中に、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種を共存させる工程を含む、反応性物質結合微小粒子の沈降抑制方法が記載されている。これは、試薬溶液中の反応性物質結合微小粒子が沈降するのを抑制することにより、反応性物質結合微小粒子を安定化させようとするものである。しかし、反応性物質結合微小粒子を含む試薬を長期間保存した場合、反応性物質結合微小粒子は自己凝集を生じ、反応性が低下するという問題がある。
【０００５】
特許文献２には、金属イオンおよびキレート物質を安定化剤として添加する方法が記載され、特許文献３には、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸、またはそれらの塩を添加する方法が記載されている。しかし、自己凝集、反応性の低下などの問題が依然として残っている。
【０００６】
ところで、特許文献４には、チオール基およびアミノ基を有する化合物の共存下で塩化金酸を還元することを特徴とするカチオン性表面をもつ金ナノ粒子の作製法が記載されている（請求項１）。特許文献５には、混合単層膜をコーティングした金属質ナノ粒子であるチオプロニン単層膜保護金ナノ粒子の合成法が記載されている（実施例３）。特許文献６には、金粒子に対し、少なくとも１個のシステインを含むペプチドを、前記システイン中の硫黄原子を介して結合させることを特徴とする免疫反応性凝集剤が記載されている（請求項１）。しかし、これらはいずれも、単に反応性の向上などを目的として金粒子表面上に物質を結合した金粒子の調製方法を示したものであり、金粒子の安定化方法については開示していない。
【特許文献１】特開２００７−１１４１２９号公報
【特許文献２】特開２０００−１４６９６７号公報
【特許文献３】特開平１１−１０１７９９号公報
【特許文献４】特開２００５−２８７５０７号公報
【特許文献５】特表２００５−５３４８１０号公報
【特許文献６】特開２００６−３１７４０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存を図るために、反応性物質結合微小粒子を分散液中で安定化し、反応性を長期間維持する技術が望まれている。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、反応性物質結合微小粒子の分散液中で該微小粒子を安定化する方法を提供することである。本発明の目的はまた、反応性が長期間維持された反応性物質結合微小粒子を含む、測定精度を減ずることなく長期間保存できる試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討した結果、反応性物質結合微小粒子の分散液中において、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させることにより、反応性物質結合微小粒子を安定化し、かつ反応性物質結合微小粒子の反応性を長期間維持できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、反応性を有する物質が結合した微小粒子の安定化方法を提供し、該方法は、該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む。
【００１１】
１つの実施態様においては、上記含硫アミノ酸は、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１２】
他の実施態様においては、上記分散液中に、上記含硫アミノ酸またはその誘導体は０．００１〜２．０質量％の割合で含有される。
【００１３】
別の実施態様においては、上記分散液中に、沈降抑制物質をさらに共存させる工程を含む。
【００１４】
別の実施態様においては、上記沈降抑制物質は、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１５】
別の実施態様においては、上記ポリアニオンは、デキストラン硫酸またはヘパリンである。
【００１６】
別の実施態様においては、上記反応性を有する物質が結合した微小粒子は、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である。
【００１７】
本発明の試薬は、反応性を有する物質が結合した微小粒子と、含硫アミノ酸またはその誘導体とを含み、そのため該微小粒子が安定化されている。
【００１８】
１つの実施態様においては、上記含硫アミノ酸は、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１９】
他の実施態様においては、上記試薬中に、上記含硫アミノ酸またはその誘導体は０．００１〜２．０質量％の割合で含有される。
【００２０】
別の実施態様においては、上記試薬は、沈降抑制物質をさらに含む。
【００２１】
別の実施態様においては、上記沈降抑制物質は、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００２２】
別の実施態様においては、上記ポリアニオンは、デキストラン硫酸またはヘパリンである。
【００２３】
別の実施態様においては、上記反応性を有する物質が結合した微小粒子は、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である。
【００２４】
本発明はまた、上記試薬を含む試薬キットを提供する。
【００２５】
本発明はさらに、上記試薬と試料とを混合する工程を含む自動化免疫測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、臨床検査などの分野で抗原抗体反応を利用した免疫学的測定に用いられる反応性物質結合微小粒子の分散液中で該微小粒子を安定化することができる。本発明によれば、反応性が長期間維持された反応性物質結合微小粒子を含む試薬を提供することができる。本発明の試薬を使用することで、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１．反応性物質結合微小粒子の安定化方法
本明細書において、反応性物質結合微小粒子の安定化とは、反応性物質結合微小粒子の反応性が経時的に実質上変化しないこと、すなわち長期間維持されることをいう。反応性物質結合微小粒子を安定化することにより、該微小粒子を含む、測定精度を減ずることなく長期間保存できる試薬を提供することができる。
【００２８】
本発明の反応性物質結合微小粒子の安定化方法は、該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む。
【００２９】
本発明の方法に用いられる反応性物質結合微小粒子は、免疫測定試薬として使用され得る微小粒子であり、好ましくはラテックス粒子および金属コロイド粒子である。金属コロイド粒子としては、金、銀、セレンなどのコロイド粒子があるが、金コロイド粒子が一般的に利用され易く、好ましく用いられる。金コロイド粒子は、市販品を用いてもよく、当業者が通常用いる方法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法により調製してもよい。金コロイド粒子の粒径は、通常５ｎｍ〜１００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。
【００３０】
上記微小粒子に結合させる物質については、測定対象物質に特異的に結合するものであれば利用可能である。例えば、抗体、還元ＩｇＧ、抗体のＦ（ａｂ’）２断片またはＦａｂ’断片、抗原、レセプター、レクチン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）などの結合親和性を有する物質が挙げられる。
【００３１】
本発明の方法においては、含硫アミノ酸またはその誘導体が用いられる。本明細書においては、これらの化合物を安定化物質という。安定化物質は、単独で用いてもよく、２以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
本明細書において、含硫アミノ酸とは、天然の含硫アミノ酸、および天然のアミノ酸であって硫黄原子が導入されたものをいう。また、誘導体とは、有機化学で一般的に用いられる概念を意味し、置換体、付加体などをいう。
【００３３】
上記安定化物質である含硫アミノ酸のうち、天然の含硫アミノ酸としては、例えば、システイン、シスチン、およびメチオニンが挙げられ、含硫アミノ酸の誘導体としては、例えば、メチオニノール、メチニナール、メチオニンアミド、２−アルキルシステイン、Ｓ−メチルシステイン、システイノール、システイナール、およびシステインアミドが挙げられる。システイン、シスチン、およびメチオニンは市販されており、本発明においては、これらを利用するのが好ましい。特に好ましいのは、メチオニンである。
【００３４】
本発明の方法は、上記反応性物質結合微小粒子の分散液中に、上記安定化物質を共存させる。共存させる手段は、特に制限されない。例えば、反応性物質結合微小粒子の分散液に安定化物質を加えてもよく、安定化物質または安定化物質を分散媒で希釈した希釈液に、反応性物質結合微小粒子を加えてもよく、あるいは反応性物質結合微小粒子と安定化物質とを混合し、この混合物を分散媒に加えてもよい。なお、分散媒は、特に制限されないが、例えば、水、あるいは後述する緩衝剤を用いた緩衝液などが用いられる。
【００３５】
本発明の方法において、分散液中の反応性物質結合微小粒子の濃度は、当該分野で通常採用される濃度であり得る。
【００３６】
本発明の方法において、分散液中に共存される安定化物質の濃度は、安定化物質の種類に応じて適宜設定される。例えば、含硫アミノ酸の場合、好ましくは０．００１〜２．０質量％、より好ましくは０．００５〜１．０質量％、さらに好ましくは０．０２〜０．５質量％である。
【００３７】
本発明の方法において、分散液中には、さらに沈降抑制物質が適宜添加されてもよい。本明細書において、沈降抑制物質とは、反応性物質結合微小粒子の分散液中に共存させることによって、該微小粒子の沈降を抑制する物質をいう。
【００３８】
上記沈降抑制物質としては、例えば、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、またはグリセロールが挙げられる。沈降抑制物質は、単独で用いてもよく、２以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３９】
上記沈降抑制物質の１種であるポリアニオンとしては、例えば、デキストラン硫酸、へパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、およびコンドロイチン硫酸が挙げられる。ポリアニオンの塩としては、例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウムなどが挙げられる。ポリアニオンまたはその塩の中でも、沈降抑制効果が高い観点から、硫酸基を有する水溶性高分子化合物が好適に用いられる。このような化合物は、例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、デキストラン硫酸ナトリウム、およびヘパリンナトリウムである。
【００４０】
本発明の方法において、分散液中に共存される沈降抑制物質の濃度は、沈降抑制物質の種類に応じて適宜設定される。例えば、ポリアニオンまたはその塩の場合、好ましくは０．３〜５．０質量％、より好ましくは０．５〜２．０質量％、さらに好ましくは０．７〜１．１質量％である。デキストランまたはシクロデキストリンの場合、好ましくは０．１〜５．０質量％、より好ましくは０．２〜１．８質量％、さらに好ましくは０．５〜１．５質量％である。ポリエチレングリコールの場合、好ましくは０．３〜５．０質量％、より好ましくは０．５〜３．０質量％である。グリセロールの場合、好ましくは５〜４０質量％、より好ましくは１０〜３５質量％である。
【００４１】
本発明の方法において、分散液中には、さらに他の安定化物質として、金属イオンおよびキレート剤（特許文献２）、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸、およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種（特許文献３）が適宜添加されてもよい。
【００４２】
本発明の方法において、分散液中には、さらに従来用いられている緩衝剤、糖および糖アルコール、アルブミン、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、防腐剤、およびその他の物質が適宜含まれる。
【００４３】
本発明の方法によれば、反応性物質結合微小粒子の分散液中に、安定化物質を共存させることによって、反応性物質結合微小粒子を安定化することができる。したがって、この方法を用いることによって、分散液中で該微小粒子の反応性を長期間維持することが可能となる。特に、分散液中に、ポリアニオン、デキストランなどの沈降抑制物質を共存させる場合に有用である。
【００４４】
２．反応性物質結合微小粒子と安定化物質とを含む試薬
本発明の試薬は、上記反応性物質結合微小粒子と、上記安定化物質とを含み、必要に応じて、上記沈降抑制物質、他の安定化物質、緩衝剤、糖、糖アルコール、アルブミン、塩化ナトリウム、防腐剤、およびその他の添加剤を含む。
【００４５】
本発明の試薬は、反応性物質結合微小粒子が安定化されているため、該微小粒子の反応性が長期間維持される。本発明の試薬の保存温度としては、好ましくは２５℃以下、より好ましくは１０℃以下、さらに好ましくは８℃以下である。本発明の試薬の他の保存条件としては、好ましくは暗所かつ低湿度下である。
【００４６】
本発明の試薬は、通常、液状であり、反応性物質結合微小粒子を用いた試薬、特に当該分野で通常用いられる免疫測定用試薬として用いられる。
【００４７】
本発明の試薬中の反応性物質結合微小粒子の濃度、および安定化物質の濃度は、特に制限されない。反応性物質結合微小粒子の安定化を高める観点から、上記方法で採用される濃度の範囲内であることが好ましい。
【００４８】
本発明の試薬に含有され得る緩衝剤としては、リン酸緩衝液；トリス塩酸緩衝液；コハク酸緩衝液；グリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン）などのグッド緩衝液などが挙げられる。上記緩衝剤は、試薬中のｐＨが５〜９、あるいは濃度が１〜１００ｍＭとなるように含有されることが好ましい。
【００４９】
本発明の試薬に含有され得る糖および糖アルコールとしては、グルコース、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。上記糖または糖アルコールは、試薬中の濃度が０．０１〜１０．０質量％であることが好ましい。
【００５０】
本発明の試薬に含有され得るアルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられる。アルブミンは、試薬中の濃度が０．００１〜１．０質量％であることが好ましい。
【００５１】
本発明の試薬に含有され得る防腐剤としては、アジ化ナトリウムなどが挙げられる。防腐剤は、試薬中の濃度が０.０１〜０．５質量％であることが好ましい。
【００５２】
本発明の試薬に含有され得るその他の添加剤としては、ツィーン２０、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、５−ブロモサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモールなどが挙げられる。
【００５３】
本発明の試薬は、上記のように、反応性物質結合微小粒子が安定化されているため、該微小粒子の反応性が長期間維持される。したがって、この試薬を用いて免疫測定を行う場合には、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存が可能となる。
【００５４】
３．試薬キット
本発明の試薬キットは、上記反応性物質結合微小粒子と安定化物質とを含む試薬（本発明の試薬）を含む。この試薬キットは、例えば、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法などを用いた免疫測定、特に自動化免疫測定に用いられる。
【００５５】
本発明の試薬キットが免疫測定用試薬キットとして用いられる場合、そのキットは、通常、試料の希釈、試料の免疫反応前の前処理、および免疫反応を補助する成分などを含有する第一試薬、本発明の試薬でなる第二試薬、および必要に応じて、検量線作成用の測定対象物質の標準品から構成され得る。
【００５６】
本発明の試薬キットは、本発明の試薬中の微小粒子に結合された反応性物質に応じて、試料中の種々の物質を測定対象とすることができる。測定対象となり得る物質（測定対象物質）としては、例えば、アルブミン、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、ミオグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン、シスタチンＣ、フェリチン、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、ペプシノーゲンＩおよびＩＩ、コラーゲンなどの蛋白質；高比重リポ蛋白質、低比重リポ蛋白質、超低比重リポ蛋白質などの脂質蛋白質；デオキシリボ核酸、リボ核酸などの核酸；アルカリ性ホスファターゼ、乳酸脱水素酵素、リパーゼ、アミラーゼなどの酵素；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、およびこれらに対する抗体などの感染症に関する抗原や抗体；ハロペリドール、ブロムペリドールなどの薬物；性ホルモンなどのホルモンなどが挙げられる。
【００５７】
測定に供する測定対象物質を含む試料としては、血液、血漿、血清、尿、糞便（懸濁液）、髄液、腹水などの生体試料、環境中より得られたサンプルまたはその抽出物などが挙げられる。
【００５８】
４．自動化免疫測定方法
本発明の自動化免疫測定方法は、本発明の試薬を用いて行われる。この自動化免疫測定方法は、試薬中において、反応性物質結合微小粒子が安定化され、反応性が長期間維持されるため、長期間保存された試薬を用いても精度の高い測定値を得ることができる。
【００５９】
本発明の自動化免疫測定方法は、具体的には、試料、第一試薬、および本発明の試薬（第二試薬）を自動分析装置にセットし、試料に、第一試薬および第二試薬を順次自動的に混合することによって行われる。第一試薬と第二試薬との割合は、適宜設定される。好ましくは本発明の試薬（第二試薬）は、２〜９倍、より好ましくは３〜５倍に希釈される。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。以下の実施例において、特に記載がない限り、％はいずれも質量／容量％（Ｗ／Ｖ％）を表す。
【００６１】
調製例１：金コロイド液の調製
９５℃の蒸留水１Ｌに１０％塩化金酸水溶液２ｍＬを攪拌しながら加え、１分後に２％クエン酸ナトリウム水溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間攪拌した後、３０℃に冷却した。冷却後、０．１％炭酸カリウム水溶液でｐＨ７．１に調節した。
【００６２】
調製例２：抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬の調製
抗シスタチンＣ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この抗シスタチンＣ抗体溶液１００ｍＬを、調製例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間攪拌した。さらに、５．４６％マンニトール、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分間攪拌した。次いで、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した後、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた。さらに、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去し、１．５％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＡ溶液で抗体結合金コロイドを分散させ、全量を２４０ｍＬとし、抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬を得た。
【００６３】
調製例３：抗シスタチンＣ還元ＩｇＧの調製
抗シスタチンＣ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、および１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）（Ｂ溶液）で透析後、１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＢ溶液で希釈した。この抗体溶液に２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を濃度６ｍｇ／ｍＬになるように添加し、溶解後、３７℃で９０分間加温した。ゲル濾過カラムにて、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を除き、抗シスタチンＣ還元ＩｇＧを得た。
【００６４】
調製例４：抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬の調製
調製例３で調製した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧを、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）で希釈し、５０μｇ／ｍＬの濃度にした。この抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ溶液１００ｍＬを、調製例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵下で２時間撹拌した。さらに、５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分間撹拌した。次いで、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去した後、Ａ溶液を約１Ｌ加え、還元ＩｇＧ結合金コロイドを分散させた。さらに、８０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を除去し、１．５％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＡ溶液で抗体感作金コロイドを分散させ、全量を２４０ｍＬとし、抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａを得た。１．２５％デキストラン硫酸ナトリウムを含むＡ溶液で抗体感作金コロイドを分散させ、全量を２４０ｍＬとし、抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ｂを得た。
【００６５】
調製例５：シスタチンＣ測定用第一試薬の調製
５％塩化ナトリウム、０．２％ＥＤＴＡ、０．２％アルキルフェニルジスルホン酸ナトリウム塩、および０．３５％ポリオキシエチレンラウリルエーテルを含む０．５Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．７）緩衝液に、反応促進剤としてポリエチレングリコールを１．０〜２．５％程度添加してシスタチンＣ測定用第一試薬とした。
【００６６】
実施例１：メチオニンの添加効果の検討
調製例２で調製した抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬にメチオニンを０．００５％、０．０２％、０．０５％、０．１％、または０．５％の濃度になるように添加してシスタチンＣ測定用第二試薬とした。シスタチンＣ濃度が８ｍｇ／Ｌの試料の測定において、第二試薬の反応性についての保存による経時変化を検討した。対照としてメチオニン無添加の抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬をシスタチンＣ測定用第二試薬とした。第二試薬を２５℃で保存し、開始時、４日後、８日後、２０日後、および３９日後に、調製例５で調製した第一試薬を用いて、以下に示す方法で検討した。
【００６７】
（検討方法）
３μＬの試料に、第一試薬を２００μＬ分注し、３７℃で約５分間加温し、次いで、第二試薬を１００μＬ分注し、３７℃で反応させ、日立７０７０自動分析装置により、主波長５０５ｎｍおよび副波長６６０ｎｍで測光ポイント１８から２４の吸光度変化量を測定した。保存開始時の吸光度変化量に対する各保存期間経過後の吸光度変化量の割合を第二試薬の反応性（％）とした。結果を表１および図１に示す。
【００６８】
【表１】
【００６９】
表１および図１の結果から明らかなように、保存２０日後の第二試薬の反応性は、メチオニン無添加の場合、約２０％の低下が認められた。しかし、メチオニンを０．５％含有する場合は、約５％の低下にとどまった。保存３９日後においても、メチオニン無添加の場合は、３０％以上の低下が認められたが、メチオニンを０．５％含有する場合は、約７％の低下にとどまった。保存３９日後においては、メチオニンを０．００５％含有する場合でも、メチオニン無添加の場合と比較して、約７％高いことから、メチオニンの添加による安定化効果が認められた。このことから、メチオニンを抗体結合金コロイド粒子の分散液中に共存させることによって、該粒子を安定化できることがわかった。
【００７０】
実施例２：メチオニンおよびシステインの添加効果の検討
調製例４で調製した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａにメチオニンを０．０３％、０．０６％、または０．１２％の濃度に、あるいはシステインを０．０３％の濃度になるように、それぞれ添加してシスタチンＣ測定用第二試薬とした。シスタチンＣ濃度が８ｍｇ／Ｌの試料の測定において、第二試薬の反応性についての保存による経時変化を検討した。対照として６’，６’−ジチオジニコチン酸またはＮ−アセチルチオ尿素を０．０３％の濃度になるように添加した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａおよび無添加の抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬ＡをシスタチンＣ測定用第二試薬とした。第二試薬を冷蔵保存し、開始時、２週後、５週後、９週後、および１３週後に、調製例５で調製した第一試薬を用いて、実施例１と同様の方法で測定した。結果を表２および図２に示す。
【００７１】
【表２】
【００７２】
表２および図２の結果から明らかなように、保存１３週後の第二試薬の反応性は、無添加の場合、約１５％の低下が認められた。しかし、メチオニンまたはシステインを含有する場合は、ほとんど低下が認められなかった。一方、含硫化合物ではあるがアミノ酸またはその誘導体ではない６’，６’−ジチオジニコチン酸またはＮ−アセチルチオ尿素を含有する場合は、無添加の場合と同等以上の低下が認められた。このことから、メチオニンまたはシステインを還元ＩｇＧ結合金コロイド粒子の分散液中に共存させることによって、該粒子を安定化できることがわかった。
【００７３】
実施例３：アミノ酸の添加効果の検討
調製例４で調製した抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ｂにメチオニン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンを０．０２％の濃度になるように、それぞれ添加してシスタチンＣ測定用第二試薬とした。シスタチンＣ濃度が４ｍｇ／Ｌの試料の測定において、第二試薬の反応性についての保存による経時変化を検討した。対照として無添加の抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬ＢをシスタチンＣ測定用第二試薬とした。第二試薬を冷蔵保存し、開始時、２ヵ月後、４ヵ月後、および６ヵ月後に、調製例５で調製した第一試薬を用いて、実施例１と同様の方法で測定した。結果を表３および図３に示す。
【００７４】
【表３】
【００７５】
表３および図３の結果から明らかなように、第二試薬の反応性は、アミノ酸としてグルタミン、グルタミン酸、またはリジンを含有する場合、無添加の場合と同等の低下が認められた。しかし、メチオニンを含有する場合は、６ヵ月後においても、ほとんど低下が認められなかった。また、自己凝集による凝集物の発生もメチオニンを含有する場合には認められなかった。このことから、アミノ酸の中でも含硫アミノ酸であるメチオニンを還元ＩｇＧ結合金コロイド粒子の分散液中に共存させることによって、該粒子を安定化できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、反応性物質結合微小粒子を安定化することができる。したがって、該微小粒子が安定化された試薬の提供が可能となる。この試薬は、該微小粒子の反応性が長期間維持される。そのため、この試薬を用いて免疫測定を行う場合には、測定精度を減ずることなく試薬の長期間の保存が可能となる。この試薬および該試薬を含む試薬キットは、特に自動化免疫装置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】種々の濃度のメチオニンを添加した場合におけるシスタチンＣ測定用第二試薬（抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬）の反応性の経時変化を示すグラフである。
【図２】種々の含硫化合物を添加した場合におけるシスタチンＣ測定用第二試薬（抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ａ）の反応性の経時変化を示すグラフである。
【図３】種々のアミノ酸を添加した場合におけるシスタチンＣ測定用第二試薬（抗シスタチンＣ還元ＩｇＧ結合金コロイド試薬Ｂ）の反応性の経時変化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応性を有する物質が結合した微小粒子の安定化方法であって、
該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記含硫アミノ酸が、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分散液中に、前記含硫アミノ酸またはその誘導体が０．００１〜２．０質量％の割合で含有される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分散液中に、沈降抑制物質をさらに共存させる工程を含む、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記沈降抑制物質が、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはヘパリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反応性を有する物質が結合した微小粒子が、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
反応性を有する物質が結合した微小粒子と、含硫アミノ酸またはその誘導体とを含む、試薬。
【請求項９】
前記含硫アミノ酸が、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記試薬中に、前記含硫アミノ酸またはその誘導体が０．００１〜２．０質量％の割合で含有される、請求項８または９に記載の試薬。
【請求項１１】
沈降抑制物質をさらに含む、請求項８から１０のいずれかの項に記載の試薬。
【請求項１２】
前記沈降抑制物質が、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはヘパリンである、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
前記反応性を有する物質が結合した微小粒子が、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である、請求項８から１３のいずれかの項に記載の試薬。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれかの項に記載の試薬を含む、試薬キット。
【請求項１６】
請求項８から１４のいずれかの項に記載の試薬と、試料とを混合する工程を含む、自動化免疫測定方法。
【請求項１】
反応性を有する物質が結合した微小粒子の安定化方法であって、
該微小粒子の分散液中に、含硫アミノ酸またはその誘導体を共存させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記含硫アミノ酸が、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分散液中に、前記含硫アミノ酸またはその誘導体が０．００１〜２．０質量％の割合で含有される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分散液中に、沈降抑制物質をさらに共存させる工程を含む、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記沈降抑制物質が、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはヘパリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反応性を有する物質が結合した微小粒子が、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
反応性を有する物質が結合した微小粒子と、含硫アミノ酸またはその誘導体とを含む、試薬。
【請求項９】
前記含硫アミノ酸が、システイン、シスチン、およびメチオニンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
前記試薬中に、前記含硫アミノ酸またはその誘導体が０．００１〜２．０質量％の割合で含有される、請求項８または９に記載の試薬。
【請求項１１】
沈降抑制物質をさらに含む、請求項８から１０のいずれかの項に記載の試薬。
【請求項１２】
前記沈降抑制物質が、ポリアニオンおよびその塩、デキストラン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、およびグリセロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはヘパリンである、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
前記反応性を有する物質が結合した微小粒子が、抗体または抗原が結合した金コロイド粒子である、請求項８から１３のいずれかの項に記載の試薬。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれかの項に記載の試薬を含む、試薬キット。
【請求項１６】
請求項８から１４のいずれかの項に記載の試薬と、試料とを混合する工程を含む、自動化免疫測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１９７９４（Ｐ２０１０−１９７９４Ａ）
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１８２７２８（Ｐ２００８−１８２７２８）
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【出願人】（０００２３１３９４）アルフレッサファーマ株式会社 (27)
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１４日（２００８．７．１４）
【出願人】（０００２３１３９４）アルフレッサファーマ株式会社 (27)
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